Efecto de la inhibición de la isoprenilación de la proteína RhoA por las estatinas lipofílicas sobre la supervivencia celular de líneas celulares de condrosarcoma

Tesis Doctoral Efecto de la inhibición de la isoprenilación de la proteína RhoA por las estatinas lipofílicas sobre la supervivencia celular de líneas celulares de condrosarcoma. Tesis Doctoral presentada por D. Ulises Torres López, Licenciado en Medicina y Cirugía para optar al grado de Doctor. DIRECTOR: Dr. José Manuel García Castellano UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Departamento de Ciencias Médicas y Quirúrgicas Facultad de Ciencias de la Salud Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extienden el presente certificado en Las Palmas de Gran Canaria a 08 de abril de 2015. AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS En este apartado quisiera empezar por mi familia, en especial, a mi madre. Sin tu apoyo incondicional, todo esto hubiera seguido otro curso. Para ti también este premio. En segundo lugar a mi director de Tesis al Dr. José M. García Castellano, desde que comenzamos este proyecto juntos hasta hoy, nunca hemos perdido la ilusión y la esperanza pese a las adversidades. Por su asesoramiento y tutela durante el desarrollo de este trabajo y por su inestimable ayuda a la hora de analizar los datos obtenidos. Gracias por confiar en mí y despertar el investigador que llevaba dentro. Quiero hacer mención especial a los que iniciaron la andadura de esta línea de trabajo y gracias a los que hemos podido llegar a buen puerto, especialmente a la Dra. Ainara Arín Martínez, al Dr. Rubén Pérez Machín, al Dr. Octavio Hernández Perera y a la Dra. Pilar Fernández Valerón. Quisiera expresar y agradecer la buena disposición de los distintos centros donde he desarrollado parte de mi doctorado: al Departamento de Ciencias Médicas y Quirúrgicas de la U.L.P.G.C.; al Departamento de Farmacología de la Facultad de Ciencias de la Salud, de la U.L.P.G. C.; y a la Unidad de Apoyo a la Investigación del C.H.U.I.M.I Un agradecimiento muy especial merecen aquellas personas que han demostrado ser pacientes y comprensivas así como el ánimo recibido. A todos ellos, muchas gracias RESUMEN RESUMEN Los condrosarcomas son tumores de origen mesenquimal con un elevado grado de agresividad debido a la resistencia inherente a la quimioterapia y a la radioterapia. La única opción en la actualidad es la cirugía radical, habitualmente responsable de una elevada morbilidad debido a que suele ser muy mutilante. Estos hechos obligan a la búsqueda de alternativas terapéuticas que proporcionen soluciones a esta patología. Las estatinas, inhibidores de la enzima hidroxi-metil-glutarilCoenzima A reductasa, son fármacos utilizados habitualmente para el tratamiento de los elevados niveles de colesterol plasmático. Sin embargo, cada vez existen más evidencias de su utilidad como fármacos útiles en el tratamiento de numerosas neoplasias. En el presente trabajo que se presenta como Tesis Doctoral se ha estudiado el efecto in vitro de las estatinas sobre la viabilidad celular, la inducción de apoptosis celular y las modificaciones en la prenilación de la proteína RhoA en líneas celulares de condrosarcoma. Hemos observado que las estatinas lipofílicas inducen un descenso de la viabilidad celular, una inducción de muerte celular por apoptosis, con alteración concomitante en la prenilación de la proteína RhoA, que se encuentran downstream en la vía del mevalonato. Aunque se trata de un estudio in vitro, este trabajo abre una vía prometedora para el tratamiento de estos tumores tan agresivos. Sin embargo, aun deben ser confirmados estos resultados en el animal de experimentación para, posteriormente, plantear un ensayo en humanos. INDICE DE TABLAS 1 INDICE DE TABLAS PÁGINA Tabla 1. Posibles vías moleculares que representan nuevas opciones terapéuticas en el condrosarcoma convencional. 17 Tabla 2: Propiedades farmacocinéticas clínicas de los inhibidores de la HMGCoA reductasa. 22 Tabla 3. Diferencias generales entre apoptosis y necrosis. 30 Tabla 4. Relación de estatinas usadas, casas comerciales y dosis usadas en estos experimentos. 38 Tabla 5. Valores de las IC50 de las líneas tumorales LTC y C422 frente al control NIH3T3. 48 Tabla 6. Representación de la sensibilidad a las estatinas (IC50) en la línea de condrosarcoma humano SW1353. 54 Tabla 7. Porcentaje de células positivas para DAPI en tratamiento con simvastatina en condrosarcoma de rata. 59 Tabla 8. Porcentaje de células anexina V+/IP+ respecto a la situación control tras tratamiento con simvastatina, con GGTI y con FTI en células de condrosarcoma humano. 67 Tabla 9. Porcentaje de células anexina V+/IP+ respecto a la situación control tras tratamiento con simvastatina y a lo largo de diferentes tiempos en el condrosarcoma humano. 68 INDICE DE FIGURAS 2 INDICE DE FIGURAS PÁGINA Figura 1. Imagen radiológica radio-opaca de aspecto moteado. 8 Figura 2. Imagen macroscópica. Tumor lobulado de aspecto opalescente y consistencia elástica que puede presentar calcificaciones. 10 Figura 3. Imagen microscópica. Tejido sarcomatoso constituido por cartílago hialino. 11 Figura 4. Estructura química de las estatinas. 18 Figura 5. Biosíntesis del colesterol. 25 Figura 6. Transducción de la señal a través de las proteínas Rho-GTP. 27 Figura 7. Disminución de la viabilidad celular en líneas celulares de condrosarcoma de rata. 46 Figura 8. Representación de la viabilidad celular en líneas celulares de condrosarcoma de rata LTC y C422. 47 Figura 9. Representación de la viabilidad celular en líneas celulares de condrosarcoma de rata LTC en comparación con la de condroblastos primarios y fibroblastos. 48 Figura 10. Representación de la viabilidad celular en líneas celulares de condrosarcoma de rata C422 en comparación con la de condroblastos primarios y fibroblastos. 49 Figura 11. Disminución de la viabilidad en la línea celular de condrosarcoma de rata LTC dependiente de la dosis administrada de simvastatina. 50 Figura 12. Disminución de la viabilidad en la línea celular de condrosarcoma de rata LTC dependiente de la dosis de simvastatina y del tiempo. 51 Figura 13. Disminución de la viabilidad en la línea celular de condrosarcoma humano SW1353 dependiente de la dosis de simvastatina y del tiempo. 52 3 Figura 14. Disminución de la viabilidad en la línea celular de condrosarcoma humano SW1353 dependiente de la dosis de lovastatina (A), de atorvastatina (B) y de fluvastatina (C), y del tiempo. 53 Figura 15. No afectación de la viabilidad en la línea celular de condrosarcoma humano SW1353 con la pravastatina. 54 Figura 16. Representación de la sensibilidad a las estatinas (IC50) en la línea de condrosarcoma humano SW1353. 55 Figura 17. Representación de la sensibilidad a la simvastatina en la línea de condrosarcoma humano SW1353. El proceso es dependiente de la vía del mevalonato. 56 Figura 18. Representación de la sensibilidad a la lovastatina en la línea de condrosarcoma humano SW1353. El proceso es dependiente de la vía del mevalonato. 56 Figura 19. Representación de la sensibilidad a la atorvastatina en la línea de condrosarcoma humano SW1353. El proceso es dependiente de la vía del mevalonato. 57 Figura 20. Representación de la sensibilidad a la fluvastatina en la línea de condrosarcoma humano SW1353. El proceso es dependiente de la vía del mevalonato. 57 Figura 21. Cambios morfológicos característicos de apoptosis inducidos por el tratamiento con simvastatina en las líneas LTC y C422. 58 Figura 22. Fotografía y representación gráfica de la inducción de apoptosis evaluada mediante la tinción de DAPI tras tratamiento de las células de condrosarcoma de rata con simvastatina. 60 Figura 23. Representación gráfica de la inducción de apoptosis evaluada mediante la degradación del ADN tras tratamiento de las células de condrosarcoma de rata con simvastatina. 61 4 Figura 24. Representación gráfica de la inducción de apoptosis evaluada mediante la degradación del ADN tras tratamiento de las células de condrosarcoma humano con simvastatina. 62 Figura 25. Representación gráfica de la inducción de apoptosis evaluada mediante la degradación del ADN tras tratamiento de las células de condrosarcoma humano con diferentes estatinas y con GGTI. 63 Figura 26. Representación gráfica del perfil del ciclo celular en la situación control y tras tratamiento con 10 µM de simvastatina de las células de condrosarcoma de rata. 64 Figura 27. Incremento del pico SubG0 tras el tratamiento con las estatinas lipofílicas, pero no con la hidrofílica (pravastatina). 64 Figura 28. Incremento del pico SubG0 tras el tratamiento con la simvastatina, que se revierte con el GGPP, pero no tras la adición de FPP. 65 Figura 29. Incremento del pico SubG0 tras el tratamiento con la simvastatina, que se mimetiza con el GGTI, pero no con el tratamiento con FTI. 66 Figura 30. Incremento de la fracción de células anexina V+/IP+ tras el tratamiento con la simvastatina, que se mimetiza con el GGTI, pero no con el tratamiento con FTI, y se revierte por el GGPP y el mevalonato, pero no por el FPP. 67 Figura 31. Incremento dependiente del tiempo de la fracción de células anexina V+/IP+ tras el tratamiento con la simvastatina. 