Papel de los receptores LXR en la diferenciación y especialización de macrófagos

Papel de los Receptores LXR en la Diferenciación y Especialización de Macrófagos Papel de los Receptores LXR en la Diferenciación y Especialización de Macrófagos TESIS DOCTORAL José A. Guillén Salgado 2015 José A. Guillén Salgado 2015 Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Consejo Superior de Investigaciones Cientificas UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA ULPGC ULPGC Los Macrófagos son células fagocíticas especializadas del Sistema Innato. En la presente Tesis Doctoral, se estudia la influencia de los Receptores Nucleares LXR en el desarrollo de las poblaciones de Macrófagos de la Zona Marginal del bazo en ratones. También se analiza la importancia de LXRa en la polarización de macrófagos en respuesta a las señales de diferenciación iniciadas por M-CSF y GM-CSF en macrófagos murinos. Así mismo, se describen los factores que intervienen en la regulación de CD209a, un gen marcador de células mieloides mononucleares activadas. UNIVERSIDAD*DE*LAS*PALMAS*DE*GRAN*CANARIA* * * DEPARTAMENTO*DE*PATOLOGÍA*ANIMAL,*PRODUCCIÓN*ANIMAL,* BROMATOLOGÍA*Y*TECNOLOGÍA*DE*LOS*ALIMENTOS* * DEPARTAMENTO*DE*CIENCIAS*CLÍNICAS* * * PROGRAMA*DE*DOCTORADO:* CLÍNICA*E*INVESTIGACIÓN*TERAPÉUTICA* * * * Memoria*para*Obtener*el*Grado*de*DOCTOR:* ! "PAPEL!DE!LOS!RECEPTORES!LXR!EN!LA!DIFERENCIACIÓN!Y! ESPECIALIZACIÓN!DE!MACRÓFAGOS"! * * presentada*por:* * José*Ángel*Guillén*Salgado* Lic.*Bioquímica* * * * * * * * Las*Palmas*de*Gran*Canaria,*a*15*de*Abril*de*2015* * José*A.*Guillén*Salgado* * * Fdo.*Doctorando* Dr.*Antonio*Castrillo*Viguera* * * Fdo.*Director* Dr.*Félix*I.*López*Blanco* * * Fdo.*Codirector* Dr.*Germán*Gallardo*Campos* * * Fdo.*Codirector* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * El* Trabajo* experimental* de* la* presente* memoria* fue* desarrollado* por* D.* José* A.* Guillén* Salgado* en* el* Departamento* de* Bioquímica,*Biología*Molecular,*Fisiología,*Genética*e*Inmunología*de* la* Facultad* de* Medicina* en* la* Universidad* de* Las* Palmas* de* Gran* Canaria*(ULPGC)*y*en*la*Unidad*Asociada*de*Biomedicina*del*Instituto* de* Investigaciones* Biomédicas* "Alberto* Sols",* Agencia* Estatal* del* Consejo*Superior*de*Investigaciones*Científicos*(CSIC).* * * Este*Trabajo*en*su*conjunto*ha*sido*desarrollado*gracias*a*las* ayudas* siguientes:* Beca* de* Formación* de* Profesorado* Universitario* (FPU)**BOE*2008*Julio\13026,**Proyecto*INNOVA*2010*de*la*Fundación* Universitaria*de*Las*Palmas*(FULP),*un*contrato*asociado*al*proyecto* S2010/BMD\2350*RAPHYME\CAM,*y*la*ayuda*de*proyectos*nacionales* financiados* por* el* MICINN* y* MINECO* SAF2008\00057* y* SAF2011\ 29244.* UNIDAD*DE*BIOMEDICINA** CSICNULPGC* * DEPARTAMENTO*DE*BIOQUÍMICA,* BIOLOGÍA*MOLECULAR,** FISIOLOGÍA,*GENÉTICA*E* INMUNOLOGÍA* * A los que me quieren Además de enseñar, enseña a dudar de lo que has enseñado José Ortega y Gasset 3.6.5 Transducción de células de la médula ósea y trasplante. 58 3.7 Análisis de la Expresión de ARN mensajero. 59 3.7.1 Extracción de ARN mensajero. 59 3.7.2 Estudio de perfil transcripcional mediante Microarray. 59 3.7.3 Análisis de ARN mensajero por RT-PCR. 60 3.7.4 Análisis de la inhibición de la expresión génica mediante siRNA. 61 3.8 Análisis de la Expresión de Proteínas. 62 3.8.1 Preparación de extractos proteicos. 62 3.8.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y Western Blot. 62 3.8.3 Citometría de Flujo. 62 3.9 Análisis "Chip-Seq". 64 3.9.1 Origen de los Chip-Seqs. 64 3.9.2 Análisis de los Chip-Seqs. 65 3.9.3 Búsqueda de secuencias de unión consenso. 65 3.10 Histología. 66 3.10.1 Obtención y conservación de la muestra. 66 3.10.2 Obtención de criosecciones. 66 3.10.3 Tinciones. 66 3.10.3.a Inmunofluorescencia. 66 3.10.3.b Inmunohistoquímica. 67 3.11 Análisis Estadístico. 67 4 RESULTADOS 69 4.1 Estudio de las poblaciones de Macrófagos del bazo. 71 4.2 Estudio de las señales de formación de la Zona Marginal del bazo. 71 4.3 Experimentos de rescate de fenotipo de la Zona Marginal. 73 4.4 Modelo de depleción de las poblaciones de Macrófagos por clodronato. 75 4.5 Generación de una cepa de ratones carentes de LXRα en las células hematopoyéticas (LXRαfl/fl/Vav-iCre+/-). 78 4.6 Estudio de la Zona Marginal en ratones carentes de LXRα en células hematopoyéticas (LXRαfl/fl/Vav-iCre+/-). 82 4.7 Reconstitución de la actividad de LXRα en progenitores hematopoyéticos mediante Lentivirus. 87 4.8 Estudio de la fagocitosis de plaquetas opsonizadas en la Zona Marginal. 87 4.9 Estudio transcripcional en Macrófagos en respuesta a M-CSF ó GM-CSF. 91 4.9.1 Expresión génica en respuesta a M-CSF. 92 4.9.2 Expresión génica en respuesta a GM-CSF. 96 4.10 La expresión de CD209a es inducida, principalmente, por GM-CSF en ratones y por IL-4 en humanos. 100 4.11 La expresión de CD209a es dependiente de LXRα en células BMDM. 100 4.12 La vida media de LXRα es menor que la de LXRβ. 101 4.13 La expresión de CD209a requiere de la expresión de LXRα, pero es independiente de activación farmacológica. 104 4.14 El Lipopolisacarido (LPS) inhibe la expresión de CD209a in vitro. 104 4.15 La captación de Manosa y Fucosa no presenta diferencias significativas entre células WT y LXRα-/-. 106 4.16 Estudio de la vía de señalización de GM-CSF. 108 4.17 Factores de Transcripción que intervienen en la regulación de la expresión de CD209a. 111 4.18 Los Factores de Transcripción STAT5, PU.1, C/EBPα y LXRα intervienen en la regulación de CD209a. 115 5 DISCUSIÓN 119 6 CONCLUSIONES 133 REFERENCIAS 137 LISTA DE FIGURAS. ______________________________________________________________ ! ! Figura'1.1.'Origen'ontogénico'propuesto'para'los'macrófagos.' Figura'1.2.'Monocitos'sanguíneos'murinos.' Figura'1.3.'Esquema'de'los'principales'tipos'de'Células'Dendríticas.' Figura' 1.4.' Modelo' actual' de' la' acción' de' las' citoquinas' GMBCSF' y' MBCSF' sobre' el' número'y'fenotipo'de'macrófagos'y'células'dendríticas.'' Figura'1.5.'Representación'esquemática'del'receptor'de'GMBCSF'(GMR)'humano'y'sus' módulos'de'señalización.' Figura'1.6.'Localización'genómica'y'estructura'proteica'de'CD209.' Figura'1.7.'Ultraestructura'del'bazo'murino.' Figura'1.8.'Modelo'por'el'que'los'factores'de'transcripción'determinantes'de'linaje' modifican' la' cromatina' y' permiten' la' unión' de' factores' de' transcripción' dependientes'de'señal.' Figura' 1.9.' Esquema' de' la' organización' en' dominios' de' un' receptor' nuclear' y' mecanismos''de'acción'de'heterodímeros'RXR.'' Figura'1.10.'Representación'esquemática'de'la'estructura'de'LXR'y'la'similitud'entre' las'isoformas'LXRα'y'LXRβ.'' Figura'3.1.'La'recombinasa'Cre'induce'la'escisión'de'la'región'flanqueada'con'sitios' LoxP.'' Figura'3.2.'Estrategia'de'cruce'para'la'obtención'de'ratones'LXRαfl/fl'iCre+/B.'' Figura'3.3.''Representación'esquemática'del'promotor'sintético'macrófagoBespecífico'' SPB146'y'de'los'plásmidos'lentivirales.' Figura'4.1.'Las'poblaciones'de'macrófagos'de'la'zona'marginal'del'bazo'dependen'de' LXRα"para$su$desarrollo.' Figura'4.2.'La'expresión'de'citoquinas'implicadas'en'la'formación'del'bazo'y'la'zona' marginal'no'presenta'diferencias'entre'WT'y'DKO.'** Figura' 4.3.' Trasplantes' con' médula' ósea' de' ratones' que' expresan' LXRα" permiten( recuperar'las'poblaciones'de'macrófagos)de)la)zona)marginal)del)bazo.' Figura'4.4.'La#activación#farmacológica#de#LXRα" acelera&la&cinética&de&repoblación& de#las#poblaciones#de#macrófagos#del#bazo.!* Figura'4.5.'Genotipado*para*la*obtención*de*las*cepas*de*ratones*LXRαBFlox%y%VavB iCre.' Figura% 4.6.% Genotipado% de% los% descendientes% del% cruce% de% ratones% LXRαBFlox% y% VavB iCre.&' Figura'4.7.'Análisis'de'la'expresión'de'LXRα'a'nivel'de'ARNm'en'varios'tejidos.' Figura'4.8.'Análisis'de'la'expresión'de'LXRα'a'nivel'de'proteína'en'varios'tejidos.' Figura!4.9.$La$escisión$de$LXRα!en#células#hematopoyéticas#determina#la#ausencia#de# macrófagos*de*zona*marginal*del*bazo.* Figura'4.10.'La'formación'de'la'zona'marginal'demuestra'haplosuficiencia'(I).' Figura'4.11.'La'formación'de'la'zona'marginal'demuestra'haplosuficiencia)(II).)' Figura'4.12.'Ratones'LXRαB/B!trasplantados)con)HSCs)transfectadas(con(LentiBSPBGFP$ muestran,*8*semanas*después,*en*torno*al*40%*de*monocitos*en*sangre*GFP*positivos."* Figura' 4.13.' Recuperación' parcial' de' las' poblaciones' de' MMM' (CD169+)" y!MZM# (MARCO+/TimB4+)"en"ratones"trasplantados"con"HSCs"tratadas"con"lentiBSPBLXRα.!* Figura'4.14.'Captura'de'plaquetas'opsonizadas'en'la'Zona'Marginal.' Figura'4.15.'Diagrama'de'Venn'y'Mapa'de'Calor'de'los'genes'upregulados!por$MBCSF$ en#células#BMDM#WT#y#LXRαB/B!.' Figura'4.16.'Diagrama'de'Venn'y'Mapa'de'Calor'de'los'genes'reprimidos'por'MBCSF$ en#células#BMDM#WT#y#LXRαB/B!.' Figura'4.17.'Diagrama'de'Venn!y"Mapa"de"Calor"de"los"genes"inducidos"por"GMBCSF$ en#células#BMDM#WT#y#LXRαB/B!.' Figura'4.18.'Diagrama'de'Venn'y'Mapa'de'Calor'de'los'genes'reprimidos'por'GMBCSF$ en#células#BMDM#WT#y#LXRαB/B!.' Figura'4.19.'La'expresión'de'CD209a'en'células'BMDM'depende'de!GMBCSF$y$LXRα.' Figura'4.20.'LXRα"es#sensible#a#CHX,#lo#que#afecta#a#la#expresión#de#CD209a.' Figura'4.21.'La'expresión'de'CD209a'en'respuesta'a'GMBCSF'se've'afectada'por'un' inhibidor' farmacológico' de' LXR' (GW233)' y' por' LPS,' pero' no' por' un' agonista' especifico'de'LXR'(GW3965).' Figura' 4.22.' La' captación' de' Manosa' y' Fucosa' no' muestra' diferencias' en' células' derivadas(de(la(médula(ósea%WT%y%LXRαB/B.' Figura' 4.23.' Efecto' de' la' inhibición' de' los' principales' intermediarios' de' la' señalización+de+GMBCSF$sobre$la$expresión$de$CD209a.' Figura'4.24.'La'expresión'de'CD209a'requiere'de'la'fosforilación'de'Jak2/STAT5.' Figura'4.25.'Estudio'de'la"unión"de"factores"de"transcripción"al"gen"de"CD209a"(I).' Figura'4.26.'Estudio'de'la'unión'de'factores'de'transcripción'al'gen'de'CD209a'(II).' Figura'4.27.'El'silenciamiento'de'LXRα,"PU.1"C/EBPα!y"STAT5"mediante"siRNA"inhibe" la#expresión#de#CD209a#inducida"por"GMBCSF.' ! LISTA DE TABLAS. ______________________________________________________________ TABLA'1.1.'Principales'poblaciones'de'macrófagos.' TABLA'3.1.'Cebadores.'' TABLA'3.2.'Anticuerpos.' TABLA' 4.1.' El' análisis' ontogénico' revela' que' el' tratamiento' con' MBCSF' induce' la' expresión,'principalmente,'de'genes'de'la'división'celular.** TABLA' 4.2.' El' análisis' ontogénico' revela' que' el' tratamiento' con' GMBCSF' induce' la' expresión,''principalmente,'de'genes'de'la'respuesta'inflamatoria'y'la'quimiotaxis.** * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ABREVIATURAS. ______________________________________________________________ ABC Familia de Transportadores de Membrana de unión a ATP tipo “Cassette”. AF Dominio de Función Activadora. AP Proteína Activadora. Api6 Inhibidor de la Apoptosis en Macrófagos. Apo Apolipoproteína. ADN Ácido Desoxirribonucleico. ADNc Ácido Desoxirribonucleico Complementario. APC Células Presentadoras de Antígenos. ARN Ácido Ribonucleico. ARNm Ácido Ribonucleico Mensajero. BMDC Células Dendríticas Derivadas de Médula Ósea. BMM Macrófagos Derivados de Médula Ósea. BSA Albúmina de Suero Bovino. CCL Ligando de Quimioquinas C-C. CD Cluster of Differentiation. cDC Células Dendríticas Convencionales. CDP Precursor Común de Células Dendríticas. CETP Proteína Transportadora de Ésteres de Colesterol. ChIP Inmunoprecipitación de Cromatina. ChIP-Seq Secuenciación de la Inmunoprecipitación de la Cromatina. CLP Progenitor Linfoide Común. CLRs Receptores de Lectina tipo C. CMP Progenitor Mieloide Común. COX Ciclooxigenasa. CRD Dominio de Reconocimiento de Carbohidratos. CSF1 Factor Estimulador de Colonias 1 (sinónimo de M-CSF). CSF1R Receptor del Factor Estimulador de Colonias 1. CX3CR1 Receptor 1 de Quimioquina CX3. Cyp7a1 Citocromo P450, familia 7, subfamilia A, polipéptido 1. DAMP Patrones Moleculares Asociados a Daño. DAPI 4,6-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato. DBD Dominio de unión a ADN. DC Célula Dendrítica. DEPC Dietil Pirocarbonato. DKO Double Knock-Out. DMEM Dulbecco’s Modified Eagle's Medium. DMSO Dimetilsulfóxido. DR Repetición Directa. ECL Enhanced Chemiluminescence. EDTA Etilendiamino Tetra-Acetato Sódico. ERK Extracellular signal-Regulated Kinase. FAS Sintasa de Ácidos Grasos. FBS Suero Fetal Bovino. FC Citometría de Flujo. FITC Isotiocianato de Fluoresceína. FSC Tamaño (forward scatter). GFP Proteína Verde Fluorescente. GM-CSF Factor Estimulador de Colonias de Macrófagos y Granulocitos. GO Ontología Génica. HDAC Deacetilasa de Histona. HDL Lipoproteínas de Alta Densidad. HRE Elemento de Respuesta Hormonal. HSC Células Madre Hematopoyéticas. ICQ Inmunocitoquímica. IF Inmunofluorescencia. IL Interleuquina. iNOS Sintasa de Óxido Nítrico Inducible. IRF Factor Regulador del Interferón. IVIG Inmunoglobulina Intravenosa. JNK c-Jun N-terminal Kinase. KO Knock-Out. LBD Dominio de unión a ligando. LC Células de Langerhans. LDTF Factores de Transcripción determinantes de Linaje. LDL Lipoproteínas de baja densidad. LFA-1 Antígeno asociado a la función de Linfocitos 1. LP Lámina Propia. LPL Lipoproteína Lipasa. LPS Lipopolisacárido Bacteriano. LXR Receptores X Hepáticos. LXRE Elemento de Respuesta a LXR. MAPK Proteína Kinasa Activada por Mitógenos. M-CSF Factor Estimulador de Colonias de Macrófagos. MCP Proteína Quimioatrayente de Monocitos. MDP Progenitor de Macrófagos y Células Dendríticas. MDSC Células Supresoras de origen Mieloide. MHC Complejo Mayor de Histocompatibilidad. MMM Macrófagos Metalofílicos de la Zona Marginal. MMP Metalopeptidasa de Matriz. NAD Nicotinamida Adenina Dinucleótido. MZ Zona Marginal del Bazo. MZM Macrófagos de la Zona Marginal. N-CoR Proteína co-represora de Receptores Nucleares. NF-kB Factor Nuclear kappa de Células B. NK Natural Killer. o/n Toda la noche. PAMP Patrones Moleculares Asociados a Patógenos. PBS Tampón Fosfato Salino. PI3K Fosfatidilinositol 3 kinasa. PLTP Proteína Transportadora de Fosfolípidos. ROS Especies de Oxígeno Reactivo. PPAR Receptores Activados por Proliferadores Peroxisomales. PRR Receptor de Reconocimiento de Patrones. RPMI Medio de cultivo celular desarrollado en Roswell Park Memorial Institute. RT Room Temperature - temperatura ambiente (~20ºC). RT-qPCR Retrotranscripción y Reacción en Cadena de la Polimerasa a Tiempo Real. RXR Receptores X de Retinoico. 1.!Introducción! ! 5 Los monocitos se han considerado, de manera clásica, eslabones intermedios entre células HSC y otras células maduras, que se originan en la médula ósea y que tras desplazarse por la sangre dan lugar a macrófagos tisulares (van Furth and Cohn, 1968) y a células dendríticas (Randolph et al., 1999; Sallusto and Lanzavecchia, 1994), probablemente pasando por un estadio intermedio denominado progenitor de macrófagos y células dendríticas (MDP, Macrophage and Dendritic cell Progenitor) (Fogg et al., 2006). Sin embargo, recientemente, estudios genéticos y de mapeo de destino celular sugieren que, en realidad, la mayoría de poblaciones de macrófagos y monocitos representan líneas fagocíticas diferentes (Hashimoto et al., 2013; Schulz et al., 2012; Yona et al., 2013). Mientras que los monocitos circulantes derivan de HSC y progenitores intermediarios que ocupan nichos especializados en la médula ósea (Mercier et al., 2012), muchas de las poblaciones de macrófagos tisulares residentes, incluyendo las del pulmón, hígado, cerebro, peritoneo, médula ósea y algunas específicas del bazo se establecen antes del nacimiento a partir del saco vitelino (Schulz et al., 2012) o precursores de hígado fetal (Guilliams et al., 2013). Estos macrófagos son independientes del factor de transcripción c-Myb y, por tanto, aparecen en el desarrollo embrionario de ratones c-Myb-/- que carecen de HSC y, por tanto, de monocitos. Fenotípicamente, las poblaciones de macrófagos que proceden del saco vitelino se distinguen por ser F4/80high, mientras que las poblaciones que proceden de HSCs son F4/80low (Schulz et al., 2012). Para estudiar si los macrófagos F4/80high procedentes del saco vitelino se mantienen durante la edad adulta o se renuevan a partir de HSCs, el grupo de Geissmann eliminó las HSCs mediante la deleción condicional de c-Myb en adultos y trasplantó médula ósea c-Myb+/+ para establecer una quimera. Tras 3 meses, todos los monocitos F4/80low CD11bhigh procedían de la médula ósea donante, mientras que los macrófagos F4/80high en el hígado (células de Kupffer), piel (células de Langerhans) y cerebro (microglía), y también subtipos del pulmón, riñón, páncreas y bazo, eran del receptor (Schulz et al., 2012). Éste, y otros experimentos, apoyan la idea de que existen dos linajes de macrófagos en el ratón: uno que procede del saco vitelino y da lugar a los macrófagos F4/80high que se suelen asociar con estructuras epiteliales y otro que procede de la médula ósea y da lugar a macrófagos F4/80low CD11bhigh y células dendríticas. Por ello, el grupo de Geissmann propone restringir el uso del término "macrófago" a aquellas poblaciones de macrófagos residentes con desarrollo c-Myb independiente (macrófagos F4/80high), y usar el término de "células mieloides" a los macrófagos c-Myb dependientes (F4/80low CD11bhigh). En esta Tesis doctoral, sin embargo, no adoptaremos aún esta nomenclatura y usaremos el término macrófago en su acepción clásica más amplia. Esta nueva hipótesis debe aún resolver, sin embargo, cómo se mantienen y renuevan (si lo hacen) estas poblaciones de macrófagos independientes de la médula ósea. Es de destacar que durante mucho tiempo se ha considerado a los macrófagos como células sin capacidad de dividirse, que se renovaban a partir de los monocitos circulantes (van Furth and Cohn, 1968). Teniendo en cuenta que los macrófagos tisulares tienen un origen independiente del monocito (Schulz et al., 2012), es necesario conocer cómo es el mantenimiento y renovación de estas poblaciones a lo largo de la vida del individuo. ! 6 Figura'1.1.'Origen'ontogénico'propuesto'para'los'macrófagos.' Según!investigaciones!recientes,!las!poblaciones!de!macrófagos!tienen!dos!orígenes!diferentes:!un!origen! embrionario! que! daría! lugar! a! las! poblaciones! de! macrófagos! residentes! (F4/80high)! y! un! origen! hematopoyético!en!la!médula!ósea!adulta!que!daría!lugar!a!las!poblaciones!de!macrófagos!derivados!de! monocitos!(F4/80low),!tal!y!como!se!detalla!en!el!texto.!En!lesiones!moderadas,!en!las!que!hay!una!cierta! pérdida!de!macrófagos!residentes!y!no!se!produce!reclutamiento!de!monocitos!sanguíneos,!la!repoblación! ocurre! a! partir! de! la! población! inicial! de! macrófagos! residentes.! Los! macrófagos! residentes! pueden! regenerarse!localmente!(flecha!circular),!por!ejemplo,!durante!una!infección!por!nemátodos!en!la!cavidad! pleural!o!en!casos!de!inflamación!del!sistema!nervioso.!En!el!caso!de!la!placa!aterosclerótica,!se!produce!la! proliferación! de! macrófagos! locales! y! macrófagos! derivados! de! monocitos,! los! cuales! proliferan! localmente!y!dan!lugar!a!un!mosaico!de!macrófagos!o!"macrophage*chimaera",!consistente!en!una!mezcla! de!macrófagos!de!origen!embrionario!y!adulto.!Este!proceso!también!ocurre!en! un!modelo!murino!de! infección! de! piel! por! el! virus! de! herpes! simplex! (HSV).! Sin! embargo,! aún! no! se! sabe! si! este! mosaico! permanece!en!el!tiempo!o!es!un!añadido!temporal!a!la!población!local.!En!el!caso!de!lesiones!severas!que! impliquen!la!pérdida!de!la!población!de!macrófagos!residentes!(aspa!roja),!la!repoblación!tiene!lugar!a! partir! de! monocitos! sanguíneos,! como! por! ejemplo! en! el! caso! de! sobreexposición! de! la! piel! a! la! luz! ultravioleta.! HSC! =! Hematopoietic* Stem* Cell,! MDP! =! Myeloid* Derived* Progenitor.! Elaborado! a! partir! de! Ginhoux!and!Jung,!2014!y!de!Neumann!and!Wekerle,!2013.! !"#$%&'()*'+$% ,-./*"%0!)"% !"#$%"&'"( #")*"'+)#,')-#( !"#$%"&'"( +)#,')-#( *)!'&($#,%,."#&( /'(0.1'$2*)$'&( &./1"#( +-!( '*"'&(*)!'&( $#,%,."#&(( 3&$( +'/'$)*'( *#4)-'( ,"#102"3$% 1)!'.)+()% ,"#102"3$% .)1'&".$%.)% ,$+$#'($% ,56789(+:;5<=;=( .>5<:6?@5<:676( ,56789(&5A5<=( "56:@B?789( "56:@B?789( "56:@B?789( 1.!Introducción! ! 