Caracterización morfológica, citoquímica y ultraestructural de las células sanguíneas y estudio hematológico en "Trachemys scripta scripta"

CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA, CITOQUÍMICA Y ULTRAESTRUCTURAL DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS Y ESTUDIO HEMATOLÓGICO EN TRACHEMYS SCRIPTA SCRIPTA TESIS DOCTORAL Programa de Doctorado en Clínica e Investigación Terapéutica Departamento de Patología Animal, Producción Animal, Bromatología y Tecnología de los Alimentos Juan Daniel Hernández Marrero Las Palmas de Gran Canaria 2015 PROGRAMA DE DOCTORADO CLÍNICA E INVESTIGACIÓN TERAPÉUTICA TESIS DOCTORAL CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA, CITOQUÍMICA Y ULTRAESTRUCTURAL DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS Y ESTUDIO HEMATOLÓGICO EN TRACHEMYS SCRIPTA SCRIPTA Memoria que, para optar al grado de Doctor por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, presenta el Licenciado J UAN D ANIEL H ERNÁNDEZ M ARRERO Director: Dr. J ORGE O RÓS M ONTÓN Las Palmas de Gran Canaria, 14 de octubre de 2015 Índice III 2.7. La Bioquímica Sanguínea de los Quelonios...............................................109 2.7.1. Las Proteínas Totales (Sólidos Totales).................................................109 2.8. Valores Hematológicos de los Emídidos (Familia Emydidae)…..............112 2.8.1. El Hematocrito de los Emídidos.............................................................112 2.8.2. El Nivel de Hemoglobina de los Emídidos............................................113 2.8.3. Índices Eritrocitarios de los Emídidos……….…...................................113 2.8.4. Recuento Total de Eritrocitos y Leucocitos de los Emídidos.................114 2.8.5. Recuento de Trombocitos de los Emídidos…………….……………...115 2.8.6. Recuento Diferencial Leucocitario de los Emídidos…….…………….116 2.9. La Bioquímica Sanguínea de los Emídidos (Familia Emydidae).............119 2.9.1. Las Proteínas Totales (Sólidos Totales).................................................119 3. MATERIAL Y MÉTODOS.................................................................................121 3.1. Especimenes en Estudio (Tortugas)............................................................121 3.2. Obtención de Muestras Sanguíneas............................................................126 3.3. Microscopia Óptica Rutinaria.....................................................................127 3.4. Determinación de las Dimensiones Celulares............................................128 3.5. Análisis Estadístico de las Dimensiones Celulares.....................................129 3.6. Técnicas Citoquímicas..................................................................................129 3.6.1. Fosfatasa Ácida (ACP).........................................................................130 3.6.2. Bencidina Peroxidasa (Mieloperoxidasa) (PER)..................................131 3.6.3. α-Naftil Butirato Esterasa (NBE).........................................................133 3.6.4. Naftol Cloroacetato Esterasa (CAE).....................................................134 3.6.5. Sudán Negro B (SBB)...........................................................................136 3.6.6. Reacción del Ácido Periódico de Schiff (PAS)....................................137 3.6.7. Azul de Toluidina (AT)........................................................................138 3.7. Microscopia Electrónica..............................................................................139 3.8. Hematocrito..................................................................................................140 3.9. Recuento Total de Eritrocitos.....................................................................140 Índice IV 3.10. Recuento Total de Leucocitos....................................................................141 3.11. Recuento de Trombocitos..........................................................................142 3.12. Recuento Diferencial Leucocitario............................................................142 3.13. Estimación del Porcentaje de Eritrocitos Inmaduros.............................143 3.14. Medición del Nivel de Hemoglobina.........................................................143 3.15. Índices Eritrocitarios.................................................................................143 3.16. Medición de las Proteínas Totales (Sólidos Totales)...............................144 3.17. Análisis Estadístico de los Parámetros Hematológicos………………...144 4. RESULTADOS.....................................................................................................147 4.1. Células Sanguíneas.......................................................................................147 4.2. Dimensiones y Morfología Celular…………...……………...……………147 4.2.1. El Eritrocito.............................................................................................147 4.2.2. El Heterófilo...........................................................................................148 4.2.3. El Eosinófilo...........................................................................................149 4.1.4. El Basófilo..............................................................................................149 4.1.5. El Linfocito.............................................................................................150 4.1.6. El Monocito............................................................................................151 4.1.7. El Trombocito.........................................................................................151 4.3. Ultraestructura Celular………………………………...…………………153 4.2.1. El Eritrocito.............................................................................................153 4.2.2. El Heterófilo...........................................................................................153 4.2.3. El Eosinófilo...........................................................................................153 4.1.4. El Basófilo..............................................................................................153 4.1.5. El Linfocito.............................................................................................154 4.1.6. El Monocito............................................................................................154 4.1.7. El Trombocito.........................................................................................154 4.4. Tinciones Citoquímicas................................................................................155 4.4.1. Fosfatasa Ácida (ACP) con y sin Tartrato..............................................155 4.4.2. Bencidina Peroxidasa (Mieloperoxidasa) (PER)....................................156 4.4.3. α-Naftil Butirato Esterasa (NBE) con y sin Fluoruro.............................156 4.4.4. Naftol Cloroacetato Esterasa (CAE).......................................................157 4.4.5. Sudán Negro B (SBB).............................................................................157 4.4.6. Reacción del Ácido Periódico de Schiff (PAS)......................................158 4.4.7. Azul de Toluidina (AT)..........................................................................158 Índice V 4.5. Recopilación de Imágenes…………..……………………...………………159 4.6. Valores Hematológicos y Bioquímicos.........................................................184 4.6.1. El Hematocrito........................................................................................184 4.6.2. Los Sólidos Totales (Proteínas Totales)..................................................185 4.6.3. La Hemoglobina......................................................................................187 4.6.4. Recuento Total de Eritrocitos y Leucocitos............................................189 4.6.5. Recuento de Trombocitos........................................................................191 4.6.6. Los Índices Eritrocitarios………………………………………………193 4.6.7. Recuento Diferencial Leucocitario…………………………………….195 4.6.8. Porcentaje de Eritrocitos Inmaduros…………………………………...197 4.7. Estudio Estadístico…………..…………………………………………….200 4.7.1. Valores Hematológicos y Bioquímicos…………...…………………...200 4.7.2. Concordancia entre las Determinaciones de Trombocitos por los Métodos CAM y FROT………………………………………………………………...204 5. DISCUSIÓN...........................................................................................................207 5.1. Morfología y Caracterización de las Células Sanguíneas.........................207 5.2. Valores Hematológicos y Bioquímicos........................................................219 6. CONCLUSIONES.................................................................................................229 7. RESUMEN.............................................................................................................231 8. SUMMARY............................................................................................................233 9. AGRADECIMIENTOS........................................................................................235 10. BIBLIOGRAFÍA..................................................................................................237 Índice VI Introducción y Objetivos 1 1.- INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS La tortuga o galápago de vientre amarillo o de orejas amarillas (Trachemys scripta scripta -Schoepff, 1792-), es un quelonio que pertenece al suborden Cryptodira y a la familia Emydidae, en la que existen aproximadamente 12 géneros y 48 especies, la mayoría de ellas conocidas como tortugas de agua dulce. El género Trachemys incluye 15 especies, todas ellas distribuidas por América del Norte, Centro y Suramérica. La especie Trachemys scripta, engloba a su vez 3 subespecies diferentes (T. scripta elegans, T. scripta scripta y T. scripta troostii), estrechamente relacionadas entre sí. Todas ellas habitan en ambientes semiacuáticos y son principalmente carnívoras/ omnívoras (E RNST Y B ARBOUR , 1989; F RANK Y R AMUS , 1995; B OYER Y B OYER , 2006; B ROTÓNS , 2007; F RITZ Y H AVAS , 2007). La subespecie objeto de este estudio tiene su área de distribución natural en el sureste de Estados Unidos (F RITZ Y H AVAS , 2007). A medida que aumenta la importancia de las tortugas de agua dulce como nuevos animales de compañía y que su presencia como pacientes se vuelve más habitual en las clínicas veterinarias, se hace crucial un mayor conocimiento de sus características anatómicas y fisiológicas. Ello incluye una detallada descripción y caracterización de sus células sanguíneas y el establecimiento de los parámetros hematológicos normales para estas especies. Sin embargo, la clasificación de las células sanguíneas en reptiles ha sido históricamente problemática, debido a la variabilidad de los criterios empleados en su categorización y al incierto estatus de las líneas celulares en estos animales (W ORK ET AL ., 1998). Es por eso que, aunque inicialmente los estudios orientados a identificar y describir las células sanguíneas en reptiles se basaban exclusivamente en la microscopía óptica estándar (S AINT G IRONS , 1970; W OOD Y E BANKS , 1984), investigaciones más recientes han añadido el uso de las técnicas de tinción citoquímica y de la microscopía electrónica, con el objetivo de obtener una mayor homogeneidad y fiabilidad en los resultados (W ORK ET AL ., 1998; M ARTÍNEZ -S ILVESTRE ET AL ., 2005; S ALAKIJ ET AL ., 2002; S ALAKIJ ET AL ., 2014). A pesar de ello, hoy en día todavía se desconocen muchos aspectos de la hematología de los reptiles y muchas especies (incluidas las habituales como mascotas) no han sido objeto de estudios estructurados que establezcan una adecuada descripción de sus características hematológicas. Esto convierte a los reptiles en el grupo de vertebrados menos estudiado, en comparación con los mamíferos y las aves. En los reptiles, al igual que en otros vertebrados (a excepción de los mamíferos), los eritrocitos son nucleados y generalmente ovales. A pesar de las diferencias morfológicas, la función de los eritrocitos en los reptiles es similar a la de los mamíferos (H AWKEY Y D ENNET , 1989). Introducción y Objetivos 2 El trombocito es otra célula nucleada muy abundante en la sangre periférica de los reptiles, análoga funcionalmente a las plaquetas de los mamíferos (S AINT G IRONS , 1970; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; H AWKEY Y D ENNET , 1989; F RYE , 1991; C AMPBELL , 1996 B ; R ASKIN , 2000). Es en los leucocitos donde encontramos una mayor variabilidad de criterios. Si bien la clasificación de linfocitos y basófilos parece clara, con una estructura y funcionalidad similar a la de los mamíferos, la descripción de las restantes líneas celulares presenta una mayor complejidad y disparidad de opiniones (M ONTALI , 1988; W ATSON , 1997). Históricamente se ha hablado, en quelonios y crocodilianos, de la existencia de dos tipos de granulocitos acidofílicos, derivados de una única línea celular (J ORDAN Y F LIPPIN , 1913; C HARIPPER Y D AVIS , 1932; J ORDAN , 1938; S AINT G IRONS , 1970) y han sido clasificados como granulocitos Tipo I y Tipo II (C ANFIELD , 1985), o como eosinófilos Tipo I y Tipo II (P IENAAR , 1962; A ZEVEDO Y L UNARDI , 2003). A pesar de ello, está más extendida y aceptada la idea de que estas células proceden de líneas celulares diferentes; la heterófila y la eosinófila (M ATEO ET AL ., 1984), clasificándose por tanto como heterófilos y eosinófilos (W ATSON , 1997). El heterófilo se considera funcionalmente análogo a los neutrófilos de mamíferos, a pesar de sus diferencias enzimáticas y bioquímicas. Si bien es cierto que existen descripciones de neutrófilos en muestras sanguíneas de reptiles (S AINT G IRONS , 1970; F RYE , 1973; D ESSER , 1978; R OSSKOPF , 1982; W OOD Y E BANKS , 1984; F RYE , 1991; M ARTÍNEZ -S ILVESTRE , 1994; A GUIRRE ET AL ., 1995), no se corresponden con hallazgos frecuentes en estas especies y la mayoría de los autores no los aceptan como parte de la fórmula leucocitaria (L AWRENCE Y H AWKEY , 1986; M ONTALI , 1988; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; H AWKEY Y D ENNET , 1989; W ORK Y B ALAZS , 1999; R ASKIN , 2000; R OSSKOPF , 2000; S MITH ET AL ., 2000). Los monocitos en reptiles parecen compartir similares características morfológicas y funcionales con los de los mamíferos. Sin embargo, en el orden Squamata aparece un tipo celular exclusivo llamado azurófilo o monocito azurófilo que presenta características intermedias entre un granulocito y un monocito (M ONTALI , 1988; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; H AWKEY Y D ENNET , 1989). La condición de animales ectotérmicos de los reptiles implica una gran dependencia de los factores ambientales externos (temperatura ambiente, fotoperiodo) que influyen en la aparición de variaciones cíclicas anuales en su fisiología (C HEYLAN , 1981). Dichos factores pueden ser causantes de cambios en los parámetros hematológicos según variaciones estacionales, sexo y edad del individuo (D UGUY , 1970). Introducción y Objetivos 3 Teniendo en cuenta todos los aspectos anteriormente mencionados, se plantea la presente Tesis Doctoral: Caracterización Morfológica, Citoquímica y Ultraestructural de las Células Sanguíneas y Estudio Hematológico en Trachemys scripta scripta, con los siguientes objetivos: 1. Descripción morfológica de las células sanguíneas de Trachemys scripta scripta. 2. Descripción ultraestructural de las células sanguíneas de Trachemys scripta scripta. 3. Caracterización citoquímica de dichas células. 4. Determinación de los valores de los parámetros hematológicos para esta especie y estudio comparativo entre sexos, pesos y estaciones. Introducción y Objetivos 4 Revisión Bibliográfica 5 2.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1.- LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS DE LOS REPTILES 2.1.1.- El Eritrocito de los Reptiles Excepto en el caso de los mamíferos, los eritrocitos de todos los vertebrados son nucleados, con morfología ovalada. En las aves los núcleos son más alargados que en los reptiles, que suelen presentar una morfología más redondeada. Algo similar pero menos evidente ocurre con la morfología del citoplasma. Generalmente los eritrocitos de los reptiles tienden a ser de mayor tamaño que los de las aves, y éstos son más grandes que los de los mamíferos. Sin embargo, los eritrocitos más grandes se han descrito en los anfibios (F RYE , 1977; H AWKEY Y D ENNET , 1989). En función de los datos publicados el reptil con los eritrocitos de mayor tamaño es el tuátara (Sphenodon punctatus) (Orden Rhynchocephalia) (S AINT G IRONS , 1970). Los tamaños eritrocitarios medios de los principales grupos de reptiles se presentan en la Tabla 2.1. Tabla 2.1. Dimensiones en µm de eritrocitos en reptiles (P IENAAR , 1962; S AINT G IRONS , 1970; F RYE , 1981; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988). DM (Citoplasma) Dm (Citoplasma) DM (Núcleo) Dm (Núcleo) Orden Chelonia 18.5-20 10-12 5-6.5 4-5 O. Rhynchocephalia 19-25 13-16 8-9 5-6 Suborden Sauria¹ 13-22 5-13.5 5.5-8 2.5-4.5 Suborden Serpentes¹ 15-19 8-11 5-8 3-4 Orden Crocodylia 16-17 9-10 5-6 3.5-4 ¹ Subórdenes pertenecientes al Orden Squamata. DM: diámetro mayor; Dm: diámetro menor. Hay autores que aseguran que el tamaño celular de los eritrocitos puede estar influenciado por el nivel evolutivo de la especie. Así, reptiles más primitivos como cocodrilianos y quelonios tendrían eritrocitos mayores, mientras que serían más pequeños en especies más evolucionadas como los lacértidos (W INTROBE , 1933). De forma similar S AINT G IRONS (1970) relacionó el tamaño celular con el nivel metabólico de cada especie. Revisión Bibliográfica 6 -Características tintoriales y morfología Los frotis sanguíneos en reptiles y otros grupos de animales pueden procesarse para su estudio hematológico con varios tipos de tinciones. Las más utilizadas son las tinciones tipo Romanowsky, como Wright, Giemsa, Wright-Giemsa, Wright-Leishman, MayGrünwald o el panóptico rápido. La más generalizada en Veterinaria ha sido la técnica de Wright (C AMPBELL , 1996 B ; R ASKIN , 2000). El citoplasma de los eritrocitos maduros se tiñe con una coloración naranja-rosada y generalmente muestra una textura homogénea con tinciones tipo Romanowsky. Los núcleos, centrales y ovalados aunque a veces irregulares o pleomórficos, tienden a ser basófilos con coloraciones violetas-azuladas (C AMPBELL , 1996 B ; D OTSON ET AL ., 1997; R ASKIN , 2000; C AMPBELL , 2004 A ). La presencia de núcleo hace que los eritrocitos de reptiles no muestren la biconcavidad con la que aparecen estas células en los mamíferos. La cromatina nuclear es densamente granular y el núcleo se condensa a medida que la célula envejece. En ocasiones los eritrocitos pierden el núcleo, denominándose entonces “eritroplástidos”, siendo normal encontrar algunos en el frotis, siempre que su número no sea elevado. El núcleo libre resultante queda recubierto de una fina capa de citoplasma. Se cree que esto forma parte del proceso natural de expulsión de los núcleos de los eritrocitos, pero también puede producirse por roturas celulares durante la elaboración del frotis sanguíneo (F RYE , 1991). Frecuentemente aparecen inclusiones basófilas redondas o irregulares en el citoplasma eritrocitario de muchas especies de reptiles. En ocasiones suelen considerarse artefactos generados durante la preparación de la extensión sanguínea (C AMPBELL , 2004 A ), aunque estudios ultraestructurales los han asociado a orgánulos degenerados (A LLEMAN ET AL ., 1992, W ORK ET AL ., 1998) o más recientemente a precipitados de hemoglobina, similares a los cuerpos de Heinz vistos en mamíferos (B ASILE ET AL ., 2011). En iguana verde (Iguana iguana) se observan inclusiones citoplasmáticas de apariencia cristalina, cuadradas, rectangulares o hexagonales (H ARR ET AL ., 2001). Algo similar ocurre en iguana rinoceronte (Cyclura cornuta) (S IMPSON Y H ARVEY , 1980), aunque en ambos casos se desconoce la causa. En otras especies se han descrito vacuolas citoplasmáticas hasta en un 1% de los eritrocitos (S ALAKIJ ET AL ., 2002). Se considera normal un cierto nivel de poiquilocitosis (alteraciones de la morfología celular) o anisocitosis (cambios del tamaño celular) en los eritrocitos de muchas especies de reptiles, salvo que estas alteraciones se incrementen porcentualmente, pudiendo indicar entonces procesos patológicos, respuestas regenerativas o desórdenes eritrocitarios (R ASKIN , 2000). En la anemia se observa un incremento de la policromasia y por tanto del número de eritrocitos inmaduros. También es frecuente en individuos jóvenes o durante la ecdisis. Los eritrocitos binucleados, con bordes nucleares anómalos (anisocariosis) o actividad mitótica, suelen asociarse con respuestas regenerativas marcadas (C AMPBELL , 2004 A ; H EARD ET AL ., 2004). También pueden aparecer en reptiles en post-hibernación o en asociación a enfermedad inflamatoria severa, malnutrición o inanición (H AWKEY Y D ENNETT , 1989). En respuestas regenerativas podemos encontrar un punteado basófilo en el citoplasma, aunque también puede aparecer en pacientes con toxicosis avanzada. La hipocromasia suele asociarse a deficiencia de hierro o enfermedad inflamatoria crónica. Revisión Bibliográfica 13 preservar correctamente los heterófilos en serpientes (D OTSON ET AL ., 1995, T ROIANO ET AL ., 1997; A LLEMAN ET AL ., 1999). Además, la fijación con glutaraldehído no permite obtener una buena tinción de otras células sanguíneas, por lo que la técnica recomendada de tinción es la de Wright-Giemsa de un solo paso (A LLEMAN ET AL ., 1999). En el dragón de agua chino (Physignathus spp.) los gránulos se tiñen menos eosinófilos y menos visibles con el uso de Diff-Quick o panóptico rápido que usando la tinción Wright modificada (L E B LANC , 2001). El heterófilo de los reptiles presenta generalmente un núcleo basófilo excéntrico, no lobulado, redondo u ovalado, con coloración de azul claro a púrpura (R YERSON , 1943; P IENAAR , 1962; K ÉLENYI Y N EMETH , 1969; F RYE , 1981; H AWKEY Y D ENNET , 1989; C AMPBELL , 1996 B ; D OTSON ET AL ., 1997). Sin embargo, algunas especies de lagartos como la iguana azul de Gran Cayman (Cyclura nubila lewisi) (F ISSE ET AL ., 2004), Iguana iguana (H ARR ET AL ., 2001) o el dragón barbudo (Pogona vitticeps) (E LIMAN , 1997) presentan lobulación en el núcleo que les otorga una apariencia similar al heterófilo aviar (C ANFIELD Y S HEA , 1988; M ONTALI , 1988; H AWKEY Y D ENNET , 1989). El heterófilo de Physignathus spp. contiene, además de los habituales gránulos heterófilos alargados, un segundo tipo de gránulos eosinófilos de contorno redondeado o irregular. El núcleo es basófilo, redondo o segmentado, dependiendo del estado de maduración celular (L E B LANC , 2001). El citoplasma del heterófilo cuando no está cubierto completamente por los gránulos muestra una coloración pálida, aunque puede aparecer ligeramente basófilo (W ATSON , 1997). En Crotalus adamanteus se describen dos variantes morfológicas del heterófilo. La primera presenta abundante citoplasma con numerosos gránulos eosinófilos de contorno irregular y en ocasiones un pequeño número de gránulos pequeños y basófilos. La segunda contiene gránulos ligeramente eosinófilos con un acúmulo focal, generalmente perinuclear, de gránulos fuertemente eosinófilos de contorno irregular. En ambos casos el núcleo es pequeño, redondo u oval y excéntrico (A LLEMAN ET AL ., 1999). Se cree que la maduración de la serie granulocítica de reptiles se puede completar en sangre periférica, lo que generaría diferentes intensidades en la tinción de los gránulos heterófilos (E GAMI Y S ASSA , 1988) y en algunos casos distintas morfologías nucleares (L E B LANC , 2001). El aumento de la presencia de heterófilos inmaduros en el frotis suele indicar un incremento de la demanda de células maduras que resulta en un agotamiento de las reservas y la consecuente liberación de células inmaduras (C AMPBELL , 1996 B ). Los cambios morfológicos celulares dan más información sobre la presencia de patologías inflamatorias y/o infecciosas que el recuento celular (W ATSON , 1997). La detección de heterófilos con apariencia anormal en el frotis ayuda a diagnosticar enfermedades infecciosas, generalmente bacterianas. Estos heterófilos tóxicos muestran una mayor basofilia citoplasmática, granulación anormal y vacuolización. También pueden aparecer células degranuladas, pudiendo ser artefactos generados durante la preparación del frotis o bien, un signo de toxicidad (D OTSON ET AL ., 1995, C AMPBELL , 1996 B ; W ATSON , 1997; C AMPBELL , 2004 A ). El núcleo de dichas células suele ser de tinción más oscura, mostrando evidencias de picnosis (A LLEMAN ET AL ., 1999). Otro signo de alteración es la presencia de lobulación nuclear en especies en las que de forma fisiológica no está descrita (C AMPBELL , 1996 B , 2004 A ). Revisión Bibliográfica 14 -Técnicas citoquímicas Por lo general se considera que los heterófilos de aves y reptiles no presentan actividad mieloperoxidasa, mientras los eosinófilos son peroxidasa positivos. Esto suele emplearse como método de distinción entre ambos tipos celulares (K ÉLENYI Y N EMETH , 1969; M ATEO ET AL ., 1984; M AXWELL , 1984; M ONTALI , 1988; E GAMI Y S ASSA , 1988; A NDREASEN Y L ATIMER , 1990; A LLEMAN ET AL ., 1992; B OUNOUS ET AL ., 1996). Dicha negatividad a la peroxidasa, frente a la respuesta positiva de los neutrófilos de mamíferos, sugiere que los heterófilos son incapaces de producir la misma respuesta oxidativa frente a las bacterias. Esta puede ser la causa de que los reptiles respondan a la infección bacteriana con piogranulomas, en lugar de con una respuesta supurativa como la de los mamíferos (H EARD ET AL ., 2004). Por el contrario, algunos autores describen actividad peroxidasa en los heterófilos de algunas serpientes y lagartos (C AXTON -M ARTINS Y N GANWUCHU , 1978; M ATEO ET AL ., 1984; M ONTALI , 1988; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988). Estas discrepancias podrían deberse a que el único acidófilo presente en muchos reptiles del orden Squamata combine características del heterófilo y del eosinófilo, lo que explicaría las descripciones de positividad a la peroxidasa en los heterófilos de los Squamata, si se da por hecho que los eosinófilos son los únicos acidófilos claramente positivos a la peroxidasa hallados en reptiles (K ÉLENYI Y N EMETH , 1969; M ONTALI , 1988). Sin embargo, en el lagarto gigante de El Hierro (Gallotia simonyi) se describen tanto heterófilos como eosinófilos, y los primeros presentan positividad a la bencidina peroxidasa, además de al PAS y a la α-naftil acetato esterasa, mientras que los eosinófilos carecen de actividad peroxidasa en esta especie (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE ET AL ., 2005). En Crotalus adamanteus se describe positividad a la reacción del PAS, la cloroacetato esterasa y la α-naftil butirato esterasa, pero no a la bencidina peroxidasa (A LLEMAN ET AL ., 1999). En iguanas hay estudios que describen positividad para dihidroclorido bencidina peroxidasa y PAS (F UENTES ET AL ., 2000), mientras que otros autores hablan de respuesta positiva al PAS, bencidina peroxidasa y sudán negro B (SBB) y moderadamente positiva a la α-naftil butirato esterasa y fosfatasa ácida. Esto hace que los heterófilos de las iguanas sean bastante similares a los neutrófilos de mamíferos (H ARR ET AL ., 2001). El agama común (Agama agama) también presenta heterófilos positivos a la bencidina peroxidasa (C AXTON -M ARTINS Y N GANWUCHU , 1978). En el alligator americano (Alligator mississippiensis) se ha citado positividad frente a esterasas no específicas, ACP, fosfatasa alcalina, peroxidasa (3-amino-9-etil-carbazol) y PAS (sin diastasa); siendo negativo al naftol AS-D cloroacetato esterasa, al PER y al PAS con diastasa (M ONTALI , 1988). En Ophiophagus hannah los gránulos heterófilos se tiñen moderadamente con SBB y la β-glucoronidasa; y son negativos, o adquieren una tinción débil, con la α-naftil acetato esterasa y la fostatasa ácida (S ALAKIJ ET AL ., 2002). En Varanus salvator existe positividad a SBB, α-naftil acetato esterasa y β-glucoronidasa (S ALAKIJ ET AL ., 2014). En Ophiophagus hannah se ha establecido la hipótesis de la existencia de diferentes estadíos de desarrollo en los heterófilos circulantes, en base a los diferentes patrones de tinción citoquímica de las células al ser tratadas con la fosfatasa ácida y la α-naftil acetato esterasa, mostrando cantidades diferentes de ácido hidrolasa (S ALAKIJ ET AL ., 2002). Citoquímicamente, se han identificado lípidos, glucógeno, peroxidasa y fosfatasas ácida y alcalina en los leucocitos de varias especies de reptiles (Tabla 2.4) (H ORII ET AL ., 1951; P IENAAR , 1962; E FRATI ET AL ., 1970). Revisión Bibliográfica 15 Tabla 2.4. Tinciones citoquímicas del heterófilo de los reptiles (G ERZELI , 1954; P IENAAR , 1962; D ESSAUER , 1970; C AXTON -M ARTINS , 1977; C AXTON -M ARTINS Y N GANWUCHU , 1978; D ESSER , 1978; recopilado en S YPEK Y B ORYSENKO , 1988) TINCIÓN CITOQUÍMICA REACCIÓN DEL HETERÓFILO ENZIMAS Fostatasa ácida Positivo Fosfatasa alcalina Positivo/Negativo Beta glucoronidasa Positivo Esterasa Positivo Peroxidasa Positivo/Negativo Deshidrogenasa ácido láctico No determinado POLISACÁRIDOS Reacción del ácido periódico de Schiff Positivo Azul alcian Negativo Azul de toluidina Positivo LÍPIDOS Sudán negro B Positivo Sudán neutro III Negativo -Ultraestructura del heterófilo Ultraestructuralmente, el heterófilo del yacaré del pantanal (Caiman crocodilus yacare) muestra una forma esférica, con contorno irregular y prolongaciones citoplasmáticas. El citoplasma es abundante, conteniendo gran cantidad de gránulos de tamaño y eletrodensidad variables, de forma esférica, oval, elíptica o irregular. Se observan numerosas vesículas electrolúcidas, pocas mitocondrias, retículo endoplasmático y ribosomas. En algunas regiones aparecen estructuras que se asemejan a formaciones fibrilares. El núcleo es excéntrico y muestra cromatina adherida a la membrana de la envoltura nuclear. Se hace evidente la presencia de un nucléolo menos electrodenso (D E M OURA ET AL ., 1997). Los gránulos citoplasmáticos del heterófilo de Gallotia simonyi también presentan gran heterogeneidad en su tamaño y electrodensidad (M ARTÍNEZ - S ILVESTRE ET AL ., 2005). En Varanus salvator se describen dos tipos diferentes de gránulos citoplasmáticos, un primer grupo más numeroso, de gran tamaño y forma de varilla, con electrodensidad variable y otro grupo más escaso, de forma redondeada y elevada electrodensidad (S ALAKIJ ET AL ., 2014). En Crotalus adamanteus se confirma ultraestructuralmente la presencia de dos variaciones morfológicas de heterófilo. Ambas variantes muestran gránulos citoplasmáticos de tamaño grande y pleomórficos, pero en una los gránulos son homogéneamente electrodensos y en la otra, unos gránulos son electrodensos y otros presentan una matriz más clara (A LLEMAN ET AL ., 1999). De forma similar, los heterófilos de Ophiophagus hannah se clasifican en dos subtipos en función de la electrodensidad de sus gránulos. Éstos songeneralmente grandes y pleomórficos con densidad electrónica variable, pero unos pocos heterófilos contienen gránulos de electrodensidad homogénea. El resto de las características de ambos tipos celulares son iguales, incluyendo la presencia de mitocondrias y pequeños acúmulos de retículo endoplasmático y la morfología nuclear, dentada con acúmulos periféricos de heterocromatina. Estas diferencias sugieren la existencia de diferentes estadíos de desarrollo de los heterófilos circulatorios (S ALAKIJ ET AL ., 2002). La misma idea se desprende del estudio ultraestructural en Elaphe obsoleta Revisión Bibliográfica 16 quadrivitatta, en la que los gránulos citoplasmáticos se clasifican en dos grupos en función de su electrodensidad (B OUNOUS ET AL ., 1996). 