Philipps-Uni e si ä Ma bu g
Fachbe eich Biologie
- Gene ik -
Die dynamische Regula ion de kleinen GTPase Rac1
wäh end des pola en Wachs ums on
Us ilago maydis
Disse a ion
zu E langung des Dok o g ades
de Na u wissenscha en
(D . e . na .)
o geleg on
Sonja Helene F iese
aus Wiesbaden
Ma bu g/Lahn, Juli 2011
Vom Fachbe eich Biologie de Philipps-Uni e si ä Ma bu g als Disse a ion
angenommen am:
Gu ach e de A bei :
E s gu ach e : P o . D . Michael Bölke
Zwei gu ach e : P o . D . Hans-Ul ich Mösch
Tag de mündlichen P ü ung am:
Die diese A bei zu G unde liegenden Un e suchungen wu den on No embe 2006
bis Mä z 2011 am Fachbe eich Biologie, Ab eilung Molekula e Gene ik de Philipps-
Uni e si ä Ma bu g un e de Lei ung on P o . D . Michael Bölke du chge üh .
Teile diese A bei sind in den olgenden A ikeln e ö en lich :
F iese , S. H., Hlubek, A., Sand ock, B. and Bölke , M. (2011).
Cla4 kinase igge s des uc ion o he Rac1-GEF Cdc24 du ing pola ized g ow h in
Us ilago maydis.Mol Biol Cell (akzep ie am 01.07.2011)
F iese , S. H., Baue , A., P zybilla, S., Sand ock, B. and Bölke , M.
Spa io empo al Regula ion o Rac1 ac i i y in Us ilago maydis. (in Vo be ei ung)
Das schöns e Glück des
denkenden Menschen is :
das E o schliche e o sch
zu haben und das Une o schliche
uhig zu e eh en.
- J. W. . Goe he -
Fü meine Mu e
Inhal s e zeichnis
Zusammen assung i
1 Einlei ung 1
1.1 De phy opa hogene B andpilz Us ilago maydis ............. 1
1.1.1 De Lebenszyklus on Us ilago maydis .............. 1
1.2 Die kleinen GTPasen Rac1 und Cdc42 in de Regula ion de Zellpola i ä
onEuka yo en............................... 3
1.2.1 Die Regula ion kleine GTPasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.2 Mechanismen zu Gene ie ung de Signalspezi i ä kleine GTPasen 5
1.2.3 Rac1 und Cdc42 in de Regula ion de Zellpola i ä höhe e Eu-
ka yo en............................... 6
1.2.4 Rac1 und Cdc42 in Pilzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.2.5 In de Bäcke he e und de Spal he e is Cdc42 de Haup egula o
des pola en Wachs ums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2.6 Cdc42 und Rac1 in Us ilago maydis ................ 15
1.3 Zielse zung de A bei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2 E gebnisse 21
2.1 Die Ak i i ä des Cdc24/Rac1/Cla4/Bem1 Signalmoduls wi d wäh end
des pola en Wachs ums on Us ilago maydis du ch eine nega i e Rück-
kopplungsschlei e egulie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.1.1 Ein Signalmodul aus Cdc24, Rac1, Cla4 und Bem1 egulie das
pola e Wachs um in U. maydis .................. 21
2.1.2 Das K euzungs yp-abhängige ilamen öse Wachs um on U. may-
dis basie au de Cdc24-abhängigen Ak i ie ung on Rac1 . . 26
2.1.3 Die b-abhängige Filamen induk ion wi d du ch einen Abbau on
Cdc24beglei e ........................... 27
2.1.4 Die Bildung eines Cdc24/Rac1/Bem1/Cla4 Komplexes is ü die
nega i e Regula ion on Cdc24 essen iell . . . . . . . . . . . . . 31
i

Inhal s e zeichnis
2.1.5 Die Phospho ylie ung on Cdc24 du ch Cla4 üh zum Abbau
desGEFs .............................. 32
2.2 Die Ak i i ä des Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Signalmoduls wi d du ch GAP-
Ak i i ä , den GDI Rdi1 und ak in e mi el e Endozy ose au die Fi-
lamen spi ze besch änk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.2.1 D ei GTPase ak i ie ende P o eine egulie en wäh end des pola-
en Wachs ums die Rac1-GTPase Ak i i ä . . . . . . . . . . . 38
2.2.2 De Guanin-Nukleo id Dissozia ions Inhibi o Rdi1 s ell inak i-
es Rac1-GDP zu e neu en Ak i ie ung zu Ve ügung . . . . . 42
2.2.3 Das En e nen on Rac1-GDP aus de Memb an wi d du ch die
ak inabhängige Endozy ose wäh end des pola en Wachs ums un-
e s ü z ............................... 45
2.2.4 Rac1 muss GTP hyd olysie en und mi Rdi1 in e agie en können,
um das pola e Wachs um zu s imulie en . . . . . . . . . . . . . 46
2.3 Die selek i e Ak i ie ung du ch Cdc24 bes imm die Rac1-Signalspezi i ä 49
2.3.1 Rac1 und Cdc42 haben in U. maydis spezi ische und edundan e
Funk ionen ............................. 49
2.3.2 Die Mu an e Cdc42F56W gewinn Rac1-Signalspezi i ä und e -
lie Cdc42-Funk ionali ä . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3 Diskussion 56
3.1 Dynamische Regula ion des Cdc24/Bem1/Rac1/Cla4 Signalmoduls . . 56
3.1.1 Die Cla4 abhängige Phospho ylie ung on Cdc24 induzie den
AbbaudesGEFs .......................... 56
3.1.2 De Abbau on Cdc24 besch änk die Ak i i ä des Bem1/Rac1-
GTP/Cla4 Signalmoduls au die wachsende Spi ze . . . . . . . . 57
3.1.3 Die Inak i ie ung des Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplexes wäh-
end des pola en Wachs ums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.1.4 Die bW/bE-abhängige Ak i ie ung on Cdc24 . . . . . . . . . . 64
3.2 Die selek i e Ak i ie ung du ch Cdc24 bes imm die Rac1-Signalspezi i ä 65
3.2.1 Rac1 und Cdc42 haben eine gemeinsame essen ielle Funk ion . . 65
3.2.2 Die Gene ie ung de Rac1-Signalspezi i ä häng on Cdc24 ab . 66
3.3 Ausblick................................... 67
4 Ma e ial und Me hoden 68
4.1 S ämme ................................... 68
4.1.1 E. coli S ämme........................... 68
4.1.2 S. ce e isiae S ämme........................ 68
4.1.3 Us ilago maydis S ämme...................... 68
ii
Inhal s e zeichnis
4.2 Vek o en................................... 69
4.3 He s ellung de in diese A bei e wende en U. maydis S ämme . . . . 70
4.3.1 Ek opische Exp ession on GFP-, RFP-, Myc- und 3xHA- Fusi-
onsp o einen im ip Locus und im na 1 Locus on Us ilago maydis 70
4.3.2 Ek opische Übe exp ession on Genen im ip Locus on U. maydis 72
4.3.3 He s ellung on Dele ionsmu an en in Us ilago maydis ..... 73
4.3.4 He s ellung kondi ionale Mu an en . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.3.5 Kons uk e zu He s ellung N- und C- e minale 3xHA-Fusionen
am genomischen Locus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.3.6 Kons uk ion des Tes sys ems zu Iden i ika ion des ü den Cdc24-
Abbau aus eichenden F agmen s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.3.7 Kons uk e zu Dele ion on einzelnen Be eichen inne halb eines
ORFs ................................ 79
4.3.8 Ein üh ung on Punk mu a ionen . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
4.3.9 Kons uk e zu Übe exp ession on U. maydis P o einen in E. coli 82
4.4 Me hoden .................................. 83
4.4.1 Kul i ie ung on Mik oo ganismen . . . . . . . . . . . . . . . . 83
4.4.2 Isolie ung on Nukleinsäu en . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
4.4.3 Analyse und Modi ika ion on Nukleinsäu en . . . . . . . . . . 85
4.4.4 T ans o ma ion on Mik oo ganismen . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.4.5 P o einbiochemische Me hoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
4.4.6 In ek ion on Zea mays ....................... 94
4.4.7 Mik oskopie on U. maydis-Zellen................. 94
4.5 Genu z e Ki s, Chemikalien und Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
4.5.1 Allgemeine Ma e ialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
4.5.2 Ki s ................................. 95
4.5.3 Chemikalien............................. 95
4.5.4 Enzyme ............................... 98
Li e a u e zeichnis 99
Abkü zungen 112
Danksagung 114
iii
Abbildungs e zeichnis
1.1 E scheinungs o men on Us ilago maydis ................. 1
1.2 De Lebenszyklus on Us ilago maydis .................. 2
1.3 Die Regula ion de Ak i i ä kleine GTPasen . . . . . . . . . . . . . . 4
1.4 Rho-GTPasen s ehen im Zen um on komplexen Signalne zwe ken . . 6
1.5 Beispiele ü Cdc42/Rac1 abhängige Pola isie ungsp ozesse in höhe en
Euka yo en ................................. 7
1.6 Wich ige E ek o en on Cdc42 und Rac1 in höhe en Euka yo en . . . . 9
1.7 Rac1 ging wäh end de E olu ion de Pilze zweimal unabhängig e lo en 10
1.8 Regula o ische P o eine und E ek o en on Cdc42 in S. ce e isiae . . . 12
1.9 Regula o ische P o eine und E ek o en on Cdc42 in S. pombe ..... 14
1.10 Rac1 egulie in U. maydis das pola e Wachs um und Cdc42 die Bildung
des sekundä en Sep ums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.11 Rho-GEFs in U. maydis .......................... 17
1.12 Rho-GAPs in U. maydis .......................... 18
2.1 Eine du ch Bem1 koo dinie e linea e Signalkaskade egulie die Zellpo-
la i ä in U. maydis ............................. 22
2.2 Cdc24, Bem1 und Cla4 lokalisie en in koope a i e Weise an de pola
wachsendenSpi ze ............................. 23
2.3 Bem1, Cdc24, Rac1 und Cla4 bilden einen Mul ip o einkomplex . . . . 25
2.4 Die Filamen induk ion üh zu einem e höh en Le el on ak i em Rac1-
GTP..................................... 27
2.5 Cdc24 wi d wäh end de om b-K euzungs yp abhängigen Filamen in-
duk iondeg adie ............................. 28
2.6 Die nega i e Rückkopplungs egula ion on Cdc24 häng on de Bildung
eines unk ionalen Cdc24/Rac1/Cla4/Bem1 Signalmoduls ab . . . . . . 30
2.7 De Abbau on Cdc24 häng wäh end des ilamen ösen Wachs ums on
de Cla4 Kinaseak i i ä ab . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
i
Abbildungs e zeichnis
2.8 De Be eich zwischen PH- und PB1-Domäne wi d du ch Cla4 Ak i i ä
phospho ylie und abgebau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.9 Eine Region on 62 Aminosäu en is ü den Cla4-induzie en Abbau on
Cdc24e o de lich.............................. 36
2.10 Die Exp ession eine s abilisie en Cdc24 Va ian e in e e ie mi de
Induk ion des ilamen ösen Wachs ums . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.11 D ei GTPase ak i ie ende P o eine (GAPs) haben Ein luss au die Zell-
pola i ä on U. maydis .......................... 39
2.12 Die Rac1-GAPs zeigen un e schiedliche Lokalisa ionsmus e . . . . . . 40
2.13 Die Dele ion de Rac1-GAPs ha eine Bem1-abhängige s abilisie ende
Wi kung au die Cdc24 Konzen a ion . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.14 Rdi1 is ein Regula o de Zellpola i ä in U. maydis .......... 43
2.15 Rdi1 ha einen Rac1-abhängigen Ein luss au die S abili ä on Cdc24 . 44
2.16 Die Inhibi ion de ak inabhängigen Endozy ose ha einen s abilisie enden
E ek au die Cdc24 Konzen a ion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.17 Rac1 muss seine GDP-gebundene Kon o ma ion du chlau en und mi
Rdi1 in e agie en können, um Cdc24 zu des abilisie en . . . . . . . . . 47
2.18 Rac1Q61L benö ig die In e ak ion mi Rdi1 und Bem1, um seine Wi kung
zuen al en ................................. 48
2.19 Cdc24 ak i ie Rac1 und Cdc42 in i o und in i o, Rac1 jedoch mi
höhe e P ä e enz.............................. 50
2.20 Die essen ielle Funk ion on Cdc24 häng on seine GEF Ak i i ä ab 51
2.21 Wede das Ge üs p o ein Bem1, noch die E ek o en Cla4 und S e20
disk iminie en zwischen Cdc42 und Rac1 . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.22 Die Mu an e Cdc42F56W gewinn Rac1-Signalspezi i ä , e lie jedoch
ih e Cdc42-Funk ionali ä . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.1 Schema isches Modell ü die nega i e Rückkopplungs egula ion des GEFs
Cdc24 .................................... 59
3.2 D ei Rac1-GAPs kon ollie en die Rezyklisie ung on Bem1 . . . . . . . 61
3.3 Schema isches Modell ü die zyklische Ak i ie ung und Deak i ie ung
on Rac1 wäh end des pola en Spi zenwachs ums . . . . . . . . . . . . 63
4.1 F agmen ie ung on cdc24 und He s ellung de Kons uk e zu Dele ion
einzelne Be eiche.............................. 78
1 Einlei ung
Magnesium o liegende GDP e d äng . Bei de Inko po a ion on GTP komm es zu
Umkeh ung de GEF-induzie en S uk u ände ung (Rossman e al., 2005). Die lipid-
bindende PH-Domäne dien e mu lich de ich igen Posi ionie ung de DH Domäne
ela i zu GTPase an de Plasmamemb an (Rossman e al., 2005).
In ielen GTPasen exis ie en C- e minale S uk u en, sogenann e „CAAX-Boxen“, wel-
che z.B. du ch Fa nesylie ung ode Palmi oylie ung pos ansla ional modi izie we -
den. Die Modi ika ionen üh en zu Ve anke ung in de Zy oplasmamemb an, die ein
wich iges Elemen de äumlichen Regula ion on G-P o einen da s ell (Glomse and
Fa nswo h, 1994; Zhang and Casey, 1996). Fü die Regula ion on Mi gliede n de
Rho/Rac/Cdc42-Familie exis ie en neben den schon besch iebenen GEFs und GAPs
noch wei e e Regula ions ak o en, die Guaninnukleo id Dissozia ionsinhibi o en (GDIs),
die eine hyd ophobe Binde asche besi zen. Übe diese in e agie en sie mi de C- e mina-
len P enylmodi ika ion de GTPasen, um diese aus de Memb an he auszulösen (Sasaki
e al., 1990; Wu e al., 1996b; Seab a and Wasmeie , 2004) (Abb. 1.3). Die Ab ennung
de GDI-Regula o en aus dem cy osolischen Komplex mi de inak i en GTPase ge-
schieh du ch GDI-Dissozia ions ak o en wie z.B. den ERM P o einen (Ez in, Radixin,
Moesin), die an GDIs binden und de en Ak i i ä e inge n (Takahashi e al., 1997).
1.2.2 Mechanismen zu Gene ie ung de Signalspezi i ä kleine
GTPasen
Eines de g undlegenden P obleme bei de Un e suchung de Signalwei e lei ung du ch
Rho-GTPasen is die F age, wie inne halb eines GEF/GTPase/E ek o Signalmoduls
siche ges ell wi d, dass das den GEF ak i ie ende Signal mi de ko ek en zellulä en
An wo e knüp wi d. Eine GTPase de Rho-Familie kann in de Regel on meh als
einem GEF ak i ie we den und ih e sei s mi meh als einem E ek o in e agie en, al-
so auch meh als eine zellulä e An wo e zeugen (Abb. 1.4). Die Signalspezi i ä kann in
einem solch komplexen Ne zwe k du ch e schiedene Mechanismen siche ges ell we -
den. Die GEF-GTPase E kennung is , wie auch die GTPase-E ek o E kennung o
hochspezi isch. Eine besonde e Rolle spiel dabei die Aminosäu e an Posi ion 56 in
Cdc42 (Phenylalanin) und Rac1 (T yp ophan). Es konn e gezeig we den, dass GEFs
de Dbl-Familie übe diese Aminosäu e zwischen Cdc42 und Rac1 disk iminie en (Gao
e al., 2001; Ka noub e al., 2001; Snyde e al., 2002; Hlubek e al., 2008). Zudem
lieg diese Aminosäu e in de E ek o bindeschlei e de GTPase, wo sie auch die Bin-
dung on spezi ischen E ek o en beein lussen kann (Ka noub e al., 2001). In ielen
Fällen is jedoch die Bindung on GTPase In e ak o en ela i unspezi isch. In einem
solchen Fall wi d die ko ek e In e ak ion on GEF, GTPase und E ek o in einem
Mul ip o einkomplex mi einem Ge üs p o ein siche ges ell (Ma inissen and Gu kind,
5

1 Einlei ung
2005; Ga cía-Ma a and Bu idge, 2007). In sel enen Fällen kann auch de GEF selbs
als Ge üs p o ein ungie en und so die Ak i ie ung des ich igen E ek o s siche s ellen,
wie es z.B. bei dem Endozy osege üs p o ein In e sec in de Fall is (Ga cía-Ma a and
Bu idge, 2007). Eine wei e e Möglichkei , Signalspezi i ä zu gene ie en, kann auch die
spezi ische Exp ession ode Lokalisa ion de mi de GTPase in e agie enden P o eine
sein, die die Ak i ie ung on GTPase und E ek o au einen bes imm en Zell yp ode
ein Kompa imen besch änk (Ga cía-Ma a and Bu idge, 2007).
Wie man zwischen diesen e schiedenen Szena ien de Spezi i ä sgene ie ung in einem
konk e en Signalmodul un e scheiden kann und da übe zu einem e ie en Ve s ändnis
de Signalwei e lei ung gelang , is eine de g öß en He aus o de ungen beim S udium
kleine GTPasen.
A
GDP
B C D E
GTP
A B C D
Ak i a o en
E ek o en
GTPase
zellulä e An wo
ak i ie endeSignale
AUS AN
Abbildung 1.4: Rho-GTPasen s ehen im Zen um on komplexen Signalne zwe ken. Rho-
GTPasen können häufig du ch meh e e Ak i a o en s imulie we den und in e agie en ih e sei s mi
meh als einem Effek o . Ein molekula e Schal e bilde olglich das zen ale Elemen meh e e Si-
gnalkaskaden, die un e schiedliche ak i ie ende Signale mi un e schiedlichen mo phologische Effek en
e knüp en. Die Spezifi ä eines solchen Signalmoduls kann sowohl au de Sei e de Ak i a o en, als
auch au de Sei e de Effek o en gene ie we den.
1.2.3 Rac1 und Cdc42 in de Regula ion de Zellpola i ä höhe e
Euka yo en
Die Ausbildung und Au ech e hal ung de ko ek en Zellpola i ä is besonde s ü
mul izellulä e O ganismen essen iell. Sie is Vo ausse zung ü die En wicklung de Zell-
mo phologie, abe auch ü die Mobili ä indi iduelle Zellen (E ienne-Manne ille and
Hall, 2002). Dabei sind Cdc42 und Rac1 zusammen mi RhoA zen ale Regula o en, die
das Zy oskele o ganisie en. Das bes un e such e Beispiel ü die Zusammena bei de
6
1 Einlei ung
d ei GTPasen is die Zellmig a ion. Diese spiel z.B. bei dem Ve schluss on Wunden
in einem Zellgewebe eine wich ige Rolle, ode bei de Chemo axis on Mak ophagen
(E ienne-Manne ille and Hall, 2002). Die Zellbewegung on Fib oblas en is das Resul-
a de du ch Cdc42 und Rac1 s imulie en Ak inpolyme isa ion, die zu Auss ülpung
on Filopodien (Cdc42) und Lamellipodien (Rac1) in de Bewegungs ich ung üh
und des RhoA induzie en Zu ückziehens on Memb an und Zellma ix am ückwä i-
gen Zellende du ch S imula ion de Ak in-Myosin Kon ak ion (Ra opoulou and Hall,
2004) (Abb. 1.5 A). Die E ablie ung eine s abilen Pola i ä sachse wi d dabei du ch Po-
la i ä skomplexe siche ges ell , die die GTPasen ek u ie en. Die d ei bes un e such en
Pola i ä skomplexe sind in Säuge n de Pa - (pa i ioning de ec i e), de C umbs- und
de Sc ibble- Komplex, wobei de Pa -Komplex die iel äl igs en Funk ionen ausüb
(Iden and Colla d, 2008). De Pa -Komplex, bes ehend aus sechs Pa (Pa 1-6) P o ei-
nen und eine un ypischen P o einkinase C (Pkc3), spiel in Caeno habdi is elegans bei
Neu on
Dend i Axon
Zygo e
pos e io an e io
Chemo axis
Auss ülpungen
Kon ak ion
Zu ückziehen
RhoA
Pa 6-Pa 3-Pkc3
-Cdc42
Pa 1/Pa 2
Epi helzelle
apikal
basal
AJ
TJ Pa 6-Pa 3-Pkc3
-Tiam1-Rac1
Cdc42-Pa 6-Pa 3
-Tiam1-Rac1
A D
B C
Sc ibble-Cdc42-Pa 6
-Pa 3-Tiam1-Rac1
Abbildung 1.5: Beispiele ü Cdc42/Rac1 abhängige Pola isie ungsp ozesse in höhe en
Euka yo en.A) Pola e Bewegung on Fib oblas en. Rac1 und Cdc42 lokalisie en mi Hil e de Po-
la i ä skomplexe Sc ibble und Pa an de Zell on . Dabei wi d Rac1 du ch Tiam1 ak i ie . Rac1 und
Cdc42 ini iie en die Bildung on Filopodien und Lamellipodien, wodu ch es zu Fo bewegung komm .
Ak i es RhoA lokalisie haup sächlich am ückwä igen Zellende, wo es die Ak omyosinkon ak ion
egulie . B) Die E ablie ung de an e io -pos e io Achse üh zu asymme ischen Teilung de C. ele-
gans Zygo e. Pa 1 und Pa 2 lokalisie en am pos e io en Zellpol, wäh end Pa 6, Pa 3 und die al e na i e
Pkc3 den an e io en Zellpol ma kie en. Cdc42 wi d an den an e io en Pol ek u ie und ak i ie . C)
Wäh end de Axon-Spezifika ion üh en ex e ne S imuli zu Bildung on Phospha idylinosi ol-3,4,5-
iphospha an de Neu i enspi ze, wodu ch es Rab1-abhängig zu Ak i ie ung on Cdc42 komm .
Cdc42-GTP ak i ie den Pa -Komplex, wws zu S imulie ung on Rac1 du ch Tiam1 üh . D) Apikal-
basale Pola isie ung on Epi helzellen. Dabei egulie de Pa 6-Pa 3-Pkc3-Tiam1-Rac1 Komplex die
Bildung on „ igh junc ions“ (TJ) und die En wicklung eines olls ändig pola isie en Epi heliums.
Modifizie nach (E ienne-Manne ille and Hall, 2002).
7
1 Einlei ung
de E ablie ung de an e io -pos e io Achse wäh end de e s en Zell eilung de Zygo e
eine wich ige Rolle. Dabei lokalisie en Pa 1 und Pa 2 am pos e io en Zellpol und Pa 3,
Pa 6 und Pkc3 am an e io en Zellpol (Kemphues, 2000).
Anschließend komm es zu Pola isa ion des Ak omyosinne zwe ks zum an e io en Pol,
wodu ch ein kon ak ile an e io e und ein nich kon ak ile pos e io e Be eich en -
s eh (Cowan and Hyman, 2007). Ve mu lich in e agie Cdc42 mi Pa 6, um Pkc3 zu
s imulie en und e binde die asymme ische Lokalisa ion de Pa P o eine mi de Po-
la isa ion des Ak inmyosinne zwe ks (Jobe y e al., 2000; Cowan and Hyman, 2007)
(Abb. 1.5 B).
Bei de E ablie ung de apikal-basalen Achse in Epi helzellen spielen neben dem Pa -
Komplex auch Cdc42 und Rac1 eine wich ige Rolle (Abb. 1.5 B). In Epi helien bilden
Lamellipodien und Filopodien benachba e Zellen mi einande o läu ige Ve bindun-
gen, an denen sich E-Cadhe in an eiche (Ebne e al., 2008). Dies üh zu Ak i-
ie ung on Rac1 und Cdc42 (Nakagawa e al., 2001; Kim e al., 2000). Rac1 spiel
jedoch o enba die bedeu ende e Rolle bei de anschließenden Pola isie ung de Zelle
(Takaishi e al., 1997). Die In e ak ion de GTPasen mi Pa 6 üh zu Ak i ie ung
de al e na i en Pkc (Yamanaka e al., 2001). Ein wei e e bedeu ende In e ak ions-
pa ne des Pa -Komplexes is de Rac1 GEF Tiam1, de mi Pa 3 in e agie und
so die Ak i i ä on Rac1 di ek mi dem Pa -Komplex wäh end de Ausbildung on
„ igh junc ions“ e knüp (Chen 2005, Me ens 2005) (Abb. 1.5 C). Die In e ak i-
on on Tiam1 mi Pa 3 inde auch wäh end de Spezi izie ung on Axonen s a , wo
de GEF die Rac1-abhängige Ak in eo ganisa ion an de Axonspi ze s imulie . Eine
Ne enzelle bilde zunächs Rac1- und Cdc42-abhängig Lamellipodien und Filopodien,
die sich zu Neu i en en wickeln (Kozma e al., 1997). Du ch ex e ne S imuli komm
es zu Ak i ie ung de Phospha idylinosi ol 3-Kinase (PI3K), was zu e höh en loka-
len Phospha idylinosi ol-3,4,5- iphospha Konzen a ion an de Dend i enspi ze üh .
Dies ak i ie e mu lich die Ras-ähnliche GTPase Rab1, was le z endlich in de S imu-
lie ung on Cdc42 esul ie (Schwambo n and Püschel, 2004). Ak i es Cdc42 ak i ie
den Pa -Komplex, was eine Ak i ie ung on Rac1 du ch Tiam zu Folge ha (Nishimu-
a e al., 2005). Dieses Cdc42/Pa 6/Pa 3/Tiam1/Rac1 Modul is eine de zen alen
Regula o en de Zellpola i ä in Säuge n und egulie neben de E ablie ung de Axon-
pola i ä auch noch wei e e P ozesse, wie z.B. die an e io -pos e io Pola isie ung on
T-Zellen (Gé a d e al., 2007).
Rac1 und Cdc42 egulie en die bishe besch iebenen P ozesse du ch die In e ak ion
mi eine Vielzahl on E ek o en. Dabei sind iele diese In e ak o en Kinasen (PAK,
MRCK) ode Ge üs p o eine (IQGAP, WASP, WAVE)(Abb. 1.6). Die Regula ion de
Ak inpolyme isa ion inde du ch PAK (p21 ac i a ed kinase) S imula ion und du ch
Ak i ie ung on N-WASP (Neu onal Wisco -Ald ich Synd om P o ein) und WAVE
8
1 Einlei ung
N-WASP
MRCK PAK Pa 6 IQGAP S a1 WAVE p67phox
Cdc42 Rac1
Ak omyosin
Kon ak ion
Mik o ubuli
Regula ion
Ak in
Polyme isa ion
Zell-
pola i ä
Zell-
adhesion
NADPH
Oxida ion
Abbildung 1.6: Wich ige E ek o en on Cdc42 und Rac1 in höhe en Euka yo en. Cdc42
und Rac1 egulie en die Zellpola isa ion du ch S imula ion de Ak omyosinkon ak ion und de Ak in-
polyme isa ion, sowie de Regula ion de Mik o ubulis abili ä . MRCK (Myo onic dys ophy kinase-
ela ed Cdc42-binding kinase), N-WASP (Neu onal-Wisko -Ald ich Synd om P o ein), PAK (p21 ac i-
a ed kinase), Pa 6 (pa ioning de ec i e 6), IQGAP (IQ mo i -con aining GTPase-ac i a ing p o ein),
S a1 (specifically Rac1-associa ed p o ein 1), WAVE (WASP amily e p olin homologous p o ein), p67
phox (p67 phagocy e oxidase p o ein). Modifizie nach (Iden and Colla d, 2008).
