Influencia de bioestimulantes sobre la accesibilidad microbiana de hidrocarburos aromáticos policíclicos

INFLUENCIA DE BIOESTIMULANTES SOBRE LA ACCESIBILIDAD MICROBIANA DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS Se illa, Diciemb e de 2011 Memo ia que p esen a Mª del Ca men Tejeda Ag edano pa a op a al í ulo de Doc o a en Química - 2 - - 3 - INFLUENCIA DE BIOESTIMULANTES SOBRE LA ACCESIBILIDAD MICROBIANA DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS Visado en Se illa, a de Diciemb e de 2011. LOS DIRECTORES EL TUTOR Memo ia que p esen a: D. Mª del Ca men Tejeda Ag edano pa a op a al g ado de Doc o a en Química Di ec o D D. José Julio O ega Cal o In es igado cien í ico del CSIC Depa amen o de Ag oquímica y Conse ación de Suelos del IRNAS Co - di ec o D . D. Manuel Can os Ba ag án Cien í ico i ula del CSIC Depa amen o de Bio ecnología Vege al del IRNAS D . D. An onio Jo dán López P o eso con a ado doc o Depa amen o de Eda ología y Química Ag ícola de la Facul ad de Química, Uni e sidad de Se illa - 4 - - 5 - DOCTOR D. Jose Manuel Pa do P ie o DIRECTOR DEL INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Ce i ica: Que la p esen e Memo ia de In es igación i ulada “In luencia de bioes imulan es sob e la accesibilidad mic obiana de hid oca bu os a omá icos policíclicos.”, p esen ada po Dª. Mª del Ca men Tejeda Ag edano pa a op a al g ado de Doc o en Química, ha sido ealizada en el Depa amen o de Ag oquímica y conse ación de suelos, bajo la di ección de los D s. D. José Julio O ega Cal o y D. Manuel Can os Ba agán euniendo odas las condiciones exigidas a los abajos de Tesis Doc o ales. En Se illa, a de Diciemb e de 2011. - 6 - - 7 - El p esen e abajo se ha ealizado en el ma co del p oyec o CGL2007-64199 del Plan Nacional de I +D (CYCIT), den o del P og ama Nacional de Fo mación de Pe sonal In es igado (FPI). - 8 - - 9 - Ag adecimien os Quisie a exp esa mis ag adecimien os a odos los que de una o ma más o menos di ec a, han con ibuido a la ealización de mi Tesis Doc o al . Muchísimas g acias al D . José Julio O ega Cal o po b inda me la opo unidad de o ma pa e de su g upo de in es igación y pode desa olla mis conocimien os en es e ámbi o. G acias po su labo como di ec o de es a esis y po sabe ansmi i sus conocimien os an necesa ios pa a mi o mación. Since amen e, g acias. Al D . Manuel Can os Ba agán po co-di igi es a Tesis Doc o al . G acias po su apoyo, an o po sus co ecciones como po sus cha las. Muchas g acias po in oduci me en su g upo, al cual ambién le quie o hace pa ícipe de mis ag adecimien os. A Ma ía del Ma y Ja ie , siemp e me aco da é del cong eso en Mu cia. G acias al D . An onio Jo dán López po acep a se el u o de es a Tesis Doc o al y acili a me en odo momen o el desa ollo de la misma. Debo de ag adece ambién al D . D. José Manuel Pa do P ie o, di ec o del Ins i u o de Recu sos Na u ales y Ag obiología de Se illa po las acilidades p es adas pa a ealiza es a Tesis. Ag adece a Philipp Maye , po hace posible mis es ancias en su cen o, en NERI, Roskilde (Dinama ca). Muchas g acias po in oduci me al apasionan e mundo del passi e dosing, g acias po su calidad humana y la de su g upo de in es igación po acoge me y a a me como uno más. Muchas g acias a Ma gui , Kilian, S in, Geo ey, Tina, Tea, Naja y sob e odo a Va a a. También a i, Eli que e conocí allí y hemos pasado unos momen os inol idables jun o a Ma ia y Almu. - 16 - ÍNDICE GENERAL - 17 - ÍNDICE GENERAL PREFACIO…………………………………………………….……….…..13 ÍNDICE GENERAL……………………………...………………..………17 ÍNDICE DE FIGURAS………………………………………….………...22 ÍNDICE DE TABLAS…………………………………..……….………..27 LISTA DE ACRÓNIMOS...........................................................30 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …. .… …. .… …… …… …. .33 I.1. INTRODUCCIÓN……………………………………….…….….35 I.2. HAPs: DISTRIBUCIÓN Y TOXICIDAD……………………...39 I.3. BIORREMEDIACIÓN: CONCEPTO, TIPOS Y FACTORES LIMITANTES………………………………………………..……..…..49 I.4. INFLUENCIA DE LOS LÍQUIDOS EN FASE NO ACUOSA (NAPLs) EN LA BIODEGRADACIÓN DE HAPs………………….56 I.5. BIODISPONIBILIDAD, BIOACCESIBILIDAD Y ACTIVIDAD QUÍMICA……………………..…………………………………………61 I.6. MÉTODOS DE REPARTO DE HAPs EMPLEANDO POLIDIMETILSILOXANO……………………………………..……..65 I.7. TÉCNICAS DE BIOESTIMULACIÓN……………………......74 I.7.1. Fe ilizan es oleo ílicos……………………………..……..74 I.7.2. Fi o emediación y izo emediación……………….….76 I.7.3. Ma e ia o gánica disuel a: Ácidos húmicos……….…86 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I II I. . O OB BJ JE ET TI IV VO OS S… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …. .. .91 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I II II I. . M MA AT TE ER RI IA AL LE ES S Y Y M ME ET TO OD DO OL LO OG GÍ ÍA A ................... 95 III.1. REACTIVOS ................................................................................... 97 ÍNDICE GENERAL - 18 - III.2. LÍQUIDOS EN FASE NO ACUOSA (NAPLs).......................... 98 III.3. SUELOS .......................................................................................... 99 III.4. BACTERIAS, MEDIOS, CONDICIONES DE CULTIVO Y PREPARACIÓN DE INÓCULOS........................................................ 101 III.5. ANÁLISIS DE HAPs POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC).............................................................. 104 III.6. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL FERTILIZANTE OLEOFÍLICO EN LA BIODEGRADACIÓN DE HAPS................. 106 III.6.1. Expe imen os de mine alización con el mé odo de la in e ase cons an e.......................................................................... 106 III.6.2. Expe imen os de epa o con el mé odo del á ea in e ásica cons an e....................................................................... 109 III.7. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LAS RAÍCES DE PLANTAS Y SUS EXUDADOS EN LA BIODEGRADACIÓN DE HAPs ......................................................................................................... 110 III.7.1. P oducción in i o de exudados.................................. 110 III.7.2. Mine alización de pi eno en cul i os líquidos en p esencia y ausencia de exudados de aíces de gi asol ...... 115 III.7.3. Ensayo en in e nade o .................................................... 116 III.7.4. Ex acción de los HAPs del suelo y pu i icación de la mues a............................................................................................... 120 III.7.5. Expe imen os de mine alización de pi eno en suspensiones de suelo con aminado con c eoso a en p esencia y ausencia de exudados de gi asol............................................. 122 III.8. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE ÁCIDOS HÚMICOS EN LA BIODEGRADACIÓN DE HAPS ......................................................... 123 III.8.1. P epa ación de ácidos húmicos..................................... 123 ÍNDICE GENERAL - 19 - III.8.2. Mine alización de pi eno y enan eno en cul i os líquidos en p esencia o ausencia de ácidos húmicos .......... 123 III.8.3. Expe imen os de disolución de pi eno en p esencia y ausencia de ácidos húmicos. Con ol de la concen ación lib e disuel a................................................................................................ 124 III.9. ENSAYOS CON TÉCNICAS DE DOPAJE PASIVO CON POLIDIMETILSILOXANO.................................................................... 127 III.9.1. P epa ación de iales con polidime ilsiloxano empleados en dopaje pasi o............................................................................... 127 III.9.2. Es udio de la mine alización y disolución de pi eno en p esencia y ausencia de ácidos húmicos en iales con PDMS128 III.9.3. Es udio de la di usión de PAHs en p esencia de los 3 bioes imulan es empleados en biodeg adación...................... 130 III.9.4. Ensayos de dopaje pasi o en el es udio de la capacidad ex ac o a de HAPs po los bioes imulan es empleados en biodeg adación.................................................................................. 133 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I IV V. . R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S..............................................137 IV.1. FERTILIZANTE OLEOFÍLICO................................................. 139 IV.1.1. Ca ac e ización del e ilizan e oleo ílico S-200....... 139 IV.1.2. In luencia del e ilizan e oleo ílico en la biodeg adación de los componen es del uel ......................................................... 139 IV.1.3. Es udio del epa o del enan eno desde los NAPLs148 IV.1.4. E ec o de las condiciones de agi ación y de los nu ien es en la biodeg adación.................................................. 155 IV.2. RIZOSFERA Y EXUDADOS DE RAÍZ................................... 156 IV.2.1. Ca ac e ización de los exudados de aíz.................... 156 ÍNDICE GENERAL - 20 - IV.2.2. In luencia de la izos e a de gi asol sob e la eliminación de HAPs p oceden es de un suelo con aminado con c eoso a162 IV.2.3. In luencia de exudados de aíces de gi asol sob e la biodeg adación de HAPs p esen es en un suelo con aminado con c eoso a....................................................................................... 168 IV.2.4. E ec o de los exudados de aíces de gi asol sob e la biodeg adación de pi eno .............................................................. 173 IV.3. ÁCIDOS HÚMICOS.................................................................... 175 IV.3.1. Ca ac e ización de los ácidos húmicos....................... 175 IV.3.2. Es udio ísico-químico de los HAPs en p esencia de ácidos húmicos median e ensayos de epa o con polidime ilsiloxano........................................................................... 176 IV.3.3. Es imación de la elocidad de deg adación de enan eno y pi eno en cul i os líquidos en p esencia de ácidos húmicos............................................................................................... 178 IV.3.4. Ca ac e ización de la concen ación o al y lib e disuel a de pi eno en p esencia de ácidos húmicos.............................. 185 IV.3.5. E olución de la concen ación de pi eno lib e disuel a du an e su biodeg adación en p esencia y ausencia de ácidos húmicos............................................................................................... 190 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O V V. . D DI IS SC CU US SI IÓ ÓN N...................................................195 V.1. FERTILIZACIÓN DIRIGIDA DE LA INTERFASE NAPL/AGUA MEDIANTE FERTILIZANTES OLEOFÍLICOS............................... 197 V. 2. EFECTO ECOFISIOLÓGICO DE LA RIZOSFERA DEL GIRASOL ................................................................................................. 201 V.3. PAPEL DE LA ACTIVIDAD QUÍMICA EN EL EFECTO BIOESTIMULANTE DE LOS ÁCIDOS HÚMICOS ....................... 207 V.4. VISIÓN GENERAL Y COMPARACIÓN ENTRE LOS BIOESTIMULANTES UTILIZADOS.................................................. 211 ÍNDICE GENERAL - 21 - C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O V VI I. . C CO ON NC CL LU US SI IO ON NE ES S ..........................................217 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O V VI II I. . B BI IB BL LI IO OG GR RA AF FÍ ÍA A...........................................223 ÍNDICE DE FIGURAS - 22 - ÍNDICE DE FIGURAS Figu a I. 1.- Con aminación del suelo en Eu opa en el año 2006 ...................................................................................................37 Figu a I. 2.- Con aminan es p esen es en Eu opa en el año 2006 ...................................................................................................37 Figu a I. 3.- Asignación p esupues al del gas o público y p i ado pa a la ges ión de de emplazamien os con aminados del año 2006.....................................................................................39 Figu a I. 4.- Repa o de los con aminan es hid ó obos desde el NAPL hacia la ase acuosa, en ausencia y p esencia de mic oo ganismos.............................................................................61 Figu a I. 5.- Esquema donde se ilus a la acción biodisponible y la bioaccesible de un con aminan e en el suelo, al y como se de inen es os é minos median e la ubicación ísica ................................................................................63 Figu a I. 6.- Esquema de un sis ema con a ias ases.....675 Figu a I.7.- Esquema ep esen a i o de la o mación de la capa de di usión limi an e (UBL) en e la uen e de con aminación y los mic oo ganismos en un medio acuoso………………………………………………………………66 Figu a I. 8.- Esquema de los 3 pasos en el p oceso de di usión de los PAHs en las mic ocáma as desde el disco con aminado al disco sin PAHs.............................................................................69 Figu a I. 9.- Fundamen o de la écnica de dopaje pasi o..72 Figu a I. 10.- Mecanismos en uel os en la i o emediación de hid oca bu os a omá icos policíclicos......................................79 Figu a I. 11.- Rizo emediación de HAP..................................85 ÍNDICE DE FIGURAS - 23 - Figu a I. 12.- Es uc u a de los ácidos húmicos..................87 Figu a III. 1.- Emplazamien o con aminado con c eoso a. Fo os de la zona y del mues eo de suelo. ............................100 Figu a III. 2.- Tubos de ensayo de 150 x 25 mm de capacidad pa a el p ime ensayo de cul i o in i o ...............................111 Figu a III. 3.- Sis ema u ilizado pa a la ob ención de exudados de gi asol in i o. ..........................................................................113 Figu a III. 4.- Diseño expe imen al del ensayo ealizado en in e nade o .....................................................................................118 Figu a III. 5.- Esquema del p oceso de ex acción y cuan i icación de HAPs de suelos............................................121 Figu a III. 6.- Viales de dopaje pasi o con PDMS ijados en su base pa a la mine alización de 50 µg·mL -1 de pi eno po Mycobac e ium gil um VM552 en p esencia de 10 µg·mL -1 de ácidos húmicos ex aidos de San a Olalla, Huel a. ..........129 Figu a III. 7.- Sección ans e sal del diseño expe imen al de las mic ocáma as empleadas en el es udio del aumen o de di usión en p esencia de los di e en es bioes imulan es u ilizados. ........................................................................................131 Figu a IV. 1.- E ec o del bioes imulan e oleo ílico (S-200) sob e la mine alización de (A) enan eno, (B) pi eno, y (C) luo an eno p esen e en uel/HMN po Mycobac e ium gil um VM552...............................................................................................141 Figu a IV. 2.- Á eas no malizadas con hopano (A/A HOP ) de los n-alcanos (m/z 85) de ec ados po el análisis GC-MS en el uel/HMN esidual de los con oles abió icos (ba as de colo neg o) y con cul i o de Mycobac e ium gil um VM552 (ba as con ayas), con S-200..................................................................143 ÍNDICE DE FIGURAS - 24 - Figu a IV. 3.- Concen aciones de HAPs ecupe adas del NAPL de los con oles y ma aces inoculados, an o con o sin bioes imulan e S-200...................................................................144 Figu a IV. 4.- C oma og amas ípicos con GC-MS del ex ac o neu o (a iba) y del ácido (abajo) de las ases acuosas de los cul i os con Mycobac e ium gil um VM552 en la p esencia de bioes imulan es con los picos iden i icados.........................145 Figu a IV. 5.- Repa o de enan eno desde el uel/HMN en p esencia y ausencia del bioes imulan e oleo ílico S-200148 Figu a IV. 6.- E ec o del bioes imulan e oleo ílico (S-200) sob e la mine alización del enan eno p esen e en el NAPL ( uel/HMN) po Mycobac e ium gil um VM552 en p esencia del ensioac i o B ij 35.......................................................................150 Figu a IV. 7.- E ec o del bioes imulan e oleo ílico (S-200) sob e la mine alización de enan eno p esen e en di e een es NAPLs pu os.................................................................................................152 Figu a IV. 8.- E ec o del bioes imulan e oleo ílico (S-200) sob e la mine alización del enan eno p esen e en uel/HMN lib emen e, con el á ea in e acial cons an e (con cilind os) y añadiendo di e en es nu ien es ..............................................156 Figu a IV. 9.- Sis ema adicula de Fes uca y Lolium.......157 Figu a IV. 10.- De alle de la calidad del sis ema adicula in i o de Helian hus, Lolium y Fes uca.....................................159 Figu a IV. 11.- Desa ollo del sis ema adicula del gi asol en una mace a con suelo con aminado.......................................163 Figu a IV. 12.- Recuen o de poblaciones del suelo con aminado con c eoso a (mezcla, 1:1) con los di e en es a amien os ealizados en el in e nade o………………..162 ÍNDICE DE FIGURAS - 25 - Figu a IV. 13.- Abundancia ela i a de los g upos ilogené icos de las eubac e ias iden i icados en los di e en es a amien os ealizados en in e nade o............................................ 167 Figu a IV. 14.- Mine alización de 14 C-pi eno en suspensiones de suelo con aminado con c eoso a po bac e ias au óc onas, en p esencia y ausencia de exudados de aíces de gi asol169 Figu a IV. 15.- Pe il del DGGE de agmen os del gen 16S RNA ampli icados con PCR de las suspensiones de suelo con aminado con c eoso a .........................................................172 Figu a IV. 16.- Mine alización de pi eno pu o en p esencia y ausencia de exudados de aíces de gi asol...........................174 Figu a IV. 17.- Mine alización de pi eno y de enan eno a una concen ación de 50 µg·mL -1 en p esencia de 100 µg·mL -1 de ácidos húmicos ........................................................................180 Figu a IV. 18.