2.1.2.3.- El Eosinófilo de los Reptiles La clasificación clásica divide a las células acidófilas en heterófilos y eosinófilos (F RYE 1973, 1981), lo que parece cierto para cocodrilianos y quelonios, pero no para muchos de los reptiles del orden Squamata, ya que en estas especies se suele hablar de la existencia de un único acidófilo, el heterófilo (F RYE , 1991). Sin embargo, en ocasiones se describe el eosinófilo en algunos Squamata (K ÉLENYI Y N EMETH , 1969; Z APATA ET AL ., 1981; M ONTALI , 1988). Ese es el caso de la serpiente de cascabel sudamericana (Crotalus durissus terrificus) (T ROIANO ET AL ., 1997), de Ophiophagus hannah (S ALAKIJ ET AL ., 2002) y de Gallotia simonyi (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE ET AL ., 2005). También aparecen eosinófilos en Cyclura cornuta e Iguana iguana, aunque en estas especies estas células no reaccionan a ninguna técnica citoquímica (F UENTES ET AL ., 2000). Por el contrario, Pogona vitticeps, Crotalus adamanteus, el monstruo de Gila (Heloderma suspectum) y Varanus salvator carecen de acidófilos eosinófilos (E LIMAN , 1997; A LLEMAN ET AL ., 1999; C OOPER - B AILEY ET AL ., 2011; S ALAKIJ ET AL ., 2014). Externamente heterófilos y eosinófilos son muy similares entre sí, lo que conduce en muchas ocasiones a errores en el recuento celular diferencial, pero por lo general se acepta que ambos proceden de precursores diferentes (M ATEO ET AL ., 1984). La función del eosinófilo se relaciona con la fagocitosis de inmunocomplejos asociados a infecciones parasitarias, aunque son necesarios estudios adicionales (M EAD Y B ORYSENKO , 1984 A ; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988). En aligatores con infecciones experimentales parasitarias se ha detectado una marcada eosinofilia con recuentos de hasta el 60% del total de la serie leucocitaria (G LASSMAN ET AL ., 1979). Así, hay autores que utilizan el recuento de eosinófilos como un indicador de infestación parasitaria (R OSSKOPF , 2000). -Dimensiones celulares El tamaño medio del eosinófilo en reptiles es de 9 a 20 µm (A LDER Y H UBER , 1923; A USTIN ET AL ., 1927; R YERSON , 1943; A TLAND Y P ARKER , 1955; A TLAND Y T HOMPSON , 1958; A NDERSEN , 1961; A GID ET AL ., 1961; P IENAAR , 1962; K ÉLENYI Y N EMETH , 1969; E FRATI ET AL ., 1970; S AINT G IRONS , 1970; D ESSER Y W ELLER , 1979 A ; M EAD Y B ORYSENKO , 1984 A ; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; W ORK ET AL ., 1998), aunque varía en función de la especie (Tabla 2.5). Los eosinófilos de mayor tamaño se encuentran en serpientes, mientras que los lagartos ostentan los más pequeños (S AINT G IRONS , 1970; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; R ASKIN , 2000). Quelonios y cocodrilianos muestran eosinófilos de tamaño intermedio (S AINT G IRONS , 1970). Así, como ejemplo, encontramos que en Ophiophagus hannah los eosinófilos tienen un diámetro aproximado de 11-18 µm, siendo de tamaño inferior a los heterófilos, pero mayores que los basófilos (S ALAKIJ ET AL ., 2002). Revisión Bibliográfica 17 Tabla 2.5. Diámetros mayores de los eosinófilos en reptiles no quelonios (S AINT G IRONS Y D UGUY , 1963; F RYE , 1991) ESPECIE MEDIA RANGO Orden Rhyncocephalia Sphenodon punctatus 14.78 9-23 Orden Squamata Suborden Sauria Heteronota binoei 16.68 13-20 Lygosoma (Sphenomorphus) sp. 14.04 10-16 Lacerta muralis 13.58 11-16 Lacerta agilis 13.90 12-16 Lacerta vivipara 14.43 12-16 Lacerta viridis 14.25 12-17 Psammodromus algirus 10.42 9-12 Anguis fragilis 14.20 11-17 Heloderma suspectum 14.20 10-18 Suborden Serpentes Coronella austriaca 18.00 16-19 Elaphe longissima 18.18 16-20 Elaphe scalaris 15.70 15-17 Coluber viridiflavus 17.88 15-20 Natrix natrix 17.59 14-20 Natrix maura 18.22 16-20 Malpolon monspessulanus 19.20 18-20 Pseudechis australis 16.73 15-19 Vipera aspis 17.70 16-20 Vipera berus 18.13 15-20 Orden Crocodilia Crocodylus niloticus 16.25 Medidas expresadas en µm -Características tintoriales y morfología El eosinófilo de reptiles se caracteriza, al igual que en aves y mamíferos, por sus gránulos redondeados naranja-rojizos con tinciones tipo Romanowsky (R YERSON , 1943; P IENAAR , 1962; K ÉLENYI Y N EMETH , 1969; E FRATI ET AL ., 1970; S AINT G IRONS , 1970; D ESSER Y W ELLER , 1979 A ; M EAD Y B ORYSENKO , 1984 A ; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; F RYE , 1991; W ATSON , 1997; W ORK ET AL ., 1998) y por su núcleo, frecuentemente excéntrico, redondo u ovalado, débilmente basófilo y que puede aparecer simple o lobulado (M ONTALI , 1988; F RYE , 1991). También se ha descrito al núcleo en posición central (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE , 1994; C AMPBELL , 1996 B ). Su citoplasma es más basófilo y suele ser más visible que el del heterófilo (H AWKEY Y D ENNET , 1989; W ATSON , 1997) y la membrana celular puede presentar numerosos pseudópodos (F RYE , 1991). Los gránulos eosinófilos de algunas especies como las iguanas se tiñen típicamente de azul con tinciones tipo Romanowsky (H AWKEY Y D ENNET , 1989). En Iguana iguana el citoplasma presenta un gran número de gránulos redondos azul claro o verdosos, con un núcleo excéntrico redondo u oval (H ARR ET AL ., 2001). De forma similar, Revisión Bibliográfica 18 los eosinófilos de Ophiophagus hannah contienen un gran número de gránulos redondos de color azul pálido que suelen dificultar la visualización del núcleo celular. Sin embargo, algunos eosinófilos contienen un escaso número de gránulos grandes, homogéneos y de coloración basófila clara que protruyen de la membrana celular (S ALAKIJ ET AL ., 2002). Otras serpientes, como Elaphe obsoleta y la pitón real (Phyton regius) presentan eosinófilos oscuros (M ONTALI , 1988; S CHUMACHER ET AL ., 1994; D OTSON ET AL ., 1995; J OHNSON Y B ENSON , 1996; R ASKIN , 2000). Los eosinófilos de Crotalus durissus terrificus mantienen la morfología y coloración estándar, con núcleo redondo o bilobulado excéntrico y gránulos citoplasmáticos esféricos, homogéneos y eosinófilos (T ROIANO ET AL ., 1997). Los eosinófilos pueden degranularse en respuesta al estrés, manteniendo sus gránulos intactos y pudiendo observarse éstos con tinción supravital, fuertemente teñidos pero carentes de su capacidad para aceptar la eosina u otras tinciones similares (F RYE , 1991). Los eosinófilos de los reptiles adquieren una coloración naranja-rojiza cuando se usa el metanol como fijador, mientras que su tonalidad es azul negruzca si se fijan con acetona (A LDER Y H UBER , 1923; A USTIN ET AL ., 1927; A TLAND Y P ARKER , 1955; A TLAND Y T HOMPSON , 1958; A NDERSEN , 1961; A GID ET AL ., 1961). -Técnicas citoquímicas Estos granulocitos han generado mucha polémica en cuanto a su clasificación y diferenciación (N OBLE , 1931; R YERSON , 1943, 1949; P IENAAR , 1962; T AYLOR ET AL ., 1963; A NDREW , 1965; E LKAN Y Z WART , 1967; K ÉLENYI Y N EMETH , 1969; E FRATI ET AL ., 1970; F RYE , 1973; C AXTON -M ARTINS Y N GANWUCHU , 1978; G LASSMAN Y B ENNETT , 1978 A , 1978 B ; W ILL , 1978, 1979; D ESSER Y W ELLER , 1979 A ; Z APATA ET AL ., 1981; F RYE , 1981; M ATEO ET AL ., 1984; M ONTALI , 1988; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; A ZEVEDO Y LUNARDI , 2003). Algunos de estos autores consideran la existencia de dos eosinófilos en la sangre de algunos reptiles; un primer tipo (eosinófilo propiamente dicho) con gránulos citoplasmáticos redondos que reaccionan de forma positiva a las técnicas citoquímicas de la bencidina peroxidasa neutral y alcalina, y un segundo tipo de eosinófilo (heterófilo) con gránulos fusiformes o alargados negativos a la bencidina peroxidasa (F RYE , 1991). De forma similar, NOBLE (1931) clasificó los eosinófilos en dos grupos; los verdaderos eosinófilos, que son positivos a la peroxidasa de Graham-Knoll (tinción con 3-amino-9etilcarbazol) y los heterófilos, peroxidasa negativos y positivos al sudán negro. Se acepta que los gránulos de los eosinófilos reaccionan positivamente a las técnicas basadas en la peroxidasa (Tabla 2.6) (K ÉLENYI Y N EMETH , 1969; M ATEO ET AL ., 1984; M AXWELL , 1984; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988), tal como ocurre en el lagarto de arena (Lacerta agilis) (K ÉLENYI Y N EMETH , 1969). Los eosinófilos de Ophiophagus hannah sólo se tiñen en escaso número con la β-glucuronidasa (S ALAKIJ ET AL ., 2002). De igual manera, el lagarto agama negro (Agama stellio) presenta eosinófilos sin actividad peroxidasa, pero con positividad a la fosfatasa ácida y a la reacción del PAS (E FRATI ET AL ., 1970). En Gallotia simonyi tampoco aparece actividad peroxidasa. En esta especie se observa positividad a fosfatasa ácida, cloroacetato esterasa y α-naftil acetato esterasa (M ARTÍNEZ - Revisión Bibliográfica 19 S ILVESTRE ET AL , 2005). En el caso de Iguana iguana los eosinófilos son negativos para todas las técnicas citoquímicas empleadas (H ARR ET AL ., 2001). Tabla 2.6. Tinciones citoquímicas del eosinófilo de los reptiles (G ERZELI , 1954; P IENAAR , 1962; D ESSAUER , 1970; C AXTON -M ARTINS , 1977; C AXTON -M ARTINS Y N GANWUCHU , 1978; D ESSER , 1978; recopilado en S YPEK Y B ORYSENKO , 1988) TINCIÓN CITOQUÍMICA REACCIÓN DEL EOSINÓFILO ENZIMAS Fostatasa ácida Positivo Fosfatasa alcalina Positivo Beta glucoronidasa Positivo Esterasa Positivo/Negativo Peroxidasa Positivo Deshidrogenasa ácido láctico No determinado POLISACÁRIDOS Reacción del ácido periódico de Schiff Positivo Azul alcian Positivo Azul de toluidina Negativo LÍPIDOS Sudán negro B Positivo/Negativo Sudán neutro III Negativo -Ultraestructura del eosinófilo Los estudios ultraestructurales en Caiman crocodilus yacare muestran un eosinófilo de forma esférica u ovalada, con prolongaciones citoplasmáticas cortas y delgadas. El abundante citoplasma es rico en mitocondrias y gránulos citoplasmáticos voluminosos con electrodensidad de moderada a intensa, de forma esférica y/o oval. Algunos gránulos muestran una estructura interna heterogénea, formada por material finamente granuloso. También aparecen pequeños acúmulos de retículo endoplasmático y algunos ribosomas y pequeñas vesículas. El núcleo se muestra excéntrico y redondeado, con heterocromatina periférica y un nucléolo en ocasiones visible (D E M OURA ET AL ., 1997). Las descripciones ultraestructurales del eosinófilo en reptiles del orden Squamata no son muy abundantes. En Sphenodon punctatus el núcleo apareció lobulado y el citoplasma lleno de gránulos irregulares en la forma, pero de electrodensidad alta y homogénea, además de inclusiones granulares más pequeñas, mitocondrias y betaglucógeno. Se describen otros orgánulos citoplasmáticos con menos frecuencia (D ESSER Y W ÉLLER , 1979 A ). En Gallotia simonyi los gránulos citoplasmáticos también manifiestan electrodensidad homogénea (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE ET AL ., 2005). Los eosinófilos de Ophiophagus hannah no presentan orgánulos en su citoplasma (S ALAKIJ ET AL ., 2002). 2.1.2.4.- El Basófilo de los Reptiles Es el leucocito granulocítico de más reciente identificación en reptiles. Los estudios ultraestructurales y citoquímicos han revelado muchas similitudes entre los basófilos de los reptiles y los de los mamíferos, por lo que se les supone la misma función como principales responsables de la respuesta alérgica y antigénica, portando inmunoglobulinas Revisión Bibliográfica 20 de superficie y respondiendo, al activarse, con la liberación del mediador histamina mediante un mecanismo de degranulación. Participan en procesos infecciosos y/o inflamatorios (M EAD ET AL ., 1983; S YPEK ET AL ., 1984; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; R ASKIN , 2000). -Dimensiones celulares El tamaño medio de los basófilos oscila entre 7-20 µm (Tabla 2.7) (A LDER Y H UBER , 1923; A USTIN ET AL ., 1927; A TLAND Y P ARKER , 1955; A TLAND Y T HOMPSON , 1958; M ONTALI , 1988), encontrándose en serpientes los de mayor tamaño, seguidos de los de quelonios y cocodrilianos. Los basófilos más pequeños aparecen en lagartos (M ONTALI , 1988), aunque es en Sphenodon punctatus donde se han descrito los basófilos de mayor tamaño (S AINT G IRONS , 1970). En Crotalus adamanteus el basófilo se describe de menor tamaño que el heterófilo, con un ratio núcleo/citoplasma moderadamente bajo (1:3) (A LLEMAN ET AL ., 1999). En Ophiophagus hannah el diámetro de los basófilos es de 8-12 µm (S ALAKIJ ET AL ., 2002) y en Varanus salvator de 6 a 9 µm (S ALAKIJ ET AL ., 2014). Tabla 2.7. Diámetros mayores de los basófilos de diferentes reptiles no quelonios (S AINT G IRONS Y D UGUY , 1963; F RYE , 1991) ESPECIE MEDIA RANGO Orden Rhyncocephalia Sphenodon punctatus 14.43 12-20 Orden Squamata Suborden Sauria Heteronota binoei 10.90 8-15 Lygosoma (Sphenomorphus) sp. 8.33 7-10 Lacerta muralis 10.80 9-13 Lacerta agilis 8.10 7-9 Lacerta vivipara 10.47 9-12 Lacerta viridis 11.90 10-13 Psammodromus algirus 9.70 8-11 Anguis fragilis 11.89 9-15 Heloderma suspectum 10.92 8-16 Suborden Serpentes Coronella austriaca 11.00 10-12 Elaphe longissima 12.53 9-16 Elaphe scalaris 10.10 9-11 Coluber viridiflavus 13.02 10-15 Natrix natrix 10.18 8-12 Natrix maura 11.83 9-15 Malpolon monspessulanus 11.70 11-13 Vipera aspis 12.26 9-16 Vipera berus 11.69 9-16 Orden Crocodilia Crocodylus niloticus 13.50 Medidas expresadas en µm -Características tintoriales y morfología Las tinciones acuosas pueden generar alteraciones en los gránulos de los basófilos, por lo que las técnicas de tinción más adecuadas son las que emplean como fijador el alcohol, o bien las tinciones tipo Romanowsky o el azul de Toloudina (S YPEK Y Revisión Bibliográfica 21 B ORYSENKO , 1988; C AMPBELL , 1996 B ). El uso de metanol otorga a los basófilos una coloración azul metacromática (A LDER Y H UBER , 1923; A USTIN ET AL ., 1927; A TLAND Y P ARKER , 1955; A TLAND Y T HOMPSON , 1958). Con la técnica Wright-Giemsa los gránulos citoplasmáticos se preservan bien en algunas especies (A LLEMAN ET AL ., 1999), aunque no ocurre igual con todos los reptiles del orden Squamata. Por ejemplo, los gránulos basófilos de la víbora jaracaca (Bothrops jaracaca) no se mantienen adecuadamente con fijaciones basadas en el metanol (E GAMI Y S ASSA , 1988). Los basófilos de Ophiophagus hannah son más difíciles de identificar debido a la coloración azulada que adquieren sus gránulos, prefiriéndose el uso de tinciones Wright (S ALAKIJ ET AL ., 2002). Los basófilos poseen gránulos citoplasmáticos basófilos metacromáticos que adquieren un color púrpura con tinciones tipo Romanowsky (S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; F RYE , 1991; C AMPBELL , 1996 B ). Su núcleo se tiñe oscuro y suele ser de localización central (F RYE , 1991), o ligeramente excéntrico y sin lobulaciones (C AMPBELL , 1996 B ; W ATSON , 1997). En reptiles, al contrario que en mamíferos, no se han observado basófilos con núcleo segmentado (H EARD ET AL ., 2004). Sin embargo, la valoración del núcleo es complicada mediante el uso de la microscopía óptica, ya que los gránulos citoplasmáticos fuertemente teñidos dificultan su visualización (S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; F RYE , 1991; C AMPBELL , 1996 B ; W ATSON , 1997). En Crotalus adamanteus el citoplasma celular es de contorno esférico, albergando un elevado número de gránulos basófilos, redondos y homogéneos, que tienden a enmascarar el núcleo, que tiene morfología ovalada y localización excéntrica (T ROIANO ET AL ., 1997; A LLEMAN ET AL ., 1999). El basófilo de Ophiophagus hannah es muy similar y los gránulos se tiñen intensamente basófilos y están frecuentemente localizados en un polo celular, desplazando al núcleo a una posición excéntrica (S ALAKIJ ET AL ., 2002). Se han realizado descripciones muy similares en Elaphe obsoleta quadrivittata (D OTSON ET AL ., 1997) y en Varanus salvator, en el que el núcleo aparece con morfología esférica y los gránulos citoplasmáticos muestran metacromasia con la tinción del nuevo azul de metileno (S ALAKIJ ET AL ., 2014). En Pogona vitticeps (E LIMAN , 1997) y Physignathus spp. (L E B LANC , 2001) los gránulos muestran una coloración violeta y morfología redondeada, oscureciendo total o parcialmente el núcleo, que se encuentra en posición central. En Iguana iguana los gránulos citoplasmáticos son redondos, azul oscuro o morados, y el núcleo es redondo u oval (H ARR ET AL ., 2001). -Técnicas citoquímicas Los basófilos de Ophiophagus hannah reaccionan positivamente con la técnica del PAS, Sudán negro B, α-naftil acetato esterasa y β-glucuronidasa (S ALAKIJ ET AL ., 2002), mientras que los de Crotalus adamanteus sólo muestran positividad al PAS (A LLEMAN ET AL ., 1999). En ambos casos no existe respuesta positiva al azul de Toluidina. Esto difiere de los resultados obtenidos en varias especies de quelonios y cocodrilianos, en los que se detecta positividad frente a esta técnica citoquímica (M ATEO ET AL ., 1984; M ONTALI , 1988; A LLEMAN ET AL ., 1992), al igual que en varias especies de iguana (Cyclura cornuta e Iguana iguana), que a su vez mostraron negatividad frente al PAS y la dihidroclorido benzidina peroxidasa (Tabla 2.8) (F UENTES ET AL ., 2000). Sin embargo, los estudios de otros autores difieren de estos resultados. Así, H ARR ET AL (2001) describen para los Revisión Bibliográfica 22 basófilos de Iguana iguana positividad leve frente al PAS, pero negatividad frente a las otras técnicas citoquímicas, incluido el azul de Toluidina. Los basófilos de Gallotia simonyi son positivos para el azul de Toluidina y la αnaftil acetato esterasa (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE ET AL ., 2005). Tabla 2.8. Tinciones citoquímicas del basófilo de los reptiles (G ERZELI , 1954; P IENAAR , 1962; D ESSAUER , 1970; C AXTON -M ARTINS , 1977; C AXTON -M ARTINS Y N GANWUCHU , 1978; D ESSER , 1978; recopilado en S YPEK Y B ORYSENKO , 1988) TINCIÓN CITOQUÍMICA REACCIÓN DEL BASÓFILO ENZIMAS Fostatasa ácida Positivo/Negativo Fosfatasa alcalina Positivo/Negativo Beta glucoronidasa Positivo Esterasa Positivo/Negativo Peroxidasa Negativo Deshidrogenasa ácido láctico No determinado POLISACÁRIDOS Reacción del ácido periódico de Schiff Positivo Azul alcian Positivo Azul de toluidina Negativo LÍPIDOS Sudán negro B Negativo Sudán neutro III No determinado -Ultraestructura del basófilo Ultraestructuralmente los basófilos de Sphenodon punctatus muestran un contorno citoplasmático bastante regular y un núcleo compacto. Los abundantes gránulos aparecen ovoides y homogéneamente electrodensos, aunque en muchos basófilos los gránulos se muestran alterados o degenerados, conteniendo microtúbulos en su estructura interna. También se describe en el citoplasma la presencia de mitocondrias, partículas de betaglucógeno y algunos microfilamentos (D ESSER Y W ELLER 1979 A ). F RYE (1991) describe un núcleo redondo con un nucléolo denso y ovalado, y los gránulos de los basófilos de Ophiophagus hannah aparecen pequeños, homogéneos y electrodensos (S ALAKIJ ET AL ., 2002), similar a lo descrito en Varanus salvator, en el que además se describe un núcleo grande y ovalado (S ALAKIJ ET AL ., 2014). Por el contrario, los basófilos de Gallotia simonyi muestran gránulos con elevada y con moderada electrodensidad (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE ET AL ., 2005). 2.1.3.- Los Leucocitos Mononucleares en Reptiles 2.1.3.1.- El Linfocito de los Reptiles La función de los linfocitos en reptiles es muy similar a la de mamíferos y aves. Existen dos tipos principales de linfocitos, T y B, que desarrollan diferentes funciones. Los Revisión Bibliográfica 29 bacterias fagocitadas y detritus celulares. Frecuentemente estas células dominan las respuestas inflamatorias en algunas especies de serpientes y lagartos (M C C RACKEN , 1993; W ATSON , 1997). -Técnicas citoquímicas Los monocitos de Cyclura conuta e Iguana iguana son PAS-positivos (F UENTES ET AL ., 2000). Para otros autores, los monocitos de Iguana iguana, además de ser ligeramente positivos al PAS, reaccionan de forma moderada a la α-naftil butirato esterasa e intensamente a la fosfatasa ácida (H ARR ET AL ., 2001). Asimismo, estos autores clasifican como monocitos a los monocitos con gránulos azurófilos y a las células que no los presentan, puesto que reaccionan citoquímicamente de la misma manera. Los monocitos de Gallotia simonyi no reaccionan positivamente para ninguna de las técnicas citoquímicas estudiadas (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE ET AL ., 2005), mientras que S ALAKIJ ET AL . (2014) describen respuesta positiva a la peroxidasa y la α-naftil acetato esterasa para los monocitos de Varanus salvator. Tabla 2.11. Tinciones citoquímicas del monocito de los reptiles (P IENAAR , 1962; C AXTON -M ARTINS , 1977; C AXTON -M ARTINS Y N GANWUCHU , 1978; recopilado en S YPEK Y B ORYSENKO , 1988) TINCIÓN CITOQUÍMICA REACCIÓN DEL MONOCITO ENZIMAS Fostatasa ácida Positivo Fosfatasa alcalina Positivo Beta glucoronidasa Positivo Esterasa No determinado Peroxidasa Positivo/Negativo Deshidrogenasa ácido láctico No determinado POLISACÁRIDOS Reacción del ácido periódico de Schiff Positivo Azul alcian No determinado Azul de toluidina Positivo LÍPIDOS Sudán negro B Positivo Sudán neutro III No determinado -Ultraestructura del monocito Las descripciones ultraestructurales del monocito en reptiles no quelonios no son muy abundantes. M ARTINEZ -S ILVESTRE ET AL . (2005) describen ultraestructuralmente el monocito de Gallotia simonyi como una célula con un núcleo con heterocromatina densa y homogénea y un citoplasma portador de algunos gránulos de gran tamaño y vacuolas de diferentes tallas, así como con algunos ribosomas. Revisión Bibliográfica 30 2.1.3.3.- El Azurófilo de los Reptiles El azurófilo es un nuevo tipo de leucocito de los reptiles, inicialmente considerado exclusivo del orden Squamata (M ONTALI , 1988; H AWKEY Y D ENNET , 1989, 1994; D IVERS ET AL ., 1996; T ROIANO ET AL ., 1996, 1997; E LIMAN , 1997; A NDERSON ET AL ., 1997; T ROIANO Y S ILVA , 1998; C HRISTOPHER , ET AL ., 1999; A LLEMAN ET AL ., 1999; F UENTES ET AL ., 2000). En un primer momento se incluyó dentro de las células mononucleares y se le otorgó una función similar a la de los monocitos de los cuales procedía (M ONTALI , 1988; A LLEMAN ET AL ., 1992; R ASKIN , 2000). Se especuló mucho con la idea de que los azurófilos eran monocitos activados presentes en sangre circulante (D UGUY , 1970; S AINT G IRONS , 1970; C AMPBELL , 1996), existiendo una gran variedad de opiniones encontradas que aún persiste actualmente, debido a que esta célula presenta simultáneamente características de acidófilo y de monocito (M ONTALI , 1988; H AWKEY Y D ENNET , 1989; W ATSON , 1997). Algunos autores relacionan esta célula con los granulocitos neutrófilos (J ORDAN , 1938; S AINT G IRONS , 1970; M AC M AHON Y H OMER , 1975; W ILL , 1978; F RYE , 1981; A LLEMAN ET AL ., 1999), mientras que otros emplean el término azurófilo para los monocitos que presentan citoplasma azurofílico (S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; A LLEMAN ET AL ., 1992; M URO ET AL ., 1994; C AMPBELL , 1996 B ; W ATSON , 1997; H ARR ET AL ., 2001; C AMPBELL , 2004 A ). Asimismo, algunos autores han descrito azurófilos en reptiles del orden Chelonia (H AWKEY Y D ENNETT , 1989; A LLEMAN ET AL ., 1992; A NDERSON ET AL ., 1997; T ROIANO Y S ILVA , 1998; C HRISTOPHER ET AL ., 1999; S MITH ET AL ., 2000), y otros han encontrado su existencia en reptiles del orden Crocodylia (H AWKEY Y D ENNET , 1989; A LLEMAN ET AL ., 1999; F ONTENOT ET AL ., 2004). Sin embargo, existen autores que afirman que en varias especies de lagartos se han clasificado erróneamente los monocitos como azurófilos, ya que los estudios se han basado únicamente en la coloración púrpura de su citoplasma. Mediante estudios citoquímicos de estas células en iguanas se ha demostrado que carecen de la actividad peroxidasa que presentan los azurófilos de las serpientes. Las características citoquímicas hacen que dichas células en iguanas sean idénticas a los monocitos, por lo que no deberían denominarse de otra manera (H ARR ET AL ., 2001). Actualmente se considera que sólo las serpientes poseen azurófilos, puesto que esta denominación debe sólo mantenerse para aquellas células monocitoides que se muestran positivas a la bencidina peroxidasa (H EARD ET AL ., 2004). Se ha descrito que los azurófilos pueden sufrir una transición de una morfología tipo granulocito a una tipo mononuclear bajo determinadas condiciones. En lagartos se suelen encontrar diferentes estadíos celulares intermedios similares a los neutrófilos o a otros granulocitos (W ILL ,1978). Según H AWKEY y D ENNET (1989), no se posee suficiente información sobre el origen y función de los azurófilos. No obstante, se cree que juegan un papel importante en las respuestas inflamatorias, particularmente en ofidios, y que la azurofilia y los cambios tóxicos en la morfología celular suelen ser indicativos de infección. Otros autores consideran que el azurófilo, al derivar del monocito, comparte la función de éste (M ONTALI , 1988; A LLEMAN ET AL ., 1992; R ASKIN , 2000). Por ello se afirma que los azurófilos, al igual que los monocitos, incrementan su número en la respuesta antigénica y en presencia de enfermedades infecciosas, ya que participan en las interacciones antígenoinmunoglobulina específica, especialmente en las que están involucradas la IgM y la IgY (M EAD Y B ORYSENKO , 1984 A ; S EKIZAWA ET AL ., 1984; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988). Asimismo, los estudios realizados en Iguana iguana han revelado al azurófilo como una célula inflamatoria y reactiva de importancia, aunque siempre precedida por el heterófilo (D IVERS ET AL ., 1996). Revisión Bibliográfica 31 -Dimensiones celulares El azurófilo de Crotalus adamanteus es ligeramente superior en tamaño al eritrocito, con un ratio núcleo/citoplasma moderadamente bajo, aproximadamente 1:3 (A LLEMAN ET AL ., 1999). En Ophiophagus hannah el diámetro de esta célula es de entre 10 y 17 µm, con un ratio núcleo/citoplasma también de 1:3 (S ALAKIJ ET AL ., 2002). En Elaphe obsoleta quadrivittata los azurófilos son similares en tamaño a los heterófilos (D OTSON ET AL ., 1997). Los azurófilos de Pogona vitticeps presentan el mismo tamaño, o ligeramente inferior, que los monocitos (E LIMAN , 1997). En Gallotia simonyi el ratio núcleo/citoplasma es bajo, de 1:3 a 1:4 (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE ET AL ., 2005), mientras que los azurófilos de Varanus salvator tienen un tamaño medio de 8 a 14 µm, con un núcleo voluminoso (S ALAKIJ ET AL ., 2014). -Características tintoriales y morfología Se desconoce a ciencia cierta el origen y función del azurófilo, aunque se supone que procede de la serie monocítica, debido a su morfología redonda, núcleo simple y finos gránulos azurófilos citoplasmáticos. Sin embargo, parece poseer características morfológicas intermedias entre el monocito y los granulocitos (M ONTALI , 1988). Varios autores describen al azurófilo muy similar al monocito, en cuanto a tamaño y morfología nuclear (D IVERS ET AL ., 1996; J OHNSON Y B ENSON , 1996), mientras otros lo consideran como un monocito pequeño, con un citoplasma de granulación variable (W ATSON , 1997). Otros autores consideran que la morfología del azurófilo puede variar desde redonda y pequeña, similar a los linfocitos, hasta mucho mayor, semejándose a un monocito, lo que podría implicar diferentes estadíos de maduración celular (H AWKEY Y D ENNET , 1989). Para R ASKIN (2000) la característica morfológica más destacable del azurófilo es que su citoplasma contiene gránulos eosinófilos finos y abundantes, que le pueden otorgar una coloración rojo-púrpura. Un factor a destacar de los azurófilos es que, cuando se exponen a tinciones tipo Romanowsky, su citoplasma muestra una reacción metacromática, lo que puede facilitar su reconocimiento e identificación en los frotis sanguíneos rutinarios (H AWKEY Y D ENNET , 1989). Los azurófilos de Crotalus adamanteus se describen como células redondas, con un citoplasma lleno de gránulos azurófilos y un moderado número de vacuolas claras. El núcleo aparece central o ligeramente excéntrico, con morfología redonda o irregular, con cromatina condensada. En esta especie las células monocitoides sin granulación azurófila son tan escasas que no se incluyen en el recuento leucocitario (A LLEMAN ET AL ., 1999). El azurófilo de Crotalus durissus terrificus se describe como una célula redonda, de núcleo excéntrico y lobulado y con citoplasma azul claro, a veces de apariencia granular (T ROIANO ET AL ., 1997). El contorno celular de los azurófilos de Elaphe obsoleta quadrivittata varía de redondo a apariencia monocitoide, con un núcleo redondo o lenticular, generalmente Revisión Bibliográfica 32 excéntrico, con cromatina condensada no muy aparente. El citoplasma se muestra grisazulado, granular y ocasionalmente con vacuolas (D OTSON ET AL ., 1997). Los azurófilos de Ophiophagus hannah se describen como células redondas, con dos variantes celulares. Un primer tipo contiene numerosos gránulos azurófilos, y otro muestra una apariencia más monocitoide, con escasos gránulos citoplasmáticos. Se cree que las células del primer tipo son más inmaduras, ya que las del segundo tipo contienen numerosos lisosomas. El núcleo es redondo o irregular con cromatina condensada y posición central o excéntrica (S ALAKIJ ET AL ., 2002). En Pogona vitticeps la clave para distinguir los azurófilos de los monocitos es su citoplasma heterocromático, con sus gránulos esféricos de coloración rosa y azul (eosinófila y azurófila). El núcleo aparece excéntrico, redondo o arriñonado (E LIMAN , 1997). Sin embargo, otros autores han descrito azurofilia pura para el citoplasma de estas células en esta especie (S AINT G IRONS , 1970). El citoplasma de los azurófilos de Gallotia simonyi muestra vacuolas dispersas de diversos tamaños y gránulos azurófilos no tan intensamente teñidos como los de los granulocitos. El núcleo es no lobulado y suele aparecer en posición central (M ARTÍNEZ - S ILVESTRE ET AL ., 2005). El núcleo del azurófilo de Varanus salvator se describe grande y redondeado y su citoplasma presenta numerosos gránulos azurófilos (S ALAKIJ ET AL ., 2014). -Técnicas citoquímicas Al igual que ocurre en el monocito de los mamíferos, se ha descrito positividad de los gránulos de los azurófilos frente a la reacción de la peroxidasa (M ONTALI , 1988). De hecho, hay autores que afirman que la denominación de azurófilo sólo debería mantenerse para las células monocitoides que reaccionen positivamente frente a la bencidina peroxidasa (H EARD ET AL ., 2004). En Crotalus adamanteus los gránulos azurófilos se tiñen intensamente con las técnicas citoquímicas de la benzidina peroxidasa y SBB y de forma menos intensa y difusa con PAS (A LLEMAN ET AL ., 1999), recordando al patrón de tinción citoquímica del neutrófilo de mamíferos (B AGGIOLINI , 1972). Sin embargo, estas células no se tiñen con la α-naftil butirato esterasa, la cual es un marcador citoquímico usado para caracterizar las células de origen monocítico en los mamíferos. Las características citoquímicas de los azurófilos de Bothrops jaracaca son muy similares a las de Crotalus adamanteus (E GAMI Y S ASSA , 1988). Sin embargo, difieren ligeramente de las de Elaphe obsoleta quadrivittata, pues en esta especie, además de teñirse con la peroxidasa y el SBB, también muestran positividad frente a la α-naftil butirato esterasa y a la cloroacetato esterasa (B OUNOUS ET AL ., 1996). Los azurófilos de Ophiophagus hannah se tiñen intensamente con SBB y moderadamente con PAS y α-naftil acetato esterasa (S ALAKIJ ET AL ., 2002). En Cyclura conuta e Iguana iguana se han descrito tanto monocitos como azurófilos, siendo estos últimos positivos frente al PAS y la dihidroclorido benzidina peroxidasa (F UENTES ET AL ., 2000). Los azurófilos de Gallotia simonyi reaccionan positivamente a la fosfatasa ácida, αnaftil acetato esterasa y cloroacetato esterasa (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE ET AL ., 2005), mientras Revisión Bibliográfica 33 que los de Varanus salvator se tiñen moderadamente con la peroxidasa y la α-naftil acetato esterasa (S ALAKIJ ET AL ., 2014). -Ultraestructura del azurófilo Ultraestructuralmente, los azurófilos de Crotalus adamanteus muestran numerosos gránulos citoplasmáticos pequeños rodeados de membrana. También aparecen en el citoplasma un número moderado de mitocondrias grandes, retículo endoplásmico rugoso y lisosomas, así como pequeños procesos citoplasmáticos y algunas vacuolas. La membrana nuclear se halla rodeada de un pequeño acúmulo de heterocromatina (A LLEMAN ET AL ., 1999). Mediante microscopía electrónica de barrido el azurófilo de Ophiophagus hannah muestra una membrana celular muy irregular con algunos microporos. Ultraestructuralmente, también se detectan diferencias entre las dos variantes celulares descritas. Una variante muestra numerosos gránulos pequeños ligados a membrana, algunas mitocondrias y retículo endoplasmático rugoso. La otra variante de azurófilo contiene numerosas vacuolas de gran tamaño y mitocondrias (S ALAKIJ ET AL ., 2002). El azurófilo de Gallotia simonyi muetra a nivel ultraestructural una significante cantidad de heterocromatina nuclear periférica. El citoplasma presenta un número moderado de orgánulos, entre los que se encuentran las mitocondrias, aparato de Golgi y lisosomas (M ARTINEZ -S ILVESTRE ET AL ., 2005). En Varanus salvator los azurófilos presentan numerosos gránulos ligados a membrana, mitocondrias y retículo endoplasmático. Al igual que en Ophiophagus Hannah la microscopía electrónica de barrido revela una membrana celular muy irregular (S ALAKIJ ET AL ., 2014). 2.1.4.- El Trombocito de los Reptiles El origen de los trombocitos está en las células multinucleadas tipo megacariocito de la médula ósea y en focos de hematopoyesis extramedular. Los trombocitos de reptiles recuerdan a los megacariocitos de mamíferos. Tanto los trombocitos maduros como los megacariocitos pueden funcionar como fagocitos activos, como demuestra la presencia de bacterias y restos tisulares y de eritrocitos en sus citoplasmas (F RYE , 1991; W ATSON , 1997). Los trombocitos son similares en cuanto a su función a las plaquetas de los mamíferos, y juegan un importante papel en la formación del trombo, coagulación sanguínea y cicatrización de heridas (F RYE , 1991; W ATSON , 1997; R ASKIN , 2000). Si bien los estímulos que desencadenan la adhesión y agregación pueden ser diferentes, parece que las plaquetas y los trombocitos funcionan de forma similar en los procesos homeostásicos. La tendencia de estas células a ser activadas por contacto con superficies extrañas puede originar cambios en su morfología durante la toma de muestras de sangre, excepto cuando se procede de forma muy cuidadosa. La activación de los trombocitos produce una vacuolización citoplasmática, alteraciones en su contorno y agregación. Aunque la activación celular frecuentemente facilita la identificación de los trombocitos, también Revisión Bibliográfica 34 puede ocultar cambios cuantitativos y morfológicos clínicamente significativos (H AWKEY Y D ENNET , 1989; C AMPBELL , 1996 B ). Además, se ha afirmado que los trombocitos con núcleo polimórfico (H AWKEY Y D ENNET , 1989; C AMPBELL , 1996 B ; W ATSON , 1997) o los trombocitos multinucleados (W ATSON , 1997) pueden estar asociados a enfermedades inflamatorias severas. Los trombocitos son pluripotenciales, lo que les permite ser transformados en eritrocitos, y al igual que sucede con el eritrocito, una vez maduros, pueden volver a sufrir división mitótica y amitótica (F RYE , 1991). La pluripotencialidad de los trombocitos se demuestra en reptiles anémicos, mediante el uso de la técnica de la bencidina peroxidasa, que detecta cantidades mínimas de hemoglobina. Con el uso de tinciones Wright o Giemsa también se comprobó que estas células portaban pigmentos sanguíneos. La confirmación llegó con la inducción de anemia en varios individuos, modificándose la morfología de los trombocitos, que pasaron de células normales a células aumentadas de tamaño, con uno o más nucléolos prominentes y un mayor contenido de hemoglobina citoplasmática (F RYE , 1991). -Dimensiones celulares Las dimensiones del trombocito pueden ser bastante variables, dependiendo de si presenta una forma elíptica o ha adquirido una morfología más redondeada. En general se considera que su tamaño suele oscilar entre 5-9 µm de ancho por 8-16 µm de largo, tendiendo a ser células relativamente pequeñas en la mayoría de las especies (B ERNSTEIN , 1938; R YERSON , 1949; T AYLOR Y K APLAN , 1961; P IENAAR , 1962; D ESSER , 1978; W OOD Y E BANKS , 1984; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988). A modo de ejemplo, los trombocitos de Crotalus adamanteus aparecen como células pequeñas, la tercera parte del tamaño del eritrocito maduro (A LLEMAN ET AL ., 1999), mientras que en Ophiophagus hannah miden aproximadamente la mitad de un eritrocito maduro, aunque los trombocitos que aparecen agrupados en el frotis tienden a ser más pequeños, aproximadamente como un linfocito (S ALAKIJ ET AL ., 2002). El trombocito de Varanus salvator también suele medir la mitad que el eritrocito maduro (S ALAKIJ ET AL ., 2014). -Características tintoriales y morfología La aplicación de tinciones supravitales ayuda a diferenciar a los trombocitos (que aceptan la tinción) de los eritrocitos (que no la aceptan) (F RYE , 1991). Morfológicamente el trombocito de reptiles varía de elíptico/fusiforme a redondo (B ERNSTEIN , 1938; R YERSON , 1949; T AYLOR Y K APLAN , 1961; P IENAAR , 1962; D ESSER , 1978; W OOD Y E BANKS , 1984; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988), con un núcleo grande, basófilo y de posición central, con cromatina por lo general más homogénea que la del eritrocito (C AMPBELL , 1996 B ; F RYE , 1991). El citoplasma de muchos de los trombocitos de reptiles varía de azul claro a poco coloreado y es agranular (F RYE , 1991), aunque con granulación azurófila ocasional (H AWKEY Y D ENNET , 1989; C AMPBELL , 1996 B ; W ATSON , 1997; R ASKIN , 2000). Los trombocitos activados son comunes y muestran vacuolización citoplasmática y contornos irregulares (C AMPBELL , 1996 B ; W ATSON , 1997; C AMPBELL , 2004 A ) y pueden ser Revisión Bibliográfica 35 hallados en reptiles anémicos (W ATSON , 1997), observándose con frecuencia en condiciones sépticas severas, tales como la septicemia producida por Salmonella spp. (R OSSKOPF , 2000). Por tanto, aunque la razón de la variación en las características morfológicas de los trombocitos se desconoce, se considera que puede estar relacionada con la actividad que desarrollan estas células o con su activación durante la toma de sangre (H EARD ET AL ., 2004). En ocasiones pueden observarse trombocitos binucleados en los frotis sanguíneos de reptiles anémicos, por lo que se les supone capaces de dividirse amitóticamente, al igual que los eritrocitos (F RYE , 1991). Los trombocitos tienen tendencia a adherirse entre ellos y formar agregados en los frotis sanguíneos (H AWKEY Y D ENNET , 1989; F RYE , 1991; A LLEMAN ET AL ., 1992; M URO ET AL ., 1994; C AMPBELL , 1996 B ; T ROIANO ET AL ., 1996; E LIMAN , 1997; W ATSON , 1997; A LLEMAN ET AL ., 1999). Cuando esto sucede puede ser difícil apreciar su citoplasma (C AMPBELL , 2004 A ). Los trombocitos pueden confundirse con los linfocitos o con los núcleos rotos de los eritrocitos (H AWKEY Y D ENNET , 1989; E LIMAN , 1997; W ATSON , 1997; A LLEMAN ET AL ., 1999), si bien los trombocitos suelen ser de menor tamaño que los linfocitos, poseen más cantidad de citoplasma y su tendencia a la aglutinación en los frotis sanguíneos los distingue. Además, si poseen gránulos azurófilos citoplasmáticos se presentan en menor número que los del linfocito (W ATSON , 1997). Los trombocitos inmaduros de reptiles son parecidos a los de las aves, y su presencia refleja una respuesta regenerativa (C AMPBELL , 2004 A ). Los trombocitos de Pogona vitticeps generalmente se describen elipsoidales, con un núcleo redondo fuertemente teñido, además de un citoplasma de coloración clara. Tienden a aparecer agregados en el frotis, distinguiéndose así de los linfocitos (E LIMAN , 1997). Los trombocitos de Physignathus spp. mantienen la misma morfología elíptica, con un citoplasma gris muy claro, más abundante que el de los linfocitos. Su núcleo presenta un patrón de cromatina muy denso, siendo más basófilo que el núcleo de los linfocitos (L E B LANC , 2001). Los trombocitos de Crotalus adamanteus pueden encontrarse aislados o formando agregados. Presentan un citoplasma ligeramente basófilo, aunque a veces aparece claro o moderadamente vacuolizado y en ocasiones puede desarrollar pseudópodos. El núcleo se muestra ovalado con cromatina densa, con un ratio núcleo/citoplasma alto, pero no tanto como el de los linfocitos (A LLEMAN ET AL ., 1999). En Ophiophagus hannah los trombocitos son alargados, con citoplasma ligeramente basófilo. El núcleo es oval, con cromatina densa y un ratio núcleo/citoplasma moderadamente elevado. Son fácilmente diferenciados de los linfocitos por la vacuolización citoplasmática perinuclear que presentan (S ALAKIJ ET AL ., 2002). Los trombocitos de Elaphe obsoleta quadrivittata suelen presentar dos morfologías. Una es elíptica con bordes lisos, con el eje mayor del núcleo paralelo al de la célula. La otra es generalmente redonda, aunque puede presentarse deforme, con bordes irregulares. En ambas formas el núcleo es central y densamente basófilo, con un patrón de cromatina condensada no muy aparente. El citoplasma comúnmente es poco coloreado y difícil de Revisión Bibliográfica 36 discernir, particularmente en los trombocitos redondos. Con frecuencia pueden observarse estas células agregadas (D OTSON ET AL ., 1997). El citoplasma del trombocito de Gallotia simonyi ocasionalmente muestra pseudopodia y en algunas células sólo supone un pequeño halo alrededor del núcleo celular. Dicho núcleo es similar en tamaño al del eritrocito (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE ET AL ., 2005). Los trombocitos de Varanus salvator son redondos u ovales, con un citoplasma claro y pequeñas vacuolas ocasionales (S ALAKIJ ET AL ., 2014). -Técnicas citoquímicas La mayoría de los trombocitos de reptiles contienen vacuolas claras que se corresponden con depósitos de glucógeno, que actúan como fuente de energía. Dichas estructuras se tiñen positivamente con PAS. Esto permite distinguir los trombocitos redondos y con escaso citoplasma de los linfocitos, ya que estos últimos no se suelen teñir con PAS (H EARD ET AL ., 2004). Esta característica se cumple en Crotalus adamanteus, ya que frente a la positividad del PAS de los trombocitos, los linfocitos se muestran negativos. En esta especie, los trombocitos también responden positivamente a la α-naftil butirato esterasa, aunque el patrón de tinción es menos intenso que con la técnica del PAS (A LLEMAN ET AL ., 1999). El mismo patrón de tinción citoquímica se observa en Iguana iguana (H ARR ET AL ., 2001). En Ophiophagus hannah sólo un pequeño número de trombocitos se tiñen intensamente con PAS, con una reacción bien definida a nivel perinuclear. Los trombocitos también se tiñen débilmente con la fostatasa ácida y la β-glucoronidasa (S ALAKIJ ET AL ., 2002). Los trombocitos de Gallotia simonyi no reaccionan positivamente con ninguna de las técnicas citoquímicas utilizadas (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE ET AL ., 2005), mientras que los de Varanus salvator son positivos para la α-naftil acetato esterasa y la β-glucuronidasa (S ALAKIJ ET AL ., 2014). Revisión Bibliográfica 37 Tabla 2.12. Tinciones citoquímicas del trombocito de los reptiles (P IENAAR , 1962; C AXTON -M ARTINS Y N GANWUCHU , 1978; D ESSER Y W ELLER , 1979; recopilado en S YPEK Y B ORYSENKO , 1988) TINCIÓN CITOQUÍMICA REACCIÓN DEL TROMBOCITO ENZIMAS Fostatasa ácida Positivo Fosfatasa alcalina Negativo Beta glucoronidasa No determinado Esterasa No determinado Peroxidasa Negativo Deshidrogenasa ácido láctico No determinado POLISACÁRIDOS Reacción del ácido periódico de Schiff Positivo Azul alcian No determinado Azul de toluidina Negativo LÍPIDOS Sudán negro B Negativo Sudán neutro III No determinado -Ultraestructura del trombocito Ultraestructuralmente, el núcleo del trombocito suele presentarse lobulado con heterocromatina densa (F RYE , 1991; C AMPBELL , 1996 B ; R ASKIN , 2000). El citoplasma de las células activas muestra pseudópodos que contienen material finamente granular (D ESSER Y W ELLER , 1979 B ; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; F RYE , 1991), además de numerosos filamentos similares a fibrina entre, y alrededor, de las células (D ESSER Y W ELLER , 1979 B ; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988). Los trombocitos de Sphenodon punctatus presentan varios tipos de orgánulos citoplasmáticos, incluyendo ribosomas, mitocondrias y vacuolas citoplasmáticas, conteniendo éstas material filamentoso o inclusiones esféricas electrodensas. El betaglucógeno se encuentra distribuido por el citoplasma, especialmente concentrado en los pseudópodos (D ESSER Y W ELLER , 1979 B ). Los trombocitos de Caiman crocodilus yacare son predominantemente elípticos y con un volumen citoplasmático variable, generalmente más abundante en los polos, donde se aprecia un área de baja electrodensidad y aspecto homogéneo. En la región perinuclear se observan gran cantidad de túbulos y vesículas electrolúcidas del sistema canalicular. Aparecen también vacuolas con gránulos densos, microtúbulos, algunas mitocondrias, retículo endoplasmático rugoso, ribosomas y vesículas de pinocitosis. El núcleo es elíptico, presentando hendiduras y heterocromatina electrodensa, además de poros nucleares en la membrana (D E M OURA ET AL ., 1997). Los trombocitos de Crotalus adamanteus contienen abundante retículo endoplásmico rugoso y polirribosomas, un pequeño número de grandes mitocondrias perinucleares y gránulos pequeños ligados a membrana. Además, el citoplasma presenta un número variable de procesos citoplasmáticos y grandes vacuolas de baja electrodensidad. El núcleo muestra un típico patrón de heterocromatina periférica (A LLEMAN ET AL ., 1999). Revisión Bibliográfica 38 Mediante la microscopía electrónica de barrido los trombocitos de Ophiophagus hannah se muestran como células alargadas de superficie lisa (S ALAKIJ ET AL ., 2002), muy similar a lo descrito en Varanus salvator (S ALAKIJ ET AL ., 2014). El citoplasma de los trombocitos de Gallotia simonyi presenta pseudópodos, vacuolas y pequeños gránulos asociados a membrana. Las mitocondrias son muy abundantes, siendo el tipo celular con mayor número de éstas. El núcleo se caracteriza por su heterocromatina periférica (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE ET AL ., 2005). Revisión Bibliográfica 45 dentro o alrededor de una determinada zona cuando las enzimas se localizan en los orgánulos celulares, pero también pueden teñirse enzimas libres, no rodeadas de membrana (B OZDECH Y B AINTON , 1981). El área focal de tinción puede que no represente sólo un orgánulo que contiene esas enzimas, sino una acumulación de orgánulos, posiblemente lisosomas, en una zona determinada de la célula (A LLEMAN ET AL ., 1992). Los heterófilos de Chelonia mydas se tiñen con α-naftil butirato esterasa y su citoplasma es PAS positivo (W ORK ET AL ., 1998), mientras que en los juveniles de Caretta caretta se detecta positividad para la bencidina peroxidasa, además de para la fosfatasa ácida (con y sin tartrato), la cloroacetato esterasa, el sudán negro B y débilmente para el PAS (C ASAL Y O RÓS , 2007). -Ultraestructura del heterófilo En Chelonia mydas el núcleo presenta acúmulos moderados de heterocromatina y el citoplasma contiene numerosos gránulos electrodensos alargados o redondos. También aparece una pequeña cantidad de gránulos pleomórficos de diferentes densidades electrónicas, retículo endoplasmático y algunas mitocondrias (W ORK ET AL ., 1998). Ultraestructuralmente, los heterófilos de los juveniles de Caretta caretta muestran una forma redonda, con un núcleo excéntrico circular, conteniendo acúmulos moderados de heterocromatina. El abundante citoplasma contiene numerosos gránulos electrodensos redondos o alargados y un escaso número de gránulos pleomórficos de densidad variable. También algunas mitocondrias y retículo endoplasmático (C ASAL ET AL ., 2007). 2.2.2.3.- El Eosinófilo de los Quelonios Los eosinófilos se observan con frecuencia como respuesta a infecciones parasitarias (G LAZEBROOK ET AL ., 1981; J AIN , 1986 B ; M URO ET AL ., 1994). Los eosinófilos de las tortugas fagocitan complejos inmunes, indicando así su participación en las respuestas inmunes (M EAD Y B ORYSENKO , 1984 A ; M URO ET AL ., 1994). Se citan 3 clases de inmunoglobulinas séricas en tortugas: Ig M, Ig Y e Ig N (C HARTRAND ET AL ., 1971; B ENEDICT Y P OLLARD , 1972; L ESLIE Y C LEM , 1972; recopilado en S YPEK Y B ORYSENKO , 1988). La presencia de la inmunoglobulina citofílica en el eosinófilo de reptiles se demuestra mediante interacciones antígeno-específicas con eritrocitos de oveja, en tortugas apropiadamente inmunizadas con dichos eritrocitos (M EAD Y B ORYSENKO , 1984 B , S YPEK Y B ORYSENKO , 1988). -Dimensiones celulares Los eosinófilos de las tortugas y cocodrilos presentan un tamaño intermedio entre los de las serpientes y los saurios (S AINT G IRONS , 1970). En la tortuga mora (Testudo graeca) el diámetro mayor de los eosinófilos presenta una media de 14.19 µm, con un rango de 11 a 17 µm (S AINT G IRONS Y D UGUY , 1963; F RYE , 1991) . En Testudo horsfieldi estas células son ligeramente mayores que los heterófilos, con un diámetro citoplasmático aproximado de 13.5 µm y un núcleo de 8.6 µm (K NOTKOVA ET AL ., 2002). Revisión Bibliográfica 46 W OOD Y E BANKS (1984) describen el eosinófilo de Chelonia mydas como una célula de gran tamaño, con 13.4 ± 2.2 µm de diámetro, mientras que W ORK ET AL . (1998) detectan dos tamaños celulares diferenciados en esta especie. Los eosinófilos pequeños, de 12 a 16 µm de diámetro y los grandes, de 14 a 22 µm. De forma similar, en Lepidochelys kempii también se citan dos tipos de eosinófilos: los grandes, de 14 µm de diámetro, con gránulos de 1.8-2.0 µm y menos frecuentes, los pequeños, de 10 µm de diámetro (C ANNON , 1992). Los eosinófilos de Caretta caretta representan la célula de mayor tamaño (Tabla 2.16.) y sólo se detecta una variante morfológica (C ASAL Y O RÓS , 2007). Tabla 2.16. Media, desviación estándar y rangos de las dimensiones citoplasmáticas de los eosinófilos de tortugas bobas juveniles (Caretta caretta) (C ASAL Y O RÓS , 2007) Área Perímetro Diámetro mayor Diámetro menor Eosinófilo 259.60±50.12 160.40-375.80 58.67±5.72 46.43-70.32 20.02±2.23 15.65-25.31 16.87±1.92 13.17-21.26 Todas las medidas están expresadas en µm, excepto el área, en µm 2 -Características tintoriales y morfología Los granulocitos eosinófilos de los quelonios se caracterizan por sus gránulos esféricos de color rosa pálido (M URO ET AL ., 1994) o eosinofílicos cuando se tiñen con las tinciones adecuadas (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE , 1994). Son células grandes, redondeadas y con un núcleo pequeño azulado de localización central (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE , 1994; M URO ET AL ., 1994) o periférica (M URO ET AL ., 1994), pudiendo presentarse lobulado (W ILKINSON , 2004). Los eosinófilos de Gopherus agassizii son similares a los heterófilos, conteniendo numerosos gránulos eosinófilos en su citoplasma, discernibles de los gránulos heterófilos por su contorno redondeado. El núcleo es simple, excéntrico y redondeado o ligeramente irregular (A LLEMAN ET AL ., 1992). Los eosinófilos de Testudo horsfieldi son células redondas, con gránulos citoplasmáticos más oscuros que los de los heterófilos, rojos y redondos. El núcleo se presenta excéntrico, con coloración uniforme y cromatina condensada (K NOTKOVA ET AL ., 2002). B RADLEY ET AL . (1998) describen los eosinófilos de ejemplares de Chelonia muydas de menos de un año de edad como células de citoplasma claro, con gránulos citoplasmáticos redondos, de tamaño variable y coloración roja oscura. El núcleo es eosinófilo, de contorno oval o dentado y cromatina condensada. C ASAL Y O RÓS (2007) describen el eosinófilo de juveniles de Caretta caretta como una célula de núcleo excéntrico, oval o redondo e intensamente violeta, con cromatina condensada. El abundante citoplasma es débilmente basófilo, con un moderado número de gránulos redondos eosinofílicos bien definidos, con un tamaño de 1 µm, aproximadamente. W OOD Y E BANKS (1984) observan sólo una variable morfológica del eosinófilo en Chelonia mydas describiéndolo como una célula redonda, con núcleo redondo o ligeramente ovalado, de posición periférica y débilmente basófilo. Los abundantes Revisión Bibliográfica 47 gránulos citoplasmáticos son esféricos y fuertemente eosinófilos. W ORK ET AL . (1998) describen dos tipos celulares en Chelonia mydas, los eosinófilos pequeños y los grandes. Los pequeños muestran un núcleo bien definido, redondo y de color violeta-azulado, con un citoplasma azulado que presenta numerosos gránulos redondos, gris-naranja o de coloración clara, lo que les da apariencia de linfocito vacuolizado. Los eosinófilos grandes tienen un núcleo amorfo, excéntrico y de coloración violeta-azulada. Su abundante citoplasma es claro o ligeramente granular, conteniendo escasos gránulos redondos con un centro naranja pálido, y rodeados por un halo azul-naranja ligeramente refráctil. Los gránulos metacromáticos bien definidos y de tamaño variable son infrecuentes en los eosinófilos de la toruga verde. En Lepidochelys kempii también se citan eosinófilos grandes y pequeños. Los grandes se caracterizan por un núcleo redondo u ovoide excéntrico, con un citoplasma lleno de unos 70-85 gránulos refráctiles redondos u ovoides, de coloración naranja y localización periférica. También pueden observarse gránulos más pequeños y menos refráctiles. Los eosinófilos pequeños son menos frecuentes, con una menor cantidad de gránulos grandes refráctiles redondos (C ANNON , 1992). Existen pocos estudios que hablen de la presencia de dos tipos morfológicos de eosinófilos en reptiles. Así, además de en Lepidochelys kempii (C ANNON , 1992) y en Chelonia mydas (W ORK ET AL ., 1998), se han descrito en la tortuga india de caparazón blando (Lissemys punctata) (D E Y M AITI , 1981, 1982). W ORK ET AL . (1998) deducen que los eosinófilos grandes encontrados en Chelonia mydas representan células activadas degranuladas o que contienen material granular coalescente en respuesta a estímulos inflamatorios. Sin embargo, no hay datos suficientes para determinar diferencias en la madurez entre los dos tipos celulares. -Técnicas citoquímicas Por lo general, en contraste con los heterófilos, los eosinófilos de muchas especies de quelonios son positivos a la peroxidasa con las técnicas de la bencidina o la pphenylenediamina, y pueden diferenciarse de los heterófilos por pruebas citoquímicas simples (K ÉLENYI Y N EMETH , 1969; M ATEO ET AL ., 1984; M AXWELL , 1984). Los eosinófilos de Gopherus agassizii resultan fácilmente identificables puesto que los gránulos reaccionan positivamente a la bencidina peroxidasa, mientras que los gránulos heterófilos se muestran negativos. Los gránulos eosinófilos no se tiñen con ninguna otra tinción citoquímica, y sólo se observan pequeñas áreas citoplasmáticas positivas a la técnica de la cloroacetato esterasa (A LLEMAN ET AL ., 1992). Análogamente, los gránulos eosinófilos de la tortuga de caja europea (Emys orbicularis) reaccionan positivamente a la peroxidasa (K ÉLENYI Y N EMETH , 1969). En Lepidochelys kempii los gránulos refráctiles de los eosinófilos pequeños reaccionan intensamente con la fosfatasa ácida, en contraste con los gránulos de los eosinófilos grandes, que son negativos. Generalmente, los eosinófilos grandes exhiben positividad moderada frente a la fosfatasa alcalina, localizándose principalmente en los gránulos más pequeños y menos refráctiles. Los gránulos refráctiles grandes muestran actividad de moderada a intensa frente a la mieloperoxidasa y la adenosin trifosfatasa. La positividad a la reacción del PAS parece concentrarse exclusivamente en los gránulos más pequeños y menos refráctiles de los eosinófilos grandes. Lo mismo sucede con la actividad esterasa inespecífica. Un moderado número de gránulos pequeños de los eosinófilos Revisión Bibliográfica 48 grandes se muestra positivo a los lípidos neutros cuando se tratan con Sudán negro B (C ANNON , 1992). En Chelonia mydas tanto los gránulos de los eosinófilos grandes como los de los pequeños se tiñen intensamente con la cloroacetato esterasa y marginalmente con la αnaftil butirato esterasa y con el PAS (W ORK ET AL ., 1998). Los gránulos de los eosinófilos de Caretta caretta reaccionan de forma positiva para la fosfatasa ácida (con y sin tartrato), α-naftil butirato esterasa (con fluoruro sódico), cloroacetato esterasa y PAS, y son moderadamente positivos para el Sudán negro B (C ASAL Y O RÓS , 2007). -Ultraestructura del eosinófilo El núcleo de los eosinófilos de Chelonia mydas es redondo u oval, con cantidades variables de heterocromatina. Los eosinófilos pequeños muestran gránulos redondos densamente homogéneos y bien definidos, que frecuentemente aparecen deformados por estructuras cristalinas internas. Algunos eosinófilos también presentan numerosos gránulos de densidad variable y vacuolas claras, múltiples y pequeñas o grandes e individuales. Los eosinófilos grandes muestran en su abundante citoplasma numerosas vacuolas coalescentes, claras y mal definidas. Algunos gránulos grandes, redondos o pleomórficos, de densidad variable y bien definidos, aparecen en un extremo celular. Algunos de estos gránulos presentan un núcleo elecrodenso, recordando a los gránulos cristaloides encontrados en otras especies. Las mitocondrias, el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi son más frecuentes en los eosinófilos pequeños (W ORK ET AL ., 1998). Los eosinófilos de Caretta caretta presentan una forma redonda homogénea, con un núcleo redondo u oval, con un contenido variable de heterocromatina. Los gránulos citoplasmáticos aparecen bien definidos, homogéneamente electrodensos y circulares, sin estructuras cristalinas internas. Algunas células muestran vacuolas claras, en patrón múltiple o como una única vacuola de gran tamaño. Las mitocondrias, el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi se identifican con facilidad (C ASAL ET AL ., 2007). 2.2.2.4.