(WASP-Familien-Ve p olin-homologes P o ein) s a . Die PAKs s imulie en ak inpoly-
me isie ende und depolyme isie ende Fak o en du ch de en Phospho ylie ung, wohin-
gegen WASP und WAVE als Ge üs p o ein ü die ak inpolyme isie ende Maschine ie
dienen, in de en Zen um de A p2/3 Komplex s eh (P ehoda e al., 2000).
Übe die Ak i ie ung de GTPase Ak i i ä on Cdc42 und Rac1 wäh end de E ablie-
ung de Zellpola i ä is wenig bekann . Es wu de besch ieben, dass de Cdc42-GAP
Cdc42GAP wäh end de Zellmig a ion am o de en Zellende du ch den Dynein Regu-
la o Nudel inhibie wi d (Shen e al., 2008). Auch konn e gezeig we den, dass de
Rac1-GAP SH3BP1 übe den Exozys Komplex an die Zell on ek u ie wi d, wo e
Rac1 inak i ie (Pa ini e al., 2011). De Rho-GDI1 is ein wei e e Regula o on
Cdc42 und Rac1. De GDI kon ollie die Homeos asis on Cdc42, Rac und Rho P o-
einen, indem e mi ihnen nach ih e P enylie ung am ER in e agie , sie löslich im
Zy osol häl und so o dem Abbau schü z (Boul e e al., 2010).
1.2.4 Rac1 und Cdc42 in Pilzen
Cdc42 und Rac1 sind eng e wand e und hoch konse ie e Mi gliede de Familie de
Rho-GTPasen, die übe ach zig P ozen Sequenzhomologie zwischen Pilzen und Men-
schen au weisen. Diese hohe Konse ie ung de Aminosäu esequenz ü Rac1 und Cdc42
is e mu lich au ih e Be eiligung an zahl eichen komplexen biologischen P ozessen
zu ückzu üh en. Obwohl so hoch konse ie e P o eine no male weise als un e zich ba
gel en (Pál e al., 2006), ha wäh end de E olu ion de Pilze o enba ein zweimali-
ge Ve lus on Rac1 s a ge unden (Abb. 1.7). Ausge echne zwei de p ominen es en
pilzlichen Modello ganismen, die Bäcke he e Saccha omyces ce e isiae und die Spal he-
9
1 Einlei ung
e Schizosaccha omyces pombe besi zen kein Rac Homolog (Pe ez and Rincón, 2010)
(Abb. 1.7).
Cdc42 Rac1 NADPH
oxidase
+-
+
+ + +
+ + +
+ + +
+ + -
+--
+--
+--
+- -
+ + -
+ + +
+* +* -
+ + +
++ +
Us ilago maydis
Cop inopsis cine ea
Phane ochae ech ysospo ium
C yp ococcusneo o mans
Aspe gillus nidulans
Magnapo heg isea
Neu ospo a c assa
Candidaalbicans
Ya owialipoly ica
Ashbyagossypii
Saccha omycesce e isiae
Schizosaccha omycespombe
Pneumocys is ca inii
Lacca iabicolo
++
Musmusculus +
-
-
-
Abbildung 1.7: Rac1 ging wäh end de E olu ion de Pilze zweimal unabhängig e lo en.
Kladog amm on Pilza en basie end au ih e 18 S DNA-Sequenz. Die o en Balken ma kie en den
Ve lus on Rac1 wäh end de E olu ion. Die S e nchen zeigen die Anwesenhei zusä zliche Cdc42,
bzw. Rac1 O hologe in C yp ococcus neo o mans an.
In diesen beiden O ganismen is Cdc42 ein essen ielles P o ein (Pe ez and Rincón, 2010),
wäh end in den meis en ilamen ösen Pilzen Cdc42 nich essen iell is . cdc42 / ac1 Dop-
pelmu an en sind jedoch nich lebens ähig (Mahle e al., 2006; Kwon e al., 2011; Vi ag
e al., 2007). Dies läss den Schluss zu, dass Cdc42 und Rac1 mindes ens eine gemeinsa-
me essen ielle Funk ion haben, bzw. einen gemeinsamen essen iellen E ek o ak i ie en.
Abgesehen on diese Gemeinsamkei a iie en die Funk ionen, die Rac1 und Cdc42 in
den ilamen ösen Pilzen übe nehmen, d ama isch, soga zwischen seh nah e wand en
A en. So is Rac1 in Aspe gillus nige ein Regula o des Hyphenwachs ums, wohinge-
gen diese Funk ion in Aspe gillus nidulans ehe on Cdc42 ausge üll wi d (Vi ag e al.,
2007). In den Basidiomyce en U. maydis und C yp ococcus neo o mans is Rac1 de
zen ale Regula o des ilamen ösen Wachs ums, wohingegen Cdc42 bei de Regula ion
de Sep ie ung eine wich ige Rolle spiel (Vallim 2005, Mahle 2006, Ballou 2010).
Auch im Bezug au die on Cdc42 und Rac1 ak i ie en E ek o en he sch im Reich
de Pilze eine g oße Va iabili ä . Eine de am bes en cha ak e isie en E ek o en, die
p21-ak i ie e Kinase Cla4, is in S. ce e isiae ein E ek o ü Cdc42, wohingegen sie
10

1 Einlei ung
in U. maydis als E ek o on Rac1 besch ieben wu de (Mahle e al., 2006). Ein wei e-
e , in Pilzen als Rac1 spezi isch besch iebene In e ak o , is die NADPH Oxidase, ein
Mul ip o einkomplex, de de Gene ie ung on eak i en Saue s o a en (ROS) dien
(Chen e al., 2008; Takemo o e al., 2011). In e essan e weise, is diese E ek o in den
Pilzen, die kein Rac1 Homolog besi zen, nich o handen (Abb. 1.7).
1.2.5 In de Bäcke he e und de Spal he e is Cdc42 de
Haup egula o des pola en Wachs ums
Das Ve s ändnis da ü , wie zellulä e Komponen en in einem einzelligen O ganismus eine
Pola i ä sachse e ablie en können, is in den Ascomyce en, o allem in den Bäcke he e
S. ce e isiae und in de Spal he e S. pombe seh wei o gesch i en. Die Schlüssel-
mechanismen de Pola i ä se ablie ung sind in beiden O ganismen seh ähnlich. Zue s
e olg die Ma kie ung des O es de Pola isie ung in Abhängigkei om Zellzyklus ode
ex e nen Reizen, wie z.B. bei de Zellpaa ung. Anschließend wi d die Pola i ä du ch
die Rek u ie ung und Ak i ie ung de Fak o en e ablie , die das Zy oskele asymme-
isch eo ganisie en. In de Folge komm es zu pola isie en Sek e ion, was le z endlich
zum pola en Wachs um üh (Pe ez and Rincón, 2010). Dabei weisen beide O ganis-
men jedoch g undsä zlich un e schiedliche Mechanismen de Zell e meh ung au . S.
ce e isiae e meh sich du ch Knospung. Die unden Zellen bilden eine Knospe, die
wäh end de ühen G1 Phase du ch apikales Wachs um bis zu eine k i ischen G öße
he anwächs . Anschließend e g öße sich die Knospe du ch iso opes Wachs um und
unde sich ab. Nach de Mi ose we den Toch e und Mu e zelle du ch Einzug des
Sep ums oneinande ge enn (Pe ez and Rincón, 2010). S. pombe Zellen haben eine
längliche zylind ische Fo m und e meh en sich du ch zen ale Spal ung. Wäh end de
G1 Phase inde zunächs monopola es apikales Wachs um am sogenann en al en Ende
s a . Zu Beginn de G2 Phase wi d das Wachs um am neuen Ende induzie (NETO:
new end ake o ) und die Zelle wächs bipola . Nach de Mi ose wi d ein zen ales
Sep um gebilde , mi dessen Hil e sich die Zellen ennen (Pe ez and Rincón, 2010).
Die Regula ion on Cdc42 in S. ce e isiae und seine E ek o en
In S. ce e isiae wi d die zukün ige Knospungss elle du ch die Ras-ähnliche GTPase
Bud1/Rs 1 zusammen mi ih em GEF, Bud5, und ih em GAP, Bud2, ma kie (Chan
e al., 1995; Chan and P ingle, 1995; Pa k and Bi, 2007). Rs 1 ek u ie Cdc24, den
einzigen und essen iellen GEF ü Cdc42 in de Bäcke he e, an die Knospungss elle
(Gulli and Pe e , 2001; Pa k and Bi, 2007) (Abb. 1.8 A). Die Ak i i ä on Cdc24 wi d
genau egulie . So wu de besch ieben, dass de GEF wäh end de ühen G1 Phase
du ch die In e ak ion mi Fa 1 im Zellke n zu ückgehal en wi d, um eine unkon ol-
11
1 Einlei ung
lie e Ak i ie ung on Cdc42 zu e hinde n. Die F eise zung on Cdc24 aus dem Ke n
e olg in Abhängigkei on de Phospho ylie ung des Fa 1 P o eins du ch das G1 Cy-
clin Cdc28 (Ne n and A kowi z, 2000; Shimada e al., 2000; Toenjes e al., 1999). Es
wu de auch eine di ek e Phospho ylie ung on Cdc24 du ch Cdc28 besch ieben (Cole
e al., 2009; Wai e al., 2009). In eine wei e en S udie wu den Auswi kungen diese
Phospho ylie ung au die Lokalisa ion on Cdc24 es ges ell (Cole e al., 2009), wo-
hingegen in eine ande en Ve ö en lichung eine Cdc24 Va ian e besch ieben wu de, die
o z Fehlen alle beobach e en CDK Phospho ylie ungss ellen keine sich ba en De ek e
au wies (Wai e al., 2009). Eine wei e e Regulie ung on Cdc24 e olg zudem du ch
Oligome isie ung des GEFs, die ihn im inak i en Zus and häl (Mionne e al., 2008).
Die Rek u ie ung on Cdc24 du ch die In e ak ion mi Rs 1 üh zu eine lokalen
Ak i ie ung und An eiche ung on Cdc42 an de Knospens elle. Diese üh zu Pola-
isie ung des Ak inzy oskele s und zu zielge ich e en Sek e ion (Pa k and Bi, 2007).
Cdc24 und Cdc42-GTP können, wie auch iele de bekann en Cdc42 E ek o en, mi
dem Ge üs p o ein Bem1 in e agie en (Gulli and Pe e , 2001; I azoqui e al., 2003;
Kozubowski e al., 2008) (Abb. 1.8 A). Es konn e gezeig we den, dass die He ezellen
auch in Abwesenhei on Rs 1 mi Hil e on Bem1 pola isie en können (I azoqui e al.,
2003). Alle dings wu de das Ge üs p o ein du ch die Exp ession eine di ek en Fusion
on Cdc24 mi dem Cdc42 E ek o Cla4 ü den P ozess de Zellpola isa ion übe lüs-
sig. Dahe wu de pos ulie , dass die Haup unk ion on Bem1 da in lieg , GEF und
E ek o zusammenzub ingen (Kozubowski e al., 2008).
Cla4 und die nah e wand e Kinase S e20 gehö en zu den p21-ak i ie en Kinasen
(PAKs) und agie en beide als E ek o en on Cdc42 (Abb. 1.8 B). Cdc42 in e agie
Cla4
Cdc42
GTP
Cdc24
Rs 1-GTP
Bem1
Ak inzy oskele Reo ganisa ion
Pola esSpi zenwachs um
A
Cdc24
Rga1 Rga2 Bem2 Bem3
Rdi1
Skm1 S e20Cla4 Bni1 Gic1 Gic2 Sec3
Typ1
Myosine Bee1
Exozy ose
Sep in
O genisa ion
Ak in ilamen
Au bau
Phe omon
An wo
Ak inpa ch
Au bau
MAPK
Cdc42
B
Abbildung 1.8: Regula o ische P o eine und E ek o en on Cdc42 in S. ce e isiae.A)
Schema ische Da s ellung des Signalmoduls, das die Zellpola i ä on S. ce e isiae egulie . Rs 1-GTP
ek u ie und ak i ie den GEF Cdc24, was zu Ak i ie ung on Cdc42 üh . Cdc24, Cdc42-GTP
und de Effek o Cla4 in e agie en mi dem Ge üs p o ein Bem1. B) Übe sich übe die Regula o en
und Effek o en on Cdc42 in S. ce e isiae. GEF: gelb, GAP: o ange, GDI: o , PAK: blau, Fo min:
g ün, CRIB-P o ein: b aun, Exozys : iole . Modifizie nach (Pe ez and Rincón, 2010).
12
1 Einlei ung
dabei mi de sogenann en Cdc42/Rac1 in e ak i en Bindungs-Domäne (CRIB) on
S e20 und Cla4. Dies üh zu Au hebung eine in amolekula en Inhibi ionss uk u ,
wodu ch die C- e minale Kinasedomäne ak i wi d (Lamson e al., 2002). Ak i es Cla4
phospho ylie Cdc24 (Gulli e al., 2000). Ob diese beobach e e Cla4-abhängige Phos-
pho ylie ung on Cdc24 eine biologische Funk ion ha , is jedoch unkla . Es wu de
pos ulie , dass diese Modi ika ion die Ak i i ä des GEFs s imulie und dami zu ei-
ne Ve s ä kung de Cdc42 Ak i ie ung üh (I azoqui e al., 2003; Kozubowski e al.,
2008). Ein ande es Modell geh da on aus, dass die Phospho ylie ung des GEFs zu Dis-
sozia ion on Cdc24 und Bem1 üh und das diese nega i e Rückkopplungs-Regula ion
dem Wechsel om apikalen zum iso open Wachs um dien (Bose e al., 2001). Alle die-
se Theo ien wu den jedoch du ch die Beobach ung in F age ges ell , dass ein S amm,
de eine Va ian e on Cdc24 exp imie , in de alle du ch Massenspek ome ie iden i-
izie en Phospho ylie ungss ellen mu ie sind, keine o ensich lichen De ek e au weis
(Wai e al., 2009).
Cla4 und S e20 egulie en das Ak inzy oskele e mu lich übe die Phospho ylie ung
und Ak i ie ung de Typ1 Myosine Myo3 und Myo5, die als Ak i a o en des Ak in po-
lyme isie enden A p2/3 (ac in- ela ed p o ein 2/3) Komplexes bekann sind (Lechle
e al., 2001; Wu e al., 1996a, 1997) (Abb. 1.8 B). Das Fo min Bni1, das die Bildung
on Ak in ilamen en s imulie , kann neben Rho1 und Rho3 auch mi Cdc42 in e agie-
en (Dong e al., 2003). Du ch Cdc42 wi d Bni1 an die Knospenspi ze ek u ie , on
de aus es die Ak inpolyme isa ion auslös und einen wei e en Ak i a o des A p2/3
Komplexes, Bee1, ek u ie (Bu e y e al., 2007; Dong e al., 2003; Lechle e al.,
2001) (Abb. 1.8 B). Als wei e e In e ak ionspa ne on Cdc42 konn en in de Bäcke -
he e die CRIB-en hal enden P o eine Gic1 und Gic2 iden i izie we den, die an de
Rek u ie ung on Sep inen an die Knospungss elle be eilig sind (B own e al., 1997;
Iwase e al., 2006). Auch konn e eine In e ak ion on Cdc42 mi eine Un e einhei des
Exozys Komplexes, Sec3, gezeig we den (Zhang e al., 2001) (Abb. 1.8 B).
In S. ce e isiae wi d die GTPase Ak i i ä on Cdc42 du ch ie GAPs, Rga1, Rga2,
Bem2 und Bem3 egulie (Abb. 1.8 B). Einzeldele ionen de GAPs sind lebens ähig
und zeigen keine g a ie enden mo phologischen De ek e (Zheng e al., 1994; Wang and
B e sche , 1995; Smi h e al., 2002). Es konn e jedoch gezeig we den, dass bem3 / ga1
Doppelmu an en einen De ek in de Knospenmo phologie au weisen, was ü eine übe -
lappende Funk ion de GAPs sp ich (Smi h e al., 2002; Ca is on e al., 2003). Fü
Rga1 wu de zudem besch ieben, dass de GAP eine „Zone de Inhibi ion“ on Cdc42 an
de al en Zell eilungss elle kons i uie , die eine e neu e Knospung an de S elle e hin-
de (Tong e al., 2007). Bem2 und Bem3 akkumulie en an O en, wo pola es Wachs um
s a inde , und ih e Ak i i ä wi d zellzyklusabhängig du ch Cdc28-abhängige Phos-
pho ylie ung nega i egulie (Knaus e al., 2007).
13
1 Einlei ung
Die Lokalisa ion on Cdc42, Cdc24 und Bem1 is in S. ce e isiae seh dynamisch
(Wedlich-Söldne e al., 2004). Cdc42 weis eine zügige Di usions a e in de Memb an
au (0.036 µm2/s) (Ma co e al., 2007) und die Zelle b auch deshalb e izien e Mecha-
nismen, um eine s abile Kappe on ak i em Cdc42 an S ellen pola isie en Wachs ums
au ech zue hal en. Da ü wu den zwei Wege besch ieben (Slaugh e e al., 2009). De
GDI Rdi1 kons i uie den e s en, di usionskon ollie en, schnellen Weg. De zwei e,
langsame e Weg, geschieh du ch Endozy ose und anschließende Sek e ion (Slaugh e
e al., 2009).
Regula o en und E ek o en on Cdc42 in S. pombe
In S. pombe is im Gegensa z zu S. ce e isiae das Mik o ubuli (MT) Zy oskele ü
die Pola i ä de Zellen seh wich ig (Cas agne i e al., 2007; Ma in, 2009). Die pola-
i ä se ablie enden P o eine Tea1, Tea3 und Tea4 agg egie en an S ellen, wo die MTs
in Kon ak mi dem Zellko ex s ehen, was e mu lich den O des pola en Wachs ums
bes imm (Te enna e al., 2008; Minc e al., 2009). Dahe üh de Ve lus on Tea1
zu ein monopola wachsenden Zellen (Ma a and Nu se, 1997). Tea3 und Tea4 haben
eine Funk ion bei dem MT abhängigen T anspo on Tea1 zu den Plus-Enden de
MTs, wo es du ch In e ak ion mi dem memb anassoziie en P o ein Mod5 e anke
wi d (Snai h e al., 2005; Snai h and Sawin, 2003) (Abb. 1.9 A). Tea4 e mi el zudem
die In e ak ion on Tea1 und dem Fo min Fo 3 (Feie bach and Chang, 2001; Ma in
e al., 2005). Die Pola isie ung des Ak inzy oskele s is abhängig on Cdc42-GTP,
Bud6 und Fo 3 (Glynn e al., 2001; Ma in e al., 2007). Fo 3 in e agie dabei mi sei-
Cdc42
GTP
Scd1
Fo 3
Ras1
Scd2
Tea1
Bud6
Mod5
Pola esSpi zenwachs um
Ak inzy oskele
Reo ganisa ion
Scd1
Rga4
Rdi1
Shk2Shk1 Fo 3
Cdc42
BGe 1
MAPK
In eg i ä skon olle
Ak in ilamen
Au bau
Phe omon
An wo
Ak in-
polyme isa ion
Zell-
in eg i ä s-
an wo
MAPK
A
Abbildung 1.9: Regula o ische P o eine und E ek o en on Cdc42 in S. pombe.A) Sche-
ma ische Da s ellung des Signalmoduls, das die Zellpola i ä on S. pombe egulie . Tea1 wi d du ch
In e ak ion mi Mod5 an de Zellspi ze e anke und ek u ie Fo 3. Fo 3 in e agie mi Bud6 und
Cdc42-GTP. Cdc42 wi d du ch Scd1 ak i ie . Scd2 ungie als Ge üs p o ein ü Scd1 und Cdc42.
B) Übe sich übe die Regula o en und Effek o en on Cdc42 in S. pombe. GEF: gelb, GAP: o ange,
GDI: o , PAK: blau, Fo min: g ün. Modifizie nach (Pe ez and Rincón, 2010).
14
2 E gebnisse
2.1 Die Ak i i ä des Cdc24/Rac1/Cla4/Bem1
Signalmoduls wi d wäh end des pola en Wachs ums
on Us ilago maydis du ch eine nega i e
Rückkopplungsschlei e egulie
2.1.1 Ein Signalmodul aus Cdc24, Rac1, Cla4 und Bem1 egulie
das pola e Wachs um in U. maydis
Die mo phologische T ansi ion on de Knospung zum ilamen ösen Wachs um is in U.
maydis on de kleinen GTPase Rac1 und ih em E ek o , de PAK-ähnlichen Kinase
Cla4 abhängig (Le eleki e al., 2004; Mahle e al., 2006). Die Übe exp ession on Rac1
is aus eichend, um in haploiden Zellen ilamen öses Wachs um zu induzie en (Mahle
e al., 2006) (Abb. 2.1 A). In e essan e weise esul ie e die Übe exp ession on Cla4
nich in eine Filamen induk ion (Abb. 2.1 A). Dies kann en wede dahe üh en, dass
die Menge an Cla4 kein limi ie ende Fak o is , ode dass die Übe exp ession on Cla4
nich zu einem e höh en Ni eau an ak i e Kinase üh . Die zwei e Hypo hese kann
als ich ig angesehen we den, da be ei s die schwache Übe exp ession on kons i u-
i ak i em Cla4∆CRIB in de Lage wa , ilamen öses Wachs um zu induzie en (siehe
Abb. 2.1 A). Auch die Übe exp ession des Dbl-Familien Guaninnukleo id Aus ausch-
ak o s (GEFs) Cdc24 esul ie e in de Ausbildung on Filamen en (Abb. 2.1 A). Um
die epis a ischen Beziehungen on Cdc24, Rac1 und Cla4 zu un e suchen, wu de de
po en ielle Rac1-GEF Cdc24 in Dele ionsmu an en on ac1 und cla4 übe exp imie .
Die Filamen induk ion wu de du ch Au op en au ak i kohlehal iges Fes medium ge-
es e , wo sie zu eine weißen, pelzigen Kolonieobe läche üh . Die Übe exp ession
on Cdc24 induzie e wede in ∆ ac1, noch in ∆cla4 Mu an en ilamen öses Wachs um
(Abb. 2.1 B), was da au hindeu e , dass Cdc24 in eine Signalkaskade obe halb on
Rac1 und Cla4 agie (siehe Abb. 2.1 C).
Die Übe exp ession des U. maydis Homologs des Ge üs p o eins Bem1, das in S. ce e-
isiae als In e ak ionspla o m ü das Cdc24/Cdc42/Cla4 Signalmodul ungie (Pe-
e son e al., 1994; Bose e al., 2001), üh e eben alls zum ilamen ösen Wachs um
(Abb. 2.1 A). Auch das du ch Bem1 induzie e Filamen wa on Rac1 und Cla4 ab-
21

2 E gebnisse
Cdc24
Rac1
Cla4
Bem1
pola esWachs um
Übe exp ession
Cdc24 Bem1
B
WT
Ä ac1
Äcla4
Cdc24
Cla4
Cdc42
Cla4ÄCRIB
Rac1
Bem1
A
C
Übe exp ession:
Abbildung 2.1: Eine du ch Bem1 koo dinie e linea e Signalkaskade egulie die Zellpola-
i ä in U. maydis.A) Phäno yp on Zellen, die Cdc24, Cdc42, Rac1, Cla4, Cla4∆CRIB ode Bem1
übe exp imie en. Die Zellen wu den in Flüssigmedium un e induzie enden Bedingungen angezogen.
Die Zellwände wu den mi „Calcofluo -Weiss“ ange ä b . Knospende Zellen weisen ein cha ack e is-
isches Doppelsep um zwischen Mu e - und Toch e zelle au . Filamen öse Zellen zeigen Re ak ions-
sep en am dis alen Ende. De G ößens anda d ep äsen ie 10 µm. B) Epis asis Analyse on cdc24,
bem1, ac1 und cla4. Wild yp, ∆ ac1 und ∆cla4 Zellen, die en wede Cdc24 ode Bem1 übe exp i-
mie en, wu den au induzie endes ak i kohlehal iges Fes medium au ge op . Filamen bildung wi d
du ch das weisse Lu mycel an de Kolonieobe fläche angezeig . C) Schema ische Übe sich übe die
Signalkaskade, die die Zellpola i ä in U. maydis kon ollie . Bem1 agie dabei als Ge üs p o ein,
das die In e ak ionen zwischen GEF, GTPase und Effek o e mi el .
hängig (Abb. 2.1 B). Es wa leide nich möglich, die Funk ion on Bem1 wäh end des
du ch die Übe exp ession on Cdc24 ode Rac1 induzie en ilamen ösen Wachs ums zu
un e suchen, da eine kondi ionale Mu an e, die bem1 un e de Kon olle des du ch A a-
binose induzie ba en c g P omo o s exp imie e, un e ep essi en Bedingungen nich
lebens ähig wa . Nach Deple ion a e ie en die bem1 Mu an en als kleine Zellen mi
s a k eduzie e Pola i ä (nich gezeig ).
Da die Epis asisanalyse da au hindeu e e, dass in U. maydis eine du ch Bem1 e mi -
el e Signalkaskade on Cdc24, Rac1 und Cla4 das pola e Wachs um egulie , wu de
die Lokalisa ion de Komponen en übe p ü . Um die Lokalisa ionen on Cdc24 und
Cla4 zu un e suchen, wu den unk ionelle C- e minale GFP-Fusionen he ges ell und
ek opisch in cdc24, bzw. cla4 Mu an en kons i u i exp imie . Im Falle on Bem1
wa nu die N- e minale Fusion unk ionell und in de Lage, eine Bem1 Deple ion zu
komplemen ie en. Cdc24-GFP, GFP-Bem1 und Cla4-GFP akkumulie en sowohl an de
Knospenspi ze, als auch an de Spi ze on induzie en Filamen en (Abb. 2.2 A). Diese
22
2 E gebnisse
Cdc24-GFP
AB31induzie
GFP-Bem1
AB31induzie
AB31induzie
Cla4-GFP
0
50
150
100
200
ela i eGFP-Fluo eszenz
13
2
Cdc24
Cdc24ÄPB1
13
2
0
50
150
100
200
ela i eGFP-Fluo eszenz
WT
Ä ac1
Cdc24 Cdc24ÄPB1
WT Ä ac1
Bem1
WT
cdc24
Cla4
Cdc24
Bem1
Äcla4 bem1
cdc24
bem1
Äcla4
Cdc24 Cla4
Bem1
0
50
150
100
200
ela i eGFP-Fluo eszenz
13
2 1 3
2 1 3
2
1
2
3
B C
D E Bem1
A
Abbildung 2.2: Cdc24, Bem1 und Cla4 lokalisie en in koope a i e Weise an de po-
la wachsenden Spi ze.A) Lokalisa ion de GFP-Fusionen on Cdc24, Bem1 und Cla4 in knos-
penden Zellen und in Filamen en, die du ch die Übe exp ession des he e odime en bW2/bE1 T an-
sk ip ions ak o s induzie wu den. De G ößens anda d ep äsen ie 10 µm. Die Inse ionen zeigen
die Knospenspi zen in s ä ke e Ve g öße ung. B) Rep äsen a i e Akkumula ionen on Cdc24-GFP,
GFP-Bem1 und Cla4-GFP an den Zellspi zen on cdc24,cla4 und bem1 Mu an en. C) Die GFP-
Fluo eszenz wu de in den in (B) gezeig en Zellen en lang eine longi udinalen Achse, die die Zellspi ze
du chschneide , gemessen. Die In ensi ä sdiag amme esul ie en aus den Mi elwe en on 5 Messun-
gen. Die GFP-Fluo eszenz is in ela i en Einhei en angegeben. Die P eilspi zen zeigen die Posi ion
en lang de Achse an. D) Ve gleich de Lokalisa ion on Cdc24-GFP und Cdc24∆PB1-GFP an de
Knospenspi ze on wild yp Zellen. Die GFP-Fluo eszenz wu de wie in (C) besch ieben gemessen. E)
Lokalisa ion on GFP-Bem1 in wild yp und in ∆ ac1 Zellen. Die In ensi ä sdiag amme wu den wie
in (C) he ges ell .