- Mine alización de pi eno a 50 µg·mL -1 en p esencia y ausencia de ácidos húmicos a 10 µg·mL -1 Di e enciándose los siguien es a amien os: sin equilib a , equilib ando y en p esencia de PDMS. ..................................182 Figu a IV. 19.- Es udio de la disolución de 50 µg·L -1 de pi eno a 80 pm y 25ºC: A) concen ación de pi eno o al disuel o, B) concen ación de pi eno lib e disuel o y C) concen ación de pi eno o al con dopaje pasi o..................................................188 Figu a IV. 20.- Concen aciones lib es disuel as medidas en la biodeg adación de pi eno en ausencia y en p esencia de 10 µg·mL -1 de ácidos húmicos po espec o o óme o sinc ónico de luo escencia.. ..........................................................................191 Figu a IV. 21.- Va iación de la in ensidad de luo escencia median e espec o o óme o de luo escencia sinc ónica de las medidas de biodeg adación en cube a de pi eno a 53.4 ng·mL - 1 y en ausencia (A) y p esencia (B) de 10 µg·mL -1 de ácidos húmicos............................................................................................193 LISTA DE ACRÓNIMOS - 32 - PDA: Pa i ioning D i en Adminis e ing PDMS: Polidime ilsiloxano PRTR-España: Regis o Es a al de Emisiones y Fuen es Con aminan es de España SH: Sus ancias Húmicas SPME: Mic oex acción en Fase Sólida SW: Medio Suiza T : Tiempos de Re ención TSA: Aga , Soja y T ip ona UBL: Us i ed Bounda y Laye C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I I In oducción - “Los imposibles de hoy se án posibles mañana”. Kons an in Tsiolko sky (1857-1935). CAPÍTULO I: In oducción - 34 - CAPÍTULO I: In oducción - 35 - I.1. INTRODUCCIÓN A a és del desa ollo indus ial en odo el mundo podemos hace nos idea de la gene ación de un amplio núme o de compues os na u ales y sin é icos pe judiciales pa a el medio ambien e debido a negligencias ealizadas en el a amien o de esiduos, e ede os ilegales de desechos indus iales p o ocados al ez, po igno ancia o al a de ecu sos y de ames acciden ales. Como consecuencia de la p oducción de es os con aminan es, exis en nume osos si ios que equie en una limpieza de es os esiduos an o en suelos, como en lodos o aguas supe iciales. Sólo en Es ados Unidos se ha calculado al ededo de 1.7 illones de dóla es in e idos en los úl imos 30 años pa a a a es os luga es con aminados (Yu, 2006). Po odo ello, se ha desa ollado una conciencia social pa a es ablece una legislación adecuada que eduzca la p oducción de esiduos con aminan es y p e eni el escape de los mismos al medio ci cundan e. Algunos acciden es han supues o un ele ado impac o ambien al como el e ido de combus ible del Exxon Valdez, la libe ación de p oduc os adiac i os as el acciden e de la cen al nuclea de Che nobil, la o u a de la p esa de Aznalcólla o la ca ás o e ecológica p oducida po el e ido del pe ole o P es ige en e a las cos as gallegas. Más ecien emen e, se ha enido cons ancia del de ame de pe óleo de uno de los pozos de la emp esa B i ish Pe oleum (BP) en el Gol o de México y la c isis nuclea en la cen al de Fukushima as el e emo o y sunami en Japón, odos es os desas es ecológicos han pues o de mani ies o la jus i icada p eocupación y ala ma que es os emas susci an en el conjun o de la población y lo mucho que queda po hace pa a p e eni o esol e adecuadamen e es e ipo de si uaciones. El empleo de la bio ecupe ación o bio emediación, es deci , la ecupe ación de e enos y acuí e os con aminados median e p ocesos biológicos, en el a amien o de esiduos pelig osos supone un concep o ela i amen e nue o que se es á con i iendo en una endencia impo an e y de ápido CAPÍTULO I: In oducción - 36 - c ecimien o den o de la legislación ambien al. Desde 1970, en la g an mayo ía de los países indus ializados se ha enido dando una g an impo ancia al a amien o de emplazamien os con aminados y se ha comp obado que los a amien os biológicos son más económicos que los p ocedimien os químicos o ísicos (Eweis y col. , 1998). El campo de ac uación pa a la bio emediación es bas an e amplio. Po ejemplo, de las se ecien as cincuen a mil ins alaciones de depósi os sub e áneos de almacenamien o exis en es en Es ados Unidos, más de escien as mil han enido ugas y se p oducen ap oximadamen e ein a mil nue as emisiones cada año. Más de la mi ad de es as ins alaciones se des inan al almacenamien o de hid oca bu os de i ados del pe óleo, con aminan es que se han comp obado que son biodeg adados con ela i a acilidad (Nikolaou y col. , 2009). Ac ualmen e no se conoce con exac i ud el núme o de emplazamien os a ados median e bio ecupe ación. Se sabe que en Cali o nia los depósi os de almacenamien o sub e áneo con ugas cons i uyen la mayo uen e de e enos y aguas sub e áneas con aminados. Has a el 1 de ene o de 1991, se ha ubicado más de diecisie e mil de es os depósi os (Wosika, 1991). La g an mayo ía de los emplazamien os de los depósi os de almacenamien o sub e áneo con ugas e an de p oduc os de i ados del pe óleo. La con aminación del suelo en Eu opa a ec a a casi doscien os cincuen a mil espacios, y se espe a que con inúe c eciendo. Se es iman ac i idades po encialmen e con aminan es en ce ca de 3 millones de emplazamien os en oda la Unión Eu opea (UE), muchos de los cuales es p eciso segui in es igando pa a es ablece el daño y si se equie e la ecupe ación del suelo (p oceso de limpieza). A pesa de los es ue zos que se han ealizado en algunos países, pasa án décadas pa a limpia el legado de la con aminación del suelo. Du an e los úl imos 30 años, ap oximadamen e ochen a mil CAPÍTULO I: In oducción - 37 - emplazamien os se han a ado en aquellos países que disponen de medidas de ecupe ación (Figu a I.1). 2965 1824 246 81 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Emplazamien os con ac i idad po encialmen e con amian e (es imados) Emplazamien os con aminados po encialmen e (iden i icados) Emplazamien os con aminados (es imados) Emplazamien os ecupe ados Núme o de luga es con aminados en el año 2006 (x 1000) Figu a I. 1.- Con aminación del suelo en Eu opa en el año 2006 (Eu opean En i onmen Agency, 2006). La Agencia Eu opea de Medio Ambien e (EEA, siglas en inglés de Eu opean En i onmen Agency) p opo cionó da os del 2006 a i mando que los con aminan es más ecuen es encon ados en el suelo son los me ales pesados y acei es mine ales que son ob enidos en el p oceso de e inación del pe óleo, siendo es os úl imos jun o a los hid oca bu os clo ados los más ecuen es en aguas sub e áneas. O os con aminan es p esen es ue on hid oca bu os a omá icos policíclicos (HAPs), BTEX (que es el ac ónimo de benceno, olueno, e ilbenceno y xileno) y enoles (Figu a I.2). 37% 4% 2% 4% 6% 13% 34% Me ales pesados Acei es mine ales HAPs BTEX Fenoles Hid oca bu os clo ados O os Figu a I. 2.- Con aminan es p esen es en Eu opa en el año 2006 (Eu opean En i onmen Agency, 2006). CAPÍTULO I: In oducción - 38 - La limpieza de emplazamien os con aminados es una ac i idad cos osa. Sin emba go, en los países donde las es imaciones son posibles, el gas o anual sigue siendo ela i amen e pequeño, con p omedio del 2% de los cos os es imados necesa ios pa a la ges ión global de los espacios con aminados. Aunque la mayo ía de los países de Eu opa ienen una legislación pa a la ges ión de emplazamien os con aminados, donde se aplica que "quien con amina paga", se siguen u ilizando g andes sumas de dine o público pa a inancia las ac i idades de emediación, con un p omedio del 35% del gas o o al. Es o se debe p incipalmen e al alcance limi ado de la legislación, especialmen e en el caso de la emediación de la con aminación his ó ica, donde muchos de los esponsables de la con aminación legalmen e ya no exis en, no pueden se iden i icados o son insol en es. Según NICOLE (las siglas en inglés de Ne wo k o Indus ially Con amina ed Land in Eu ope) se ha des inado pa a la ecupe ación de zonas con aminadas a a és de los Fondos Es uc u ales Eu opeos, un p esupues o o al de dos mil doscien os cincuen a millones de eu os pa a los años 2005 al 2013 (Ne wo k o Indus ially Con amina ed Land in Eu ope, 2009). Lamen ablemen e és a es una endencia común en oda Eu opa. La p opo ción de los ondos públicos u ilizados pa a ecupe a emplazamien os con aminados oscila en e el 100% en la República Checa, ex República Yugosla a de Macedonia y en España, siendo un mínimo del 7% en F ancia, donde una g an p opo ción de los ondos p o iene del sec o p i ado (Figu a I.3). Pe o al igual que muchos aspec os de la in o mación del suelo, sólo los da os ap oximados sob e el gas o público es án disponibles, mien as que la in o mación sob e el gas o p i ado sigue siendo i egula . CAPÍTULO I: In oducción - 39 - Figu a I. 3.- Asignación p esupues al del gas o público y p i ado pa a la ges ión de de emplazamien os con aminados del año 2006 (Eu opean En i onmen Agency, 2006). Pa a educi los gas os en la ecupe ación de suelos con aminados, se han es ado desa ollando y mejo ando écnicas de bio emediación. La mayo ía de los HAPs, como po ejemplo, na aleno, enan eno, luo an eno, an aceno, pi eno, benzo[a]an aceno y benzo[a]pi eno han sido desc i os como una uen e ene gé ica de ca bono, o bien son deg adados come abólicamen e po di e sos g upos de bac e ias (Miya a y col. , 2004). La biodeg adación es una he amien a signi ica i a pa a elimina es os con aminan es del medio ambien e, pe o su baja disponibilidad hace que sean necesa ios es udios cen ados en es e ac o limi an e. I.2. HAPs: DISTRIBUCIÓN Y TOXICIDAD Los hid oca bu os a omá icos policíclicos son p oducidos en di e sas ope aciones indus iales a al as empe a u as ales como el e inado de pe óleo, p oducción de coque y conse ación de made as, ambién pueden se sin e izados po algunas plan as o po o mación na u al du an e uegos en bosques o p ade as. Son con aminan es comunes en es e ipo de indus ias (Wilson y Jones, 1993) y en e ede os incon olados de esiduos pelig osos. También CAPÍTULO I: In oducción - 40 - se pueden encon a en la a mós e a, medios acuá icos, en el suelo, en la bio a, en comidas, e c. (Ei oa y col. , 1998). Es e g upo de compues os consis en en dos o más anillos de benceno condensados, dispues os en di e en es con igu aciones, pe o siemp e con la p esencia exclusi a de ca bono e hid ógeno. Los HAPs a amen e suelen encon a se de mane a indi idual, sino que no malmen e se encuen an en o ma de mezclas complejas con o os hid oca bu os, lo cual di icul a aún más su eliminación del suelo (Nikolaou y col. , 2009). Son e modinámicamen e es ables debido a la ene gía de esonancia asociada a la deslocalización de los elec ones [ en los anillos bencénicos en e a o os compues os no a omá icos (Mas and ea y col. , 2005). Es os compues os a omá icos son el mayo cons i uyen e de la c eoso a (al ededo del 85% es su con enido en PAHs), que es un p oduc o ípico u ilizado en la p ese ación de la made a (Eweis y col. , 1998) y cuyo uso y come cialización se p ohibió en España al en a en igo la nue a no ma i a eu opea (Di ec i a 2001/90/CE, el 30 de junio de 2003). Es a nue a no ma i a p ohibió el uso y come cialización de made as a adas con c eoso a po el daño que es e p oduc o puede ocasiona an o al medio ambien e como a la salud humana. Debido a su baja solubilidad y al a hid o obicidad, los HAPs ienden a adhe i se a la supe icie de pa ículas como las cons i uidas po la ma e ia o gánica del suelo, haciendo que es os compues os engan una impo an e pe sis encia en condiciones na u ales (Bam o h y Single on, 2005). La adso ción de los HAPs en el suelo se e a ec ada po a ios ac o es, de los cuales, los más impo an es son las p opiedades del compues o con aminan e (es uc u a molecula y solubilidad en agua) y las p opiedades del e eno (con enido en a cillas y ma e ia o gánica, pH, humedad y empe a u a). O ganismos o iciales de p es igio cien í ico in e nacional, incluyendo la Agencia de P o ección Ambien al de los Es ados Unidos (EPA), ase e an la pelig osidad de es os CAPÍTULO I: In oducción - 41 - compues os, y ecomiendan su con ol, educción y a se posible su eliminación. Exis e una lis a con eccionada po la EPA en la que igu an los 129 compues os o gánicos que deben se moni o izados en los e idos indus iales y municipales, den o de la cual hay ecogidos 16 HAPs, que se ían los más pelig osos pa a la salud. Además, son conside ados po la EPA, la O ganización Mundial de la Salud (OMS) y la Comunidad Económica Eu opea (CEE), como con aminan es p io i a ios debido a sus e ec os ca cinogénicos. El benzo(a)pi eno es á incluido como uno de los 12 compues os diana en una es a egia de la EPA pa a con ola la pe sis encia y bioacumulación de con aminan es óxicos (Renne , 1999). En la Tabla I. 1 apa ecen las p opiedades ísico- químicas y es uc u ales de 16 HAPs p io i a ios, donde se obse a la disminución de la ola ilidad y la solubilidad en agua a medida que aumen a el peso molecula (Wilson y Jones, 1993). El aumen o del núme o de anillos hace que es os compues os o gánicos sean menos solubles en agua y se inc emen e su esis encia a la deg adación biológica. El coe icien e de epa o oc anol-agua (K ow ) es una o ma de medi la hid o obicidad de los compues os químicos o gánicos. Los HAPs ienen un coe icien e ela i amen e al o, lo cual indica que ienen una a inidad mayo po las pa ículas o gánicas del suelo que po el agua. El coe icien e de epa o sólido-agua (K oc ) es un ac o a ene en cuen a pa a sabe la endencia de es os compues os a se ela i amen e inmó iles y pe sis en es en el suelo. En gene al, los HAPs de bajo peso molecula (como el na aleno) son más olá iles, solubles en agua y menos lipo ílicos que los compues os de al o peso molecula . Es as ca ac e ís icas ísicas y químicas de e minan en g an medida su compo amien o en el ambien e. Los HAPs de bajo peso molecula al se más olá iles, se encuen an p incipalmen e en la ase de apo en el ai e, donde son suscep ibles a la descomposición ( o oquímica y é mica), lo que es inge sus iempos de esidencia en la a mós e a a un pa de días. Los que no son deg adados, son ans e idos a aguas supe iciales o a suelos po deposición CAPÍTULO I: In oducción - 48 - - Pa a los se es humanos, La Agencia de Sus ancias Tóxicas y Regis o de En e medades de Es ados Unidos (ATSDR po sus siglas en inglés) explica que podemos expone nos a los HAPs espi ando ai e con aminado si se abaja en áb icas que p oducen coque, alqui án y as al o, plan as donde se ab ican p oduc os ahumados y en ins alaciones donde quemen esiduos municipales. También espi ando ai e del humo de ciga illos, humo de made a, emisiones del ubo de escape de au omó iles, caminos de as al o, o humo de la combus ión de p oduc os ag ícolas, a a és del con ac o con ai e, agua o ie a ce ca de si ios de esiduos pelig osos; comiendo ca nes p epa adas en la pa illa, ce eales, ha ina, pan, ho alizas, u as, alimen os en escabeche o omando leche de aca o agua con aminadas. Las mad es que lac an y que i en ce ca de si ios con esiduos pelig osos pueden ansmi i los HAPs a los niños a a és de la leche (ATSDR, 1995). El na aleno, miemb o del g upo de HAPs p io i a ios, es un con aminan e común en el agua po able. El en enenamien o agudo con na aleno en humanos puede da como esul ado anemia hemolí ica y ne o oxicidad. Adicionalmen e, se han obse ado cambios de ma ológicos y o almológicos en abajado es expues os a na aleno en el ambien e ocupacional. El enan eno es conocido po se un o osensibilizado de la piel humana, un alé geno mode ado y mu agénico pa a sis emas bac e ianos en condiciones especí icas (Mas angelo y col. , 1996). Hay poca in o mación disponible pa a o os HAPs como el acena eno, luo an eno y luo eno, espec o a su oxicidad en mamí e os. Sin emba go, la oxicidad del benzo(a)pi eno, benzo(a)an aceno, benzo(b) luo an eno, benzo(k) luo an eno, dibenzo(a,h)- an aceno e indeno (1,2,3-cd)pi eno ha sido muy es udiada y exis e su icien e e idencia expe imen al pa a demos a que son ca cinogénicos (Mas angelo y col. , 1996). CAPÍTULO I: In oducción - 49 - I.3. BIORREMEDIACIÓN: CONCEPTO, TIPOS Y FACTORES LIMITANTES La bio emediación es una ecnología que u iliza el po encial me abólico de mic oo ganismos deg adado es ( undamen almen e bac e ias, pe o ambién hongos y le adu as) pa a ans o ma con aminan es o gánicos en compues os más simples, poco o nada con aminan es, como dióxido de ca bono, agua y biomasa celula . Es a ecnología puede ealiza se en condiciones ae obias y anae obias y se puede emplea pa a limpia e enos o aguas con aminadas. En condiciones ae obias, los mic oo ganismos deg adado es disponen de oxígeno a mos é ico como acep o de elec ones, mien as que, en condiciones anae obias, la ac i idad biológica es á espaldada po la p esencia de o os acep o es de elec ones. A eces du an e el p oceso ae obio o anae obio, los p oduc os in e medios que se o man son menos, igual o mas óxicos que el con aminan e o iginal de pa ida. En e las posibles écnicas de a amien o aplicables pa a la descon aminación de un de e minado espacio na u al, me ecen especial a ención los p ocesos de deg adación biológica ya que son ú iles pa a muchos ipos de esiduos o gánicos. Son p ocesos na u ales que no suponen un impac o adicional signi ica i o sob e los ecosis emas y que se pueden ealiza a un bajo cos e. En muchos casos, pueden lle a se a cabo en el si io donde se ha p oducido la con aminación, con lo cual se elimina la necesidad de anspo a ma e iales pelig osos. El esul ado inal de un a amien o de bio emediación depende en g an medida de la oxicidad y la concen ación inicial de los con aminan es, su biodeg adabilidad, las p opiedades del suelo con aminado y el sis ema de a amien o seleccionado. En e los con aminan es a ados habi ualmen e po es os mé odos se encuen an los compues os o gánicos olá iles y semi olá iles no halogenados CAPÍTULO I: In oducción - 50 - y los de i ados del pe óleo cuyos componen es p io i a ios son los HAPs. Cuando la con aminación se debe a al as concen aciones de me ales, compues os o gánicos con al a p opo ción de clo o o sales ino gánicas, la e icacia del a amien o se educe debido a la oxicidad de es os compues os pa a los mic oo ganismos. Como