Die dynamische Regulation der kleinen GTPase Rac1 während des polaren Wachstums von Ustilago maydis

Philipps-Universität Marburg Fachbereich Biologie - Genetik - Die dynamische Regulation der kleinen GTPase Rac1 während des polaren Wachstums von Ustilago maydis Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) vorgelegt von Sonja Helene Frieser aus Wiesbaden Marburg/Lahn, Juli 2011 Vom Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg als Dissertation angenommen am: Gutachter der Arbeit: Erstgutachter: Prof. Dr. Michael Bölker Zweitgutachter: Prof. Dr. Hans-Ulrich Mösch Tag der mündlichen Prüfung am: Die dieser Arbeit zu Grunde liegenden Untersuchungen wurden von November 2006 bis März 2011 am Fachbereich Biologie, Abteilung Molekulare Genetik der PhilippsUniversität Marburg unter der Leitung von Prof. Dr. Michael Bölker durchgeführt. Teile dieser Arbeit sind in den folgenden Artikeln veröffentlicht: Frieser, S. H., Hlubek, A., Sandrock, B. and Bölker, M. (2011). Cla4 kinase triggers destruction of the Rac1-GEF Cdc24 during polarized growth in Ustilago maydis.Mol Biol Cell (akzeptiert am 01.07.2011) Frieser, S. H., Bauer, A., Przybilla, S., Sandrock, B. and Bölker, M. Spatiotemporal Regulation of Rac1 activity in Ustilago maydis. (in Vorbereitung) Das schönste Glück des denkenden Menschen ist: das Erforschliche erforscht zu haben und das Unerforschliche ruhig zu verehren. - J. W. v. Goethe - Für meine Mutter Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung vi 1 Einleitung 1 1.1 Der phytopathogene Brandpilz Ustilago maydis ............. 1 1.1.1 Der Lebenszyklus von Ustilago maydis .............. 1 1.2 Die kleinen GTPasen Rac1 und Cdc42 in der Regulation der Zellpolarität vonEukaryoten............................... 3 1.2.1 Die Regulation kleiner GTPasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1.2.2 Mechanismen zur Generierung der Signalspezifität kleiner GTPasen 5 1.2.3 Rac1 und Cdc42 in der Regulation der Zellpolarität höherer Eukaryoten............................... 6 1.2.4 Rac1 und Cdc42 in Pilzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.2.5 In der Bäckerhefe und der Spalthefe ist Cdc42 der Hauptregulator des polaren Wachstums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.2.6 Cdc42 und Rac1 in Ustilago maydis ................ 15 1.3 Zielsetzung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2 Ergebnisse 21 2.1 Die Aktivität des Cdc24/Rac1/Cla4/Bem1 Signalmoduls wird während des polaren Wachstums von Ustilago maydis durch eine negative Rückkopplungsschleife reguliert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.1.1 Ein Signalmodul aus Cdc24, Rac1, Cla4 und Bem1 reguliert das polare Wachstum in U. maydis .................. 21 2.1.2 Das Kreuzungstyp-abhängige filamentöse Wachstum von U. maydis basiert auf der Cdc24-abhängigen Aktivierung von Rac1 . . 26 2.1.3 Die b-abhängige Filamentinduktion wird durch einen Abbau von Cdc24begleitet........................... 27 2.1.4 Die Bildung eines Cdc24/Rac1/Bem1/Cla4 Komplexes ist für die negative Regulation von Cdc24 essentiell . . . . . . . . . . . . . 31 i Inhaltsverzeichnis 2.1.5 Die Phosphorylierung von Cdc24 durch Cla4 führt zum Abbau desGEFs .............................. 32 2.2 Die Aktivität des Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Signalmoduls wird durch GAPAktivität, den GDI Rdi1 und aktinvermittelte Endozytose auf die Filamentspitze beschränkt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 2.2.1 Drei GTPase aktivierende Proteine regulieren während des polaren Wachstums die Rac1-GTPase Aktivität . . . . . . . . . . . 38 2.2.2 Der Guanin-Nukleotid Dissoziations Inhibitor Rdi1 stellt inaktives Rac1-GDP zur erneuten Aktivierung zu Verfügung . . . . . 42 2.2.3 Das Entfernen von Rac1-GDP aus der Membran wird durch die aktinabhängige Endozytose während des polaren Wachstums unterstützt............................... 45 2.2.4 Rac1 muss GTP hydrolysieren und mit Rdi1 interagieren können, um das polare Wachstum zu stimulieren . . . . . . . . . . . . . 46 2.3 Die selektive Aktivierung durch Cdc24 bestimmt die Rac1-Signalspezifität 49 2.3.1 Rac1 und Cdc42 haben in U. maydis spezifische und redundante Funktionen ............................. 49 2.3.2 Die Mutante Cdc42F56W gewinnt Rac1-Signalspezifität und verliert Cdc42-Funktionalität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 3 Diskussion 56 3.1 Dynamische Regulation des Cdc24/Bem1/Rac1/Cla4 Signalmoduls . . 56 3.1.1 Die Cla4 abhängige Phosphorylierung von Cdc24 induziert den AbbaudesGEFs .......................... 56 3.1.2 Der Abbau von Cdc24 beschränkt die Aktivität des Bem1/Rac1GTP/Cla4 Signalmoduls auf die wachsende Spitze . . . . . . . . 57 3.1.3 Die Inaktivierung des Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplexes während des polaren Wachstums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 3.1.4 Die bW/bE-abhängige Aktivierung von Cdc24 . . . . . . . . . . 64 3.2 Die selektive Aktivierung durch Cdc24 bestimmt die Rac1-Signalspezifität 65 3.2.1 Rac1 und Cdc42 haben eine gemeinsame essentielle Funktion . . 65 3.2.2 Die Generierung der Rac1-Signalspezifität hängt von Cdc24 ab . 66 3.3 Ausblick................................... 67 4 Material und Methoden 68 4.1 Stämme ................................... 68 4.1.1 E. coli Stämme........................... 68 4.1.2 S. cerevisiae Stämme........................ 68 4.1.3 Ustilago maydis Stämme...................... 68 ii Inhaltsverzeichnis 4.2 Vektoren................................... 69 4.3 Herstellung der in dieser Arbeit verwendeten U. maydis Stämme . . . . 70 4.3.1 Ektopische Expression von GFP-, RFP-, Mycund 3xHAFusionsproteinen im ip Locus und im nar1 Locus von Ustilago maydis 70 4.3.2 Ektopische Überexpression von Genen im ip Locus von U. maydis 72 4.3.3 Herstellung von Deletionsmutanten in Ustilago maydis ..... 73 4.3.4 Herstellung konditionaler Mutanten . . . . . . . . . . . . . . . . 75 4.3.5 Konstrukte zur Herstellung Nund C-terminaler 3xHA-Fusionen am genomischen Locus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 4.3.6 Konstruktion des Testsystems zur Identifikation des für den Cdc24Abbau ausreichenden Fragments . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 4.3.7 Konstrukte zur Deletion von einzelnen Bereichen innerhalb eines ORFs ................................ 79 4.3.8 Einführung von Punktmutationen . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 4.3.9 Konstrukte zur Überexpression von U. maydis Proteinen in E. coli 82 4.4 Methoden .................................. 83 4.4.1 Kultivierung von Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.4.2 Isolierung von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 4.4.3 Analyse und Modifikation von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . 85 4.4.4 Transformation von Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . . 89 4.4.5 Proteinbiochemische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 4.4.6 Infektion von Zea mays ....................... 94 4.4.7 Mikroskopie von U. maydis-Zellen................. 94 4.5 Genutzte Kits, Chemikalien und Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 4.5.1 Allgemeine Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 4.5.2 Kits ................................. 95 4.5.3 Chemikalien............................. 95 4.5.4 Enzyme ............................... 98 Literaturverzeichnis 99 Abkürzungen 112 Danksagung 114 iii Abbildungsverzeichnis 1.1 Erscheinungsformen von Ustilago maydis ................. 1 1.2 Der Lebenszyklus von Ustilago maydis .................. 2 1.3 Die Regulation der Aktivität kleiner GTPasen . . . . . . . . . . . . . . 4 1.4 Rho-GTPasen stehen im Zentrum von komplexen Signalnetzwerken . . 6 1.5 Beispiele für Cdc42/Rac1 abhängige Polarisierungsprozesse in höheren Eukaryoten ................................. 7 1.6 Wichtige Effektoren von Cdc42 und Rac1 in höheren Eukaryoten . . . . 9 1.7 Rac1 ging während der Evolution der Pilze zweimal unabhängig verloren 10 1.8 Regulatorische Proteine und Effektoren von Cdc42 in S. cerevisiae . . . 12 1.9 Regulatorische Proteine und Effektoren von Cdc42 in S. pombe ..... 14 1.10 Rac1 reguliert in U. maydis das polare Wachstum und Cdc42 die Bildung des sekundären Septums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.11 Rho-GEFs in U. maydis .......................... 17 1.12 Rho-GAPs in U. maydis .......................... 18 2.1 Eine durch Bem1 koordinierte lineare Signalkaskade reguliert die Zellpolarität in U. maydis ............................. 22 2.2 Cdc24, Bem1 und Cla4 lokalisieren in kooperativer Weise an der polar wachsendenSpitze ............................. 23 2.3 Bem1, Cdc24, Rac1 und Cla4 bilden einen Multiproteinkomplex . . . . 25 2.4 Die Filamentinduktion führt zu einem erhöhten Level von aktivem Rac1GTP..................................... 27 2.5 Cdc24 wird während der vom b-Kreuzungstyp abhängigen Filamentinduktiondegradiert ............................. 28 2.6 Die negative Rückkopplungsregulation von Cdc24 hängt von der Bildung eines funktionalen Cdc24/Rac1/Cla4/Bem1 Signalmoduls ab . . . . . . 30 2.7 Der Abbau von Cdc24 hängt während des filamentösen Wachstums von der Cla4 Kinaseaktivität ab . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 iv Abbildungsverzeichnis 2.8 Der Bereich zwischen PHund PB1-Domäne wird durch Cla4 Aktivität phosphoryliert und abgebaut . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 2.9 Eine Region von 62 Aminosäuren ist für den Cla4-induzierten Abbau von Cdc24erforderlich.............................. 36 2.10 Die Expression einer stabilisierten Cdc24 Variante interferiert mit der Induktion des filamentösen Wachstums . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.11 Drei GTPase aktivierende Proteine (GAPs) haben Einfluss auf die Zellpolarität von U. maydis .......................... 39 2.12 Die Rac1-GAPs zeigen unterschiedliche Lokalisationsmuster . . . . . . 40 2.13 Die Deletion der Rac1-GAPs hat eine Bem1-abhängige stabilisierende Wirkung auf die Cdc24 Konzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 2.14 Rdi1 ist ein Regulator der Zellpolarität in U. maydis .......... 43 2.15 Rdi1 hat einen Rac1-abhängigen Einfluss auf die Stabilität von Cdc24 . 44 2.16 Die Inhibition der aktinabhängigen Endozytose hat einen stabilisierenden Effekt auf die Cdc24 Konzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 2.17 Rac1 muss seine GDP-gebundene Konformation durchlaufen und mit Rdi1 interagieren können, um Cdc24 zu destabilisieren . . . . . . . . . 47 2.18 Rac1Q61L benötigt die Interaktion mit Rdi1 und Bem1, um seine Wirkung zuentfalten ................................. 48 2.19 Cdc24 aktiviert Rac1 und Cdc42 in vitro und in vivo, Rac1 jedoch mit höhererPräferenz.............................. 50 2.20 Die essentielle Funktion von Cdc24 hängt von seiner GEF Aktivität ab 51 2.21 Weder das Gerüstprotein Bem1, noch die Effektoren Cla4 und Ste20 diskriminieren zwischen Cdc42 und Rac1 . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 2.22 Die Mutante Cdc42F56W gewinnt Rac1-Signalspezifität, verliert jedoch ihre Cdc42-Funktionalität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 3.1 Schematisches Modell für die negative Rückkopplungsregulation des GEFs Cdc24 .................................... 59 3.2 Drei Rac1-GAPs kontrollieren die Rezyklisierung von Bem1 . . . . . . . 61 3.3 Schematisches Modell für die zyklische Aktivierung und Deaktivierung von Rac1 während des polaren Spitzenwachstums . . . . . . . . . . . . 63 4.1 Fragmentierung von cdc24 und Herstellung der Konstrukte zur Deletion einzelnerBereiche.............................. 78 v 1 Einleitung Magnesium vorliegende GDP verdrängt. Bei der Inkorporation von GTP kommt es zur Umkehrung der GEF-induzierten Strukturänderung (Rossman et al., 2005). Die lipidbindende PH-Domäne dient vermutlich der richtigen Positionierung der DH Domäne relativ zur GTPase an der Plasmamembran (Rossman et al., 2005). In vielen GTPasen existieren C-terminale Strukturen, sogenannte „CAAX-Boxen“, welche z.B. durch Farnesylierung oder Palmitoylierung posttranslational modifiziert werden. Die Modifikationen führen zur Verankerung in der Zytoplasmamembran, die ein wichtiges Element der räumlichen Regulation von G-Proteinen darstellt (Glomset and Farnsworth, 1994; Zhang and Casey, 1996). Für die Regulation von Mitgliedern der Rho/Rac/Cdc42-Familie existieren neben den schon beschriebenen GEFs und GAPs noch weitere Regulationsfaktoren, die Guaninnukleotid Dissoziationsinhibitoren (GDIs), die eine hydrophobe Bindetasche besitzen. Über diese interagieren sie mit der C-terminalen Prenylmodifikation der GTPasen, um diese aus der Membran herauszulösen (Sasaki et al., 1990; Wu et al., 1996b; Seabra and Wasmeier, 2004) (Abb. 1.3). Die Abtrennung der GDI-Regulatoren aus dem cytosolischen Komplex mit der inaktiven GTPase geschieht durch GDI-Dissoziationsfaktoren wie z.B. den ERM Proteinen (Ezrin, Radixin, Moesin), die an GDIs binden und deren Aktivität verringern (Takahashi et al., 1997). 1.2.2 Mechanismen zur Generierung der Signalspezifität kleiner GTPasen Eines der grundlegenden Probleme bei der Untersuchung der Signalweiterleitung durch Rho-GTPasen ist die Frage, wie innerhalb eines GEF/GTPase/Effektor Signalmoduls sichergestellt wird, dass das den GEF aktivierende Signal mit der korrekten zellulären Antwort verknüpft wird. Eine GTPase der Rho-Familie kann in der Regel von mehr als einem GEF aktiviert werden und ihrerseits mit mehr als einem Effektor interagieren, also auch mehr als eine zelluläre Antwort erzeugen (Abb. 1.4). Die Signalspezifität kann in einem solch komplexen Netzwerk durch verschiedene Mechanismen sichergestellt werden. Die GEF-GTPase Erkennung ist, wie auch die GTPase-Effektor Erkennung oft hochspezifisch. Eine besondere Rolle spielt dabei die Aminosäure an Position 56 in Cdc42 (Phenylalanin) und Rac1 (Tryptophan). Es konnte gezeigt werden, dass GEFs der Dbl-Familie über diese Aminosäure zwischen Cdc42 und Rac1 diskriminieren (Gao et al., 2001; Karnoub et al., 2001; Snyder et al., 2002; Hlubek et al., 2008). Zudem liegt diese Aminosäure in der Effektorbindeschleife der GTPase, wo sie auch die Bindung von spezifischen Effektoren beeinflussen kann (Karnoub et al., 2001). In vielen Fällen ist jedoch die Bindung von GTPase Interaktoren relativ unspezifisch. In einem solchen Fall wird die korrekte Interaktion von GEF, GTPase und Effektor in einem Multiproteinkomplex mit einem Gerüstprotein sichergestellt (Marinissen and Gutkind, 5 1 Einleitung 2005; García-Mata and Burridge, 2007). In seltenen Fällen kann auch der GEF selbst als Gerüstprotein fungieren und so die Aktivierung des richtigen Effektors sicherstellen, wie es z.B. bei dem Endozytosegerüstprotein Intersectin der Fall ist (García-Mata and Burridge, 2007). Eine weitere Möglichkeit, Signalspezifität zu generieren, kann auch die spezifische Expression oder Lokalisation der mit der GTPase interagierenden Proteine sein, die die Aktivierung von GTPase und Effektor auf einen bestimmten Zelltyp oder ein Kompartiment beschränkt (García-Mata and Burridge, 2007). Wie man zwischen diesen verschiedenen Szenarien der Spezifitätsgenerierung in einem konkreten Signalmodul unterscheiden kann und darüber zu einem vertieften Verständnis der Signalweiterleitung gelangt, ist eine der größten Herausforderungen beim Studium kleiner GTPasen. A GDP B C D E GTP A B C D Aktivatoren Effektoren GTPase zelluläre Antwort aktivierendeSignale AUS AN Abbildung 1.4: Rho-GTPasen stehen im Zentrum von komplexen Signalnetzwerken. RhoGTPasen können häufig durch mehrere Aktivatoren stimuliert werden und interagieren ihrerseits mit mehr als einem Effektor. Ein molekularer Schalter bildet folglich das zentrale Element mehrerer Signalkaskaden, die unterschiedliche aktivierende Signale mit unterschiedlichen morphologische Effekten verknüpfen. Die Spezifität eines solchen Signalmoduls kann sowohl auf der Seite der Aktivatoren, als auch auf der Seite der Effektoren generiert werden. 1.2.3 Rac1 und Cdc42 in der Regulation der Zellpolarität höherer Eukaryoten Die Ausbildung und Aufrechterhaltung der korrekten Zellpolarität ist besonders für multizelluläre Organismen essentiell. Sie ist Voraussetzung für die Entwicklung der Zellmorphologie, aber auch für die Mobilität individueller Zellen (Etienne-Manneville and Hall, 2002). Dabei sind Cdc42 und Rac1 zusammen mit RhoA zentrale Regulatoren, die das Zytoskelett organisieren. Das bestuntersuchte Beispiel für die Zusammenarbeit der 6 1 Einleitung drei GTPasen ist die Zellmigration. Diese spielt z.B. bei dem Verschluss von Wunden in einem Zellgewebe eine wichtige Rolle, oder bei der Chemotaxis von Makrophagen (Etienne-Manneville and Hall, 2002). Die Zellbewegung von Fibroblasten ist das Resultat der durch Cdc42 und Rac1 stimulierten Aktinpolymerisation, die zur Ausstülpung von Filopodien (Cdc42) und Lamellipodien (Rac1) in der Bewegungsrichtung führt und des RhoA induzierten Zurückziehens von Membran und Zellmatrix am rückwärtigen Zellende durch Stimulation der Aktin-Myosin Kontraktion (Raftopoulou and Hall, 2004) (Abb. 1.5 A). Die Etablierung einer stabilen Polaritätsachse wird dabei durch Polaritätskomplexe sichergestellt, die die GTPasen rekrutieren. Die drei bestuntersuchten Polaritätskomplexe sind in Säugern der Par- (partitioning defective), der Crumbsund der ScribbleKomplex, wobei der Par-Komplex die vielfältigsten Funktionen ausübt (Iden and Collard, 2008). Der Par-Komplex, bestehend aus sechs Par (Par1-6) Proteinen und einer untypischen Proteinkinase C (Pkc3), spielt in Caenorhabditis elegans bei Neuron Dendrit Axon Zygote posterior anterior Chemotaxis Ausstülpungen Kontraktion Zurückziehen RhoA Par6-Par3-Pkc3 -Cdc42 Par1/Par2 Epithelzelle apikal basal AJ TJ Par6-Par3-Pkc3 -Tiam1-Rac1 Cdc42-Par6-Par3 -Tiam1-Rac1 A D B C Scribble-Cdc42-Par6 -Par3-Tiam1-Rac1 Abbildung 1.5: Beispiele für Cdc42/Rac1 abhängige Polarisierungsprozesse in höheren Eukaryoten.A) Polare Bewegung von Fibroblasten. Rac1 und Cdc42 lokalisieren mit Hilfe der Polaritätskomplexe Scribble und Par an der Zellfront. Dabei wird Rac1 durch Tiam1 aktiviert. Rac1 und Cdc42 initiieren die Bildung von Filopodien und Lamellipodien, wodurch es zur Fortbewegung kommt. Aktives RhoA lokalisiert hauptsächlich am rückwärtigen Zellende, wo es die Aktomyosinkontraktion reguliert. B) Die Etablierung der anterior-posterior Achse führt zur asymmetrischen Teilung der C. elegans Zygote. Par1 und Par2 lokalisieren am posterioren Zellpol, während Par6, Par3 und die alternative Pkc3 den anterioren Zellpol markieren. Cdc42 wird an den anterioren Pol rekrutiert und aktiviert. C) Während der Axon-Spezifikation führen externe Stimuli zur Bildung von Phosphatidylinositol-3,4,5triphosphat an der Neuritenspitze, wodurch es Rab1-abhängig zur Aktivierung von Cdc42 kommt. Cdc42-GTP aktiviert den Par-Komplex, wws zur Stimulierung von Rac1 durch Tiam1 führt. D) Apikalbasale Polarisierung von Epithelzellen. Dabei reguliert der Par6-Par3-Pkc3-Tiam1-Rac1 Komplex die Bildung von „tight junctions“ (TJ) und die Entwicklung eines vollständig polarisierten Epitheliums. Modifiziert nach (Etienne-Manneville and Hall, 2002). 