23
2 E gebnisse
Spi zenlokalisa ion and in koope a i e Weise s a . Bei Deple ion on Bem1 wa we-
de eine Akkumula ion on Cdc24-GFP, noch eine on Cla4-GFP zu beobach en (Abb.
2.2 B und C). In Abwesenhei on Cdc24 konn e GFP-Bem1 und somi auch Cla4-GFP
nich an de Spi ze lokalisie en (Abb. 2.2 B und C). In S. ce e isiae in e agie en Cdc24
und Bem1 übe ih e C- e minalen PB1-Domänen (Bose e al., 2001; Kozubowski e al.,
2008)(Abb. 2.3 A). Die Spi zenakkumula ion on Cdc24-GFP wa on de Anwesenhei
de C- e minalen PB1-Domäne abhängig (Abb. 2.2 D), wo aus olg , dass eine In e -
ak ion mi Bem1 ü die pola e Lokalisa ion no wendig is . In Abwesenhei on Rac1
wa keine Akkumula ion on GFP-Bem1 an de Zellspi ze zu de ek ie en (Abb. 2.2 E),
was da au hindeu e , dass die In e ak ion mi de GTPase ü die Lokalisa ion des
Signalmoduls eine en scheidende Rolle spiel . Vo s ellba is , dass de P enylanke on
Rac1 benö ig wi d, um eine s abile Lokalisa ion des Komplexes an de Memb an zu
gewäh leis en.
Um die Komplexbildung on Cdc24, Rac1, Cla4 und Bem1 di ek zu es en, wu -
den Kop äzipi a ionsexpe imen e du chge üh . Dazu wu den aus E. coli au ge einig e
Rac1-Fusionsp o eine genu z (Abb. 2.3 C), die mi GDP ode nich spal ba em GTPγS
beladen und anschließend mi U. maydis P o einex ak en inkubie wu den. In einem
e s en Expe imen wu den Ex ak e on S ämmen genu z , die Cdc24-GFP, Cla4-GFP
ode GFP-Bem1 einzeln übe exp imie en. Inak i es Rac1-GDP zeig e eine hohe A ini-
ä zu Cdc24 und keine A ini ä zu Bem1 (Abb. 2.3 D). Zudem konn e eine seh ge inge,
abe ep oduzie ba e A ini ä on Rac1-GDP ü Cla4 es ges ell we den (Abb. 2.3 D).
Ak i es Rac1-GTPγS wa nich in de Lage, Cdc24 zu p äzipi ie en, ha e abe hohe
A ini ä zu Cla4 und Bem1 (Abb. 2.3 D). Die posi i e In e ak ion zwischen ak i em
Rac1-GTPγS und Cla4 wa dabei on de CRIB-Domäne on Cla4 abhängig (Abb. 2.3
G). Wenn dominan nega i es GST-Rac1T17N (S acey e al., 1991) ode dominan ak i-
es NusA-6xHis-Rac1Q61L (Ziman e al., 1991) zu Kon olle genu z wu den, e hiel en
sie sich in ih en A ini ä en e gleichba zu GST-Rac1-GDP, bzw. GST-Rac1-GTPγS
(Abb. 2.3 D). Im olgenden Expe imen wu den alle In e ak ionspa ne on Rac1 in
paa weisen Kombina ionen ge es e . In de Anwesenhei on Cdc24 wa eine schwache
In e ak ion on Rac1-GDP und Bem1 zu de ek ie en. Umgekeh üh e die Anwe-
senhei on Bem1 zu eine Kop äzipi a ion on Cdc24 mi Rac1-GTPγS, die on de
C- e minalen PB1-Domäne on Cdc24 abhängig wa (Abb. 2.3 E und F). Diese Da-
en weisen au die Bildung eines e nä en Komplexes on Cdc24, Rac1 und Bem1 hin.
Die Kop äzipi a ion on Bem1 und Cla4 mi Rac1-GTPγS könn e auch dahe üh en,
dass ak i es Rac1 mi beiden P o einen einzeln in e agie en kann. Jedoch weis die Ko-
p äzipi a ion on Bem1 und mu ie em Cla4∆CRIB, das selbs nich meh mi Rac1
in e agi en kann, au einen e nä en Bem1/Rac1/Cla4 Komplex hin (Abb. 2.3 E und
G). Die Bildung eines Cdc24/Rac1/Bem1/Cla4 Komplexes konn e du ch Kop äzipi a i-
24
2 E gebnisse
NusA-6His
NusA-6His-Rac1Q61L
Cdc24
Cla4
Bem1
GST-Rac1GDP
GST
GST-Rac1GTPãS
GST-Rac1GDP
GST
GST-Rac1GTPãS
GST-Rac1GDP
GST
GST-Rac1GTPãS
GST-Rac1GDP
GST
GST-Rac1GTPãS
GST-Rac1
GST
NusA-6His-Rac1
NusA-6His
Cdc24-GFP
Cla4-RFP Cdc24-GFP
Myc-Bem1
Cla4-RFP
Myc-Bem1
Cdc24-GFP
Cla4-RFP
Myc-Bem1
GST-Rac1
GST
GST-Rac1T17N
GST
á-GFP
á-RFP
á-Myc
Cdc24
Bem1
Cla4
GST-Rac1GDP
NusA-6His
NusA-6His-Rac1Q61L
GST
GST-Rac1GTPãS
GST-Rac1T17N
GST
Cdc24-GFP
Cla4-GFP
GFP-Bem1
á-GFP
á-GFP
á-GFP
Cdc24ÄPB1
Bem1
GST-Rac1GDP
GST
GST-Rac1GTPãS
Cla4ÄCRIB
Bem1
GST-Rac1GDP
GST
GST-Rac1GTPãS
GST-Rac1GDP
GST
GST-Rac1GTPãS
Cla4
Bem1
ÄCRIB-RFP
Myc-
Cla4ÄCRIB-RFP
Cdc24ÄPB1-GFP
Myc-Bem1
á-GFP
á-Myc
á-RFP
á-Myc
C E
D
F G
GDP GTP
B
A
Bem1
Cla4
Cdc24
Bem1
Cla4
Cdc24
Rac1 Rac1
Kinase
CH DH PH PB1
PX
SH3
SH3
PB1
Cdc24
Bem1
PH
Cla4
PxxPPxxP CRIB
685
714
1102
Abbildung 2.3: Bem1, Cdc24, Rac1 und Cla4 bilden einen Mul ip o einkomplex.A) Do-
mänens uk u on U. maydis Cdc24, Bem1 und Cla4. Cdc24 en häl eine Calponin-Homologie (CH),
eine Dbl-Homologie (DH), eine Plecks in-Homologie (PH) und eine C- e minale Phox und Bem1
Domäne (PB1). Bem1 um ass zwei N- e minale SH3-Domänen, eine zen ale Phox-Homologie (PX)
und eine C- e minale PB1-Domäne. Cla4 beinhal e eine N- e minale PH-Domäne, eine „Cdc42 und
Rac1 in e ak i e Bindungs-“ Domäne (CRIB), meh e e PxxP Mo i e, die mi SH3-Domänen in e -
agie en können und eine C- e minale Kinase-Domäne. B) Schema ische Da s ellung alle du ch Ko-
p äzipi a ion de eck ie en In e ak ionen. Die schwa zen du chgezogenen Linien ep äsen ie en s a ke,
die g auen ges ichel en Linien schwache In e ak ionen. C) Wild yp GST-Rac1, dominan nega i es
GST-Rac1T17N und dominan ak i es NusAHis6-Rac1Q61L wu den in E. coli exp imie und du ch
Affini ä s-Ch oma og aphie ge einig . P o einp oben wu den in einem SDS-Gel au ge enn , au ei-
ne PVDF Memb an übe agen und übe Ponceau-S Fä bung nachgewiesen. GST und NusA-His6
dien en als Kon olle. D) Fü die Kop äzipi a ionen wu de GST-Rac1 mi GDP ode nich hyd o-
lisie ba em GTPγS beladen. GST-Rac1T17N und NusA-His6-Rac1Q61L wu den ohne küns liche Be-
ladung eingese z . Gleiche An eile de GTPasen wu den mi U. maydis P o inex ak en on Zellen
inkubie , die GFP-ma kie e Ve sionen on Cdc24, Cla4 ode Bem1 übe exp imie en. Die Komple-
xe wu den mi Hil e on Glu a hion-Aga ose (GST-Rac1 and GST-Rac1T17N) ode Nickel-Sepha ose
(NusA-His6-Rac1Q61L) p äzipi ie , im SDS-Gel au ge enn und au eine PVDF Memb an ans e-
ie . Cdc24-GFP, Cla4-GFP und GFP-Bem1 wu den mi Hil e eines monoklonalen GFP-An ikö pe s
nachgewiesen. E) Die gezeig en Kop äzipi a ionen wu den wie in (D) besch ieben du chge üh , je-
doch mi P o einex ak en, die en wede paa weise Kombina ionen on Cdc24-GFP, Cla4-RFP und
Myc-Bem1 en hiel en, ode alle d ei Fusionsp o eine gemeinsam. F) Gezeig sind Kop äzipi a ionen
mi Ex ak en, die Myc-Bem1 und Cdc24∆PB1-GFP en hiel en. G) Kop äzipi a ionen mi Ex ak en,
die en wede Cla4∆CRIB-RFP alleine, ode in Kombina ion mi Myc-Bem1 en hiel en.
25
2 E gebnisse
on on Cdc24, Bem1 und Cla4 in einem Ansa z mi Rac1-GTPγS gezeig we den (Abb.
2.3 E). In e essan e weise konn e die Komplexbildung auch mi Rac1-GDP nachgewie-
sen we den, wenn auch mi ge inge e A ini ä (Abb. 2.3 E).
Du ch Epis asisanalyse, Kolokalisa ionss udien und Kop äzipi a ionsexpe imen e konn-
e bes ä ig we den, dass ein Mul ip o einkomplex bes ehend aus dem GEF Cdc24, de
GTPase Rac1, de Kinase Cla4 und dem in e ak ions e mi elnden P o ein Bem1 das
pola e Wachs um in U. maydis kon ollie . Die nach olgenden Expe imen e konzen-
ie en sich au die dynamische Regula ion de Ak i i ä dieses Signalmoduls.
2.1.2 Das K euzungs yp-abhängige ilamen öse Wachs um on U.
maydis basie au de Cdc24-abhängigen Ak i ie ung on
Rac1
Um die P lanze in izie en zu können, bilde U. maydis ein dika yo isches Filamen .
Haploide Spo idien mi un e schiedlichem aund bPaa ungs yp nehmen einande au
de P lanzenobe läche wa und bilden Paa ungshyphen en lang des Phe omong adi-
en en aus, die an de Spi ze usionie en (Abb. 2.4 A)(Banue and He skowi z, 1989;
Sne selaa e al., 1996). Die olgende Bildung und das Wachs um des dika yo ischen
Filamen s wi d du ch den mul iallelischen b-Locus egulie , de ü ein Paa Homeo-
domänen P o eine, bW und bE, kodie . Diese P o eine können ein He e odime bilden,
wenn sie on un e schiedlichen b-Loci s ammen und so als T ansk ip ions ak o ungie-
en (Kämpe e al., 1995). Die Übe exp ession eines solchen unk ionalen bW2/bE1
He e odime s un e de Kon olle des induzie ba en c g P omo o s (Abb. 2.4 B), is in
dem S amm AB31 aus eichend, um ilamen öses Wachs um zu induzie en (B achmann
e al., 2001).
Obwohl be ei s iele Gene iden i izie we den konn en, die du ch den b-T ansk ip ions-
ak o egulie we den (B achmann e al., 2001; Heimel e al., 2010a,b; Wahl e al.,
2010), is de genaue molekula e Mechanismus de Filamen induk ion noch nich au -
geklä . Wie be ei s im o he igen Abschni e wähn , häng das Wachs um des U.
maydis Filamen s on Rac1 ab. Die Exp ession des ac1 Genes wi d jedoch nich om
bW/bE He e odime beein luss (Mahle e al., 2006). Es is dahe anzunehmen, dass
es du ch b-Induk ion zu S imula ion de Ak i i ä on Rac1 komm . Da um wu de
die Menge an ak i em Rac1-GTP o und nach de Induk ion on bW2/bE1 in dem
S amm AB31 bes imm . Zu besse en De ek ion wu de die GTPase am genomischen
Locus mi einem d ei achen HA-Epi op e sehen Abb. 2.4 B). Zu P äzipi a ion de
ak i en GTPase wu de die CRIB-Domäne de PAK Kinase Smu1 (Smi h e al., 2004)
genu z , die selek i an die ak i en Fo men on Rac1 und Cdc42 binde (Le eleki e al.,
2004). Un e induzie enden Bedingungen üh e die Übe exp ession on bW2/bE1 zu
26

2 E gebnisse
0 %
50%
100%
150%
200%
250%
300%
350%
3xHA-Rac1-GTP
Coomassie
P äzipi a ion
GST-CRIB
3xHA-Rac1gesam
Einsa z
Cdc42gesam
Tub1
Cdc42-GTP
0.0
1.0
3.0
Cdc42-GTP
Rac1-GTP
C
-+-+-+
WT bE1/bW2 Cdc24
2.0
-+-+-+
WT bE1/bW2 Cdc24
a1b1/a2b2
a2b2
a1b1
dika yo ischesFilamen
haploideknospendeZellen
Zellpaa ung
A
B
Pc g Pc g
bW2 bE1
P ac1
ac1
3xHA
CRIB-P äzipi a ion
ela i eKonzen a ion
Abbildung 2.4: Die Filamen induk ion üh zu einem e höh en Le el on ak i em Rac1-
GTP.A) Schema ische Da s ellung de mo phologischen T ansi ion on U. maydis. Haploide Zellen
un e schiedlichen K euzungs yps (a1b1 und a2b2) usionie en an de Spi ze um eine dika yo ische
Hyphe zu bilden. B) De S amm AB31 exp imie ein ak i es Dime aus bW2 und bE1 un e de
Kon olle des induzie ba en c g P omo o s. Zu besse en De ek ion wu de ac1 am genomischen Lo-
cus mi einem d ei achen HA-Epi op e sehen. C) De e mina ion de Menge an ak i em Rac1-GTP
und Cdc42-GTP be o (-) und ie S unden nach de Induk ion (+) des he e odime en T ansk ip-
ions ak o s bE1/bW2 und des GEFs Cdc24. GST-CRIBSmu1 wu de in E. coli übe exp imie und
übe Affini ä s-Ch oma og aphie ge einig . Mi GST-CRIBSmu1 beladene GSH-Aga ose wu de mi
den U. maydis P o einex ak en inkubie . P äzipi ie e P o eine wu den au eine PVDF Memb an
ans e ie und du ch Immunode ek ion sich ba gemach . Das Diag amm zeig die Mi elwe e d eie
unabhängige Ve suche. Die S anda dabweichung wi d on den Balken ep äsen ie .
einem deu lich e höh en Ni eau on Rac1-GTP, nich jedoch on Cdc42-GTP (Abb.
2.4 C). In e essan e weise kam es du ch die Übe exp ession on Cdc24 zu einem e -
gleichba en Ans ieg de Menge an ak i em Rac1-GTP (Abb. 2.4 C). Die Ak i ie ung
on Rac1 wäh end de b-Induk ion des ilamen ösen Wachs ums schein dahe du ch
den GEF Cdc24 zu e olgen.
2.1.3 Die b-abhängige Filamen induk ion wi d du ch einen Abbau
on Cdc24 beglei e
Wie be ei s in Abschni (2.1.1) besch ieben, wu de eine C- e minale GFP-Fusion on
Cdc24 kons i u i exp imie , um die Lokalisa ion des GEFs in knospenden Zellen und
27
2 E gebnisse
bE1/bW2
AB31Ä ac1
cdc24-GFP
ppi
AB31
0h 0h 8h8h
AB
+bE1/bW2
0h 4h 8h
AB31 Ä ac1 AB31
D
bE1/bW2
AB31
0h 4h 8h2h 6h
bE1/bW2
AB31Ä ac1
Cdc24-GFP
Tub1
AB31
C
0h 0h 8h8h
Cdc24-GFP
Tub1
bE1/bW2
AB31Ä ac1
0h 4h 8h2h 6h +
-
Cdc42 Rac1
WT
+
-
cdc24-GFP
ppi
E
G
Cdc24-3xHA
Tub1
Rac1
WT +
-
Cdc42
WT -+
bE1/bW2
WT -+
+
-
Cdc42 Rac1
WT
+
-
Cdc24-GFP
Tub1
F
0h 2h 4h 6h 8h 10h 0h 10h
+ + + + + + - -
Cycloheximid
WT
0h 2h 4h 6h 8h 10h 0h 10h
+ + + + + + - -
D ac1
Cdc24-GFP
PonceauS
H
Abbildung 2.5: Cdc24 wi d wäh end de om b-K euzungs yp abhängigen Filamen in-
duk ion deg adie .A) Die Lokalisa ion on kons i u i exp imie em Cdc24-GFP wu de in den
S ämmen AB31 und AB31∆ ac1 e olg . DIC und GFP-Fluo eszenz Bilde wu den o (0 h) und
ie (4 h) und ach (8 h) S unden nach de Induk ion de bW2/bE1 Übe exp ession gemach . De
G ößens anda d ep äsen ie 10 µm. B) Analyse de cdc24-GFP mRNA Konzen a ion in den S äm-
men AB31 und AB31∆ ac1 be o (0 h) und nach de Induk ion (8 h) de bW2/bE1 Übe exp ession.
Die mRNA de kons i u i exp imie en Pep idyl-P olyl cis/ ans Isome ase (ppi) dien e als Ladekon-
olle. C) Bes immung de Cdc24-GFP P o einmenge in den selben U. maydis Kul u en die in (B)
zu cdc24-GFP mRNA Mengenbes immung genu z wu den. Ein monoklonale An ikö pe gegen GFP
wu de zum Nachweis on Cdc24 genu z . Tubulin (Tub1) dien e als Ladekon olle. D) Die Menge an
Cdc24-GFP wu de o (0 h) und zu meh e en Zei punk en (2 h, 4 h, 6 h, 8 h) nach de bW2/bE1 Induk-
ion bes imm . E) Analyse de cdc24-GFP mRNA Menge in kondi ionalen ac1 und cdc42 Mu an en,
die die GTPasen un e de Kon olle des c g P omo o s exp imie en. Die Zellen wu den un e nich -
induzie enden (-) und induzie enden Bedingungen (+) angezogen. F) Bes immung des Cdc24-GFP
P o ein Ni eaus in den selben Kul u en, die in (E) genu z wu den. G) Kon olle de P o einmenge
on Cdc24-3xHA, das un e de Kon olle des endogenen P omo o s exp imie wu de, in AB31 und
in kondi ionalen Mu an en on ac1 und cdc42. Die Zellen wu den un e nich induzie enden (-) und
induzie enden (+) Bedingungen angezogen. H) Inhibi ion de T ansla ion du ch Cycloheximid (100
µg/ml) in Kul u en des Wild yp und des ac1 Dele ionss ammes, die Cdc24-GFP un e de Kon olle
des e P omo o s kons i u i exp imie en.
28
2 E gebnisse
wäh end des ilamen ösen Wachs ums zu bes immen. Dabei akkumulie e Cdc24-GFP
an de Knospenspi ze und an de Spi ze de Filamen e ku z nach de Induk ion de
bW2/bE1 Übe exp ession (Abb. 2.5 A)). Übe aschende weise nahm die In ensi ä de
Cdc24-GFP-Fluo eszenz wäh end des b-induzie en ilamen ösen Wachs ums d as isch
ab, obwohl die Exp ession de GFP-Fusion un e de Kon olle des kons i u i en e
P omo o s e olg e (Abb. 2.5 A). Die Analyse de mRNA Menge bes ä ig e, dass es
wäh end de bW2/bE1 Übe exp ession zu keine Ve ände ung des cdc24-GFP Ni eaus
kam (Abb. 2.5 B). Die Bes immung de Cdc24-GFP P o einmenge bes ä ig e hinge-
gen, dass das Cdc24-GFP Ni eau du ch die Übe exp ession des T ansk ip ions ak o s
d as isch eduzie wu de (Abb. 2.5 C). Die Abnahme de Cdc24 Konzen a ion begann
dabei o enba di ek nach de b-Induk ion, da be ei s nach zwei S unden Wachs um
un e induzie enden Bedingungen das Cdc24-GFP Ni eau um e wa die Häl e eduzie
wa (Abb. 2.5 D). Um einen möglichen Ein luss de kons i u i en Exp ession au den
beobach e en Ab all de Cdc24-GFP Konzen a ion auszuschließen, wu de cdc24 auch
am genomischen Locus mi einem d ei achen HA-Epi op e sehen. Auch das endogen
exp imie e Cdc24-3xHA wu de nach de b-Induk ion eduzie (Abb. 2.5 G). Die Ta -
sache, dass die Übe exp ession on bW2/bE1 auch die Ak i ie ung on Rac1 zu Folge
ha , üh e zu de Ve mu ung, dass die beobach e e pos ansk ip ionelle Regula ion
on Cdc24 du ch die Ak i ie ung on Rac1 ausgelös wi d. Eine Dele ion des ac1 Ge-
nes in dem S amm AB31∆ ac1 e hinde e sowohl die Filamen bildung, als auch die
nega i e Regula ion de Cdc24 Menge (Abb. 2.5 A und C). Die Übe exp ession on
Rac1 ha e hingegen eine des abilisie ende Wi kung sowohl au das ek opisch, als auch
au das endogen exp imie e Cdc24 P o ein, die mi de on bW2/bE1 e gleichba wa
(Abb. 2.5 F und G). Zusammen assend kann geschlossen we den, dass die Ak i ie ung
on Rac1 wäh end des ilamen ösen Wachs ums on U. maydis o enba zu eine nega-
i en Regula ion des GEFs Cdc24 üh .
Sowohl die S ä ke de GFP-Fluo eszenz, als auch die de ek ie e Menge an P o ein wa
im ∆ ac1 Hin e g und deu lich e höh (Abb. 2.5 A und C). Diese s abilisie ende E -
ek de Abwesenhei on Rac1, konn e auch bei endogen exp imie em Cdc24-3xHA
bes ä ig we den (Abb. 2.5 G). Dies weis da au hin, dass die Rac1-abhängige nega i e
Rückkopplungs-Regula ion sowohl wäh end des b-induzie en ilamen ösen Wachs ums,
als auch wäh end de Knospung de haploiden Zelle, die Menge an Cdc24 beein luss .
Wede die Dele ion, noch die Übe exp ession on cdc42 ha e einen E ek au die S abi-
li ä on Cdc24 (Abb. 2.5 F und G). Dies bes ä ig die Hypo hese, dass Cdc24 wäh end
des pola en Wachs ums als Rac1-GEF ungie . Um zu un e suchen, ob es sich bei de
Regula ion on Cdc24 um einen Abbau des GEFs handel , ode um eine Inhibi ion de
T ansla ion, wu de die T ansla ion du ch Zugabe on Cycloheximid im Wild yp und im
ac1 Dele ionss amm inhibie . Das kons i u i exp imie e Cdc24-GFP Ni eau begann
29
2 E gebnisse
nach Zugabe on Cycloheximid im Wild yp mi eine unge äh en Halbwe szei on ie
S unden abzu allen. Im ac1 Dele ionshin e g und blieb Cdc24-GFP hingegen wei ge-
hend s abil (Abb. 2.5 H). Dies zeig , dass es sich bei dem beobach e en Ab allen des
Cdc24 Ni eaus um einen Abbau des GEFs handel . Die Übe exp ession on dominan
nega i em Rac1T17N (S acey e al., 1991) ha e keine nega i en Auswi kungen au die
Menge an Cdc24 in de Zelle (Abb. 2.6 A). Dies weis da au hin, dass Rac1 du ch den
GEF ak i ie ba sein muss und somi de Übe gang om GDP- zum GTP-gebundenen
Zus and ü die nega i e Regula ion de Cdc24 Menge en scheidend is . Diese Schluss ol-
ANAUS
--
Rac1 AUS AN ANAUS
Cla4 -
+-
+
Cdc24-GFP
Tub1
C
Rac1Q61L
AUS AN
Cla4ÄCRIB
WT
Cdc24-3xHA
Tub1
Rac1T17N
AUS AN AUS AN
A
GFP
Tub1
Cdc24-GFP
B
Cdc24 -GFP
T285A
Bem1 ++ ++ ++
ANAUS
--
Cla4 CRIBDAUS AN ANAUS
Rac1 -
+-
+
Cdc24-GFP
Tub1
E
Bem1 ++ ++
++ PB1PB1
Cdc24
Bem1
Cla4 CRIBD
SH3
PxxP
N
CC
Cdc24
Abbau
PB1PB1
Cdc24
Bem1
Cla4*
SH3
PxxP
N
CC
Cdc24
Abbau
Rac1-GTP
D
F
Abbildung 2.6: Die nega i e Rückkopplungs egula ion on Cdc24 häng on de Bildung
eines unk ionalen Cdc24/Rac1/Cla4/Bem1 Signalmoduls ab.A) Bes immung des Einflusses
de Übe exp ession on Rac1Q61L, Rac1T17N und Cla4∆CRIB au das endogene Ni eau on Cdc24-
3xHA. Die Zellen wu den in nich induzie endem Medium angezogen (AUS) und anschließend ach
S unden in induzie endem Medium inkubie (AN). B) Ve gleich des P o einni eaus de dominan ne-
ga i en Va ian e Cdc24T283A mi dem on Wild yp Cdc24. Beide GFP-Fusionen wu den un e den glei-
chen Bedingungen kons i u i exp imie . C) De Effek de Rac1 Übe exp ession au die Cdc24-GFP
Konzen a ion wu de in de An- (+) und Abwesenhei (-) des Rac1 Effek o s Cla4 und des Ge üs -
p o eins Bem1 un e such . Dabei wu de Rac1 ek opisch in Wild ypzellen, in cla4 Dele ionsmu an en
und in eine kondi ionalen bem1 Mu an e übe exp imie . Die analysie en P oben wu den o (AUS)
und ach S unden nach de Rac1 Induk ion (AN) genommen. D) Ak i es Rac1-GTP b auch sowohl
Cla4, als auch Bem1 um den Abbau on Cdc24 zu induzie en. E) Die Menge an Cdc24-GFP wu de o
(AUS) und nach (AN) de Induk ion de Übe exp ession de kons i u i ak i en Kinase Cla4∆CRIB
in Wild yp Zellen, in ∆ ac1 Mu an en und in kondi ionalen bem1 Mu an en bes imm . Die Anzuch
de Kul u en e olg e wie in (A) besch ieben. F) Die kons i u i ak i e Kinase Cla4∆CRIB benö ig
die b ückenbildende Funk ion on Bem1 um Cdc24 dem Abbau zuzu üh en.
30
2 E gebnisse
sen Wachs ums ha , wu de die Cdc24* Va ian e im S amm AB31 endogen exp imie .