es e iden e, el p oceso biológico pa a a a los compues os óxicos debe compe i con los mé odos exis en es en é minos de economía y e iciencia. Los p ocesos biológicos ienen las en ajas de eque i in e siones de capi al mode adas, bajo consumo de ene gía, se ambien almen e segu os y no gene a esiduos. En los úl imos años, se han c eado una se ie de emp esas pa a desa olla y come cializa ecnologías de biodeg adación. La exis encia de es as compañías se jus i ica desde el pun o de is a económico po el aumen o del cos e de los a amien os adicionales y del echazo social a los mismos, así como po el endu ecimien o de la no ma i a en ma e ia de esiduos y medio ambien e. El desa ollo u u o de las écnicas de ecupe ación biológica de espacios con aminados, equie e la adecuada in eg ación de mic obiología molecula e ingenie ía de sis emas. El a amien o de ecupe ación biológica ue ya ensayado a g an escala, con mo i o de la con aminación po pe óleo ocasionada po el e ido al ma del buque pe ole o Exxon Valdez en Alaska (Gallego y col. , 2006). Muchos mic oo ganismos pueden p oduci ensioac i os, que pueden emulsiona los acei es en el agua y acili a su eliminación. A di e encia de los ensioac i os químicos, los de o igen mic obiológico son inocuos y biodeg adables. También se han u ilizado, en ocasiones, e ilizan es pa a inc emen a la asa de c ecimien o de las poblaciones au óc onas capaces de deg ada compues os de i ados del pe óleo, po ejemplo en el desas e ocasionado po el pe ole o Exxon Valdez en Alaska, donde se aplica on e ilizan es oleo ílicos como el INIPOL o el S-200, u ilizado en es a esis, y del que se habla á más de enidamen e en el apa ado I.7.1. CAPÍTULO I: In oducción - 51 - El uso de mic oo ganismos no es á es ingido únicamen e al a amien o de compues os o gánicos. En algunos casos, los o ganismos seleccionados pueden ambién educi los ca iones óxicos de los me ales pesados (como el selenio), a la o ma elemen al menos soluble y menos óxica. Po lo an o, el a amien o biológico puede ambién aplica se a las aguas supe iciales con aminadas po me ales pesados. Pa a ealiza la ecupe ación de un espacio con aminado, podemos ealiza di e en es es a egias (Conde, 2000) que, en gene al, se pueden ag upa en es ca ego ías: con inamien o, limpieza y es a egia de espues a. El con inamien o iene como inalidad el aislamien o de la uen e con aminan e, e i ando la salida de líquidos (lixi iados), pol o o gases; es deci con olando la dispe sión de la con aminación. Es el a amien o que se aplica habi ualmen e en el caso de con aminaciones p o ocadas po los e ede os incon olados de esiduos indus iales. Las medidas que incluye gene almen e es e ipo de ac uación son: ecub imien o, e ege ación, con ol de aguas de esco en ía supe icial y con ol de lixi iados y aguas sub e áneas. La limpieza incluye la aplicación de una o a ias ecnologías pa a elimina los con aminan es del suelo. Se dis inguen es ipos de a amien o: 1) a amien o in si u del suelo con aminado, 2) exca ación del emplazamien o con aminado, e i ada del suelo a ec ado y a amien o ex si u del mismo y po úl imo, 3) exca ación, e i ada y depósi o en e ede o con olado. En el p ime caso, la con aminación se a a en el luga en el que se ha p oducido y en el segundo caso hay que p ocede a una exca ación del suelo con aminado o a un bombeo del agua con aminada an es de p ocede a su a amien o. En gene al, el a amien o in si u es menos cos oso y pe mi e que se u ilice el espacio du an e el mismo, po lo que se aplica cada ez con más ecuencia a pesa de que habi ualmen e equie e la gos pe íodos de iempo (Roo e y col. , 1997). CAPÍTULO I: In oducción - 52 - La es a egia de espues a es un a amien o a la go plazo que incluye ac uaciones di e sas y modi icables en unción de una p ime a e aluación de la si uación y de la e olución de la misma du an e el a amien o. Se suele elegi cuando las aguas sub e áneas ya se han con aminado. Las aguas con aminadas pueden a a se median e: a) ex acción po bombeo seguida de a amien o en el p opio emplazamien o, po écnicas con encionales aplicables a aguas esiduales indus iales, b) a amien o in si u median e mu os de a amien o y c) dilución o des ío de la con aminación, median e inyección de agua limpia u ilizando sis emas de pozos. Los mé odos exis en es pa a a a los suelos con aminados pueden se de na u aleza ísica, química o biológica y an o unos como o os pueden aplica se en el luga de la con aminación o como a amien o ex si u, e abla I. 4. Tabla I. 4.- Clasi icación de las di e en es écnicas empleadas pa a a a los suelos con aminados, ag upadas según su na u aleza y o ma de aplicación. T a amien os in si u T a amien os ex si u – Fisicoquímicos: a) Ex acción con apo b) La ado c) Solidi icación y es abilización d) Sepa ación elec ociné ica – Biológicos: a) Bio emediación b) Fi o emediación – Té micos: a) Deso ción é mica b) Incine ación – Fisicoquímicos: a) Ex acción con disol en es b) La ado c) Oxido- educción d) Deshalogenación química e) Solidi icación y es abilización – Biológicos: a) Labo eo ag ícola b) Biopilas c) Biodeg adación en eac o El obje i o de las écnicas de bio ecupe ación es la c eación de las condiciones ambien ales óp imas pa a que los mic oo ganismos se puedan desa olla adecuadamen e y CAPÍTULO I: In oducción - 53 - p o oca la máxima descon aminación.La ecnología especí ica empleada en cada caso depende del ipo de mic oo ganismos de que se a e, de las condiciones del espacio con aminado y de la na u aleza y can idad de con aminan e o con aminan es. Dis in os mic oo ganismos deg adan di e en es ipos de compues os y sob e i en en di e en es condiciones. Debemos ecalca que el a amien o in si u no equie e exca a y e i a el suelo con aminado, po lo cual p o oca una meno libe ación de pol o y con aminan es, pe mi iendo descon amina un olumen mayo de suelo po a amien o que las écnicas ex si u. En es e caso, el p opio suelo unciona como un eac o biológico. Tiene o os incon enien es como mayo len i ud, di icul ad de man ene las condiciones y dependencia del ipo de suelos, que deben se pe meables si se quie e asegu a un buen endimien o del p oceso. Pa a palia los incon enien es e e idos a la len i ud del a amien o in si u se han desa ollado écnicas como bioes imulación o bioaumen o, las cuales se de ini án a con inuación pe o an es se debe de ini qué es la a enuación na u al o bio emediación in ínseca: • La a enuación na u al o bio emediación in ínseca se lle a a cabo po mic oo ganismos au óc onos, p incipalmen e bac e ias del medio a ec ado que u ilizan los nu ien es y acep o es de elec ones del medio, que c ecen mine alizando y come abolizando los con aminan es has a su desapa ición. Tiene una en aja e iden e que es su bajo cos e pe o necesi a una e aluación p e ia del iesgo. La bio emediación in ínseca puede eque i que la uen e de con aminación sea, en p ime luga , ex aída pa a p e eni una en ada adicional y que se ex ienda po los al ededo es o que exis a algún sis ema que p e enga la mig ación de una pluma de con aminación en un acuí e o. Se necesi a un p og ama de moni o ización a la go plazo pa a con i ma que la biodeg adación se es á ealizando co ec amen e y que no se es á p oduciendo el desplazamien o de los con aminan es. Es e p og ama CAPÍTULO I: In oducción - 54 - puede conlle a medidas de con aminan es pa a demos a la ac i idad mic obiana, pa a mos a que los ni eles de O 2 o ni a os disuel os son meno es que la concen ación inicial de ondo o que los p oduc os de bio emediación es án apa eciendo. • Bioaumen o. Consis e en in oduci mic oo ganismos no au óc onos en el medio a descon amina con el in de mejo a la biodeg adación. No obs an e, es udios ecien es han demos ado que la adición de una mezcla come cial de mic oo ganismos deg adado es de con aminan es o cul i os en iquecidos po mic oo ganismos au óc onos no aumen a necesa iamen e la asa de biodeg adación en el medio na u al po encima de la log ada median e la adición de nu ien es (bioes imulación). Los mic oo ganismos no au óc onos pa ecen no se capaces de compe i con la mic o lo a na u al ya que las condiciones ambien ales son dis in as y di icul an su adap ación al medio donde los mic oo ganismos indígenas es án pe ec amen e aclima ados (Lee y Me lin, 1999). Exis en en el me cado p oduc os come ciales, ensayados en el labo a o io que eúnen mic oo ganismos con g an po encial biodeg adado , pe o la ein oducción de mic oo ganismos au óc onos, aislados del sis ema con aminado y cul i ados pos e io men e, es más e ec i a, especialmen e cuando se acompaña de un suplemen o nu icional y oxígeno. • La bioes imulación adica en la in oducción de modi icaciones en el medio, median e el apo e de nu ien es, ai eación y o os p ocesos. En ocasiones se á su icien e añadi oxígeno median e ai eación, aunque en o os casos se pod ía eque i la adición de nu ien es o ajus es de pH. En odo caso es as ap oximaciones son álidas siemp e y cuando los mic oo ganismos au óc onos sean capaces de deg ada el con aminan e as un p oceso más o menos la go de aclima ación p e ia (Nikolopoulou y Kaloge akis, 2008). CAPÍTULO I: In oducción - 55 - En lo que se e ie e a la adición de nu ien es, la bio emediación equie e que és os en en en con ac o con el á ea con aminada y que su concen ación sea su icien e pa a sopo a el c ecimien o máximo p e is o de la población deg adado a en el anscu so de las ope aciones de emediación. Es udios expe imen ales han demos ado que el uso de e ilizan es de libe ación len a de ni ógeno y ós o o o ece una sólida al e na i a pa a comba i los de ames de pe óleo en el medio ambien e y de ini la elación óp ima de bio emediación de ca bono, ni ógeno y ós o o, 100:10:1 (Leys y col., 2005). En cuan o a los ac o es que a ec an a la bio emediación de los HAPs, se conoce que exis en muchos ejemplos que consiguen el éxi o en la aplicación de ecnologías de bio emediación pa a descon amina si ios usando mé odos como el compos aje o biopilas. Muchos es udios publicados han in es igado la e icacia de la bio emediación a pequeña escala y bajo condiciones ideales en el labo a o io ales como a pH neu o y empe a u as meso ílicas (en e 25ºC y 45ºC). No obs an e, es á cla o que los ac o es ambien ales que a ían de un si io a o o, ales como el pH del suelo, la disponibilidad de los nu ien es y de los con aminan es, pueden a ec a los p ocesos de bio emediación, inhibiendo el c ecimien o de los mic oo ganismos deg adado es. Los p incipales ac o es que in e ienen en la iabilidad de la bio emediación son: Tempe a u a: Tiene un conside able e ec o sob e la capacidad de los mic oo ganismos pa a deg ada los HAPs in si u. En gene al, la mayo ía de los luga es con aminados no ienen una empe a u a óp ima du an e odo el año. La solubilidad de los HAPs aumen a con la empe a u a, así como la biodisponibilidad de las moléculas de HAPs. Además, la solubilidad del oxígeno disminuye con el aumen o de la empe a u a, lo que educe la ac i idad me abólica de los mic oo ganismos ae obios (Bam o h y Single on, 2005). CAPÍTULO I: In oducción - 56 - La biodeg adación de HAPs puede ocu i en un amplio ango de empe a u as. En la mayo ía de los es udios hay una endencia a cen a se en empe a u as meso ílicas (en e 25 y 35ºC) po que la mayo ía de los mic oo ganismos del suelo p esen an su ac i idad óp ima en es e in e alo de empe a u a. pH: Se ha demos ado que el p oceso de mine alización de los hid oca bu os es más ápido a alo es de pH comp endidos en e 6.5 y 8.0. El ajus e del pH en suelos ácidos y alcalinos den o de es e ango hace que aumen e la asa de deg adación po los mic oo ganismos (Mo gan y Wa kinson, 1989b). El pH in luye además en la solubilidad de ós o o, que es uno de los nu ien es de especial impo ancia pa a el desa ollo mic obiológico, y ambién a ec a en la solubilización y anspo e de me ales pesados en el suelo. Humedad: Cuando el con enido de agua en suelo se encuen a en e un 50% y 80% de la capacidad de campo, la ac i idad mic obiológica es gene almen e óp ima. Los po os exis en es en el suelo húmedo ienen poco o ningún espacio pa a los gases, gene ándose condiciones anae obias. Los hid oca bu os de i ados del pe óleo ienden a dis ibui se en la ase sólida del suelo, po lo que en la ase acuosa hab á unas concen aciones de con aminan es muy bajas. Debido a que los mic oo ganismos oman nu ien es de la ase líquida, la asa de bio emediación puede e se limi ada po la elocidad con que se p oduce la deso ción, po lo que el agua debe de es a en con ac o con los con aminan es y en can idades que pe mi an el desa ollo de las comunidades mic obianas (Mo gan y Wa kinson, 1989a). Los alo es de humedad óp ima pa a la bio emediación de e enos no sa u ados es án comp endidos en e 150 y 250 g amos de agua/kg de e eno seco. En la bio emediación de acuí e os con aminados, el mayo p oblema se debe al suminis o de oxígeno a causa de su baja solubilidad en el agua (7.5 y 9 mg·L -1 en aguas sub e áneas). CAPÍTULO I: In oducción - 57 - El oxígeno es, en gene al, el acep o de elec ones más empleado en la espi ación mic obiana. Pa a los e enos no sa u ados, el suminis o de oxígeno no cons i uye un p oblema pe o su baja solubilidad en agua y la he e ogeneidad de los acuí e os hacen que el anspo e del oxígeno a a és de las zonas con aminadas sea muy di ícil. Exis en o os acep o es de elec ones más áciles de suminis a como son ni a os, ni i os, sul a os, Fe(III) y CO 2 . Nu ien es: Además de deg ada ácilmen e las uen es de ca bono, los mic oo ganismos equie en nu ien es ales como ni ógeno, ós o o y po asio pa a su me abolismo celula y su c ecimien o. En las zonas con aminadas donde los ni eles de ca bono o gánico son al os debido a la na u aleza del con aminan e, la disponibilidad de los nu ien es puede llega a ago a se ápidamen e du an e el me abolismo mic obiológico. Pa a e i a es e ago amien o, se puede añadi un suplemen o de nu ien es pa a es imula la comunidad bac e iana y aumen a la bio emediación in si u. Se u iliza gene almen e una elación mola C:N:P de 100:10:1 pa a la bio emediación de suelos (Gallego y col. , 2006). Concen ación de los con aminan es: Se conoce que los HAPs ienen una g an a inidad po la ase sólida del suelo an o a a cillas como a la ma e ia o gánica, dando como esul ado una baja concen ación de es os compues os en la ase acuosa del suelo. De es a mane a se puede conside a un ac o limi an e ya que al se an baja es a concen ación de con aminan es en la ase acuosa, no pod á sopo a el c ecimien o y desa ollo de una población mic obiana capaz de me aboliza lo. Mien as que si nos encon amos en una si uación con al as concen aciones de con aminan e en la ase acuosa del suelo puede que no se p oduzca biodeg adación po pa e de los mic oo ganismos debido a que es a al a concen ación les p o oque un e ec o de oxicidad. CAPÍTULO I: In oducción - 64 - débil/ e e siblemen e). Cuando los mic oo ganismos cap an la concen ación de COH lib emen e disuel a, es a concen ación disminuye e inmedia amen e es epues a po la acción de COH que es aba so bida débil y e e siblemen e. De es a mane a, la acción ápidamen e deso bida puede ep esen a mejo esa can idad que es accesible a un o ganismo en una escala de iempo ele an e, mien as que la acción de COH que es á ue emen e so bida al suelo o sedimen o gene almen e no se conside a bioaccesible. • Ac i idad química. Es el po encial que posee un compues o pa a expe imen a p ocesos espon áneos ales como di usión y epa o. Es á elacionada con la ue za de so ción de los COHs. Una ue e so ción implica una disminución de la ac i idad química y po an o una disminución en la biodisponibilidad de los COHs. En ma ices ambien ales, los COHs se mue en desde á eas de al a ac i idad química hacia á eas de baja ac i idad, has a alcanza el equilib io. En el equilib io la ac i idad química es la misma en cada compa imen o de una ma iz (po ejemplo, en pa ículas sólidas, ma e ia o gánica disuel a, ase acuosa, bio a, e c) (Di o o y col. , 1991). De es a mane a, las concen aciones de COH en el equilib io pa a cada compa imen o, incluyendo la bio a, son p opo cionales en e sí. Si la elación en e las ases se conoce, la acción de COH en una ase se puede u iliza jun o a un ap opiado ac o de co ección (como K oc ) pa a es ima la acción en la o a ase. Es o es la base de la Teo ía de epa o en el equilib io que ue p opues a o iginalmen e como mé odo de medi la biodisponibilidad po Shea (1988), Di o o y col., (1991). En de ini i a, la biodisponibilidad depende de a ios ac o es, donde se incluyen las p opiedades del suelo o los sedimen os (como po ejemplo, el con enido de ca bono o gánico, el con enido de ca bono neg o conocido como “black ca bon”, su composición ísica y química, e c), las p opiedades CAPÍTULO I: In oducción - 65 - del con aminan e (como po ejemplo su solubilidad en agua, K oc , la o ma de su molécula, e c), el iempo de con ac o en e el con aminan e y el suelo o sedimen o y la u a de cap u a den o del o ganismo. I.6. MÉTODOS DE REPARTO DE HAPs EMPLEANDO POLIDIMETILSILOXANO Debido a su na u aleza hid o óbica, el epa o de hid oca bu os a omá icos policíclicos (HAPs) se ealiza con acilidad en ases o gánicas sólidas ó líquidas, exis iendo en la ase acuosa sólo a concen aciones limi adas. Es o hace que la deg adación de HAPs po las células bac e ianas sea di ícil. En cul i os de bac e ias deg adado as donde sólo u ilizan los compues os disuel os en medios acuosos, la ans e encia de masa o la elocidad de deso ción con olan las asas de c ecimien o y deg adación (Alexande , 1999). El uso combinado de la bio emediación con o as ecnologías de emediación de suelos, como el uso de elec o emediación (Niqui-A oyo y col. , 2006; Niqui-A oyo y O ega-Cal o, 2007; Niqui-A oyo y O ega-Cal o, 2010), la aplicación de biosu ac an es (Ga cia-Junco y col. , 2001; Ga cia-Junco y col. , 2003) o la adición de bioes imulan es pa a suelos con aminados con HAPs (Gallego y col. , 2007; Tejeda- Ag edano y col. , 2011), pueden ayuda a supe a es a limi ación, lo que aumen a la e icacia de la bio emediación como una opción de a amien o. El des ino y anspo e de los con aminan es o gánicos hid o óbicos pueden se in luidos no ablemen e po los p ocesos de so ción. La cues ión de si la so ción inhibe la biodisponibilidad de los con aminan es o gánicos es de g an impo ancia pa a el éxi o de la bio emediación an o de suelos como de acuí e os. Las concen aciones biodisponibles de COHs en medios acuosos, a menudo dec ecen como esul ado de p ocesos de (bio)so ción, ola ilización o deg adación. Pa a man ene cons an e la exposición de ni eles de es os con aminan es en CAPÍTULO I: In oducción - 66 - medios acuosos se in odujo el epa o adminis ado conocido como “pa i ioning d i en adminis e ing” (PDA, Figu a I.6), cuyo p incipio consis e en con ola las concen aciones disuel as de es os con aminan es median e epa o desde una ase sólida dominan e (Maye y col. , 1999). Figu a I. 6.