193
ekaia
ZIENTZIA e a TEKNOLOGIA
ALDIZKARIA
ISSN 0214-9001 – eISSN 2444-3255
Ekaia, 2022, 42, 193-206
h ps://doi.o g/10.1387/ekaia.22644
* Ha emane an ja zeko / Co esponding au ho : José An onio Rod íguez. Gene ika, An opologia Fisikoa e a Animalien
Fisiologia Saila, Zien zia e a Teknologia Fakul a ea, Leioa (UPV/EHU), Sa iena auzoa, zg (48940 Leioa, Bizkaia, Euskal
He ia). – [email p o ec ed] – h ps://o cid.o g/0000-0002-2823-3733
Nola aipa u / How o ci e: Ga cía-San is eban, I aia; Olazabal-He e o, Anne; Rod íguez, José An onio (2022). «MARK4 en
in e akzioak USP21 deubikui inasa en kokapen azpizelula dinamikoa e egula zen du». Ekaia, 42, 2022, 193-206.
(h ps://doi.o g/10.1387/ekaia.22644).
Jaso ze-da a: 2021, ma xoak 22; Ona ze-da a: 2021, aza oak 8.
ISSN 0214-9001 - eISSN 2444-3255 / © 2022 UPV/EHU
Lan hau C ea i e Commons Ai o u-EzKome ziala-LanE a o i ikGabe 4.0 Nazioa ekoa
lizen zia ba en mende dago
MARK4 en in e akzioak USP21 deubikui inasa en
kokapen azpizelula dinamikoa e egula zen du
(MARk4 in e ac ion modula es he dynamic subcellula localiza ion
o USP21 deubiqui inase)
I aia Ga cía-San is eban1,2, Anne Olazabal-He e o1,3,4, José An onio Rod íguez1*
1 Gene ika, An opologia Fisikoa e a Animalien Fisiologia Saila (UPV/EHU)
2 Bioc uces-Bizkaia osasun Ike ke a Ins i u ua (Ba akaldo)
3 Depa men o oncology, Geo ge own Uni e si y (Washing on, DC)
4 Depa men o In e nal Medicine, Yale Uni e si y School o Medicine (New Ha en, CT)
LABURPEnA: USP21 deubikui inasa nukleoa en e a zi oplasma en a ean ansloka zen da,
e a zen osoman e e koka dai eke, baina kokapen azpizelula konplexu ho i nola modula zen
den ezezaguna da. P o eomika-analisia en bidez, MARk4 kinasa zen osomala iden i ika u da
USP21 p o eina en balizko in e ak o e gisa. Lan hone an, USP21/MARk4 in e akzioa balioz a-
zen dugu, e a USP21 p o einan MARk4 lo u a-eskualdea iden i ika u. Gu e emai zen a abe a,
MARk4ekiko in e akzioak USP21en nukleoa en e a zi oplasma en a eko kokapen dinamikoa
e egula dezake, zi oplasma ekiko a xikipena a eago uz. Bes alde, gu e da uek bi p o einen ko-
kapen zen osomala oso dinamikoa dela e akus en du e, e a USP21en dinamika zen osomala
MARk4en bidez modula dai ekeela i adoki zen du e.
HITZ GAkoAk: USP21, MARk4, kokapen zen osomala, ga aio nukleo-zi oplasmikoa, p o-
eina-p o eina elka ekin za.
Abs Ac : The deubiqui inase USP21 shu les be ween he nucleus and he cy oplasm and
can also localize o he cen osome, bu how his complex subcellula localiza ion is modula ed
emains unknown. A p o eomics analysis has iden i ied he cen osomal kinase MARK4 as a po-
en ial USP21-in e ac ing pa ne . In his wo k, we alida e he USP21/MARK4 in e ac ion,
iden i ying he MARK4-binding egion o USP21. Ou esul s indica e ha MARK4 in e ac ion
may egula e USP21 nucleocy oplasmic shu ling dynamics, inc easing i s e en ion in he cy o-
plasm. On he o he hand, ou da a show ha he cen osomal localiza ion o bo h p o eins is
highly dynamic, and sugges ha USP21 cen osomal dynamics migh be modula ed by MARK4.