- El Basófilo de los Quelonios Los basófilos juegan un importante papel en la defensa del organismo en aves y reptiles, especies en las que el número de basófilos circulantes es considerablemente superior al de los mamíferos (M ONTALI , 1988). R OSSKOPF (2000) ha descrito un aumento de basófilos circulantes en diferentes especies de quelonios en respuesta a infestaciones parasitarias intestinales. En los basófilos de quelonios, tras inmunización con eritrocitos de ovejas, se hallan antígenos específicos de anticuerpos citofílicos con función reagínica y, por tanto, asociados a reacciones de hipersensibilidad (M EAD ET AL ., 1983; S YPEK ET AL ., 1984). -Dimensiones celulares Aunque generalmente los basófilos de los quelonios se describen como células pequeñas (W ILKINSON , 2004), sólo Sphenodon punctatus y los cocodrilianos presentan basófilos más grandes que los observados en quelonios (S AINT G IRONS , 1970). Revisión Bibliográfica 49 El diámetro mayor de los basófilos de Testudo graeca tiene de media 11 µm, con un rango de 8 a 15 µm (S AINT G IRONS Y D UGUY , 1963; F RYE , 1991), mientras que en Testudo horsfieldi estas células presentan un diámetro aproximado de 9.5 µm (K NOTKOVA ET AL ., 2002). Los basófilos de Caretta caretta tienen un tamaño similar al heterófilo de esta especie, o ligeramente inferior (B RADLEY ET AL 1998). Sin embargo, C ASAL Y O RÓS (2007) no determinaron las dimensiones celulares del basófilo en esta especie debido a la dificultad para detectar este leucocito en el frotis sanguíneo. De igual forma, W ORK ET AL . (1998) no pudieron determinar las dimensiones celulares del basófilo de Chelonia mydas debido a su escasez en el frotis sanguíneo. W OOD Y E BANKS (1984) establecieron el tamaño del basófilo para esta especie, definiéndola como una célula pequeña, con un diámetro de 5.8 ± 0.9µm, aproximadamente el tamaño del núcleo del eritrocito. -Características tintoriales y morfología Los basófilos de los quelonios son esféricos con un núcleo no lobulado (W ILKINSON , 2004), raramente visible al ser ocultado por los abundantes gránulos citoplasmáticos (M URO ET AL ., 1994; W ILKINSON , 2004). Estos gránulos se caracterizan por su color azul oscuro y morfología esférica (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE , 1994; M URO ET AL ., 1994; W ILKINSON , 2004), aunque también pueden tener forma de varilla (M URO ET AL ., 1994). Dichos gránulos son importantes a la hora de diferenciar estas células de los heterófilos tóxicos, en los que los gránulos tienden a tornarse oscuros y redondeados (W ILKINSON , 2004). Los basófilos de Gopherus agassizii se identifican fácilmente en las preparaciones sanguíneas tratadas con Wright-Giemsa debido a la presencia de numerosos gránulos citoplasmáticos redondos y densamente basófilos. Los gránulos suelen ser tan numerosos que tienden a enmascarar el núcleo celular (A LLEMAN ET AL ., 1992). Muy similares son los basófilos de Testudo horsfieldi, ya que se muestran repletos de gránulos redondos de gran tamaño. La coloración de éstos varía de violeta a azul o negruzca. Su núcleo prácticamente no es visible, aunque suele presentar acúmulos de cromatina (K NOTKOVA ET AL ., 2002). En Caretta caretta el citoplasma se muestra abundante, de coloración azul clara y conteniendo gránulos violetas (metacromáticos). En ocasiones pueden aparecer parcialmente degranulados, con un citoplasma de apariencia apolillada. El núcleo es eosinófilo, con cromatina condensada (B RADLEY ET AL 1998). C ASAL Y O RÓS (2007) describen estas células en esta especie de tortuga marina con una superficie redondeada y un núcleo excéntrico y denso, de color azul-violeta y un patrón de cromatina agrupada. Los gránulos citoplasmáticos son grandes y basófilos, y frecuentemente enmascaran al núcleo. Los basófilos de Chelonia mydas se describen como células redondas, con un núcleo denso, violeta-azulado de posición central y un citoplasma bien definido, lleno de gránulos basófilos pequeños que tienden a ocultar el núcleo (W OOD Y E BANKS , 1984; W ORK ET AL ., 1998 ). Revisión Bibliográfica 50 -Técnicas citoquímicas En la mayoría de las especies de quelonios en las que se han realizado estudios citoquímicos, los basófilos han resultado positivos exclusivamente para el azul de toluidina (A LLEMAN ET AL ., 1992; W ORK ET AL ., 1998; C ASAL Y O RÓS , 2007). -Ultraestructura del basófilo Ni W ORK ET AL . (1998) en Chelonia mydas, ni C ASAL Y O RÓS (2007) en Caretta caretta pudieron determinar las características ultraestructurales del basófilo en esas especies debido a la escasez de estas células en la sangre de estos quelonios. 2.2.3.- Los Leucocitos Mononucleares en Quelonios 2.2.3.1.- El Linfocito de los Quelonios Determinadas variaciones patológicas pueden generar aumentos de los niveles de linfocitos circulantes, tales como la estimulación inmune y las neoplasias linforreticulares (F RYE , 1991). La linfocitosis se suele asociar con la inflamación, los procesos de cicatrización, el parasitismo y la leucemia (W ILKINSON , 2004). La linfopenia patológica tiende a aparecer ante una disminución de la capacidad de respuesta inmunitaria por parte del animal, tanto por condiciones ambientales adversas, como por el uso de glucocorticoides o fármacos inmunosupresores (M URO ET AL ., 1994). También puede diagnosticarse en condiciones de estrés (L ANCE , 1990; H AJDUK ET AL ., 1992; A GUIRRE ET AL ., 1995) y de hipotermia (S MITH ET AL ., 2000), además de en procesos de anorexia/malnutrición, durante la hibernación o en enfermedades linfoproliferativas (W ILKINSON , 2004). -Dimensiones celulares Los linfocitos se describen como células de tamaño variable (M ARTÍNEZ - S ILVESTRE , 1994; M URO ET AL ., 1994; W ILKINSON , 2004). Los linfocitos de Testudo horsfieldi muestran un diámetro de aproximadamente 5.7 µm (K NOTKOVA , ET AL ., 2002). W OOD Y E BANKS (1984) establecen un tamaño medio para los linfocitos de Chelonia mydas de 11.3 ± 2.7 µm, aunque observan células tan pequeñas como un basófilo y otras más grandes que el neutrófilo o el eosinófilo. W ORK ET AL . (1998) describen el linfocito de esta especie como una célula pequeña de 6 a 14µm. El diámetro del linfocito de Lepidochelys kempii mide entre 7.2 y 8.5 µm (C ANNON , 1992). Los linfocitos de Caretta caretta se describen también como células pequeñas (Tabla 2.17) (C ASAL Y O RÓS , 2007). Revisión Bibliográfica 51 Tabla 2.17. Media, desviación estándar y rangos de las dimensiones citoplasmáticas de los linfocitos de tortugas bobas juveniles (Caretta caretta) (C ASAL Y O RÓS , 2007) Área Perímetro Diámetro mayor Diámetro menor Linfocito 106.82±24.56 66.72-177.70 37.09±4.30 29.87-49.60 12.31±1.48 9.70-16.66 11.10±1.33 8.06-14.55 Todas las medidas están expresadas en µm, excepto el área, en µm 2 -Características tintoriales y morfología Los linfocitos de los quelonios muestran un citoplasma azulado, ligeramente granular (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE , 1994; M URO ET AL ., 1994; W ILKINSON , 2004), y pueden contener partículas fagocitadas y en ocasiones, pequeños gránulos eosinófilos. Su superficie puede presentar pequeños pseudópodos y se describen gránulos periféricos en algunas preparaciones, lo cual puede ser artefactual (W ILKINSON , 2004). Ocasionalmente pueden contener inclusiones hialinas (M ARTÍNEZ -S ILVESTRE , 1994; M URO ET AL ., 1994) y azurófilas (M URO ET AL ., 1994). Su núcleo es grande, lateral en los linfocitos de mayor tamaño y central en los linfocitos pequeños, en los que ocupa casi la totalidad del citoplasma (M URO ET AL ., 1994). Estos leucocitos se presentan con frecuencia en el frotis moldeados por las células adyacentes (W ILKINSON , 2004). Los linfocitos inmaduros poseen mayor cantidad de citoplasma y un nucleolo más grande, siendo similares a los linfocitos de mamíferos (W ILKINSON , 2004). Los linfocitos de Gopherus agassizii son morfológicamente similares a los de los mamíferos, con escasa cantidad de citoplasma. El ratio núcleo/citoplasma es elevado y comúnmente el núcleo presenta cromatina condensada. La similitud morfológica entre los linfocitos y los trombocitos de esta especie puede conducir a errores en la fórmula leucocitaria. Las características distintivas de los linfocitos con respecto a los trombocitos se basan en sus contornos citoplasmáticos redondeados y mayor tamaño, así como en la tinción más clara de su núcleo (A LLEMAN ET AL ., 1992). La morfología celular de los linfocitos de Testudo horsfieldi es similar a la de Gopherus agassizii, presentando un núcleo compacto oscuro y un fino citoplasma con bordes azulados o violetas (K NOTKOVA , ET AL ., 2002). Los estudios existentes en Chelonia mydas discrepan ligeramente en cuanto a la morfología de los linfocitos. W OOD Y E BANKS (1984) los describen como células esféricas u ovales, con un núcleo de contorno irregular que puede ocupar la mayor parte de la célula o sólo un tercio. El citoplasma aparece azul-violáceo pálido, sin gránulos, pero con vacuolas. W ORK ET AL . (1998) describen un núcleo redondo bien definido violeta-azulado, con abundante cromatina condensada. Rodeando al núcleo, hay un halo citoplasmático granular y basófilo, a menudo con burbujas. Al contrario que en Gopherus agassizii, W ORK ET AL . (1998) no tuvieron problemas para diferenciar los linfocitos de los trombocitos en muestras frescas de sangre. Los linfocitos pequeños de Lepidochelys kempii aparecen como células redondas u ovales, con un núcleo denso y redondo, ocasionalmente dentado, que ocupa casi todo el volumen celular. El citoplasma es azul pálido, pudiendo contener escasos gránulos azurófilos (C ANNON , 1992). Revisión Bibliográfica 52 C ASAL Y O RÓS (2007) describen el linfocito de Caretta caretta como una célula con núcleo redondo, bien definido, violeta-azulado y portador de cromatina agrupada. Alrededor del núcleo se extiende una fina capa de citoplasma basófilo moderadamente granular. El ratio núcleo/citoplasma estimado fue habitualmente de 0.6. -Técnicas citoquímicas Tanto en Gopherus agassizii como en Chelonia mydas los linfocitos no reaccionan positivamente a ninguna de las técnicas citoquímicas estudiadas (A LLEMAN ET AL ., 1992; W ORK ET AL ., 1998). Los linfocitos pequeños de Lepidochelys kempii muestran actividad esterasa no específica muy leve en algunos gránulos, pero no así para el resto de las enzimas hidrolíticas u oxidativas ni para los lípidos. Algunos gránulos o partículas intracelulares aparecen PAS-positivos, por lo que el glucógeno constituye probablemente la fuente de energía del linfocito en esta especie (C ANNON , 1992). En el linfocito de Caretta caretta sólo se detecta respuesta positiva moderada a la α-naphtil butirato esterasa sin inhibición de fluoruro sódico (C ASAL Y O RÓS , 2007). El que los linfocitos de la mayoría de las especies de quelonios estudiadas muestren escasez de hidrolasas en su paquete enzimático puede estar asociado a la ausencia de actividad fagocítica de los linfocitos pequeños ya que la función principal de estas células es la de mediar en la respuesta celular y humoral (W ILLIAMS ET AL ., 1972). -Ultraestructura del linfocito Ultraestructuralmente, el linfocito de Chelonia mydas se describe como una célula con un núcleo redondo, frecuentemente dentado, con grandes agrupaciones de heterocromatina. El escaso citoplasma muestra pocas mitocondrias, retículo endoplasmático y pequeños gránulos electrodensos (W ORK ET AL ., 1998). Los linfocitos de Caretta caretta son muy similares ultraestructuralmente a los de Chelonia mydas. Muestran una forma irregularmente circular, con un núcleo redondeado, frecuentemente dentado y con cantidades abundantes de heterocromatina. El escaso citoplasma contiene algunas mitocondrias, polirribosomas, retículo endoplasmático y pequeños gránulos electrodensos (C ASAL ET AL ., 2007). 2.2.3.2.- El Monocito de los Quelonios La función principal de los monocitos de los quelonios es la fagocitosis, como se desprende del estudio in vitro en el galápago de cuello ladeado de Hilarie (Phrynopys hilarii) constatándose además la tendencia de estos leucocitos a fusionarse para formar células gigantes multinucleadas, que probablemente tienen un importante papel en los procesos de “limpieza” de la sangre (P ITOL ET AL ., 2008). Una vez abandonan la sangre y pasan a los tejidos, los monocitos se diferencian a macrófagos, que contribuyen al desarrollo de la respuesta inflamatoria (C HRISTOPHER ET AL ., 1999). Revisión Bibliográfica 53 La monocitosis aparece en los procesos infecciosos crónicos (necrosis tisulares, procesos supurativos crónicos), y en las infecciones víricas (poxvirus), clamidiasis (M URO ET AL ., 1994) y granulomas (A GUIRRE ET AL ., 1995). En general, la monocitosis puede presentarse en respuesta a la infección aguda o crónica y a la inflamación, aunque la frecuencia con que la monocitosis es diagnosticada depende mucho de los rangos de referencia empleados (W ILKINSON , 2004). -Dimensiones celulares Los monocitos se consideran células de tamaño superior al linfocito (M URO ET AL ., 1994). Su diámetro suele representar 1-1.5 veces el diámetro mayor del eritrocito (W ILKINSON , 2004). Los monocitos de Testudo horsfieldi presentan un diámetro aproximado de 15.5 µm (K NOTKOVA , ET AL ., 2002). Los monocitos de Chelonia mydas muestran un tamaño superior al de los linfocitos, con un diámetro de entre 11 y 26 µm (W ORK ET AL ., 1998). B RADLEY ET AL . (1998) describen el tamaño del monocito de Caretta caretta similar al del heterófilo, mientras que C ASAL Y O RÓS (2007) observan que el diámetro de los monocitos de esta especie esun 33% superior al de los linfocitos (Tabla 2.18). Tabla 2.18. Media, desviación estándar y rangos de las dimensiones citoplasmáticas de los monocitos de tortugas bobas juveniles (Caretta caretta) (C ASAL Y O RÓS , 2007) Área Perímetro Diámetro mayor Diámetro menor Monocito 187.81±40.55 108.96-301.91 49.69±5.53 38.44-64.73 16.41±1.91 12.97-20.60 14.77±1.65 10.34-19.34 Todas las medidas están expresadas en µm, excepto el área, en µm 2 -Características tintoriales y morfología Los monocitos de los quelonios suelen presentar un contorno celular uniforme. Su citoplasma es azul pálido, a menudo vacuolizado con apariencia espumosa y ligeramente granular. Su núcleo es variable, frecuentemente oval o dentado con forma arriñonada, pudiendo presentar un solo nucléolo grande (W ILKINSON , 2004) y conteniendo cromatina fina (M URO ET AL ., 1994). Los monocitos de Testudo horsfielii presentan un gran núcleo que contiene fina y pálida cromatina. Estas células poseen un contorno cuadrangular y su abundante citoplasma es azul-grisáceo y puede presentar vacuolas (K NOTKOVA , ET AL ., 2002). En la sangre de Gopherus agassizii se identifican dos tipos de monocitos circulantes. Los monocitos tipo I, más abundantes, son células de apariencia similar a los monocitos de mamíferos. Contienen un núcleo simple de contorno irregular y una moderada cantidad de citoplasma basófilo que a menudo contiene una o más vacuolas claras. Los monocitos tipo II tienen una apariencia similar aunque muestran un número bajo o moderado de gránulos citoplasmáticos pequeños y azurófilos, con un núcleo que va de lobulado a pleomórfico (A LLEMAN ET AL ., 1992). Este último tipo celular se identifica también en otros reptiles (W ILL , 1978) y es morfológicamente diferente a los azurófilos Revisión Bibliográfica 54 identificados en serpientes y aligátores, y probablemente se corresponde con los monocitos azurófilos (M ATEO ET AL ., 1984; M ONTALI , 1988). Los monocitos de Chelonia mydas se describen como células redondas o ameboides. El núcleo es esférico, ovalado o dentado, de color violeta-azulado y con un fino patrón de cromatina. El citoplasma es moderadamente basófilo, con bordes bien definidos o irregulares y vacuolas de tamaño variable. No presentan gránulos azurófilos (W ORK ET AL ., 1998). Los estudios que describen los monocitos de los ejemplares juveniles de Caretta caretta coinciden en la mayoría de sus características, salvo en la coloración del núcleo. B RADLEY ET AL . (1998) describen un núcleo eosinófilo mientras que CASAL Y ORÓS (2007) lo describen violeta-azulado. Generalmente la morfología nuclear aparece oval, arriñonada o fusiforme, con un patrón de cromatina menos agrupado que el linfocito. Son células redondas o ameboides con citoplasma moderadamente basófilo, que a veces desarrolla pseudopodia, y vacuolas ocasionales de talla variable. No presentan gránulos azurófilos (B RADLEY ET AL ., 1998; CASAL Y ORÓS , 2007). El ratio núcleo/citoplasma estimado es generalmente de 0.5, menor al de los linfocitos de esta especie ( CASAL Y ORÓS , 2007). -Técnicas citoquímicas El monocito tipo I de Gopherus agassizii se tiñe con la técnica citoquímica de la αnaftil butirato esterasa (A LLEMAN ET AL ., 1992), al igual que los monocitos de mamíferos (J AIN , 1986 A ) y de otros reptiles (M ATEO ET AL ., 1984; M ONTALI , 1988). También muestra positividad a la fostatasa ácida y en ocasiones, a la cloroacetato esterasa (A LLEMAN ET AL ., 1992). Los monocitos de Chelonia mydas reaccionan positivamente con las técnicas de la fosfatasa ácida y el PAS, y débilmente con la cloroacetato esterasa y la α-naftil butirato esterasa (W ORK ET AL ., 1998). Sin embargo, los monocitos de la tortuga boba (Caretta caretta) sólo muestran positividad moderada para la α-naftil butirato esterasa sin inhibición de fluoruro sódico ( CASAL Y ORÓS , 2007). En los fagocitos mononucleares circulantes de Phrynopys hilarii se detecta positividad a enzimas lisosomiales como las fosfatasas ácidas o la trimetafosfatasa. Así, la β-glicerofastatasa ácida se detecta en los lisosomas y en el interior de los fagolisosomas. La reacción a la citidina 5-monofosfatasa ácida se produce alrededor de los lisosomas y la trimetafosfatasa se detecta también en el interior de los fagolisosomas (P ITOL ET AL ., 2008). -Ultraestructura del monocito Los monocitos de Chelonia mydas presentan un núcleo con escasa heterocromatina en el que ocasionalmente puede detectarse el nucléolo. El abundante citoplasma contiene un gran complejo de Golgi, mitocondrias, retículo endoplasmático y algunos pequeños gránulos electrodensos (W ORK ET AL ., 1998). La descripción ultraestructural del monocito de Caretta caretta es muy similar a lo anteriormente observado para esta célula en Chelonia mydas (C ASAL ET AL ., 2007). Los fagocitos mononucleares de Phrynopys hilarii muestran en su citoplasma, tras un proceso de incubación, mitocondrias, lisosomas y fagolisosomas conteniendo partículas Revisión Bibliográfica 61 2.3.2.- Los Leucocitos Granulocíticos en Emídidos 2.3.2.1.- El Neutrófilo de los Emídidos Ninguno de los autores o artículos referenciados en esta revisión bibliográfica ha descrito neutrófilos en especies de quelonios emídidos. 2.3.2.2.- El Heterófilo de los Emídidos -Dimensiones celulares Los heterófilos de los juveniles de Pseudemys rubriventris presentan un tamaño aproximado de 13 µm de diámetro (I NNIS ET AL ., 2007). El tamaño de los heterófilos de Hieremys annandalii es muy similar (13.66 ± 1.73 µm de diámetro), siendo el segundo leucocito en tamaño después del azurófilo (C HANSUE ET AL ., 2011). Los heterófilos de Ocadia sinensis representan los leucocitos de mayor tamaño descritos para esta especie, mostrando un diámetro en el microscopio óptico de 16.8 ± 2.6 µm, aunque mediante la microscopía electrónica se describien con un tamaño de 5.1-6.6 µm (C HUNG ET AL ., 2009). Los tamaños celulares de los heterófilos de Trachemys callirostris se describen en la Tabla 2.24. En esta especie este tipo celular se corresponde con el leucocito de mayor tamaño (C ARRASCAL -V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014). 2.24. Áreas citoplasmáticas y nucleares de los heterófilos de hicoteas (Trachemys callirostris) (C ARRASCAL - V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014) Área total Área núcleo Área citoplasma Heterófilo 224.0±1.2 52.3±1.3 171.3±2.0 Las medidas están expresadas en µm 2 En Emys trinacris no se observaron diferencias significativas entre el tamaño de los heterofilos de las tortugas macho (13.9 ± 6.71 µm) y las hembras (13.3 ± 1.27 µm), y también esta célula representó el leucocito de mayor tamaño para esta especie (A RIZZA ET AL ., 2014). -Características tintoriales y morfología Bajo el microscopio óptico los heterófilos de Pseudemys rubriventris muestran un núcleo excéntrico, de circular a ligeramente irregular, con un ratio núcleo/citoplasma relativamente bajo. El citoplasma aparece lleno de numerosos gránulos fusiformes con coloración rosada o naranja (I NNIS ET AL ., 2007). La morfología irregular de los heterófilos de Ocadia sinensis es muy similar a la mostrada por los eosinófilos de esta especie. El abundante citoplasma contiene numerosos gránulos eosinofílicos alargados (C HUNG ET AL ., 2009). En el galápago de Orbigny (Chrysemys dorbignih) los heterófilos fueron Revisión Bibliográfica 62 nombrados inicialmente como “eosinófilos tipo II” debido a la eosinofilia exhibida por sus gránulos citoplasmáticos en respuesta a tinciones tipo Romanowsky. Estos gránulos muestran una morfología alargada y fueron difíciles de distinguir. Estas células son polimórficas con un núcleo excéntrico (A ZEVEDO Y L UNARDI , 2003). Los heterófilos de Hieremys annandalii muestran una morfología irregular, conteniendo numerosos gránulos fusiformes, muy apretados entre sí, y un núcleo excéntrico. Mediante la tinción Wright-Giemsa los gránulos presentan una coloración roja oscura y una superfice dentada, mientras que con la tinción de Wright aparecen de un brillante color rojo-anaranjado. Sin embargo, cuando se tiñen con Diff-Quik, los gránulos no muestran coloración alguna (C HANSUE ET AL ., 2011). La morfología externa de los heterófilos de Trachemys callirostris es más homogénea, generalmente redondeada. El núcleo ocupa una posición excéntrica y aparece redondo o en ocasiones aplanado, con cromatina basófila de color morado opaco. Los gránulos citoplasmáticos son fusiformes y alargados con coloración acidófila (C ARRASCAL -V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014). El núcleo de los heterófilos de Emys trinacris, al contrario que en el resto de los emídidos estudiados, aparece segmentado, con posición lateral, basófilo y con cromatina densa. El citoplasma, cuando no queda completamente enmascarado por los grandes gránulos eosinófilos de morfología fusiforme que contiene, muestra una coloración débilmente azulada o clara (A RIZZA ET AL ., 2014). -Técnicas citoquímicas Los heterófilos de Chrysemys dorbignih muestran actividad para la trimetafosfatasa en la mayoría de los gránulos citoplasmáticos, y también presentan actividad fosfatasa alcalina en la membrana de los gránulos alargados. En la membrana citoplasmática y algunos gránulos pequeños se deteca actividad esterasa no específica. También hay detección de proteínas básicas en gránulos citoplasmáticos y en el núcleo, y actividad peroxidasa en algunos gránulos citoplasmáticos cuando la reacción se incuba en pH neutro. Sin embargo, si la incubación se realiza en pH alcalino, la actividad peroxidasa se ve claramente disminuída (A ZEVEDO Y L UNARDI , 2003). En Ocadia sinensis sólo se detecta positividad frente a la peroxidasa, mostrándose como una tinción débil en los gránulos citoplasmáticos, que son PAS negativos (C HUNG ET AL ., 2009). Los gránulos de los heterófilos de Hieremys annandalii también muestran positividad muy débil a la peroxidasa, mientras que el citoplasma es positivo para el Sudán negro B, la fosfatasa ácida y alcalina, la α-naftil acetato esterasa y PAS (C HANSUE ET AL ., 2011). -Ultraestructura del heterófilo Los heterófilos de Chrysemys dorbignih muestran un núcleo indentado con heterocromatina cerca de la envuelta nuclear. El citoplasma contiene mitocondrias pequeñas, escaso retículo endoplasmático y aparato de Golgi poco notable. Se describe también un fino granulado electrodenso compatible con depósitos de glucógeno. Los gránulos aparecen como una población heterogénea, con forma redonda-alargada o Revisión Bibliográfica 63 acampanada y también se describen gránulos pequeños rodeados por una membrana que contiene material homogéneamente electrodenso (A ZEVEDO Y L UNARDI , 2003). La microscopía electrónica de barrido revela un contorno celular irregular, rugoso y con proyecciones en forma de cresta en los heterófilos de Ocadia sinensis (C HUNG ET AL ., 2009). Mediante la microscopía electrónica de barrido los gránulos de los heterófilos de Hieremys annandalii se aprecian ovoides y protruyen contra la membrana celular. Con la microscopía electrónica de transmisión los gránulos aparecen grandes y pleomórficos, en su mayoría fusiformes, con áreas de electrodensidad variable. Los gránulos heterofílicos presentan un núcleo central de matriz heterogénea electrodensa. Los ribosomas son escasos y el citoplasma no está vacuolizado. El núcleo es pleomórfico y rico en eucromatina (C HANSUE ET AL ., 2011). 2.3.2.3.- El Eosinófilo de los Emídidos -Dimensiones celulares En Pseudemys rubriventris sólo se observa un tipo celular de eosinófilo, y su tamaño oscila entre 14-18 µm, siendo el leucocito de mayor tamaño en este emídido (I NNIS ET AL ., 2007). Por el contrario, los eosinófilos de Hieremys annandalii representan el granulocito más pequeño de esta especie, con un diámetro de 10.61 ± 1.22 µm (C HANSUE ET AL ., 2011). Los eosinófilos de Ocadia sinensis son el segundo leucocito en tamaño, después del heterófilo, con un diámetro en microscopía óptica de 15.1 ± 2.4 µm y de 4.34.9 µm en microscopía electrónica (C HUNG ET AL ., 2009). Los tamaños celulares de los eosinófilos de Trachemys callirostris se describen en la Tabla 2.25. En esta especie, este leucocito sólo es superado en tamaño por el heterófilo (C ARRASCAL -V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014). Tabla 2.25. Áreas citoplasmáticas y nucleares de los eosinófilos de hicoteas (Trachemys callirostris) (C ARRASCAL -V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014) Área total Área núcleo Área citoplasma Eosinófilo 198.0±5.0 43.0±2.3 154.5±5.6 Las medidas están expresadas en µm 2 El tamaño de los eosinófilos de Emys trinacris es de 13.5 ± 5.67 µm en machos y de 12.6 ± 1.3 µm en hembras, siguiendo en dimensiones al heterófilo (A RIZZA ET AL ., 2014). -Características tintoriales y morfología Los eosinófilos de Pseudemys rubriventris se caracterizan por poseer un núcleo bilobulado o irregular de posición excéntrica y basófilo. El ratio núcleo/citoplasma es Revisión Bibliográfica 64 relativamente bajo. Los abundantes gránulos citoplasmáticos se muestran circulares y de color rosado o anaranjado (I NNIS ET AL ., 2007). En Ocadia sinensis el núcleo se observa simple, redondo o con forma irregular y localización central. Con las tinciones de Wright y Giemsa estas células muestran numerosos gránulos redondos eosinófilos (C HUNG ET AL ., 2009). Los eosinófilos de Chrysemys dorbignih se muestran como células redondeadas de núcleo excéntrico, con un citoplasma lleno de gránulos redondos y de gran tamaño, que se tiñen eosinófilos en respuesta a tinciones tipo Romanowsky (A ZEVEDO Y L UNARDI , 2003). Los granulocitos eosinófilos de Hieremys annandalii son típicamente redondos, con un núcleo excéntrico y un citoplasma lleno de gránulos esféricos. Empleando las tinciones de Wright-Giemsa y Wright estos gránulos se tiñen de color púrpura, mientras que con el Diff-Quick aparecen rojo-anaranjados (C HANSUE ET AL ., 2011). Los eosinófilos de Trachemys callirostris son células redondeadas, con núcleo redondo de posición central o periférica y coloración morada. Los gránulos citoplasmáticos se muestran circulares y rosados (C ARRASCAL -V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014). Los eosinófilos de Emys trinacris son fácilmente reconocibles por sus gránulos citoplasmáticos redondos y eosinofílicos. El núcleo presenta gruesa cromatina agrupada, y se tiñe intensamente azul. Su morfología es de redonda a oval, simple o bilobulado, con localización lateral, cerca de la membrana celular (A RIZZA ET AL ., 2014). -Técnicas citoquímicas Los gránulos de los eosinófilos de Chrysemys dorbignii, al contrario de lo que sucede en el heterófilo, no presentan actividad trimetafosfatasa ni fosfatasa alcalina. Se observa actividad esterasa no específica en la membrana celular. Las proteínas básicas se detectan tanto en los gránulos como en el núcleo celular, al igual que lo observado en heterófilos. La actividad peroxidasa de los eosinófilos aparece muy susceptible al peróxido de hidrógeno, llevando a la destrucción parcial de los gránulos. Sin embargo, los gránulos intactos muestran actividad peroxidasa tanto en pH neutro como alcalino (A ZEVEDO Y L UNARDI , 2003). En Ocadia sinensis se describe una respuesta citoquímica similar a los heterófilos, mostrando positividad a la peroxidasa, pero no al PAS (C HUNG ET AL ., 2009). Los eosinófilos de Hieremys annandalii reaccionan positivamente a todas las ténicas citoquímicas estudiadas salvo al azul de toluidina, es decir, muestran positividad para la peroxidasa, el Sudán negro B, las fosfatasas ácida y alcalina, la α-naftil acetato esterasa, el PAS y el nuevo azul de metileno (C HANSUE ET AL ., 2011). -Ultraestructura del eosinófilo Los eosinófilos de Chrysemys dorbignih muestran un núcleo dentado con heterocromatina cerca de la envoltura nuclear. El citoplasma presenta algunas mitocondrias, grandes cantidades de retículo endoplasmático rugoso y un bien desarrollado complejo de Golgi. Los gránulos citoplasmáticos aparecen grandes y esféricos rodeados Revisión Bibliográfica 65 por una membrana que contiene material homogéneamente electrodenso. También se observan algunos gránulos más pequeños (A ZEVEDO Y L UNARDI , 2003). Mediante la microscopía electrónica de barrido los eosinófilos de Ocadia sinensis muestran una superficie irregular, con proyecciones en forma de cresta, pero una morfología general redonda u ovalada (C HUNG ET AL ., 2009). Mediante microscopía electrónica de barrido los eosinófilos de Hieremys annandalii se muestran con forma de mórula debido a la protrusión de los gránulos contra el citoplasma. La microscopía electrónica de transmisión revela una superficie celular cubierta por microvellosidades. Los abundantes gránulos aparecen grandes, redondos y con electrodensidad homogénea. La densidad de estos gránulos es superior a la de los heterófilos. En el citoplasma se observan escasos ribosomas pequeños y mitocondrias, pero no vacuolas. El núcleo presenta principalmente heterocromatina (C HANSUE ET AL ., 2011). 