- Esquema de un sis ema con a ias ases. El PDA con ola las concen aciones disuel as de los HAPs con a una se ie de p ocesos de educción deg ada i os (líneas discon inuas) y no deg ada i os (líneas con inuas) median e epa o desde una ase sólida dominan e (Va ian e del esquema de Maye y col., 1999). Basados en es e p incipio se desa olla on nue os mé odos pa a de e mina la ans e encia de masa po di usión median e mic ocáma as y medi de la capacidad de solubilización de medios acuosos (dopaje pasi o) u ilizando polidime ilsiloxano como ase sólida dominan e en ambos mé odos: a) Es udio de la ans e encia de masa de con aminan es median e di usión. Debido a las p opiedades hid ó obas de los HAPs, las concen aciones de es os con aminan es se encuen an gene almen e a meno es ó denes de magni ud en el medio acuoso que en pa ículas del suelo, de sedimen os o en o ganismos acuá icos. Es o iene CAPÍTULO I: In oducción - 67 - impo an es implicaciones pa a su in e cambio po di usión en e dis in os compa imen os ambien ales, donde una ina película acuosa puede ac ua como una ba e a e icaz pa a la ans e encia de masa po di usión (Maye y col. , 2005) (Figu a I.7). Figu a I. 7.- Esquema ep esen a i o de la o mación de la capa de di usión limi an e (UBL) en e la uen e de con aminación y los mic oo ganismos en un medio acuoso. El anspo e de los con aminan es se p oduci ía desde la uen e de con aminación hacia los mic oo ganismos a a és de la capa de di usión limi an e (Maye y col. , 2005). La di usión molecula de es os con aminan es a a és de es as capas limi an es conocidas como Uns i ed bounda y laye s (UBL)" a menudo cons i uye el paso limi an e de su deso ción desde ma ices del suelo y de sedimen os, así como pa a su cap ación po los o ganismos (Johnsen y Ka lson, 2004). La p ime a ley de Fick de la di usión es di ec amen e aplicable pa a desc ibi una ans e encia de masa median e di usión a a és de UBLs homogéneos. También puede aplica se en modelos que desc iben anspo e po di usión a a és de medios he e ogéneos y el in e cambio median e di usión en las in e ases. Sin emba go, es os modelos gene almen e se basan en supues os (como po ejemplo, que el anspo e se limi a po la di usión de moléculas disuel as lib emen e) que pueden se bas an e di íciles de con i ma po a a con p oduc os químicos o gánicos hid o óbicos (Wells y col., 2004). Es o hace que la de e minación di ec a de la CAPÍTULO I: In oducción - 68 - ans e encia de masa po di usión a a és de una UBL enga an a impo ancia. Pa a medi la elocidad de di usión de los con aminan es en un medio, se u iliza on unas mic ocáma as que consis ían en dos discos de polidime ilsiloxano (PDMS), uno de ellos limpio y el o o donde se ija el con aminan e hid ó obo en es udio (HAPs). La ans e encia de masa del disco con aminado (que se ía la uen e de con aminación en la Figu a I.7) al disco limpio (que se ía la bac e ia) se ealiza a una dis ancia de 100 µm de cada uno. El medio que se coloca en e ambos discos, es el ac o a iable de es e diseño expe imen al ya que dependiendo de las ca ac e ís icas del medio se ob end á una mayo o meno di usión de los con aminan es. El undamen o básico de es e sis ema expe imen al consis e en e la ans e encia de las moléculas HAPs desde el disco con aminado al disco limpio que equie e 3 pasos (Figu a I.8): 1.- Repa o de las moléculas de HAPs en la in e ase en e el disco con aminado y el medio, el cual es á gobe nado po el coe icien e de epa o K PDMS,Medio . MedioPDMS Con Medio K C C , = 2.- Di usión de las moléculas de HAPs (di usión linea ) a a és del medio, que es unción del g adien e de concen ación (∆C/ ∆x) y del coe icien e de di usión (D). x CD lujoDi usión ∆ ∆ × −=, 3.- El epa o de las moléculas de HAPs en la in e ase en e el medio y el disco limpio es á gobe nado po K PDMS,Medio . La ans e encia de masa po di usión del disco con aminado al disco limpio se con ola midiendo el con enido de los HAPs que quedan en el disco con aminado y los que han pasado al disco limpio po unidad de iempo. La cons an e de elocidad K (s -1 ) se ajus a a los da os medidos. MedioPDMS Lim Medio K C C , = . CAPÍTULO I: In oducción - 69 - Figu a I. 8.- Esquema de los 3 pasos en el p oceso de di usión de los PAHs en las mic ocáma as desde el disco con aminado al disco sin HAPs (Maye y col. , 2005). La acción de HAPs p esen e en el medio es desp eciable: V PDMS > V Medio y K PDMS,Medio >>1. Los HAPs es án homogéneamen e dis ibuidos en el disco de PDMS debido a la pe meabilidad especialmen e al a de es e políme o. Como consecuencia, los dos discos imponen un g adien e lineal de ac i idad química (o ugacidad) en la UBL, es as capas limi an es de la di usión (UBLs) ac úan a menudo como un cuello de bo ella pa a el anspo e po di usión de compues os o gánicos hid o óbicos (COHs), cons i uyendo a menudo un paso limi an e an o pa a su cap ación desde el suelo o ma ices de sedimen os, como pa a su cap ación po los o ganismos. La ans e encia de masa po di usión de COHs a a és de UBLs se puede aumen a po la p esencia de medios que no malmen e son conside ados pa a educi la cap ación di usa. Bajo el supues o de que oda la uga de masa química del disco con aminado se ecupe a en el disco limpio y que la masa p esen e en e la ina capa es insigni ican e, el balance de masa del sis ema puede se desc i o po : CAPÍTULO I: In oducción - 70 - LimCon Con amam d dm +−= (1) Donde m Con y m Lim son la masa (kg) en el disco con aminado y limpio espec i amen e y a es la cons an e de la asa de elocidad (s -1 ). Usando el supues o de que un balance de masa ce ado p oduce una condición de sime ía m Lim =m 0 –m Con , donde m Con y m Lim son la masa del disco con aminado y limpio espec i amen e, al iempo y m 0 es la masa inicial (en el disco con aminado). De es a mane a, la solución analí ica de la ecuación 1, nos da: ( ) ( ) ( ) a LimLim e C C m m 2 00 1%50 − −⋅== (2) En analogía a la p ime a Ley de di usión de Fick, se puede exp esa la ecuación 2 como: C x DK V A d dC lib e ∆ ∆ × =·· (3) Donde LimCon CCC −=∆ , A es el á ea supe icial e ec i a (m 2 ), V es el olumen del disco (m 3 ), ∆ x es el espeso de la capa (m), K es el coe icien e de epa o en e la solución en la capa de di usión y el políme o MedioPDMS PDMSMedio K K , , 1 = y D es el coe icien e de di usión (m 2 ·s -1 ). La asa de elocidad cons an e a (s -1 ) de an es puede se iden i icada como: MedioPDMS K D xV A a , · ∆× = (4) La cons an e de asa de elocidad a desc ibe la ciné ica del sis ema y es p opo cional al lujo de di usión. También es á linealmen e elacionada con o os pa áme os de di usión es ablecidos: [1] el p oduc o ,DK × ambién pa a conoce la pe meabilidad (P) o conduc i idad g (m·s -1 ), y [2] el coe icien e de ans e encia de anspo e po di usión en los modelos de ugacidad (po ejemplo, en el mol·año -1 ·Pa -1 ). Es o es á en CAPÍTULO I: In oducción - 71 - con as e con las cáma as de di usión clásica, que ienen po obje o la de e minación del coe icien e de di usión (D). Los olúmenes de los dos discos, V Con aminado y V Limpio , se man ienen cons an e, así como la supe icie pa a el in e cambio A y el espeso de la película ∆x. Cualquie di e encia en la cons an e de la asa de elocidad a en los dos medios i y j se a ibuyen únicamen e al p oduc o :DK × j i ij j i D D K a a×= (5) Donde K ij es el coe icien e de epa o en e el medio i y el medio j, D es el coe icien e de di usión pa a el medio i y pa a el medio j y a i /a j es la elación en e elocidades que desc ibe una conduc i idad ela i a pa a la ans e encia de masa po di usión. Po ejemplo, el lujo desconocido de HAPs a a és del medio i puede exp esa se como el lujo de es os HAPs a a és del medio j, mul iplicado po la elación en e las cons an es de elocidad medidas a i /a j . b) Es udio de la capacidad de solubilización de con aminan es en un medio de e minado median e dopaje pasi o. La silicona o mada po polidime ilsiloxano (PDMS) ha sido ampliamen e u ilizada como un ma e ial común de ecub imien o pa a la mic oex acción en ase sólida (SPME). Es a écnica ha sido empleada pa a medi concen aciones de anali os disuel os lib emen e y pa a es udios de especiación, como po ejemplo: pa a medi p o eínas unidas a óxicos y a d ogas (Vaes y col. , 1996; Mus ea a y col. , 2006), ácidos húmicos unidos a con aminan es medio ambien ales (Poe schmann y col. , 1997; Lu zho y col. , 2000) y complejos de inclusión en e compues os a omá icos y β-ciclodex inas (Chalumo y col. , 2009). SPME ue in oducida po A hu and Pawliszyn en 1990 (Reichenbe g y col. , 2008) y su o ma o esul a muy a ac i o pa a los disposi i os de mues eo en el equilib io (o ambién conocidos como Equilib ium Sampling De ice, ESD) po que la ase de mues eo es un olumen pequeño (µL) del CAPÍTULO I: In oducción - 72 - políme o con un á ea supe icial ela i amen e g ande. La mic o-ex acción se gene a po di usión molecula a a és de la supe icie, la cual es á impulsada po la ac i idad química del anali o en la mues a y, de es a mane a, la concen ación esul a medible en el políme o. SPME es un mé odo pode oso y e icaz pe o que no se encuen a exen o de p oblemas y limi aciones como la di icul ad de llega al equilib io en un pe íodo de iempo p ác ico, que el con enido de los HAPs en el políme o no sea meno que el con enido de PAHs de la mues a, la adso ción a la supe icie del políme o debe se insigni ican e po que la ugacidad y la ac i idad química sólo son p opo cionales a la abso ción (disolución) de concen ación den o del políme o o asumi que se cumple el balance de masas sin que exis a pé didas an o en la ijación como en la ex acción de los anali os en el políme o. Po es a causa, se ha desa ollado un nue o mé odo analí ico conocido como dopaje pasi o (passi e dosing) donde se p oduce la libe ación de los anali os desde un políme o (Figu a I.9) en luga de hace un mues eo con inuo po di usión como se hace con SPME. Es e mé odo se basa en los p incipios de dopaje pasi o desa ollados pa a el con ol de la concen ación lib e disuel a en ensayos de oxicidad. Figu a I. 9.- Fundamen o de la écnica de dopaje pasi o: A) Los anali os disuel os en me anol se ijan en la silicona o mada po polidime ilsiloxano (PDMS) en menos de una ho a, B) equilib io alcanzado con agua donde se con ola la concen ación lib e disuel a de los anali os y C) equilib io alcanzado con la mues a donde se mide la concen ación o al del anali o (lib e y unida a la ma e ia o gánica disuel a, MOD) (Modi icación del esquema de Bi ch y col, 2010). CAPÍTULO I: In oducción - 73 - El p ime paso en es e mé odo nue o es con ola la concen ación de anali o lib e disuel o o ac i idad química po epa o en el equilib io desde un políme o ca gado con el con aminan e p e iamen e en iales o almen e ce ados e i ando pé didas a a és de la silicona. El segundo paso es medi la concen ación o al del anali o en la mues a una ez alcanzado el equilib io, median e la écnica analí ica elegida. La concen ación medida en la mues a puede combina se con el co espondien e epa o en el equilib io con agua pu a con el in de ob ene : • La acción lib e de anali o en la mues a ( mues a agua C C FL = ). • El aumen o de la capacidad ( agua mues a C C AC = , donde lib eagua CC =) que cuan i ica la capacidad de disolución de un medio pa a los HAPs con espec o al agua, siendo el dopaje pasi o una buena he amien a pa a es udia la especiación de HAPs en mues as acuosas. • Los alo es de las asas de epa o K DOC y K D ( 1· += CODCOD CKAC , donde K COD es la asa de epa o pa a el ca bono o gánico disuel o y C COD es la concen ación de ca bono o gánico disuel o)(Bi ch y col. , 2010). Con es e nue o mé odo se consigue con ola la concen ación lib e disuel a de cada componen e en mezclas de HAPs, se e i an sepa aciones de ases, no se necesi a asumi hipó esis de balance de masas, se equie e un pe íodo co o de equilib io e modinámico, es un mé odo p eciso con una des iación es ánda del 3%, se educen los p oblemas que se ocasionan con la SPME, se calculan cons an es de epa o con eg esiones lineales simples, se puede medi el aumen o de la capacidad (AC) pa a cuan i ica la capacidad de CAPÍTULO I: In oducción - 80 - azúca es, polisacá idos, aminoácidos, ácidos o gánicos, i aminas, aninos, alcaloides, es e oles, enzimas, ac o es de c ecimien o, ensioac i os, la onones, nucleó idos, e c. Todos ellos p opo cionan una uen e ica de de nu ien es pa a las poblaciones mic obianas en al izos e a (Pin on y col. , 2007). De hecho, los compues os de i ados de la izodeposición (libe ación de compues os o gánicos desde la aíz al suelo) ales como exudados, mucílagos y es os de aíz po desp endimien o de ejidos y células mue as, ep esen an en e el 8 y el 86% del ca bono ne o anual ijado po o osín esis (Meng y Zhu, 2011). De es os compues os se es ima que los exudados cons i uyen en e el 40 y 90% (Lynch y Whipps, 1990; Pin on y col. , 2007), los cuales pueden p opo ciona ca bono y ene gía su icien es pa a man ene un g an núme o de mic oo ganismos, al ededo de 10 8 -10 9 mic oo ganismos asociados a la izos e a po g amo de suelo (E ickson y col., 1995). Debido a la p esencia de es os exudados, las poblaciones y ac i idades mic obianas son del o den de 5 a 100 eces mayo en la izos e a que en la mayo pa e del suelo. (Ande son y col., 1993; Gun he y col., 1996). Es os conso cios mic obianos, a su ez pueden o ece a las plan as di e sos bene icios como la sec eción de quelan es pa a aumen a la disponibilidad de mine ales y su mejo abso ción po la aíz, p o ección con a pa ógenos pa a la plan a y deg adación de los con aminan es an es de que puedan in lui nega i amen e en el ege al. El éxi o de la izo emediación depende en g an medida de la capacidad de los mic oo ganismos deg adado es de los con aminan es p esen es en el suelo pa a descon amina , así como del c ecimien o de las plan as que impulsan a los mic oo ganismos a coloniza e icien emen e las aíces. La quimio axis hacia compues os especí icos de los exudados de aíz puede se la cla e pa a la colonización e icien e de las aíces aunque la espues a quimio ác ica puede se p o ocada po di e en es compues os en unción de la especie colonizado a (de Wee y col., 2002; Kuipe y col., 2002). O ega-Cal o y col., (2003) demos a on que se p oducía CAPÍTULO I: In oducción - 81 - quimio axis hacia na aleno, enan eno y exudados de aíz en bac e ias de la izos e a deg adado as de HAPs. Cabe des aca que algunas especies de plan as pueden aumen a el núme o de deg adado es en un g an olumen de suelo que se ex iende más allá de la izos e a (Siciliano y col., 2003; Leigh y col., 2006). Aunque la izo emediación ocu e de o ma na u al, ambién se puede op imiza , median e la manipulación delibe ada de la izos e a. Es o se puede log a median e el uso adecuado del pa plan a-mic oo ganismo. Es as combinaciones pueden se plan as y izobac e ias p omo o as del c ecimien o de las plan as (Plan G ow h P omo ing Rhizobac e ia, PGPR) o plan as y mic oo ganismos deg adado es de con aminan es. Po ejemplo, una especie de césped combinada con un mic oo ganismo deg adado de na aleno que p o ege la semilla del césped de los e ec os óxicos del na aleno, el c ecimien o de las aíces impulsa a las bac e ias deg adado as de na aleno en el suelo, el cual pod ía habe es ado p o undamen e dis ibuido en el suelo como pa a pode lo deg ada en ausencia de aíces (Kuipe y col., 2004). Asimismo, las plan as p o ocan la mo ilización de los HAPs en el suelo, dando luga a su acumulación, en una o ma más biodisponible, en zonas p óximas a las aíces, posiblemen e median e el e ec o combinado del lujo de agua a a és de las aíces y la pseudosolubilización de los HAPs po compues os o gánicos de i ados de la plan a (Lis e y Alexande , 2000a; Lis e y Alexande , 2000b). Se conoce muy poco sob e la idoneidad de la especie de plan a a u iliza en un p oceso de i o emediación de HAPs. Si bien la mayo pa e de los es udios se han ealizado con especies he báceas (Ap ill y Sims, 1990; Bine y col. , 2000; Miya y Fi es one, 2000), posiblemen e po su ácil manejo en el labo a o io, especies del géne o Pinus (P. banksiana, P. esinosa, P. s obus y P. syl es is) son ambién capaces de es imula la biodeg adación de HAPs en el suelo (Heinonsalo y col. , 2000; Lis e y Alexande , 2000b). Cla amen e, la plan a a u iliza debe se capaz de c ece en p esencia de los CAPÍTULO I: In oducción - 82 - con aminan es, y deben ole a condiciones locales, ales como d enaje limi ado o concen aciones al as de sal. O as p opiedades deseables incluyen c ecimien o ápido, que sea pe enne, y que posea un sis ema adicula p o undo y denso (Alexande , 1999). Es a úl ima p opiedad es ele an e en el caso de con aminan es si uados a cie a p o undidad en el suelo, y añade in e és al es udio de especies o es ales, donde exis e una in o mación muy escasa. En e las especies es udiadas en la i o emediación de HAPs, esul a de especial in e és, de ca a a es a Tesis Doc o al las que, apa e de ene las ca ac e ís icas an e io es, cumplan los dos c i e ios siguien es: a) una buena adap ación a las zonas medi e áneas con una con as ada u ilidad en i o emediación de suelos con