INFLUENCIA DE BIOESTIMULANTES
SOBRE LA ACCESIBILIDAD
MICROBIANA DE HIDROCARBUROS
AROMÁTICOS POLICÍCLICOS
Se illa, Diciemb e de 2011
Memo ia que p esen a
Mª del Ca men Tejeda Ag edano
pa a op a al í ulo de Doc o a en Química
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INFLUENCIA DE BIOESTIMULANTES
SOBRE LA ACCESIBILIDAD MICROBIANA
DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS
POLICÍCLICOS
Visado en Se illa, a de Diciemb e de 2011.
LOS DIRECTORES
EL TUTOR
Memo ia que p esen a: D. Mª del Ca men Tejeda Ag edano pa a op a al g ado
de Doc o a en Química
Di ec o D D. José Julio O ega Cal o
In es igado cien í ico del CSIC
Depa amen o de Ag oquímica y
Conse ación de Suelos del IRNAS
Co
-
di ec o D . D. Manuel Can os Ba ag
án
Cien í ico i ula del CSIC
Depa amen o de Bio ecnología Vege al del
IRNAS
D . D. An onio Jo dán López
P o eso con a ado doc o
Depa amen o de Eda ología y Química
Ag ícola de la Facul ad de Química,
Uni e sidad de Se illa
- 4 -
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DOCTOR D. Jose Manuel Pa do P ie o DIRECTOR DEL INSTITUTO DE RECURSOS
NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE
INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
Ce i ica: Que la p esen e Memo ia de In es igación i ulada “In luencia de
bioes imulan es sob e la accesibilidad mic obiana de hid oca bu os
a omá icos policíclicos.”, p esen ada po Dª. Mª del Ca men Tejeda Ag edano
pa a op a al g ado de Doc o en Química, ha sido ealizada en el Depa amen o
de Ag oquímica y conse ación de suelos, bajo la di ección de los D s. D. José
Julio O ega Cal o y D. Manuel Can os Ba agán euniendo odas las condiciones
exigidas a los abajos de Tesis Doc o ales.
En Se illa, a de Diciemb e de 2011.

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El p esen e abajo se ha ealizado en el ma co del p oyec o
CGL2007-64199 del Plan Nacional de I +D (CYCIT), den o del
P og ama Nacional de Fo mación de Pe sonal In es igado (FPI).
- 8 -
- 9 -
Ag adecimien os
Quisie a exp esa mis ag adecimien os a odos los que de una o ma
más o menos di ec a, han con ibuido a la ealización de mi
Tesis
Doc o al
.
Muchísimas g acias al D . José Julio O ega Cal o po b inda me la
opo unidad de o ma pa e de su g upo de in es igación y pode
desa olla mis conocimien os en es e ámbi o. G acias po su labo
como di ec o de es a esis y po sabe ansmi i sus conocimien os
an necesa ios pa a mi o mación. Since amen e, g acias.
Al D . Manuel Can os Ba agán po co-di igi es a
Tesis Doc o al
.
G acias po su apoyo, an o po sus co ecciones como po sus
cha las. Muchas g acias po in oduci me en su g upo, al cual
ambién le quie o hace pa ícipe de mis ag adecimien os. A Ma ía
del Ma y Ja ie , siemp e me aco da é del cong eso en Mu cia.
G acias al D . An onio Jo dán López po acep a se el u o de es a
Tesis Doc o al
y acili a me en odo momen o el desa ollo de la
misma.
Debo de ag adece ambién al D . D. José Manuel Pa do P ie o,
di ec o del Ins i u o de Recu sos Na u ales y Ag obiología de Se illa
po las acilidades p es adas pa a ealiza es a Tesis.
Ag adece a Philipp Maye , po hace posible mis es ancias en su
cen o, en NERI, Roskilde (Dinama ca). Muchas g acias po
in oduci me al apasionan e mundo del passi e dosing, g acias po
su calidad humana y la de su g upo de in es igación po acoge me y
a a me como uno más. Muchas g acias a Ma gui , Kilian, S in,
Geo ey, Tina, Tea, Naja y sob e odo a Va a a. También a i, Eli
que e conocí allí y hemos pasado unos momen os inol idables jun o
a Ma ia y Almu.
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ÍNDICE GENERAL
- 17 -
ÍNDICE GENERAL
PREFACIO…………………………………………………….……….…..13
ÍNDICE GENERAL……………………………...………………..………17
ÍNDICE DE FIGURAS………………………………………….………...22
ÍNDICE DE TABLAS…………………………………..……….………..27
LISTA DE ACRÓNIMOS...........................................................30
C
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….
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….
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……
……
….
.33
I.1. INTRODUCCIÓN……………………………………….…….….35
I.2. HAPs: DISTRIBUCIÓN Y TOXICIDAD……………………...39
I.3. BIORREMEDIACIÓN: CONCEPTO, TIPOS Y FACTORES
LIMITANTES………………………………………………..……..…..49
I.4. INFLUENCIA DE LOS LÍQUIDOS EN FASE NO ACUOSA
(NAPLs) EN LA BIODEGRADACIÓN DE HAPs………………….56
I.5. BIODISPONIBILIDAD, BIOACCESIBILIDAD Y ACTIVIDAD
QUÍMICA……………………..…………………………………………61
I.6. MÉTODOS DE REPARTO DE HAPs EMPLEANDO
POLIDIMETILSILOXANO……………………………………..……..65
I.7. TÉCNICAS DE BIOESTIMULACIÓN……………………......74
I.7.1. Fe ilizan es oleo ílicos……………………………..……..74
I.7.2. Fi o emediación y izo emediación……………….….76
I.7.3. Ma e ia o gánica disuel a: Ácidos húmicos……….…86
C
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A ................... 95
III.1. REACTIVOS ................................................................................... 97
ÍNDICE GENERAL
- 18 -
III.2. LÍQUIDOS EN FASE NO ACUOSA (NAPLs).......................... 98
III.3. SUELOS .......................................................................................... 99
III.4. BACTERIAS, MEDIOS, CONDICIONES DE CULTIVO Y
PREPARACIÓN DE INÓCULOS........................................................ 101
III.5. ANÁLISIS DE HAPs POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN (HPLC).............................................................. 104
III.6. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL FERTILIZANTE
OLEOFÍLICO EN LA BIODEGRADACIÓN DE HAPS................. 106
III.6.1. Expe imen os de mine alización con el mé odo de la
in e ase cons an e.......................................................................... 106
III.6.2. Expe imen os de epa o con el mé odo del á ea
in e ásica cons an e....................................................................... 109
III.7. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LAS RAÍCES DE
PLANTAS Y SUS EXUDADOS EN LA BIODEGRADACIÓN DE
HAPs ......................................................................................................... 110
III.7.1. P oducción in i o de exudados.................................. 110
III.7.2. Mine alización de pi eno en cul i os líquidos en
p esencia y ausencia de exudados de aíces de gi asol ...... 115
III.7.3. Ensayo en in e nade o .................................................... 116
III.7.4. Ex acción de los HAPs del suelo y pu i icación de la
mues a............................................................................................... 120
III.7.5. Expe imen os de mine alización de pi eno en
suspensiones de suelo con aminado con c eoso a en p esencia
y ausencia de exudados de gi asol............................................. 122
III.8. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE ÁCIDOS HÚMICOS EN LA
BIODEGRADACIÓN DE HAPS ......................................................... 123
III.8.1. P epa ación de ácidos húmicos..................................... 123
ÍNDICE GENERAL
- 19 -
III.8.2. Mine alización de pi eno y enan eno en cul i os
líquidos en p esencia o ausencia de ácidos húmicos .......... 123
III.8.3. Expe imen os de disolución de pi eno en p esencia y
ausencia de ácidos húmicos. Con ol de la concen ación lib e
disuel a................................................................................................ 124
III.9. ENSAYOS CON TÉCNICAS DE DOPAJE PASIVO CON
POLIDIMETILSILOXANO.................................................................... 127
III.9.1. P epa ación de iales con polidime ilsiloxano empleados
en dopaje pasi o............................................................................... 127
III.9.2. Es udio de la mine alización y disolución de pi eno en
p esencia y ausencia de ácidos húmicos en iales con PDMS128
III.9.3. Es udio de la di usión de PAHs en p esencia de los 3
bioes imulan es empleados en biodeg adación...................... 130
III.9.4. Ensayos de dopaje pasi o en el es udio de la capacidad
ex ac o a de HAPs po los bioes imulan es empleados en
biodeg adación.................................................................................. 133
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IV.1. FERTILIZANTE OLEOFÍLICO................................................. 139
IV.1.1. Ca ac e ización del e ilizan e oleo ílico S-200....... 139
IV.1.2. In luencia del e ilizan e oleo ílico en la biodeg adación
de los componen es del uel ......................................................... 139
IV.1.3. Es udio del epa o del enan eno desde los NAPLs148
IV.1.4. E ec o de las condiciones de agi ación y de los
nu ien es en la biodeg adación.................................................. 155
IV.2. RIZOSFERA Y EXUDADOS DE RAÍZ................................... 156
IV.2.1. Ca ac e ización de los exudados de aíz.................... 156
ÍNDICE GENERAL
- 20 -
IV.2.2. In luencia de la izos e a de gi asol sob e la eliminación
de HAPs p oceden es de un suelo con aminado con c eoso a162
IV.2.3. In luencia de exudados de aíces de gi asol sob e la
biodeg adación de HAPs p esen es en un suelo con aminado
con c eoso a....................................................................................... 168
IV.2.4. E ec o de los exudados de aíces de gi asol sob e la
biodeg adación de pi eno .............................................................. 173
IV.3. ÁCIDOS HÚMICOS.................................................................... 175
IV.3.1. Ca ac e ización de los ácidos húmicos....................... 175
IV.3.2. Es udio ísico-químico de los HAPs en p esencia de
ácidos húmicos median e ensayos de epa o con
polidime ilsiloxano........................................................................... 176
IV.3.3. Es imación de la elocidad de deg adación de
enan eno y pi eno en cul i os líquidos en p esencia de ácidos
húmicos............................................................................................... 178
IV.3.4. Ca ac e ización de la concen ación o al y lib e disuel a
de pi eno en p esencia de ácidos húmicos.............................. 185
IV.3.5. E olución de la concen ación de pi eno lib e disuel a
du an e su biodeg adación en p esencia y ausencia de ácidos
húmicos............................................................................................... 190
C
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V.1. FERTILIZACIÓN DIRIGIDA DE LA INTERFASE NAPL/AGUA
MEDIANTE FERTILIZANTES OLEOFÍLICOS............................... 197
V. 2. EFECTO ECOFISIOLÓGICO DE LA RIZOSFERA DEL
GIRASOL ................................................................................................. 201
V.3. PAPEL DE LA ACTIVIDAD QUÍMICA EN EL EFECTO
BIOESTIMULANTE DE LOS ÁCIDOS HÚMICOS ....................... 207
V.4. VISIÓN GENERAL Y COMPARACIÓN ENTRE LOS
BIOESTIMULANTES UTILIZADOS.................................................. 211
ÍNDICE GENERAL
- 21 -
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A...........................................223

ÍNDICE DE FIGURAS
- 22 -
ÍNDICE DE FIGURAS
Figu a I. 1.- Con aminación del suelo en Eu opa en el año
2006 ...................................................................................................37
Figu a I. 2.- Con aminan es p esen es en Eu opa en el año
2006 ...................................................................................................37
Figu a I. 3.- Asignación p esupues al del gas o público y
p i ado pa a la ges ión de de emplazamien os con aminados
del año 2006.....................................................................................39
Figu a I. 4.- Repa o de los con aminan es hid ó obos desde el
NAPL hacia la ase acuosa, en ausencia y p esencia de
mic oo ganismos.............................................................................61
Figu a I. 5.- Esquema donde se ilus a la acción
biodisponible y la bioaccesible de un con aminan e en el
suelo, al y como se de inen es os é minos median e la
ubicación ísica ................................................................................63
Figu a I. 6.- Esquema de un sis ema con a ias ases.....675
Figu a I.7.- Esquema ep esen a i o de la o mación de la
capa de di usión limi an e (UBL) en e la uen e de
con aminación y los mic oo ganismos en un medio
acuoso………………………………………………………………66
Figu a I. 8.- Esquema de los 3 pasos en el p oceso de di usión
de los PAHs en las mic ocáma as desde el disco con aminado
al disco sin PAHs.............................................................................69
Figu a I. 9.- Fundamen o de la écnica de dopaje pasi o..72
Figu a I. 10.- Mecanismos en uel os en la i o emediación de
hid oca bu os a omá icos policíclicos......................................79
Figu a I. 11.- Rizo emediación de HAP..................................85
ÍNDICE DE FIGURAS
- 23 -
Figu a I. 12.- Es uc u a de los ácidos húmicos..................87
Figu a III. 1.- Emplazamien o con aminado con c eoso a.
Fo os de la zona y del mues eo de suelo. ............................100
Figu a III. 2.- Tubos de ensayo de 150 x 25 mm de capacidad
pa a el p ime ensayo de cul i o in i o ...............................111
Figu a III. 3.- Sis ema u ilizado pa a la ob ención de exudados
de gi asol in i o. ..........................................................................113
Figu a III. 4.- Diseño expe imen al del ensayo ealizado en
in e nade o .....................................................................................118
Figu a III. 5.- Esquema del p oceso de ex acción y
cuan i icación de HAPs de suelos............................................121
Figu a III. 6.- Viales de dopaje pasi o con PDMS ijados en su
base pa a la mine alización de 50 µg·mL
-1
de pi eno po
Mycobac e ium gil um VM552 en p esencia de 10 µg·mL
-1
de
ácidos húmicos ex aidos de San a Olalla, Huel a. ..........129
Figu a III. 7.- Sección ans e sal del diseño expe imen al de
las mic ocáma as empleadas en el es udio del aumen o de
di usión en p esencia de los di e en es bioes imulan es
u ilizados. ........................................................................................131
Figu a IV. 1.- E ec o del bioes imulan e oleo ílico (S-200) sob e
la mine alización de (A) enan eno, (B) pi eno, y (C)
luo an eno p esen e en uel/HMN po Mycobac e ium gil um
VM552...............................................................................................141
Figu a IV. 2.- Á eas no malizadas con hopano (A/A
HOP
) de los
n-alcanos (m/z 85) de ec ados po el análisis GC-MS en el
uel/HMN esidual de los con oles abió icos (ba as de colo
neg o) y con cul i o de Mycobac e ium gil um VM552 (ba as
con ayas), con S-200..................................................................143
ÍNDICE DE FIGURAS
- 24 -
Figu a IV. 3.- Concen aciones de HAPs ecupe adas del NAPL
de los con oles y ma aces inoculados, an o con o sin
bioes imulan e S-200...................................................................144
Figu a IV. 4.- C oma og amas ípicos con GC-MS del ex ac o
neu o (a iba) y del ácido (abajo) de las ases acuosas de los
cul i os con Mycobac e ium gil um VM552 en la p esencia de
bioes imulan es con los picos iden i icados.........................145
Figu a IV. 5.- Repa o de enan eno desde el uel/HMN en
p esencia y ausencia del bioes imulan e oleo ílico S-200148
Figu a IV. 6.- E ec o del bioes imulan e oleo ílico (S-200) sob e
la mine alización del enan eno p esen e en el NAPL
( uel/HMN) po Mycobac e ium gil um VM552 en p esencia del
ensioac i o B ij 35.......................................................................150
Figu a IV. 7.- E ec o del bioes imulan e oleo ílico (S-200) sob e
la mine alización de enan eno p esen e en di e een es NAPLs
pu os.................................................................................................152
Figu a IV. 8.- E ec o del bioes imulan e oleo ílico (S-200) sob e
la mine alización del enan eno p esen e en uel/HMN
lib emen e, con el á ea in e acial cons an e (con cilind os) y
añadiendo di e en es nu ien es ..............................................156
Figu a IV. 9.- Sis ema adicula de Fes uca y Lolium.......157
Figu a IV. 10.- De alle de la calidad del sis ema adicula in
i o de Helian hus, Lolium y Fes uca.....................................159
Figu a IV. 11.- Desa ollo del sis ema adicula del gi asol en
una mace a con suelo con aminado.......................................163
Figu a IV. 12.- Recuen o de poblaciones del suelo
con aminado con c eoso a (mezcla, 1:1) con los di e en es
a amien os ealizados en el in e nade o………………..162
ÍNDICE DE FIGURAS
- 25 -
Figu a IV. 13.- Abundancia ela i a de los g upos ilogené icos
de las eubac e ias iden i icados en los di e en es a amien os
ealizados en in e nade o............................................ 167
Figu a IV. 14.- Mine alización de
14
C-pi eno en suspensiones
de suelo con aminado con c eoso a po bac e ias au óc onas,
en p esencia y ausencia de exudados de aíces de gi asol169
Figu a IV. 15.- Pe il del DGGE de agmen os del gen 16S
RNA ampli icados con PCR de las suspensiones de suelo
con aminado con c eoso a .........................................................172
Figu a IV. 16.- Mine alización de pi eno pu o en p esencia y
ausencia de exudados de aíces de gi asol...........................174
Figu a IV. 17.- Mine alización de pi eno y de enan eno a
una concen ación de 50 µg·mL
-1
en p esencia de 100 µg·mL
-1
de ácidos húmicos ........................................................................180
Figu a IV. 18.- Mine alización de pi eno a 50 µg·mL
-1
en
p esencia y ausencia de ácidos húmicos a 10 µg·mL
-1
Di e enciándose los siguien es a amien os: sin equilib a ,
equilib ando y en p esencia de PDMS. ..................................182
Figu a IV. 19.- Es udio de la disolución de 50 µg·L
-1
de pi eno
a 80 pm y 25ºC: A) concen ación de pi eno o al disuel o, B)
concen ación de pi eno lib e disuel o y C) concen ación de
pi eno o al con dopaje pasi o..................................................188
Figu a IV. 20.- Concen aciones lib es disuel as medidas en la
biodeg adación de pi eno en ausencia y en p esencia de 10
µg·mL
-1
de ácidos húmicos po espec o o óme o sinc ónico
de luo escencia.. ..........................................................................191
Figu a IV. 21.- Va iación de la in ensidad de luo escencia
median e espec o o óme o de luo escencia sinc ónica de las
medidas de biodeg adación en cube a de pi eno a 53.4 ng·mL
-
1
y en ausencia (A) y p esencia (B) de 10 µg·mL
-1
de ácidos
húmicos............................................................................................193
LISTA DE ACRÓNIMOS
- 32 -
PDA: Pa i ioning D i en Adminis e ing
PDMS: Polidime ilsiloxano
PRTR-España: Regis o Es a al de Emisiones y Fuen es
Con aminan es de España
SH: Sus ancias Húmicas
SPME: Mic oex acción en Fase Sólida
SW: Medio Suiza
T : Tiempos de Re ención
TSA: Aga , Soja y T ip ona
UBL: Us i ed Bounda y Laye