7 1 Einleitung der Etablierung der anterior-posterior Achse während der ersten Zellteilung der Zygote eine wichtige Rolle. Dabei lokalisieren Par1 und Par2 am posterioren Zellpol und Par3, Par6 und Pkc3 am anterioren Zellpol (Kemphues, 2000). Anschließend kommt es zur Polarisation des Aktomyosinnetzwerks zum anterioren Pol, wodurch ein kontraktiler anteriorer und ein nichtkontraktiler posteriorer Bereich entsteht (Cowan and Hyman, 2007). Vermutlich interagiert Cdc42 mit Par6, um Pkc3 zu stimulieren und verbindet die asymmetrische Lokalisation der Par Proteine mit der Polarisation des Aktinmyosinnetzwerks (Joberty et al., 2000; Cowan and Hyman, 2007) (Abb. 1.5 B). Bei der Etablierung der apikal-basalen Achse in Epithelzellen spielen neben dem ParKomplex auch Cdc42 und Rac1 eine wichtige Rolle (Abb. 1.5 B). In Epithelien bilden Lamellipodien und Filopodien benachbarter Zellen miteinander vorläufige Verbindungen, an denen sich E-Cadherin anreichert (Ebnet et al., 2008). Dies führt zur Aktivierung von Rac1 und Cdc42 (Nakagawa et al., 2001; Kim et al., 2000). Rac1 spielt jedoch offenbar die bedeutendere Rolle bei der anschließenden Polarisierung der Zelle (Takaishi et al., 1997). Die Interaktion der GTPasen mit Par6 führt zur Aktivierung der alternativen Pkc (Yamanaka et al., 2001). Ein weiterer bedeutender Interaktionspartner des Par-Komplexes ist der Rac1 GEF Tiam1, der mit Par3 interagiert und so die Aktivität von Rac1 direkt mit dem Par-Komplex während der Ausbildung von „tight junctions“ verknüpft (Chen 2005, Mertens 2005) (Abb. 1.5 C). Die Interaktion von Tiam1 mit Par3 findet auch während der Spezifizierung von Axonen statt, wo der GEF die Rac1-abhängige Aktinreorganisation an der Axonspitze stimuliert. Eine Nervenzelle bildet zunächst Rac1und Cdc42-abhängig Lamellipodien und Filopodien, die sich zu Neuriten entwickeln (Kozma et al., 1997). Durch externe Stimuli kommt es zur Aktivierung der Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K), was zur erhöhten lokalen Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat Konzentration an der Dendritenspitze führt. Dies aktiviert vermutlich die Ras-ähnliche GTPase Rab1, was letztendlich in der Stimulierung von Cdc42 resultiert (Schwamborn and Püschel, 2004). Aktives Cdc42 aktiviert den Par-Komplex, was eine Aktivierung von Rac1 durch Tiam zur Folge hat (Nishimura et al., 2005). Dieses Cdc42/Par6/Par3/Tiam1/Rac1 Modul ist einer der zentralen Regulatoren der Zellpolarität in Säugern und reguliert neben der Etablierung der Axonpolarität auch noch weitere Prozesse, wie z.B. die anterior-posterior Polarisierung von T-Zellen (Gérard et al., 2007). Rac1 und Cdc42 regulieren die bisher beschriebenen Prozesse durch die Interaktion mit einer Vielzahl von Effektoren. Dabei sind viele dieser Interaktoren Kinasen (PAK, MRCK) oder Gerüstproteine (IQGAP, WASP, WAVE)(Abb. 1.6). Die Regulation der Aktinpolymerisation findet durch PAK (p21 activated kinase) Stimulation und durch Aktivierung von N-WASP (Neuronal Wiscott-Aldrich Syndrom Protein) und WAVE 8 1 Einleitung N-WASP MRCK PAK Par6 IQGAP Sra1 WAVE p67phox Cdc42 Rac1 Aktomyosin Kontraktion Mikrotubuli Regulation Aktin Polymerisation Zellpolarität Zelladhesion NADPH Oxidation Abbildung 1.6: Wichtige Effektoren von Cdc42 und Rac1 in höheren Eukaryoten. Cdc42 und Rac1 regulieren die Zellpolarisation durch Stimulation der Aktomyosinkontraktion und der Aktinpolymerisation, sowie der Regulation der Mikrotubulistabilität. MRCK (Myotonic dystrophy kinaserelated Cdc42-binding kinase), N-WASP (Neuronal-Wiskott-Aldrich Syndrom Protein), PAK (p21 activated kinase), Par6 (partioning defective 6), IQGAP (IQ motiv-containing GTPase-activating protein), Sra1 (specifically Rac1-associated protein 1), WAVE (WASP family verprolin homologous protein), p67 phox (p67 phagocyte oxidase protein). Modifiziert nach (Iden and Collard, 2008). (WASP-Familien-Verprolin-homologes Protein) statt. Die PAKs stimulieren aktinpolymerisierende und depolymerisierende Faktoren durch deren Phosphorylierung, wohingegen WASP und WAVE als Gerüstprotein für die aktinpolymerisierende Maschinerie dienen, in deren Zentrum der Arp2/3 Komplex steht (Prehoda et al., 2000). Über die Aktivierung der GTPase Aktivität von Cdc42 und Rac1 während der Etablierung der Zellpolarität ist wenig bekannt. Es wurde beschrieben, dass der Cdc42-GAP Cdc42GAP während der Zellmigration am vorderen Zellende durch den Dynein Regulator Nudel inhibiert wird (Shen et al., 2008). Auch konnte gezeigt werden, dass der Rac1-GAP SH3BP1 über den Exozyst Komplex an die Zellfront rekrutiert wird, wo er Rac1 inaktiviert (Parrini et al., 2011). Der Rho-GDI1 ist ein weiterer Regulator von Cdc42 und Rac1. Der GDI kontrolliert die Homeostasis von Cdc42, Rac und Rho Proteinen, indem er mit ihnen nach ihrer Prenylierung am ER interagiert, sie löslich im Zytosol hält und so vor dem Abbau schützt (Boulter et al., 2010). 1.2.4 Rac1 und Cdc42 in Pilzen Cdc42 und Rac1 sind eng verwandte und hoch konservierte Mitglieder der Familie der Rho-GTPasen, die über achtzig Prozent Sequenzhomologie zwischen Pilzen und Menschen aufweisen. Diese hohe Konservierung der Aminosäuresequenz für Rac1 und Cdc42 ist vermutlich auf ihre Beteiligung an zahlreichen komplexen biologischen Prozessen zurückzuführen. Obwohl so hoch konservierte Proteine normalerweise als unverzichtbar gelten (Pál et al., 2006), hat während der Evolution der Pilze offenbar ein zweimaliger Verlust von Rac1 stattgefunden (Abb. 1.7). Ausgerechnet zwei der prominentesten pilzlichen Modellorganismen, die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae und die Spalthe9 1 Einleitung fe Schizosaccharomyces pombe besitzen kein Rac Homolog (Perez and Rincón, 2010) (Abb. 1.7). Cdc42 Rac1 NADPH oxidase +- + + + + + + + + + + + + - +-- +-- +-- +- - + + - + + + +* +* - + + + ++ + Ustilago maydis Coprinopsis cinerea Phanerochaetechrysosporium Cryptococcusneoformans Aspergillus nidulans Magnaporthegrisea Neurospora crassa Candidaalbicans Yarrowialipolytica Ashbyagossypii Saccharomycescerevisiae Schizosaccharomycespombe Pneumocystis carinii Laccariabicolor ++ Musmusculus + - - - Abbildung 1.7: Rac1 ging während der Evolution der Pilze zweimal unabhängig verloren. Kladogramm von Pilzarten basierend auf ihrer 18 S rDNA-Sequenz. Die roten Balken markieren den Verlust von Rac1 während der Evolution. Die Sternchen zeigen die Anwesenheit zusätzlicher Cdc42, bzw. Rac1 Orthologe in Cryptococcus neoformans an. In diesen beiden Organismen ist Cdc42 ein essentielles Protein (Perez and Rincón, 2010), während in den meisten filamentösen Pilzen Cdc42 nicht essentiell ist. cdc42 /rac1 Doppelmutanten sind jedoch nicht lebensfähig (Mahlert et al., 2006; Kwon et al., 2011; Virag et al., 2007). Dies lässt den Schluss zu, dass Cdc42 und Rac1 mindestens eine gemeinsame essentielle Funktion haben, bzw. einen gemeinsamen essentiellen Effektor aktivieren. Abgesehen von dieser Gemeinsamkeit variieren die Funktionen, die Rac1 und Cdc42 in den filamentösen Pilzen übernehmen, dramatisch, sogar zwischen sehr nah verwandten Arten. So ist Rac1 in Aspergillus niger ein Regulator des Hyphenwachstums, wohingegen diese Funktion in Aspergillus nidulans eher von Cdc42 ausgefüllt wird (Virag et al., 2007). In den Basidiomyceten U. maydis und Cryptococcus neoformans ist Rac1 der zentrale Regulator des filamentösen Wachstums, wohingegen Cdc42 bei der Regulation der Septierung eine wichtige Rolle spielt (Vallim 2005, Mahlert 2006, Ballou 2010). Auch im Bezug auf die von Cdc42 und Rac1 aktivierten Effektoren herrscht im Reich der Pilze eine große Variabilität. Einer der am besten charakterisierten Effektoren, die p21-aktivierte Kinase Cla4, ist in S. cerevisiae ein Effektor für Cdc42, wohingegen sie 10 1 Einleitung in U. maydis als Effektor von Rac1 beschrieben wurde (Mahlert et al., 2006). Ein weiterer, in Pilzen als Rac1 spezifisch beschriebener Interaktor, ist die NADPH Oxidase, ein Multiproteinkomplex, der der Generierung von reaktiven Sauerstoffarten (ROS) dient (Chen et al., 2008; Takemoto et al., 2011). Interessanterweise, ist dieser Effektor in den Pilzen, die kein Rac1 Homolog besitzen, nicht vorhanden (Abb. 1.7). 1.2.5 In der Bäckerhefe und der Spalthefe ist Cdc42 der Hauptregulator des polaren Wachstums Das Verständnis dafür, wie zelluläre Komponenten in einem einzelligen Organismus eine Polaritätsachse etablieren können, ist in den Ascomyceten, vor allem in den Bäckerhefe S. cerevisiae und in der Spalthefe S. pombe sehr weit fortgeschritten. Die Schlüsselmechanismen der Polaritätsetablierung sind in beiden Organismen sehr ähnlich. Zuerst erfolgt die Markierung des Ortes der Polarisierung in Abhängigkeit vom Zellzyklus oder externen Reizen, wie z.B. bei der Zellpaarung. Anschließend wird die Polarität durch die Rekrutierung und Aktivierung der Faktoren etabliert, die das Zytoskelett asymmetrisch reorganisieren. In der Folge kommt es zur polarisierten Sekretion, was letztendlich zum polaren Wachstum führt (Perez and Rincón, 2010). Dabei weisen beide Organismen jedoch grundsätzlich unterschiedliche Mechanismen der Zellvermehrung auf. S. cerevisiae vermehrt sich durch Knospung. Die runden Zellen bilden eine Knospe, die während der frühen G1 Phase durch apikales Wachstum bis zu einer kritischen Größe heranwächst. Anschließend vergrößert sich die Knospe durch isotropes Wachstum und rundet sich ab. Nach der Mitose werden Tochter und Mutterzelle durch Einzug des Septums voneinander getrennt (Perez and Rincón, 2010). S. pombe Zellen haben eine längliche zylindrische Form und vermehren sich durch zentrale Spaltung. Während der G1 Phase findet zunächst monopolares apikales Wachstum am sogenannten alten Ende statt. Zu Beginn der G2 Phase wird das Wachstum am neuen Ende induziert (NETO: new end take off) und die Zelle wächst bipolar. Nach der Mitose wird ein zentrales Septum gebildet, mit dessen Hilfe sich die Zellen trennen (Perez and Rincón, 2010). Die Regulation von Cdc42 in S. cerevisiae und seine Effektoren In S. cerevisiae wird die zukünftige Knospungsstelle durch die Ras-ähnliche GTPase Bud1/Rsr1 zusammen mit ihrem GEF, Bud5, und ihrem GAP, Bud2, markiert (Chant et al., 1995; Chant and Pringle, 1995; Park and Bi, 2007). Rsr1 rekrutiert Cdc24, den einzigen und essentiellen GEF für Cdc42 in der Bäckerhefe, an die Knospungsstelle (Gulli and Peter, 2001; Park and Bi, 2007) (Abb. 1.8 A). Die Aktivität von Cdc24 wird genau reguliert. So wurde beschrieben, dass der GEF während der frühen G1 Phase durch die Interaktion mit Far1 im Zellkern zurückgehalten wird, um eine unkontrol11 1 Einleitung lierte Aktivierung von Cdc42 zu verhindern. Die Freisetzung von Cdc24 aus dem Kern erfolgt in Abhängigkeit von der Phosphorylierung des Far1 Proteins durch das G1 Cyclin Cdc28 (Nern and Arkowitz, 2000; Shimada et al., 2000; Toenjes et al., 1999). Es wurde auch eine direkte Phosphorylierung von Cdc24 durch Cdc28 beschrieben (Cole et al., 2009; Wai et al., 2009). In einer weiteren Studie wurden Auswirkungen dieser Phosphorylierung auf die Lokalisation von Cdc24 festgestellt (Cole et al., 2009), wohingegen in einer anderen Veröffentlichung eine Cdc24 Variante beschrieben wurde, die trotz Fehlen aller beobachteten CDK Phosphorylierungsstellen keine sichtbaren Defekte aufwies (Wai et al., 2009). Eine weitere Regulierung von Cdc24 erfolgt zudem durch Oligomerisierung des GEFs, die ihn im inaktiven Zustand hält (Mionnet et al., 2008). Die Rekrutierung von Cdc24 durch die Interaktion mit Rsr1 führt zu einer lokalen Aktivierung und Anreicherung von Cdc42 an der Knospenstelle. Diese führt zur Polarisierung des Aktinzytoskeletts und zur zielgerichteten Sekretion (Park and Bi, 2007). Cdc24 und Cdc42-GTP können, wie auch viele der bekannten Cdc42 Effektoren, mit dem Gerüstprotein Bem1 interagieren (Gulli and Peter, 2001; Irazoqui et al., 2003; Kozubowski et al., 2008) (Abb. 1.8 A). Es konnte gezeigt werden, dass die Hefezellen auch in Abwesenheit von Rsr1 mit Hilfe von Bem1 polarisieren können (Irazoqui et al., 2003). Allerdings wurde das Gerüstprotein durch die Expression einer direkten Fusion von Cdc24 mit dem Cdc42 Effektor Cla4 für den Prozess der Zellpolarisation überflüssig. Daher wurde postuliert, dass die Hauptfunktion von Bem1 darin liegt, GEF und Effektor zusammenzubringen (Kozubowski et al., 2008). Cla4 und die nah verwandte Kinase Ste20 gehören zu den p21-aktivierten Kinasen (PAKs) und agieren beide als Effektoren von Cdc42 (Abb. 1.8 B). Cdc42 interagiert Cla4 Cdc42 GTP Cdc24 Rsr1-GTP Bem1 AktinzytoskelettReorganisation PolaresSpitzenwachstum A Cdc24 Rga1 Rga2 Bem2 Bem3 Rdi1 Skm1 Ste20Cla4 Bni1 Gic1 Gic2 Sec3 Typ1 Myosine Bee1 Exozytose Septin Orgenisation Aktinfilament Aufbau Pheromon Antwort Aktinpatch Aufbau MAPK Cdc42 B Abbildung 1.8: Regulatorische Proteine und Effektoren von Cdc42 in S. cerevisiae.A) Schematische Darstellung des Signalmoduls, das die Zellpolarität von S. cerevisiae reguliert. Rsr1-GTP rekrutiert und aktiviert den GEF Cdc24, was zur Aktivierung von Cdc42 führt. Cdc24, Cdc42-GTP und der Effektor Cla4 interagieren mit dem Gerüstprotein Bem1. B) Übersicht über die Regulatoren und Effektoren von Cdc42 in S. cerevisiae. GEF: gelb, GAP: orange, GDI: rot, PAK: blau, Formin: grün, CRIB-Protein: braun, Exozyst: violett. Modifiziert nach (Perez and Rincón, 2010). 12 1 Einleitung dabei mit der sogenannten Cdc42/Rac1 interaktiven Bindungs-Domäne (CRIB) von Ste20 und Cla4. Dies führt zur Aufhebung einer intramolekularen Inhibitionsstruktur, wodurch die C-terminale Kinasedomäne aktiv wird (Lamson et al., 2002). Aktives Cla4 phosphoryliert Cdc24 (Gulli et al., 2000). Ob diese beobachtete Cla4-abhängige Phosphorylierung von Cdc24 eine biologische Funktion hat, ist jedoch unklar. Es wurde postuliert, dass diese Modifikation die Aktivität des GEFs stimuliert und damit zu einer Verstärkung der Cdc42 Aktivierung führt (Irazoqui et al., 2003; Kozubowski et al., 2008). Ein anderes Modell geht davon aus, dass die Phosphorylierung des GEFs zur Dissoziation von Cdc24 und Bem1 führt und das diese negative Rückkopplungs-Regulation dem Wechsel vom apikalen zum isotropen Wachstum dient (Bose et al., 2001). Alle diese Theorien wurden jedoch durch die Beobachtung in Frage gestellt, dass ein Stamm, der eine Variante von Cdc24 exprimiert, in der alle durch Massenspektrometrie identifizierten Phosphorylierungsstellen mutiert sind, keine offensichtlichen Defekte aufweist (Wai et al., 2009). Cla4 und Ste20 regulieren das Aktinzytoskelett vermutlich über die Phosphorylierung und Aktivierung der Typ1 Myosine Myo3 und Myo5, die als Aktivatoren des Aktin polymerisierenden Arp2/3 (actin-related protein 2/3) Komplexes bekannt sind (Lechler et al., 2001; Wu et al., 1996a, 1997) (Abb. 1.8 B). Das Formin Bni1, das die Bildung von Aktinfilamenten stimuliert, kann neben Rho1 und Rho3 auch mit Cdc42 interagieren (Dong et al., 2003). Durch Cdc42 wird Bni1 an die Knospenspitze rekrutiert, von der aus es die Aktinpolymerisation auslöst und einen weiteren Aktivator des Arp2/3 Komplexes, Bee1, rekrutiert (Buttery et al., 2007; Dong et al., 2003; Lechler et al., 2001) (Abb. 1.8 B). Als weitere Interaktionspartner von Cdc42 konnten in der Bäckerhefe die CRIB-enthaltenden Proteine Gic1 und Gic2 identifiziert werden, die an der Rekrutierung von Septinen an die Knospungsstelle beteiligt sind (Brown et al., 1997; Iwase et al., 2006). Auch konnte eine Interaktion von Cdc42 mit einer Untereinheit des Exozyst Komplexes, Sec3, gezeigt werden (Zhang et al., 2001) (Abb. 1.8 B). In S. cerevisiae wird die GTPase Aktivität von Cdc42 durch vier GAPs, Rga1, Rga2, Bem2 und Bem3 reguliert (Abb. 1.8 B). Einzeldeletionen der GAPs sind lebensfähig und zeigen keine gravierenden morphologischen Defekte (Zheng et al., 1994; Wang and Bretscher, 1995; Smith et al., 2002). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass bem3 /rga1 Doppelmutanten einen Defekt in der Knospenmorphologie aufweisen, was für eine überlappende Funktion der GAPs spricht (Smith et al., 2002; Caviston et al., 2003). Für Rga1 wurde zudem beschrieben, dass der GAP eine „Zone der Inhibition“ von Cdc42 an der alten Zellteilungsstelle konstituiert, die eine erneute Knospung an der Stelle verhindert (Tong et al., 2007). Bem2 und Bem3 akkumulieren an Orten, wo polares Wachstum stattfindet, und ihre Aktivität wird zellzyklusabhängig durch Cdc28-abhängige Phosphorylierung negativ reguliert (Knaus et al., 2007). 13 1 Einleitung Die Lokalisation von Cdc42, Cdc24 und Bem1 ist in S. cerevisiae sehr dynamisch (Wedlich-Söldner et al., 2004). Cdc42 weist eine zügige Diffusionsrate in der Membran auf (0.036 µm2/s) (Marco et al., 2007) und die Zelle braucht deshalb effiziente Mechanismen, um eine stabile Kappe von aktivem Cdc42 an Stellen polarisierten Wachstums aufrechtzuerhalten. Dafür wurden zwei Wege beschrieben (Slaughter et al., 2009). Der GDI Rdi1 konstituiert den ersten, diffusionskontrollierten, schnellen Weg. Der zweite, langsamere Weg, geschieht durch Endozytose und anschließende Sekretion (Slaughter et al., 2009). Regulatoren und Effektoren von Cdc42 in S. pombe In S. pombe ist im Gegensatz zu S. cerevisiae das Mikrotubuli (MT) Zytoskelett für die Polarität der Zellen sehr wichtig (Castagnetti et al., 2007; Martin, 2009). Die polaritätsetablierenden Proteine Tea1, Tea3 und Tea4 aggregieren an Stellen, wo die MTs in Kontakt mit dem Zellkortex stehen, was vermutlich den Ort des polaren Wachstums bestimmt (Terenna et al., 2008; Minc et al., 2009). Daher führt der Verlust von Tea1 zu rein monopolar wachsenden Zellen (Mata and Nurse, 1997). Tea3 und Tea4 haben eine Funktion bei dem MT abhängigen Transport von Tea1 zu den Plus-Enden der MTs, wo es durch Interaktion mit dem membranassoziierten Protein Mod5 verankert wird (Snaith et al., 2005; Snaith and Sawin, 2003) (Abb. 1.9 A). Tea4 vermittelt zudem die Interaktion von Tea1 und dem Formin For3 (Feierbach and Chang, 2001; Martin et al., 2005). Die Polarisierung des Aktinzytoskeletts ist abhängig von Cdc42-GTP, Bud6 und For3 (Glynn et al., 2001; Martin et al., 2007). For3 interagiert dabei mit seiCdc42 GTP Scd1 For3 Ras1 Scd2 Tea1 Bud6 Mod5 PolaresSpitzenwachstum Aktinzytoskelett Reorganisation Scd1 Rga4 Rdi1 Shk2Shk1 For3 Cdc42 BGef1 MAPK Integritätskontrolle Aktinfilament Aufbau Pheromon Antwort Aktinpolymerisation Zellintegritätsantwort MAPK A Abbildung 1.9: Regulatorische Proteine und Effektoren von Cdc42 in S. pombe.A) Schematische Darstellung des Signalmoduls, das die Zellpolarität von S. pombe reguliert. Tea1 wird durch Interaktion mit Mod5 an der Zellspitze verankert und rekrutiert For3. For3 interagiert mit Bud6 und Cdc42-GTP. Cdc42 wird durch Scd1 aktiviert. Scd2 fungiert als Gerüstprotein für Scd1 und Cdc42. B) Übersicht über die Regulatoren und Effektoren von Cdc42 in S. pombe. GEF: gelb, GAP: orange, GDI: rot, PAK: blau, Formin: grün. Modifiziert nach (Perez and Rincón, 2010). 14 2 Ergebnisse 2.1 Die Aktivität des Cdc24/Rac1/Cla4/Bem1 Signalmoduls wird während des polaren Wachstums von Ustilago maydis durch eine negative Rückkopplungsschleife reguliert 2.1.1 Ein Signalmodul aus Cdc24, Rac1, Cla4 und Bem1 reguliert das polare Wachstum in U. maydis Die morphologische Transition von der Knospung zum filamentösen Wachstum ist in U. maydis von der kleinen GTPase Rac1 und ihrem Effektor, der PAK-ähnlichen Kinase Cla4 abhängig (Leveleki et al., 2004; Mahlert et al., 2006). Die Überexpression von Rac1 ist ausreichend, um in haploiden Zellen filamentöses Wachstum zu induzieren (Mahlert et al., 2006) (Abb. 2.1 A). Interessanterweise resultierte die Überexpression von Cla4 nicht in einer Filamentinduktion (Abb. 2.1 A). Dies kann entweder daher rühren, dass die Menge an Cla4 kein limitierender Faktor ist, oder dass die Überexpression von Cla4 nicht zu einem erhöhten Niveau an aktiver Kinase führt. Die zweite Hypothese kann als richtig angesehen werden, da bereits die schwache Überexpression von konstitutiv aktivem Cla4∆CRIB in der Lage war, filamentöses Wachstum zu induzieren (siehe Abb. 2.1 A). Auch die Überexpression des Dbl-Familien Guaninnukleotid Austauschfaktors (GEFs) Cdc24 resultierte in der Ausbildung von Filamenten (Abb. 2.1 A). Um die epistatischen Beziehungen von Cdc24, Rac1 und Cla4 zu untersuchen, wurde der potentielle Rac1-GEF Cdc24 in Deletionsmutanten von rac1 und cla4 überexprimiert. Die Filamentinduktion wurde durch Auftropfen auf aktivkohlehaltiges Festmedium getestet, wo sie zu einer weißen, pelzigen Kolonieoberfläche führt. Die Überexpression von Cdc24 induzierte weder in ∆rac1, noch in ∆cla4 Mutanten filamentöses Wachstum (Abb. 2.1 B), was darauf hindeutet, dass Cdc24 in einer Signalkaskade oberhalb von Rac1 und Cla4 agiert (siehe Abb. 2.1 C). Die Überexpression des U. maydis Homologs des Gerüstproteins Bem1, das in S. cerevisiae als Interaktionsplattform für das Cdc24/Cdc42/Cla4 Signalmodul fungiert (Peterson et al., 1994; Bose et al., 2001), führte ebenfalls zum filamentösen Wachstum (Abb. 2.1 A). Auch das durch Bem1 induzierte Filament war von Rac1 und Cla4 ab21 2 Ergebnisse Cdc24 Rac1 Cla4 Bem1 polaresWachstum Überexpression Cdc24 Bem1 B WT Ärac1 Äcla4 Cdc24 Cla4 Cdc42 Cla4ÄCRIB Rac1 Bem1 A C Überexpression: Abbildung 2.1: Eine durch Bem1 koordinierte lineare Signalkaskade reguliert die Zellpolarität in U. maydis.A) Phänotyp von Zellen, die Cdc24, Cdc42, Rac1, Cla4, Cla4∆CRIB oder Bem1 überexprimieren. Die Zellen wurden in Flüssigmedium unter induzierenden Bedingungen angezogen. Die Zellwände wurden mit „Calcofluor-Weiss“ angefärbt. Knospende Zellen weisen ein charackteristisches Doppelseptum zwischen Mutterund Tochterzelle auf. Filamentöse Zellen zeigen Retraktionssepten am distalen Ende. Der Größenstandard repräsentiert 10 µm. B) Epistasis Analyse von cdc24, bem1,rac1 und cla4. Wildtyp, ∆rac1 und ∆cla4 Zellen, die entweder Cdc24 oder Bem1 überexprimierten, wurden auf induzierendes aktivkohlehaltiges Festmedium aufgetropft. Filamentbildung wird durch das weisse Luftmycel an der Kolonieoberfläche angezeigt. C) Schematische Übersicht über die Signalkaskade, die die Zellpolarität in U. maydis kontrolliert. Bem1 agiert dabei als Gerüstprotein, das die Interaktionen zwischen GEF, GTPase und Effektor vermittelt. hängig (Abb. 2.1 B). Es war leider nicht möglich, die Funktion von Bem1 während des durch die Überexpression von Cdc24 oder Rac1 induzierten filamentösen Wachstums zu untersuchen, da eine konditionale Mutante, die bem1 unter der Kontrolle des durch Arabinose induzierbaren crg Promotors exprimierte, unter repressiven Bedingungen nicht lebensfähig war. Nach Depletion arretieren die bem1 Mutanten als kleine Zellen mit stark reduzierter Polarität (nicht gezeigt). Da die Epistasisanalyse darauf hindeutete, dass in U. maydis eine durch Bem1 vermittelte Signalkaskade von Cdc24, Rac1 und Cla4 das polare Wachstum reguliert, wurde die Lokalisation der Komponenten überprüft. Um die Lokalisationen von Cdc24 und Cla4 zu untersuchen, wurden funktionelle C-terminale GFP-Fusionen hergestellt und ektopisch in cdc24, bzw. cla4 Mutanten konstitutiv exprimiert. Im Falle von Bem1 war nur die N-terminale Fusion funktionell und in der Lage, eine Bem1 Depletion zu komplementieren. Cdc24-GFP, GFP-Bem1 und Cla4-GFP akkumulierten sowohl an der Knospenspitze, als auch an der Spitze von induzierten Filamenten (Abb. 2.2 A). Diese 22 2 Ergebnisse Cdc24-GFP AB31induziert GFP-Bem1 AB31induziert AB31induziert Cla4-GFP 0 50 150 100 200 relativeGFP-Fluoreszenz 13 2 Cdc24 Cdc24ÄPB1 13 2 0 50 150 100 200 relativeGFP-Fluoreszenz WT Ärac1 Cdc24 Cdc24ÄPB1 WT Ärac1 Bem1 WT cdc24 Cla4 Cdc24 Bem1 Äcla4 bem1 cdc24 bem1 Äcla4 Cdc24 Cla4 Bem1 0 50 150 100 200 relativeGFP-Fluoreszenz 13 2 1 3 2 1 3 2 1 2 3 B C D E Bem1 A Abbildung 2.2: Cdc24, Bem1 und Cla4 lokalisieren in kooperativer Weise an der polar wachsenden Spitze.A) Lokalisation der GFP-Fusionen von Cdc24, Bem1 und Cla4 in knospenden Zellen und in Filamenten, die durch die Überexpression des heterodimeren bW2/bE1 Transkriptionsfaktors induziert wurden. Der Größenstandard repräsentiert 10 µm. Die Insertionen zeigen die Knospenspitzen in stärkerer Vergrößerung. B) Repräsentative Akkumulationen von Cdc24-GFP, GFP-Bem1 und Cla4-GFP an den Zellspitzen von cdc24,cla4 und bem1 Mutanten. C) Die GFPFluoreszenz wurde in den in (B) gezeigten Zellen entlang einer longitudinalen Achse, die die Zellspitze durchschneidet, gemessen. Die Intensitätsdiagramme resultieren aus den Mittelwerten von 5 Messungen. Die GFP-Fluoreszenz ist in relativen Einheiten angegeben. Die Pfeilspitzen zeigen die Position entlang der Achse an. D) Vergleich der Lokalisation von Cdc24-GFP und Cdc24∆PB1-GFP an der Knospenspitze von wildtyp Zellen. Die GFP-Fluoreszenz wurde wie in (C) beschrieben gemessen. E) Lokalisation von GFP-Bem1 in wildtyp und in ∆rac1 Zellen. Die Intensitätsdiagramme wurden wie in (C) hergestellt. 