7 Varios grupos de investigación han encontrado evidencias que podrían explicar este aspecto de la biología del macrófago. Según estos autores, el macrófago tiene cierta capacidad de proliferar y autorenovarse, tanto en condiciones basales (Hashimoto et al., 2013) como ante estímulos concretos, como infecciones helmínticas (Jenkins et al., 2011; Robbins et al., 2013) a lo largo de la vida del individuo. Un esquema del origen y mantenimiento de las poblaciones de macrófagos se representa en la Figura 1.1. 1.4.1 Monocitos. Los monocitos son células mieloides que se encuentran de manera abundante en la sangre, médula ósea y bazo, y que no proliferan en condiciones basales (Swirski et al., 2009). Se originan dependientes del factor CSF1 y su receptor CSF1R, también denominado CD115 (aunque esto se ha puesto en duda, véase Ginhoux et al., 2010) a partir de precursores hematopoyéticos, y están equipados con receptores de citoquinas y de reconocimiento de patógenos que median su quimiotaxis y extravasación desde la sangre a los tejidos durante una infección. Constituyen alrededor de un 10 % de los leucocitos de la sangre en humanos, y un 4 % en ratones (Auffray et al., 2009). Existen dos subtipos funcionales de monocitos (ver Figura 1.2), unos denominados "inflamatorios", caracterizados por los marcadores CD115+ Ly-6Chigh, y otros denominados "patrolling", que se distinguen por los marcadores CD115+ Ly-6Clow (Auffray et al., 2009). Los monocitos Ly-6Chigh son los más numerosos. Expresan receptor de quimioquinas CCR2, la molécula de adhesión L-selectin (CD62L) y bajos niveles del receptor de quimioquinas CX3CR1 (Auffray et al., 2009). En humanos, su equivalente son los monocitos CD14+. Acuden selectivamente a los tejidos inflamados y nódulos inflamados in vivo y producen una respuesta de tipo M1 con altos niveles de TNF-α e IL-1, por lo que se denominaron "inflamatorios" (Auffray et al., 2009). Dan lugar a macrófagos y DCs en varios modelos de infección. Por ejemplo, en el caso de infección por Listeria monocytogenes, los monocitos Ly-6Chigh dan lugar a un tipo de DCs denominado Tip-DCs (TNFα/iNOS-producing DCs) que producen mediadores inflamatorios como TNFα, óxido nítrico y ROS (NarniMancinelli et al., 2007). En el caso de infección con Toxoplasma gondii, los monocitos Ly6Chigh se diferencian a macrófagos de mucosa que a diferencia de las Tip-DCs son CD11c- (Dunay et al., 2008). En el contexto de un tumor, por otro lado, los monocitos Ly-6Chigh forman parte de la población de las células supresoras de tipo mieloide (MDSC, Myeloid-Derived Suppressor Cells), que interviene en el desarrollo de anergia de las células T hacia el tumor. En particular, las MDSC impiden las respuestas antígenoespecíficas de las células T CD8+ mediante un mecanismo molecular que involucra la producción de NO y ROS (Auffray et al., 2009; Bronte et al., 2000, 1999; Gallina et al., 2006; Rössner et al., 2005). La inhibición de la señalización CCL2-CCR2 bloquea el ! 8 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura'1.2.'Monocitos'sanguíneos'murinos.' Panel!A.!Se!muestra!un!monocito!sanguíneo!Ly_6Chigh!que!presenta!mayor!tamaño!(FSC)!y!complejidad! (SSC),!que!los!monocitos!Ly_6C!low.! Panel!B.!Se!muestran!monocitos!sanguíneos!Ly_6Clow.! Obtenido!de!Swirski!et!al.,!2009.! A.! B. ! ! ! FSC:!118.8!±!3.0!! SSC:!51.4!±!2.3! ! ! FSC:!133.2!±!4.4!! SSC:!64.3!±!4.7! 1.!Introducción! ! 9 reclutamiento de monocitos inflamatorios, prolongando la vida de ratones con tumor (Qian et al., 2011). Los monocitos Ly-6Clow son menos numerosos. Se caracterizan por tener menor tamaño, expresar el receptor de quimioquinas CX3CR1, LFA-1 y CD43, y carecer de expresión de CCR2 y L-selectina (Geissmann et al., 2003). También se denominan residentes porque tienen una vida media más larga in vivo y se localizan tanto en tejido normal como inflamado. Mediante experimentos de microscopía intravital, se descubrió que los monocitos Ly-6Clow patrullan los vasos sanguíneos, rodando por el endotelio gracias a la integrina LFA-1 y al receptor de quimioquinas CX3CR1 (Auffray et al., 2007). Esto podría tener el objetivo de vigilar posibles patógenos y fagocitar células muertas y lípidos oxidados (Auffray et al., 2007). En el caso de una infección por Listeria monocytogenes, los monocitos Ly-6Clow se extravasan rápidamente y empiezan a producir TNF-α a las 2 horas de la infección. Tras 8 horas, sin embargo, los mayores productores de TNF-α son los monocitos Ly6Chigh. Posteriormente, los monocitos Ly-6Clow empiezan un programa de activación alternativa con marcadores de tipo M2 como Arginasa, Mgl2 e IL-4Rα (Auffray et al., 2007). Este tipo de respuesta se relaciona con el remodelado tisular, la reparación de heridas y la inmunomodulación (Allavena et al., 2008). Por otro lado, tras un infarto de miocardio, los monocitos Ly-6Clow expresan factor de crecimiento vascular-endotelial (VEGF, vascular-endothelial growth factor). En este contexto, se piensa que intervienen en la recuperación del tejido promoviendo la atracción de miofibroblastos, la angiogénesis y la deposición de colágeno (Nahrendorf et al., 2007). Sin embargo, su rol en la angiogénesis aún necesita un estudio más profundo (Geissmann et al., 2010). Por tanto, los monocitos son células de una gran plasticidad, capaces de responder a distintas señales y dar lugar a formas más especializadas, lo que en último término permite una respuesta más eficiente a la inmensa diversidad de retos inmunológicos posibles. 1.4.2 Células Dendríticas. Las células dendríticas se originan a partir de precursores de la médula ósea, si bien no existe consenso si proceden de uno o varios de ellos, tales como MDP (Monocyte/macrophage and Drenditic cell Precursor), CDP (Common Dendritic Cell Precursor) o monocitos (Auffray et al., 2009; Varol et al., 2007). Las células dendríticas se suelen dividir en tres grupos: células de Langerhans (LC), DCs convencionales CD11chigh (cDC, conventional DC) y DCs plasmacitoides (pDC, plamacytoid DC) (Shortman and Liu, 2002). A estos grupos se les añaden otros definidos más recientemente, como las Tip-DCs (Narni-Mancinelli et al., 2007) o las DCs derivadas de monocitos (MO-DCs, MOnocyte-derived Dendritic Cell) (Cheong et al., 2010) (ver Figura 1.3). ! 10 Figura'1.3.'Esquema'de'los'principales'tipos'de'Células'Dendríticas.' En!la!médula!ósea,!el!precursor!MDP!da!lugar!al!precursor!CDP!y!a!monocitos.!CDP!da!lugar!a!pre_cDC!y! pDC!en!sangre,!que!se!desplazan!a!los!tejidos!linfoides!para!dar!lugar!a!cDCs!y!pDCs!.!El!monocito!por!su! parte!da!lugar!a!MO_DCs!y!TIP_DCs.!Su!papel!como!precursor!de!células!de!Langerhans!está!cada!vez!más! discutido! (ver! texto).! MDP! (monocyte/macrophages* and* DC* precursor),! CDP! (Common* Dendritic* Cell* Precursor),! pre_cDC! (precursor! de! Células! Dendríticas! Convencionales),! pDC! (Células! Dendríticas! Plasmacitoides),! MO_DC! (Células! Dendríticas! derivadas! de! Monocitos),! TIP_DC! (TNF/iNOS?Producing* Dendritic*Cells).!Modificado!a!partir!de!Geissmann!et!al.,!2010.! !"#$%&'()*&' )&+,-*' !"#$%&'()*+*',-*( ./+0123/+4( ./*%' 0*1/#2'/+3%&!' -,!$&'( )*$&'( %&'(5&'( 0*1/#2)'%/+32/#*)' 5&'( '&!( )&!( 1.!Introducción! ! 11 Los distintos tipos se distinguen por su localización y por sus marcadores de superficie. Por ejemplo, en el bazo de ratón los subtipos que podemos encontrar son pDC (B220+ CD11cint GR1−), MO-DC (B220− CD11cint GR1±), y cDC (B220− CD11chigh GR1−). Las cDC se suelen dividir en CD8α+ (CD11chigh, B220−, DEC205+, CD24high, CD11b−) y CD8α− (CD11chigh, B220−, DEC205−, CD24low, CD11b+,CD172+,CD4±) (Fuertes Marraco et al., 2012). Las LC se encuentran en la epidermis y se han clasificado tradicionalmente como células dendríticas. Sin embargo, dependen de IL-34 y CSF1R durante su desarrollo (Greter et al., 2012b; Wang et al., 2012), no tienen un origen monocítico (Varol et al., 2007) sino embrionario (Hoeffel et al., 2012) y su programa transcripcional (Satpathy et al., 2012) parece situarlas más dentro del linaje de los macrófagos residentes, por lo que su clasificación como dendríticas responde más a motivos históricos que funcionales. Sin embargo, su clasificación como macrófagos tampoco parece clara, ya que presentan capacidad migratoria, y tras migrar, adquieren la expresión de marcadores típicos de cDCs como Flt3, CCR7 y Zbtb46 (Miller et al., 2012). Las cDCs fueron descritas originalmente por R. Steinman y A. Cohn (Steinman and Cohn, 1973). Pueden ser de dos tipos: migratorias o residentes. Las cDC migratorias capturan patógenos en el sitio de infección y rápidamente se desplazan al nódulo linfático más cercano para la presentación del antígeno. También son importantes en la regulación de la tolerancia a lo propio (Idoyaga et al., 2013). Según los marcadores de superficie, las cDC migratorias son CD4-CD8y se subdividen en CD11b+, CD11bCD103y CD103+ (Idoyaga et al., 2013). Las cDC residentes actúan más bien como centinelas en órganos linfoides secundarios y otros tejidos para la captura y presentación del antígeno in situ (Fuertes Marraco et al., 2012). Según los marcadores de superficie, las cDCs residentes, a su vez, se subdividen en dos (CD8-, CD8+) (Idoyaga et al., 2013; Shortman and Heath, 2010) o tres subgrupos (CD4+CD8-, CD4-CD8y CD4CD8+) (Vremec et al., 2000). Las pDCs representan un linaje independiente según su morfología, expresión génica y habilidad para secretar grandes cantidades de interferón tipo I en respuesta a virus (Robbins et al., 2008; Siegal et al., 1999). A diferencia de las cDCs, son ineficientes en la captura y presentación de antígenos. Además, en contraste a la apariencia "dendrítica" de las cDCs, las pDCs exhiben una forma esférica característica similar a células plasmáticas. Según sus marcadores de superficie, las pDCs se distinguen de cDCs por la expresión de B220, Siglec-H y Bst2 en ratón, y BDCA2 (CD303) en humanos (Satpathy et al., 2012). Las células dendríticas derivadas de Monocitos, Mo-DCs, se descubrieron por primera vez en 1994 (Sallusto and Lanzavecchia, 1994), y su relevancia como DCs in vivo ha sido cuestionada por distintos investigadores desde entonces. El grupo de R. Steinman, sin embargo, las define como auténticas células dendríticas por varias razones. Primero, en términos de motilidad, son células no adherentes que continuamente forman y retraen ! 12 extensiones, de manera idéntica a como lo hacen las células dendríticas en las áreas T de los nódulos linfáticos (Lindquist et al., 2004). Además, se concentran en las áreas T, una característica de las DCs clásicas, y esta localización facilita la selección clonal de células T antígeno-específicas del arsenal circulante. Fenotípicamente, son muy similares a las DCs de los tejidos linfoides, incluyendo la pérdida de marcadores que se han usado previamente para definir monocitos inflamatorios in vivo, tales como Ly6C, Gr-1 y CD115. Finalmente, cuando se compara la funcionalidad de MO-DCs y cDCs de un mismo ganglio linfático, las MO-DCs son incluso superiores en la presentación de antígenos tanto in vivo como in vitro (Cheong et al., 2010). 1.4.3 Macrófagos. Los macrófagos son fagocitos profesionales residentes en tejidos que presentan muy poca capacidad de migrar, y que son, en general, mucho menos eficientes que las células dendríticas en la presentación del antígeno. En contraposición, poseen una alta actividad catabólica y proteolítica, que les permite ingerir y degradar patógenos, objetos extraños, células muertas y debris celulares (Murray and Wynn, 2011). Existe una gran diversidad de tipos de macrófagos, con diversas funciones tales como remodelado óseo, remodelación del tejido y morfogénesis, reproducción, angiogénesis, reciclado del hierro y, por supuesto, función inmunitaria (Ver Tabla 1.1). En condiciones basales, los macrófagos presentan actividad inmunitaria antiinflamatoria que contribuye a la homeostasis tisular, en parte por la producción de IL-10 (Denning et al., 2007). En condiciones inflamatorias, los macrófagos se pueden activar de manera "clásica" y participar en la respuesta proinflamatoria hacia los patógenos. Así, el IFNγ producido por células Th1, T citotóxicas CD8+ y células NK convierte a los macrófagos en células con elevada capacidad citotóxica, microbicida y anti-proliferativa. Esta activación clásica, llamada también polarización M1, se caracteriza por la secreción de elevados niveles de IL-12 e IL-23 y bajos niveles de IL-10 en respuesta a infecciones como las causadas por el género Mycobacterium sp. (Martinez et al., 2009). Por otro lado, en respuesta a las citoquinas Th2 IL-4 e IL-13, los macrófagos se pueden activar de manera "alternativa", también llamada polarización M2. En estas condiciones, producen grandes cantidades de IL-10 y TGFβ y bajos niveles de IL-12. La respuesta Th2 se caracteriza por eosinofilia, basofilia, mastocitosis, cambio de clase en las células B y producción de anticuerpos IgE e IgG1. Esta respuesta es esencial en el control de parásitos extracelulares. En este contexto, la activación alternativa de los macrófagos disminuye su capacidad de producir óxido nítrico (NO, Nitric Oxide) y su actividad clásica frente a virus y bacterias pero induce la expresión de mediadores de remodelado tisular (Martinez et al., 2009). 1.!Introducción! ! 13 TABLA'1.1.'Principales'poblaciones'de'macrófagos.'' Simplificación!de!las!principales!poblaciones!de!macrófagos.!El!símbolo!"_"!indica!la!falta!de!nombre! específico.!Elaborada!a!partir!de!Pollard,!2009!y!Davies!et!al.,!2013.! Tejido Nombre específico Función principal Hueso Osteoclasto Remodelado del hueso. Proveer un nicho a las células madre. Macrófago de la médula ósea Eritropoiesis. Cerebro Célula microglial Conectividad y supervivencia neuronal, reparación tras lesión. Piel Célula de Langerhans Vigilancia inmunitaria. Macrófagos dérmicos Vigilancia inmunitaria. Ojo - Remodelado vascular. Intestino Macrófago críptico Vigilancia inmunitaria. Bazo Macrófago de la pulpa roja Reciclado del hierro, fagocitosis de eritrocitos viejos. Macrófagos metalofílicos de la zona marginal (MMM) Vigilancia inmunitaria. Macrófagos de la zona marginal (MZM) Vigilancia inmunitaria. Macrófagos de la pulpa blanca Eliminación de células apoptóticas del centro germinal. Riñón - Desarrollo de conductos. Hígado Células de Kupffer Eliminación de debris sanguíneos, reparación del tejido hepático tras lesión. Glándula Mamaria - Desarrollo de conductos y morfogénesis de las ramificaciones. Ovario - Producción de hormona esteroidea y ovulación. Páncreas - Desarrollo de las islas. Testículos - Producción de hormona esteroidea. Útero DC uterina Angiogénesis y decidualización. Macrófago uterino Maduración cervical. Tejidos Serosos Macrófagos peritoneales Vigilancia inmunitaria. Macrófagos pleurales Vigilancia inmunitaria. Pulmón Macrófagos alveolares Vigilancia inmunitaria y reciclado del surfactante. Macrófagos intersticiales Regulación de la maduración y activación de DCs. Tejido Adiposo Macrófagos asociados a Tejido Adiposo Control de la sensibilidad a insulina y termogénesis. ! 14 1.4.3.a Regulación de la polarización del macrófago por citoquinas. Las citoquinas son pequeñas proteínas que actúan modulando la actividad, expresión génica y polarización de células diana. Dos citoquinas importantes para controlar el número y la función de poblaciones de macrófagos, tanto en el estadio estacionario como en condiciones inflamatorias, son las citoquinas "Factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos" (GM-CSF, Granulocyte-Monocyte ColonyStimulating Factor, también llamada CSF2) y "Factor estimulador de colonias de macrófagos" (M-CSF, Macrophage Colony-Stimulating Factor, también llamado CSF1). Estudios en ratones denominados Csf1op/op, que poseen una mutación recesiva en el gen del M-CSF, muestran que esta citoquina es esencial en el desarrollo de determinadas poblaciones de macrófagos, tales como osteoclastos, macrófagos peritoneales, macrófagos metalofílicos de la zona marginal del bazo y macrófagos del seno subcapsular de nódulos linfáticos (Wiktor-Jedrzejczak et al., 1982; Witmer-Pack et al., 1993). Otras poblaciones, como células de Kupffer, microglía o macrófagos alveolares, aparecen reducidas, mientras que otras tienen un desarrollo aparentemente normal, como los macrófagos de la lámina propia intestinal (Witmer-Pack et al., 1993). El estudio de ratones KO para el receptor de M-CSF, CSF1R-/-, indica que CSF1R (también conocido como CD115) es esencial para la producción de macrófagos derivados del saco vitelino y microglía (Ginhoux et al., 2010). Hay que tener en cuenta que las poblaciones de macrófagos afectadas en ratones CSF1-/- y en ratones CSF1R-/- no tienen por qué ser exactamente coincidentes, ya que al receptor CSF1R se pueden unir otros ligandos diferentes a M-CSF, como IL-34 (Ginhoux et al., 2010; Wang et al., 2012). CSF1R se usa habitualmente como marcador de monocitos, y se cree que los monocitos tienen un desarrollo CSF1R dependiente (Auffray et al., 2009; Dai et al., 2002). Sorprendentemente, estudios recientes han descrito la posibilidad del desarrollo de monocitos de manera independiente a CSF1R (Ginhoux et al., 2010). Aunque ambos grupos usan ratones CSF1R-/-, la explicación a esta aparente contradicción podría ser debida a que el grupo de Dai y colaboradores mide los niveles de monocitos en adultos (68 semanas), mientras que el grupo de Ginhoux y colaboradores mide los niveles de monocitos durante el desarrollo embrionario. Además, Dai y colaboradores identifican a los monocitos según su patrón de dispersión de la luz (FSC-SSC) (Dai et al., 2002) mientras que Ginhoux y colaboradores usan los marcadores CD45+CD11b+F4/80+ (Ginhoux et al., 2010). En el mismo sentido, se pensaba que CSF1 era esencial para el desarrollo de los monocitos (Wiktor-Jedrzejczak et al., 1982), aunque parece que el número de monocitos en ratones adultos Csf1op/op es normal (Chitu and Stanley, 2006; Dai et al., 2004), lo que podría explicarse por la técnica usada a la hora de medir los monocitos. En un caso se mide en un frotis sanguíneo con tinción de Wright (Wiktor-Jedrzejczak et al., 1982), mientras que en otro se realizó por citometría de flujo con marcadores Mac1+/Gr-1- (Dai et al., 2004). Otro estudio indica que el número de monocitos F4/80low de la médula ósea 1.!Introducción! ! 21 Figura'1.6.'Localización'genómica'y'estructura'proteica'de'CD209.' Panel! A.!Localización!del!gen! CD209! en!el!cromosoma!19!del!genoma!humano! (versión!GRCh37/hg19)! según!UCSC*Genome*Browser.! Panel!B.!Localización!de!los!genes!de!la!familia!CD209!en!el!cromosoma!8!del!genoma!murino!(versión! NCBI37/mm9)!según!UCSC*Genome*Browser.! Panel!C.!Representación!esquemática!de!los!dominios!de!la!familia!CD209/SIGNR!en!humano!y!ratón.!En! azul!se!representan!segmentos!que!se!repiten!a!lo!largo!del!cuello!del!receptor!mientras!que!en!verde!se! representan!dominios!variables.!Según!Powlesland!et!al.,!2006.! Cd209!Clec4M!Clec4gp1! Fcer2!Clec4g! 7,760,000| 7,770,000| 7,780,000| 7,790,000| 7,800,000| 7,810,000| 7,820,000| 7,830,000| 7,840,000| 7,850,000| 7,860,000|! 50 kb!hg19! 19p12! chr19! 19p13.3 19p13.2 13.12 19p13.11! Cd209a!Cd209e!Cd209d!Cd209b!Cd209f!Cd209g! Clec4g!Cd209c! 100 kb!mm9! 3,700,000| 3,750,000| 3,800,000| 3,850,000| 3,900,000| 3,950,000| 4,000,000| 4,050,000| 4,100,000| 4,150,000|! 8qA1.1! 8qA2 8qA3 8qA4 B1.1 8qB1.3 8qB2! chr8! Fcer2a! A.! B.! C.! ! !!!Ratón! !!Humano! ! 22 expresión de CD209b y CD209d en células dendríticas, pero a mucho menor nivel (Park et al., 2001). La función principal de los componentes de la familia SIGNR es el reconocimiento de carbohidratos. Powlesland y colaboradores estudiaron la habilidad relativa de manosa y fucosa para competir por la unión de casi todos los componentes de la familia SIGNR. Según sus resultados, los miembros de SIGNR con unión preferente a fucosa serían DC-SIGN humano (CD209), SIGNR1 (cd209b), SIGNR3 (cd209d) y SIGNR7 (cd209g), mientras que los que presentan unión preferente a manosa serían DC-SIGNR humano (CD209L), SIGNR5 (cd209a, DC-SIGN) y SIGNR8 (cd209f). En este contexto, los autores sugieren que, según su unión a carbohidratos, CD209a recuerda más a DC-SIGNR y CD209b a DC-SIGN (Powlesland et al., 2006). CD209b (SIGNR1) es quizá la proteína más estudiada de los homólogos, gracias en parte a que se identificó como el antígeno que reconoce el anticuerpo monoclonal ER-TR9 (Kang et al., 2003). SIGNR1 se expresa en macrófagos de la zona marginal y macrófagos peritoneales, y colabora en la captura de patógenos como Streptococcus pneumoniae inyectados vía intraperitoneal (Lanoue et al., 2004) o vía intranasal (Koppel et al., 2005). También se ha relacionado con el efecto terapéutico de la inmunoglobulina intravenosa (IVIG, IntraVenous ImmunoGlobulin) en enfermedades como la púrpura trombocitopénica idiopática (Anthony et al., 2008b). 