KEyWORDS: USP21, MARK4, cen osomal localiza ion, nucleocy oplasmic anspo , p o ein-
p o ein in e ac ion.
194 Ekaia, 2022, 42, 193-206
I aia Ga cía-San is eban, Anne Olazabal-He e o,
José An onio Rod íguez
1. SARRERA
Ubikui ina en p o easa espezi ikoak (ingelesez Ubiqui in Speci ic P o-
eases, USPs) i u-p o eina uga i en ubikui inazio-maila modula zen du-
en en zima deubikui ina zaileak (deubikui inasak) di a. En zima ho iek
hainba un zio zelula en un sezko alde diak e egula zen di uz e, hala
nola geneen adie azpena e a ziklo zelula a en p og esioa [1]. USP21 p o-
eina amilia hone ako kidea da, e a zelula en konpa imen u desbe dine-
an koka zen di en subs a u uga i dauzka: nukleoan H2A his ona [2] e a
FoXM1 [3] ansk ipzio- ak o ea deubikui ina zen di u, e a zi oplasman
Rip1 [4] e a RIG-I [5] i uak di u. Au o e ba zuek USP21ek mik o ubuluei
e a zen osomei lo u ako un zioen e egulazioan ze egin ga an zi sua be-
e zen duela desk iba u du e [6], adibidez Gli1 ansk ipzio- ak o ea zen o-
soman bahi zea e a egonko zea [7].
USP21en un zioa en e a e egulazioa en alde di uga i o aindik eze-
zagunak di a. Ha en subs a uen kokapen he e ogeneoa kon uan ha u a,
li ekeena da USP21en banake a azpizelula a zehaz en du en mekanis-
moek ga an zi handia iza ea ha en un zioa e egula zeko. Alde ho e a-
ik, USP21en domeinu amino- e minalak espo azio nuklea eko seinale
ba (ingelesez Nuclea Expo Signal, NES) duela e aku si genuen [8].
Ga aio-seinale ho en bi a ez, CRM1 (ch omosome egion main enance
ac o 1) espo azio-ha zaileak USP21en banake a nukleozi oplasma iko
dinamikoa modula zen du. Bes alde, USP21en kokapen zen osomala
ezaguna bada e e [6], o aindik ez dago a gi USP21 molekulak zen o-
soma ekiko lo u a egonko a man en zen duen, ala p o eina en kokapen
zen osomikoak e e izae a dinamikoa duen. Aipa zekoa da duela u e ba-
zuk iden i ika u ako USP21en zen osoma a lo zeko mo iboak [6] ha en
NESa e e bil zen duela [8]. Jakina da NES du en p o eina ba zuen koka-
pen zen osomala NES seinaleak be ak e egula zen duela [9], USP21
p o eina en kokapen zen osomala e e NES menpekoa izan li ekeela i a-
dokiz.
Ga aio-seinaleen ja due az gain, p o eina ba en kokapen zelula a
konpa imen u azpizelula desbe dine ako bes e p o einekin duen in e ak-
zioen bidez e e modula dai eke. Eskala handiko p o eomika az e ke a ba-
ean, USP21 lo u dezake en 17 p o eina iden i ika u zi uz en [10], bes eak
bes e MARk1-4 p o einak. MARk (Mic o ubule A ini y Regula ing Kina-
ses) p o einak mik o ubuluen a ini a ea e egula zen du en se ina/ eonina
aldeko kinasak di a [11], e a zelula en p ozesu desbe dinen e egulazioan
pa e ha zen du e, hala nola mik o ubuluen dinamikan e a zelula en pola i-
a ean [12]. Fun zio ho ie az gain, USP21 deubiki inasa en bidezko MARk
kinasen egonko zeak Hippo seinalez apen bidea e egula zen duela desk i-
ba u da [13]. GFP-USP21ek MARk1, MARk2 e a MARk3 ekin duen in-
e akzioa be e si da [6]. Hala e e, USP21en e a MARk4 en a eko in e ak-
h ps://doi.o g/10.1387/ekaia.22644 195
MARK4 en in e akzioak USP21 deubikui inasa en
kokapen azpizelula dinamikoa e egula zen du
zioa balioz a zeke dago. Gaine a, o aindik ez da ike u MARk p o einek
USP21en kokapen-dinamikan izan dezake en e agina.