23 2 Ergebnisse Spitzenlokalisation fand in kooperativer Weise statt. Bei Depletion von Bem1 war weder eine Akkumulation von Cdc24-GFP, noch eine von Cla4-GFP zu beobachten (Abb. 2.2 B und C). In Abwesenheit von Cdc24 konnte GFP-Bem1 und somit auch Cla4-GFP nicht an der Spitze lokalisieren (Abb. 2.2 B und C). In S. cerevisiae interagieren Cdc24 und Bem1 über ihre C-terminalen PB1-Domänen (Bose et al., 2001; Kozubowski et al., 2008)(Abb. 2.3 A). Die Spitzenakkumulation von Cdc24-GFP war von der Anwesenheit der C-terminalen PB1-Domäne abhängig (Abb. 2.2 D), woraus folgt, dass eine Interaktion mit Bem1 für die polare Lokalisation notwendig ist. In Abwesenheit von Rac1 war keine Akkumulation von GFP-Bem1 an der Zellspitze zu detektieren (Abb. 2.2 E), was darauf hindeutet, dass die Interaktion mit der GTPase für die Lokalisation des Signalmoduls eine entscheidende Rolle spielt. Vorstellbar ist, dass der Prenylanker von Rac1 benötigt wird, um eine stabile Lokalisation des Komplexes an der Membran zu gewährleisten. Um die Komplexbildung von Cdc24, Rac1, Cla4 und Bem1 direkt zu testen, wurden Kopräzipitationsexperimente durchgeführt. Dazu wurden aus E. coli aufgereinigte Rac1-Fusionsproteine genutzt (Abb. 2.3 C), die mit GDP oder nicht spaltbarem GTPγS beladen und anschließend mit U. maydis Proteinextrakten inkubiert wurden. In einem ersten Experiment wurden Extrakte von Stämmen genutzt, die Cdc24-GFP, Cla4-GFP oder GFP-Bem1 einzeln überexprimierten. Inaktives Rac1-GDP zeigte eine hohe Affinität zu Cdc24 und keine Affinität zu Bem1 (Abb. 2.3 D). Zudem konnte eine sehr geringe, aber reproduzierbare Affinität von Rac1-GDP für Cla4 festgestellt werden (Abb. 2.3 D). Aktives Rac1-GTPγS war nicht in der Lage, Cdc24 zu präzipitieren, hatte aber hohe Affinität zu Cla4 und Bem1 (Abb. 2.3 D). Die positive Interaktion zwischen aktivem Rac1-GTPγS und Cla4 war dabei von der CRIB-Domäne von Cla4 abhängig (Abb. 2.3 G). Wenn dominant negatives GST-Rac1T17N (Stacey et al., 1991) oder dominant aktives NusA-6xHis-Rac1Q61L (Ziman et al., 1991) zur Kontrolle genutzt wurden, verhielten sie sich in ihren Affinitäten vergleichbar zu GST-Rac1-GDP, bzw. GST-Rac1-GTPγS (Abb. 2.3 D). Im folgenden Experiment wurden alle Interaktionspartner von Rac1 in paarweisen Kombinationen getestet. In der Anwesenheit von Cdc24 war eine schwache Interaktion von Rac1-GDP und Bem1 zu detektieren. Umgekehrt führte die Anwesenheit von Bem1 zu einer Kopräzipitation von Cdc24 mit Rac1-GTPγS, die von der C-terminalen PB1-Domäne von Cdc24 abhängig war (Abb. 2.3 E und F). Diese Daten weisen auf die Bildung eines ternären Komplexes von Cdc24, Rac1 und Bem1 hin. Die Kopräzipitation von Bem1 und Cla4 mit Rac1-GTPγS könnte auch daher rühren, dass aktives Rac1 mit beiden Proteinen einzeln interagieren kann. Jedoch weist die Kopräzipitation von Bem1 und mutiertem Cla4∆CRIB, das selbst nicht mehr mit Rac1 interagiren kann, auf einen ternären Bem1/Rac1/Cla4 Komplex hin (Abb. 2.3 E und G). Die Bildung eines Cdc24/Rac1/Bem1/Cla4 Komplexes konnte durch Kopräzipitati24 2 Ergebnisse NusA-6His NusA-6His-Rac1Q61L Cdc24 Cla4 Bem1 GST-Rac1GDP GST GST-Rac1GTPãS GST-Rac1GDP GST GST-Rac1GTPãS GST-Rac1GDP GST GST-Rac1GTPãS GST-Rac1GDP GST GST-Rac1GTPãS GST-Rac1 GST NusA-6His-Rac1 NusA-6His Cdc24-GFP Cla4-RFP Cdc24-GFP Myc-Bem1 Cla4-RFP Myc-Bem1 Cdc24-GFP Cla4-RFP Myc-Bem1 GST-Rac1 GST GST-Rac1T17N GST á-GFP á-RFP á-Myc Cdc24 Bem1 Cla4 GST-Rac1GDP NusA-6His NusA-6His-Rac1Q61L GST GST-Rac1GTPãS GST-Rac1T17N GST Cdc24-GFP Cla4-GFP GFP-Bem1 á-GFP á-GFP á-GFP Cdc24ÄPB1 Bem1 GST-Rac1GDP GST GST-Rac1GTPãS Cla4ÄCRIB Bem1 GST-Rac1GDP GST GST-Rac1GTPãS GST-Rac1GDP GST GST-Rac1GTPãS Cla4 Bem1 ÄCRIB-RFP MycCla4ÄCRIB-RFP Cdc24ÄPB1-GFP Myc-Bem1 á-GFP á-Myc á-RFP á-Myc C E D F G GDP GTP B A Bem1 Cla4 Cdc24 Bem1 Cla4 Cdc24 Rac1 Rac1 Kinase CH DH PH PB1 PX SH3 SH3 PB1 Cdc24 Bem1 PH Cla4 PxxPPxxP CRIB 685 714 1102 Abbildung 2.3: Bem1, Cdc24, Rac1 und Cla4 bilden einen Multiproteinkomplex.A) Domänenstruktur von U. maydis Cdc24, Bem1 und Cla4. Cdc24 enthält eine Calponin-Homologie (CH), eine Dbl-Homologie (DH), eine Pleckstrin-Homologie (PH) und eine C-terminale Phox und Bem1 Domäne (PB1). Bem1 umfasst zwei N-terminale SH3-Domänen, eine zentrale Phox-Homologie (PX) und eine C-terminale PB1-Domäne. Cla4 beinhaltet eine N-terminale PH-Domäne, eine „Cdc42 und Rac1 interaktive Bindungs-“ Domäne (CRIB), mehrere PxxP Motive, die mit SH3-Domänen interagieren können und eine C-terminale Kinase-Domäne. B) Schematische Darstellung aller durch Kopräzipitation detecktierten Interaktionen. Die schwarzen durchgezogenen Linien repräsentieren starke, die grauen gestrichelten Linien schwache Interaktionen. C) Wildtyp GST-Rac1, dominant negatives GST-Rac1T17N und dominant aktives NusAHis6-Rac1Q61L wurden in E. coli exprimiert und durch Affinitäts-Chromatographie gereinigt. Proteinproben wurden in einem SDS-Gel aufgetrennt, auf eine PVDF Membran übertragen und über Ponceau-S Färbung nachgewiesen. GST und NusA-His6 dienten als Kontrolle. D) Für die Kopräzipitationen wurde GST-Rac1 mit GDP oder nicht hydrolisierbarem GTPγS beladen. GST-Rac1T17N und NusA-His6-Rac1Q61L wurden ohne künstliche Beladung eingesetzt. Gleiche Anteile der GTPasen wurden mit U. maydis Protinextrakten von Zellen inkubiert, die GFP-markierte Versionen von Cdc24, Cla4 oder Bem1 überexprimierten. Die Komplexe wurden mit Hilfe von Glutathion-Agarose (GST-Rac1 and GST-Rac1T17N) oder Nickel-Sepharose (NusA-His6-Rac1Q61L) präzipitiert, im SDS-Gel aufgetrennt und auf eine PVDF Membran transferiert. Cdc24-GFP, Cla4-GFP und GFP-Bem1 wurden mit Hilfe eines monoklonalen GFP-Antikörpers nachgewiesen. E) Die gezeigten Kopräzipitationen wurden wie in (D) beschrieben durchgeführt, jedoch mit Proteinextrakten, die entweder paarweise Kombinationen von Cdc24-GFP, Cla4-RFP und Myc-Bem1 enthielten, oder alle drei Fusionsproteine gemeinsam. F) Gezeigt sind Kopräzipitationen mit Extrakten, die Myc-Bem1 und Cdc24∆PB1-GFP enthielten. G) Kopräzipitationen mit Extrakten, die entweder Cla4∆CRIB-RFP alleine, oder in Kombination mit Myc-Bem1 enthielten. 25 2 Ergebnisse on von Cdc24, Bem1 und Cla4 in einem Ansatz mit Rac1-GTPγS gezeigt werden (Abb. 2.3 E). Interessanterweise konnte die Komplexbildung auch mit Rac1-GDP nachgewiesen werden, wenn auch mit geringerer Affinität (Abb. 2.3 E). Durch Epistasisanalyse, Kolokalisationsstudien und Kopräzipitationsexperimente konnte bestätigt werden, dass ein Multiproteinkomplex bestehend aus dem GEF Cdc24, der GTPase Rac1, der Kinase Cla4 und dem interaktionsvermittelnden Protein Bem1 das polare Wachstum in U. maydis kontrolliert. Die nachfolgenden Experimente konzentrierten sich auf die dynamische Regulation der Aktivität dieses Signalmoduls. 2.1.2 Das Kreuzungstyp-abhängige filamentöse Wachstum von U. maydis basiert auf der Cdc24-abhängigen Aktivierung von Rac1 Um die Pflanze infizieren zu können, bildet U. maydis ein dikaryotisches Filament. Haploide Sporidien mit unterschiedlichem aund bPaarungstyp nehmen einander auf der Pflanzenoberfläche war und bilden Paarungshyphen entlang des Pheromongradienten aus, die an der Spitze fusionieren (Abb. 2.4 A)(Banuett and Herskowitz, 1989; Snetselaar et al., 1996). Die folgende Bildung und das Wachstum des dikaryotischen Filaments wird durch den multiallelischen b-Locus reguliert, der für ein Paar Homeodomänen Proteine, bW und bE, kodiert. Diese Proteine können ein Heterodimer bilden, wenn sie von unterschiedlichen b-Loci stammen und so als Transkriptionsfaktor fungieren (Kämper et al., 1995). Die Überexpression eines solchen funktionalen bW2/bE1 Heterodimers unter der Kontrolle des induzierbaren crg Promotors (Abb. 2.4 B), ist in dem Stamm AB31 ausreichend, um filamentöses Wachstum zu induzieren (Brachmann et al., 2001). Obwohl bereits viele Gene identifiziert werden konnten, die durch den b-Transkriptionsfaktor reguliert werden (Brachmann et al., 2001; Heimel et al., 2010a,b; Wahl et al., 2010), ist der genaue molekulare Mechanismus der Filamentinduktion noch nicht aufgeklärt. Wie bereits im vorherigen Abschnitt erwähnt, hängt das Wachstum des U. maydis Filaments von Rac1 ab. Die Expression des rac1 Genes wird jedoch nicht vom bW/bE Heterodimer beeinflusst (Mahlert et al., 2006). Es ist daher anzunehmen, dass es durch b-Induktion zur Stimulation der Aktivität von Rac1 kommt. Darum wurde die Menge an aktivem Rac1-GTP vor und nach der Induktion von bW2/bE1 in dem Stamm AB31 bestimmt. Zur besseren Detektion wurde die GTPase am genomischen Locus mit einem dreifachen HA-Epitop versehen Abb. 2.4 B). Zur Präzipitation der aktiven GTPase wurde die CRIB-Domäne der PAK Kinase Smu1 (Smith et al., 2004) genutzt, die selektiv an die aktiven Formen von Rac1 und Cdc42 bindet (Leveleki et al., 2004). Unter induzierenden Bedingungen führte die Überexpression von bW2/bE1 zu 26 2 Ergebnisse 0 % 50% 100% 150% 200% 250% 300% 350% 3xHA-Rac1-GTP Coomassie Präzipitation GST-CRIB 3xHA-Rac1gesamt Einsatz Cdc42gesamt Tub1 Cdc42-GTP 0.0 1.0 3.0 Cdc42-GTP Rac1-GTP C -+-+-+ WT bE1/bW2 Cdc24 2.0 -+-+-+ WT bE1/bW2 Cdc24 a1b1/a2b2 a2b2 a1b1 dikaryotischesFilament haploideknospendeZellen Zellpaarung A B Pcrg Pcrg bW2 bE1 Prac1 rac1 3xHA CRIB-Präzipitation relativeKonzentration Abbildung 2.4: Die Filamentinduktion führt zu einem erhöhten Level von aktivem Rac1GTP.A) Schematische Darstellung der morphologischen Transition von U. maydis. Haploide Zellen unterschiedlichen Kreuzungstyps (a1b1 und a2b2) fusionieren an der Spitze um eine dikaryotische Hyphe zu bilden. B) Der Stamm AB31 exprimiert ein aktives Dimer aus bW2 und bE1 unter der Kontrolle des induzierbaren crg Promotors. Zur besseren Detektion wurde rac1 am genomischen Locus mit einem dreifachen HA-Epitop versehen. C) Determination der Menge an aktivem Rac1-GTP und Cdc42-GTP bevor (-) und vier Stunden nach der Induktion (+) des heterodimeren Transkriptionsfaktors bE1/bW2 und des GEFs Cdc24. GST-CRIBSmu1 wurde in E. coli überexprimiert und über Affinitäts-Chromatographie gereinigt. Mit GST-CRIBSmu1 beladene GSH-Agarose wurde mit den U. maydis Proteinextrakten inkubiert. Präzipitierte Proteine wurden auf eine PVDF Membran transferiert und durch Immunodetektion sichtbar gemacht. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte dreier unabhängiger Versuche. Die Standardabweichung wird von den Balken repräsentiert. einem deutlich erhöhten Niveau von Rac1-GTP, nicht jedoch von Cdc42-GTP (Abb. 2.4 C). Interessanterweise kam es durch die Überexpression von Cdc24 zu einem vergleichbaren Anstieg der Menge an aktivem Rac1-GTP (Abb. 2.4 C). Die Aktivierung von Rac1 während der b-Induktion des filamentösen Wachstums scheint daher durch den GEF Cdc24 zu erfolgen. 2.1.3 Die b-abhängige Filamentinduktion wird durch einen Abbau von Cdc24 begleitet Wie bereits in Abschnitt (2.1.1) beschrieben, wurde eine C-terminale GFP-Fusion von Cdc24 konstitutiv exprimiert, um die Lokalisation des GEFs in knospenden Zellen und 27 2 Ergebnisse bE1/bW2 AB31Ärac1 cdc24-GFP ppi AB31 0h 0h 8h8h AB +bE1/bW2 0h 4h 8h AB31 Ärac1 AB31 D bE1/bW2 AB31 0h 4h 8h2h 6h bE1/bW2 AB31Ärac1 Cdc24-GFP Tub1 AB31 C 0h 0h 8h8h Cdc24-GFP Tub1 bE1/bW2 AB31Ärac1 0h 4h 8h2h 6h + - Cdc42 Rac1 WT + - cdc24-GFP ppi E G Cdc24-3xHA Tub1 Rac1 WT + - Cdc42 WT -+ bE1/bW2 WT -+ + - Cdc42 Rac1 WT + - Cdc24-GFP Tub1 F 0h 2h 4h 6h 8h 10h 0h 10h + + + + + + - - Cycloheximid WT 0h 2h 4h 6h 8h 10h 0h 10h + + + + + + - - Drac1 Cdc24-GFP PonceauS H Abbildung 2.5: Cdc24 wird während der vom b-Kreuzungstyp abhängigen Filamentinduktion degradiert.A) Die Lokalisation von konstitutiv exprimiertem Cdc24-GFP wurde in den Stämmen AB31 und AB31∆rac1 verfolgt. DIC und GFP-Fluoreszenz Bilder wurden vor (0 h) und vier (4 h) und acht (8 h) Stunden nach der Induktion der bW2/bE1 Überexpression gemacht. Der Größenstandard repräsentiert 10 µm. B) Analyse der cdc24-GFP mRNA Konzentration in den Stämmen AB31 und AB31∆rac1 bevor (0 h) und nach der Induktion (8 h) der bW2/bE1 Überexpression. Die mRNA der konstitutiv exprimierten Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerase (ppi) diente als Ladekontrolle. C) Bestimmung der Cdc24-GFP Proteinmenge in den selben U. maydis Kulturen die in (B) zur cdc24-GFP mRNA Mengenbestimmung genutzt wurden. Ein monoklonaler Antikörper gegen GFP wurde zum Nachweis von Cdc24 genutzt. Tubulin (Tub1) diente als Ladekontrolle. D) Die Menge an Cdc24-GFP wurde vor (0 h) und zu mehreren Zeitpunkten (2 h, 4 h, 6 h, 8 h) nach der bW2/bE1 Induktion bestimmt. E) Analyse der cdc24-GFP mRNA Menge in konditionalen rac1 und cdc42 Mutanten, die die GTPasen unter der Kontrolle des crg Promotors exprimierten. Die Zellen wurden unter nichtinduzierenden (-) und induzierenden Bedingungen (+) angezogen. F) Bestimmung des Cdc24-GFP Protein Niveaus in den selben Kulturen, die in (E) genutzt wurden. G) Kontrolle der Proteinmenge von Cdc24-3xHA, das unter der Kontrolle des endogenen Promotors exprimiert wurde, in AB31 und in konditionalen Mutanten von rac1 und cdc42. Die Zellen wurden unter nichtinduzierenden (-) und induzierenden (+) Bedingungen angezogen. H) Inhibition der Translation durch Cycloheximid (100 µg/ml) in Kulturen des Wildtyp und des rac1 Deletionsstammes, die Cdc24-GFP unter der Kontrolle des tef Promotors konstitutiv exprimierten. 28 2 Ergebnisse während des filamentösen Wachstums zu bestimmen. Dabei akkumulierte Cdc24-GFP an der Knospenspitze und an der Spitze der Filamente kurz nach der Induktion der bW2/bE1 Überexpression (Abb. 2.5 A)). Überraschenderweise nahm die Intensität der Cdc24-GFP-Fluoreszenz während des b-induzierten filamentösen Wachstums drastisch ab, obwohl die Expression der GFP-Fusion unter der Kontrolle des konstitutiven tef Promotors erfolgte (Abb. 2.5 A). Die Analyse der mRNA Menge bestätigte, dass es während der bW2/bE1 Überexpression zu keiner Veränderung des cdc24-GFP Niveaus kam (Abb. 2.5 B). Die Bestimmung der Cdc24-GFP Proteinmenge bestätigte hingegen, dass das Cdc24-GFP Niveau durch die Überexpression des Transkriptionsfaktors drastisch reduziert wurde (Abb. 2.5 C). Die Abnahme der Cdc24 Konzentration begann dabei offenbar direkt nach der b-Induktion, da bereits nach zwei Stunden Wachstum unter induzierenden Bedingungen das Cdc24-GFP Niveau um etwa die Hälfte reduziert war (Abb. 2.5 D). Um einen möglichen Einfluss der konstitutiven Expression auf den beobachteten Abfall der Cdc24-GFP Konzentration auszuschließen, wurde cdc24 auch am genomischen Locus mit einem dreifachen HA-Epitop versehen. Auch das endogen exprimierte Cdc24-3xHA wurde nach der b-Induktion reduziert (Abb. 2.5 G). Die Tatsache, dass die Überexpression von bW2/bE1 auch die Aktivierung von Rac1 zur Folge hat, führte zu der Vermutung, dass die beobachtete posttranskriptionelle Regulation von Cdc24 durch die Aktivierung von Rac1 ausgelöst wird. Eine Deletion des rac1 Genes in dem Stamm AB31∆rac1 verhinderte sowohl die Filamentbildung, als auch die negative Regulation der Cdc24 Menge (Abb. 2.5 A und C). Die Überexpression von Rac1 hatte hingegen eine destabilisierende Wirkung sowohl auf das ektopisch, als auch auf das endogen exprimierte Cdc24 Protein, die mit der von bW2/bE1 vergleichbar war (Abb. 2.5 F und G). Zusammenfassend kann geschlossen werden, dass die Aktivierung von Rac1 während des filamentösen Wachstums von U. maydis offenbar zu einer negativen Regulation des GEFs Cdc24 führt. Sowohl die Stärke der GFP-Fluoreszenz, als auch die detektierte Menge an Protein war im ∆rac1 Hintergrund deutlich erhöht (Abb. 2.5 A und C). Dieser stabilisierende Effekt der Abwesenheit von Rac1, konnte auch bei endogen exprimiertem Cdc24-3xHA bestätigt werden (Abb. 2.5 G). Dies weist darauf hin, dass die Rac1-abhängige negative Rückkopplungs-Regulation sowohl während des b-induzierten filamentösen Wachstums, als auch während der Knospung der haploiden Zelle, die Menge an Cdc24 beeinflusst. Weder die Deletion, noch die Überexpression von cdc42 hatte einen Effekt auf die Stabilität von Cdc24 (Abb. 2.5 F und G). Dies bestätigt die Hypothese, dass Cdc24 während des polaren Wachstums als Rac1-GEF fungiert. Um zu untersuchen, ob es sich bei der Regulation von Cdc24 um einen Abbau des GEFs handelt, oder um eine Inhibition der Translation, wurde die Translation durch Zugabe von Cycloheximid im Wildtyp und im rac1 Deletionsstamm inhibiert. Das konstitutiv exprimierte Cdc24-GFP Niveau begann 29 2 Ergebnisse nach Zugabe von Cycloheximid im Wildtyp mit einer ungefähren Halbwertszeit von vier Stunden abzufallen. Im rac1 Deletionshintergrund blieb Cdc24-GFP hingegen weitgehend stabil (Abb. 2.5 H). Dies zeigt, dass es sich bei dem beobachteten Abfallen des Cdc24 Niveaus um einen Abbau des GEFs handelt. Die Überexpression von dominant negativem Rac1T17N (Stacey et al., 1991) hatte keine negativen Auswirkungen auf die Menge an Cdc24 in der Zelle (Abb. 2.6 A). Dies weist darauf hin, dass Rac1 durch den GEF aktivierbar sein muss und somit der Übergang vom GDPzum GTP-gebundenen Zustand für die negative Regulation der Cdc24 Menge entscheidend ist. Diese SchlussfolANAUS -- Rac1 AUS AN ANAUS Cla4 - +- + Cdc24-GFP Tub1 C Rac1Q61L AUS AN Cla4ÄCRIB WT Cdc24-3xHA Tub1 Rac1T17N AUS AN AUS AN A GFP Tub1 Cdc24-GFP B Cdc24 -GFP T285A Bem1 ++ ++ ++ ANAUS -- Cla4 CRIBDAUS AN ANAUS Rac1 - +- + Cdc24-GFP Tub1 E Bem1 ++ ++ ++ PB1PB1 Cdc24 Bem1 Cla4 CRIBD SH3 PxxP N CC Cdc24 Abbau PB1PB1 Cdc24 Bem1 Cla4* SH3 PxxP N CC Cdc24 Abbau Rac1-GTP D F Abbildung 2.6: Die negative Rückkopplungsregulation von Cdc24 hängt von der Bildung eines funktionalen Cdc24/Rac1/Cla4/Bem1 Signalmoduls ab.A) Bestimmung des Einflusses der Überexpression von Rac1Q61L, Rac1T17N und Cla4∆CRIB auf das endogene Niveau von Cdc243xHA. Die Zellen wurden in nicht induzierendem Medium angezogen (AUS) und anschließend acht Stunden in induzierendem Medium inkubiert (AN). B) Vergleich des Proteinniveaus der dominant negativen Variante Cdc24T283A mit dem von Wildtyp Cdc24. Beide GFP-Fusionen wurden unter den gleichen Bedingungen konstitutiv exprimiert. C) Der Effekt der Rac1 Überexpression auf die Cdc24-GFP Konzentration wurde in der An- (+) und Abwesenheit (-) des Rac1 Effektors Cla4 und des Gerüstproteins Bem1 untersucht. Dabei wurde Rac1 ektopisch in Wildtypzellen, in cla4 Deletionsmutanten und in einer konditionalen bem1 Mutante überexprimiert. Die analysierten Proben wurden vor (AUS) und acht Stunden nach der Rac1 Induktion (AN) genommen. D) Aktives Rac1-GTP braucht sowohl Cla4, als auch Bem1 um den Abbau von Cdc24 zu induzieren. E) Die Menge an Cdc24-GFP wurde vor (AUS) und nach (AN) der Induktion der Überexpression der konstitutiv aktiven Kinase Cla4∆CRIB in Wildtyp Zellen, in ∆rac1 Mutanten und in konditionalen bem1 Mutanten bestimmt. Die Anzucht der Kulturen erfolgte wie in (A) beschrieben. F) Die konstitutiv aktive Kinase Cla4∆CRIB benötigt die brückenbildende Funktion von Bem1 um Cdc24 dem Abbau zuzuführen. 