68 Figura 32. Acúmulo de la forma no isoprenilada de la proteína RhoA tras tratamiento con simvastatina. 69 Figura 33. De-localización de la forma no isoprenilada de la proteína RhoA desde la membrana al citosol tras tratamiento con simvastatina. Este efecto fue revertido por el mevalonato y mimetizado por GGTI. 70 5 Figura 34. De-localización de la forma no isoprenilada de la proteína RhoA desde la membrana al citosol tras tratamiento con simvastatina. Este efecto fue revertido por el mevalonato y se produce igualmente con las estatinas lipofílicas, pero no con la hidrofílica (pravastatina) 71 INTRODUCCIÓN Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 6 1. CONDROSARCOMAS 1.1. Introducción El condrosarcoma es un tumor maligno que forma parte del grupo de tumores de origen mesenquimal denominados sarcomas. Es un tumor de crecimiento lento proveniente del tejido cartilaginoso. Supone en torno al 25% de los tumores óseos primarios. Como se ha dicho anteriormente, se origina a partir del cartílago y se diagnostica en pacientes de 40 a 60 años de edad, siendo raro encontrarlo en pacientes menores de 20 años, en menos del 4% de los casos. El tumor primario se suele localizar habitualmente en la cintura escapular (15%), en la parte proximal del fémur (20%) o en la pelvis (30%). En el esternón y en la escápula se considera que es el tumor maligno más frecuente que se encuentra en estas localizaciones anatómicas (Forscher, 2000). Es un tumor relativamente poco frecuente. Su incidencia es difícil estimar, calculándose una incidencia anual del 3.6% de todos los tumores óseos primarios en E.E.U.U. (Jemal, 2006). En nuestro entorno, en las Islas Canarias, en el registro publicado en 2007 se observaron 39 casos en varones y 22 casos en mujeres, lo cual representa una incidencia estandarizada por edad de 0,9 y 0,6 casos por 100.000 habitantes respectivamente (Curado, 2007). 1.2. Clasificación El término condrosarcoma engloba a un grupo heterogéneo de tumores de estirpe cartilaginosa en el que, en más del 90% de los casos son denominados condrosarcomas convencionales. El 90% de los Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 7 condrosarcomas convencionales, en relación con el grado de malignidad, son de grado bajo o intermedio (grados 1 o 2). En estos casos el comportamiento clínico es de crecimiento muy lento con reducido potencial metastásico. Por el contrario, el 10% de los condrosarcomas convencionales tienen mayor agresividad clínica, se denominan grado 3, y tienden a la metastatización. Los condrosarcomas pueden ser igualmente clasificados dependiendo de que sean primarios, si se desarrollan de novo, o secundarios si se desarrollan a partir de lesiones previas, tales como los encondromas o los osteocondromas. Acorde a su localización, los condrosarcomas se consideran centrales, si se originan dentro de la cavidad medular, y se denominan periféricos si nacen desde la superficie del hueso. En este sentido, los condrosarcomas primarios suelen ser casi siempre centrales y los secundarios pueden ser tanto centrales como periféricos (Dorfman, 1998). Además de los condrosarcomas convencionales hay otras variantes histológicas mucho menos frecuentes. Así, destacan los condrosarcomas desdiferenciados, que son tumores inicialmente de bajo grado, pero con gran capacidad para transformarse en sarcomas de alto grado. Es muy frecuente que puedan tener características histológicas propias de otros tumores como pueden ser del osteosarcoma, del fibrosarcoma o del fibrohistiocitoma maligno. También podemos encontrarnos con el condrosarcoma mesenquimal, de alto grado de malignidad, en el que se observan lesiones sólidas con elevada celularidad a base de células mesenquimales primitivas y con características histológicas muy similares al sarcoma de Ewing, de origen neuroectodérmico. En el caso del Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 14 Además, el aumento de la presión intersticial, debido a la gran cantidad de matriz extracelular, unido a la pobre o nula vascularización tumoral también se han nombrado como posibles factores. Existen pocos datos clínicos disponibles, que además son contradictorios, en cuanto a la eficacia que tiene la quimioterapia convencional como tratamiento adyuvante en los casos. Destacan quizá el uso de nuevos compuestos y regímenes terapéuticos tales como el uso del factor de crecimiento endotelial vascular, de la Apo2L/FNT, de la perifosfina/ dasatinib/apomab o bien de la combinación de la gemcitabina con el doxetacel en ensayos clínicos prospectivos (Gelderblom y col., 2008). 1.5. Pronóstico Se estima una tasa acumulada de supervivencia en aquellos casos de condrosarcoma no metastásico en torno al 70% a los 10 años. Diversos factores de riesgo influyen en esta tasa de supervivencia. Entre ellos destacan la extensión extracompartimental del tumor, así como el desarrollo de recidiva local. En este sentido se considera a la recidiva local como un factor de mal pronóstico en aquellos pacientes que presentan metástasis concomitantes, pero no en aquellos que no las tienen. También influye como factor de riesgo para la recidiva local los márgenes quirúrgicos libres de tumor inadecuados y el tamaño tumoral mayor a los 10 centímetros. Otros factores que también se han relacionado con el pronóstico del condrosarcoma incluyen el alto grado histológico; la edad del paciente; el hecho de ser diagnosticado por biopsia o bien ser diagnosticado de forma no invasiva; y también el elevado índice de proliferación celular (MIB-1) también han mostrado correlación con la recurrencia y la Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 15 mortalidad (Bergh y col., 2001; Rizzo y col., 2001). Sin embargo, ni la localización anatómica, ni el tipo de cirugía ni la duración de los síntomas han mostrado ser factores pronósticos (Fiorenza y co., 2002). 1.6. Biología Molecular Desde el punto de vista de la investigación básica, los datos que nos aporta la biología molecular parecen darnos pistas de cuáles son los procesos que subyacen en esta patología. Así, la detección mediante inmunohistoquímica de los distintos sub-tipos de colágeno se ha implicado tanto en la diferenciación celular como en el pronóstico. Los colágenos tipo II y X y el proteoglicano agrecano representan un fenotipo neoplásico maduro y por tanto conllevan buen pronóstico. Por el contrario, el colágeno tipo I parece indicar una transición a un tipo más proliferativo con menor diferenciación y por tanto con peor pronóstico (Aigner y col., 2002). Otros autores han sugerido la sobre-expresión de la ciclo-oxigenasa 2 como factor pronóstico (Endo y col., 2006). Recientemente se han encontrado varias vías oncogénicas implicadas en el desarrollo del condrosarcoma: • Activación de la vía Akt/proteín-kinasa B (una protein kinasa serina/treonina implicada en la inhibición de la apoptosis y mediador crítico de la supervivencia celular), que se une a receptores de las células de condrosarcoma. • Activación conjunta de las vías AKT y de la ERK 1 (Kinasa regulada por la señal extracelular) en células mesenquimales cóndroprogenitoras. Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 16 • Activación de la vía de la Kinasa Jun N-terminal y la ERK en condrosarcomas (Jang y col., 2005; Akiyama y col., 2006; Papachristou y col., 2006). También se ha hallado correlación entre la amplificación del oncogen c-Myc y la polisomía 8 con la progresión del condrosarcoma desdiferenciado y la disminución de la supervivencia de los pacientes que lo padecen. Se ha hallado igualmente una relación entre la pérdida del cromosoma 6 y la ganancia del segmento 12q12 con un alto grado histológico. Se han encontrado en el 66% de los condrosarcomas alteraciones genéticas frecuentemente implicadas, como son la pérdida de heterocigosis en las posiciones 5q, 9p, 11p, 13q y 19q, lo que demuestra una heterogenicidad en los diferentes tipos de condrosarcoma (Morrison y col., 2005; Rozeman y col., 2006; Papachristou y col., 2006). Otros factores moleculares están también en estudio con la esperanza de encontrar vías terapéuticas. En la tabla 1 se resumen los factores más importantes. Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 17 Diana Función Abordaje terapéutico Tenascina-C Carductina Proteína de la matriz extracelular. Activa la proteína secretada Akt y le ERK 1/2 Inhibidores de la Akt y la ERK Hedgehog Estimula la expresión de los receptores de la PTH y la proliferación de los condrocitos. Inhibición (ciclopamina, triparanol) PDGFRβ Receptor de la tirosina kinasas Inhibición (mesilato de imatinib) Receptor estrogénico El estrógeno estimula la proliferación de los condrocitos de la metáfisis Inhibición (tamoxifeno e inhibidores de la aromatasa) MMP-1 Degrada la matriz extracelular, facilita la salida de las células tumorales MMP-1 siRNA HDAC Remodelación de la cromatina Inhibición (depsipéptido) MTAP Rescate de adenina, síntesis de metionina Anti-folatos Osteoclastos Resorción ósea Bifosfonatos (zolendronato, minodrato) VEGF-A Angiogénesis Proteína relacionada con el plasminógeno B, VEGF antisentido. P16ink4a Inhibidor de la kinasa dependiente de la ciclina Re-expresión de la p16ink4a Tabla 1. Posibles vías moleculares que representan nuevas opciones terapéuticas en el condrosarcoma convencional. ERK: Kinasa reguladora de la señal extracelular; HDAC: histna deacetilasas; MMP: metaloproteinasa de la matriz; MTAP: fosforilasa de la metil-thio-adenosina; PDGFR: receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas; PTHrP: Proteína relacionada con la hormona paratifoidea; siRNA: ARN pequeño inhibidor; VEGF: Factor de crecimiento vasculo-endotelial. Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 18 2. ESTATINAS 2.1 Introducción El colesterol es un esterol esencial para la vida, ya que es necesario, entre otras funciones, para crear la membrana plasmática que regula la entrada y salida de sustancias en las células. Es además precursor de moléculas tan importantes como las hormonas esteroideas y los ácidos biliares. Sin embargo, por otro lado, los niveles elevados de colesterol plasmático es un reconocido factor de riesgo de numerosas enfermedades, dentro de las que destacan las enfermedades cardiovasculares. Los niveles plasmáticos de colesterol es el conjunto del colesterol que proviene de la dieta, lo cual supone un tercio del total, y el colesterol que se sintetiza en el hígado, el cual supone más de las dos terceras partes. Esta es la razón por la que es necesario inhibir su biosíntesis hepática mediante diferentes estrategias terapéuticas, entre las que se encuentra el uso de las estatinas. Estas drogas son uno de los fármacos más eficaces conocidos usados clínicamente con el fin de reducir los niveles séricos de colesterol (Liao y Laufs 2005). Figura 4. Estructura química de las estatinas (Tomado de Wong y col., Leukemia, 2002) Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 19 2.2 Características principales de las estatinas 2.2.1. Método de obtención. Desde el inicio de su uso, se pueden distinguir tres generaciones bien diferenciadas de estatinas (Figura 4). En la primera generación de estatinas, algunas de ellas se obtuvieron mediante fermentación fúngica. Así, la mevastatina fue la primera estatina aislada a partir del hongo Penicillium citrinum (Endo y col., 1976). En el caso de la lovastatina, otra estatina natural, la obtención se realizó a partir del hongo Aspergillus terreus (Alberts y col., 1980). La segunda generación de estatinas se obtuvo a partir de la modificación química de la lovastatina. A este grupo pertenecen las estatinas pravastatina y simvastatina. Por último, la tercera generación de estatinas se obtiene de forma sintética a partir de la mevastatina. Este es el caso de la fluvastatina, atorvastatina, cerivastatina, pitavastatina y rosuvastatina. Estas estatinas son las de mayor potencia. En la actualidad, son de uso clínico la lovastatina, simvastatina, atorvastatina, pravastatina, fluvastatina, rosuvastatina y pitavastatina. 2.2.2. Solubilidad. Acorde a su solubilidad en agua, las estatinas se pueden diferenciar en estatinas hidrofílicas: la pravastatina y la rosuvastatina; y las estatinas lipofílicas, como la lovastatina, la simvastatina, la atorvastatina y la cerivastatina. En el caso de la fluvastatina la solubilidad posee características intermedias. Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 20 2.2.3. Metabolismo de las estatinas. a) Metabolismo hepático. Las diferentes estatinas son metabolizadas por diversos miembros de la familia de citocromos P450 (CYP 450). Así, la lovastatina, simvastatina y atorvastatina son metabolizadas por la isoenzima CYP3A4. Para la metabolización de la fluvastatina es necesaria la colaboración de diferentes sistemas enzimáticos, comenzando por la enzima CYP2C9, ayudada por las enzimas CYP3A4 y CYP2C8. En el caso de la rosuvastatina no podemos decir que sea metabolizada en sentido estricto por este sistema enzimático, pero, sin embargo, sí que interacciona con la enzima CYP2C9. Por último, decir que la pravastatina, no sigue este patrón de metabolización, sino que se transforma enzimáticamente en el citosol hepático. Es importante el conocimiento de estas vías de metabolización ya que son la base para conocer la interacción con otros fármacos que inhiben la enzima CYP3A4, como por ejemplo los antibióticos macrólidos, los azoles, los inhibidores de las proteasas, el verapamilo o la warfarina. b) Excreción: En lo que concierne a las vías de excreción, existen dos rutas de excreción de las estatinas: la urinaria y la fecal, siendo esta última la predominante (Tabla 2). 2.2.4. Mecanismo de acción. Las estatinas pueden ser administrados como compuestos activos o como formas pro-fármacos. Dentro del primer grupo (compuestos activos) tenemos la atorvastatina, la cerivastatina (ya retirada del mercado), la fluvastatina y la pravastatina. Estas estatinas se administran como compuestos en forma ácida. Sin embargo, dentro de las formas Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 21 profármacos están la lovastatina y la simvastatina, que se suministran como lactonas, y han de ser hidrolizadas enzimáticamente para producir las formas activas. En relación a las células diana sobre las que operan la enzima 3hidroxi-3-metilglutaril coenzima a (HMG-CoA) reductasa, decir que como norma general son los hepatocitos. En estas células las estatinas inhiben a la reductasa de forma competitiva, mediante una unión reversible en el lugar activo de la enzima. Gracias a esta unión se produce un cambio en la estructura de la enzima conduciendo a una disminución intracelular del producto inmediato de la reacción (mevalonato) y de los productos que se sintetizan a continuación, incluidos los lípidos isoprenoides, moléculas responsables de múltiples funciones celulares esenciales gracias a los procesos de isoprenilación proteica (Alegret y Silvestre, 2006). El valor de la constante de Michaelis-Menten (Km) para la estatinas, o lo que es lo mismo, la concentración de sustrato con la cual la velocidad de reacción enzimática alcanza un valor igual a la mitad de la velocidad máxima, se encuentra en el rango nanomolar. Es por ello, por lo que estas drogas reemplazan eficientemente al sustrato natural (la HMG-CoA), el cual se une en condiciones fisiológicas con la reductasa en el rango de concentraciones micromolares (Moghadasian, 1999). Desde el punto de vista clínico, el rango terapéutico de estas drogas varía entre 10-80 mg/día, según el tipo de estatina que se use. Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 22 Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 23 2.2.5. Permeabilidad de las estatinas. Todas las estatinas tienen su diana tisular en el hígado. Sin embargo, el grado de inhibición de la enzima HMG-CoA reductasa en otros tejidos no hepáticos varía en función de su permeabilidad tisular y metabolismo. Las estatinas lipofílicas, como son la lovastatina, la simvastatina y la atorvastatina, atraviesan con facilidad las membranas celulares por difusión pasiva, por lo que son potentes inhibidores de la enzima HMG-CoA reductasa en gran cantidad de tejidos. Sin embargo, las estatinas hidrofílicas, como es el caso de la pravastatina y de la rosuvastatina, son relativamente impermeables a estas membranas, razón por lo que son más selectivas desde el punto de vista tisular que las anteriores. En general sus acciones están limitadas al hígado. 2.3 Biosíntesis del colesterol El colesterol desempeña funciones muy importantes en el ser vivo ya que forma parte de las membranas celulares y es el precursor de los ácidos biliares y de las hormonas esteroideas. Las células de los mamíferos, utilizan el colesterol que se genera a través de las vías endógenas y exógenas. A través de la ruta exógena, el colesterol se incorpora a las células gracias a las lipoproteínas, especialmente la LDL (lipoproteína de baja densidad). Esta molécula es introducida en la célula mediante un mecanismo de endocitosis (Brown y Goldstein, 1986), siendo a continuación degradadas las lipoproteínas en el interior de los lisosomas y el colesterol reciclado. Cuando no hay LDL plasmática, se pone en marcha un proceso de síntesis celular a través de las propias rutas endógenas que posee la célula Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 30 3.2. Cambios Morfológicos. En la apoptosis no existe un cuadro inflamatorio asociado. Los datos más significativos son la compactación nuclear precoz y la condensación citoplasmática. Posteriormente, el núcleo se rompe en varios pedazos. Las células se rompen en cuerpos apoptóticos, que poseen un componente nuclear en su interior, mientras que los orgánulos citoplasmáticos aparecen indemnes. Estos cuerpos suelen ser fagocitados por los macrófagos con intención de eliminarlos. Este tipo de muerte celular ocurre en células individuales de una manera asincrónica, lo cual lo diferencia de la necrosis. En la Tabla 3 se resumen las diferencias morfológicas básicas entre la necrosis y la apoptosis. Sin embargo, a pesar de lo dicho, normalmente la necrosis y la apoptosis coexisten muchas veces tras el daño celular (O'Brien y cols, 2000). Características Necrosis Apoptosis Tipo de muerte Catastrófica Programada Modo Pasivo Activo (ATP dependiente) Volumen celular Aumenta Disminuye Densidad celular Disminuye Aumenta Lisis de la m. plasmática Al principio Al final Hidrólisis del ADN Al final Temprana Orgánulos Lisados Compactos Respuesta inflamatoria Si No Tabla 3. Diferencias generales entre apoptosis y necrosis. Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 31 3.3. Vías de señalización de la apoptosis. El proceso de apoptosis se puede desencadenar a través de múltiples vías de señalización. La apoptosis está controlada por diversas señales celulares implicadas en la regulación del destino celular, bien sea hacia la muerte o hacia la supervivencia celular. 3.3.1. Vías implicadas en la transducción de señal. En esta vía están implicados receptores que al activarse conducen a la muerte celular y es por lo que se les denominan receptores de muerte celular. Están encargados de detectar señales que provienen del entorno extracelular y transmitirlos al interior celular a través de una señal proapoptótica. En general este tipo de receptores pertenecen a la superfamilia de receptores TNF (Tumor Necrosis Factor). Otros receptores involucrados en la apoptosis son los relacionados con Fas/Apo1, cuya activación, cuando se le une en su dominio extracelular su correspondiente ligando, conduce a la activación de su dominio intracelular (denominado dominio de muerte) y este dominio interacciona con determinadas proteínas citoplasmáticas necesarias para la transducción de la señal a través de las caspasas. Otra vía de transducción de señal es a través de los cambios en la concentración del calcio iónico. En los casos dependientes del Ca2+ se produciría una activación de las endonucleasa Ca2+-dependientes implicadas en la degradación de la histona H1. En otros casos, la PKC (Protein Kinasa C) puede activar o prevenir la apoptosis, al igual que le ocurre al AMPc, dependiendo del modelo apoptótico que se estudie. La ceramida, molécula resultante de la hidrólisis de la esfingomielina, es un iniciador de la apoptosis cuando interviene TNF, a través de la Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 32 inducción del factor de transcripción c-Jun, vía Ras. Determinadas CDKs (Cyclin Dependent Kinases) pueden promover la apoptosis, como es el caso de la ciclina B y E en la apoptosis inducida por daño del ADN, y de la ciclina A, inducida por el factor de transcripción Myc. Las proteínas Ras, miembros de la superfamilia de GTPasas promotoras de muerte celular o supervivencia dependiendo de las moléculas que participen en cada caso. Puede inducir muerte celular si se activa la proteína Raf a través de la vía ERK; o puede promover la supervivencia celular si se activa PI3K. 3.3. 2. Factores de transcripción implicados. El factor de transcripción AP-1 (Activating Protein-1) está formado por homoo heterodímeros de las proteínas nucleares Fos (c-Fos, Fos B, Fra1 y Fra2), Jun (c-Jun, JunB y JunD) y proteínas con cremallera de leucina bZIP (ATF-2, ATF3/LRF1, B-ATF). En algunos casos se necesita AP-1 para provocar apoptosis; sin embargo, en otros casos no es necesario. El factor de transcripción NFκB (Nuclear Factor kappaB) pasa del citoplasma al núcleo uniéndose al ADN a través de las secuencias κB y, dependiendo del estímulo y de la línea celular que se considere, generará una respuesta protectora o promotora de la apoptosis. Las proteínas Myc son una familia de proteínas nucleares que controlan diversas funciones celulares. Se han descrito tres miembros: c-myc, N-myc y L-myc. La sobreexpresión de c-myc confiere susceptibilidad a las células tumorales para entrar en apoptosis. Por otro lado, su anulación las hace más resistentes a morir por apoptosis. La entrada en apoptosis mediada por c-myc está mediada por las proteínas bcl-2 y p53. Introducción Tesis Doctoral: Ulises Torres López 33 La proteína p53 es una proteína fosforilada involucrada en dos funciones celulares importantes: la decisión de que la célula entre en apoptosis o progrese a través del ciclo celular; y tomar parte en la reparación del ADN. De forma genérica, p53 evalúa los daños en el ADN y decide si se debe parar el ciclo celular para reparar los daños, en caso de que sean leves. En caso de que este daño sea más grave, p53 actúa como un factor protector induciendo a la célula a que entre en apoptosis. PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS Planteamiento*y*Objetivos! ! Tesis%Doctoral:%Ulises!Torres!López! 34! 1.- PLANTEAMIENTO El uso de las estatinas como fármacos reductores de los niveles de colesterol plasmático ha supuesto una importante disminución en la tasa de mortalidad secundaria a las alteraciones cardiovasculares que produce este desarreglo metabólico. Sin embargo, en los estudios epidemiológicos encaminados para evaluar la disminución de la tasa de mortalidad secundaria a enfermedades cardiovasculares debido al subsecuente descenso de los niveles de colesterol provocado por las estatinas se pudo comprobar que el descenso en la mortalidad fue superior al esperable por el simple hecho de disminuir la concentración de colesterol plasmático. Se observó, que además de la reducción de este lípido, los pacientes sujeto de evaluación en estos estudios morían menos por cáncer. Por otro lado, sabemos que los condrosarcomas son tumores sólidos extremadamente agresivos y con escasas o nulas opciones terapéuticas, quedando circunscritas prácticamente a la cirugía, ya que son normalmente radioy quimio-resistentes. Por ello, nos preguntamos que si las estatinas, poseedores de esta capacidad antitumoral ya probada en otras estirpes tumorales, podría ser de utilidad en el tratamiento de los condrosarcomas, ya que estos tumores son tan resistentes a la quimioterapia. En base a este planteamiento, nos hemos propuesto los siguientes objetivos. Planteamiento*y*Objetivos! ! Tesis%Doctoral:%Ulises!Torres!López! 35! 2.- OBJETIVOS 2.1.- Objetivo general: Evaluar la posible acción antitumoral de las estatinas in vitro en los condrosarcomas de rata y humano 2.2.- Objetivos específicos: 1. Determinar el efecto de las estatinas sobre la viabilidad celular de las líneas de condrosarcoma humano y de rata al ser comparada con células control fibroblástico y condroblástico no tumoral. 2. Demostrar que las estatinas ejercen su efecto deletéreo sobre los condrosarcomas a través de la muerte celular programada (apoptosis). 3. Comprobar que la alteración en la isoprenilación de la proteína RhoA está presente en la acción de las estatinas sobre las células de condrosarcoma. 4. Comprobar que el efecto sobre la viabilidad celular, la apoptosis y la implicación de RhoA sobre estas líneas celulares está vehiculizado por la vía del mevalonato. 5. Disecar la vía del mevalonato para determinar qué intermediarios de esta vía están involucrados en los efectos observados. 6. Definir si las acciones de las estatinas sobre estas células es por igual en las dos subfamilias de estos fármacos o, por el contrario, el grado de lipo o hidrofilicidad juega algún papel diferencial. ! MATERIAL Y MÉTODOS Material y Métodos Tesis Doctoral: Ulises Torres López 36 1. MATERIALES! Los anticuerpos anti-RhoA , IgG anti-conejo ligado a peroxidasa de rábano y el IgG de cabra anti-ratón se obtuvieron de la empresa Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); la inmunoglobulina anti-ratón conjugada con peroxidasa se obtuvo de Dako (Glostrup, Dinamarca). El anticuerpo anti-tubulina (T3526) se obtuvo de Sigma-Aldrich. Los fármacos simvastatina, fluvastatina, lovastatina, atorvastatina y pravastatina fueron obtenidos de diversas casas comerciales (Tabla 4). Los lípidos isoprenoides FPP (F6892), GGPP (G6025) y los demás reactivos fueron obtenidos de Sigma. ! 2. CELULAS Y CULTIVOS CELULARES Las líneas celulares de condrosarcoma de rata LTC y C422 fueron generosamente cedidas por el Dr. Jeff Stevens, del Iowa Hospitals & Clinics (Universidad de Iowa City, IA, E.E.U.U.). La línea celular de condrosarcoma humano SW1353 y la línea de fibroblastos inmortalizados NIH3T3 (controles) fueron compradas a la ATCC (American Type Culture Collection). Estas líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640, suplementado con FBS al 10%, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Las líneas celulares fueron cultivadas a 37º C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5%. Utilizamos también como células control, junto a las NIH3T3, a condroblastos primarios obtenidos en nuestro laboratorio, siguiendo el siguiente procedimiento:! Material y Métodos Tesis Doctoral: Ulises Torres López 37 2.1. Cultivo primario de condroblastos. Los condroblastos primarios se obtuvieron de ratas de la cepa Sprague-Dawley recién nacidas (entre 3 y 4 días de edad). En primer lugar, tras anestesiar a los animales, se aisló la región costal, obteniéndose varios fragmentos de cartílago costal. Dichos fragmentos fueron primero troceados con el bisturí en fragmentos de aproximadamente 4 mm2 y luego digeridos secuencialmente con colagenasa tipo IA al 0,2% (Sigma) y con tripsina al 0,2% en el incubador a 37º C y CO2 al 5% durante 20, 40 y 90 minutos. De la tercera digestión, las células obtenidas se cultivaron en placas de cultivo de 60 mm con medio de cultivo α-MEM (Cambrex BioScience), suplementado con desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, ultraglutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina, 250 µg/ml de fungizona y FBS al 10%. El medio de cultivo se cambió inicialmente a las 72 horas y luego cada 48 horas hasta que el cultivo alcanzó la confluencia de la placa. A continuación, estas células, consideradas como el primer pase celular, fueron subcultivadas usando tripsina al 0,05% y EDTA al 0,01% (Cambrex) en placas de 60 mm. Los experimentos que más tarde se detallarán se realizaron con células en el segundo pase celular. 