Gu e ike ke a hone an, USP21en kokapen zen osomala oso dinamikoa
e a NESa ekiko independen ea dela e akus en dugu. Gaine a, MARk4 en
e a USP21en a eko elka ekin za balioz a zen dugu, e a MARk4 lo ze-gu-
nea USP21en eskualde amino- e minalean mapa u. Ho e az gain, MARk4
elka ekin zak USP21en banake a nukleozi oplasmikoa e a kokapen zen-
osomala modula zen lagundu dezakeela e akus en dugu.
2. MATERIALAK ETA METoDoAK
2.1. Plasmidoen e aikun za
Flag-HA-e ike ekin ma ka u ako giza USP21 kode zen duen plasmi-
doa J.W. Ha pe -en labo a egi ik lo u genuen (Ha a deko Medikun za
Eskola) Addgenen bidez (#22574 plasmidoa). YFP-USP21 WT e a NESm
kode zen di uz en plasmidoen e aikun za au e ik desk iba u a dago [8].
USP21 delezio-mu an e mul zoa so zeko, USP21en 1-208, 71-565 e a
209-565 aminoazido eskualdeek kode zen di uz en DNA za iak PCR bi-
dez anpli ika u geni uen idel asun handiko P u Ul aII HS DNA polime-
asa (S a agene) e abiliz, e a pEYFP-C1 plasmidoan (Clon ech) sa u ge-
ni uen XhoI e a EcoRI e es ikzio-guneak e abiliz. MARk1, MARk2 e a
MARk3 en cDNAak (HsCD00079951, HsCD00003690, HsCD00005836,
hu enez hu en) PlasmIDen e osi geni uen, e a HA-MARk4 kode zen
duen plasmidoa D. Alessi- en labo a egi ik (MRC P o ein Phospho yla ion
Uni , Dundee-ko Unibe si a ea) esku a u genuen. P o eina ho ien YFP be -
sioak kode zen di uz en plasmidoak so zeko, MARken cDNAak PCR bi-
dez anpli ika u geni uen, e a pEYFP-C1 plasmidoan azpiklona u geni uen
XhoI / EcoRI (MARk1), SalI / kpnI (MARk2), XhoI / kpnI (MARk3)
edo HindIII / BamHI (MARk4) e es ikzio-guneak e abiliz. E aiki ako
plasmidoak Sange sekuen ziazio bidez baiez a u zi en.
2.2. zelulen kul iboa, ans ekzioa e a a amendua
HeLa e a HEk293T zelulak DMEM (Dulbecco’s modi ied Eagle’s me-
dium) medioan hazi geni uen, % 10 idi-umeki se oa (ingelesez e al bo ine
se um, FBS), 100 U/ml penizilina e a 100 μg/ml es ep omizina (In i o-
gen) gehi u a. T ans ekzioak X- emeGENE9 ans ekzio e eak iboa e-
kin (Roche Diagnos ics) egin geni uen ab ika zailea en a gibideei ja ai-
uz. Adie azi ako espe imen ue an, kul ibo medioa i 6 ng/ml lep omizina B
(LMB) (Apollo Scien i ic) gehi u genion.