1.4.5.a CD209a como marcador celular. En humanos, DC-SIGN está presente en células dendríticas derivadas de monocitos (Mo-DCs) (Bergman et al., 2004; Geijtenbeek et al., 2000b) y se ha propuesto también como marcador de macrófagos M2 (Verreck et al., 2006). En ratones, CD209a se ha mostrado útil para distinguir entre Mo-DCs y DCs clásicas en suspensiones celulares y en secciones de tejido (Cheong et al., 2010), lo que tiene implicaciones importantes para entender las funciones de estas células. De manera consistente, en otro estudio con células aisladas de bazo, se detectó la expresión de CD209a a nivel de ARNm en pDC y DC CD11b+, pero no en DCs CD8a+, células mieloides, NK, T CD8+, T CD4+ o células B (Robbins et al., 2008). 1.4.5.b Control transcripcional de DC-SIGN/CD209a. En humanos, la expresión de DC-SIGN depende de IL-4 (Relloso et al., 2002; Teles et al., 2010) y está regulada por PU.1 (Dominguez-Soto et al., 2005). En ratones, aunque la expresión de CD209a no se ha estudiado en detalle, existe un precedente donde se describe cómo su expresión aumenta en respuesta a GM-CSF e IL4 (Cheong et al., 2010), pero su regulación por PU.1 no ha sido estudiada. 1.!Introducción! ! 23 Por otro lado, aunque se ha descrito que la estimulación con LPS moviliza las Mo-DCs CD209a+ CD206+ en ratones in vivo (Cheong et al., 2010), tanto el LPS como el TNFα disminuyen la expresión de DC-SIGN/CD209a en ratones y humanos in vitro (Caminschi et al., 2001; Geijtenbeek et al., 2000b). La explicación probablemente resida en la activación de las células T, las cuales median en la producción in vivo de Mo-DCs CD209a+, en un proceso mediado por CD40L (Davidson et al., 2013). 1.5 Órganos Linfoides. Los órganos linfoides se clasifican funcionalmente en dos tipos: primarios y secundarios. Los primarios suministran el microambiente necesario para la maduración de los linfocitos, mientras que los secundarios facilitan el encuentro con el antígeno. Los distintos órganos linfoides están interconectados por vasos sanguíneos y linfáticos, de modo que forman una red unitaria. Los órganos linfoides primarios son el timo, donde se producen las células T, y la médula ósea, donde se producen las células B. Los órganos linfoides secundarios son los ganglios, el tejido asociado a mucosas y el bazo. 1.6 El Bazo. El bazo es el principal órgano linfoide secundario, tanto en tamaño como en funcionalidad. Además, es el único que se encuentra intercalado en el torrente circulatorio. En él se produce la captura y procesamiento de antígenos y su presentación a las células T para empezar la respuesta adaptativa. A parte de su función inmunitaria, el bazo desempeña otras funciones como eliminar los eritrocitos senescentes para el reciclaje del hierro de su grupo hemo, actuar de reservorio de sangre liberada en caso de hipovolemia, y constituir un reservorio de determinados tipos celulares como plaquetas y monocitos (Bronte and Pittet, 2013; Swirski et al., 2009). El bazo se encuentra recubierto por un tejido conjuntivo capsular, que se reúne en un cordón llamado hilio a través del que entran y salen los vasos sanguíneos. La vascularización del bazo se organiza, en esencia, como un “árbol” de arterias denominadas branquiales, procedentes de una arteria esplénica que después se ramifica en pequeñas arteriolas, las cuales terminan en un sistema sinusoidal venoso (Mebius and Kraal, 2005). Esta especial vascularización, en la que interviene un sistema sinusoidal abundante, permite al bazo desempeñar una eficaz tarea de captura de las células rojas senescentes y posibles antígenos presentes en la sangre. El parénquima esplénico se denomina pulpa, y puede ser de dos tipos: la pulpa blanca y la pulpa roja, distinguibles a simple vista. En medio, se organiza la llamada zona marginal, distinguible sólo con ayuda de un microscopio (ver Figura 1.7). ! 24 Figura'1.7.'Ultraestructura'del'bazo'murino.' ! Panel!A.!Representación!de!la!organización!microscópica!del!bazo!en!la!que!se!destaca!la!cápsula,!pulpa! roja,!zona!marginal!y!pulpa!blanca.!Según!Bronte!and!Pittet,!2013.! Panel!B.!Representación!de!los!tipos!celulares!más!abundantes!de!la!zona!marginal!del!bazo,!seno!marginal! y!pulpa!blanca.!Según!O’Neill!et!al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ntroducción! ! 25 1.6.1 Pulpa Blanca. La arteria esplénica aferente se encuentra rodeada de zonas de linfocitos T y a su vez las arteriolas se rodean por linfocitos B organizados en folículos. Estas zonas de tejido linfoide forman lo que se denomina la pulpa blanca del bazo. La pulpa blanca es estructuralmente similar a un nódulo linfático, con un compartimento de linfocitos B y T además de células reticulares y un subtipo de células dendríticas conocidas como células dendríticas foliculares. Los linfocitos T se organizan en forma de vainas de linfocitos T periarteriolares conocidas como PALS (Periarteriolar Lymphoid Sheath). Estas células T reconocen los antígenos presentados por las células dendríticas y linfocitos B, promoviendo la generación de anticuerpos. Los folículos de linfocitos B se sitúan alrededor de estas zonas T, y es el lugar en el que ocurre el proceso de expansión clonal una vez el linfocito B entra en contacto con el antígeno. La organización y mantenimiento de la pulpa blanca está controlada por ciertas quimioquinas que atraen a los linfocitos B y linfocitos T a sus zonas específicas dentro de la pulpa blanca (Mebius and Kraal, 2005). Al igual que en otros órganos linfoides secundarios, existen poblaciones de macrófagos en las zonas T y las zonas B que se denominan macrófagos de la pulpa blanca, y que se caracterizan por ser F4/80lo/-CD68+Tim-4+. En las zonas B, también denominadas centros germinales, que son lugares en los que ocurre la proliferación, diferenciación y maduración de los linfocitos B, estos macrófagos reciben el nombre de Tingible Body Macrophages (TBM) (den Haan and Kraal, 2012). Las arteriolas pequeñas vierten al espacio marginal, área entre la pulpa blanca y la zona marginal, mientras que otras atraviesan la zona marginal y se introducen en la pulpa roja, donde pasan a formar parte del sistema venoso. 1.6.2 Pulpa Roja. En la pulpa roja la sangre fluye a través de sinuoides, que constituyen un sistema sanguíneo abierto sin lámina endotelial entre los que se encuentran los cordones de Billroth constituidos por fibroblastos y fibras reticulares (Groom et al., 1991). Este sistema abierto con una organización reticular permite la retención de los eritrocitos viejos que presentan membranas menos flexibles, impidiendo su retorno al torrente sanguíneo a través de la vena colectora. Los macrófagos de la pulpa roja F4/80+CD68+ están especializados en la fagocitosis de los eritrocitos retenidos, iniciándose el proceso de reciclado del hierro (Kohyama et al., 2009). 1.6.3 Zona Marginal. La zona marginal (MZ) se describe histológicamente como una capa celular rodeando a la pulpa blanca, cuyo límite lo marcan células epiteliales MadCAM-1+ (Kraal, 1992). Su presencia se describió por primera vez en 1929 por Ward J. MacNeal (MacNeal, 1929), quien ya subrayó su importancia en la fagocitosis. Quizá la característica anatómica más llamativa de la zona marginal es la presencia de un seno o espacio marginal en el que vierten muchos vasos sanguíneos. Esto permite que la mayor parte de la sangre que entra al bazo sea cribada por varios tipos celulares residentes, incluyendo dos subtipos de macrófagos y una población de linfocitos B (ver Figura 1.7). ! 26 Los dos subtipos de macrófagos especializados se denominan macrófagos de zona marginal (MZM) y macrófagos metalofílicos de zona marginal (MMM) y se caracterizan por ser CD68-F4/80lo/-. Ambos expresan un amplio conjunto de receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que les permiten fagocitar patógenos y empezar la respuesta innata. Por ejemplo, en un estudio se estableció que los macrófagos de la zona marginal (MZM y MMM) son necesarios para generar respuestas T-CD8+ en un modelo de infección viral intravenosa (Hu et al., 2011). Además, parecen estar relacionados con la captura de células apoptóticas y la autotolerancia. Mediante la depleción de los macrófagos de la zona marginal, la inyección de células apoptóticas asociadas con autoantígenos concretos y la posterior inducción de un síndrome autoinmune (EAE) en ratones normales, se comprobó que aquellos ratones que no tenían macrófagos en la zona marginal presentaban una menor tolerancia inmunitaria y desarrollaban la enfermedad antes (Miyake et al., 2007), lo que se ha demostrado en otros modelos como lupus eritematoso sistémico (McGaha et al., 2011). Así, los autores sugieren un papel regulador para los macrófagos de zona marginal de la respuesta inmunitaria a antígenos asociados a células apoptóticas. Los MMM se identificaron por primera vez en 1964 por Snook (Snook, 1964) y se diferencian fenotípicamente de los MZM y de los macrófagos de la pulpa roja en la expresión de la molécula Sialoadhesina (Sn). La Sialoadhesina es un miembro de la familia de las lectinas tipo-inmunoglobulina que unen ácido siálico, (Siglec-1, Sialic acidbinding Ig-like Lectin) que se describió originalmente como un receptor de eritrocitos (Crocker and Gordon, 1989) y está codificada por el gen CD169. Previamente, y de manera independiente, se había desarrollado otro anticuerpo denominado MOMA-1 que reconocía específicamente los MMM (Kraal and Janse, 1986) y que posteriormente se comprobó que reconocía la misma molécula de Sialoadhesina (Oetke et al., 2006a). La Sialoadhesina está involucrada en la activación de las células T, ligando la inmunidad innata a la adquirida (Backer et al., 2010; Jiang et al., 2006; Oetke et al., 2006b). Recientemente, se ha descubierto el rol de los MMM en la fagocitosis de exosomas a través de Sialoadhesina (Saunderson et al., 2014). Los exosomas son vesículas circulantes que contienen autoantígenos y que podrían intervenir en la regulación de la respuesta inmunitaria frente a autoantígenos, incluyendo tumores (Saunderson et al., 2014). Los macrófagos de zona marginal, MZM, se sitúan en forma de anillo compuesto por dos o tres capas celulares alrededor de los MMM y el espacio o seno marginal. Estos macrófagos se distinguen fenotípicamente por la expresión de las moléculas SIGN-R1, que es una lectina tipo-C homóloga a la molécula DC-SIGN en humanos, MARCO, que es un receptor Scavenger de tipo-I y TIM-4, una glicoproteína que une fosfatidilserina de células apoptóticas. Los MZM presentan una gran actividad fagocítica que, unido a su ubicación en la zona marginal, les confiere un papel esencial en la retirada de patógenos y antígenos transportados por la sangre (Geijtenbeek et al., 2002). En concreto, la molécula SIGNR1 presenta una gran afinidad en el reconocimiento e internalización de polisacáridos de 1.!Introducción! ! 27 dextrano, los cuales están presentes en algunas bacterias (Geijtenbeek et al., 2002; Kang et al., 2004, 2003). La ausencia de expresión de MHC clase II en estas células y su gran actividad en el reconocimiento y fagocitosis de patógenos y antígenos, podrían parecer antagónicos ya que tras la fagocitosis de esos antígenos debería haber un procesamiento y presentación de los mismos para generar la respuesta inmunitaria frente a ellos. Se piensa que los MZM internalizan los patógenos y, más tarde, los productos de degradación se desprenden de la superficie de la célula y son captados por linfocitos B de zona marginal que migran al interior del folículo y los presentan, provocando así el inicio de la respuesta inmunitaria (Geijtenbeek et al., 2002). Por tanto, existe una interdependencia entre los macrófagos y los linfocitos B de zona marginal en la generación de la respuesta inmunitaria. Los linfocitos B de zona marginal (MZB) se distinguen de los linfocitos B de la pulpa blanca en que no forman folículos, capturan antígenos transportados en la sangre mediante receptores de complemento y promueven respuestas inmunitarias dependientes e independientes de células T (Cinamon et al., 2008; Fagarasan, 2000; Pillai and Cariappa, 2009). Tanto las células B foliculares como las MZB expresan el receptor CXCR5, y por tanto tienen capacidad de respuesta a CXCL13, que atrae a las células B al folículo. Sin embargo, las MZB presentan altas cantidades de receptores S1PR1 y S1PR3. La unión de esfingosina 1 fosfato (SP1) a estos receptores induce la acumulación de MZB en la MZ y la pulpa roja, donde SP1 se encuentra en altas concentraciones (Cinamon et al., 2004). La expresión de integrinas como VLA-4 y LFA-1 en las MZB facilita su fijación en el torrente circulatorio de la MZ. Sin embargo, estas células no son sésiles, sino que se mueven continuamente entre la MZ y los folículos. Esto se ha visto gracias a técnicas de microscopía intravital, y el mecanismo subyacente parece ser la desensibilización transitoria de S1PR1 hacia su ligando (que permite la migración desde la MZ al folículo), seguida por una resensibilización (que permite la migración de vuelta a la MZ). Este proceso de desensibilización cíclico está regulado por GRK2, y explica la entrada de los MZB al folículo en contra de gradiente de S1P (Arnon et al., 2013, 2011). Allí pueden presentar el antígeno, iniciándose la respuesta inmunitaria humoral (Cinamon et al., 2008). Adicionalmente, las MZB parecen desempeñar un papel estructural en la retención de los MZM mediante la interacción con el receptor MARCO, expresado en estos macrófagos (Karlsson et al., 2003). Esta función de retención de las células parece ser recíproca, y por tanto, habría una cierta interdependencia entre los linfocitos B y los macrófagos de zona marginal. Por último, algunos estudios llevados a cabo en los últimos años relacionan los macrófagos de la zona marginal con el desarrollo y el tratamiento de las enfermedades autoinmunes. La administración en ratones de IgG intravenosa, IVIG, sustancia que se administra con éxito en clínica para combatir los síntomas de la Artritis Reumatoide y de la Púrpura Trombocitopénica Idiopática (ITP), reveló que estas inmunoglobulinas estaban dirigidas específicamente a los macrófagos de zona marginal (Anthony et al., 2008b). Concretamente, son las moléculas de SIGNR1 las que se proponen como receptores de esta sustancia y las que serían responsables del inicio de la supresión inflamatoria promovida por la administración del IVIG (Anthony et al., 2008b). ! 28 1.7 FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN. Los factores de transcripción (TF, Transcription Factors) son proteínas que regulan la expresión génica de la célula en respuesta a las señales del medio que le rodea. En un organismo pluricelular con diferentes tipos celulares, los factores de transcripción juegan un papel importante en la activación y regulación del conjunto génico característico de cada linaje celular. Por ejemplo, el factor de transcripción c-Myb es necesario para la producción de HSC fuera del saco vitelino. La mutación de este gen genera una anemia severa en los fetos a partir del día 15 de gestación, momento en el que cesa la hematopoyesis en el saco vitelino y empieza la hematopoyesis adulta definitiva (Mucenski et al., 1991). Sin embargo, no interfiere en el desarrollo de una línea precursora de macrófagos c-Mybindependiente (Clarke et al., 2000), que finalmente dará lugar a los macrófagos tisulares (Schulz et al., 2012). Por otro lado, varios estudios han destacado la importancia de los factores de transcripción determinantes de linaje (LDTF, Lineage-Determining Transcription Factors), también denominados factores pioneros o reguladores principales, en la selección de enhancers específicos de tipo celular (Garber et al., 2012; Trompouki et al., 2011). Los enhancers no son más que regiones del ADN donde los factores de transcripción se pueden unir y regular la expresión génica. Según el modelo actual, la unión de los LDTFs a los enhancers predispone a esa región de ADN mediante modificaciones histónicas en regiones reguladoras cis activas. Estas modificaciones permiten la unión de TFs dependientes de señal (SDTF, Signal-Dependent Transcription Factors), que finalmente regulan la expresión génica (Ghisletti et al., 2010; Heinz et al., 2010; Mullen et al., 2011). Los patógenos parecen haber descubierto hace tiempo esta regulación de la cromatina en su carrera armamentística, pues presentan mecanismos para intentar usarla a su favor (Arbibe, 2008), por lo que esta regulación se está empezando a investigar en autoinmunidad y cáncer (Woan et al., 2012). El modelo propuesto podría explicar 1) por qué TFs diferentes tienden a colocalizar en el genoma en un mismo tipo celular, 2) por qué el mismo TF presenta patrones de unión al genoma diferentes en distintos tipos celulares (Heinz et al., 2010). Diversos estudios han identificado a PU.1 y C/EBPα como LDTFs importantes en el desarrollo mielo-monocítico (Friedman, 2007; Heinz et al., 2013, 2010; Schulz et al., 2012). PU.1 (PUrine-rich box 1, codificado por el gen Spi-1) es un factor de transcripción de la familia ETS (E-Twenty Six), que puede regular la expresión génica mediante la unión a motivos ETS canónicos u otros sitios gracias a su interacción con otros factores de transcripción, como Irf4, Irf8, C/EBPα, C/EBPβ y c-Jun (Carotta et al., 2010). En células mieloides, PU.1 se encuentra en las regiones reguladoras de prácticamente todos los genes analizados, incluyendo receptores de citoquinas (CSF1R y CSF2R), marcadores de superficie (CD11b, CD18, CD45, FcRs), y enzimas con acción 1.!Introducción! ! 29 Figura' 1.8.' Modelo' por' el' que' los' factores' de' transcripción' determinantes' de' linaje' modifican'la'cromatina'y'permiten'la'unión'de'factores'de'transcripción'dependientes'de' señal.' La!unión!de!los!factores!de!transcripción!determinantes!de!linaje!(LDTF)!como!PU.1!y!CEBP!a!enhancers! abren! la! cromatina! y! facilitan! la! monometilación! de! la! lisina! 4! de! las! histonas! (H3K4Me1).! Esta! modificación!permite!la!unión!de!factores!de!transcripción!dependientes!de!señal!(SDTF),!como!LXR_RXR.! Modificado!de!Heinz!et!al.,!2010.! Unión!de!LDTF:!PU.1!/!CEBP! Monometilación:!H3K4M1! Unión!de!SDTF:!LXRIRXR! ! 30 microbicida como gp91 (Carotta et al., 2010). Efectivamente, mediante la técnica del ChIP-Seq se identifican unos 45.000 sitios de unión de PU.1 al genoma de macrófagos (Ghisletti et al., 2010; Heinz et al., 2010). Los ratones PU.1-/- carecen de linfocitos B y monocitos, y presentan un menor número de neutrófilos (McKercher et al., 1996; Scott et al., 1994). Por otro lado, las células mieloides presentan mayores niveles de PU.1 que las células linfoides, y la introducción de PU.1 en progenitores linfoides los redirige hacia el linaje monocítico (DeKoter and Singh, 2000). C/EBPα (CCAAT/Enhancer Binding Protein) es un factor de transcripción de la familia C/EBP, cuyos miembros forman homo o heterodímeros a través de una cremallera de leucina y se unen al ADN a través de una región de carácter básico (Miller et al., 2003). C/EBPα puede formar heterodímeros con PU.1 (Carotta et al., 2010) y miembros de las familias CREB (Shuman et al., 1997) y AP-1 (Hong et al., 2011), y se ha demostrado que, al igual que PU.1, regula los genes de CSF1R y CSF2R, y el propio gen para PU.1 (Kummalue and Friedman, 2003). Mediante ChIP-Seq, se identifican unos 40.000 sitios de unión de C/EBPα, un 35 % de ellos situados a menos de 100pb de PU.1 (Heinz et al., 2010). Ratones C/EBPα-/- recién nacidos presentan monocitos pero carecen de granulocitos, mientras que los adultos carecen tanto de monocitos y granulocitos debido a un defecto en la formación del progenitor de granulocitos y monocitos (GMP, Granulocyte-Monocyte Progenitor) (Heath et al., 2004; Zhang et al., 1997). PU.1 y C/EBPα presentan funciones diferentes en cuanto a la determinación del linaje monocito/granulocito, siendo PU.1 esencial para la diferenciación de monocitos a expensas de la diferenciación granulocítica (Dakic et al., 2005) y antagonizando a C/EBPα (Dahl et al., 2003), que es esencial para el desarrollo de granulocitos (Zhang et al., 1997). A pesar de reprimir mutuamente el programa transcripcional del otro, es de destacar que es necesaria la presencia de ambos TFs para el normal desarrollo de monocitos y granulocitos. Así, ratones PU.1-/- presentan menores niveles de neutrófilos (McKercher et al., 1996) y ratones C/EBPα-/- presentan defectos en el desarrollo de macrófagos (Heath et al., 2004). Además, en experimentos de expresión ectópica se ha observado que ambos TFs son necesarios para la reprogramación de células B (Xie et al., 2004), progenitores T (Laiosa et al., 2006) y fibroblastos (Feng et al., 2008) hacia macrófagos. Una hipótesis para explicar esta aparente paradoja es el denominado sistema biestable, según el cual una célula progenitora (inestable en el tiempo) presenta bajos niveles de expresión de ambos TFs, que se encuentran correprimidos. Una pequeña diferencia en los niveles de expresión de uno de los dos TFs inclinará la balanza hacia uno de los dos destinos celulares posibles (estables): monocito o granulocito (Laslo et al., 2006; Muzzey and van Oudenaarden, 2006). Esto subraya la importancia de las moléculas con las que interacciona un TF para regular su función (Sieweke and Graf, 1998), incluido sus represores. 