Análisis funcional y de reconstitución traduccional de mutaciones hereditarias del gen PTEN en pacientes con síndromes tumorales y de autismo

Tesis doctoral: Sandra Luna Blanco Enero, 2022 Director: Dr. Rafael Pulido Murillo Tutora: Dra. Ana Zubiaga Departamento de Genética, Antropología Física y Fisiología Animal Universidad del País Vasco (UPV/EHU) Análisis funcional y de reconstitución traduccional de mutaciones hereditarias del gen PTEN en pacientes con síndromes tumorales y de autismo (cc) 2022 SANDRA LUNA BLANCO (cc by-nc-sa 4.0) Agradecimientos Me gustaría que estas líneas sirvieran para expresar mi más sincero agradecimiento a la Universidad del País Vasco y al Instituto de Investigación Sanitaria Biocruces Bizkaia que con su ayuda han colaborado en la realización del presente trabajo, pero en especial a Rafael Pulido Murillo, director de este trabajo, por la orientación, el seguimiento y la supervisión continúa de la misma. También al grupo de Victor J.Cid donde parte de los resultados han sido obtenidos gracias a la colaboración de su grupo (Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid). A todas mis compañeras del Departamento de Biomarcadores de Cáncer por su amistad, colaboración, por el apoyo recibido y por hacer tan agradable mi estancia durante la realización de este proyecto. A Janire, Lorena, Olaia y Laura por acogerme en mi llegada y enseñarme el valor del compañerismo, a Leire, por esa alegria que transmites y por esos momentos vividos durante nuestra estancia en Madrid (sin ti no hubiera sido lo mismo). Por supuesto, a todos los demás compañeros de Biocruces. Gustavo y Ana, por la ayuda con todas las muestras de secuenciación que os llevaba. Patri, Edurne, Ane, Piedad, Iñigo, Marta, por todos los momentos vividos fuera y dentro del laboratorio. Echaré de menos los descansos de los viernes. Quiero hacer extensiva mi gratitud, a toda mi familia que siempre me ha estado apoyando en los momentos más dificiles, en especial a Roberto, Mary Carmen, Carla, Jesús, Jose Luis, Isabel, Josu, Joseba, Cristina y Leia, por estar siempre ahí, por transmitirme todo el cariño y amor para conseguir que luche por lo que quiero y hacer que todo el esfuerzo dedicado den sus frutos. A mis abuelos, que sé que estarán orgullosos de mi. A mi abuela Manoli, un ejemplo de admiración y superación. A mis tios y primos, Manoli, Patxo, Iñigo, Aitor, Jose Luis, Pili, Tania y Maikel. Muchos de mis logros se lo debo a vosotros. Por supuesto, a la persona que desde el minuto uno ha estado conmigo, Iñigo mi marido, gracias a ti empecé este proyecto y lo he conseguido finalizar. Gracias por creer en mi, por escucharme, por saber que es lo que necesito en cada momento y por todos los momentos/viajes que hemos vivido (que no son pocos) y los que nos quedan por hacer. Gracias también por todos tus consejos, por enseñarme, sobre todo en los momentos no tan buenos, a ver la vida desde otra perspectiva, se que nos quedan muchos proyectos juntos y que todo nos irá bien porque ¡tengo a la mejor persona que podria tener a mi lado! A todos ellos, muchas gracias. I ÍNDICE GENERAL ÍNDICE GENERAL ......................................................................................................................... I Abreviaturas .............................................................................................................................. V RESUMEN ................................................................................................................................... VIII INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 1 1. El gen supresor tumoral PTEN ............................................................................................... 1 1.1. Estructura de PTEN ........................................................................................................ 1 1.2. Isoformas traduccionales de PTEN ................................................................................ 4 1.2.1. PTEN-L ................................................................................................................... 6 1.2.2. PTEN-M .................................................................................................................. 8 1.3. Conformación de PTEN y relación con localización subcelular ..................................... 9 1.3.1. PTEN extracelular ................................................................................................ 10 1.4. Función molecular de PTEN ........................................................................................ 11 1.4.1. Función de PTEN en la membrana plasmática. Actividad fosfatasa de PTEN ..... 12 1.4.2. Función nuclear de PTEN ..................................................................................... 13 1.5. Regulación de PTEN ..................................................................................................... 15 1.5.1. Regulación transcripcional de PTEN .................................................................... 15 1.5.2. Regulación post-transcripcional .......................................................................... 15 1.5.3. Modificaciones post-traduccionales ................................................................... 16 1.6. Implicación de PTEN en enfermedades humanas. ...................................................... 19 1.6.1. Función de PTEN en enfermedades hereditarias: PHTS y ASD ........................... 19 Síndrome hamartoma tumoral de PTEN (PHTS) ................................................................. 19 Desórdenes del espectro autista asociados a PTEN (PTEN-ASD) ........................................ 21 1.6.2. Función de PTEN como regulador homeostático: relación con cáncer .............. 22 1.6.3. Función de PTEN en el Sistema Nervioso Central (SNC): relación con ASD ........ 25 1.7. Mutaciones en PTEN asociadas a enfermedades........................................................ 29 1.7.1. Mutaciones somáticas ......................................................................................... 29 1.7.2. Mutaciones germinales ....................................................................................... 33 1.7.3. Mutaciones PTC ................................................................................................... 35 2. Lectura a través (readthrough, RT) como aproximación terapéutica en enfermedades causadas por PTCs. ...................................................................................................................... 36 2.1. Mecanismo de acción .................................................................................................. 36 2.2. Eficiencia del Readthrough .......................................................................................... 39 II 2.3. Tipos de inductores de readthrough ........................................................................... 40 OBJETIVOS ................................................................................................................................... 43 MATERIALES Y METODOS ............................................................................................................ 46 1. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR ................................................................................. 48 1.1. Mutagénesis dirigida ................................................................................................... 48 1.2. Plásmidos .................................................................................................................... 49 2. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA CELULAR ....................................................................................... 49 2.1. TRANSFORMACIÓN Y CRECIMIENTO DE BACTERIAS ................................................... 49 2.1.1. Cepa de bacteria y medios de crecimiento ......................................................... 49 2.1.2. Preparación de bacterias competentes con cloruro cálcico ............................... 50 2.1.3. Transformación de bacterias ............................................................................... 50 2.1.4. Purificación del DNA plasmídico ......................................................................... 50 2.1.5. Secuenciación ...................................................................................................... 51 2.2. TRANSFORMACIÓN Y CRECIMIENTO DE LEVADURAS ................................................. 52 2.2.1. Cepa de levadura y medios de crecimiento ........................................................ 52 2.2.2. Transformación de la levadura ............................................................................ 52 2.2.3. Ensayo de crecimiento en gota mediante diluciones seriada ............................. 53 3. CULTIVOS DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS .............................................................................. 53 3.1. Líneas celulares ....................................................................................................... 53 3.2. Método de transfección .......................................................................................... 53 3.3. Lisis de cultivos celulares......................................................................................... 54 4. INMUNODETECCIÓN PROTÉICA .......................................................................................... 55 4.1. Electroforesis ............................................................................................................... 55 4.2. Transferencia e hibridación ......................................................................................... 55 4.3. Revelado ...................................................................................................................... 56 4.4. Anticuerpos ................................................................................................................. 56 5. Determinación de la actividad fosfatasa de PTEN .............................................................. 56 RESULTADOS ............................................................................................................................... 59 1. Optimización del protocolo de mutagénesis para análisis de alto rendimiento ................ 61 2. Respuesta de readthrough de los codones de terminación prematura (PTC) en el gen PTEN ............................................................................................................................................. 64 2.1. PTCome de PTEN asociado a enfermedades ............................................................... 64 2.2. Inducción de readthrough en mutaciones PTC de PTEN ............................................. 65 2.3. Análisis global del readthrough del PTCome de la línea germinal de PTEN asociado a enfermedades ......................................................................................................................... 69 III 2.4. Puntuación de eficiencia del readthrough de PTEN .................................................... 73 2.5. Reconstitución funcional de PTEN mediante el readthrough de los PTC ................... 77 3. Análisis global de mutaciones hereditarias de PTEN: implicaciones en síndromes tumorales y de autismo............................................................................................................... 80 3.1. Patrón de distribución de mutaciones missense de PTEN en pacientes con ASD y PHTS. ..................................................................................................................................... 80 3.2. Patrón funcional de mutaciones missense de PTEN encontradas en la línea germinal de pacientes con ASD y/o PHTS. ............................................................................................. 83 3.3. Análisis comparativo de las mutaciones de la línea germinal en PTEN y PTEN-L ....... 85 DISCUSIÓN ................................................................................................................................... 95 1. Protocolo de mutagénesis dirigida estandarizado .......................................................... 97 2. Respuesta al readthrough de los PTCs de PTEN .............................................................. 98 3. Análisis global de mutaciones missense de la línea germinal de PTEN asociadas a ASD y PHTS ...................................................................................................................................... 101 CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 105 BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................ 109 BIBLIOGRAFÍA SUPLEMENTARIA ............................................................................................... 127 ANEXOS ..................................................................................................................................... 137 IV V Abreviaturas Akt Proteína quinasa B ATP trifosfato de adenosina ASD Autism Spectrum Disorder-Transtornos del espectro autista BLAST Basic Local Aligment Search Tool Bp Pares de bases BRRS Síndrome de Bannayan-Riley-Ruvalcaba cDNA DNA complementario CHX Cicloheximida CLS Cytoplasmic Localization Signal CRCs sporadic colorectal cancers CS Síndrome Cowden DD Developmental delay-Retraso en el desarrollo DMEM Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium DMSO Dimetil sulfóxido DNA Ácido desoxirribonucleico dNTP Deoxynucleotide triphosphate DO Densidad óptica dsDNA double stranded DNA DTT Ditiotreitol EC endometrial carcinoma E.coli Escherichia coli EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EJC exón junction complex FBS Suero fetal bovino G418 Geneticina GAPDH Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa GF factor de crecimiento GSK3 glucógeno quinasa sintasa 3 HGMD Human Gene Mutation Database ICC International Cowden Consortium LB Medio de Luria-Bertani mRNA ARN mensajero miRNAs microRNAs MMAC1 Mutated in Multiple Advanced Cancers 1 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent mTORC1 Mammalian target of rapamycin complex 1 NLS Nuclear Localization Signal -Señal de localización nuclear NPC nuclear pore complexes NMD nonsense mediated decay NMDAR N-metil Daspartato receptor OBB Odyssey Blocking Buffer OFC Occipital-frontal circumference PBD PIP2 Binding Domain -Motivo de unión a PIP2 Introducción 1 1. El gen supresor tumoral PTEN El gen PTEN (Phosphatase and TENsin homolog deleted on chromosome 10) fue descubierto en 1996, cuando dos grupos independientes lo hallaron en una región del cromosoma 10q23, comúnmente deleccionada en cánceres humanos [1, 2]. Inicialmente, PTEN, se identificó como una proteína fosfatasa de tirosina (Protein Tyrosine Phosphatase; PTP) debido a su homología con la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de la familia de las PTPs, aunque también fue denominado MMAC1 (Mutated in Multiple Advanced Cancers) o TEP-1 (Transforming growth factor (TGF) regulated and Epithelial cellenriched Phosphatase 1) [3-5]. PTEN es considerado uno de los genes supresores tumorales más importantes, junto a p53, ya que se encuentra mutado con relativa alta frecuencia en tumores humanos [6, 7]. Además, PTEN se encuentra mutado en la línea germinal de pacientes con síndromes de cáncer hereditario caracterizados por trastornos en el desarrollo, deficiencias neurológicas, desarrollo de hamartomas y una mayor predisposición a desarrollar ciertos cánceres [8, 9]. 