Zu einem Zei punk , als das P o einni eau on Wild yp Cdc24 du ch die b-Induk ion
be ei s um übe ün zig P ozen eduzie wa , wa die Menge an Cdc24* nu leich
nega i beein luss (Abb. 2.10 A). Dies deu e da au hin, dass die En e nung de
Phospho ylie ungss ellen in Cdc24* die nega i e Au o egula ion wäh end des ilamen-
ösen Wachs ums deu lich abschwäch . Die Exp ession des s abilisie en Cdc24* ha e
auch Auswi kungen au den Phäno yp de Zellen. Knospende Zellen wa en deu lich
länge und an den Knospenspi zen s ä ke abge unde . Auch de Zelldu chmesse wa
Mu an eCdc24*
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
WTCdc24
Mu an eCdc24*
A
+bE1/bW2 (4h)
WTCdc24
+bE1/bW2
0h 8h 0h 8h
Cdc24-3xHA
Tub1
0%
50%
100%
150%
0h
8h
1.5
0.0
0.5
1.0
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
0
5
10
15
20
25
0
1
2
3
4
5
Länge[ m]m
Länge[ m]m
Zellänge Zelldu chmesse
WT Cdc24
Mu an e Cdc24*
ela i eKonzen a ion
D E
BC
WT Cdc24
Mu an e Cdc24*
WT Cdc24
Mu an e Cdc24*
0,00%
20,00%
40,00%
60,00%
WTCdc24
Mu an eCdc24*
0%
P ozen uale Zellan eil
20%
40%
60%
kein Filamen
<10 m
m
10-20 mm
20-50 mm
>50 m
m
+bE1/bW2 (4h)
Filamen länge
0%
20%
40%
60%
80%
100%
keineSymp ome
An hocyanbildung
Chlo ose
kleineTumo e
g oßeTumo e
S amm umo e
n=153 n=159 n=166
FVi ulenz es :
WT Cdc24
1 2
Mu an eCdc24*
Abbildung 2.10: Die Exp ession eine s abilisie en Cdc24 Va ian e in e e ie mi de
Induk ion des ilamen ösen Wachs ums.A) Immunonachweis de Mengen on Cdc24 und Cdc24*
o (0 h) und nach (8 h) de Induk ion de bW2/bE1 Übe exp ession. Das Diag amm zeig die Quan i-
fizie ung de de ek ie en P o einmengen. Die G aphik esul ie aus den Mi elwe en d eie unabhän-
gige Ve suche. De Balken ep äsen ie die S anda dabweichung. B) E scheinungsbild on U. maydis
Zellen, die Cdc24 und Cdc24* am genomischen Locus als C- e minale Fusion mi 3xHA exp imie-
en. De G ößens anda d en sp ich 10 µm. C) Quan ifizie ung (n=50) de du chschni lichen Länge
und des Du chmesse s on Zellen, die Cdc24* am genomischen O exp imie en. D) Quan ifizie ung
(n=100) des p ozen ualen An eils de Zellen ohne Filamen und mi Filamen en de angezeig en Län-
gen (un e 10 µm, zwischen 10 und 20 µm, zwischen 20 und 50 µm und übe 50 µm) ie S unden nach
de Induk ion de bW2/bE1 Übe exp ession im Wild yp und in de Cdc24* Mu an e. E) Phäno yp
on AB31 Zellen, die die Cdc24* Mu an e am genomischen Locus exp imie en, ie S unden nach de
Induk ion de bW2/bE1 Übe exp ession. De G ößens anda d en sp ich 10 µm. F) Die G aphik zeig
das E gebnis eines Vi ulenz es s mi dem solopa hogenen S amm SG200. Neben dem Wild yp wu den
zwei unabhängige Cdc24* Mu an en ge es e . Die Symp ome sind du ch die in de Legende zugewie-
sene Fa be ep äsen ie . De p ozen uale An eil de Pflanzen mi den en sp echenden Symp omen an
de Gesam zahl is im Diag amm gezeig . Die Anzahl (n) de infizie en Pflanzen is übe den Balken
beziffe .
37

2 E gebnisse
signi ikan e g öße (Abb. 2.10 B). Besonde s he o zuheben is , dass die Exp ession
on Cdc24* mi de b-induzie en Filamen bildung in e e ie e. Sowohl die Anzahl,
als auch die Länge de du ch b-Induk ion gebilde en Filamen e wa in den mu ie en
Zellen d as isch eduzie (Abb. 2.10 D und E). Bei länge e b-Induk ion wa en jedoch
auch alle Cdc24* Zellen in de Lage, ein Filamen auszubilden. Um zu es en, ob sich
die deu lich e langsam e Filamen induk ion au die Vi ulenz on U. maydis auswi k ,
wu den P lanzenin ek ionen du chge üh . Hie bei zeig e sich, dass die Vi ulenz eines
Cdc24* exp imie enden S ammes im Ve gleich zum Wild yp eduzie wa . Wäh end
übe ach zig P ozen de mi dem Wild yp in izie en P lanzen deu liche Me kmale eine
U. maydis In ek ion au wiesen (z.B. S amm umo e und g oße Tumo e an den Blä e n),
zeig en nu ün ig P ozen de mi de Mu an e in izie en P lanzen schwache In ek i-
onsme kmale (Chlo ose und kleine Gallen an den Blä e n)(Abb. 2.10 F). Die Mu an e
wa auch in de Lage, wenn auch e zöge , au de P lanze App esso ien auszubilden
und in die P lanze einzud ingen (nich gezeig ). Dahe is anzunehmen, dass de ini ia-
le Sch i de In ek ion no mal ablau en kann, die eduzie e Vi ulenz jedoch on de
Ve zöge ung im In ek ionsp ozess he üh . Die P lanze hä e in diesem Fall meh Zei ,
den eind ingenden pa hogenen Pilz zu bekämp en.
2.2 Die Ak i i ä des Bem1/Rac1-GTP/Cla4
Signalmoduls wi d du ch GAP-Ak i i ä , den GDI
Rdi1 und ak in e mi el e Endozy ose au die
Filamen spi ze besch änk
2.2.1 D ei GTPase ak i ie ende P o eine egulie en wäh end des
pola en Wachs ums die Rac1-GTPase Ak i i ä
Es konn e gezeig we den, dass die Cla4- e mi el e Regula ion on Cdc24 ü das po-
la e Wachs um wäh end de Knospung und o allem ü die Induk ion on Filamen en
wich ig is . Aus diese Beobach ung e gab sich die F age nach de biologischen Funk-
ion des Cdc24 Abbaus. Die En e nung des GEFs aus dem Signalkomplex mi Bem1,
Rac1-GTP und Cla4 könn e dadu ch e klä we den, dass ein Ve bleiben on Cdc24 im
Modul ü die Inak i ie ung on Rac1-GTP und die anschließende Wiede e wendung
de Komponen en des Signalmoduls hinde lich wä e. Um diese Hypo hese nachzugehen,
muss en zunächs die GAPs ü Rac1 iden i izie we den. Dazu wu den die ka aly i-
schen Domänen alle zehn po en iellen U. maydis Rho-GAPs in Zellen übe exp imie ,
die eine Cdc24-GFP Fusion kons i u i exp imie en. D ei GAP-Domänen zeig en dabei
einen Ein luss au das Cdc24-GFP Ni eau (nich gezeig ). Es handel e sich dabei um
die U. maydis Homologe on Bem2 und Bem3 und ein U. maydis spezi isches mi Rac1
38
2 E gebnisse
WT
- Rip1
- Bem3
- Bem2
D D
ip1 bem3
D D
ip1 bem3 - Bem2
Zellänge (µm)
WT -Rip1 -Bem3 -Bem2 D D ip1 bem3 D D ip1 bem3-Bem2
Rac1 Rip1 Bem3 Bem2
Übe exp ession:
GAP
GAP
GAP
GEFGEF
Ras-spezi isch
PHPX
Bem2
Bem3
Rip1
2649
1149
987
bem2 gapD
0
5
10
15
20
25
30
bem2Dgap
D
E F
GST
GST-Rac1
GST-Rac1EN91/92HH
P o einex ak
GST
GST-Rac1-GDP
GST-Rac1-GTP Sg
GST-Rac1 -GDP
EN91/92HH
GST-Rac1 GTP Sg
EN91/92HH-
3xHA-Rip1(GAP)
3xHA-Bem3(GAP)
3xHA-Bem2(GAP)
B CA
Abbildung 2.11: D ei GTPase ak i ie ende P o eine (GAPs) haben Ein luss au die Zell-
pola i ä on U. maydis.A) Domänens uk u de d ei iden ifizie en Rac1-GAPs. Bem2 en häl
neben de C- e minalen Rho-GTPasen ak i ie enden Domäne (GAP) zwei Ras-GEF-Domänen. Bem3
um ass ausse de C- e minalen GAP-Domäne zwei lipidbindende Domänen, eine Phox (PX) und eine
Plecks in Homologie (PH) Domäne. In Rip1 konn en neben de GAP-Funk ion keine wei e en unk-
ionellen Domänen iden ifizie we den. B) Wild yp GST-Rac1 und mu ie es GST-Rac1EN91/92HH,
das nich meh mi GAPs in e agie en kann, wu den in E. coli exp imie und du ch Affini ä s-
Ch oma og aphie ge einig . P o einp oben wu den in einem SDS-Gel au ge enn und du ch Fä bung
mi „Coomassie B illian Blau“ nachgewiesen. GST dien e als Kon olle. C) Fü die Kop äzipi a ionen
wu de GST-Rac1 mi GDP ode nich hyd olisie ba em GTPγS beladen. Gleiche An eile de GTPasen
wu den mi U. maydis P o inex ak en on Zellen inkubie , die die 3xHA-ma kie en GAP-Domänen
on Rip1, Bem2 und Bem3 kons i u i exp imie en. Dime e aus Rac1 und den GAPs wu den mi Hil e
on Glu a hion-Aga ose p äzipi ie , im SDS-Gel au ge enn und au eine PVDF Memb an ans e-
ie . Die GAP Domänen wu den mi Hil e eines monoklonalen HA-An ikö pe s nachgewiesen. D)
Phäno yp on Zellen, in denen Rip1, Bem2 und Bem3 einzeln, ode in den angezeig en Kombina io-
nen abwesend sind. De G ößens anda d en sp ich 10 µm. E) Quan ifizie ung (n=50) de Zellänge
de in (D) gezeig en GAP Mu an en. Die S anda dabweichung is du ch die Balken angezeig . F) E -
scheinungsbild on Zellen, die Rac1, Rip1, Bem3 ode Bem2 übe exp imie en. Die Bilde wu den ach
S unden nach Induk ion de Übe exp ession au genommen. De G ößens anda d en sp ich 10 µm.
39
2 E gebnisse
GFP-Rip1:
GFP-Bem3:
GFP-Bem2:
Abbildung 2.12: Die Rac1-GAPs zeigen un e schiedliche Lokalisa ionsmus e . Gezeig is
die Lokalisa ion kons i u i exp imie e N- e minale GFP-Fusionen on Rip1, Bem3 und Bem2 in
Abwesenhei de en sp echenden Wild yp GAPs. Es wu den ep äsen a i e Zellen ohne und mi kleine
und g oße Knospe ausgewähl . Le z e e haben schon beide Sep en ausgebilde . De G ößens anda d
en sp ich 10 µm. (Die Pho os on Rip1-GFP wu den mi eundliche weise on Bjö n Sand ock zu
Ve ügung ges ell , die on Bem2-GFP on Anne e Baue )
in e agie endes P o ein, Rip1 genann (Abb. 2.11 A). Au ge einig es Rac1 wa in sei-
ne GTP-gebundenen ak i en Kon o ma ion in de Lage, die GAP-Domänen alle d ei
Kandida en zu p äzipi ie en (Abb. 2.11 C). Die In e ak ionen konn en du ch Ein üh-
ung on zwei Punk mu a ionen in Rac1EN91/92HH, die die Bindung on GAP-Domänen
e hinde n (Ri inge e al., 1997a; Wu e al., 2009), au gehoben we den (Abb. 2.11
C). Um die biologische Funk ion on Rip1, Bem2 und Bem3 zu un e suchen, wu den
kondi ionale Mu an en he ges ell , die das jeweilige Gen un e de Kon olle des c g
P omo o s am genomischen Locus exp imie en. Die Deple ionen on Rip1, Bem2 und
Bem3 üh en jeweils zu eine deu lichen Hype pola isie ung de Zellen (Abb. 2.11 D
und E). Im Falle on Bem2, das neben de GAP-Domäne noch zwei Ras-GEF Domänen
besi z , konn e du ch in e ne Dele ion de GAP-Domäne (bem2∆gap) gezeig we den,
dass de beobach e e Phäno yp au den Ve lus de GAP-Funk ion zu ückzu üh en is
(Abb. 2.11 D). Die kombinie en Mu a ionen on ip1 /bem3 und ip1 /bem3 /bem2
üh en nu zu eine leich en zusä zlichen Ve länge ung de Zellen im Ve gleich zu den
Einzeldeple ionen (Abb. 2.11 D und E). Die Übe exp ession de Rac1-GAPs üh e
40
2 E gebnisse
eben alls zu eine ges ö en Zellmo phologie, e bunden mi deu lichen Elonga ionen.
Dabei wa die beobach e e Zell e länge ung im Falle on Bem2 am s ä ks en und im
Falle on Bem3 am schwächs en ausgep äg (Abb. 2.11 F).
Sowohl du ch Deple ion, als auch bei Übe exp ession ha en Rip1, Bem2 und Bem3
Ein luss au die Pola isie ung de Zellen. Da aus kann ge olge we den, dass sie an de
Regula ion des pola en Wachs ums be eilig sind. In Zusammena bei mi Bjö n Sand-
ock und Anne e Baue wu de die Lokalisa ion de po en iellen Rac1-GAPs übe p ü .
Dazu wu de GFP-Rip1 in ∆ ip1 Zellen und GFP-Bem3 in eine ∆bem3 Mu an e kon-
s i u i exp imie . Bem2 wu de am genomischen O C- e minal an GFP usionie
und un e de Kon olle des e P omo o s übe exp imie . GFP-Rip1 zeig e Akkumu-
la ionen an de Spi ze kleine Knospen (Abb. 2.12). GFP-Bem3 agg egie e schon o
de Knospung an de Zellspi ze, wa abe auch an den Spi zen kleine und g oße Knos-
pen zu inden. Bem2-GFP zeig e eine seh schwache Lokalisa ion an de Zellmemb an
und an Endomemb anen (Abb. 2.12).
A
0 %
50%
1 0 0 %
1 5 0 %
2 0 0 %
2 5 0 %
3 0 0 %
3 5 0 %
4 0 0 %
KNO3
-
NH4
+
WT D ip1
Tub1
Cdc24
Dbem3 Dbem2
KNO3
-
NH4
+KNO3
-
NH4
+KNO3
-
NH4
+
bem1Pna
2,5
3,0
3,5
4,0
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
ela i eCdc24-Konzen a ion
0
5 0
100
150
200
250
300
350
400
450
500
A aGlu +
-+
-
WT ac1kond ip1kond
+
-
bem3kond
+
-
bem2kond
ela i eCdc24-Konzen a ion
2,5
3,0
3,5
4,0
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
4,5
5,0
0%
50%
100%
150%
200%
250%
bem2 GAPD
Dbem2
WT
2,0
2,5
1,5
1,0
0,5
0,0
ela i eCdc24-Konzen a ion
CB
Tub1
Cdc24
Tub1
Cdc24
Abbildung 2.13: Die Dele ion de Rac1-GAPs ha eine Bem1-abhängige s abilisie ende
Wi kung au die Cdc24 Konzen a ion.A) Ve gleich de Auswi kungen de Deple ion (-) und
Übe exp ession (+) on Rac1, Rip1, Bem3 und Bem2 au die Menge an Cdc24. Cdc24 wu de in kondi-
ionalen Mu an en on ac1, ip1,bem3 und bem2, die das en sp echende Gen un e de Kon olle des
c g P omo o s exp imie en, am genomischen locus mi 3xHA ma kie . Die S ämme wu den in Glu-
kose (-) und A abinose (+) hal igem Flüssigmedium angezogen. Die G aphik zeig die Mi elwe e und
die S anda dabweichung d eie unabhängige Ve suche. B) Ve gleich de Cdc24-3xHA Menge in Wild-
yp Zellen, in bem2 Dele ions- und in bem2∆GAP Mu an en. Mi elwe e und S anda dabweichung
on d ei Ve suchen sind gezeig . C) Auswi kungen eines e höh en Bem1 Ni eaus au den s abilisie en-
den Effek de Deple ionen on ip1,bem3 und bem2. Bem1 wu de ek opisch un e de Kon olle des
ni a induzie ba en na P omo e s in den GAP Mu an en exp imie . Die Kul u en wu den in am-
moniumhal igem (NH4+) Flüssigmedium angezogen und in ni a hal igem (KNO3-) ü sechs S unden
induzie . Die G aphik zeig Mi elwe und S anda dabweichung on d ei Expe imen en.
Um zu übe p ü en, ob de beobach e e E ek de GAP Deple ionen und Übe exp es-
sionen au die Zellpola i ä sich auch au die Cdc24 P o eins abili ä auswi k , wu de
Cdc24-3xHA un e de Kon olle des endogenen P omo o s in kondi ionalen ip1,bem3
und bem2 Mu an en exp imie . Deple ion de Rac1-GAPs ha e einen deu lichen posi-
i en E ek au die Cdc24 P o eins abili ä (Abb. 2.13 A). Dabei wa das Cdc24-3xHA
41
2 E gebnisse
Ni eau im Ve gleich zum Wild yp in Abwesenhei on Rip1 bis au übe d eihunde
P ozen e höh , wohingegen es in Abwesenhei on Bem3 und Bem2 nu au einen We
on übe zweihunde P ozen , bzw. übe hunde ün zig P ozen e höh wa (Abb. 2.13
A). De s abilisie ende E ek de Bem2 Deple ion üh e on de Abwesenhei seine
GAP-Funk ion he (Abb. 2.13 B). In e essan e weise konn e das du ch die Deple ion
de GAPs s abilisie e Cdc24-3xHA Ni eau du ch die gleichzei ige ek opische Übe ex-
p ession on Bem1 (Abb. 2.13 C), nich jedoch du ch die on Rac1 (nich gezeig ),
wiede abgesenk we den. Die Übe exp essionen de Rac1-GAPs üh en zu eine s a -
ken Des abilisie ung on Cdc24-3xHA, die mi de du ch eine Rac1 Übe exp ession
induzie en Deg ada ion des GEFs e gleichba wa (Abb. 2.13 A).
2.2.2 De Guanin-Nukleo id Dissozia ions Inhibi o Rdi1 s ell
inak i es Rac1-GDP zu e neu en Ak i ie ung zu Ve ügung
Es is anzunehmen, dass nach eine GAP-s imulie en Inak i ie ung on Rac1 du ch
GTP-Hyd olyse, de Rac1/Bem1/Cla4 Komplex ze äll , da wede Bem1 noch Cla4
A ini ä zu Rac1-GDP besi z (Abb. 2.3 D). Das eigese z e Rac1-GDP e bleib e -
mu lich zunächs an de Memb an. Um die GTPase wäh end des pola en Wachs ums
eine e neu en Ak i ie ung zuzu üh en, muss sie an die Spi ze zu ückgeb ach we den.
Dies kann du ch In e ak ion mi einem Guanin-Nukleo id Dissozia ions Inhibi o (GDI)
siche ges ell we den, de die GTPase du ch eine hyd ophobe In e ak ion mi dem P e-
nylanke on de Memb an ablös (Sasaki e al., 1990; Wu e al., 1996b; Seab a and
Wasmeie , 2004). Die Dele ion des U. maydis Homologes des GDI Rdi1 ha e keine Aus-
wi kungen au das E scheinungsbild haploide Zellen. Sowohl die Knospung, als auch
die Sep enbildung wa en unges ö (Abb. 2.14 A). Diese Beobach ung wa mi ühe en
E gebnissen konsis en (And ea Hlubek, Disse a ion). Eine N- e minale GFP-Fusion
des GDIs, die in ∆ di1 Zellen ek opisch kons i u i exp imie wu de, lokalisie e im
Zy oplasma und an Endomemb anen (Abb. 2.14 D). Um die Auswi kungen eines e höh-
en Rdi1 Ni eaus zu un e suchen, wu de eine kondi ionale Mu an e he ges ell , in de
di1 un e de Kon olle des s a ken induzie ba en c g P omo o s s and. In e essan e -
weise üh e die Übe exp ession on Rdi1 zu eine seh s a ken Zell e länge ung (Abb.
2.14 B und C). Um die Bedeu ung on Rdi1 ü das b-induzie e ilamen öse Wachs-
um zu un e suchen, wu de di1 in dem S amm AB31 dele ie . AB31∆ di1 zeig e eine
e zöge e Filamen bildung. D ei S unden nach Induk ion de bW2/bE1 Übe exp essi-
on, wenn meh als ach zig P ozen de Wild ypzellen be ei s ein Filamen ausgebilde
ha en, zeig e höchs ens die Häl e de ∆ di1 Zellen eine deu lich kü ze e ilamen öse
S uk u (Abb. 2.14 E und F). Nach länge e b-Induk ion wa en jedoch nahezu alle
AB31∆ di1 Zellen in de Lage, ein Filamen auszubilden, dass im Au bau mi denen
42

2 E gebnisse
WT
calco luo
D di1
calco luo
GFP-Rdi1
Rac1 Rdi1
Übe exp ession:
WT
+ Rdi1
- Rdi1
0
5
10
15
20
25
30
35
A
BD
C+bE1/bW2 (3h)
WT
D di1
0%
20%
40%
60%
WT
D di1
0%
P ozen uale Zellan eil
20%
40%
60%
kein Filamen
<10 mm
10-20 mm
20-50 mm
+bE1/bW2 (3h)
Filamen länge
DIC
E
F
0
35
30
25
20
15
10
5
Zellänge (µm)
Abbildung 2.14: Rdi1 is ein Regula o de Zellpola i ä in U. maydis.A) Phäno yp on di1
Dele ionsmu an en. Die Zellwände wu den mi Calcofluo -Weiss ange ä b . Knospende Zellen weisen
ein cha ack e is isches Doppelsep um zwischen Mu e - und Toch e zelle au . De G ößens anda d
ep äsen ie 10 µm. B) E scheinungsbild on Zellen, die Rac1 ode Rdi1 übe exp imie en. Die Zellen
wu den ü ach S unden in induzie endem Flüssigmedium inkubie . De G ößens anda d en sp ich 10
µm. C) Quan ifizie ung (n=50) de Zellänge bei Rdi1 Deple ion (-Rdi1) und Übe exp ession (+Rdi1).
Die S anda dabweichung is du ch die Balken angezeig . D) Lokalisa ion eine N- e minalen GFP-
Fusion on Rdi1 in ∆ di1 Mu an en. E) Phäno yp on AB31 und AB31∆ di1 Zellen d ei S unden nach
de Induk ion de bW2/bE1 Übe exp ession. De G ößens anda d en sp ich 10 µm. F) Quan ifizie ung
(n=150) des p ozen ualen An eils de Zellen ohne Filamen und mi Filamen en de angezeig en Längen
(un e 10 µm, zwischen 10 und 20 µm, zwischen 20 und 50 µm und übe 50 µm) d ei S unden nach
de Induk ion de bW2/bE1 Übe exp ession im Wild yp und in de AB31∆ di1 Mu an e.
on AB31 e gleichba (nich gezeig ).
Um zu übe p ü en, ob Rdi1 in U. maydis mi GTPasen in e agie und sie aus de
Memb an he auslösen kann, wu den N- e minale GFP-Fusionen on Rac1 und dem
nah e wand en Cdc42 in de kondi ionalen di1 Mu an e exp imie . In Wild ypzel-
len zeig en GFP-Rac1 und GFP-Cdc42 eine s a ke Lokalisa ion an de gesam en Zell-
memb an und an den Sep en. GFP-Rac1 zeig e zusä zlich eine Akkumula ion an de
Knospenspi ze, wohingegen GFP-Cdc42 auch an Endomemb anen lokalisie e (Abb.
2.15 A und C). Im Falle eine Rdi1 Deple ion wa die Memb anlokalisa ion de GTP-
asen nich ges ö . Im Fall on Cdc42 kam es jedoch zu zusä zlichen Akkumula ionen
im Zy oplasma (Abb. 2.15 C). Die Übe exp ession on Rdi1 üh e hingegen zu Au -
hebung de Memb anlokalisa ion, wobei hie de E ek ü GFP-Rac1 deu lich g öße
wa (Abb. 2.15 A und C). Fü das Säuge ie O holog on Rdi1, GDI1, wu de eine
GTPasen s abilisie ende Funk ion besch ieben (Boul e e al., 2010). Folglich wu den
43
2 E gebnisse
GFP-Cdc42
WT
GFP-Rac1
WT -Rdi1 +Rdi1Übe exp ession
-Rdi1 +Rdi1Übe exp ession A aGlu +
-
WT di1kond
Cdc42
Tub1
0 %
2 0 %
4 0 %
6 0 %
8 0 %
1 0 0 %
1 2 0 %
1 4 0 %
1,0
1,2
1,4
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
ela i eCdc24-Konzen a ion
A aGlu +
-
WT di1kond
3xHA-Rac1
Tub1
0 %
2 0 %
4 0 %
6 0 %
8 0 %
1 0 0 %
1 2 0 %
1 4 0 %
1,0
1,2
1,4
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
ela i eCdc24-Konzen a ion
A B
DC
KNO3
-
NH4
+
WT
D di1
KNO3
-
NH4
+
bem1Pna
Cdc24-3xHA
Tub1
0 %
2 0 %
4 0 %
6 0 %
8 0 %
1 0 0 %
1 2 0 %
1 4 0 %
1 6 0 %
1,0
1,2
1,4
1,6
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
ela i eCdc24-Konzen a ion
G
KNO3
-
NH4
+
WT
D di1
KNO3
-
NH4
+
ac1Pna
Cdc24-3xHA
Tub1
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
160%
1,0
1,2
1,4
1,6
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
ela i eCdc24-Konzen a ion
F
0 %
5 0 %
1 0 0 %
1 5 0 %
2 0 0 %
2 5 0 %
3 0 0 %
3 5 0 %
4 0 0 %
A aGlu +
-+
-
WT ac1kond di1kond
Cdc24-3xHA
Tub1
2,5
3,0
3,5
4,0
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
ela i eCdc24-Konzen a ion
E
Abbildung 2.15: Rdi1 ha einen Rac1-abhängigen Ein luss au die S abili ä on Cdc24.
A) Lokalisa ion eine kons i u i exp imie en N- e minalen GFP-Fusion on Rac1 in wild yp Zellen
und in eine kondi ionalen di1 Mu an e, in de das di1 Gen an seinem Locus un e de Kon olle
des c g P omo o s s and. Die Zellen wu den übe Nach in glukosehal igem Flüssigmedium angezogen
(-Rdi1) und dann ü ie S unden in a abinosehal igem Medium inkubie (+Rdi1). De G ößen-
s anda d en sp ich 10 µm. B) Quan ifizie ung de Menge an endogen exp imie em 3xHA-Rac1 in
Abwesenhei on Rdi1 (-) und bei Übe exp ession des GDIs (+). Das Diag amm zeig den Mi elwe
d eie unabhängige Ve suche. Die Balken zeigen die S anda dabweichung. C) Lokalisa ion on kons i-
u i exp imie em GFP-Cdc42 in de kondi ionalen di1 Mu an e. Die Anzuch de Kul u en e olg e
wie in (A) besch ieben. De G ößens anda d ep äsen ie 10 µm. D) Die Quan ifizie ung de Menge
an endogenem Cdc42 e olg e wie in (B) besch ieben. E) Ve gleich de Auswi kungen de Deple ion
und Übe exp ession on Rac1 und Rdi1 au das endogene Cdc24-3xHA Ni eau. Die kondi ionalen ac1
und di1 Mu an en wu den au Glukose (-) und A abinose (+) angezogen. Das Diag amm zeig die
Mi elwe e und S anda dabweichungen d eie Expe imen e. F) Effek de Bem1 Übe exp ession un e
Kon olle des na P omo o s au die Cdc24 s abilisie ende Wi kung de di1 Deple ion. Die Kul u en
wu den in ammoniumhal igem (NH4+) Flüssigmedium angezogen und in ni a hal igem (KNO3-) ü
sechs S unden induzie . De aus d ei Expe imen en e hobene Mi elwe und die S anda dabweichung
sind gezeig . G) Auswi kungen de Übe exp ession on Rac1 un e de Kon olle des na P omo o s
au die s abilisie ende Wi kung de di1 Dele ion. Die Exp essionsbedingungen sind in (F) besch ieben.