1.!Introducción! ! 37 !"#$%&'$($)"""""*+,-.*/"0+/1,23" !"45657589$)"""""""*:*-.*/"0/+1;23" # Identidad: 59/78 (75.6%)! # Similitud: 65/78 (83.3%)! !"#$%&'(%&'$#)%&!!#!%& &&&&&*+,&&&&&&&&&&&&&&&&&&&-&&&&&&&&&&&&&&&&.&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&/&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&0&&&&&&&&&&&&&&&&& Figura'1.10.'Representación' esquemática' de' la' estructura' de' LXR' y' la' similitud' entre' las' isoformas'LXRα'y'LXRβ.'' De!cada!región!se!realizó!un!alineamiento!de!las!secuencias!proteicas!murinas!de!las!isoformas!LXR α!y! LXRβ ,!obteniéndose!una!identidad!del!33!%!en!la!región!A/B,!un!75,6!%!en!la!región!C!(que!corresponde!a! la!DBD),!un!39,5!%!en!la!región!D!(que!corresponde!a!la!región!bisagra)!y!un!78!%!en!la!región!E/F!(que! corresponde!a!la!LBD).!La!región!F!está!prácticamente!ausente!en!LXR.!En!amarillo!se!destacan!los!"dedos! de! zinc"! de! unión! al! ADN.! ! Parámetros! del! alineamiento:! Algorithm:! Water! (local! alignment),! Matrix:! EBLOSUM62,!Gap_open:!10.0,!Gap_extend:!0.5.! ! ! 38 predominante en hígado, lugar donde se lleva a cabo la lipogénesis, y LXRβ se expresa de manera ubicua y tiene teóricamente más peso en el transporte reverso del colesterol, se están buscando agonistas LXRβ específicos para aumentar el transporte reverso del colesterol sin aumentar la lipogénesis hepática (Lund et al., 2006; Miao et al., 2004). Por otro lado, varios estudios parecen indicar que LXRα podría ser la principal isoforma funcional de macrófagos, mayormente en cuanto a la regulación de su función inmunitaria. Por ejemplo, se ha demostrado que LXRα es primordial en la supervivencia de los macrófagos a la infección por Listeria monocytogenes (LM) (Joseph et al., 2004). Este efecto está mediado por la inducción del gen antiapoptótico AIM/Spα (Apoptosis Inhibitor expressed by Macrophages, Aim/Spα) (Miyazaki et al., 1999) que es un gen diana exclusivo de LXRα (Joseph et al., 2004; Valledor et al., 2004). Otro gen diana regulado por LXRα en macrófagos es SCD-1 (Erbay et al., 2009), que media en la resistencia a la muerte celular inducida por sobrecarga de lípidos, en un proceso mediado por estrés del retículo endoplásmico y que termina en apoptosis (Erbay et al., 2009). LXRα también reduce los efectos proaterogénicos de Chlamydia pneumoniae en un modelo de aterosclerosis (Naiki et al., 2008), es más eficiente que LXRβ en la inducción de Arginasa I (Pourcet et al., 2011) y mediante aproximaciones transcriptómicas se ha identificado como uno de los TFs reguladores de macrófagos (ver tablas suplementarias 11 y 13 de Jojic et al., 2013). Por otro lado, se ha descubierto que LXRα es importante en hígado para la homeostasis de los niveles de colesterol (Zhang et al., 2012). LXRβ, por su parte, podría ser más importante en el control lipídico y proliferación. Así, LXRβ interacciona directamente con ABCA1 (Hozoji et al., 2008; Hozoji-Inada et al., 2011), y el control de los esteroles se ha relacionado con la modulación de la proliferación celular y la inmunidad adquirida (Bensinger et al., 2008). El trabajo de Bensinger y colaboradores demuestra que la regulación de la proliferación de varios tipos celulares, entre ellos los linfocitos T y B, es dependiente de la homeostasis de esteroles por parte de LXRβ. Más concretamente, al disminuir la viabilidad de esteroles, la isoforma LXRβ inhibe la expansión de linfocitos en respuesta a TCR (T Cell Receptor) y BCR (B Cell Receptor). Ratones LXRβ-/- presentan hiperplasia linfoide y una mayor respuesta a antígenos, indicando que la regulación de esteroles dependiente de LXRβ es importante en la respuesta inmunitaria (Bensinger et al., 2008). Además, en cuanto a modificaciones postranslacionales, parece ser que la fosforilación ocurre en LXRα (Chen et al., 2006; Torra et al., 2008) y que la SUMOilación podría llevarse a cabo de manera diferente en una isoforma que otra, al menos en astrocitos (Lee et al., 2009), mientras que otras modificaciones como la modificación O-beta-N-acetilglucosamina (Anthonisen et al., 2010) o la acetilación (Li et al., 2007) serían equivalentes en ambas isoformas. ! ! ! ! ! ! OBJETIVOS 2. ! ! ! ! 43 OBJETIVOS _______________________________________________________________ En resumen, los Objetivos planteados para esta Tesis son los siguientes: * Estudiar la relevancia de los receptores nucleares LXR en la formación de las poblaciones de macrófagos esplénicos. * Establecer el origen ontogenético de las células mieloides que dan lugar a las poblaciones de macrófagos de la zona marginal del bazo. * Estudiar la respuesta transcripcional de células mieloides carentes de receptores LXRα a las citoquinas M-CSF y GM-CSF. * Analizar la regulación transcripcional de genes inducidos por estas citoquinas en los que LXRα juegue un papel primordial. ! 2. ! ! ! ! MATERIAL Y MÉTODOS 3. ! 3.!Material!y!Métodos! ! 53 3.3 Cultivo de Líneas Celulares. Todas las células se cultivaron a 37°C en una atmósfera que contenía 5 % de CO2 – 95 % de aire. A menos que se especifique lo contrario, los medios empleados son RPMI 1640 (Lonza) completo o DMEM (Lonza) completo - suplementados con 10 % de FBS (PAA Laboratories GmbH), Penicilina (100U/ml) (Sigma) y Estreptomicina (100 µg/ml) (Sigma). 3.3.1 Cultivos Primarios. 3.3.1.a Obtención de macrófagos derivados de medula ósea murina (BMDM). La médula ósea del interior del fémur y la tibia se extrae haciendo pasar una solución de PBS (Tampón fosfato salino pH 7,4) con una jeringuilla de 10 ml y una aguja de 0,5 mm. El tejido medular se disgrega a través de un separador celular de Nylon, con un tamaño de poro de 70 µm (BD FalconTM, BD Bioscience). La suspensión celular se centrifuga a 1500 rpm 4ºC durante 5 minutos, y se resuspende en medio hipotónico (Red Blood Lysis Buffer, Sigma) durante 2 minutos para favorecer la lisis de los eritrocitos. Tras 2 minutos, se añade PBS y se centrifuga a 1500 rpm 4ºC durante 5 minutos. Las células se siembran en platos bacteriológicos con 10ml de medio RPMI 1640 completo suplementado con 1/3 de medio L929. La médula ósea procedente de 1 ratón se siembra finalmente en 4 platos (5 x 106 células aproximadamente). Tras 7 días de cultivo, las células se recogieron con varios lavados de PBS y PBS-EDTA 10 mM, se contaron y se sembraron en platos tratados (Nunc) con medio RPMI 1640 completo suplementado con 10 ng/ml de citoquinas recombinantes murinas M-CSF o GM-CSF (Immunotools), según se indique. 3.3.1.b Obtención de macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica humana (MDM, monocyte-derived macrophages). La sangre de voluntarios sanos se separó mediante un gradiente de densidad con Lymphoprep, y de los buffy coats se aislaron las células CD14+ mediante enriquecimiento magnético (Miltenyi). Las células obtenidas se cultivaron en medio de cultivo: DMEM completo suplementado con 10 ng/ml de M-CSF humano (Peprotech). La citoquina se añadió cada tercer día. Tras 7 días las células se subcultivan en platos tratados con medio de cultivo fresco DMEM completo + 10 ng/ml de M-CSF humano (Peprotech). Al día siguiente, las células se lavaron con PBS y se añadieron los tratamientos M-CSF, GM-CSF o IL-4 humano (Peprotech) durante 24 horas. 3.3.1.c Obtención de macrófagos peritoneales murinos. Para inducir el reclutamiento de los macrófagos del peritoneo, inyectamos 3ml de tioglicolato en la cavidad peritoneal de ratones LXRαfl/fl Vav-iCre-/-, LXRαfl/- VaviCre+/ y LXRαfl/fl Vav-iCre+/. Tres días después se sacrificaron y se aislaron las células del peritoneo mediante tres lavados de la cavidad peritoneal con 10 ml de PBS, que se filtró a través de un separador celular de Nylon con un poro de 70 µm (BD FalconTM, BD Bioscience) para eliminar impurezas. Las células se centrifugaron a 300g durante 10', se resuspendieron en medio RPMI 1640 completo y se sembraron en placas de cultivo. Al ! 54 cabo de 4 horas, se realizaron lavados con PBS para retirar las células no adheridas, y las células adheridas se lisaron para el análisis de proteínas tal y como se detalla en la sección 7.1. 3.3.2 Líneas celulares. 3.3.2.a Cultivo de células RAW-LXRα-3FLAG. Las células RAW264.7 que sobreexpresan LXRα unido a tres repeticiones del octapéptido FLAG (Alonso-Gonzalez et al., 2009; Chen et al., 2006) se cultivaron en platos tratados (Nunc) con medio DMEM completo. 3.4 Tratamientos in vitro. Los tratamientos in vitro se realizaron en cultivos celulares de células BMDM. Por un lado, se estudió la influencia de CD209a en la captación de azúcares y por otro se realizaron estudios farmacológicos para estudiar las vías de señalización que regulan la expresión de CD209a. 3.4.1 Captación de azúcares de células BMDM. El estudio de captación de azúcares se realizó modificado ligeramente las indicaciones de Serrano-Gomez et al., 2008. Brevemente, 0,3 x 106 células BMDM WT o LXRα-/- se sembraron en platos de 35 mm con cubreobjetos tratados previamente con poli-L-Lisina (Sigma P4707) en medio RPMI completo con M-CSF o GM-CSF (10 ng/ml). Al día siguiente, las células estaban ya adheridas al cubreobjetos. Los cubreobjetos se lavaron con PBS y se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente con azúcares a una concentración de 100 µg/ml en medio RPMI completo. Los azúcares (α-D-Manosa o αL-Fucosa) se encuentran conjugados a esferas de poliacrilamida (PAA)-FITC, proceden de la compañía Lectinity (Rusia) y han sido usados previamente (Serrano-Gomez et al., 2008). Como control se usaron esferas de PAA-FITC sin conjugar. Posteriormente, las células se lavaron con PBS, se fijaron con PFA 4 %, se volvieron a lavar con PBS, se montaron con medio de montaje Vectashield Mounting Medium with DAPI (Vector laboratories), se fotografiaron en el microscopio de fluorescencia Eclipse 80i (Nikon) y se analizaron en el programa NIS-Elements F3.0 (Nikon). 3.4.2 Tratamientos Farmacológicos e Inhibidores. Los tratamientos farmacológicos se llevaron a cabo en 2,5 x 106 células BMDM cultivadas en platos de 60 mm y a las concentraciones indicadas en la sección de Resultados. Para el estudio de la función de LXR-RXR se usaron los ligandos sintéticos GW3965 (GSK), LG268 (Ligand Pharmaceuticals) y el antagonista GW233 (Zuercher et al., 2010). 3.!Material!y!Métodos! ! 55 Para el estudio de las rutas de señalización de GM-CSF las células se levantaron, contaron y sembraron en RPMI completo + M-CSF (10 ng/ml). Al día siguiente se lavaron con PBS y se cultivaron con medio RPMI completo (sin citoquina). Tras 1 hora se añadieron los inhibidores y tras 2 horas se dispensó GM-CSF (10 ng/ml). A las 6 horas del tratamiento con GM-CSF se procedió a la extracción del ARNm con Trizol. Los inhibidores usados fueron PD98059, BI605906, SN50, SB203580, LY294002, wortmanina (cedidos amablemente por el Dr. Lisardo Boscá y la Dra. Susana Alemany ), JakI (cedido amablemente por la Dra. Sonsoles Hortelano), AG490 (cedido amablemente por el Dr. Borja Guerra) y Cicloheximida (Sigma). 3.5 Tratamientos in vivo. 3.5.1 Plaquetas opsonizadas. Las plaquetas se prepararon siguiendo el protocolo del laboratorio del Dr. John W. Semple (Semple et al., 2007), obtenido durante una estancia en el laboratorio del Dr. Alan H. Lazarus. Primero, se recoge la sangre de la vena cava de ratones sacrificados mediante inhalación de sevofluorano (Abbot) y se deposita en tubos de cristal “BD Vacutainer Serum” (Ref 366430) con 500 µl de PBS y el anticoagulante citrato-fosfatodextrosa-adenina (CPDA, Sigma C4431) (ratio 10:1). La sangre de varios ratones se centrifuga a 150g, y se aísla el plasma rico en plaquetas (PRP). Las plaquetas se lavan en PBS y se ajustan a 109 células/mL en PBS-CPDA. A continuación, 150 x 106 plaquetas se opsonizan con 5 µg de anticuerpo frente a CD41 (BD PharMingen #553847), o se dejan opsonizar como control, se lavan, y se inyectan por la vía de la vena de la cola. La presencia de CD41 en el bazo se detecta mediante Inmunohistoquímica, empleando un anticuerpo secundario anti-rata-AF488. Alternativamente, las plaquetas se incuban con 20 µM de Red CellTracker CMTPX (Invitrogen C34552) y 5 µg de anticuerpo frente a CD41 a 37ºC 30 minutos, empleando plaquetas sin marcar como control. En ambos casos, el aislamiento de los bazos para posterior análisis se realizó tras 90 minutos de tratamiento. 3.5.2 Clodronato. El clodronato (Cl2MBP; diclorometileno-bifosfonato) es un compuesto que se ha usado previamente para eliminar temporalmente las poblaciones de macrófagos (Van Rooijen and Sanders, 1994). Se administra por vía intravenosa encapsulado en el interior de liposomas (Encapsula Nanosciences) que son fagocitados y causan la muerte del macrófago. Como control se usan liposomas vacíos sin clodronato. Se emplearon animales LXRα-/- y LXRβ-/-, y a las 48h una parte de los ratones se sacrificaron para comprobar la eficacia del tratamiento con clodronato. Tras dos semanas, un grupo de ratones se trató vía intraperitoneal con una solución de GW3965 a 20 mg/kg de peso corporal o vehículo cada 2 días. Una semana después de empezar el tratamiento con GW3965, se sacrificaron los animales y se analizó la reconstitución de macrófagos esplénicos mediante inmunohistoquímica, empleando para ello anticuerpos específicos. ! 56 3.6 Lentivirus. La terapia génica es una técnica consistente en la introducción de un gen funcional para suplir un gen defectuoso in vivo. Se ha empleado con cierto éxito para el tratamiento de enfermedades monogenéticas como la deficiencia en adenosina deaminasa (ADA) (Wirth et al., 2013). En nuestro caso, usamos la terapia génica para reconstituir progenitores de médula ósea LXRαβ-/- con el gen de LXRα murino empleando un sistema lentiviral especial. En esta terapia génica, las HSCs se transducen ex vivo con vectores lentivirales para permitir la integración estable del gen de interés y se reintroducen de manera autóloga. Como el gen se encuentra regulado por un promotor específico de macrófagos, se expresará preferentemente en estas células. Por tanto, la elección de un promotor adecuado es de vital importancia para la especificidad de esta técnica. 3.6.1 Promotor. En la literatura podemos encontrar varios promotores específicos para macrófagos: sheep visna virus long terminal repeat, promotor de CD68, chicken lysozyme minigene construct o el promotor del receptor scavenger A (SA), pero resultan no ser lo suficientemente potentes y/o específicos para las finalidades de la terapia génica (He et al., 2006). En esta Tesis usaremos un promotor sintético específico de células mieloides, que ha sido usado previamente con éxito en animales trasplantados (He et al., 2006). Para generar el promotor específico, los autores unieron al azar en la zona 5' del promotor de p47phox elementos cis para PU.1, C/EBPα, AML-1, Sp1 y AP-1, (ver Figura 3.3A) y determinaron la eficiencia y especificidad mediante un sistema de luciferasa en células monocíticas THP-1, así como en células no monocíticas tales como células epiteliales del intestino Caco-2, células de carcinoma epitelioide de cérvix Hela o células embrionarias de riñón HEK293. 3.6.2 Vectores Lentivirales. Los Lentivirus son Retrovirus, es decir, tienen un genoma de ARN que deben transcribir reversamente a ADN para integrarse en el genoma de la célula hospedadora y así poder multiplicarse. Como vectores presentan la ventaja de poder infectar tanto a células quiescentes como a células en división, mientras que el resto de Retrovirus sólo puede infectar células en división. Los vectores lentivirales que hemos usado en esta Tesis están basados en el virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH-1) y proceden del laboratorio del Dr. Li (Li et al., 2011). Pertenecen a la tercera generación de vectores lentivirales, en los que se ha incrementado la seguridad mediante un sistema de 4 plásmidos (ver Figura 3.3B y 3.3C) desprovistos de todas las secuencias codificantes y que únicamente aportan en trans las secuencias del ARN viral necesarias para la transcripción reversa, la integración y el encapsidamiento del ARN genómico (Dull et al., 1998). En concreto, contienen un tracto polipurínico (PPT, polypurine tract) necesario para la síntesis de la segunda cadena, 3.!Material!y!Métodos! ! 57 Figura' 3.3.'Representación' esquemática' del' promotor' sintético' macrófagoHespecífico' SPH146'y'de'los'plásmidos'lentivirales.' Panel!A.!En!la!parte!superior!se!representa!la!secuencia!de!módulos!de!unión!del!promotor!SP_146.!En! la!parte!inferior!izquierda,!la!leyenda!de!cada!uno!de!los!módulos,!y!en!la!parte!inferior!derecha,!su! secuencia.(He!et!al.,!2006).! Panel! B.!Representación! esquemática! de! los! 4! plásmidos! usados! en! la! obtención! de! vectores!!! lentivirales.!Elaborado!a!partir!de!información!de!Dull!et!al.,!1998!y!Li!et!al.,!2011.! Panel!C.!Obtención!de!vectores!lentivirales!tras!transfección!de!una!célula!huésped!con!los!plásmidos! adecuados.! ! B.1 A.1 C.1 ! 58 secuencia de terminación central (CTS, central termination sequence) y elementos regulatorios post-transcripcionales del virus de la hepatitis de marmota. Por otra parte, carecen de todos los genes accesorios (vif, vpr, vpu y nef), genes reguladores (tat) y utilizan una repetición terminal larga auto-inactivante. Además, están pseudo-tipados con la glicoproteína de la envuelta del virus de la estomatitis vesicular (VSVg), el cual tiene un amplio tropismo, lo que significa que una gran cantidad de tipos celulares se pueden transducir con este sistema. La VSVg también confiere una gran estabilidad a las partículas virales, lo que permite concentrarlas por ultracentrifugación (Naldini et al., 1996). 3.6.3 Obtención de los Plásmidos. Los plásmidos necesarios para obtener lentivirus de tercera generación pMDLg-pRRE, pRSV/Rev, pMD.G, Lenti-SP-GFP y Lenti-SP-LXRα proceden del laboratorio del Dr. S. Li (Li et al., 2011), y se usaron para transformar células competentes DH5α. Posteriormente, se realizaron minipreps (Qiagen Qiaprep Spin Miniprep Kit), se comprobó la identidad de los plásmidos mediante digestión con enzimas de restricción específicas y se procedió a amplificarlos por maxiprep (Omega Bioteck EZNA Endo-Free Plasmid Maxi Kit). 3.6.4 Transfección. Los plásmidos Lenti-SP-GFP o Lenti-SP-LXRα junto con los plásmidos accesorios pMDLg-pRRE, pRSV/Rev y pMD.G se co-transfectaron en células 293T a un ratio de 10:6:1.5:2.5, usando FuGENE HD (Promega). El medio con virus se recolectó a 48h, se centrifugó a 2500G 10 minutos a 4ºC para descartar debrís celulares, y el sobrenadante se centrifugó a 86000G durante 90 minutos a 4ºC en una ultracentrífuga Beckman Optima L-100 XP usando un rotor SW41Ti. El pellet resultante se resuspendió en StemPro-34 SFM (Life Technologies) 1 % L-Glut, 1 % Pen+Strep y se almacenó a -80ºC. La eficiencia de las partículas lentivirales se examinó por citometría en células RAW264.7. 