30 2 Ergebnisse sen Wachstums hat, wurde die Cdc24* Variante im Stamm AB31 endogen exprimiert. Zu einem Zeitpunkt, als das Proteinniveau von Wildtyp Cdc24 durch die b-Induktion bereits um über fünfzig Prozent reduziert war, war die Menge an Cdc24* nur leicht negativ beeinflusst (Abb. 2.10 A). Dies deutet darauf hin, dass die Entfernung der Phosphorylierungsstellen in Cdc24* die negative Autoregulation während des filamentösen Wachstums deutlich abschwächt. Die Expression des stabilisierten Cdc24* hatte auch Auswirkungen auf den Phänotyp der Zellen. Knospende Zellen waren deutlich länger und an den Knospenspitzen stärker abgerundet. Auch der Zelldurchmesser war MutanteCdc24* 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 WTCdc24 MutanteCdc24* A +bE1/bW2 (4h) WTCdc24 +bE1/bW2 0h 8h 0h 8h Cdc24-3xHA Tub1 0% 50% 100% 150% 0h 8h 1.5 0.0 0.5 1.0 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 0 5 10 15 20 25 0 1 2 3 4 5 Länge[ m]m Länge[ m]m Zellänge Zelldurchmesser WT Cdc24 Mutante Cdc24* relativeKonzentration D E BC WT Cdc24 Mutante Cdc24* WT Cdc24 Mutante Cdc24* 0,00% 20,00% 40,00% 60,00% WTCdc24 MutanteCdc24* 0% ProzentualerZellanteil 20% 40% 60% kein Filament <10 m m 10-20 mm 20-50 mm >50 m m +bE1/bW2 (4h) Filamentlänge 0% 20% 40% 60% 80% 100% keineSymptome Anthocyanbildung Chlorose kleineTumore großeTumore Stammtumore n=153 n=159 n=166 FVirulenztest: WT Cdc24 1 2 MutanteCdc24* Abbildung 2.10: Die Expression einer stabilisierten Cdc24 Variante interferiert mit der Induktion des filamentösen Wachstums.A) Immunonachweis der Mengen von Cdc24 und Cdc24* vor (0 h) und nach (8 h) der Induktion der bW2/bE1 Überexpression. Das Diagramm zeigt die Quantifizierung der detektierten Proteinmengen. Die Graphik resultiert aus den Mittelwerten dreier unabhängiger Versuche. Der Balken repräsentiert die Standardabweichung. B) Erscheinungsbild von U. maydis Zellen, die Cdc24 und Cdc24* am genomischen Locus als C-terminale Fusion mit 3xHA exprimieren. Der Größenstandard entspricht 10 µm. C) Quantifizierung (n=50) der durchschnittlichen Länge und des Durchmessers von Zellen, die Cdc24* am genomischen Ort exprimieren. D) Quantifizierung (n=100) des prozentualen Anteils der Zellen ohne Filament und mit Filamenten der angezeigten Längen (unter 10 µm, zwischen 10 und 20 µm, zwischen 20 und 50 µm und über 50 µm) vier Stunden nach der Induktion der bW2/bE1 Überexpression im Wildtyp und in der Cdc24* Mutante. E) Phänotyp von AB31 Zellen, die die Cdc24* Mutante am genomischen Locus exprimieren, vier Stunden nach der Induktion der bW2/bE1 Überexpression. Der Größenstandard entspricht 10 µm. F) Die Graphik zeigt das Ergebnis eines Virulenztests mit dem solopathogenen Stamm SG200. Neben dem Wildtyp wurden zwei unabhängige Cdc24* Mutanten getestet. Die Symptome sind durch die in der Legende zugewiesene Farbe repräsentiert. Der prozentuale Anteil der Pflanzen mit den entsprechenden Symptomen an der Gesamtzahl ist im Diagramm gezeigt. Die Anzahl (n) der infizierten Pflanzen ist über den Balken beziffert. 37 2 Ergebnisse signifikant vergrößert (Abb. 2.10 B). Besonders hervorzuheben ist, dass die Expression von Cdc24* mit der b-induzierten Filamentbildung interferierte. Sowohl die Anzahl, als auch die Länge der durch b-Induktion gebildeten Filamente war in den mutierten Zellen drastisch reduziert (Abb. 2.10 D und E). Bei längerer b-Induktion waren jedoch auch alle Cdc24* Zellen in der Lage, ein Filament auszubilden. Um zu testen, ob sich die deutlich verlangsamte Filamentinduktion auf die Virulenz von U. maydis auswirkt, wurden Pflanzeninfektionen durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass die Virulenz eines Cdc24* exprimierenden Stammes im Vergleich zum Wildtyp reduziert war. Während über achtzig Prozent der mit dem Wildtyp infizierten Pflanzen deutliche Merkmale einer U. maydis Infektion aufwiesen (z.B. Stammtumore und große Tumore an den Blättern), zeigten nur fünfig Prozent der mit der Mutante infizierten Pflanzen schwache Infektionsmerkmale (Chlorose und kleine Gallen an den Blättern)(Abb. 2.10 F). Die Mutante war auch in der Lage, wenn auch verzögert, auf der Pflanze Appressorien auszubilden und in die Pflanze einzudringen (nicht gezeigt). Daher ist anzunehmen, dass der initiale Schritt der Infektion normal ablaufen kann, die reduzierte Virulenz jedoch von der Verzögerung im Infektionsprozess herrührt. Die Pflanze hätte in diesem Fall mehr Zeit, den eindringenden pathogenen Pilz zu bekämpfen. 2.2 Die Aktivität des Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Signalmoduls wird durch GAP-Aktivität, den GDI Rdi1 und aktinvermittelte Endozytose auf die Filamentspitze beschränkt 2.2.1 Drei GTPase aktivierende Proteine regulieren während des polaren Wachstums die Rac1-GTPase Aktivität Es konnte gezeigt werden, dass die Cla4-vermittelte Regulation von Cdc24 für das polare Wachstum während der Knospung und vor allem für die Induktion von Filamenten wichtig ist. Aus dieser Beobachtung ergab sich die Frage nach der biologischen Funktion des Cdc24 Abbaus. Die Entfernung des GEFs aus dem Signalkomplex mit Bem1, Rac1-GTP und Cla4 könnte dadurch erklärt werden, dass ein Verbleiben von Cdc24 im Modul für die Inaktivierung von Rac1-GTP und die anschließende Wiederverwendung der Komponenten des Signalmoduls hinderlich wäre. Um dieser Hypothese nachzugehen, mussten zunächst die GAPs für Rac1 identifiziert werden. Dazu wurden die katalytischen Domänen aller zehn potentiellen U. maydis Rho-GAPs in Zellen überexprimiert, die eine Cdc24-GFP Fusion konstitutiv exprimierten. Drei GAP-Domänen zeigten dabei einen Einfluss auf das Cdc24-GFP Niveau (nicht gezeigt). Es handelte sich dabei um die U. maydis Homologe von Bem2 und Bem3 und ein U. maydis spezifisches mit Rac1 38 2 Ergebnisse WT - Rip1 - Bem3 - Bem2 D D rip1 bem3 D D rip1 bem3 - Bem2 Zellänge (µm) WT -Rip1 -Bem3 -Bem2 D Drip1 bem3 D Drip1 bem3-Bem2 Rac1 Rip1 Bem3 Bem2 Überexpression: GAP GAP GAP GEFGEF Ras-spezifisch PHPX Bem2 Bem3 Rip1 2649 1149 987 bem2 gapD 0 5 10 15 20 25 30 bem2Dgap D E F GST GST-Rac1 GST-Rac1EN91/92HH Proteinextrakt GST GST-Rac1-GDP GST-Rac1-GTP Sg GST-Rac1 -GDP EN91/92HH GST-Rac1 GTP Sg EN91/92HH3xHA-Rip1(GAP) 3xHA-Bem3(GAP) 3xHA-Bem2(GAP) B CA Abbildung 2.11: Drei GTPase aktivierende Proteine (GAPs) haben Einfluss auf die Zellpolarität von U. maydis.A) Domänenstruktur der drei identifizierten Rac1-GAPs. Bem2 enthält neben der C-terminalen Rho-GTPasen aktivierenden Domäne (GAP) zwei Ras-GEF-Domänen. Bem3 umfasst ausser der C-terminalen GAP-Domäne zwei lipidbindende Domänen, eine Phox (PX) und eine Pleckstrin Homologie (PH) Domäne. In Rip1 konnten neben der GAP-Funktion keine weiteren funktionellen Domänen identifiziert werden. B) Wildtyp GST-Rac1 und mutiertes GST-Rac1EN91/92HH, das nicht mehr mit GAPs interagieren kann, wurden in E. coli exprimiert und durch AffinitätsChromatographie gereinigt. Proteinproben wurden in einem SDS-Gel aufgetrennt und durch Färbung mit „Coomassie Brilliant Blau“ nachgewiesen. GST diente als Kontrolle. C) Für die Kopräzipitationen wurde GST-Rac1 mit GDP oder nicht hydrolisierbarem GTPγS beladen. Gleiche Anteile der GTPasen wurden mit U. maydis Protinextrakten von Zellen inkubiert, die die 3xHA-markierten GAP-Domänen von Rip1, Bem2 und Bem3 konstitutiv exprimierten. Dimere aus Rac1 und den GAPs wurden mit Hilfe von Glutathion-Agarose präzipitiert, im SDS-Gel aufgetrennt und auf eine PVDF Membran transferiert. Die GAP Domänen wurden mit Hilfe eines monoklonalen HA-Antikörpers nachgewiesen. D) Phänotyp von Zellen, in denen Rip1, Bem2 und Bem3 einzeln, oder in den angezeigten Kombinationen abwesend sind. Der Größenstandard entspricht 10 µm. E) Quantifizierung (n=50) der Zellänge der in (D) gezeigten GAP Mutanten. Die Standardabweichung ist durch die Balken angezeigt. F) Erscheinungsbild von Zellen, die Rac1, Rip1, Bem3 oder Bem2 überexprimieren. Die Bilder wurden acht Stunden nach Induktion der Überexpression aufgenommen. Der Größenstandard entspricht 10 µm. 39 2 Ergebnisse GFP-Rip1: GFP-Bem3: GFP-Bem2: Abbildung 2.12: Die Rac1-GAPs zeigen unterschiedliche Lokalisationsmuster. Gezeigt ist die Lokalisation konstitutiv exprimierter N-terminaler GFP-Fusionen von Rip1, Bem3 und Bem2 in Abwesenheit der entsprechenden Wildtyp GAPs. Es wurden repräsentative Zellen ohne und mit kleiner und großer Knospe ausgewählt. Letztere haben schon beide Septen ausgebildet. Der Größenstandard entspricht 10 µm. (Die Photos von Rip1-GFP wurden mir freundlicherweise von Björn Sandrock zur Verfügung gestellt, die von Bem2-GFP von Annette Bauer) interagierendes Protein, Rip1 genannt (Abb. 2.11 A). Aufgereinigtes Rac1 war in seiner GTP-gebundenen aktiven Konformation in der Lage, die GAP-Domänen aller drei Kandidaten zu präzipitieren (Abb. 2.11 C). Die Interaktionen konnten durch Einführung von zwei Punktmutationen in Rac1EN91/92HH, die die Bindung von GAP-Domänen verhindern (Rittinger et al., 1997a; Wu et al., 2009), aufgehoben werden (Abb. 2.11 C). Um die biologische Funktion von Rip1, Bem2 und Bem3 zu untersuchen, wurden konditionale Mutanten hergestellt, die das jeweilige Gen unter der Kontrolle des crg Promotors am genomischen Locus exprimierten. Die Depletionen von Rip1, Bem2 und Bem3 führten jeweils zu einer deutlichen Hyperpolarisierung der Zellen (Abb. 2.11 D und E). Im Falle von Bem2, das neben der GAP-Domäne noch zwei Ras-GEF Domänen besitzt, konnte durch interne Deletion der GAP-Domäne (bem2∆gap) gezeigt werden, dass der beobachtete Phänotyp auf den Verlust der GAP-Funktion zurückzuführen ist (Abb. 2.11 D). Die kombinierten Mutationen von rip1 /bem3 und rip1 /bem3 /bem2 führten nur zu einer leichten zusätzlichen Verlängerung der Zellen im Vergleich zu den Einzeldepletionen (Abb. 2.11 D und E). Die Überexpression der Rac1-GAPs führte 40 2 Ergebnisse ebenfalls zu einer gestörten Zellmorphologie, verbunden mit deutlichen Elongationen. Dabei war die beobachtete Zellverlängerung im Falle von Bem2 am stärksten und im Falle von Bem3 am schwächsten ausgeprägt (Abb. 2.11 F). Sowohl durch Depletion, als auch bei Überexpression hatten Rip1, Bem2 und Bem3 Einfluss auf die Polarisierung der Zellen. Daraus kann gefolgert werden, dass sie an der Regulation des polaren Wachstums beteiligt sind. In Zusammenarbeit mit Björn Sandrock und Annette Bauer wurde die Lokalisation der potentiellen Rac1-GAPs überprüft. Dazu wurde GFP-Rip1 in ∆rip1 Zellen und GFP-Bem3 in einer ∆bem3 Mutante konstitutiv exprimiert. Bem2 wurde am genomischen Ort C-terminal an GFP fusioniert und unter der Kontrolle des tef Promotors überexprimiert. GFP-Rip1 zeigte Akkumulationen an der Spitze kleiner Knospen (Abb. 2.12). GFP-Bem3 aggregierte schon vor der Knospung an der Zellspitze, war aber auch an den Spitzen kleiner und großer Knospen zu finden. Bem2-GFP zeigte eine sehr schwache Lokalisation an der Zellmembran und an Endomembranen (Abb. 2.12). A 0 % 50% 1 0 0 % 1 5 0 % 2 0 0 % 2 5 0 % 3 0 0 % 3 5 0 % 4 0 0 % KNO3 - NH4 + WT Drip1 Tub1 Cdc24 Dbem3 Dbem2 KNO3 - NH4 +KNO3 - NH4 +KNO3 - NH4 + bem1Pnar 2,5 3,0 3,5 4,0 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 relativeCdc24-Konzentration 0 5 0 100 150 200 250 300 350 400 450 500 AraGlu + -+ - WT rac1kond rip1kond + - bem3kond + - bem2kond relativeCdc24-Konzentration 2,5 3,0 3,5 4,0 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 4,5 5,0 0% 50% 100% 150% 200% 250% bem2 GAPD Dbem2 WT 2,0 2,5 1,5 1,0 0,5 0,0 relativeCdc24-Konzentration CB Tub1 Cdc24 Tub1 Cdc24 Abbildung 2.13: Die Deletion der Rac1-GAPs hat eine Bem1-abhängige stabilisierende Wirkung auf die Cdc24 Konzentration.A) Vergleich der Auswirkungen der Depletion (-) und Überexpression (+) von Rac1, Rip1, Bem3 und Bem2 auf die Menge an Cdc24. Cdc24 wurde in konditionalen Mutanten von rac1,rip1,bem3 und bem2, die das entsprechende Gen unter der Kontrolle des crg Promotors exprimierten, am genomischen locus mit 3xHA markiert. Die Stämme wurden in Glukose (-) und Arabinose (+) haltigem Flüssigmedium angezogen. Die Graphik zeigt die Mittelwerte und die Standardabweichung dreier unabhängiger Versuche. B) Vergleich der Cdc24-3xHA Menge in Wildtyp Zellen, in bem2 Deletionsund in bem2∆GAP Mutanten. Mittelwerte und Standardabweichung von drei Versuchen sind gezeigt. C) Auswirkungen eines erhöhten Bem1 Niveaus auf den stabilisierenden Effekt der Depletionen von rip1,bem3 und bem2. Bem1 wurde ektopisch unter der Kontrolle des nitratinduzierbaren nar Promoters in den GAP Mutanten exprimiert. Die Kulturen wurden in ammoniumhaltigem (NH4+) Flüssigmedium angezogen und in nitrathaltigem (KNO3-) für sechs Stunden induziert. Die Graphik zeigt Mittelwert und Standardabweichung von drei Experimenten. Um zu überprüfen, ob der beobachtete Effekt der GAP Depletionen und Überexpressionen auf die Zellpolarität sich auch auf die Cdc24 Proteinstabilität auswirkt, wurde Cdc24-3xHA unter der Kontrolle des endogenen Promotors in konditionalen rip1,bem3 und bem2 Mutanten exprimiert. Depletion der Rac1-GAPs hatte einen deutlichen positiven Effekt auf die Cdc24 Proteinstabilität (Abb. 2.13 A). Dabei war das Cdc24-3xHA 41 2 Ergebnisse Niveau im Vergleich zum Wildtyp in Abwesenheit von Rip1 bis auf über dreihundert Prozent erhöht, wohingegen es in Abwesenheit von Bem3 und Bem2 nur auf einen Wert von über zweihundert Prozent, bzw. über hundertfünfzig Prozent erhöht war (Abb. 2.13 A). Der stabilisierende Effekt der Bem2 Depletion rührte von der Abwesenheit seiner GAP-Funktion her (Abb. 2.13 B). Interessanterweise konnte das durch die Depletion der GAPs stabilisierte Cdc24-3xHA Niveau durch die gleichzeitige ektopische Überexpression von Bem1 (Abb. 2.13 C), nicht jedoch durch die von Rac1 (nicht gezeigt), wieder abgesenkt werden. Die Überexpressionen der Rac1-GAPs führten zu einer starken Destabilisierung von Cdc24-3xHA, die mit der durch eine Rac1 Überexpression induzierten Degradation des GEFs vergleichbar war (Abb. 2.13 A). 2.2.2 Der Guanin-Nukleotid Dissoziations Inhibitor Rdi1 stellt inaktives Rac1-GDP zur erneuten Aktivierung zu Verfügung Es ist anzunehmen, dass nach einer GAP-stimulierten Inaktivierung von Rac1 durch GTP-Hydrolyse, der Rac1/Bem1/Cla4 Komplex zerfällt, da weder Bem1 noch Cla4 Affinität zu Rac1-GDP besitzt (Abb. 2.3 D). Das freigesetzte Rac1-GDP verbleibt vermutlich zunächst an der Membran. Um die GTPase während des polaren Wachstums einer erneuten Aktivierung zuzuführen, muss sie an die Spitze zurückgebracht werden. Dies kann durch Interaktion mit einem Guanin-Nukleotid Dissoziations Inhibitor (GDI) sichergestellt werden, der die GTPase durch eine hydrophobe Interaktion mit dem Prenylanker von der Membran ablöst (Sasaki et al., 1990; Wu et al., 1996b; Seabra and Wasmeier, 2004). Die Deletion des U. maydis Homologes des GDI Rdi1 hatte keine Auswirkungen auf das Erscheinungsbild haploider Zellen. Sowohl die Knospung, als auch die Septenbildung waren ungestört (Abb. 2.14 A). Diese Beobachtung war mit früheren Ergebnissen konsistent (Andrea Hlubek, Dissertation). Eine N-terminale GFP-Fusion des GDIs, die in ∆rdi1 Zellen ektopisch konstitutiv exprimiert wurde, lokalisierte im Zytoplasma und an Endomembranen (Abb. 2.14 D). Um die Auswirkungen eines erhöhten Rdi1 Niveaus zu untersuchen, wurde eine konditionale Mutante hergestellt, in der rdi1 unter der Kontrolle des starken induzierbaren crg Promotors stand. Interessanterweise führte die Überexpression von Rdi1 zu einer sehr starken Zellverlängerung (Abb. 2.14 B und C). Um die Bedeutung von Rdi1 für das b-induzierte filamentöse Wachstum zu untersuchen, wurde rdi1 in dem Stamm AB31 deletiert. AB31∆rdi1 zeigte eine verzögerte Filamentbildung. Drei Stunden nach Induktion der bW2/bE1 Überexpression, wenn mehr als achtzig Prozent der Wildtypzellen bereits ein Filament ausgebildet hatten, zeigte höchstens die Hälfte der ∆rdi1 Zellen eine deutlich kürzere filamentöse Struktur (Abb. 2.14 E und F). Nach längerer b-Induktion waren jedoch nahezu alle AB31∆rdi1 Zellen in der Lage, ein Filament auszubilden, dass im Aufbau mit denen 42 2 Ergebnisse WT calcofluor Drdi1 calcofluor GFP-Rdi1 Rac1 Rdi1 Überexpression: WT + Rdi1 - Rdi1 0 5 10 15 20 25 30 35 A BD C+bE1/bW2 (3h) WT Drdi1 0% 20% 40% 60% WT Drdi1 0% Prozentualer Zellanteil 20% 40% 60% kein Filament <10 mm 10-20 mm 20-50 mm +bE1/bW2 (3h) Filamentlänge DIC E F 0 35 30 25 20 15 10 5 Zellänge (µm) Abbildung 2.14: Rdi1 ist ein Regulator der Zellpolarität in U. maydis.A) Phänotyp von rdi1 Deletionsmutanten. Die Zellwände wurden mit Calcofluor-Weiss angefärbt. Knospende Zellen weisen ein charackteristisches Doppelseptum zwischen Mutterund Tochterzelle auf. Der Größenstandard repräsentiert 10 µm. B) Erscheinungsbild von Zellen, die Rac1 oder Rdi1 überexprimieren. Die Zellen wurden für acht Stunden in induzierendem Flüssigmedium inkubiert. Der Größenstandard entspricht 10 µm. C) Quantifizierung (n=50) der Zellänge bei Rdi1 Depletion (-Rdi1) und Überexpression (+Rdi1). Die Standardabweichung ist durch die Balken angezeigt. D) Lokalisation einer N-terminalen GFPFusion von Rdi1 in ∆rdi1 Mutanten. E) Phänotyp von AB31 und AB31∆rdi1 Zellen drei Stunden nach der Induktion der bW2/bE1 Überexpression. Der Größenstandard entspricht 10 µm. F) Quantifizierung (n=150) des prozentualen Anteils der Zellen ohne Filament und mit Filamenten der angezeigten Längen (unter 10 µm, zwischen 10 und 20 µm, zwischen 20 und 50 µm und über 50 µm) drei Stunden nach der Induktion der bW2/bE1 Überexpression im Wildtyp und in der AB31∆rdi1 Mutante. von AB31 vergleichbar (nicht gezeigt). Um zu überprüfen, ob Rdi1 in U. maydis mit GTPasen interagiert und sie aus der Membran herauslösen kann, wurden N-terminale GFP-Fusionen von Rac1 und dem nah verwandten Cdc42 in der konditionalen rdi1 Mutante exprimiert. In Wildtypzellen zeigten GFP-Rac1 und GFP-Cdc42 eine starke Lokalisation an der gesamten Zellmembran und an den Septen. GFP-Rac1 zeigte zusätzlich eine Akkumulation an der Knospenspitze, wohingegen GFP-Cdc42 auch an Endomembranen lokalisierte (Abb. 2.15 A und C). Im Falle einer Rdi1 Depletion war die Membranlokalisation der GTPasen nicht gestört. Im Fall von Cdc42 kam es jedoch zu zusätzlichen Akkumulationen im Zytoplasma (Abb. 2.15 C). Die Überexpression von Rdi1 führte hingegen zur Aufhebung der Membranlokalisation, wobei hier der Effekt für GFP-Rac1 deutlich größer war (Abb. 2.15 A und C). Für das Säugetier Ortholog von Rdi1, GDI1, wurde eine GTPasen stabilisierende Funktion beschrieben (Boulter et al., 2010). Folglich wurden 43 2 Ergebnisse GFP-Cdc42 WT GFP-Rac1 WT -Rdi1 +Rdi1Überexpression -Rdi1 +Rdi1Überexpression AraGlu + - WT rdi1kond Cdc42 Tub1 0 % 2 0 % 4 0 % 6 0 % 8 0 % 1 0 0 % 1 2 0 % 1 4 0 % 1,0 1,2 1,4 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 relativeCdc24-Konzentration AraGlu + - WT rdi1kond 3xHA-Rac1 Tub1 0 % 2 0 % 4 0 % 6 0 % 8 0 % 1 0 0 % 1 2 0 % 1 4 0 % 1,0 1,2 1,4 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 relativeCdc24-Konzentration A B DC KNO3 - NH4 + WT Drdi1 KNO3 - NH4 + bem1Pnar Cdc24-3xHA Tub1 0 % 2 0 % 4 0 % 6 0 % 8 0 % 1 0 0 % 1 2 0 % 1 4 0 % 1 6 0 % 1,0 1,2 1,4 1,6 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 relativeCdc24-Konzentration G KNO3 - NH4 + WT Drdi1 KNO3 - NH4 + rac1Pnar Cdc24-3xHA Tub1 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 140% 160% 1,0 1,2 1,4 1,6 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 relativeCdc24-Konzentration F 0 % 5 0 % 1 0 0 % 1 5 0 % 2 0 0 % 2 5 0 % 3 0 0 % 3 5 0 % 4 0 0 % AraGlu + -+ - WT rac1kond rdi1kond Cdc24-3xHA Tub1 2,5 3,0 3,5 4,0 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 relativeCdc24-Konzentration E Abbildung 2.15: Rdi1 hat einen Rac1-abhängigen Einfluss auf die Stabilität von Cdc24. A) Lokalisation einer konstitutiv exprimierten N-terminalen GFP-Fusion von Rac1 in wildtyp Zellen und in einer konditionalen rdi1 Mutante, in der das rdi1 Gen an seinem Locus unter der Kontrolle des crg Promotors stand. Die Zellen wurden über Nacht in glukosehaltigem Flüssigmedium angezogen (-Rdi1) und dann für vier Stunden in arabinosehaltigem Medium inkubiert (+Rdi1). Der Größenstandard entspricht 10 µm. B) Quantifizierung der Menge an endogen exprimiertem 3xHA-Rac1 in Abwesenheit von Rdi1 (-) und bei Überexpression des GDIs (+). Das Diagramm zeigt den Mittelwert dreier unabhängiger Versuche. Die Balken zeigen die Standardabweichung. C) Lokalisation von konstitutiv exprimiertem GFP-Cdc42 in der konditionalen rdi1 Mutante. Die Anzucht der Kulturen erfolgte wie in (A) beschrieben. Der Größenstandard repräsentiert 10 µm. D) Die Quantifizierung der Menge an endogenem Cdc42 erfolgte wie in (B) beschrieben. E) Vergleich der Auswirkungen der Depletion und Überexpression von Rac1 und Rdi1 auf das endogene Cdc24-3xHA Niveau. Die konditionalen rac1 und rdi1 Mutanten wurden auf Glukose (-) und Arabinose (+) angezogen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte und Standardabweichungen dreier Experimente. F) Effekt der Bem1 Überexpression unter Kontrolle des nar Promotors auf die Cdc24 stabilisierende Wirkung der rdi1 Depletion. Die Kulturen wurden in ammoniumhaltigem (NH4+) Flüssigmedium angezogen und in nitrathaltigem (KNO3-) für sechs Stunden induziert. Der aus drei Experimenten erhobene Mittelwert und die Standardabweichung sind gezeigt. G) Auswirkungen der Überexpression von Rac1 unter der Kontrolle des nar Promotors auf die stabilisierende Wirkung der rdi1 Deletion. Die Expressionsbedingungen sind in (F) beschrieben. Das Diagramm zeigt den Mittelwert von drei Experimenten und die Standardabweichung. 