C
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I
In oducción
- “Los imposibles de hoy
se án posibles mañana”.
Kons an in Tsiolko sky
(1857-1935).
CAPÍTULO I: In oducción
- 34 -
CAPÍTULO I: In oducción
- 35 -
I.1. INTRODUCCIÓN
A a és del desa ollo indus ial en odo el mundo
podemos hace nos idea de la gene ación de un amplio núme o
de compues os na u ales y sin é icos pe judiciales pa a el
medio ambien e debido a negligencias ealizadas en el
a amien o de esiduos, e ede os ilegales de desechos
indus iales p o ocados al ez, po igno ancia o al a de
ecu sos y de ames acciden ales. Como consecuencia de la
p oducción de es os con aminan es, exis en nume osos si ios
que equie en una limpieza de es os esiduos an o en suelos,
como en lodos o aguas supe iciales. Sólo en Es ados Unidos
se ha calculado al ededo de 1.7 illones de dóla es in e idos
en los úl imos 30 años pa a a a es os luga es con aminados
(Yu, 2006).
Po odo ello, se ha desa ollado una conciencia social
pa a es ablece una legislación adecuada que eduzca la
p oducción de esiduos con aminan es y p e eni el escape de
los mismos al medio ci cundan e. Algunos acciden es han
supues o un ele ado impac o ambien al como el e ido de
combus ible del Exxon Valdez, la libe ación de p oduc os
adiac i os as el acciden e de la cen al nuclea de
Che nobil, la o u a de la p esa de Aznalcólla o la ca ás o e
ecológica p oducida po el e ido del pe ole o P es ige en e
a las cos as gallegas. Más ecien emen e, se ha enido
cons ancia del de ame de pe óleo de uno de los pozos de la
emp esa B i ish Pe oleum (BP) en el Gol o de México y la
c isis nuclea en la cen al de Fukushima as el e emo o y
sunami en Japón, odos es os desas es ecológicos han
pues o de mani ies o la jus i icada p eocupación y ala ma que
es os emas susci an en el conjun o de la población y lo
mucho que queda po hace pa a p e eni o esol e
adecuadamen e es e ipo de si uaciones.
El empleo de la bio ecupe ación o bio emediación, es
deci , la ecupe ación de e enos y acuí e os con aminados
median e p ocesos biológicos, en el a amien o de esiduos
pelig osos supone un concep o ela i amen e nue o que se
es á con i iendo en una endencia impo an e y de ápido
CAPÍTULO I: In oducción
- 36 -
c ecimien o den o de la legislación ambien al. Desde 1970, en
la g an mayo ía de los países indus ializados se ha enido
dando una g an impo ancia al a amien o de
emplazamien os con aminados y se ha comp obado que los
a amien os biológicos son más económicos que los
p ocedimien os químicos o ísicos (Eweis y col. , 1998).
El campo de ac uación pa a la bio emediación es
bas an e amplio. Po ejemplo, de las se ecien as cincuen a mil
ins alaciones de depósi os sub e áneos de almacenamien o
exis en es en Es ados Unidos, más de escien as mil han
enido ugas y se p oducen ap oximadamen e ein a mil
nue as emisiones cada año. Más de la mi ad de es as
ins alaciones se des inan al almacenamien o de hid oca bu os
de i ados del pe óleo, con aminan es que se han comp obado
que son biodeg adados con ela i a acilidad (Nikolaou y col. ,
2009).
Ac ualmen e no se conoce con exac i ud el núme o de
emplazamien os a ados median e bio ecupe ación. Se sabe
que en Cali o nia los depósi os de almacenamien o
sub e áneo con ugas cons i uyen la mayo uen e de
e enos y aguas sub e áneas con aminados. Has a el 1 de
ene o de 1991, se ha ubicado más de diecisie e mil de es os
depósi os (Wosika, 1991). La g an mayo ía de los
emplazamien os de los depósi os de almacenamien o
sub e áneo con ugas e an de p oduc os de i ados del
pe óleo.
La con aminación del suelo en Eu opa a ec a a casi
doscien os cincuen a mil espacios, y se espe a que con inúe
c eciendo. Se es iman ac i idades po encialmen e
con aminan es en ce ca de 3 millones de emplazamien os en
oda la Unión Eu opea (UE), muchos de los cuales es p eciso
segui in es igando pa a es ablece el daño y si se equie e la
ecupe ación del suelo (p oceso de limpieza). A pesa de los
es ue zos que se han ealizado en algunos países, pasa án
décadas pa a limpia el legado de la con aminación del suelo.
Du an e los úl imos 30 años, ap oximadamen e ochen a mil
CAPÍTULO I: In oducción
- 37 -
emplazamien os se han a ado en aquellos países que
disponen de medidas de ecupe ación (Figu a I.1).
2965
1824
246
81
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
Emplazamien os con ac i idad
po encialmen e con amian e (es imados)
Emplazamien os con aminados
po encialmen e (iden i icados)
Emplazamien os con aminados (es imados)
Emplazamien os ecupe ados
Núme o de luga es con aminados en
el año 2006 (x 1000)
Figu a I. 1.- Con aminación del suelo en Eu opa en el año 2006 (Eu opean
En i onmen Agency, 2006).
La Agencia Eu opea de Medio Ambien e (EEA, siglas en
inglés de Eu opean En i onmen Agency) p opo cionó da os
del 2006 a i mando que los con aminan es más ecuen es
encon ados en el suelo son los me ales pesados y acei es
mine ales que son ob enidos en el p oceso de e inación del
pe óleo, siendo es os úl imos jun o a los hid oca bu os
clo ados los más ecuen es en aguas sub e áneas. O os
con aminan es p esen es ue on hid oca bu os a omá icos
policíclicos (HAPs), BTEX (que es el ac ónimo de benceno,
olueno, e ilbenceno y xileno) y enoles (Figu a I.2).
37%
4%
2%
4%
6%
13%
34%
Me ales pesados
Acei es mine ales
HAPs
BTEX
Fenoles
Hid oca bu os clo ados
O os
Figu a I. 2.- Con aminan es p esen es en Eu opa en el año 2006 (Eu opean
En i onmen Agency, 2006).

CAPÍTULO I: In oducción
- 38 -
La limpieza de emplazamien os con aminados es una
ac i idad cos osa. Sin emba go, en los países donde las
es imaciones son posibles, el gas o anual sigue siendo
ela i amen e pequeño, con p omedio del 2% de los cos os
es imados necesa ios pa a la ges ión global de los espacios
con aminados. Aunque la mayo ía de los países de Eu opa
ienen una legislación pa a la ges ión de emplazamien os
con aminados, donde se aplica que "quien con amina paga",
se siguen u ilizando g andes sumas de dine o público pa a
inancia las ac i idades de emediación, con un p omedio del
35% del gas o o al. Es o se debe p incipalmen e al alcance
limi ado de la legislación, especialmen e en el caso de la
emediación de la con aminación his ó ica, donde muchos de
los esponsables de la con aminación legalmen e ya no
exis en, no pueden se iden i icados o son insol en es. Según
NICOLE (las siglas en inglés de Ne wo k o Indus ially
Con amina ed Land in Eu ope) se ha des inado pa a la
ecupe ación de zonas con aminadas a a és de los Fondos
Es uc u ales Eu opeos, un p esupues o o al de dos mil
doscien os cincuen a millones de eu os pa a los años 2005 al
2013 (Ne wo k o Indus ially Con amina ed Land in Eu ope,
2009).
Lamen ablemen e és a es una endencia común en oda
Eu opa. La p opo ción de los ondos públicos u ilizados pa a
ecupe a emplazamien os con aminados oscila en e el 100%
en la República Checa, ex República Yugosla a de Macedonia
y en España, siendo un mínimo del 7% en F ancia, donde una
g an p opo ción de los ondos p o iene del sec o p i ado
(Figu a I.3). Pe o al igual que muchos aspec os de la
in o mación del suelo, sólo los da os ap oximados sob e el
gas o público es án disponibles, mien as que la in o mación
sob e el gas o p i ado sigue siendo i egula .
CAPÍTULO I: In oducción
- 39 -
Figu a I. 3.- Asignación p esupues al del gas o público y p i ado pa a la ges ión de
de emplazamien os con aminados del año 2006 (Eu opean En i onmen Agency,
2006).
Pa a educi los gas os en la ecupe ación de suelos
con aminados, se han es ado desa ollando y mejo ando
écnicas de bio emediación. La mayo ía de los HAPs, como
po ejemplo, na aleno, enan eno, luo an eno, an aceno,
pi eno, benzo[a]an aceno y benzo[a]pi eno han sido desc i os
como una uen e ene gé ica de ca bono, o bien son
deg adados come abólicamen e po di e sos g upos de
bac e ias (Miya a y col. , 2004). La biodeg adación es una
he amien a signi ica i a pa a elimina es os con aminan es
del medio ambien e, pe o su baja disponibilidad hace que
sean necesa ios es udios cen ados en es e ac o limi an e.
I.2. HAPs: DISTRIBUCIÓN Y TOXICIDAD
Los hid oca bu os a omá icos policíclicos son
p oducidos en di e sas ope aciones indus iales a al as
empe a u as ales como el e inado de pe óleo, p oducción
de coque y conse ación de made as, ambién pueden se
sin e izados po algunas plan as o po o mación na u al
du an e uegos en bosques o p ade as. Son con aminan es
comunes en es e ipo de indus ias (Wilson y Jones, 1993) y
en e ede os incon olados de esiduos pelig osos. También
CAPÍTULO I: In oducción
- 40 -
se pueden encon a en la a mós e a, medios acuá icos, en el
suelo, en la bio a, en comidas, e c. (Ei oa y col. , 1998).
Es e g upo de compues os consis en en dos o más
anillos de benceno condensados, dispues os en di e en es
con igu aciones, pe o siemp e con la p esencia exclusi a de
ca bono e hid ógeno. Los HAPs a amen e suelen encon a se
de mane a indi idual, sino que no malmen e se encuen an
en o ma de mezclas complejas con o os hid oca bu os, lo
cual di icul a aún más su eliminación del suelo (Nikolaou y
col. , 2009). Son e modinámicamen e es ables debido a la
ene gía de esonancia asociada a la deslocalización de los
elec ones [ en los anillos bencénicos en e a o os
compues os no a omá icos (Mas and ea y col. , 2005). Es os
compues os a omá icos son el mayo cons i uyen e de la
c eoso a (al ededo del 85% es su con enido en PAHs), que es
un p oduc o ípico u ilizado en la p ese ación de la made a
(Eweis y col. , 1998) y cuyo uso y come cialización se p ohibió
en España al en a en igo la nue a no ma i a eu opea
(Di ec i a 2001/90/CE, el 30 de junio de 2003). Es a nue a
no ma i a p ohibió el uso y come cialización de made as
a adas con c eoso a po el daño que es e p oduc o puede
ocasiona an o al medio ambien e como a la salud humana.
Debido a su baja solubilidad y al a hid o obicidad, los
HAPs ienden a adhe i se a la supe icie de pa ículas como
las cons i uidas po la ma e ia o gánica del suelo, haciendo
que es os compues os engan una impo an e pe sis encia en
condiciones na u ales (Bam o h y Single on, 2005). La
adso ción de los HAPs en el suelo se e a ec ada po a ios
ac o es, de los cuales, los más impo an es son las
p opiedades del compues o con aminan e (es uc u a
molecula y solubilidad en agua) y las p opiedades del e eno
(con enido en a cillas y ma e ia o gánica, pH, humedad y
empe a u a).
O ganismos o iciales de p es igio cien í ico
in e nacional, incluyendo la Agencia de P o ección Ambien al
de los Es ados Unidos (EPA), ase e an la pelig osidad de es os
CAPÍTULO I: In oducción
- 41 -
compues os, y ecomiendan su con ol, educción y a se
posible su eliminación. Exis e una lis a con eccionada po la
EPA en la que igu an los 129 compues os o gánicos que
deben se moni o izados en los e idos indus iales y
municipales, den o de la cual hay ecogidos 16 HAPs, que
se ían los más pelig osos pa a la salud. Además, son
conside ados po la EPA, la O ganización Mundial de la Salud
(OMS) y la Comunidad Económica Eu opea (CEE), como
con aminan es p io i a ios debido a sus e ec os
ca cinogénicos. El benzo(a)pi eno es á incluido como uno de
los 12 compues os diana en una es a egia de la EPA pa a
con ola la pe sis encia y bioacumulación de con aminan es
óxicos (Renne , 1999).
En la Tabla I. 1 apa ecen las p opiedades ísico-
químicas y es uc u ales de 16 HAPs p io i a ios, donde se
obse a la disminución de la ola ilidad y la solubilidad en
agua a medida que aumen a el peso molecula (Wilson y
Jones, 1993). El aumen o del núme o de anillos hace que
es os compues os o gánicos sean menos solubles en agua y se
inc emen e su esis encia a la deg adación biológica. El
coe icien e de epa o oc anol-agua (K
ow
) es una o ma de
medi la hid o obicidad de los compues os químicos o gánicos.
Los HAPs ienen un coe icien e ela i amen e al o, lo cual
indica que ienen una a inidad mayo po las pa ículas
o gánicas del suelo que po el agua. El coe icien e de epa o
sólido-agua (K
oc
) es un ac o a ene en cuen a pa a sabe la
endencia de es os compues os a se ela i amen e inmó iles y
pe sis en es en el suelo. En gene al, los HAPs de bajo peso
molecula (como el na aleno) son más olá iles, solubles en
agua y menos lipo ílicos que los compues os de al o peso
molecula . Es as ca ac e ís icas ísicas y químicas de e minan
en g an medida su compo amien o en el ambien e.
Los HAPs de bajo peso molecula al se más olá iles, se
encuen an p incipalmen e en la ase de apo en el ai e,
donde son suscep ibles a la descomposición ( o oquímica y
é mica), lo que es inge sus iempos de esidencia en la
a mós e a a un pa de días. Los que no son deg adados, son
ans e idos a aguas supe iciales o a suelos po deposición
CAPÍTULO I: In oducción
- 48 -
- Pa a los se es humanos, La Agencia de Sus ancias Tóxicas y
Regis o de En e medades de Es ados Unidos (ATSDR po sus
siglas en inglés) explica que podemos expone nos a los HAPs
espi ando ai e con aminado si se abaja en áb icas que
p oducen coque, alqui án y as al o, plan as donde se ab ican
p oduc os ahumados y en ins alaciones donde quemen
esiduos municipales. También espi ando ai e del humo de
ciga illos, humo de made a, emisiones del ubo de escape de
au omó iles, caminos de as al o, o humo de la combus ión de
p oduc os ag ícolas, a a és del con ac o con ai e, agua o
ie a ce ca de si ios de esiduos pelig osos; comiendo ca nes
p epa adas en la pa illa, ce eales, ha ina, pan, ho alizas,
u as, alimen os en escabeche o omando leche de aca o
agua con aminadas. Las mad es que lac an y que i en ce ca
de si ios con esiduos pelig osos pueden ansmi i los HAPs a
los niños a a és de la leche (ATSDR, 1995).
El na aleno, miemb o del g upo de HAPs p io i a ios, es
un con aminan e común en el agua po able. El
en enenamien o agudo con na aleno en humanos puede da
como esul ado anemia hemolí ica y ne o oxicidad.
Adicionalmen e, se han obse ado cambios de ma ológicos y
o almológicos en abajado es expues os a na aleno en el
ambien e ocupacional. El enan eno es conocido po se un
o osensibilizado de la piel humana, un alé geno mode ado y
mu agénico pa a sis emas bac e ianos en condiciones
especí icas (Mas angelo y col. , 1996). Hay poca in o mación
disponible pa a o os HAPs como el acena eno, luo an eno y
luo eno, espec o a su oxicidad en mamí e os. Sin emba go,
la oxicidad del benzo(a)pi eno, benzo(a)an aceno,
benzo(b) luo an eno, benzo(k) luo an eno, dibenzo(a,h)-
an aceno e indeno (1,2,3-cd)pi eno ha sido muy es udiada y
exis e su icien e e idencia expe imen al pa a demos a que
son ca cinogénicos (Mas angelo y col. , 1996).

CAPÍTULO I: In oducción
- 49 -
I.3. BIORREMEDIACIÓN: CONCEPTO, TIPOS Y
FACTORES LIMITANTES
La bio emediación es una ecnología que u iliza el
po encial me abólico de mic oo ganismos deg adado es
( undamen almen e bac e ias, pe o ambién hongos y
le adu as) pa a ans o ma con aminan es o gánicos en
compues os más simples, poco o nada con aminan es, como
dióxido de ca bono, agua y biomasa celula .
Es a ecnología puede ealiza se en condiciones ae obias
y anae obias y se puede emplea pa a limpia e enos o
aguas con aminadas. En condiciones ae obias, los
mic oo ganismos deg adado es disponen de oxígeno
a mos é ico como acep o de elec ones, mien as que, en
condiciones anae obias, la ac i idad biológica es á espaldada
po la p esencia de o os acep o es de elec ones. A eces
du an e el p oceso ae obio o anae obio, los p oduc os
in e medios que se o man son menos, igual o mas óxicos
que el con aminan e o iginal de pa ida.
En e las posibles écnicas de a amien o aplicables
pa a la descon aminación de un de e minado espacio na u al,
me ecen especial a ención los p ocesos de deg adación
biológica ya que son ú iles pa a muchos ipos de esiduos
o gánicos. Son p ocesos na u ales que no suponen un
impac o adicional signi ica i o sob e los ecosis emas y que se
pueden ealiza a un bajo cos e. En muchos casos, pueden
lle a se a cabo en el si io donde se ha p oducido la
con aminación, con lo cual se elimina la necesidad de
anspo a ma e iales pelig osos.
El esul ado inal de un a amien o de bio emediación
depende en g an medida de la oxicidad y la concen ación
inicial de los con aminan es, su biodeg adabilidad, las
p opiedades del suelo con aminado y el sis ema de
a amien o seleccionado. En e los con aminan es a ados
habi ualmen e po es os mé odos se encuen an los
compues os o gánicos olá iles y semi olá iles no halogenados
CAPÍTULO I: In oducción
- 50 -
y los de i ados del pe óleo cuyos componen es p io i a ios
son los HAPs. Cuando la con aminación se debe a al as
concen aciones de me ales, compues os o gánicos con al a
p opo ción de clo o o sales ino gánicas, la e icacia del
a amien o se educe debido a la oxicidad de es os
compues os pa a los mic oo ganismos.
Como es e iden e, el p oceso biológico pa a a a los
compues os óxicos debe compe i con los mé odos exis en es
en é minos de economía y e iciencia. Los p ocesos biológicos
ienen las en ajas de eque i in e siones de capi al
mode adas, bajo consumo de ene gía, se ambien almen e
segu os y no gene a esiduos. En los úl imos años, se han
c eado una se ie de emp esas pa a desa olla y come cializa
ecnologías de biodeg adación. La exis encia de es as
compañías se jus i ica desde el pun o de is a económico po
el aumen o del cos e de los a amien os adicionales y del
echazo social a los mismos, así como po el endu ecimien o
de la no ma i a en ma e ia de esiduos y medio ambien e. El
desa ollo u u o de las écnicas de ecupe ación biológica de
espacios con aminados, equie e la adecuada in eg ación de
mic obiología molecula e ingenie ía de sis emas. El
a amien o de ecupe ación biológica ue ya ensayado a g an
escala, con mo i o de la con aminación po pe óleo
ocasionada po el e ido al ma del buque pe ole o Exxon
Valdez en Alaska (Gallego y col. , 2006).
Muchos mic oo ganismos pueden p oduci
ensioac i os, que pueden emulsiona los acei es en el agua y
acili a su eliminación. A di e encia de los ensioac i os
químicos, los de o igen mic obiológico son inocuos y
biodeg adables. También se han u ilizado, en ocasiones,
e ilizan es pa a inc emen a la asa de c ecimien o de las
poblaciones au óc onas capaces de deg ada compues os
de i ados del pe óleo, po ejemplo en el desas e ocasionado
po el pe ole o Exxon Valdez en Alaska, donde se aplica on
e ilizan es oleo ílicos como el INIPOL o el S-200, u ilizado en
es a esis, y del que se habla á más de enidamen e en el
apa ado I.7.1.
CAPÍTULO I: In oducción
- 51 -
El uso de mic oo ganismos no es á es ingido
únicamen e al a amien o de compues os o gánicos. En
algunos casos, los o ganismos seleccionados pueden ambién
educi los ca iones óxicos de los me ales pesados (como el
selenio), a la o ma elemen al menos soluble y menos óxica.
Po lo an o, el a amien o biológico puede ambién aplica se
a las aguas supe iciales con aminadas po me ales pesados.
Pa a ealiza la ecupe ación de un espacio
con aminado, podemos ealiza di e en es es a egias (Conde,
2000) que, en gene al, se pueden ag upa en es ca ego ías:
con inamien o, limpieza y es a egia de espues a.
El con inamien o iene como inalidad el aislamien o de
la uen e con aminan e, e i ando la salida de líquidos
(lixi iados), pol o o gases; es deci con olando la dispe sión
de la con aminación. Es el a amien o que se aplica
habi ualmen e en el caso de con aminaciones p o ocadas po
los e ede os incon olados de esiduos indus iales. Las
medidas que incluye gene almen e es e ipo de ac uación son:
ecub imien o, e ege ación, con ol de aguas de esco en ía
supe icial y con ol de lixi iados y aguas sub e áneas.
La limpieza incluye la aplicación de una o a ias
ecnologías pa a elimina los con aminan es del suelo. Se
dis inguen es ipos de a amien o: 1) a amien o in si u del
suelo con aminado, 2) exca ación del emplazamien o
con aminado, e i ada del suelo a ec ado y a amien o ex si u
del mismo y po úl imo, 3) exca ación, e i ada y depósi o en
e ede o con olado. En el p ime caso, la con aminación se
a a en el luga en el que se ha p oducido y en el segundo
caso hay que p ocede a una exca ación del suelo
con aminado o a un bombeo del agua con aminada an es de
p ocede a su a amien o. En gene al, el a amien o in si u
es menos cos oso y pe mi e que se u ilice el espacio du an e el
mismo, po lo que se aplica cada ez con más ecuencia a
pesa de que habi ualmen e equie e la gos pe íodos de
iempo (Roo e y col. , 1997).
CAPÍTULO I: In oducción
- 52 -
La es a egia de espues a es un a amien o a la go
plazo que incluye ac uaciones di e sas y modi icables en
unción de una p ime a e aluación de la si uación y de la
e olución de la misma du an e el a amien o. Se suele elegi
cuando las aguas sub e áneas ya se han con aminado. Las
aguas con aminadas pueden a a se median e: a) ex acción
po bombeo seguida de a amien o en el p opio
emplazamien o, po écnicas con encionales aplicables a
aguas esiduales indus iales, b) a amien o in si u median e
mu os de a amien o y c) dilución o des ío de la
con aminación, median e inyección de agua limpia u ilizando
sis emas de pozos.
Los mé odos exis en es pa a a a los suelos
con aminados pueden se de na u aleza ísica, química o
biológica y an o unos como o os pueden aplica se en el luga
de la con aminación o como a amien o ex si u, e abla I. 4.
Tabla I. 4.- Clasi icación de las di e en es écnicas empleadas pa a a a los suelos
con aminados, ag upadas según su na u aleza y o ma de aplicación.
T a amien os in si u T a amien os ex si u
– Fisicoquímicos:
a) Ex acción con apo
b) La ado
c) Solidi icación y es abilización
d) Sepa ación elec ociné ica
– Biológicos:
a) Bio emediación
b) Fi o emediación
– Té micos:
a) Deso ción é mica
b) Incine ación
– Fisicoquímicos:
a) Ex acción con disol en es
b) La ado
c) Oxido- educción
d) Deshalogenación química
e) Solidi icación y es abilización
– Biológicos:
a) Labo eo ag ícola
b) Biopilas
c) Biodeg adación en eac o
El obje i o de las écnicas de bio ecupe ación es la
c eación de las condiciones ambien ales óp imas pa a que los
mic oo ganismos se puedan desa olla adecuadamen e y
CAPÍTULO I: In oducción
- 53 -
p o oca la máxima descon aminación.La ecnología especí ica
empleada en cada caso depende del ipo de mic oo ganismos
de que se a e, de las condiciones del espacio con aminado y
de la na u aleza y can idad de con aminan e o con aminan es.
Dis in os mic oo ganismos deg adan di e en es ipos de
compues os y sob e i en en di e en es condiciones.
Debemos ecalca que el a amien o in si u no equie e
exca a y e i a el suelo con aminado, po lo cual p o oca
una meno libe ación de pol o y con aminan es, pe mi iendo
descon amina un olumen mayo de suelo po a amien o
que las écnicas ex si u. En es e caso, el p opio suelo unciona
como un eac o biológico. Tiene o os incon enien es como
mayo len i ud, di icul ad de man ene las condiciones y
dependencia del ipo de suelos, que deben se pe meables si
se quie e asegu a un buen endimien o del p oceso.
Pa a palia los incon enien es e e idos a la len i ud del
a amien o in si u se han desa ollado écnicas como
bioes imulación o bioaumen o, las cuales se de ini án a
con inuación pe o an es se debe de ini qué es la a enuación
na u al o bio emediación in ínseca:
• La a enuación na u al o bio emediación in ínseca
se lle a a cabo po mic oo ganismos au óc onos,
p incipalmen e bac e ias del medio a ec ado que u ilizan
los nu ien es y acep o es de elec ones del medio, que
c ecen mine alizando y come abolizando los
con aminan es has a su desapa ición. Tiene una
en aja e iden e que es su bajo cos e pe o necesi a una
e aluación p e ia del iesgo. La bio emediación
in ínseca puede eque i que la uen e de
con aminación sea, en p ime luga , ex aída pa a
p e eni una en ada adicional y que se ex ienda po los
al ededo es o que exis a algún sis ema que p e enga la
mig ación de una pluma de con aminación en un
acuí e o. Se necesi a un p og ama de moni o ización a
la go plazo pa a con i ma que la biodeg adación se es á
ealizando co ec amen e y que no se es á p oduciendo
el desplazamien o de los con aminan es. Es e p og ama