196 Ekaia, 2022, 42, 193-206
I aia Ga cía-San is eban, Anne Olazabal-He e o,
José An onio Rod íguez
2.3. Immuno luo eszen zia e a luo eszen zia mik oskopia
Bei azko es alkie an hazi ako zelulen ixapena % 3,7 o maldehidoa e-
kin 30 minu uz gi o enpe a u an edo me anol ho za (–20ºC) e abiliz 5 mi-
nu uz bu u u genuen. Fo maldehidoan ixa u ako zelulak i agazko ze-so-
luzioa ekin (% 0,2 T i on X-100, Sigma) inkuba u zi en 10 minu uz gi o
enpe a u an. Immuno luo eszen zia egi eko p o okoloa au e ik desk iba u
dugu [14]. An i-γ- ubulina (Abcam, 1:200), an i-Flag (Sigma, 1:300) e a
an i-HA (San a C uz Bio echnology, 1:300) an igo pu z p ima io gisa e a-
bili geni uen, e a Alexa Fluo 594 sagua en au kako IgG (In i ogen) an i-
go pu z sekunda io gisa. Hoechs 33285 DNA kolo a zailea (Sigma) gehi u
genuen nukleoak ikus eko. Es alkiak Vec ashield-ekin (Vec o Labo a o-
ies) mun a u geni uen bei azko po e an. P es akinak Zeiss Axioskop luo-
eszen zia-mik oskopioa edo olympus Fluo iew FV500 mik oskopio kon-
okala e abiliz az e u geni uen. Emisio espek oen gainja zea saihes eko,
luo ok omo bakoi za en a gazkiak banan-banan esku a u geni uen.
2.4. Fluo escence eco e y A e Pho obleaching (F AP) espe imen ua
HeLa zelulak 35 mm-ko ibiT ea kul ibo-plake an (Ibidi) hazi geni uen.
FRAP espe imen ua ans ekzioa egin e a 24 o du a a bu u u genuen, LEICA
LCS SP2 AoBS mik oskopioa en 63 handipen-objek iboa e abiliz. ki zi-
kapen-lase a en po en zia % 10ean eza i genuen, e a in e eseko eskualdea
% 100eko lase po en zia bidez zu i u zen. ki zikapen au eko hama e a on-
do engo be ogei a hama i udi ha u geni uen, 1.635 segundoko denbo a a -
ea ekin. Espe imen u bakoi zeko sei zelula indibidual az e u geni uen, e a
espe imen uak gu xienez bi aldiz e epika u geni uen. I udiak ImageJ so -
wa ea en bidez p ozesa u geni uen, e a da uak Mic oso Excel e a G aphPad
P ism p og amak e abiliz az e u geni uen. Be esku apena en denbo a e dia
( 1/2) e a za iki mugiko a (Fm) h p://www.embl.de/eamne / ap/h ml/o e -
iew.h ml webgunean azal zen den moduan kalkula u geni uen.
2.5. Ko-immunop ezipi azioa (ko-IP) e a immunoplapake a
IP Lysis bu e (Pie ce) e abiliz, zelulak lisa u, e a GFP en au kako im-
munop ezipi azioa GFP-T ap_M e eak iboa (Ch omo ek) e abiliz bu u u
genuen, ab ika zailea en a gibideei ja ai uz. Immunop ezipi a u ako p o-
einak immunoplapake a en bidez az e u geni uen. Ho e a ako, p o eina
laginak % 10eko SDS-PAGE gele an ka ga u, elek o o esia en bidez ba-
na u e a ni ozelulosa min ze a ans e i u geni uen. Min zak TTBS an di-
solba u ako % 5eko gan zik gabeko esne an blokea u geni uen o du ba ez,
e a an i-HA (San a C uz Bio echnology, 1:400, gauean zeha 4 ºC- an) edo
an i-GFP (Ch omo ek, 1:1000, o du ba gi o- enpe a u an) an igo pu z p i-
ma ioekin inkuba u geni uen. Min zak pe oxidasa ekin konjuga u ako an i-
go pu z sekunda io ba ekin inkuba u geni uen (Ame sham edo San a-C uz,
h ps://doi.o g/10.1387/ekaia.22644 197
MARK4 en in e akzioak USP21 deubikui inasa en
kokapen azpizelula dinamikoa e egula zen du
1:3.000). Ga bi u ondo en, min zak ECL edo Fem o kimiolumineszen zia
e eak iboak e abiliz (The mo Scien i ic) e ebela u geni uen.