aminados po HAPs y b) exis encia de p o ocolos de p opagación, an o sexuales como agámicos, e icaces pa a su ge minación y desa ollo en suelos con aminados po HAPs, así como pa a la p opagación clonal pos e io . Es as dos condiciones las cumplen, en e o as, Fes uca a undinácea Sch eb; Lolium pe enne, L. y el gi asol Helian hus annuus, L. Fes uca a undinacea. Sch eb. Pe enece a la amilia de las Poaceas y se conoce ulga men e como es uca al a, i e en juncales, ibe as de íos, lagos, a oyos y pas os. Es a plan a pe enne se ha usado ampliamen e en la i o emediación de HAPs y se ha cons a ado su éxi o en la sup esión de a ios de es os compues os (Shann y Boyle, 1994; Cunningham y col., 1996; Banks y col., 1999; Cheema y col., 2009). Pa ish y col., (2004) encon a on que en e a ias especies ue es a plan a la que desa olló una mayo biomasa an o en aíces como en pa e aé ea y la que eliminó un po cen aje mayo de con aminan e. Epu i y So ensen (1997) indica on el cla o e ec o de es a especie en la mine alización y ex ac abilidad de benzo(a)pi eno en un suelo con aminado con es e HAP. Pa ish y col., (2005) cul i a on Fes uca a undinacea du an e 12 meses en in e nade o, en mace as con suelo que con u ie on 15 ipos de HAPs y obse a on que las poblaciones mic obianas deg ado as de CAPÍTULO I: In oducción - 83 - es os compues os ue on 100 eces mayo es en las mace as con es as plan as que en el con ol (sin plan a). Huang y col., (2004) des aca on su capacidad de man ene o, incluso inc emen a , el con enido de agua en los ejidos o osin é icos y aumen a on el desa ollo de las aíces acili ando el anspo e de o oasimilados en condiciones de al o es és p o ocado po c eoso a. Apa e de la conocida capacidad de ge minación de las semillas de es a especie, que la hacen muy adecuada pa a su uso inicial en suelos con aminados, exis en p o ocolos e icaces pa a su mic op opagación. Seko y Nishimu a (1996) es udia on el e ec o del CO 2 sob e la supe i encia de egene an es in i o en medio de cul i o sin azúca . Gyulai y col., (1995) incluye on es a especie en un amplio es udio sob e desa ollo in i o de Monoco iledóneas de ca a a su in e acción con mic oo ganismos. Cao y col., (2006) op imiza on las écnicas de cul i o in i o pa a egene a plan as de Fes uca a undiacea y Lolium pe enne ans o madas con Ag obac e ium. Lolium pe enne, L. conocida ulga men e como allico, pe enece ambién a las Poaceas, es pe enne y muy común en p ade as y céspedes o mando pa e impo an e de los pas os, po lo que es alimen o dia io del ganado. Johnson y col., (2004) demos a on que un suelo plan ado con Lolium pe enne y T i olium epens jun o a un inóculo de la bac e ia Rhizobium leguminosa um i olii p esen ó una concen ación meno de HAPs ex aíbles que el suelo sin plan a , as 180 días de expe imen ación y aumen ando ( as es e pe íodo) la biomasa mic obiana en los suelos a ados. Olson y col., (2007) es udia on la capacidad de uso en i o emediación de 18 especies, an o Monoco iledóneas como Dico iledóneas, y des aca on, en e las p ime as, a Lolium pe enne y And opogon ge a dii, como las más e ec i as y, en ambos casos mul iplica on po dos el descenso de los HAPs es ados a los 220 días de expe imen ación. L. pe enne cuen a con sis emas de p opagación an o con encionales po semillas como median e mic op opagación (C eeme smolenaa y col. , 1992), incluso se han ob enido plan as de Lolium pe enne mas ole an es a suelos salinos median e ansgenización con CAPÍTULO I: In oducción - 84 - Ag obac e ium ume aciens (Wu y col. , 2005), al que hay que uni el abajo ya ci ado pa a Fes uca de Cao y col., (2006). Helian hus annuus, L. El gi asol, pe enecien e a la amilia As e acea es ampliamen e conocido po la p oducción de acei e de sus semillas. Es una plan a anual, que puede alcanza los dos me os de al u a. Es a especie se ha usado como pilo o en expe iencias de i o emedianción de HAPs, y p esen a cie a sensibilidad al luo an eno, en compa ación con o as especies como Faba ulga is (Kumme o a y col. , 2001). En expe imen os con luo eno, an aceno, pi eno y c iseno, el gi asol compa ado con o as especies, elimina en mayo medida que el es o, los HAPs ci ados del suelo, sob e odo al inal del expe imen o (Maliszewska-Ko dybach y Sm eczak, 2000). Es os au o es indica on que en e un g upo de especies ensayadas, el gi asol ue el que p esen aba mejo espues a a la ge minación de semillas y elongación adical en suelos con los HAPs an es ci ados. Olson y col., (2007) encon a on que den o de las Dico iledóneas, Helian hus annuus es la que mejo esponde en p esencia un suelo muy con aminado con HAPs en e a o as 11 especies de Dico iledóneas ensayadas. Respec o a su p opagación, po se una especie ampliamen e cul i ada, las semillas disponibles en el me cado p esen an una máxima capacidad de ge minación. Así mismo, la me odología de p opagación in i o es á ampliamen e desa ollada desde hace años (T i i y col., 1981; Ca allini y Lupi, 1987; Imho y col., 1996). Exis en o os abajos que inciden en el cul i o de p o oplas os de es a especie (Wingende y col. , 1996), en el con ol gené ico de plan as ob enidas po o ganogénesis in i o (Be ios y col. , 1999), en el uso del saco emb iona io como ma e ial de pa ida (Popiela ska y P zywa a, 2003) y en el cul i o de emb iones cigó icos (Suja ha y P abaka an, 2001) o somá icos (Pe i p ez y col. , 2005). Po o o lado, los biocombus ibles se conside an como una de las al e na i as ecológicas al pe óleo, a in de educi , a co o plazo, las emisiones de CO 2 en la a mós e a, con ibuyendo así a educi el e ec o in e nade o. En e los biocombus ibles, el biodiesel es una uen e de ene gía eno able, biodeg adable y no óxico. CAPÍTULO I: In oducción - 85 - En B asil, uno de los países más desa ollados en lo e e en e a biodiesel, basa la p oducción de es e biocombus ible en la u ilización del gi asol (Ta a es y col. , 2011). Po lo que cab ía la posibilidad de combina la capacidad de es a plan a pa a ecupe a suelos con aminados con HAPs, y su uso po encial pa a la ob ención de biodiesel, de mane a al e na i a e independien e de la aplicación habi ual en alimen ación. Una ez seleccionada la plan a más adecuada, según los supues os an e io es, lo más in e esan e del es udio po su complejidad, es e los p incipales p ocesos in oluc ados en izodeg adación de HAPs, los cuales se esumen en la Figu a I.11. Figu a I. 11.- Rizo emediación de HAP. A) Biodisponibilidad del HAP en NAPL: el con aminan e o gánico se encuen a unido a las pa ículas de suelo o ísicamen e a apado en mic opo os donde no son ácilmen e biodisponibles. B) P ocesos gene ales que a ec an a la izo emediación: las aíces de las plan as sus en an el c ecimien o mic obiano en la supe icie de la aíz y en la izos e a. Las aíces c ean canales en el suelo que pe mi en el mo imien o de O 2 y H 2 O, que son lo su icien emen e anchos pa a que los con aminan es engan una mayo accesibilidad mic obiana. C) Deg adación ae óbica de HAPs: en la in e ase agua/NAPL los mic oo ganismos u ilizan mé odos de adhesión o su ac an es mejo ando la accesibilidad y po an o aumen ando la descon aminación del suelo (Ge ha d y col. , 2009). CAPÍTULO I: In oducción - 86 - Además del aumen o de la ac i idad y de las poblaciones mic obianas, se debe ene en cuen a que las aíces adquie en agua del suelo omen ando la anslocación de los con aminan es disuel os en la izos e a (Fe o y col., 1994), que los ensioac i os p oceden es de exudados de aíz pueden aumen a la solubilidad de los hid oca bu os a omá icos policíclicos y mejo a así su biodisponibilidad (Song y col., 2004) y que las aíces pueden mejo a la di usión de oxígeno, p opo cionando canales de lujo de ai e (Child y col., 2007). La disponibilidad de oxígeno es impo an e, debido a la deg adación de los HAPs po cie as bac e ias del suelo, incluyendo a las micobac e ias, que ealizan las ans o maciones a a és de dioxigenasas. I.7.3. Ma e ia o gánica disuel a: Ácidos húmicos En el medio acuá ico, ap oximadamen e en e un 75 y 99% del ca bono o gánico es á en o ma de pa ículas o como ma e ia ine e disuel a (el es o es á p esen e en los o ganismos i os). Las concen aciones de ma e ia o gánica disuel a (MOD) en aguas na u ales se encuen an den o del ango de 0.5 a 50 mg/L. La MOD es á p edominan emen e compues a po sus ancias húmicas (SH) que cons i uyen en e el 40-80% del o al de MOD (S einbe g y col., 2006). En sedimen os, el ca bono o gánico o mado po SH puede ep esen a has a un 20% del o al de su peso seco (Akkanen y col., 2005). Las SH son p oduc os na u ales o mados po diagénesis de la descomposición de la ma e ia o gánica, que incluye deg adación y p ocesos de condensación. Gene almen e, las SH se pueden di idi en ácidos húmicos (AH), ácidos úl icos (AF) y huminas coloidales o insolubles, que di ie en an o en sus p opiedades ísico-químicas como biológicas. Debido a la amplia gama de amaño molecula nominal y g upos uncionales, es os compues os son gene almen e de inidos po su solubilidad en soluciones alcalinas o po sus ca ac e ís icas espec ales. CAPÍTULO I: In oducción - 87 - Pan y col., (2007) encon a on que las a inidades de adso ción de los HAPs a ia on en e AH, AF y las acciones de huminas debido a las di e encias en e ellas, ci adas an e io men e. También se demos ó que el pi eno en el HA ue más disponible que en humina du an e la biodeg adación (Tang y col., 2008). La dis ibución de HAPs en di e en es acciones húmicas pod ía da una idea del mecanismo que ige la biodisponibilidad de los HAPs en suelos. Engeb e son y Vonwand uszka (1994) desc ibie on la o ma que podían ene los ácidos húmicos, que poseían una especie de mic oes uc u a micela simila a la de los ensioac i os (Figu a I.12). Figu a I. 12.- Es uc u a de los ácidos húmicos mos ando la con ibución de Mg 2+ en la o mación de un mic oambien e hid o óbico in amolecula . R, es la con inuación de unidades es uc u ales simila es. (Esquema modi icado de Engeb e son y Vonwand uszka, 1994). Es a mic oes uc u a acele a la deg adación de HAPs median e el aumen o de la solubilidad de es os con aminan es, p omo iendo su biodisponibilidad pa a los mic oo ganismos. A pesa del g an núme o de a ículos que CAPÍTULO I: In oducción - 88 - hablan de la impo ancia de los AH en la bio emediación de di e en es con aminan es an opogénicos (Haluska y col., 1995; Fu y col., 1999), su papel en la de oxi icación de los HAPs po los mic oo ganismos se man iene incie o. Exis en es udios de los e ec os de los AH sob e la biodeg adación de los HAPs en ambien es geológicos sa u ados de agua y en medios acuosos que p esen an aumen o de la deg adación (O ega-Cal o y Saiz-Jimenez, 1998; Ha ka y col., 2008; Smi h y col., 2009), o os que mues an inhibición y o os que mues an ningún e ec o (Lao y col., 1999). Se sabe que la biodeg adación de los HAPs depende del lujo de masa o al hacia las células deg adado as. Las bac e ias deg adado as suelen oma los HAPs disuel os po di usión desde los al ededo es de la ase acuosa hacia las células. Aquí, las concen aciones disuel as de e minan la biodisponibilidad, y bajas concen aciones lib es disuel as pueden p oduci una biodeg adación len a. Debido a la baja solubilidad de los HAPs y a su al a hid o obicidad, es os compues os son adso bidos de al o ma que las concen aciones lib es disuel as son bajas. Además, si el depósi o de concen aciones lib es disuel as se ago a po biodeg adación, po una ciné ica de deso ción limi ada, como po ejemplo en mic opo os de la ma e ia sólida, la eposición es limi an e. Algunos de es os HAPs pe manece án inaccesibles y pe sis en es du an e mucho iempo. Exis e un amplio núme o de a ículos que indican que hay o as ías de anspo e que puedan p opo ciona HAPs adicionales pa a las células deg adado as. La mayo ía de las e idencias p o ienen de la ciné ica de deg adación en p esencia de su ac an es a i iciales y na u ales. Dependiendo del ipo de ensioac i o y de bac e ia, la acción de HAP en o ma de micela puede es a di ec amen e biodisponible pa a las células bac e ianas sin necesidad de se deso bida pasando a se una concen ación lib e disuel a. Es o se ha a ibuido a la in e acción de la micela del ensioac i o con la supe icie de la célula, seguida po la libe ación di ec a de HAP in e calado. Mien as que los AH pueden disminui la biodeg adación, educiendo la concen ación de HAPs lib es disuel os po CAPÍTULO I: In oducción - 89 - so ción, los AH además pueden ac ua como anspo ado es de HAPs (To sche y col., 1997; Ha ka y col., 2008). No malmen e la adso ción de COH a la ma e ia o gánica disuel a (MOD) se exp esa como un coe icien e de epa o (K OC ) del compues o químico en e la MOD y las ases acuosas lib es. La de e minación del K OC equie e de medidas o cálculos de la can idad de compues o químico so bido al ca bono o gánico disuel o (COD) y la concen ación del compues o químico lib e disuel o en la ase acuosa. Pa a de e mina la concen ación lib e disuel a del con aminan e en disoluciones que con ienen COD se necesi a una écnica que pueda medi di ec amen e es a concen ación sin ene necesidad de hace una sepa ación de ases, de o ma que se pueda conoce la concen ación lib e disuel a y la concen ación del con aminan e unida a la MOD. Gau hie y col., (1986) ue on los p ime os en in oduci el uso del quenching de luo escencia como un mé odo no des uc i o pa a de e mina cons an es en equilib io de in e acciones en e ma e iales húmicos disuel os y HAPs sin é icos. O os in es igado es han empleado écnicas simila es pa a de e mina cons an es de unión con na aleno (T aina y col., 1989) y enan eno (Magee y col., 1991) en p esencia de ca bono o gánico disuel o en agua pa a sabe qué es lo que ocu e en e na aleno o 1- na ol y ácidos húmicos (Mo a y col., 1990). Cualquie p oceso en el que disminuya la luo escencia de un compues o es conocido como quenching de luo escencia, es e enómeno se u ilizó pa a desa olla una nue a écnica conocida como Espec o o ome ía de luo escencia sinc ónica. Las écnicas más comunes pa a la de e minación de HAPs son los mé odos c oma og á icos, especialmen e la c oma og a ía líquida de al a esolución (HPLC) con ase e e sa (con columna C18 pa a esol e p oblemas de co- elución con HAPs isomé icos) con de ección luo imé ica. Es a écnica log a la sepa ación de los 16 HAPs de la EPA. No obs an e los mé odos c oma og á icos son ca os, consumen mucho iempo y equie en g andes can idades de disol en es. CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 96 - CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 97 - III.1. REACTIVOS Hid oca bu os a omá icos policíclicos (HAPs). Se u iliza on enan eno (98%) y pi eno (98%), ambos dis ibuidos po la casa come cial Sigma Chemical Co. Los compues os adioquímicos ue on suminis ados po Sigma Chemical Co (S Louis, MO): enan eno-9- 14 C [ac i idad especí ica, 13,1 mCi/mmol; pu eza adioquímica, >98%], luo an eno-3- 14 C [ac i idad especí ica, 45 mCi/mmol; pu eza adioquímica, >98%] y pi eno-4,5,9,10- 14 C [ac i idad especí ica, 55 mCi/mmol; pu eza adioquímica, >98%]. Tensioac i o. El ensioac i o empleado ue B ij 35 (C 12 E 10 ) a ándose de un ensioac i o no-iónico (Poe schmann y col. ) y suminis ado po Sigma -Ald ich. Bioes imulan es. El e ilizan e oleo ílico usado como bioes imulan e ue S-200, ab icado y suminis ado po IEP Eu ope (Mad id). Con iene u ea ( uen e de N) y és e es os ó icos ( uen es de P), en una mezcla de ácidos g asos sa u ados e insa u ados en la que p edomina el ácido oleico como p oduc o oleo ílico. Con iene como disol en es 2-bu oxi- e anol y glicol-é e , además de lle a como base agua. Los ácidos húmicos empleados ue on ácidos húmicos suminis ados po Ald ich y ácidos húmicos ex aídos de un suelo localizado en el Pa que Nacional de Doñana, ce ca del lago de San a Olalla (Huel a) (Lahlou y col., 2000). Ácido oleico (90%) ue suminis ado po Ald ich y u ea po la casa Fluka. Disol en es. Todos los disol en es u ilizados (ace ona, diclo ome ano, me anol y ace oni ilo) ue on de calidad HPLC y ue on suminis ados po Me ck. CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 98 - III.2. LÍQUIDOS EN FASE NO ACUOSA (NAPLs) En es e abajo se emplea on 4 líquidos en ase no acuosa: • 2,2,4,4,6,8,8- hep ame ilnonano (HMN), n-hexadecano (HD) y di-2-e ilhexil- ala o (DEHP) se ob u ie on de Sigma Chemical Co, odos ellos con una pu eza igual o supe io a 98%. • Fuel pesado, RMG 35 (ISO 8217), ob enido de la O icina Técnica de Ve idos Ma inos Acciden ales (OTVM), Uni e sidad de Vigo. Las cons an es ísico-químicas de cada NAPL u ilizado, ele an e pa a es e es udio y disponible en la li e a u a (Ca oquino y Alexande , 1998) o p opo cionada po OTVM, son la solubilidad en agua, S w (mg/L); pa ición oc anol-agua, log k ow , densidad, D (g/L), y la iscosidad, V (cen is okes, cS ). Los alo es de es as cons an es ísico-químicas co espondien es a cada NAPL los podemos e en la Tabla III. 1. Tabla III. 1.- P opiedades ísico-químicas de los NAPLs. NAPLs S w (mg/L) Log k ow D (g/mL) V (cS ) DEHP 2.2·10 -5 7.45 0.981 81.4 (20ºC) HD 0.283·10 -3 9.16 0.773 3.03 (25ºC) HMN 0.278·10 -3 8.25 0.793 3.18 (25ºC) FUEL PESADO - - 0.981 380 (50ºC) Con el in de educi la iscosidad y pe mi i que los esul ados ue an ep oducibles en los expe imen os de biodeg adación y de epa o, las mues as de uel pesado se mezcla on en la p opo ción siguien e: 1 g de uel con 1 mL de HMN o DEHP. El esul ado de es as mues as de NAPL más luidas, a las que se e ie e como uel/HMN y uel/DEHP, CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 99 - enían iscosidades a 25ºC de 13.99 ± 0.28 y 31.16 ± 0.14 cS , espec i amen e. Es os alo es de iscosidad se de e mina on median e el iempo que anscu e cuando pasa el luido a a és de una pipe a de 10 mL compa ándolo con HMN (Bi man y Alexande , 1996). III.3. SUELOS Se u iliza on dos ipos de suelo en es e abajo: A) Suelo con aminado po c eoso a. Es e suelo ue acili ado po EMGRISA (Emp esa de Ges ión de Residuos Indus iales, Sociedad Es a al, Mad id, España) esponsable de la ges ión ambien al del emplazamien o. Las mues as p ocedían de una an igua plan a de a amien o de made as si uada en Andalucía con un al o con enido en HAPs (Niqui- A oyo y col., 2006). Se u ilizó una pala exca ado a pa a ecoge las mues as del ho izon e supe icial del suelo has a un me o de p o undidad que es has a donde pene ó la c eoso a (Figu a III.1). Una ez cogidas las mues as de suelo se gua da on en con enedo es especiales pa a es e ipo de mues as y se man u ie on a 4ºC has a su pos e io u ilización. B) Suelo no con aminado. Se a a de un suelo anco a enoso con el 67% de a ena la ada (Aqua ama) y 33% de suelo de Vega p oceden e de la inca expe imen al “Las Hampas” del IRNAS-CSIC en Co ia del Río (Se illa). La mezcla de ambos suelos con enía un pH de 8.73, 27.5% de CaCO 3 , 1.75% de ma e ia o gánica, 0.096% de ni ógeno o gánico (Kjeldahl), 13.8 mg·kg -1 de ós o o disponible y 428 mg·kg -1 de po asio. La dis ibución de amaño de pa ículas ue: 19.5% de a ena de g ano g ueso, 39.9% de a ena de g ano ino, 15.9% de limo y 24.6% de a cilla. CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 100 - Figu a III. 1.