1.1. Estructura de PTEN El gen PTEN está localizado en la región q23 del cromosoma 10, y consta de 9 exones. La isoforma más abundante de la proteína PTEN muestra un peso molecular aparente de 47.2 kDa, y posee 403 aminoácidos distribuidos en 5 regiones con relevancia funcional: la región N-terminal de unión a fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato = PIP2 (PIP2 Binding Domain; PBD), seguido de un dominio fosfatasa de tirosinas (PTP), un dominio C2 de unión a membranas, una cola C-terminal (C-tail) y un motivo de interacción con dominios PDZ (PDZ-Binding Domain; PDZ-BD) [10] (Figura 1). Introducción 2 Figura 1. Dominios funcionales de la proteína PTEN. Regiones indicadas por colores. Nterminal de PTEN (aminoácidos 1-7, rectángulo amarillo). Motivos de localización N-terminal (NLMs). Dominio fosfatasa (PTP) (aminoácidos 8-185, rectángulo azul); dominio C2 (aminoácidos 185-353, rectángulo naranja); cola C-terminal (aminoácidos 353-403, rectángulo morado) que incluye un motivo de unión a dominios PDZ (PDZ-BD) (aminoácidos 401-403). En la parte de arriba se muestran las regiones codificadas por los diferentes exones de PTEN. La región amino terminal (N-terminal) (aminoácidos 1-7) contiene varios motivos de localización subcelular (NLMs): un motivo de unión a PIP2 (PIP2 Binding Domain; PBD, aminoácidos 6-14) encargado de activar la enzima posicionando a PTEN en las membranas [11], una región de localización citoplasmática (Cytoplasmic Localization Signal; CLS, aminoácidos 19-25) [12, 13] y una región de localización nuclear (Nuclear Localization Signal; NLS, aminoácidos 8-32) [14, 15]. El dominio fosfatasa (dominio PTP) de PTEN (aminoácidos 8-185) contiene el centro activo de la enzima, con el motivo catalítico PTP 123HCKAGKGR130, que incluye la C124 y la R130 catalíticas. El dominio fosfatasa posee actividad frente a sustratos lipídicos y proteínicos [16], y pertenece al grupo de PTPs de doble especificidad (DUSPs) [3, 16, 17] (Figura 2). Introducción 3 Figura 2. Comparación de la estructura tridimensional de PTEN con otras proteínas relacionadas. El dominio fosfatasa de PTEN (azul oscuro) está relacionado con el dominio fosfatasa de PTPs clásicas (representadas por PTP1B) y PTPs de especificidad dual (DUSPs, representadas por VHR). La estructura del dominio C2 (naranja) es similar a los que presentan las fosfolipasas A2 y C1 (PLA2 y PLC1). El dominio C2 de PTEN (aminoácidos 186-353) se une a vesículas fosfolipídicas y esta unión es importante para que PTEN realice su función, ya que asocia a PTEN con las membranas celulares y le ayuda a posicionar el dominio catalítico hacía su sustrato fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato, PIP3 [10]. La estructura tridimensional del dominio C2, es similar a la de los dominios C2 de la proteína quinasa C (PKC), la fosfolipasa A2 (PLA2) o la fosfolipasa C1 (PLC1; también conocida como PLCG1) (Figura 2). La región carboxi terminal (C-terminal) de PTEN (aminoácidos 353-403) contiene una secuencia PEST y un motivo de interacción PDZ (Post-synaptic density-95, Discs-large, Zonula occludens-1) [10]. La secuencia PEST se denomina así por ser una secuencia rica en Prolina (P), ácido glutámico (E), Serina (S) y Treonina (T). Las proteínas que poseen esta secuencia exhiben una vida intracelular corta, por lo que se ha propuesto que esta secuencia actúa como un péptido señal para la degradación de la proteína [18]. El motivo PDZ consta de 80-90 aminoácidos en donde se encuentra el motivo de unión a los dominios PDZ (PDZ-BD) (T401-K402-V403; TKV), muy conservado en vertebrados. El motivo de unión a los dominios PDZ de PTEN se asocia con proteínas reguladoras con dominios PDZ [19]. PDZ-BD es importante para la interacción entre proteínas y la regulación de la actividad de PTEN [20]. Además, muchas de las proteínas que interaccionan con PTEN a Introducción 4 través de los dominios PDZ son proteínas de andamiaje con múltiples dominios PDZ que estabilizan PTEN y lo dirigen a compartimentos asociados con las membranas. Esta región es diana de modificaciones post-traduccionales, como la fosforilación, la acetilación y la escisión por caspasa-3 [21, 22]. A diferencia del dominio catalítico y C2, la cola C-terminal y el extremo N-terminal no se han podido resolver mediante cristalización [10]. 1.2. Isoformas traduccionales de PTEN El RNA mensajero (mRNA) de PTEN codifica diferentes proteínas debido a la presencia de inicios de traducción alternativos no canónicos. Comúnmente, los ribosomas inician la traducción a partir del codón de iniciación AUG más cercano al extremo 5´del mRNA. Sin embargo, recientes estudios han identificado codones de iniciación alternativos al codón AUG de PTEN, que generan diferentes proteínas [23]. Se han identificado 4 nuevas isoformas que varían en el número de aminoácidos de la región N-terminal (Figura 3, Tabla 1). La primera isoforma que se descubrió fue PTEN-Long (PTEN-L), también llamada PTENα. A las posteriores isoformas de PTEN se propuso denominarlas siguiendo el orden alfabético a partir de la isoforma PTEN-L: PTEN-M, PTEN-N y PTEN-O [24-26]. PTEN-M (también llamada PTEN-β) es la isoforma predominante, sin embargo, la isoforma más estudiada ha sido PTEN-L [27]. PTEN-L, PTEN-M, PTEN-N y PTEN-O poseen 173, 146, 131 y 72 aminoácidos adicionales al PTEN canónico, respectivamente (Figura 3, Tabla 1). Las isoformas PTEN-L, PTEN-N y PTEN-O inician la traducción a partir del codón CUG, mientras que la isoforma PTEN-M lo hace a través del codón AUU [25]. Introducción 5 Tabla 1. Isoformas de PTEN. Se indica los aminoácidos que posee la extensión N-terminal de cada isoforma de PTEN (PTEN-L/α, PTEN-M/β, PTEN-N y PTEN-O), así como los aminoácidos totales de cada isoforma y su peso molecular previsto. Figura 3. Isoformas traduccionales de PTEN. Se indican las diferentes isoformas de PTEN (con el número de aminoácidos). PTEN consta de 403 aminoácidos. PTEN-L/α, PTEN-M/β, PTEN-N y PTEN-O poseen 173, 146, 131 y 72 aminoácidos adicionales al PTEN canónico, respectivamente (rectángulo verde). El dominio PTP (rectángulo azul), C2 (rectángulo naranja) y la cola Cterminal (rectángulo morado) de las isoformas no varía respecto a la de PTEN. La Met1 de PTEN se corresponde con la Met174 (M174-L) de PTEN-L (marcada en rojo). En la parte de arriba se muestran las regiones codificadas por los diferentes exones de PTEN. Todas las isoformas de PTEN se expresan y son activas [25], es decir, tienen actividad fosfatasa, ya que reducen los niveles de Akt fosforilado a niveles similares a los de PTEN y PTEN-L. Introducción 6 1.2.1. PTEN-L La traducción de PTEN-L se inicia a partir de una Leucina (Leu), obteniendo una proteína con una extensión de 173 aminoácidos adicionales a la proteína canónica (Figura 4). Con el fin de evitar confusión a la hora de identificar y nombrar los residuos de PTEN y PTEN-L, se ha establecido una nomenclatura común. Los aminoácidos de PTEN-L serán calculados añadiendo 173 aminoácidos adicionales al residuo de PTEN, y se nombrarán seguidos de una L en mayúsculas (–L), de tal manera que la cisteína 124 (Cys124, C124) de PTEN es equivalente a la cisteína 297-L (Cys297-L, C297-L) de PTEN-L [26]. PTEN-L es 5 veces más efectiva en unirse al substrato PIP3 que PTEN wt y no requiere de PIP2 para mantenerse en la conformación activa. Se ha propuesto que esta extensión de la región N-terminal de PTEN-L le proporciona una mayor estabilidad conformacional a PTEN [28]. Figura 4. Dominios funcionales de PTEN-L. PTEN-L posee los mismos dominios estructurales que PTEN además de una extensión de 173 aminoácidos en la región N-terminal (rectángulo verde). En la región N-terminal de PTEN-L hay una señal de secreción/localización mitocondrial (aminoácidos 1-L-22-L, rectángulo negro), una secuencia de poli argininas (aminoácidos 47-L-52-L, rectángulo amarillo) y una secuencia de localización nucleolar (NLS). Dominio fosfatasa (PTP) (aminoácidos 174-L358-L, rectángulo azul); dominio C2 (aminoácidos 358-L-526-L, rectángulo naranja); cola Cterminal (aminoácidos 526-L-576-L, rectángulo morado). En la parte de arriba se muestran las regiones codificadas por los diferentes exones de PTEN. La extensión N-terminal de las isoformas de PTEN juegan un papel importante en la regulación funcional y localización subcelular. Se ha propuesto un posible modelo de unión a la membrana de PTEN-L gracias a una hélice de unión a membrana (Membrane-Binding Helix, MBH) (aminoácidos 151-L-174-L) en la extensión N-terminal de PTEN-L, la cual podría operar como una hélice transmembranal o interactuar con la Introducción 7 superficie de la membrana celular [29]. En un estudio llevado a cabo en un modelo de levadura humanizada, previamente usado para analizar variantes patogénicas de PTEN [30, 31], se observó que dicha hélice es esencial para la acumulación de PTEN-L en la membrana plasmática y que prevenía la importación de PTEN-L al núcleo [32]. Por otro lado, originalmente se describió que la extensión N-terminal de PTEN-L contiene una señal secretora compuesta por una región de seis alaninas (A12-A17-L) que le permite salir de las células, un sitio de escisión (S22-L) que facilita la secreción de PTEN-L fuera de la célula, y un motivo de argininas (R47-R52-L) que actúa como una secuencia de internalización en células receptoras (Figura 4) [23, 33]. Sin embargo, el análisis en el modelo de levadura humanizada demostró que este motivo de argininas es importante para la localización nuclear [32], en concordancia con otro estudio independiente en el cual se mostró que dicho motivo de alaninas era responsable de la localización nucleolar de PTEN-M [34]. Además, mediante análisis bioinformáticos, se ha propuesto la existencia de secuencias de localización nucleolar (NoLS) y nuclear (NLS) en esta región N-terminal de PTEN-L y PTEN-M [27]. De hecho, se ha observado que PTEN-L se transloca al núcleo tras un estrés isquémico [35]. PTEN-L se ha localizado en la mitocondria [36], y el estudio en la levadura humanizada reveló la existencia de una señal de localización mitocondrial en los primeros 22 aminoácidos de PTEN-L [32]. Se ha demostrado que PTEN-L desempeña funciones importantes en el mantenimiento de la estructura mitocondrial y el metabolismo energético, regula negativamente la mitofagia mediante la desfosforilación de la S65 de la ubiquitina, y participa en el mantenimiento de la energía mitocondrial [36-38]. PTEN-L antagoniza la vía de señalización PI3K tanto en células productoras como en células aceptoras e induce la muerte celular en células cancerígenas, manteniendo así la función supresora tumoral. Se ha demostrado que PTEN-L induce apoptosis en células de cáncer colorrectal y, junto con GAS1 (proteína implicada en el arresto del ciclo celular), inhibe el crecimiento en gliomas [23, 39, 40]. Se ha propuesto que versiones secretadas de PTEN-L mutado podrían ejercer un efecto dominante negativo sobre PTEN silvestre en células aceptoras, en cuyo caso PTEN-L favorecería la creación de un ambiente tumorogénico [41, 42]. Además, se ha observado que PTEN-L y PTEN- Introducción 8 M promueven la tumorogénesis de células cancerígenas a través de la interacción con la proteína 5 con repeticiones WD (WDR5) y la trimetilación de la lisina 4 de la histona H3. Estos hallazgos sugieren la existencia de funciones pro-oncogénicas, independientes de actividad fosfatasa, para PTEN-L y PTEN-M [43]. Estudios recientes atribuyen a PTEN-L funciones no relacionadas directamente con la supresión tumoral. Se ha revelado que PTEN-L modula la potenciación a largo plazo (LTP) del hipocampo y los procesos de memoria y aprendizaje a través de la regulación de la señalización de la proteína quinasa dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKII) y la subunidad 2B del receptor NMDA (NR2B) [44], y que PTEN-L se encuentra involucrada en la regulación tanto de la función olfativa como en la endocitosis de células del bulbo olfatorio (OB) [45]. Por otro lado, Li y sus colaboradores proponen a PTEN-L como un regulador positivo del reclutamiento de neutrófilos a lugares de infección, mediante la desfosforilación de la T558 de Moesin (una proteína que forma parte de la familia ERM, Ezrin-Radixin-Moesin, cuya función es el anclaje de microfilamentos) [46]. PTEN-L también mejora la respuesta del interferón de tipo I (IFN) y de citoquinas proinflamatorias, y promueve la inmunidad innata antiviral durante la infección viral de manera dependiente de su actividad fosfatasa [47]. 1.2.2. PTEN-M La isoforma PTEN-M (Figura 3), posee una extensión de 146 aminoácidos en la región N-terminal en comparación con PTEN canónico, y carece de la secuencia de secreción N-terminal de PTEN. PTEN-M se encuentra principalmente en el nucleolo desfosforilando la nucleolina y regulando negativamente la transcripción del DNA ribosomal y la proliferación celular [34]. Introducción 9 1.3. Conformación de PTEN y relación con localización subcelular La isoforma canónica de PTEN ejerce funciones esenciales tanto en asociación con membranas (principalmente la membrana plasmática) como en el núcleo. Diferentes regiones de PTEN (la región NLM, los motivos de exclusión nuclear, y la cola C-terminal, principalmente) median cambios conformacionales en la proteína y participan en la regulación de su función y distribución subcelular [15, 48]. Cuando el motivo de unión a PIP2 y la NLS de la región N-terminal se encuentran enmascarados por los motivos de exclusión nuclear de la cola C-terminal, PTEN está en una conformación cerrada. Alteraciones en los motivos de exclusión nuclear o en la cola Cterminal de PTEN, como cambios en su estado de fosforilación, unión a proteínas reguladoras, o una proteólisis parcial, exponen el dominio NLS, promoviendo la conformación abierta de PTEN (Figura 5). La conformación cerrada de PTEN mayoritariamente se encuentra en el citoplasma de forma estable, aunque puede entrar en el núcleo por difusión o por mecanismos independientes de importinas. La conformación abierta podría estar favorecida por la asociación de PTEN a la membrana a través de interacciones con proteínas con dominios PDZ, o mediante interacciones electrostáticas entre la carga positiva de los motivos de unión a membrana y la carga negativa de la membrana plasmática. La interacción de PTEN con la membrana plasmática es esencial para la desfosforilación de PIP3, controlando la proliferación y el crecimiento celular [49-51]. Las mutaciones en la región N-terminal de PTEN asociadas a tumores reducen frecuentemente su actividad catalítica y la capacidad de unirse a la membrana plasmática, favoreciendo la acumulación en el núcleo [12, 52]. La conformación abierta de PTEN también puede ser transportada al núcleo por RAN GTPasas (RAS-related nuclear protein) dependientes de NLS y de mecanismos relacionados con importinas u otras proteínas transportadoras, y con la ubiquitinación o sumoilación de residuos de Lys específicos [14, 53, 54]. Introducción 16 1.5.3. Modificaciones post-traduccionales PTEN está altamente regulado por modificaciones post-traduccionales (Tabla 2) [20, 92]. Tabla 2. Principales modificaciones post-traduccionales que regulan la actividad de PTEN. En la tabla se muestra las regiones de PTEN implicadas, así como los efectos que provocan dichas modificaciones post-traduccionales en la función de PTEN. Regulación por fosforilación La fosforilación es una de las modificaciones post-traduccionales más importantes para regular la actividad de PTEN, y afecta a residuos Ser, Thr y Tyr [93]. Existen varios sitios de fosforilación, predominantemente localizados en el dominio C2 y en la región C-terminal de PTEN, que pueden afectar a la estabilidad, a la actividad fosfatasa y a la localización celular de la proteína [21, 94-96]. La estabilización es el resultado de la asociación de residuos fosforilados de la región C-terminal con el dominio C2, promoviendo la disociación del dominio C2 de la membrana y formando la conformación cerrada, forma más estable de PTEN. Sin embargo, a pesar de ser la forma más estable, es la conformación menos activa. La fosforilación de la Thr366 juega un papel importante en la desestabilización de PTEN [97]. La autofosforilación de Modificaciones posttraduccionales Regiones de PTEN implicadas Efectos en la función de PTEN Promueve la conformación cerrada y estable Reduce la dimerización de PTEN Oxidación Dominio fosfatasa (C124) Inhibe la actividad fosfatasa Inhibe la actividad fosfatasa Disminuye la estabilidad de la proteína Dominio fosfatasa (K125, K128) Inhibe la actividad fosfatasa Dominio fosfatasa (K163) Aumenta la asociación con la membrana plasmática Dominio C-terminal (K402) Aumenta las interacciones con proteínas que contengan dominios PDZ Dominio C2 (K266) Aumenta la asociación con la membrana plasmática Dominio C2 (K254) Induce la importación nuclear SUMOilación Modificaciones