CAPÍTULO I: In oducción
- 54 -
puede conlle a medidas de con aminan es pa a
demos a la ac i idad mic obiana, pa a mos a que los
ni eles de O
2
o ni a os disuel os son meno es que la
concen ación inicial de ondo o que los p oduc os de
bio emediación es án apa eciendo.
• Bioaumen o. Consis e en in oduci mic oo ganismos
no au óc onos en el medio a descon amina con el in de
mejo a la biodeg adación. No obs an e, es udios
ecien es han demos ado que la adición de una mezcla
come cial de mic oo ganismos deg adado es de
con aminan es o cul i os en iquecidos po
mic oo ganismos au óc onos no aumen a
necesa iamen e la asa de biodeg adación en el medio
na u al po encima de la log ada median e la adición de
nu ien es (bioes imulación). Los mic oo ganismos no
au óc onos pa ecen no se capaces de compe i con la
mic o lo a na u al ya que las condiciones ambien ales
son dis in as y di icul an su adap ación al medio donde
los mic oo ganismos indígenas es án pe ec amen e
aclima ados (Lee y Me lin, 1999). Exis en en el me cado
p oduc os come ciales, ensayados en el labo a o io que
eúnen mic oo ganismos con g an po encial
biodeg adado , pe o la ein oducción de
mic oo ganismos au óc onos, aislados del sis ema
con aminado y cul i ados pos e io men e, es más
e ec i a, especialmen e cuando se acompaña de un
suplemen o nu icional y oxígeno.
• La bioes imulación adica en la in oducción de
modi icaciones en el medio, median e el apo e de
nu ien es, ai eación y o os p ocesos. En ocasiones
se á su icien e añadi oxígeno median e ai eación,
aunque en o os casos se pod ía eque i la adición de
nu ien es o ajus es de pH. En odo caso es as
ap oximaciones son álidas siemp e y cuando los
mic oo ganismos au óc onos sean capaces de deg ada
el con aminan e as un p oceso más o menos la go de
aclima ación p e ia (Nikolopoulou y Kaloge akis, 2008).
CAPÍTULO I: In oducción
- 55 -
En lo que se e ie e a la adición de nu ien es, la
bio emediación equie e que és os en en en con ac o con el
á ea con aminada y que su concen ación sea su icien e pa a
sopo a el c ecimien o máximo p e is o de la población
deg adado a en el anscu so de las ope aciones de
emediación.
Es udios expe imen ales han demos ado que el uso de
e ilizan es de libe ación len a de ni ógeno y ós o o o ece
una sólida al e na i a pa a comba i los de ames de pe óleo
en el medio ambien e y de ini la elación óp ima de
bio emediación de ca bono, ni ógeno y ós o o, 100:10:1
(Leys y col., 2005).
En cuan o a los ac o es que a ec an a la
bio emediación de los HAPs, se conoce que exis en muchos
ejemplos que consiguen el éxi o en la aplicación de ecnologías
de bio emediación pa a descon amina si ios usando
mé odos como el compos aje o biopilas. Muchos es udios
publicados han in es igado la e icacia de la bio emediación a
pequeña escala y bajo condiciones ideales en el labo a o io
ales como a pH neu o y empe a u as meso ílicas (en e
25ºC y 45ºC). No obs an e, es á cla o que los ac o es
ambien ales que a ían de un si io a o o, ales como el pH del
suelo, la disponibilidad de los nu ien es y de los
con aminan es, pueden a ec a los p ocesos de
bio emediación, inhibiendo el c ecimien o de los
mic oo ganismos deg adado es. Los p incipales ac o es que
in e ienen en la iabilidad de la bio emediación son:
Tempe a u a: Tiene un conside able e ec o sob e la
capacidad de los mic oo ganismos pa a deg ada los HAPs in
si u. En gene al, la mayo ía de los luga es con aminados no
ienen una empe a u a óp ima du an e odo el año. La
solubilidad de los HAPs aumen a con la empe a u a, así
como la biodisponibilidad de las moléculas de HAPs. Además,
la solubilidad del oxígeno disminuye con el aumen o de la
empe a u a, lo que educe la ac i idad me abólica de los
mic oo ganismos ae obios (Bam o h y Single on, 2005).
CAPÍTULO I: In oducción
- 56 -
La biodeg adación de HAPs puede ocu i en un amplio
ango de empe a u as. En la mayo ía de los es udios hay una
endencia a cen a se en empe a u as meso ílicas (en e 25 y
35ºC) po que la mayo ía de los mic oo ganismos del suelo
p esen an su ac i idad óp ima en es e in e alo de
empe a u a.
pH: Se ha demos ado que el p oceso de mine alización
de los hid oca bu os es más ápido a alo es de pH
comp endidos en e 6.5 y 8.0. El ajus e del pH en suelos
ácidos y alcalinos den o de es e ango hace que aumen e la
asa de deg adación po los mic oo ganismos (Mo gan y
Wa kinson, 1989b). El pH in luye además en la solubilidad de
ós o o, que es uno de los nu ien es de especial impo ancia
pa a el desa ollo mic obiológico, y ambién a ec a en la
solubilización y anspo e de me ales pesados en el suelo.
Humedad: Cuando el con enido de agua en suelo se
encuen a en e un 50% y 80% de la capacidad de campo, la
ac i idad mic obiológica es gene almen e óp ima. Los po os
exis en es en el suelo húmedo ienen poco o ningún espacio
pa a los gases, gene ándose condiciones anae obias. Los
hid oca bu os de i ados del pe óleo ienden a dis ibui se en
la ase sólida del suelo, po lo que en la ase acuosa hab á
unas concen aciones de con aminan es muy bajas. Debido a
que los mic oo ganismos oman nu ien es de la ase líquida,
la asa de bio emediación puede e se limi ada po la
elocidad con que se p oduce la deso ción, po lo que el agua
debe de es a en con ac o con los con aminan es y en
can idades que pe mi an el desa ollo de las comunidades
mic obianas (Mo gan y Wa kinson, 1989a). Los alo es de
humedad óp ima pa a la bio emediación de e enos no
sa u ados es án comp endidos en e 150 y 250 g amos de
agua/kg de e eno seco. En la bio emediación de acuí e os
con aminados, el mayo p oblema se debe al suminis o de
oxígeno a causa de su baja solubilidad en el agua (7.5 y 9
mg·L
-1
en aguas sub e áneas).
CAPÍTULO I: In oducción
- 57 -
El oxígeno es, en gene al, el acep o de elec ones más
empleado en la espi ación mic obiana. Pa a los e enos no
sa u ados, el suminis o de oxígeno no cons i uye un
p oblema pe o su baja solubilidad en agua y la he e ogeneidad
de los acuí e os hacen que el anspo e del oxígeno a a és
de las zonas con aminadas sea muy di ícil. Exis en o os
acep o es de elec ones más áciles de suminis a como son
ni a os, ni i os, sul a os, Fe(III) y CO
2
.
Nu ien es: Además de deg ada ácilmen e las uen es
de ca bono, los mic oo ganismos equie en nu ien es ales
como ni ógeno, ós o o y po asio pa a su me abolismo celula
y su c ecimien o. En las zonas con aminadas donde los
ni eles de ca bono o gánico son al os debido a la na u aleza
del con aminan e, la disponibilidad de los nu ien es puede
llega a ago a se ápidamen e du an e el me abolismo
mic obiológico. Pa a e i a es e ago amien o, se puede añadi
un suplemen o de nu ien es pa a es imula la comunidad
bac e iana y aumen a la bio emediación in si u. Se u iliza
gene almen e una elación mola C:N:P de 100:10:1 pa a la
bio emediación de suelos (Gallego y col. , 2006).
Concen ación de los con aminan es: Se conoce que
los HAPs ienen una g an a inidad po la ase sólida del suelo
an o a a cillas como a la ma e ia o gánica, dando como
esul ado una baja concen ación de es os compues os en la
ase acuosa del suelo. De es a mane a se puede conside a un
ac o limi an e ya que al se an baja es a concen ación de
con aminan es en la ase acuosa, no pod á sopo a el
c ecimien o y desa ollo de una población mic obiana capaz
de me aboliza lo. Mien as que si nos encon amos en una
si uación con al as concen aciones de con aminan e en la
ase acuosa del suelo puede que no se p oduzca
biodeg adación po pa e de los mic oo ganismos debido a que
es a al a concen ación les p o oque un e ec o de oxicidad.
CAPÍTULO I: In oducción
- 64 -
débil/ e e siblemen e). Cuando los mic oo ganismos
cap an la concen ación de COH lib emen e disuel a,
es a concen ación disminuye e inmedia amen e es
epues a po la acción de COH que es aba so bida
débil y e e siblemen e. De es a mane a, la acción
ápidamen e deso bida puede ep esen a mejo esa
can idad que es accesible a un o ganismo en una escala
de iempo ele an e, mien as que la acción de COH
que es á ue emen e so bida al suelo o sedimen o
gene almen e no se conside a bioaccesible.
• Ac i idad química. Es el po encial que posee un
compues o pa a expe imen a p ocesos espon áneos
ales como di usión y epa o. Es á elacionada con la
ue za de so ción de los COHs. Una ue e so ción
implica una disminución de la ac i idad química y po
an o una disminución en la biodisponibilidad de los
COHs. En ma ices ambien ales, los COHs se mue en
desde á eas de al a ac i idad química hacia á eas de
baja ac i idad, has a alcanza el equilib io. En el
equilib io la ac i idad química es la misma en cada
compa imen o de una ma iz (po ejemplo, en
pa ículas sólidas, ma e ia o gánica disuel a, ase
acuosa, bio a, e c) (Di o o y col. , 1991). De es a
mane a, las concen aciones de COH en el equilib io
pa a cada compa imen o, incluyendo la bio a, son
p opo cionales en e sí. Si la elación en e las ases se
conoce, la acción de COH en una ase se puede u iliza
jun o a un ap opiado ac o de co ección (como K
oc
)
pa a es ima la acción en la o a ase. Es o es la base
de la Teo ía de epa o en el equilib io que ue
p opues a o iginalmen e como mé odo de medi la
biodisponibilidad po Shea (1988), Di o o y col., (1991).
En de ini i a, la biodisponibilidad depende de a ios
ac o es, donde se incluyen las p opiedades del suelo o los
sedimen os (como po ejemplo, el con enido de ca bono
o gánico, el con enido de ca bono neg o conocido como “black
ca bon”, su composición ísica y química, e c), las p opiedades

CAPÍTULO I: In oducción
- 65 -
del con aminan e (como po ejemplo su solubilidad en agua,
K
oc
, la o ma de su molécula, e c), el iempo de con ac o en e
el con aminan e y el suelo o sedimen o y la u a de cap u a
den o del o ganismo.
I.6. MÉTODOS DE REPARTO DE HAPs
EMPLEANDO POLIDIMETILSILOXANO
Debido a su na u aleza hid o óbica, el epa o de
hid oca bu os a omá icos policíclicos (HAPs) se ealiza con
acilidad en ases o gánicas sólidas ó líquidas, exis iendo en la
ase acuosa sólo a concen aciones limi adas. Es o hace que la
deg adación de HAPs po las células bac e ianas sea di ícil. En
cul i os de bac e ias deg adado as donde sólo u ilizan los
compues os disuel os en medios acuosos, la ans e encia de
masa o la elocidad de deso ción con olan las asas de
c ecimien o y deg adación (Alexande , 1999). El uso
combinado de la bio emediación con o as ecnologías de
emediación de suelos, como el uso de elec o emediación
(Niqui-A oyo y col. , 2006; Niqui-A oyo y O ega-Cal o,
2007; Niqui-A oyo y O ega-Cal o, 2010), la aplicación de
biosu ac an es (Ga cia-Junco y col. , 2001; Ga cia-Junco y
col. , 2003) o la adición de bioes imulan es pa a suelos
con aminados con HAPs (Gallego y col. , 2007; Tejeda-
Ag edano y col. , 2011), pueden ayuda a supe a es a
limi ación, lo que aumen a la e icacia de la bio emediación
como una opción de a amien o.
El des ino y anspo e de los con aminan es o gánicos
hid o óbicos pueden se in luidos no ablemen e po los
p ocesos de so ción. La cues ión de si la so ción inhibe la
biodisponibilidad de los con aminan es o gánicos es de g an
impo ancia pa a el éxi o de la bio emediación an o de
suelos como de acuí e os.
Las concen aciones biodisponibles de COHs en medios
acuosos, a menudo dec ecen como esul ado de p ocesos de
(bio)so ción, ola ilización o deg adación. Pa a man ene
cons an e la exposición de ni eles de es os con aminan es en
CAPÍTULO I: In oducción
- 66 -
medios acuosos se in odujo el epa o adminis ado conocido
como “pa i ioning d i en adminis e ing” (PDA, Figu a I.6),
cuyo p incipio consis e en con ola las concen aciones
disuel as de es os con aminan es median e epa o desde una
ase sólida dominan e (Maye y col. , 1999).
Figu a I. 6.- Esquema de un sis ema con a ias ases. El PDA con ola las
concen aciones disuel as de los HAPs con a una se ie de p ocesos de educción
deg ada i os (líneas discon inuas) y no deg ada i os (líneas con inuas) median e
epa o desde una ase sólida dominan e (Va ian e del esquema de Maye y col.,
1999).
Basados en es e p incipio se desa olla on nue os
mé odos pa a de e mina la ans e encia de masa po
di usión median e mic ocáma as y medi de la capacidad de
solubilización de medios acuosos (dopaje pasi o) u ilizando
polidime ilsiloxano como ase sólida dominan e en ambos
mé odos:
a) Es udio de la ans e encia de masa de
con aminan es median e di usión. Debido a las
p opiedades hid ó obas de los HAPs, las concen aciones de
es os con aminan es se encuen an gene almen e a meno es
ó denes de magni ud en el medio acuoso que en pa ículas del
suelo, de sedimen os o en o ganismos acuá icos. Es o iene
CAPÍTULO I: In oducción
- 67 -
impo an es implicaciones pa a su in e cambio po di usión
en e dis in os compa imen os ambien ales, donde una ina
película acuosa puede ac ua como una ba e a e icaz pa a la
ans e encia de masa po di usión (Maye y col. , 2005)
(Figu a I.7).
Figu a I. 7.- Esquema ep esen a i o de la o mación de la capa de di usión
limi an e (UBL) en e la uen e de con aminación y los mic oo ganismos en un
medio acuoso. El anspo e de los con aminan es se p oduci ía desde la uen e
de con aminación hacia los mic oo ganismos a a és de la capa de di usión
limi an e (Maye y col. , 2005).
La di usión molecula de es os con aminan es a a és
de es as capas limi an es conocidas como Uns i ed bounda y
laye s (UBL)" a menudo cons i uye el paso limi an e de su
deso ción desde ma ices del suelo y de sedimen os, así como
pa a su cap ación po los o ganismos (Johnsen y Ka lson,
2004). La p ime a ley de Fick de la di usión es di ec amen e
aplicable pa a desc ibi una ans e encia de masa median e
di usión a a és de UBLs homogéneos. También puede
aplica se en modelos que desc iben anspo e po di usión a
a és de medios he e ogéneos y el in e cambio median e
di usión en las in e ases. Sin emba go, es os modelos
gene almen e se basan en supues os (como po ejemplo, que
el anspo e se limi a po la di usión de moléculas disuel as
lib emen e) que pueden se bas an e di íciles de con i ma po
a a con p oduc os químicos o gánicos hid o óbicos (Wells y
col., 2004). Es o hace que la de e minación di ec a de la
CAPÍTULO I: In oducción
- 68 -
ans e encia de masa po di usión a a és de una UBL enga
an a impo ancia.
Pa a medi la elocidad de di usión de los
con aminan es en un medio, se u iliza on unas mic ocáma as
que consis ían en dos discos de polidime ilsiloxano (PDMS),
uno de ellos limpio y el o o donde se ija el con aminan e
hid ó obo en es udio (HAPs). La ans e encia de masa del
disco con aminado (que se ía la uen e de con aminación en la
Figu a I.7) al disco limpio (que se ía la bac e ia) se ealiza a
una dis ancia de 100 µm de cada uno. El medio que se coloca
en e ambos discos, es el ac o a iable de es e diseño
expe imen al ya que dependiendo de las ca ac e ís icas del
medio se ob end á una mayo o meno di usión de los
con aminan es.
El undamen o básico de es e sis ema expe imen al
consis e en e la ans e encia de las moléculas HAPs desde
el disco con aminado al disco limpio que equie e 3 pasos
(Figu a I.8):
1.- Repa o de las moléculas de HAPs en la in e ase
en e el disco con aminado y el medio, el cual es á gobe nado
po el coe icien e de epa o K
PDMS,Medio
.
MedioPDMS
Con
Medio
K
C
C
,
=
2.- Di usión de las moléculas de HAPs (di usión linea ) a
a és del medio, que es unción del g adien e de
concen ación (∆C/ ∆x) y del coe icien e de di usión (D).
x
CD
lujoDi usión ∆
∆
×
−=,
3.- El epa o de las moléculas de HAPs en la in e ase
en e el medio y el disco limpio es á gobe nado po K
PDMS,Medio
.
La ans e encia de masa po di usión del disco con aminado
al disco limpio se con ola midiendo el con enido de los HAPs
que quedan en el disco con aminado y los que han pasado al
disco limpio po unidad de iempo. La cons an e de elocidad
K (s
-1
) se ajus a a los da os medidos.
MedioPDMS
Lim
Medio K
C
C
,
=
.
CAPÍTULO I: In oducción
- 69 -
Figu a I. 8.- Esquema de los 3 pasos en el p oceso de di usión de los PAHs en las
mic ocáma as desde el disco con aminado al disco sin HAPs (Maye y col. , 2005).
La acción de HAPs p esen e en el medio es
desp eciable: V
PDMS
> V
Medio
y K
PDMS,Medio
>>1.
Los HAPs es án homogéneamen e dis ibuidos en el
disco de PDMS debido a la pe meabilidad especialmen e al a
de es e políme o. Como consecuencia, los dos discos imponen
un g adien e lineal de ac i idad química (o ugacidad) en la
UBL, es as capas limi an es de la di usión (UBLs) ac úan a
menudo como un cuello de bo ella pa a el anspo e po
di usión de compues os o gánicos hid o óbicos (COHs),
cons i uyendo a menudo un paso limi an e an o pa a su
cap ación desde el suelo o ma ices de sedimen os, como pa a
su cap ación po los o ganismos. La ans e encia de masa
po di usión de COHs a a és de UBLs se puede aumen a
po la p esencia de medios que no malmen e son
conside ados pa a educi la cap ación di usa.
Bajo el supues o de que oda la uga de masa química
del disco con aminado se ecupe a en el disco limpio y que la
masa p esen e en e la ina capa es insigni ican e, el balance
de masa del sis ema puede se desc i o po :