Das Diag amm zeig den Mi elwe on d ei Expe imen en und die S anda dabweichung.
44
2 E gebnisse
auch die Auswi kungen de Rdi1 Deple ion und Übe exp ession au die Menge an en-
dogen exp imie em 3xHA-Rac1 und Cdc42 un e such . Die Menge beide GTPasen
blieb jedoch sowohl bei Übe exp ession, als auch bei Deple ion on Rdi1 nahezu un-
beein luss (Abb. 2.15 B und D). Da Rdi1 in de Lage is , Rac1 aus de Memb an zu
lösen, bei Übe exp ession Zellen zu hype pola isie en und die Anwesenhei on Rdi1
eine Vo ausse zung ü die zügige Filamen induk ion is , wu de de Ein luss des GDI
au die Regula ion on Cdc24 un e such . Dazu wu de Cdc24 in de kondi ionalen di1
Mu an e am genomischen O mi einem d ei achen HA-Epi op ma kie . Die Deple ion
on Rdi1 ha e nu eine e gleichsweise ge inge Auswi kungen au die P o eins abili ä
on Cdc24-3xHA (Abb. 2.15 E). In e essan e weise wa de s abilisie ende E ek eine
Deple ion on Rdi1 du ch die Übe exp ession on Rac1 au hebba (Abb. 2.15 F), nich
jedoch du ch die on Bem1 (Abb. 2.15 G). Die Übe exp ession des GDI ha e eine, mi
de on Rac1 e gleichba e, deu liche des abilisie ende Wi kung au die Cdc24-3xHA
Menge (Abb. 2.15 E).
2.2.3 Das En e nen on Rac1-GDP aus de Memb an wi d du ch
die ak inabhängige Endozy ose wäh end des pola en
Wachs ums un e s ü z
Die Ta sache, dass ∆ di1 Mu an en nu ge inge Pola i ä sde ek e zeigen, weis da au
hin, dass es zusä zliche Mechanismen geben muss, die die En e nung on inak i em
Rac1-GDP aus de Memb an siche s ellen, dami es anschließend eine neuen Ak i ie-
ung zuge üh we den kann. Es is bekann , dass in S. ce e isia die ak in e mi el e
Endozy ose ü die Funk ion on Cdc42 eine wich ige Rolle spiel (Slaugh e e al.,
2009). Um die Bedeu ung de Endozy ose ü die Rac1-abhängige Regula ion on Cdc24
zu un e suchen, wu de de endozy o ische P ozess au zwei A en inhibie . Zum einen
wu de die empe a u sensi i e Mu a ion in dem endosomalen -SNARE Yup1 s genu z
(Wedlich-Söldne e al., 2000). Zum ande en wu den die Zellen mi La unculinA (50
µM) inkubie , um das Ak inzy oskele zu ze s ö en. Die Inhibi ion de Endozy ose
üh e in beiden Fällen zu eine Ve dickung de Zellen und eine i egulä en Sep ie ung
(Abb. 2.16 A und C). Sowohl die Inkuba ion de Yup1 s Mu an e bei nich pe missi-
e Tempe a u , als auch die Inkuba ion de Zellen mi La unculinA, esul ie e in
eine leich en S abilisie ung des Cdc24-3xHA Ni eaus au e wa hunde ie zig P ozen
(Abb. 2.16 B und D). Die Inhibi ion de Endozy ose üh e in ∆ di1 Zellen zu einem
Ans ieg de Cdc24-3xHA Konzen a ion au hunde achzig P ozen (Abb. 2.16 F), was
da au hindeu e , dass de s abilisie ende E ek de Inhibi ion de Endozy ose und de
s abilisie ende E ek de di1 Dele ion addi i wi ken.
45
2 E gebnisse
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
160%
25°C 32°C
Yup1 s
32°C25°C
WT yup s
Cdc24-3xHA
Tub1
ela i eCdc24-Konzen a ion
32°C25°C
- +La A
La unculinA
WT
Cdc24-3xHA
Tub1
ela i eCdc24-Konzen a ion
WT+DMSO
WT+La A
1,0
1,2
1,4
1,6
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1,0
1,2
1,4
1,6
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
A
B
C
D
0%
40%
80%
120%
160%
200%
D di1
+La A
La unculinA
D di1
Cdc24-3xHA
Tub1
ela i eCdc24-Konzen a ion
D di1+DMSO
D di1+La A
1,2
1,6
2,0
0,8
0,4
0,0
E
F
-
WT
Abbildung 2.16: Die Inhibi ion de ak inabhängigen Endozy ose ha einen s abilisie en-
den E ek au die Cdc24 Konzen a ion.A) Phäno yp on Zellen nach ie s ündige Inhibi ion
de empe a u sensi i en Mu an e des endosomalen -SNARE Yup1. De G ößens anda d en sp ich
10 µm. B) Quan ifizie ung de Menge an endogenem Cdc24-3xHA o (25◦C) und nach (32◦C) de
Inhibi ion on Yup1 s. Das Diag amm zeig den Mi elwe d eie Expe imen e. De Balken ep ä-
sen ie die S anda dabweichung. C) E scheinungsbild on Zellen nach ie s ündige Inkuba ion mi
La unculinA (La A). De Längens anda d en sp ich 10 µm. D) Bes immung de Menge an endo-
genem Cdc24-3xHA o (WT und WT + DMSO) und ie S unden nach de Zugabe des Inhibi o s
(+La A). De Mi elwe d eie Expe imen e is mi S anda dabweichung gezeig . E) Phäno yp on
∆ di1 Zellen o (-) und nach Inkuba ion mi La A. De G ößens anda d zeig 10 µm. F) Ve gleich
des endogenen Cdc24-3xHA Ni eaus im Wild yp, in ∆ di1 Zellen, in ∆ di1 Zellen, die mi dem Lö-
sungsmi el on La A (DMSO) inkubie wu den und in ∆ di1 Zellen, die mi La A behandel wu den.
Mi elwe und S anda dabweichung on d ei Expe imen en sind in de G aphik gezeig .
2.2.4 Rac1 muss GTP hyd olysie en und mi Rdi1 in e agie en
können, um das pola e Wachs um zu s imulie en
Wäh end des pola en Wachs ums muss Rac1-GTP du ch Rip1, Bem2 und Bem3 inak-
i ie und du ch Rdi1, bzw du ch Endozy ose eine neuen Ak i ie ung an de Spi ze
zuge üh we den. Um die Bedeu ung de einzelnen Sch i e ü das pola e Spi zen-
wachs um beu eilen zu können, wu den die In e ak ionen on Rac1 mi ande en Regu-
la o en einzeln und in Kombina ion au gehoben. Dies wu de du ch die Ein üh ung on
spezi ischen Punk mu a ionen e eich . Die en sp echenden Rac1 Va ian en wu den au
ih e Fähigkei hin un e such , ilamen öses Wachs um zu induzie en und die Cdc24 P o-
eins abili ä nega i zu egulie en. Die Fähigkei on Rac1 mi den GAP-Domänen on
Rip1, Bem2 und Bem3 zu in e agie en, wu de du ch die Ein üh ung de EN91/92HH
Mu a ionen (Ri inge e al., 1997a; Wu e al., 2009) au gehoben (Abb. 2.11 C). Die
Übe exp ession on Rac1EN91/92HH wa zwa aus eichend, um pola es Wachs um zu in-
duzie en, die Zellen zeig en jedoch eine i egulä e, iel ach e dick e Fo m (Abb. 2.17
A). Die In e ak ion mi Rdi1 wu de du ch die Ein üh ung de Mu a ion R66E e hinde
(Gibson and Wilson-Del osse, 2001). GFP-Rac1R66E e blieb auch bei s a ke Übe ex-
46
2 E gebnisse
die s ä ks e F agmen ie ung de Vakuolen au und die Cdc42/Smu1 Doppeldeple ion
die schwächs e (Abb. 2.19 B und C).
Die Fähigkei on Rac1 und Cdc42 sowohl mi Cla4, als auch mi Smu1 mi gleiche A -
ini ä zu in e agie en, konn e du ch In e ak ionss udien bes ä ig we den. GST-Rac1
und GST-Cdc42 wa en in ih e GTP-gebundenen Kon o ma ion in de Lage, gleiche
Mengen an Cla4-GFP und Smu1-GFP zu p äzipi ie en (Abb. 2.21 B).
Die In e ak ion on Rac1 und Cla4 wi d wäh end des pola en Wachs ums du ch das
Ge üs p o ein Bem1 e mi el . Die Deple ion des essen iellen P o eins Bem1 üh zum
Pola i ä s e lus und zu s a ken F agmen ie ung de Vakuolen (Abb. 2.19 B). Dabei
is die Anzahl de nachweisba en akuolä en S uk u en in de Zelle jedoch ge inge als
bei eine Doppeldeple ion on Rac1 und Cdc42, was jedoch e mu lich au das deu lich
kleine e Zell olumen de bem1 Mu an en zu ückzu üh en is . Auch das Ge üs p o e-
in Bem1 konn e sowohl mi Rac1-GTP, als auch mi Cdc42-GTP p äzipi ie we den
(Abb. 2.21 B). Zusammenge ass läss sich sagen, dass k euzweise In e ak ionen zwi-
schen dem Rac1- und dem Cdc42-abhängigen Signalweg, sowohl beim ak i ie enden
Sch i (Cdc24), als auch au de Ebene de E ek o s imula ion (Cla4/Smu1) im Kom-
plex mi dem Ge üs p o ein Bem1 s a inden können (Abb. 2.21 D).
2.3.2 Die Mu an e Cdc42F56W gewinn Rac1-Signalspezi i ä und
e lie Cdc42-Funk ionali ä
Basie end au de Beobach ung, dass Cdc42 mi ähnliche A ini ä wie Rac1 mi Bem1
und Cla4 in e agie , kann geschlossen we den, dass de einzige G und, wa um Cdc42
Rac1 in i o nich olls ändig e se zen kann, on de ge inge en A ini ä des Ak i a-
o s Cdc24 ü Cdc42 he üh . Um diese Theo ie expe imen ell zu un e maue n, wu de
du ch Ein üh ung eine Punk mu a ion (F56W) in Cdc42 e such , diese GTPase zu
einem besse en Subs a ü Cdc24 zu machen. Alle bekann en Cdc42 P o eine agen
an Posi ion 56 ein Phenylalanin (F), wäh end alle bekann en Rac1 P o eine ein T yp-
ophan (W) an diese Posi ion au weisen. Es konn e gezeig we den, dass ein Aus ausch
on F und W an diese Posi ion die GTPasen zum Subs a ü die GEFs de jeweils
ande en machen kann (Gao e al., 2001; Snyde e al., 2002). Die ka aly ische DH-PH
Tandem Domäne on Cdc24 e hiel sich in einem on Kay Schink du chge üh en in
i o Ak i i ä s es gegenübe GST-Cdc42F56W und GST-Rac1W56F wie e wa e . GST-
Cdc42F56W wu de du ch Cdc24 mi hohe E izienz ak i ie , wäh end die A ini ä des
GEFs ü GST-Rac1W56F d as isch eduzie wa (Kay Schink, Disse a ion und Abb.
2.22 A). In i o wa die Ein üh ung on Cdc42F56W in Dele ionsmu an en on ac1
aus eichend, um du ch Cdc24 Übe exp ession Filamen e zu induzie en, wäh end dies
du ch Ein üh ung de ko espondie enden Rac1W56F Mu an e nich möglich wa (Abb.
53

2 E gebnisse
(min)
0 20 40 60
ela i eFluo eszenz
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
Cdc42
Cdc42F56W
Cdc24(DH-PH)
Cdc42(Kon olle)
Cdc42 (Kon olle)
F56W
GEF
(min)
0 20 40 60
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Rac1(Kon olle)
Rac1
Rac1W56F
Rac1 (Kon olle)
W56F
GEF
Cdc24 Aus
Rac1W56F
Cdc42F56W
WT
-
Ä ac1
Cdc24 AN
A
Ä ac1cdc42F56W
Äcdc42
cdc42F56W
WT D ac1
ela i eFluo eszenz
B
E
0%
25%
75%
50%
100%
An eilGesam zellzahl
Ä ac1
Äcdc42
WT
Ä ac1 cdc42F56W
5-15
>15
1-5
Vakuolen
Ä ac1cdc42F56W Ä ac1
Äcdc42
WT
Vakuolen
CD
-
-
Dcdc42
AUS AN
Rac1
AUS AN
Cdc42F56W
WT
Cdc24-3xHA
Tub1
Rac1W56F
AUS AN
Cdc42
AUS AN
F
Abbildung 2.22: Die Mu an e Cdc42F56W gewinn Rac1-Signalspezi i ä , e lie jedoch
ih e Cdc42-Funk ionali ä A) in i o Tes de Ak i ie ung on GST-Cdc42F56W und GST-
Rac1W56F du ch das ka aly ische DH-PH Tandem on Cdc24. Gemessen wu de die Inko po a ion
on man -GDP in die GTPasen (Die „GEF-assays“ wu den on Kay Schink du chge üh ). B) E -
scheinungsbild on Zellen, die Cdc42F56W an S elle on Cdc42 am genomischen Locus und in de An-
und Abwesenhei on Rac1 exp imie en. Wild yp, ∆ ac1 und ∆cdc42 Zellen sind zum Ve gleich ge-
zeig . De G ößens anda d en sp ich 10 µm (Die Mu an e cdc42F56W wu de on B i a Tillmann zu
Ve ügung ges ell ). C) Vakuolenmo phologie in ∆ ac1 Zellen, die Cdc42F56W am na ü lichen Locus
exp imie en. Die Vakuolen wu den mi „CellT acke blue“ (Molecula P obes) ge ä b . Die Vakuolen-
mo phologie on Wild yp, ∆ ac1 und ∆cdc42 Zellen is zum Ve gleich gezeig . D) Quan ifizie ung
(n=50) de Vakuolenzahl in den in (C) gezeig en Zellen. Da ges ell is de p ozen uale An eil on
Zellen mi bis zu ün , zwischen sechs und ün zehn und mi meh als sechzehn Vakuolen an de
Gesam zellpopula ion. E) Wild yp, ∆cdc42 und ∆ ac1 Zellen, die Cdc24 übe exp imie en, wu den
au ak i kohlehal iges Fes medium au ge op . Die Cdc24-induzie e Filamen bildung wi d du ch das
weiße Mycel angezeig . Die Filamen bildung konn e in ∆ ac1 Mu an en du ch die ek opische kons i u-
i e Exp ession on Cdc42F56W ge e e we den, jedoch nich du ch Rac1W56F.F) Auswi kungen de
Übe exp ession on Rac1W56F und Cdc42F56W au das endogene Cdc24-3xHA Ni eau. Die GTPasen
wu den ek opisch un e de Kon olle des c g P omo o s exp imie . Die Flüssigkul u en wu den mi
Glukose (AUS) angezogen und anschließend ach S unden mi A abinose (AN) inkubie .
54
2 E gebnisse
2.22 E). Die Ak i ie ung on Cdc42F56W du ch Cdc24 und die dami e bundene S i-
mula ion on Cla4 üh e zum Abbau on Cdc24 (Abb. 2.22 F). Aus den besch iebenen
Beobach ungen kann geschlossen we den, dass Cdc42F56W alle Rac1 Funk ionen wäh-
end des pola en Wachs ums on U. maydis übe nehmen kann. Die Exp ession on
Cdc42F56W am genomischen Locus in ∆ ac1 Zellen, üh e neben de Au hebung des
Pola i ä sde ek es auch zu eine Supp ession de Vakuolen agmen ie ung (de S amm
wu de eundliche weise on B i a Tillmann zu Ve ügung ges ell ). Die Zellen wiesen
eine no male Vakuoleng öße und Zahl au (Abb. 2.21 C und D). Cdc42F56W konn e
also auch die ü die In eg i ä de Vakuolen essen ielle Funk ion alleine übe nehmen.
Jedoch wiesen alle Zellen, die Cdc42F56W am genomischen Locus exp imie en, einen
Zellsepa ie ungsde ek au , de mi dem on cdc42 Dele ionsmu an en e gleichba wa
(Abb. 2.22 B). Dies komm e mu lich dadu ch zus ande, dass sich Cdc42F56W in i o
wie Rac1 e häl und dahe nich in de Lage is Cdc42 wäh end de Zy okinese zu
e se zen. Von Kay Schink und B i a Tillmann konn e gezeig we den, dass Cdc42F56W
in i o schlech e du ch die Cdc42-spezi ischen GEFs Don1 und Ho 1 e kann wi d als
Cdc42. Hinzu komm , dass die Aminosäu e an Posi ion 56 in de E ek o schlei e de
GTPase lieg und eine Mu a ion an diese S elle auch Auswi kungen au die In e ak ion
mi E ek o en haben kann (Ka noub e al., 2001).
55
3 Diskussion
3.1 Dynamische Regula ion des
Cdc24/Bem1/Rac1/Cla4 Signalmoduls
3.1.1 Die Cla4 abhängige Phospho ylie ung on Cdc24 induzie
den Abbau des GEFs
In diese A bei konn e gezeig we den, dass de Rho-GEF Cdc24 die GTPase Rac1 wäh-
end des pola en Wachs ums on U. maydis ak i ie . Die Ak i ie ung on Rac1 üh
sowohl wäh end de Knospung, als auch wäh end des ilamen ösen Wachs ums, zu eine
nega i en pos ansla ionellen Regula ion on Cdc24. Wäh end des pola en Wachs ums
wi d Cdc24 du ch Cla4-abhängige Phospho ylie ung des abilisie . Das Homolog on
Cdc24 in S. ce e isiae, Cdc24p, is auch ein Subs a ü Cla4p-abhängige Phospho y-
lie ung. Die biologische Funk ion diese Modi ika ion wi d jedoch kon o e s disku ie
(Bose e al., 2001; Gulli e al., 2000; I azoqui e al., 2003). Es wu de besch ieben, dass
die Cla4-abhängige Phospho ylie ung on Cdc24 die Dissozia ion des GEFs aus dem
Komplex mi dem Ge üs p o ein Bem1p egulie und so eine nega i e egula o ische
Rückkopplungsschlei e kons i uie (Gulli e al., 2000). Diese Sich weise wu de du ch
eine ande e S udie in F age ges ell , in de kein Ein luss de Cla4-abhängigen Phos-
pho ylie ung au die Cdc24-Bem1 In e ak ion es ges ell we den konn e (Bose e al.,
2001). In diesem Zusammenhang wu de spekulie , dass die Phospho ylie ung des GEFs
einen posi i en Ein luss au die Ak i i ä des GEFs ha (Bose e al., 2001; Kozubowski
e al., 2008). Eine Cdc24p Mu an e, in de alle du ch massenspek ome ische Analysen
iden i izie en Phospho ylie ungss ellen zu Alanin mu ie wa en, zeig e keine De ek e
in S abili ä und Funk ion (Wai e al., 2009). Wäh end also in S. ce e isiae du chaus
in F age ges ell we den kann, dass die Phospho ylie ung on Cdc24p eine biologische
Funk ion ha , so konn e eine solche in U. maydis im Rahmen diese A bei nachgewiesen
we den. Es gelang, eine ku ze, 62 Aminosäu en um assende Region zu iden i izie en, die
sowohl no wendig, als auch aus eichend is , um den Cla4-induzie en Abbau on Cdc24
zu gewäh leis en. Die Mu a ion alle Se ine und Th eonine in diesem Be eich üh e
zu eine signi ikan en S abilisie ung des GEFs, wobei seine Ak i i ä nich beein luss
wa . De Ve gleich mi Cdc24p aus S. ce e isiae zeig e, dass keine diese po en iellen
56
3 Diskussion
Phospho ylie ungss ellen zwischen U. maydis und de Bäcke he e konse ie sind. Da
die Mu a ion einzelne Se ine und Th eonine die P o eins abili ä on Cdc24 nich e -
ände en, is anzunehmen, dass eine mul iple Phospho ylie ung inne halb diese Region
ü den Abbau on Cdc24 no wendig is . Die Regula ion on P o einen du ch mul iple
Phospho ylie ung is ein wei e b ei e es Phänomen (Salaza and Hö e , 2009). So wi d
z.B. in S. ce e isiae die S abili ä des CDK Inhibi o s Sic1p und des T ansk ip ions-
ak o s Tec1p du ch mul iple Phospho ylie ung egulie (Nash e al., 2001; Bao e al.,
2010). Dies e möglich die E kennung de P o eine du ch Cdc4, eine Un e einhei des
SCF E3 Ubiqui in Ligase Komplexes (Deshaies and Joazei o, 2009). In Säuge n wu de
auch be ei s die Regula ion on zwei humanen Rho-GEFs de Dbl-Familie, FGD1 und
FGD3, du ch SCF-abhängigen Abbau besch ieben (Hayakawa e al., 2005, 2008). Da-
he kann spekulie we den, ob das phospho ylie e Cdc24 in U. maydis eben alls du ch
eine bislang noch unbekann e Ubiqui in Ligase e kann und dann Ubiqui in-abhängig
abgebau wi d. Alle Ve suche eine Ubiqui inie ung on Cdc24 nachzuweisen, blieben
jedoch bislang ohne E olg, da noch kein Weg ge unden wu de, P o easominhibi o en
s abil in U. maydis Zellen einzuschleusen.
Wäh end des ilamen ösen Wachs ums konn e beobach e we den, dass das s abilisie e
Cdc24* zwa deu lich langsame als de nich mu ie e GEF, abe dennoch ep odu-
zie ba eine pos ansla ionellen Des abilisie ung ausgese z wa . Ob es sich dabei um
einen Cla4-unabhängigen Mechanismus handel , ode ob es wei e e, noch unbekann e
Phospho ylie ungss ellen gib , die einen Ein luss au die S abili ä on Cdc24 haben,
muss an diese S elle o en bleiben.
3.1.2 De Abbau on Cdc24 besch änk die Ak i i ä des
Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Signalmoduls au die wachsende
Spi ze
Fü das pola isie e Wachs um on U. maydis is es on essen ielle Bedeu ung die
Wachs umsak i i ä au einen Punk zu besch änken. In S. ce e isiae wi d diese Punk
no male weise du ch die Knospungss elle ma kie ende P o eine es geleg (Casamayo
and Snyde , 2002). Eine wich ige Au gabe übe nimm dabei die Ras-GTPase Rs 1p
(Gulli and Pe e , 2001). Jedoch sind die Zellen auch in Abwesenhei on Rs 1p in
de Lage, eine einzelne Knospe an eine zu älligen Posi ion zu bilden, ein Phänomen,
das als „symme y-b eaking“ besch ieben wu de (I azoqui e al., 2003). Die F age, wie
in diesem Fall ein s abile G adien on ak i em Cdc42-GTP e ablie und au ech
e hal en wi d, wu de du ch zwei wide s ei ende Modelle e klä . Basie end au Un-
e suchungen mi kons i u i ak i em Cdc42p wu de pos ulie , dass ak i es Cdc42p
am Zellko ex den ak inabhängigen T anspo on wei e en Cdc42p Molekülen s imu-
57
3 Diskussion
lie , was zu einem wachsenden Agg ega on ak i em Cdc42p üh (Wedlich-Söldne
e al., 2003). Du ch ma hema ische Modellie ung und Simula ion des Vesikel anspo s,
wu de dieses ein ache Modell jedoch angezwei el (Lay on e al., 2011). In einem al-
e na i en Model wi d pos ulie , dass ak i es Cdc42p-GTP den zy oplasma ischen
Cdc24p/Bem1p/Cla4p Komplex an die Memb an ek u ie . De memb anassoziie e
Komplex e zeug dann du ch die Ak i i ä on Cdc24p wei e e ak i e Cdc42p P o eine,
die ih e sei s wei e e Komplexe ek u ie en, wodu ch die Konzen a ion on Cdc42p-
GTP lokal ans eig (Go yache and Pokhilko, 2008; I azoqui e al., 2003; Kozubowski
e al., 2008). Die Besch änkung de Knospung au nu ein wachsendes Cdc42-GTP Ag-
g ega komm dabei e mu lich dadu ch zus ande, dass die wachsenden Agg ega e um
eine limi ie e Menge an Cdc24p/Bem1p/Cla4p Komplex kompe i ie en (Howell e al.,
2009).
In U. maydis häng die Zellpola isa ion zwingend on de Bildung eines e nä en
Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplexes ab. Die Gene ie ung eines s abilen G adien en on
ak i en Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplexen an de Spi ze on Knospen und Filamen-
en wi d e mu lich übe meh e e ineinande g ei ende Mechanismen e eich . De Me-
chanismus, de die Ini ia ion des pola en Spi zenwachs ums selek i au einen Zellpol
besch änk is dabei unkla . Die Dele ion des U. maydis Homologs on Rs 1p ha -
e keinen Ein luss au das Knospungsmus e , sonde n nu au die Geschwindigkei ,
mi de nach abgeschlossene Zell eilung eine neue Toch e zelle gebilde wu de (Sa-
b ina Pa zak, Diploma bei ). Ak i es Cdc24 in e agie mi dem Bem1/Cla4 Modul
und ek u ie Rac1-GDP in einen ansien en, du ch Kop äzipi a ion nachweisba en,
Cdc24/Bem1/Rac1/Cla4 Komplex (Abb 3.1). Die Ak i ie ung on Rac1 e höh dessen
A ini ä zu Bem1. Dabei dien de P enylanke on Rac1 e mu lich de S abilisie-
ung on Bem1 an de Memb an, da GFP-Bem1 in Abwesenhei on Rac1 nich an
de Zellspi ze lokalisie e. Rac1-GTP in e agie mi Cla4 und s imulie dadu ch e -
mu lich dessen Kinaseak i i ä (Abb 3.1). Die ak i e Cla4 Kinase s imulie das pola e
Wachs um du ch Phospho ylie ung on noch nich iden i izie en E ek o en. Gleichzei-
ig komm es zu Phospho ylie ung on Cdc24, was dessen Abbau induzie (Abb 3.1).