post-traduccionales que regulan la actividad de PTEN Poliubiquitinación dando lugar a la degradación de la proteína Monoubiquitinación para facilitar la importación al núcleo Dominio N-terminal y C2 (K13, K66, K289, K327, K330, K342 y K344) Ubiquitinación Excluye a PTEN del núcleo y está involucrada en la reparación del DNA Fosforilación Fosforilación C-terminal (T366, S370, S380, T382, T383 y S385) S-nitrosilación Dominio N-terminal (C83 y C106) Acetilación Introducción 17 la cola C-terminal libera la asociación con el dominio C2, favoreciendo la actividad funcional de PTEN [98]. La localización nuclear se ve afectada por alteraciones en la fosforilación de la cola C-terminal [14]. Regulación por ubiquitinación PTEN puede ser regulado por monoubiquitinaciones y por poliubiquitinaciones. La monoubiquitinación de las Lys13 y Lys289, llevada a cabo por la enzima E3 ligasa (NEDD4-1), facilitan la translocación de PTEN al núcleo [99]. Por otra parte, la sobreexpresión de NEDD4-1 poliubiquitina PTEN y favorece su degradación por el proteosoma [99, 100]. La poliubiquitinación de PTEN en Lys66 también regula su expresión y la estabilidad promoviendo su degradación a través del proteosoma [101]. Recientemente, se ha visto que la poliubiquitinación de PTEN en la Lys342 y Lys344 por la WWP1 (WW Domain-containing ubiquitin E3 protein ligase 1) suprime el reclutamiento de PTEN a la membrana plasmática y su dimerización, inhibiendo así la supresión tumoral [102]. WWP2 (WW Domain-containing ubiquitin E3 protein ligase 2), CHIP (Carboxyl terminus of Hsc70 interacting protein) y XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis) son ubiquitin ligasas que también contribuyen a la ubiquitinación y degradación de PTEN [103-105]. Regulación por oxidación Las especies reactivas de oxigeno (reactive oxygen species, ROS) regulan la actividad fosfatasa de PTEN al oxidar residuos de Cys (Cys124 y Cys71), lo que causa la inactivación reversible de la enzima, uno de los principales mecanismos que controlan la actividad fisiológica de PTEN [106-108]. Se han descrito varias proteínas reguladoras del estado redox intracelular, como la peroxirredoxina 1 (PRDX1), TXNIP (thioredoxininteracting protein), hidroperóxido de cumeno (CuHP) o la enzima glutatión peroxidasa (GPX) [109-112], capaces de contrarrestar la oxidación de PTEN. Regulación por S-nitrosilación El óxido nítrico (NO) desencadena la S-nitrosilación de PTEN en residuos de Cys. La S-nitrosilación del residuo Cys83 de PTEN da lugar a la supresión de la actividad fosfatasa de PTEN y promueve la señalización a través de Akt. Dependiendo de la concentración de NO se regula la señalización de Akt; a concentraciones bajas de NO se activa Akt y viceversa [113]. Por otro lado, la oxidación de PTEN a través de ROS da lugar a la formación de un puente disulfuro, mientras que la oxidación de PTEN por NO Introducción 18 parece formar un puente disulfuro mixto con cisteínas o con glutatión (GSH) [114]. Además, la regulación mediada por NO podría explicar la perdida de actividad de PTEN observada en enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad del Alzheimer (AD) [115]. DJ-1 es una proteína protectora frente a la neurodegeneración en la enfermedad de Parkinson. Dicha proteína parece regular la señalización de PI3K a través de la nitrosilación de la Cys106 de PTEN, inhibiendo la actividad fosfatasa [116]. Regulación por acetilación La acetilación de PTEN se produce en respuesta a la estimulación de factores de crecimiento por la interacción entre la histona acetiltransferasa, PCAF, con lisinas (Lys125 y Lys128) de PTEN, inhibiendo su actividad [117]. Por otra parte, la inhibición de histonas deacetilasas (HDACs) producen la translocación de PTEN a la membrana a través de la acetilación de la Lys163, inhibiendo la proliferación, la migración y la invasión celular [118]. La Lys402 del motivo PDZ de PTEN también se acetila por CBP (p300-CREB-binding protein) aumentando su capacidad de interaccionar con otras proteínas con dominios PDZ como el dominio PDZ 2 de MAGI2 y DLG1 (PDZ2/MAGI2 y PDZ2/DLG1) [119, 120]. Regulación por SUMOilación. La proteína de pequeño peso molecular (11kDa) SUMO (Small Ubiquitin-related Modifier) regulan la actividad de PTEN. La proteína SUMO1 modifica covalentemente a PTEN en sus lisinas Lys254 y Lys266. La SUMOilación de PTEN en la Lys254 mejora la retención de PTEN en el núcleo y contribuye a reparar el DNA [121], mientras que la sumoilación en la Lys266 de PTEN promueve la unión de PTEN a la membrana plasmática, suprime la vía de señalización PI3K/Akt e inhibe la proliferación y el crecimiento del tumor [122]. La SUMOilación de PTEN, además, se ve incrementada por PIASxα, uno de los miembros de la familia de proteínas PIAS (protein inhibitor of activated STAT) con actividad ligasa SUMO E3, que regula positivamente el nivel de proteína PTEN, mejorando la estabilidad de la misma al reducir la ubiquitinación. Además, PIASxα inhibe la vía PI3K/Akt y detiene el ciclo celular [123]. Por otro lado, se ha observado que la infección por el virus de la estomatitis vesicular (VSV) induce la SUMOilación de PTEN, pudiéndose considerar como un mecanismo para aumentar la respuesta antiviral celular [124]. Introducción 19 1.6. Implicación de PTEN en enfermedades humanas. 1.6.1. Función de PTEN en enfermedades hereditarias: PHTS y ASD El gen PTEN se encuentra mutado en la línea germinal de pacientes con síndromes de cáncer hereditario, caracterizados por trastornos en el desarrollo, deficiencias neurológicas, desarrollo de hamartomas múltiples, y por mayor predisposición a desarrollar cáncer de mama, tiroides y endometrio, entre otros. Desde el punto de vista del diagnóstico genético, estos síndromes se agrupan con la denominación de síndrome hamartoma tumoral de PTEN (PTEN hamartoma tumor síndrome, PHTS, OMIM *601728) [9, 125-129]. También se encuentran mutaciones en la línea germinal de PTEN en individuos con macrocefalia, retardo en el desarrollo y desordenes del espectro autista (PTEN Autism Spectrum Disorder, PTEN-ASD, OMIM #605309) [130-133]. Síndrome hamartoma tumoral de PTEN (PHTS) Las manifestaciones clínicas de PHTS son heterogéneas, e incluyen, principalmente, el síndrome de Cowden (CS), síndrome Bannayan-Riley-Ruvalcaba (BRRS), la enfermedad de Lhermitte-Duclos (LD) y síndromes similares a Proteus (todos agrupados en OMIM #158350). La mayoría de estos síndromes siguen un patrón de herencia autosómica dominante. • Síndrome de Cowden (CS) El síndrome Cowden (CS) [134] es una enfermedad rara caracterizada por la presencia de múltiples hamartomas en diversos tejidos, comúnmente en la piel y en el tracto gastrointestinal (GI), y con una mayor predisposición al cáncer [135]. Los pólipos gastrointestinales en CS ocurren en el 60-90% de los pacientes, aunque estos, normalmente son asintomáticos. A pesar de que los hamartomas en la piel y en el GI son muy comunes en pacientes con CS, no hay evidencias de que estos pacientes posean un mayor riesgo de desarrollar tumores malignos en la piel o GI [126]. Por otro lado, los lipomas, fibromas, anomalías vasculares y la macrocefalia también son características de pacientes con CS [136]. El 85% de los casos de pacientes con CS están causados por mutaciones germinales en el gen PTEN, y aproximadamente un 4060% de los casos se estima que es de origen familiar [137]. Introducción 20 • Síndrome de Bannayan-Riley-Ruvalcaba (BRRS) El síndrome Bannayan-Riley-Ruvalcaba (BRRS) es un desorden congénito caracterizado por macrocefalia en combinación con pólipos intestinales hamartomatosos, malformaciones vasculares, lipomas, hemangiomas y lentiginosis genital [138]. A pesar de que no existen unas reglas específicas para identificar BRRS, se pueden emplear varios criterios basados en la presencia o ausencia de macrocefalia, en características dermatológicas, malformaciones vasculares y/o poliposis gastrointestinal para diagnosticar este síndrome [139]. El síndrome BRRS se estima que posee una mayor predominancia en las mujeres y con una penetrancia más temprana, en relación a la edad, en comparación a pacientes con CS. • Enfermedad Lhermitte-Duclos (LD) La enfermedad Lhermitte-Duclos (LD) es un trastorno raro caracterizado por el crecimiento anómalo del cerebelo y está considerada una variante fenotípica del CS [140, 141]. Un estudio realizado por Zhou y sus colaboradores sugiere que LD asociado con mutaciones en PTEN en la línea germinal se manifiesta principalmente en adultos, ya que no encontraron mutaciones en PTEN en pacientes pediátricos con LD [142]. • Síndrome similares a Proteus (PS-like) El síndrome Proteus (PS) un trastorno complejo de sobrecrecimiento hamartomatoso muy poco frecuente (solo existen 120 casos), que se caracteriza por un sobrecrecimiento progresivo a nivel de esqueleto, piel, grasa y sistema nervioso central [143, 144]. El síndrome similar a Proteus (PS-like) describe a aquellos pacientes que no cumplen los criterios diagnósticos para el síndrome de Proteus, pero que comparten una multitud de rasgos clínicos característicos de la enfermedad. Se han identificado mutaciones en el gen PTEN en un 50% de casos del síndrome similar a Proteus [145]. Introducción 21 Desórdenes del espectro autista asociados a PTEN (PTEN-ASD) Individuos con mutaciones en PTEN en la línea germinal manifiestan fenotipos relacionados con desórdenes neurológicos, tales como desordenes del espectro autista (ASDs), retraso en el desarrollo (DD)/ retraso mental y macrocefalias [130, 131]. Los desórdenes del espectro autista son desórdenes complejos que se caracterizan por interacciones sociales anormales, déficits en la comunicación, comportamientos repetitivos y, problemas cognitivos con limitaciones a la hora de imaginar y entender las emociones y las intenciones de los demás [146]. Estudios familiares y de gemelos sugieren que los factores genéticos desempeñan un papel importante en la etiología del ASD. El riesgo de aparición de autismo en hermanos de niños con ASD es del 38% frente al 13.5% en aquellas familias que no tiene a un hijo afectado. Además, este riesgo se incrementa dependiendo del genero del hijo afectado. Siendo la tasa de concordancia genética para gemelos dicigóticos femeninos de un 5.3% frente a un 50% en gemelos dicigóticos varones [147]. La macrocefalia observada en pacientes de ASD con mutaciones en la línea germinal de PTEN es más severa que en pacientes con ASD pero sin mutaciones en el gen PTEN, por lo que el perímetro de la cabeza es un fenotipo muy importante a tener en cuenta en pacientes con ASD [148]. La contribución genética al autismo es muy heterogénea. Se han propuesto varias redes biológicas como posibles mecanismos en ASD. A nivel molecular, se incluyen genes involucrados en la transcripción y traducción sináptica (FMR1, TSC1/2, PTEN, NF1 y CYF1P1); moléculas de adhesión a células neuronales (Familia de neurexinas y neuroliginas); proteínas de andamiaje en la sinapsis (Familia de genes SHANK); vía de ubiquitinación (PARK2 y TRIM33); genes relacionadas con el calcio o proteínas del canal iónico (CACNA1A, CACNA1H, KCNMA1, SCN1A y SCN2A); neurotransmisores (GRIN2, SLC6A3); y genes remodeladores de la cromatina (MECP2, CHD8 y BAF155); genes reguladores del crecimiento y la morfogénesis (HOX, PTEN y EIF4E), entre otros [149, 150]. Introducción 22 1.6.2. Función de PTEN como regulador homeostático: relación con cáncer PTEN es un supresor tumoral haploinsuficiente, es decir, un individuo con una sola copia del gen no es capaz de producir proteína suficiente para asegurar la función normal del gen, de tal manera que una reducción del 50% de los niveles de PTEN están asociados con una mayor aceleración de la progresión del cáncer [151]. El gen PTEN se encuentra mutado con relativa alta frecuencia en casi todos los cánceres humanos primarios: cáncer de endometrio (59%), glioblastoma (22%), melanoma (10%), colorrectal (5%) y mama (5%) (http://cbioportal.org/). Los tumores de endometrio y glioma son los tumores que presentan mayor porcentaje de mutaciones en PTEN, mientras que los tumores de próstata presentan una alta frecuencia de deleción (Figura 9). Además, los niveles del mRNA de PTEN también se encuentran alterados en los distintos tipos de cáncer, siendo los canceres de próstata, ovario y mama los que muestran una mayor disminución en el mRNA de PTEN [152]. Figura 9. Frecuencia de mutaciones de PTEN en diferentes tipos de canceres. Datos obtenidos de TCGA (The Cancer Genome Atlas) vía cBioPortal (http://cbioportal.org/). (Abril 2020). El carcinoma de endometrio (endometrial carcinoma, EC) es el cáncer genital femenino más frecuente. Existen dos tipos de cáncer de endometrio según las manifestaciones clínico-patológicas; tumores de tipo I o endometrioides (EEC) y de tipo II o no endometrioides (NEEC). A nivel molecular, las alteraciones asociadas a cada tipo de tumor son diferentes. En el caso del EEC, las mutaciones más frecuentes son Introducción 23 mutaciones en el gen PTEN y en PI3K [153-155]. La inactivación de PTEN es el defecto genético más común en el EEC, con más del 80% debido a mutaciones somáticas [156]. Individuos con mutaciones en la línea germinal de PTEN tienen un 28% de probabilidad de desarrollar cáncer de endometrio, comparado con el 2.6% de la población general (Tabla 3) [157, 158]. El glioblastoma (GBM) es uno de los tumores cerebrales más frecuentes en el sistema nervioso central (SNC) (50-75%), y el 30% de los estudios han revelado un valor pronóstico positivo para la expresión del gen PTEN [152]. Se han detectado mutaciones en PTEN en un 15-40% de casos de GBM primarios [159]. La radiación ionizante y la quimioterapia son tratamientos estándares para pacientes con GBM, los cuales provocan daño en el DNA celular. Se ha identificado un mecanismo de resistencia a través de la fosforilación de la tirosina 240 de PTEN, lo que se promueve la reparación del DNA en respuesta a la radicación, prolongando la supervivencia de las células y la progresión del tumor [160]. El cáncer de mama es el cáncer más frecuente en mujeres, con más de un millón de casos nuevos diagnosticados cada año. El cáncer de mama es muy heterogéneo, con un importante papel en el desarrollo y progresión tumoral para la vía de señalización de PI3K. A pesar de que es raro encontrar mutaciones somáticas de PTEN en pacientes con cáncer de mama, la expresión de la proteína se encuentra ausente con mucha frecuencia en tumores de mama [152]. La deficiencia de PTEN representa un potencial factor de pronóstico para la resistencia a Trastuzumab (anti-HER2). Además, una pérdida de PTEN puede afectar a la regulación del punto de control inmunitario, al inducir la sobreexpresión de PD-L1 [161]. Por otra parte, mujeres con CS poseen un riesgo de vida de desarrollar cáncer de mama del 25-50% [162], mientras que en mujeres con CS y con mutaciones en la línea germinal de PTEN, este porcentaje se eleva hasta un 85%, frente al 12% de la población general de desarrollar cáncer de mama [157, 158] (Tabla 3). Otros estudio reveló datos parecidos en los que mujeres con mutaciones en el gen PTEN tienen un 77% de riesgo de tener cáncer de mama a los 70 años [163]. No solo el cáncer de mama está asociado a mujeres, también existen hombres con cáncer de mama asociado a CS y con mutaciones en la línea germinal de PTEN [164]. Introducción 24 El cáncer de tiroides es el tipo de tumor endocrino con mayor prevalencia. El cáncer de tiroides presenta una gran variabilidad fenotípica, tanto en su manifestación como en el tratamiento. El carcinoma folicular de tiroides (Folicular Thyroid Carcinoma, FTC) es el más frecuente (90%) de los canceres de tiroides diagnosticados. A nivel molecular, la vía de señalización PI3K/Akt/mTOR juega un papel muy importante en este tipo de cáncer. Además de ser activada por mutaciones en el oncogén Ras, también se han descrito mutaciones activadoras en PIK3CA que afectan al 12-34% de tumores diferenciados [165]. PTEN también es objeto de mutaciones y delecciones en carcinomas foliculares. El carcinoma de tiroides folicular es frecuente en pacientes PHTS (75% de prevalencia) [166]. Mutaciones germinales de PTEN se han encontrado en el 38% de pacientes con cáncer de tiroides comparado con el 1% de pacientes sin este tipo de cáncer (Tabla 3) [158, 167]. El cáncer de próstata (PCa) es el tumor maligno diagnosticado con mayor frecuencia en la población masculina y es la segunda causa de muerte por cáncer en hombres, por detrás del cáncer de pulmón. A nivel molecular, la mayoría de los genes implicados en este tipo de cáncer están relacionados con el ciclo celular, respuesta al daño en el DNA y las vías de traducción de señales Ras/MAPK y PI3K/Akt. La inactivación de PTEN es una de las alteraciones más observadas en este tipo de cáncer, con un 50-80% de tumores de próstata que muestran una pérdida de PTEN (Figura 9) y un 10% con mutaciones puntuales en el gen PTEN [168, 169]. La pérdida de PTEN también se correlaciona con mayores niveles de inestabilidad cromosómica y un aumento de la aneuploidía en el cáncer de próstata [170]. Por otro lado, los individuos con PHTS poseen mayor riesgo de tener otros tipos de canceres a los arriba mencionados, comparándolos con la población general, como el cáncer renal (34% vs. 1.6%), cáncer de colon (17% vs. 5%) y melanomas (6% vs. 2%) (Tabla 3) [157, 158]. Varios estudios han relacionado la pérdida de PTEN como un factor pronóstico para una peor supervivencia general en pacientes con cáncer renal debido a la agresividad del tumor [170]. Mutaciones en genes supresores tumorales corriente abajo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) como BRAF, KRAS, PI3K y PTEN están asociadas con cáncer colorrectal. Más del 90% de pacientes con mutaciones en PTEN tienen pólipos colorrectales, entre los que se incluyen pólipos hamartomatosos, ganglioneuromas, pólipos juveniles y pólipos adenomatosos [171]. Introducción 25 Además, existen estudios en los que se ha visto la existencia de melanomas en pacientes de CS [157]. La alteración del gen PTEN no se encuentra entre los eventos mutacionales más frecuentes en melanoma (10%); sin embargo, la pérdida de PTEN coexiste con mutaciones de BRAF en un 44% de pacientes [170]. Tabla 3. Incidencia de cáncer de la población en general y de pacientes con PHTS (en porcentaje)[158] . 