2.3.2.4.- El Basófilo de los Emídidos -Dimensiones celulares Los basófilos de Pseudemys rubriventris muestran un tamaño de 12-15 µm de diámetro, similar al descrito para los heterófilos, pero inferior al de los eosinófilos (I NNIS ET AL ., 2007). En el caso de Hieremys annandalii el basófilo es el segundo granulocito en tamaño después del heterófilo, con un diámetro de 12.87 ± 6.2 µm (C HANSUE ET AL ., 2011). Los basófilos de Ocadia sinensis representan el tercer granulocito en cuanto a dimensiones, con un diámetro en microscopía óptica de 13.4 ± 2.1 µm y de 3.1-4.7 µm en microscopía electrónica de barrido (C HUNG ET AL ., 2009). En Trachemys callirostris el basófilo también representa el tercer granulocito en tamaño, con un área total de 86 ± 3.6 µm², sólo superando en dimensiones al linfocito y al trombocito (C ARRASCAL -V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014). El basófilo de Emys trinacris se describe como una célula pequeña, de unos 9.49 µm de diámetro, sin diferencias de tamaño significativas entre machos y hembras. Muestra un gran núcleo en proporción a su tamaño celular, midiendo 7.09 ± 0.25 µm (A RIZZA ET AL ., 2014). -Características tintoriales y morfología Los basófilos de Pseudemys rubriventris se caracterizan por un núcleo central o ligeramente excéntrico, de coloración azul pálida, que frecuentemente aparece disimulado por la presencia de numerosos gránulos citoplasmáticos fuertemente basófilos. Mediante el uso de Diff-Quik® el citoplasma suele aparecer vacuolizado o apolillado debido a la degranulación de sus gránulos hidrosolubles bajo condiciones de fijación inadecuadas. Los gránulos se preservan y distinguen mejor en preparaciones bien fijadas y teñidas con Wright-Leishman (I NNIS ET AL ., 2007). Los basófilos de Ocadia sinensis se identifican fácilmente en los frotis teñidos con Wright y Giemsa por la presencia de numerosos gránulos citoplasmáticos redondos y basófilos. El núcleo ocupa una posición central (C HUNG ET AL ., 2009). Los basófilos de Hieremys annandalii muestran una morfología variable, al igual que el número y tamaño de sus gránulos citoplasmáticos. Usando la tinción Wright-Giemsa Revisión Bibliográfica 66 el núcleo aparece rojo-violeta, pero los gránulos no se tiñen, aunque frecuentemente ocultan el núcleo. Con la tinción de Wright los gránulos se observan de color azul oscuro o negro-violeta, pero el núcleo no adquiere coloración. Ni los gránulos ni el núcleo se tiñen en respuesta al Diff-Quick (C HANSUE ET AL ., 2011). De forma muy similar a lo descrito en el resto de los emídidos estudiados, los basófilos de Emys trinacris muestran un núcleo redondo de localización central. Los abundantes gránulos citoplasmáticos aparecen con una coloración violeta muy oscura (A RIZZA ET AL ., 2014). -Técnicas citoquímicas Los basófilos de Ocadia sinensis reaccionan fuertemente frente a la peroxidasa, pero no muestran positividad en respuesta al PAS (C HUNG ET AL ., 2009). En los basófilos de Hieremys annandalii se detecta positividad citoplasmática para la peroxidasa y el PAS, y tinción positiva de los gránulos para el nuevo azul de metileno. El azul de toluidina, sin embargo, no genera respuesta tintorial en esta especie (C HANSUE ET AL ., 2011). -Ultraestructura del basófilo El uso de la microscopía electrónica de barrido en los basófilos de Ocadia sinensis pone de manifiesto una superficie celular suave, con protuberancias ligeramente redondeadas (C HUNG ET AL ., 2009). Con la misma técnica, los basófilos de Hieremys annandalii muestran características especiales que los diferencian de las otras células. Su superficie muestra numerosas microvellosidades, y los gránulos de diferentes tamaños generan protrusiones en la membrana citoplasmática. La microscopía electrónica de transmisión permite observar que los basófilos tienen vacuolas de gran tamaño conteniendo en algunos casos gránulos densos en su interior. El abundante citoplasma presenta gránulos finamente lamelares y electrodensos y numerosas mitocondrias. El núcleo presenta principalmente heterocromatina (C HANSUE ET AL ., 2011). Revisión Bibliográfica 67 2.3.3.- Los Leucocitos Mononucleares en Emídidos 2.3.3.1.- El Linfocito de los Emídidos Aunque la función principal de los linfocitos B es la de producir varios tipos de inmunoglobulinas y la de los linfocitos T consiste en participar en la moderación de la respuesta inmune (C AMPBELL , 1996; R ASKIN , 2000; C AMPBELL , 2004 A ), algunos estudios recientes en Trachemys scripta han puesto de manifiesto que las células B tienen la capacidad de ingerir partículas extrañas in vitro. Esto sugiere que los linfocitos B de reptiles pueden actuar de forma complementaria como células fagocíticas (Z IMMERMAN ET AL ., 2010). -Dimensiones celulares Los linfocitos de Pseudemys rubriventris representan el leucocito de menor tamaño en esta especie con un diámetro aproximado de 8-10 µm (I NNIS ET AL ., 2007). Algo similar sucede en Hieremys annandalii, especie en la que el linfocito aparece como la célula sanguínea de menor tamaño, con 6.41 ± 0.61 µm (C HANSUE ET AL ., 2011). También el linfocito de Ocadia sinensis es el leucocito más pequeño de esta especie, aunque su tamaño en microscopía óptica (11.2 ± 2.3 µm de diámetro) es bastante superior al observado en Hieremys annandalii. Mediante microscopía electrónica de barrido el diámetro del linfocito mide 3.2-3.6 µm (C HUNG ET AL ., 2009). Los tamaños celulares de los linfocitos de Trachemys callirostris se describen en la Tabla 2.26. En esta especie este leucocito aparece como la célula sanguínea de menor tamaño (C ARRASCAL -V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014). Tabla 2.26. Áreas citoplasmáticas y nucleares de los linfocitos de hicoteas (Trachemys callirostris) (C ARRASCAL -V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014) Área total Área núcleo Área citoplasma Linfocito 75.0±2.0 52.0±2.0 23.71±2.0 Las medidas están expresadas en µm 2 Los linfocitos de Emys trinacris son la célula sanguínea más pequeña de este emídido. El diámetro celular en los machos es de 6.7 ± 2.12 µm y en las hembras es 6.5 ± 1.26 µm (A RIZZA ET AL ., 2014). -Características tintoriales y morfología Los linfocitos de Pseudemys rubriventris se caracterizan por un ratio núcleo/citoplasma relativamente elevado, siendo el núcleo central, circular y basófilo, y el citoplasma escaso y de coloración débilmente azulada (I NNIS ET AL ., 2007). En Ocadia sinensis también se observa un ratio núcleo/citoplasma elevado. El escaso citoplasma aparece basófilo y el núcleo presenta frecuentemente cromatina agrupada. Los linfocitos se diferencian de los trombocitos en esta especie por sus bordes citoplasmáticos rugosos y por su núcleo más grande y de tinción más clara (C HUNG ET AL ., 2009). Revisión Bibliográfica 68 Los linfocitos de Hieremys annandalii aparecen como células redondeadas con un ratio núcleo/citoplasma alto. El núcleo se presenta excéntrico y portador de cromatina condensada. Las características tintoriales son similares independientemente de la técnica de tinción empleada. El citoplasma se observa basófilo, con un área más clara alrededor del núcleo. La mayoría de los linfocitos son agranulares, pero algunas células poseen unos pocos gránulos pequeños de coloración roja (C HANSUE ET AL ., 2011). Los linfocitos de Trachemys callirostris también presentan una morfología generalmente redondeada. El núcleo es grande, ocupando aproximadamente un 70% del tamaño celular, y contiene cromatina condensada y una coloración morada. El escaso citoplasma aparece basófilo-grisáceo (C ARRASCAL -V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014). En Emys trinacris A RIZZA ET AL . (2014) no tuvieron problemas para distinguir los linfocitos de los trombocitos, ya que morfológicamente ambos tipos celulares resultaron muy diferentes. Los linfocitos son células redondas con un ratio núcleo/citoplasma elevado. El escaso citoplasma se tiñe de color azul y el núcleo es redondo con un fino patrón reticular. -Técnicas citoquímicas Los linfocitos de Ocadia sinensis no se tiñeron con ninguna de las dos técnicas citoquímicas empleadas para la caracterización celular en esta especie (C HUNG ET AL ., 2009). Por el contrario, en Hieremys annandalii los linfocitos muestran positividad para la fosfatasa ácida, la α-naftil acetato esterasa y el PAS, pero sólo a nivel de los gránulos citoplasmáticos (C HANSUE ET AL ., 2011). -Ultraestructura del linfocito La microscopía electrónica debarrido muestra al linfocito de Ocadia sinensis como una célula de morfología redonda o irregular, con una superficie también irregular, caracterizada por proyecciones en forma de cresta (C HUNG ET AL ., 2009). De igual manera, con el uso de la microscopía electrónica de superficie, el linfocito de Hieremys annandalii aparece con una forma redonda y una superficie irregular, con proyecciones citoplasmáticas y microvellosidades. La microscopía electrónica de transmisión muestra un citoplasma rico en pseudópodos, grandes mitocondrias, retículo endoplasmático rugoso y ribosomas libres. El núcleo aparece redondo o dentado, conteniendo heterocromatina (C HANSUE ET AL ., 2011). 2.3.3.2.- El Monocito de los Emídidos -Dimensiones celulares El tamaño de los monocitos de Pseudemys rubriventris es muy similar al de los heterófilos, con 13 µm de diámetro (I NNIS ET AL ., 2007). El monocito de Ocadia sinensis tiene un tamaño en microscopía óptica de 12.5 ± 1.6 µm, inferior al de los granulocitos Revisión Bibliográfica 69 pero superior al de los linfocitos, mientras que con la microscopía electrónica de barrido se observa un tamaño de 4.7-5.4 µm (C HUNG ET AL ., 2009). Los tamaños celulares de los monocitos de Trachemys callirostris se describen en la Tabla 2.27. En esta especie el monocito muestra un menor tamaño que el heterófilo y el eosinófilo, pero es mayor que el linfocito y el basófilo (C ARRASCAL -V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014). Tabla 2.27. Áreas citoplasmáticas y nucleares de los monocitos de hicoteas (Trachemys callirostris) (C ARRASCAL -V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014) Área total Área núcleo Área citoplasma Monocito 170.0±2.2 103.0±3.0 67.10±3.5 Las medidas están expresadas en µm 2 En Emys trinacris y Trachemys callirostris el monocito es superado en tamaño por el heterófilo y el eosinófilo. No se aprecian diferencias significativas entre las medidas celulares de machos y hembras. Así, en los machos el diámetro celular es de 11.3 ± 4.81 µm y en las hembras, 11.7 ± 1.75 µm (A RIZZA ET AL ., 2014). -Características tintoriales y morfología C HANSUE ET AL . (2011) no describen monocitos en la sangre de Hieremys annandalii. En su lugar identificaron azurófilos, algo que no se ha observado en ninguno de los otros emídidos en estudio. Los monocitos de Pseudemys rubriventris presentan una forma de circular a irregular, con un núcleo grande, basófilo, bilobulado o irregular. El citoplasma aparece débilmente basófilo y en ocasiones contiene vacuolas claras (I NNIS ET AL ., 2007). El citoplasma de los monocitos de Ocadia sinensis se tiñe basófilo y su núcleo muestra morfología en forma de “U”. La presencia de una o más vacuolas citoplasmáticas es un hallazgo habitual pero no se detectan gránulos azurófilos (C HUNG ET AL ., 2009). Los monocitos de Trachemys callirostris son células redondas, sin granulación citoplasmática. El citoplasma es débilmente basófilo, con una tonalidad azul-grisácea. El núcleo es grande, con forma de media luna o redondeado y ocupa gran parte de la célula. Su coloración es basófila de mayor intensidad que la del citoplasma (C ARRASCAL - V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014). Los monocitos de Emys trinacris presentan una gran cantidad de citoplasma de color débilmente gris-azulado, finamente granular o vacuolizado. El núcleo es ovalado o arriñonado, con un patrón de cromatina denso cerca de la membrana nuclear (A RIZZA ET AL ., 2014). Revisión Bibliográfica 70 -Técnicas citoquímicas Los monocitos de Ocadia sinensis sólo muestran ser débilmente positivos para el PAS y no en todos los casos, y no son positivos a la técnica de la peroxidasa (C HUNG ET AL ., 2009). -Ultraestructura del monocito La microscopía electrónica de barrido muestra al monocito de Ocadia sinensis como una célula de bordes muy rugosos y proyecciones irregulares en forma de cresta, además de estructuras del citoesqueleto en la superficie (C HUNG ET AL ., 2009). 2.3.3.3.- El Azurófilo de los Emídidos Hieremys annandalii es la única especie de emídido en la que existe un estudio completo de la morfología de sus células sanguíneas, y en la que se describen azurófilos en lugar de monocitos (C HANSUE ET AL ., 2011). -Dimensiones, morfología celular, técnicas citoquímicas y ultraestructura Los azurófilos de Hieremys annandalii son los leucocitos menos frecuentemente observados y los de mayor tamaño en esta especie. Su forma y tamaño son variables, presentando un diámetro medio de 14.32 ± 2.19 µm. El citoplasma aparece azurófilo (grispúrpura) con la tinción de Wright-Giemsa, pero se tiñe azul oscuro con las técnicas de Wright y Diff-Quik. El núcleo se observa pleomórfico y el citoplasma espumoso. Los gránulos citoplasmáticos característicos del azurófilo no se pueden delimitar claramente mediante la microscopía óptica. Esta célula sólo reacciona positivamente para la técnica citoquímica de la fosfatasa ácida y dicha reacción se localiza exclusivamente en los gránulos citoplasmáticos. Mediante la microscopía electrónica de barrido el azurófilo presenta numerosas burbujas en la membrana que dificultan la visualización de la superficie celular. La microscopía electrónica de transmisión evidencia la presencia de numerosos gránulos azurofílicos de 0.3-0.4 µm de diámetro. El citoplasma presenta escasa cantidad de retículo endoplasmático rugoso, mitocondrias y lisosomas. Algunas células son portadoras de grandes vacuolas y emiten pseudópodos de diferentes tamaños. El núcleo es grande con heterocromatina periférica (C HANSUE ET AL ., 2011). 2.3.4.- El Trombocito de los Emídidos -Dimensiones celulares Los trombocitos de Pseudemys rubriventris presentan un diámetro mayor de 16 µm y un diámetro menor de 6 µm (I NNIS ET AL ., 2007). Los trombocitos de Ocadia sinensis tienen un diámetro de 9.2 ± 1.3 µm en microscopía óptica y de 3.1-5.6 µm con microscopía electrónica de barrido (C HUNG ET AL ., 2009). Revisión Bibliográfica 77 2.4.3.- Índices Eritrocitarios de los Reptiles Los índices eritrocitarios describen el tamaño medio y el contenido en hemoglobina de los eritrocitos. Pueden ser calculados por medio de contadores celulares automáticos o utilizando ecuaciones estándar. Las fórmulas empleadas en mamíferos para calcular el volumen corpuscular medio (VCM), la hemoglobina corpuscular media (HCM) y la concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) pueden ser utilizadas de igual forma en los reptiles (C AMPBELL , 1995). VCM: Hematocrito x 10/Recuento glóbulos rojos (10 6 ) HCM: Hemoglobina x 10/Recuento glóbulos rojos (10 6 ) CHCM: Hemoglobina x 100/Hematocrito  El VCM indica el tamaño medio de los eritrocitos. Un valor aumentado, normal o disminuido indica que el eritrocito medio es macrocítico, normocítico o microcítico, respectivamente.  La HCM indica el contenido medio de hemoglobina por eritrocito. Desde el punto de vista clínico es frecuentemente ignorada.  La CHCM indica la concentración de hemoglobina en un eritrocito medio. Una CHCM normal o disminuida indica que, morfológicamente, el eritrocito es normocrómico o hipocrómico respectivamente. Un aumento de la CHCM indica un error laboratorial o de muestreo, como puede ocurrir en muestras hemolisadas (W ILLARD Y T VEDTEN , 2004). Tabla 2.31. Índices eritrocitarios en algunas especies de reptiles Especie VCM (femtolitros) CHCM (g/dL) HCM (picogramos) Corucia zebrata 1 152-600 17-56 42-111 Crocodylus porosus 2 240-311 26.1-31.9 72-92 Iguana iguana 3,4 266 (machos) 279 (hembras) 25.1 (machos) 27.9 (hembras) Varanus salvator 5 284.5 33.0 94.0 1: W RIGHT Y S KEBA , 1992 2: M ILLAN ET AL ., 1997 3: H ARR ET AL ., 2001 4: H EARD ET AL ., 2004 5: S ALAKIJ ET AL ., 2014 Nótese que en Iguana iguana, las hembras, grávidas o no, mostraron una concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) significativamente mayor que los machos. La deshidratación no causa aumentos en la CHCM, por lo que esta diferencia puede deberse a un incremento en la capacidad de transporte de oxígeno en las hembras de esta especie (H ARR ET AL ., 2001). Revisión Bibliográfica 78 2.4.4.- Recuento Total de Eritrocitos y Leucocitos de los Reptiles El número de eritrocitos en sangre periférica de reptiles es generalmente menor que en aves y mamíferos (S YPEK Y B ORYSENKO , 1988). El recuento total de eritrocitos (RBC) de los saurios tiende a ser mayor que el de las serpientes (D UGUY , 1970; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988) y a su vez, las serpientes suelen presentar un mayor RBC que los quelonios (D UGUY , 1970). Parece existir, por tanto, una relación inversa entre el RBC y el tamaño de los glóbulos rojos (S YPEK Y B ORYSENKO , 1988). Se ha descrito que, en respuesta a enfermedades crónicas, puede producirse un descenso en el recuento de eritrocitos (D IVERS , 2000 A ). Además, el RBC puede variar a causa de las condiciones ambientales, el estado nutricional, el sexo y la estación. Así, el RBC es mayor previamente a la fase de hibernación y aparece disminuido justo después de ese período (M USSACHIA Y S IEVERS , 1956; D UGUY , 1970; S AINT G IRONS , 1970; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; F RYE , 1991). El número total de leucocitos (WBC) puede experimentar una elevación en respuesta a procesos inflamatorios o infecciosos, especialmente cuando dichos procesos tienen un carácter agudo. En los casos en que las patologías tienen una evolución más crónica es frecuente que se manifieste un WBC normal o ligeramente aumentado. Aunque menos común que en las enfermedades infecciosas, el WBC puede también elevarse en respuesta a la neoplasia. Se suele aceptar que el grado de incremento del WBC se correlaciona con la severidad del proceso patológico experimentado (D IVERS , 2000 A ). Los descensos en el WBC pueden asociarse con enfermedad vírica, secuestro celular o trastornos de la médula ósea. También suelen detectarse recuentos bajos o muy bajos de leucocitos durante el período de hibernación y posthibernación (D IVERS , 2000 A ). Revisión Bibliográfica 79 Tabla 2.32. Recuentos totales de eritrocitos y leucocitos en algunas especies de reptiles Especie Recuento de eritrocitos (x 10 5 /microlitro (µl)) Recuento de leucocitos (/µl) Orden Squamata. Suborden Sauria Sauria 1 4.0-21 12000-22500 Agama atra 2 12.5 Chamaeleo chamaeleon 3 8 31120 Corucia sp. 4 15 12400 Corucia zebrata 4 8.4-18.3 3900-22400 Heloderma suspectum 30 5 4600 (3300-6400) Iguanas 5 15-35 6000-14000 Iguana iguana 6 14-58 1700-15000 Iguana iguana 7 35-58 4300-15000 Iguana iguana 8 Alto: 8-14 x 10 6 Bajo: 4-7 x 10 6 Iguana iguana 9 8-20 4500-10000 Iguana iguana 10 14 14800 Iguana iguana 11, 12 12.7 (machos) 26 14.8 (hembras) 27 15200 (machos) 26 13300 (hembras) 27 Iguana iguana 13 13 (machos) 14 (hembras y juveniles) 15100 (machos) 14800 (hembras) Lacerta agilis 14 9.45 Tarentola mauritanica 15 6.92-8.42 Varanus salvadorii 16 15 11450 Varanus salvator 31 10,76 (Macho)-11,72(Hembra) 15670 (Macho)-16050 (Hembra) Orden Squamata. Suborden Serpentes Serpientes 17 1 x 10 6 Serpentes 18 10 6.7-8.1 x 10 6 Serpentes 1 4.0-25 6700-81000 Boa sp. 19 10-25 4000-10000 Boa constrictor 20 1.71 6700 Coluber constrictor 21 7.30-10.75 Crotalus atrox 22 0.68 Elaphe scalaris 23 11.81 Natrix maura 24 3.78-10.7 Natrix maura 25 3.8-10.7 Phyton sp. 25 1.0-2.5 6000-12000 Phyton sp. 19 10-25 6000-12000 Phyton regius 26 14770 Vipera aspis 27 5.71-14.10 Orden Crocodilia Aligatores 17 600000 Alligator mississippiensis 28 6.18-14.80 Alligator mississippiensis 29 4-12 1800-20800 Crocodylus niloticus 29 10 5500-12400 Osteolaemus tetraspis 29 0.3-4.5 2000-6000 Paleosuchus palepebrosus 29 4-9 2700-13500 1: L AWTON , 1991 2: P IENAAR , 1962 3: C UADRADO ET AL ., 2002 4: W RIGHT Y S KEBA , 1992 Revisión Bibliográfica 80 5: University of Miami, Avian and Wildlife Laboratory, 1996. In: Exotic companion medicine handbook for veterinarians, 2: 2 6: B ARTEN , 1993 7: A NDERSON , 1992 8: R OSENTHAL , 2002 9: F RYE Y T OWNSEND , 1993; F RYE , 1995 10: H ARR ET AL ., 2001 11: Datos de B. L OCK . In: Biology, Husbandry, and Medicine of the Green iguana. E. R. Jacobson (ed.). 2003: 101-102. 12: Datos de L. K. M AXWELL . In: Biology, Husbandry, and Medicine of the Green iguana. E. R. Jacobson (ed.). Krieger Publishing Company, Florida. 2003. Pp. 101-102 13: H EARD ET AL ., 2004 14: A LDER Y H UBER , 1923; P EÑA R OCHE , 1939; S ALGUES , 1937 15: A LDER Y H UBER , 1923; S ALGUES , 1937 16: F ONTENOT ET AL ., 2004 17: D IVERS ET AL ., 1996; G OTTDENKER Y J ACOBSON , 1995; B ARTEN , 1993 18: R AITI , 2002 19: R OSSKOPF ET AL ., 1982; University of Miami, Avian and Wildlife Laboratory, 1996. In: Exotic companion medicine handbook for veterinarians, 2: 2 20: F RYE , 1973 21: H UTTON , 1958 22: W ALLACH Y B OEVER , 1983 23: S ALGUES , 1937 24: D UGUY , 1967; S ALGUES , 1937 25: D ESSAUER , 1970 26: California Avian Laboratory (Citrus Heights, California). In: A. M. Fudge (ed.). 1999. Laboratory Medicine (Avian and Exotic Pets). Philadelphia, W.B. Saunders Company: 375-400 27: B ABUDIERI , 1930 28: A LTMAN Y D ITTMER , 1964; C OULSON ET AL ., 1950; H OPPING , 1923; W INTROBE , 1933 29: L LOYD , 2003 30: C OOPER -B AILEY ET AL ., 2011 31: S ALAKIJ ET AL ., 2014 2.4.5.- Recuento de Trombocitos de los Reptiles Actualmente no existe un método completamente fiable para determinar el número de trombocitos en sangre circulante de reptiles. Se puede hacer una estimación de su número en frotis teñidos, buscando un campo al azar en el microscopio donde no se observen agregaciones de trombocitos, y multiplicar el número de trombocitos presentes en este campo por el cuadrado del objetivo utilizado. Se puede repetir en varios campos para obtener una media. Con ello se consigue el número aproximado de trombocitos por microlitro de sangre (R ASKIN , 2000; B ARROWS ET AL ., 2004; W ILKINSON , 2004). También se puede realizar un recuento total de trombocitos empleando la técnica de la cámara de Neubauer con el diluyente de Natt y Herrick, con una dilución de la sangre de 1:200. El recuento se hace en la totalidad de la cuadrícula central, en ambos lados de la cámara. El número obtenido se multiplica por 1000, resultando en el número total de trombocitos por µL de sangre. Sin embargo, los resultados desprendidos mediante esta técnica son variables debido a la dificultad de distinguir estas células de los linfocitos pequeños (F RYE 1991; M ARTÍNEZ -S ILVESTRE ET AL ., 2011). Se ha descrito que el número de trombocitos en reptiles oscila en un rango de 25-350 células por cada 100 leucocitos (P IENAAR , 1962; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988), pero el recuento suele ser inferior al 40% y los reptiles sanos frecuentemente exhiben un rango de 10500-19500 trombocitos/µl de sangre (P IENAAR , 1962; F RYE , 1981). La Tabla 2.33 expone valores de trombocitos para diferentes especies de reptiles. Revisión Bibliográfica 81 Tabla 2.33. Valores del recuento de trombocitos en diferentes especies de reptiles Especie Trombocitos Caiman latirostris 1 14 ± 3.2 (10 3 /mm 3 ) Caiman crocodylus jacare 1 12.7 ± 4 (10 3 /mm 3 ) Crotalus durissus terrificus 2 6900 ± 2400 (10 9 /l) 1: T ROIANO ET AL ., 1996 2: T ROIANO ET AL ., 1997 Los trombocitos de Crotalus adamanteus representan el segundo tipo celular en abundancia, después de los eritrocitos. Su recuento puede variar mucho en los diferentes frotis sanguíneos, dependiendo de la mayor o menor presencia de agregados trombocitarios que pueden ser consecuencia de una defectuosa toma de sangre (A LLEMAN ET AL ., 1999). Varanus salvator presenta una media de 85.5 ± 41.2 trombocitos por cada 100 leucocitos (S ALAKIJ ET AL ., 2014). Algunos estudios describen la existencia de variaciones estacionales en el número de trombocitos, observando un descenso de estas células en invierno y un aumento durante el período estival (K APLAN , 1954; P IENAAR , 1962; D UGUY , 1970; T ROIANO ET AL ., 1997). La trombocitopenia en reptiles suele deberse a una excesiva utilización de los trombocitos periféricos o a un descenso en su producción (C AMPBELL , 2004 A ). Así, puede derivarse de un proceso de coagulación intravascular diseminada u otros desórdenes de la coagulación. La presencia de trombocitos activados en el frotis puede ser señal de coagulación intravascular diseminada (H AWKEY Y D ENNET , 1989), aunque también pueden aparecer en respuesta a una mala técnica de obtención de sangre (W ATSON , 1997). La trombocitosis se detecta cuando existe una hemorragia o una infección bacteriana, mientras que la anisocitosis y la presencia de formas gigantes está asociada a menudo con una hiperplasia mieloide y linfoide (H AWKEY Y D ENNET , 1989). El polimorfismo nuclear se considera anormal y suele estar asociado a procesos inflamatorios severos (H AWKEY Y D ENNETT , 1989). 2.4.6.- Recuento Diferencial Leucocitario de los Reptiles Se pueden emplear numerosas tinciones hematológicas para realizar el recuento diferencial leucocitario. Las tinciones rápidas tienen bastantes ventajas y se consideran adecuadas (W ILKINSON , 2004). -Neutrófilo En reptiles sanos, en aquellas especies en las que se ha descrito su presencia, esta célula suele representar un 3-7% del total de leucocitos, y raramente excede el 10% (F RYE , 1991). -Heterófilo Esta célula se ha clasificado como el leucocito más abundante en la mayoría de los cocodrilianos y quelonios (H EARD ET AL ., 2004), más aún en los quelonios acuáticos (F RYE , Revisión Bibliográfica 82 1973). El número de heterófilos circulantes en reptiles puede ser muy variable. Algunos autores consideran que puede representar hasta un 40-45% del recuento diferencial leucocitario (T AYLOR Y K APLAN , 1961; D UGUY , 1970; W OOD Y E BANKS , 1984; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; J ACOBSON ET AL ., 1990; M ARKS Y C ITINO , 1990; F RYE , 1991; W RIGHT Y S KEBA , 1992), pero hay estudios en los que se afirma que puede llegar a representar hasta un 65% del total de leucocitos (F RYE , 1991). Hay especies en las que el heterófilo se ha descrito como el segundo leucocito más numeroso del recuento diferencial, como es el caso de Iguana iguana (A NDERSON , 1992; H ARR ET AL ., 2001), la iguana azul del Gran Cayman (Cyclura nubila lewisi) (F ISSE ET AL ., 2004), Pogona vitticeps (E LIMAN , 1997), Varanus salvator (S ALAKIJ ET AL ., 2014), el cocodrilo del Nilo (Crocodylus niloticus), y el caimán enano (Paleosuchus palpebrosus) (L LOYD , 2003). En contraste, en el varano de Papúa (Varanus salvadorii) (F ONTENOT ET AL ., 2004), Alligator mississipiensis, el cocodrilo enano (Osteolaemus tetraspis) (L LOYD , 2003), el mostruo de Gila (Heloderma suspectum) (C OOPER -B AILEY ET AL ., 2011) y el camaleón común (Chamaeleo chamaeleon) (C UADRADO ET AL ., 2002), el heterófilo representa el leucocito más abundante. Sin embargo, en algunas especies de serpiente como Ophiophagus hannah los heterófilos constituyen el tercer leucocito en número (S ALAKIJ ET AL ., 2002), mientras que en Crotalus adamanteus los heterófilos y los basófilos representan los leucocitos menos abundantes (A LLEMAN ET AL ., 1999). Debido a que los reptiles son animales ectotérmicos, los leucocitos tienden a fluctuar en sus recuentos influenciados por varios factores, como la estación del año y la temperatura (P IENAAR , 1962; S HEELER Y B ARBER , 1964; S TENROSS Y B OWMAN , 1968; S EMPLE ET AL ., 1970; D UGUY , 1970; R OSSKOPF ET AL ., 1982; W OOD Y E BANKS , 1984; L AWRENCE Y H AWKEY , 1986; F RYE , 1991; H ART ET AL ., 1991; A NDERSON , 1996). Algunos estudios no han hallado cambios significativos en los parámetros sanguíneos en función de la edad o el sexo, pero sí en relación con la época del año (T ROIANO Y S ILVA , 1998). Generalmente se reconoce la gran variabibilidad de los leucogramas de reptiles (D UGUY , 1970, H AWKEY Y D ENNET , 1989; C AMPBELL , 1996 B ). Algunos autores consideran que el número de heterófilos circulantes está influenciado por factores estacionales, observándose recuentos más elevados durante el verano y más bajos durante el período de hibernación (D UGUY , 1970; L AWRENCE Y H AWKEY , 1986; W ATSON , 1997; R ASKIN , 2000). También se ha citado un incremento de estas células en hembras grávidas en algunas especies de reptiles (D UGUY , 1970; C UADRADO ET AL ., 2002). Otros autores no han hallado evidencias de variaciones en los recuentos totales de leucocitos ni en el porcentaje de heterófilos en función de la estación o del sexo del reptil (C HRISTOPHER ET AL ., 1999). Los incrementos significativos en el número de heterófilos suelen asociarse a enfermedades inflamatorias (especialmente infecciones microbianas o parasitarias y daños tisulares), aunque también aparecen en trastornos no inflamatorios como el estrés, la neoplasia o la leucemia mieloide (R OSSKOPF , 1982; C AMPBELL , 1996 B ; R ASKIN , 2000; C AMPBELL , 2004 A ). Varios autores han descrito un aumento del porcentaje de heterófilos como consecuencia del estrés generado en el momento de la captura de los animales (L ANCE , 1990; H AJDUK ET AL ., 1992; A GUIRRE ET AL ., 1995). La heteropenia se ha descrito en reptiles con enfermedades virales masivas Revisión Bibliográfica 83 (R OSSKOPF , 2000), particularmente en la enfermedad de los cuerpos de inclusión de algunas serpientes (J ACOBSON , 1999), y algunos autores la relacionan con estados de inmunosupresión (N EIFFER ET AL ., 2005). -Eosinófilo Los recuentos de eosinófilos suelen oscilar entre el 7-20% del total de leucocitos en los frotis sanguíneos de reptiles (S YPEK Y BORYSENKO , 1988; F RYE , 1991), pero generalmente su porcentaje es bastante variable. Los estudios publicados en lacértidos ponen de manifiesto