44 2 Ergebnisse auch die Auswirkungen der Rdi1 Depletion und Überexpression auf die Menge an endogen exprimiertem 3xHA-Rac1 und Cdc42 untersucht. Die Menge beider GTPasen blieb jedoch sowohl bei Überexpression, als auch bei Depletion von Rdi1 nahezu unbeeinflusst (Abb. 2.15 B und D). Da Rdi1 in der Lage ist, Rac1 aus der Membran zu lösen, bei Überexpression Zellen zu hyperpolarisieren und die Anwesenheit von Rdi1 eine Voraussetzung für die zügige Filamentinduktion ist, wurde der Einfluss des GDI auf die Regulation von Cdc24 untersucht. Dazu wurde Cdc24 in der konditionalen rdi1 Mutante am genomischen Ort mit einem dreifachen HA-Epitop markiert. Die Depletion von Rdi1 hatte nur eine vergleichsweise geringe Auswirkungen auf die Proteinstabilität von Cdc24-3xHA (Abb. 2.15 E). Interessanterweise war der stabilisierende Effekt einer Depletion von Rdi1 durch die Überexpression von Rac1 aufhebbar (Abb. 2.15 F), nicht jedoch durch die von Bem1 (Abb. 2.15 G). Die Überexpression des GDI hatte eine, mit der von Rac1 vergleichbare, deutliche destabilisierende Wirkung auf die Cdc24-3xHA Menge (Abb. 2.15 E). 2.2.3 Das Entfernen von Rac1-GDP aus der Membran wird durch die aktinabhängige Endozytose während des polaren Wachstums unterstützt Die Tatsache, dass ∆rdi1 Mutanten nur geringe Polaritätsdefekte zeigen, weist darauf hin, dass es zusätzliche Mechanismen geben muss, die die Entfernung von inaktivem Rac1-GDP aus der Membran sicherstellen, damit es anschließend einer neuen Aktivierung zugeführt werden kann. Es ist bekannt, dass in S. cerevisia die aktinvermittelte Endozytose für die Funktion von Cdc42 eine wichtige Rolle spielt (Slaughter et al., 2009). Um die Bedeutung der Endozytose für die Rac1-abhängige Regulation von Cdc24 zu untersuchen, wurde der endozytotische Prozess auf zwei Arten inhibiert. Zum einen wurde die temperatursensitive Mutation in dem endosomalen t-SNARE Yup1ts genutzt (Wedlich-Söldner et al., 2000). Zum anderen wurden die Zellen mit LatrunculinA (50 µM) inkubiert, um das Aktinzytoskelett zu zerstören. Die Inhibition der Endozytose führte in beiden Fällen zu einer Verdickung der Zellen und einer irregulären Septierung (Abb. 2.16 A und C). Sowohl die Inkubation der Yup1ts Mutante bei nichtpermissiver Temperatur, als auch die Inkubation der Zellen mit LatrunculinA, resultierte in einer leichten Stabilisierung des Cdc24-3xHA Niveaus auf etwa hundertvierzig Prozent (Abb. 2.16 B und D). Die Inhibition der Endozytose führte in ∆rdi1 Zellen zu einem Anstieg der Cdc24-3xHA Konzentration auf hundertachzig Prozent (Abb. 2.16 F), was darauf hindeutet, dass der stabilisierende Effekt der Inhibition der Endozytose und der stabilisierende Effekt der rdi1 Deletion additiv wirken. 45 2 Ergebnisse 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 140% 160% 25°C 32°C Yup1ts 32°C25°C WT yupts Cdc24-3xHA Tub1 relativeCdc24-Konzentration 32°C25°C - +LatA LatrunculinA WT Cdc24-3xHA Tub1 relativeCdc24-Konzentration WT+DMSO WT+LatA 1,0 1,2 1,4 1,6 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 1,0 1,2 1,4 1,6 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 A B C D 0% 40% 80% 120% 160% 200% Drdi1 +LatA LatrunculinA Drdi1 Cdc24-3xHA Tub1 relativeCdc24-Konzentration Drdi1+DMSO Drdi1+LatA 1,2 1,6 2,0 0,8 0,4 0,0 E F - WT Abbildung 2.16: Die Inhibition der aktinabhängigen Endozytose hat einen stabilisierenden Effekt auf die Cdc24 Konzentration.A) Phänotyp von Zellen nach vierstündiger Inhibition der temperatursensitiven Mutante des endosomalen t-SNARE Yup1. Der Größenstandard entspricht 10 µm. B) Quantifizierung der Menge an endogenem Cdc24-3xHA vor (25◦C) und nach (32◦C) der Inhibition von Yup1ts. Das Diagramm zeigt den Mittelwert dreier Experimente. Der Balken repräsentiert die Standardabweichung. C) Erscheinungsbild von Zellen nach vierstündiger Inkubation mit LatrunculinA (LatA). Der Längenstandard entspricht 10 µm. D) Bestimmung der Menge an endogenem Cdc24-3xHA vor (WT und WT + DMSO) und vier Stunden nach der Zugabe des Inhibitors (+LatA). Der Mittelwert dreier Experimente ist mit Standardabweichung gezeigt. E) Phänotyp von ∆rdi1 Zellen vor (-) und nach Inkubation mit LatA. Der Größenstandard zeigt 10 µm. F) Vergleich des endogenen Cdc24-3xHA Niveaus im Wildtyp, in ∆rdi1 Zellen, in ∆rdi1 Zellen, die mit dem Lösungsmittel von LatA (DMSO) inkubiert wurden und in ∆rdi1 Zellen, die mit LatA behandelt wurden. Mittelwert und Standardabweichung von drei Experimenten sind in der Graphik gezeigt. 2.2.4 Rac1 muss GTP hydrolysieren und mit Rdi1 interagieren können, um das polare Wachstum zu stimulieren Während des polaren Wachstums muss Rac1-GTP durch Rip1, Bem2 und Bem3 inaktiviert und durch Rdi1, bzw durch Endozytose einer neuen Aktivierung an der Spitze zugeführt werden. Um die Bedeutung der einzelnen Schritte für das polare Spitzenwachstum beurteilen zu können, wurden die Interaktionen von Rac1 mit anderen Regulatoren einzeln und in Kombination aufgehoben. Dies wurde durch die Einführung von spezifischen Punktmutationen erreicht. Die entsprechenden Rac1 Varianten wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, filamentöses Wachstum zu induzieren und die Cdc24 Proteinstabilität negativ zu regulieren. Die Fähigkeit von Rac1 mit den GAP-Domänen von Rip1, Bem2 und Bem3 zu interagieren, wurde durch die Einführung der EN91/92HH Mutationen (Rittinger et al., 1997a; Wu et al., 2009) aufgehoben (Abb. 2.11 C). Die Überexpression von Rac1EN91/92HH war zwar ausreichend, um polares Wachstum zu induzieren, die Zellen zeigten jedoch eine irreguläre, vielfach verdickte Form (Abb. 2.17 A). Die Interaktion mit Rdi1 wurde durch die Einführung der Mutation R66E verhindert (Gibson and Wilson-Delfosse, 2001). GFP-Rac1R66E verblieb auch bei starker Überex46 2 Ergebnisse die stärkste Fragmentierung der Vakuolen auf und die Cdc42/Smu1 Doppeldepletion die schwächste (Abb. 2.19 B und C). Die Fähigkeit von Rac1 und Cdc42 sowohl mit Cla4, als auch mit Smu1 mit gleicher Affinität zu interagieren, konnte durch Interaktionsstudien bestätigt werden. GST-Rac1 und GST-Cdc42 waren in ihrer GTP-gebundenen Konformation in der Lage, gleiche Mengen an Cla4-GFP und Smu1-GFP zu präzipitieren (Abb. 2.21 B). Die Interaktion von Rac1 und Cla4 wird während des polaren Wachstums durch das Gerüstprotein Bem1 vermittelt. Die Depletion des essentiellen Proteins Bem1 führt zum Polaritätsverlust und zur starken Fragmentierung der Vakuolen (Abb. 2.19 B). Dabei ist die Anzahl der nachweisbaren vakuolären Strukturen in der Zelle jedoch geringer als bei einer Doppeldepletion von Rac1 und Cdc42, was jedoch vermutlich auf das deutlich kleinere Zellvolumen der bem1 Mutanten zurückzuführen ist. Auch das Gerüstprotein Bem1 konnte sowohl mit Rac1-GTP, als auch mit Cdc42-GTP präzipitiert werden (Abb. 2.21 B). Zusammengefasst lässt sich sagen, dass kreuzweise Interaktionen zwischen dem Rac1und dem Cdc42-abhängigen Signalweg, sowohl beim aktivierenden Schritt (Cdc24), als auch auf der Ebene der Effektorstimulation (Cla4/Smu1) im Komplex mit dem Gerüstprotein Bem1 stattfinden können (Abb. 2.21 D). 2.3.2 Die Mutante Cdc42F56W gewinnt Rac1-Signalspezifität und verliert Cdc42-Funktionalität Basierend auf der Beobachtung, dass Cdc42 mit ähnlicher Affinität wie Rac1 mit Bem1 und Cla4 interagiert, kann geschlossen werden, dass der einzige Grund, warum Cdc42 Rac1 in vivo nicht vollständig ersetzen kann, von der geringeren Affinität des Aktivators Cdc24 für Cdc42 herrührt. Um diese Theorie experimentell zu untermauern, wurde durch Einführung einer Punktmutation (F56W) in Cdc42 versucht, diese GTPase zu einem besseren Substrat für Cdc24 zu machen. Alle bekannten Cdc42 Proteine tragen an Position 56 ein Phenylalanin (F), während alle bekannten Rac1 Proteine ein Tryptophan (W) an dieser Position aufweisen. Es konnte gezeigt werden, dass ein Austausch von F und W an dieser Position die GTPasen zum Substrat für die GEFs der jeweils anderen machen kann (Gao et al., 2001; Snyder et al., 2002). Die katalytische DH-PH Tandem Domäne von Cdc24 verhielt sich in einem von Kay Schink durchgeführten in vitro Aktivitätstest gegenüber GST-Cdc42F56W und GST-Rac1W56F wie erwartet. GSTCdc42F56W wurde durch Cdc24 mit hoher Effizienz aktiviert, während die Affinität des GEFs für GST-Rac1W56F drastisch reduziert war (Kay Schink, Dissertation und Abb. 2.22 A). In vivo war die Einführung von Cdc42F56W in Deletionsmutanten von rac1 ausreichend, um durch Cdc24 Überexpression Filamente zu induzieren, während dies durch Einführung der korrespondierenden Rac1W56F Mutante nicht möglich war (Abb. 53 2 Ergebnisse t(min) 0 20 40 60 relativeFluoreszenz 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 Cdc42 Cdc42F56W Cdc24(DH-PH) Cdc42(Kontrolle) Cdc42 (Kontrolle) F56W GEF t(min) 0 20 40 60 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 Rac1(Kontrolle) Rac1 Rac1W56F Rac1 (Kontrolle) W56F GEF Cdc24 Aus Rac1W56F Cdc42F56W WT - Ärac1 Cdc24 AN A Ärac1cdc42F56W Äcdc42 cdc42F56W WT Drac1 relativeFluoreszenz B E 0% 25% 75% 50% 100% AnteilGesamtzellzahl Ärac1 Äcdc42 WT Ärac1 cdc42F56W 5-15 >15 1-5 Vakuolen Ärac1cdc42F56W Ärac1 Äcdc42 WT Vakuolen CD - - Dcdc42 AUS AN Rac1 AUS AN Cdc42F56W WT Cdc24-3xHA Tub1 Rac1W56F AUS AN Cdc42 AUS AN F Abbildung 2.22: Die Mutante Cdc42F56W gewinnt Rac1-Signalspezifität, verliert jedoch ihre Cdc42-Funktionalität A) in vitro Test der Aktivierung von GST-Cdc42F56W und GSTRac1W56F durch das katalytische DH-PH Tandem von Cdc24. Gemessen wurde die Inkorporation von mant-GDP in die GTPasen (Die „GEF-assays“ wurden von Kay Schink durchgeführt). B) Erscheinungsbild von Zellen, die Cdc42F56W an Stelle von Cdc42 am genomischen Locus und in der Anund Abwesenheit von Rac1 exprimieren. Wildtyp, ∆rac1 und ∆cdc42 Zellen sind zum Vergleich gezeigt. Der Größenstandard entspricht 10 µm (Die Mutante cdc42F56W wurde von Britta Tillmann zur Verfügung gestellt). C) Vakuolenmorphologie in ∆rac1 Zellen, die Cdc42F56W am natürlichen Locus exprimieren. Die Vakuolen wurden mit „CellTracker blue“ (Molecular Probes) gefärbt. Die Vakuolenmorphologie von Wildtyp, ∆rac1 und ∆cdc42 Zellen ist zum Vergleich gezeigt. D) Quantifizierung (n=50) der Vakuolenzahl in den in (C) gezeigten Zellen. Dargestellt ist der prozentuale Anteil von Zellen mit bis zu fünf, zwischen sechs und fünfzehn und mit mehr als sechzehn Vakuolen an der Gesamtzellpopulation. E) Wildtyp, ∆cdc42 und ∆rac1 Zellen, die Cdc24 überexprimierten, wurden auf aktivkohlehaltiges Festmedium aufgetropft. Die Cdc24-induzierte Filamentbildung wird durch das weiße Mycel angezeigt. Die Filamentbildung konnte in ∆rac1 Mutanten durch die ektopische konstitutive Expression von Cdc42F56W gerettet werden, jedoch nicht durch Rac1W56F.F) Auswirkungen der Überexpression von Rac1W56F und Cdc42F56W auf das endogene Cdc24-3xHA Niveau. Die GTPasen wurden ektopisch unter der Kontrolle des crg Promotors exprimiert. Die Flüssigkulturen wurden mit Glukose (AUS) angezogen und anschließend acht Stunden mit Arabinose (AN) inkubiert. 54 2 Ergebnisse 2.22 E). Die Aktivierung von Cdc42F56W durch Cdc24 und die damit verbundene Stimulation von Cla4 führte zum Abbau von Cdc24 (Abb. 2.22 F). Aus den beschriebenen Beobachtungen kann geschlossen werden, dass Cdc42F56W alle Rac1 Funktionen während des polaren Wachstums von U. maydis übernehmen kann. Die Expression von Cdc42F56W am genomischen Locus in ∆rac1 Zellen, führte neben der Aufhebung des Polaritätsdefektes auch zu einer Suppression der Vakuolenfragmentierung (der Stamm wurde freundlicherweise von Britta Tillmann zur Verfügung gestellt). Die Zellen wiesen eine normale Vakuolengröße und Zahl auf (Abb. 2.21 C und D). Cdc42F56W konnte also auch die für die Integrität der Vakuolen essentielle Funktion alleine übernehmen. Jedoch wiesen alle Zellen, die Cdc42F56W am genomischen Locus exprimierten, einen Zellseparierungsdefekt auf, der mit dem von cdc42 Deletionsmutanten vergleichbar war (Abb. 2.22 B). Dies kommt vermutlich dadurch zustande, dass sich Cdc42F56W in vivo wie Rac1 verhält und daher nicht in der Lage ist Cdc42 während der Zytokinese zu ersetzen. Von Kay Schink und Britta Tillmann konnte gezeigt werden, dass Cdc42F56W in vitro schlechter durch die Cdc42-spezifischen GEFs Don1 und Hot1 erkannt wird als Cdc42. Hinzu kommt, dass die Aminosäure an Position 56 in der Effektorschleife der GTPase liegt und eine Mutation an dieser Stelle auch Auswirkungen auf die Interaktion mit Effektoren haben kann (Karnoub et al., 2001). 55 3 Diskussion 3.1 Dynamische Regulation des Cdc24/Bem1/Rac1/Cla4 Signalmoduls 3.1.1 Die Cla4 abhängige Phosphorylierung von Cdc24 induziert den Abbau des GEFs In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Rho-GEF Cdc24 die GTPase Rac1 während des polaren Wachstums von U. maydis aktiviert. Die Aktivierung von Rac1 führt sowohl während der Knospung, als auch während des filamentösen Wachstums, zu einer negativen posttranslationellen Regulation von Cdc24. Während des polaren Wachstums wird Cdc24 durch Cla4-abhängige Phosphorylierung destabilisiert. Das Homolog von Cdc24 in S. cerevisiae, Cdc24p, ist auch ein Substrat für Cla4p-abhängige Phosphorylierung. Die biologische Funktion dieser Modifikation wird jedoch kontrovers diskutiert (Bose et al., 2001; Gulli et al., 2000; Irazoqui et al., 2003). Es wurde beschrieben, dass die Cla4-abhängige Phosphorylierung von Cdc24 die Dissoziation des GEFs aus dem Komplex mit dem Gerüstprotein Bem1p reguliert und so eine negative regulatorische Rückkopplungsschleife konstituiert (Gulli et al., 2000). Diese Sichtweise wurde durch eine andere Studie in Frage gestellt, in der kein Einfluss der Cla4-abhängigen Phosphorylierung auf die Cdc24-Bem1 Interaktion festgestellt werden konnte (Bose et al., 2001). In diesem Zusammenhang wurde spekuliert, dass die Phosphorylierung des GEFs einen positiven Einfluss auf die Aktivität des GEFs hat (Bose et al., 2001; Kozubowski et al., 2008). Eine Cdc24p Mutante, in der alle durch massenspektrometrische Analysen identifizierten Phosphorylierungsstellen zu Alanin mutiert waren, zeigte keine Defekte in Stabilität und Funktion (Wai et al., 2009). Während also in S. cerevisiae durchaus in Frage gestellt werden kann, dass die Phosphorylierung von Cdc24p eine biologische Funktion hat, so konnte eine solche in U. maydis im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden. Es gelang, eine kurze, 62 Aminosäuren umfassende Region zu identifizieren, die sowohl notwendig, als auch ausreichend ist, um den Cla4-induzierten Abbau von Cdc24 zu gewährleisten. Die Mutation aller Serine und Threonine in diesem Bereich führte zu einer signifikanten Stabilisierung des GEFs, wobei seine Aktivität nicht beeinflusst war. Der Vergleich mit Cdc24p aus S. cerevisiae zeigte, dass keine dieser potentiellen 56 3 Diskussion Phosphorylierungsstellen zwischen U. maydis und der Bäckerhefe konserviert sind. Da die Mutation einzelner Serine und Threonine die Proteinstabilität von Cdc24 nicht veränderten, ist anzunehmen, dass eine multiple Phosphorylierung innerhalb dieser Region für den Abbau von Cdc24 notwendig ist. Die Regulation von Proteinen durch multiple Phosphorylierung ist ein weitverbreitetes Phänomen (Salazar and Höfer, 2009). So wird z.B. in S. cerevisiae die Stabilität des CDK Inhibitors Sic1p und des Transkriptionsfaktors Tec1p durch multiple Phosphorylierung reguliert (Nash et al., 2001; Bao et al., 2010). Dies ermöglicht die Erkennung der Proteine durch Cdc4, einer Untereinheit des SCF E3 Ubiquitin Ligase Komplexes (Deshaies and Joazeiro, 2009). In Säugern wurde auch bereits die Regulation von zwei humanen Rho-GEFs der Dbl-Familie, FGD1 und FGD3, durch SCF-abhängigen Abbau beschrieben (Hayakawa et al., 2005, 2008). Daher kann spekuliert werden, ob das phosphorylierte Cdc24 in U. maydis ebenfalls durch eine bislang noch unbekannte Ubiquitin Ligase erkannt und dann Ubiquitin-abhängig abgebaut wird. Alle Versuche eine Ubiquitinierung von Cdc24 nachzuweisen, blieben jedoch bislang ohne Erfolg, da noch kein Weg gefunden wurde, Proteasominhibitoren stabil in U. maydis Zellen einzuschleusen. Während des filamentösen Wachstums konnte beobachtet werden, dass das stabilisierte Cdc24* zwar deutlich langsamer als der nicht mutierte GEF, aber dennoch reproduzierbar einer posttranslationellen Destabilisierung ausgesetzt war. Ob es sich dabei um einen Cla4-unabhängigen Mechanismus handelt, oder ob es weitere, noch unbekannte Phosphorylierungsstellen gibt, die einen Einfluss auf die Stabilität von Cdc24 haben, muss an dieser Stelle offen bleiben. 3.1.2 Der Abbau von Cdc24 beschränkt die Aktivität des Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Signalmoduls auf die wachsende Spitze Für das polarisierte Wachstum von U. maydis ist es von essentieller Bedeutung die Wachstumsaktivität auf einen Punkt zu beschränken. In S. cerevisiae wird dieser Punkt normalerweise durch die Knospungsstelle markierende Proteine festgelegt (Casamayor and Snyder, 2002). Eine wichtige Aufgabe übernimmt dabei die Ras-GTPase Rsr1p (Gulli and Peter, 2001). Jedoch sind die Zellen auch in Abwesenheit von Rsr1p in der Lage, eine einzelne Knospe an einer zufälligen Position zu bilden, ein Phänomen, das als „symmetry-breaking“ beschrieben wurde (Irazoqui et al., 2003). Die Frage, wie in diesem Fall ein stabiler Gradient von aktivem Cdc42-GTP etabliert und aufrecht erhalten wird, wurde durch zwei widerstreitende Modelle erklärt. Basierend auf Untersuchungen mit konstitutiv aktivem Cdc42p wurde postuliert, dass aktives Cdc42p am Zellkortex den aktinabhängigen Transport von weiteren Cdc42p Molekülen stimu57 3 Diskussion liert, was zu einem wachsenden Aggregat von aktivem Cdc42p führt (Wedlich-Söldner et al., 2003). Durch mathematische Modellierung und Simulation des Vesikeltransports, wurde dieses einfache Modell jedoch angezweifelt (Layton et al., 2011). In einem alternativen Model wird postuliert, dass aktives Cdc42p-GTP den zytoplasmatischen Cdc24p/Bem1p/Cla4p Komplex an die Membran rekrutiert. Der membranassoziierte Komplex erzeugt dann durch die Aktivität von Cdc24p weitere aktive Cdc42p Proteine, die ihrerseits weitere Komplexe rekrutieren, wodurch die Konzentration von Cdc42pGTP lokal ansteigt (Goryachev and Pokhilko, 2008; Irazoqui et al., 2003; Kozubowski et al., 2008). Die Beschränkung der Knospung auf nur ein wachsendes Cdc42-GTP Aggregat kommt dabei vermutlich dadurch zustande, dass die wachsenden Aggregate um eine limitierte Menge an Cdc24p/Bem1p/Cla4p Komplex kompetitieren (Howell et al., 2009). In U. maydis hängt die Zellpolarisation zwingend von der Bildung eines ternären Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplexes ab. Die Generierung eines stabilen Gradienten von aktiven Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplexen an der Spitze von Knospen und Filamenten wird vermutlich über mehrere ineinandergreifende Mechanismen erreicht. Der Mechanismus, der die Initiation des polaren Spitzenwachstums selektiv auf einen Zellpol beschränkt ist dabei unklar. Die Deletion des U. maydis Homologs von Rsr1p hatte keinen Einfluss auf das Knospungsmuster, sondern nur auf die Geschwindigkeit, mit der nach abgeschlossener Zellteilung eine neue Tochterzelle gebildet wurde (Sabrina Patzak, Diplomarbeit). Aktives Cdc24 interagiert mit dem Bem1/Cla4 Modul und rekrutiert Rac1-GDP in einen transienten, durch Kopräzipitation nachweisbaren, Cdc24/Bem1/Rac1/Cla4 Komplex (Abb 3.1). Die Aktivierung von Rac1 erhöht dessen Affinität zu Bem1. Dabei dient der Prenylanker von Rac1 vermutlich der Stabilisierung von Bem1 an der Membran, da GFP-Bem1 in Abwesenheit von Rac1 nicht an der Zellspitze lokalisierte. Rac1-GTP interagiert mit Cla4 und stimuliert dadurch vermutlich dessen Kinaseaktivität (Abb 3.1). Die aktive Cla4 Kinase stimuliert das polare Wachstum durch Phosphorylierung von noch nicht identifizierten Effektoren. Gleichzeitig kommt es zur Phosphorylierung von Cdc24, was dessen Abbau induziert (Abb 3.1). Die Tatsache, dass Cdc24 gebraucht wird, um Rac1 während des polaren Wachstums zu aktivieren, lässt den verstärkten Abbau des GEFs während des polaren Wachstums zunächst kontraintuitiv erscheinen. Die einzige plausible Erklärung ist, dass ein Verbleiben von Cdc24 im Komplex mit Bem1, Rac1-GTP und Cla4 für das polare Wachstum hinderlich wäre. Aktives Rac1-GTP muss auf die wachsende Spitze beschränkt werden. Dies wird vermulich durch die in dieser Arbeit identifizierten Rac1-GAPs Rip1, Bem2 und Bem3 erreicht (siehe Abschnitt 3.1.3 für eine detaillierte Diskussion). Es ist anzunehmen, dass die Rac1-GAPs eine subapikale „Zone der Inhibition“ konstituieren, wie sie z.B. in S. cerevisiae zur Verhinderung der Knospung innerhalb der alten 58 3 Diskussion Rac1 Rac1 Bem1 Cla4 Cdc24 Bem1 Cla4 Cdc24 Rac1 Rac1 Cla4 Effektoren Bem1 Bem1 Cla4 Cdc24 Cdc24 Cdc24 Cdc24 Cdc24 Rac1 Rho-GDI Rho-GAP Rho-GDI Cdc24 Rac1 Cla4 Bem1 Abbildung 3.1: Schematisches Modell für die negative Rückkopplungsregulation des GEFs Cdc24. Cdc24 und Cla4 interagieren mit dem Gerüstprotein Bem1. Cdc24 rekrutiert inaktives Rac1GDP (orange) in den Komplex. In diesem quaternären Übergangskomplex wird Rac1 durch den von Cdc24 stimulierten GDP-GTP Austausch aktiviert. Rac1-GTP (grün) interagiert mit Cla4 und stimuliert vermutlich dessen Aktivität (offene Konformation). Cla4 phosphoryliert Cdc24 (roter Punkt) und induziert so den Abbau des GEFs. Zurück bleibt ein ternärer Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplex, der das polare Wachstum über die Stimulation von noch unbekannten Faktoren reguliert. Die Inaktivierung des Komplexes und die Wiederverwendung der Proteine wird durch Interaktion mit Rac1-GAPs und dem GDI Rdi1 sichergestellt. Knospungsstelle beschrieben wurde (Tong et al., 2007). Es kann vermutet werden, dass ein Verbleiben von Cdc24 im Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplex einer Inaktivierung von Rac1 durch sofortige Reaktivierung entgegenwirken könnte. Für diese Theorie spricht, dass die Expression von stabilisiertem Cdc24* sowohl während der Knospung, als auch bei der Initiation des filamentösen Wachstums, Auswirkungen hatte. Die Zellen waren länger und dicker, wobei die Knospenspitzen deutlich abgerundet waren, was für eine schlechtere Fokussierung der Rac1, bzw. der Cla4 Aktivität spricht. Die beobachtete deutliche Verzögerung der Filamentinduktion ist vermutlich ebenfalls auf Probleme bei der Generierung eines stabilen Rac1-GTP Gradienten zurückzuführen. Offenbar spielt die negative Rückkopplungsregulation von Cdc24 auch bei der Pflanzeninfektion durch U. maydis eine Rolle. Die Reduktion der Virulenz von Stämmen, die die stabilisierte Variante Cdc24* exprimierten, kann vermutlich auf die beobachtete verzögerte Filamentund Appressorienbildung zurückgeführt werden. Darüber, ob es in der Pflanze zu weiteren Verzögerungen im polaren Wachstum kommt, kann an dieser Stelle nur spekuliert werden. 