1.6.3. Función de PTEN en el Sistema Nervioso Central (SNC): relación con ASD La actividad de los circuitos neuronales es la base neurobiológica de la conducta y la actividad mental (emociones, memoria y pensamientos). Los procesos de diferenciación de las células neurales y la formación de circuitos por contactos sinápticos entre neuronas (sinaptogénesis) ocurren en el sistema nervioso central (SNC) durante las últimas fases del desarrollo prenatal y los primeros meses después del nacimiento. Los pacientes con ASD manifiestan anomalías en la formación de circuitos y contactos sinápticos en regiones cerebrales implicadas en la conducta social, especialmente en la corteza cerebral prefrontal. Estas anomalías pueden ser causadas por mutaciones en genes involucrados en la formación de sinapsis y plasticidad sináptica, la regulación de la morfología de las espinas dendríticas, la organización del citoesqueleto y el control del equilibrio excitador e inhibidor en la sinapsis [172]. PTEN está presente en la mayoría de las neuritas durante el crecimiento temprano de las mismas, y en los axones y dendritas en las neuronas maduras, por lo que también participa en la plasticidad sináptica en el cerebro adulto [173]. Además, PTEN se encuentra altamente expresado en las neuronas dopaminérgicas y Tipo de cáncer PHTS (%) Población (%) Mama 85 12 Tiroides 38 1 Renal 34 1,6 Endometrio 28 2,6 Colon 17 5 Melanoma 6 2 Introducción 32 Figura 15. Distribución del porcentaje de mutaciones de PTEN en diferentes tipos de cánceres. Se muestra la distribución de las mutaciones en: A. cáncer de endometrio, B. Glioblastoma, C. cáncer de próstata, D. melanoma y, E. cáncer de mama. Los puntos verdes representan mutaciones missense. Los puntos marrones representan mutaciones con un cambio en el marco de lectura. Los puntos negros representan mutaciones nonsense. Los puntos morados son residuos con otras alteraciones. Datos obtenidos de TCGA (The Cancer Genome Atlas) vía cBioPortal (http://cbioportal.org/). (Abril2020). Introducción 33 1.7.2. Mutaciones germinales Las mutaciones germinales que predominan en el gen PTEN son mutaciones missense y nonsense, representando un 44% de todas las mutaciones de PTEN (Figura 16). Figura 16. Porcentaje de la distribución de las mutaciones germinales del gen PTEN. Datos procedentes de la base de datos Human Gene Mutation Database (HGMD) (Agosto 2020). Dentro de las mutaciones missense y nonsense se observa que casi la mitad de todas ellas están asociadas a CS, seguido de cáncer de mama, otros tipos de canceres, PHTS, macrocefalia y autismo (Figura 17). Introducción 34 Figura 17. Distribución de mutaciones missense y nonsense según su fenotipo. Síndrome de Cowden (CS), Síndrome hamartoma tumoral de PTEN (PHTS), Síndrome de BannayanRiley-Ruvalcaba (BRRS), Síndrome del espectro autista (ASD), Síndromes similares a Proteus (PS), enfermedad de Lhermitte-Duclos (LD). Datos procedentes de la base de datos Human Gene Mutation Database (HGMD, Abril 2020). La prevalencia de mutaciones germinales de PTEN en los síndromes PHTS es variable; familias con CS tienen un 85% de prevalencia [202, 203], individuos con BRRS presentan un 65% [137, 202], pacientes con diagnóstico clínico de PS presentan entre un 7-20% de predominio, y entre un 50-67% de pacientes con el síndrome similar a Proteus tienen mutaciones en la línea germinal de PTEN [8, 129, 145]. A pesar de que todos estos síndromes son heredados de forma autosómica dominante, las mutaciones de novo en PTEN ocurren entre un 10-40% de pacientes PHTS [204]. Algunas de las mutaciones de la línea germinal de PTHS también se han identificado en pacientes con ASD y macrocefalia, y en la mayoría de los casos (>80 %) dichas mutaciones son de novo [205]. Introducción 35 1.7.3. Mutaciones PTC Alrededor de un tercio de las enfermedades genéticas hereditarias están causadas por mutaciones nonsense que generan codones de terminación prematura (PTCs, premature termination codons), los cuales producen en la mayoría de los casos proteínas inestables y no funcionales [206]. Por su parte, los genes supresores tumorales son una diana frecuente de PTC. Por ejemplo, los genes p53, APC (Adenomatous polyposis coli) y PTEN, muestran un 10%, 30% y 17% de mutaciones somáticas nonsense asociadas a tumores, respectivamente [207, 208]. En el caso de PTEN, las mutaciones que introducen PTC son frecuentes, tanto en tumores como en pacientes PHTS, en los dominios PTP y C2 (Figura 18), por lo que las estrategias terapéuticas basadas en la reconstitución de la expresión de PTEN en pacientes afectados por estas mutaciones tienen especial relevancia. Figura 18. Distribución del número de mutaciones nonsense y missense en muestras de tumores humanos en el gen PTEN. El número entre paréntesis encima de cada barra indica la media del número de mutaciones por aminoácido en cada dominio. Modificado de [6] (COSMIC, Julio 2020). Introducción 36 2. Lectura a través (readthrough, RT) como aproximación terapéutica en enfermedades causadas por PTCs. Las mutaciones nonsense que generan PTCs son frecuentes en enfermedades genéticas tales como la distrofia muscular de Duchenne (DMD, Duchenne muscular dystrophy) (10-20% de los pacientes) [209] y la fibrosis quística (CF, Cystic fibrosis) (2-5% de los pacientes) [210]. Por ello, se han propuesto intervenciones clínicas en pacientes con este tipo de mutaciones para restaurar la biosíntesis de las proteínas afectadas, entre las que destaca la “lectura a través” traduccional (readthrough, RT). El readthrough traduccional consiste en la incorporación de un aminoácido en la posición correspondiente a un PTC, facilitada por compuestos que se unen al ribosoma y disminuyen la fidelidad de la terminación de la traducción [211-214]. El primer estudio en el que se demostró la eficacia de compuestos inductores de readthrough (antibióticos aminoglucósidos) fue en un modelo de fibrosis quística [210, 215]. Posteriormente, se han descrito inductores de readthrough no-aminoglucósidos con menor toxicidad y aplicación potencial en otras enfermedades [207, 216-220]. 2.1. Mecanismo de acción En las células eucariotas, la biosíntesis de proteínas consiste en dos procesos compartimentados: transcripción génica y procesamiento del mRNA en el núcleo y traducción del mRNA maduro en el citoplasma. En el citoplasma, el proceso de traducción del mRNA se describe en tres fases: iniciación, elongación y terminación (Figura 19). La fase de iniciación de la traducción comienza cuando la subunidad pequeña (40S) del ribosoma, junto con los factores de iniciación, se une al extremo 5´ del mRNA y escanea el mismo hasta encontrar el primer codón de iniciación AUG (Metionina) en un contexto de secuencia apropiado [221, 222]. Durante la elongación, los tRNA incorporan aminoácidos en la cadena polipeptídica por complementariedad de bases. En condiciones normales, la terminación de la traducción ocurre cuando uno de los tres codones de parada (UAA, UGA o UAG) entra en el sitio A del ribosoma y los factores de liberación (eukaryotic release factors) facilitan la liberación de la cadena polipeptídica (Figura 19B; Figura 20A) [223, 224]. Introducción 37 Figura 19. Representación esquemática del proceso de la biosíntesis de una proteína. A. El gen es transcrito y procesado a un mRNA maduro en el núcleo, y en el citoplasma es traducido a proteína. B. 1. El proceso de la traducción tiene lugar tras el reconocimiento del codón de iniciación en el extremo 5´del mRNA. 2. Durante la elongación, se van incorporando aminoacidos a la cadena polipeptidica 3. La terminación de la traducción ocurre con el reconocimiento de un codón de terminación en el extremo 3´ del mRNA. En presencia de mutaciones nonsense que generen PTC en el mRNA, el ribosoma reconoce el PTC como si fuera un codón de parada canónico, liberando una cadena polipeptídica truncada (Figura 20B). Estudios de cristalografía han demostrado que los aminoglucósidos inductores de readthrough se unen al sitio A del ribosoma reduciendo la fidelidad del proceso de terminación de la traducción y permitiendo el readthrough del PTC (Figura 20C) [225]. Introducción 38 Figura 20. Representación esquemática del efecto del readthrough en la traducción de una proteína. A. Traducción normal de una proteína. B. En presencia de un PTC el ribosoma no es capaz de sintetizar la proteína entera, generándose una proteína truncada. C. En presencia de inductores de readthrough, el ribosoma es capaz de “leer a través” del PTC, generando una proteína entera. Nótese que el aminoácido incorporado en la posición del PTC no coincide necesariamente con el aminoácido silvestre, lo que puede producir proteínas enteras no funcionales. El mRNA está sujeto a varios sistemas de vigilancia o controles de calidad, tanto en el núcleo como en el citoplasma [226]. Uno de los sistemas de vigilancia que tiene lugar en el citoplasma es el llamado nonsense-mediated mRNA decay (NMD), el cual es capaz de distinguir y degradar aquellos mRNAs que contienen PTCs para prevenir la síntesis de proteínas truncadas no funcionales [227]. Dependiendo de la posición en la que se encuentre el PTC, el mRNA es susceptible a la degradación por la vía NMD. En resumen, si un mRNA maduro presenta algún PTC a más de 50-55 nucleótidos corriente arriba de la última unión exón-exón, el ribosoma se detendrá en el PTC en la primera ronda de traducción y reclutará proteínas para la degradación del mRNA [228230]. Los agentes inductores de readthrough, al mantener la traducción de proteínas a pesar de la presencia de un PTC, impiden el NMD y estabilizan el mRNA [231]. Introducción 39 La frecuencia con la que se incorpora un aminoácido en el proceso de readthrough depende del PTC, ya que el ribosoma añade aminoácidos a partir de tRNAs con anticodones “parecidos” por complementariedad al PTC [232-234]. En síntesis, la frecuencia descrita de aminoácidos incorporados con el inductor de RT G418, en células de mamífero, es como sigue: UGA: 64% Arginina (R), 18% Cisteína (C) y 18% triptófano (W); UAG: 86% Glutamina (Q), 10% Tirosina (Y) y 2% Lisina (K); UAA: 52% Glutamina (Q) y 48% Tirosina (Y) [234]. 2.2. Eficiencia del Readthrough La eficiencia del readthrough no es igual para los tres codones de terminación. Experimentos en líneas celulares de mamífero han demostrado que el codón de parada UGA tiene el potencial de readthrough más alto y, por tanto, la fidelidad más baja, seguido del codón UAG y UAA (UGA>UAG>UAA) [213, 217, 235]. Estudios experimentales en varios organismos han demostrado que tanto el contexto de la secuencia corriente arriba como la secuencia corriente abajo del codón de parada también desempeña un papel esencial en la eficiencia de la terminación de la traducción. El nucleótido inmediatamente después del codón de parada (denominado +4 o la cuarta base) ejerce la mayor influencia en la fidelidad de la terminación [236], lo que sugiere que la señal de terminación de la traducción consiste en un tetranucleótido y no solo en el codón de parada en sí [237]. La presencia de cisteína (C) en la cuarta base se ha relacionado con mayores niveles de readthrough, tanto en presencia como en ausencia de aminoglucósidos inductores [238, 239] y el efecto de la cuarta base también se ve alterado en función del codón de parada [235, 240, 241]. Además, la secuencia corriente arriba del codón de parada (posiciones -1 a -3) también juega un papel importante en la eficiencia de la terminación de la traducción. Experimentos en levaduras [240], así como en células de mamífero [241, 242], han demostrado que una adenina en la posición -1 o -2 respecto al codón de parada estimula el readthrough modificando la estructura del mRNA en el sitio-P del ribosoma [242]. Por otra parte, la combinación de UGA-C con un uracilo en la posición -1 (U- Introducción 40 UGA-C) presenta el mayor potencial de readthrough estimulado por aminoglucósidos [243]. Se estima que el readthrough basal de los codones de terminación naturales se produce entre un 0.001-0.1% de todas las rondas de traducción. En el caso de los PTCs, se estima que los niveles de RT basal son más altos y pueden variar entre 0.01% al 0.1%. Los inductores de readthrough son más eficaces con los PTCs que con los codones de terminación naturales, por lo que incrementan la síntesis de la proteína entera sin afectar su correcta terminación [243, 244]. 2.3. Tipos de inductores de readthrough Los antibióticos aminoglucósidos son los compuestos más estudiados como inductores de readthrough de PTCs, con estudios que se remontan a la década de 1960, en donde se publicó el primer estudio mostrando el potencial de estos antibióticos en bacterias [245]. 25 años después, se demostró la eficacia inductora de readthrough de los aminoglucósidos en células de mamífero, donde la paromomicina y G418 podían restaurar casi el 20% de la actividad proteica [246]. Los aminoglucósidos son comúnmente usados para tratar infecciones bacterianas en la práctica clínica, y se han desarrollado y estudiado un gran número de compuestos sintéticos y naturales, que se pueden clasificar como aminoglucósidos y no aminoglucósidos (Tabla 4). El potencial terapéutico de los aminoglucósidos como compuestos estimulantes de la lectura de un PTC ha sido testado en muchos modelos, desde sistemas de transcripción y traducción in vitro [235, 247], en líneas celulares [248-253], en células derivadas de pacientes [254], en modelos animales [250, 255-257] y en ensayos clínicos [258-260]. También existen moléculas que no son aminoglucósidos con capacidad de inducir readthrough en modelos animales y celulares. Estos compuestos son los antibióticos macrólidos (como la tilosina, espiramicina y josamicina) [261], la negamicina [255, 262], PTC124 (también conocido como Ataluren o Translarna) [220, 263-267], clitocina [268] y Amlexanox [269], entre otros. Introducción 41 Tabla 4: Tipos de inductores de readthrough Se muestra los aminoglucósidos más importantes, así como la referencia en la que se usaron para hacer readthrough en células de mamífero. Los aminoglucósidos presentan varios efectos adversos, tales como toxicidad renal y ótica y, con menor frecuencia, bloqueo neuromuscular [270, 271]. A pesar de ello, algunos estudios han demostrado que la administración de gentamicina a pacientes con DMD o con CF es relativamente segura y puede ser beneficiosa [258, 259]. En la actualidad, solo está aprobado el uso clínico de inductores de RT en el caso del PTC124 (en Europa, para pacientes con DMD) [272]. El uso de inductores de readthrough como agentes terapéuticos en el futuro requiere la identificación y caracterización de compuestos de alta eficacia y baja toxicidad, lo que constituye el área de investigación muy activa en los últimos años, que incluye estudios sobre la potencialidad de estos compuestos como nuevas terapias anti-cáncer. AMINOGLUCOSIDOS NO AMINOGLUCOSIDOS Nombre Referencia Nombre Referencia Paromomicina [246] [248] Macrólidos [261] Gentamicina [257] [243] [253] PTC124 [234] [264] [263] Geneticina (G418) [235] [235, 251] [252] Clitocina [268] Tobramicina [247] Amikacina [250] [247] Eritromicina Diop 2007 Kanamicina [260] MATERIALES Y METODOS Material y métodos 48 1. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 1.1. Mutagénesis dirigida La mutagénesis realizada en este trabajo está basada en la optimización de la metodología del Kit comercial QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis (Agilent Technologies) para hacer mutagénesis dirigida sobre secuencias de DNA. En el procedimiento se utiliza un vector de doble cadena de DNA (dsDNA) con el inserto de interés y dos oligonucleótidos sintéticos solapantes, diseñados individualmente a partir de la secuencia de cDNA que se desea mutar. Las condiciones estándar que hemos optimizado para la mutagénesis de PTEN utilizan oligonucleótidos con una longitud de 29 bases, quedando el codón que contiene la mutación deseada en medio del oligonucleótido y flanqueado por el mismo número de nucleótidos (13+3+13) [273, 274]. La reacciones de PCR se llevaron a cabo con la DNA polimerasa termoestable Pwo (Tabla 5) (5 U/μL; Roche, Switzerland) con actividad correctora exonucleasa 3´→5´. Tabla 5: Condiciones de la PCR para crear mutaciones sobre la secuencia del gen PTEN. *Para la mutagénesis de PTEN-L, se aumentó en 2 minutos la fase de elongación. El producto de PCR obtenido es tratado durante 2 horas a 37ºC con 0.1 μl DpnI (20 U/μl; New England Biolabs) (Figura xx), una endonucleasa específica (5´-Gm6 ATC3´) que digiere el DNA parental metilado, quedando así las cadenas no metiladas de DNA de nueva síntesis con la mutación deseada (Figura 21). PCR Fases Ciclos Temperatura (oC) Tiempo 1 1 95 oC 1 min 2 18 95 oC 50 seg 60 oC 50 seg 68 oC 5 (7*) min 3 1 68 oC 7 min Material y métodos 49 1.2. Plásmidos Los plásmidos utilizados en este trabajo se describen en la Tabla 6. Tabla 6: Plásmidos utilizados en esta tesis doctoral. Plásmido Características Fuente pRK5 Vector de expresión en mamíferos. Pharminger pRK5 PTEN Contiene el cDNA codificante de PTEN (secuencia humana, NM_000314; aminoácidos 1-403) clonado en el vector pRK5. [21] pRK5 PTEN-L Contiene el cDNA codificante de PTEN-L (secuencia humana, NM_001304717; aminoácidos 1-576) clonado en el vector pRK5. [275] pYES2 Vector de expresión en levaduras. Contiene el promotor inducible por galactosa GAL1 y el marcador auxotrófico URA3. Invitrogen pYES2 PTEN Contiene el cDNA codificante de PTEN (aminoácidos 1-403) clonado en el vector pRK5. [276] pYES2 PTEN-L Contiene el cDNA codificante de PTEN-L (aminoácidos 22-576) clonado en el vector pRK5. [31] YCpLG Vector de expresión centromérico en levaduras. Contiene el promotor inducible por galactosa GAL1 y el marcador auxotrófico LEU2. L. Bardwell y J. Thorner (Univ. de California)[276] YCpLG-p100α - CAAX Contiene el cDNA codificante de la subunidad catalítica p110α (secuencia bovina, NM_006218) fusionada en 3´ con la secuencia de la señal de prenilación de RAS [276] 2. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA CELULAR 2.1. TRANSFORMACIÓN Y CRECIMIENTO DE BACTERIAS 2.1.1. Cepa de bacteria y medios de crecimiento Se utiliza medio líquido LB (Luria-Bertani) (1% triptona, 0.5% extracto de levadura, 1% NaCl) y placas de agar (1.5% agar y 0.01% NaOH) con/sin ampicilina como medio selectivo de crecimiento para la cepa DH5α de Escherichia coli. El fenotipo de dicha cepa es FΦ80lacZΔM15 Δ (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk, mk+) phoAsupE44 thi1 gyrA96 relA1 λ-. Material y métodos 50 2.1.2. Preparación de bacterias competentes con cloruro cálcico Las células competentes de E. coli se han obtenido mediante el método de transformación de cloruro de calcio (CaCl2). Se crece una colonia DH5α en 5 ml de medio LB sin penicilina durante 24 horas a 37ºC. Posteriormente, se incubó 1 ml del inóculo en 50 ml de medio LB hasta llegar a una densidad óptica (D.O 600nm) de 0.6. Después, se realizaron dos procesos de centrifugación (10 min a 4000 rpm a 4ºC) en los que se resuspendió el pellet en CaCl2 0.1M. Por último, se resuspendió en 2 ml de CaCl2 0.1M con 20% de glicerol, y se hicieron alícuotas que se congelaron con hielo seco y se almacenaron a -80ºC. 2.1.3. Transformación de bacterias En tubos de polipropileno de 15 ml se añaden 2-10 μl del producto de PCR mutagénica obtenido tras el tratamiento con DpnI, 10μL de tampón TNE (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA) y 10μl de TCM 10X (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2, 100 mM MgCl2), y se dejó hielo durante 5 minutos. Al cabo de ese tiempo, se añadieron 25μl de células competentes DH5α. Tras 30 minutos en hielo, se aplicó un choque térmico a 42ºC durante 90 segundos. Posteriormente se añadieron 500 μl de medio LB y se dejaron a 37ºC en agitación durante 90 minutos. Las células bacterianas transformadas se transfirieron a placas LB con ampicilina (50 g/ml) y se dejaron creciendo durante 24 horas a 37ºC (Figura 21). Al día siguiente, se picaron colonias en 5 ml de LB con ampicilina (50 g/ml), y se dejaron creciendo a 37ºC durante toda la noche. 2.1.4. Purificación del DNA plasmídico El DNA plasmídico se puede extraer por dos métodos: - Purificación a pequeña escala: se extrajo el DNA plasmídico mediante el kit comercial NucleoSpin Plasmid Easy Pure (Macherey-Nagel) de las colonias transformadas en 5 ml de LB con ampicilina a 37ºC en agitación durante 24 horas. - Purificación a gran escala: se utilizó el kit NucleoBond Xtra Midi (MacheryNagel) de las colonias bacterianas transformadas en 100 ml de LB con ampicilina a 37ºC en agitación durante 24 horas. Material y métodos 51 Los plásmidos obtenidos tras la mutagénesis se digirieron con enzimas de restricción y se comprobaron mediante una electroforesis en geles de agarosa al 1% en tampón TAE (40mM Tris-acetato, 1mM EDTA) con Gel-RedTM Nucleo Acid Stain (Biotium) a voltaje continuo. El gel se visualiza en el sistema G:BOX con su programa de análisis Gene Snap (Syngene, Cambridge) (Figura 21). 2.1.5. Secuenciación Las muestras seleccionadas se secuenciaron (ABI 3130xl Genetic Analyzer (Life Technologies)) para confirmar la mutación deseada y para verificar que no se hayan introducido mutaciones adicionales durante el proceso de PCR. La secuenciación se realizó en la Plataforma de Genética y Genómica del Instituto de Investigación Sanitaria Biocruces Bizkaia. Las secuencias de DNA se analizan utilizando el programa BioEdit (Figura 21). Figura 21: Representación esquemática del método de mutagénesis dirigida Quikchange. Se lleva a cabo la mutagénesis sobre el vector de mamíferos pRK5-PTEN y el vector de levaduras pYES2-PTEN. 1. Reacción de PCR. Reacción de amplificación del DNA mediante PCR usando oligonucleótidos complementarios con la mutación deseada. 2. Digestión. Digestión del DNA molde parental con DpnI. 3. Transformación del producto obtenido en células E. coli competentes en placas de LB con ampicilina. 4. Obtención y aislamiento del DNA plasmídico. Digestión con la enzima de restricción (XbaI) y comprobación de la secuencia del DNA mediante análisis de datos. Material y métodos 52 2.2. TRANSFORMACIÓN Y CRECIMIENTO DE LEVADURAS 2.2.1. Cepa de levadura y medios de crecimiento La cepa de Saccharomyces cerevisiae utilizada fue YPH499, cuyo fenotipo es MATa ade2-101 trp1-63 leu2-1 ura3-52 his3∆200 lys2-801. Se utiliza como medio general de crecimiento no selectivo el medio líquido YPD (1% extracto de levadura, 2% peptona y 2% glucosa), o sólido con agar (2%). El medio sintético completo (SD) contiene 0.17% base nitrogenada sin aminoácidos, 0.5% sulfato amónico y 2% de glucosa (Dextrosa), suplementándose con los aminoácidos apropiados en función de los plásmidos correspondientes. Los medios SG y SR contienen 2% de galactosa y rafinosa, respectivamente. 2.2.2. Transformación de la levadura En aquellos casos en los que se transforman dos plásmidos, las transformaciones de levadura se llevaron a cabo directamente desde placas YPD. Para ello, se preparó en un tubo eppendorf 100 µl de la mezcla de transformación (80 µl de polietilenglicol (PEG) al 50 % y 20 µl de acetato de litio (AcLi) 1M), se agitó con el vortex. Después, con un palillo estéril se cogió una pequeña cantidad de la cepa de levadura crecida en la placa YPD y se añadió a la mezcla junto con 2 µl (1 µg/µl) de DNA plasmídico. Para aquellas transformaciones de más de 2 plásmidos, la cepa de S. cerevisiae se creció en 10 ml de medio liquido YPD a 30ºC durante 24 horas en agitación. Se diluyó 1 ml del inóculo en medio YPD y cuando el medio obtuvo una D.O600 nm de 0.4, se dejó incubando durante 4 horas más. Después se centrifugó en frio durante 5 min a 2500 rpm y el pellet obtenido se resuspendió con la mezcla previamente preparada de PEG al 50% con AcLi 1M, DTT, conteniendo 3 µl de DNA plasmídico (1,5 µg/µl) y 5 µl de DNA de esperma de salmón (Sigma, 10 mg/ml) por muestra. El DNA de esperma de salmón se calienta durante 5 minutos a 95ºC y es enfriado en hielo antes de ser añadido a la mezcla. En ambos casos, los tubos de transformación se incubaron en agitación durante 45 min a 45ºC. Las levaduras transformadas se sembraron en placas de agar con medio sintético completo (sin uracilo (SD-U), sin leucina (SD-L), sin uracilo ni leucina (SD-UL) o sin uracilo ni leucina ni triptófano (SD –UTL)) y se dejó incubando a 30ºC durante 3 días. Material y métodos 53 2.2.3. Ensayo de crecimiento en gota mediante diluciones seriada Las colonias transformadas se incubaron en medio SD durante 18 horas, y dichos cultivos se diluyeron en agua estéril hasta una densidad óptica de 0.15, a partir de los cuales se prepararon 3 diluciones seriadas (1/10, 1/100 y 1/1000). Con una pipeta multicanal se depositaron 5 µl de cada dilución en paralelo tanto en placas SD, como control del crecimiento, como en placas SG para inducir la expresión de los genes regulados por el promotor GAL1. Se incubaron a 30ºC y el crecimiento de las gotas en las placas se monitorizó tras 72 horas. Todos los experimentos se realizaron, al menos, tres veces. 3. CULTIVOS DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS 3.1. Líneas celulares La línea celular COS-7 es una línea celular de riñón de mono que expresa de forma endógena PTEN. Esta línea se cultivó en DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium, Lonza, USA) complementado con 5% FBS (suero fetal bovino), 1mM L-Glutamina, 100 U/ml penicilina, y 0,1 mg/ml estreptomicina. La línea celular U87-MG es una línea celular humana de glioblastoma, no expresa PTEN de forma endógena. Esta línea celular se cultivó en DMEM complementado con 10% FBS, 1mM L-Glutamina, 1 % de aminoácidos no esenciales, 100 U/ml penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina y 1mM piruvato sódico. 3.2. Método de transfección La línea celular COS-7 se transfectó utilizando el protocolo de transfección DEAEdextrano y el método de transfección GenJetTM. En ambos casos, días antes de la transfección se plaquearon alrededor de 1,5·104 células/cm2 en placas Petri. En el método de transfección DEAE-dextrano, tras un lavado con PBS (Tampón fosfato salino (1,85 mM Na2HPO4, 8,4 mM Na2HPO4, 150mM NaCl)), las células se incubaron durante 4 horas en una solución con DMEM al 2%, 10Mm de cloroquina, 10 mg/ml de dextrano y 1 µg de DNA plasmídico. Transcurrido ese tiempo, las células Material y métodos 54 transfectadas se incubaron 2 minutos con una solución de PBS con 10% de DMSO (dimetilsulfóxido) y se lavaron con PBS. Finalmente, las células se cultivaron durante 48 horas antes de ser procesadas. En el método de transfección GenJetTM In Vitro DNA Transfection Reagent (SignaGen Laboratories), las células se dejan en placas de seis pocillos con medio completo 1 hora antes de ser transfectadas. Mientras tanto, se preparan dos soluciones; la primera se añade 1 g de DNA en medio DMEM sin suero y en la segunda, se prepara medio DMEM sin suero junto con GenJet Reagent para cada transfección. Se añade la solución del reactivo de GenJet sobre la solución de DNA, se vortexea y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. Transcurridos los 15 minutos la mezcla se añade a las células. Las células se cultivaron en un incubador saturado de humedad a 37ºC y 5% de CO2 durante 24 horas. Pasadas 24 horas se añade medio nuevo y las células se procesaron 24-48 horas post-transfección. La línea celular U87-MG se transfectó con Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, USA). En esta transfección se realizan dos incubaciones. Primero, en un tubo se mezcla la solución OptiMEM con 1 µg de DNA y la solución Plus Reagent; en otro tubo se incuba la solución Lipofectamine con medio OptiMEM. Transcurridos 10 minutos, se juntan las dos incubaciones y se dejan durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadió la mezcla de la transfección a las placas con medio nuevo sin antibióticos. Ambas líneas se cultivaron de forma rutinaria en placas de 6 pocillos en un incubador saturado de humedad a 37ºC y 5% de CO2, y se procesaron 48-72 horas posttransfección. En los experimentos de estabilidad de proteínas, las células se trataron con 800 µg/ml de cicloheximida (CHX, Sigma-Aldrich) durante 6 horas antes de lisarlas. En los experimentos de readthrough, las células se incubaron durante 24 horas en presencia de G418 (geneticina) a una concentración de 200 μg/ml (o a la dosis indicada). 3.3. Lisis de cultivos celulares Se realizaron lavados con PBS frio (4ºC). Después las células se incubaron a 4ºC con 150-200 µl tampón de lisis Mammalian Protein Extration Reagent (M-PER, Thermo Fisher Scientific) suplementado con un inhibidor de fosfatasas PhosSTOP y con un cocktail de inhibidor de proteasas cOmplete EDTA-free (Roche, Switzerland) durante 10 min. Después, el lisado celular resultante se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Material y métodos 55 Dicha centrifugación permite obtener un sobrenadante postnuclear con el lisado celular. La concentración proteica de cada muestra se cuantificó empleando el kit PierceTM BCA Protein Assay (Thermo Fisher). Con concentraciones conocidas de la seroalbúmina bovina (BSA) se estableció la recta de calibrado que permite calcular la absorbancia correspondiente a la concentración proteica de nuestra muestra. La absorbancia se midió en un espectrofotómetro BioPhotometer (Eppendorf). 4. INMUNODETECCIÓN PROTÉICA 4.1. Electroforesis Para la separación electroforética, se añadió tampón de carga Nu-PAGE 4X a los extractos proteicos procedentes de células de mamífero (125 mM de Tris HCl pH=6,8, 5% de SDS, 25% de glicerol y β-mercaptoetanol (Merck) por cada ml de tampón de carga) y se hirvieron a 95ºC durante 10 minutos. A continuación, se llevó a cabo una Las electroforesis se realizaron en geles de poliacrilamida (10% SDS-PAGE), en condiciones desnaturalizantes y reductoras, a un voltaje continuo de 20 V durante toda la noche. Se incluyó Precision Plus Protein (Bio-Rad) como marcador de peso molecular. 