que estos animales tienen pocos eosinófilos circulantes. Es el caso de Iguana iguana (A NDERSON , 1992; H ARR ET AL ., 2001) y Cyclura nubila lewisi (F ISSE ET AL ., 2004). Asimismo, algunas serpientes como la boa constrictor (Boa constrictor) (C HIODINI Y S UNDBERG , 1982; R OSSKOPF ET AL ., 1982), la pitón tigrina (Phyton molurus), la pitón real (Phyton regius) y la pitón reticulada (Phyton reticulatis) (R OSSKOPF ET AL ., 1982) presentan un número muy bajo de eosinófilos (0-3 %), constituyendo en Ophiophagus Hannah el leucocito más escaso (S ALAKIJ ET AL ., 2002). De igual forma, en Alligator mississipiensis, Crocodylus niloticus, Osteolaemus tetraspis y Paleosuchus palpebrosus los eosinófilos suponen generalmente el último leucocito en el recuento diferencial (L LOYD , 2003). Además, en Physignathus spp. (L E B LANC , 2001), Varanus salvadorii (F ONTENOT ET AL ., 2004), Varanus salvator (S ALAKIJ ET AL ., 2014), Heloderma suspectum (C OOPER -B AILEY ET AL ., 2011), Chamaeleo chamaeleon (C UADRADO ET AL ., 2002) y Elaphe obsoleta quadrivittata (D OTSON ET AL ., 1997) no se describen eosinófilos. Por el contrario, algunas especies de tortugas pueden poseer hasta un 20 % de eosinófilos (T AYLOR Y K APLAN , 1961; D UGUY , 1970; W OOD Y E BANKS , 1984; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; J ACOBSON ET AL ., 1990; M ARKS Y C ITINO , 1990; W RIGHT Y S KEBA , 1992). Se ha postulado que los eosinófilos siempre se presentan en un número inferior al del heterófilo (W ATSON , 1997). El número de eosinófilos puede verse influenciado por factores estacionales, contabilizándose números menores en verano y mayores durante la hibernación (L AWRENCE Y H AWKEY , 1986; D UGUY , 1970; W ATSON , 1997). Esta fluctuación se asocia al declive de los eosinófilos en los períodos donde los animales muestran una mayor actividad metabólica (S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; D UGUY , 1970). Otros autores no han hallado diferencias en las fórmulas leucocitarias como consecuencia de factores estacionales (T ROIANO Y S ILVA , 1998). El recuento de eosinófilos tiende a incrementarse ante estimulaciones parasitarias e inmunológicas no específicas (M EAD Y B ORYSENKO , 1984 A ). La eosinofilia se ha citado en infestaciones por parásitos sanguíneos, digestivos o externos (W ATSON , 1997). Bajo estimulación antigénica también se incrementa su número (F RYE , 1991) y se ha demostrado la presencia de la inmunoglobulina citofílica en el eosinófilo de los reptiles (M EAD Y B ORYSENKO , 1984 B , S YPEK Y B ORYSENKO , 1988). La eosinopenia en reptiles sólo se ha descrito en respuesta a incrementos en la actividad metabólica de los animales (D UGUY , 1970) y a situaciones de estrés (L ANCE , 1990; H AJDUK ET AL ., 1992). Revisión Bibliográfica 84 -Basófilo Los basófilos pueden representar un 0-40% del recuento diferencial leucocitario en reptiles (T AYLOR Y K APLAN , 1961; D UGUY , 1970; R OSSKOPF , 1982; R OSSKOPF ET AL ., 1982; W OOD Y E BANKS , 1984; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; J ACOBSON ET AL ., 1990; M ARKS Y C ITINO , 1990; W RIGHT Y S KEBA , 1992; C AMPBELL , 1996 B ; R ASKIN , 2000; R OSSKOPF , 2000), mientras que otros autores consideran que en muchos individuos sanos y no hibernantes los basófilos pueden suponer el 10-25% del total de leucocitos (F RYE , 1991). Es destacable que en algunos quelonios estas células pueden presentar recuentos superiores al 50% (M ICHELS , 1923; M EAD ET AL ., 1983; S YPEK ET AL ., 1984; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988). Sin embargo, es poco frecuente observar basófilos en Elaphe obsoleta quadrivittata (D OTSON ET AL ., 1995; 1997), Ophiophagus hannah (S ALAKIJ ET AL ., 2002) e Iguana iguana (A NDERSON , 1992; H ARR ET AL ., 2001). En Crotalus durissus terrificus (T ROIANO ET AL ., 1997), Crotalus adamanteus (A LLEMAN ET AL ., 1999), Chamaeleo chamaeleon (C UADRADO ET AL ., 2002) y Varanus salvator (S ALAKIJ ET AL ., 2014) los basófilos representan la célula menos numerosa en el recuento diferencial leucocitario. En Varanus salvadorii (F ONTENOT ET AL ., 2004) constituye el penúltimo leucocito, mientras que en Alligator mississipiensis, Crocodylus niloticus, Osteolaemus tetraspis y Paleosuchus palpebrosus supone el tercer o cuarto leucocito en número (L LOYD , 2003). De igual manera, en Pogona vitticeps (E LIMAN , 1997), Cyclura nubila lewisi (F ISSE ET AL ., 2004), Boa constrictor (C HIODINI Y S UNDBERG , 1982; R OSSKOPF ET AL ., 1982) y varias especies de pitones (Phyton molurus, Phyton regius y Phyton reticulatis) (R OSSKOPF ET AL ., 1982) los basófilos representan el tercer leucocito en frecuencia en el recuento diferencial leucocitario. Se ha descrito una pequeña variación estacional en el número de basófilos, disminuyendo su recuento durante la hibernación y aumentando al llegar la época activa del individuo (S AINT G IRONS , 1970; R ASKIN , 2000). A diferencia de lo que ocurre con los mamíferos, en los reptiles es frecuente que se produzca un incremento significativo en el número absoluto de basófilos en respuesta a patógenos bacterianos, especialmente en aquellas especies que en condiciones normales presentan un número elevado de estas células (H EARD ET AL ., 2004). Se ha observado basofilia en presencia de ciertos parásitos sanguíneos (S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; C AMPBELL , 1996 B ; W ATSON , 1997) como hemogregarinas y tripanosomas, y en infecciones por iridovirus (S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; C AMPBELL , 1996 B ). -Linfocito Muchos autores consideran a los linfocitos los leucocitos más numerosos en la sangre periférica de los reptiles (S AINT G IRONS , 1970; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; C AMPBELL , 1996 B ). En algunas especies los linfocitos pueden representar hasta un 80% del recuento diferencial leucocitario (S YPEK Y B ORYSENKO , 1988). Otros autores describen porcentajes superiores al 50% del total de leucocitos en iguanas y tortugas marinas (D IVERS ET AL ., 1996; W ORK ET AL ., 1998). Así sucede en Iguana iguana (A NDERSON , 1992; H ARR ET AL ., 2001) y de forma muy similar en Cyclura nubila lewisi, cuyo porcentaje linfocitario puede alcanzar el 46% (F ISSE ET AL ., 2004). De igual manera, en Crotalus durissus terrificus (T ROIANO ET AL ., 1997), Crotalus adamanteus (A LLEMAN ET AL ., 1999), la culebra arbórea parda (Boiga irregularis) (L AMIRANDE ET AL ., 1999), Ophiophagus hannah (S ALAKIJ ET AL ., 2002) y Elaphe obsoleta quadrivittata (D OTSON ET AL ., 1997), así Revisión Bibliográfica 85 como en Crocodylus niloticus (P IENAAR , 1962; L LOYD , 2003), Paleosuchus palpebrosus (L LOYD , 2003) y Varanus salvator (S ALAKIJ ET AL ., 2014) los linfocitos son los leucocitos más numerosos. Otros autores corroboran esta predominancia linfocitaria para algunas especies de ofidios (P IENAAR , 1962; D UGUY , 1970; R OOSKOPF ET AL ., 1982). Contrariamente, otros trabajos realizados en Crotalus durissus terrificus y Boa constrictor (P IENAAR , 1962; D OTSON ET AL ., 1995) hallan al azurófilo como el leucocito predominante. P IENAAR (1962) comprobó una predominancia linfocitaria en varias especies de reptiles sudafricanos: Pelomedusa subrufa, Pelosios sinuatus, Agama atra, Chamaeleo dilepsis dilepsis, Cordylus jonesii, Cordylus vittifer, Lygodactylus c. capensis, Mabuya varia, Pachydactylus c. capensis, Pachydactylus bibroni, Varanus niloticus, Albabophis rufulus, Crotaphopeltis hotamboei y Psammophis s. subtaeniatus. Lo mismo sucede con Pogona vitticeps (E LIMAN , 1997). Sin embargo, en Alligator mississipiensis, Osteolaemus tetraspis (L LOYD , 2003), Chamaeleo chamaeleon (C UADRADO ET AL ., 2002) y Heloderma suspectum (C OOPER - B AILEY ET AL ., 2011) el linfocito es el segundo leucocito más abundante. En Varanus salvadorii el linfocito representa el tercer leucocito (F ONTENOT ET AL ., 2004). En general se considera que el recuento total y relativo de linfocitos en reptiles es bastante variable, estando influenciado por diversos factores como la especie, la edad, el sexo, la estación del año, el estado nutricional, el grado de parasitismo por hemoprotozoos y metazoos, o la presencia de enfermedades concominantes (F RYE , 1991). Muchos autores han descrito recuentos linfocitarios superiores en las hembras de algunas especies de reptiles en comparación con los machos de su misma edad y en idénticas condiciones ambientales (D UGUY , 1970; B ORYSENKO Y L EWIS , 1979; G LAZEBROOK ET AL ., 1981; B URKE Y R ODGERS , 1982; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; F RYE , 1991; W ATSON , 1997; C AMPBELL , 1996 B ). En lo que respecta a la edad, los reptiles más jóvenes tienden a mostrar números ligeramente superiores de linfocitos, monocitos, heterófilos y trombocitos, comparados con los ejemplares adultos de su misma especie (F RYE , 1991). Durante la muda o ecdisis el recuento de linfocitos también tiende a elevarse ligeramente (F RYE , 1991; W ATSON , 1997), y lo mismo puede suceder después del apareamiento (W ATSON , 1997). La estación y las condiciones ambientales también afectan al recuento de linfocitos, incrementándose durante los meses calurosos de verano y descendiendo a la llegada del invierno y la hibernación (D UGUY , 1970; H USSEIN ET AL ., 1978; D ESSER Y W ELLER , 1979 A ; W RIGHT Y C OOPER , 1981; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; F RYE , 1991; C AMPBELL , 1996 B ; W ATSON , 1997). Así, las especies de climas templados presentan una disminución de los linfocitos durante el período de hibernación (H USSEIN ET AL ., 1978; 1979 A ; 1979 B ; W RIGHT Y C OOPER , 1981; C AMPBELL , 1996 B ) y en primavera exhiben una proliferación linfocitaria posthibernación. Se ha explicado el descenso en el recuento linfocitario como una consecuencia de la relativa incapacidad de algunas especies de climas templados a desarrollar una respuesta inmune primaria durante las bajas temperaturas invernales o durante el período normal de hibernación (W RIGHT Y C OOPER , 1981). Las experiencias clínicas con una variedad de serpientes, lagartos y quelonios de climas templados llevó a proponer esta hipótesis (F RYE , 1991). Las especies tropicales también muestran un declive estacional del número de linfocitos durante el invierno como consecuencia de una Revisión Bibliográfica 86 disminución de los linfocitos esplénicos y circulantes (S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; C AMPBELL , 1996 B ). En contraste, en Crotalus durissus terrificus no se hallan variaciones en el recuento diferencial leucocitario y por tanto en el número de linfocitos, en función de la edad o del sexo de los individuos, o en respuesta a la estación (T ROIANO ET AL ., 1997). La linfocitosis puede observarse como consecuencia de un proceso inflamatorio o durante la cicatrización de heridas (C AMPBELL , 1996 B ; J ACOBSON , 1999), aunque también puede ocurrir en respuesta a infecciones parasitarias o enfermedades víricas (C AMPBELL , 1996 B ; W ATSON , 1997; J ACOBSON , 1999) o durante la ecdisis (W ALLACH Y B OEVER , 1983). En serpientes que padecen la enfermedad de los cuerpos de inclusión, además de una marcada linfocitosis, ocasionalmente se pueden detectar dichos cuerpos de inclusión en el interior de los linfocitos (J ACOBSON , 1999). La linfopenia se asocia con estados de malnutrición (D UGUY , 1970; B ORYSENKO Y L EWIS , 1979; G LAZEBROOK ET AL ., 1981; B URKE Y R ODGERS , 1982; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; F RYE , 1991; W ATSON , 1997; C AMPBELL , 1996 B , 2004 A ) o aparece de forma secundaria en respuesta a diversas enfermedades derivadas del estrés y la inmunosupresión (C AMPBELL , 2004 A ), como el estrés post-captura en reptiles silvestres (L ANCE , 1990; H AJDUK ET AL ., 1992; A GUIRRE ET AL ., 1995). -Monocito Los monocitos usualmente se presentan en bajo número en los frotis sanguíneos de la mayoría de las especies de reptiles, constituyendo un 0-10% del recuento diferencial leucocitario (T AYLOR Y K APLAN , 1961; T AYLOR ET AL ., 1963; D UGUY , 1970; O TIS , 1973; R OSSKOPF , 1982; R OSSKOPF ET AL ., 1982; W OOD Y E BANKS , 1984; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; J ACOBSON ET AL ., 1990; M ARKS Y C ITINO , 1990; A LLEMAN ET AL ., 1992; W RIGHT Y S KEBA , 1992; C AMPBELL , 1996 B ). Este rango es mayor en algunas especies de serpientes (H AWKEY Y D ENNET , 1989; C AMPBELL , 1996 B ). Otros autores los contabilizan como 0.53% del recuento diferencial leucocitario (F RYE , 1991). Un porcentaje similar (0-3 %) se ha observado en Boa constrictor (C HIODINI Y S UNDBERG , 1982; R OSSKOPF ET AL ., 1982) y en varias especies de pitones (Phyton molurus, Phyton regius y Phyton reticulatis) (R OSSKOPF ET AL ., 1982). Un número inferior al 4 % se ha citado en Iguana iguana (A NDERSON , 1992; H ARR ET AL ., 2001) y Cyclura nubila lewisi (F ISSE ET AL ., 2004). P IENAAR (1962) describió recuentos de monocitos de hasta un 20% en algunos reptiles sudafricanos. En Pogona vitticeps (E LIMAN , 1997), Varanus salvadorii (F ONTENOT ET AL ., 2004) y Varanus salvator (S ALAKIJ ET AL ., 2014) los monocitos representan la célula menos frecuente, después del basófilo. En Alligator mississipiensis, Crocodylus niloticus y Paleosuchus palpebrosus los monocitos constituyen el penúltimo o último leucocito (L LOYD , 2003). El monocito de Heloderma suspectum (C OOPER -B AILEY ET AL ., 2011) representa el último leucocito en número, mientras que en Chamaeleo chamaeleon (C UADRADO ET AL ., 2002) estas células representan el tercer leucocito más abundante. Los monocitos no se han observado en ejemplares de Elaphe obsoleta quadrivitatta sanas (D OTSON ET AL ., 1995; 1997), pero se citan en otras especies de serpientes con infecciones bacterianas severas (D OTSON ET AL ., 1995). Sin embargo, se observan en algunas especies de serpientes sin patologías: Ophiophagus hannah, especie en la que los monocitos y los eosinófilos representan los leucocitos menos numerosos (S ALAKIJ ET AL ., Revisión Bibliográfica 93 Tabla 2.36. Valores de hematocrito en algunas especies de quelonios Especie Hematocrito (%) Quelonios 1 20-40 Quelonios 2 32-55 Familia Testudinidae (tortugas terrestres) Clemmys muhlenbergii 8 ,silvestres 20 Geochelone sp. 4 17 Geochelone yniphora 3 20 Gopherus agassizii 9,10 23-37 Gopherus agassizii 11 25-53 Gopherus polyphemus 12 23 Malacochersus tornieri 3 34 Terrapene carolina 5,13 20-38 Terrapene carolina 14 28.6 Terrapene carolina 7 28 Terrapene carolina 6 20-38 Testudo spp. 15 24 Testudo graeca 15 24 Testudo graeca y Testudo hermanni 8 34 (primavera) 28 (verano) Testudo hermanni 15 25 Testudo hermanni 16 24.44 Testudo horsfieldii 15 27 Testudo marginata 17 14 Testudo marginata 15 23 Testudo radiata 18 31 Tortugas marinas Caretta caretta 19 , edad: 2 meses 18.5 Caretta caretta 19 , edad: 3 meses 16.4 Caretta caretta 19 , edad: 4 meses 19.0 Caretta caretta 19 , edad: 5 meses 18.8 Caretta caretta 19 , edad: 6 meses 20.1 Caretta caretta 19 , edad: 7 meses 19.3 Caretta caretta 19 , edad: 8 meses 20.3 Caretta caretta 19 , edad: 9 meses 20.2 Caretta caretta 19 , edad: 12 meses 20.1 Caretta caretta 20 - 21 32 Caretta caretta 22 32 Caretta caretta 23 30.5 Caretta caretta 24 35.4 (rango:28-48) Caretta caretta 25 29 Caretta caretta 26 22 Caretta caretta 27 29.8 Chelonia mydas 28 36 Chelonia mydas 27 35.2 Chelonia mydas 23 26.3 Chelonia mydas 29 36 Chelonia mydas 30 29 Chelonia mydas 22 30 Chelonia mydas 31 35.2 Revisión Bibliográfica 94 Especie Hematocrito (%) Tortugas marinas Lepidochelys kempi 32 30.1 Lepidochelys kempi 33 31.1 Lepidochelys olivacea 34 ,crías 24.5 Lepidochelys olivacea 35 ,adultos 31 Tortugas de agua dulce Cuora flavomarginata 36 Machos (31), hembras (27) Cuora trifasciata 37 30 1: University of Miami, Avian and Wildlife Laboratory. 1996. In: Exotic companion medicine handbook for veterinarians, 2: 6 2: Grange Laboratories, comunicación personal, 1993. In: S. McArthur (ed.). Veterinary management of tortoises and turtles. Blackwell Science Ltd.: 117. 3: R APHAEL , 2003 4: W ANG ET AL ., 1999 5: F RYE , 1994 6: W ALLACH Y B OEVER , 1983 7: J ACKSON , 1991 8: B RENNER ET AL ., 2002 9: R OSSKOPF , 1982 10: T AYLOR Y J ACOBSON , 1982 11: Clinical laboratory normals: California desert tortoise. PAL News, Winter 1992-1993: 7 12: S AMOUR ET AL ., 1986 13: S TEIN , 1996 14: A LTMAN Y D ITTMER , 1964 15: M ATHES ET AL ., 2005 16: M URO ET AL ., 1998 17: L ÓPEZ -O LVERA ET AL ., 2003 18: G OTTDENKER Y J ACOBSON , 1995 19: B RADLEY ET AL ., 1998 20: F RAIR , UNPUBLISHED , 1964 21: T HORSON , 1968 22: D ESSAUER , 1970 23: J ACOBSON , ET AL ., 2004 (datos de Agosto del 2004) 24: L UTZ Y D UNBAR -C OOPER , 1987 25: W HITMORE , 1994 26: R APHAEL , 2003 27: G ELLI ET AL ., 2004 28: W ANG ET AL ., 1999 29: N ORTON ET AL ., 1990 30: M ONTILLA ET AL ., 2006 31: L UTZ , 1990 32: M C G EHEE , 1979 33: W HITAKER Y K RUM , 1999 34: M OHANTY -H EJMADI ET AL ., 1984 35: F RAIR , 1977 A 36: Y ANG ET AL , 2014 (Valores obtenidos tras sacar la media de los registros de diferentes estaciones) 37: G RIONI ET AL , 2014 Revisión Bibliográfica 95 2.6.2.- El Nivel de Hemoglobina de los Quelonios En la Tabla 2.37 se exponen los niveles de hemoglobina de varias especies de quelonios. Tabla 2.37. Valores de hemoglobina en algunas especies de quelonios Especie Hb (g/dL) Quelonios 1 12-18 Familia Testudinidae Tortugas terrestres Geochelone radiata 2 (cautivas) 6.7 Gopherus agassizii 5 (machos) 10.2 Terrapene carolina major 3 5.9 Testudo graeca y Testudo hermanii 3 10.1-11.3 (primavera) 9.1-9.5 (verano) Testudo hermanni 4 10.1(invierno) 9.3 (verano) Tortugas marinas Caretta caretta 6 , edad:4 meses 5.28 Caretta caretta 6 , edad:5 meses 5.19 Caretta caretta 6 , edad:6 meses 5.80 Caretta caretta 6 , edad:7 meses 5.42 Caretta caretta 6 , edad:8 meses 6.25 Caretta caretta 6 , edad:9 meses 6.20 Caretta caretta 7 - 8 4.7 Caretta caretta 9 4.7 Caretta caretta 10 9.82 Caretta caretta 11 10.1 Chelonia mydas 9 6.6 Lepidochelys olivacea 9 3.8 Tortugas de agua dulce Cuora flavomarginata 12 Machos(8.16), henbras (6.72) 1: Grange Laboratories, comunicación personal, 1993. In: S. McArthur (ed.). Veterinary management of tortoises and turtles. Blackwell Science Ltd.: 117 2: R APHAEL , 2003 3: J ACKSON , 1991 4: H EARD ET AL ., 2004 5: D ICKINSON ET AL ., 2002 6: B RADLEY ET AL ., 1998 7: F RAIR , unpublished, 1964 8: T HORSON , 1968 9: D ESSAUER , 1970 10: K ELLER ET AL ., 2004 11: B OLTEN ET AL ., 1992 12: Y ANG ET AL , 2014 (Valores obtenidos tras sacar la media de los registros de diferentes estaciones) Revisión Bibliográfica 96 2.6.3.- Índices Eritrocitarios de los Quelonios En la Tabla 2.38 se exponen los valores de los índices eritrocitarios de varias especies de quelonios. Tabla 2.38. Índices eritrocitarios en algunas especies de quelonios Especie MCV (fl) MCHC (gm/dL) MCH (pg) Quelonios 1 59-77 30-36 20-26 Familia Testudinae Tortugas terrestres Terrapene carolina 2 309-587 79-131 Testudo graeca 3 416 (invierno) 427 (verano) 29.8 (invierno) 32.2 (verano) 124 (invierno) 137 (verano) Testudo hermanni 3 402 (invierno) 426 (verano) 31.1 (invierno) 32.2 (verano) 124 (invierno) 137 (verano) Testudo hermanni 4 514.8 26.32 122.64 Tortugas marinas Caretta caretta 5 277.9 Chelonia mydas 6 730.17 Chelonia mydas 7 725 198.18 27.50 Tortugas de agua dulce Cuora flacomarginata 8 389.5(Hembras) 371.25(Machos) 25.5(Hembras) 26.5(Machos) 97.5(Hembras) 97.25(Machos) 1: Grange Laboratories, comunicación personal, 1993. In: S. McArthur (ed.). Veterinary management of tortoises and turtles. Blackwell Science Ltd.: 117 2: W ALLACH Y B OEVER , 1983 3: H EARD ET AL ., 2004 4: M URO ET AL ., 1998 5: G ELLI ET AL ., 2004 6: M ONTILLA ET AL ., 2006 7: A GUIRRE ET AL ., 1995 8: Y ANG ET AL , 2014 (Valores obtenidos tras sacar la media de los registros de diferentes estaciones) 2.6.4.- Recuento Total de Eritrocitos y Leucocitos de los Quelonios Debido a su condición de animales ectotérmicos los quelonios están sometidos a una serie de variaciones cíclicas anuales, dependientes de la temperatura ambiente, el fotoperíodo y de variaciones hormonales (M URO ET AL ., 1994). En los quelonios, al igual que en el resto de los reptiles, se han descrito variaciones estacionales en el recuento de eritrocitos (K APLAN , 1960; P IENAAR , 1962; S HEELER Y B ARBER , 1964; S TENROSS Y B OWMAN , 1968; D UGUY , 1970; S EMPLE ET AL ., 1970; R OSSKOPF , 1982; W OOD Y E BANKS , 1984; L AWRENCE Y H AWKEY , 1986; H ART ET AL ., 1991). En el período invernal suelen observarse los mayores recuentos totales de eritrocitos, así como la mayor concentración de hemoglobina. En el período postinvernal (marzo-abril) se aprecia una disminución en el recuento de eritrocitos, mientras que en el período preinvernal (principios de septiembre a finales de octubre) hay un aumento del recuento total de eritrocitos y un aumento de la concentración de hemoglobina (D UGUY , Revisión Bibliográfica 97 1970). De forma opuesta, en la tortuga de caja china (Cuora flavomarginata) dichos valores son superiores en verano (Y ANG ET AL , 2014). También se observa una disminución significativa de estos valores hematológicos durante el período invernal en Gopherus agassizii, siendo dichas variaciones estacionales más acentuadas en las hembras que en los machos (C HRISTOPHER ET AL ., 1999). Según D ICKINSON ET AL . (2002) los cambios observados en esta especie ocurren en respuesta a la disponibilidad estacional de agua y alimento, llegando a variar en sucesivos años. Todo lo contrario afirman O´C ONNOR ET AL . (1994), quienes en sus investigaciones con esta especie de tortuga no hallaron variaciones de los parámetros sanguíneos en función de la época del año. En las tortugas mora (Testudo graeca) y mediterránea (Testudo hermanni) las variaciones estacionales se corresponden con descensos del número de eritrocitos desde finales de marzo hasta junio, permaneciendo después estables hasta el mes de octubre. En noviembre se cita un ligero incremento en el número de eritrocitos (L AWRENCE Y H AWKEY , 1986), seguido de un descenso en el mes de diciembre (G ILLES -B AILLIEN , 1973; L AWRENCE Y H AWKEY , 1986). En la tortuga terrestre argentina (Chelonoidis chilensis chilensis) se ha descrito también un aumento de eritrocitos, hematocrito y hemoglobina en el período invernal, con una disminución durante el período estival (T ROIANO Y S ILVA , 1998). Existen dos teorías para explicar las posibles causas del aumento del recuento de eritrocitos, del hematocrito y de la concentración de hemoglobina que experimentan algunos quelonios durante la hibernación. Por un lado, se cree que la deshidratación resultante de la hibernación y el menor consumo de alimentos y agua determinan una disminución del plasma, con secuestro de líquidos en el intersticio y un aumento del recuento de eritrocitos y hematocrito (T ROIANO Y S ILVA , 1998). S TENROSS Y B OWMAN (1968) y F RAIR (1977 A ) observaron este hecho en varias especies de tortugas, como Chelydra serpentina, Lysemmys punctata, Trachemys scripta y la tortuga de estanque moteada (Emydoidea blandingii). Otra teoría propone que el aumento de eritrocitos, hematocrito y hemoglobina en la época invernal se debe a un estímulo de la eritropoyetina en respuesta a la caída de la tensión de oxígeno mientras el animal hiberna (G AUMMER Y G OODNIGHT , 1957; D UGUY , 1970). No existen evidencias directas que ratifiquen esta última hipótesis. La elevada vida media de los eritrocitos de las tortugas (B RACE Y A TLAND , 1955) y la baja probabilidad de que suceda una fuerte eritropoyesis activa durante el estado de reposo conlleva a afirmar que esta hipótesis no es acertada (L AWRENCE Y H AWKEY , 1986). En cuanto a las variaciones en el recuento eritrocitario asociadas al sexo, se suele observar un mayor número de eritrocitos en el macho (D UGUY , 1970; P ALOMEQUE ET AL . 1977). Así sucede en la tortuga de caja común (Terrapene carolina) (D UGUY , 1970), la tortuga mordedora de Nueva Guinea (Elseya novaeguineae) (A NDERSON ET AL ., 1997), la tortuga gigante de Aldabra (Geochelone gigantea) (H ART ET AL ., 1991), Gopherus agassizii (O´C ONNOR ET AL ., 1994; C HRISTOPHER ET AL ., 1999) y Cuora flavomarginata (Y ANG ET AL , 2014). En contraste, no se encuentra variación debida al sexo en el recuento eritrocitario de los adultos de la tortuga de las grietas (Malacochersus tornieri) y la tortuga del desierto común (Gopherus polyphemus) (T AYLOR Y J ACOBSON , 1982; R APHAEL ET AL ., 1994), ni en los ejemplares jóvenes y adultos de Chelonoidis chilensis chilensis (T ROIANO Y S ILVA , 1998). Se han descrito variaciones en el recuento eritrocitario asociadas a la edad en algunos quelonios, observándose mayores recuentos de eritrocitos en los adultos (D UGUY , Revisión Bibliográfica 98 1970). Sin embargo, algunos quelonios, como Chelonoidis chilensis chilensis no muestran dicha variación (T ROIANO Y S ILVA , 1998). Algunos autores también han hallado variaciones en el recuento eritrocitario asociadas al tamaño del individuo. Así, F RAIR (1977 A ) en sus investigaciones sobre la tortuga malaya (Malayemys spixii) observó una relación directamente proporcional entre el recuento de eritrocitos, el hematocrito y el tamaño de los ejemplares. El estrés se ha mostrado como un factor influyente en el descenso de los niveles de hematocrito en quelonios (D UGGAN , 1981; M OBERG , 1985; M AHAPATRA ET AL ., 1991; K REGER Y M ENCH , 1993; A GUIRRE ET AL ., 1995). Dicho estrés puede presentarse de forma aguda (por captura) o crónica (por enfermedad) (A GUIRRE ET AL ., 1995). Las alteraciones patológicas en el recuento total de eritrocitos pueden producirse por defecto (anemia) o exceso (policitemia) (M URO ET AL ., 1994). Los eritrocitos de las tortugas tienen una vida media muy larga (F RYE , 1991) por lo que no desarrollan fácilmente anemias asociadas a inflamaciones orgánicas crónicas (M URO ET AL ., 1994). La presencia de anemia en un quelonio puede ser artefactual, debida a una hemodilución linfática de la muestra, o asociarse a anorexia post-hibernación, pobres condiciones nutricionales y ambientales, pérdida de sangre, eritrolisis (autoinmune o inducida por hemoparásitos) o deberse a una enfermedad crónica (M C A RTHUR ET AL ., 2002). El recuento total de eritrocitos (RBC) de los quelonios suele estar comprendido en el rango de 0.154-0.980 x 10 6 /µl, dependiendo de la especie y de la época del año (R APHAEL , 2003). En general, el recuento total de leucocitos (WBC) en los quelonios es de 8000-9000/µl posthibernación y aproximadamente 6000-7000/µl antes de la hibernación (M C A RTHUR , 1996). Como nota relevante, en estudios en tortugas marinas se ha evidenciado que el método de recuento de WBC influye en el resultado. Así, los recuentos realizados con el método Natt & Herrick superaron en cuantía a los realizados con el método Unopette en un rango del 38.5% (A RNOLD , 1994). R ASKIN (2000) recomienda no usar el método Unopette. En la Tabla 2.39 se exponen los valores de RBC y recuento total de leucocitos (WBC) en varias especies de quelonios. Revisión Bibliográfica 99 Tabla 2.39. Valores de WBC y RBC en varias especies de quelonios Especie RBC (x10 5 /µl) WBC (/µl) Quelonios 1 15-25 3000-8000 Quelonios 2 0.055-0.085 6000-15000 Familia Testudinidae Tortugas terrestres Geochelone sp. 4 4.0 3400 Gopherus agassizii 5,6 1.20-3.0 6600-8900 Gopherus agassizii 7 5-9 3100-9300 Gopherus polyphemus 8 5.4 15700 Terrapene carolina 3 0.65 7500 Terrapene carolina 9,10 3.0-8.0 7500 Terrapene carolina 3 2.7-8.3 7500 Testudo graeca y Testudo hermanni 7 8.2-9.6 (primavera) 6.7 (verano) Testudo hermanni 11 4.9 7240 Testudo hermanni 12 8.3 (invierno) 9.6 (primavera) 6.7 (verano) 10800 (invierno) 7700 (primavera) 9800 (verano) Testudo marginata 13 3.4 2770 Testudo radiata 14 5.0 4300 Tortugas marinas Caretta caretta 15 3.9 14670 Caretta caretta 16 13 3900 Caretta caretta 17 3800-3900 Chelonia mydas 18 6.1 12066 Chelonia mydas 19 4.2 6160 Chelonia mydas 20 3.4 2000-3900 Lepidochelys kempi 21 5700-9500 Tortugas de agua dulce Cuora flavomarginata 22 8.6(Machos)-7.1(Hembras) 3852(Machos)-4186(Hembras) 1: University of Miami, Avian and Wildlife Laboratory. 1996. In: Exotic companion medicine handbook for veterinarians, 2: 6 2: Grange Laboratories, comunicación personal, 1993. In: S. McArthur (ed.). Veterinary management of tortoises and turtles. Blackwell Science Ltd.: 117 3: W ALLACH Y B OEVER , 1983 4: W ANG ET AL ., 1999 5: R OSSKOPF , 1982 6: T AYLOR Y J ACOBSON , 1982 7: Clinical laboratory normals: California desert tortoise. PAS News, Winter 1992-1993:7 8: S AMOUR ET AL ., 1986 9: F RYE , 1994 10: S TEIN , 1996 11: M URO ET AL ., 1998 12: H EARD ET AL ., 2004 13: L ÓPEZ -O LVERA ET AL ., 2003 14: G OTTDENKER Y J ACOBSON , 1995 15: R APHAEL , 2003 16: G ELLI ET AL ., 2004 17: B RADLEY ET AL ., 1998; T URNBULL ET AL ., 2000 18: N ORTON ET AL ., 1990 19: M ONTILLA ET AL ., 2006 20: W OOD Y E BANKS , 1984 21: T URNBULL ET AL ., 2000 22: Y ANG ET AL , 2014 (Valores obtenidos tras sacar la media de los registros de diferentes estaciones) Revisión Bibliográfica 100 2.6.5.- Recuento de Trombocitos de los Quelonios La trombocitosis está asociada a la liberación de grandes cantidades de trombocitos desde la médula ósea y el bazo en hemorragias como parte del mecanismo de coagulación, o en presencia de infecciones bacterianas por su capacidad fagocitaria (M URO ET AL ., 1994). La trombocitopenia aparece fundamentalmente tras la anemia grave (F RYE , 1991; W ILKINSON , 2004) por transformación de los trombocitos maduros en células capaces de transportar hemoglobina, y también en las enfermedades mieloproliferativas (F RYE , 1991). En la Tabla 2.40 se exponen los recuentos de trombocitos en algunas especies de quelonios. Tabla 2.40. Recuento de trombocitos en algunas especies de quelonios Especie Trombocitos/µL Geochelone pardalis 1 95* Testudo hermanni 2 10000-19000 Testudo hermanni y Testudo graeca 3 8500-38100 Chelonoidis chilensis chilensis 4 13000 Caretta caretta 5 46000 (30000-60000) Chelonia mydas 6 36* *Por 100 leucocitos 1: P IENAAR , 1962; F RYE , 1991. 2: B OURDEAU , 1989; F RYE , 1991. 3: L AWRENCE Y H AWKEY , 1986. En el mes de Enero 4: T ROIANO Y S ILVA , 1998. En invierno 5: B RADLEY ET AL ., 1998 6: W OOD Y E BANKS , 1984 2.6.6.