2.6. Analisi es a is ikoak
A ikuluko espe imen u bakoi za en e eplika kopu ua dagokion i udia-
en oinean adie azi a dago. Analisi es a is ikoak S uden -en - es a en bi-
dezko konpa ake a en bidez bu u u di a; P-balioa <0.05 denean esangu a
es a is ikoa dagoela kon side a u da.
3. EMAITzAK ETA EzTABAIDA
3.1. USP21en kokapen zen osomala oso dinamikoa e a nESa ekiko
independen ea da
USP21 deubikui inasa mik o ubulue an, zi oeskele oan e a zen osoman
koka dai ekeela oga u da au e iaz [6]. Zelula bizien az e ke a zine ikoek
age ian u zi du e zen osomako hainba p o eina (adibidez, γ- ubulina) zen-
osoman egonko man en zen di en bi a ean [15] bes e ba zuk (adibidez,
BARD1) e engabe a i di ela zen osoma a joan e a e o i [16]. USP21en
kokapen zen osomala en dinamika ike zeko, zelula bizien FRAP az e -
ke a egin genuen YFP-USP21ekin ans ek a u ako HeLa zelule an. 1A i u-
dian age zen den bezala, ki zikapena en os eko YFP-USP21 luo eszen-
zia zen osomala azka be esku a u zen. Be esku apena en denbo a e dia
( 1/2) 17,36 segundokoa izan zen, e a za iki mugiko a (Fm) % 77,41koa.
Da u hauen a abe a, YFP-USP21en kokapen zen osomala oso dinamikoa
da, e a p o eina guz ia en pa e xiki ba (~% 23) baka ik ge a zen da zen-
osoma ekin egonko lo u a. Be az, gu e aldeko au eko da uen [8], e a
ike ke a hone ako emai zen a abe a, USP21 zelula en konpa imen u des-
be dinen, hau da, nukleoa en, zi oplasma en e a zen osoma en a ean e en-
gabe ga aia zen den p o eina da.
1B i udian azal zen den moduan, zen osoma lo zeko mo iboak (in-
gelesez, cen osome binding mo i , CBM, 122-174 amino azidoak) [8]
USP21en NESa (134-152 amino azidoak) [9] bil zen du. Jakina da NES
mo iboek p o eina ba zuk, hala nola nukleo osmina, BARD1 e a RGS14,
zen osoma a bide a zen di uz ela [9, 16, 17]. Izan e e, NESe an e agin-
dako mu azio inak iba zaileek p o eina hauen kokapen zen osomala asko
mu iz en du e [9, 16, 17]. USP21en NESa inak iba zen du en bi mu azio
pun ualek (L142A / L144A) [8], o dea, ez zu en ha en kokapen zen omala
inda gabe u (1B i udia). Be az, gu e da uen a abe a, NESa du en bes e p o-
eina zen osomal ba zuek ez bezala, USP21ek ez du CRM1en menpeko
NES un zionalik beha be e kokapen e a dinamika zen osomala man en-
zeko. Ho ela, zen osoºma lo zeko mo iboa e a USP21en NESa, isikoki
gainja iak di en a en, un zionalki independen eak di ela esan dezakegu.

198 Ekaia, 2022, 42, 193-206
I aia Ga cía-San is eban, Anne Olazabal-He e o,
José An onio Rod íguez
1. i udia. USP21en kokapen zen osomala oso dinamikoa e a NESa ekiko
independen ea da. (A) YFP-USP21 dinamika zen osomala az e zeko FRAP
analisia. Goiko a gazkiek YFP-USP21 p o eina luo eszen ea e akus en du e,
ki zikapena en au e ik e a ki zikapena en os ean; lauki xikien ba neko i udiek
zen osoma i dagokion o ozu i u ako za ia handipen gehiagoz e akus en du e.