4.2. Transferencia e hibridación Tras la separación de proteínas en el gel de poliacrilamida, estás se transfirieron a una membrana de PVDF (Immobilon-FL, Millipore), activadas previamente con metanol, a través de una transferencia semiseca (Thermo Scientific Owl serie HEP) durante 1 hora a 200 mA y 30 min a 100 mA. Una vez realizada la transferencia de proteínas y para evitar la posibilidad de uniones inespecíficas, la membrana se bloqueó con OBB (Odissey Blocking Buffer, LI-COR) (Dilución 1:1 en PBS) durante 2 horas a temperatura ambiente y se incubó con un anticuerpo primario monoclonal (diluido en tampón de bloqueo 1/1.000 con 2% de azida sódica, la cual previene de contaminaciones bacterianas y permite reutilizar el anticuerpo) (Tabla 7) durante toda la noche a 4ºC. Después se realizaron 6 lavados de 10 minutos con tampón NET-gelatina (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 5mM EDTA, 0.05% Tritón X-100, 0.25% gelatina). A continuación, la membrana se incubó con un anticuerpo secundario conjugado con un fluorocromo (Tabla 7) (diluido en tampón de bloqueo 1/20.000) durante una hora a temperatura ambiente. Resultados 62 Figura 22. Monitorización de la mutagénesis dirigida usando una sustitución de aminoácido de PTEN como ejemplo. A. Ejemplo de par de oligonucleótidos de 29 nucleótidos de longitud (+, primer forward; -, primer reverse) (13+3+13, subrayado el codón que se sustituye), para la mutación D24G de PTEN, en donde el aspartato de la posición 24 (GAC) es sustituido por una glicina (GGC). B. Gel de agarosa al 1%. Se muestra el DNA obtenido de la PCR tratado con/sin Pwo y/o con/sin DpnI. El plásmido pRK5-PTEN tiene un tamaño aproximado de 6 kb, mientras que el plásmido pYES2-PTEN tiene un tamaño de 7.1 kb. C. Control de digestión con enzimas de restricción (XbaI + SalI, cortan el inserto PTEN de 1,2 kb) de DNA plasmídico obtenido de bacterias transformadas con el producto de PCR mutagénico. D. Eficiencia de la transformación bacteriana del producto de PCR (se muestra el número de colonias después del tratamiento con DpnI) y eficiencia de mutagénesis (número de muestras mutadas con respecto al número de muestras secuenciadas). La Tabla 8 muestra ejemplos de mutagénesis de PTEN con oligonucleótidos de la misma longitud (13+3+13) pero distinta Tm (melting temperature) y contenido de G/C. Como se observa, ni la Tm, ni la presencia de una G o una C en los extremos 3´de los oligonucleótidos, ni el contenido de G/C afectó a la eficiencia de la mutagénesis. Por ello, para el resto de experimentos de esta tesis, hemos utilizado oligonucleótidos mutagénicos de 29 nucleótidos de longitud, independientemente de su Tm y contenido en G/C. Resultados 63 Tabla 8. Mutagénesis dirigida estandarizada para mutaciones de PTEN1 Mutación2 Contenido de GC (%) Tm3 Número de colonias Eficiencia de mutagénesis M1I (ATG→ATA) 48 75 22 1/1 K6E* (AAA→GAA) 52 76.5 12 1/1 K6I* (AAA→ATA) 52 76.5 8 1/1 N12T** (AAC→ACC) 41 72 12 1/1 R14G* (AGG→GGG) 41 72 20 1/2 D24G (GAC→GGC) 38 71 58 1/1 E43G (GAA→GGA) 48 75 11 1/1 I50T (ATT→ACT) 31 68 19 1/1 Y65C** (TAC→TGC) 34 69.5 8 1/1 Y68N** (TAC→AAC) 34 69.5 9 2/3 Y68H** (TAC→CAC) 38 71 15 1/1 Y68C** (TAC→TGC) 38 71 32 1/1 L70P** (CTT→CCT) 38 71 14 1/1 K80E*(AAA→GAA) 41 72 5 1/1 I101T* (ATC→ACC) 41 72 20 1/1 D107G* (GAT→GGT) 48 75 10 1/1 L112P (CTA→CCA) 45 74 10 1/1 H123R (CAC→CGC) 45 74 25 1/1 R130L (CGA→CTA) 45 74 38 1/1 G132D* (GGT→GAT) 38 71 32 1/2 R142P (CGG→CCG) 24 65 44 1/1 R159G* (AGG→GGG) 48 75 39 1/1 Q171E (CAG→GAG) 48 75 15 1/2 M205V (ATG→GTG) 45 74 19 1/1 D252V (GAT→GTT) 41 72 55 1/1 K254T** (AAA→ACA) 45 74 26 1/1 V255A (GTA→GCA) 41 72 100 1/1 1La mutagénesis se ha llevado a cabo usando el plásmido pYES2-PTEN con oligonucleótidos de 29 nucleótidos de longitud. 2Se indica la sustitución del nucleótido y el cambio de aminoácido. 3La Tm se calculó de acuerdo con el manual QuikChange. * Uno de los oligonucleótidos mutagénicos tiene una G o C en la posición 3´. ** Los dos oligonucleótidos mutagénicos tiene una G o C en la posición 3´. Resultados 64 2. Respuesta de readthrough de los codones de terminación prematura (PTC) en el gen PTEN 2.1. PTCome de PTEN asociado a enfermedades En la Figura 23 se muestra el PTCome potencial de PTEN, es decir, todos los diferentes PTC que se pueden generar, cambiando un nucleótido, a partir de la secuencia de DNA codificante del gen PTEN. El PTCome potencial de PTEN incluye 183 PTC, generados a partir de 146 codones, que incluyen 17 de los 18 codones que pueden producir codones nonsense mediante el cambio de un nucleótido (el codón TCG no está presente en el gen PTEN). A día de hoy, se han identificado 141 PTC en PTEN asociados a enfermedades, de los cuales 15 se han encontrado solo en la línea germinal de pacientes PHTS, 71 son PTC resultado de mutaciones somáticas en tumores y, 55 están presentes en la línea germinal de pacientes en tumores. Estos PTC se distribuyen a lo largo del dominio PTP y el dominio C2 de PTEN, mientras que en la cola C-terminal no se ha encontrado ningún PTC asociado a enfermedad. Figura 23: PTCome de PTEN. Representación de los dominios de la proteína PTEN y la distribución de los PTC. En la parte superior se muestran los exones de PTEN y los dominios de la proteína (los números se corresponde con la numeración de aminoácidos de PTEN: dominio PTP, aminoácidos 1185; dominio C2, aminoácidos 186-353; cola C-terminal, aminoácidos 354-403). En el diagrama de barras superior se muestra el PTCome potencial de PTEN con los 141 PTC asociados a enfermedades (marcados en negro) y 42 PTC no relacionados con enfermedades (marcado en amarillo). En los diagramas de barras inferiores, se muestra la distribución de los PTC somáticos y los PTC de línea germinal (marcados en rojo) del gen PTEN asociados a enfermedades (enfermedades asociadas al PTCome de PTEN). Tanto en pacientes con PHTS como en muestras de tumores, existen tres mutaciones halladas frecuentemente (R130X, R233X y R335X, situadas en los exones 5, 7 y 8, respectivamente). Estas mutaciones constituyen el 15%, 18%, y 4%, respectivamente, Resultados 65 del total de mutaciones PTC de PTEN encontradas en tumores humanos, y el 22%, 13%, y 17%, respectivamente, de las mutaciones PTC de PTEN encontradas en pacientes con PHTS (Figura 24). Figura 24. Representación de los PTC somáticos y germinales encontrados en el gen PTEN. En el gráfico de la izquierda, se muestra el número de veces que un PTC ha sido encontrado en la línea germinal de pacientes (datos procedentes de la literatura (ver Bibliografía suplementaria) y de la base de datos HGMD). En el gráfico de la derecha se muestra el número de veces que un PTC ha sido encontrado en muestras de tumores. Datos procedentes de la base de datos COSMIC. Los números en el eje de abscisas corresponden a la numeración de los aminoácidos de PTEN. 2.2. Inducción de readthrough en mutaciones PTC de PTEN En la Figura 25 se muestran varios experimentos sobre la lectura traduccional inducible por readthrough de diferentes mutaciones PTC de PTEN. En primer lugar, analizamos la eficacia de G418 (geneticina), un antibiótico aminoglucósido, para inducir readthrough en el gen PTEN. Se usó líneas celulares humanas positivas (COS-7) y negativas (U87MG) para PTEN, transfectadas transitoriamente con plásmidos de cDNA que codifican las mutaciones PTC de PTEN más abundantes en tumores, R130X (TGA) y R233X (TGA). En ambas líneas celulares observamos la inducción de readthrough en presencia de G418 (Figura 25A). Para evaluar la especificidad del PTC-readthrough inducido por G418, se cotransfectó el plásmido pRK5-PTEN (el vector pRK5 carece del gen de resistencia a neomicina, cuyo producto proteico inactiva G418) con el plásmido pRC/CMV (plásmido que contiene el gen de resistencia a neomicina) o el plásmido vacío pSG5 (plásmido que carece de dicho gen de resistencia). La co-transfección con el plásmido pRC/CMV bloqueó la inducción con G418 del readthrough del PTC R233X (Figura 25B). A continuación, se evaluó el readthrough inducido por G418 y gentamicina (otro antibiótico aminoglucósido) en algunas variantes representativas de PTEN que contienen PTC, usando dos anticuerpos anti-PTEN diferentes (anti-C-terminal o anti-N-terminal). Ambos antibióticos activaron el Resultados 66 readthrough de estos PTC de PTEN, generando proteínas completas de PTEN con una eficiencia variable dependiendo del PTC. Se puede observar como la inducción del readthrough es mayor con G418 en todos los PTC, aunque también se puede apreciar con gentamicina. En algunas variantes de PTC de PTEN, como R335X, se detectó la proteína PTEN truncada mediante el anticuerpo anti-N-terminal (Figura 25C). El análisis detallado de la expresión de diferentes PTC de PTEN muestra una disminución gradual en los niveles de expresión de las proteínas truncadas C-terminales de PTEN, siendo indetectable las truncaciones anteriores al aminoácido 219 (Figura 25D). Esto concuerda con la falta de estabilidad en las células de las proteínas truncadas C-terminales de PTEN. La cantidad de proteína truncada C-terminal R335X disminuyó proporcionalmente a la cantidad de proteína completa de PTEN generada por el readthrough (Figura 25C). Figura 25. Inducción de readthrough en diferentes mutaciones PTC de PTEN. Las células COS-7 se transfectaron con plásmidos pRK5 que codifican diferentes PTC de PTEN (φ, vector vacío; wt, tipo silvestre). Tras 24h de incubación las células se dejan sin tratan o se incuban con G418 (200 µg/ml) o gentamicina (800 µg/ml) durante 24h más. La expresión de proteína se detectó mediante Western Blot usando por separado el anticuerpo anti-PTEN C-terminal (6H2.1), anticuerpo PTEN N-terminal y antiGAPDH como control de carga. A. Las células COS-7 y U87MG se transfectaron con plásmidos pRK5 que codifican diferentes variantes de PTEN (R130X y R233X). B. Las células COS-7 se co-transfectaron con el plásmido pRK5 y el vector vacío pRc/CMV y pSG5. C. Activación del readthrough en células COS-7 con ambos antibióticos. El asterisco (*) indica la migración de la proteína truncada R335X C-terminal de PTEN. D. Expresión de las proteínas truncadas C-terminales de PTEN en células COS-7 a partir de las correspondientes variantes PTC. Resultados 67 Las variantes de PTEN cuyo PTC se encuentra localizado en la región N-terminal antes de la metionina 35 (Met35), como R11X (TGA) y R15X (TGA), produjeron una proteína truncada N-terminal de PTEN en condiciones no inductoras de readthrough; dicha proteína se detecta con el anticuerpo anti-C-terminal de PTEN, pero no con el anticuerpo anti-N-terminal (Figura 26A). A continuación, analizamos comparativamente, en distintas mutaciones PTC de PTEN, la respuesta de readthrough frente a varios inductores, entre los que se incluyen compuestos aminoglucósidos (G418, gentamicina, Amicacina y Tobramicina) y no aminoglucósidos (Eritromicina). El compuesto que más readthrough induce es el G418, seguido de la gentamicina. Se incluyó la mutación Y176X como ejemplo de mutación PTC que no sufre readthrough (Figura 26B). Para saber la concentración de inductor y el tiempo necesario para inducir readthrough, se realizaron los siguientes experimentos. En primer lugar, se realizó un experimento con concentraciones crecientes de G418 y de gentamicina (Figura 26C) en las variantes R130X y R233X de PTEN. Observamos que al añadir G418 a una concentración de 200 µg/ml o gentamicina a una concentración de 800 µg/ml, tanto a la variante R130X como a R233X, se conseguía mayores niveles de readthrough (consiguiendo niveles óptimos con G418). En segundo lugar, se realizó un experimento para determinar el tiempo necesario para inducir readthrough en las células. Se observa que 24 horas es suficiente para obtener expresión de proteínas mediante la inducción con G418 y dicho efecto se mantiene en las células hasta 48 horas después (Figura 26D). Resultados 68 Figura 26. Inducción de readthrough en diferentes mutaciones de PTEN. A. Las células COS-7 se transfectaron con diferentes variantes con PTC de PTEN (R11X, R15X, y R130X). El asterisco (*) indica la migración de la proteína truncada N-terminal de PTEN.B. Cuantificación de los niveles de expresión de readthrough de diferentes mutaciones PTC de PTEN en presencia de diferentes inductores. Se mide la expresión de los diferentes PTC en presencia de G418 (200 µg/ml), Gentamicina (800 µg/ml), Amicacina (2 mg/ml), Tobramicina (800 µg/ml) y Eritromicina (175 µg/ml). Las barras corresponden a la media ± SD. C. Respuesta a la dosis del inductor de readthrough de diferentes mutaciones PTC de PTEN. Las células COS-7 se incuban con G418 (200, 75, o 30 µg/ml) y gentamicina (800, 300, o 100 µg/ml) durante 24h. D. Panel izquierdo: las células COS-7 son tratadas con o sin G418 (200 µg/ml) durante el tiempo indicado. Panel derecho: las células COS-7 se incubaron durante 24h en presencia de G418 (200 µg/ml), seguido de otra incubación en ausencia de G418, como se indica. En ambos casos, se muestra un experimento representativo de al menos dos experimentos independientes. Resultados 69 2.3. Análisis global del readthrough del PTCome de la línea germinal de PTEN asociado a enfermedades La eficiencia del readthrough está influenciada por la identidad de cada PTC, así como por la secuencia de nucleótidos próxima en el mRNA. Para hacer una estimación global del potencial de readthrough realizamos un análisis global de la inducción de readthrough con G418, como inductor óptimo de readthrough, de 70 PTC hallados en la línea germinal de PTEN en asociación con enfermedades (15 PTC se han encontrado en la línea germinal de pacientes PHTS y 55 PTC se han encontrado en la línea germinal de pacientes y en muestras de tumores esporádicos). La Figura 27 muestra un patrón heterogéneo de los niveles de expresión de proteína obtenidos (entre un 0-30% de inducción de readthrough) de las variantes de PTC germinales de PTEN. La tabla 9 presenta una clasificación de PTC según su eficacia de readthrough. Aproximadamente el 6% de los PTC mostró una eficiencia óptima de readthrough (>20% de expresión respecto a PTEN silvestre), el 11.5 % mostró una eficiencia subóptima de readthrough (10-20% de expresión), el 18% mostró una eficiencia baja de readthrough (5-9% de expresión), y el 65% mostró una eficiencia muy baja de readthrough (0-4% de expresión). Figura 27. Análisis global de la inducción de readthrough de mutaciones PTC germinales de PTEN. Los niveles de readthrough se determinaron mediante Western Blot en células COS-7 en presencia (barras rojas) /ausencia (barras azules) de G418 (200 µg/ml) durante 24h. Los datos están normalizados frente a la expresión de PTEN tipo salvaje. Se muestra la media de al menos dos experimentos independientes. Resultados 70 Tabla 9. Eficiencia de readthrough del PTCome asociado a enfermedades según el tipo de PTC PTC n1 Eficiencia de readthrough2 Óptima 4 (5,7%) Subóptima 8 (11.4%) Baja 13 (18.6%) Muy baja 45 (64.28%) TGA 16 (22.85%) 3 (75%) 4 (50%) 4 (30,8%) 5 (11.1%) TAG 22 (31.45%) 1 (25%) 4 (50%) 3 (23.1%) 14 (31.1%) TAA 32 (45.7%) 0 (0%) 0 (0%) 6 (46.1%) 26 (57.8%) 1 Número y porcentaje de cada tipo de PTC de la línea germinal de PTEN asociadas a enfermedades. 2 La eficiencia de readthrough se define como el porcentaje de expresión respecto a PTEN wt (100%): óptima (>20% de expresión), subóptima (10%-20% de expresión), baja (5%-9% de expresión) y muy baja (0%-4% de expresión). Se indica el número y el porcentaje de cada tipo de PTC. Nuestro análisis global nos permitió realizar algunos análisis comparativos en términos de secuencias de mRNA óptimas para el readthrough de PTEN. La media de las eficiencias de readthrough para cada tipo de PTC fueron: TGA, eficacia de readthrough del 11% (rango 125%); TAG, eficacia de readthrough del 4.8% (rango 0-29%); TAA, eficacia de readthrough del 2.52% (rango 0-9%). La mayoría de los PTC que mostraron una eficiencia óptima o subóptima de readthrough fueron TGA PTC (77,5%), seguidos de TAG (37,5%) y TAA (0%). Por otro lado, los PTC que mostraron una eficiencia de readthrough muy baja fueron en su mayoría TAA (57.8%), seguido de TAG (31.1%) y TGA (11.1%) (Tabla 9). Estos resultados, al igual que otros estudios de readthrough comparativos utilizando diferentes mRNA, refuerzan la idea de que los codones de terminación TGA presentan una mayor eficiencia de readthrough seguido de los codones TAG y TAA [251, 253]. Las mutaciones PTC prevalentes de PTEN R130X, R233X y R335X mostraron un readthrough óptimo o subóptimo (>17% de expresión) (Tabla 10). Esto refuerza el potencial de las terapias basadas en readthrough de PTEN para grupos específicos de pacientes. Resultados 71 Tabla 10. Eficiencia de readthrough de las mutaciones PTC germinales de PTEN Aminoácido1 Variante2 Sustitución de aminoácido2* PTC3 Eficiencia de readthrough4 Puntuación funcional (FS)5 Puntuación de eficiencia funcional del readthrough6 K6 c.16A>T p. (Lys6Ter)/K16X ATC TAA GAG 2.9+0.3 1/0 1.5 Y16 c.48T>A p. (Tyr16Ter)/Y16X AGA TAA CAA 3.8+ 1.6 0.5/0 2.8 Q17 c.49C>T p. (Glu17Ter)/Q17X TAT TAA GAG 6,2+3.6 0.5/1/1 6,2 L23 c.68T>A p. (Leu23Ter)/L23X GAC TAA GAC 1.5+0.8 0/0 0 c.68T>G GAC TGA GAC 4.7+3.9 0/0/0 0 Y27 c.84T>A p. (Tyr27Ter)/Y27X ACC TAA ATT 1.7+1.8 0/1 0.8 Y29 c.87T>A p. (Tyr29Ter)/Y29X ATT TAA CCA 8.7+6.0 1/1 8.7 c.87T>G ATT TAG CCA 10.8+4.3 1/1/1 10.8 G36 c.106G>T p.