CAPÍTULO I: In oducción
- 70 -
LimCon
Con
amam
d
dm +−= (1)
Donde m
Con
y m
Lim
son la masa (kg) en el disco
con aminado y limpio espec i amen e y a es la cons an e de
la asa de elocidad (s
-1
). Usando el supues o de que un
balance de masa ce ado p oduce una condición de sime ía
m
Lim
=m
0
–m
Con
, donde m
Con
y m
Lim
son la masa del disco
con aminado y limpio espec i amen e, al iempo y m
0
es la
masa inicial (en el disco con aminado). De es a mane a, la
solución analí ica de la ecuación 1, nos da:
(
)
(
)
( )
a
LimLim
e
C
C
m
m
2
00
1%50
−
−⋅==
(2)
En analogía a la p ime a Ley de di usión de Fick, se
puede exp esa la ecuación 2 como:
C
x
DK
V
A
d
dC
lib e
∆
∆
×
=·· (3)
Donde
LimCon
CCC −=∆ , A es el á ea supe icial e ec i a
(m
2
), V es el olumen del disco (m
3
),
∆
x es el espeso de la
capa (m), K es el coe icien e de epa o en e la solución en la
capa de di usión y el políme o
MedioPDMS
PDMSMedio
K
K
,
,
1
=
y D es el
coe icien e de di usión (m
2
·s
-1
). La asa de elocidad cons an e
a (s
-1
) de an es puede se iden i icada como:
MedioPDMS
K
D
xV
A
a
,
·
∆×
=
(4)
La cons an e de asa de elocidad a desc ibe la ciné ica
del sis ema y es p opo cional al lujo de di usión. También
es á linealmen e elacionada con o os pa áme os de di usión
es ablecidos: [1] el p oduc o
,DK
×
ambién pa a conoce la
pe meabilidad (P) o conduc i idad g (m·s
-1
), y [2] el coe icien e
de ans e encia de anspo e po di usión en los modelos de
ugacidad (po ejemplo, en el mol·año
-1
·Pa
-1
). Es o es á en
CAPÍTULO I: In oducción
- 71 -
con as e con las cáma as de di usión clásica, que ienen po
obje o la de e minación del coe icien e de di usión (D).
Los olúmenes de los dos discos, V
Con aminado
y V
Limpio
,
se man ienen cons an e, así como la supe icie pa a el
in e cambio A y el espeso de la película ∆x. Cualquie
di e encia en la cons an e de la asa de elocidad a en los dos
medios i y j se a ibuyen únicamen e al p oduc o
:DK
×
j
i
ij
j
i
D
D
K
a
a×=
(5)
Donde K
ij
es el coe icien e de epa o en e el medio i y
el medio j, D es el coe icien e de di usión pa a el medio i y
pa a el medio j y a
i
/a
j
es la elación en e elocidades que
desc ibe una conduc i idad ela i a pa a la ans e encia de
masa po di usión. Po ejemplo, el lujo desconocido de HAPs a
a és del medio i puede exp esa se como el lujo de es os
HAPs a a és del medio j, mul iplicado po la elación en e
las cons an es de elocidad medidas a
i
/a
j
.
b) Es udio de la capacidad de solubilización de
con aminan es en un medio de e minado median e
dopaje pasi o. La silicona o mada po polidime ilsiloxano
(PDMS) ha sido ampliamen e u ilizada como un ma e ial
común de ecub imien o pa a la mic oex acción en ase
sólida (SPME). Es a écnica ha sido empleada pa a medi
concen aciones de anali os disuel os lib emen e y pa a
es udios de especiación, como po ejemplo: pa a medi
p o eínas unidas a óxicos y a d ogas (Vaes y col. , 1996;
Mus ea a y col. , 2006), ácidos húmicos unidos a
con aminan es medio ambien ales (Poe schmann y col. , 1997;
Lu zho y col. , 2000) y complejos de inclusión en e
compues os a omá icos y β-ciclodex inas (Chalumo y col. ,
2009). SPME ue in oducida po A hu and Pawliszyn en
1990 (Reichenbe g y col. , 2008) y su o ma o esul a muy
a ac i o pa a los disposi i os de mues eo en el equilib io (o
ambién conocidos como Equilib ium Sampling De ice, ESD)
po que la ase de mues eo es un olumen pequeño (µL) del
CAPÍTULO I: In oducción
- 72 -
políme o con un á ea supe icial ela i amen e g ande. La
mic o-ex acción se gene a po di usión molecula a a és de
la supe icie, la cual es á impulsada po la ac i idad química
del anali o en la mues a y, de es a mane a, la concen ación
esul a medible en el políme o.
SPME es un mé odo pode oso y e icaz pe o que no se
encuen a exen o de p oblemas y limi aciones como la
di icul ad de llega al equilib io en un pe íodo de iempo
p ác ico, que el con enido de los HAPs en el políme o no sea
meno que el con enido de PAHs de la mues a, la adso ción a
la supe icie del políme o debe se insigni ican e po que la
ugacidad y la ac i idad química sólo son p opo cionales a la
abso ción (disolución) de concen ación den o del políme o o
asumi que se cumple el balance de masas sin que exis a
pé didas an o en la ijación como en la ex acción de los
anali os en el políme o. Po es a causa, se ha desa ollado un
nue o mé odo analí ico conocido como dopaje pasi o (passi e
dosing) donde se p oduce la libe ación de los anali os desde
un políme o (Figu a I.9) en luga de hace un mues eo
con inuo po di usión como se hace con SPME. Es e mé odo
se basa en los p incipios de dopaje pasi o desa ollados pa a
el con ol de la concen ación lib e disuel a en ensayos de
oxicidad.
Figu a I. 9.- Fundamen o de la écnica de dopaje pasi o: A) Los anali os disuel os
en me anol se ijan en la silicona o mada po polidime ilsiloxano (PDMS) en menos
de una ho a, B) equilib io alcanzado con agua donde se con ola la concen ación
lib e disuel a de los anali os y C) equilib io alcanzado con la mues a donde se
mide la concen ación o al del anali o (lib e y unida a la ma e ia o gánica disuel a,
MOD) (Modi icación del esquema de Bi ch y col, 2010).
CAPÍTULO I: In oducción
- 73 -
El p ime paso en es e mé odo nue o es con ola la
concen ación de anali o lib e disuel o o ac i idad química po
epa o en el equilib io desde un políme o ca gado con el
con aminan e p e iamen e en iales o almen e ce ados
e i ando pé didas a a és de la silicona.
El segundo paso es medi la concen ación o al del
anali o en la mues a una ez alcanzado el equilib io,
median e la écnica analí ica elegida. La concen ación medida
en la mues a puede combina se con el co espondien e
epa o en el equilib io con agua pu a con el in de ob ene :
•
La acción lib e de anali o en la mues a
(
mues a
agua
C
C
FL =
).
•
El aumen o de la capacidad (
agua
mues a
C
C
AC =
, donde
lib eagua
CC =) que cuan i ica la capacidad de disolución de
un medio pa a los HAPs con espec o al agua, siendo el
dopaje pasi o una buena he amien a pa a es udia la
especiación de HAPs en mues as acuosas.
•
Los alo es de las asas de epa o K
DOC
y K
D
(
1·
+=
CODCOD
CKAC , donde K
COD
es la asa de epa o
pa a el ca bono o gánico disuel o y C
COD
es la
concen ación de ca bono o gánico disuel o)(Bi ch y col.
, 2010).
Con es e nue o mé odo se consigue con ola la
concen ación lib e disuel a de cada componen e en mezclas
de HAPs, se e i an sepa aciones de ases, no se necesi a
asumi hipó esis de balance de masas, se equie e un pe íodo
co o de equilib io e modinámico, es un mé odo p eciso con
una des iación es ánda del 3%, se educen los p oblemas
que se ocasionan con la SPME, se calculan cons an es de
epa o con eg esiones lineales simples, se puede medi el
aumen o de la capacidad (AC) pa a cuan i ica la capacidad de
CAPÍTULO I: In oducción
- 80 -
azúca es, polisacá idos, aminoácidos, ácidos o gánicos,
i aminas, aninos, alcaloides, es e oles, enzimas, ac o es de
c ecimien o, ensioac i os, la onones, nucleó idos, e c. Todos
ellos p opo cionan una uen e ica de de nu ien es pa a las
poblaciones mic obianas en al izos e a (Pin on y col. , 2007).
De hecho, los compues os de i ados de la izodeposición
(libe ación de compues os o gánicos desde la aíz al suelo)
ales como exudados, mucílagos y es os de aíz po
desp endimien o de ejidos y células mue as, ep esen an
en e el 8 y el 86% del ca bono ne o anual ijado po
o osín esis (Meng y Zhu, 2011). De es os compues os se
es ima que los exudados cons i uyen en e el 40 y 90% (Lynch
y Whipps, 1990; Pin on y col. , 2007), los cuales pueden
p opo ciona ca bono y ene gía su icien es pa a man ene un
g an núme o de mic oo ganismos, al ededo de 10
8
-10
9
mic oo ganismos asociados a la izos e a po g amo de suelo
(E ickson y col., 1995). Debido a la p esencia de es os
exudados, las poblaciones y ac i idades mic obianas son del
o den de 5 a 100 eces mayo en la izos e a que en la mayo
pa e del suelo. (Ande son y col., 1993; Gun he y col., 1996).
Es os conso cios mic obianos, a su ez pueden o ece a
las plan as di e sos bene icios como la sec eción de quelan es
pa a aumen a la disponibilidad de mine ales y su mejo
abso ción po la aíz, p o ección con a pa ógenos pa a la
plan a y deg adación de los con aminan es an es de que
puedan in lui nega i amen e en el ege al.
El éxi o de la izo emediación depende en g an medida
de la capacidad de los mic oo ganismos deg adado es de los
con aminan es p esen es en el suelo pa a descon amina , así
como del c ecimien o de las plan as que impulsan a los
mic oo ganismos a coloniza e icien emen e las aíces. La
quimio axis hacia compues os especí icos de los exudados de
aíz puede se la cla e pa a la colonización e icien e de las
aíces aunque la espues a quimio ác ica puede se p o ocada
po di e en es compues os en unción de la especie
colonizado a (de Wee y col., 2002; Kuipe y col., 2002).
O ega-Cal o y col., (2003) demos a on que se p oducía

CAPÍTULO I: In oducción
- 81 -
quimio axis hacia na aleno, enan eno y exudados de aíz en
bac e ias de la izos e a deg adado as de HAPs.
Cabe des aca que algunas especies de plan as pueden
aumen a el núme o de deg adado es en un g an olumen de
suelo que se ex iende más allá de la izos e a (Siciliano y col.,
2003; Leigh y col., 2006). Aunque la izo emediación ocu e
de o ma na u al, ambién se puede op imiza , median e la
manipulación delibe ada de la izos e a. Es o se puede log a
median e el uso adecuado del pa plan a-mic oo ganismo.
Es as combinaciones pueden se plan as y izobac e ias
p omo o as del c ecimien o de las plan as (Plan G ow h
P omo ing Rhizobac e ia, PGPR) o plan as y mic oo ganismos
deg adado es de con aminan es. Po ejemplo, una especie de
césped combinada con un mic oo ganismo deg adado de
na aleno que p o ege la semilla del césped de los e ec os
óxicos del na aleno, el c ecimien o de las aíces impulsa a
las bac e ias deg adado as de na aleno en el suelo, el cual
pod ía habe es ado p o undamen e dis ibuido en el suelo
como pa a pode lo deg ada en ausencia de aíces (Kuipe y
col., 2004).
Asimismo, las plan as p o ocan la mo ilización de los
HAPs en el suelo, dando luga a su acumulación, en una
o ma más biodisponible, en zonas p óximas a las aíces,
posiblemen e median e el e ec o combinado del lujo de agua a
a és de las aíces y la pseudosolubilización de los HAPs po
compues os o gánicos de i ados de la plan a (Lis e y
Alexande , 2000a; Lis e y Alexande , 2000b).
Se conoce muy poco sob e la idoneidad de la especie de
plan a a u iliza en un p oceso de i o emediación de HAPs.
Si bien la mayo pa e de los es udios se han ealizado con
especies he báceas (Ap ill y Sims, 1990; Bine y col. , 2000;
Miya y Fi es one, 2000), posiblemen e po su ácil manejo en
el labo a o io, especies del géne o Pinus (P. banksiana, P.
esinosa, P. s obus y P. syl es is) son ambién capaces de
es imula la biodeg adación de HAPs en el suelo (Heinonsalo y
col. , 2000; Lis e y Alexande , 2000b). Cla amen e, la plan a a
u iliza debe se capaz de c ece en p esencia de los
CAPÍTULO I: In oducción
- 82 -
con aminan es, y deben ole a condiciones locales, ales
como d enaje limi ado o concen aciones al as de sal. O as
p opiedades deseables incluyen c ecimien o ápido, que sea
pe enne, y que posea un sis ema adicula p o undo y denso
(Alexande , 1999). Es a úl ima p opiedad es ele an e en el
caso de con aminan es si uados a cie a p o undidad en el
suelo, y añade in e és al es udio de especies o es ales, donde
exis e una in o mación muy escasa.
En e las especies es udiadas en la i o emediación de
HAPs, esul a de especial in e és, de ca a a es a Tesis Doc o al
las que, apa e de ene las ca ac e ís icas an e io es,
cumplan los dos c i e ios siguien es: a) una buena adap ación
a las zonas medi e áneas con una con as ada u ilidad en
i o emediación de suelos con aminados po HAPs y b)
exis encia de p o ocolos de p opagación, an o sexuales como
agámicos, e icaces pa a su ge minación y desa ollo en suelos
con aminados po HAPs, así como pa a la p opagación clonal
pos e io . Es as dos condiciones las cumplen, en e o as,
Fes uca a undinácea Sch eb; Lolium pe enne, L. y el gi asol
Helian hus annuus, L.
Fes uca a undinacea. Sch eb. Pe enece a la amilia
de las Poaceas y se conoce ulga men e como es uca al a,
i e en juncales, ibe as de íos, lagos, a oyos y pas os. Es a
plan a pe enne se ha usado ampliamen e en la
i o emediación de HAPs y se ha cons a ado su éxi o en la
sup esión de a ios de es os compues os (Shann y Boyle,
1994; Cunningham y col., 1996; Banks y col., 1999; Cheema
y col., 2009). Pa ish y col., (2004) encon a on que en e
a ias especies ue es a plan a la que desa olló una mayo
biomasa an o en aíces como en pa e aé ea y la que eliminó
un po cen aje mayo de con aminan e. Epu i y So ensen
(1997) indica on el cla o e ec o de es a especie en la
mine alización y ex ac abilidad de benzo(a)pi eno en un suelo
con aminado con es e HAP. Pa ish y col., (2005) cul i a on
Fes uca a undinacea du an e 12 meses en in e nade o, en
mace as con suelo que con u ie on 15 ipos de HAPs y
obse a on que las poblaciones mic obianas deg ado as de
CAPÍTULO I: In oducción
- 83 -
es os compues os ue on 100 eces mayo es en las mace as
con es as plan as que en el con ol (sin plan a). Huang y col.,
(2004) des aca on su capacidad de man ene o, incluso
inc emen a , el con enido de agua en los ejidos o osin é icos
y aumen a on el desa ollo de las aíces acili ando el
anspo e de o oasimilados en condiciones de al o es és
p o ocado po c eoso a. Apa e de la conocida capacidad de
ge minación de las semillas de es a especie, que la hacen muy
adecuada pa a su uso inicial en suelos con aminados, exis en
p o ocolos e icaces pa a su mic op opagación. Seko y
Nishimu a (1996) es udia on el e ec o del CO
2
sob e la
supe i encia de egene an es in i o en medio de cul i o sin
azúca . Gyulai y col., (1995) incluye on es a especie en un
amplio es udio sob e desa ollo in i o de Monoco iledóneas
de ca a a su in e acción con mic oo ganismos. Cao y col.,
(2006) op imiza on las écnicas de cul i o in i o pa a
egene a plan as de Fes uca a undiacea y Lolium pe enne
ans o madas con Ag obac e ium.
Lolium pe enne, L. conocida ulga men e como allico,
pe enece ambién a las Poaceas, es pe enne y muy común en
p ade as y céspedes o mando pa e impo an e de los pas os,
po lo que es alimen o dia io del ganado. Johnson y col.,
(2004) demos a on que un suelo plan ado con Lolium pe enne
y T i olium epens jun o a un inóculo de la bac e ia Rhizobium
leguminosa um i olii p esen ó una concen ación meno de
HAPs ex aíbles que el suelo sin plan a , as 180 días de
expe imen ación y aumen ando ( as es e pe íodo) la biomasa
mic obiana en los suelos a ados. Olson y col., (2007)
es udia on la capacidad de uso en i o emediación de 18
especies, an o Monoco iledóneas como Dico iledóneas, y
des aca on, en e las p ime as, a Lolium pe enne y
And opogon ge a dii, como las más e ec i as y, en ambos
casos mul iplica on po dos el descenso de los HAPs es ados
a los 220 días de expe imen ación. L. pe enne cuen a con
sis emas de p opagación an o con encionales po semillas
como median e mic op opagación (C eeme smolenaa y col. ,
1992), incluso se han ob enido plan as de Lolium pe enne mas
ole an es a suelos salinos median e ansgenización con
CAPÍTULO I: In oducción
- 84 -
Ag obac e ium ume aciens (Wu y col. , 2005), al que hay que
uni el abajo ya ci ado pa a Fes uca de Cao y col., (2006).
Helian hus annuus, L. El gi asol, pe enecien e a la
amilia As e acea es ampliamen e conocido po la p oducción
de acei e de sus semillas. Es una plan a anual, que puede
alcanza los dos me os de al u a. Es a especie se ha usado
como pilo o en expe iencias de i o emedianción de HAPs, y
p esen a cie a sensibilidad al luo an eno, en compa ación
con o as especies como Faba ulga is (Kumme o a y col. ,
2001). En expe imen os con luo eno, an aceno, pi eno y
c iseno, el gi asol compa ado con o as especies, elimina en
mayo medida que el es o, los HAPs ci ados del suelo, sob e
odo al inal del expe imen o (Maliszewska-Ko dybach y
Sm eczak, 2000). Es os au o es indica on que en e un g upo
de especies ensayadas, el gi asol ue el que p esen aba mejo
espues a a la ge minación de semillas y elongación adical en
suelos con los HAPs an es ci ados. Olson y col., (2007)
encon a on que den o de las Dico iledóneas, Helian hus
annuus es la que mejo esponde en p esencia un suelo muy
con aminado con HAPs en e a o as 11 especies de
Dico iledóneas ensayadas. Respec o a su p opagación, po se
una especie ampliamen e cul i ada, las semillas disponibles
en el me cado p esen an una máxima capacidad de
ge minación. Así mismo, la me odología de p opagación in
i o es á ampliamen e desa ollada desde hace años (T i i y
col., 1981; Ca allini y Lupi, 1987; Imho y col., 1996).
Exis en o os abajos que inciden en el cul i o de
p o oplas os de es a especie (Wingende y col. , 1996), en el
con ol gené ico de plan as ob enidas po o ganogénesis in
i o (Be ios y col. , 1999), en el uso del saco emb iona io
como ma e ial de pa ida (Popiela ska y P zywa a, 2003) y en
el cul i o de emb iones cigó icos (Suja ha y P abaka an,
2001) o somá icos (Pe i p ez y col. , 2005). Po o o lado, los
biocombus ibles se conside an como una de las al e na i as
ecológicas al pe óleo, a in de educi , a co o plazo, las
emisiones de CO
2
en la a mós e a, con ibuyendo así a educi
el e ec o in e nade o. En e los biocombus ibles, el biodiesel
es una uen e de ene gía eno able, biodeg adable y no óxico.
CAPÍTULO I: In oducción
- 85 -
En B asil, uno de los países más desa ollados en lo e e en e
a biodiesel, basa la p oducción de es e biocombus ible en la
u ilización del gi asol (Ta a es y col. , 2011). Po lo que cab ía
la posibilidad de combina la capacidad de es a plan a pa a
ecupe a suelos con aminados con HAPs, y su uso po encial
pa a la ob ención de biodiesel, de mane a al e na i a e
independien e de la aplicación habi ual en alimen ación.
Una ez seleccionada la plan a más adecuada, según los
supues os an e io es, lo más in e esan e del es udio po su
complejidad, es e los p incipales p ocesos in oluc ados en
izodeg adación de HAPs, los cuales se esumen en la Figu a
I.11.
Figu a I. 11.- Rizo emediación de HAP. A) Biodisponibilidad del HAP en NAPL: el
con aminan e o gánico se encuen a unido a las pa ículas de suelo o ísicamen e
a apado en mic opo os donde no son ácilmen e biodisponibles. B) P ocesos
gene ales que a ec an a la izo emediación: las aíces de las plan as sus en an el
c ecimien o mic obiano en la supe icie de la aíz y en la izos e a. Las aíces c ean
canales en el suelo que pe mi en el mo imien o de O
2
y H
2
O, que son lo
su icien emen e anchos pa a que los con aminan es engan una mayo accesibilidad
mic obiana. C) Deg adación ae óbica de HAPs: en la in e ase agua/NAPL los
mic oo ganismos u ilizan mé odos de adhesión o su ac an es mejo ando la
accesibilidad y po an o aumen ando la descon aminación del suelo (Ge ha d y col.
, 2009).