3.1.3 Die Inaktivierung des Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplexes während des polaren Wachstums In dieser Arbeit konnten drei Rac1-GAPs identifiziert werden, die sowohl bei Depletion, als auch bei Überexpression Auswirkungen auf das polare Wachstum und die 59 3 Diskussion Stabilität von Cdc24 haben. Die Depletion der GAPs resultierte in einer signifikanten Zellverlängerung und Stabilisierung von Cdc24. Dies lässt sich dadurch erklären, dass der Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplex mangels GAP-Aktivität länger aktiv bleibt. Die GAP-stimulierte GTP Hydrolyse bewirkt auch die Dissoziation von Rac1 und Bem1. Während inaktives Rac1-GDP in der Membran verbleibt, stehen Cla4 und Bem1 für eine erneute Komplexbildung zur Verfügung (Abb 3.1). Die verzögerte Inaktivierung von Rac1 führt in Abwesenheit der GAPs also vermutlich dazu, dass Bem1 zunehmend komplexiert vorliegt. Dadurch steht weniger Bem1 für die Cdc24 konsumierende Bildung von neuen Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplexen zur Verfügung. Diese Hypothese konnte dadurch bestätigt werden, dass eine erhöhte Expression von Bem1 der Cdc24 Stabilisation in den GAP Mutanten entgegenwirkt. Die Cdc24 stabilisierenden Effekte der Einzeldeletionen von rip1,bem2 und bem3 sind dramatisch, obgleich die Funktion der Proteine im Bezug auf die Inaktivierung von Rac1 redundant zu sein scheint. Dies kann vermutlich dadurch erklärt werden, dass die drei Rac1-GAPs räumlich und/oder zeitlich voneinander getrennt agieren. In einem solchen Modell würde jeder der drei GAPs die Freisetzung eines distinkten Anteils an der Gesamtzahl der Bem1 Moleküe aus dem Komplex mit aktivem Rac1 regulieren (Abb. 3.2). Die Deletion eines einzelnen GAPs führt in diesem Modell zur Sequestrierung von Bem1 in dem normalerweise von dem GAP kontrollierten räumlichen und/oder zeitlichen Bereich (Abb. 3.2). Ein erster Hinweis darauf, dass jeder der drei möglichen Rac1-GAPs eine eigene „Zone der Inhibition“ bildet, kann in den unterschiedlichen Lokalisationen von Rip1, Bem2 und Bem3 gesehen werden. Die Beobachtung, dass die Überexpression der Rac1-GAPs zu einer Zellverlängerung und einem Abbau von Cdc24 führt, war unerwartet. So wurde für die GAPs Bem2p und Bem3p in S. cerevisiae ein Überexpressionsphänotyp beschrieben, der dem von Zellen gleicht, die eine temperatursensitive Variante von Cdc42p bei nichtpermissiver Temperatur exprimieren (Caviston et al., 2003). Die Überexpression von GAP-minus Mutanten führte hingegen zu elongierten Knospen (Caviston et al., 2003). Bem2p und Bem3p lokalisieren in S. cerevisiae in der G1 Phase des Zellzyklus am Zellkortex, wo sie vermutlich die verfrühte Aktivierung von Cdc42p verhindern (Knaus et al., 2007). Es konnte gezeigt werden, dass beide Cdc42-GAPs Cdc28-abhängig phosphoryliert werden, wodurch ihre Aktivität herabgesetzt werden soll (Knaus et al., 2007). Es wurde postuliert, dass diese Inhibition der GAPs die Cdc42p Aktivierung an der Knospungsstelle und damit die Knospung ermöglicht (Knaus et al., 2007). In U. maydis führt die Überexpression der Rac1-GAPs nicht zu einer Inaktivierung der GTPase. Statt zum Polaritätsverlust, kommt es zur Hyperpolarisierung und Zellverlängerung. Dies lässt sich dadurch erklären, dass eine erhöhte GAP-Aktivität an der Zellspitze zu einem schnelleren Umsatz von Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplexen führt, was auch den drastisch 60 3 Diskussion Bem1 Rip1 Bem1Bem1 Bem2 Bem3 Rac1-GAPs Bem1 Abbildung 3.2: Drei Rac1-GAPs kontrollieren die Rezyklisierung von Bem1. Die Inaktivierung von Rac1-GTP durch die GAPs Rip1, Bem2 und Bem3 bewirkt vermutlich die Freisetzung von Bem1 aus dem Komplex mit Rac1. Dabei reguliert jeder GAP einen bestimmten „Pool“ des Gerüstproteins, der räumlich und/oder zeitlich von dem der anderen getrennt ist. Die Deletion eines GAPs führt zur Sequestrierung von immer mehr Bem1 in einem der „Pools“, wodurch immer weniger Gerüstprotein in den anderen zur Verfügung steht. erhöhten Verbrauch von Cdc24 erklärt. GAP-Aktivität wird während des polaren Wachstums von U. maydis also nicht von der Zone, in der das polare Wachstum stattfindet ausgeschlossen, sondern ist im Gegenteil eine elementare Voraussetzung. So ist eine GAP insensitive Variante von Rac1 (Rac1EN91/92HH) nicht in der Lage, bei Überexpression Filamente mit normaler Morphologie zu erzeugen. Dass der Wechsel zwischen der GDPund der GTP-gebundenen Form einer GTPase für den von ihr regulierten Prozess wichtig sein kann, wurde auch in anderen Systemen beobachtet. So ist dies offenbar bei der Zellfusion während der Zellpaarung von S. cerevisiae unverzichtbar (Barale et al., 2006). In Säugern kolokalisiert der GAP SH3BP1 mit Rac1 am vorderen Zellende von migrierenden Fibroblasten, wo er vermutlich in Kombination mit dem GEF Tiam1 für einen „GTPase-Flux“ von Rac1 sorgt, der für die Ausbildung von Ausstülpungen essentiell ist (Parrini et al., 2011). In U. maydis liegt die Funktion der Rac1-GAPs offenbar darin, das Wachstum auf die Zellspitze zu beschränken. Ein „Durchbrechen“ dieser „Zone der Inhibition“ sei es durch Insensivität von Rac1 gegenüber den GAPs, oder durch sofortige Reaktivierung der GTPase durch den stabilisierten GEF Cdc24*, führt zu delokalisierter Rac1-Aktivität, die das polare Wachstum stört. Interessanterweise sind die so mutierten Zellen aber nicht 61 3 Diskussion apolar. Es muss also noch weitere Mechanismen geben, die einen wichtigen Einfluss auf die Beschränkung des aktiven Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplexes auf den Bereich des Spitzenwachstums haben. Diese basieren offenbar auf dem Rho-GDI Rdi1. GDIs sind in vielen Organismen als Regulatoren des polaren Wachstums beschrieben. So ist z.B. die Interaktion der Rac-Rop GTPase Rop2 mit ihrem Rho-GDI in Arabidopsis thaliana für die Positionierung und die Elongation von Haarwurzeln von Bedeutung (Carol et al., 2005) und in Tabakpflanzen ist der Rho-GDI2 für die Regulation der Rac-Rop Aktivität während des Wachstums von Pollenschläuchen wichtig (Klahre et al., 2006). Auch in S. cerevisiae bindet und extrahiert der GDI Rdi1p Cdc42p aus der Membran (Masuda et al., 1994). Dabei konstituiert Rdi1p einen von zwei möglichen Wegen der Rezyklisierung von Cdc42p während des polaren Wachstums (Slaughter et al., 2009). Ein zweiter, redundanter Weg, erfolgt über die aktinabhängige Endozytose (Slaughter et al., 2009). Beide Mechanismen sind offenbar auch in U. maydis verwirklicht. Knospende Zellen, die eine rdi1 Deletion tragen, weisen keinen Polaritätsdefekt auf. Die Rezyklisierung von Rac1 scheint jedoch verzögert zu verlaufen, da ein signifikant stabilisierender Effekt auf die Cdc24 Menge feststellbar war, der durch eine verstärkte Expression von Rac1 wieder aufgehoben werden konnte. Die Überexpression von Rdi1 resultierte sowohl in einer Zellverlängerung, als auch in einer Destabilisierung von Cdc24. Dies erscheint bei erster Betrachtung nicht einleuchtend. In S. cerevisiae führt eine Überexpression von Rdi1p zu einem mit dem der Inaktivierung von Cdc42ts vergleichbaren Phänotyp, da Cdc42 aus der Membran entfernt wird (Masuda et al., 1994). In U. maydis kommt es durch die erhöhte Konzentration von Rdi1 auch zum Entfernen von Rac1 aus der Plasmamembran. Die damit verbundene größere Verfügbarkeit der GTPase führt jedoch offenbar zu einem erhöhten Flux von Rac1 am wachsenden Pol, was wiederum in dem zunehmenden Abbau von Cdc24 resultiert. Die Beobachtung, dass rdi1 Mutanten keinen starken Phänotyp haben und die Überexpression von GDI insensitivem Rac1 (Rac1R66E) zur Filamentinduktion ausreichend ist, weist darauf hin, dass die aktinabhängige Endozytose in U. maydis ebenfalls zur Rezyklisierung von Rac1 beiträgt. Dies konnte dadurch bestätigt werden, dass die Inhibition der Endozytose ebenfalls einen signifikannt stabilisierenden Effekt auf das Cdc24 Niveau hatte, der mit dem der Deletion von rdi1 additiv wirkte. Sowohl die in dieser Arbeit identifizierten Rac1-GAPs, als auch der GDI Rdi1 und die aktinabhängige Endozytose sind in U. maydis für das polare Wachstum wichtig. Nach der Entfernung von Cdc24 aus dem aktiven Bem1/Rac1-GTP/Cla4 Komplex diffundiert dieser vermutlich lateral in der Membran bis er die postulierte subapikale Zone der hohen GAP Aktivität erreicht (Abb. 3.3 2 und 3). Die GAP stimulierte GTP Hydrolyse bewirkt den Zerfall des Komplexes. Bem1 und Cla4 werden über einen noch unbekannten Mechanismus einer erneuten Komplexbildung zur Verfügung gestellt und 62 4 Material und Methoden 4.2 Vektoren Name Resistenz Herkunft Verwendung PJet2.1 Ampicillin Fermentas Klonierung von PCR-Fragmenten zur Vermehrung in E. coli pUC18 Ampicillin Laborsammlung Klonierung von Konstrukten zur Vermehrung in E. coli pGEX Ampicillin Amersham GE Healthcare Expression von GST-Fusionsproteinen in E. coli (Zur besseren Klonierung wurde eine NdeI Schnittstelle in die MCS eingefügt) pETM-60 Kanamycin (Dümmler et al., 2005) Expression von NusA-6xHis-Fusionsproteinen in E. coli (Zur besseren Klonierung wurde eine NdeI Schnittstelle in die MCS eingefügt) pRS426 Ampicillin, Ura3 (Sikorski and Hieter, 1989) Klonierung von Konstrukten in S. cerevisiae p123 Ampicillin, Carboxin Laborsammlung Konstitutive Expression von GFPFusionsproteinen in Ustilago maydis p123-RFP Ampicillin, Carboxin Laborsammlung Konstitutive Expression von RFPFusionsproteinen in Ustilago maydis pCrg-GFPAla6-MXN-Cbx Ampicillin, Carboxin Laborsammlung Überexpression von GFP-Fusionsproteinen in Ustilago maydis pOtef-GFPAla6-MXN-Cbx Ampicillin, Carboxin Laborsammlung Konstitutive Expression von GFPFusionsproteinen in Ustilago maydis pOtef-MycAla6-MXN-Cbx Ampicillin, Carboxin Laborsammlung Konstitutive Expression von MycFusionsproteinen in Ustilago maydis pOtef-3xHAAla6-MXN-Cbx Ampicillin, Carboxin Laborsammlung Konstitutive Expression von 3xHAFusionsproteinen in Ustilago maydis pRU11 Ampicillin, Carboxin Laborsammlung Überexpression von Proteinen unter der Kontrolle des crg Promotors pRU2 Ampicillin, Carboxin Laborsammlung Überexpression von Proteinen unter der Kontrolle des nar Promotors pMF1C Ampicillin, Carboxin (Brachmann et al., 2004) Enthält die SfiI-CbxRKassette pMF1H Ampicillin, Hygromycin (Brachmann et al., 2004) Enthält die SfiI-HygRKassette pMF1N Ampicillin, Nourseotricin (Brachmann et al., 2004) Enthält die SfiI-NatRKassette pMF1P Ampicillin, Phleomycin (Brachmann et al., 2004) Enthält die SfiI-PhleoRKassette pMF2-1H Ampicillin, Hygromycin (Brachmann et al., 2004) Enthält die SfiI-HygR-Pcrg Kassette pMF2-1N Ampicillin, Nourseotricin (Brachmann et al., 2004) Enthält die SfiI-NatR-Pcrg Kassette pMF2-1P Ampicillin, Phleomycin (Brachmann et al., 2004) Enthält die SfiI-PhleoR-Pcrg Kassette 69 4 Material und Methoden Name Resistenz Herkunft Verwendung pMF5-1H Ampicillin, Hygromycin (Brachmann et al., 2004) Enthält die SfiI-GFP-TNOS-HygRKassette pHA-1H Ampicillin, Hygromycin AG Kahmann (MPI Marburg) Enthält die SfiI-3xHA-HygRKassette pHA-1N Ampicillin, Nourseotricin AG Kahmann (MPI Marburg) Enthält die SfiI-3xHA-NatRKassette 4.3 Herstellung der in dieser Arbeit verwendeten U. maydis Stämme 4.3.1 Ektopische Expression von GFP-, RFP-, Mycund 3xHAFusionsproteinen im ip Locus und im nar1 Locus von Ustilago maydis Zur ektopischen konstitutiven Expression von C-terminalen Fusionsproteinen, wurde das zu markierende Gen wahlweise in die SmaI Schnittstelle, oder zwischen die SmaI und die NcoI Schnittstelle der Plasmide pOtef-GFP-Ala6-MXN-Cbx (Cdc24-GFP, Cla4-GFP) oder p123-RFP (Cla4-RFP) ligiert. Zur konstitutiven Expression von N-terminalen Fusionsproteinen, wurden die Gene zwischen die MluI oder SacII und die NotI Schnittstelle der Plasmide pOtef-GFP-Ala6-MXN-Cbx (GFP-Rdi1, GFPBem1), pOtef-Myc-Ala6-MXN-Cbx (Myc-Bem1) und pOtef-3xHA-Ala6-MXN-Cbx (3xHA-Fusionen der GAP-Domänen von Rip1, Bem2 und Bem3) ligiert. Die Plasmide wurden durch Inkubation mit SspI innerhalb der Carboxin-Resistenz linearisiert und in U. maydis eingebracht. Die korrekte Integration durch homologe Rekombination in den ip Locus, wurde mittels Kontroll-PCR überprüft. Der ip-Locus von U. maydis kodiert für die Eisen-Schwefel-Untereinheit der Sukzinat-Dehydrogenase. Ein Aminosäurenaustausch an Position 257 von Histidin nach Leucin führt dazu, dass der Organismus eine Resistenz gegen das Fungizid Carboxin entwickelt. Neben der gewünschten ortsspezifischen Integration durch homologe Rekombination, kann es aber auch zu anderen Integratiosereignissen kommen. Mit den folgenden Primerkombinationen können richtige Transformanden bestimmt werden: Primerkombination 1: MB766 und MB767 Annealingtemperatur: 62◦C Primerkombination 2: MB768 und MB769 Annealingtemperatur: 64◦C Primerkombination 3: MB767 und MB769 Annealingtemperatur: 62◦C Dabei paart der Primer MB767 mit der genomischen Sequenz oberhalb des ip-Locus, der Primer MB768 mit der Vektorsequenz oberhalb des vom Vektor codierten, Resistenz vermittelnden Allels, der Primer MB766 mit dem Resistenz-vermittelnden Allel im Bereich der Mutation und MB769 mit dem Wildtyp-Allel im gleichen Bereich. Bei richtiger Integration liefern die Primerkombinationen 1 und 2 ein ca. 1,5 kb großes Fragment, nicht jedoch die Kombination 3. Zur Integration in den nar1 locus wurden 1000bp lange Bereiche oberhalb und unterhalb des nar1 70 4 Material und Methoden Gens durch PCR amplifiziert. Mit Hilfe des Enzyms SmaI wurden stumpfe Enden generiert. Die linke Flanke wurde zwischen die SspI und die PvuII Schnittstelle oberhalb des otef Promotors des Plasmides pOtef-cdc24-GFP-Ala6-MXN-Cbx ligiert und die rechte in die EcoRV Schnittstelle unterhalb von GFP. Eine den Terminator TNOS und die Hygromycinresistenz enthaltende Kassete wurde zwischen GFP und rechte Flanke zwischen die AflII und NotI Schnittstelle ligiert. Das Konstrukt wurde durch einen SwaI-Verdau linearisiert und durch homologe Rekombination in den nar1 Locus integriert, wobei nar1 deletiert wurde. Die Abwesenheit des Genproduktes, der Nitratreduktase1, ermöglichte die Selektion positiver Klone durch mangelndes Wachstum auf Nitrat. Positive Klone wurden mittels „Southern Blot“ bestätigt. Verwendete Oligos: Name Verwendung Sequenz MB766 PCR-Kontrolle der richtigen Integration in den ip-Locus GAGCAGTTCATGATGGTAAG MB767 PCR-Kontrolle der richtigen Integration in den ip-Locus TTCGAGCTGGTTGCCTGC MB768 PCR-Kontrolle der richtigen Integration in den ip-Locus CTATGCGGCATCAGAGCAG MB769 PCR,Kontrolle der richtigen Integration in den ip-Locus GAGCAGTTCATGATGGTGTG MD637 Amplifikation der linken Flanke des nar1 Locus mit einer SmaI Schnittstelle am 5´Ende gcatCCCGGGcaccgcgttccagcgctctcg MD638 Amplifikation der linken Flanke des nar1 Locus mit einer SmaI Schnittstelle am 3´Ende gcatCCCGGGcctaactgctcgtgtggtgg MD639 Amplifikation der rechten Flanke des nar1 Locus mit einer SmaI Schnittstelle am 5´Ende gcatCCCGGGcgtgactgtaagttatggcgc MD640 Amplifikation der rechten Flanke des nar1 Locus mit einer SmaI Schnittstelle am 3´Ende gcatCCCGGGccaagctttccaaatctacgg MC407 Amplifikation von cdc24 mit einer KpnI und einer SmaI Schnittstelle am 5´Ende CCGGGTACCCCCGGGACCATGGCTGCTTCCACATCG MC408 Amplifikation von cdc24 mit einer NotI und einer SmaI Schnittstelle am 3´Ende (ohne Stopcodon) CTGGCGGCCGCCTACCCGGGGTTGACGACCAACTC ME952 Amplifikation von cdc24 mit einer EheI Schnittstelle am 5´Ende CGATggcgccATGGCTGCTTCCACATCGCTTGC ME953 Amplifikation von cdc24 mit einer EheI Schnittstelle am 3´Ende (ohne Stopcodon) CGATggcgccGTTGACGACCAACTCGACTTCG MF554 Amplifikation von rdi1 mit einer MluI und einer SmaI Schnittstelle am 5´Ende GCATacgcgtGcccgggATGTCGCATGCACAGGATCCCACCATTGG 71 4 Material und Methoden Name Verwendung Sequenz MF555 Amplifikation von rdi1 mit einer SmaI und einer NotI Schnittstelle am 3´Ende (ohne Stopcodon) CGATgcggccgcTTAcccgggCCAGTCCTTGGCGATCTTGAAAGCCCACTC MF144 Amplifikation der GAP-Domäne von bem3 mit einer MluI Schnittstelle am 5´Ende CGATacgcgtgTCGATTGCGATCTCCAGCATCCACG MF145 Amplifikation der GAP-Domäne von bem3 mit einer NotI Schnittstelle am 3´Ende CGATgcggccgcGTTGTACAACGAGCTGTTTCGCTTG MF146 Amplifikation der GAP-Domäne von bem2 mit einer SacII Schnittstelle am 5´Ende CGATtggccatcCGGTTGGGGGAGCTCGTAGAGCGCG MF147 Amplifikation der GAP-Domäne von bem2 mit einer NotI Schnittstelle am 3´Ende GCATgcggccgcCTCTGGCTCTGGCTCTGGCTC MF148 Amplifikation der GAP-Domäne von rip1 mit einer MluI Schnittstelle am 5´Ende CGATtggccatcCTCACTGTACCGTATCGCCTTCG MF149 Amplifikation der GAP-Domäne von rip1 mit einer NotII Schnittstelle am 3´Ende CGATgcggccgcCGGTGCGCCTGCCGTCTTGAGATC ME114 Amplifikation von cla4 mit einer SmaI und einer NdeI Schnittstelle am 5´Ende GCATcccgggcatATGTCTGGCTTTCGTGGCACG ME115 Amplifikation von cla4 mit einer NcoI und einer NotI Schnittstelle am 3´Ende (ohne Stopcodon) CGATgcggccgccatgggACGATCGGGCTTGTTGCGGAAGCGG MD889 Amplifikation von bem1 mit einer MluI Schnittstelle am 5´Ende CGATacgcgtcATGAAGGGTCTCAAAGATTTTCGC MD890 Amplifikation von bem1 mit einer NotI Schnittstelle am 3´Ende GCTAgcggccgcCTAGGAAGCATGGAGCATGAACTTCC MF204 Amplifikation von smuI mit einer MluI und einer SmaI Schnittstelle am 5´Ende CGATACGCGTGCCCGGGATGCATCCATCACCTAAGCGATCGGTGATC MF205 Amplifikation von smuI mit einer SmaI und einer NotI Schnittstelle am 5´Ende (ohne Stopcodon) GCATGCGGCCGCCTACCCGGGCGACTTGCGCGTCTGTTCACGCGCCGCC Die Sequenz der Oligos ist jeweils in 5‘-3‘ Richtung angegeben. 