(Gly36Ter)/G36X ATG TGA TTT 19.9+1.4 0/0/1 3.5 Y46 c.138C>A p. (Tyr46Ter)/Y46X GTA TAA AGG 3.4+2.1 0/1 1.6 c.138C>G GTA TAG AGG 2.5+1.7 0/1/0 0.3 S59 c.176C>A p. (Ser59Ter)/S59X GAT TAA AAG 6.5+3.7 1/1 6.5 c.176C>G GAT TAG AAG 28.9+4.8 1/1/1 28.9 Y65 c.195C>A p. (Tyr65Ter)/Y65X CAT TAA AAG 5.2+3.4 0.5/1 3.8 c.195C>G CAT TAG AAG 1.9+0.4 0.5/1/0.5 1 Y68 c.204C>A p. (Tyr68Ter)/Y68X ATA TAA AAT 0.1+0.1 0/1 0 E73 c.217G>T p.(Glu73Ter)/E73X GCT TAA AGA 2.5+ 1.8 1/1 2.5 K80 c.238A>T p.(Lys80Ter)/K80X GCC TAA TTT 1.5+0.2 1/1 1.5 R84 c.250A>T p.(Arg84Ter)/R84X TGC TGA GTT 3.9+0.2 1/1/1 3.9 Q87 c.259C>T p.(Gln87Ter)/Q87X GCA TAA TAT 0.6+0.3 1/1 0.6 Y88 c.264T>A p.(Tyr88Ter)/Y88X CAA TAA CCT 4.4+2.9 0.5/1 2.1 Q97 c.289C>T p.(Gln97Ter)/Q97X CCA TAG CTA 6.1+0.1 1/1/1 6.1 E106 c.316G>T p.(Glu106Ter)/E106X TGT TAA GAT 0.6+0.1 1/0 0.3 Q110 c.328C>T p.(Gln110Ter)/Q110X GAC TAA TGG 6.9+5.8 1/1 6.9 W111 c.332G>A p.(Trp111Ter)/W111X CAA TAG CTA 3.1+1.2 0/1/0 0.3 G127 c.379G>T p.(Gly127Ter)/G127X GCT TGA AAG 1.9+0.6 0/0/0 0 R130 c.388C>T p. (Arg130Ter)/R130X GGA TGA ACT 19,6+ 4,8 1/0/0 12,6 L139 c.416T>A p.(Leu139Ter)/L139X TAT TAA TTA 1.2+0.1 1/0 0.6 c.416T>G TAT TGA TTA 7.9+4.2 1/0/1 20.6 Resultados 78 Figura 30. Reconstitución de la actividad funcional PTEN en células. A. Las células COS-7 se cotransfectaron con plásmidos pRK5 que codifican diferentes variantes de PTEN (φ, vector vacío; wt, tipo silvestre, S59X, R130X, R233X, R335X y Y176X), solos o en combinación con el plásmido pSG5 HA-AKT. Se incluye la mutación Y176X como ejemplo de PTC que no induce readthrough. Tras 24h de incubación, las células se incuban en presencia o ausencia de G418 (200 µg/ml) durante 24h más. Los niveles de proteína HA-pAKT, HA-AKT y PTEN se midieron mediante Western Blot usando por separado el anticuerpo anti-pAKT (S473), anti-AKT y anti-PTEN (6H2.1). También se usa el anti-GAPDH como control de carga. Las flechas indican la migración de PTEN. B. Cuantificación del ratio pAKT/AKT de cada condición. La fosforilación de AKT se usa como medida indirecta de la actividad catalítica de PTEN. Los datos son la media de, al menos, dos experimentos independientes. Las barras corresponden a la media ±SD. Además, investigamos la acumulación nuclear de mutaciones PTC de PTEN tras la inducción del readthrough. Para estos experimentos, se utilizó una variante Q17P PTEN-GFP que se acumula en el núcleo [52]. Como se observa, en el background de Q17P, las mutaciones R130X y R233X se detectaron dentro del núcleo tras la inducción de readthrough, pero no la mutación Y176X (Figura 31A). Estos datos concuerdan con la detección de dichas variantes tras la inducción del readthrough (Figura 31B). Resultados 79 Figura 31. Reconstitución de la acumulación nuclear de PTEN. Las células COS-7 son transfectadas con diferentes variantes PTEN-GFP (etiqueta de GFP en la región C-terminal). Tras 24h de incubación las células se incuban en presencia o ausencia de G418 (200 µg/ml) durante 24h más. A. Las células se visualizan directamente con microscopia de fluorescencia. Las imágenes de arriba muestran la localización de PTEN-GFP wt y Q17P en células sin tratar. Las imágenes de abajo muestran la localización de las diferentes mutaciones en células tratadas y sin tratar con G418. Para cada variante de PTEN-GFP, las imágenes de la izquierda muestran la localización de PTEN-GFP (verde), y las imágenes de la derecha muestra la localización nuclear (azul, Hoechst). B. Monitorización de la reconstitución inducida por readthrough de las variantes PTEN-GFP. Western Blot de lisados de células COS-7 transfectadas con los plásmidos correspondientes. Los niveles de proteínas se analizaron usando el anticuerpo anti-PTEN (6H2.1) y anti-GAPDH como control de carga. En todos los casos, se muestra la imagen de un experimento representativo de, al menos, dos experimentos independientes. Estos resultados indican que la inducción del readthrough de algunos PTC tiene competencia para reconstituir proteínas funcionales de longitud completa de PTEN, tanto en términos de actividad fosfatasa PIP3 en células como en el transporte entre el citoplasma y el núcleo. Resultados 80 3. Análisis global de mutaciones hereditarias de PTEN: implicaciones en síndromes tumorales y de autismo. 3.1. Patrón de distribución de mutaciones missense de PTEN en pacientes con ASD y PHTS. Se han identificado 208 mutaciones missense en la línea germinal de PTEN vinculadas a enfermedades, asociadas principalmente con PHTS y variantes relacionadas (agrupado como PHTS) y, en menor medida, con ASD y síndromes de retraso del desarrollo (agrupado como ASD) (Figura 32A; Tabla 12). Alrededor del 14% de mutaciones missense de la línea germinal de PTEN se han encontrado tanto en pacientes con PHTS como con ASD (Figura 32A; Tabla 12). Esto indica una penetrancia variable para las mutaciones de PTEN en muchos casos [8, 282, 283]. El número de mutaciones germinales missense, comparado con los otros tipos de mutaciones de PTEN (mutaciones nonsense, delecciones, inserciones), es mayor en pacientes con ASD que en pacientes con PHTS [9, 284]. Las mutaciones missense de la línea germinal de PTEN identificadas se distribuyen a lo largo de los dominios PTP y C2, siendo la distribución de mutaciones missense predominante en el dominio PTP tanto en pacientes con PHTS como en ASD (Figura 32B). Esta observación concuerda con la importancia de la actividad catalítica de PTEN para de ejercer sus funciones biológicas. Al comparar los tres loops catalíticos del dominio PTP de PTEN (loop WPD, aminoácidos 88-98; loop P, aminoácidos 121-131; loop TI, aminoácidos 160-171), el número de sustituciones de aminoácidos en el loop P es 5 veces mayor en mutaciones asociadas a PHTS que a ASD. Sin embargo, al comparar los motivos de localización subcelular (NLM, aminoácidos 6-32), se observa un aumento de sustituciones de aminoácidos en ASD respecto a PHTS (Figura 32C). Resultados 81 Figura 32: A. Representación de los dominios de la proteína PTEN y la distribución de mutaciones missense de línea germinal de PTEN detectada en pacientes con ASD y PHTS. En la parte superior se muestran los exones de PTEN, los dominios de la proteína (los números se corresponde con la numeración de aminoácidos de PTEN: dominio PTP, aminoácidos 1-185; dominio C2, aminoácidos 186353; cola C-terminal, aminoácidos 354-403), NLM (aminoácidos 6-32) y los loops catalíticos (loop WPD, aminoácidos 88-98; loop P, aminoácidos 121-131; loop TI, aminoácidos 160-171). En los diagramas de barras (color rojo), se muestra la distribución de mutaciones missense de línea germinal de PTEN detectada en; pacientes con ASD (diagrama superior), pacientes con ASD y PHTS (diagrama de en medio) y en pacientes con PHTS (diagrama inferior). Las áreas azules indican los residuos que no son objeto de mutaciones. B. Distribución de mutaciones missense de la línea germinal de PTEN asociadas a ASD, ASD-PHTS y PHTS en los dominios PTP y C2. El porcentaje ha sido calculado respecto a los residuos 1353. C. Distribución de mutaciones missense de la línea germinal de PTEN en los loops catalíticos del dominio PTP (loop WPD, aminoácidos 88-98; loop P, aminoácidos 121-131; loop TI, aminoácidos 160171) y en la región NLM (aminoácidos 6-32). Se ha denominado frecuencia relativa aproximada al número de veces que cada sustitución de aminoácidos ha sido encontrada en pacientes. En general, el patrón de frecuencia relativa aproximada de mutaciones individuales es distinto en pacientes ASD, ASDPHTS y PHTS, aunque las frecuencias agrupadas de mutaciones en el dominio PTP y C2 son similares (Figura 33). En la cola C-terminal solo se han encontrado tres mutaciones en pacientes con PHTS o ASD (PHTS: P354Q y N356D; ASD: P391S). Resultados 82 Figura 33. A. Frecuencia de las mutaciones missense de línea germinal de PTEN detectada en pacientes. Se muestra la frecuencia relativa aproximada de mutaciones a lo largo de la secuencia de aminoácidos de PTEN (número de veces que cada sustitución de aminoácidos ha sido encontrada en pacientes). En los gráficos de la izquierda, se muestra el número de veces que una mutación missense de PTEN ha sido encontrado en pacientes ASD, ASD-PHTS y PHTS. Los números en el eje de abscisas corresponden a la numeración de los aminoácidos de PTEN. B. Frecuencia relativa aproximada de mutaciones missense de la línea germinal de PTEN asociadas a ASD, ASD-PHTS y PHTS en los dominios PTP y C2. El porcentaje ha sido calculado respecto a los residuos 1-353. Datos procedentes de la base de datos HGMD, COSMIC y literatura (ver referencias suplementarias). Resultados 83 3.2. Patrón funcional de mutaciones missense de PTEN encontradas en la línea germinal de pacientes con ASD y/o PHTS. Utilizando un sistema heterólogo de la levadura como una plataforma de alto rendimiento para evaluar in vivo la actividad fosfatasa PIP3 de PTEN (apartado de Materiales y Métodos), hemos realizado un análisis funcional de las mutaciones missense de PTEN asociadas a la línea germinal, incluyendo mutaciones encontradas en ASD (49 mutaciones), en ASD-PHTS (26 mutaciones) y en PHTS (133 mutaciones). En nuestro modelo de la levadura, la expresión de una forma hiperactiva de la subunidad catalítica de PI3K (p110α-CAAX) impide el crecimiento celular. La co-expresión de PTEN silvestre contrarresta este efecto, mientras que mutantes de PTEN catalíticamente inactivos o con pérdida de función no son capaces de rescatar el crecimiento de la levadura en presencia de p110α-CAAX (Tabla 12). Se ha monitorizado la actividad funcional de PTEN mediante el crecimiento de la levadura (Tabla 12; ver ejemplos en Figura 35) y mediante la ubicación en la membrana plasmática de un gen reporter GPF-Akt (Figura 34; Tabla 12) que se une a PIP3 [31, 278], y hemos comparado el impacto funcional de las mutaciones en PTEN y PTEN-L. Hemos establecido tres categorías funcionales para las mutaciones de PTEN: actividad completa = rescate de crecimiento total (+++, ++), 0-20% GFP-Akt en la membrana; actividad reducida = rescate de crecimiento parcial (+, +/-), 21-70% GFP-Akt en la membrana; y sin actividad = sin rescate de crecimiento (--), 71100% GFP-Akt en la membrana. Analizando los datos de forma global, se observa una mayor pérdida de actividad funcional de PTEN en pacientes PHTS y ASD-PHTS que en ASD, tanto con los datos obtenidos por la localización de GFP-Akt en la membrana plasmática (Figura 34A) como con los datos obtenidos mediante la monitorización del ensayo de crecimiento de la levadura (Figura 34B). Casi un 60% y un 50% de las mutaciones de la línea germinal de PTEN de pacientes PHTS y ASDPHTS, respectivamente, no presentan actividad funcional, frente a un 31% de mutaciones de pacientes ASD. Por otra parte, el 57% de las mutaciones ASD presentan actividad funcional, frente a un 25% y un 23% de mutaciones de pacientes PHTS y ASD-PHTS, respectivamente. Resultados 84 Figura 34. Análisis comparativo de las mutaciones de la línea germinal de PTEN en pacientes ASD, ASD-PHTS y PHTS. A. Diagrama de cajas de la actividad funcional de mutaciones de la línea germinal de PTEN en pacientes ASD, ASD-PHTS y PHTS, según la ubicación del gen reporter GFP-Akt en la membrana plasmática. Los bigotes representan el mínimo y máximo de todos los datos; las cajas representan los valores entre el cuartil 1 y 3, y la línea dentro de las cajas representa la mediana. Los datos se corresponden con los datos de la columna 4 de la Tabla 12. Actividad total, 0-24% de células PIP3 (+); actividad parcial, 25-74% de células PIP3 (+); no actividad, 75-100% de células PIP3 (+). B. Porcentaje de la actividad funcional de mutaciones de la línea germinal de PTEN en pacientes ASD, ASD-PHTS y PHTS, monitorizada mediante el crecimiento de la levadura. Las categorías funcionales se han establecido de la siguiente manera: actividad completa= rescate de crecimiento total (+++, ++), 020% GFP-Akt en la membrana; actividad reducida = rescate de crecimiento parcial (+, +/-), 21-70% GFPAkt en la membrana; y sin actividad= sin rescate de crecimiento (--),71-100% GFP-Akt en la membrana. Resultados 85 3.3. Análisis comparativo de las mutaciones de la línea germinal en PTEN y PTEN-L La expresión de la isoforma larga de PTEN (PTEN-L) revierte la toxicidad causada por PI3K de forma similar a PTEN silvestre (Figura 35; Tabla 12). Figura 35. Ejemplo de análisis funcional comparativo en la levadura de mutaciones de pacientes asociadas a ASD en PTEN y PTEN-L. Se induce la toxicidad en la levadura mediante la expresión inducible de la subunidad catalítica de PI3K (p100) en galactosa, y dicha toxicidad es revertida mediante la co-expresión de PTEN tipo silvestre (wt). Las mutaciones en los recuadros en rojo son catalíticamente inactivas (M1I, K6E, K6I, P38H) o parcialmente inactivas en PTEN (N12T, D22E, T26I, Y27C), pero son totalmente activas en PTEN-L, excepto P38H. En condiciones de no expresión (glucosa), las proteínas no se expresan y sirve para monitorizar que en todos los casos se plaquean la misma cantidad de células. Analizando los datos obtenidos sobre la actividad funcional en PTEN y PTEN-L, se observa una mayor actividad funcional de PTEN-L respecto a PTEN (Figura 36 superior). Hemos descubierto que mutaciones de pacientes ASD, ASD-PHTS y PHTS, que confieren a PTEN Resultados 86 pérdida de actividad fosfatasa PIP3 en células, no afectan a la actividad catalítica de PTEN-L (ASD, 57% de mutaciones con actividad funcional en PTEN frente a un 85% de mutaciones con actividad funcional en PTEN-L; ASD-PHTS, 28% de mutaciones con actividad funcional en PTEN frente a un 65% de mutaciones con actividad funcional en PTEN-L; PHTS, 8% de mutaciones con actividad funcional en PTEN frente a un 33% de mutaciones con actividad funcional en PTEN-L) (Figura 36; Tabla 12). Esto sugiere una mayor tolerancia a la mutación en PTEN-L que en PTEN. Figura 36. Comparativa de la actividad funcional de mutaciones missense de la línea germinal en PTEN y PTEN-L, monitorizada mediante el crecimiento de la levadura. El gráfico superior, indica la actividad funcional de todas las mutaciones analizadas en PTEN y PTEN-L; en el grafico inferior, se indica la actividad funcional de mutaciones missense en PTEN y PTEN-L en pacientes ASD, ASD-PHTS y PHTS. El número entre parentesis representa el número total de mutaciones analizadas. Resultados 87 Tabla 12: Listado de las mutaciones en PTEN y PTEN-L de ASD y PHTS analizadas in vivo. Mutación1 Enfermedad2 Actividad de PTEN3 Gotas/ Ojimetr4 Actividad de PTEN-L 3 PTEN silvestre +++ ++++/6 +++ M1I (*) ASD, CS -- ----/93 +++ M1V ASD -- -----/90 ++ M1L (*) ASD, Cáncer de mama y/o ovarios -- ---/98 K6E ASD -- +---/89 ++ K6I ASD -- +---/93 ++ N12T ASD ++ ++++/7 ++ N12I CS - ----/96 -- K13E CS - ----/95 ++ R14G ASD -- ++--/90 ++ R15S (*) ASD,CS -- ----/90 +- Y16H PHTS - ++--/17 ++ Q17E(*) ASD,CS +/- +---/45 -- D19Y Cáncer de mama +/- 10 ++ D22G CS/BRRS - ----/93 -- D22E ASD +- ++--/89 ++ L23F CS +/- ++--/55 -- L23V CS - ----/97 -- D24G PHTS - ----/79 D24H CS - ----/90 -- D24V CS - ----/94 -- D24Y(*) DD;BBRS -- ----/96 -- L25F(*) ASD,CS -- ----/94 -- T26I DD,macroc +- ++--/70 ++ T26P CS - 95,92 Y27N PHTS - ----/95 -- Y27C ASD -- ----/92 ++ P30L CS + ++--/9 + I32N CS - ----/90 -- A34D BRRS - ----/95 M35R JPS - ----/93 M35T PLS +/- ----/66 M35V CS - ----/93 DISCUSIÓN Discusión 97 1. Protocolo de mutagénesis dirigida estandarizado El estudio funcional de las proteínas afectadas por las alteraciones genéticas presentes en pacientes con cáncer o enfermedades hereditarias es esencial para el desarrollo de