Die Ta sache, dass Cdc24 geb auch wi d, um Rac1 wäh end des pola en Wachs ums
zu ak i ie en, läss den e s ä k en Abbau des GEFs wäh end des pola en Wachs ums
zunächs kon ain ui i e scheinen. Die einzige plausible E klä ung is , dass ein Ve blei-
ben on Cdc24 im Komplex mi Bem1, Rac1-GTP und Cla4 ü das pola e Wachs um
hinde lich wä e. Ak i es Rac1-GTP muss au die wachsende Spi ze besch änk we -
den. Dies wi d e mulich du ch die in diese A bei iden i izie en Rac1-GAPs Rip1,
Bem2 und Bem3 e eich (siehe Abschni 3.1.3 ü eine de aillie e Diskussion). Es
is anzunehmen, dass die Rac1-GAPs eine subapikale „Zone de Inhibi ion“ kons i u-
ie en, wie sie z.B. in S. ce e isiae zu Ve hinde ung de Knospung inne halb de al en
58

3 Diskussion
Rac1
Rac1
Bem1
Cla4
Cdc24
Bem1
Cla4
Cdc24
Rac1
Rac1
Cla4
E ek o en
Bem1
Bem1
Cla4
Cdc24
Cdc24
Cdc24
Cdc24
Cdc24
Rac1
Rho-GDI
Rho-GAP
Rho-GDI
Cdc24
Rac1
Cla4
Bem1
Abbildung 3.1: Schema isches Modell ü die nega i e Rückkopplungs egula ion des GEFs
Cdc24. Cdc24 und Cla4 in e agie en mi dem Ge üs p o ein Bem1. Cdc24 ek u ie inak i es Rac1-
GDP (o ange) in den Komplex. In diesem qua e nä en Übe gangskomplex wi d Rac1 du ch den on
Cdc24 s imulie en GDP-GTP Aus ausch ak i ie . Rac1-GTP (g ün) in e agie mi Cla4 und s imu-
lie e mu lich dessen Ak i i ä (offene Kon o ma ion). Cla4 phospho ylie Cdc24 ( o e Punk ) und
induzie so den Abbau des GEFs. Zu ück bleib ein e nä e Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplex, de das
pola e Wachs um übe die S imula ion on noch unbekann en Fak o en egulie . Die Inak i ie ung
des Komplexes und die Wiede e wendung de P o eine wi d du ch In e ak ion mi Rac1-GAPs und
dem GDI Rdi1 siche ges ell .
Knospungss elle besch ieben wu de (Tong e al., 2007). Es kann e mu e we den, dass
ein Ve bleiben on Cdc24 im Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplex eine Inak i ie ung on
Rac1 du ch so o ige Reak i ie ung en gegenwi ken könn e. Fü diese Theo ie sp ich ,
dass die Exp ession on s abilisie em Cdc24* sowohl wäh end de Knospung, als auch
bei de Ini ia ion des ilamen ösen Wachs ums, Auswi kungen ha e. Die Zellen wa en
länge und dicke , wobei die Knospenspi zen deu lich abge unde wa en, was ü eine
schlech e e Fokussie ung de Rac1, bzw. de Cla4 Ak i i ä sp ich . Die beobach e e
deu liche Ve zöge ung de Filamen induk ion is e mu lich eben alls au P obleme bei
de Gene ie ung eines s abilen Rac1-GTP G adien en zu ückzu üh en. O enba spiel
die nega i e Rückkopplungs egula ion on Cdc24 auch bei de P lanzenin ek ion du ch
U. maydis eine Rolle. Die Reduk ion de Vi ulenz on S ämmen, die die s abilisie e Va-
ian e Cdc24* exp imie en, kann e mu lich au die beobach e e e zöge e Filamen -
und App esso ienbildung zu ückge üh we den. Da übe , ob es in de P lanze zu wei-
e en Ve zöge ungen im pola en Wachs um komm , kann an diese S elle nu spekulie
we den.
3.1.3 Die Inak i ie ung des Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplexes
wäh end des pola en Wachs ums
In diese A bei konn en d ei Rac1-GAPs iden i izie we den, die sowohl bei Deple-
ion, als auch bei Übe exp ession Auswi kungen au das pola e Wachs um und die
59
3 Diskussion
S abili ä on Cdc24 haben. Die Deple ion de GAPs esul ie e in eine signi ikan en
Zell e länge ung und S abilisie ung on Cdc24. Dies läss sich dadu ch e klä en, dass
de Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplex mangels GAP-Ak i i ä länge ak i bleib . Die
GAP-s imulie e GTP Hyd olyse bewi k auch die Dissozia ion on Rac1 und Bem1.
Wäh end inak i es Rac1-GDP in de Memb an e bleib , s ehen Cla4 und Bem1 ü
eine e neu e Komplexbildung zu Ve ügung (Abb 3.1). Die e zöge e Inak i ie ung
on Rac1 üh in Abwesenhei de GAPs also e mu lich dazu, dass Bem1 zunehmend
komplexie o lieg . Dadu ch s eh wenige Bem1 ü die Cdc24 konsumie ende Bil-
dung on neuen Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplexen zu Ve ügung. Diese Hypo hese
konn e dadu ch bes ä ig we den, dass eine e höh e Exp ession on Bem1 de Cdc24
S abilisa ion in den GAP Mu an en en gegenwi k . Die Cdc24 s abilisie enden E ek e
de Einzeldele ionen on ip1,bem2 und bem3 sind d ama isch, obgleich die Funk ion
de P o eine im Bezug au die Inak i ie ung on Rac1 edundan zu sein schein . Dies
kann e mu lich dadu ch e klä we den, dass die d ei Rac1-GAPs äumlich und/ode
zei lich oneinande ge enn agie en. In einem solchen Modell wü de jede de d ei
GAPs die F eise zung eines dis ink en An eils an de Gesam zahl de Bem1 Moleküe
aus dem Komplex mi ak i em Rac1 egulie en (Abb. 3.2). Die Dele ion eines einzelnen
GAPs üh in diesem Modell zu Seques ie ung on Bem1 in dem no male weise on
dem GAP kon ollie en äumlichen und/ode zei lichen Be eich (Abb. 3.2). Ein e s e
Hinweis da au , dass jede de d ei möglichen Rac1-GAPs eine eigene „Zone de Inhibi-
ion“ bilde , kann in den un e schiedlichen Lokalisa ionen on Rip1, Bem2 und Bem3
gesehen we den.
Die Beobach ung, dass die Übe exp ession de Rac1-GAPs zu eine Zell e länge ung
und einem Abbau on Cdc24 üh , wa une wa e . So wu de ü die GAPs Bem2p
und Bem3p in S. ce e isiae ein Übe exp essionsphäno yp besch ieben, de dem on
Zellen gleich , die eine empe a u sensi i e Va ian e on Cdc42p bei nich pe missi e
Tempe a u exp imie en (Ca is on e al., 2003). Die Übe exp ession on GAP-minus
Mu an en üh e hingegen zu elongie en Knospen (Ca is on e al., 2003). Bem2p und
Bem3p lokalisie en in S. ce e isiae in de G1 Phase des Zellzyklus am Zellko ex, wo
sie e mu lich die e üh e Ak i ie ung on Cdc42p e hinde n (Knaus e al., 2007).
Es konn e gezeig we den, dass beide Cdc42-GAPs Cdc28-abhängig phospho ylie we -
den, wodu ch ih e Ak i i ä he abgese z we den soll (Knaus e al., 2007). Es wu de
pos ulie , dass diese Inhibi ion de GAPs die Cdc42p Ak i ie ung an de Knospungs-
s elle und dami die Knospung e möglich (Knaus e al., 2007). In U. maydis üh die
Übe exp ession de Rac1-GAPs nich zu eine Inak i ie ung de GTPase. S a zum Po-
la i ä s e lus , komm es zu Hype pola isie ung und Zell e länge ung. Dies läss sich
dadu ch e klä en, dass eine e höh e GAP-Ak i i ä an de Zellspi ze zu einem schnel-
le en Umsa z on Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplexen üh , was auch den d as isch
60
3 Diskussion
Bem1
Rip1
Bem1Bem1
Bem2 Bem3 Rac1-GAPs
Bem1
Abbildung 3.2: D ei Rac1-GAPs kon ollie en die Rezyklisie ung on Bem1. Die Inak i-
ie ung on Rac1-GTP du ch die GAPs Rip1, Bem2 und Bem3 bewi k e mu lich die F eise zung
on Bem1 aus dem Komplex mi Rac1. Dabei egulie jede GAP einen bes imm en „Pool“ des Ge-
üs p o eins, de äumlich und/ode zei lich on dem de ande en ge enn is . Die Dele ion eines
GAPs üh zu Seques ie ung on imme meh Bem1 in einem de „Pools“, wodu ch imme wenige
Ge üs p o ein in den ande en zu Ve ügung s eh .
e höh en Ve b auch on Cdc24 e klä .
GAP-Ak i i ä wi d wäh end des pola en Wachs ums on U. maydis also nich on
de Zone, in de das pola e Wachs um s a inde ausgeschlossen, sonde n is im Ge-
gen eil eine elemen a e Vo ausse zung. So is eine GAP insensi i e Va ian e on Rac1
(Rac1EN91/92HH) nich in de Lage, bei Übe exp ession Filamen e mi no male Mo -
phologie zu e zeugen. Dass de Wechsel zwischen de GDP- und de GTP-gebundenen
Fo m eine GTPase ü den on ih egulie en P ozess wich ig sein kann, wu de auch in
ande en Sys emen beobach e . So is dies o enba bei de Zell usion wäh end de Zell-
paa ung on S. ce e isiae un e zich ba (Ba ale e al., 2006). In Säuge n kolokalisie
de GAP SH3BP1 mi Rac1 am o de en Zellende on mig ie enden Fib oblas en, wo
e e mu lich in Kombina ion mi dem GEF Tiam1 ü einen „GTPase-Flux“ on Rac1
so g , de ü die Ausbildung on Auss ülpungen essen iell is (Pa ini e al., 2011).
In U. maydis lieg die Funk ion de Rac1-GAPs o enba da in, das Wachs um au die
Zellspi ze zu besch änken. Ein „Du chb echen“ diese „Zone de Inhibi ion“ sei es du ch
Insensi i ä on Rac1 gegenübe den GAPs, ode du ch so o ige Reak i ie ung de
GTPase du ch den s abilisie en GEF Cdc24*, üh zu delokalisie e Rac1-Ak i i ä ,
die das pola e Wachs um s ö . In e essan e weise sind die so mu ie en Zellen abe nich
61
3 Diskussion
apola . Es muss also noch wei e e Mechanismen geben, die einen wich igen Ein luss au
die Besch änkung des ak i en Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplexes au den Be eich des
Spi zenwachs ums haben. Diese basie en o enba au dem Rho-GDI Rdi1. GDIs sind in
ielen O ganismen als Regula o en des pola en Wachs ums besch ieben. So is z.B. die
In e ak ion de Rac-Rop GTPase Rop2 mi ih em Rho-GDI in A abidopsis haliana ü
die Posi ionie ung und die Elonga ion on Haa wu zeln on Bedeu ung (Ca ol e al.,
2005) und in Tabakp lanzen is de Rho-GDI2 ü die Regula ion de Rac-Rop Ak i i ä
wäh end des Wachs ums on Pollenschläuchen wich ig (Klah e e al., 2006). Auch in
S. ce e isiae binde und ex ahie de GDI Rdi1p Cdc42p aus de Memb an (Masuda
e al., 1994). Dabei kons i uie Rdi1p einen on zwei möglichen Wegen de Rezyklisie-
ung on Cdc42p wäh end des pola en Wachs ums (Slaugh e e al., 2009). Ein zwei e ,
edundan e Weg, e olg übe die ak inabhängige Endozy ose (Slaugh e e al., 2009).
Beide Mechanismen sind o enba auch in U. maydis e wi klich . Knospende Zellen, die
eine di1 Dele ion agen, weisen keinen Pola i ä sde ek au . Die Rezyklisie ung on
Rac1 schein jedoch e zöge zu e lau en, da ein signi ikan s abilisie ende E ek
au die Cdc24 Menge es s ellba wa , de du ch eine e s ä k e Exp ession on Rac1
wiede au gehoben we den konn e. Die Übe exp ession on Rdi1 esul ie e sowohl in
eine Zell e länge ung, als auch in eine Des abilisie ung on Cdc24. Dies e schein bei
e s e Be ach ung nich einleuch end. In S. ce e isiae üh eine Übe exp ession on
Rdi1p zu einem mi dem de Inak i ie ung on Cdc42 s e gleichba en Phäno yp, da
Cdc42 aus de Memb an en e n wi d (Masuda e al., 1994). In U. maydis komm es
du ch die e höh e Konzen a ion on Rdi1 auch zum En e nen on Rac1 aus de Plas-
mamemb an. Die dami e bundene g öße e Ve ügba kei de GTPase üh jedoch
o enba zu einem e höh en Flux on Rac1 am wachsenden Pol, was wiede um in dem
zunehmenden Abbau on Cdc24 esul ie .
Die Beobach ung, dass di1 Mu an en keinen s a ken Phäno yp haben und die Übe -
exp ession on GDI insensi i em Rac1 (Rac1R66E) zu Filamen induk ion aus eichend
is , weis da au hin, dass die ak inabhängige Endozy ose in U. maydis eben alls zu
Rezyklisie ung on Rac1 bei äg . Dies konn e dadu ch bes ä ig we den, dass die Inhi-
bi ion de Endozy ose eben alls einen signi ikann s abilisie enden E ek au das Cdc24
Ni eau ha e, de mi dem de Dele ion on di1 addi i wi k e.
Sowohl die in diese A bei iden i izie en Rac1-GAPs, als auch de GDI Rdi1 und die
ak inabhängige Endozy ose sind in U. maydis ü das pola e Wachs um wich ig. Nach
de En e nung on Cdc24 aus dem ak i en Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplex di un-
die diese e mu lich la e al in de Memb an bis e die pos ulie e subapikale Zone
de hohen GAP Ak i i ä e eich (Abb. 3.3 2 und 3). Die GAP s imulie e GTP Hy-
d olyse bewi k den Ze all des Komplexes. Bem1 und Cla4 we den übe einen noch
unbekann en Mechanismus eine e neu en Komplexbildung zu Ve ügung ges ell und
62
4 Ma e ial und Me hoden
4.2 Vek o en
Name Resis enz He kun Ve wendung
PJe 2.1 Ampicillin Fe men as Klonie ung on PCR-F agmen en zu Ve meh-
ung in E. coli
pUC18 Ampicillin Labo sammlung Klonie ung on Kons uk en zu Ve meh ung in
E. coli
pGEX Ampicillin Ame sham GE
Heal hca e
Exp ession on GST-Fusionsp o einen in E. co-
li (Zu besse en Klonie ung wu de eine NdeI
Schni s elle in die MCS einge üg )
pETM-60 Kanamycin (Dümmle e al.,
2005)
Exp ession on NusA-6xHis-Fusionsp o einen in
E. coli (Zu besse en Klonie ung wu de eine NdeI
Schni s elle in die MCS einge üg )
pRS426 Ampicillin,
U a3
(Siko ski and
Hie e , 1989)
Klonie ung on Kons uk en in S. ce e isiae
p123 Ampicillin, Ca -
boxin
Labo sammlung Kons i u i e Exp ession on GFP-
Fusionsp o einen in Us ilago maydis
p123-RFP Ampicillin, Ca -
boxin
Labo sammlung Kons i u i e Exp ession on RFP-
Fusionsp o einen in Us ilago maydis
pC g-GFP-
Ala6-MXN-Cbx
Ampicillin, Ca -
boxin
Labo sammlung Übe exp ession on GFP-Fusionsp o einen in
Us ilago maydis
pO e -GFP-
Ala6-MXN-Cbx
Ampicillin, Ca -
boxin
Labo sammlung Kons i u i e Exp ession on GFP-
Fusionsp o einen in Us ilago maydis
pO e -Myc-
Ala6-MXN-Cbx
Ampicillin, Ca -
boxin
Labo sammlung Kons i u i e Exp ession on Myc-
Fusionsp o einen in Us ilago maydis
pO e -3xHA-
Ala6-MXN-Cbx
Ampicillin, Ca -
boxin
Labo sammlung Kons i u i e Exp ession on 3xHA-
Fusionsp o einen in Us ilago maydis
pRU11 Ampicillin, Ca -
boxin
Labo sammlung Übe exp ession on P o einen un e de Kon olle
des c g P omo o s
pRU2 Ampicillin, Ca -
boxin
Labo sammlung Übe exp ession on P o einen un e de Kon olle
des na P omo o s
pMF1C Ampicillin, Ca -
boxin
(B achmann
e al., 2004)
En häl die SfiI-CbxRKasse e
pMF1H Ampicillin, Hy-
g omycin
(B achmann
e al., 2004)
En häl die SfiI-HygRKasse e
pMF1N Ampicillin,
Nou seo icin
(B achmann
e al., 2004)
En häl die SfiI-Na RKasse e
pMF1P Ampicillin,
Phleomycin
(B achmann
e al., 2004)
En häl die SfiI-PhleoRKasse e
pMF2-1H Ampicillin, Hy-
g omycin
(B achmann
e al., 2004)
En häl die SfiI-HygR-Pc g Kasse e
pMF2-1N Ampicillin,
Nou seo icin
(B achmann
e al., 2004)
En häl die SfiI-Na R-Pc g Kasse e
pMF2-1P Ampicillin,
Phleomycin
(B achmann
e al., 2004)
En häl die SfiI-PhleoR-Pc g Kasse e
69

4 Ma e ial und Me hoden
Name Resis enz He kun Ve wendung
pMF5-1H Ampicillin, Hy-
g omycin
(B achmann
e al., 2004)
En häl die SfiI-GFP-TNOS-HygRKasse e
pHA-1H Ampicillin, Hy-
g omycin
AG Kahmann
(MPI Ma bu g)
En häl die SfiI-3xHA-HygRKasse e
pHA-1N Ampicillin,
Nou seo icin
AG Kahmann
(MPI Ma bu g)
En häl die SfiI-3xHA-Na RKasse e
4.3 He s ellung de in diese A bei e wende en U.
maydis S ämme
4.3.1 Ek opische Exp ession on GFP-, RFP-, Myc- und 3xHA-
Fusionsp o einen im ip Locus und im na 1 Locus on
Us ilago maydis
Zu ek opischen kons i u i en Exp ession on C- e minalen Fusionsp o einen, wu de das zu ma kie-
ende Gen wahlweise in die SmaI Schni s elle, ode zwischen die SmaI und die NcoI Schni s elle de
Plasmide pO e -GFP-Ala6-MXN-Cbx (Cdc24-GFP, Cla4-GFP) ode p123-RFP (Cla4-RFP) ligie .
Zu kons i u i en Exp ession on N- e minalen Fusionsp o einen, wu den die Gene zwischen die MluI
ode SacII und die No I Schni s elle de Plasmide pO e -GFP-Ala6-MXN-Cbx (GFP-Rdi1, GFP-
Bem1), pO e -Myc-Ala6-MXN-Cbx (Myc-Bem1) und pO e -3xHA-Ala6-MXN-Cbx (3xHA-Fusionen
de GAP-Domänen on Rip1, Bem2 und Bem3) ligie . Die Plasmide wu den du ch Inkuba ion mi
SspI inne halb de Ca boxin-Resis enz linea isie und in U. maydis eingeb ach . Die ko ek e In e-
g a ion du ch homologe Rekombina ion in den ip Locus, wu de mi els Kon oll-PCR übe p ü . De
ip-Locus on U. maydis kodie ü die Eisen-Schwe el-Un e einhei de Sukzina -Dehyd ogenase. Ein
Aminosäu enaus ausch an Posi ion 257 on His idin nach Leucin üh dazu, dass de O ganismus eine
Resis enz gegen das Fungizid Ca boxin en wickel . Neben de gewünsch en o sspezifischen In eg a ion
du ch homologe Rekombina ion, kann es abe auch zu ande en In eg a iose eignissen kommen. Mi den
olgenden P ime kombina ionen können ich ige T ans o manden bes imm we den:
P ime kombina ion 1: MB766 und MB767
Annealing empe a u : 62◦C
P ime kombina ion 2: MB768 und MB769
Annealing empe a u : 64◦C
P ime kombina ion 3: MB767 und MB769
Annealing empe a u : 62◦C
Dabei paa de P ime MB767 mi de genomischen Sequenz obe halb des ip-Locus, de P ime
MB768 mi de Vek o sequenz obe halb des om Vek o codie en, Resis enz e mi elnden Allels, de
P ime MB766 mi dem Resis enz- e mi elnden Allel im Be eich de Mu a ion und MB769 mi dem
Wild yp-Allel im gleichen Be eich. Bei ich ige In eg a ion lie e n die P ime kombina ionen 1 und 2
ein ca. 1,5 kb g oßes F agmen , nich jedoch die Kombina ion 3.
Zu In eg a ion in den na 1 locus wu den 1000bp lange Be eiche obe halb und un e halb des na 1
70
4 Ma e ial und Me hoden
Gens du ch PCR amplifizie . Mi Hil e des Enzyms SmaI wu den s ump e Enden gene ie . Die linke
Flanke wu de zwischen die SspI und die P uII Schni s elle obe halb des o e P omo o s des Plasmides
pO e -cdc24-GFP-Ala6-MXN-Cbx ligie und die ech e in die EcoRV Schni s elle un e halb on GFP.
Eine den Te mina o TNOS und die Hyg omycin esis enz en hal ende Kasse e wu de zwischen GFP
und ech e Flanke zwischen die AflII und No I Schni s elle ligie . Das Kons uk wu de du ch einen
SwaI-Ve dau linea isie und du ch homologe Rekombina ion in den na 1 Locus in eg ie , wobei na 1
dele ie wu de. Die Abwesenhei des Genp oduk es, de Ni a eduk ase1, e möglich e die Selek ion
posi i e Klone du ch mangelndes Wachs um au Ni a . Posi i e Klone wu den mi els „Sou he n
Blo “ bes ä ig .
Ve wende e Oligos:
Name Ve wendung Sequenz
MB766 PCR-Kon olle de ich igen In eg a i-
on in den ip-Locus
GAGCAGTTCATGATGGTAAG
MB767 PCR-Kon olle de ich igen In eg a i-
on in den ip-Locus
TTCGAGCTGGTTGCCTGC
MB768 PCR-Kon olle de ich igen In eg a i-
on in den ip-Locus
CTATGCGGCATCAGAGCAG
MB769 PCR,Kon olle de ich igen In eg a i-
on in den ip-Locus
GAGCAGTTCATGATGGTGTG
MD637 Amplifika ion de linken Flanke des
na 1 Locus mi eine SmaI Schni s el-
le am 5´Ende
gca CCCGGGcaccgcg ccagcgc c cg
MD638 Amplifika ion de linken Flanke des
na 1 Locus mi eine SmaI Schni s el-
le am 3´Ende
gca CCCGGGcc aac gc cg g gg gg
MD639 Amplifika ion de ech en Flanke des
na 1 Locus mi eine SmaI Schni s el-
le am 5´Ende
gca CCCGGGcg gac g aag a ggcgc
MD640 Amplifika ion de ech en Flanke des
na 1 Locus mi eine SmaI Schni s el-
le am 3´Ende
gca CCCGGGccaagc ccaaa c acgg
MC407 Amplifika ion on cdc24 mi eine KpnI
und eine SmaI Schni s elle am 5´En-
de
CCGGGTACCCCCGGGACCATGGCTGCTTCCA-
CATCG
MC408 Amplifika ion on cdc24 mi eine No I
und eine SmaI Schni s elle am 3´En-
de (ohne S opcodon)
CTGGCGGCCGCCTACCCGGGGTTGACGACCA-
ACTC
ME952 Amplifika ion on cdc24 mi eine EheI
Schni s elle am 5´Ende
CGATggcgccATGGCTGCTTCCACATCGCTTGC
ME953 Amplifika ion on cdc24 mi eine EheI
Schni s elle am 3´Ende (ohne S opco-
don)
CGATggcgccGTTGACGACCAACTCGACTTCG
MF554 Amplifika ion on di1 mi eine MluI
und eine SmaI Schni s elle am 5´En-
de
GCATacgcg GcccgggATGTCGCATGCACAGGAT-
CCCACCATTGG
71
4 Ma e ial und Me hoden
Name Ve wendung Sequenz
MF555 Amplifika ion on di1 mi eine SmaI
und eine No I Schni s elle am 3´Ende
(ohne S opcodon)
CGATgcggccgcTTAcccgggCCAGTCCTTGGCGAT-
CTTGAAAGCCCACTC
MF144 Amplifika ion de GAP-Domäne on
bem3 mi eine MluI Schni s elle am
5´Ende
CGATacgcg gTCGATTGCGATCTCCAGCATCCA-
CG
MF145 Amplifika ion de GAP-Domäne on
bem3 mi eine No I Schni s elle am
3´Ende
CGATgcggccgcGTTGTACAACGAGCTGTTTCGC-
TTG
MF146 Amplifika ion de GAP-Domäne on
bem2 mi eine SacII Schni s elle am
5´Ende
CGAT ggcca cCGGTTGGGGGAGCTCGTAGAGC-
GCG
MF147 Amplifika ion de GAP-Domäne on
bem2 mi eine No I Schni s elle am
3´Ende
GCATgcggccgcCTCTGGCTCTGGCTCTGGCTC
MF148 Amplifika ion de GAP-Domäne on
ip1 mi eine MluI Schni s elle am
5´Ende
CGAT ggcca cCTCACTGTACCGTATCGCCTTCG
MF149 Amplifika ion de GAP-Domäne on
ip1 mi eine No II Schni s elle am
3´Ende
CGATgcggccgcCGGTGCGCCTGCCGTCTTGAGA-
TC
ME114 Amplifika ion on cla4 mi eine SmaI
und eine NdeI Schni s elle am 5´Ende
GCATcccgggca ATGTCTGGCTTTCGTGGCACG
ME115 Amplifika ion on cla4 mi eine NcoI
und eine No I Schni s elle am 3´Ende
(ohne S opcodon)
CGATgcggccgcca gggACGATCGGGCTTGTTGCG-
GAAGCGG
MD889 Amplifika ion on bem1 mi eine MluI
Schni s elle am 5´Ende
CGATacgcg cATGAAGGGTCTCAAAGATTTTCG-
C
MD890 Amplifika ion on bem1 mi eine No I
Schni s elle am 3´Ende
GCTAgcggccgcCTAGGAAGCATGGAGCATGAAC-
TTCC
MF204 Amplifika ion on smuI mi eine MluI
und eine SmaI Schni s elle am 5´En-
de
CGATACGCGTGCCCGGGATGCATCCATCACC-
TAAGCGATCGGTGATC
MF205 Amplifika ion on smuI mi eine SmaI
und eine No I Schni s elle am 5´Ende
(ohne S opcodon)
GCATGCGGCCGCCTACCCGGGCGACTTGCGC-
GTCTGTTCACGCGCCGCC
Die Sequenz de Oligos is jeweils in 5‘-3‘ Rich ung angegeben.
4.3.2 Ek opische Übe exp ession on Genen im ip Locus on U.
maydis
Zu ek opischen Übe exp ession on Genen un e de Kon olle on induzie ba en P omo o en wu -
den die Plasmide pRU11 (A abinose induzie ba e c g P omo o ) und pRU2 (Ni a induzie ba e na
72
4 Ma e ial und Me hoden
P omo o ) e wende . Die PCR-amplifizie en Gene wu den zwischen die NdeI und die No I Schni -
s elle de Vek o en ligie . Die In eg a ion in den ip Locus und die In eg a ionskon olle e olg e wie
im o angegangenen Abschni besch ieben.