3.6.5 Transducción de células de la médula ósea y Trasplante. Para aumentar los niveles de HSCs, los ratones donantes se trataron con 5fluorouracilo (110mg/kg) i.p. 4 días antes de su sacrificio. Posteriormente, la médula ósea obtenida de fémures y tibias se centrifugó en el medio de separación por densidad Lympholyte-M (Tebu-Bio) para concentrar las células blancas, que se recuperaron y cultivaron en StemPro-34 (Life Technologies) 1 % L-Glut, 1 % Pen+Strep, 2 % Stem Pro-34 Nutrient Supplement (Life Technologies), y 10 ng/ml de IL-3, IL-6, IL-1α y mSCF (Peprotech) durante 18 horas a 37ºC y 5 % de CO2. Los vectores lentivirales más Sulfato de Protamina 8 µl/ml (Sigma P3369) se añaden a las células y la mezcla se incuba durante 5 horas. Seis horas antes del trasplante se irradian los ratones LXRα-/- recipientes con un dosis letal de 900 rads. Las HSCs transfectadas se centrifugan, se resuspenden en PBS 2 3.!Material!y!Métodos! ! 59 % FBS, se cuentan y se inyectan 2 x 106 de HSCs transfectadas junto a una fracción de células totales de médula ósea de un LXRα-/- sano (50 x 104) en un volumen de 200 µl vía plexo retro-orbital. Tras 8-12 semanas, se recoge la sangre y el bazo de los animales trasplantados para su análisis por citometría e histología, respectivamente. 3.7 Análisis de la Expresión de ARN mensajero. 3.7.1 Extracción de ARN mensajero. El ARN se extrajo según la técnica del fenol/cloforomo usando el reactivo comercial TRIZOL (Invitrogen). Para tejidos se usó el homogenizador ULTRATRURRAX (IKA). Posteriormente, se añadió cloroformo en una proporción 1:5 respecto al volumen de TRIZOL y se agitó vigorosamente 10 segundos. Tras 5 minutos a RT, se centrifugaron 15 minutos a 4ºC y 13.000 rpm. A 4ºC, se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo y se añadió isopropanol frío en una proporción 1:1 al sobrenadante. La precipitación se obtuvo a 1h RT o -20ºC toda la noche, y a continuación se centrifugó 15 minutos a 4ºC y 13.000 rpm. El precipitado se lavó con una solución fría de etanol al 75 % en agua estéril tratado con DEPC, se centrifugó 5 minutos a 4ºC y 13.000 rpm y se resuspendió en un volumen conveniente de agua estéril tratada con DEPC. La cantidad de ARN se cuantificó mediante espectofotómetro Nanodrop (ND-1000 Spectophotometer, Nanodrop Technologies) y comprobó su calidad según ratio A260/A280 y ratio 18S/28S en electroforesis de agarosa 1,5 % con buffer MOPS. 3.7.2 Estudio de perfil transcripcional mediante Microarray. Los microarrays o chips de ADN son placas que permiten analizar la expresión de miles de genes de manera simultánea. Para estudiar los cambios transcripcionales, se realizaron tres experimentos independientes en los que se diferenciaron BMDM procedentes de WT o αKO con citoquina M-CSF (10 ng/ml) durante 7 días. Al séptimo día, se levantaron, contaron, sembraron y se trataron con M-CSF (10 ng/ml), GM-CSF (10 ng/ml) o vehículo durante 24 horas. Las citoquinas son proteínas recombinantes murinas y proceden de Immunotools. Tras el tratamiento, se obtuvo el ARN según el método previamente descrito. Posteriormente, se procedió a la reunificación del ARN de los tres experimentos (en cantidades iguales) y se purificó con el kit RNeasy (Qiagen). El microarray se realizó en el Parque Científico de Madrid - UCM. La placa empleada fue el modelo Affymetrix Mouse Gene 2.0 ST Array y el software de procesado de datos el GeneChip Analysis Suite (Affymetrix). Las representaciones de Diagramas de Venn y Mapas de calor (heatmaps) las realizamos usando Bioconductor (Gentleman et al., 2004), un paquete en lenguaje R (versión 2.14.1, en interfaz RStudio versión 0.97.173). La Ontología Génica (Gene Ontology [GO] en inglés) es un campo de estudio encargada de la descripción y catalogación de los genes según la función que lleve a cabo la proteína a nivel molecular (p. ej. kinasa, nucleasa, receptor...), procesos biológicos en los que participa (p. ej. ruta de señalización, transporte de sustratos, apoptosis...) y localización dentro de la célula (p.ej. núcleo, citosol...). Mediante el análisis GO de los resultados de un microarray se puede conocer los procesos, funciones y localizaciones que se encuentran diferencialmente alterados debidos al factor experimental a estudio. Para el análisis GO se ! 60 empleó la herramienta GOrilla (Eden et al., 2009), a la que proporcionamos dos listas denominadas "target" y "background". La lista "target" contiene los genes diferencialmente upregulados o downregulados de los que se quiere conocer las categorías GO enriquecidas respecto al "background". La lista "background" corresponde a todos los genes presentes en el microarray, en nuestro caso el Affymetrix Mouse Gene 2.0 ST Array. En ambos casos, el programa usará sólo aquellas sondas y genes que tengan asignado una categoría GO. De cada categoría GO obtenemos una lista de genes, un FDR "q-value" y un "Enrichment (N,B,n,b)". Procederemos a explicar con más detalle estos últimos parámetros. GOrilla obtiene el "valor P" según el modelo hipergeométrico (hypergeometric, HG). Una distribución hipergeométrica es una distribución de probabilidad discreta relacionada con muestreos aleatorios sin reemplazamiento. La tasa de descubrimientos falsos (False Discovery Rate, FDR) es la corrección del "valor P" según el método de Benjamini y Hochberg (1995), que ajusta el "valor P" teniendo en cuenta los errores tipo I (falsos positivos) para múltiples tests. En resumen, el valor "FDR q-value" representa la proporción esperada de falsos positivos entre aquellos elementos que fueron significativos. El enriquecimiento "Enrichment (N,B,n,b)" se define como el número de veces más que se encuentra un grupo GO respecto a lo esperado. Por ejemplo, un valor de 2 significa que ese grupo GO está el doble de representado respecto a lo esperado. N - número total de genes en la lista "background". B - número total de genes que se encuentran asociados en la base de datos a un determinado término GO. n - número de genes presentes en la lista "target". b - número de genes de la lista "target" que se asocian al término GO. El enriquecimiento se calcula como (b/n)/(B/N) También se analizó el experimento de microarray GSE13125 disponible de manera pública en las bases de datos. El objetivo del microarray GSE13125 es detectar diferencias de expresión tras la activación de PU.1. Para ello se emplean células PUER, células procedentes de precursores hematopoyéticos murinos a las que se transduce retroviralmente a expresar PU.1 fusionado con el receptor de estrógenos. De esta manera, al añadir tamoxifeno (ligando del receptor de estrógenos) se produce la activación de PU.1. En el experimento, se recoge la expresión génica en condiciones basales y tras 24 horas de tamoxifeno, en triplicados. Estos datos en formato .CEL los hemos analizado mediante la interfaz Microarray Я Us (Dai et al., 2012), usando el paquete Limma (Smyth, 2004) y análisis estadístico 1-way Anova (Anova de un factor). 3.7.3 Análisis de ARN mensajero por RT-PCR. Para el análisis de los niveles relativos de ARN mensajero (ARNm) se utilizó la técnica de la Real Time-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) y el método de análisis 3.!Material!y!Métodos! ! 61 ΔΔCt. Este método permite cuantificar la abundancia relativa de un ARNm con respecto a un gen de referencia cuya expresión no cambia en las condiciones experimentales, y que se suele denominar housekeeping gene. Primero, una cantidad de 0,5-1 µg de ARNm fue retrotranscrita a ADN complementario (ADNc) usando iScript cDNA Synthesis Kit (BioRad), siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente, se usaron 12,5-25 ng de ADNc para realizar la RT-PCR con 400 nM de cebadores específicos y 15 µl de cóctel SYBR® Green PCR Master Mix (SYBR Green 2X, Diagenode) en un volumen de reacción de 20 µl. La amplificación y detección se llevó a cabo en un termociclador (iQTM5, Multicolor RealTime PCR Detection System, BioRad), y los datos se analizaron con iQ5 Software Data Analysis (BioRad). En todos los casos, la expresión relativa de ARNm se normalizó con respecto a la expresión endógena del gen 36B4. 3.7.4 Análisis de la inhibición de la expresión génica mediante siRNA. La tecnología del siRNA (small interfering RNA) se basa en que la unión de un ARN complementario (el siRNA) a un ARN mensajero impide su traducción, haciendo que la expresión absoluta del gen disminuya. En nuestro caso, se realizaron estudios con los siguientes siRNA comerciales: control siRNA (Ambion 4390843), C/EBPα (sc37048), PU.1 (sc-36331 e Invitrogen 5255362, con resultados similares), LXRα (sc38829), STAT5 (sc-29496). Para la transfección se usaron células BMDM de 4 días de diferenciación. Las células se lavaron con PBS, levantaron con PBS-EDTA 10 mM, y se sembraron en platos de cultivo tratados de 60 mm (BD FALCON #353004) a 1,5 x 106 celulas en 2,5 ml de medio RPMI completo + 1/3 medio L929. Al día siguiente, se transfectan las células con medio Opti-MEM I (Gibco #11058) y Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen #13778-075) según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se usa siRNA a una concentración final de 20 nM, en una mezcla con OptiMEM I y RNAiMAx, de la siguiente manera: Tubo A 300 µl Opti Mem I + siRNA Tubo B 300 µl Opti Mem I + 10 µl RNAiMAX Tras 5 minutos, se mezclan los tubos A y B y la mezcla se deja reposar 25 minutos a temperatura ambiente. En este periodo, se procede al lavado de las células con PBS. Entonces se añade 1 ml de Opti-MEM I por plato y 600 µl de mezcla A+B y se deja transfectar durante 8 horas. Pasado este tiempo, se pone 1600 µl de medio 2X consistente en RPMI 20 %+Ab. 2X+20 ng/ml M-CSF o GM-CSF, según el tratamiento. Tras 48 horas, se aísla el ARN con Trizol para medir la expresión génica. ! 62 3.8 Análisis de la Expresión de Proteínas. 3.8.1 Preparación de extractos proteicos. Las células se lisaron en buffer RIPA (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, Tritón X100 1 %, deoxicolato sódico 0,5 %, SDS 0,1 % y un cóctel de inhibidores de proteasas Complete protease inhibitor cocktail, (Roche #11697498001). En las muestras en las que se midió la fosforilación proteica, el buffer contenía adicionalmente cóctel de inhibidores de fosfatasas (Sigma #P-2850 y #P-5726). Los tejidos se homogenizaron en buffer RIPA en el triturador Ultra-Trurrax (IKA). A continuación, los lisados de células o tejidos se centrifugaron 5 minutos a 4ºC y 14.000 rpm. Se separaron los sobrenadantes y se cuantificaron según el método del ácido bicinconínico (Smith et al., 1985). Como control de detección de LXRα se usaron extractos de células RAW264.7 que sobreexpresan LXRα-3FLAG, descritas en la sección 3.3.2.a de Material y Métodos. 3.8.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y Western Blot. Las proteínas se separaron según su tamaño mediante electroforesis en gel de acrilamida en condiciones desnaturalizantes. Se empleó acrilamida (Bio-Rad) con una proporción 29:1 de acrilamida:bisacrilamida. La electroforesis se realizó en cubetas Mini Protean II® (Bio-Rad), con tampón de electroforesis compuesto por glicina 1.25 M, TrisHCl 12mM y SDS 0.2 %. Las proteínas separadas en el gel de poliacrilamida se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Blottansfer Medium, Bio Rad Laboratories) a un amperaje constante de 400 mA, durante 90 minutos, a 4º C en un medio de transferencia constituido por Tris 25 mM, glicina 192 mM y metanol 20 %, pH 8,3. Las membranas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con una solución que contenía leche desnatada al 5 % disuelta en TBS (Tris–HCl, 50 mM pH 7.4, NaCl 200 mM), con el fin de evitar uniones inespecíficas de los anticuerpos. Las membranas se incubaron toda la noche a 4°C en agitación suave con el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo al 1:2 en TBST (Tampón salino de Tris con el detergente Tween-20 al 0,1 %). Al día siguiente se realizaron 3 lavados de cinco minutos con TBS-T. Posteriormente, las membranas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario que lleva acopladas moléculas de peroxidasa de rábano (Horseadishperoxidase, HRP). Tras realizar otros tres lavados, la presencia de las proteínas se reveló con luminol (ECL Plus, Amersham), un compuesto que en su oxidación por la peroxidasa emite luminiscencia que puede ser detectada por exposición en una película fotosensible o con el sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad). Los anticuerpos empleados se describen en la Tabla 3.2. 3.8.3 Citometría de Flujo. El análisis de proteínas de membrana por citometría de flujo constituye un método eficaz y preciso que permite cuantificar y comparar la expresión de determinados marcadores celulares entre varias muestras, y determinar distintas poblaciones celulares. ! ! RESULTADOS 4. ! ! ! ! 71 RESULTADOS _______________________________________________________________ 4.1 Estudio de las poblaciones de macrófagos del bazo. Tal y como se detalló en la introducción, el estroma del bazo se divide en pulpa roja y pulpa blanca, delimitadas ambas regiones por la zona marginal. Las principales poblaciones de macrófagos en el bazo se corresponden con los macrófagos metalofílicos de la zona marginal (MMM), característicos por la elevada expresión de CD169 o Sialoadhesina (CD169+), los macrófagos de la zona marginal (MZM) que destacan por ser SIGNR1+, MARCO+ y Tim-4+, los macrófagos de la pulpa blanca que son CD68+ y los macrófagos de la pulpa roja, distinguibles por su expresión de F4/80+. Por otro lado, un número creciente de publicaciones demuestran la importancia del receptor nuclear LXR en la biología del macrófago, principalmente en el contexto del transporte de lípidos y control de la respuesta inflamatoria (Joseph et al., 2003) y la retirada de células apoptóticas (Alonso-Gonzalez et al., 2009). Con el objetivo de estudiar la influencia de LXR sobre las poblaciones de macrófagos esplénicos, realizamos tinciones inmunohistoquímicas de bazos procedentes de ratones WT, LXRα-/-, LXRβ-/- y LXR-DKO -carente de ambas isoformas-. De esta manera, pudimos comprobar el normal desarrollo de la población de macrófagos de la pulpa roja (F4/80+) en ratones de todos los genotipos (Ver Figura 4.1A). Sin embargo, observamos que los bazos de ratones que no expresan LXRα, en concreto los genotipos LXRα-/- y LXR-DKO, carecen de las poblaciones de macrófagos de la zona marginal MMM y MZM, mientras que los ratones con genotipos que expresan LXRα como WT y LXRβ-/-, presentan ambas poblaciones bien definidas (ver Figura 4.1.B). Con este experimento pudimos concluir que la expresión de LXRα es esencial para la formación de ciertas poblaciones de macrófagos en el bazo, en concreto MMM y MZM, pero no de otras, como los macrófagos de la pulpa roja. 4.2 Estudio de las señales de formación de la zona marginal del bazo. Procedimos entonces a realizar una búsqueda bibliográfica sobre vías de señalización importantes para la formación de las poblaciones de macrófagos de la zona 4. ! 72 ! ! A.! LAMININA F4/80 Figura'4.1.'Las'poblaciones' de' macrófagos' de' la' zona' marginal' del' bazo' dependen' de' LXRα' para'su'desarrollo.' Tinciones!inmunohistoquímicas!de!las!poblaciones!de!macrófagos!esplénicos!en!bazos!procedentes!de!ratones! WT,!LXRα_/_,!LXRβ_/_!y!LXR_DKO.! Panel!A.!Inmunodetección! de!Laminina!(azul)!y! F4/80!(marrón)!en! la! que! no!se! aprecian!diferencias!en!la! población!de!macrófagos!de!la!pulpa!roja!(F4/80+)!entre!genotipos.!! Panel! B.!!Inmunodetección! de! Marco! (azul)! y! CD169!(marrón)! en! la! que! se! aprecia! la! ausencia! de! las! poblaciones! de! macrófagos! metalofílicos! de! la! zona! marginal! (MMM,! CD169+)! y! de! macrófagos! de! la! zona! marginal!(MZM,!MARCO+)!en!los!genotipos!carentes!de!LXRα!(LXRα_/_!y!DKO).! Los!datos!son!representativos!de!4!experimentos!con!n=3_5!ratones!por!grupo.!La!barra!representa!50!μm.! WT!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!LXRα–/–!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! LXRβ–/–!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!LXR_DKO! MARCO CD169 WT!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!LXRα–/–!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! LXRβ–/–!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!LXR_DKO! B.! 4.!Resultados! ! 73 marginal en el bazo. Encontramos que los ratones plt/plt, que carecen de la expresión funcional de las quimoquinas CCL19 y CCL21, presentan un menor número de macrófagos MZM en comparación con ratones normales C57BL/6, debido a un defecto en la localización (Ato et al., 2004). Es decir, existe un menor número de macrófagos en la zona marginal porque las señales involucradas en su localización anatómica están ausentes. Por tanto, nos preguntamos si la ausencia de macrófagos de la zona marginal en los ratones que carecen de LXRα podría tener relación con un defecto en las citoquinas responsables de la localización de los macrófagos, es decir, del microambiente de señalización esplénico. Estudios previos de nuestro laboratorio nos permitieron conocer que en ratones la localización de los macrófagos en la zona marginal ocurre aproximadamente en la tercera semana del desarrollo postnatal. Consecuentemente, aislamos bazos de ratones WT y LXR-DKO recién nacidos de 1, 2 y 3 semanas de edad, y medimos la expresión de CCL19 y CCL21 mediante RT-PCR. Como se puede observar en la figura 4.2, la expresión de estas quimioquinas aumenta con la edad, pero no se observan diferencias entre ambos genotipos que pudieran explicar la ausencia de poblaciones de macrófagos de la zona marginal. Tampoco observamos diferencias en la expresión de LTα (lymphotoxin α) y su receptor, LTBR (lymphotoxin β receptor), moléculas que intervienen en la formación de los órganos linfoides (Tumanov et al., 2003). Por otro lado, la expresión de LXRα aumenta de manera paralela a la formación de la zona marginal, de manera similar al patrón de expresión de Tim-4 -un marcador de los macrófagos de la zona marginal MZMvirtualmente ausente en bazos de ratones LXR-DKO. Estos resultados indican que la expresión de las quimioquinas CCL19 y CCL21 implicadas en la organogénesis linfoide y localización de los macrófagos de la zona marginal no presenta grandes diferencias que pudieran explicar el fenotipo observado. 4.3 Experimentos de rescate de fenotipo de la zona marginal. LTα es una citoquina de la familia de TNF que interviene en el desarrollo de los órganos linfáticos, organización y mantenimiento del microambiente linfoide y en el proceso de inflamación (Ware, 2005). Los ratones deficientes en linfotoxina LTα carecen de zona marginal, pero a diferencia de los ratones carentes de LXRα, presentan defectos adicionales en los ganglios linfáticos que no observamos en los ratones LXRα-/-. Este fenotipo es debido al papel de la linfotoxina LTα en la quimiotaxis y localización, es decir, LTα proporciona las señales apropiadas para la localización de los tipos celulares involucrados en la organización de los órganos linfoides secundarios como bazo y ganglios linfáticos. Es importante tener en cuenta que los trasplantes de médula ósea de ratones WT a ratones deficientes en LTα no consiguen recuperar las poblaciones de la zona ! 74 ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! !! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 0! 2! 4! 6! 8! Expresión!Relativa!de!ARNm! ! 0! 2! 4! 6! 8! 10! Expresión!Relativa!de!ARNm! 0,0! 0,5! 1,0! 1,5! 2,0! 2,5! 3,0! Expresión!Relativa!de!ARNm! 0! 5! 10! 15! 20! 25! 30! Expresión!Relativa!de!ARNm! 0! 10! 20! 30! 40! 50! 60! Expresión!Relativa!de!ARNm! LTA! LTBR! ! CCL19! ! 0! 5! 10! 15! 20! 25! 30! Expresión!Relativa!de!ARNm! Figura' 4.2.' La' expresión' de' citoquinas' implicadas' en' la' formación' del' bazo' y' la' zona' marginal'no'presenta'diferencias'entre'WT'y'DKO.'!! Se!estudió!los!niveles!de!expresión!de!CCL19,!CCL21,!LTA,!LTBR,!LXRα !y!TIM_4!en!bazos!de!ratones!recién! nacidos!de!1,!2!y!3!semanas!de!edad!WT!y!LXR_DKO.!La!expresión!de!todos!ellos!aumenta!con!la!edad!sin! diferencias!significativas!entre!genotipos,!salvo!la!expresión!de!LXRα!y!TIM_4.!Se!indica!la!media! ±!SD!de! tres!experimentos!independientes.!*!p<0,05.! ! WT! DKO! ! LXRα! ! TIM_4! ! *! CCL21! ! 4.!Resultados! ! 