Beheko g a ikoan be esku apen-ku ba e a FRAP pa ame oak age zen di a:
be esku apena en denbo a e dia ( 1/2) e a za iki mugiko a (Fm). G a ikoa e a
pa ame oen balioak hi u espe imen u independen e an az e u ako 18 zelula a-
ik e a o i akoak di a. (B) Goiko i udiak USP21 p o eina en i udikapen eske-
ma ikoa e akus en du: espo azio nuklea eko seinalea en (NES, 134-152 aa),
zen osoma lo zeko mo iboa (CBM, 122-174 aa) e a domeinu ka ali ikoa adie-
az en di a. Beheko a gazkiek e akus en du e bai YFP-USP21 WT, e a bai
YFP-USP21 NESm e e zen osoman koka zen di ela γ- ubulina endogenoa e-
kin ba e a. Zen osoma i dagokion za ia handipen gehiagoz e akus en da lauki
xikie an. Zelulen nukleoak Hoechs ekin inda u geni uen (DNA panelak).
h ps://doi.o g/10.1387/ekaia.22644 199
MARK4 en in e akzioak USP21 deubikui inasa en
kokapen azpizelula dinamikoa e egula zen du
2. i udia. USP21en eskualde amino- e minalak MARk4 ekin lo zeko
e emua bil zen du. (A) I udiek HEk293T zelulen GFP- ap bidezko ko-
immunop ezipi azio analisia en emai zak e akus en di uz e. HA-MARk4
YFP-USP21ekin ba e a ans ek a u zen edo, kon ol nega ibo gisa, YFP-
bek o ea ekin. HA-MARk4k YFP-USP21ekin ba e a immunop ezipi a u
du, baina ez YFP kon ola ekin. Pun uzko le oek panelak gel be eko bi
i udik osa u ako konposa uak di ela adie az en du e. (B) I udiek MARk4
lo zeko gunea mapa zeko e abili di ugun USP21 delezio-mu an een i udi-
kapen eskema ikoa e akus en du e. Azpian, immunop ezipi azio-analisia en
emai zak, 1-208 e a 71-565 USP21 za iek, baina ez 209-565 za iak, HA-
MARk4 ekin in e akziona zen du ela e akus en du enak. Pun uzko le oek
adie az en du e panelak gel be eko bi i udik osa u ako konposa uak di ela.
200 Ekaia, 2022, 42, 193-206
I aia Ga cía-San is eban, Anne Olazabal-He e o,
José An onio Rod íguez
3.2. MARK4 in e akzio-gunea USP21en eskualde amino- e minalean
koka zen da
P o eomikako analisi global ba en bidez, deubikui inasen in e ak oma
(hau da, en zima hauekin in e akziona dezakeen p o eina mul zoa) desk iba u
da [10]. Analisi honek USP21ekin lo u dai ezkeen 17 p o eina iden i ika u
zi uen, e a haien a ean mik o ubuluen a ini a ea e egula zen du en kinasen
amiliako lau kideak (MARk1-4) au ki zen di a. Eskala handiko az e ke a
p o eomikoak p o eina ba en in e ak oma ezagu zen has eko balio suak di-
en a en, au kikun zak modu independen ean baiez a u beha di a. Izan e e,
deubikui inasen in e ak oman ze enda u ako «kon ian za handiko kide» po-
en zialen % 30 ingu u ezin izan zen me odo independen e ba e abiliz ba-
lioz a u [10]. Alde ho e a ik, USP21ek MARk1-3 ekin duen elka ekin za
baiez a u den a en [6], USP21 e a MARk4 en a eko elka ekin za o ain-
dik e e balioz a zeke dago. 2A i udian e akus en den bezala, ans ek a u ako
HEk293T zelule an HA-MARk4 p o eina YFP-USP21ekin ba e a immu-
nop ezipi a u zen, e a ez YFP-bek o ea ekin. Emai za ho iek p o eomikako
da uak be es en di uz e, e a MARk4 p o eina USP21en in e ak o e gisa
balioz a zen du e. USP21en MARk4 lo zeko gunea iden i ika zeko, ko-IP
espe imen uak egin geni uen YFP-USP21 delezio-mu an e so a ba ekin
(2B i udia). Gu e emai zen a abe a, MARk4 lo zeko eskualdea USP21 do-
meinu ka ali ikoa en kanpoaldean dago, e a 71-208 aminoazidoen segmen ua
bil zen du. Au eko behake ekin konbina u a, gu e au kikun zek USP21en
e emu amino- e minala be e kokapena e a bes e p o eina ba zuekin duen el-
ka e akin za e egula zen duen eskualde k i ikoa dela dio e.