Ve wende e Oligos:
Name Ve wendung Sequenz
MF486 Amplifika ion on cdc24 mi eine NdeI
Schni s elle am 5´Ende
GCATca ATGGCTGCTTCCACATCGCTTGCG
MF489 Amplifika ion on cdc24 mi eine No I
Schni s elle am 3´Ende
CGATgcggccgcCTAGTTGACGACCAACTCGACT-
TCGC
MF484 Amplifika ion on bem1 mi eine NdeI
Schni s elle am 5´Ende
gca ca ATGAAGGGTCTCAAAGATTTTCGCAGG
MF485 Amplifika ion on bem1 mi eine No I
Schni s elle am 3´Ende
cga gcggccgcCTAGGAAGCATGGAGCATGAACT-
TCC
MF553 Amplifika ion on di1 mi eine NdeI
Schni s elle am 5´Ende
ATCGca ATGTCGCATGCACAGGATCCCACCA-
TTGG
MF555 Amplifika ion on di1 mi eine No I
Schni s elle am 3´Ende
CGATgcggccgcTTAcccgggCCAGTCCTTGGCGAT-
CTTGAAAGCCCACTC
MF592 Amplifika ion on cdc42 mi eine NdeI
Schni s elle am 5´Ende
GCATca ATGCAGACCATCAAGTGTGTCGTCG-
TCGG
MF593 Amplifika ion on cdc42 mi eine No I
Schni s elle am 3´Ende
GCATgcggccgcTCAGAGAATGGCGCACTTGGAC-
TTCTTGCG
MB479 Amplifika ion on ac1 mi eine NdeI
Schni s elle am 5´Ende
CGATca ATGCAGACCATCAAGTGTGTAGTCG
MF151 Amplifika ion on ac1 mi eine No I
Schni s elle am 3´Ende
GCATgcggccgcTTAAAGAATCATACAGTTGTTC-
TTCTTCTTAC
Die Sequenz de Oligos is jeweils in 5‘-3‘ Rich ung angegeben.
4.3.3 He s ellung on Dele ionsmu an en in Us ilago maydis
Die Dele ionskons uk e wu den un e Geb auch eines Resis enzkasse ensys ems, das speziell ü U.
maydis konzipie is , he ges ell (B achmann e al., 2004). Dabei wu den 1000bp lange Be eiche
obe halb und un e halb des zu dele ie enden Gens du ch PCR amplifizie . De ückwä sge ich e e
P ime de linken Flanke und de o wä sge ich e e P ime de ech en Flanke des zu dele ie enden
Gens, wa en mi eine Sfi I Schni s elle e sehen. Das Enzym schneide an S ellen de Sequenz GG-
CCNNNNNGGCC. Dabei wa en die ün Nukleo ide zwischen den GGCC-Flanken de Schni s elle
am 3´-Ende de linken Flanke (Sfiup) und am 5´-Ende de ech en Flanke (Sfidown) un e schiedlich.
Zwischen die Flanken wu de eine Resis enzkasse e mi de zum 3´-Ende de linken Flanke passenden
Sfi I Schni s elle am 5´-Ende und de zum 5´Ende de ech en Flanke passenden SfiI Schni s elle am
3´-Ende, ligie .
Zu He s ellung de Dele ionskons uk e wu de das effek i e Rekombina ionssys em de Bäcke he e S.
ce e isiae genu z . Hie zu wu den an das 5´Ende de linken Flanke und an das 3´Ende de ech en
Flanke ein 30 bp lange , zu dem Plasmid pRS426 homologe , Be eich angehäng . Die zu dem Vek o
homologen Be eiche wa en dabei du ch eine SspI Schni s elle on dem Flankenende ge enn . Ein
zu de Resis enzkasse e homologe 30 bp lange Be eich am 3´Ende de linken und am 5´Ende de
73
4 Ma e ial und Me hoden
ech en Flanke, dien e de In eg a ion de Resis enzkasse e. 500 ng de linken Flanke, de ech en
Flanke und de mi SfiI linea isie en Resis enzkasse e wu den mi 25ng des mi KpnI und BamHI
linea isie en Vek o s gemisch und in He ezellen ans o mie . Die aus de He e isolie en und in E.
coli e meh en Kons uk e, wu den anhand de zwei Ssp1 Schni s ellen linea isie und in U. maydis
P o oplas en eingeb ach . Die ko ek e In eg a ion du ch homologe Rekombina ion wu de in einem
„Sou he n Blo “ bes ä ig .
e wende e Oligos:
Name Ve wendung Sequenz
MF450 Amplifika ion de linken Flanke
on cdc24 mi eine SspI Schni -
s elle am 5´Ende
GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGaa ATTT-
CACCTCGGCTTGCTTTCTCTCCCTATCGGCG
MF451 Amplifika ion de linken Flan-
ke on cdc24 mi eine SfiIup
Schni s elle am 3´Ende
gcaa g cacgcca gg ggcca c aggccGATGAATTGTCTATG-
GCAGAGCTAGCCGAACTC
ME501 Amplifika ion de ech en Flan-
ke on cdc24 mi eine SfiIdown
Schni s elle am 5´Ende
AAGCTGTGCGGCCGCATTAATAGGCCTGAGTGGCC-
CTCTCCCCTGTATTTGTACCTTGCATCCATTCC
MF299 Amplifika ion de ech en Flan-
ke on cdc24 mi eine Ssp1
Schni s elle am 3´Ende
GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCaa ATTT-
GGGCTCGAACATGCCGCAACAGTGGCGACC
SF001 Amplifika ion de linken Flanke
on cla4 mi eine SspI Schni -
s elle am 5´Ende
GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGaa ATTC-
AGTTGTCGTTGCGTGAGATCCAGGGCG
SF002 Amplifika ion de linken Flanke
on cla4 mi eine SfiIup Schni -
s elle am 3´Ende
gcaa g cacgcca gg ggcca c aggccTGTTGCAGACGCTGT-
CTGATGGCGCTCGTTTG
SF003 Amplifika ion de ech en Flan-
ke on cla4 mi eine SfiIdown
Schni s elle am 5´Ende
ggag gcggccgca aa aggcc gag ggccAGCAGGTGCACTCC-
CTTCCCTTTTCATGTATG
SF004 Amplifika ion de ech en Flanke
on cla4 mi eine Ssp1 Schni -
s elle am 3´Ende
GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCaa ATTG-
AGTCTAGTCGGGTCAATCAACTTGCCG
MF556 Amplifika ion de linken Flanke
on di1 mi eine SspI Schni -
s elle am 5´Ende
GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGaa ATTG-
CAGCCTTATTGCGAGCTCAACTGCAAATGG
MF557 Amplifika ion de linken Flanke
on di1 mi eine SfiIup Schni -
s elle am 3´Ende
cgcaa g cacgcca gg ggcca c aggccGATGACGAAGGCAC-
TTTTGCTGCTATAGCAGGGACG
MF558 Amplifika ion de ech en Flan-
ke on di1 mi eine SfiIdown
Schni s elle am 5´Ende
gc g gcggccgca aa aggcc gag ggccAAACTTTCGCTCC-
GGCCCGCCTTCGCTGCTTCATATC
MF559 Amplifika ion de ech en Flanke
on di1 mi eine Ssp1 Schni -
s elle am 3´Ende
GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCaa ATTC-
ATGCCTCTACTTCTCTGCCCTACCCCCATTATC
74

4 Ma e ial und Me hoden
Die Sequenz de Oligos is jeweils in 5‘-3‘ Rich ung angegeben.
4.3.4 He s ellung kondi ionale Mu an en
Die Kons uk e zu He s ellung kondi ionale Mu an en, die das jeweilige Gen un e de Kon olle
des induzie ba en c g P omo o s exp imie en, sind mi denen zu Dele ion on Genen e gleichba .
Jedoch beinhal e die SfiI-Kasse e am 3´Ende des Resis enzma ke s den induzie ba en P omo o und
wi d übe die SfiIdown Schni s elle an das 5´Ende eine zu den e s en 1000 bp des ORFs homologen
Flanke ligie . Die Kons uk e wu den in PJe 2.1 (cdc24 und ip1), pUC18 (bem1) und pRS426 ( di1)
e meh .
Ve wende e Oligos:
Name Ve wendung Sequenz
MC523 Amplifika ion de linken Flanke
on cdc24 mi eine Ps I Schni -
s elle am 5´Ende
CGCTGCAGTCGCTGCTGCCTCTCCGT
MC524 Amplifika ion de linken Flan-
ke on cdc24 mi eine SfiIup
Schni s elle am 3´Ende
GCGGCCATCTAGGCCCGGACCTGAACGCAAGCG
MC525 Amplifika ion de ORF Flanke
on cdc24 eine SfiIdown Schni -
s elle am 5´Ende
GCGGCCTGAGTGGCCATGGCTGCTTCCACATCG
MC526 Amplifika ion de ORF Flanke
on cdc24 eine Ps I Schni s el-
le am 3´Ende
GCGGTACCAACGTTTTCTTCGACA
MD583 Amplifika ion de linken Flanke
on bem1 mi eine SfiI Schni -
s elle am 5´Ende
GCATggcc aga ggccCACGCACAGATACGCCTGCATC
MD584 Amplifika ion de linken Flan-
ke on bem1 mi eine SfiIup
Schni s elle am 3´Ende
GCATggcca c aggccGATGGGCCAATCGCGGTAATGTG-
C
MD585 Amplifika ion de ORF Flanke
on bem1 eine SfiIdown Schni -
s elle am 5´Ende
GCATggcc gag ggccATGAAGGGTCTCAAAGATTTTCG
MD586 Amplifika ion de ORF Flanke
on bem1 eine SfiI Schni s el-
le am 3´Ende
GCATggccac caggccGCATAGCACCGGCCAGAGACCC
MF556 Amplifika ion de linken Flanke
on di1 mi eine SspI Schni -
s elle am 5´Ende
GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGaa ATTG-
CAGCCTTATTGCGAGCTCAACTGCAAATGG
MF557 Amplifika ion de linken Flanke
on di1 mi eine SfiIup Schni -
s elle am 3´Ende
cgcaa g cacgcca gg ggcca c aggccGATGACGAAGGCAC-
TTTTGCTGCTATAGCAGGGACG
MF560 Amplifika ion de ORF Flanke
on di1 eine SfiIdown Schni -
s elle am 5´Ende
ccaaaaaaga acca aa aggcc gag ggccATGTCGCATGCACA-
GGATCCCACCATTGGCGACGAC
75
4 Ma e ial und Me hoden
Name Ve wendung Sequenz
MF561 Amplifika ion de ORF Flanke
on di1 eine SspI Schni s elle
am 3´Ende
GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCaa ATTG-
GGAACTTGCATTGCGTAGAGTACGAGAAGTATTG
ME814 Amplifika ion de linken Flanke
on ip1 mi eine SspI Schni -
s elle am 5´Ende
GCATaa ATTCGCGTGTGCTACTCACGC
ME246 Amplifika ion de linken Flanke
on ip1 mi eine SfiIup Schni -
s elle am 3´Ende
TGAGGCCATCTAGGCCGTTGCTCTCGCCGTGATGT-
GGG
ME816 Amplifika ion de ORF Flanke
on ip1 eine SfiIdown Schni -
s elle am 5´Ende
GCATggcc gag ggccATGGACACGCTCTCCGCTGGG
ME817 Amplifika ion de ORF Flanke
on ip1 eine SspI Schni s el-
le am 3´Ende
GCTAaa ATTTGAATACATCGAAAAAGTTGG
Die Sequenz de Oligos is jeweils in 5‘-3‘ Rich ung angegeben.
4.3.5 Kons uk e zu He s ellung N- und C- e minale
3xHA-Fusionen am genomischen Locus
Die Kons uk e zu He s ellung on C- e minalen 3xHA-Fusionen am genomischen Locus bes anden
aus eine mindes ens 1000 bp langen, zum 3´Ende des ORFs homologen Flanke ge olg , on eine
3xHA-Hyg omycinRSfiI-Kasse e und de 1000 bp langen ech en Flanke. Das S opcodon am 3´Ende
de ORF-Flanke wu de dele ie und die SfiIFus Schni s elle so angehäng , dass das 3xHA-P o ein im
ich igen Lese ahmen lag. Die Kons uk e wu den nach dem selben Ve ah en wie die Dele ionskon-
s uk e in de He e im Vek o pRS426 assemblie und anschließend in E. coli e meh . Linea isie
wu de übe die SspI Schni s elle am 5´Ende de ORF- und am 3´Ende de ech en Flanke.
Zu He s ellung eine N- e minalen 3xHA- ac1 Fusion am genomischen Lokus, wu den zwei komple-
men ä e, ü das 3xHA-P o ein codie ende Oligos aneinande gelage und zwischen die NcoI und die
SacII Schni s elle des Vek o s pO e -GFP- ac1-Ala6-MXN-Cbx ligie . Anschließend wu de die linke
Flanke on ac1 zwischen die KpnI und die NcoI Schni s elle des Plasmides ligie , wobei de o e
P omo o dele ie wu de. Eine TNOS-Hyg omycinRKasse e wu de un e halb on Rac1 zwischen
die AflII und die No I Schni s elle ligie . Die ech e Flanke on ac1 wu de mi Hil e de Enzyme
HpaI (5´Ende) und SmaI (3´Ende) abges ump und in die eben alls s ump e HpaI Schni s elle des
Vek o s ligie . Das Kons uk wu de mi Hil e on KpnI und HpaI linea isie und in U. maydis Zellen
eingeb ach .
Ve wende e Oligos:
Name Ve wendung Sequenz
MF301 Amplifika ion de ORF Flanke
on cdc24 mi eine SspI Schni -
s elle am 5´Ende
GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGaa ATTC-
GTCTACCACCGCGTCCATGGCCAGCAGCTCG
76
4 Ma e ial und Me hoden
Name Ve wendung Sequenz
MF300 Amplifika ion de ORF Flan-
ke on cdc24 mi eine SfiIFus
Schni s elle am 3´Ende (ohne
S opcodon)
cgggcacg cg agggg aggccgcg ggccccGTTGACGACCAAC-
TCGACTTCGCCGGCGGGGC
ME501 Amplifika ion de ech en Flan-
ke on cdc24 mi eine SfiIdown
Schni s elle am 5´Ende
AAGCTGTGCGGCCGCATTAATAGGCCTGAGTGGCC-
CTCTCCCCTGTATTTGTACCTTGCATCCATTCC
MF299 Amplifika ion de ech en Flanke
on cdc24 mi eine SspI Schni -
s elle am 3´Ende
GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCaa ATTT-
GGGCTCGAACATGCCGCAACAGTGGCGACC
ME834 Oligo zu Ein üh ung eines 3xHA
P o eins ( wd)
ca ggccTACCCCTACGACGTGCCCGACTATGCCGGTG-
CCGCCTACCCCTACGACGTGCCCGATTACTCGGCT-
GGTGGTTACCCCTACGACGTGCCCGACTATgccgc
ME834 Oligo zu Ein üh ung eines 3xHA
P o eins ( e )
ggcATAGTCGGGCACGTCGTAGGGGTAACCACCAGC-
CGAGTAATCGGGCACGTCGTAGGGGTAGGCGGCAC-
CGGCATAGTCGGGCACGTCGTAGGGGTAggc
ME836 Amplifika ion de ech en Flan-
ke on ac1 mi eine SfiIdown
und eine SmaI Schni s elle am
5´Ende
GCATcccgggcc gag ggccGAGTGAAACGCGAACACGCA-
GATGG
ME837 Amplifika ion de ech en Flanke
on ac1 mi eine HpaI Schni -
s elle am 3´Ende
CGATg aacGAATCTGTACGAAGACGGCAAAG
ME838 Amplifika ion de linken Flanke
on ac1 mi eine KpnI Schni -
s elle am 5´Ende
GCATgg accCCCCTGTGCACATGTGCTGGTACAG
ME839 Amplifika ion de linken Flanke
on ac1 mi eine NcoI Schni -
s elle am 3´Ende
CGATcca ggGATTGCGAGTGTGAATACGAGAGCGC
Die Sequenz de Oligos is jeweils in 5‘-3‘ Rich ung angegeben.
4.3.6 Kons uk ion des Tes sys ems zu Iden i ika ion des ü den
Cdc24-Abbau aus eichenden F agmen s
Zu He s ellung de N- e minalen SH3-Fusionsp o eine wu de zunächs die zwei e SH3-Domäne on
Bem1 amplifizie und das 5´Ende mi EheI und das 3´Ende mi SmaI abges ump . Bei de anschlie-
ßenden Liga ion in die SmaI Schni s elle obe halb on GFP in pO e -GFP-Ala6-MXN-Cbx wu de
am 3´Ende die SmaI Schni s elle e hal en, in die nach olgend die cdc24 F agmen e ligie wu den.
Abbildung 4.1 A zeig eine Übe sich de amplifizie en cdc24 F agmen e.
In das Plasmid P u11cla4∆CRIB (Le eleki e al., 2004) wu de eine TNOS-Hyg omycin Kasse e
zwischen die AflII und die No I Schni s elle in eg ie . Das Plasmid wu de mi HpaI linea isie und
zu ällig in das Genom on Bub8∆ ac1 (Mahle e al., 2006) in eg ie . In den so e hal enen S amm
wu den die Plasmide mi den cdc24 F agmen en in den ip Locus in eg ie .
77
4 Ma e ial und Me hoden
CH DH PH PB1
cdc24
ME764
ME767ME768ME769 MF348
ME765 MF942 ME766
F agmen 1
F agmen 2
F agmen 3
F agmen 4
F agmen 5
F agmen 6
F agmen 7
F agmen 8
F agmen 3 F agmen 5
F agmen 3 F agmen 8
F agmen 7 F agmen 5
SmaI
SmaI
SmaI
S iIFus S iIdown
3xHA-HygRRF
D622-1016
D622-684
D684-1016
MF301
ME501
A
B
Abbildung 4.1: F agmen ie ung on cdc24 und He s ellung de Kons uk e zu Dele ion
einzelne Be eiche.A) Schema ische Da s ellung de du ch PCR mi den eingezeichne en Oligos
amplifizie en cdc24 F agmen e. B) Übe sich de zu Dele ion in e ne Be eiche e wende en Kon-
s uk e. Die N- e minalen F agmen e (g ün) wu den übe eine SmaI Schni s elle an die C- e minalen
F agmen e ( o ) ligie . Die 3xHA-Hyg omycinRKasse e und die ech e Flanke wu den du ch Rekom-
bina ion in S. ce e isiae angehäng .
Ve wende e Oligos:
Name Ve wendung Sequenz
ME761 Amplifika ion de zwei en SH3-Domäne
on Bem1 mi eine EheI Schni s elle
und einem ATG am 5´Ende
GCATggcgccATGCTCTACGCCGTGGTCAAGTA-
CG
ME763 Amplifika ion de zwei en SH3-Domäne
on Bem1 mi eine SmaI Schni s elle
3´Ende
CGATcccgggATCACGGATCTCGACAAAGGCAA-
CAGG
ME764 Amplifika ion de Cdc24 F agmen e 1,
2, 3 und 7 mi eine SmaI Schni s elle
am 5´Ende
CGATcccgggATGGCTGCTTCCACATCGCTTGC
ME765 Amplifika ion de Cdc24 F agmen e 4
und 6 mi eine SmaI Schni s elle am
5´Ende
GCATcccgggAACATGCGACGACAGCAGGCAGC
ME766 Amplifika ion des Cdc24 F agmen s 5
mi eine SmaI Schni s elle am 5´Ende
GCATcccgggGCCATCAAACTCAACATCAGC
78
4 Ma e ial und Me hoden
P äpa a ion on Plasmid-DNA aus S. ce e isiae
Zu Gewinnung on Plasmid-DNA aus S. ce e isiae wu den 3 ml Flüssigkul u abzen i ugie , das
Sedimen in 200 µl Lösung A (siehe: alkalische Lyse) esuspendie und mi Glaspe len e misch . De
Zellau schluss e olg e au dem Vib ax bei maximale Geschwindigkei . Zu Gewinnung de Plasmide
aus de Suspension wu de das High-Speed Plasmid Mini Ki de Fi ma A egene nach He s elle angaben
e wende .
P äpa a ion on ch omosomale DNA aus Us ilago maydis
Zu Gewinnung on ch omosomale DNA aus U. maydis wu den 3 ml eine dich gewachsenen Übe -
nach kul u abgenommen und in einem en sp echenden Reak ionsge äß zen i ugie (1 min, 13000
pm). Das Sedimen wu de in 500 µl Lysis-Puffe esuspendie und mi 0,3 g Glaspe len und 500 µl
Phenol/Chlo o o m e se z . De Ansa z wu de nach 10 minü igem Schü eln au dem Vib ax zen i-
ugie (10 min, 13000 pm). Die obe e, kla e Phase wu de in einem neuen Reak ionsge äß mi 50 µl
3 M Na iumace a , pH 5,3 und 800 µl 96 %igem E hanol gemisch und zen i ugie (10 min, 13000
pm). De Niede schlag wu de mi 500 µl 70 %igem E hanol gewaschen und anschließend nach oll-
s ändige En e nung des E hanols in 20-50 µl TE mi RNaseA au genommen. Die Langzei lage ung
de p äpa ie en DNA e olg e bei -20◦C.
Lysis-Puffe : 10 mM T is/HCl pH8,0 Phenol/ 50 %( / )Phenol
100 mM NaCl Chlo o o m: 50 % ( / ) Chlo o o m
1 mM EDTA
1 % (w/ ) SDS
2 % (w/ ) T i on X-100
P äpa a ion on RNA aus Us ilago maydis
Zu P äpa a ion on RNA aus U. maydis wu den 20 ml eine exponen iell wachsenden Kul u zen i u-
gie (10 min, 3500 pm) und das Sedimen bei -80◦C schockge o en. Anschließend wu de das Sedimen
in 1 ml TRIzol Reagenz (In i ogen) au genommen und in ein o be ei e es 2 ml Eppendo -Röh chen
mi Glaspe len übe üh . Die Zellen wu den in de Zellmühle 10 min mi maximale Geschwindigkei
au geschlossen. Dann wu de die P obe mi 200 µl Chlo o o m gemisch und ü 3 min bei Raum empe-
a u inkubie . Nach dem Abzen i ugie en (11000 pm, 15 min, 4◦C) wu de die obe e, wäss ige Phase
in einem ischen Eppendo -Röh chen mi 500 µl Isop opanol gemisch . Nach 10 minü ige P äzipi a-
ion bei Raum empe a u wu de die RNA sedimen ie (11000 pm, 15 min, 4◦C) und de Übe s and
e wo en. Das Sedimen wu de mi 1 ml 80 % ETOH gewaschen (11000 pm, 5 min, 4◦C). Nach oll-
s ändigem En e nen des Waschalkohols wu de die RNA in 50 µl RNAse eiem Wasse au genommen,
bei 50◦C ü 10 min gelös und bei -80◦C einge o en.
4.4.3 Analyse und Modi ika ion on Nukleinsäu en
Res ik ionsenzyma ische Spal ung on DNA
Zu Au spal ung de DNA du ch Res ik ionsendonukleasen wu den Enzyme und die dazugehö igen
Puffe sys eme de Fi men New England Biolabs und Fe man as e wende . Sowohl die Puffe konzen-
a ion, als auch die Inkuba ions empe a u und Enzymkonzen a ion wu de nach He s elle angaben
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4 Ma e ial und Me hoden
gewähl . Bei Ansä zen mi zwei Enzymen wu de au die Puffe -Kombina ions abellen de He s elle
zu ückgeg iffen.
Au ennung on DNA-F agmen en mi els Aga ose-Gelelek opho ese
Zu Au ennung de DNA-F agmen e wu den Aga osegele benu z (Sha p e al., 1973). Eine Sus-
pension on 0,8-1,5 % Aga ose in TAE-Puffe wu de au gekoch , nach dem He un e kühlen au 60◦C
bis au eine Endkonzen a ion on 1-5 µg/ml mi E hidiumb omid e se z und in einen Gelschli en
mi einges eck em Kamm eingegossen. Nach dem E s a en des Geles wu de de Kamm en e n und
de Schli en in die mi TAE-Puffe be üll e, ho izon ale Gelkamme eingeleg . Die au zu ennenden
DNA-Lösungen wu de mi 1/10 Volumen 10x Au agspuffe gemisch und in die Taschen gegeben. Die
Au ennung e olg e bei 80-130 V. Als G ößens anda d wu de de Gene ule T M DNA Ladde Mix de
Fi ma Fe men as e wende . Zu Dokumen a ion wu den die DNA-Banden du ch UV-Lich sich ba
gemach und pho og aphie .
TAE- 40 mM T is/HCl pH8,3 DNA- 0,2 % (w/ ) O ange G
Lau puffe : 20 mM Na iumace a Au agspuffe : 50 % (w/ ) Saccha ose
2 mM EDTA 1 mM EDTA
Au ennung on RNA mi els dena u ie ende Glyoxal/DMSO-Gelelek opho ese
Zu Au ennung on RNA du ch Aga osegelelek opho ese, wu den 5-20 µl de RNA-Lösung mi 5
µl 10x MOPS-Puffe , 5 µl 8M Glyoxal und 10 µl DMSO gemisch und ü eine S unde bei 50◦C
dena u ie . Nach dem Zuse zen on 4 µl Au agspuffe wu den die P oben in einem 1 %igen MOPS-
Aga osegel bei 90 V au ge enn . Hie bei wu de das Gel jede halbe S unde in de Kamme ged eh ,
wobei auch die Kamme umgepol wu de, um den pH-We des Puffe s möglichs kons an zu hal en.
10x MOPS- 200 mM MOPS pH7,0 RNA- 50 % (w/ ) Saccha ose
Puffe : 80 mM Na iumace a Au agspuffe : 0,25 % (w/ ) B omphenolblau
10 mM Na2-EDTA 0,25 % (w/ ) Xylencyanol FF
in MOPS-Puffe
Ex ak ion on DNA-F agmen en aus Aga osegelen
Zu Isola ion spezifische DNA-F agmen e aus den Gelen, wu den en sp echende Banden ausgeschni -
en und die DNA mi Hil e des Gel/PCR DNA F agmen s Ex ac ion Ki de Fi ma AVEGENE den
He s elle angaben olgend ex ahie .
Dephospho ylie ung on DNA
Um die Selbs liga ion on Vek o en zu minimie en, wu den die geschni enen Vek o en mi de Sh imp
Alkaline Phospha ase (SAP) de Fi ma Fe men as, in en sp echendem, om He s elle mi gelie e en
Puffe , dephospho ylie . Das Enzym wu de den Ansä zen im Volumen on 0,5-1 µl zugegeben und
nach de eins ündigen Inkuba ion bei 37◦C du ch Hi ze inak i ie (15 min, 65◦C).
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4 Ma e ial und Me hoden
Liga ion on DNA-F agmen en
Zu ko alen en Ve knüp ung on zwei bis d ei DNA-F agmen en, wu den diese in geeigne em Ve häl nis
(i.d.R. 1/10 Vek o und 9/10 zu inse ie endes F agmen ) in einem Reak ionsge äß au ein End olu-
men on 17,5 µl e einig und mi 2 µl 10xLigasepuffe und 0,5 µl T4-DNA-Ligase de Fi ma Roche
Diagnos ics GmbH e se z . Die Inkuba ion e olg e übe Nach bei 14◦C.
DNA-Sequenzie ung
Die Sequenzie ung on DNA-F agmen en e olg e nach de Ke enabb uch-Me hode (Sange e al.,
1977) und wu de on de Fi ma eu ofins du chge uh .