75 marginal (Tumanov et al., 2003), probablemente debido a que este defecto en la señalización no permite a los precursores localizarse donde deben. Con el objetivo de comprobar si las poblaciones de macrófagos de la zona marginal se podían recuperar en ratones carentes de expresión de LXRα, trasplantamos médula ósea procedente de ratones WT, LXRα-/-, LXRβ-/- y LXR-DKO a ratones LXRDKO. Comprobamos que el trasplante con médula ósea de ratones que expresan LXRα (en concreto WT y LXRβ-/-) permite la recuperación de los macrófagos de la zona marginal en ratones LXR-DKO (Ver Figura 4.3A), efecto que no se observa cuando los donantes de medula ósea son ratones carentes de LXRα como LXRα-/- y LXR-DKO. Por otro lado, la población de macrófagos de la pulpa roja F4/80+ no se ve afectada por la presencia o ausencia de LXR (Ver Figura 4.3B). Estos resultados apoyan la idea de que el microambiente de señalización en el bazo de los ratones carentes de LXRα es correcto y por ello los precursores de la médula ósea que expresan LXRα son capaces de repoblar la zona marginal de ratones LXRDKO. Esto nos permite formular la hipótesis de que la acción de LXRα debe ocurrir a nivel de estos precursores hematopoyéticos. 4.4 Modelo de depleción de las poblaciones de macrófagos por clodronato. El clodronato es un bisfosfonato, una sustancia que al ser captada por los macrófagos se transforma en un análogo tóxico del ATP que causa la muerte celular por apoptosis. Para facilitar la captación y fagocitosis, las moléculas de clodronato se administran incluidas dentro de liposomas. Con el objetivo de estudiar la influencia de LXR en la cinética de repoblación de las poblaciones de macrófagos del bazo, se administró liposomas de clodronato a distintas cohortes de ratones para promover primero la desaparición de dichas poblaciones. Posteriormente, tratamos a los ratones con un agonista de LXR para inducir su activación y observar su influencia en la repoblación. Según estudios anteriores, tras un tratamiento de liposomas con clodronato la repoblación de los macrófagos de la pulpa roja ocurre en 2 semanas aproximadamente, mientras que la repoblación de los macrófagos de la zona marginal ocurre a lo largo de 4 semanas (van Rooijen et al., 1989). Los liposomas, que contenían clodronato o PBS como control, se administraron por vía intraperitoneal a ratones LXRβ-/- y LXRα-/-. Tras 48 horas se sacrificó una parte de los ratones y se comprobó la eficacia del clodronato en inducir la desaparición de macrófagos en el bazo. Efectivamente, se comprueba que el clodronato consigue eliminar tanto las dos poblaciones de macrófagos de la zona marginal (CD169+ y MARCO+) como los macrófagos de la pulpa roja (F4/80+) (ver Figura 4.4). Tras dos semanas, a los restantes ratones se les administró una dosis del agonista de LXR (GW3965) o vehículo cada 2 días. Tras una semana de tratamiento con GW3965 (3 semanas desde el tratamiento con clodronato), se sacrificaron los ratones y se ! 76 Figura'4.3.'Trasplantes'con'médula'ósea'de'ratones'que'expresan'LXRα'permiten'recuperar' las'poblaciones'de'macrófagos'de'la'zona'marginal'del'bazo.' Tinciones!inmunohistoquímicas!de! bazos!procedentes!de! ratones!DKO!a! los!que!se!ha!trasplantado!con! médula!ósea!de!ratones!WT,!LXRα_/_,!LXRβ_/_!o!DKO,!según!se!indica.! Panel!A.!Se!observa!la!recuperación!de!las!poblaciones!de!macrófagos!de!la!zona!marginal!en!los!ratones! trasplantados!con!médula!ósea!procedente!de!genotipos!que!expresan!LXRα!(WT!y!LXRβ_/_).! Panel!B.1La!población!de!macrófagos!de!la!pulpa!roja!F4/80+!permanece!inalterada.! Los!datos!son!representativos!de!2!experimentos!con!n=6!ratones!por!grupo.!La!barra!representa!50!μm.! ! ! DKO!!!!!!!!!DKO! WT!!!!!!!!!!DKO! A.! MARCO CD169 LXRβ–/–!!!!!!!!!!!!!DKO! LXRα –/–!!!!!!!!!!!!!! DKO! LXRβ–/–!!!!!!!!!!!!!DKO! LXRα –/–!!!!!!!!!!!!!! DKO! DKO!!!!!!!!!DKO! WT!!!!!!!!!!DKO! B.! LAMININA F4/80 4.!Resultados! ! 77 ! ! ! !!!!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! PBS$48h $ Clo+Lip $ $48h $ LXRβ –/– LXRα –/– LXRβ –/– LXRβ –/– LXRα –/– LXRα –/– CD169& MARCO& F4/80& Figura'4.4.'La'activación'farmacológica'de'LXRα'acelera'la'cinética'de'repoblación'de'las' poblaciones'de'macrófagos'del'bazo.!! La! activación! de! LXRα! con! el! ligando! sintético! GW3965! aumenta! sensiblemente! la! velocidad! de! repoblación!de!los!macrófagos!de!la!zona!marginal!CD169+!y!MARCO+ ,!mientras!que!la!repoblación!de!los! macrófagos!de!la!pulpa!roja!F4/80+!es!independiente!de!esta!activación. Imágenes!representativas!de!un!experimento!con!5!ratones!por!grupo. Escala!150!μm. Clo+Lip$ $3$semanas $ +$DMSO$$ Clo+Lip $ 3$semanas$ +$GW3965$$ ! 78 estudiaron las poblaciones de macrófagos esplénicos. Mediante inmunohistoquímica, se observa que los macrófagos de la pulpa roja F4/80+ se han recuperado de manera eficiente independientemente de LXRα. Sin embargo, se observa una mayor recuperación de la zona marginal en ratones tratados con GW3965, tal y como indican los marcadores CD169 y MARCO, con respecto a los ratones tratados con vehículo. Además, esta recuperación es dependiente de LXRα ya que sólo se observa en los ratones LXRβ-/- y no en ratones LXRα-/- (Ver Figura 4.4). Esta aproximación nos permite comprobar que LXRα es importante en la recuperación de las poblaciones de macrófagos de la zona marginal tras un tratamiento fagotóxico, y que este proceso se puede acelerar mediante activación farmacológica. 4.5 Generación de una cepa de ratones carentes de LXRα en las células hematopoyéticas (LXRαfl/fl/Vav-iCre+/-). Con el objeto de confirmar el papel de LXRα en los precursores de la médula ósea, generamos un modelo murino carente de la expresión de LXRα en células hematopoyéticas. Para ello, se realizaron una serie de cruces entre ratones con el gen de LXRα "floxeado" (LXRαfl/fl) y ratones con el gen de Vav-iCre, tal y como se detalla a continuación. Primero, para obtener ratones homocigotos LXRαfl/fl, se cruzaron ratones heterocigotos LXRαfl/+ entre sí (ver Figura 4.5A). Para aumentar el número de individuos, también se debieron de cruzar los ratones Vav-iCre entre sí. Es de destacar que por la naturaleza del genotipado de este gen es imposible distinguir homocigotos de heterocigotos, por lo que emplearemos el símbolo Vav-iCre+/ para designar a los portadores (ver Figura 4.5B). En cualquier caso, una única copia del gen es suficiente para escindir la región floxeada (de Boer et al., 2003). Finalmente, se realizaron los cruces 1 y 2 descritos en la sección 3.1.2 de Material y Métodos para obtener los ratones LXRαfl/fl/Vav-iCre+/- (ver Figura 4.6). Para el genotipado del cruce LXRαfl/fl/Vav-iCre+/- se empleó ADN de células de la médula ósea. En la cola de ratón no se observa la escisión, porque Vav-iCre sólo se expresa en células hematopoyéticas. Para comprobar el grado de escisión se estudió la expresión a nivel de ARNm de LXRα en distintos tejidos. Observamos que en órganos en los que la mayoría de células tienen un origen hematopoyético como el bazo y en células derivadas de la médula ósea (BMDM), la expresión de LXRα ha sido prácticamente anulada, pero en otros órganos como el hígado en los que el porcentaje de células hematopoyéticas es mucho menor la expresión de LXRα se conserva (ver Figura 4.7A). Además, como es de esperar, sólo los ratones homocigotos LXRαfl/fl/Vav-iCre+/ presentan deleción total de LXRα 4.!Resultados! ! 85 ! ! ! !!!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! LXRαfl/fl! Vav_iCre!_/!! ! LXRαfl/_! Vav_iCre!+/!! ! LXRαfl/fl! Vav_iCre!+/!! ! A.! B.! C.! Figura'4.10.'La'formación'de'la'zona'marginal'demuestra'haplosuficiencia'(I).' Identificación!de!macrófagos!de!la!pulpa!roja!(F4/80+,!en!verde)!y!macrófagos!de!la!zona!marginal!(SIGNR_ 1+ ,!en!rojo).!Como!referencia!se!usó!un!marcador!de!láminas!basales!(Laminin,!en!azul).!En!el!Panel!B!se! observa!que!los!ratones!heterocigotos!(LXRαfl/fl!y!Vav_iCre+/),!los!cuales!expresan!un!nivel!intermedio!de! LXRα!(figura!4.6!y!4.7),!presentan!una!población!normal!de!MZM.!! La!barra!representa!50!μm.!Se!muestra!un!experimento!representativo!de,!al!menos,!otros!tres!por!grupo. ! Laminin1 SIGNR11F4/801 ! 86 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura'4.11.'La'formación'de'la'zona'marginal'demuestra'haplosuficiencia'(II).'' Identificación! simultánea!de! las!dos!poblaciones!de!macrófagos! de! la!zona!marginal!(MMM! CD169+ ,!en! verde!y!MZM!Marco+ ,!en!rojo).!Como!referencia!se!usó!un!marcador!de!núcleos!(DAPI,!en!azul).!!En!el!Panel! B.!se!observa!que!los!ratones!heterocigotos!(LXRαfl/fl!y!Vav_iCre+/),!los!cuales!expresan!un!nivel!intermedio! de!LXRα!(figura!4.6!y!4.7),!presentan!poblaciones!normales!de!MMM!y!MZM.!! La!barra!representa!50!μm.!Se!muestra!un!experimento!representativo!de,!al!menos,!otros!tres!!por!grupo. ' A.! LXRαfl/fl! Vav_iCre!_/!! ! LXRαfl/_! Vav_iCre!+/!! ! LXRαfl/fl! Vav_iCre!+/!! ! B.! C.! DAPI1CD1691MARCO11 4.!Resultados! ! 87 células hematopoyéticas es suficiente para el desarrollo de las poblaciones de macrófagos de la zona marginal, fenómeno conocido como haplosuficiencia. 4.7 Reconstitución de la actividad de LXRα en progenitores hematopoyéticos mediante Lentivirus. Para ahondar en el estudio de la formación de la zona marginal y de la señalización dependiente de LXRα, establecimos un modelo de ganancia de función de LXRα. Para ello, reconstituimos la expresión de LXRα en HSCs de ratones LXRα-/- usando un sistema lentiviral específico de células mieloides (Li et al., 2011). Estos lentivirus están pseudotipados con la glicoproteína de la envuelta del virus de la estomatitis vesicular (VSVg), lo que les confiere un alto tropismo y por tanto, capacidad para transducir muchos tipos celulares diferentes. Por otro lado, el promotor sintético SP (Synthetic Promoter) que dirige la expresión del gen se activa sólo en células mieloides, por lo que la expresión de LXRα estará restringida a dicho linaje, tal y como se detalla en la sección 3.6 de Material y Métodos. Como control de la expresión se empleó un lentivirus que en lugar de LXRα contiene la proteína verde fluorescente GFP (Green Fluorescent Protein), cuya presencia es fácilmente detectable. Primero, examinamos la expresión de GFP en monocitos de animales LXRα-/- trasplantados con medula ósea enriquecida con HSCs transfectadas con Lenti-SP-GFP o Lenti-SP-LXRα. Observamos que tras 8 semanas, entre un 30 % a un 40 % de los monocitos de sangre periférica son GFP+ (ver Figura 4.12). Estos datos indican que la transfección de las células HSCs con el lentivirus ha dado lugar a un porcentaje sustancial de monocitos sanguíneos transfectados, por lo que, a las 12 semanas, procedimos a estudiar la reconstitución de la zona marginal de estos ratones. Los análisis de secciones de bazo muestran una recuperación parcial en los ratones trasplantados con células tratadas con lenti-SP-LXRα de ambas poblaciones de macrófagos de la zona marginal según los marcadores CD169, Marco y Tim-4, mientras que los ratones trasplantados con HSCs tratadas con lenti-SP-GFP carecen de las poblaciones de macrófagos de la zona marginal, en consonancia con nuestra hipótesis inicial (ver Figura 4.13). Con estos resultados mostramos que la re-introducción del gen LXRα en células de médula ósea LXR-deficientes es suficiente para, mediante trasplante, inducir una recuperación de las poblaciones de macrófagos de la zona marginal. 4.8 Estudio de la fagocitosis de plaquetas opsonizadas en la Zona Marginal. Como parte de otros estudios realizados en nuestro laboratorio, habíamos comprobado la gran capacidad de los macrófagos de la zona marginal para fagocitar antígenos sanguíneos tales como dextrano o partículas de S. aureus (A-Gonzalez et al., 2013). A continuación, nos propusimos estudiar el papel de los macrófagos de la zona ! 88 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura' 4.12.' Ratones' LXRαH/H'trasplantados' con' HSCs' transfectadas' con' LentiHSPHGFP' muestran,'8'semanas'después,'en'torno'al'40'%'de'monocitos'en'sangre'GFP'positivos.!! Siguiendo! el! procedimiento! descrito! en!Material! y! Métodos! (sección! 3.8.3),! los! monocitos! obtenidos! a! partir! de! la! sangre! de! ratones! LXRα_/_! fueron! detectados! mediante! citometría! de! flujo.! El! número! mostrado! dentro! de! la! zona! enmarcada! en! azul! (derecha)! indica! el! porcentaje! de! células! GFP+! de! la! población!CD115+!(izquierda).!! Se!muestra!un!experimento!representativo!de!otros!tres,!cada!uno!de!ellos!con!n=4_5!ratones!por!grupo.! Ly6C CD115 GFP 10 4 10 3 10 2 10 1 10 4 10 3 10 2 10 1 101 102 103 104 101 102 103 104 0.5 38 Control Lenti_GFP 4.!Resultados! ! 89 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! A.! B.! C.! LXRα–/–! +"Lenti_GFP LXRα –/– +"Lenti+LXRα Figura' 4.13.' Recuperación' parcial' de' las' poblaciones' de' MMM' (CD169 + )' y' MZM' (MARCO+/TimH4+)'en'ratones'trasplantados'con'HSCs'tratadas'con'lentiHSPHLXRα.!! Los!bazos!de!ratones!LXRα!_/_!tratados!con!lentivirus!se!recolectaron!tras!12!semanas!y!se!realizó!una! inmunodetección! fluorescente!según! se!describe!en! Material!y!Métodos!(sección! 5).!En! azul! se! muestra! Laminin.!En!rojo!se!muestra!en!el!Panel!A.!CD169,!en!el!Panel!B.1MARCO!y!en!el!Panel!C.!Tim_4.'! La!barra!representa!100!μm.!Imágenes!representativas!de!2!experimentos!independientes!con!resultados! similares,!con!n=4_5!ratones!por!grupo.! Laminin11111!CD1691 Laminin11111!MARCO1 Laminin11111!TimI41 ! 90 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura'4.14.'Captura'de'plaquetas'opsonizadas'en'la'Zona'Marginal.' Inmunofluorescencia! de!secciones! seriadas! de!bazo! de!ratones! WT! y! LXR_DKO!a!los!que!se!les!inyectó! plaquetas!opsonizadas!frente!a!CD41,!según!se!explica!en!Material!y!Métodos!sección!3.5.1.!! Panel! A.!El! reconocimiento! de! las! plaquetas! opsonizadas! por! CD41! se! reveló! usando! un! anticuerpo! secundario! anti_rata! AF488.!La!unión! inespecífica! del! secundario! se! valoró! en! ratones! a! los! que! se! les! inyectó!plaquetas!sin!opsonizar.!Como!marcador!de!la!zona!marginal!se!usó!SIGNR1!(en!rojo).!La!barra! representa!300!µm.!! Panel!B.!Las!plaquetas!se!marcaron!con!celltracker_CMTPX!previo!a!su!opsonización,!lo!que!les!confiere!un! color!rojo.!Como!marcador!de!la!zona!marginal!se!usó!Marco!(en!verde).!La!barra!representa!120!µm.! Las!fotos!son!representativas!de!3!experimentos!independientes!con!5!ratones!por!grupo.! DKO! WT! WT! DKO! CD411 CD411 MARCO1 MARCO1 CMTPXIPlaquetas1 CMTPXIPlaquetas1 SIGNR11 SIGNR11 A.! B.! 4.!Resultados! ! 91 marginal en la fagocitosis de plaquetas en un modelo murino de Púrpura Trombocitopénica Idiopática (cuyas siglas en inglés son ITP), una enfermedad con una prevalencia de 9,5 casos por cada 100.000 personas en los EEUU (Michel, 2009), que se caracteriza por un bajo contaje de plaquetas y médula ósea normal, en la que hay una destrucción elevada de plaquetas por autoanticuerpos frente a antígenos de membrana plaquetarios (George et al., 1994). Procedimos a aislar plaquetas de sangre de ratones donantes y las opsonizamos con un anticuerpo frente a la integrina gpαIIb (CD41), situada en la superficie de plaquetas (Mizutani et al., 1993), tal y como se describe en la sección 3.5.1 de Material y Métodos. Las plaquetas opsonizadas se inyectaron en ratones WT y DKO, y como procedimiento control se inyectaron plaquetas sin opsonizar. Tras 90 minutos, se aislaron los bazos y se reveló la presencia de CD41 mediante un anticuerpo secundario específico y la población de macrófagos de la zona marginal con un anticuerpo frente a SIGNR1. Se observa que las plaquetas opsonizadas son capturadas de forma mayoritaria en la zona marginal en ratones WT, mientras que en ratones LXR-DKO, en los que no hay macrófagos de zona marginal, las plaquetas opsonizadas se observan dispersas por la pulpa roja (Ver Figura 4.14A). Para corroborar los resultados obtenidos, procedimos a realizar un experimento adicional con un enfoque diferente. En vez de detectar el anticuerpo anti-CD41 que opsoniza a las plaquetas, la detección la conseguimos marcando a las plaquetas con CMTPX, un producto fluorescente no tóxico capaz de marcar células in vivo. De esta manera, tras la opsonización e inyección, pudimos detectar de manera directa los lugares en los que se acumulan las plaquetas opsonizadas. Pudimos comprobar que, al igual que en el caso anterior, las plaquetas colocalizan con macrófagos de la zona marginal (MARCO+) en ratones WT, mientras que en ratones LXR-DKO las plaquetas se encuentran dispersas por la pulpa roja (Ver Figura 4.14B). Por tanto, hemos podido comprobar que los macrófagos de la zona marginal no sólo son importantes en la captura de bacterias y cuerpos extraños, sino que contribuyen a la captura de células propias opsonizadas, fenómeno posible en enfermedades autoinmunes como la ITP. 4.9 Estudio transcripcional en Macrófagos en respuesta a M-CSF o GM-CSF. Los resultados hasta aquí presentados, así como otros experimentos realizados en nuestro laboratorio, parecen demostrar que los progenitores de las poblaciones de macrófagos de la zona marginal proceden de la médula ósea. Además, hemos mostrado que la ausencia de expresión de LXRα en estos progenitores hematopoyéticos es la que impide la formación de las poblaciones de macrófagos de la zona marginal, tal y como se observa en los ratones LXRαfl/fl/Vav-iCre+/- y en los ratones LXRα-/- trasplantados con médula ósea reconstituida con Lentivirus-LXRα, y que la activación farmacológica acelera la cinética de repoblamiento en ratones con actividad LXRα. ! 92 Con el objeto de estudiar las rutas génicas gobernadas por LXRα que nos permita profundizar en el conocimiento de estos fenómenos, nos planteamos un estudio transcripcional empleando como modelo la diferenciación in vitro de progenitores de médula ósea en presencia o ausencia de LXRα. Para ello, estudiamos mediante microarray la expresión génica de monocitos derivados de médula ósea (BMDM) procedentes de ratones WT y LXRα-/- a los que se estimuló durante 24 horas con las citoquinas M-CSF, GM-CSF o vehículo, de manera similar a la aproximación descrita en Fleetwood et al., 2007. De esta manera, pretendemos sustanciar el papel regulatorio de LXRα sobre los genes modulados por estas citoquinas. 4.9.1 Expresión génica en respuesta a M-CSF. Tras la estimulación de células BMDM con M-CSF recombinante murina durante 24 horas, un total de 222 genes se encuentran inducidos de manera común en ambos genotipos con respecto al control sin tratar, mientras que se inducen de manera diferencial 74 genes en WT y 78 genes en LXRα-/- (ver Figura 4.15A). La expresión de cada uno de los genes se representa en la Figura 4.15B en forma de código de colores (heatmap), así como la expresión y el nombre de los 20 genes más inducidos de cada grupo en la Figura 4.15C. El análisis de la Ontología Génica (GO) indica que el proceso más representado por los genes cuya expresión es inducida por M-CSF es el de la división celular (cell division), tanto en los genes inducidos en WT como en los genes inducidos en LXRα-/- y en los genes inducidos en ambos, tal y como se observa en la Tabla 4.1. Otras categorías diferencialmente representadas corresponden a genes involucrados en el mantenimiento de la replicación del ADN (maintenance of fidelity involved in DNA-dependent DNA replication) y genes con actividad helicasa (helicase activity). De manera exclusiva en LXRα-/- se encuentran inducidos genes involucrados en la actividad quimioquina (chemokine activity) y respuesta inflamatoria (inflammatory response) (Tabla 4.1), lo que sugiere que las células BMDM carentes del receptor nuclear LXRα presentan una mayor respuesta proinflamatoria a M-CSF. Por otro lado, la estimulación con M-CSF conduce a la represión de la expresión de 5 genes de manera común en WT y LXRα-/-, 8 genes en WT y 25 en LXRα-/- (ver Figura 4.16). Debido al bajo número de genes reprimidos, el análisis GO en este caso no nos aporta categorías significativamente reguladas. Por tanto, el tratamiento de células BMDM con la citoquina M-CSF tiene como efecto principal la inducción de genes involucrados mayoritariamente en la división celular. 4.!Resultados! ! 