2.2 Tratamientos. Las concentraciones de las estatinas usadas en este estudio vienen reflejadas en la Tabla 4). Las concentraciones de los lípidos isoprenoides FPP y GGPP fueron de 5 µM, mientras que la del mevalonato fue de 200 µM. Los inhibidores de la farnesil transferasa (FTI 277) y de la geranilgeraniltransferasa (GGTI 298) se usaron a concentraciones de 20 Material y Métodos Tesis Doctoral: Ulises Torres López 44 pH 7.5, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, sacarosa 250 mM y DTT (Ditiotreitol) 0.1 mM conteniendo 2 µg/ml de cada uno de los inhibidores de proteasas leupeptina, aprotinina, pepstatina). Por último, los lisados se centrifugaron a 200.000 g durante 30 minutos a 4º C (Beckman TLA100 rotor). La fracción membranal se obtuvo del sobrenadante de esta centrifugación y la fracción citosólica del pellet celular. 5.3. Cuantificación de proteínas. Siguiendo el método clásico de Bradford (Bradford 1976) se determinó la concentración proteica con el kit de Bio-Rad (Protein Assay Dye Reagent Concentrate Catalog Number 500-0006). 5.4. Ensayos de Western Blot.!! Para el estudio proteico se hizo una electroforesis vertical (MiniProtean® 3 Cell, Bio-Rad) en geles de poliacrilamida-SDS al 15%. En primer lugar, las proteínas fueron transferidas a las membranas PVDF (Immuno-Blot® PVDF, Bio-Rad) mediante el equipo Mini-Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad) durante 16 horas a 4º C. A continuación se tiñeron las membranas con rojo Ponceau con el fin de confirmar la homogeneidad de la carga de proteínas en cada pocillo, así como la uniformidad de la transferencia antes de iniciar el proceso de incubación con los anticuerpos: anticuerpo primario anti RhoA (dilución 1:1000, 2 horas de incubación a temperatura ambiente, Santa Cruz Biotech). Tras estas incubación, se realizaron de 1 a 3 lavados con el tampón TBST-T y se incubó con el anticuerpo secundario anti-ratón (dilución 1:6000, 40 minutos de incubación a temperatura ambiente, Material y Métodos Tesis Doctoral: Ulises Torres López 45 Dako). Las membranas se bloquearon a temperatura ambiente durante una hora con leche desnatada al 10% disuelta en tampón TBST-T. 6. ANALISIS ESTADISTICO Los valores numéricos obtenidos se expresaron como media + SEM, y fueron comparados los grupos tratados con los no tratados, así como los procedentes de las células tumorales contra las células que sirvieron como controles. La significación estadística de las diferencias observadas entre los grupos se evaluó usando el test del análisis de la varianza ANOVA, y, a continuación, un análisis post hoc con el test de Scheffé. Se asumió una diferencia significativa cuando p>0,05 ! ! RESULTADOS Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 46 1.- ENSAYO DE VIABILIDAD CELULAR 1.1.- La simvastatina tiene un efecto antiproliferativo en las líneas de condrosarcoma de rata LTC y C422. En las líneas celulares de condrosarcoma de rata LTC y C422 evaluamos la sensibilidad a la acción de la simvastatina en estas líneas, en comparación con las células controles (células NIH3T3 y cultivos primarios de condroblastos). En primer lugar, el ensayo con MTT objetivó una marcada disminución de la viabilidad celular en las líneas tumorales tras 24 y 48 horas de tratamiento con la simvastatina. Este efecto antitumoral fue máximo a la concentración de 10 µM de simvastatina (Figura 7). Figura 7. Disminución de la viabilidad celular en líneas celulares de condrosarcoma de rata. Gráfica comparativa de la actividad MTT en las líneas celulares LTC y C422. En todos los ensayos la actividad se representa por la media + SEM de tres experimentos Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 47 En estas líneas la acción supresora de la viabilidad celular fue contrarrestada tras la adición de 200 µM de mevalonato, indicativo de que este efecto farmacológico es dependiente de la vía del mevalonato (Figura 8).  Figura 8. Representación de la viabilidad celular en líneas celulares de condrosarcoma de rata LTC y C422. En ambos casos la disminución de la viabilidad inducida por la simvastatina pudo ser revertida casi en su totalidad tras añadir el mevalonato. Se representa la media + SEM de tres experimentos Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 48 Las concentraciones inhibitorias del crecimiento celular al 50% (IC50) inducida por la simvastatina (Tabla 5) oscilaron entre el 0.74-2.60 µM, en el caso de la línea celular LTC, y de 1.64-1.29 µM para la línea C422 (p<0.05, p<0.01), en comparación con los condroblastos primarios), y con los fibroblastos, respectivamente (Figuras 9 y 10). Sin embargo, en caso de los fibroblastos NIH3T3 la viabilidad celular no se modificó significativamente a dosis menores a 10 µM (p<0.05). IC50 (µM) LTC 0,74-2,60 C422 1,29-1,64 NIH3T3 4,75  Figura 9. Representación gráfica de la viabilidad celular en líneas celulares de condrosarcoma de rata LTC y C422 en comparación con la de condroblastos primarios y fibroblastos. La IC 50 fue entre 3 y 6 veces menor en las células tumorales que en las no transformadas. Se representa la media + SEM de tres experimentos Tabla 5. Valores de las IC50 de las líneas tumorales LTC y C422 frente al control NIH3T3. Se representa la media + SEM de tres experimentos Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 49 Cuando este mismo efecto se estudió en las células cartilaginosas no transformadas, provenientes de los cartílagos costales de ratas neonatas, los resultados obtenidos nos indicaron que el efecto antitumoral de la simvastatina en el condrosarcoma parece que es selectivo en las células tumorales y no en las sanas. Ello es debido a que la viabilidad no se afectó con los tratamientos de simvastatina en los condroblastos normales a las concentraciones farmacológicas usadas en las células tumorales. Figura 10. Representación gráfica de la viabilidad celular en líneas celulares de condrosarcoma de rata LTC y C422 en comparación con la condroblastos primarios y fibroblastos. La IC50 fue entre 3 y 6 veces menor en las células tumorales que en las no transformadas. Se representa la media + SEM de tres experimentos Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 50 El efecto antitumoral de la simvastatina sobre los condrosarcomas fue dosisy tiempo-dependiente, descendiendo progresivamente la viabilidad con la concentración y el tiempo, siendo máximos a una dosis de 10 µM de simvastatina y tras 72 horas de administración del fármaco (Figura 11).   El efecto antitumoral de la simvastatina fue dependiente de la vía del mevalonato. Cuando las células tumorales fueron co-tratadas con simvastatina y con mevalonato, la reversión sobre la disminución de la viabilidad fue completa. Este efecto fue similar al obtenido tras la co-administración de los dos lípidos isoprenoides FPP y GGPP con la simvastatina. El grado de reversión del efecto de la simvastatina, sin embargo, fue menor cuando sólo se coadministró con FPP que cuando se hizo con GGPP, lo cual sugiere que la afectación de la viabilidad celular parece depender más de los procesos de geranilgeranilación que de farnesilación (Figura 12) Figura 11. La disminución de la viabilidad en la línea celular de condrosarcoma de rata LTC fue dependiente de la dosis administrada de simvastatina, siendo máxima a 10 µM. A una dosis de 1 µM a las 72 horas la diferencia en la disminución de la viabilidad fue significativa respecto a los controles (33% superior respecto al control, p< 0,001). Se representa la media + SEM de tres experimentos Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 51   Figura 12. La disminución de la viabilidad en la línea celular de condrosarcoma de rata LTC fue dependiente de la dosis administrada de simvastatina y del tiempo durante el cual fueron tratadas. La reversión del proceso fue completa cuando se administró conjuntamente con el mevalonato y parcial cuando se coadministró con los diferentes lípidos isoprenoides. Se representa la media + SEM de tres experimentos Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 52 1.2.- Las estatinas lipofílicas ejercen un efecto antiproliferativo que es dependiente del tiempo y la dosis en las líneas SW1353. En los gráficos que se exponen a continuación, se observa que el mismo efecto observado en las líneas celulares de condrosarcoma de rata LTC y C422 también se reproduce en la línea celular de condrosarcoma humano SW1353, lo cual indica que esta respuesta no depende de la especie tratada. En la Figura 13, se pueden observar los mismos resultados usando la simvastatina en la línea humana, siendo esta respuesta tiempo y dosis dependiente.  Lo siguiente que se estudió era si este efecto era clase-dependiente de la familia de las estatinas y en qué medida. Para ello utilizamos diferentes estatinas lipofílicas (lovastatina, atorvastatina y fluvastatina) e hidrofílicas (pravastatina). Como se puede comprobar en las gráficas de la Figura 14, en las que se representa la viabilidad celular tras ser tratadas con la lovastatina, atorvastatina y fluvastatina, el perfil de la respuesta a estas tres drogas fue similar al observado tras ser tratadas con simvastatina, siendo esta respuesta tanto tiempocomo dosis-dependiente. Figura 13. La disminución de la viabilidad en la línea celular de condrosarcoma humano SW1353 fue dependiente de la dosis administrada de simvastatina y del tiempo durante el cual fueron tratadas. Se representa la media + SEM de tres experimentos Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 59 2.2.