terapias eficaces [285, 286]. Sin embargo, todavía existe una gran brecha entre la recopilación de información genética a partir de muestras biológicas de pacientes y las posibilidades experimentales para estudiar y analizar las propiedades de las proteínas mutadas. Para poder analizar dichas mutaciones, un paso importante es generar colecciones de mutaciones de cDNA en plásmidos de expresión apropiados [279], y la mutagénesis dirigida se ha convertido en el método ideal para realizar este abordaje. El desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ha supuesto un gran avance en el desarrollo de procedimientos experimentales de mutagénesis dirigida [287, 288]. La mutagénesis de saturación es una metodología poderosa para crear colecciones definidas de variantes de proteínas para la experimentación clínica, y existen numerosos métodos de mutagénesis basados en la PCR [289, 290]. Sin embargo, la efectividad se ve comprometida cuando se requiere un gran número de mutaciones diferentes. El método de mutagénesis dirigida basada en PCR más utilizado en la actualidad es el método Quikchange. Según este método, los oligonucleótidos mutagénicos tienen que tener determinadas características: longitud entre 25-45 bases, temperatura de fusión igual o mayor a 78ºC (según la fórmula: Tm= 81.5 + 0.41 (%GC) – (675/N) - % Mismatch; siendo N el número de bases del oligonucleótido), contenido en GC mínimo de 40%, y presencia de una o más bases de C o G en sus extremos. Los oligonucleótidos resultantes suelen ser largos, lo que aumenta la posibilidad de creación de estructuras secundarias que dificultan la reacción de PCR y el coste de cada mutagénesis. Se han desarrollado métodos alternativos para aumentar la eficacia de la mutagénesis mediante PCR [291-293], pero el diseño es bastante complejo, los oligonucleótidos siguen siendo largos y presentan unos elevados costes y una metodología compleja. Estas limitaciones son importantes cuando se necesita generar un número elevado de mutaciones. En esta tesis, proporcionamos una breve visión de la utilidad de mutaciones específicas en el análisis experimental de las funciones de PTEN, una proteína relevante en enfermedad. Describimos un método estandarizado, rápido y simple de mutagénesis para realizar sustituciones de aminoácidos únicas y múltiples, basado en el método Quikchange (PCR inversa de un solo paso y tratamiento con la Discusión 98 enzima de restricción DpnI) (Figura 22; Tabla 8) [273, 274]. Nuestros resultados, validados con varios tipos de plásmidos y con cDNAs que codifican dos proteínas diferentes, indican que la utilización de oligonucleótidos mutagénicos estándar de 29 nucleótidos de longitud, independientemente de su Tm y contenido en G/C, proporcionan unas condiciones de amplificación y mutagénesis eficientes. Creemos que este método de mutagénesis dirigida estandarizada es ventajoso para obtener un gran número de mutaciones diferentes, y aplicable a cualquier proteína de interés, aunque la amplificación de cada cDNA puede tener distintos requerimientos y necesitar optimización. 2. Respuesta al readthrough de los PTCs de PTEN El gen PTEN es uno de los supresores tumorales más importantes, con una incidencia global de mutaciones asociadas a cáncer sólo superada por TP53. Como ocurre con otros supresores tumorales, existe un gran número de mutaciones somáticas y de línea germinal en PTEN asociadas a enfermedad que introducen en la proteína PTC, produciendo proteínas truncadas e inestables que no son capaces de inhibir la proliferación celular o promover la apoptosis (Figura 15 y 17). La terapia supresora de mutaciones nonsense generadoras de PTC es capaz de suprimir la terminación de la traducción causada por dichas mutaciones mediante el uso de agentes farmacológicos, como algunos antibióticos aminoglucósidos, permitiendo el readthrough del PTC. Se han llevado a cabo una gran variedad de estudios donde se demuestra la eficacia de los compuestos inductores de readthrough en modelos experimentales de diversas enfermedades genéticas, como la distrofia muscular de Duchenne (DMD) y la fibrosis quística (CF), entre otras [207, 210, 215, 217, 219]. En el caso del cáncer, se ha evaluado el potencial del readthrough de varios PTC que afectan a los genes supresores tumorales TP53 y APC, con resultados prometedores en la restauración funcional de ambos genes [208, 218, 249, 261]. Sin embargo, hasta la realización de nuestro trabajo, no se habían llevado a cabo estudios de readthrough en PTEN. Discusión 99 En este trabajo hemos definido la colección de mutaciones PTC (PTCome) de PTEN asociadas a enfermedad, y hemos realizado un análisis del readthrough traduccional y funcional del conjunto de PTC hallados en la línea germinal de pacientes PHTS (15 PTC se han encontrado en la línea germinal de pacientes PHTS, y 55 PTC se han encontrado en la línea germinal de pacientes y en muestras de tumores esporádicos) (Figura 23). Utilizando la geneticina (G418) como un inductor óptimo de readthrough, los resultados obtenidos indican un patrón heterogéneo de la respuesta del readthrough para los diferentes PTC de PTEN, obteniendo un rango de inducción de readthrough entre 0% y 30% con respecto a la expresión de PTEN tipo salvaje. De todos los PTC analizados, 12 PTC (17%) mostraron una eficiencia óptima-subóptima de readthrough (>10% de expresión), 13 PTC (18,6%) mostraron una eficiencia de readthrough baja (5%-9% de expresión), y 45 PTC (64,3%) una eficiencia del readthrough muy baja (0%-4% de expresión) (Tabla 9). A pesar de la gran variabilidad a la respuesta a G418, hemos observado que los tres codones de terminación no son igualmente susceptibles a readthrough: en general, los PTC de TGA producen niveles de readthrough más altos, seguidos de TAG y TAA (Figura 27). La mayoría de los PTC con una eficiencia de readthrough óptima-subóptima fueron PTC TGA (62,5%), seguido de TAG (37,5%) y TAA (0%) (Tabla 9). Esto está en línea con otros estudios comparativos de readthrough en los cuales el orden de eficacia de lectura de los PTC era: TGA>TAG>TAA [235, 251, 253]. La presencia de Cisteína (C) en la posición +4 (nucleótido +1 después del PCT) y una Adenina (A) en la posición -1 se ha propuesto como otros factores a tener en cuenta a la hora de mejorar la eficiencia del readthrough [242, 294]. Nuestros resultados indican que el nucleótido +4 C favorece el readthrough, pero sólo con una secuencia contexto de nucleótidos apropiada y con algunos aminoglucósidos inductores de readthrough. La incorporación durante la lectura traduccional de aminoácidos codificados por codones afines con respecto al codón con la mutación PTC puede afectar a la funcionalidad de la proteína resultante [212, 214, 280]. Esto es crucial en el caso de proteínas como PTEN, que muestran funciones deterioradas a causa de una gran variedad de sustituciones de un solo aminoácido a lo largo de la secuencia. Para analizar funcionalmente las variantes de PTEN producidas por readthrough, hemos tenido en cuenta la frecuencia de incorporación de aminoácidos para cada tipo de PTC [TGA: Arg (R), 64.5%; Cys (C), 17.7%; Trp (W), 17.9%. TAG: Gln (Q), 86.5%; Tyr (Y), 10.8%; Lys (K), 2%. Discusión 100 TAA: Gln (Q), 52%; Tyr (Y), 47.9%] (Roy 2016), y hemos realizado experimentos funcionales con las posibles variantes de PTEN generadas, asignando a cada una un Functional Score (FS) relativo. De todas las mutaciones PTC de la línea germinal de PTEN, un 57% (40 PTC) mostraron actividad funcional similar a PTEN tipo salvaje para cualquier aminoácido que se incorpore durante la lectura traduccional (FS=1); 39% (27 PTC) mostró actividad funcional reducida (FS=0.5) o nula (FS=0) para alguno de los aminoácidos que se incorporan, y 4% (3 PTC) muy poca o ausencia de actividad funcional (FS=0) (Tabla 10). Todas las variantes R233 y R335 mostraron una actividad funcional parecida a PTEN tipo salvaje, a excepción de la mutación R335W que mostró una actividad funcional reducida. Las variantes R130 y los PTC R130X, R233X y R335X no mostraron actividad funcional (FS=0) (Figura 28). Hemos definido una puntuación de la eficiencia funcional del readthrough, que tiene en consideración tanto la respuesta traduccional del readthrough, como la actividad funcional de las proteínas generadas por readthrough de dichas mutaciones. Esta puntuación de la eficiencia funcional del readthrough corrige el potencial de reconstitución funcional de PTEN de algunos PTC, cuyos valores de readthrough son óptimos o subóptimos (Figura 29, Tabla 10). El 86% (60 PTC) mostraron una puntuación de la eficiencia funcional del readthrough menor de 10; un 10% (7 PTC) mostraron una puntuación entre 10 y 20; y 4% (3 PTC) obtuvieron una puntuación funcional entre 20 y 30. Los PTC más frecuentes, R130X, R233X y R335X, muestran una puntuación la eficiencia funcional del readthrough de 12.6, 25.2 y 15.5, respectivamente, lo que indica que podrían ser PTC favorables para terapias basadas en readthrough. La reconstitución funcional de PTEN incluso se logró en el caso de PTC dirigida a residuos esenciales, como el residuo catalítico R130 que es altamente sensible a la pérdida de función por la sustitución de aminoácidos. Esto puede explicarse por la incorporación relativa de alta frecuencia, durante el readthrough de algunos PTC, del aminoácido de tipo salvaje (Tabla 11, [234]). En general, estos hallazgos sugieren que el tratamiento con inductores de readthrough es una alternativa prometedora a la terapia génica para pacientes portadores de mutaciones nonsense en genes relevantes. Nuestro análisis puede contribuir a la determinación de qué pacientes poseen una mayor probabilidad de beneficiarse de un posible tratamiento de precisión. Sin embargo, la aplicabilidad del readthrough dependerá del tipo de mutación, la ubicación del PTC, el contexto celular y la naturaleza del gen. Además, hay que tener en cuenta que nuestro análisis se ha llevado a cabo usando, principalmente, G418, un compuesto inductor de readthrough tóxico. El uso Discusión 101 prolongado de otros inductores, como la gentamicina, también produce importantes efectos secundarios [270, 271, 295], por lo que es necesaria la identificación y validación de fármacos inductores de readthrough con menor toxicidad. A este respecto, han sido descubiertos otros compuestos inductores de la lectura traduccional para trastornos genéticos causados por mutaciones nonsense [219]. Amlexanox, un agente antiinflamatorio que se administra por vía oral o tópica para tratar el asma, fue descubierto para inhibir la vía NMD e inducir la lectura de PTC [269]. Este compuesto es menos tóxico y activo a concentraciones más bajas que las requeridas para la geneticina. También se ha descubierto que la clitocina puede inducir la lectura traduccional dos o tres veces más que la gentamicina y geneticina [220, 268]. También se ha identificado la fenilpirazolanilida (Y-320), un compuesto que cuando se combina con G418 aumenta la eficiencia del readthrough [296], y la 2,6-diaminopurina (DAP), un compuesto con una alta eficiencia de corrección para mutaciones nonsense [297]. Otro obstáculo en el desarrollo de terapias supresoras de mutaciones nonsense es el nivel mínimo de proteína funcional necesaria para alcanzar niveles terapéuticos. Diferentes enfermedades poseen un umbral terapéutico distinto. Se han descrito diferentes inhibidores de la vía NMD, como la cafeína, el inhibidor SMG1 quinasa o NMD1, que aumentan la cantidad de mRNA portador del PTC. Junto con los inductores de readthrough pueden aumentar la cantidad de proteína funcional [219, 269, 298, 299]. Sin embargo, en muchos casos esta estrategia no restaura la funcionalidad de las proteínas ya que carecen de dominios cruciales. 3. Análisis global de mutaciones missense de la línea germinal de PTEN asociadas a ASD y PHTS El gen PTEN se encuentra mutado en la línea germinal de pacientes con síndromes de cáncer hereditario, caracterizados por trastornos en el desarrollo, deficiencias neurológicas, desarrollo de hamartomas múltiples, y con una mayor predisposición a desarrollar cáncer de mama y tiroides, entre otros. Estos síndromes se agrupan bajo el termino síndrome hamartoma tumoral de PTEN (PHTS). También se han encontrado mutaciones en la línea germinal de PTEN en individuos con macrocefalia, retardo en el desarrollo y desordenes del espectro autista (ASD) [9, 130, 148]. Discusión 102 En este trabajo hemos creado y analizado funcionalmente 208 mutaciones missense de la línea germinal de PTEN. Se han analizado dichas mutaciones agrupándolas en dos grupos: mutaciones de la línea germinal de pacientes con PHTS (133 mutaciones) y mutaciones de la línea germinal de pacientes con ASD y pacientes con ASD-PHTS (75 mutaciones) (Figura 32). Alrededor de un 14% de mutaciones missense se han encontrado tanto en la línea germinal de pacientes con PHTS como de pacientes con ASD. Las mutaciones missense se distribuyen a lo largo de los dominios PTP y C2, siendo dominantes en el dominio PTP tanto en pacientes PHTS como ASD (Figura 32B). La frecuencia relativa aproximada de mutaciones individuales a lo largo de la secuencia de aminoácidos de PTEN es distinta en pacientes PHTS y ASD; sin embargo, las frecuencias agrupadas en el dominio PTP y C2 son similares en pacientes PHTS y ASD (Figura 33). PTEN está codificado por un único gen, pero la traducción alternativa de su mRNA produce varias isoformas proteicas: PTEN (isoforma predominante) y otras proteínas con extensiones N-terminales (PTEN-L, principalmente), las cuales difieren en la localización subcelular y propiedades funcionales [6]. Aunque todavía se desconoce la penetrancia de las mutaciones de PTEN en pacientes ASD y PHTS, en términos de predisposición tumoral, se pueden hacer predicciones basadas en las propiedades funcionales de las variantes de PTEN. Sin embargo, no hay estudios globales de cómo mutaciones asociadas a PHTS y ASD pueden afectar a la función de PTEN-L. En este trabajo hemos analizado funcionalmente las mutaciones missense de PTEN asociadas a la línea germinal, utilizando el sistema heterólogo de la levadura como una plataforma de alto rendimiento para evaluar la actividad fosfatasa PIP3 de PTEN y PTEN-L (Tabla 12). El análisis realizado en PTEN, refleja una mayor pérdida de actividad funcional en pacientes PHTS que en ASD-PHTS, tanto con los datos obtenidos por la localización GFP-Akt en la membrana plasmática como con los datos obtenidos por la monitorización del ensayo de crecimiento de levadura. Casi un 60% de las mutaciones de la línea germinal de PTEN de pacientes PHTS y un 50% de las mutaciones de la línea germinal de PTEN de pacientes ASD-PHTS no presentan actividad funcional, frente a un 31% de mutaciones de pacientes ASD (Figura 34). Estos datos corroboran nuestrso estudios previos, y los datos de otros laboratorios, con un número más reducido de mutaciones , y que sugieren que, en general, las mutaciones en PTEN que afectan al neurodesarrollo podrían tener impacto patogénico menos grave relacionado con el cáncer. Discusión 103 Por otra parte, la comparación del impacto funcional de un grupo de mutaciones en PTEN y en PTEN-L indica una mayor tolerancia de PTEN-L a la pérdida de función. En el grupo de mutaciones de pacientes ASD, el 30% de mutaciones presentaban actividad funcional en PTEN frente a un 43% de actividad funcional en PTEN-L, y en el grupo de mutaciones de pacientes ASD-PHTS, el 7% de mutaciones presentaban actividad en PTEN frente a un 16% de mutaciones con actividad funcional en PTEN-L (Figura 36; Tabla 12). Estos resultados se podrían explicar, al menos en parte, por la mayor estabilidad intrínseca atribuida a PTEN-L, en comparación con PTEN [28], ya que muchas mutaciones patogénicas afectan a la estabilidad protéica de PTEN [28] (nuestros resultados no publicados). Además, también se ha atribuido una mayor actividad catalítica constitutiva a PTEN-L, en comparación con PTEN. En resumen, hemos observado que PTEN-L es menos susceptible a ser alterado por mutaciones potencialmente patogénicas que PTEN, lo que podría tener repercusiones importantes en estos grupos de pacientes [28] [300]. BIBLIOGRAFIA Bibliografía 111 1. 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