- Emplazamien o con aminado con c eoso a. Fo os de la zona y del mues eo de suelo. CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 101 - III.4. BACTERIAS, MEDIOS, CONDICIONES DE CULTIVO Y PREPARACIÓN DE INÓCULOS La es i pe u ilizada en es a Tesis Doc o al ue Mycobac e ium gil um VM552. Es a es i pe p ocede de un suelo con aminado con HAPs y es capaz de c ece con enan eno, luo an eno y pi eno como única uen e de ca bono y de ene gía (Wick y col., 2002; an He wijnen, 2003). También se han obse ado esul ados de deg adación, median e p ocesos come abólicos, de an aceno y benzo(a)pi eno (Bueno-Mon es y col., 2011). El medio líquido u ilizado pa a cul i a la es i pe se denomina Medio Suiza (SW), (pH=7, Tabla III. 2). El cul i o se ealizó en agi ado o bi al a 30ºC, 150 e oluciones po minu o ( pm) y con 0.2 % (p/ ) de enan eno como uen e de ca bono. Los c is ales de enan eno ue on p e iamen e es e ilizados median e disolución en diclo ome ano y pos e io ec is alización. Es a es i pe o ma en medio sólido de aga soja ip ona suplemen ado (TSA, Cul imed, Pan eac Química, S. A.) colonias edondas de colo ama illo-ana anjado y de aspec o mucoso y b illan e. Es e medio ico (Tabla III. 2) se p epa ó añadiendo a un medio denominado MSB (minimal sal s medium), el peso adecuado de aga soja ip ona (42 g/L). En los ensayos de biodeg adación, se empleó el medio de mine alización (MM, Tabla III. 2) cuyo pH ue igual a 5.7, siendo su icien emen e ácido como pa a pe mi i la libe ación del 14 CO 2 gene ado du an e el p oceso de biodeg adación del sus a o ma cado, y su cap u a en la ampa alcalina. Pa a la p epa ación de los inóculos, se siguió el siguien e p ocedimien o: 1º) Se il ó a a és de una placa po osa nº2 (40 µm de amaño de po o) 1000 mL de cul i o pa a los expe imen os de in e ase cons an e y 100 mL de cul i o pa a los expe imen os CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 102 - de mine alización con exudados y ácidos húmicos, cada uno incubado con enan eno como uen e de ca bono adecuada. 2º) Se man u o el cul i o bac e iano il ado, du an e 24 h, en agi ación a 30ºC y 150 pm, pa a elimina los posibles c is ales esiduales de enan eno en solución. 3º) Después de la incubación del cul i o il ado, és e se some ió a a ios ciclos de la ado pa a libe a el pelle bac e iano de es os de me aboli os. Es e la ado consis ió en a ias cen i ugaciones con medio de mine alización du an e 10 minu os a 8000 pm (pa a los expe imen os de in e ase cons an e) y 5 minu os a 10000 pm (pa a los expe imen os de mine alización en p esencia de exudados y ácidos húmicos). 4º) T as el la ado, el pelle se esuspendió en un olumen conocido de medio de mine alización es é il. Las células iables se de e mina on en cada expe imen o como unidades o mado as de colonias (CFU) después de sucesi as diluciones del pelle con medio de cul i o y siemb a en placas de TSA (T ip one Soy Aga ). También se midió la densidad óp ica del inoculo a 600 nm en un espec o o óme o UV- isible (Genesys 10 is, Spec onic Unicam). CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 103 - Tabla III. 2.- Composición po li o de los dis in os medios u ilizados en es a esis. Los eac i os ma cados con * se au ocla a on po sepa ado de los ma cados con ** y se mezcla on una ez en iados. Los ma cados con *** se añadie on po il ación a a és de millipo e de po o 0.2 µm. Compues o Medio Suiza (SW) Medio Mine alización (MM) MM con N ajus ado (MMNA) Medio MSB Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 3.52g ** 670 mg KH 2 PO 4 0.2g ** 900 mg** 900mg ** 340 mg K 2 HPO 4 100 mg** 100 mg ** MgCl 2 ·6H 2 O 0.1 g* (NH 4 ) 2 SO 4 0.5 g* Ca(NO 3 ) 2 ·4H 2 O 0.05 g* CaCl 2 80 mg* 80 mg* 14 mg NH 4 Cl 500 mg NH 4 NO 3 100 mg* 876 mg* MgSO 4 ·7H 2 O 100 mg* 100 mg* 112 mg ZnSO 4 ·7H 2 O 2.5 µg*** 5 mg ZnCl 2 5 µg*** MnCl 2 ·4H 2 O 30 µg*** H 3 BO 3 5.5 µg*** CoCl 2 ·6H 2 O 19.5 µg*** CuCl 2 ·2H 2 O 1.7 µg*** NiCl 2 ·6H 2 O 2.3 µg*** Na 2 B 4 O 7 ·10H 2 O 2 µg*** 2 µg*** MnSO 4 ·H2O 2 µg*** 2 µg*** CuSO 4 ·5 H 2 O 2 µg*** 2 µg*** Na 2 MoO 4 ·2 H 2 O 10 µg*** 1.4 µg*** 1.4 µg*** 2.5 mg ZnSO 4 ·H 2 O 2 µg*** 2 µg*** CuSO 4 2.5 µg*** Na 2 EDTA 2 mg*** FeCl 2 0.75 mg*** LiCl 1.25 µg*** SnCl 2 1.25 µg*** KB 5 µg*** KI 5 µg*** BaCl 2 1.25 µg*** FeCl 3 ·6H 2 O 10 mg*** 10 mg*** 0.22 mg TSA 40 g pH 7.0 5.7 5.7 7.0 CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 104 - III.5. ANÁLISIS DE HAPs POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) La ins umen ación u ilizada ue un c oma óg a o líquido de al a esolución (Wa e s 996 Sepa a ion Module) de ase e e sa equipado con un de ec o de UV-VIS (Wa e s 996 Pho odiode A ay De ec o ) y o o de ec o de luo escencia (Wa e s 474 Scanning Fluo escence De ec o ). La columna empleada es á especialmen e indicada pa a la de e minación de hid oca bu os a omá icos policíclicos (Wa e s PAH column, C 18 , 5 µm de amaño, 4.6 x 250 mm). Los componen es de la ase mó il, ace oni ilo de calidad HPLC (Me ckx y col. ) y agua Milli-Q, ue on il ados p e iamen e a su uso pa a aumen a la ida ú il de la columna, u ilizando pa a ello un il o de memb ana de nylon de 0.45 µm de po o y 47 mm de diáme o (Teknok oma, Ba celona, España). Las condiciones c oma og á icas ue on las siguien es: • Flujo ase mó il: 1 mL/min. • Tempe a u a de la columna: 30ºC. • Volumen de inyección 80 µL. • Tiempo de análisis 50 min. El g adien e empleado pa a la ase mó il lo podemos e en la Tabla III. 3 (Ga ago i y col. , 1999), así como la p og amación del de ec o de luo escencia en la Tabla III. 4. Tabla III. 3.- G adien e empleado como ase mó il en el análisis de mues as de epa o. Tiempo (min) Ace oni ilo (%) Agua Milli-Q (%) 0 45 55 5 45 55 25 95 5 31 100 0 38 100 0 43 45 55 CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 105 - Tabla III. 4.- P og amación del de ec o de luo escencia. Es as condiciones analí icas se u iliza on en los análisis de los expe imen os de epa o de los HAPs desde los NAPLs a la ase acuosa, en el ensayo del in e nade o a iempo inical, in e medio (45 días) y inal (90 días), así como, en los ensayos de mine alización con suspensiones de suelo con aminado con c eoso a median e poblaciones au óc onas en p esencia y ausencia de exudados de gi asol a iempo inicial y inal. Se ealizó una ec a de calib ado pa a el análisis de las mues as de cinco pun os, cub iendo el in e alo de concen aciones de las mues as a de e mina . Los lími es de de ección y cuan i icación de los componen es analizados se calcula on como es eces y diez eces la des iación es ánda ela i a de la o denada en el o igen de la ec a de calib ado. La cu a de calib ado pa a el expe imen o de epa o de enan eno ue del o den de ng·mL -1 , siendo el lími e de de ección igual a 0.2 ng·mL -1 y el lími e de cuan i icación igual a 0.7 ng·mL -1 , ob enidos con el de ec o de luo escencia. La cu a de calib ado pa a los HAPs de las mues as de suelo ue del o den de µg·mL -1 , los lími es de de ección y de cuan i icación calculados apa ecen en la Tabla III. 5. Tiempo (min) λ Exci ación (nm) λ Emisión (nm) 0.0 270 323 14.5 248 374 21.0 270 400 32.5 305 430 38.0 270 323 CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 112 - las p ime as ge minaciones de semillas, po lo que se e i ó el papel de aluminio, quedándose a una in ensidad lumínica de 2.75 µEm -2 s -1 y 18 ho as de o ope íodo. T anscu idos 45 días se io un desa ollo adecuado de la zona adicula de las plan as de ambas especies. En consecuencia, se e i a on las plan as y se congeló el medio a -20ºC pa a su pos e io análisis an o del ca bono o gánico como del ca bono o gánico o al median e el Se icio de Análisis del IRNAS. An e los esul ados alen ado es conseguidos en el p ime ensayo, se ealizó una p oducción de exudados a mayo escala. Pa a ello, se p epa a on ascos de 1000 mL de capacidad a lo que se les ins aló en su in e io un sopo e a modo de ces a de ela me álica de ace o inoxidable (0.98 mm de luz y 0.40 mm de diáme o) sos enida po hilos me álicos que se suje a on en la boca del asco que se ce ó he mé icamen e. La longi ud de es os hilos me álicos se calculó pa a que las semillas posicionadas en la ces illa es u ie an en con ac o con el medio de cul i o (500 mL de MM), pe o sin hundi se en él, lo que p oduci ía e ec os de anoxia y, en consecuencia, la ge minación esul a ía se iamen e a ec ada. G acias a es e sis ema (Figu a III.3), las aíces que se an desa ollando se in e nan en el medio líquido donde ie en los exudados obje o de ex acción, sin ene ningún ipo de pa icipación la pa e aé ea. Pos e io men e, en el in e io de la cabina de lujo lamina , se es e iliza on po sepa ado dos g upos de 50 semillas de gi asol median e inme sión en e anol 96º du an e 90 seg. Seguidamen e ambos g upos se some ie on a una nue a inme sión en hipoclo i o sódico (NaClO) (3.5% de clo o ac i o) du an e 30 minu os y pa a elimina los es os de hipoclo i o se ealiza on es la ados de cinco minu os cada uno en agua des ilada es é il. De igual modo 200 semillas de Lolium pe enne y 200 de Fes uca a undinacea se es e iliza on po sepa ado median e inme sión en e anol 96º du an e 90 segundos y pos e io men e en NaClO (3.5% de clo o ac i o) CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 113 - du an e 20 minu os inalizando con los es la ados con agua es é il de cinco minu os cada uno. Figu a III. 3.- Sis ema u ilizado pa a la ob ención de exudados de gi asol in i o. Una ez es e ilizadas las semillas se coloca on los 2 g upos de 50 semillas en el caso del gi asol, y 2 g upos de 100 pa a el caso de las dos g amíneas en cada uno de los 6 ascos con los sopo es desc i os an e io men e, p e iamen e es e ilizados en au ocla e. A cada uno de los ascos se les añadió en cáma a de lujo lamina , 500 mL de MM (pH=5.7) es é il sin egulado es de c ecimien o y sin uen e de ca bono, a in de no in e e i con los exudados de aíz y que ue an és os los únicos compues os hid oca bonados disponibles pa a los mic oo ganismos. Una ez semb adas las semillas y ce ados los ascos con pa a ilm, el conjun o se deposi ó en una cáma a de cul i o a 25±1ºC, 65.24 µEm -2 s -1 , pa a CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 114 - po encia la o osín esis dado que el medio de cul i o ca ece de uen e de ca bono, y 18 ho as de o ope íodo. T anscu ido un mes de incubación en es as condiciones, se obse ó una ge minación adecuada de las semillas con una p oli e ación del sis ema adicula bas an e acep able, po lo que se sepa a on las plan as de los medios de cul i o con los exudados exc e ados en condiciones es é iles. Los medios ecogidos se cen i uga on du an e 3 ho as a 31000 g pa a ob ene una solución ní ida que incluye la ma e ia o gánica disuel a po encialmen e p esen e en el agua in e s icial de los sedimen os (Ha ka y col., 2008) y se almacena a -20ºC has a su uso en los expe imen os de mine alización. Se analizó el ca bono o gánico o al (COT) a los medios cen i ugados, ambién median e el Se icio de Análisis del IRNAS, Se illa. Dada la mayo concen ación de exudados p oducidos po Helian hus annuus, es imada median e la concen ación de ca bono o gánico o al (COT) y su mejo c ecimien o in i o, se u iliza on p e e en emen e los exudados de es a plan a en los pos e io es ensayos de mine alización y eliminación de de HAP en in e nade o. Pa a lle a a cabo es a p oducción egula de exudados de aíces de gi asol, se ealiza on sie e cul i os, usando siemp e 50 semillas comple as y es e ilizadas en cabina de lujo lamina sume giéndolas en e anol absolu o du an e 3 minu os, inmedia amen e después de la eliminación del e anol se in oduje on en una solución de hipoclo i o sódico al 57% (14% de clo o ac i o) du an e 25 minu os y pos e io la ado de 5 minu os cada uno con agua es e ilizada. T anscu idos 30 días, se cuan i icó el núme o de plan as pa a calcula el po cen aje de ge minación, el peso eso y seco y la asa de c ecimien o ela i o ( ela i e g ow h a e, RGR) de la plan a comple a de acue do con la ecuación: 1 )ln(ln − ⋅−= Dpip RGR (Me ckx y col., 1987) donde p es el peso seco de la plan a comple a al inal del expe imen o; pi es el peso seco al inicio del expe imen o (media de 5 plán ulas CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 115 - secadas 3 días después de la ge minación de la semilla) y D es la du ación del expe imen o en días. El secado de las plan as se e ec uó man eniendo el ma e ial ege al en es u a a 70ºC du an e 72 ho as. III.7.2. Mine alización de pi eno en cul i os líquidos en p esencia y ausencia de exudados de aíces de gi asol Pa a e el e ec o de los exudados de aíces de gi asol en la biodeg adación de HAPs pu os, lle amos a cabo dos ipos de es udios de mine alización de pi eno en p esencia o ausencia de es os exudados: Po debajo de la solubilidad del pi eno (S=0.135 µg·mL -1 a 25ºC) a 6·10 -4 µg·mL -1 y po encima de la solubilidad del pi eno a 27.2 µg·mL -1 . A) Pa a medi la mine alización del hid oca bu o po debajo de su solubilidad, se p epa ó una disolución de MM de 40 mL con 4296 dmp·mL -1 . Conociendo el alo de dmp·mL - 1 de es a disolución y la ac i idad especí ica podemos conoce la concen ación del es e hid oca bu o en la disolución. De es a mane a, la disolución de pi eno en MM e a de 7.21·10 -3 µg·mL -1 . Una ez p epa adas las disoluciones, és as se añadie on po duplicado en ubos de pi ex 18 x 100 cm has a alcanza una concen ación de HAP ma cado de 6·10 -4 µg·mL -1 en 5 mL de olumen o al donde 0.5 mL e an de inóculo bac e iano (densidad óp ica a 600 nm igual a 0.19 en los 5 mL o ales, 2.3·10 8 células/mL) en ausencia o p esencia de 50 µg·mL -1 de ca bono o gánico p oceden e de los exudados de aíz de gi asol. En el in e io del ubo de ensayo se colocó una a illa de id io de 5 cm pa a homogeniza la disolución en su in e io du an e la agi ación a 80 pm y 25ºC. Los ubos de ensayo se ce a on con apones en uel os en Te lón, de los cuales suspendían unos iales de 1 mL donde se coloca on las ampas de NaOH (1 mL a 0.5 M). CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 116 - Se omó dia iamen e 1 mL de la ampa de sosa pa a medi la p oducción de 14 CO 2 como se ha desc i o an e io men e. B) Los expe imen os de mine alización po encima de la solubilidad del pi eno, se ealiza on en los mismos ubos de ensayo y en las mismas condiciones de empe a u a y agi ación. Se p epa ó una disolución de pi eno en ace ona (136 µg·mL -1 ) de la cual se deposi ó 100 µL en el ondo de los ubos de ensayo es é iles añadiéndoles a cada ubo de ensayo el pi eno ma cado pa a consegui una adiac i idad de 40000 dpm po ubo y se dejó e apo a oda la ace ona du an e 24 ho as, quedándose los c is ales de HAP en el ondo del ubo. Una ez e apo ado odo, se añadie on las disoluciones de MM, exudados de gi asol a 50 µg·mL -1 y 0.5 mL de inóculo bac e iano (Densidad óp ica a 600 nm de 0.19 ± 0.03, 2.3·10 8 células/mL pa a un olumen o al de 5 mL). Como el olumen o al pa a cada a amien o ue de 5 mL, la concen ación inal de pi eno que se ob u o ue de 27.2 µg·L -1 . La mine alización se pudo medi , ecogiendo las ampas de sosa (0.5 M) dia iamen e como hemos desc i o en el caso an e io . III.7.3. Ensayo en in e nade o El suelo u ilizado en es a a ea ue una mezcla (1:1) de suelo con aminado con c eoso a y suelo no con aminado. La desc ipción de es os suelos apa ece de allada en el apa ado III.3. El suelo no con aminado u ilizado se au ocla ó p e iamen e an es de mezcla se con el suelo con aminado pa a que sólo exis ie an los mic oo ganismos au óc onos de es e úl imo. La mezcla se secó lige amen e en es u a a 30ºC CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 117 - du an e 18 ho as, pos e io men e se molió y se ealizó un c ibado has a ob ene un amaño de g ano no supe io a 2 mm. Una ez inalizados es os a amien os, la mezcla (1:1) se homogeneizó en una ho migone a du an e pe íodos dia ios de 9 ho as a lo la go de una semana, cambiando pe iódicamen e el sen ido de gi o pa a consegui una mezcla óp ima. Las ca ac e ís icas inales de la mezcla (1:1) ue on: 2.2% de humedad sob e peso húmedo, pH de 8.09; 15.9% de CaCO 3, 0.69% de ma e ia o gánica oxidable, 0.401% ca bono o gánico oxidable, 0.055% de ni ógeno o gánico (Kjeldahl), 7.0 mg·kg -1 de ós o o Olsen, 0.9% ca bono o gánico o al. Dis ibución de amaño de pa ícula: 46.6% de a ena de g ano g ueso, 4.3% de a ena de g ano ino, 15.8% de limo, y el 33.2% de a cilla. La clase ex u al ue: anco- a cillo-a enosa. Po úl imo, se ealizó una ex acción de los HAPs p esen es en la mezcla homogénea de suelo ( e apa ado III.7.4) pa a su pos e io análisis po HPLC ( e apa ado III.5). La concen ación inicial de HAPs en la mezcla (1:1) ue igual a 21.75 mg·kg -1 que co esponde al suma o io de 6 PAHs ( luo eno, enan eno, an aceno, luo an eno, pi eno y c iseno). Se conside ó que es os ni eles de HAPs en el suelo ue on su icien es pa a pe mi i pe íodos de p uebas ela i amen e co os y es imaciones p ecisas del p oceso de biodeg adación en nues o sis ema expe imen al. Además, las concen aciones esul an es pueden se conside adas ealis as po los suelos p esen ados en uen es pun uales de con aminación debido a la eliminación de esiduos indus iales o de ames acciden ales de hid oca bu os a omá icos policíclicos, que suelen con ene concen aciones supe io es a 1 mg / kg (Posada-Baque o y O ega-Cal o, 2011). Después de conoce el con enido de HAPs en el suelo y comp oba la homogeneidad de la mezcla, comenzó el ensayo en in e nade o según el diseño expe imen al de la Figu a III.4. CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 118 - Figu a III. 4.