- Estudio mediante marcaje con DAPI. Cuando las células LTC y C422 fueron tratadas con 10 µM de simvastatina el porcentaje de células con núcleos fragmentados y con cromatina condensada, indicadores de la existencia de un proceso apoptótico, debidas al marcaje con DAPI, mostró un aumento del número de respecto a la situación control (Figura 22). Mientras en el grupo control se observó un 2,5% de células positivas para DAPI, en el grupo tratado el porcentaje ascendió hasta un 25% (10 veces más), siendo este incremento significativo desde el punto de vista estadístico (Tabla 7, p<0.01). Tras la co-administración con 200 µM de mevalonato, este efecto revirtió, siendo la diferencia sólo de 0,8 veces menor, no siendo estadísticamente significativa. Cuando se utilizó como control la acción del quimioterápico etopósido a dosis de 5 y 10 µM, el porcentaje de células apoptóticas fue superior al encontrado en la situación control (1,36 veces y 2,64 veces, respectivamente, siendo en estos casos las diferencias significativas, con p < 0,02). Sin embargo, el efecto del quimioterápico a estas dosis no superó a la producida por la simvastatina a una dosis de 10 µM. A la dosis de 5 µM de etopósido se cuantificaron 7,35 veces menos células TRATAMIENTO % APOPTOSIS % vs CONTROL Control 2,5 10 µM Sv 25 1000 10 µM Sv + Mev 2 80 5 µM Etop 3,4 136 10 µM Etop 6,6 264 Golpe de calor 11,3 452 Tabla 7. Porcentaje de células positivas para DAPI en tratamiento con simvastatina. Mev mevalonato; Etop etopósido Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 60 apoptóticas que con la simvastatina. En el caso del etopósido a una dosis de 10 µM de etopósido se cuantificaron 3,39 veces menos células apoptóticas que con la simvastatina. Por último, cuando se utilizó el golpe de calor como método para provocar la apoptosis celular, el porcentaje de células apoptóticas fue 4,52 veces superior que en la situación control (p<0.01), pero menor que la provocada por la simvastatina (2,21 veces menor, p<0.01).                     Figura 22. Fotografía y representación gráfica de la inducción de apoptosis evaluada mediante la tinción de DAPI tras tratamiento de las células de condrosarcoma con simvastatina, comparado con situaciones control tratado con etopósido y con golpe de calor. Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 61 2.3.- Estudio de apoptosis mediante DNA laddering. Cuando las células LTC y C422 fueron tratadas con simvastatina a dosis de 0,1, 1 y 10 µM durante 24, 48 y 72 horas, se observó que se producía una degradación del ADN que fue dependiente del tiempo y de la dosis, siendo apreciable a partir de las 48 horas con dosis superiores a 1 µM. Este efecto apoptótico fue revertido tras la co-administración con 200 µM de mevalonato, indicando de nuevo que este proceso es dependiente de esta vía metabólica (Figura 23).       la     Figura 23. Representación gráfica de la inducción de apoptosis evaluada mediante la degradación del ADN tras tratamiento de las células de condrosarcoma de rata con diferentes dosis de simvastatina durante 24, 48 y 72 horas. Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 62 Cuando se evaluó el efecto de la simvastatina en células de condrosarcoma humano SW1353 se observó el mismo efecto de degradación en escalera del ADN que en las células de condrosarcoma de rata anteriormente reseñado (Figura 24). El efecto fue dosis dependiente (0,3, 1, 3, 10, 30 y 100 µM), siendo revertido con el mevalonato y con los lípidos FPP y GGPP. Este efecto de la simvastatina fue dependiente del tiempo igualmente (12, 24, 36, 48 y 72 horas), sobre todo a partir de las 36 horas, siendo revertido con el mevalonato, con el lípido isoprenoide GGPP y parcialmente con el FPP.                   Figura 24. Representación gráfica de la inducción de apoptosis evaluada mediante la degradación del ADN tras tratamiento de las células de condrosarcoma humano con diferentes dosis de simvastatina durante diferentes tiempos. El efecto fue dependiente del tiempo y la dosis y revertido por el mevalonato y el GGPP, pero no por el FPP. Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 63 Se observó además que este efecto de las estatinas en células de condrosarcoma humano SW1353 fue dependiente de los procesos de geranilgeranilación (mimetizado tras la adición de GGTI), y dependiente de la lipofilicidad de la estatina, ya que se reproducía tras la adición de fluvastatina, atorvastatina y lovastatina, pero no tras añadir la estatina hidrofílica pravastatina (Figura 25).      2.4.- Estudio de apoptosis mediante citometría de flujo. Cuando las células de condrosarcoma de rata LTC fueron tratadas con simvastatina a una dosis de 10 µM durante 48 horas y se marcaron las células con ioduro de propio, se observó que la droga producía una disminución en la fase de síntesis, con parada del ciclo sobre todo en la fase G0-G1 (Figura 26).  Figura 25. Representación gráfica de la inducción de apoptosis evaluada mediante la degradación del ADN tras tratamiento de las células de condrosarcoma humano con diferentes estatinas. El efecto fue mimetizado por GGTI y no se reprodujo cuando se utilizó una estatina hidrofílica (pravastatina). Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 64   Esta parada del ciclo celular producido por la estatina se vio acompañada de cambios en el pico SubG0, indicando la presencia de muerte celular por apoptosis. Este efecto apoptótico de las estatinas sobre la línea de condrosarcoma humano SW1353 se evaluó, por tanto, midiendo el porcentaje de células en esta población subdiploide. En primer lugar se constató que las estatinas inducen un incremento en el porcentaje de células en esta población subdiploide, que es dependiente de la dosis y de la vía del mevalonato, ya que revierte tras su co-administración. Se observó de nuevo que la inducción de apoptosis sólo ocurre con las estatinas lipofílicas, pero no en las hidrofílicas, como es el caso de la pravastatina (Figura 27).   Figura 26. Representación gráfica del perfil del ciclo celular en la situación control y tras tratamiento con 10 µM de simvastatina, observándose una disminución en la fase de síntesis del ADN y una p arada del ciclo en la fase G0 / G1. Figura 27. Incremento del pico SubG0 tras el tratamiento con las estatinas lipofílicas, pero no con la hidrofílica (pravastatina), que es dosis dependiente y que se revierte con el mevalonato. Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 65 Además, esta respuesta depende esencialmente de los fenómenos de geranilgeranilación proteica, ya que el efecto apoptótico de la simvastatina en las líneas SW1353 revierte tras la adición de GGPP de manera dosisdependiente, pero no con el FPP (Figura 28).      Igualmente, se observó un efecto dosis-respuesta sobre la inducción de apoptosis representada por el incremento de la población subdiploide en las líneas SW1353 tras la administración de los inhibidores de la isoprenilación proteica FTI y GGTI, siendo constatable de forma dosis-dependiente tras la administración de este último, pero no tras la administración del FTI. Ambos experimentos demuestran la importancia de la geranilgeranilación proteica en estos fenómenos (Figura 29).   Figura 28. Incremento del pico SubG0 tras el tratamiento con la simvastatina, que se revierte con el GGPP, pero no tras la adición de FPP. Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 66          Al analizar en detalle la distribución de las células y ver el porcentaje de células acorde a la detección de la Anexina V y del Ioduro de Propidio, se observó que la simvastatina incrementó el porcentaje de células anexina V+/IP+ de manera dosis-dependiente en las líneas SW1353. Este efecto fue revertido por el mevalonato, por el GGPP y el GGPP + FPP. Fue parcialmente revertido por el FPP; no fue mimetizado por el FTI, pero si por el GGTI, indicando de nuevo que es un proceso dependiente de la geranilgeranilación proteica (Figura 30). La simvastatina incrementa el porcentaje de células anexina V+/IP+ entre un 35,17% y un 310,17% respecto a la situación control. Tras la adición de FTI sólo incrementó un 26,27%, mientras que cuando se añadió GGTI, el incremento fue del 357% (Tabla 8).  Figura 29. Incremento del pico SubG0 tras el tratamiento con la simvastatina, que se mimetiza con el GGTI, pero no con el tratamiento con FTI. Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 67       Figura 30. Incremento de la fracción de células anexina V+/IP+ tras el tratamiento con la simvastatina, que se mimetiza con el GGTI, pero no con el tratamiento con FTI, y se revierte por el GGPP y el mevalonato, pero no por el FPP. Tabla 8. Incremento del porcentaje de células anexina V+/IP+ respecto a la situación control tras tratamiento con simvastatina y con GGTI, pero no con FTI. Resultados  TesisDoctoral:UlisesTorresLópez 68 Igualmente, la simvastatina incrementó el porcentaje de células anexina V+/IP+ de manera tiempo-dependiente en las líneas SW1353. Este efecto también fue revertido por el mevalonato tras 48 horas de tratamiento con 10 µM de simvastatina (Figura 31). Este incremento fue del 26,52%, 49,72%, 132% y 141% al cabo de 12, 24, 36 y 48 horas, siendo completamente revertido con el mevalonato en este último tiempo de estudio (Tabla 9).       