CAPÍTULO I: In oducción
- 86 -
Además del aumen o de la ac i idad y de las
poblaciones mic obianas, se debe ene en cuen a que las
aíces adquie en agua del suelo omen ando la anslocación
de los con aminan es disuel os en la izos e a (Fe o y col.,
1994), que los ensioac i os p oceden es de exudados de aíz
pueden aumen a la solubilidad de los hid oca bu os
a omá icos policíclicos y mejo a así su biodisponibilidad
(Song y col., 2004) y que las aíces pueden mejo a la di usión
de oxígeno, p opo cionando canales de lujo de ai e (Child y
col., 2007). La disponibilidad de oxígeno es impo an e, debido
a la deg adación de los HAPs po cie as bac e ias del suelo,
incluyendo a las micobac e ias, que ealizan las
ans o maciones a a és de dioxigenasas.
I.7.3. Ma e ia o gánica disuel a: Ácidos
húmicos
En el medio acuá ico, ap oximadamen e en e un 75 y
99% del ca bono o gánico es á en o ma de pa ículas o como
ma e ia ine e disuel a (el es o es á p esen e en los
o ganismos i os). Las concen aciones de ma e ia o gánica
disuel a (MOD) en aguas na u ales se encuen an den o del
ango de 0.5 a 50 mg/L. La MOD es á p edominan emen e
compues a po sus ancias húmicas (SH) que cons i uyen
en e el 40-80% del o al de MOD (S einbe g y col., 2006). En
sedimen os, el ca bono o gánico o mado po SH puede
ep esen a has a un 20% del o al de su peso seco (Akkanen
y col., 2005). Las SH son p oduc os na u ales o mados po
diagénesis de la descomposición de la ma e ia o gánica, que
incluye deg adación y p ocesos de condensación.
Gene almen e, las SH se pueden di idi en ácidos húmicos
(AH), ácidos úl icos (AF) y huminas coloidales o insolubles,
que di ie en an o en sus p opiedades ísico-químicas como
biológicas. Debido a la amplia gama de amaño molecula
nominal y g upos uncionales, es os compues os son
gene almen e de inidos po su solubilidad en soluciones
alcalinas o po sus ca ac e ís icas espec ales.
CAPÍTULO I: In oducción
- 87 -
Pan y col., (2007) encon a on que las a inidades de
adso ción de los HAPs a ia on en e AH, AF y las acciones
de huminas debido a las di e encias en e ellas, ci adas
an e io men e. También se demos ó que el pi eno en el HA
ue más disponible que en humina du an e la biodeg adación
(Tang y col., 2008). La dis ibución de HAPs en di e en es
acciones húmicas pod ía da una idea del mecanismo que
ige la biodisponibilidad de los HAPs en suelos.
Engeb e son y Vonwand uszka (1994) desc ibie on la
o ma que podían ene los ácidos húmicos, que poseían una
especie de mic oes uc u a micela simila a la de los
ensioac i os (Figu a I.12).
Figu a I. 12.- Es uc u a de los ácidos húmicos mos ando la con ibución de
Mg
2+
en la o mación de un mic oambien e hid o óbico in amolecula . R, es la
con inuación de unidades es uc u ales simila es. (Esquema modi icado de
Engeb e son y Vonwand uszka, 1994).
Es a mic oes uc u a acele a la deg adación de HAPs
median e el aumen o de la solubilidad de es os
con aminan es, p omo iendo su biodisponibilidad pa a los
mic oo ganismos. A pesa del g an núme o de a ículos que
CAPÍTULO I: In oducción
- 88 -
hablan de la impo ancia de los AH en la bio emediación de
di e en es con aminan es an opogénicos (Haluska y col.,
1995; Fu y col., 1999), su papel en la de oxi icación de los
HAPs po los mic oo ganismos se man iene incie o. Exis en
es udios de los e ec os de los AH sob e la biodeg adación de
los HAPs en ambien es geológicos sa u ados de agua y en
medios acuosos que p esen an aumen o de la deg adación
(O ega-Cal o y Saiz-Jimenez, 1998; Ha ka y col., 2008;
Smi h y col., 2009), o os que mues an inhibición y o os que
mues an ningún e ec o (Lao y col., 1999).
Se sabe que la biodeg adación de los HAPs depende del
lujo de masa o al hacia las células deg adado as. Las
bac e ias deg adado as suelen oma los HAPs disuel os po
di usión desde los al ededo es de la ase acuosa hacia las
células. Aquí, las concen aciones disuel as de e minan la
biodisponibilidad, y bajas concen aciones lib es disuel as
pueden p oduci una biodeg adación len a. Debido a la baja
solubilidad de los HAPs y a su al a hid o obicidad, es os
compues os son adso bidos de al o ma que las
concen aciones lib es disuel as son bajas. Además, si el
depósi o de concen aciones lib es disuel as se ago a po
biodeg adación, po una ciné ica de deso ción limi ada, como
po ejemplo en mic opo os de la ma e ia sólida, la eposición
es limi an e. Algunos de es os HAPs pe manece án
inaccesibles y pe sis en es du an e mucho iempo. Exis e un
amplio núme o de a ículos que indican que hay o as ías de
anspo e que puedan p opo ciona HAPs adicionales pa a
las células deg adado as. La mayo ía de las e idencias
p o ienen de la ciné ica de deg adación en p esencia de
su ac an es a i iciales y na u ales. Dependiendo del ipo de
ensioac i o y de bac e ia, la acción de HAP en o ma de
micela puede es a di ec amen e biodisponible pa a las
células bac e ianas sin necesidad de se deso bida pasando a
se una concen ación lib e disuel a. Es o se ha a ibuido a la
in e acción de la micela del ensioac i o con la supe icie de la
célula, seguida po la libe ación di ec a de HAP in e calado.
Mien as que los AH pueden disminui la biodeg adación,
educiendo la concen ación de HAPs lib es disuel os po
CAPÍTULO I: In oducción
- 89 -
so ción, los AH además pueden ac ua como anspo ado es
de HAPs (To sche y col., 1997; Ha ka y col., 2008).
No malmen e la adso ción de COH a la ma e ia o gánica
disuel a (MOD) se exp esa como un coe icien e de epa o
(K
OC
) del compues o químico en e la MOD y las ases acuosas
lib es.
La de e minación del K
OC
equie e de medidas o cálculos
de la can idad de compues o químico so bido al ca bono
o gánico disuel o (COD) y la concen ación del compues o
químico lib e disuel o en la ase acuosa. Pa a de e mina la
concen ación lib e disuel a del con aminan e en disoluciones
que con ienen COD se necesi a una écnica que pueda medi
di ec amen e es a concen ación sin ene necesidad de hace
una sepa ación de ases, de o ma que se pueda conoce la
concen ación lib e disuel a y la concen ación del
con aminan e unida a la MOD. Gau hie y col., (1986) ue on
los p ime os en in oduci el uso del quenching de
luo escencia como un mé odo no des uc i o pa a de e mina
cons an es en equilib io de in e acciones en e ma e iales
húmicos disuel os y HAPs sin é icos. O os in es igado es han
empleado écnicas simila es pa a de e mina cons an es de
unión con na aleno (T aina y col., 1989) y enan eno (Magee
y col., 1991) en p esencia de ca bono o gánico disuel o en
agua pa a sabe qué es lo que ocu e en e na aleno o 1-
na ol y ácidos húmicos (Mo a y col., 1990). Cualquie
p oceso en el que disminuya la luo escencia de un compues o
es conocido como quenching de luo escencia, es e enómeno
se u ilizó pa a desa olla una nue a écnica conocida como
Espec o o ome ía de luo escencia sinc ónica.
Las écnicas más comunes pa a la de e minación de
HAPs son los mé odos c oma og á icos, especialmen e la
c oma og a ía líquida de al a esolución (HPLC) con ase
e e sa (con columna C18 pa a esol e p oblemas de co-
elución con HAPs isomé icos) con de ección luo imé ica.
Es a écnica log a la sepa ación de los 16 HAPs de la EPA. No
obs an e los mé odos c oma og á icos son ca os, consumen
mucho iempo y equie en g andes can idades de disol en es.
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 96 -

CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 97 -
III.1. REACTIVOS
Hid oca bu os a omá icos policíclicos (HAPs). Se
u iliza on enan eno (98%) y pi eno (98%), ambos
dis ibuidos po la casa come cial Sigma Chemical Co. Los
compues os adioquímicos ue on suminis ados po Sigma
Chemical Co (S Louis, MO): enan eno-9-
14
C [ac i idad
especí ica, 13,1 mCi/mmol; pu eza adioquímica, >98%],
luo an eno-3-
14
C [ac i idad especí ica, 45 mCi/mmol; pu eza
adioquímica, >98%] y pi eno-4,5,9,10-
14
C [ac i idad
especí ica, 55 mCi/mmol; pu eza adioquímica, >98%].
Tensioac i o. El ensioac i o empleado ue B ij 35
(C
12
E
10
) a ándose de un ensioac i o no-iónico (Poe schmann
y col. ) y suminis ado po Sigma -Ald ich.
Bioes imulan es. El e ilizan e oleo ílico usado como
bioes imulan e ue S-200, ab icado y suminis ado po IEP
Eu ope (Mad id). Con iene u ea ( uen e de N) y és e es
os ó icos ( uen es de P), en una mezcla de ácidos g asos
sa u ados e insa u ados en la que p edomina el ácido oleico
como p oduc o oleo ílico. Con iene como disol en es 2-bu oxi-
e anol y glicol-é e , además de lle a como base agua. Los
ácidos húmicos empleados ue on ácidos húmicos
suminis ados po Ald ich y ácidos húmicos ex aídos de un
suelo localizado en el Pa que Nacional de Doñana, ce ca del
lago de San a Olalla (Huel a) (Lahlou y col., 2000). Ácido
oleico (90%) ue suminis ado po Ald ich y u ea po la casa
Fluka.
Disol en es. Todos los disol en es u ilizados (ace ona,
diclo ome ano, me anol y ace oni ilo) ue on de calidad HPLC
y ue on suminis ados po Me ck.
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 98 -
III.2. LÍQUIDOS EN FASE NO ACUOSA (NAPLs)
En es e abajo se emplea on 4 líquidos en ase no
acuosa:
• 2,2,4,4,6,8,8- hep ame ilnonano (HMN), n-hexadecano
(HD) y di-2-e ilhexil- ala o (DEHP) se ob u ie on de
Sigma Chemical Co, odos ellos con una pu eza igual o
supe io a 98%.
• Fuel pesado, RMG 35 (ISO 8217), ob enido de la
O icina Técnica de Ve idos Ma inos Acciden ales
(OTVM), Uni e sidad de Vigo.
Las cons an es ísico-químicas de cada NAPL u ilizado,
ele an e pa a es e es udio y disponible en la li e a u a
(Ca oquino y Alexande , 1998) o p opo cionada po OTVM,
son la solubilidad en agua, S
w
(mg/L); pa ición oc anol-agua,
log k
ow
, densidad, D (g/L), y la iscosidad, V (cen is okes, cS ).
Los alo es de es as cons an es ísico-químicas
co espondien es a cada NAPL los podemos e en la Tabla III.
1.
Tabla III. 1.- P opiedades ísico-químicas de los NAPLs.
NAPLs S
w
(mg/L) Log k
ow
D (g/mL) V (cS )
DEHP
2.2·10
-5
7.45
0.981
81.4 (20ºC)
HD 0.283·10
-3
9.16 0.773 3.03 (25ºC)
HMN 0.278·10
-3
8.25 0.793 3.18 (25ºC)
FUEL PESADO - - 0.981 380 (50ºC)
Con el in de educi la iscosidad y pe mi i que los
esul ados ue an ep oducibles en los expe imen os de
biodeg adación y de epa o, las mues as de uel pesado se
mezcla on en la p opo ción siguien e: 1 g de uel con 1 mL de
HMN o DEHP. El esul ado de es as mues as de NAPL más
luidas, a las que se e ie e como uel/HMN y uel/DEHP,
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 99 -
enían iscosidades a 25ºC de 13.99 ± 0.28 y 31.16 ± 0.14 cS ,
espec i amen e. Es os alo es de iscosidad se de e mina on
median e el iempo que anscu e cuando pasa el luido a
a és de una pipe a de 10 mL compa ándolo con HMN
(Bi man y Alexande , 1996).
III.3. SUELOS
Se u iliza on dos ipos de suelo en es e abajo:
A) Suelo con aminado po c eoso a. Es e suelo ue
acili ado po EMGRISA (Emp esa de Ges ión de Residuos
Indus iales, Sociedad Es a al, Mad id, España) esponsable
de la ges ión ambien al del emplazamien o. Las mues as
p ocedían de una an igua plan a de a amien o de made as
si uada en Andalucía con un al o con enido en HAPs (Niqui-
A oyo y col., 2006). Se u ilizó una pala exca ado a pa a
ecoge las mues as del ho izon e supe icial del suelo has a
un me o de p o undidad que es has a donde pene ó la
c eoso a (Figu a III.1). Una ez cogidas las mues as de suelo
se gua da on en con enedo es especiales pa a es e ipo de
mues as y se man u ie on a 4ºC has a su pos e io
u ilización.
B) Suelo no con aminado. Se a a de un suelo anco
a enoso con el 67% de a ena la ada (Aqua ama) y 33% de
suelo de Vega p oceden e de la inca expe imen al “Las
Hampas” del IRNAS-CSIC en Co ia del Río (Se illa). La mezcla
de ambos suelos con enía un pH de 8.73, 27.5% de CaCO
3
,
1.75% de ma e ia o gánica, 0.096% de ni ógeno o gánico
(Kjeldahl), 13.8 mg·kg
-1
de ós o o disponible y 428 mg·kg
-1
de
po asio. La dis ibución de amaño de pa ículas ue: 19.5%
de a ena de g ano g ueso, 39.9% de a ena de g ano ino,
15.9% de limo y 24.6% de a cilla.
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 100 -
Figu a III. 1.- Emplazamien o con aminado con c eoso a. Fo os de la zona y del
mues eo de suelo.
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 101 -
III.4. BACTERIAS, MEDIOS, CONDICIONES DE
CULTIVO Y PREPARACIÓN DE INÓCULOS
La es i pe u ilizada en es a Tesis Doc o al ue
Mycobac e ium gil um VM552. Es a es i pe p ocede de un
suelo con aminado con HAPs y es capaz de c ece con
enan eno, luo an eno y pi eno como única uen e de
ca bono y de ene gía (Wick y col., 2002; an He wijnen, 2003).
También se han obse ado esul ados de deg adación,
median e p ocesos come abólicos, de an aceno y
benzo(a)pi eno (Bueno-Mon es y col., 2011).
El medio líquido u ilizado pa a cul i a la es i pe se
denomina Medio Suiza (SW), (pH=7, Tabla III. 2). El cul i o se
ealizó en agi ado o bi al a 30ºC, 150 e oluciones po
minu o ( pm) y con 0.2 % (p/ ) de enan eno como uen e de
ca bono. Los c is ales de enan eno ue on p e iamen e
es e ilizados median e disolución en diclo ome ano y pos e io
ec is alización.
Es a es i pe o ma en medio sólido de aga soja ip ona
suplemen ado (TSA, Cul imed, Pan eac Química, S. A.)
colonias edondas de colo ama illo-ana anjado y de aspec o
mucoso y b illan e. Es e medio ico (Tabla III. 2) se p epa ó
añadiendo a un medio denominado MSB (minimal sal s
medium), el peso adecuado de aga soja ip ona (42 g/L).
En los ensayos de biodeg adación, se empleó el medio
de mine alización (MM, Tabla III. 2) cuyo pH ue igual a 5.7,
siendo su icien emen e ácido como pa a pe mi i la libe ación
del
14
CO
2
gene ado du an e el p oceso de biodeg adación del
sus a o ma cado, y su cap u a en la ampa alcalina.
Pa a la p epa ación de los inóculos, se siguió el
siguien e p ocedimien o:
1º) Se il ó a a és de una placa po osa nº2 (40 µm de
amaño de po o) 1000 mL de cul i o pa a los expe imen os de
in e ase cons an e y 100 mL de cul i o pa a los expe imen os

CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 102 -
de mine alización con exudados y ácidos húmicos, cada uno
incubado con enan eno como uen e de ca bono adecuada.
2º) Se man u o el cul i o bac e iano il ado, du an e 24
h, en agi ación a 30ºC y 150 pm, pa a elimina los posibles
c is ales esiduales de enan eno en solución.
3º) Después de la incubación del cul i o il ado, és e se
some ió a a ios ciclos de la ado pa a libe a el pelle
bac e iano de es os de me aboli os. Es e la ado consis ió en
a ias cen i ugaciones con medio de mine alización du an e
10 minu os a 8000 pm (pa a los expe imen os de in e ase
cons an e) y 5 minu os a 10000 pm (pa a los expe imen os
de mine alización en p esencia de exudados y ácidos
húmicos).
4º) T as el la ado, el pelle se esuspendió en un
olumen conocido de medio de mine alización es é il. Las
células iables se de e mina on en cada expe imen o como
unidades o mado as de colonias (CFU) después de sucesi as
diluciones del pelle con medio de cul i o y siemb a en placas
de TSA (T ip one Soy Aga ). También se midió la densidad
óp ica del inoculo a 600 nm en un espec o o óme o UV-
isible (Genesys 10 is, Spec onic Unicam).
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 103 -
Tabla III. 2.- Composición po li o de los dis in os medios u ilizados en es a esis.
Los eac i os ma cados con * se au ocla a on po sepa ado de los ma cados con **
y se mezcla on una ez en iados. Los ma cados con *** se añadie on po il ación
a a és de millipo e de po o 0.2 µm.
Compues o
Medio
Suiza
(SW)
Medio
Mine alización
(MM)
MM con N
ajus ado
(MMNA)
Medio
MSB
Na
2
HPO
4
·12H
2
O 3.52g ** 670 mg
KH
2
PO
4
0.2g ** 900 mg** 900mg ** 340 mg
K
2
HPO
4
100 mg** 100 mg **
MgCl
2
·6H
2
O 0.1 g*
(NH
4
)
2
SO
4
0.5 g*
Ca(NO
3
)
2
·4H
2
O 0.05 g*
CaCl
2
80 mg* 80 mg* 14 mg
NH
4
Cl 500 mg
NH
4
NO
3
100 mg* 876 mg*
MgSO
4
·7H
2
O 100 mg* 100 mg* 112 mg
ZnSO
4
·7H
2
O 2.5 µg*** 5 mg
ZnCl
2
5 µg***
MnCl
2
·4H
2
O 30 µg***
H
3
BO
3
5.5 µg***
CoCl
2
·6H
2
O 19.5 µg***
CuCl
2
·2H
2
O 1.7 µg***
NiCl
2
·6H
2
O 2.3 µg***
Na
2
B
4
O
7
·10H
2
O 2 µg*** 2 µg***
MnSO
4
·H2O 2 µg*** 2 µg***
CuSO
4
·5 H
2
O 2 µg*** 2 µg***
Na
2
MoO
4
·2 H
2
O 10 µg*** 1.4 µg*** 1.4 µg*** 2.5 mg
ZnSO
4
·H
2
O 2 µg*** 2 µg***
CuSO
4
2.5 µg***
Na
2
EDTA 2 mg***
FeCl
2
0.75 mg***
LiCl 1.25 µg***
SnCl
2
1.25 µg***
KB 5 µg***
KI 5 µg***
BaCl
2
1.25 µg***
FeCl
3
·6H
2
O 10 mg*** 10 mg*** 0.22 mg
TSA 40 g
pH 7.0 5.7 5.7 7.0
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 104 -
III.5. ANÁLISIS DE HAPs POR CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
La ins umen ación u ilizada ue un c oma óg a o
líquido de al a esolución (Wa e s 996 Sepa a ion Module) de
ase e e sa equipado con un de ec o de UV-VIS (Wa e s 996
Pho odiode A ay De ec o ) y o o de ec o de luo escencia
(Wa e s 474 Scanning Fluo escence De ec o ). La columna
empleada es á especialmen e indicada pa a la de e minación
de hid oca bu os a omá icos policíclicos (Wa e s PAH column,
C
18
, 5 µm de amaño, 4.6 x 250 mm). Los componen es de la
ase mó il, ace oni ilo de calidad HPLC (Me ckx y col. ) y agua
Milli-Q, ue on il ados p e iamen e a su uso pa a aumen a
la ida ú il de la columna, u ilizando pa a ello un il o de
memb ana de nylon de 0.45 µm de po o y 47 mm de diáme o
(Teknok oma, Ba celona, España).
Las condiciones c oma og á icas ue on las siguien es:
• Flujo ase mó il: 1 mL/min.
• Tempe a u a de la columna: 30ºC.
• Volumen de inyección 80 µL.
• Tiempo de análisis 50 min.
El g adien e empleado pa a la ase mó il lo podemos e
en la Tabla III. 3 (Ga ago i y col. , 1999), así como la
p og amación del de ec o de luo escencia en la Tabla III. 4.
Tabla III. 3.- G adien e empleado como ase mó il en el análisis de mues as de epa o.
Tiempo (min) Ace oni ilo (%) Agua Milli-Q (%)
0
45
55
5
45
55
25
95
5
31
100
0
38 100
0
43 45
55
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 105 -
Tabla III. 4.- P og amación del de ec o de luo escencia.
Es as condiciones analí icas se u iliza on en los análisis
de los expe imen os de epa o de los HAPs desde los NAPLs a
la ase acuosa, en el ensayo del in e nade o a iempo inical,
in e medio (45 días) y inal (90 días), así como, en los ensayos
de mine alización con suspensiones de suelo con aminado con
c eoso a median e poblaciones au óc onas en p esencia y
ausencia de exudados de gi asol a iempo inicial y inal.
Se ealizó una ec a de calib ado pa a el análisis de las
mues as de cinco pun os, cub iendo el in e alo de
concen aciones de las mues as a de e mina . Los lími es de
de ección y cuan i icación de los componen es analizados se
calcula on como es eces y diez eces la des iación es ánda
ela i a de la o denada en el o igen de la ec a de calib ado. La
cu a de calib ado pa a el expe imen o de epa o de
enan eno ue del o den de ng·mL
-1
, siendo el lími e de
de ección igual a 0.2 ng·mL
-1
y el lími e de cuan i icación igual
a 0.7 ng·mL
-1
, ob enidos con el de ec o de luo escencia. La
cu a de calib ado pa a los HAPs de las mues as de suelo ue
del o den de µg·mL
-1
, los lími es de de ección y de
cuan i icación calculados apa ecen en la Tabla III. 5.
Tiempo (min)
λ Exci ación (nm)
λ Emisión (nm)
0.0
270 323
14.5
248 374
21.0
270 400
32.5
305 430
38.0
270 323
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 112 -
las p ime as ge minaciones de semillas, po lo que se e i ó el
papel de aluminio, quedándose a una in ensidad lumínica de
2.75 µEm
-2
s
-1
y 18 ho as de o ope íodo. T anscu idos 45
días se io un desa ollo adecuado de la zona adicula de las
plan as de ambas especies. En consecuencia, se e i a on las
plan as y se congeló el medio a -20ºC pa a su pos e io
análisis an o del ca bono o gánico como del ca bono o gánico
o al median e el Se icio de Análisis del IRNAS.
An e los esul ados alen ado es conseguidos en el
p ime ensayo, se ealizó una p oducción de exudados a
mayo escala.
Pa a ello, se p epa a on ascos de 1000 mL de
capacidad a lo que se les ins aló en su in e io un sopo e a
modo de ces a de ela me álica de ace o inoxidable (0.98 mm
de luz y 0.40 mm de diáme o) sos enida po hilos me álicos
que se suje a on en la boca del asco que se ce ó
he mé icamen e. La longi ud de es os hilos me álicos se
calculó pa a que las semillas posicionadas en la ces illa
es u ie an en con ac o con el medio de cul i o (500 mL de
MM), pe o sin hundi se en él, lo que p oduci ía e ec os de
anoxia y, en consecuencia, la ge minación esul a ía
se iamen e a ec ada. G acias a es e sis ema (Figu a III.3), las
aíces que se an desa ollando se in e nan en el medio
líquido donde ie en los exudados obje o de ex acción, sin
ene ningún ipo de pa icipación la pa e aé ea.
Pos e io men e, en el in e io de la cabina de lujo
lamina , se es e iliza on po sepa ado dos g upos de 50
semillas de gi asol median e inme sión en e anol 96º du an e
90 seg. Seguidamen e ambos g upos se some ie on a una
nue a inme sión en hipoclo i o sódico (NaClO) (3.5% de clo o
ac i o) du an e 30 minu os y pa a elimina los es os de
hipoclo i o se ealiza on es la ados de cinco minu os cada
uno en agua des ilada es é il. De igual modo 200 semillas de
Lolium pe enne y 200 de Fes uca a undinacea se es e iliza on
po sepa ado median e inme sión en e anol 96º du an e 90
segundos y pos e io men e en NaClO (3.5% de clo o ac i o)

CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 113 -
du an e 20 minu os inalizando con los es la ados con
agua es é il de cinco minu os cada uno.
Figu a III. 3.- Sis ema u ilizado pa a la ob ención de exudados de gi asol in
i o.
Una ez es e ilizadas las semillas se coloca on los 2
g upos de 50 semillas en el caso del gi asol, y 2 g upos de 100
pa a el caso de las dos g amíneas en cada uno de los 6 ascos
con los sopo es desc i os an e io men e, p e iamen e
es e ilizados en au ocla e. A cada uno de los ascos se les
añadió en cáma a de lujo lamina , 500 mL de MM (pH=5.7)
es é il sin egulado es de c ecimien o y sin uen e de ca bono,
a in de no in e e i con los exudados de aíz y que ue an
és os los únicos compues os hid oca bonados disponibles
pa a los mic oo ganismos. Una ez semb adas las semillas y
ce ados los ascos con pa a ilm, el conjun o se deposi ó en
una cáma a de cul i o a 25±1ºC, 65.24 µEm
-2
s
-1
, pa a
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 114 -
po encia la o osín esis dado que el medio de cul i o ca ece
de uen e de ca bono, y 18 ho as de o ope íodo. T anscu ido
un mes de incubación en es as condiciones, se obse ó una
ge minación adecuada de las semillas con una p oli e ación
del sis ema adicula bas an e acep able, po lo que se
sepa a on las plan as de los medios de cul i o con los
exudados exc e ados en condiciones es é iles. Los medios
ecogidos se cen i uga on du an e 3 ho as a 31000 g pa a
ob ene una solución ní ida que incluye la ma e ia o gánica
disuel a po encialmen e p esen e en el agua in e s icial de los
sedimen os (Ha ka y col., 2008) y se almacena a -20ºC has a
su uso en los expe imen os de mine alización.
Se analizó el ca bono o gánico o al (COT) a los medios
cen i ugados, ambién median e el Se icio de Análisis del
IRNAS, Se illa.
Dada la mayo concen ación de exudados p oducidos
po Helian hus annuus, es imada median e la concen ación
de ca bono o gánico o al (COT) y su mejo c ecimien o in
i o, se u iliza on p e e en emen e los exudados de es a
plan a en los pos e io es ensayos de mine alización y
eliminación de de HAP en in e nade o.
Pa a lle a a cabo es a p oducción egula de exudados
de aíces de gi asol, se ealiza on sie e cul i os, usando
siemp e 50 semillas comple as y es e ilizadas en cabina de
lujo lamina sume giéndolas en e anol absolu o du an e 3
minu os, inmedia amen e después de la eliminación del e anol
se in oduje on en una solución de hipoclo i o sódico al 57%
(14% de clo o ac i o) du an e 25 minu os y pos e io la ado de
5 minu os cada uno con agua es e ilizada. T anscu idos 30
días, se cuan i icó el núme o de plan as pa a calcula el
po cen aje de ge minación, el peso eso y seco y la asa de
c ecimien o ela i o ( ela i e g ow h a e, RGR) de la plan a
comple a de acue do con la ecuación:
1
)ln(ln
−
⋅−= Dpip RGR (Me ckx y col., 1987) donde p es el
peso seco de la plan a comple a al inal del expe imen o; pi es
el peso seco al inicio del expe imen o (media de 5 plán ulas
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 115 -
secadas 3 días después de la ge minación de la semilla) y D es
la du ación del expe imen o en días. El secado de las plan as
se e ec uó man eniendo el ma e ial ege al en es u a a 70ºC
du an e 72 ho as.
III.7.2. Mine alización de pi eno en cul i os
líquidos en p esencia y ausencia de exudados de
aíces de gi asol
Pa a e el e ec o de los exudados de aíces de gi asol en
la biodeg adación de HAPs pu os, lle amos a cabo dos ipos
de es udios de mine alización de pi eno en p esencia o
ausencia de es os exudados: Po debajo de la solubilidad del
pi eno (S=0.135 µg·mL
-1
a 25ºC) a 6·10
-4
µg·mL
-1
y po encima
de la solubilidad del pi eno a 27.2 µg·mL
-1
.
A) Pa a medi la mine alización del hid oca bu o po
debajo de su solubilidad, se p epa ó una disolución de MM
de 40 mL con 4296 dmp·mL
-1
. Conociendo el alo de dmp·mL
-
1
de es a disolución y la ac i idad especí ica podemos conoce
la concen ación del es e hid oca bu o en la disolución. De
es a mane a, la disolución de pi eno en MM e a de 7.21·10
-3
µg·mL
-1
.
Una ez p epa adas las disoluciones, és as se añadie on
po duplicado en ubos de pi ex 18 x 100 cm has a alcanza
una concen ación de HAP ma cado de 6·10
-4
µg·mL
-1
en 5 mL
de olumen o al donde 0.5 mL e an de inóculo bac e iano
(densidad óp ica a 600 nm igual a 0.19 en los 5 mL o ales,
2.3·10
8
células/mL) en ausencia o p esencia de 50 µg·mL
-1
de
ca bono o gánico p oceden e de los exudados de aíz de
gi asol.
En el in e io del ubo de ensayo se colocó una a illa de
id io de 5 cm pa a homogeniza la disolución en su in e io
du an e la agi ación a 80 pm y 25ºC. Los ubos de ensayo se
ce a on con apones en uel os en Te lón, de los cuales
suspendían unos iales de 1 mL donde se coloca on las
ampas de NaOH (1 mL a 0.5 M).
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 116 -
Se omó dia iamen e 1 mL de la ampa de sosa pa a
medi la p oducción de
14
CO
2
como se ha desc i o
an e io men e.
B) Los expe imen os de mine alización po encima
de la solubilidad del pi eno, se ealiza on en los mismos
ubos de ensayo y en las mismas condiciones de empe a u a
y agi ación.
Se p epa ó una disolución de pi eno en ace ona (136
µg·mL
-1
) de la cual se deposi ó 100 µL en el ondo de los ubos
de ensayo es é iles añadiéndoles a cada ubo de ensayo el
pi eno ma cado pa a consegui una adiac i idad de 40000
dpm po ubo y se dejó e apo a oda la ace ona du an e 24
ho as, quedándose los c is ales de HAP en el ondo del ubo.
Una ez e apo ado odo, se añadie on las disoluciones
de MM, exudados de gi asol a 50 µg·mL
-1
y 0.5 mL de inóculo
bac e iano (Densidad óp ica a 600 nm de 0.19 ± 0.03, 2.3·10
8
células/mL pa a un olumen o al de 5 mL). Como el olumen
o al pa a cada a amien o ue de 5 mL, la concen ación inal
de pi eno que se ob u o ue de 27.2 µg·L
-1
.
La mine alización se pudo medi , ecogiendo las
ampas de sosa (0.5 M) dia iamen e como hemos desc i o en
el caso an e io .
III.7.3. Ensayo en in e nade o
El suelo u ilizado en es a a ea ue una mezcla (1:1) de
suelo con aminado con c eoso a y suelo no con aminado. La
desc ipción de es os suelos apa ece de allada en el apa ado
III.3.
El suelo no con aminado u ilizado se au ocla ó
p e iamen e an es de mezcla se con el suelo con aminado
pa a que sólo exis ie an los mic oo ganismos au óc onos de
es e úl imo. La mezcla se secó lige amen e en es u a a 30ºC
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 117 -
du an e 18 ho as, pos e io men e se molió y se ealizó un
c ibado has a ob ene un amaño de g ano no supe io a 2
mm.
Una ez inalizados es os a amien os, la mezcla (1:1)
se homogeneizó en una ho migone a du an e pe íodos dia ios
de 9 ho as a lo la go de una semana, cambiando
pe iódicamen e el sen ido de gi o pa a consegui una mezcla
óp ima. Las ca ac e ís icas inales de la mezcla (1:1)
ue on: 2.2% de humedad sob e peso húmedo, pH de 8.09;
15.9% de CaCO
3,
0.69% de ma e ia o gánica oxidable, 0.401%
ca bono o gánico oxidable, 0.055% de ni ógeno o gánico
(Kjeldahl), 7.0 mg·kg
-1
de ós o o Olsen, 0.9% ca bono
o gánico o al. Dis ibución de amaño de pa ícula: 46.6% de
a ena de g ano g ueso, 4.3% de a ena de g ano ino, 15.8% de
limo, y el 33.2% de a cilla. La clase ex u al ue: anco-
a cillo-a enosa.
Po úl imo, se ealizó una ex acción de los HAPs
p esen es en la mezcla homogénea de suelo ( e apa ado
III.7.4) pa a su pos e io análisis po HPLC ( e apa ado III.5).
La concen ación inicial de HAPs en la mezcla (1:1) ue igual a
21.75 mg·kg
-1
que co esponde al suma o io de 6 PAHs
( luo eno, enan eno, an aceno, luo an eno, pi eno y
c iseno). Se conside ó que es os ni eles de HAPs en el suelo
ue on su icien es pa a pe mi i pe íodos de p uebas
ela i amen e co os y es imaciones p ecisas del p oceso de
biodeg adación en nues o sis ema expe imen al. Además, las
concen aciones esul an es pueden se conside adas ealis as
po los suelos p esen ados en uen es pun uales de
con aminación debido a la eliminación de esiduos
indus iales o de ames acciden ales de hid oca bu os
a omá icos policíclicos, que suelen con ene concen aciones
supe io es a 1 mg / kg (Posada-Baque o y O ega-Cal o,
2011).
Después de conoce el con enido de HAPs en el suelo y
comp oba la homogeneidad de la mezcla, comenzó el ensayo
en in e nade o según el diseño expe imen al de la Figu a III.4.

CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 118 -
Figu a III. 4.- Diseño expe imen al del ensayo ealizado en in e nade o. Los
cí culos simbolizan las mace as u ilizadas y los colo es nos indican el ipo de suelo
empleado.
Se coloca on en el in e nade o 20 mace as con 2 kg de
suelo en cada mace a (10 kg de suelo no con aminado y 10 kg
de mezcla (1:1). En las mace as con plan a se plan a on 5
semillas de gi asol po mace a (50 semillas en o al).
La du ación de la p ueba ue de 90 días. Las
condiciones del in e nade o ue on: empe a u a 23±1ºC,
égimen de luz na u al y el sus a o se man u o a capacidad
de campo median e adición de 100 cc de agua de la ed a cada
mace a cuando ue necesa io.
Se oma on mues as de suelo y plan a a iempo inicial
(T
0
), as 45 (T
45
) y 90 días (T
90
) pa a comp oba la e olución
de los HAPs en el suelo y su e ec o sob e las plan as. Las
mues as de suelo se ex aje on con un ubo de id io (20 g) y
con cuidado pa a no daña las plan as. Las mues as
ecogidas se congela on (-20ºC) y se gua da on has a su
ex acción ( e apa ado III.7.4) y análisis po HPLC ( e
apa ado III.5). Además del análisis químico de los
con aminan es así como de las p opiedades del suelo a T
0
y
T
90
, es as mues as ue on analizadas a ni el mic obiológico
g acias a la colabo ación del Depa amen o de Mic obiología
de la Uni e sidad de Ba celona lide ado po la Doc o a
Magdalena G i oll. También se gua da on mues as de la
mezcla de suelo homogénea a T
0
a -20ºC y a 4ºC pa a los
expe imen os de mine alización en suspensiones (apa ado
III.7.5).
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 119 -
El análisis mic obiológico consis ió en cuan i ica las
poblaciones mic obianas ( an o he e ó o a como la
deg adado a de al o y bajo peso molecula de HAPs) median e
la écnica del núme o más p obable (NMP) minia u izado en
placas de mic o i ulación, con 8 éplicas po dilución (W enn
y Venosa, 1996). Y además se hizo un es udio de la
composición de las comunidades mic obianas median e la
écnica molecula de secuenciación di ec a de bandas de
DGGE (gel de g adien e desna u alizan e químico) pa a el
análisis de genes que codi ican el 16S RNA. Es a écnica
pe mi ió la sepa ación de una mezcla he e ogénea de genes
ampli icados po PCR en un gel de poliac ilamida con un
g adien e químico de o mamida y u ea en concen aciones
c ecien es en el sen ido de la mig ación elec o o é ica de
mues as de suelo con c eoso a (mezcla 1:1, in e nade o)
con ol y suelo con c eoso a (mezcla 1:1, in e nade o) en
p esencia de Helian hus annuus después de los 90 días que
du ó el expe imen o en in e nade o. La sepa ación de las
moléculas de DNA se consigue po que du an e su mig ación
po el gel de poliac ilamida, el DNA, se encuen a con
concen aciones c ecien es de los agen es desna u alizan es
o mamida y u ea, lo que gene a di e en es ho quillas de
desna u alización, según la secuencia de las moléculas de
DNA, aduciéndose en una educción de la elocidad de
mig ación y una sepa ación en di e en es bandas de mig ación
elec o o é ica. Una ez las moléculas quedan sepa adas en el
gel, es posible eco a las y es udia su secuencia, con el in
de asocia cada banda a un de e minado g upo ilogené ico.
Al inal del expe imen o se calcula on el po cen aje de
ge minación y el peso esco y seco de allos y aíces po
sepa ado. Pa a el peso seco se man u o el ma e ial ege al
du an e 72 ho as en es u a a 70ºC.
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 120 -
III.7.4. Ex acción de los HAPs del suelo y
pu i icación de la mues a
La ex acción de los HAPs p esen es en la mezcla de
suelo (1:1) u ilizada en el in e nade o, así como su ex acción
en las suspensiones pa a los expe imen os de mine alización
se ealiza on como se explica a con inuación (esquema
de allado en la Figu a III.5):
1º) Se ealizó una ex acción Soxhle de 250 mL de
capacidad. Se u ilizó como ase o gánica ex ac o a 100 mL de
diclo ome ano. Se pesó 2.8 g de suelo pa a las mues as del
in e nade o y 1 g pa a las suspensiones de los expe imen os
de mine alización. Todas las mues as se some ie on a un
p oceso de secado en es u a a 40ºC du an e 48 ho as y
pos e io men e se eliminó la humedad es an e median e
molienda de la mues a en un mo e o de ága a jun o a un
peso equi alen e a la mues a de sul a o sódico anhid o.
Después es as mues as se in oduje on en unos ca uchos de
celulosa (19 mm Ø
in e io
x 90 mm, Fil os Anoia, S.A.,
Ba celona, España) y se some ie on a ex acción du an e un
pe iodo de 8 ho as (Jones y col., 1989).
2º) El ex ac o o gánico ob enido se lle ó al o a apo
has a casi su sequedad y se esuspendió en 5 mL de
diclo ome ano. Pa a elimina los compues os más pola es del
ex ac o, se pasó po un ca ucho de luo isil (Sep-Pak
ca idges, WATERS) que pe mi ió el paso de los compues os
apola es como los HAPs y e u o los pola es. El ca ucho se
acondicionó p e iamen e con 9.5 mL de diclo ome ano con
ayuda de una je inga Hamil on. Después de pasa el ex ac o
po el ca ucho, se limpió el ca ucho con 2 mL de
diclo ome ano pa a a as a las azas de HAPs que se
hubie an quedado e enidas (Ga igues y Bellocq, 1989;
Ace es y G imal , 1993; Leal-G anadillo y col. , 2000).
3º) Una ez que el ex ac o quedó limpio, se lle ó a
sequedad median e co ien e de ni ógeno. Se esuspendió en
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 121 -
un olumen conocido de ace oni ilo y se sonicó du an e 15
minu os pa a alcanza la comple a disolución de los HAPs.
4º) Po úl imo, la mues a en ace oni ilo se il ó
median e un il o de Nylon (0.45 µm y 13 mm de diáme o)
pa a elimina las posibles impu ezas exis en es en la
disolución y se aspasó a un ial pa a se analizada median e
HPLC (apa ado III.5).
Figu a III. 5.- P oceso de ex acción y cuan i icación de HAPs en suelos.
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 128 -
Los iales con PDMS en el ondo, se man u ie on a 5ºC
du an e 72 h pa a educi las bu bujas de ai e, luego se
pusie on a empe a u a ambien e du an e 72 h y a 110ºC
du an e una noche pa a ija bien la silicona.
Una ez ijada la silicona, se p osiguió con su limpieza
median e 3 la ados de e anol (96%) con los iales o almen e
ce ados y man eniendo un con ac o o al de 48 ho as pa a
elimina impu ezas y oligóme os. Después de es e iempo se
hicie on 3 la ados con agua Milli-Q du an e 24 ho as pa a
elimina los es os de e anol.
Po úl imo, los iales con el políme o se seca on a 110ºC
du an e una ho a y se man u ie on a empe a u a ambien e
has a su uso en los ensayos de biodeg adación o de disolución
del pi eno.
Pa a la es e ilización de es os iales, se ealiza on 3
la ados con e anol absolu o du an e 72 ho as, luego 3 la ados
con agua Milli-Q au ocla ada y po úl imo, se eliminó el agua
pa a seca los en es u a a 80ºC du an e 24 ho as.
III.9.2. Es udio de la mine alización y
disolución de pi eno en p esencia y ausencia de
ácidos húmicos en iales con PDMS
Pa a e el e ec o de los ácidos húmicos (10 µg·mL
-1
)
sob e la biodeg adación de pi eno a 50 µg·mL
-1
y su
disolución en MM, se usa on los iales con PDMS ijada en su
base pa a con ola la concen ación de pi eno lib e disuel a.
En es os iales con PDMS (Figu a III.6) y en condiciones
es é iles, se ijó 100 µL de pi eno en ace ona (250 µg·mL
-1
)
como en los apa ados de mine alización (III.8.2) y de
disolución (III.8.3) pa a ene una concen ación de 50 µg·mL
-1
en un olumen de 5 mL. Se añadió 15000 dpm de
14
C-pi eno
en ace ona po ial. Se dejó e apo a la ace ona du an e 24 h
y el pi eno quedó e enido en la silicona debido a la al a
hid o obicidad de la silicona. A con inuación, se añadie on las

CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 129 -
disoluciones de medio MM (con ol) y 10 µg·mL
-1
de ácidos
húmicos de San a Olalla en MM. Po úl imo se colocó 0.5 mL
de inóculo bac e iano (M. gil um VM552, A
600nm
= 0.16, 1.9·10
8
células/mL) en los expe imen os de mine alización.
Figu a III. 6.- Viales de dopaje pasi o con PDMS ijados en su base pa a la
mine alización de 50 µg·mL
-1
de pi eno po Mycobac e ium gil um VM552 en
p esencia de 10 µg·mL
-1
de ácidos húmicos ex aidos de San a Olalla, Huel a.
Los iales ue on sellados con apones en uel os en
e lón, de los cuales pendían las ampas de NaOH (1 mL, 0.5
M). En el in e io de es os iales se coloca on unas ba i as de
id io de 5 cm de longi ud pa a homogeneiza la mezcla
du an e su incubación en agi ado o bi al a 80 pm y 25ºC.
Las mues as de NaOH con
14
CO
2
p oducido de la
mine alización del pi eno, ue on ecogidas a dia io en iales
de cen elleo de 7 mL jun o a 5 mL de líquido de cen elleo
(Ready sa e, Beckman Ins umen s, Fulle on, Cali o nia) y
anscu idas 8 ho as de oscu idad pa a disipa su
quimioluminiscencia, ue on medidas po con ado de
cen elleo (Beckman Ins umen s, Fulle on, Cali o nia). Se
ealiza on iplicados po cada a amien o (con o sin 10
µg·mL
-1
de ácidos húmicos de San a Olalla).
En el caso de los ensayos de disolución de pi eno a 50
µg·mL
-1
, se emplea on los mismos iales de la Figu a III.6 con
las mismas disoluciones que en los ensayos de mine alización
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 130 -
y las mismas condiciones de incubación, pe o sin añadi los
mic oo ganismos ni la ampa de sosa. Al igual que en el
apa ado III.8.3, se p epa a on a ias se ies de a amien os
en pa alelo pa a e i a un cambio b usco de concen ación al
mues ea . Se ecogie on 0.5 mL de mues a du an e 8 ho as
y la úl ima mues a 24 ho as después. Es as mues as
ambién ue on medidas po con ado de cen elleo (Beckman
Ins umen s, Fulle on, Cali o nia) pa a conoce la
concen ación o al de pi eno en odo el p oceso ya que la
concen ación disuel a se con oló con la p esencia de la
silicona.
III.9.3. Es udio de la di usión de PAHs en
p esencia de los 3 bioes imulan es empleados en
biodeg adación
Pa a es udia la in luencia de los bioes imulan es
empleados en la biodeg adación de hid oca bu os a omá icos
policíclicos, se u iliza on unas siliconas de polidime ilsiloxano
con o ma de discos (SSP-M823), con un espeso de 600 ± 10
µm y 6 mm de diáme o, que ue on suminis adas po
Special y Silicone P oduc s, Inc. (Balls on Spa, NY).
Sodeman Indus i jed e A/S (Viby, Dinama ca)
suminis a on a andelas de ace o inoxidable de 100 µm (ID
4mm, OD 8 mm) que se u iliza on como sepa ado es. Se
selecciona on de las a andelas suminis adas aquellas que
u ie on un adio de 100 ± 5 µm. Los imanes u ilizados ue on
unos discos de neodimio-hie o-bo o niquelados con 10 mm
de diáme o y un espeso de 5 mm, ue on suminis ados po
Fa nell (He le , Dinama ca).
Los HAPs es udiados ue on; enan eno (98%, Ald ich),
luo an eno (99%, Ald ich), pi eno (99%, EGA),
benzo(a)an aceno (Ald ich), c iseno (95%, Ald ich),
benzo(k) luo an eno (98%, Ald ich) y benzo(a)pi eno (98%,
Ald ich).
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 131 -
Más de 1000 discos de PDMS se limpia on 3 eces con
200 mL de me anol du an e 24 h. Es os discos se
con amina on con una mezcla me anol: agua (90:10, / ) que
con enían los HAPs a una concen ación de 40-47 µg·mL
-1
cada hid oca bu o. El con ac o o al en e los discos y la
mezcla ue de 16 ho as pa a que los HAPs queda an e enidos
en el PDMS. En el mismo día que se ealizó el expe imen o de
di usión, los discos con aminados se aslada on a un aso de
p ecipi ado con un olumen pequeño de agua (mL/disco) con
el in de elimina el me anol.
El expe imen o consis ió en una se ie de mic ocáma as
(Figu a III.7) pa a medi la ans e encia de masa median e
epa o-di usión- epa o, poniendo 10 µL de las disoluciones
en es udio con los bioes imulan es en e un disco
con aminado con HAPs y un disco limpio.
Los bioes imulan es empleados ue on: e ilizan e
oleo ílico (100 µg·mL
-1
), exudados de gi asol (71.7 µg·mL
-1
) y
ácidos húmicos (100 µg·mL
-1
) ex aídos de San a Olalla en
MM.
Figu a III. 7.- Sección ans e sal del diseño expe imen al de las mic ocáma as
empleadas en el es udio del aumen o de di usión en p esencia de los di e en es
bioes imulan es u ilizados. (Modi icación de Maye , P., y col., 2005).
Las di e en es ma ices se coloca on en cada
mic ocáma a y queda on ijadas en el medio po una a andela
de ace o inoxidable de 100 µm de espeso . Las di e en es
disoluciones que componen las ma ices en es udio son el
ac o a iable de es e diseño expe imen al y o man el modelo
“Uns i ed Bounda y Laye ” (UBL) ci ado en la in oducción
I.3.
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 132 -
Las mic ocáma as se coloca on sob e una placa de
id io ho izon al con sopo e de ace o y se man enían unidas
g acias al empuje de un imán. Todas las mic ocáma as se
ealiza on sob e un po a de c is al 40 x 60.
De es a o ma los HAPs pasa on po epa o del disco de
PDMS a la ma iz en es udio, median e di usión a a és de
los 100 µm del modelo UBL y inalmen e po epa o al disco
de PDMS limpio.
Se cogie on mues as po iplicado en pe íodos de
iempo de 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 min, 24 y 48 h. Las
medidas se ealiza on qui ando el imán y as i iendo cada
disco a 0.4 mL de me anol (pa a los discos limpios) y a 4 mL
de me anol (pa a los discos con aminados con HAPs) pa a
ex ae los HAPs y medi los po HPLC.
El HPLC u ilizado enía de ección po luo escencia
(Agilen 1100 sys em con G1321A FLD, ex. 260 nm; em 350,
420, 440 y 500 nm). La columna de sepa ación “CP-Ecosphe
4 PAH” ue ob enida po Va ian Inc. (Palo Al o, CA) y ope aba
a 0.5 mL/min (28ºC, 30 µL de inyección). Me anol (g ado
HPLC suminis ado po Me ck) y agua Milli-Q e an la ase
mó il: 50% me anol a =0-2 min, g adien e linea desde 50 a
75% me anol a =2-7 min, g adien e linea desde 75 a 100% a
=7-35 min y 100% me anol a =33-55 min.
La cuan i icación de las concen aciones de HAPs en los
ex ac os se ealizó po una cu a es ánda ex e na de cinco
pun os. El análisis de las mues as se lle ó a cabo den o de
dos semanas después de la oma de mues as. La in eg ación
de la señal se ealizó con HP Chems a ion so wa e (A.06.03,
Agilen Technologies, Palo Al o, CA) y se co igió a mano
cuando ue necesa io.
Gene almen e, se ecupe ó en e un 90-100% de los
HAPs iniciales en el ex ac o inal de los discos con aminados
y limpios espec i amen e, indicando un comple o balance de
masas.
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 133 -
Finalmen e, el po cen aje que ue ans e ido al disco
limpio ue ajus ado pa a cada HAPs con la ecuación (1), con el
in de de e mina la asa de elocidad cons an e a, que luego
se no malizó con la cons an e de elocidad de e minada po el
agua des ilada (ecuación 2). Es as eg esiones no lineales se
ealiza on median e mínimos cuad ados con el p og ama
G aphPad P izm 5 (San Diego, CA).
(
)
(
)
( )
a
dldl
e
C
C
m
m
2
00
1%50
−
−⋅==
(1)
Donde m
dl
es la masa de HAP en el disco limpio, m
0
es
la masa de HAP inicial y a es la cons an e de elocidad (s
-1
).
j
i
j
i
j
i
D
D
K
a
a⋅= (2)
Donde K
ij
es el coe icien e de epa o en e el medio i y
el medio j, D es el coe icien e de di usión pa a el medio i y
pa a el medio j y a
i
/a
j
es la elación en e elocidades que
desc ibe una conduc i idad ela i a pa a la ans e encia de
masa po di usión. Pa a mas de alle e la in oducción
(apa ado I.6).
III.9.4. Ensayos de dopaje pasi o en el
es udio de la capacidad ex ac o a de HAPs po
los bioes imulan es empleados en biodeg adación
Pa a conoce la capacidad de los bioes imulan es en
cap a los HAPs de un medio donde se encuen an con enidos
(en es e caso la silicona), se p opuso el siguien e esquema
expe imen al.
P ime o se usa on iales de id io de 10 mL de
capacidad con silicona (PDMS) ijada en el ondo de su base
(Ve apa ado III.8.4.1). Es os iales ue on expues os a una
disolución sa u ada de PAHs al 10 % de su solubilidad en
me anol. Los HAPs u ilizados ue on: na ale no (>99%,

CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 134 -
Ald ich), enan eno (>98%, Me ck), an aceno (>99%, Fluka),
luo an eno (>99%, Ald ich) y pi eno (>99%, Sigma). Los
c is ales de los HAPs en me anol man u ie on el ni el de
sa u ación.
La silicona de es os iales con iene los HAPs debido al
epa o de es os hid oca bu os desde el me anol a la silicona a
22ºC du an e un pe iodo mínimo de 72h. Después de que la
silicona cap a a los HAPs, el me anol ue cuidadosamen e
e i ado y se limpió la supe icie con un isú pa a elimina
cualquie solución adhe ida. Po úl imo, se la ó la silicona 3
eces con agua Milli-Q pa a elimina el posible me anol
e enido y se secó con un isú (Smi h y col., 2010).
Una ez p epa ados los iales con los HAPs e enidos en
la silicona, se añadió 3 mL de agua Milli-Q en cada ial y
equilib amos los iales a 20ºC y 1000 pm du an e 24. Todo el
expe imen o se ealizó en una habi ación con empe a u a
con olada. Después de es e iempo, se omó 0.75 mL de cada
mues a y se mezcla on con 0.75 mL de me anol pa a
medi las po HPLC con de ec o de luo escencia. De es a
cuan i icación se ob u o una concen ación de HAPs disuel a,
C
1
.
Se e i ó el agua Milli-Q y se añadió 3 mL de los
siguien es bioes imulan es en cada ial: ácidos húmicos de
San a Olalla (10 µg·mL
-1
y 100 µg·mL
-1
), exudados de gi asol
(71.7 µg·mL
-1
), exudados de Lolium (10.1 µg·mL
-1
) y exudados
de Fes uca (17.8 µg·mL
-1
), además del con ol MM. Se alcanzó
el equilib io de es as disoluciones a las 24h de incubación, se
cogie on mues as después de alcanza el equilib io (0.75 mL
de mues a + 0.75 mL de me anol) y se midió la concen ación
median e HPLC con de ec o de luo escencia. De es a
cuan i icación se ob u o una concen ación o al de HAPs, C
.
Po úl imo, se e i a on las disoluciones con los
bioes imulan es y se añadió 3 mL de agua Milli-Q en cada ial,
se equilib a on los iales con agua de igual modo que en los
casos an e io es. Se oma on las mues as y se ealizó
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 135 -
cuan i icación de la misma mane a. De es a medida se ob u o
una concen ación en disolución de HAPs, C
2
.
También se coloca on unos iales con agua Milli-Q en
pa alelo a 20ºC y 1000 pm, pa a con ola que no exis ía una
des iación en las medidas de C
1
y C
2
.
De es a o ma se puede sabe que en el equilib io exis e
una concen ación de HAPs lib e disuel a (C
ld
) dada po la
ecuación 1.
2
21
CC
CC
Aguald
+
== (1)
Mien as que el aumen o de la capacidad (AC) de cap a
los HAPs de las disoluciones con los bioes imulan es en
es udio iene exp esada po la siguien e ecuación (2).
ld
C
C
AC =
(2)
CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías
- 136 -
C
CA
AP
PÍ
ÍT
TU
UL
LO
O
I
IV
V
Resul ados
- “Cuando puedes medi
aquello de lo que hablas,
y exp esa lo con núme os,
sabes algo ace ca de ello;
pe o cuando no lo puedes
medi , cuando no lo puedes
exp esa con núme os, u
conocimien o es pob e e
insa is ac o io: puede se
el p incipio del
conocimien o, pe o apenas
has a anzado en us
pensamien os a la e apa de
ciencia”.
William Thomson Kel in
(1824-1907).
CAPITULO IV: Resul ados
- 144 -
Figu a IV. 3.- Concen aciones de HAPs ecupe adas del NAPL de los con oles y
ma aces inoculados, an o con o sin bioes imulan e S-200. Sólo se mues an los
HAPs con la deg adación signi ica i a (P<0.05). Las ba as mues an la elación
en e el á ea del pico y la del hopano pa a cada ipo de mues a. FL, luo eno; FEN,
enan eno; ANT, an aceno; FLT, luo an eno y PIR, pi eno.
El análisis po GC-MS de los ex ac os neu o y ácido de
la ase acuosa con y sin bioes imulan e p esen ó pe iles
simila es de acumulación de me aboli os. Sin emba go, la
concen ación en los ma aces con bioes imulan e ue
al ededo de 10 eces mayo (los alo es ue on de al ededo
de una décima de a ios mic og amos po milili o, es deci ,
120 ng·mL
-1
pa a 1-indanona, 140 ng·mL
-1
pa a el ácido
di énico, 690 ng·mL
-1
pa a el ácido 2-ca boxicinámico y 3.6
mg·mL
-1
pa a el ácido 4-me il álico, Figu a IV.4). Los
me aboli os neu os co espondie on a alquilos oxidados o
na alenos enólicos, mien as que los compues os ácidos
ue on p incipalmen e ácidos dica boxílicos, gene almen e
acumulados du an e la deg adación de hid oca bu os
a omá icos policíclicos y sus de i ados de me ilo po cepas de
Mycobac e ium. En conc e o, el ácido álico es un p oduc o
in e medio común en la deg adación de na aleno, enan eno,