- Recuento Diferencial Leucocitario de los Quelonios Los estudios realizados en Cuora flavomarginata demuestran que los machos de esta especie presentan recuentos significativamente mayores de eosinófilos en comparación con las hembras, mientras que éstas presentan un mayor número de monocitos. A su vez, el nivel de monocitos es menor durante el verano para ambos sexos (Y ANG ET AL ., 2014). -Neutrófilo Algunos autores han descrito la presencia de neutrófilos en tortugas marinas, como Caretta caretta (G EORGE , 1996) y Chelonia mydas (W OOD Y E BANKS , 1984; A GUIRRE ET AL ., 1995). El neutrófilo de Chelonia mydas es el leucocito menos numeroso en el recuento diferencial (W OOD Y E BANKS , 1984; A GUIRRE ET AL ., 1995) aunque suele observarse un aumento de su número asociado al estrés, tanto agudo como crónico (A GUIRRE ET AL ., 1995). Sin embargo, hay que tener en cuenta que estos autores sólo usaron microscopía óptica para la identificación de los diferentes leucocitos. W ORK ET AL . (1998) en base a Revisión Bibliográfica 101 estudios ultraestructurales y citoquímicos suponen que los neutrófilos descritos por W OOD Y E BANKS (1984) en esta especie se corresponden con los eosinófilos grandes degranulados hallados en sus investigaciones. -Heterófilo Los heterófilos de Testudo graeca (L AWRENCE Y H AWKEY , 1986), Testudo hermanni (L AWRENCE Y H AWKEY , 1986; B OURDEAU , 1989; F RYE , 1991), Testudo radiata (M ARKS Y C ITINO , 1990), la tortuga terrestre de cuello largo (Chelodina longicollis) (H AIGH , 1991), Geochelone gigantea (S AMOUR ET AL ., 1986), Caretta caretta (A RNOLD , 1994; B RADLEY ET AL ., 1998; S MITH ET AL ., 2000; C ASAL Y O RÓS , 2007) y Cuora flavomarginata (Y ANG ET AL ., 2014) representan el leucocito más numeroso en el recuento diferencial leucocitario. Asimismo, los heterófilos de Gopherus agassizii representan los leucocitos más numerosos en la mayoría de los ejemplares estudiados (A LLEMAN ET AL ., 1992; G OTTDENKER Y J ACOBSON , 1995; C HRISTOPHER ET AL ., 1999; D ICKINSON ET AL ., 2002), siendo sus valores superiores a los citados para Testudo radiata (R OSSKOPF , 1982). Sin embargo, otros autores numeran en último lugar al heterófilo de Gopherus agassizii (D ESSAUER , 1970; W ALLACH Y B OEVER , 1983). En contraste, los heterófilos de Chelonoidis chilensis chilensis (T ROIANO Y S ILVA , 1998), Terrapene carolina (D ESSAUER , 1970; W ALLACH Y B OEVER , 1983; S TEIN , 1996), Gopherus polyphemus (T AYLOR Y J ACOBSON , 1982) y Testudo marginata (L ÓPEZ -O LVERA ET AL ., 2003) representan el segundo leucocito dominante en el recuento celular, similar a lo observado por otros autores (P IENAAR , 1962; S HEELER Y B ARBER , 1964; S TENROSS Y B OWMAN , 1968; S EMPLE ET AL ., 1970; F RAIR , 1972; R OSSKOPF , 1982; W OOD Y E BANKS , 1984; H ART ET AL ., 1991). En Chelonia mydas, dependiendo del autor citado, los heterófilos constituyen el tercer leucocito más numeroso (W ORK ET AL ., 1998), el segundo (A GUIRRE ET AL ., 1995), o el primer leucocito más abundante (N ORTON ET AL ., 1990). En Lepidochelys kempii los heterófilos son poco numerosos, estando precedidos por los eosinófilos y los linfocitos (C ANNON , 1992). En el caso de la tortuga marrón de río (Kachuga smithi) J AVAID Y S HARIF (1972) no encontraron heterófilos. Algunos autores describen la aparición de heteropenia durante el período de hibernación en quelonios y otros reptiles (L AWRENCE Y H AWKEY , 1986; S AAD Y E L R IDI , 1988). Así, en Testudo graeca y Testudo hermanni se observa un moderado descenso del número de heterófilos entre los meses de enero y marzo (L AWRENCE Y H AWKEY , 1986). Sin embargo, la heteropenia en reptiles suele describirse en enfermedades virales masivas (R OSSKOPF , 2000), y algunos autores la asocian a inmunosupresión (N EIFFER ET AL ., 2005). En Chelonoidis chilensis chilensis no se hallan diferencias significativas en el número de heterófilos en asociación con las variables época del año, edad o sexo (T ROIANO Y S ILVA , 1998). Tampoco en Gopherus agassizii en relación con las variables estación del año, sexo y zona de muestreo (C HRISTOPHER ET AL , 1999; D ICKINSON ET AL ., 2002). Existen variaciones en el recuento de heterófilos en respuesta a procesos patológicos. Así, se desarrolla una heterofilia de aparición rápida ante inflamaciones e infecciones bacterianas, llegando incluso a multiplicarse los recuentos de heterófilos por cinco (F RYE , 1991). En Chelonia mydas se observa una marcada heterofilia en los análisis sanguíneos realizados a las 24 horas de la captura de los ejemplares silvestres (A GUIRRE ET AL ., 1995). Este fenómeno se ha descrito también en otros reptiles (L ANCE , 1990; H AJDUK ET AL ., Revisión Bibliográfica 102 1992). Los ratios heterófilo/linfocito representan una medida del estrés crónico en algunas especies (G ROSS Y S IEGEL , 1983). Este ratio es menos variable que los números absolutos y tiene una correlación positiva con los niveles de corticosterona. Las tortugas verdes estresadas de forma crónica muestran un incremento significativo de este ratio, así como una correlación positiva con el aumento de corticosterona (A GUIRRE ET AL ., 1995). En general, la heterofilia puede ser estacional, principalmente durante la época estival, o bien debida a inflamación o infección, estrés, trauma o neoplasia. Así, las crías de Caretta caretta que resultan localmente lesionadas durante la extracción de sangre exhiben una respuesta inflamatoria que resulta en leucocitosis con heterofilia y linfopenia (B RADLEY ET AL ., 1998), similar a la respuesta observada en otros reptiles (M ITCHELL , 1996). Sin embargo, puede no observarse heterofilia en una enfermedad infecciosa. En algunas enfermedades virales o bacterianas el recuento de heterófilos puede ser bajo o normal. Los cambios tóxicos suponen un hallazgo importante en estos casos (W ILKINSON , 2004). -Eosinófilo El número de eosinófilos en las distintas especies de quelonios es muy variable. Generalmente se considera que las tortugas tienen una mayor cantidad de eosinófilos circulantes que los lagartos puesto que algunos quelonios presentan más de un 20% de eosinófilos en el recuento diferencial leucocitario (T AYLOR Y K APLAN , 1961; D UGUY , 1970; W OOD Y E BANKS , 1984; S YPEK Y B ORYSENKO , 1988; J ACOBSON ET AL ., 1990; M ARKS Y C ITINO , 1990; W RIGHT Y S KEBA , 1992; R ASKIN , 2000). Hay autores que consideran que la fórmula leucocitaria de los quelonios tiene un porcentaje aun mayor de eosinófilos (3133%) (P IENAAR , 1962; S HEELER Y B ARBER , 1964; S TENROSS Y B OWMAN , 1968; S EMPLE ET AL ., 1970; F RAIR , 1972; R OSSKOPF , 1982; W OOD Y E BANKS , 1984; H ART ET AL ., 1991). Esto es especialmente cierto para Chelonoidis chilensis chilensis, especie en la que el eosinófilo es la célula más numerosa del recuento diferencial leucocitario (T ROIANO Y S ILVA , 1998). Los eosinófilos de Testudo radiata (M ARKS Y C ITINO , 1990), Testudo graeca, Testudo hermanni (L AWRENCE Y H AWKEY , 1986) y Testudo marginata (L ÓPEZ -O LVERA ET AL ., 2003) representan el penúltimo leucocito en el recuento diferencial leucocitario, mientras que en Chelodina longicollis (H AIGH , 1991), Gopherus agassizii (R OSSKOPF , 1982; A LLEMAN ET AL ., 1992; G OTTDENKER Y J ACOBSON , 1995; C HRISTOPHER ET AL ., 1999), Elseya novaeguineae (A NDERSON ET AL ., 1997), Geochelone spp. (S AMOUR ET AL ., 1986) y Cuora flavomarginata (Y ANG ET AL ., 2014) generalmente constituyen el último leucocito. En Caretta caretta los eosinófilos representan el cuarto (B RADLEY ET AL ., 1998; S MITH ET AL ., 2000) o el tercer leucocito (A RNOLD , 1994; B RADLEY ET AL ., 1998; C ASAL Y O RÓS , 2007) en el recuento diferencial leucocitario, aunque algunos autores no los han identificado en sus recuentos (H ARMS ET AL ., 2000 B ). En Chelonia mydas constituyen el segundo (A GUIRRE ET AL ., 1995; W ORK ET AL ., 1998; W ORK Y B ALAZS , 1999), tercer (A GUIRRE ET AL ., 1995; W ORK Y B ALAZS , 1999), o bien, el tercer o cuarto leucocito (W OOD Y E BANKS , 1984). Sin embargo, en Lepidochelys kempii los eosinófilos grandes son los leucocitos más numerosos, mientras que los eosinófilos pequeños constituyen el tercer leucocito predominante (C ANNON , 1992). En algunas especies de quelonios se han descrito diferencias intersexuales en el recuento de eosinófilos. Es el caso de la tortuga negra (Chelonia mydas agassizii), en la que el número de eosinófilos del macho es inferior al de la hembra (G RUMBLES ET AL ., 1990) o Cuora flavomarginata, especie en la que ocurre justamente lo contrario (Y ANG ET Revisión Bibliográfica 109 18: M ARKS Y C ITINO , 1990 19: Y ANG ET AL , 2014 (Valores obtenidos tras sacar la media de los registros de diferentes estaciones) 20: M ONTILLA ET AL ., 2006 21: A GUIRRE ET AL ., 1995 (valores 24 horas postcaptura de los ejemplares) 22: W ORK ET AL ., 1998 23: W ORK Y B ALAZS , 1999 24: W OOD Y E BANKS , 1984 (ejemplares adultos) 25: S MITH ET AL ., 2000 26: B RADLEY ET AL ., 1998 27: A RNOLD , 1994 2.7.- LA BIOQUÍMICA SANGUÍNEA DE LOS QUELONIOS El plasma de muchos quelonios sanos puede mostrar una coloración amarilloanaranjada, pudiendo ser el resultado de la ingestión de pigmentos carotenoides de plantas, por lo que no debería ser necesariamente interpretado como un indicativo de una alteración en la degradación de la hemoglobina (N AKAMURA , 1980). La contaminación con linfa de las muestras sanguíneas en quelonios causa dilución en algunos parámetros bioquímicos (L ÓPEZ -O LVERA ET AL ., 2003). 2.7.1.- Las Proteínas Totales (Sólidos Totales) En los quelonios el plasma contiene aproximadamente 4.4 gm/dL de proteínas, con un rango de 2.9-6.1 gm/dL (D ESSAUER , 1970). La hiperalbuminemia puede ser secundaria a la deshidratación (M C A RTHUR ET AL ., 2002; W ILKINSON , 2004), hibernación o a la actividad ovárica (M C A RTHUR ET AL ., 2002). L AWRENCE (1987) afirmó que las hembras, durante la época estival, presentan un nivel de albúmina un 30% superior al de los machos, probablemente debido a la vitelogénesis. Este hecho también se ha observado en Gopherus agassizii (D ICKINSON ET AL ., 2002). Esto podría explicar los altos niveles de proteínas descritos en las tortugas blancas (Trionyx spiniferus) no hibernantes (S EIDEL , 1974). Además, durante la foliculogénesis los niveles de globulinas también pueden observarse elevados (R APHAEL , 2003). Sin embargo, Trachemys scripta y Terrapene carolina hibernantes presentan unos niveles de proteínas superiores en los meses de invierno, lo cual puede ser resultado de la hemoconcentración (H UTTON Y G OODNIGHT , 1957). Parece que la hipoalbuminemia es frecuente en animales inmaduros (W ILKINSON , 2004). Así, W HITAKER Y K RUM (1999) citan valores de albúmina en ejemplares juveniles de Caretta caretta mucho más bajos que los observados en adultos. Sin embargo, los valores de proteínas totales que se observan en las crías de Lepidochelys olivacea son similares a los observados en quelonios maduros (M OHANTY -H EJMADI , ET AL ., 1984). También se cita un descenso en los niveles de albúmina en presencia de anorexia, malnutrición, estomatitis, parasitismo intestinal y otras enteropatías (M C A RTHUR ET AL ., 2002; W ILKINSON , 2004), y se ha hipotetizado con que pueda ocurrir en enfermedad hepática, pérdida de sangre o enfermedad renal (W ILKINSON , 2004). En la Tabla 2.42 se muestran los niveles de proteínas plasmáticas de varias especies de quelonios. Revisión Bibliográfica 110 Tabla 2.42. Valores de proteínas totales plasmáticas en algunas especies de quelonios Especie PT (g/dL) Quelonios 1 5.5-7.5 Familia Testudinidae. Tortugas terrestres Clemmys muhlenbergii 4 ,machos silvestres 2.8 Clemmys muhlenbergii 4 ,hembras silvestres 2.9 Dipsochelys gigantea 5 0.5-3.8 Geochelone pardalis 7 3.2-4.9 Geochelone radiata 2 (cautivas) 3.97 Geochelone radiata 2 (silvestres) 3.3 Geochelone yniphora 2 (cautivas) 3.33 Gopherus agassizii 8 2.2-5.0 Gopherus agassizii 9 (machos) 3.4 Gopherus agassizii 10,11 3.6 Gopherus agassizii 12 2.3-5.0 Gopherus polyphemus 13 3.1 Gopherus agassizii 6 4.6 Kinixys erosa 14 6.1 ± 0.044 Malacochersus tornieri 15 2.4-4.1 Malacochersus tornieri 2 (silvestres) 3.1 Testudo sp. 1 6 3.4 Testudo graeca 1 6 3.25 Testudo graeca/hermanni 1 7 1.3-3.8 Testudo hermanni 1 8 3.1-5.4 Testudo hermanni 1 6 3.65 Testudo hermanni 3 7.3 (invierno) 8.7 (verano) Testudo horsfieldi 1 6 3.32 Testudo horsfieldi 19 4.51 Testudo marginata 2 0 2.03 Testudo marginata 1 6 3.25 Testudo radiata 2 1 4.0 Tortugas de agua dulce Cuora flavomarginata 22 5.87 (Machos) 6.27 (Hembras) Cuora trifasciata 23 5.1 Tortugas marinas Caretta caretta 24 2.0 ± 0.8 Caretta caretta 2 5 (juveniles, cautivos) 2.0 Caretta caretta 26 , edad:2 meses 1.31 Caretta caretta 26 , edad:3 meses 1.58 Caretta caretta 26 , edad:4 meses 1.69 Caretta caretta 26 , edad:5 meses 1.78 Caretta caretta 26 , edad:6 meses 1.70 Caretta caretta 26 , edad:7 meses 1.53 Caretta caretta 26 , edad:8 meses 1.32 Caretta caretta 26 , edad:9 meses 1.60 Caretta caretta 26 , edad:12 meses 3.0±1.1 Caretta caretta 27 - 30 2.0 Caretta caretta 31 4.5 Caretta caretta 32 4.0 Revisión Bibliográfica 111 Especie PT (g/dL) Caretta caretta 33 3.5 Caretta caretta 34 4.1 Caretta caretta 35 3.0 Caretta caretta 36 1.4 Chelonia mydas 37 2.6-6.9 Chelonia mydas 25 (juveniles, silvestres) 5.1 Chelonia mydas 33 3.2 Chelonia mydas 27,28,30,38,39 2.9 Chelonia mydas 40 , cautivas 4.1-5.4 Chelonia mydas 40 ,silvestres 4.3 Chelonia mydas 41 5.1 Chelonia mydas 42 , silvestres. En Oahu 4.2 Chelonia mydas 42 , silvestres. En Hawaii 5.0 Lepidochelys kempi 24 3.0-5.0 Lepidochelys kempi 26 3.2 ± 0.66 Lepidochelys kempi 43 3.1 Lepidochelys olivacea 32 3.2 Lepidochelys olivacea 44 ,crías 4.31 1: Grange Laboratories, comunicación personal, 1993. In: S. McArthur (ed.). Veterinary management of tortoises and turtles. Blackwell Science Ltd.: 117 2: R APHAEL , 2003 3: H EARD ET AL ., 2004 4: B RENNER ET AL ., 2002 5: G HEBREMESKEL ET AL ., 1991 6: California Avian Laboratory (Citrus Heights, California). In: A. M. Fudge (ed.). Laboratory Medicine (Avian and Exotic Pets). Philadelphia, W.B. Saunders Company: 375-400 7: R AITI Y H ARAMATI , 1997 8: R OSSKOPF , 1982 9: D ICKINSON ET AL ., 2002 10: R OSSKOPF , 1982 11: T AYLOR Y J ACOBSON , 1982 12: Clinical laboratory normals: California desert tortoise. PAL News, Winter 1992-1993:7 13: S AMOUR ET AL ., 1986 14: O YEWALE ET AL ., 1998 15: R APHAEL ET AL ., 1994 16: M ATHES ET AL ., 2005 17: H ARCOURT -B ROWN , 1998 18: G ÖBEL Y S PÖRLE , 1992 19: K NOTKOVA ET AL ., 2002 20: L ÓPEZ -O LVERA ET AL ., 2003 21: G OTTDENKER Y J ACOBSON , 1995 22: Y ANG ET AL , 2014 (Valores obtenidos tras sacar la media de los registros de diferentes estaciones) 23: G RIONI ET AL , 2014 24: W HITAKER Y K RUM , 1999 25: R APHAEL , 2003 26: B RADLEY ET AL ., 1998 27: F RAIR , unpublished, 1964 28: L EWIS , 1964 29: T ERCAFS ET AL ., 1963 30: T HORSON , 1968 31: A RNOLD , 1994 32: D ESSAUER , 1970 33: J ACOBSON ET AL ., 2004 (datos de Agosto del 2004) 34: B OLTEN ET AL ., 1992 35: W HITMORE , 1994 36: G ELLI ET AL ., 2004 37: B OLTEN Y B JORNDAL , 1992 38: B ERKSON , 1966 25: K HALIL , 1947 40: S WIMMER , 2000 41: L UTZ , 1990 42: A GUIRRE , 1996 43: M C G EHEE , 1979 44: M OHANTY -H EJMADI ET AL ., 1984 Revisión Bibliográfica 112 2.8.- VALORES HEMATOLÓGICOS DE LOS EMÍDIDOS (Familia Emydidae) Como ya se ha comentado anteriormente, en los quelonios el área anatómica de punción venosa puede influir en los resultados de los valores hematológicos y de algunos parámetros bioquímicos debido a contaminación linfática (L ÓPEZ -O LVERA ET AL ., 2003). Este hecho se ha descrito también en los quelonios emídidos (C RAWSHAW Y H OLZ , 1996; I NNIS ET AL ., 2007), observándose muestras sanguíneas más puras en las punciones yugulares (C RAWSHAW Y H OLZ , 1996). Asimismo, el método de recuento celular y el diluyente/colorante empleado pueden influir en el resultado de los recuentos eritrocitarios y leucocitarios (T SAI ET AL ., 2014). 2.8.1.- El Hematocrito de los Emídidos Hay autores que han descrito diferencias en el porcentaje de hematocrito asociadas al sexo, época del año, tamaño de los individuos u origen de los mismos. C HUNG ET AL . (2009) observan en Ocadia sinensis un nivel de hematocrito significativamente superior en las hembras en comparación con los machos, detectándose los registros máximos durante el mes de junio y los mínimos en noviembre. En Trachemys callirostris se constatan diferencias significativas para este valor entre machos y hembras (siendo mayor en estas últimas), entre individuos in situ y ex situ y con respecto al peso de los especímenes, observándose valores inferiores en los animales de <500grs y >1.500grs, y mayores en el grupo entre 500 y 1.500grs (C ARRASCAL -V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014). Otros autores no detectan diferencias significativas en el valor de hematocrito entre sexos (C HANSUE ET AL ., 2011). Tabla 2.43. Valores de hematocrito en algunas especies de quelonios emídidos Especie Hematocrito (%) Clemmys muhlenbergii 1 12-33 Graptemys gibbonsi 2 21.25 Hieremys annandalii 3 14.90±3,48 Mauremys caspica leprosa 4 16.29 Ocadia sinensis 5 24.25 (machos); 27.00 (hembras) Pseudemys rubriventris 6 25.67 Trachemys callirostris 7 29.91±5.04 Trachemys picta 8 22.9 Trachemys sp. 9,10 26 Trachemys scripta elegans 11 17.5 Trachemys scripta elegans 12 26 1: B RENNER ET AL ., 2002 2: P ERPIÑAN ET AL ., 2008 3: C HANSUE ET AL ., 2011 4: R APHAEL , 2003 5: C HUNG ET AL ., 2009. (Los valores se han obtenido promediando los resultados descritos para varias épocas del año) 6: I NNIS ET AL ., 2007. (Los valores se han obtenido promediando los resultados descritos) 7: C ARRASCAL -V ELAZQUEZ ET AL ., 2014 8: W ANG ET AL ., 1999 9: F RYE , 1994 10: M ARKS Y C ITINO , 1990 11: W ALLACH Y B OEVER , 1983 12: J ACKSON , 1991 Revisión Bibliográfica 113 2.8.2.- El Nivel de Hemoglobina de los Emídidos En Ocadia sinensis no se han observado diferencias entre machos y hembras en lo que respecta a los niveles sanguíneos de hemoglobina, pero sí se han detectado diferencias estacionales, con niveles más altos en los muestreos realizados durante el mes de junio (C HUNG ET AL ., 2009). En Trachemys callirostris los niveles de hemoglobina de las hembras son superiores a los de los machos, al igual que en los individuos in situ en comparación con los ex situ. Los animales con pesos <500grs y >1500grs presentan registros de hemoglobina superiores a los de los comprendidos entre los 500 y los 1500grs (C ARRASCAL -V ELÁSQUEZ ET AL ., 2014). En la Tabla 2.44 se exponen los niveles de hemoglobina de varias especies de quelonios de la familia Emydidae. Tabla 2.44. Valores de hemoglobina en varias especies de quelonios emídidos Especie Hb (g/dL) Hieremys annandalii 1 6.08±1.12 Mauremys caspica leprosa 2 (silvestres, verano) 7.69 Ocadia sinensis 3 4.87 Trachemys callirostris 4 4.0±1.0 Trachemys scripta elegans 5 8.0 Trachemys scripta elegans 6 8.0 1: C HANSUE ET AL ., 2011 2: R APHAEL , 2003 3: C HUNG ET AL ., 2009. (Los valores se han obtenido promediando los resultados descritos para varias épocas del año) 4: C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014 5: J ACKSON , 1991 6: H EARD ET AL ., 2004 2.8.3.- Índices Eritrocitarios de los Emídidos En la Tabla 2.45 se exponen los valores de los índices eritrocitarios en diversas especies de quelonios de la familia Emydidae. Tabla 2.45. Índices eritrocitarios en algunas especies de emídidos Especie MCV (fl) MCHC (gm/dL) MCH (pg) Hieremys annandalii 1 595.33±209.49 42.85±11.67 245.86±91.53 Ocadia sinensis 2 587.75 19.5 111.5 Trachemys callirostris 3 327.0±15.30 14.0±6.0 45±17.50 Trachemys scripta 4 211-296 96-118 Trachemys scripta elegans 5 310-1000 31 95-308 1: C HANSUE ET AL ., 2011 2: C HUNG ET AL ., 2009. (Los valores se han obtenido promediando los resultados descritos para varias épocas del año) 3: C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014 4: W ALLACH Y B OEVER , 1983 5: H EARD ET AL ., 2004 Revisión Bibliográfica 114 2.8.4.- Recuento Total de Eritrocitos y Leucocitos de los Emídidos Al igual que sucede en otros quelonios, en los emídidos los factores ambientales pueden influir en los recuentos de eritrocitos y/o leucocitos. Así, en Trachemys scripta el recuento de eritrocitos presenta un nivel de mayo a julio que se incrementa en septiembre, para decrecer hasta alcanzar el mínimo en diciembre y volver a incrementarse a medida que se acerca la primavera (K APLAN , 1960). Algo parecido ha descrito R APHAEL (2003) en Mauremys caspica silvestre y en Trachemys scripta elegans, observando que el recuento total de eritrocitos es mayor en otoño que en verano. Postuló que este hecho puede ser debido a una adaptación consistente en incrementar la capacidad oxigenativa de la sangre antes de la hibernación. Se ha observado hemodilución en ejemplares de Chrysemys picta expuestas al frío, y ésta ha sido achacada a la pérdida de eritrocitos circulantes en el hígado y el bazo (M USSACHIA Y S IEVERS , 1956). El recuento de eritrocitos en Ocadia sinensis es más elevado en las mediciones realizadas durante el mes de junio (C HUNG ET AL ., 2009) . En cuanto a las diferencias en el recuento de eritrocitos asociadas al sexo, hay autores que citan un mayor número de estas células en el macho, como sucede en el galápago europeo (Emys orbicularis) (D UGUY , 1970), mientras que otros han descrito justo lo contrario, como es el caso de Trachemys callirostris (C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014), o no han hallado diferencias estadísticamente significativas, como en Hieremys annandalii (C HANSUE ET AL ., 2011). En algunas especies se han descrito otros factores influyentes en el recuento de eritrocitos. Por ejemplo, en Trachemys callirostris C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL . (2014) observan niveles mayores de eritrocitos en los animales en cautividad frente a los de vida libre y también detectan diferencias en el recuento en relación al tamaño de los individuos. Los factores externos también son influyentes en el recuento de leucocitos. En Ocadia sinensis los mayores recuentos se observan en junio y los menores en noviembre (C HUNG ET AL ., 2009) . La influencia del sexo en el recuento de leucocitos varía con la especie. Así, en Hieremys annandalii los machos muestran niveles de glóbulos blancos superiores a los de las hembras (C HANSUE ET AL ., 2011), ocurriendo justo lo contrario en Trachemys callirostris (C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014). En el galápago de Muhlenberg (Clemmys muhlenbergii) el recuento total de leucocitos en los individuos cautivos es superior al de los silvestres (B RENNER ET AL ., 2002). La misma circunstancia describieron C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL . (2014) en Trachemys callirostris. En esta especie se observa que los ejemplares con pesos inferiores a 500 grs presentan recuentos leucocitarios menores que el resto de los individuos. En la Tabla 2.46 se exponen los recuentos de eritrocitos y leucocitos en varias especies de quelonios de la familia Emydidae. Revisión Bibliográfica 115 Tabla 2.46. Valores de WBC y RBC en varias especies de quelonios emídidos Especie RBC (x10 6 /µl) WBC (/µl) Clemmys muhlenbergii 1 3000-13000 Graptemys gibbonsi 2 0.37 1460 Hieremys annandalii 3 0.275±0.094 11660±6590 Ocadia sinensis 4 0.43 8625 Pseudemys rubriventris 5 12274 Trachemys callirostris 6 0.92±0.12 12100±5000 Trachemys scripta elegans 7 0.69 9700 1: B RENNER ET AL ., 2002 2: P ERPIÑAN ET AL ., 2008 3: C HANSUE ET AL ., 2011 4: C HUNG ET AL ., 2009. (Los valores se han obtenido promediando los resultados descritos para varias épocas del año) 5: I NNIS ET AL ., 2007. (Los valores se han obtenido promediando los resultados descritos) 6: C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014 7: W ALLACH Y B OEVER , 1983 2.8.5.- Recuento de Trombocitos de los Emídidos Algunos estudios hematológicos en emídidos han puesto de manifiesto la existencia de influencias externas en el recuento de trombocitos. Es el caso de Trachemys callirostris, especie en la que se ha observado un mayor número de estas células en los animales en cautividad en comparación con los individuos in situ. También se describen diferencias en el recuento en función del tamaño y el sexo. Los ejemplares con peso inferior a 500 grs muestran menor número de trombocitos. Las hembras de esta especie presentan más trombocitos que los machos (C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014). Sin embargo, en Hieremys annandalii no se aprecian diferencias estadísticamente significativas entre machos y hembras en lo que respecta al recuento de trombocitos (C HANSUE ET AL ., 2011). Tabla 2.47. Recuento de trombocitos en algunas especies de quelonios emídidos Especie Trombocitos/µL Graptemys gibbonsi 1 128.8* Hieremys annandalii 2 10970±5400 Ocadia sinensis 3 6500 Trachemys callirostris 4 15000±5400 * Por cada 100 leucocitos. 1: P ERPIÑAN ET AL ., 2008 2: C HANSUE ET AL ., 2011 3: C HUNG ET AL ., 2009. (Los valores se han obtenido promediando los resultados descritos para varias épocas del año) 4: C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014 Revisión Bibliográfica 116 2.8.6.- Recuento Diferencial Leucocitario de los Emídidos -Neutrófilo Ninguno de los estudios hematológicos en quelonios emídidos referenciados en este trabajo describe la presencia de neutrófilos en estas especies. -Heterófilo Los heterófilos se consideran más numerosos en tortugas acuáticas que en otros reptiles (F RYE , 1973). En Hieremys annandalii esta célula representa el leucocito más numeroso (C HANSUE ET AL ., 2011) y en Ocadia sinensis supone uno de los más abundantes junto con el eosinófilo (C HUNG ET AL ., 2009) . El heterófilo de Trachemys callirostris aparece como el segundo leucocito en número (C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014), al igual que en Clemmys muhlenbergii (B RENNER ET AL ., 2002) y Trachemys scripta (D ESSAUER , 1970; W ALLACH Y B OEVER , 1983). En Pseudemys rubriventris el heterófilo se clasifica como el segundo o tercer leucocito (I NNIS ET AL ., 2007) y en Graptemys gibbonsi representa el tercero en número (P ERPIÑAN ET AL ., 2008). En el caso de Emys orbicularis el heterófilo es el segundo leucocito menos numeroso (D ESSAUER , 1970). Las hembras de Trachemys callirostris muestran un porcentaje de heterófilos superior al de los machos, y los individuos de menos de 500 grs y más de 1500grs presentan recuentos inferiores que el resto de los animales. No se aprecian diferencias entre los individuos in situ y ex situ para este parámetro (C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014), al contrario de lo que ocurre en Clemmys muhlenbergii, especie en la que B RENNER ET AL . (2002) describen un mayor número de heterófilos en los animales salvajes en comparación con los cautivos. En Ocadia sinensis los registros de heterófilos en las hembras son también superiores a los de los machos, observándose los mayores recuentos en junio (C HUNG ET AL ., 2009). En Hieremys annandalii no se observaron diferencias intersexuales estadísticamente significativas para este parámetro (C HANSUE ET AL ., 2011). -Eosinófilo Algunos autores no han hallado eosinófilos en Trachemys scripta (D ESSAUER , 1970; W ALLACH Y B OEVER , 1983), mientras que en otras especies este leucocito se ha clasificado como el menos numeroso. Este es el caso de Graptemys gibbonsi (P ERPIÑAN ET AL ., 2008) y Clemmys muhlenbergii (B RENNER ET AL ., 2002). Los eosinófilos de Ocadia sinensis son uno de los leucocitos más abundantes junto con los heterófilos (C HUNG ET AL ., 2009), y en Hieremys annandalii (C HANSUE ET AL ., 2011) y Emys orbicularis (D ESSAUER , 1970) son el segundo leucocito más numeroso en el recuento diferencial leucocitario. En Trachemys callirostris los eosinófilos ocupan el tercer lugar en el recuento (C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014) y el cuarto en el caso de Pseudemys rubriventris (I NNIS ET AL ., 2007). C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL . (2014) no observan diferencias en el recuento de eosinófilos entre machos y hembras de Trachemys callirostris, pero sí describen porcentajes mayores de este leucocito en los animales cautivos frente a los silvestres y menores en el grupo de peso comprendido entre 500 y 1500 grs. C HANSUE ET AL . (2011) tampoco detectan diferencias intersexuales en el recuento de eosinófilos en Hieremys Revisión Bibliográfica 117 annandalii, mientras que C HUNG ET AL . (2009) describen que los machos de Ocadia sinensis presentan porcentajes de eosinófilos superiores a los de las hembras. En esta especie los niveles más altos de este leucocito se registran en junio y los más bajos en abril. En Clemmys muhlenbergii, de forma opuesta a lo descrito en Ocadia sinensis, son las hembras las que manifiestan mayores recuentos de eosinófilos (B RENNER ET AL ., 2002). -Basófilo En algunos emídidos, como Graptemys gibbonsi (P ERPIÑAN ET AL ., 2008) o Pseudemys rubriventris (I NNIS ET AL ., 2007), los basófilos representan el leucocito más abundante, mientras que en Clemmys muhlenbergii (B RENNER ET AL ., 2002), Hieremys annandalii (C HANSUE ET AL ., 2011) y Ocadia sinensis (C HUNG ET AL ., 2009) ocupan el tercer lugar en el recuento diferencial leucocitario. De forma opuesta, los basófilos de Trachemys callirostris aparecen como el leucocito menos abundante en esta especie (C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014). En las especies de emídidos estudiadas no se aprecian diferencias estadísticamente significativas en el recuento de basófilos entre machos y hembras (B RENNER ET AL ., 2002; C HUNG ET AL ., 2009; C HANSUE ET AL ., 2011; C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014). Sin embargo, en Ocadia sinensis se describen influencias estacionales, observándose los recuentos más bajos de basófilos en abril y los más altos en junio (C HUNG ET AL ., 2009). Trachemys callirostris no se aprecian diferencias estadísticamente significativas en los recuentos de basófilos entre animales in situ y ex situ, pero sí se observa un porcentaje menor de basófilos en los animales de menos de 500 grs (C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014). -Linfocito