Simv(10µM) AV/IP/AV/IP+/AV/IP+/+AV/IP/+ C79,7010,659,050,55 12h72,7515,5011,450,30 24h58,9027,1513,550,55 36h43,2035,2521,000,65 48h39,9537,0521,801,25 48h+Mev75,5015,509,000,10  Figura 31. El incremento de la fracción de células anexina V+/IP+ tras el tratamiento con la simvastatina fue de p endiente del tiem p o en el q ue fueron tratadas las células. Tabla 9. Incremento del porcentaje de células anexina V+/IP+ respecto a la situación control tras tratamiento con simvastatina y a lo largo de los diferentes tiempos de tratamiento. Discusión Tesis Doctoral: Ulises Torres López 74 proteínas también geranilgeraniladas incluyen las proteínas Rab, necesarias para el transporte de vesículas dentro de la célula; la familia Rap, que desempeña un papel en la replicación celular, la activación plaquetaria y la generación de radicales de oxígeno; y las proteínas G, necesarias en el proceso de transducción de señales (Faggiotto y Paoletti, 1999). Cada vez son más los estudios que identifican a las estatinas como posibles agentes quimioterapéuticos en la terapia y/o prevención del cáncer (Mo y Elson, 2004; Hindler et al., 2006) a través de sus interacciones con funciones celulares esenciales, como es el caso del crecimiento de la células tumorales (Sumi y col., 1992). Además, se han identificado estos efectos pleitrópicos con cambios en la célula cancerígena relacionados con la proliferación celular, diferenciación, supervivencia, morfología celular, motilidad e inducción de apoptosis (Jakóbisiak y Golab, 2003). Por otro lado, dentro de su capacidad antitumoral hay que destacar los efectos anti-angiogénicos al disminuir la producción de factores de crecimiento endoteliales (Holash y col., 1999); al inhibir la formación de tubos capilares (Vincent y col., 2001; Park y col., 2002); al inhibir la proliferación-migración de las células endoteliales; y al inducir la apoptosis de estas células vasculares (Dulak y Józkowicz, 2005). Varios efectos han sido descritos tras la inhibición de la síntesis de FPP y GGPP por las estatinas en las células tumorales, como la potenciación del efecto apoptótico, la disminución de la proliferación celular, y la disminución de la invasividad. Así, en relación con la apoptosis, Dimitroulakos describe que la Discusión Tesis Doctoral: Ulises Torres López 75 lovastatina induce apoptosis en células de leucemia mieloide aguda, pero no en los progenitores normales de la médula ósea con dosis que pueden alcanzarse in vivo (Dimitroulakos y col., 1999). En líneas celulares del sarcoma de Ewing CHP-100 el análisis de microarrays de ADN confirmó que la lovastatina altera el programa de la expresión génica, y, tras la diferenciación morfológica, las células sufrieron apoptosis rápidamente (Kim y col., 2000). Por otro lado, en relación con el ciclo celular y la proliferación celular, el fallo en la geranilgeranilación de proteínas del citoesqueleto, como las proteínas Rho, es el evento molecular más probable en la inhibición de la progresión del ciclo celular. En este sentido, la inhibición de la síntesis de los isoprenoides, pero no del colesterol, por las estatinas disminuyó la síntesis de ADN inducida de PDGF e inhibe la proliferación celular mediante la detención del ciclo celular entre la fase de transición G1/S. Algunos autores piensan que este efecto es mediado por la acción de la vía p21WAF1/CIP1/p53/E2F (Lee y col., 1998; Rao y col., 1998). Sin embargo, otros autores encuentran que la inhibición del ciclo celular por las estatinas es independientemente de esta vía (Rao y col., 1998). Una vía alternativa sugerida por algunos autores, es a través de la vía de p73, independiente de p53 /E2F (Park y col., 2002) Respecto a la acción sobre la invasividad, se sabe que el cambio más deletéreo durante la progresión del cáncer es el cambio de un tumor con crecimiento localizado a una forma metastásica (Clark, 2000). En este sentido, se sabe que las estatinas están implicados en la modificación de las proteínas del citoesqueleto involucradas en la migración celular, aumentando con ello la motilidad celular a través de la Discusión Tesis Doctoral: Ulises Torres López 76 acción de RhoA (Matsumoto, 2001), con una alteración concomitante de la función quimiotáctica. Por otro lado, algunos autores sugieren que otra acción antitumoral de las estatinas se relaciona con la inhibición de la degradación de la matriz extracelular (Denoyelle y col., 2001) y sobre la disminución de su capacidad invasiva. En este sentido se ha demostrado que el nivel de expresión de RhoA en los tumores es varias veces superior a la del tejido normal circundante (Clark, 2000). Además, el tratamiento de los animales portadores de tumor con inhibidores de la HMG-CoA reductasa ha demostrado que disminuye la metástasis de pulmón de células de melanoma de ratón B16F10 (Jani y col., 1993); de las células de cáncer de mama del ratón (Alonso y col., 1998); de las metástasis en ganglios linfáticos de las células de linfoma de rata (Matar y col., 1999); y la metástasis hepáticas de las células del cáncer de colon de ratón (Mehta y col., 1998). A lo largo de los años han ido aumentando el número de estudios en los que se evalúa la potencial acción de las estatinas como posibles agentes quimioterapéuticos en la terapia y/o prevención del cáncer (Mo y Elson, 2004; Hindler y col., 2006; Osmak, 2012; Thurnher y col., 2012; Zeichner y col., 2012; Clendening y Penn, 2012; Gronich y! Rennert, 2013). Es importante el uso de estos fármacos ya que la inhibición de la síntesis de isoprenoides por las estatinas es un paso esencial en la regulación de la proliferación celular y en la apoptosis (Joo y Jetten, 2010). Se sabe que la depleción de los lípidos isoprenoides, fundamentalmente el GGPP producida por la inhibición de la enzima HMG-CoA reductasa, es el principal mecanismo que regula la muerte Discusión Tesis Doctoral: Ulises Torres López 77 celular en líneas celulares tumorales después de la exposición a las estatinas (Cafforio y col., 2005; Rattan y col., 2006). Esta inhibición en la síntesis endógena de los lípidos isoprenoides resulta usualmente en modificaciones en los procesos de isoprenilación, y por tanto, de modificaciones post-traslacionales en ciertas proteínas que, a su vez, inhiben la activación de diferentes proteínas efectoras que intervienen en los procesos de señalización celular. Generalmente, estas proteínas que sufren modificaciones post-traslacionales pertenecen a la familia de proteínas Rho y K-Ras y son denominadas pequeñas GTPasas (Jani y col., 1993; Denoyelle y col., 2001; Kusama y col., 2001). Son numerosos los estudios aparecidos en los últimos años que demuestran el efecto de estos fármacos tanto en tumores sólidos (Beales y col., 2013; Park y col., 2013; Singh y Singh, 2013; Singh y col., 2013; Liu y col., 2014; Lytras y col., 2014; Yeganeh y col., 2014) como hematológicos (Qi y col., 2013; van Besien y col., 2013; Chae y col., 2014; Song y col., 2014). En todos casos se ha observado un retardo en el crecimiento tumoral y/o la inhibición del procesos metastático (Jakóbisiak y Golab, 2003). Adicionalmente, varios ensayos clínicos estudian actualmente la actividad antitumoral de las estatinas (Thibault y col., 1996; Larner y col., 1998; Dimitroulakos y col., 2001; Minden y col., 2001; Knox y col., 2005). Sin embargo, no existen referencias sobre el uso de las estatinas en los condrosarcomas, razón por la que decidimos estudiar en este tipo tumoral su acción sobre los fenómenos apoptóticos inductores de muerte celular tumoral. Por todo ello, el presente trabajo que presentamos como Tesis Discusión Tesis Doctoral: Ulises Torres López 78 Doctoral ha mostrado que las estatinas lipofílicas simvastatina, lovastatina, atorvastatina y fluvastatina, pero no la estatina hidrofílica pravastatina, tras inhibir a la enzima HMG-CoA reductasa, inhiben la viabilidad celular de las líneas celulares de condrosarcoma de rata LTC y C422 y la humana SW1353, además, de provocar la muerte celular por apoptosis de las mismas. Asociado a estos fenómenos, estos efectos de las estatinas lipofílicas en estas líneas de condrosarcoma mostraron una dependencia de RhoA, al alterarse su isoprenilación y delocalizarse de su posición membranal hacia la citosólica. En diferentes líneas celulares tumorales, como el cáncer de próstata, el carcinoma gástrico, el carcinoma pancreático, el adenocarcinoma de colon, el neuroblastoma, el glioblastoma, el mesotelioma, el melanoma y las células de la leucemia mieloide aguda ya ha sido mostrado por otros autores una inhibición de la viabilidad celular tras ser tratadas con estatinas (Sumi y col., 1992; Newman y col., 1997; Bouterfa y col., 2000; Kim y col., 2000). Sin embargo, en tumores de estirpe mesenquimal sólo hay datos consistentes en líneas celulares de osteosarcoma de rata. Recientemente se ha descrito que la