T ans e und De ek ion on DNA au Memb anen (Sou he n Blo )
Zu De ek ion on DNA-Res ik ions agmen en definie e G öße und Sequenz wu de die Sou he n
Blo ing Me hode (Sou he n, 1992) du chge üh . Dabei wu den elek opho e isch au ge enn e DNA-
F agmen e au eine Nylonmemb an übe agen und du ch Hyb idisie ung mi adioak i ma kie en
Sonden nachgewiesen. Ch omosomale DNA wu de mi geeigne en Res ik ionsenzymen e dau , im
Aga osegel au ge enn und zu Dokumen a ion un e UV-Lich pho og aphie . Das Gel wu de e s
ü 15 min zu Depu inie ung in 0,25 M HCl und danach ü 20 min in 0,4 N NaOH inkubie . Zu Übe -
agung de DNA au die Nylonmemb an (Hybond-N+, Ame sham Pha macia) wu de eine Glaspla e
übe ein Bassin mi 0,4 N NaOH geleg . Que übe die Glaspla e wu de ein S ei en in T ans e puffe
ge änk es Blo ing-Papie so au geleg , dass beide Enden ins Vo a sbassin ein auch en. Dann wu de
das Gel mi den Taschenöffnungen nach un en au geleg , ge olg on de , mi T ans e puffe bene z en,
Nylonmemb an und d ei Schich en in Puffe ge änk en Blo ing-Papie s. Um die au wä sge ich e en
Kapilla k ä e zu un e s ü zen, wu de eine dicke Schich saug ähiges Papie au geleg und die Kon-
s uk ion mi einem Gewich on 300-500 g beschwe . Geblo e wu de übe Nach . Die Memb an
wu de nach dem Blo en ge ockne und die DNA du ch UV-Bes ahlung (254 nm, 1200 mJ/cm2) im
S a alinke 2400 (S a agene) da au fixie . Die au de Nylonmemb an fixie e DNA wu de mi eine
adioak i en Sonde hyb idisie (Chu ch and Gilbe , 1984). Die Memb an wu de 20 min bei 60◦C in
15 ml Sou he n-Hyb idisie ungspuffe o inkubie . Die Sonde wu de 5 min bei 95◦C dena u ie und
hinzugegeben (Endkonzen a ion e wa 106cpm/ml). Es wu de übe Nach bei 60◦C inkubie und
die Memb an anschließend in 2x 15 ml Sou he n-Waschpuffe 20 min gewaschen. Anschließend wu de
die Memb an in Plas ik olie eingeschweiß und ein bis zwei Tage in eine Phosphoimage Kasse e
(Ame sham) exponie . Die De ek ion de Signale e olg e mi Hil e eines Phosphoimage s (S o m860,
Ame sham).
Depu inie ungs- 0,25 M HCl T ans e - 0,4 M NaOH
Lösung: Lösung:
Hyb idisie ungs- 7 % (w/ ) SDS Waschpuffe : 1 % (w/ ) SDS
puffe : 500 mM Na iumphos-
pha Puffe pH7,0
100 mM Na iumphos-
pha Puffe pH7,0
T ans e und De ek ion on RNA au Memb anen (No he n Blo )
Fü die De ek ion spezifische RNA wu de diese mi els eine dena u ie enden Glyoxal/ DMSO-
Gelelek opho ese in einem 1 %igen MOPS-Aga osegel mi 0,5 µg/ml E hidiumb omid au ge enn .
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4 Ma e ial und Me hoden
Die Gleichmäßigkei de un e UV-Lich sich ba en 18s- und 28s- RNA Banden wu de dokumen ie .
Das Gel wu de 15 min in 20x SSC inkubie . De T ans e de RNA au die Nylonmemb an (Hybond-
N+, Ame sham Pha macia) e olg e im Kapilla blo , wie ü den Sou he n Blo besch ieben, abe mi
20x SSC als T ans e puffe . Auch die Fixie ungs-, Hyb idisie ungs- und De ek ions e ah en wa en
gleich. Es wu de jedoch de No he n-Hyb idisie ungs- und de No he n-Waschpuffe an S elle de
Sou he n-Puffe e wende .
20x SSC: 300 mM Na iumci a - No he n- 50 mM PIPES pH6,5
Puffe pH7,0 Hyb idisie ungs- 100 mM NaCl
3 M NaCl puffe : 50 mM Na iumphospha -
puffe pH7,0
No he n- 1 x SSC 1 mM EDTA
Waschpuffe : 5 % (w/ ) SDS 5 % (w/ ) SDS
He s ellung on adioak i ma kie en Sonden
Zu He s ellung de adioak i en Sonden wu de das Megap ime Labeling Sys em de Fi ma Ame sham
Biosciences e wende . Dabei wu den 25 ng Sonden-DNA mi eine Länge on 400-1000bp mi 5 µl
de P ime -Lösung (Hexanukleo ide mi zu ällige Sequenz) und des illie em Wasse au ein Volumen
on 33 µl au ge üll und im Heizblock bei 95◦C 5 min dena u ie . Danach wu de de Ansa z ku z au
Eis gekühl und 10 µl Reak ionspuffe (Puffe subs anzan und alle dNTPs ausse dCTP), 2 µl Klenow
Polyme ase und 5 µlα32P-dCTP zugegeben. De Ansa z wu de eine S unde bei 37◦C inkubie und
die Reak ion anschließend du ch Zugabe on 5 µl 0,2 M EDTA ges opp . Die Sonde wu de zule z mi
Hil e eine Mobi ec S-200 Säule du ch Zen i uga ion on übe schüssigen Nukleo iden ge einig .
Ampli ika ion on DNA
Die DNA wu de mi el „Polyme ase-Chain-Reac ion“amplifizie (Mullis e al., 1986; Bell, 1989; Whi e
e al., 1989). Du ch die he mos abilen Polyme asen P x (In i ogen) und Phusion (Finnzymes) wu -
den mi Hil e on Oligos und dNTPs spezifische DNA-F agmen e amplifizie . Die PCR-Reak ion läu
in 3 cha ak e is ischen Sch i en ab. Zunächs wi d die doppels ängige DNA du ch E hi zen au 94◦C
dena u ie und so in einzels ängige DNA übe üh . Bei eine Tempe a u zwischen 50-60◦C binden
die PCR-P ime an die DNA-Einzels änge (Annealing). Die he mos abile Polyme ase syn he isie
anschließend ausgehend on den P ime n einen komplemen ä en DNA-S ang. Du ch eine e neu e De-
na u ie ung bei 94◦C beginn de Zyklus e neu . Sowohl die e wende en Puffe -, Oligo-, dNTP- und
DNA-Konzen a ionen, als auch die Inkuba ionszei en und Tempe a u en ich e en sich nach den He -
s elle angaben.
S anda d-PCRs wu den in einem End olumen on 50µl wie olg du chge üh :
5µl 10x PCR-Puffe
1µl MgSO4(50 mM)
1µl dNTPs (10 mM)
0,5 µl 5’P ime (25 mM)
0,5 µl 3’P ime (25 mM)
100 ng Ma izen-DNA
2,5 U DNA-Polyme ase
H2O ad 50 µl
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4 Ma e ial und Me hoden
S anda d PCR-P og amm:
5 min 95◦C (ini iale Dena u ie ung)
1 min 95◦C (Dena u ie ung)
1 min 40-65◦C (Annealing, abhängig on P ime n)
1 min 72◦C (Elonga ion, 1 min p o kb)





30x
10 min 72◦C (Auffüll-Reak ion)
Die PCR-P oduk e konn en anschließend in den Klonie ungs ek o pJET2.1 ligie we den.
4.4.4 T ans o ma ion on Mik oo ganismen
He s ellung on chemokompe en en E. coli Zellen
Chemokompe en e E. coli-Zellen wu den nach de CCMB 80 Me hode he ges ell . 100 ml DYT-
Flüssigkul u wu den ae ob bei 37◦C bis au eine op ische Dich e (OD600) on 0.4 angezogen. Die
Kul u wu de 20 min au Eis inkubie und die Zellen anschließend zen i ugie (3500 pm, 5 min,
4◦C). Das Sedimen wu de in 30 ml CCMB 80 Puffe esuspendie und 15 min au Eis inkubie . Dann
wu den die Zellen e neu zen i ugie (3500 pm, 15 min, 4◦C) und das Sedimen in 8 ml CCMB 80
Puffe au genommen. Die Zellen wu den in 50 µl Aliquo s bei -80◦C ie ge o en.
CCMB 80: CaCl211,8 g/l
MnCl24 g/l
MgCl22 g/l
Kaliumace a 10 ml/l eine 1M S ocklösung
Glyce in 100 ml/l
T ans o ma ion on chemokompe en en E. coli-Zellen
Zu T ans o ma ion chemisch kompe en e E. coli-Zellen wu den 10 µl des Liga ionsansa zes mi 50 µl
chemokompe en en Zellen gemisch und ü 20 min au Eis inkubie . Dann wu de de Ansa z ü eine
Minu e au 42◦C e wä m , danach mi 1 ml dYT-Medium e se z und ü 30-60 min un e ae oben
Bedingungen bei 37◦C inkubie . Anschließend wu den die Zellen abzen i ugie , das Sedimen in 100
µl s e iles Wasse au genommen und au Selek i medium auspla ie . Die Pla en wu den übe Nach
bei 37◦C inkubie .
P o oplas ie ung on U. maydis
Zu He s ellung on U. maydis-P o oplas en wu den 50 ml YEPS-Flüssigkul u en de jeweiligen S äm-
me bis zu eine op ischen Dich e (OD600) on ca. 0,5 angezogen und anschließend zen i ugie (3500
pm, 5 min, RT). Das Zellsedimen wu de in 25 ml SCS-Lösung esuspendie und e neu abzen-
i ugie (3500 pm, 5 min, RT). Dann wu de das Sedimen in 2 ml SCS-Lysing-Enzymes-Lösung
(SIGMA) au genommen und die P o oplas ie ung de Zellen un e dem Mik oskop e olg . Als de
An eil an P o oplas en im Ansa z ca. 70% be ug, wu de die Reak ion du ch Zugabe on 10 ml eis-
kal e SCS-Lösung ges opp und die P o oplas en pele ie (2500 pm, 10 min, 4◦C). Das Sedimen
wu de zweimal mi 10 ml eiskal e SCS-Lösung und einmal mi dem gleichen Volumen an eiskal e
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4 Ma e ial und Me hoden
STC-Lösung gewaschen und in 300 µl eiskal e STC-Lösung au genommen. Die P o oplas en wu den
in Volumina on 50 µl aliquo ie und bei -80◦C einge o en.
SCS-Puffe : 20 mM Na iumci a STC-Puffe : 10 mM T is/HCl pH7,5
-Puffe pH5,8 100 mM CaCl2
1 M So bi ol 1 M So bi ol
SCS-Lysing-Enzymes-
Lösung:
35 mg/ml Lysing Enzymes in
SCS
T ans o ma ion on U. maydis-P o oplas en
Zu T ans o ma ion wu den 50 µlU. maydis-P o oplas en au Eis au ge au und mi 500 ng de
zu ans o mie enden DNA e se z . De Ansa z wu de ü 10 min au Eis inkubie . Anschließend
wu den 350 µl STC/PEG zugegeben und e neu ü 15 min au Eis inkubie . Du ch die Zugabe on
PEG wu den die Zellmemb anen ü die zugegebene DNA pe meabel gemach . De Ansa z wu de
au Regene a ionsaga auspla ie . Diese wu de in zwei Schich en übe einande gegossen, on denen
die un e e das Fungizid in zwei ache Konzen a ion en hiel , ü das die ans o mie e DNA die
Resis enz e mi el e. Die obe e Schich wa ei on Selek ions ak o en. So s ell e sich du ch Diffusion
zwischen den beiden Schich en e s übe einen länge en Zei aum hinweg die übliche Konzen a ion
des An ibio ikums ein, so dass es o he zu Ausp ägung de Resis enz in den ans o mie en Zellen
und zu de en Regene a ion kommen konn e. Die Pla en wu den bei 28◦C inkubie .
STC/PEG: 40 % (w/ ) Polye hylenglycol in STC
T ans o ma ion on S. ce e isiae Zellen
De zu ans o mie nde He es amm wu de in 50 ml YEP Medium mi 1 % (w/ ) Glukose übe Nach
bis au eine OD600 on 0,5 angezogen. Die Kul u wu de abzen i ugie (3000 pm, 10 min, RT),
de Übe s and e wo en und das Sedimen in einem de Anzahl an T ans o ma ionen angepass em
Volumen LiT au genommen. Aliquo s on 100 µl wu den in s e ile Eppendo -Röh chen e eil und
mi 5 µl dena u ie e He insspe ma-DNA (10 mg/ml) und 1 µg Plasmid-DNA gemisch . Nach Zugabe
on 500 µl LiT-PEG wu de de Ansa z un e s e igem Du chmischen bei RT ü eine S unde inku-
bie . Anschließend wu den 50 µl DMSO zugegeben und ü 15 min bei 42◦C inkubie . Nach ku zem
Abzen i ugie en (3000 pm, 30 s) wu de die Zellen in 100 µl s e ilem Wasse au genommen und au
Selek ionsmedium auspla ie .
LiT: 10 mM T is-HCl pH 7,4 LiT-PEG: 100g PEG in
100 mM Li hiumace a 100 ml LiT
4.4.5 P o einbiochemische Me hoden
P o einex ak ion aus U. maydis Zellen
Zu He s ellung on P o einex ak en aus U. maydis wu den 25 ml eine dich en Flüssigkul u zen i-
ugie (3500 pm, 5 min, RT) und das Sedimen in 10 ml TBS-Puffe gewaschen. Nach einem wei e en
90

4 Ma e ial und Me hoden
Zen i uga ionssch i (3500 pm, 5 min, RT) wu de das Sedimen in 500 µl TBS au genommen und
in ein 2 ml Reak ionsge äß übe üh . De Zellsuspension wu den 0,3 g Glaspe len, 5 µl 10 % T i on
X-100 und 5 µl P o ease Inhibi o Cock ail ü Pilze (Sigma) zugese z und de Ansa z in flüssigem
S icks off schockge o en. Dann wu de das Reak ionsge äß bei 4◦C 30 min au dem Vib ax geschü el .
De Ansa z wu de zen i ugie (13000 pm, 10 min, 4◦C). De kla e Übe s and wu de in ein neues
Reak ionsge äß übe üh und die P o einkonzen a ion bes imm . Die Langzei lage ung de P o eine
e olg e bei -80◦C.
TBS: 50 mM T is/HCl pH7,5
150 mM NaCl
Konzen a ionsbes immung on U. maydis P o einex ak en
Die E mi lung de P o einkonzen a ion e olg e nach B ad o d (B ad o d, 1976), alle dings in eine
modifizie en Fo m mi Bio ad-Reagenz (Bio ad). Die P o einp oben wu den au ein End olumen on
100 µl um den Fak o 1:10 in TBS e dünn . 10 µl da on wu den mi 990 µl de um den Fak o 1:5
e dünn en Bio ad-Lösung gemisch . De Nachweis e olg e so o im Pho ome e bei eine Wellenlänge
on 595nm. Zu S anda disie ung wu den BSA-Ve dünnungs eihen mi definie en Konzen a ionen
eingese z .
SDS-Gelelek opho ese
Fü die Au ennung de P o einex ak e wu den SDS-hal ige Polyac ylamidgele genu z . 6 %ige Po-
lyac ylamidgele dien en dem Nachweis de Cdc24-GFP Fusion, 12 %ige dem on GFP.
Komponen e % 1 M T is
pH8,8
1 M T is
pH6,8
SDS Aa/Bis
30:0,8
H2O APS TEMED
T enngel 6 2250µl - 75µl 1200µl 2400µl 100µl 10µl
T enngel 10 2250µl - 75µl 2000µl 1600µl 100µl 10µl
T enngel 12 2250µl - 75µl 2400µl 1200µl 100µl 10µl
Sammelgel - - 375µl 30µl 500µl 2050µl 50µl 7,5µl
APS-S ammlösung: 10 % (w/ ) Ammoniumpe oxidsul a
SDS-S ammlösung: 10 % (w/ ) Na iumdodecylsul a
Fü die P o eingele wu den Mini-PROTEAN Te a Cell Appa a u en (Bio ad) e wende . Die Ap-
pa a u wu de nach He s elle angaben zusammengese z , au ih e Dich hei übe p ü und zue s das
T enngel zwischen die Glaspla en gegossen. Dieses wu de mi Isop opanol übe schich e . Nach dem
Auspolyme isie en des T enngels, wu de de Alkohol olls ändig abgenommen, das Sammelgel ein-
gegossen und de Kamm eingese z . Nach dem Auspolyme isie en des Sammelgels, wu de de Kamm
en e n , die Taschen so g äl ig gespül und das Gel in die e ikale Lau kamme eingese z . Die äuße e
und die inne e Puffe kamme wu den mi Lau puffe be üll . Die P o einp oben wu den in TBS au
eine Konzen a ion on 2 µg/µl e dünn und je 10 µl diese P o einlösung mi 3 µl 3x P obenpuffe
e se z . Die Ansä ze wu den 5 min zu Dena u ie ung au gekoch , ku z au Eis he un e gekühl und
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4 Ma e ial und Me hoden
au das Gel au ge agen. Die Elek opho ese e olg e bei 120 V. Als Längens anda d wu de de Ma ke
„Page Rule P es ained P o ein Ladde “ de Fi ma Fe men as e wende .
3x P o ein- 400 mM T is/HCl pH6,8 P o eingel 0,25 % (w/ ) Coomassie
Au agspuffe : 30 mM DTT -Fä belösung: B illian Blue R-250
6 % (w/ ) SDS 20 % ( / ) Me hanol
40 % ( / ) Glyce in 10 % ( / ) Essigsäu e
0,006 % (w/ ) B omphenolblau
Lau puffe : 25 mM T is/HCl pH8,8 En ä be : 20 % ( / ) Me hanol
200 mM Glycin 10 % ( / ) Essigsäu e
0,2 % (w/ ) SDS
T ans e und Nachweis on P o einen au PVDF-Memb anen (Wes e n Blo )
Die P o eine wu den au eine PVDF-Memb an du ch Hyb idisie ung mi spezifischen An ikö pe n
nachgewiesen (Gül ekin and Hee mann, 1988). Fü den T ans e de P o eine om SDS-Gel au ei-
ne PVDF (Poly inylidenfluo id)-Memb an (Ro h) wu de ein „We -Blo “ mi eine Mini T ans-Blo
Cell (BioRad) du chge üh . Dabei wu de ein mi Blo puffe ge änk es Schwämmchen au die de
Ka hode zugewand e Sei e de Blo -Kasse e geleg und mi einem eben alls in Puffe ge änk em
Wha man-Papie übe schich e . Da au wu de das T enngel pla zie . Au das T enngel wu de die in
Me hanol ak i ie e PVDF Memb an au geleg und mi eine wei e en Lage Papie und dem zwei en
Schwämmchen übe schich e . Die Kasse e wu de in die Blo -Appa a u eingespann und bei 25 V übe
Nach , ode bei 100 V ü eine S unde geblo e . Die Memb an wu de in TBST0,1-Milch 10 min un e
Ro a ion abgesä ig und in einen Plas ikbeu el eingeschweiß . In diesen wu den 10 ml eine 1:1000
Ve dünnung des p imä en An ikö pe s (GFP mouse monoclonal IgG2a, San a C uz Bio echnology; HA
mouse monoclonal IgG, eigene He s ellung; RFP mouse monoclonal IgG, San a C uz Bio echnology;
Tub1 mouse monoclonal IgG, Calbiochem; Myc abbi monoclonal IgG, Sigma) in TBST0,1-Milch ein-
ge üll . De Ansa z wu de übe Nach bei 4◦C au de Wippe inkubie . Dann wu de die Memb an 3x
10 min in 10 ml TBST0,1gewaschen und danach mi eine 1:1000 Ve dünnung des sekundä en An ikö -
pe s (donkey an i-mouse IgG-HRP conjuga e, San a C uz Bio echnology; goa an i abbi IgG-HRP
conjuga e, San a C uz Bio echnology) in TBST0,1-Milch zwei S unden bei Raum empe a u inkubie .
Zum Nachweis de P o eine du ch Chemilumineszenz wu de die Memb an 3x 10 min in 10 ml TBST0,1
gewaschen, abge op und in eine nach d ei Sei en hin offene Plas ikhülle geleg . 0,5 ml de De ek-
ionslösung 1 wu den mi 0,5 ml de De ek ionslösung 2 gemisch und au die Memb an au ge op .
Übe schüssige Lösung wu de zu den Sei en hin aus de Plas ikhülle ges ichen. Die Memb an wu de
in ih e Hülle in eine Rön genkasse e eingeleg , ein Film au geleg und de Blo ü 15 s-5 min in de
geschlossenen Kasse e exponie . Dann wu de de Film en wickel . Die Memb an wu de 1 min in eine
Schale Ponceau-S-Lösung (Sigma) gebade und dann so lange in Wasse en ä b , bis die Gesam hei
de P o einbanden au ih deu lich sich ba wa en.
T ans e puffe : 25 mM T is TBST: 0,1 % ( / ) Tween 20 in TBS
200mM Glycin
0,02 % (w/ ) SDS TBST-Milch: TBST mi 3% (w/ )
20 % ( / ) Me hanol T ockenmilch
92
4 Ma e ial und Me hoden
Luminol A: 100 mM T is/HCl pH 8,5 Luminol B: 100 mM T is/HCl pH 8,5
2,5 mM Luminol 5,4 mM H2O2
400 µM P-Cuma säu e
Au einigung on Fusionsp o einen aus E. coli
Die DH-PH Tandem Domäne on Cdc24 und die Vollängen GTPasen wu den als GST-Fusionsp o eine
im pGEX Vek o Sys em (GE-Heal hca e) ode als NusA-6xHis-Fusionsp o eine in Vek o pETM6
(Dümmle e al., 2005) in dem E. coli S amm BL21-CodonPlus(DE3)-RP(Codon3+) übe exp imie .
Die Zellen wu den übe Tag in 1 l DYT Medium bei 37◦C bis au eine OD600 on 0,4-1 angezogen. Die
Induk ion e olg e übe Nach bei 24◦C und 0,25 mM IPTG. Anschließend wu de die Zellen abzen i-
ugie und in 10-15 ml Lyse-Puffe esuspendie . De Zellau schluss e olg e in de „F ench-P ess“.
De du ch Ul azen i uga ion (35000 pm, 1 h, 4◦C) geklä e Ex ak wu de anschließend mi GSH-
Aga ose (Mache ey-Nagel) ode Ni-NTA-Aga ose (Qiagen) gemisch und bei 4◦C eine S unde un e
Ro a ion inkubie . Die beladene Aga ose wu de abzen i ugie (500 pm, 15 min, 4◦C) und d ei ach
mi Lyse-Puffe gewaschen. Die GST-Fusionsp o eine wu den mi 10 mM eduzie em Glu a hion bei
pH 8,8 eluie und die NusA-6xHis-Fusionsp o eine mi 50 mM Imidazol. Die P o eine wu den bei
-80◦C gelage .
Lyse-Puffe : 50 mM T is-HCl pH 7.5
100 mM NaCl
10 mM MgCl2
5 mM DTT ode 2.5 mM 2-me cap oe hanol
P o ease Inhibi o (Roche)
Kop äzipi a ionen
Die au ge einig en GTPasen wu den an GSH-Aga ose (Mache ey-Nagel) ode Ni-NTA-Aga ose (Qia-
gen) gebunden. Zu Beladung mi GDP ode GTPγS wu den die GTPasen in Lyse-Puffe , mi 20
mM EDTA und en wede 10 mM GDP ode 1 mM GTPγS inkubie (1 h, 4◦C). Anschließend wu de
die Beladung du ch die Zugabe on MgCl2bis zu eine finalen Konzen a ion on 20 mM ges opp .
Die beladenen GTPasen wu den zwei ach mi Lysepuffe gewaschen. Jeweils 10 µl GTPase wu den
mi 100-200 µgU. maydis P o einex ak gemisch , de eine ma kie e Va ian e des in e agie enden
P o eins en hiel . Um den Beladungss a us de GTPasen zu e hal en, wu den den Ansä zen 10 mM
GDP ode 1 mM GTPγS zugese z . Die Ansä ze wu den eine S unde bei 4◦C o ie end inkubie . An-
schliesend wu den die Aga ose sedimen ie (3000 pm, 1 min, 4◦C) und ünffach mi 1 ml Lyse-Puffe
gewaschen. Das P äzipi a wu de in SDS-P obenpuffe au gekoch , in einem SDS-Gel au ge enn und
die p äzipi ie en P o eine nach dem T ans e au PVDF Memb anen mi spezifischen An ikö pe n
de ek ie .
GST-CRIB-P äzipi a ion
Fü die CRIB-P äzipi a ion wu de GSH-Aga ose mi au ge einig em GST-CRIB P o ein beladen. Die
U. maydis Ex ak e wu den ie S unden nach Induk ion de Übe exp ession des bE1/bW2 T ansk ip-
ions ak o s ode de Cdc24 Va ian en p äpa ie . Die geklä en Ex ak e mi definie e P o einkon-
zen a ion wu den mi gleichen Mengen GST-CRIB-beladene GSH-Aga ose inkubie (30 min, 4◦C).
Das P äzipi a wu de d ei ach gewaschen, und die P o eine im „Wes e n-Blo “ nachgewiesen.
93
4 Ma e ial und Me hoden
Quan i izie ung on P o einmengen
Zu Quan ifizie ung de S ä ke de HRP-Fluo eszenz bei de De ek ion on P o einen au PVDF-
Memb anen, wu den die Signale mi Hil e eine Chemokame a de Fi ma INTAS und de zugehö i-
gen So wa e ChemoS a pho og aphie . Die Quan ifizie ung de Signalin ensi ä e olg e mi dem
P og amm ImageJ (Ab amoff e al., 2004). Dazu wu den die einzelnen Banden mi dem We kzeug
“Rec angula Selec ions“ ma kie und de du chschni liche G auwe „Mean G ay Value“ mi dem
We kzeug „Measu e“ im Menü „Analyze“ bes imm . Von diesem We wu de de gemessene We ü
den Hin e g und des Pho os abgezogen. Um die e hal enen We e ü die einzelnen Banden au die
eingese z e Gesam p o einmenge zu no mie en, wu de de zu quan ifizie ende We du ch den, in de
gleichen Spu , ü die Kon olle Tub1 e hal enen We di idie . Anschließend wu de die p ozen uale
Abweichung de Messwe e on de Wid yp Kon olle be echne .
4.4.6 In ek ion on Zea mays
Zum Tes de Pa hogeni ä on U. maydis-S ämmen wu den im Gewächshaus gezogene 7 Tage al e
Maispflanzen de So e Ea ly Golden Ban am infizie . Dazu wu den Kul u en des solopa hogenen
S ammes SG200 mi eine OD600 on 0,5 abzen i ugie und eine Zellsuspensionen mi OD600 1,0
in s e ilem Wasse he ges ell . Je 500 µl wu den mi Hil e eine Sp i ze in den S ängel de Pflanze
un e halb des Bla ansa zes injizie . Die Pflanze konn e nach 14 Tagen au Chlo ose-, An hocyan-
und Gallenbildung un e such we den.
4.4.7 Mik oskopie on U. maydis-Zellen
Zu Mik oskopie on U. maydis-Zellen kam ein Fluo eszenzmik oskop om Typ Axio e 200M mi
einem Ludel Piezo D i e (Zeiss) zum Einsa z. Die Fä bungen e olg en mi den Fluo eszenz a bs offen,
die in de nach olgenden Tabelle angegeben sind. Sie wu den (bis au GFP) den Flüssigkul u en in
de genann en Endkonzen a ion beigemisch (Inkuba ionszei : 5 min). Die zu un e suchenden Zellen
wu den im Volumen on 1 µl au einen mi eine ca. 0,5 mm dicken Wasse aga schich bedeck en
Objek äge au ge op . Anschließend wu de das Deckglas au geleg . De Wasse aga dien e de Fi-
xie ung de Zellen an ih e Posi ion um unscha e Bilde zu e meiden. Zu An egung de e schiedenen
Fa bs offe wu den die zu Wellenlänge passenden Fil e genu z . Ve gleichspho os wu den im Diffe en-
ialkon as gemach . De Dokumen a ion dien e eine Kame a des Typs ORCA (Hammama su) und
die So wa e Voloci y 5.0. Die Bilde wu den mi ImageJ (Ab amoff e al., 2004) bea bei e .
Name Zellbes and eil µg/ml Kul u Exci a ion Emission Fa be
GFP Fusionsp o eine - 400 nm 509 nm g ün
Calcofluo Glucan 2 350 nm 461 nm blau
CMAC Vakuolen 1 350 nm 466 nm blau
94
Li e a u e zeichnis
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