El linfocito se muestra como el leucocito más numeroso del recuento diferencial en algunos emídidos, como Trachemys scripta elegans (F RYE , 1976), Clemmys muhlenbergii (B RENNER ET AL ., 2002) y Trachemys callirostris (C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014). En otras especies, como Graptemys gibbonsi (P ERPIÑAN ET AL ., 2008) representa el segundo leucocito más abundante, o el segundo/tercero del recuento en el caso de Pseudemys rubriventris (I NNIS ET AL ., 2007). Los linfocitos de Hieremys annandalii (C HANSUE ET AL ., 2011) y de Ocadia sinensis (C HUNG ET AL ., 2009) ocupan el cuarto lugar del recuento diferencial leucocitario. Se han descrito diferentas intersexuales en los recuentos de linfocitos de algunas especies de quelonios de la familia Emydidae. Las hembras de Clemmys muhlenbergii muestran porcentajes de este leucocito superiores a los de los machos (B RENNER ET AL ., 2002), mientras que en Trachemys callirostris se describe lo contrario (C ARRASCAL - V ELASQUEZ ET AL ., 2014). En Hieremys annandalii (C HANSUE ET AL ., 2011) y Ocadia sinensis (C HUNG ET AL ., 2009) no se detectan diferencias estadísticamente significativas para este parámetro entre sexos. En esta última especie se aprecian influencias estacionales para el recuento de linfocitos, observándose los mayores niveles en abril y junio (C HUNG ET AL ., 2009). E N Trachemys callirostris los individuos muestreados in situ presentan porcentajes de linfocitos superiores a los de los animales ex situ, no apreciádose diferencias en relación al tamaño (C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014). Revisión Bibliográfica 118 -Monocito En la mayoría de los emídidos los monocitos son células poco abundantes. Es el leucocito menos frecuente en Pseudemys rubriventris (I NNIS ET AL ., 2007) y Ocadia sinensis (C HUNG ET AL ., 2009) y ocupan el cuarto lugar en el recuento diferencial leucocitario en Clemmys muhlenbergii (B RENNER ET AL ., 2002), Graptemys gibbonsi (P ERPIÑAN ET AL ., 2008) y Trachemys callirostris (C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014). E N Ocadia sinensis las hembras presentan niveles superiores de monocitos que los machos, observándose los mayores recuentos durante el mes de junio (C HUNG ET AL ., 2009). Por el contrario, esta célula es más abundante en los machos de Trachemys callirostris y en los individuos in situ en comparación con los ex situ, pero no se aprecian diferencias asociadas al tamaño de los ejemplares (C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014). -Azurófilo De todas las especies de emídidos expuestas en esta revisión sólo se describen azurófilos en Hieremys annandalii (C HANSUE ET AL ., 2011), si bien en Clemmys muhlenbergii se habla de monocitos azurofílicos (B RENNER ET AL ., 2002). En Hieremys annandalii,el azurófilo representa el último leucocito en frecuencia del recuento diferencial leucocitario y los machos muestran un mayor número de estas células que las hembras (C HANSUE ET AL ., 2011). Tabla 2.48 Recuentos diferenciales leucocitarios de varias especies de quelonios emídidos Especie Heterófilo (%) Eosinófilo (%) Basófilo (%) Linfocito (%) Monocito (%) Azurófilo (%) Clemmys muhlenbergii 1 11-54 0-22 2-38 14-71 0-34 Emys orbicularis 2 - 5 2-21 12-89 0-25 45-76 0-1 Emys orbicularis 6 2-21 2-89 0-25 45-76 0-1 Graptemys gibbonsi 7 13.25 3.25 47.5 25.25 6.25 Hieremys annandalii 8 29.4±6.88 23.69±5.30 21.23±1.90 14.81±5.88 10.73±5.29 Ocadia sinensis 9 2925* 2506M/2011H* 1311* 1148.75* 167.5* Pseudemys rubriventris 10 2457* 686.33* 5109.67* 2965* 38.5* Trachemys callirostris 11 23.64±5.62 22.75±6.22 3.59±1.48 34.83±5.48 15.19±3.89 Trachemys scripta 6,12 34 1.5 39.5 1 * Leucocito/µL; Macho (M), Hembra (H) 1: B RENNER ET AL ., 2002 2: A LDER Y H UBER , 1923 3: B ABUDIERI , 1930 4: S ALGUES , 1937 5: D UGUY , 1967 6: D ESSAUER , 1970 7: P ERPIÑAN ET AL ., 2008 8: C HANSUE ET AL ., 2011 9: C HUNG ET AL ., 2009. (Los valores se han obtenido promediando los resultados descritos para varias épocas del año) 10: I NNIS ET AL ., 2007. (Los valores se han obtenido promediando los resultados descritos) 11: C ARRASCAL -V ELASQUEZ ET AL ., 2014 12: W ALLACH Y B OEVER , 1983 Material y Métodos 125 Tomando como referencia los 30 animales muestreados en las dos estaciones, se evidencia un aumento estadísticamente significativo de los tamaños y pesos en verano en comparación con el invierno anterior para ambos sexos (Tabla 3.3). Esto es normal para animales que aún se encuentran en edad de crecimiento, como es el caso. Asimismo, el tamaño medio de las hembras es superior al de los machos. Esto se explica parcialmente porque la edad media de las hembras en estudio es mayor a la de los machos, pero en esta especie además, se ha descrito que las hembras tienden a alcanzar tamaños superiores a los de los machos en condiciones fisiológicas (B ROTÓNS , 2007). Tabla 3.3. Diferencias de tamaño y peso para los ejemplares de Trachemys scripta scripta entre las dos estaciones de muestreo para ambos sexos Estación Variables Machos N = 13 Hembras N = 17 P-valor INVIERNO Edad, años 5 6 – 9 ≥ 10 10 (76.9%) 2 (15.4%) 1 (7.7%) 2 (11.8%) 7 (41.2%) 8 (47.1%) .001 Peso, kg 0.45 ± 0.23 * 1.10 ± 0.48 † < .001 Altura, cm 5.34 ± 0.92 * 7.26 ± 1.34 † < .001 Longitud lineal, cm 13.2 ± 2.0 * 18.0 ± 3.7 † < .001 Anchura lineal, cm 11.0 ± 1.4 * 14.1 ± 2.5 † < .001 Longitud curva, cm 14.6 ± 2.6 * 19.9 ± 3.7 † < .001 Anchura curva, cm 13.9 ± 2.4 * 19.0 ± 3.7 † < .001 VERANO Edad, años 5 6 – 9 ≥ 10 9 (69.2%) 3 (23.1%) 1 (7.7%) 2 (11.8%) 7 (41.2%) 8 (47.1%) .004 Peso, kg 0.53 ± 0.25 * 1.19 ± 0.46 † < .001 Altura, cm 5.58 ± 0.96 * 7.40 ± 1.24 † < .001 Longitud lineal, cm 13.7 ± 2.1 * 18.5 ± 3.3 † < .001 Anchura lineal, cm 11.3 ± 1.4 * 14.4 ± 2.3 † < .001 Longitud curva, cm 15.3 ± 2.4 * 20.3 ± 3.4 † < .001 Anchura curva, cm 14.3 ± 2.2 * 19.3 ± 3.5 † < .001 Los datos son medias ± SD (*) Indica diferencias significativas en machos entre estaciones (p < 0.05) (†) Indica diferencias significativas en hembras entre estaciones (p < 0.05) Nótese que todas las medidas biométricas han experimentado un incremento estadísticamente significativo en machos (*) y en hembras (†) del invierno al verano. Los datos se analizaron utilizando el paquete R, versión 3.1.0 (R Development Core Team, 2014). Material y Métodos 126 Las medidas del caparazón de los ejemplares en estudio se realizaron con un pie de rey en el caso de la Alt C, la LRC y la ARC, y con una cinta métrica flexible para la LCC y la ACC. Los pesos se obtuvieron mediante el uso de una báscula Blauscal® GRAM PRECISION SL, con una ponderación mínima de 1 gramo. Para la determinación de las características citoquímicas y morfológicas y de los tamaños de las células sanguíneas de Trachemys scripta scripta, se emplearon las muestras de sangre obtenidas durante el invierno de 2012-2013 de 15 de los 31 ejemplares en estudio, 7 machos (Nº identificación: 9, 10, 11, 19, 20, 24, 39) y 8 hembras (Nº identificación: 12, 13, 16, 17, 18, 21, 40, 43). Para el desarrollo de la descripción ultraestructural de las células sanguíneas de Trachemys scripta scripta, se emplearon muestras de sangre obtenidas durante el verano de 2013 de 10 de los 31 ejemplares en estudio, 5 machos (Nº identificación: 9, 10, 11, 32, 33) y 5 hembras (Nº identificación: 12, 13, 16, 27, 28). Para el establecimiento de los parámetros hematológicos normales de Trachemys scripta scripta en dos estaciones diferenciadas (invierno y verano), se empleó la totalidad de los individuos en estudio en ambas estaciones, a excepción del animal Nº 18, que fue descartado para su inclusión en el estudio hematológico debido a que manifestaba claros signos de enfermedad en el momento del muestreo veraniego. Esto no impidió que fuera incluido en el estudio citoquímico y morfológico realizado el invierno anterior, ya que en aquel momento, tras una exhaustiva exploración, se consideró como un individuo clínicamente sano (Tablas 3.1 y 3.2). 3.2.- OBTENCIÓN DE MUESTRAS SANGUÍNEAS Dependiendo del número de pruebas al que estuviera destinada la sangre de los especimenes, se obtuvo una cantidad mínima de 0.1ml y máxima de 0.5ml de sangre. La extracción se llevó a cabo en la vena coccígea dorsal, evitando la extracción de líquido linfático (los vasos linfáticos de esta región anatómica están muy desarrollados y próximos al sistema venoso) y descartando las muestras contaminadas con dicho líquido (F RYE , 1991; M AUTINO Y P AGE , 1993; C RAWSHAW Y H OLZ , 1996; R EDROBE Y M AC D ONALD , 1999; L ÓPEZ -O LVERA ET AL ., 2003; I NNIS ET AL ., 2007). Se optó por este sitio de punción venosa porque, pese a existir mayor riesgo de hemodilución linfática que en la punción yugular (C RAWSHAW Y H OLZ , 1996), el procedimiento resultaba más sencillo, debido a que esta especie de quelonio tiende a mostrarse agresiva ante la manipulación y el uso de la vía yugular para la obtención de sangre resultó virtualmente imposible en la mayoría de los individuos no sedados, y se quería evitar el tener que recurrir al uso de anestésicos. Asimismo, resultó relativamente sencillo detectar el momento en el que se producía una contaminación linfática, procediendo entonces a realizar una nueva extracción en un área más distal o proximal de la cola. Sin embargo, al igual que afirmaron I NNIS ET AL ., (2007), no se puede descartar por completo la existencia de contaminaciones linfáticas moderadas en algunas de las muestras obtenidas. La punción venosa se realizó con jeringuillas de insulina de 1ml con agujas de 30Gx1/2” estériles. Material y Métodos 127 Acto seguido a la extracción de la sangre, se procedió a la preparación de los frotis sanguíneos. Para el recuento diferencial leucocitario se realizaron 2 frotis por animal y estación. Los frotis de 15 de los animales muestreados en invierno se utilizaron a su vez para la caracterización morfológica y la determinación de las medidas celulares. A partir de la sangre de esos mismos 15 ejemplares se realizaron 2 frotis más para cada una de las 7 técnicas citoquímicas en estudio y sus variantes, es decir, un total de 18 frotis por animal. Por motivos logísticos relacionados con el procesado de los frotis, la obtención de las muestras destinadas a la realización de las técnicas citoquímicas se realizó en 7 días diferentes dentro de la estación invernal. Para la preparación de las extensiones se emplearon dos portaobjetos (técnica portaporta) de bordes romos y pulidos para minimizar así el riesgo de rotura celular (H AWKEY Y D ENNET , 1989). Las extensiones se realizaron inmediatamente después de la obtención de la muestra sanguínea, evitando así el uso de anticoagulantes (C AMPBELL , 1996 B ; B RADLEY ET AL ., 1998). A este respecto, debe destacarse que se ha descrito que la heparina tiende a generar una coloración azul en los frotis sanguíneos procesados con las tinciones tipo Romanowsky, además de predisponer a la agregación de plaquetas y leucocitos (H AWKEY Y D ENNET , 1989). A continuación se realizaron los hematocritos, dos por cada animal y estación, mediante el método del microhematocrito (C AMPBELL , 1996 B ). La sangre remanente se depositó en tubos con heparina de litio y se conservó en refrigeración a unos 4º C, para posteriormente emplearla en la determinación del recuento total de eritrocitos, leucocitos y trombocitos y en la medición del nivel de hemoglobina. Se eligió como anticoagulante la heparina de litio debido a que el EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), que es el anticoagulante más usado en mamíferos, tiende a generar hemólisis en las muestras de algunas especies de reptiles, especialmente en quelonios (P ALOMEQUE ET AL ., 1977; J ACOBSON , 1987; H AWKEY Y D ENNET , 1989; G RUMBLES ET AL ., 1990; F RYE , 1991; A LLEMAN ET AL ., 1992; B OLTEN ET AL ., 1992; J ACOBSON , 1992; M ARTÍNEZ -S ILVESTRE , 1994; F RYE , 1995; C AMPBELL , 1996 B , C ; W ATSON , 1997; M URO ET AL ., 1998; H ANLEY ET AL ., 2004; H EARD ET AL ., 2004). 3.3.- MICROSCOPÍA ÓPTICA RUTINARIA Una vez obtenidas las extensiones sanguíneas se dejaron secar al aire durante aproximadamente una hora, tiempo tras el cual se procedió a su procesado con las tinciones hematológicas correspondientes. Se ha descrito que la morfología celular se preserva mejor cuando los frotis son fijados y teñidos en un corto plazo tras su elaboración (R APHAEL , 2003). Las extensiones sanguíneas destinadas al recuento diferencial leucocitario, caracterización morfológica y medidas celulares, fueron procesadas con una tinción rápida tipo Romanowsky (W ALLACH Y B OEVER , 1983). Concretamente se empleó el panóptico rápido o Diff quick  (DQ) (Panreac Química S.A.U. Barcelona, España). Este método proporciona la suficiente calidad tintorial a la extensiones sanguíneas como para llevar a cabo una correcta identificación y caracterización celular (B ARROWS , ET AL ., 2004; L ASSEN Material y Métodos 128 Y W EISER , 2004). Además, el Diff quick  ha sido empleado por múltiples autores para evaluar las células sanguíneas en quelonios (L ÓPEZ -O LVERA ET AL ., 2003; G ELLI ET AL ., 2004; M ONTILLA ET AL ., 2006; C ASAL Y O RÓS , 2007), incluyendo algunas especies de emídidos (I NNIS ET AL ., 2007; C HANSUE ET AL ., 2011). Esta técnica es una modificación de la tinción de Wright, que reduce el tiempo del procedimiento original de cuatro minutos a quince segundos, aproximadamente. La tinción se lleva a cabo en 3 pasos (V IVES Y A GUILAR , 1988 A ); 1. El frotis sanguíneo se fija introduciéndolo en disolución metílica de triarilmetano durante 5 segundos u 8 inmersiones. 2. Se retira el exceso de fijador sin aclarar y se introduce el frotis en el primer colorante, una solución tamponada de xanteno, que se corresponde con la tinción ácida de eosina (color rojo), durante 5 segundos u 8 inmersiones. 3. Se retira el exceso de colorante sin aclarar y se introduce el frotis en el segundo colorante, una solución tamponada de tiazina, que se corresponde con la tinción alcalina de hematoxicilina (color azul), durante 5 segundos u 8 inmersiones. A continuación, el porta se aclara suavemente con agua corriente hasta que ésta se vuelve cristalina y finalmente la preparación se deja secar al aire. Una vez secas, las preparaciones se montaron sellándolas con un cubreobjetos unido al porta mediante un adhesivo con base de xilol, para de esta manera evitar el deterioro de la preparación. Finalmente, los frotis fueron valorados en un microscopio Nikon Eclipse E400 bajo el objetivo de 100 aumentos (1000x), usando aceite de inmersión. En aquellos casos en los que era necesario tomar imágenes de las preparaciones, se empleó una cámara de fotos digital Olympus SC 30 acoplada al microscopio. 3.4.- DETERMINACIÓN DE LAS DIMENSIONES CELULARES Para establecer el tamaño celular y nuclear de las células sanguíneas de Trachemys scripta scripta (eritrocitos, leucocitos y trombocitos), se empleó el programa informático de análisis de imagen Image-Pro  Plus Software, Version 4.5 (Media Cybernetics  ). Como base para la realización de las medidas, se emplearon imágenes tomadas con la cámara Olympus SC 30 a 100 aumentos, a partir de las preparaciones sanguíneas procesadas con Diff quick  de 15 de los individuos muestreados en invierno. Para cada ejemplar se midieron 20 eritrocitos y al menos 10 heterófilos, 10 eosinófilos, 10 basófilos, 10 linfocitos y 10 monocitos. En el caso de los trombocitos, se decidió distinguir entre trombocitos “normales” y trombocitos “pleomórficos”, caracterizados por su morfología irregular, por lo que se midieron al menos 10 células de cada uno de los dos tipos por animal. La unidad de medida empleada fue el micrómetro (µm) y las medidas usadas para establecer el tamaño celular y nuclear fueron el área, el perímetro, el diámetro mayor y el diámetro menor. Material y Métodos 129 3.5.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LAS DIMENSIONES CELULARES Las variables se resumieron en medias y desviaciones estándar (SD) para cada uno de los parámetros en estudio. Dado que las medias están anidadas en los animales, la comparación de medias según sexo se realizó utilizando los modelos de efectos mixtos (L AIRD Y W ÄRE , 1982). Un contraste de hipótesis se consideró estadísticamente significativo cuando el correspondiente p-valor fue inferior a 0.05. Los datos se analizaron utilizando el paquete R, versión 3.1.0 (R Development Core Team, 2014). 3.6.- TÉCNICAS CITOQUÍMICAS Para la realización de las técnicas citoquímicas se emplearon las extensiones sanguíneas obtenidas de 15 de los animales muestreados en invierno; 2 preparaciones por animal y técnica, es decir, 18 extensiones por animal, teniendo en cuenta que se llevaron a cabo 7 técnicas citoquímicas, dos de ellas a su vez divididas en dos variantes, necesitando por tanto dos preparaciones para cada una de estas variantes. Las técnicas citoquímicas realizadas fueron (A LLEMAN ET AL ., 1992; W ORK ET AL ., 1998; C ASAL Y O RÓS , 2007): o Fosfatasa ácida (ACP) -Con inhibición de tartrato -Sin inhibición de tartrato o Bencidina peroxidasa (PER) o α αα α-Naftil butirato esterasa (NBE) -Con inhibición de fluoruro -Sin inhibición de fluoruro o Cloroacetato esterasa (CAE) o Sudán negro B (SBB) o Ácido periódico de Schiff (PAS) o Azul de toluidina (AT) Para la elaboración de todas las técnicas citoquímicas, a excepción de las técnicas NBE y AT, se usaron los protocolos del fabricante de los reactivos (SIGMA-ALDRICH  INC) incluidos en los kits comerciales y, como apoyo complementario, los descritos por otros autores (J AIN , 1986 A ; V IVES Y A GUILAR , 1988 B ). Como mecanismo de control de la correcta realización de las técnicas citoquímicas, dado que los kits comerciales están estandarizados para su uso en humana, se realizaron preparaciones de sangre humana para todas las tinciones, comprobando que los resultados obtenidos fueran los mismos que los esperados para cada técnica. Material y Métodos 130 3.6.1.- Fostatasa Ácida (ACP) Esta técnica citoquímica se emplea para la detección a nivel citológico de actividad fosfatasa ácida en los leucocitos. -Principio Se basa en el uso del naftol AS-BI fosfato y de la sal Fast Garnet GBC. Depende de las sales de diazonio (cloruro de diazonio) que se forman tras hacer reaccionar una arilamina con nitrito sódico en un medio ácido, originando depósitos coloreados altamente insolubles (B URSTONE , 1962). El ácido tartárico se emplea para detectar la existencia de resistencia al tartrato por parte de la fosfatasa ácida. Los frotis sanguíneos se incuban en una solución que contiene naftol AS-BI ácido fosfórico y sal Fast Garnet GBC. Los frotis se pueden tratar con L(+)-tartrato. El naftol AS-BI, liberado por hidrólisis enzimática, forma complejos rápidamente con la sal Fast Garnet GBC originando depósitos insolubles de color marrón en los lugares de actividad enzimática. Las células que contienen fosfatasa ácida sensible al ácido tartárico no demuestran actividad, mientras que las que poseen fosfatasa resistente al ácido tartárico no se ven afectadas por su uso. -Procedimiento 1.- Fijación: - Solución fijadora: Se mezclan 25ml de solución citrato, 65ml de acetona y 8ml de formaldehído al 37% - Los frotis se fijan durante 30 segundos a temperatura ambiente (18-26º C) y posteriormente se aclaran bien con agua desionizada. 2.-Tinción: - Se toman dos tubos de ensayo y a cada uno se le añaden 0,5ml de solución base de Fast Garnet y 0,5ml de solución de nitrito sódico. Se mezcla cuidadosamente durante 30 segundos y se deja reposar 2 minutos. - Se toman dos cubetas de 100ml (cubetas A y B) y se introduce, al mismo tiempo que se mezcla; Cubeta A (Sin tartrato) Cubeta B (Con tartrato) Agua desionizada precalentada a 37º C 45ml 45ml Solución preparada en paso anterior 1.0ml 1.0ml Solución Naftol AS-BI fosfato 0.5ml 0.5ml Solución de acetato 2.0ml 2.0ml Solución de tartrato ------------------- 1.0ml - Etiquetar como A y B dos vasos Coplin y transferir a ellos las soluciones de las cubetas correspondientes. Mantener a 37º C en baño María. - Introducir los portaobjetos (duplicados para cada variante de la técnica) e Material y Métodos 131 incubar durante 1 hora a 37º C protegidos de la luz. (Cada vez que se vayan a incubar nuevas muestras se debe renovar la solución). - Aclarar bien los portas con agua desionizada y contrateñir durante 2 minutos en solución de hematoxilina de Gill Nº 3. - Aclarar en agua alcalina del grifo durante varios minutos para azular los núcleos. - Secar al aire. No se recomienda usar un medio de montaje para evitar que se dañen las características tintoriales. -Observaciones esperadas Los portas se evalúan subjetivamente por la presencia o ausencia de la enzima resistente al tartrato. La actividad fosfatasa ácida se manifiesta como gránulos de color púrpura y/o rojo oscuro en los leucocitos y una reacción se considera positiva en el frotis cuando existen más de dos células con actividad difusa e intensa, es decir, más de 40 gránulos positivos (S UN , 1985). En humana, en ausencia de ácido tartárico, muchos leucocitos muestran zonas granulares de actividad enzimática. En presencia de tartrato, puede observarse algún gránulo ocasional en los linfocitos y en algunos macrófagos especializados (S UN , 1985), pero normalmente son las células polimorfonucleares las que se muestran positivas (V IVES Y A GUILAR , 1988 B ). 3.6.2.- Bencidina Peroxidasa (Mieloperoxidasa) (PER) Es un sistema de tinción citoquímica utilizado en humana para caracterizar polimorfonucleares en frotis de sangre o de médula ósea. -Principio La diaminobencidina (DAB) se usa como sustituto de la bencidina para la citoquímica de la peroxidasa (mieloperoxidasa). Tiene menos poder tintorial que la bencidina (G RAHAM Y K ARNOVSKY , 1966 A , B ), lo que hace que sea menos atractiva para las técnicas histoquímicas. Sin embargo, algunos autores han mejorado la metodología DAB haciendo a esta enzima más útil para diferenciar a los granulocitos y sus precursores y a los monocitos de las células de origen linfoide (H ANKER ET AL ., 1978, 1979, 1980; H ANKER Y G IAMMARA , 1991). Acorde a su modificación, el producto de reacción de color marrón se intensifica en primer lugar con las sales de cobre, seguido por la aplicación de la tinción de Papanicolaou modificada por Gill, provocando gránulos de coloración grisnegra intensa en los lugares de actividad mieloperoxidasa en neutrófilos y monocitos (G ILL ET AL ., 1974). El procedimiento de SIGMA-ALDRICH  es similar al desarrollado por H ANKER ET AL . (1978, 1979, 1980) y H ANKER Y G IAMMARA (1991), involucrando las siguientes reacciones: DAB + H 2 O 2 DAB oxidada (pigmento marrón claro) PM DAB oxidada + Cu (NO 3 ) 2 Pigmento gris-negro Material y Métodos 132 Cuando se usa la tinción de Papanicolaou modificada por Gill el producto de reacción se intensifica y tiñe de un color característico a los neutrófilos, eosinófilos y basófilos. -Procedimiento 1.- Fijación: - Solución fijadora: Se emplea la solución glutaraldehído-acetona. Se obtiene mezclando 25ml de acetona de grado reactivo y 75ml de solución de glutaraldehído. - Los frotis se fijan durante 1 minuto a una temperatura de 4-8º C y posteriormente se aclaran 30 segundos en agua desionizada 2.- Tinción: - Incubar durante 45 segundos en solución Diaminobenzidina/Peróxido¹ (para cada cambio de muestras se renueva la solución) - Aclarar brevemente (30 segundos) con agua desionizada - Sumergir en solución de nitrato cúprico² 2 minutos aplicando una suave agitación (para cada cambio de muestras se renueva la solución) - Aclarar brevemente (30 segundos) con agua desionizada - Sumergir en solución de hematoxicilina de Gill Nº 3 durante 8 segundos ó 4 inmersiones. Filtrar previamente la solución - Aclarar en agua desionizada 5 segundos, con agitación, cambiándola dos veces - Sumergir durante 12 segundos ó 6 inmersiones en la solución de trabajo de concentrado de Scott sustituto del agua corriente³ - Aclarar en agua desionizada 5 segundos cambiándola dos veces - Sumergir en solución de EA modificada de Gill durante 1 minuto - Aclarar en etanol al 95% 3 segundos, cambiando 2 veces - Aclarar en etanol absoluto 3 segundos, cambiando 2 veces - Aclarar en xilol 3 segundos, cambiando 3 veces - Dejar secar y montar con un medio de montaje permanente con base de xilol o Solución Diaminobenzidina/Peróxido¹. - Se preparan 50ml de solución de trabajo Trizmal, mezclando 5ml de tampón Trizmal y 45ml de agua desionizada - Se añade un vial de diaminobenzidina - Se añaden 0.5ml de peróxido de hidrógeno al 1% y se mezcla bien o Solución de nitrato cúprico². - Se disuelve un vial de nitrato cúprico en 250ml de agua desionizada o Solución de trabajo de concentrado de Scott sustituto del agua corriente³. - Se mezclan 5ml de concentrado de Scott y 45ml de agua desionizada Material y Métodos 133 -Observaciones esperadas En muestras humanas, los neutrófilos y sus precursores presentan una granulación intracelular gris-negra. Los monocitos se tiñen de forma menos intensa, mientras que los eosinófilos se tiñen rojo-naranja. Los basófilos adquieren una coloración azul y los linfocitos son negativos. 3.6.3.- α-Naftil Butirato Esterasa (NBE) (A NSLEY Y O RNSTEIN , 1970) Esta técnica está orientada a detectar actividad esterasa en algunos linfocitos, principalmente células T maduras, aunque también permite demostrar una actividad esterasa inespecífica en monocitos y macrófagos. -Principio Las esterasas no específicas hidrolizan ésteres sintéticos, como el α-naftil acetato o butirato, liberando α-naftol, que forma un complejo con las sales diazonio originando un producto coloreado insoluble en el lugar de la actividad enzimática o adyacente al mismo (K ASS , 1979). -Procedimiento En su mayor parte se siguieron las pautas del fabricante (SIGMA-ALDRICH  ), salvo para el paso de la inhibición por fluoruro (V IVES Y A GUILAR , 1988 B ). 1.- Fijación: - Solución fijadora: Se emplea el fijador citrato-acetona-formaldehído. Se mezclan 25ml de solución citrato, 65ml de acetona y 8ml de formol al 37%. - Se fijan los portas durante 10 segundos a temperatura ambiente (23-26º C) y se aclaran con agua desionizada durante 45 segundos, dejándose secar al aire durante al menos 45 minutos. 2.- Tinción: - Se prepara una solución tampón fosfato; se disuelve el contenido de un bote de tampón fosfato en 500ml de agua desionizada - Se prepara una solución de tabletas de nitrito sódico; se disuelve una tableta en 6.25ml de agua desionizada - Se añaden 1.5ml de solución de tabletas de nitrito sódico a 1.5ml de solución de pararosalinina. Se mezcla cuidadosamente y se deja reposar al menos 5 minutos - Precalentar 40ml de tampón fosfato a 37º C y añadir a la solución anterior - Añadir 5ml de solución α-naftil butirato y mezclar bien. Decantar en un vaso Coplin. La solución deberá tener un color ámbar - Colocar las muestras en la solución e incubar durante 1 hora a 37º C - Para realizar la inhibición con fluoruro, se añaden a la solución anterior 72mg de fluoruro sódico y se incuban las muestras 1 hora a 37º C. (En Material y Métodos 134 ambos casos se debe preparar una nueva solución de incubación cada vez que se realice un cambio de muestras) - Aclarar con agua corriente del grifo 2-3 minutos y dejar secar al aire al menos 15 minutos - Añadir 5ml de azul de metileno a 45ml de agua desionizada y contrateñir durante 5 minutos - Lavar con agua desionizada y dejar secar. No se recomienda usar un medio de montaje para evitar que se dañen las características tintoriales. -Observaciones esperadas En humana se considera que la reacción es positiva en todos los elementos pertenecientes al sistema mononuclear fagocítico (A NSLEY Y O RNSTEIN , 1970; V IVES Y A GUILAR , 1988 B ). Así, los monocitos muestran una coloración rojo-marrón y los linfocitos (células T maduras) presentan un patrón de tinción focal (puntos) rojo-marrón. En contraste con los linfocitos, la actividad enzimática en los monocitos es sensible al fluoruro (A NSLEY Y O RNSTEIN , 1970). 3.6.4.- Naftol Cloroacetato Esterasa (CAE) Esta técnica citoquímica se emplea en humana con la finalidad de demostrar citológicamente la presencia de esterasas específicas y no específicas en los leucocitos. -Principio Las esterasas celulares son ubicuas, representando una serie de enzimas que actúan sobre ciertos substratos. Bajo determinadas condiciones de reacción es posible diferenciar los tipos celulares usando substratos específicos para esterasas. Los métodos descritos otorgan a los leucocitos granulocíticos unas características hematológicas que los hacen discernibles de los monocitos (B URSTONE , 1957; M OLONEY ET AL ., 1960; Y AM ET AL ., 1971; C AWLEY Y H AYHOE , 1972; B EARD Y F AIRLY , 1974; B ECKMANN ET AL ., 1974, Y AM ET AL ., 1974; B ENNET Y R EED , 1975). Para llevar a cabo la técnica, los frotis de sangre, de médula ósea o las preparaciones tisulares, se incuban con el naftol AS-D cloroacetato (NCAE) y con la presencia de una sal diazonio recién preparada. Como consecuencia, se forma un complejo con la sal diazonio que genera depósitos muy coloreados en los lugares de actividad enzimática. Los procedimientos más recientes, como el de SIGMA-ALDRICH  , incorporan sales diazonio estables. Estas sales se forman al reaccionar una arilamina con nitrito sódico en un medio ácido (B URSTONE , 1962), dando como resultado el cloruro de diazonio (usualmente inestable), que puede tratarse con determinados compuestos (cloruro de zinc, sulfato de zinc o naftaleno-1-6-disulfonato) originando sales estables. Los citados estabilizantes pueden producir una marcada inhibición de algunos sistemas enzimáticos, mientras los cloruros de diazonio son menos inhibitorios (B URSTONE , 1962). Bibliografía 237 10.- BIBLIOGRAFÍA A DNYANA , W., L ADDS , P. W. Y B LAIR , D. 1997. Observations of fibropapillomatosis in green turtles (Chelonia mydas) in Indonesia. Australian Veterinary Journal, 10: 737-742. A GID , R., S AINT G IRONS , H., M ARTOJA , M. Y D UGUY , R. 1961. Influence de la temperature et des facteurs endocrines dans la glucoregulation chez Vipera aspis. Role de l`adrenaline. Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances de L Academie des Sciences, Paris, 252: 2007-2009. A GUIRRE , A. 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