93 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura' 4.15.' Diagrama' de' Venn' y' Mapa' de' Calor' de' los' genes' upregulados' por' MHCSF'en' células'BMDM'WT'y'LXRαH/H'.' Tras! 7! días! de! diferenciación,! las! células! BMDM! se! trataron! con! M_CSF!durante! 24h! y! se! analizó! la! expresión!génica!con!respecto!al!control!sin!tratar,!tal!y!como!se!detalla!en!Material!y!Métodos!sección! 3.3.1.a.!! Panel!A.!Diagrama!de!Venn!que!permite!visualizar!tres!grupos!de!genes:!genes!inducidos!exclusivamente! en! WT! (n=74),! genes! inducidos! de! manera! común! en! ambos! grupos! (n=222)! y! genes! inducidos! exclusivamente!en!LXRα_/_!(n=78).! Panel! B.!Mapa!de!calor! de!los!genes!inducidos!por!M_CSF!en!células!BMDM!WT!(columna!izquierda)!y! LXRα_/_!(columna!derecha).!Se!representa!la!expresión!de!los!genes!agrupados!según!el!Diagrama!de!Venn! del!Panel!A.!! Panel! C.!Mapa! de! calor! de! los! 20! genes! con! mayor! diferencia! de! expresión! con! respecto! al! control! agrupados!según!el!Diagrama!de!Venn!del!Panel!A.!! Valores!de!expresión!en!escala!logarítmica.! ! LXRαI/I1 WT1 Comunes1 WT! n=74!! ! LXRα _/_! n=78! ! Comunes! n=222! ! !!WT!!!!!!!!!!LXRα_/_! ! !WT!!!!!!!!!!! LXRα_/_! ! WT! ! ! Comunes! ! B.! A.! C.! LXRα _/_! ! ! 94 ! TABLA'4.1.'El'análisis'ontogénico'revela'que'el'tratamiento'con'MHCSF'induce'la'expresión'principalmente'de' genes'de'la'división'celular.!! Selección!de!categorías!GO!significativamente!enriquecidas!en!cada!uno!de!los!tres!grupos!establecidos!por!el!Diagrama!de!Venn! (Figura! 4.12).! Descripción! detalla! del! FDR! q_value! y! Enrichment! en! el! apartado! de! Material! y! Métodos! sección! 3.7.2.! En! la! columna!"Abundancia"!se!representa!en!un!gráfico!el!número!de!genes!de!cada!grupo!("WT"!en!negro,!"Comunes"!en!gris!y! "LXRα!_/_"!en!blanco)!presentes!en!cada!categoría!GO.! ! GO ! ! ! Descripción! ! WT Comunes LXRα -/- Abundancia! ! ! ! ! ! ! GO:0051301! 1 1 1 1 1 1 cell1 division1 ! Syce2,Nek2,Ska1,! Nup43,Cenpw,Cdca3,! Ube2c,Cks1b.! ! ! Cenph,Cdca7,Mastl,Zwilch,Kntc1,Dsn 1,Wee1,Cdca2,Lig1,Nuf2,Fbxo5,Cit,! Tipin,Spc25,Sgol1,Aurkb,Aurka,! Cdca5,Racgap1,Casc5,Kif18b,Mad2l1, Top2a,F630043A04Rik,Ncaph,Spag5, Ncapd2,Cdc6,Kif11,Plk1,Ercc6l,! Mcm5,Tpx2,Ccna2,Cep55,Anln,Ect2,! Ccne1,Ccnd2,Ccnd1,Ccnb1,Smc2,! Ccnf,Cks2,Ccne2,Ndc80,Cdc7,! 6720463M24Rik,Kif2c,! Cdk1,Cdc25c,Kif20b,Cdc45,Prc1,! Bub1b,Bub1,Hells,Nsl1,Nusap1,! Birc5,!Oip5.! ! ! Fam83d,Cenpe,Ccnb2,Cdca8,! Sgol2,Cdc25a,Cenpt,! ! FDR! q_value! 4.95E_2! ! Enrichment! (N,B,n,b)! 6.83! (21400,353,71,8)! FDR! q_value! 2.85E_54! ! Enrichment! (N,B,n,b)! 16.96! (21400,353,218,61)! FDR! q_value! 9.63E_2! ! Enrichment! (N,B,n,b)! 5.66! (21400,353,75,7)! GO:0045005! ! ! ! ! ! maintenance1of1 fidelity1 involved1in1 DNAIdependent1 DNA1replication1 ! Zranb,3,! Pold1.! ! Brca2,Tonsl,! Tipin,Mms22l.! ! _! ! FDR! q_value! 5.52E_1! ! Enrichment! (N,B,n,b)! 46.37! (21400,13,71,2)! FDR! q_value! 6.54E_4! ! Enrichment! (N,B,n,b)! 30.20! (21400,13,218,4)! ! _! ! ! _! ! GO:0004386! ! ! ! helicase1 activity1 1 ! _! ! ! Mcm8,Hells,Mcm2,Mcm4,! Polq,Rad54l,Mcm3,Mcm7,! Ercc6l,Brip1,Mcm5,Mcm6.! ! _! ! ! ! ! _! ! _! ! ! FDR! q_value! 2.44E_6! ! ! Enrichment! (N,B,n,b)! 8.54! (21400,138,218,12)! ! ! _! ! ! ! _! ! ! ! GO:0008009! ! ! ! chemokine1 activity1 1 1 ! ! _! ! ! _! ! Ccl12,Ccl6,Cxcl3,! Ccl17,Ccl3,Ccl4.! ! ! ! _! ! ! _! ! ! _! ! ! _! ! FDR! q_value! 8.79E_6! ! Enrichment! (N,B,n,b)! 48.91! (21400,35,75,6)! GO:0006954! ! inflammatory1 response1 ! ! _! ! ! ! _! ! ! Il1a,Ccl12,Cxcl3,Ccl3,! Rasgrp1,Ccl4.! ! ! ! _! ! ! _! ! ! _! ! ! _! ! FDR! q_value! 1.06E_1! ! ! Enrichment! (N,B,n,b)! 6.69! (21400,256,75,6)! ! 4.!Resultados! ! 101 de CD209a en células murinas depende exclusivamente de su inducción por GM-CSF y no por M-CSF. Para comprobar que las células carentes de LXRα responden correctamente a GM-CSF, y que el defecto está restringido sólo a un subgrupo de genes como CD209a, se analizó la expresión de genes que, basándonos en los resultados obtenidos en el microarray, se inducen en respuesta a GM-CSF tanto en células WT como LXRα. De esta manera, confirmamos que el patrón de expresión de genes como IRF4 y Clec10a1 en células BMDM en respuesta a GM-CSF es similar en ambos genotipos (Ver Figura 4.19C). Estos datos sugieren que la vía de señalización de GM-CSF no se encuentra afectada de manera general en células WT y LXRα, pero que la expresión de CD209a requiere de la presencia de LXRα. 4.12 La vida media de LXRα es menor que la de LXRβ. Recientemente, se ha descrito que LXRα tiene una tasa de renovación molecular mucho más alta que LXRβ en células humanas (Ignatova et al., 2013). Para estudiar este efecto en células murinas, hemos empleado un inhibidor de síntesis proteica denominado cicloheximida (CHX) (Schneider-Poetsch et al., 2010) tanto en células RAW264.7 transfectadas con LXRα-3FLAG como en células BMDM WT (Figura 4.20 A). Hemos comprobado por western blot que tras un tratamiento de CHX de 6 horas, los niveles de LXRα disminuyen significativamente (Ver Figura 4.20A). De manera similar, los niveles de ABCA1 se reducen de manera muy llamativa tras el tratamiento con CHX. Esto concuerda con trabajos previos (Arakawa et al., 2009; Zhou et al., 2010) en los que se describe la alta tasa de renovación de ABCA1, sustentada en una alta tasa de degradación y síntesis proteica. La expresión de LXRβ, STAT5 o β-actina no se ven afectadas por el tratamiento con CHX (Ver Figura 4.20A). Esto se debe a que tienen una mayor vida media y una menor tasa de recambio que LXRα y ABCA1, y por tanto, la inhibición de la síntesis proteica durante un intervalo de 6h no modifica sus niveles de proteína. Por otro lado, el tratamiento con CHX conduce a un bloqueo en la inducción de la expresión de CD209a en respuesta a GM-CSF (Figura 4.20 B). Esto es consistente con un papel de LXRα en la regulación de CD209a, ya que hemos comprobado mediante western blot, que el tratamiento con CHX consigue prácticamente suprimir los niveles de proteína de LXRα. ! 102 0! 2! 4! 6! 8! 10! Expresión$RelaKva$ ctl! M_CSF! GM_CSF! 0! 2! 4! 6! 8! 10! Expresión$RelaKva$ ctl! M_CSF! GM_CSF! 0! 5! 10! 15! 20! BMDM! MDM! Expresión!Relativa! control! IL4! GM_CSF! GM_CSF+IL4! 0! 10! 20! 30! 40! WT! LXRα!_/_! LXRβ!_/_! LXRαβ!_/_! Expresión!Relativa! control! M_CSF! GM_CSF! IRF4! ! CLEC10a1! ! A.! B.! C.! CD209a! ! CD209a/DC_SIGN! ! Figura'4.19.'La'expresión'de'CD209a'en'células'BMDM'depende'de'GMHCSF'y'LXRα.' Panel!A.!Se!midió!la!expresión!de!CD209a!en!BMDM!(ratón)!tratadas!con!GM_CSF!o!IL4!murinas!(10!ng/ml! en!cada!caso)!y!DC_SIGN!en!MDM!(humano)!tratadas!con!IL_4!(1000!U/ml),!o!GM_CSF!(100!ng/ml)!humanas! durante!16!horas.!!Como!control!se!usaron!células!tratadas!con!M_CSF.!! Panel!B.!Se!midió!la!expresión!de!CD209a!en!BMDM!procedentes!de!ratones!de!los!4!genotipos!indicados,!! tratadas!con!M_CSF!o!GM_CSF!(10!ng/ml)!o!vehículo!durante!24!horas.!!! Panel!C.!Se!midió!la!expresión!de!IRF4!y!Clec10a1!en!BMDM!extraídas!de!ratones!WT!o!de!LXRα_/_,!tratadas! con!M_CSF!o!GM_CSF!(10!ng/ml)!o!vehículo!durante!24!horas.!!! Se!indica!la!media!±!SD!de!tres!experimentos!independientes.!*!p<0,05,!p<0,01!con!respecto!a!su!control.! ! ! *! *! !!!!!!!!!*! *! !!!!**! !!!!!!**! *! *! *! *! 4.!Resultados! ! 103 ! ! ! 0! 20! 40! 60! 80! 100! 0h 1h 3h 6h Expresión!Relativa! GM! GM+CHX! CHX(5µM) - - + + - - + + GW(1µM)+LG(100nM) - + - + - + - + ABCA1 ! RAW_LXRα_3FLAG ! BMDM!WT!! LXRβ ! LXRα_3FLAG! LXRα! STAT5 ! β_actina ! A.! B.! Figura'4.20.'LXRα'es'sensible'a'CHX,'lo'que'afecta'a'la'expresión'de'CD209a.' Panel!A.!Inmunodetección!de!los!niveles!de!LXRα,!LXRβ,!ABCA1,!STAT5!y!β_actina!en!células!RAW_LXRα_ flag!y!BMDM!WT!en!respuesta!a!ligandos!y!Cicloheximida!(CHX).!Se!comprueba!el!efecto!de!un!tratamiento! de! 6h.! de! CHX! en! proteínas! de! alto! recambio! como! LXRα! y! ABCA1,! mientras! que! proteínas! de! menor! recambio! molecular! como! LXRβ,! STAT5! y! β_actina! no! se! ven! afectadas.! ! Se! muestran! imágenes! representativas!de!2!experimentos!independientes.! Panel!B.!Expresión!de!CD209a!medida!mediante!RT_PCR!en!células!BMDM!WT!tratadas!con!GM_CSF!(10! ng/ml)!y!cicloheximida!(CXH,!5μM)!o!vehículo!durante!los!tiempos!especificados.!Se!indica!la!media!±!SD! de!dos!experimentos!independientes.!*!p<0,05.! ! ! CD209a! ! !!!*! ! 104 4.13 La expresión de CD209a requiere de la expresión de LXRα, pero es independiente de activación farmacológica. Previamente, hemos demostrado que las células BMDM de ratones carentes de LXRα no son capaces de inducir la expresión de CD209a en respuesta a GM-CSF (Ver Figura 4.19B). A continuación, nos preguntamos si es posible inducir la expresión de CD209a mediante la activación farmacológica de LXR con el ligando GW3965, o por el contrario inhibirla con el antagonista GW233. Observamos que el ligando GW3965 no incrementa la expresión de CD209a ni en solitario (Ver Figura 4.21A), ni en conjunción con GM-CSF (datos no mostrados). Por otro lado, como era de esperar, el tratamiento con GW3965 sí incrementa la expresión de ABCA1, una diana conocida de LXR (Ver Figura 4.21A). Paralelamente, realizamos un tratamiento con el antagonista de LXR llamado GW233 (Zuercher et al., 2010). Está descrito que GW233 es capaz de antagonizar con el ligando GW3965 en la inducción farmacológica de ABCA1 y que, además, puede disminuir los niveles de ABCA1 por debajo de los niveles sin estimulación farmacológica, es decir, es capaz incluso de disminuir los niveles basales de ABCA1 (Zuercher et al., 2010), lo que hemos podido comprobar en nuestros experimentos (Ver Figura 4.21A). Además, se observa que la inhibición de LXR mediante GW233 disminuye la expresión basal de CD209a alrededor de un 70 % (Ver Figura 4.21A), y que cuando GW233 se usa en conjunción con GM-CSF, se produce una inhibición de la inducción de CD209a de alrededor de un 40 % (Ver Figura 4.21B). Estos sorprendentes resultados obtenidos con GW3965, contrarios a nuestra hipótesis previa, nos indican que a pesar de que la expresión de CD209a es dependiente de LXRα, la estimulación farmacológica con este ligando sintético no conduce a cambios significativos en su expresión. Por otro lado, el hecho de que GW233 sea capaz de disminuir los niveles basales de ABCA1 podría explicarse por el mayor tamaño molecular del inhibidor, que implicaría una perturbación de la estructura conformacional de LXR que dificulte la asociación de proteínas coactivadoras (Zuercher et al., 2010). Quizá, esto pueda explicar por qué la activación farmacológica no consigue inducir la expresión de CD209a, pero el tratamiento con el antagonista GW233 es capaz de inhibir los niveles basales y la inducción de CD209a. 4.14 El Lipopolisacarido (LPS) inhibe la expresión de CD209a in vitro. Se ha descrito que la inyección de LPS, un componente de la membrana externa de bacterias Gram negativas, promueve el reclutamiento de células Mo-DCs CD209a+ a nódulos linfáticos de la piel (pero no al bazo) en ratones in vivo (Cheong et al., 2010). En consecuencia, nos propusimos estudiar la influencia del tratamiento de LPS en la regulación de CD209a mediada por GM-CSF en células BMDM in vitro. 4.!Resultados! ! 105 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! GW3965 - - + + - - + + GW233 - + - + - + - + CD209a! 0! 1! 2! 3! 4! 5! Expresión Relativa! 0! 2! 4! 6! 8! 10! 12! 14! Expresión Relativa! ABCA1! GM-CSF - + + GW233 - - + CD209a! GM-CSF - + - + - + - + LPS - - + + - - + + 0! 500! 1000! 1500! 2000! 2500! Expresión!Relativa! GM-CSF - + - + - + - + LPS - - + + - - + + iNOS! CD209a! Figura'4.21.' La'expresión'de'CD209a'en'respuesta'a'GMHCSF'se've'afectada'por'un'inhibidor' farmacológico' de' LXR' (GW233)' y' por' LPS,' pero' no' por' un' agonista' especifico' de' LXR' (GW3965).' Panel!A.!Niveles!de!ARNm!de!CD209a!y!ABCA1!en!células!BMDM!WT!tratadas!durante!24h.!Se!observa!que! el!ligando! de! LXR!GW3965! (1μM)!no!induce!la!expresión!de!CD209a,!pero!el! inhibidor!de!LXR!GW233! (2μM)!si!inhibe!su!expresión!basal.!*!p<0,05!con!respecto!a!su!control.! Panel! B.!Niveles! de! ARNm! de! CD209a! en! células! BMDM! WT! tratadas! durante! 24h.! Se! observa! una! inhibición!de!la!inducción!de!CD209a!por!GM_CSF!(10!ng/ml)!debida!al!inhibidor!de!LXR!GW233!(2μM).! Panel! C.!y! D.!Niveles!de! ARNm! de! iNOS! y!CD209a!en! células! BMDM! WT! (negro)!y! LXRα_/_!(blanco)! en! respuesta!a!GM_CSF!(10!ng/ml)!y!LPS!(100!ng/ml)!durante!24h.!Se!observa!la!inhibición!inducida!por!LPS! sobre!la!expresión!de!CD209a.!*!p<0,05.! Se!indica!la!media!±!SD!de!dos!experimentos!independientes.! ! ! C.! A.! B.! D.! 0! 50! 100! 150! Expresión!Relativa! WT! LXRα_/_! ! *! *! *! *! *! *! WT! LXRα_/_! ! ! 106 La expresión de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) aumenta en respuesta a LPS (Nussler et al., 1992), por lo que en este caso lo usaremos como control de una adecuada estimación inflamatoria. Como podemos ver en la Figura 4.21C, el tratamiento con LPS induce la expresión de iNOS pero inhibe tanto la inducción mediada por GMCSF como los niveles basales de CD209a (Ver Figura 4.21D). En concordancia con estos resultados, el reclutamiento de la ARN Polimerasa II (Pol2) al promotor de CD209a disminuye tras una exposición de 60 minutos a LPS en células BMDCs, tal y como detallaremos más adelante (Ver Figura 4.26B). Estas evidencias parecen indicar que la señalización LPS-TLR4 promueve el reclutamiento de monocitos in vivo, probablemente a través de las moléculas CD14 y CCR7, hacia las zonas ricas en linfocitos T de determinados ganglios linfáticos en forma de Mo-DCs CD209a+ (Cheong et al., 2010), pero in vitro tiene un efecto inhibitorio en la expresión de CD209a sobre células derivadas de la médula ósea. 4.15 La captación de Manosa y Fucosa no presenta diferencias significativas entre células WT y LXRα-/-. Ya hemos adelantado en la introducción que CD209a es un receptor de tipo lectina, receptores especializados en la unión de azúcares (Powlesland et al., 2006). El receptor DC-SIGN humano une preferentemente oligosacáridos formados por manosa y fucosa (Guo et al., 2004), al igual que los homólogos murinos (Powlesland et al., 2006), oligosacáridos que se encuentran en estructuras propias pero también en patógenos (Guo et al., 2004). Debido a las diferencias de expresión de CD209a en células BMDM WT y LXRα-/-, y que el proceso de unión de manosa se encuentra diferencialmente regulado en nuestro Microarray (Ver Tabla 4.2), nos propusimos investigar si esta diferencia se traduciría en una diferencia en la unión de manosa o fucosa. Para ello, se cultivaron las células BMDM con esferas de poliacrilamida-FITC conjugadas con manosa (FITCPAA-Man) o fucosa (FITC-PAA-Fuc) y tras efectuar sucesivos lavados para eliminar esferas no unidas, estudiamos la captación mediante microscopía de fluorescencia (Ver Figura 4.22). Las células BMDM estimuladas con M-CSF, presentan una mayor captación de esferas de FITC-PAA-Man que de FITC-PAA-Fuc, aunque no se aprecian diferencias significativas entre genotipos. Por otro lado, la captación de esferas de FITCPAA-Fuc es muy similar a la captación de esferas de FITC-PAA-Man en células BMDM tratadas con GM-CSF. Por tanto de acuerdo a los resultados de nuestra aproximación, a pesar de la gran diferencia de expresión de CD209a, la captación de esferas de FITC-PAA-Man y FITC-PAA-Fuc no parece presentar grandes diferencias en células BMDM WT y LXRα-/-. 4.!Resultados! ! 107 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! FITC!_PAA! ! FITC!_PAA_FUCOSA! FITC!_PAA_MANOSA! WT! LXRα_/_! WT! LXRα_/_! M_CSF! GM_CSF! Figura'4.22.'La'captación'de'Manosa'y'Fucosa'no'muestra'diferencias'en'células'derivadas' de'la'médula'ósea'WT'y'LXRαH/H.' Se!estudió!la!captura!de!las!esferas!FITC_PAA_azúcar!o!vehículo!FITC_PAA!(100!μg/ml)!en!células!BMDM! WT! y! LXRα_/_!tratadas! previamente! con! M_CSF! o! GM_CSF! durante! 24! horas.! Mediante! microscopía! de! fluorescencia!no!se!observaron!diferencias!significativas!entre!genotipos.!Imágenes!representativas!de!3! experimentos!independientes!tomadas!a!un!aumento!de!40X.! ! ! 108 4.16 Estudio de la vía de señalización de GM-CSF. Tal y como se detalló en la introducción, GM-CSF induce su respuesta a través de un receptor heterodimérico constituido por una subunidad GMRα exclusiva y una subunidad GMRβc común a los receptores de IL3 e IL5. Las principales rutas de señalización son Jak-STAT, PI3K-AKT y ERK-MAPK (Perugini et al., 2010). Para explorar qué intermediarios de señalización juegan un papel relevante en la expresión de CD209a, decidimos emplear inhibidores específicos de dichas rutas (Ver Figura 4.23A). En primer lugar, parece que la vía de ERK no interviene en la regulación de CD209a, ya que un inhibidor específico de esta vía, PD98059, no altera su expresión en respuesta a GM-CSF. Por otro lado, empleamos dos inhibidores de la actividad de la ruta IKK-NFκB denominados BI605906 y SN50. BI605906 es un inhibidor de IKK B, mientras que SN50 es un péptido que contiene la secuencia NLS de p50 y actúa bloqueando la translocación nuclear del dímero RelA:p50. A la vista de los resultados, parece que la señalización de la vía IKK-NF-κB no tiene un papel primordial en la inducción de la expresión de CD209a por GM-CSF. El inhibidor de p38 SB203580 inhibe parcialmente la expresión de CD209a. En este caso, puede que la actividad de p38 intervenga en la cascada de señalización que conduce a la inducción de CD209a, aunque se han descrito proteínas diferentes a p38 (off-target) afectadas por este inhibidor (Bain et al., 2007), por lo que se requeriría un estudio más detallado. Con respecto a los inhibidores de PI3K wortmanina y LY294002 hemos obtenido resultados contradictorios. Si bien ambos son capaces de inhibir la fosforilación de AKT en respuesta a estimulación rápida con GM-CSF (Ver Figura 4.23B), esta inhibición no se refleja en una inhibición de la expresión de CD209a a tiempos más largos de estimulación con GM-CSF en el caso de wortmanina, pero sí en el caso de LY294002 (Ver Figura 4.23A). Otros estudios también han obtenido resultados contradictorios usando ambos inhibidores (Hazeki et al., 2006), y esto es posible que sea debido a la inhibición de proteínas diferentes de PI3K (off-target) por LY294002 (Gharbi et al., 2007; Hazeki et al., 2006). Considerando que la wortmanina es un inhibidor de PI3K más específico que el LY294002 (Bain et al., 2007), entendemos que los resultados obtenidos con wortmanina reflejan mejor la realidad y, por tanto, no tenemos datos concluyentes que indiquen que la ruta de señalización PI3K-AKT intervenga de manera importante en la inducción de CD209a mediada por GM-CSF. Finalmente, los inhibidores Jak-I (inhibidor de todas las Jaks) y AG490 (inhibidor de Jak2) impiden la expresión de CD209a en respuesta a GM-CSF (ver Figura 4.24A). Además, hemos comprobado mediante western blot el efecto inhibitorio de Jak-I sobre la fosforilación de Jak2 y STAT5 en respuesta a GM-CSF (ver Figura 4.24B). 4.!Resultados! ! 109 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 0! 5! 10! 15! 20! 25! 30! Expresión!Relativa! control! GM! GM+SB! 0$ 5$ 10$ 15$ 20$ 25$ 30$ CD209a$ control! GM! GM+BI! Figura'4.23.'Efecto'de'la'inhibición'de'los'principales'intermediarios'de'la'señalización'de' GMHCSF'sobre'la'expresión'de'CD209a.' Panel! A.!Niveles! de! ARNm! de! CD209a! en! células! BMDM! WT! tratadas! con! GM_CSF! durante! 6! horas! y! preincubadas!1!hora!con!vehículo!o!inhibidor!según!se!indica,!a!las!siguientes!concentraciones:!PD98059! (20µM),!BI605906!(5µM),!SN50!(20µM),!!SB203580!(20µM),!!wortmanina!(500nM)!y!LY294002!(25µM).! Se!indica!la!media!±!SD!de!dos!experimentos!independientes.!*!p<0,05!con!respecto!a!GM.! Panel!B.!Comprobación!del!efecto!inhibidor!de!wortmanina!y!LY294002!sobre!la!fosforilación!de!AKT!y! STAT5!mediante!western*blot.! PD98059! SB203580 BI605906! A.! B.! Wortmanina! *! *! 0$ 5$ 10$ 15$ 20$ 25$ 30$ SN50$ control$ GM$ GM+SN50$ SN50! 0! 5! 10! 15! 20! 25! 30! Expresión!Relativa! control! GM! GM+PD! 0$ 5$ 10$ 15$ 20$ 25$ control$ GM$ GM+wort$ 0$ 5$ 10$ 15$ 20$ 25$ control$ GM$ GM+LY$ LY294002! *! GM-CSF - + + + wortmanina - - + - LY294002 - - - + P_STAT5! !!!!STAT5! AKT! P_AKT! CD209a! ! 110 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! A.! Figura'4.24.'La'expresión'de'CD209a'requiere'de'la'fosforilación'de'Jak2/STAT5.' Panel! A.!Niveles! de! ARNm! de! CD209a! en! células! BMDM! WT! tratadas! con! GM_CSF! durante! 