4.3.2 Ektopische Überexpression von Genen im ip Locus von U. maydis Zur ektopischen Überexpression von Genen unter der Kontrolle von induzierbaren Promotoren wurden die Plasmide pRU11 (Arabinose induzierbarer crg Promotor) und pRU2 (Nitrat induzierbarer nar 72 4 Material und Methoden Promotor) verwendet. Die PCR-amplifizierten Gene wurden zwischen die NdeI und die NotI Schnittstelle der Vektoren ligiert. Die Integration in den ip Locus und die Integrationskontrolle erfolgte wie im vorangegangenen Abschnitt beschrieben. Verwendete Oligos: Name Verwendung Sequenz MF486 Amplifikation von cdc24 mit einer NdeI Schnittstelle am 5´Ende GCATcatATGGCTGCTTCCACATCGCTTGCG MF489 Amplifikation von cdc24 mit einer NotI Schnittstelle am 3´Ende CGATgcggccgcCTAGTTGACGACCAACTCGACTTCGC MF484 Amplifikation von bem1 mit einer NdeI Schnittstelle am 5´Ende gcatcatATGAAGGGTCTCAAAGATTTTCGCAGG MF485 Amplifikation von bem1 mit einer NotI Schnittstelle am 3´Ende cgatgcggccgcCTAGGAAGCATGGAGCATGAACTTCC MF553 Amplifikation von rdi1 mit einer NdeI Schnittstelle am 5´Ende ATCGcatATGTCGCATGCACAGGATCCCACCATTGG MF555 Amplifikation von rdi1 mit einer NotI Schnittstelle am 3´Ende CGATgcggccgcTTAcccgggCCAGTCCTTGGCGATCTTGAAAGCCCACTC MF592 Amplifikation von cdc42 mit einer NdeI Schnittstelle am 5´Ende GCATcatATGCAGACCATCAAGTGTGTCGTCGTCGG MF593 Amplifikation von cdc42 mit einer NotI Schnittstelle am 3´Ende GCATgcggccgcTCAGAGAATGGCGCACTTGGACTTCTTGCG MB479 Amplifikation von rac1 mit einer NdeI Schnittstelle am 5´Ende CGATcatATGCAGACCATCAAGTGTGTAGTCG MF151 Amplifikation von rac1 mit einer NotI Schnittstelle am 3´Ende GCATgcggccgcTTAAAGAATCATACAGTTGTTCTTCTTCTTAC Die Sequenz der Oligos ist jeweils in 5‘-3‘ Richtung angegeben. 4.3.3 Herstellung von Deletionsmutanten in Ustilago maydis Die Deletionskonstrukte wurden unter Gebrauch eines Resistenzkassettensystems, das speziell für U. maydis konzipiert ist, hergestellt (Brachmann et al., 2004). Dabei wurden 1000bp lange Bereiche oberhalb und unterhalb des zu deletierenden Gens durch PCR amplifiziert. Der rückwärtsgerichtete Primer der linken Flanke und der vorwärtsgerichtete Primer der rechten Flanke des zu deletierenden Gens, waren mit einer Sfi I Schnittstelle versehen. Das Enzym schneidet an Stellen der Sequenz GGCCNNNNNGGCC. Dabei waren die fünf Nukleotide zwischen den GGCC-Flanken der Schnittstelle am 3´-Ende der linken Flanke (Sfiup) und am 5´-Ende der rechten Flanke (Sfidown) unterschiedlich. Zwischen die Flanken wurde eine Resistenzkassette mit der zum 3´-Ende der linken Flanke passenden Sfi I Schnittstelle am 5´-Ende und der zum 5´Ende der rechten Flanke passenden SfiI Schnittstelle am 3´-Ende, ligiert. Zur Herstellung der Deletionskonstrukte wurde das effektive Rekombinationssystem der Bäckerhefe S. cerevisiae genutzt. Hierzu wurden an das 5´Ende der linken Flanke und an das 3´Ende der rechten Flanke ein 30 bp langer, zu dem Plasmid pRS426 homologer, Bereich angehängt. Die zu dem Vektor homologen Bereiche waren dabei durch eine SspI Schnittstelle von dem Flankenende getrennt. Ein zu der Resistenzkassette homologer 30 bp langer Bereich am 3´Ende der linken und am 5´Ende der 73 4 Material und Methoden rechten Flanke, diente der Integration der Resistenzkassette. 500 ng der linken Flanke, der rechten Flanke und der mit SfiI linearisierten Resistenzkassette wurden mit 25ng des mit KpnI und BamHI linearisierten Vektors gemischt und in Hefezellen transformiert. Die aus der Hefe isolierten und in E. coli vermehrten Konstrukte, wurden anhand der zwei Ssp1 Schnittstellen linearisiert und in U. maydis Protoplasten eingebracht. Die korrekte Integration durch homologe Rekombination wurde in einem „Southern Blot“ bestätigt. verwendete Oligos: Name Verwendung Sequenz MF450 Amplifikation der linken Flanke von cdc24 mit einer SspI Schnittstelle am 5´Ende GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGaatATTTCACCTCGGCTTGCTTTCTCTCCCTATCGGCG MF451 Amplifikation der linken Flanke von cdc24 mit einer SfiIup Schnittstelle am 3´Ende gcaattgtcacgccatggtggccatctaggccGATGAATTGTCTATGGCAGAGCTAGCCGAACTC ME501 Amplifikation der rechten Flanke von cdc24 mit einer SfiIdown Schnittstelle am 5´Ende AAGCTGTGCGGCCGCATTAATAGGCCTGAGTGGCCCTCTCCCCTGTATTTGTACCTTGCATCCATTCC MF299 Amplifikation der rechten Flanke von cdc24 mit einer Ssp1 Schnittstelle am 3´Ende GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCaatATTTGGGCTCGAACATGCCGCAACAGTGGCGACC SF001 Amplifikation der linken Flanke von cla4 mit einer SspI Schnittstelle am 5´Ende GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGaatATTCAGTTGTCGTTGCGTGAGATCCAGGGCG SF002 Amplifikation der linken Flanke von cla4 mit einer SfiIup Schnittstelle am 3´Ende gcaattgtcacgccatggtggccatctaggccTGTTGCAGACGCTGTCTGATGGCGCTCGTTTG SF003 Amplifikation der rechten Flanke von cla4 mit einer SfiIdown Schnittstelle am 5´Ende ggagtgcggccgcattaataggcctgagtggccAGCAGGTGCACTCCCTTCCCTTTTCATGTATG SF004 Amplifikation der rechten Flanke von cla4 mit einer Ssp1 Schnittstelle am 3´Ende GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCaatATTGAGTCTAGTCGGGTCAATCAACTTGCCG MF556 Amplifikation der linken Flanke von rdi1 mit einer SspI Schnittstelle am 5´Ende GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGaatATTGCAGCCTTATTGCGAGCTCAACTGCAAATGG MF557 Amplifikation der linken Flanke von rdi1 mit einer SfiIup Schnittstelle am 3´Ende cgcaattgtcacgccatggtggccatctaggccGATGACGAAGGCACTTTTGCTGCTATAGCAGGGACG MF558 Amplifikation der rechten Flanke von rdi1 mit einer SfiIdown Schnittstelle am 5´Ende gctgtgcggccgcattaataggcctgagtggccAAACTTTCGCTCCGGCCCGCCTTCGCTGCTTCATATC MF559 Amplifikation der rechten Flanke von rdi1 mit einer Ssp1 Schnittstelle am 3´Ende GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCaatATTCATGCCTCTACTTCTCTGCCCTACCCCCATTATC 74 4 Material und Methoden Die Sequenz der Oligos ist jeweils in 5‘-3‘ Richtung angegeben. 4.3.4 Herstellung konditionaler Mutanten Die Konstrukte zur Herstellung konditionaler Mutanten, die das jeweilige Gen unter der Kontrolle des induzierbaren crg Promotors exprimieren, sind mit denen zur Deletion von Genen vergleichbar. Jedoch beinhaltet die SfiI-Kassette am 3´Ende des Resistenzmarkers den induzierbaren Promotor und wird über die SfiIdown Schnittstelle an das 5´Ende einer zu den ersten 1000 bp des ORFs homologen Flanke ligiert. Die Konstrukte wurden in PJet2.1 (cdc24 und rip1), pUC18 (bem1) und pRS426 (rdi1) vermehrt. Verwendete Oligos: Name Verwendung Sequenz MC523 Amplifikation der linken Flanke von cdc24 mit einer PstI Schnittstelle am 5´Ende CGCTGCAGTCGCTGCTGCCTCTCCGT MC524 Amplifikation der linken Flanke von cdc24 mit einer SfiIup Schnittstelle am 3´Ende GCGGCCATCTAGGCCCGGACCTGAACGCAAGCG MC525 Amplifikation der ORF Flanke von cdc24 einer SfiIdown Schnittstelle am 5´Ende GCGGCCTGAGTGGCCATGGCTGCTTCCACATCG MC526 Amplifikation der ORF Flanke von cdc24 einer PstI Schnittstelle am 3´Ende GCGGTACCAACGTTTTCTTCGACA MD583 Amplifikation der linken Flanke von bem1 mit einer SfiI Schnittstelle am 5´Ende GCATggcctagatggccCACGCACAGATACGCCTGCATC MD584 Amplifikation der linken Flanke von bem1 mit einer SfiIup Schnittstelle am 3´Ende GCATggccatctaggccGATGGGCCAATCGCGGTAATGTGC MD585 Amplifikation der ORF Flanke von bem1 einer SfiIdown Schnittstelle am 5´Ende GCATggcctgagtggccATGAAGGGTCTCAAAGATTTTCG MD586 Amplifikation der ORF Flanke von bem1 einer SfiI Schnittstelle am 3´Ende GCATggccactcaggccGCATAGCACCGGCCAGAGACCC MF556 Amplifikation der linken Flanke von rdi1 mit einer SspI Schnittstelle am 5´Ende GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGaatATTGCAGCCTTATTGCGAGCTCAACTGCAAATGG MF557 Amplifikation der linken Flanke von rdi1 mit einer SfiIup Schnittstelle am 3´Ende cgcaattgtcacgccatggtggccatctaggccGATGACGAAGGCACTTTTGCTGCTATAGCAGGGACG MF560 Amplifikation der ORF Flanke von rdi1 einer SfiIdown Schnittstelle am 5´Ende ccaaaaaagataccataataggcctgagtggccATGTCGCATGCACAGGATCCCACCATTGGCGACGAC 75 4 Material und Methoden Name Verwendung Sequenz MF561 Amplifikation der ORF Flanke von rdi1 einer SspI Schnittstelle am 3´Ende GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCaatATTGGGAACTTGCATTGCGTAGAGTACGAGAAGTATTG ME814 Amplifikation der linken Flanke von rip1 mit einer SspI Schnittstelle am 5´Ende GCATaatATTCGCGTGTGCTACTCACGC ME246 Amplifikation der linken Flanke von rip1 mit einer SfiIup Schnittstelle am 3´Ende TGAGGCCATCTAGGCCGTTGCTCTCGCCGTGATGTGGG ME816 Amplifikation der ORF Flanke von rip1 einer SfiIdown Schnittstelle am 5´Ende GCATggcctgagtggccATGGACACGCTCTCCGCTGGG ME817 Amplifikation der ORF Flanke von rip1 einer SspI Schnittstelle am 3´Ende GCTAaatATTTGAATACATCGAAAAAGTTGG Die Sequenz der Oligos ist jeweils in 5‘-3‘ Richtung angegeben. 4.3.5 Konstrukte zur Herstellung Nund C-terminaler 3xHA-Fusionen am genomischen Locus Die Konstrukte zur Herstellung von C-terminalen 3xHA-Fusionen am genomischen Locus bestanden aus einer mindestens 1000 bp langen, zum 3´Ende des ORFs homologen Flanke gefolgt, von einer 3xHA-HygromycinRSfiI-Kassette und der 1000 bp langen rechten Flanke. Das Stopcodon am 3´Ende der ORF-Flanke wurde deletiert und die SfiIFus Schnittstelle so angehängt, dass das 3xHA-Protein im richtigen Leserahmen lag. Die Konstrukte wurden nach dem selben Verfahren wie die Deletionskonstrukte in der Hefe im Vektor pRS426 assembliert und anschließend in E. coli vermehrt. Linearisiert wurde über die SspI Schnittstelle am 5´Ende der ORFund am 3´Ende der rechten Flanke. Zur Herstellung einer N-terminalen 3xHA-rac1 Fusion am genomischen Lokus, wurden zwei komplementäre, für das 3xHA-Protein codierende Oligos aneinandergelagert und zwischen die NcoI und die SacII Schnittstelle des Vektors pOtef-GFP-rac1-Ala6-MXN-Cbx ligiert. Anschließend wurde die linke Flanke von rac1 zwischen die KpnI und die NcoI Schnittstelle des Plasmides ligiert, wobei der otef Promotor deletiert wurde. Eine TNOS-HygromycinRKassette wurde unterhalb von Rac1 zwischen die AflII und die NotI Schnittstelle ligiert. Die rechte Flanke von rac1 wurde mit Hilfe der Enzyme HpaI (5´Ende) und SmaI (3´Ende) abgestumpft und in die ebenfalls stumpfe HpaI Schnittstelle des Vektors ligiert. Das Konstrukt wurde mit Hilfe von KpnI und HpaI linearisiert und in U. maydis Zellen eingebracht. Verwendete Oligos: Name Verwendung Sequenz MF301 Amplifikation der ORF Flanke von cdc24 mit einer SspI Schnittstelle am 5´Ende GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGaatATTCGTCTACCACCGCGTCCATGGCCAGCAGCTCG 76 4 Material und Methoden Name Verwendung Sequenz MF300 Amplifikation der ORF Flanke von cdc24 mit einer SfiIFus Schnittstelle am 3´Ende (ohne Stopcodon) cgggcacgtcgtaggggtaggccgcgttggccccGTTGACGACCAACTCGACTTCGCCGGCGGGGC ME501 Amplifikation der rechten Flanke von cdc24 mit einer SfiIdown Schnittstelle am 5´Ende AAGCTGTGCGGCCGCATTAATAGGCCTGAGTGGCCCTCTCCCCTGTATTTGTACCTTGCATCCATTCC MF299 Amplifikation der rechten Flanke von cdc24 mit einer SspI Schnittstelle am 3´Ende GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCaatATTTGGGCTCGAACATGCCGCAACAGTGGCGACC ME834 Oligo zur Einführung eines 3xHA Proteins (fwd) catggccTACCCCTACGACGTGCCCGACTATGCCGGTGCCGCCTACCCCTACGACGTGCCCGATTACTCGGCTGGTGGTTACCCCTACGACGTGCCCGACTATgccgc ME834 Oligo zur Einführung eines 3xHA Proteins (rev) ggcATAGTCGGGCACGTCGTAGGGGTAACCACCAGCCGAGTAATCGGGCACGTCGTAGGGGTAGGCGGCACCGGCATAGTCGGGCACGTCGTAGGGGTAggc ME836 Amplifikation der rechten Flanke von rac1 mit einer SfiIdown und einer SmaI Schnittstelle am 5´Ende GCATcccgggcctgagtggccGAGTGAAACGCGAACACGCAGATGG ME837 Amplifikation der rechten Flanke von rac1 mit einer HpaI Schnittstelle am 3´Ende CGATgttaacGAATCTGTACGAAGACGGCAAAG ME838 Amplifikation der linken Flanke von rac1 mit einer KpnI Schnittstelle am 5´Ende GCATggtaccCCCCTGTGCACATGTGCTGGTACAG ME839 Amplifikation der linken Flanke von rac1 mit einer NcoI Schnittstelle am 3´Ende CGATccatggGATTGCGAGTGTGAATACGAGAGCGC Die Sequenz der Oligos ist jeweils in 5‘-3‘ Richtung angegeben. 4.3.6 Konstruktion des Testsystems zur Identifikation des für den Cdc24-Abbau ausreichenden Fragments Zur Herstellung der N-terminalen SH3-Fusionsproteine wurde zunächst die zweite SH3-Domäne von Bem1 amplifiziert und das 5´Ende mit EheI und das 3´Ende mit SmaI abgestumpft. Bei der anschließenden Ligation in die SmaI Schnittstelle oberhalb von GFP in pOtef-GFP-Ala6-MXN-Cbx wurde am 3´Ende die SmaI Schnittstelle erhalten, in die nachfolgend die cdc24 Fragmente ligiert wurden. Abbildung 4.1 A zeigt eine Übersicht der amplifizierten cdc24 Fragmente. In das Plasmid Pru11cla4∆CRIB (Leveleki et al., 2004) wurde eine TNOS-Hygromycin Kassette zwischen die AflII und die NotI Schnittstelle integriert. Das Plasmid wurde mit HpaI linearisiert und zufällig in das Genom von Bub8∆rac1 (Mahlert et al., 2006) integriert. In den so erhaltenen Stamm wurden die Plasmide mit den cdc24 Fragmenten in den ip Locus integriert. 77 4 Material und Methoden CH DH PH PB1 cdc24 ME764 ME767ME768ME769 MF348 ME765 MF942 ME766 Fragment1 Fragment2 Fragment3 Fragment4 Fragment5 Fragment6 Fragment7 Fragment8 Fragment3 Fragment5 Fragment3 Fragment8 Fragment7 Fragment5 SmaI SmaI SmaI SfiIFus SfiIdown 3xHA-HygRRF D622-1016 D622-684 D684-1016 MF301 ME501 A B Abbildung 4.1: Fragmentierung von cdc24 und Herstellung der Konstrukte zur Deletion einzelner Bereiche.A) Schematische Darstellung der durch PCR mit den eingezeichneten Oligos amplifizierten cdc24 Fragmente. B) Übersicht der zur Deletion interner Bereiche verwendeten Konstrukte. Die N-terminalen Fragmente (grün) wurden über eine SmaI Schnittstelle an die C-terminalen Fragmente (rot) ligiert. Die 3xHA-HygromycinRKassette und die rechte Flanke wurden durch Rekombination in S. cerevisiae angehängt. Verwendete Oligos: Name Verwendung Sequenz ME761 Amplifikation der zweiten SH3-Domäne von Bem1 mit einer EheI Schnittstelle und einem ATG am 5´Ende GCATggcgccATGCTCTACGCCGTGGTCAAGTACG ME763 Amplifikation der zweiten SH3-Domäne von Bem1 mit einer SmaI Schnittstelle 3´Ende CGATcccgggATCACGGATCTCGACAAAGGCAACAGG ME764 Amplifikation der Cdc24 Fragmente 1, 2, 3 und 7 mit einer SmaI Schnittstelle am 5´Ende CGATcccgggATGGCTGCTTCCACATCGCTTGC ME765 Amplifikation der Cdc24 Fragmente 4 und 6 mit einer SmaI Schnittstelle am 5´Ende GCATcccgggAACATGCGACGACAGCAGGCAGC ME766 Amplifikation des Cdc24 Fragments 5 mit einer SmaI Schnittstelle am 5´Ende GCATcccgggGCCATCAAACTCAACATCAGC 78 4 Material und Methoden Präparation von Plasmid-DNA aus S. cerevisiae Zur Gewinnung von Plasmid-DNA aus S. cerevisiae wurden 3 ml Flüssigkultur abzentrifugiert, das Sediment in 200 µl Lösung A (siehe: alkalische Lyse) resuspendiert und mit Glasperlen vermischt. Der Zellaufschluss erfolgte auf dem Vibrax bei maximaler Geschwindigkeit. Zur Gewinnung der Plasmide aus der Suspension wurde das High-Speed Plasmid Mini Kit der Firma Avegene nach Herstellerangaben verwendet. Präparation von chromosomaler DNA aus Ustilago maydis Zur Gewinnung von chromosomaler DNA aus U. maydis wurden 3 ml einer dicht gewachsenen Übernachtkultur abgenommen und in einem entsprechenden Reaktionsgefäß zentrifugiert (1 min, 13000 rpm). Das Sediment wurde in 500 µl Lysis-Puffer resuspendiert und mit 0,3 g Glasperlen und 500 µl Phenol/Chloroform versetzt. Der Ansatz wurde nach 10 minütigem Schütteln auf dem Vibrax zentrifugiert (10 min, 13000 rpm). Die obere, klare Phase wurde in einem neuen Reaktionsgefäß mit 50 µl 3 M Natriumacetat, pH 5,3 und 800 µl 96 %igem Ethanol gemischt und zentrifugiert (10 min, 13000 rpm). Der Niederschlag wurde mit 500 µl 70 %igem Ethanol gewaschen und anschließend nach vollständiger Entfernung des Ethanols in 20-50 µl TE mit RNaseA aufgenommen. Die Langzeitlagerung der präparierten DNA erfolgte bei -20◦C. Lysis-Puffer: 10 mM Tris/HCl pH8,0 Phenol/ 50 %(v/v)Phenol 100 mM NaCl Chloroform: 50 % (v/v) Chloroform 1 mM EDTA 1 % (w/v) SDS 2 % (w/v) Triton X-100 Präparation von RNA aus Ustilago maydis Zur Präparation von RNA aus U. maydis wurden 20 ml einer exponentiell wachsenden Kultur zentrifugiert (10 min, 3500 rpm) und das Sediment bei -80◦C schockgefroren. Anschließend wurde das Sediment in 1 ml TRIzol Reagenz (Invitrogen) aufgenommen und in ein vorbereitetes 2 ml Eppendorf-Röhrchen mit Glasperlen überführt. Die Zellen wurden in der Zellmühle 10 min mit maximaler Geschwindigkeit aufgeschlossen. Dann wurde die Probe mit 200 µl Chloroform gemischt und für 3 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Abzentrifugieren (11000 rpm, 15 min, 4◦C) wurde die obere, wässrige Phase in einem frischen Eppendorf-Röhrchen mit 500 µl Isopropanol gemischt. Nach 10 minütiger Präzipitation bei Raumtemperatur wurde die RNA sedimentiert (11000 rpm, 15 min, 4◦C) und der Überstand verworfen. Das Sediment wurde mit 1 ml 80 % ETOH gewaschen (11000 rpm, 5 min, 4◦C). Nach vollständigem Entfernen des Waschalkohols wurde die RNA in 50 µl RNAsefreiem Wasser aufgenommen, bei 50◦C für 10 min gelöst und bei -80◦C eingefroren. 4.4.3 Analyse und Modifikation von Nukleinsäuren Restriktionsenzymatische Spaltung von DNA Zur Aufspaltung der DNA durch Restriktionsendonukleasen wurden Enzyme und die dazugehörigen Puffersysteme der Firmen New England Biolabs und Fermantas verwendet. Sowohl die Pufferkonzentration, als auch die Inkubationstemperatur und Enzymkonzentration wurde nach Herstellerangaben 85 4 Material und Methoden gewählt. Bei Ansätzen mit zwei Enzymen wurde auf die Puffer-Kombinationstabellen der Hersteller zurückgegriffen. Auftrennung von DNA-Fragmenten mittels Agarose-Gelelektrophorese Zur Auftrennung der DNA-Fragmente wurden Agarosegele benutzt (Sharp et al., 1973). Eine Suspension von 0,8-1,5 % Agarose in TAE-Puffer wurde aufgekocht, nach dem Herunterkühlen auf 60◦C bis auf eine Endkonzentration von 1-5 µg/ml mit Ethidiumbromid versetzt und in einen Gelschlitten mit eingestecktem Kamm eingegossen. Nach dem Erstarren des Geles wurde der Kamm entfernt und der Schlitten in die mit TAE-Puffer befüllte, horizontale Gelkammer eingelegt. Die aufzutrennenden DNA-Lösungen wurde mit 1/10 Volumen 10x Auftragspuffer gemischt und in die Taschen gegeben. Die Auftrennung erfolgte bei 80-130 V. Als Größenstandard wurde der GenerulerT M DNA Ladder Mix der Firma Fermentas verwendet. Zur Dokumentation wurden die DNA-Banden durch UV-Licht sichtbar gemacht und photographiert. TAE40 mM Tris/HCl pH8,3 DNA0,2 % (w/v) Orange G Laufpuffer: 20 mM Natriumacetat Auftragspuffer: 50 % (w/v) Saccharose 2 mM EDTA 1 mM EDTA Auftrennung von RNA mittels denaturierender Glyoxal/DMSO-Gelelektrophorese Zur Auftrennung von RNA durch Agarosegelelektrophorese, wurden 5-20 µl der RNA-Lösung mit 5 µl 10x MOPS-Puffer, 5 µl 8M Glyoxal und 10 µl DMSO gemischt und für eine Stunde bei 50◦C denaturiert. Nach dem Zusetzen von 4 µl Auftragspuffer wurden die Proben in einem 1 %igen MOPSAgarosegel bei 90 V aufgetrennt. Hierbei wurde das Gel jede halbe Stunde in der Kammer gedreht, wobei auch die Kammer umgepolt wurde, um den pH-Wert des Puffers möglichst konstant zu halten. 10x MOPS200 mM MOPS pH7,0 RNA50 % (w/v) Saccharose Puffer: 80 mM Natriumacetat Auftragspuffer: 0,25 % (w/v) Bromphenolblau 10 mM Na2-EDTA 0,25 % (w/v) Xylencyanol FF in MOPS-Puffer Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Zur Isolation spezifischer DNA-Fragmente aus den Gelen, wurden entsprechende Banden ausgeschnitten und die DNA mit Hilfe des Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit der Firma AVEGENE den Herstellerangaben folgend extrahiert. Dephosphorylierung von DNA Um die Selbstligation von Vektoren zu minimieren, wurden die geschnittenen Vektoren mit der Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) der Firma Fermentas, in entsprechendem, vom Hersteller mitgelieferten Puffer, dephosphoryliert. Das Enzym wurde den Ansätzen im Volumen von 0,5-1 µl zugegeben und nach der einstündigen Inkubation bei 37◦C durch Hitze inaktiviert (15 min, 65◦C). 86 4 Material und Methoden Ligation von DNA-Fragmenten Zur kovalenten Verknüpfung von zwei bis drei DNA-Fragmenten, wurden diese in geeignetem Verhältnis (i.d.R. 1/10 Vektor und 9/10 zu inserierendes Fragment) in einem Reaktionsgefäß auf ein Endvolumen von 17,5 µl vereinigt und mit 2 µl 10xLigasepuffer und 0,5 µl T4-DNA-Ligase der Firma Roche Diagnostics GmbH versetzt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 14◦C. DNA-Sequenzierung Die Sequenzierung von DNA-Fragmenten erfolgte nach der Kettenabbruch-Methode (Sanger et al., 1977) und wurde von der Firma eurofins durchgefuhrt. Transfer und Detektion von DNA auf Membranen (Southern Blot) Zur Detektion von DNA-Restriktionsfragmenten definierter Größe und Sequenz wurde die Southern Blotting Methode (Southern, 1992) durchgeführt. Dabei wurden elektrophoretisch aufgetrennte DNAFragmente auf eine Nylonmembran übertragen und durch Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden nachgewiesen. Chromosomale DNA wurde mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, im Agarosegel aufgetrennt und zur Dokumentation unter UV-Licht photographiert. Das Gel wurde erst für 15 min zur Depurinierung in 0,25 M HCl und danach für 20 min in 0,4 N NaOH inkubiert. Zur Übertragung der DNA auf die Nylonmembran (Hybond-N+, Amersham Pharmacia) wurde eine Glasplatte über ein Bassin mit 0,4 N NaOH gelegt. Quer über die Glasplatte wurde ein Streifen in Transferpuffer getränktes Blotting-Papier so aufgelegt, dass beide Enden ins Vorratsbassin eintauchten. Dann wurde das Gel mit den Taschenöffnungen nach unten aufgelegt, gefolgt von der, mit Transferpuffer benetzten, Nylonmembran und drei Schichten in Puffer getränkten Blotting-Papiers. Um die aufwärtsgerichteten Kapillarkräfte zu unterstützen, wurde eine dicke Schicht saugfähiges Papier aufgelegt und die Konstruktion mit einem Gewicht von 300-500 g beschwert. Geblottet wurde über Nacht. Die Membran wurde nach dem Blotten getrocknet und die DNA durch UV-Bestrahlung (254 nm, 1200 mJ/cm2) im Stratalinker 2400 (Stratagene) darauf fixiert. Die auf der Nylonmembran fixierte DNA wurde mit einer radioaktiven Sonde hybridisiert (Church and Gilbert, 1984). Die Membran wurde 20 min bei 60◦C in 15 ml Southern-Hybridisierungspuffer vorinkubiert. Die Sonde wurde 5 min bei 95◦C denaturiert und hinzugegeben (Endkonzentration etwa 106cpm/ml). Es wurde über Nacht bei 60◦C inkubiert und die Membran anschließend in 2x 15 ml Southern-Waschpuffer 20 min gewaschen. Anschließend wurde die Membran in Plastikfolie eingeschweißt und ein bis zwei Tage in einer Phosphoimager Kassette (Amersham) exponiert. Die Detektion der Signale erfolgte mit Hilfe eines Phosphoimagers (Storm860, Amersham). Depurinierungs0,25 M HCl Transfer0,4 M NaOH Lösung: Lösung: Hybridisierungs7 % (w/v) SDS Waschpuffer: 1 % (w/v) SDS puffer: 500 mM Natriumphosphat Puffer pH7,0 100 mM Natriumphosphat Puffer pH7,0 Transfer und Detektion von RNA auf Membranen (Northern Blot) Für die Detektion spezifischer RNA wurde diese mittels einer denaturierenden Glyoxal/ DMSOGelelektrophorese in einem 1 %igen MOPS-Agarosegel mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid aufgetrennt. 