CAPITULO IV: Resul ados
- 145 -
luo an eno y pi eno, mien as que los ácidos ca boxicinámico
y di énico son me aboli os del na aleno y enan eno,
espec i amen e (Lopez y col., 2008). La p esencia de
me aboli os con los g upos me ilo indica ías simila es de
biodeg adación pa a los co espondien es HAPs alquilo (Vila y
col., 2001; Lopez y col., 2008; Vila y G i oll, 2009).
Figu a IV. 4.- C oma og amas ípicos con GC-MS del ex ac o neu o (a iba) y del
ácido (abajo) de las ases acuosas de los cul i os con Mycobac e ium gil um VM552
en la p esencia de bioes imulan es con los picos iden i icados ( e Tabla IV. 1). Los
me aboli os ácidos ue on iden i icados como los co espondien es a és e es
me ílicos. (•) Ácidos monoa omá icos; (*) lac onas del ácido hid oxi a omá ico; MN,
me ilna aleno; HMN, hep ame ilnonano; DMN, dime ilna aleno, TMN,
ime ilna aleno; MFL, me il luo eno. Pa a la iden i icación de los compues os 1-
18, e ablas IV. 1 y 2.
19 21 23 25 27 29
14 16 18 20 22 24
O
O
H3C
CH2OH
CH3
OH
H3C
HO H
OH
H
H3C
OH
H3C
H3C
H3C
HO H
OH
H
H3C
H3C
OH
H3C
H3C
CH3
OH
H3C
COOCH
3
H3COOC
COOCH3
COOCH3
H3C
H3C
O
O
H3C
O
O
H3C
COOCH3
COOCH3
H3C
COOCH3
COOCH3
COOCH3
COOCH3
H3C
H3CCOOH
COOCH3
2MN
2MN
1,7DMN
TMN
MFL
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
**
*
*
COOCH3
COOCH3
H3C
H3C
1
12
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
14
13
15
16
17
18
19 21 23 25 27 29
14 16 18 20 22 24
O
O
H3C
CH2OH
CH3
OH
H3C
HO H
OH
H
H3C
OH
H3C
H3C
H3C
HO H
OH
H
H3C
H3C
OH
H3C
H3C
CH3
OH
H3C
COOCH
3
H3COOC
COOCH3
COOCH3
H3C
H3C
O
O
H3C
O
O
H3C
COOCH3
COOCH3
H3C
COOCH3
COOCH3
COOCH3
COOCH3
H3C
H3CCOOH
COOCH3
2MN
2MN
1,7DMN
TMN
MFL
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
**
*
*
COOCH3
COOCH3
H3C
H3C
1
12
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
14
13
15
16
17
18
CAPITULO IV: Resul ados
- 146 -
Tabla IV. 1.- Tiempos de e ención (T ) y los iones agmen o del GC-MS pa a
iden i ica los me aboli os de ec ados en los ex ac os neu os de los ma aces con
Mycobac e ium gil um VM552 con uel, en p esencia y ausencia de S-200.
Nº T Ion F agmen o, m/z (%) Iden i icación
1 15.0 132 (M
+
,100), 104 (M
+
-CO, 86.1), 89 (M
+
-CH
3
-CO,4.2), 78
(30.9), 51 (17.06) 1-Indanona
1
2 17.2
146 (M
+
, 94.42), 131 (M
+
-CH
3
, 4.51),117 (M
+
-CH
3
-CH
2
,
100),103 (M
+
-CH
3
-CH
2
-CH
2
, 10.2),91 (22.09), 77 (9.11), 63
(8.86), 51 (8.18)
Me il 1-ndanona
2
3 20.5 158 (M
+
, 56.17), 141 (M
+
-OH, 20.68), 129 (M
+
-CHO, 100), 115
(17.22), 102 (4.06), 98 (1.02)
Na aleno
me anol
2
4 20.6 158 (M
+
,100), 141 (M
+
-OH, 31.08), 129 (M
+
-CHO, 93.24), 115
(M
+
-CHO-CH
2
, 79.73), 105 (79.73), 91 (50), 77 (36.48) Me il na ol
2
20.9 158 (M
+
, 87.83), 141 (M
+
-OH, 28.37), 129 (M
+
-CHO, 100), 115
(M
+
-CHO-CH
2
, 55.41), 104 (18.92), 91 (22.98), 77 (21.62)
21.1 158 (M
+
,100), 141 (M
+
-OH, 4.05), 129 (M
+
-CHO, 32.43), 115
(M
+
-CHO-CH
2
, 18.92), 102 (4.05), 89 (2.70)
5 22.2
190 (M
+
, 5.35), 172 (M
+
-H
2
O, 100), 157 (M
+
-H
2
O-CH
3
, 35.23),
143 (M
+
-H
2
O-CH
3
-CH
2
, 32.57), 129 (M
+
-H
2
O-CH
3
-CH
2
-CH
2
,
39.24), 115 (M
+
-H
2
O-CH
3
-CH
2
-CH
2
-CH
2
, 26.05), 104 (2.85)
1,2-dihid oxi 1,2-
dihid o dime il
na aleno
3
22.3
190 (M
+
, 6.56), 172 (M
+
-H
2
O, 100), 157 (M
+
-H
2
O-CH
3
, 34.95),
143 (M
+
-H
2
O-CH
3
-CH
2
, 30.16), 129 (M
+
-H
2
O-CH
3
-CH
2
-CH
2
,
41.4), 115 (M
+
-H
2
O-CH
3
-CH
2
-CH
2
-CH
2
, 25.48), 104 (4.09)
22.3
190 (M
+
, 19.6), 172 (M
+
-H
2
O, 100), 157 (M
+
-H
2
O-CH
3
, 15.69),
143 (M
+
-H
2
O-CH
3
-CH
2
, 52.94), 129 (M
+
-H
2
O-CH
3
-CH
2
-CH
2
,
26.47), 115 (M
+
-H
2
O-CH
3
-CH
2
-CH
2
-CH
2
, 24.51), 105 (6.86), 91
(10.78), 77 (10.78)
6 22.8
172, (M
+
,100 ), 157 (M
+
-CH
3
, 20.55), 143 (M
+
-CH
3
-CH
2
, 9.82),
128 (M
+
-CH
3
-CH
2
-CH
3
, 26.84), 115 (M
+
-CH
3
-CH
2
-CH
3
-CH
3
,
12.74), 102 (M
+
-CH
3
-CH
2
-CH
3
-CH
3
-CH, 1.99), 86 (M
+
-CH
3
-CH
2
-
CH
3
-CH
3
-CH-O, 4.46)
Dime il na ol
2
22.8
172 (M
+
, 100), 157 (M
+
-CH
3
,39.1), 141 (M
+
-CH
3
-O, 12.57), 128
(M
+
-CH
3
-O-CH, 22.52), 115 (M
+
-CH
3
-O-CH-CH, 12.69), 103
(1.80), 91 (5.02)
23.0
172 (M
+
, 100), 157 (M
+
-CH
3
, 18.43), 143 (M
+
-CH
3
-CH
2
, 8.30),
128 (M
+
-CH
3
-CH
2
-CH
3
, 25.37), 115 (M
+
-CH
3
-CH
2
-CH
3
-CH
3
,
15.02), 102 (M
+
-CH
3
-CH
2
-CH
3
-CH
3
-CH, 2.80), 86 (M
+
-CH
3
-CH
2
-
CH
3
-CH
3
-CH-O, 4.69)
7 23.3
204 (M
+
, 7.30), 186 (M
+
-H2O, 51.13), 171 (M
+
-H
2
O-CH
3
, 100),
158 (M
+
-H
2
O-CH
3
-CH, 15.77), 143 (M
+
-H
2
O-CH
3
-CH-CH
3
,
13.30), 128 (M
+
-H
2
O-CH
3
-CH-CH
3
, 23.87), 115 (17.09)
1,2-dihid oxi 1,2-
dihid o ime il
na aleno
3
24.1
204 (M
+
, 4.85), 186 (M
+
-H
2
O, 100), 171 (M
+
-H
2
O-CH
3
57.28),
157 (M
+
-H
2
O-CH
3
-CH
2
, 7.76), 141 (53.39), 128 (20.38), 115
(33.01)
CAPITULO IV: Resul ados
- 147 -
Tabla IV. 2.- Con inuación de la abla IV. 1.
Nº T Ion F agmen o, m/z (%) Iden i icación
8 23.7 186 (M
+
, 100), 168 (M
+
-H
2
O, 66.72), 157 (70.20), 143
(55.50), 128 (50.75), 115 (54.33) T ime ilna ol
3
24.2 186 (M
+
, 46.31), 171 (M
+
-CH
3
, 100), 153 (M
+
-CH
3
-H2O,
3.06), 141 (8.66), 128 (M
+
12.77), 115 (9.66), 102 (1.83)
9 24.7 196 (M
+
,47.97), 181(M
+
-CH
3
, 100), 165 (M
+
-CH
3
-O,
31.37), 152 (M
+
-CH
3
-O-CH, 25.91) Me il luo enol
3
10 19.1 162 (M
+
, 100), 147 (M
+
-CH
3
, 3.9), 134 (M
+
-CO, 57.7), 119
(31.6), 105 (12.6), 91 (62.9)
2H-1-Benzopi a-2-
ona,3,4-dihid o-6-
me il
2
11 19.5 160 (M
+
, 100), 132 (M
+
-CO, 69.4), 131 (M
+
-CO-H, 71.0),
104 (21.3), 77 (18.0)
2H-1-Benzopi a-2-
ona,6-me il
2
12 20.2 208 (M
+
, 13.7), 177 (M
+
-CH
3
, 100), 149 (M
+
-COOCH
3
,
5.7), 118 (2.8), 91 (11.5)
DME ácido
4-me il- álico
1
13 20.9 194 (M
+
, 31.1), 162 (M
+
-OCH
3
-H, 100), 134 (M
+
-OCH
3
-
HCO, 77.7), 105 (12.6), 91 (60.2) ME me al álico
3
14 21.7
222 (M
+
, 13.5), 191 (M
+
-OCH
3
, 100), 163 (M
+
-COOCH
3
,
4.9), 148 (1.5), 132 (1.9), 120 (1.2), 105 (5.8), 91 (2.7),
77 (4.9)
DME ácido 4,5-
dime il álico
2
15 23.1
220 (M
+
, 3.6), 189 (M
+
-O CH
3
, 10.6), 173 (14.5), 161
(M
+
-COOCH
3
, 100), 145 (7.6), 130 (6.7), 118 (11.0), 115
(6.17), 102 (7.8), 91 (5.7)
DME ácido 2-
ca boxicinámico
1
16 23.4
234 (M
+
, 6.8), 220 (M
+
- CH
3
, 4.9), 203 (M
+
-OCH
3
, 3.9),
189 (M
+
-CH
3
-OCH
3
, 10.7), 175 (M
+
-COOCH
3
, 100), 161
(M
+
-CH
2
-COOCH
3
, 32.0), 145 (30.6), 131 (14.6), 118
(8.7), 115 (16.5), 105 (6.8), 91 (16.5)
DME ácido me il
ca boxicinámico
3
17 25.6
270 (M
+
, 2.7), 239 (M
+
-O CH
3
, 3.8), 211 (M
+
-COOCH
3
,
100), 196 (M
+
-COO CH
3
-CH
3
, 13.4), 180 (M
+
-COOCH-
OCH
3
, 13.3), 168 (6.5), 152 (12.4), 139 (10.1)
DME ácido
di énico
1
18 26.1
248 (M
+
, 7.7), 234 (M
+
-CH
3
, 10.2), 217 (M
+
-OCH
3
, 20.7),
189 (M
+
-COOCH
3
, 100), 174 (M
+
-CH
2
-COOCH
3
, 26.0), 161
(M
+-
CH-COOCH
3
, 7.0), 145 (26.6), 131 (13.1), 115
(42.5), 105 (9.4), 91 (22.5)
DME ácido dime il
ca boxicinámico
3
La iden i icación se basó en análisis de es ánda es au én icos
1
, en el uso
de pa ones de agmen ación con pa ecidos supe io es al 90% con la
lib e ía NIST
2
, o se dedujo de acue do al pa ón de agmen ación y
median e da os de la li e a u a
3
.
a
ME es me il és e , y DME es dime il és e .
CAPITULO IV: Resul ados
- 148 -
IV.1.3. Es udio del epa o del enan eno
desde los NAPLs
La ans e encia de masa del enan eno, omado como
HAP modelo, desde el NAPL a la ase acuosa se midió pa a
de e mina si el aumen o de mine alización causado po el
bioes imulan e pod ía explica se po un aumen o del epa o
en e ambas ases. Sin emba go, el epa o de enan eno,
elegido como ep esen an e de los HAPs del uel en el NAPL,
no se modi icó sus ancialmen e en p esencia del
bioes imulan e (Figu a IV.5).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 10 20 30 40 50 60
Ho as
C (ng/mL)
Figu a IV. 5.- Repa o de enan eno desde el uel/HMN en p esencia y ausencia
del bioes imulan e oleo ílico S-200. Los símbolos ep esen an las concen aciones
de enan eno en la ase acuosa sin bioes imulan e (●) y con bioes imulan e (□). Las
líneas con inua y discon inua ep esen an, espec i amen e, al ajus e expe imen al
de la ecuación 3 (III.6.2) sin y con bioes imulan e. Las ba as de e o indican una
des iación es ánda de los duplicados.
Las asas de epa o y las concen aciones en el
equilib io en ase acuosa se mues an en la Tabla IV. 3. Las
asas pa a los p ocesos abió icos se compa a on con las asas
CAPITULO IV: Resul ados
- 149 -
máximas de mine alización. En ausencia de bioes imulan e, la
asa de mine alización del enan eno inicialmen e p esen e en
el uel/HMN no ue signi ica i amen e di e en e de la que se
midió pa a la asa de epa o. Es o con i ma la consis encia
en e las mediciones po HPLC y
14
C en el sis ema
expe imen al u ilizado. Sin emba go, cuando el bioes imulan e
es aba p esen e, la asa de mine alización máxima ue
supe io a la asa de epa o ob enida.
Tabla IV. 3.- E ec o del bioes imulan e oleo ílico S-200 sob e el epa o y
mine alización de enan eno inicialmen e p esen e en NAPL con uel.
Repa o
Mine alización
NAPL S-200
C
eq
(ng·mL
-1
)
Tasa
( ng·mL
-1
·h
-1
)
Tasa
( ng·mL
-1
·h
-1
)
Final
(%)
Días
b
Fuel/HMN
-
1.62 ± 0.006a
0.18 ± 0.002Aa
0.11 ± 0.012Aa 12.64 ± 0.16a
58
+
1.86 ± 0.047a
0.13 ± 0.007Aa
1.13 ± 0.07Bb 42.5 ± 1.96b 58
-
c
26.60 ± 9.41
d
a
0.70 ± 0.18Aa
e
0.14 ± 0.001Ba 8.12 ± 0.54a 35
+
c
33.83 ± 1.69
d
a
0.77 ± 0.31Aa
e
1.67 ± 0.091Bb 32.57 ± 0.94b
35
Fuel/DEHP
-
2.30 ± 0.34a
0.30 ± 0.12Aa 0.07 ± 0.002Ba 2.96 ± 1.02a 35
+
3.82 ± 0.38
d
a
0.17 ± 0.04Aa
e
0.29 ± 0.18Ba 5.54 ± 2.89a 35
a
Los alo es mos ados son la media ± una des iación es ánda . Los alo es en una
línea seguidos con la misma le a mayúscula no son signi ica i amen e di e en es
(P = 0.05). Pa a cada NAPL, los alo es en una columna seguidos po la misma
le a minúscula no son signi ica i amen e di e en es (P = 0.05). Los análisis
es adís icos de los da os de epa o se ealiza on sepa adamen e median e
a amien os con y sin B ij 35.
b
Pe íodo de iempo empleado pa a las medidas de los expe imen os de
mine alización.
c
T a amien os con B ij 35.
d
Úl imo alo expe imen al po que no se alcanzó el equilib io du an e el
expe imen o.
e
Valo es calculados median e eg esión lineal con los 10 p ime os pun os (las
p ime as 24 h).

CAPITULO IV: Resul ados
- 150 -
Ho as
0
10
20
30
40
0 200 400 600 800 1000
%
14
C Mine alizado
Una si uación simila se obse ó cuando añadimos el
ensioac i o B ij 35 pa a aumen a el epa o de enan eno
desde el NAPL ( uel/HMN) hacia la ase acuosa (Tabla IV. 3).
En es as condiciones, el bioes imulan e oleo ílico no u o, de
nue o, e ec o signi ica i o sob e las asas de epa o, pe o la
mine alización de enan eno se mejo ó en su p esencia,
siguiendo una g á ica en o ma de “S” (Figu a IV.6) y
p oduciéndose asas máximas de mine alización supe io es a
las p e is as po epa o abió ico. En ausencia de
bioes imulan e, la mine alización ambién ue lineal, pe o
ob eniendo signi ica i amen e asas meno es que las asas de
epa o (Tabla IV. 3), lo que sugie e que el epa o excedió el
po encial ca abólico de los mic oo ganismos.
Figu a IV. 6.- E ec o del bioes imulan e oleo ílico (S-200) sob e la mine alización
del enan eno p esen e en el NAPL ( uel/HMN) po Mycobac e ium gil um VM552
en p esencia del ensioac i o B ij 35. Los símbolos ep esen an el % de
14
C-
enan eno mine alizado sin bioes imulan e (○) y con bioes imulan e (■). Las ba as
de e o ep esen an una des iación es ánda de los duplicados.
El e ec o es imulado del S-200 sob e la mine alización
de enan eno se obse ó ambién cuando el HMN ue
sus i uido po DEHP como medio pa a luidiza el NAPL (Tabla
IV. 3). La asa de mine alización ue, en p esencia del
CAPITULO IV: Resul ados
- 151 -
bioes imulan e, in e io a la obse ada con la mezcla de HMN,
pe o aún ue el doble de las p edicciones de la asa de epa o.
También se ealiza on expe imen os de mine alización y
de epa o con enan eno disuel o en NAPLs pu os
(cons i uidos po un solo componen e), con el in de
disc imina los posibles e ec os causados po la
biodeg adabilidad de los NAPLs. Po lo an o, se de e minó la
mine alización del enan eno inicialmen e disuel o en un
NAPL que pod ía se u ilizado como uen e de ca bono y
ene gía (hexadecano o HD) y dos NAPLs que no ue on
deg adados po la cepa bac e iana u ilizada (HMN y
die ilhexil ala o, DEHP). En es as condiciones, las asas de
epa o y las concen aciones en equilib io medidas en
ausencia de bac e ias aumen ó en el ensayo con HMN y con
DEHP, pe o no con HD (Tabla IV. 4). La azón exac a de es as
di e encias es desconocida, pe o puede es a elacionada con
el al o alo del log K
ow
del HD en compa ación con los alo es
de log K
ow
del HMN y DEHP. No obs an e, con independencia
del NAPL usado, las cu as de mine alización del enan eno
u ie on o ma de “S” (Figu a IV.7).
En el inicio de la mine alización del enan eno p esen e
en HD, se obse a on dos ases di e en es. El aumen o po el
bioes imulan e oleo ílico ue e iden e sólo en la ase inicial de
mine alización (has a 234 h) (Figu a IV.7.A), alcanzando la
mine alización su alo máximo. La asa siguien e (has a 404
h) no ue es adís icamen e di e en e con y sin la p esencia del
bioes imulan e. En es a g á ica se p esen ó un pe íodo de
la encia de 150 ho as y un iempo de duplicación de 71.7 h
(µ
max
= 0.009 h
-1
) en expe imen os de c ecimien o po
sepa ado con HD, posiblemen e debido a que la p oli e ación
en HD ocu ió du an e la ase de mine alización máxima de
enan eno.
CAPITULO IV: Resul ados
- 152 -
Figu a IV. 7.- E ec o del bioes imulan e oleo ílico (S-200) sob e la mine alización de
enan eno p esen e en hexadecano (A), hep ame ilnonano (B) y en ala o de di-2-
e ilhexil (C) po Mycobac e ium gil um VM552. Los símbolos ep esen an %
14
C
mine alizados sin bioes imulan e (○) y con bioes imulan e (■). Las ba as de e o
ep esen an una des iación es ánda de los duplicados.
0
10
20
30
0 200 400 600
0
10
20
30
40
50
0 100 200 300
0
10
20
30
40
50
60
0 100 200 300
Ho as
Ho as
Ho as
%
14
C Mine alizado
%
14
C Mine alizado
%
14
C
Mine alizado
A)
B)
C)
CAPITULO IV: Resul ados
- 153 -
Cuando el enan eno se suminis ó en o ma de
c is ales y en las mismas condiciones de c ecimien o, M.
gil um no mos ó ase de la encia y el iempo de duplicación
ue de 22.7 h (µ
max
= 0.03 h
-1
). El c ecimien o exponencial
obse ado en es os expe imen os de c ecimien o excluye
cualquie limi ación nu icional en las condiciones
expe imen ales u ilizadas. La mine alización se mejo ó
ambién en p esencia del bioes imulan e oleo ílico en los
ensayos con enan eno en HMN y DEHP, pe o las di e encias
en las asas se man u ie on du an e oda la ase de
mine alización máxima (Tabla IV. 4). En odos los casos, las
asas de mine alización ue on supe io es a las asas de
epa o.
Todos es os esul ados de epa o conco da on con los
esul ados ob enidos median e ensayos con
polidime ilsiloxano pa a p o undiza en el compo amien o
ísico-químico del enan eno en p esencia y ausencia del
bioes imulan e oleo ílico. Median e es os ensayos se
ob u ie on esul ados de di usión donde
omedioacuos
medioconS
a
a
200−
no ue
supe io a 1, indicando ningún e ec o de ans e encia de
masa po di usión del enan eno en p esencia del e ilizan e
oleo ílico, S-200 y su conco dancia con los da os ob enidos de
la ausencia de un e ec o sob e el epa o.