6! horas! y! preincubadas! 1! hora! con! vehículo! o! inhibidor! según! se! indica,! a! las! siguientes! concentraciones:! Jak_I! (10µM)! y! AG490! (10µM).!Se! indica! la! media! ±! SD! de! dos! experimentos! independientes.! *! p<0,05!con! respecto!a!GM.! Panel! B.!Comprobación! del! efecto! inhibidor! de! Jak_I! sobre! la! fosforilación! de! Jak2! y! STAT5! mediante! western*blot.! ! ! ! 0$ 5$ 10$ 15$ 20$ 25$ 30$ Expresión$RelaKva$ control$ GM$ GM+JakI$ !!!!!JakI! 0$ 5$ 10$ 15$ 20$ 25$ 30$ control$ GM$ GM+AG490$ !!!!AG490! *! *! P_STAT5! STAT5!total ! P_JAK2! GM-CSF (20 ng/ml) - + + + JAK-I inh(10µM) - - 2 10 B.! CD209a! ! ! ! ! ! ! ! ! DISCUSIÓN 5. ! ! ! ! 121 DISCUSIÓN _______________________________________________________________ Las células mieloides del sistema inmunitario constituyen el eje central de la respuesta innata y un eslabón fundamental de enlace hacia la respuesta adaptativa (Geissmann et al., 2010). Para poder mantener la integridad y salud del individuo, la respuesta inmunitaria debe de ser capaz de responder eficazmente a una enorme variedad de posibles patógenos y, a su vez, reconocer las células y estructuras propias. Esto ocurre gracias a la especialización de las células del sistema inmunitario en función del tejido en el que se encuentran, el ambiente al que se ven expuestas y los retos inmunológicos a los que deben de hacer frente. Es precisamente esta diversidad funcional la que dificulta, en gran medida, una clasificación estándar de todos los tipos celulares, y la que en parte ha estimulado los esfuerzos de la comunidad científica. Tradicionalmente, los monocitos se han considerado simples precursores sanguíneos que se extravasan a los tejidos para dar lugar a células terminalmente diferenciadas como células dendríticas y macrófagos, las cuales se distinguen a su vez en base a su morfología, marcadores de superficie, capacidad de fagocitosis y capacidad de presentación de antígeno. Existe una gran diversidad de poblaciones de macrófagos (Gautier et al., 2012 y Tabla 1.1) cuyo origen ontogenético está empezando a revelarse. Recientemente, se ha descubierto que muchas poblaciones de macrófagos residentes tienen su origen durante el desarrollo embrionario en el saco vitelino (Schulz et al., 2012; Yona et al., 2013) o precursores de hígado fetal (Guilliams et al., 2013), y hay evidencias que sugieren que su mantenimiento a lo largo de la vida del individuo ocurre por proliferación local de manera independiente de precursores hematopoyéticos de la médula ósea (Hashimoto et al., 2013; Jenkins et al., 2011; Robbins et al., 2013). Estos macrófagos se caracterizan por ser F4/80high e independientes del factor de transcripción c-Myb (Schulz et al., 2012). Otras poblaciones de macrófagos proceden de precursores HSC en la etapa adulta, y se caracterizan por ser F4/80low y dependientes de c-Myb (Schulz et al., 2012). Estos resultados procedentes de nuevas aproximaciones basadas en mapeo del destino celular parecen confirmar estudios anteriores que habían pasado inadvertidos. Por ejemplo, en un experimento clásico Van Furth y Diesselhoff-den Dulk mostraron el origen dual de los macrófagos tisulares marcando monocitos de la médula ósea con Timidina[3H]. Con este experimento llegaron a la conclusión de que alrededor del 55 % de los macrófagos esplénicos tenían su origen en los monocitos marcados, mientras que el 45 % restante tenía un origen local (Van Furth and Diesselhoff-den Dulk, 1984). Por otro lado, mediante experimentos de quimerismo, se observa que sólo el 10 % 5. ! 122 de los macrófagos F4/80high del bazo proceden del donante, es decir, los macrófagos F4/80high del bazo apenas se renuevan a partir de precursores provenientes de la médula ósea (Schulz et al., 2012). Por otra parte, se han identificado factores de transcripción denominados LDTFs (Lineage Determining Transcription Factors), entre los que se encuentran PU.1 (Schulz et al., 2012) y C/EBPα (Heath et al., 2004), cuyo defecto determina la ausencia de la práctica totalidad de los macrófagos tisulares. Es de destacar que las poblaciones de macrófagos presentan una diversidad génica considerable, y únicamente comparten la expresión de unos pocos cientos de ARNm (Gautier et al., 2012). La regulación subyacente a la diferenciación de cada una de estas poblaciones es en gran medida desconocida. Recientemente, se ha descubierto que la ausencia de un único factor de transcripción de la familia de PU.1, denominado Spi-C, dificulta el desarrollo de la población de macrófagos esplénicos de la pulpa roja F4/80high sin afectar otras poblaciones, defecto que se manifiesta fisiológicamente a nivel del reciclado del hierro (Kohyama et al., 2009). Resultados de nuestro laboratorio muestran que los ratones LXRα-/- carecen de las poblaciones de macrófagos de la zona marginal del bazo (Fig. 4.1), por lo que podría estar regulando la localización o la diferenciación celular. Nuestro estudio de los niveles de expresión de citoquinas implicadas en la formación y compartimentalización del bazo, como CCL19, CCL21, LTA y LTBR (descritas en Ato et al., 2004; Mebius and Kraal, 2005), no reveló diferencias en ratones WT y LXR-DKO de 1 a 3 semanas de edad (Fig. 4.2). Estos datos apoyan la idea de que la señalización y la localización no están alteradas en ratones carentes de LXR, aspecto que hemos confirmado mediante una estrategia de trasplantes. En efecto, pudimos comprobar que la medula ósea de ratones WT es capaz de inducir la formación de las poblaciones de macrófagos de la zona marginal en ratones trasplantados LXR-DKO (Fig. 4.3), y que el defecto es debido a la ausencia de LXRα, ya que la médula de ratones LXRβ -/-, pero no de LXRα -/-, es capaz de inducir la formación de la MZ (Fig. 4.3). En esta Tesis, hemos abordado varias aproximaciones que confirman la decisiva influencia del factor de transcripción LXRα en la diferenciación de las dos poblaciones de macrófagos de la zona marginal (MMM y MZM). Por un lado, la reconstitución con lenti-SP-LXRα de células hematopoyéticas adultas aisladas de ratones LXR-DKO confirmó la reversibilidad del fenotipo, al menos de manera parcial. En un plazo de 8 semanas tras el trasplante con lenti-SP-GFP, se detecta un 30 % de monocitos circulantes GFP-positivos mediante citometría (Fig. 4.12). Este porcentaje de transfección es muy similar al 26,4 % publicado en otro laboratorio independiente (Zhong et al., 2014). En concordancia con estos niveles de transfección de la población de monocitos circulantes, los bazos de los ratones trasplantados con médula tratada con lenti-SP-LXRα muestran una recuperación parcial de los marcadores CD169, MARCO y Tim-4 en la MZ (Fig. 4.13). Además, la activación farmacológica de LXR mediante su ligando sintético GW3965 acelera la cinética de repoblación de los macrófagos de la zona marginal en 5.!Discusión! ! 123 ratones tratados previamente con clodronato (Fig. 4.4), sin afectar a la cinética de repoblación de los macrófagos de la pulpa roja. Por otro lado, hemos generado ratones KO tejido específicos mediante la aproximación LoxP-Cre. En concreto, nuestros ratones LXRαfl/fl Vav-iCre+/ presentan una expresión normal de LXRα en todos los tejidos menos en las células derivadas de la médula ósea, tanto a nivel de ARNm (Fig. 4.7) como a nivel de proteína (Fig. 4.8). El fundamento es la escisión específica del gen floxeado LXRα por parte de la recombinasa Vav-iCre, que presenta una expresión restringida a células de la línea hematopoyética (de Boer et al., 2003). Con esta aproximación, hemos podido comprobar que los macrófagos de la pulpa roja F4/80+ se desarrollan de manera independiente de LXRα, mientras que las poblaciones de macrófagos de la zona marginal requieren de la expresión de LXRα+ en los precursores hematopoyéticos para poder desarrollarse (Ver Fig. 4.9). Además, la expresión de una única copia de LXRα es suficiente, tal y como se observa en los heterocigotos LXRαfl/+ Vav-iCre+/ (Fig. 4.10 y 4.11), fenómeno conocido como haplosuficiencia. Esta aproximación, unida al estudio de las poblaciones esplénicas en distintos estadíos del desarrollo postnatal (Fig. 4.2), confirma el origen hematopoyético de los precursores de los macrófagos de la zona marginal. Debemos tener en cuenta que en condiciones de irradiación propias de un trasplante de médula ósea, las poblaciones de macrófagos residentes se pueden ver sustituidas por monocitos procedentes de la médula ósea (Gomez Perdiguero and Geissmann, 2013), lo que hemos podido evitar mediante la tecnología Lox-Cre. Además, el origen hematopoyético de las poblaciones de macrófagos de la zona marginal concuerda con su fenotipo F4/80-/low, típico de macrófagos procedentes de precursores HSC (Schulz et al., 2012). La explicación para la distinta procedencia de las poblaciones de macrófagos, bien sea desarrollo embrionario o médula ósea, aún no se conoce. Es probable que el origen monocítico de los macrófagos de la zona marginal les confiera unas cualidades únicas. Por ejemplo, los macrófagos derivados de los monocitos parecen estar mejor equipados que los que derivan del saco vitelino para empezar y modular la respuesta inmunitaria (Schulz et al., 2012), una característica que puede ser esencial en el ambiente de la zona marginal, lugar donde se criba todo el torrente sanguíneo. Además, es probable que los macrófagos de la zona marginal, al igual que los macrófagos del sistema digestivo (Hashimoto et al., 2013; Yona et al., 2013), nunca estén en estado de "reposo" debido a la repetida exposición a antígenos, lo que determina la acumulación de monocitos y su diferenciación local a macrófagos activados (Bronte and Pittet, 2013). En la zona marginal se capturan la inmensa mayoría de antígenos circulantes en la sangre (Aichele et al., 2003). La Púrpura Trombocitopenica Idiopática (Idiopathic Thrombocytopenic Purpura, ITP), también llamada Púrpura Trombocitopénica Autoinmune (Autoimmune Thrombocytopenic Purpura, AITP), es una enfermedad que se caracteriza por un contaje bajo de plaquetas y médula ósea normal, en la que hay una destrucción elevada de plaquetas por autoanticuerpos frente a antígenos de membrana plaquetarios (George et al., 1994). Presenta una prevalencia de 9,5 casos por cada 100.000 personas en los EEUU (Michel, 2009). Dado que el bazo es el principal sitio de captura ! 124 de los complejos plaqueta-anticuerpo, una intervención terapéutica muy extendida para evitar el descenso de plaquetas es la esplenectomía, que tiene éxito en alrededor del 66 % de los casos (Kojouri et al., 2004). Para estudiar la relevancia funcional de la zona marginal en una enfermedad como la ITP, hemos puesto a punto un modelo murino en el que se induce la opsonización de las plaquetas mediante un anticuerpo frente a la integrina gpαIIb (CD41). De esta manera, las plaquetas opsonizadas son marcadas para fagocitosis, disminuyéndose sus niveles circulantes (Mizutani et al., 1993; Crow et al., 2001). A las 3 horas de la inyección del anticuerpo hemos comprobado mediante citometría de flujo un descenso del 80 % de los niveles circulantes de plaquetas en ratones WT, lo que demuestra la efectividad del tratamiento (datos no mostrados). En ratones LXR-DKO, el descenso fue del 35 % (datos no mostrados). Esta notable diferencia en la captura de plaquetas opsonizadas puede ser debida a la ausencia de zona marginal, pero no se pueden descartar otras explicaciones. En concreto, se ha descrito que tras la unión del anticuerpo, la plaqueta se vuelve apoptótica (Leytin et al., 2006), y es conocida la menor capacidad de retirada de células apoptóticas por parte de los macrófagos carentes de LXR (Alonso-Gonzalez et al., 2009). Es probable, por tanto, que el resultado sea debido a un efecto conjunto de ambos fenómenos. No obstante, mediante la inyección de plaquetas ya opsonizadas pudimos comprobar que en condiciones normales el principal sitio de captura dentro del bazo es la zona marginal en ratones WT, mientras que en la zona marginal de ratones LXR-DKO existe un defecto en su captura (Fig. 4.14). El estudio de los macrófagos de la zona marginal es complicado, ya que los marcadores moleculares no son exclusivos de esta población. Aún cuando estos marcadores son muy abundantes en la zona marginal, es probable que las estrategias de silenciamiento de estas proteínas mediante generación de animales knock-out o depleción selectiva como en el caso de los animales CD169-DTR, afecten también a otras poblaciones de macrófagos, pues su expresión es también significativa en otros subtipos de macrófagos tisulares. Otras aproximaciones emplean clodronato a baja concentración, que elimina preferentemente los macrófagos de zona marginal. Las conclusiones de estos estudios implican a los macrófagos de la zona marginal en el proceso de la tolerancia inmunitaria y la regulación del tratamiento de enfermedades autoinmunes (Anthony et al., 2008a; McGaha et al., 2011; Miyake et al., 2007; Ravishankar et al., 2012). Por tanto, no deja de ser paradójico que los macrófagos de la zona marginal, que evitan la aparición de enfermedades autoinmunes mediante la retirada de células propias en estado apoptótico (McGaha et al., 2011), contribuyan, mediante la retirada de plaquetas opsonizadas, a las consecuencias adversas de una enfermedad autoinmune como es la Púrpura Trombocitopénica Idiopática. El mecanismo genético último por el cual LXRα regula la formación de los macrófagos de la zona marginal aún no se conoce, pero hipotetizamos que debe de estar mediado por un programa genético específico de una isoforma de LXR, es decir, regulado por LXRα pero no regulado por LXRβ. Un ejemplo de esta regulación es el gen SPα, también conocido como AIM (Apoptosis Inhibitor of Macrophage). Los ratones carentes de LXRα son especialmente susceptibles a apoptosis inducida por la bacteria Listeria Monocytogenes (LM) debido, en parte, a la pérdida de regulación del gen SPα (Joseph et al., 2004). En la Tesis de la Dra. Noelia Alonso González, de nuestro laboratorio, se 5.!Discusión! ! 125 estudió la zona marginal de bazos procedentes de ratones SPα-/-, y se comprobó que las poblaciones de macrófagos MMM y MZM presentan un desarrollo normal. Por tanto, concluimos que la ausencia de expresión de SPα no es un determinante génico en la formación o mantenimiento de las poblaciones de macrófagos de la zona marginal. Por otro lado, los macrófagos son sensibles a la sobrecarga de lípidos, pudiendo entrar en apoptosis por estrés del retículo endoplásmico (Feng et al., 2003). Se ha propuesto que LXRα es el regulador principal de SCD-1 (steaoryl CoA desaturase) en macrófagos, y que su inducción protege a este tipo celular frente a la apoptosis por sobrecarga de lipidos (Erbay et al., 2009). Como hemos indicado anteriormente, la zona marginal es una zona de exposición continua a antígenos (Bronte and Pittet, 2013) y el lugar principal de captura de células apoptóticas (Kraal and Mebius, 2006; Ravishankar et al., 2012). Por tanto, constituye una localización anatómica propensa a una sobrecarga lipídica de los macrófagos por fagocitosis. En consecuencia, sería interesante comprobar en el futuro el desarrollo de las poblaciones de macrófagos de la zona marginal de los ratones SCD-1-/-. Para estudiar la regulación transcripcional ejercida por LXRα en células mieloides in vitro, realizamos un estudio del análisis de la expresión génica mediante microarray de células BMDM procedentes de ratones WT y LXRα -/- en respuesta a un tratamiento de 24 horas con las citoquinas M-CSF o GM-CSF, tal y como se describe en la sección 3.7.2 de Material y Métodos. La Tabla 5.1 muestra un resumen del número de genes diferencialmente regulados con respecto al control en WT, LXRα -/- y genes diferencialmente regulados con respecto al control en ambos genotipos, que hemos denominado genes "Comunes". TABLA'5.1.'Número1 de1genes1 cuya1 expresión1 es1 mayor1 o1 menor1 respecto1 a1 su1 control1 en1 respuesta1a1GMICSF1o1MICSF.1 WT Comunes LXRα GM-CSF Más expresados 72 210 158 Menos expresados 75 99 89 M-CSF Más expresados 74 222 78 Menos expresados 8 5 25 El análisis de la Ontología Génica (GO) indica que el proceso más representado en respuesta a M-CSF es el de la división celular (cell division) mientras que en respuesta a GM-CSF los procesos más representados son los de quimiotaxis (chemotaxis) y respuesta inflamatoria (inflammatory response) (ver Tablas 4.1 y 4.2). Esto concuerda con funciones conocidas de estas citoquinas (Lacey et al., 2012). Se sabe que la producción de la citoquina M-CSF ocurre de manera ubicua y que controla el número de macrófagos en varios tejidos, mientras que la citoquina GM-CSF presenta bajos niveles circulantes que a menudo se elevan durante reacciones inmunitarias o inflamatorias (Lacey et al., 2012). Además, en algunas condiciones patológicas caracterizadas por ! 126 inflamación crónica, como es el caso del asma, la producción y liberación de GM-CSF, IL-3 e IL-5 en pulmón causa la infiltración y activación de células mieloides, lo que acentúa el daño en las vías aéreas (Broughton et al., 2012). Es de destacar el mayor número de genes expresados en respuesta a GM-CSF en células BMDM de ratones LXRα -/- (n=158) en comparación con WT (n=72), además de la mayor representación de genes de procesos pro-inflamatorios como la biosíntesis de prostaglandinas (prostaglandin biosynthetic process). Se sabe que, en el contexto de la respuesta a LPS, la activación de LXR tiene un efecto antiinflamatorio, actuando ambas isoformas de manera redundante y, que en este mismo contexto, células carentes de LXR presentan una respuesta proinflamatoria aberrante (Joseph et al., 2003). Sin embargo, a nuestro entender, es la primera vez que se estudia el efecto de un tratamiento agudo de GM-CSF en células BMDM carentes de una única isoforma (LXRα). En este sentido, nuestros datos apuntan a una mayor inducción de genes y vías inflamatorias en células BMDM LXRα -/- que en células BMDM WT en respuesta a GM-CSF. Debemos tener en cuenta, por otro lado, que la inflamación es un proceso fisiológico normal esencial en la respuesta inmunitaria (Janssen and Henson, 2012). Por eso nos resultó interesante estudiar aquellos procesos fisiológicos que se activan en células BMDM WT en respuesta a GM-CSF, ya que podrían constituir rutas potencialmente reguladas por LXRα. Por ejemplo, el proceso de unión a manosa (mannose binding, GO:0005537) se encuentra sobre-expresado solamente en WT (Tabla 4.2). Uno de los genes presentes en este grupo es CD209a, que además se encuentra entre los 20 genes más diferencialmente regulados en WT (Ver Figura 4.17C). Este gen constituye un marcador de células Mo-DC (Cheong et al., 2010) y macrófagos de la fase de resolución (Stables et al., 2011). Basándonos en la relevancia e interés de este gen desde el punto de vista inmunitario, decidimos estudiar su regulación en mayor profundidad. Según el consenso actual, el gen murino CD209a es homólogo del gen humano DC-SIGN (Cheong et al., 2010). Sin embargo, hemos comprobado que la regulación de ambos genes es ligeramente diferente en células mieloides murinas y humanas. Así, la citoquina IL-4 es el principal regulador de la expresión de DC-SIGN en humanos (Relloso et al., 2002); mientras que la principal citoquina implicada en la regulación de CD209a hemos descubierto que es GM-CSF (Ver Figura 4.19A). En este sentido, está descrito que las proteínas JAK1 y STAT6 intervienen en la cascada de señalización de IL4 (Luzina et al., 2012), mientras que en el caso de la cascada de señalización de GM-CSF intervienen las isoformas JAK2 y STAT5 (Perugini et al., 2010). Es por tanto probable que la diferente regulación de DC-SIGN/CD209a en humanos y ratones se articule también a través de algunas diferencias a nivel de factores de transcripción, activados diferencialmente por las vías mencionadas. Por otro lado, hemos descubierto que la presencia de LXRα es imprescindible para la expresión de CD209a en respuesta a GM-CSF en células BMDM. Así, células carentes de LXRα, como LXRα-/- o LXR-DKO, presentan una inducción deficiente de CD209a en respuesta a GM-CSF, mientras que las células carentes de la isoforma LXRβ presentan una expresión equiparable a la de células WT. Además, hemos encontrado que