- Diseño expe imen al del ensayo ealizado en in e nade o. Los cí culos simbolizan las mace as u ilizadas y los colo es nos indican el ipo de suelo empleado. Se coloca on en el in e nade o 20 mace as con 2 kg de suelo en cada mace a (10 kg de suelo no con aminado y 10 kg de mezcla (1:1). En las mace as con plan a se plan a on 5 semillas de gi asol po mace a (50 semillas en o al). La du ación de la p ueba ue de 90 días. Las condiciones del in e nade o ue on: empe a u a 23±1ºC, égimen de luz na u al y el sus a o se man u o a capacidad de campo median e adición de 100 cc de agua de la ed a cada mace a cuando ue necesa io. Se oma on mues as de suelo y plan a a iempo inicial (T 0 ), as 45 (T 45 ) y 90 días (T 90 ) pa a comp oba la e olución de los HAPs en el suelo y su e ec o sob e las plan as. Las mues as de suelo se ex aje on con un ubo de id io (20 g) y con cuidado pa a no daña las plan as. Las mues as ecogidas se congela on (-20ºC) y se gua da on has a su ex acción ( e apa ado III.7.4) y análisis po HPLC ( e apa ado III.5). Además del análisis químico de los con aminan es así como de las p opiedades del suelo a T 0 y T 90 , es as mues as ue on analizadas a ni el mic obiológico g acias a la colabo ación del Depa amen o de Mic obiología de la Uni e sidad de Ba celona lide ado po la Doc o a Magdalena G i oll. También se gua da on mues as de la mezcla de suelo homogénea a T 0 a -20ºC y a 4ºC pa a los expe imen os de mine alización en suspensiones (apa ado III.7.5). CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 119 - El análisis mic obiológico consis ió en cuan i ica las poblaciones mic obianas ( an o he e ó o a como la deg adado a de al o y bajo peso molecula de HAPs) median e la écnica del núme o más p obable (NMP) minia u izado en placas de mic o i ulación, con 8 éplicas po dilución (W enn y Venosa, 1996). Y además se hizo un es udio de la composición de las comunidades mic obianas median e la écnica molecula de secuenciación di ec a de bandas de DGGE (gel de g adien e desna u alizan e químico) pa a el análisis de genes que codi ican el 16S RNA. Es a écnica pe mi ió la sepa ación de una mezcla he e ogénea de genes ampli icados po PCR en un gel de poliac ilamida con un g adien e químico de o mamida y u ea en concen aciones c ecien es en el sen ido de la mig ación elec o o é ica de mues as de suelo con c eoso a (mezcla 1:1, in e nade o) con ol y suelo con c eoso a (mezcla 1:1, in e nade o) en p esencia de Helian hus annuus después de los 90 días que du ó el expe imen o en in e nade o. La sepa ación de las moléculas de DNA se consigue po que du an e su mig ación po el gel de poliac ilamida, el DNA, se encuen a con concen aciones c ecien es de los agen es desna u alizan es o mamida y u ea, lo que gene a di e en es ho quillas de desna u alización, según la secuencia de las moléculas de DNA, aduciéndose en una educción de la elocidad de mig ación y una sepa ación en di e en es bandas de mig ación elec o o é ica. Una ez las moléculas quedan sepa adas en el gel, es posible eco a las y es udia su secuencia, con el in de asocia cada banda a un de e minado g upo ilogené ico. Al inal del expe imen o se calcula on el po cen aje de ge minación y el peso esco y seco de allos y aíces po sepa ado. Pa a el peso seco se man u o el ma e ial ege al du an e 72 ho as en es u a a 70ºC. CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 120 - III.7.4. Ex acción de los HAPs del suelo y pu i icación de la mues a La ex acción de los HAPs p esen es en la mezcla de suelo (1:1) u ilizada en el in e nade o, así como su ex acción en las suspensiones pa a los expe imen os de mine alización se ealiza on como se explica a con inuación (esquema de allado en la Figu a III.5): 1º) Se ealizó una ex acción Soxhle de 250 mL de capacidad. Se u ilizó como ase o gánica ex ac o a 100 mL de diclo ome ano. Se pesó 2.8 g de suelo pa a las mues as del in e nade o y 1 g pa a las suspensiones de los expe imen os de mine alización. Todas las mues as se some ie on a un p oceso de secado en es u a a 40ºC du an e 48 ho as y pos e io men e se eliminó la humedad es an e median e molienda de la mues a en un mo e o de ága a jun o a un peso equi alen e a la mues a de sul a o sódico anhid o. Después es as mues as se in oduje on en unos ca uchos de celulosa (19 mm Ø in e io x 90 mm, Fil os Anoia, S.A., Ba celona, España) y se some ie on a ex acción du an e un pe iodo de 8 ho as (Jones y col., 1989). 2º) El ex ac o o gánico ob enido se lle ó al o a apo has a casi su sequedad y se esuspendió en 5 mL de diclo ome ano. Pa a elimina los compues os más pola es del ex ac o, se pasó po un ca ucho de luo isil (Sep-Pak ca idges, WATERS) que pe mi ió el paso de los compues os apola es como los HAPs y e u o los pola es. El ca ucho se acondicionó p e iamen e con 9.5 mL de diclo ome ano con ayuda de una je inga Hamil on. Después de pasa el ex ac o po el ca ucho, se limpió el ca ucho con 2 mL de diclo ome ano pa a a as a las azas de HAPs que se hubie an quedado e enidas (Ga igues y Bellocq, 1989; Ace es y G imal , 1993; Leal-G anadillo y col. , 2000). 3º) Una ez que el ex ac o quedó limpio, se lle ó a sequedad median e co ien e de ni ógeno. Se esuspendió en CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 121 - un olumen conocido de ace oni ilo y se sonicó du an e 15 minu os pa a alcanza la comple a disolución de los HAPs. 4º) Po úl imo, la mues a en ace oni ilo se il ó median e un il o de Nylon (0.45 µm y 13 mm de diáme o) pa a elimina las posibles impu ezas exis en es en la disolución y se aspasó a un ial pa a se analizada median e HPLC (apa ado III.5). Figu a III. 5.- P oceso de ex acción y cuan i icación de HAPs en suelos. CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 128 - Los iales con PDMS en el ondo, se man u ie on a 5ºC du an e 72 h pa a educi las bu bujas de ai e, luego se pusie on a empe a u a ambien e du an e 72 h y a 110ºC du an e una noche pa a ija bien la silicona. Una ez ijada la silicona, se p osiguió con su limpieza median e 3 la ados de e anol (96%) con los iales o almen e ce ados y man eniendo un con ac o o al de 48 ho as pa a elimina impu ezas y oligóme os. Después de es e iempo se hicie on 3 la ados con agua Milli-Q du an e 24 ho as pa a elimina los es os de e anol. Po úl imo, los iales con el políme o se seca on a 110ºC du an e una ho a y se man u ie on a empe a u a ambien e has a su uso en los ensayos de biodeg adación o de disolución del pi eno. Pa a la es e ilización de es os iales, se ealiza on 3 la ados con e anol absolu o du an e 72 ho as, luego 3 la ados con agua Milli-Q au ocla ada y po úl imo, se eliminó el agua pa a seca los en es u a a 80ºC du an e 24 ho as. III.9.2. Es udio de la mine alización y disolución de pi eno en p esencia y ausencia de ácidos húmicos en iales con PDMS Pa a e el e ec o de los ácidos húmicos (10 µg·mL -1 ) sob e la biodeg adación de pi eno a 50 µg·mL -1 y su disolución en MM, se usa on los iales con PDMS ijada en su base pa a con ola la concen ación de pi eno lib e disuel a. En es os iales con PDMS (Figu a III.6) y en condiciones es é iles, se ijó 100 µL de pi eno en ace ona (250 µg·mL -1 ) como en los apa ados de mine alización (III.8.2) y de disolución (III.8.3) pa a ene una concen ación de 50 µg·mL -1 en un olumen de 5 mL. Se añadió 15000 dpm de 14 C-pi eno en ace ona po ial. Se dejó e apo a la ace ona du an e 24 h y el pi eno quedó e enido en la silicona debido a la al a hid o obicidad de la silicona. A con inuación, se añadie on las CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 129 - disoluciones de medio MM (con ol) y 10 µg·mL -1 de ácidos húmicos de San a Olalla en MM. Po úl imo se colocó 0.5 mL de inóculo bac e iano (M. gil um VM552, A 600nm = 0.16, 1.9·10 8 células/mL) en los expe imen os de mine alización. Figu a III. 6.- Viales de dopaje pasi o con PDMS ijados en su base pa a la mine alización de 50 µg·mL -1 de pi eno po Mycobac e ium gil um VM552 en p esencia de 10 µg·mL -1 de ácidos húmicos ex aidos de San a Olalla, Huel a. Los iales ue on sellados con apones en uel os en e lón, de los cuales pendían las ampas de NaOH (1 mL, 0.5 M). En el in e io de es os iales se coloca on unas ba i as de id io de 5 cm de longi ud pa a homogeneiza la mezcla du an e su incubación en agi ado o bi al a 80 pm y 25ºC. Las mues as de NaOH con 14 CO 2 p oducido de la mine alización del pi eno, ue on ecogidas a dia io en iales de cen elleo de 7 mL jun o a 5 mL de líquido de cen elleo (Ready sa e, Beckman Ins umen s, Fulle on, Cali o nia) y anscu idas 8 ho as de oscu idad pa a disipa su quimioluminiscencia, ue on medidas po con ado de cen elleo (Beckman Ins umen s, Fulle on, Cali o nia). Se ealiza on iplicados po cada a amien o (con o sin 10 µg·mL -1 de ácidos húmicos de San a Olalla). En el caso de los ensayos de disolución de pi eno a 50 µg·mL -1 , se emplea on los mismos iales de la Figu a III.6 con las mismas disoluciones que en los ensayos de mine alización CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 130 - y las mismas condiciones de incubación, pe o sin añadi los mic oo ganismos ni la ampa de sosa. Al igual que en el apa ado III.8.3, se p epa a on a ias se ies de a amien os en pa alelo pa a e i a un cambio b usco de concen ación al mues ea . Se ecogie on 0.5 mL de mues a du an e 8 ho as y la úl ima mues a 24 ho as después. Es as mues as ambién ue on medidas po con ado de cen elleo (Beckman Ins umen s, Fulle on, Cali o nia) pa a conoce la concen ación o al de pi eno en odo el p oceso ya que la concen ación disuel a se con oló con la p esencia de la silicona. III.9.3. Es udio de la di usión de PAHs en p esencia de los 3 bioes imulan es empleados en biodeg adación Pa a es udia la in luencia de los bioes imulan es empleados en la biodeg adación de hid oca bu os a omá icos policíclicos, se u iliza on unas siliconas de polidime ilsiloxano con o ma de discos (SSP-M823), con un espeso de 600 ± 10 µm y 6 mm de diáme o, que ue on suminis adas po Special y Silicone P oduc s, Inc. (Balls on Spa, NY). Sodeman Indus i jed e A/S (Viby, Dinama ca) suminis a on a andelas de ace o inoxidable de 100 µm (ID 4mm, OD 8 mm) que se u iliza on como sepa ado es. Se selecciona on de las a andelas suminis adas aquellas que u ie on un adio de 100 ± 5 µm. Los imanes u ilizados ue on unos discos de neodimio-hie o-bo o niquelados con 10 mm de diáme o y un espeso de 5 mm, ue on suminis ados po Fa nell (He le , Dinama ca). Los HAPs es udiados ue on; enan eno (98%, Ald ich), luo an eno (99%, Ald ich), pi eno (99%, EGA), benzo(a)an aceno (Ald ich), c iseno (95%, Ald ich), benzo(k) luo an eno (98%, Ald ich) y benzo(a)pi eno (98%, Ald ich). CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 131 - Más de 1000 discos de PDMS se limpia on 3 eces con 200 mL de me anol du an e 24 h. Es os discos se con amina on con una mezcla me anol: agua (90:10, / ) que con enían los HAPs a una concen ación de 40-47 µg·mL -1 cada hid oca bu o. El con ac o o al en e los discos y la mezcla ue de 16 ho as pa a que los HAPs queda an e enidos en el PDMS. En el mismo día que se ealizó el expe imen o de di usión, los discos con aminados se aslada on a un aso de p ecipi ado con un olumen pequeño de agua (mL/disco) con el in de elimina el me anol. El expe imen o consis ió en una se ie de mic ocáma as (Figu a III.7) pa a medi la ans e encia de masa median e epa o-di usión- epa o, poniendo 10 µL de las disoluciones en es udio con los bioes imulan es en e un disco con aminado con HAPs y un disco limpio. Los bioes imulan es empleados ue on: e ilizan e oleo ílico (100 µg·mL -1 ), exudados de gi asol (71.7 µg·mL -1 ) y ácidos húmicos (100 µg·mL -1 ) ex aídos de San a Olalla en MM. Figu a III. 7.- Sección ans e sal del diseño expe imen al de las mic ocáma as empleadas en el es udio del aumen o de di usión en p esencia de los di e en es bioes imulan es u ilizados. (Modi icación de Maye , P., y col., 2005). Las di e en es ma ices se coloca on en cada mic ocáma a y queda on ijadas en el medio po una a andela de ace o inoxidable de 100 µm de espeso . Las di e en es disoluciones que componen las ma ices en es udio son el ac o a iable de es e diseño expe imen al y o man el modelo “Uns i ed Bounda y Laye ” (UBL) ci ado en la in oducción I.3. CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 132 - Las mic ocáma as se coloca on sob e una placa de id io ho izon al con sopo e de ace o y se man enían unidas g acias al empuje de un imán. Todas las mic ocáma as se ealiza on sob e un po a de c is al 40 x 60. De es a o ma los HAPs pasa on po epa o del disco de PDMS a la ma iz en es udio, median e di usión a a és de los 100 µm del modelo UBL y inalmen e po epa o al disco de PDMS limpio. Se cogie on mues as po iplicado en pe íodos de iempo de 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 min, 24 y 48 h. Las medidas se ealiza on qui ando el imán y as i iendo cada disco a 0.4 mL de me anol (pa a los discos limpios) y a 4 mL de me anol (pa a los discos con aminados con HAPs) pa a ex ae los HAPs y medi los po HPLC. El HPLC u ilizado enía de ección po luo escencia (Agilen 1100 sys em con G1321A FLD, ex. 260 nm; em 350, 420, 440 y 500 nm). La columna de sepa ación “CP-Ecosphe 4 PAH” ue ob enida po Va ian Inc. (Palo Al o, CA) y ope aba a 0.5 mL/min (28ºC, 30 µL de inyección). Me anol (g ado HPLC suminis ado po Me ck) y agua Milli-Q e an la ase mó il: 50% me anol a =0-2 min, g adien e linea desde 50 a 75% me anol a =2-7 min, g adien e linea desde 75 a 100% a =7-35 min y 100% me anol a =33-55 min. La cuan i icación de las concen aciones de HAPs en los ex ac os se ealizó po una cu a es ánda ex e na de cinco pun os. El análisis de las mues as se lle ó a cabo den o de dos semanas después de la oma de mues as. La in eg ación de la señal se ealizó con HP Chems a ion so wa e (A.06.03, Agilen Technologies, Palo Al o, CA) y se co igió a mano cuando ue necesa io. Gene almen e, se ecupe ó en e un 90-100% de los HAPs iniciales en el ex ac o inal de los discos con aminados y limpios espec i amen e, indicando un comple o balance de masas. CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 133 - Finalmen e, el po cen aje que ue ans e ido al disco limpio ue ajus ado pa a cada HAPs con la ecuación (1), con el in de de e mina la asa de elocidad cons an e a, que luego se no malizó con la cons an e de elocidad de e minada po el agua des ilada (ecuación 2). Es as eg esiones no lineales se ealiza on median e mínimos cuad ados con el p og ama G aphPad P izm 5 (San Diego, CA). ( ) ( ) ( ) a dldl e C C m m 2 00 1%50 − −⋅== (1) Donde m dl es la masa de HAP en el disco limpio, m 0 es la masa de HAP inicial y a es la cons an e de elocidad (s -1 ). j i j i j i D D K a a⋅= (2) Donde K ij es el coe icien e de epa o en e el medio i y el medio j, D es el coe icien e de di usión pa a el medio i y pa a el medio j y a i /a j es la elación en e elocidades que desc ibe una conduc i idad ela i a pa a la ans e encia de masa po di usión. Pa a mas de alle e la in oducción (apa ado I.6). III.9.4. Ensayos de dopaje pasi o en el es udio de la capacidad ex ac o a de HAPs po los bioes imulan es empleados en biodeg adación Pa a conoce la capacidad de los bioes imulan es en cap a los HAPs de un medio donde se encuen an con enidos (en es e caso la silicona), se p opuso el siguien e esquema expe imen al. P ime o se usa on iales de id io de 10 mL de capacidad con silicona (PDMS) ijada en el ondo de su base (Ve apa ado III.8.4.1). Es os iales ue on expues os a una disolución sa u ada de PAHs al 10 % de su solubilidad en me anol. Los HAPs u ilizados ue on: na ale no (>99%, CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 134 - Ald ich), enan eno (>98%, Me ck), an aceno (>99%, Fluka), luo an eno (>99%, Ald ich) y pi eno (>99%, Sigma). Los c is ales de los HAPs en me anol man u ie on el ni el de sa u ación. La silicona de es os iales con iene los HAPs debido al epa o de es os hid oca bu os desde el me anol a la silicona a 22ºC du an e un pe iodo mínimo de 72h. Después de que la silicona cap a a los HAPs, el me anol ue cuidadosamen e e i ado y se limpió la supe icie con un isú pa a elimina cualquie solución adhe ida. Po úl imo, se la ó la silicona 3 eces con agua Milli-Q pa a elimina el posible me anol e enido y se secó con un isú (Smi h y col., 2010). Una ez p epa ados los iales con los HAPs e enidos en la silicona, se añadió 3 mL de agua Milli-Q en cada ial y equilib amos los iales a 20ºC y 1000 pm du an e 24. Todo el expe imen o se ealizó en una habi ación con empe a u a con olada. Después de es e iempo, se omó 0.75 mL de cada mues a y se mezcla on con 0.75 mL de me anol pa a medi las po HPLC con de ec o de luo escencia. De es a cuan i icación se ob u o una concen ación de HAPs disuel a, C 1 . Se e i ó el agua Milli-Q y se añadió 3 mL de los siguien es bioes imulan es en cada ial: ácidos húmicos de San a Olalla (10 µg·mL -1 y 100 µg·mL -1 ), exudados de gi asol (71.7 µg·mL -1 ), exudados de Lolium (10.1 µg·mL -1 ) y exudados de Fes uca (17.8 µg·mL -1 ), además del con ol MM. Se alcanzó el equilib io de es as disoluciones a las 24h de incubación, se cogie on mues as después de alcanza el equilib io (0.75 mL de mues a + 0.75 mL de me anol) y se midió la concen ación median e HPLC con de ec o de luo escencia. De es a cuan i icación se ob u o una concen ación o al de HAPs, C . Po úl imo, se e i a on las disoluciones con los bioes imulan es y se añadió 3 mL de agua Milli-Q en cada ial, se equilib a on los iales con agua de igual modo que en los casos an e io es. Se oma on las mues as y se ealizó CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 135 - cuan i icación de la misma mane a. De es a medida se ob u o una concen ación en disolución de HAPs, C 2 . También se coloca on unos iales con agua Milli-Q en pa alelo a 20ºC y 1000 pm, pa a con ola que no exis ía una des iación en las medidas de C 1 y C 2 . De es a o ma se puede sabe que en el equilib io exis e una concen ación de HAPs lib e disuel a (C ld ) dada po la ecuación 1. 