87 4 Material und Methoden Die Gleichmäßigkeit der unter UV-Licht sichtbaren 18sund 28s-rRNA Banden wurde dokumentiert. Das Gel wurde 15 min in 20x SSC inkubiert. Der Transfer der RNA auf die Nylonmembran (HybondN+, Amersham Pharmacia) erfolgte im Kapillarblot, wie für den Southern Blot beschrieben, aber mit 20x SSC als Transferpuffer. Auch die Fixierungs-, Hybridisierungsund Detektionsverfahren waren gleich. Es wurde jedoch der Northern-Hybridisierungsund der Northern-Waschpuffer an Stelle der Southern-Puffer verwendet. 20x SSC: 300 mM NatriumcitratNorthern50 mM PIPES pH6,5 Puffer pH7,0 Hybridisierungs100 mM NaCl 3 M NaCl puffer: 50 mM Natriumphosphatpuffer pH7,0 Northern1 x SSC 1 mM EDTA Waschpuffer: 5 % (w/v) SDS 5 % (w/v) SDS Herstellung von radioaktiv markierten Sonden Zur Herstellung der radioaktiven Sonden wurde das Megaprime Labeling System der Firma Amersham Biosciences verwendet. Dabei wurden 25 ng Sonden-DNA mit einer Länge von 400-1000bp mit 5 µl der Primer-Lösung (Hexanukleotide mit zufälliger Sequenz) und destilliertem Wasser auf ein Volumen von 33 µl aufgefüllt und im Heizblock bei 95◦C 5 min denaturiert. Danach wurde der Ansatz kurz auf Eis gekühlt und 10 µl Reaktionspuffer (Puffersubstanzan und alle dNTPs ausser dCTP), 2 µl Klenow Polymerase und 5 µlα32P-dCTP zugegeben. Der Ansatz wurde eine Stunde bei 37◦C inkubiert und die Reaktion anschließend durch Zugabe von 5 µl 0,2 M EDTA gestoppt. Die Sonde wurde zuletzt mit Hilfe einer Mobitec S-200 Säule durch Zentrifugation von überschüssigen Nukleotiden gereinigt. Amplifikation von DNA Die DNA wurde mittel „Polymerase-Chain-Reaction“amplifiziert (Mullis et al., 1986; Bell, 1989; White et al., 1989). Durch die thermostabilen Polymerasen Pfx (Invitrogen) und Phusion (Finnzymes) wurden mit Hilfe von Oligos und dNTPs spezifische DNA-Fragmente amplifiziert. Die PCR-Reaktion läuft in 3 charakteristischen Schritten ab. Zunächst wird die doppelsträngige DNA durch Erhitzen auf 94◦C denaturiert und so in einzelsträngige DNA überführt. Bei einer Temperatur zwischen 50-60◦C binden die PCR-Primer an die DNA-Einzelstränge (Annealing). Die thermostabile Polymerase synthetisiert anschließend ausgehend von den Primern einen komplementären DNA-Strang. Durch eine erneute Denaturierung bei 94◦C beginnt der Zyklus erneut. Sowohl die verwendeten Puffer-, Oligo-, dNTPund DNA-Konzentrationen, als auch die Inkubationszeiten und Temperaturen richteten sich nach den Herstellerangaben. Standard-PCRs wurden in einem Endvolumen von 50µl wie folgt durchgeführt: 5µl 10x PCR-Puffer 1µl MgSO4(50 mM) 1µl dNTPs (10 mM) 0,5 µl 5’Primer (25 mM) 0,5 µl 3’Primer (25 mM) 100 ng Matrizen-DNA 2,5 U DNA-Polymerase H2O ad 50 µl 88 4 Material und Methoden Standard PCR-Programm: 5 min 95◦C (initiale Denaturierung) 1 min 95◦C (Denaturierung) 1 min 40-65◦C (Annealing, abhängig von Primern) 1 min 72◦C (Elongation, 1 min pro kb)      30x 10 min 72◦C (Auffüll-Reaktion) Die PCR-Produkte konnten anschließend in den Klonierungsvektor pJET2.1 ligiert werden. 4.4.4 Transformation von Mikroorganismen Herstellung von chemokompetenten E. coli Zellen Chemokompetente E. coli-Zellen wurden nach der CCMB 80 Methode hergestellt. 100 ml DYTFlüssigkultur wurden aerob bei 37◦C bis auf eine optische Dichte (OD600) von 0.4 angezogen. Die Kultur wurde 20 min auf Eis inkubiert und die Zellen anschließend zentrifugiert (3500 rpm, 5 min, 4◦C). Das Sediment wurde in 30 ml CCMB 80 Puffer resuspendiert und 15 min auf Eis inkubiert. Dann wurden die Zellen erneut zentrifugiert (3500 rpm, 15 min, 4◦C) und das Sediment in 8 ml CCMB 80 Puffer aufgenommen. Die Zellen wurden in 50 µl Aliquots bei -80◦C tiefgefroren. CCMB 80: CaCl211,8 g/l MnCl24 g/l MgCl22 g/l Kaliumacetat 10 ml/l einer 1M Stocklösung Glycerin 100 ml/l Transformation von chemokompetenten E. coli-Zellen Zur Transformation chemisch kompetenter E. coli-Zellen wurden 10 µl des Ligationsansatzes mit 50 µl chemokompetenten Zellen gemischt und für 20 min auf Eis inkubiert. Dann wurde der Ansatz für eine Minute auf 42◦C erwärmt, danach mit 1 ml dYT-Medium versetzt und für 30-60 min unter aeroben Bedingungen bei 37◦C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert, das Sediment in 100 µl steriles Wasser aufgenommen und auf Selektivmedium ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37◦C inkubiert. Protoplastierung von U. maydis Zur Herstellung von U. maydis-Protoplasten wurden 50 ml YEPS-Flüssigkulturen der jeweiligen Stämme bis zu einer optischen Dichte (OD600) von ca. 0,5 angezogen und anschließend zentrifugiert (3500 rpm, 5 min, RT). Das Zellsediment wurde in 25 ml SCS-Lösung resuspendiert und erneut abzentrifugiert (3500 rpm, 5 min, RT). Dann wurde das Sediment in 2 ml SCS-Lysing-Enzymes-Lösung (SIGMA) aufgenommen und die Protoplastierung der Zellen unter dem Mikroskop verfolgt. Als der Anteil an Protoplasten im Ansatz ca. 70% betrug, wurde die Reaktion durch Zugabe von 10 ml eiskalter SCS-Lösung gestoppt und die Protoplasten pelettiert (2500 rpm, 10 min, 4◦C). Das Sediment wurde zweimal mit 10 ml eiskalter SCS-Lösung und einmal mit dem gleichen Volumen an eiskalter 89 4 Material und Methoden STC-Lösung gewaschen und in 300 µl eiskalte STC-Lösung aufgenommen. Die Protoplasten wurden in Volumina von 50 µl aliquotiert und bei -80◦C eingefroren. SCS-Puffer: 20 mM Natriumcitrat STC-Puffer: 10 mM Tris/HCl pH7,5 -Puffer pH5,8 100 mM CaCl2 1 M Sorbitol 1 M Sorbitol SCS-Lysing-EnzymesLösung: 35 mg/ml Lysing Enzymes in SCS Transformation von U. maydis-Protoplasten Zur Transformation wurden 50 µlU. maydis-Protoplasten auf Eis aufgetaut und mit 500 ng der zu transformierenden DNA versetzt. Der Ansatz wurde für 10 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden 350 µl STC/PEG zugegeben und erneut für 15 min auf Eis inkubiert. Durch die Zugabe von PEG wurden die Zellmembranen für die zugegebene DNA permeabel gemacht. Der Ansatz wurde auf Regenerationsagar ausplattiert. Dieser wurde in zwei Schichten übereinander gegossen, von denen die untere das Fungizid in zweifacher Konzentration enthielt, für das die transformierte DNA die Resistenz vermittelte. Die obere Schicht war frei von Selektionsfaktoren. So stellte sich durch Diffusion zwischen den beiden Schichten erst über einen längeren Zeitraum hinweg die übliche Konzentration des Antibiotikums ein, so dass es vorher zur Ausprägung der Resistenz in den transformierten Zellen und zu deren Regeneration kommen konnte. Die Platten wurden bei 28◦C inkubiert. STC/PEG: 40 % (w/v) Polyethylenglycol in STC Transformation von S. cerevisiae Zellen Der zu transformiernde Hefestamm wurde in 50 ml YEP Medium mit 1 % (w/v) Glukose über Nacht bis auf eine OD600 von 0,5 angezogen. Die Kultur wurde abzentrifugiert (3000 rpm, 10 min, RT), der Überstand verworfen und das Sediment in einem der Anzahl an Transformationen angepasstem Volumen LiT aufgenommen. Aliquots von 100 µl wurden in sterile Eppendorf-Röhrchen verteilt und mit 5 µl denaturierter Herinssperma-DNA (10 mg/ml) und 1 µg Plasmid-DNA gemischt. Nach Zugabe von 500 µl LiT-PEG wurde der Ansatz unter stetigem Durchmischen bei RT für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurden 50 µl DMSO zugegeben und für 15 min bei 42◦C inkubiert. Nach kurzem Abzentrifugieren (3000 rpm, 30 s) wurde die Zellen in 100 µl sterilem Wasser aufgenommen und auf Selektionsmedium ausplattiert. LiT: 10 mM Tris-HCl pH 7,4 LiT-PEG: 100g PEG in 100 mM Lithiumacetat 100 ml LiT 4.4.5 Proteinbiochemische Methoden Proteinextraktion aus U. maydis Zellen Zur Herstellung von Proteinextrakten aus U. maydis wurden 25 ml einer dichten Flüssigkultur zentrifugiert (3500 rpm, 5 min, RT) und das Sediment in 10 ml TBS-Puffer gewaschen. Nach einem weiteren 90 4 Material und Methoden Zentrifugationsschritt (3500 rpm, 5 min, RT) wurde das Sediment in 500 µl TBS aufgenommen und in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt. Der Zellsuspension wurden 0,3 g Glasperlen, 5 µl 10 % Triton X-100 und 5 µl Protease Inhibitor Cocktail für Pilze (Sigma) zugesetzt und der Ansatz in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Dann wurde das Reaktionsgefäß bei 4◦C 30 min auf dem Vibrax geschüttelt. Der Ansatz wurde zentrifugiert (13000 rpm, 10 min, 4◦C). Der klare Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die Proteinkonzentration bestimmt. Die Langzeitlagerung der Proteine erfolgte bei -80◦C. TBS: 50 mM Tris/HCl pH7,5 150 mM NaCl Konzentrationsbestimmung von U. maydis Proteinextrakten Die Ermittlung der Proteinkonzentration erfolgte nach Bradford (Bradford, 1976), allerdings in einer modifizierten Form mit Biorad-Reagenz (Biorad). Die Proteinproben wurden auf ein Endvolumen von 100 µl um den Faktor 1:10 in TBS verdünnt. 10 µl davon wurden mit 990 µl der um den Faktor 1:5 verdünnten Biorad-Lösung gemischt. Der Nachweis erfolgte sofort im Photometer bei einer Wellenlänge von 595nm. Zur Standardisierung wurden BSA-Verdünnungsreihen mit definierten Konzentrationen eingesetzt. SDS-Gelelektrophorese Für die Auftrennung der Proteinextrakte wurden SDS-haltige Polyacrylamidgele genutzt. 6 %ige Polyacrylamidgele dienten dem Nachweis der Cdc24-GFP Fusion, 12 %ige dem von GFP. Komponente % 1 M Tris pH8,8 1 M Tris pH6,8 SDS Aa/Bis 30:0,8 H2O APS TEMED Trenngel 6 2250µl - 75µl 1200µl 2400µl 100µl 10µl Trenngel 10 2250µl - 75µl 2000µl 1600µl 100µl 10µl Trenngel 12 2250µl - 75µl 2400µl 1200µl 100µl 10µl Sammelgel - - 375µl 30µl 500µl 2050µl 50µl 7,5µl APS-Stammlösung: 10 % (w/v) Ammoniumperoxidsulfat SDS-Stammlösung: 10 % (w/v) Natriumdodecylsulfat Für die Proteingele wurden Mini-PROTEAN Tetra Cell Apparaturen (Biorad) verwendet. Die Apparatur wurde nach Herstellerangaben zusammengesetzt, auf ihre Dichtheit überprüft und zuerst das Trenngel zwischen die Glasplatten gegossen. Dieses wurde mit Isopropanol überschichtet. Nach dem Auspolymerisieren des Trenngels, wurde der Alkohol vollständig abgenommen, das Sammelgel eingegossen und der Kamm eingesetzt. Nach dem Auspolymerisieren des Sammelgels, wurde der Kamm entfernt, die Taschen sorgfältig gespült und das Gel in die vertikale Laufkammer eingesetzt. Die äußere und die innere Pufferkammer wurden mit Laufpuffer befüllt. Die Proteinproben wurden in TBS auf eine Konzentration von 2 µg/µl verdünnt und je 10 µl dieser Proteinlösung mit 3 µl 3x Probenpuffer versetzt. Die Ansätze wurden 5 min zur Denaturierung aufgekocht, kurz auf Eis heruntergekühlt und 91 4 Material und Methoden auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte bei 120 V. Als Längenstandard wurde der Marker „Page Ruler Prestained Protein Ladder“ der Firma Fermentas verwendet. 3x Protein400 mM Tris/HCl pH6,8 Proteingel 0,25 % (w/v) Coomassie Auftragspuffer: 30 mM DTT -Färbelösung: Brilliant Blue R-250 6 % (w/v) SDS 20 % (v/v) Methanol 40 % (v/v) Glycerin 10 % (v/v) Essigsäure 0,006 % (w/v) Bromphenolblau Laufpuffer: 25 mM Tris/HCl pH8,8 Entfärber: 20 % (v/v) Methanol 200 mM Glycin 10 % (v/v) Essigsäure 0,2 % (w/v) SDS Transfer und Nachweis von Proteinen auf PVDF-Membranen (Western Blot) Die Proteine wurden auf einer PVDF-Membran durch Hybridisierung mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen (Gültekin and Heermann, 1988). Für den Transfer der Proteine vom SDS-Gel auf eine PVDF (Polyvinylidenfluorid)-Membran (Roth) wurde ein „Wet-Blot“ mit einer Mini Trans-Blot Cell (BioRad) durchgeführt. Dabei wurde ein mit Blottpuffer getränktes Schwämmchen auf die der Kathode zugewandte Seite der Blot-Kassete gelegt und mit einem ebenfalls in Puffer getränktem Whatman-Papier überschichtet. Darauf wurde das Trenngel platziert. Auf das Trenngel wurde die in Methanol aktivierte PVDF Membran aufgelegt und mit einer weiteren Lage Papier und dem zweiten Schwämmchen überschichtet. Die Kassette wurde in die Blot-Apparatur eingespannt und bei 25 V über Nacht, oder bei 100 V für eine Stunde geblottet. Die Membran wurde in TBST0,1-Milch 10 min unter Rotation abgesättigt und in einen Plastikbeutel eingeschweißt. In diesen wurden 10 ml einer 1:1000 Verdünnung des primären Antikörpers (GFP mouse monoclonal IgG2a, Santa Cruz Biotechnology; HA mouse monoclonal IgG, eigene Herstellung; RFP mouse monoclonal IgG, Santa Cruz Biotechnology; Tub1 mouse monoclonal IgG, Calbiochem; Myc rabbit monoclonal IgG, Sigma) in TBST0,1-Milch eingefüllt. Der Ansatz wurde über Nacht bei 4◦C auf der Wippe inkubiert. Dann wurde die Membran 3x 10 min in 10 ml TBST0,1gewaschen und danach mit einer 1:1000 Verdünnung des sekundären Antikörpers (donkey anti-mouse IgG-HRP conjugate, Santa Cruz Biotechnology; goat anti rabbit IgG-HRP conjugate, Santa Cruz Biotechnology) in TBST0,1-Milch zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Nachweis der Proteine durch Chemilumineszenz wurde die Membran 3x 10 min in 10 ml TBST0,1 gewaschen, abgetropft und in eine nach drei Seiten hin offene Plastikhülle gelegt. 0,5 ml der Detektionslösung 1 wurden mit 0,5 ml der Detektionslösung 2 gemischt und auf die Membran aufgetropft. Überschüssige Lösung wurde zu den Seiten hin aus der Plastikhülle gestrichen. Die Membran wurde in ihrer Hülle in eine Röntgenkassette eingelegt, ein Film aufgelegt und der Blot für 15 s-5 min in der geschlossenen Kassette exponiert. Dann wurde der Film entwickelt. Die Membran wurde 1 min in einer Schale Ponceau-S-Lösung (Sigma) gebadet und dann so lange in Wasser entfärbt, bis die Gesamtheit der Proteinbanden auf ihr deutlich sichtbar waren. Transferpuffer: 25 mM Tris TBST: 0,1 % (v/v) Tween 20 in TBS 200mM Glycin 0,02 % (w/v) SDS TBST-Milch: TBST mit 3% (w/v) 20 % (v/v) Methanol Trockenmilch 92 4 Material und Methoden Luminol A: 100 mM Tris/HCl pH 8,5 Luminol B: 100 mM Tris/HCl pH 8,5 2,5 mM Luminol 5,4 mM H2O2 400 µM P-Cumarsäure Aufreinigung von Fusionsproteinen aus E. coli Die DH-PH Tandem Domäne von Cdc24 und die Vollängen GTPasen wurden als GST-Fusionsproteine im pGEX Vektor System (GE-Healthcare) oder als NusA-6xHis-Fusionsproteine in Vektor pETM6 (Dümmler et al., 2005) in dem E. coli Stamm BL21-CodonPlus(DE3)-RP(Codon3+) überexprimiert. Die Zellen wurden über Tag in 1 l DYT Medium bei 37◦C bis auf eine OD600 von 0,4-1 angezogen. Die Induktion erfolgte über Nacht bei 24◦C und 0,25 mM IPTG. Anschließend wurde die Zellen abzentrifugiert und in 10-15 ml Lyse-Puffer resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgte in der „French-Press“. Der durch Ultrazentrifugation (35000 rpm, 1 h, 4◦C) geklärte Extrakt wurde anschließend mit GSHAgarose (Macherey-Nagel) oder Ni-NTA-Agarose (Qiagen) gemischt und bei 4◦C eine Stunde unter Rotation inkubiert. Die beladene Agarose wurde abzentrifugiert (500 rpm, 15 min, 4◦C) und dreifach mit Lyse-Puffer gewaschen. Die GST-Fusionsproteine wurden mit 10 mM reduziertem Glutathion bei pH 8,8 eluiert und die NusA-6xHis-Fusionsproteine mit 50 mM Imidazol. Die Proteine wurden bei -80◦C gelagert. Lyse-Puffer: 50 mM Tris-HCl pH 7.5 100 mM NaCl 10 mM MgCl2 5 mM DTT oder 2.5 mM 2-mercaptoethanol Protease Inhibitor (Roche) Kopräzipitationen Die aufgereinigten GTPasen wurden an GSH-Agarose (Macherey-Nagel) oder Ni-NTA-Agarose (Qiagen) gebunden. Zur Beladung mit GDP oder GTPγS wurden die GTPasen in Lyse-Puffer, mit 20 mM EDTA und entweder 10 mM GDP oder 1 mM GTPγS inkubiert (1 h, 4◦C). Anschließend wurde die Beladung durch die Zugabe von MgCl2bis zu einer finalen Konzentration von 20 mM gestoppt. Die beladenen GTPasen wurden zweifach mit Lysepuffer gewaschen. Jeweils 10 µl GTPase wurden mit 100-200 µgU. maydis Proteinextrak gemischt, der eine markierte Variante des interagierenden Proteins enthielt. Um den Beladungsstatus der GTPasen zu erhalten, wurden den Ansätzen 10 mM GDP oder 1 mM GTPγS zugesetzt. Die Ansätze wurden eine Stunde bei 4◦C rotierend inkubiert. Anschliesend wurden die Agarose sedimentiert (3000 rpm, 1 min, 4◦C) und fünffach mit 1 ml Lyse-Puffer gewaschen. Das Präzipitat wurde in SDS-Probenpuffer aufgekocht, in einem SDS-Gel aufgetrennt und die präzipitierten Proteine nach dem Transfer auf PVDF Membranen mit spezifischen Antikörpern detektiert. GST-CRIB-Präzipitation Für die CRIB-Präzipitation wurde GSH-Agarose mit aufgereinigtem GST-CRIB Protein beladen. Die U. maydis Extrakte wurden vier Stunden nach Induktion der Überexpression des bE1/bW2 Transkriptionsfaktors oder der Cdc24 Varianten präpariert. Die geklärten Extrakte mit definierter Proteinkonzentration wurden mit gleichen Mengen GST-CRIB-beladener GSH-Agarose inkubiert (30 min, 4◦C). Das Präzipitat wurde dreifach gewaschen, und die Proteine im „Western-Blot“ nachgewiesen. 93 4 Material und Methoden Quantifizierung von Proteinmengen Zur Quantifizierung der Stärke der HRP-Fluoreszenz bei der Detektion von Proteinen auf PVDFMembranen, wurden die Signale mit Hilfe einer Chemokamera der Firma INTAS und der zugehörigen Software ChemoStar photographiert. Die Quantifizierung der Signalintensität erfolgte mit dem Programm ImageJ (Abramoff et al., 2004). Dazu wurden die einzelnen Banden mit dem Werkzeug “Rectangular Selections“ markiert und der durchschnittliche Grauwert „Mean Gray Value“ mit dem Werkzeug „Measure“ im Menü „Analyze“ bestimmt. Von diesem Wert wurde der gemessene Wert für den Hintergrund des Photos abgezogen. Um die erhaltenen Werte für die einzelnen Banden auf die eingesetzte Gesamtproteinmenge zu normieren, wurde der zu quantifizierende Wert durch den, in der gleichen Spur, für die Kontrolle Tub1 erhaltenen Wert dividiert. Anschließend wurde die prozentuale Abweichung der Messwerte von der Widtyp Kontrolle berechnet. 4.4.6 Infektion von Zea mays Zum Test der Pathogenität von U. maydis-Stämmen wurden im Gewächshaus gezogene 7 Tage alte Maispflanzen der Sorte Early Golden Bantam infiziert. Dazu wurden Kulturen des solopathogenen Stammes SG200 mit einer OD600 von 0,5 abzentrifugiert und eine Zellsuspensionen mit OD600 1,0 in sterilem Wasser hergestellt. Je 500 µl wurden mit Hilfe einer Spritze in den Stängel der Pflanze unterhalb des Blattansatzes injiziert. Die Pflanze konnte nach 14 Tagen auf Chlorose-, Anthocyanund Gallenbildung untersucht werden. 4.4.7 Mikroskopie von U. maydis-Zellen Zur Mikroskopie von U. maydis-Zellen kam ein Fluoreszenzmikroskop vom Typ Axiovert 200M mit einem Ludel Piezo Drive (Zeiss) zum Einsatz. Die Färbungen erfolgten mit den Fluoreszenzfarbstoffen, die in der nachfolgenden Tabelle angegeben sind. Sie wurden (bis auf GFP) den Flüssigkulturen in der genannten Endkonzentration beigemischt (Inkubationszeit: 5 min). Die zu untersuchenden Zellen wurden im Volumen von 1 µl auf einen mit einer ca. 0,5 mm dicken Wasseragarschicht bedeckten Objektträger aufgetropft. Anschließend wurde das Deckglas aufgelegt. Der Wasseragar diente der Fixierung der Zellen an ihrer Position um unscharfe Bilder zu vermeiden. Zur Anregung der verschiedenen Farbstoffe wurden die zur Wellenlänge passenden Filter genutzt. Vergleichsphotos wurden im Differentialkontrast gemacht. Der Dokumentation diente eine Kamera des Typs ORCA (Hammamatsu) und die Software Volocity 5.0. Die Bilder wurden mit ImageJ (Abramoff et al., 2004) bearbeitet. Name Zellbestandteil µg/ml Kultur Excitation Emission Farbe GFP Fusionsproteine - 400 nm 509 nm grün Calcofluor Glucan 2 350 nm 461 nm blau CMAC Vakuolen 1 350 nm 466 nm blau 94 Literaturverzeichnis Chang, E. C., Barr, M., Wang, Y., Jung, V., Xu, H. P. and Wigler, M. H. (1994) Cooperative interaction of S. pombe proteins required for mating and morphogenesis. Cell,79, 131–141. Chant, J., Mischke, M., Mitchell, E., Herskowitz, I. and Pringle, J. R. (1995) Role of Bud3p in producing the axial budding pattern of yeast. J Cell Biol,129, 767–78. Chant, J. and Pringle, J. R. (1995) Patterns of bud-site selection in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol,129, 751–65. 0021-9525 Journal Article. 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