3.3. MARK4k USP21en banake a nukleozi oplasmikoa modula zen du
MARk p o einak zi oplasman e a min ze an koka dai ezke [11, 18-21]
e a MARk4, USP21en an ze a, zen osoman e a mik o ubuluen zi oeske-
le oan e e koka dai ekeela jakina azi da [22]. Ho i jakinda, geu e bu ua i
galde u genion ea MARk p o einak, e a be eziki MARk4, USP21en ko-
kapena modula zeko gai zi en. MARk p o einen elka ekin zak USP21en
mugimendu nukleozi oplasmiko dinamikoa modula zeko gai asuna ebalua-
zeko asmoz, YFP-MARk1-4 p o einak Flag-HA-USP21ekin ba e a adie-
azi geni uen HEk293T zelule an. kon ol nega ibo gisa, Flag-HA-USP21
YFP-bek o ea ekin ba e a adie azi genuen. P o eina bakoi za en kokapen
nukleozi oplasma ikoa luo eszen zia mik oskopia en bidez zehaz u ge-
nuen, bai a a u gabeko zelule an, bai lep omizina B (LMB) konposa ua e-
kin a a u ako zelule an. LMBk CRM1ek e agindako espo azio nuklea a
inhibi zen du [23]. Au eko ike ke en emai zekin ba eginez [11, 18-21],
YFP-MARk p o einak zi oplasman age i zi en, e a YFP-MARk1-3 min z
plasma ikoan e e koka zi ezkeela zi udien, ba ez e e YFP-MARk2 (3A i u-
dia). LMB a amenduak ez zuen YFP-MARk1-4 me ake a nuklea a e a-
gin, CRM1ek e agindako espo azio nuklea ak p o eina ho ien kokapen
zi oplasma ikoa en bi a eka i zan pa e ha zen ez duela i adokiz.
h ps://doi.o g/10.1387/ekaia.22644 201
MARK4 en in e akzioak USP21 deubikui inasa en
kokapen azpizelula dinamikoa e egula zen du
3. i udia. MARk4k USP21en mugimendu nukleozi oplasmikoa modula zen du.
(A) A gazkiek Flag-HA-USP21 (go ia) e a YFP-bek o ea edo YFP-MARk1-4
p o einak (be deak) kode zen di uz en plasmidoekin ans ek a u ako HEk293T
zelulen adibide adie azga iak e akus en di uz e, a a u gabeko e a LMB ekin a-
a u ako zelule an. Zelulen nukleoak Hoechs ekin inda u geni uen (DNA panelak).
(B) A a aleko espe imen ua en az e ke a semikuan i a iboa. G a ikoak Flag-HA-
USP21en lokalizazio nuklea a (N) edo nukleozi oplasmikoa (NC) e akus en du,
ehuneko an (%). Ba a bakoi zak gu xienez 3 espe imen u independen e en ba ez
bes ekoa (± desbide ake a es anda a) adie az en du. Lagin bakoi zeko gu xienez
200 ans ek a u ako zelula ebalua u zi en. Iza xoek YFP-MARk4 ko-adie azpe-
nak Flag-HA-USP21en lekualda ze nuklea a naba menki mu iz u duela adie az-
en du e (p = 0,006; S uden en - es a). MARk1-3 ko-adie azpena en e agina Flag-
HA-USP21en lekualda ze nuklea ean ez zen esangu a sua izan (ns).