2 21 CC CC Aguald + == (1) Mien as que el aumen o de la capacidad (AC) de cap a los HAPs de las disoluciones con los bioes imulan es en es udio iene exp esada po la siguien e ecuación (2). ld C C AC = (2) CAPÍTULO III: Ma e iales y Me odologías - 136 - C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I IV V Resul ados - “Cuando puedes medi aquello de lo que hablas, y exp esa lo con núme os, sabes algo ace ca de ello; pe o cuando no lo puedes medi , cuando no lo puedes exp esa con núme os, u conocimien o es pob e e insa is ac o io: puede se el p incipio del conocimien o, pe o apenas has a anzado en us pensamien os a la e apa de ciencia”. William Thomson Kel in (1824-1907). CAPITULO IV: Resul ados - 144 - Figu a IV. 3.- Concen aciones de HAPs ecupe adas del NAPL de los con oles y ma aces inoculados, an o con o sin bioes imulan e S-200. Sólo se mues an los HAPs con la deg adación signi ica i a (P<0.05). Las ba as mues an la elación en e el á ea del pico y la del hopano pa a cada ipo de mues a. FL, luo eno; FEN, enan eno; ANT, an aceno; FLT, luo an eno y PIR, pi eno. El análisis po GC-MS de los ex ac os neu o y ácido de la ase acuosa con y sin bioes imulan e p esen ó pe iles simila es de acumulación de me aboli os. Sin emba go, la concen ación en los ma aces con bioes imulan e ue al ededo de 10 eces mayo (los alo es ue on de al ededo de una décima de a ios mic og amos po milili o, es deci , 120 ng·mL -1 pa a 1-indanona, 140 ng·mL -1 pa a el ácido di énico, 690 ng·mL -1 pa a el ácido 2-ca boxicinámico y 3.6 mg·mL -1 pa a el ácido 4-me il álico, Figu a IV.4). Los me aboli os neu os co espondie on a alquilos oxidados o na alenos enólicos, mien as que los compues os ácidos ue on p incipalmen e ácidos dica boxílicos, gene almen e acumulados du an e la deg adación de hid oca bu os a omá icos policíclicos y sus de i ados de me ilo po cepas de Mycobac e ium. En conc e o, el ácido álico es un p oduc o in e medio común en la deg adación de na aleno, enan eno, CAPITULO IV: Resul ados - 145 - luo an eno y pi eno, mien as que los ácidos ca boxicinámico y di énico son me aboli os del na aleno y enan eno, espec i amen e (Lopez y col., 2008). La p esencia de me aboli os con los g upos me ilo indica ías simila es de biodeg adación pa a los co espondien es HAPs alquilo (Vila y col., 2001; Lopez y col., 2008; Vila y G i oll, 2009). Figu a IV. 4.- C oma og amas ípicos con GC-MS del ex ac o neu o (a iba) y del ácido (abajo) de las ases acuosas de los cul i os con Mycobac e ium gil um VM552 en la p esencia de bioes imulan es con los picos iden i icados ( e Tabla IV. 1). Los me aboli os ácidos ue on iden i icados como los co espondien es a és e es me ílicos. (•) Ácidos monoa omá icos; (*) lac onas del ácido hid oxi a omá ico; MN, me ilna aleno; HMN, hep ame ilnonano; DMN, dime ilna aleno, TMN, ime ilna aleno; MFL, me il luo eno. Pa a la iden i icación de los compues os 1- 18, e ablas IV. 1 y 2. 19 21 23 25 27 29 14 16 18 20 22 24 O O H3C CH2OH CH3 OH H3C HO H OH H H3C OH H3C H3C H3C HO H OH H H3C H3C OH H3C H3C CH3 OH H3C COOCH 3 H3COOC COOCH3 COOCH3 H3C H3C O O H3C O O H3C COOCH3 COOCH3 H3C COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 H3C H3CCOOH COOCH3 2MN 2MN 1,7DMN TMN MFL ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ** * * COOCH3 COOCH3 H3C H3C 1 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 13 15 16 17 18 19 21 23 25 27 29 14 16 18 20 22 24 O O H3C CH2OH CH3 OH H3C HO H OH H H3C OH H3C H3C H3C HO H OH H H3C H3C OH H3C H3C CH3 OH H3C COOCH 3 H3COOC COOCH3 COOCH3 H3C H3C O O H3C O O H3C COOCH3 COOCH3 H3C COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 H3C H3CCOOH COOCH3 2MN 2MN 1,7DMN TMN MFL ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ** * * COOCH3 COOCH3 H3C H3C 1 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 13 15 16 17 18 CAPITULO IV: Resul ados - 146 - Tabla IV. 1.- Tiempos de e ención (T ) y los iones agmen o del GC-MS pa a iden i ica los me aboli os de ec ados en los ex ac os neu os de los ma aces con Mycobac e ium gil um VM552 con uel, en p esencia y ausencia de S-200. Nº T Ion F agmen o, m/z (%) Iden i icación 1 15.0 132 (M + ,100), 104 (M + -CO, 86.1), 89 (M + -CH 3 -CO,4.2), 78 (30.9), 51 (17.06) 1-Indanona 1 2 17.2 146 (M + , 94.42), 131 (M + -CH 3 , 4.51),117 (M + -CH 3 -CH 2 , 100),103 (M + -CH 3 -CH 2 -CH 2 , 10.2),91 (22.09), 77 (9.11), 63 (8.86), 51 (8.18) Me il 1-ndanona 2 3 20.5 158 (M + , 56.17), 141 (M + -OH, 20.68), 129 (M + -CHO, 100), 115 (17.22), 102 (4.06), 98 (1.02) Na aleno me anol 2 4 20.6 158 (M + ,100), 141 (M + -OH, 31.08), 129 (M + -CHO, 93.24), 115 (M + -CHO-CH 2 , 79.73), 105 (79.73), 91 (50), 77 (36.48) Me il na ol 2 20.9 158 (M + , 87.83), 141 (M + -OH, 28.37), 129 (M + -CHO, 100), 115 (M + -CHO-CH 2 , 55.41), 104 (18.92), 91 (22.98), 77 (21.62) 21.1 158 (M + ,100), 141 (M + -OH, 4.05), 129 (M + -CHO, 32.43), 115 (M + -CHO-CH 2 , 18.92), 102 (4.05), 89 (2.70) 5 22.2 190 (M + , 5.35), 172 (M + -H 2 O, 100), 157 (M + -H 2 O-CH 3 , 35.23), 143 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 , 32.57), 129 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 -CH 2 , 39.24), 115 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 -CH 2 -CH 2 , 26.05), 104 (2.85) 1,2-dihid oxi 1,2- dihid o dime il na aleno 3 22.3 190 (M + , 6.56), 172 (M + -H 2 O, 100), 157 (M + -H 2 O-CH 3 , 34.95), 143 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 , 30.16), 129 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 -CH 2 , 41.4), 115 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 -CH 2 -CH 2 , 25.48), 104 (4.09) 22.3 190 (M + , 19.6), 172 (M + -H 2 O, 100), 157 (M + -H 2 O-CH 3 , 15.69), 143 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 , 52.94), 129 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 -CH 2 , 26.47), 115 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 -CH 2 -CH 2 , 24.51), 105 (6.86), 91 (10.78), 77 (10.78) 6 22.8 172, (M + ,100 ), 157 (M + -CH 3 , 20.55), 143 (M + -CH 3 -CH 2 , 9.82), 128 (M + -CH 3 -CH 2 -CH 3 , 26.84), 115 (M + -CH 3 -CH 2 -CH 3 -CH 3 , 12.74), 102 (M + -CH 3 -CH 2 -CH 3 -CH 3 -CH, 1.99), 86 (M + -CH 3 -CH 2 - CH 3 -CH 3 -CH-O, 4.46) Dime il na ol 2 22.8 172 (M + , 100), 157 (M + -CH 3 ,39.1), 141 (M + -CH 3 -O, 12.57), 128 (M + -CH 3 -O-CH, 22.52), 115 (M + -CH 3 -O-CH-CH, 12.69), 103 (1.80), 91 (5.02) 23.0 172 (M + , 100), 157 (M + -CH 3 , 18.43), 143 (M + -CH 3 -CH 2 , 8.30), 128 (M + -CH 3 -CH 2 -CH 3 , 25.37), 115 (M + -CH 3 -CH 2 -CH 3 -CH 3 , 15.02), 102 (M + -CH 3 -CH 2 -CH 3 -CH 3 -CH, 2.80), 86 (M + -CH 3 -CH 2 - CH 3 -CH 3 -CH-O, 4.69) 7 23.3 204 (M + , 7.30), 186 (M + -H2O, 51.13), 171 (M + -H 2 O-CH 3 , 100), 158 (M + -H 2 O-CH 3 -CH, 15.77), 143 (M + -H 2 O-CH 3 -CH-CH 3 , 13.30), 128 (M + -H 2 O-CH 3 -CH-CH 3 , 23.87), 115 (17.09) 1,2-dihid oxi 1,2- dihid o ime il na aleno 3 24.1 204 (M + , 4.85), 186 (M + -H 2 O, 100), 171 (M + -H 2 O-CH 3 57.28), 157 (M + -H 2 O-CH 3 -CH 2 , 7.76), 141 (53.39), 128 (20.38), 115 (33.01) CAPITULO IV: Resul ados - 147 - Tabla IV. 2.- Con inuación de la abla IV. 1. Nº T Ion F agmen o, m/z (%) Iden i icación 8 23.7 186 (M + , 100), 168 (M + -H 2 O, 66.72), 157 (70.20), 143 (55.50), 128 (50.75), 115 (54.33) T ime ilna ol 3 24.2 186 (M + , 46.31), 171 (M + -CH 3 , 100), 153 (M + -CH 3 -H2O, 3.06), 141 (8.66), 128 (M + 12.77), 115 (9.66), 102 (1.83) 9 24.7 196 (M + ,47.97), 181(M + -CH 3 , 100), 165 (M + -CH 3 -O, 31.37), 152 (M + -CH 3 -O-CH, 25.91) Me il luo enol 3 10 19.1 162 (M + , 100), 147 (M + -CH 3 , 3.9), 134 (M + -CO, 57.7), 119 (31.6), 105 (12.6), 91 (62.9) 2H-1-Benzopi a-2- ona,3,4-dihid o-6- me il 2 11 19.5 160 (M + , 100), 132 (M + -CO, 69.4), 131 (M + -CO-H, 71.0), 104 (21.3), 77 (18.0) 2H-1-Benzopi a-2- ona,6-me il 2 12 20.2 208 (M + , 13.7), 177 (M + -CH 3 , 100), 149 (M + -COOCH 3 , 5.7), 118 (2.8), 91 (11.5) DME ácido 4-me il- álico 1 13 20.9 194 (M + , 31.1), 162 (M + -OCH 3 -H, 100), 134 (M + -OCH 3 - HCO, 77.7), 105 (12.6), 91 (60.2) ME me al álico 3 14 21.7 222 (M + , 13.5), 191 (M + -OCH 3 , 100), 163 (M + -COOCH 3 , 4.9), 148 (1.5), 132 (1.9), 120 (1.2), 105 (5.8), 91 (2.7), 77 (4.9) DME ácido 4,5- dime il álico 2 15 23.1 220 (M + , 3.6), 189 (M + -O CH 3 , 10.6), 173 (14.5), 161 (M + -COOCH 3 , 100), 145 (7.6), 130 (6.7), 118 (11.0), 115 (6.17), 102 (7.8), 91 (5.7) DME ácido 2- ca boxicinámico 1 16 23.4 234 (M + , 6.8), 220 (M + - CH 3 , 4.9), 203 (M + -OCH 3 , 3.9), 189 (M + -CH 3 -OCH 3 , 10.7), 175 (M + -COOCH 3 , 100), 161 (M + -CH 2 -COOCH 3 , 32.0), 145 (30.6), 131 (14.6), 118 (8.7), 115 (16.5), 105 (6.8), 91 (16.5) DME ácido me il ca boxicinámico 3 17 25.6 270 (M + , 2.7), 239 (M + -O CH 3 , 3.8), 211 (M + -COOCH 3 , 100), 196 (M + -COO CH 3 -CH 3 , 13.4), 180 (M + -COOCH- OCH 3 , 13.3), 168 (6.5), 152 (12.4), 139 (10.1) DME ácido di énico 1 18 26.1 248 (M + , 7.7), 234 (M + -CH 3 , 10.2), 217 (M + -OCH 3 , 20.7), 189 (M + -COOCH 3 , 100), 174 (M + -CH 2 -COOCH 3 , 26.0), 161 (M +- CH-COOCH 3 , 7.0), 145 (26.6), 131 (13.1), 115 (42.5), 105 (9.4), 91 (22.5) DME ácido dime il ca boxicinámico 3 La iden i icación se basó en análisis de es ánda es au én icos 1 , en el uso de pa ones de agmen ación con pa ecidos supe io es al 90% con la lib e ía NIST 2 , o se dedujo de acue do al pa ón de agmen ación y median e da os de la li e a u a 3 . a ME es me il és e , y DME es dime il és e . CAPITULO IV: Resul ados - 148 - IV.1.3. Es udio del epa o del enan eno desde los NAPLs La ans e encia de masa del enan eno, omado como HAP modelo, desde el NAPL a la ase acuosa se midió pa a de e mina si el aumen o de mine alización causado po el bioes imulan e pod ía explica se po un aumen o del epa o en e ambas ases. Sin emba go, el epa o de enan eno, elegido como ep esen an e de los HAPs del uel en el NAPL, no se modi icó sus ancialmen e en p esencia del bioes imulan e (Figu a IV.5). 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0 10 20 30 40 50 60 Ho as C (ng/mL) Figu a IV. 5.- Repa o de enan eno desde el uel/HMN en p esencia y ausencia del bioes imulan e oleo ílico S-200. Los símbolos ep esen an las concen aciones de enan eno en la ase acuosa sin bioes imulan e (●) y con bioes imulan e (□). Las líneas con inua y discon inua ep esen an, espec i amen e, al ajus e expe imen al de la ecuación 3 (III.6.2) sin y con bioes imulan e. Las ba as de e o indican una des iación es ánda de los duplicados. Las asas de epa o y las concen aciones en el equilib io en ase acuosa se mues an en la Tabla IV. 3. Las asas pa a los p ocesos abió icos se compa a on con las asas CAPITULO IV: Resul ados - 149 - máximas de mine alización. En ausencia de bioes imulan e, la asa de mine alización del enan eno inicialmen e p esen e en el uel/HMN no ue signi ica i amen e di e en e de la que se midió pa a la asa de epa o. Es o con i ma la consis encia en e las mediciones po HPLC y 14 C en el sis ema expe imen al u ilizado. Sin emba go, cuando el bioes imulan e es aba p esen e, la asa de mine alización máxima ue supe io a la asa de epa o ob enida. Tabla IV. 3.- E ec o del bioes imulan e oleo ílico S-200 sob e el epa o y mine alización de enan eno inicialmen e p esen e en NAPL con uel. Repa o Mine alización NAPL S-200 C eq (ng·mL -1 ) Tasa ( ng·mL -1 ·h -1 ) Tasa ( ng·mL -1 ·h -1 ) Final (%) Días b Fuel/HMN - 1.62 ± 0.006a 0.18 ± 0.002Aa 0.11 ± 0.012Aa 12.64 ± 0.16a 58 + 1.86 ± 0.047a 0.13 ± 0.007Aa 1.13 ± 0.07Bb 42.5 ± 1.96b 58 - c 26.60 ± 9.41 d a 0.70 ± 0.18Aa e 0.14 ± 0.001Ba 8.12 ± 0.54a 35 + c 33.83 ± 1.69 d a 0.77 ± 0.31Aa e 1.67 ± 0.091Bb 32.57 ± 0.94b 35 Fuel/DEHP - 2.30 ± 0.34a 0.30 ± 0.12Aa 0.07 ± 0.002Ba 2.96 ± 1.02a 35 + 3.82 ± 0.38 d a 0.17 ± 0.04Aa e 0.29 ± 0.18Ba 5.54 ± 2.89a 35 a Los alo es mos ados son la media ± una des iación es ánda . Los alo es en una línea seguidos con la misma le a mayúscula no son signi ica i amen e di e en es (P = 0.05). Pa a cada NAPL, los alo es en una columna seguidos po la misma le a minúscula no son signi ica i amen e di e en es (P = 0.05). Los análisis es adís icos de los da os de epa o se ealiza on sepa adamen e median e a amien os con y sin B ij 35. b Pe íodo de iempo empleado pa a las medidas de los expe imen os de mine alización. c T a amien os con B ij 35. d Úl imo alo expe imen al po que no se alcanzó el equilib io du an e el expe imen o. e Valo es calculados median e eg esión lineal con los 10 p ime os pun os (las p ime as 24 h). CAPITULO IV: Resul ados - 150 - Ho as 0 10 20 30 40 0 200 400 600 800 1000 % 14 C Mine alizado Una si uación simila se obse ó cuando añadimos el ensioac i o B ij 35 pa a aumen a el epa o de enan eno desde el NAPL ( uel/HMN) hacia la ase acuosa (Tabla IV. 3). En es as condiciones, el bioes imulan e oleo ílico no u o, de nue o, e ec o signi ica i o sob e las asas de epa o, pe o la mine alización de enan eno se mejo ó en su p esencia, siguiendo una g á ica en o ma de “S” (Figu a IV.6) y p oduciéndose asas máximas de mine alización supe io es a las p e is as po epa o abió ico. En ausencia de bioes imulan e, la mine alización ambién ue lineal, pe o ob eniendo signi ica i amen e asas meno es que las asas de epa o (Tabla IV. 3), lo que sugie e que el epa o excedió el po encial ca abólico de los mic oo ganismos. Figu a IV. 6.- E ec o del bioes imulan e oleo ílico (S-200) sob e la mine alización del enan eno p esen e en el NAPL ( uel/HMN) po Mycobac e ium gil um VM552 en p esencia del ensioac i o B ij 35. Los símbolos ep esen an el % de 14 C- enan eno mine alizado sin bioes imulan e (○) y con bioes imulan e (■). Las ba as de e o ep esen an una des iación es ánda de los duplicados. El e ec o es imulado del S-200 sob e la mine alización de enan eno se obse ó ambién cuando el HMN ue sus i uido po DEHP como medio pa a luidiza el NAPL (Tabla IV. 3). La asa de mine alización ue, en p esencia del CAPITULO IV: Resul ados - 151 - bioes imulan e, in e io a la obse ada con la mezcla de HMN, pe o aún ue el doble de las p edicciones de la asa de epa o. También se ealiza on expe imen os de mine alización y de epa o con enan eno disuel o en NAPLs pu os (cons i uidos po un solo componen e), con el in de disc imina los posibles e ec os causados po la biodeg adabilidad de los NAPLs. Po lo an o, se de e minó la mine alización del enan eno inicialmen e disuel o en un NAPL que pod ía se u ilizado como uen e de ca bono y ene gía (hexadecano o HD) y dos NAPLs que no ue on deg adados po la cepa bac e iana u ilizada (HMN y die ilhexil ala o, DEHP). En es as condiciones, las asas de epa o y las concen aciones en equilib io medidas en ausencia de bac e ias aumen ó en el ensayo con HMN y con DEHP, pe o no con HD (Tabla IV. 4). La azón exac a de es as di e encias es desconocida, pe o puede es a elacionada con el al o alo del log K ow del HD en compa ación con los alo es de log K ow del HMN y DEHP. No obs an e, con independencia del NAPL usado, las cu as de mine alización del enan eno u ie on o ma de “S” (Figu a IV.7). En el inicio de la mine alización del enan eno p esen e en HD, se obse a on dos ases di e en es. El aumen o po el bioes imulan e oleo ílico ue e iden e sólo en la ase inicial de mine alización (has a 234 h) (Figu a IV.7.A), alcanzando la mine alización su alo máximo. La asa siguien e (has a 404 h) no ue es adís icamen e di e en e con y sin la p esencia del bioes imulan e. En es a g á ica se p esen ó un pe íodo de la encia de 150 ho as y un iempo de duplicación de 71.7 h (µ max = 0.009 h -1 ) en expe imen os de c ecimien o po sepa ado con HD, posiblemen e debido a que la p oli e ación en HD ocu ió du an e la ase de mine alización máxima de enan eno. CAPITULO IV: Resul ados - 152 - Figu a IV. 7.- E ec o del bioes imulan e oleo ílico (S-200) sob e la mine alización de enan eno p esen e en hexadecano (A), hep ame ilnonano (B) y en ala o de di-2- e ilhexil (C) po Mycobac e ium gil um VM552. Los símbolos ep esen an % 14 C mine alizados sin bioes imulan e (○) y con bioes imulan e (■). Las ba as de e o ep esen an una des iación es ánda de los duplicados. 0 10 20 30 0 200 400 600 0 10 20 30 40 50 0 100 200 300 0 10 20 30 40 50 60 0 100 200 300 Ho as Ho as Ho as % 14 C Mine alizado % 14 C Mine alizado % 14 C Mine alizado A) B) C) CAPITULO IV: Resul ados - 153 - Cuando el enan eno se suminis ó en o ma de c is ales y en las mismas condiciones de c ecimien o, M. gil um no mos ó ase de la encia y el iempo de duplicación ue de 22.7 h (µ max = 0.03 h -1 ). El c ecimien o exponencial obse ado en es os expe imen os de c ecimien o excluye cualquie limi ación nu icional en las condiciones expe imen ales u ilizadas. La mine alización se mejo ó ambién en p esencia del bioes imulan e oleo ílico en los ensayos con enan eno en HMN y DEHP, pe o las di e encias en las asas se man u ie on du an e oda la ase de mine alización máxima (Tabla IV. 4). En odos los casos, las asas de mine alización ue on supe io es a las asas de epa o. Todos es os esul ados de epa o conco da on con los esul ados ob enidos median e ensayos con polidime ilsiloxano pa a p o undiza en el compo amien o ísico-químico del enan eno en p esencia y ausencia del bioes imulan e oleo ílico. Median e es os ensayos se ob u ie on esul ados de di usión donde omedioacuos medioconS a a 200− no ue supe io a 1, indicando ningún e ec o de ans e encia de masa po di usión del enan eno en p esencia del e ilizan e oleo ílico, S-200 y su conco dancia con los da os ob enidos de la ausencia de un e ec o sob e el epa o.