simvastatina disminuye la viabilidad celular e induce apoptosis en la línea de osteosarcoma de rata UMR-106 (Sandoval-Usme y col., 2014). En los resultados que presentamos en la presente Tesis Doctoral demostramos que las estatinas ejercen un efecto deletéreo in vitro sobre la viabilidad celular de los condrosarcomas. Nuestros resultados demuestran una inhibición de la viabilidad celular en las líneas celulares de condrosarcoma de rata LTC y C422 tras ser estimuladas con FBS al 10% para favorecer el crecimiento y la Discusión Tesis Doctoral: Ulises Torres López 79 proliferación celular (Nagata, 1997). Este efecto fue independientemente de las características fenotípicas del tipo celular estudiado y, además, fue dependiente de la dosis y del tiempo durante el cual fueron tratadas las células. Así, por ejemplo, se observó que con la dosis de 10 µM de simvastatina la línea celular de rata C422 mostró mayor eficacia al cabo de 48 horas de tratamiento que en la línea celular de rata LTC; aunque la IC50 para las células C422 fue de 0.95 µM y para las LTC fue de 2.10 µM. En este sentido se sabe que a la concentración plasmática de 0.10 a 3.92 µM (24 mg/kg/día) corresponde a un rango de dosis que produce la apoptosis in vitro en diferentes tipos tumorales sensibles a estas drogas (Dimitroulakos y col., 1999; Dimitroulakos y col., 2001), estando en nuestro modelo en concordancia con estas observaciones. La IC50 media para las células C422 y para las LTC estuvo en torno 1.5 µM, mientras que en las células controles NIH3T3 fue de 4,75 (3 veces superior). Así mismo, otros autores han observado que las células normales parecen ser más resistentes a los efectos antiproliferativos de las estatinas que las células tumorales (Dimitroulakos y col., 2001; Kusama y col., 2001). En nuestros resultados llegamos a la misma conclusión, al observar como la viabilidad celular prácticamente no sufrió cambio alguno cuando se trataron los fibroblastos NIH3T3 y las células condroblásticas sanas, demostrándose con ello una mayor selectividad de la droga en las células tumorales del condrosarcoma. Otros autores, como Dimitroulakos y Newman (Newman y col., 1997; Dimitroulakos y col., 1999) ya apoyaron antes la hipótesis del efecto selectivo de las estatinas sobre células transformadas. Este dato parece estar también en correlación con los datos experimentales que Discusión Tesis Doctoral: Ulises Torres López 80 muestran mayor eficacia pro-apoptótica de las estatinas fundamentalmente en las células que están activamente proliferando (Han y Wyche, 1996; Park y col., 1999; Kim y col., 2000; Marom y col., 1994). Esto hace que este efecto apoptótico tenga mayor selectividad en las células tumorales que en las células sanas. Es importante destacar que la adición del mevalonato, producto de la reacción catalizada por la HMG-CoA reductasa, previno el efecto inhibitorio de la viabilidad celular tal y como otros autores ya habían informado previamente (Soma y col., 1992). Ello prueba que el efecto de estas drogas es dependiente específicamente de esta vía metabólica. Respecto a la capacidad de los lípidos isoprenoides FPP y GGPP para revertir el efecto de las estatinas, está claro que la acción es fundamentalmente dependiente del GGPP, resaltando con ello los fenómenos de geranilgeranilación como responsables de los efectos terapéuticos de las estatinas. Este efecto sobre la viabilidad celular en células de condrosarcoma de rata fue igualmente confirmado en la línea de condrosarcoma humano SW1353, comprobándose, al igual que en el caso de la rata, que este efecto fue tiempo y dosis dependiente, que fue contrarrestado por los miembros de la vía del mevalonato, esencialmente por este último y por el GGPP; y, un dato muy importante, es que este efecto sólo se produjo con la estatinas lipofílicas y no con las hidrofílicas, como la pravastatina. Diversos trabajos han mostrado que las estatinas inducen apoptosis a nivel experimental en diferentes modelos tumorales, como es el caso de la leucemia mono-mielocítica juvenil; en tumores el rabdo- Discusión Tesis Doctoral: Ulises Torres López 81 miosarcoma; en el meduloblastoma; en el mesotelioma maligno; en el astrocitoma; o en los carcinomas de células escamosas de cérvix, o de cabeza y cuello (Rubins y col., 1998; Bouterfa y col., 2000; Dimitroulakos y col., 2001; Dimitroulakos y col., 2002). En nuestro modelo, hemos demostrado que la simvastatina induce apoptosis en células de condrosarcoma de rata y humano, al observar una pérdida del anclaje celular al sustrato; al generarse cuerpos apoptóticos, al redondearse la célula y constreñirse el citoplasma; al producirse la fragmentación internucleosomal del ADN, característica de los procesos apoptóticos; y, por último, al producirse los cambios en el perfil de la citometría de flujo con Anexina-V y ioduro de propidio característicos de la apoptosis. Además, otro aspecto muy interesante de este trabajo, es que la apoptosis inducida en las células de condrosarcoma tras ser tratadas con estatinas sólo fue evidente cuando la estatina usada tenía características lipofílicas, pero no siendo sensibles a las hidrofílicas, como la pravastatina. En esta Tesis hemos demostrado, además, que los cambios apoptóticos inducidos por las estatinas se pueden revertir con mevalonato, lo cual indica que esta vía metabólica resulta imprescindible para la supervivencia celular de los condrosarcomas. Este mismo fenómeno ha sido observado por otros autores, los cuales han mostrado que la depleción de mevalonato es responsable de la apoptosis inducida por las estatinas (Xia y col., 2001). De todos los metabolitos que intervienen en esta vía metabólica, las evidencias científicas parecen demostrar que el único lípido isoprenoide capaz de inhibir la apoptosis tras ser tratadas con las estatinas es el GGPP, tal como ha sido defendido Discusión Tesis Doctoral: Ulises Torres López 82 por algunos autores (Marcelli y col., 1998; Agarwal y col., 1999; Xia y col., 2001). En concordancia con esta hipótesis, en nuestros resultados se demuestra que el GGPP previene la apoptosis inducida por simvastatina con mayor efectividad que el FPP, tal como ha sido observado por otros autores (Marcelli y col., 1998; Agarwal y col., 1999; Xia y col., 2001). Esto nos indica que la geranilgeranilación juega un papel crítico en los mecanismos de supervivencia de algunas células tumorales. Ahondando más en este aspecto, este hecho ha sido confirmado por otros autores usando inhibidores específicos de la geranilgeranil transferasa, como es el GGTI. Así, similares resultados se han observado experimentalmente al demostrarse que el GGTI es más potente que la lovastatina para producir apoptosis, mientras que este efecto fue más pobre cuando se añadía FTI (Xia y col., 2001). De igual manera, nuestros resultados demuestran que GGTI, mimetizando la acción de la simvastatina, fue más eficiente que el FTI para inducir apoptosis en las células de condrosarcoma humano. Ello, de nuevo, recalca el papel esencial de la geranilgeranilación en estos fenómenos observados en los condrosarcomas. Aunque no sabemos bien por qué la geranilgeranilación es más importante que la farnesilación de proteínas en la supervivencia celular, ya que aproximadamente sólo entre el 0,5% y el 1% de todas las proteínas celulares están geranilgeraniladas, y sólo un pequeño número de ellas han sido debidamente identificadas (Prendergast y col., 2000). Entre estas proteínas destacan las GTPasas de pequeño tamaño K-Ras y N-Ras, así como la familia de proteínas Rho. En base a este hecho, una hipótesis para demostrar que la disminución de la viabilidad celular y la inducción Discusión Tesis Doctoral: Ulises Torres López 83 de apoptosis tumoral de los condrosarcomas podría ser debido a que la depleción de este lípido isoprenoide provoca una inadecuada localización subcelular de estas proteínas geranilgeraniladas, (Cafforio y col., 2005). Se sabe que la prenilación de determinadas proteínas permite su localización en la membrana celular, lo cual condiciona su activación y la puesta en marcha de una respuesta celular en cascada (Van Aelst y D'Souza-Schorey, 1997). Como se ha dicho anteriormente, determinados integrantes de las GTPasas Ras y Rho son las principales proteínas modificadas post-translacionalmente por mecanismos de isoprenilación y, por tanto, son las principales dianas para los procesos inhibitorios de las estatinas (Liao, 2002). En consecuencia con lo dicho, nuestros resultados mostraron un aumento en los niveles de expresión de la proteína total RhoA cuando las células fueron tratadas con la simvastatina. Este resultado no significa que aumente la expresión de RhoA debido al tratamiento con la simvastatina, sino que estos cambios en la expresión de RhoA a nivel post-traslacional disminuyen la degradación de RhoA, produciendo un acúmulo en los niveles proteicos de su forma no isoprenilada, tal como fue demostrado por Stamatakis en 2002 (Stamatakis y col., 2002). La acción de la estatina fue contrarrestada por el co-tratamiento con mevalonato, demostrando de nuevo la implicación de esta vía metabólica en este efecto. Además, fue observado que el efecto sobre RhoA tras el tratamiento con simvastatina se reprodujo de igual forma con el tratamiento con las otras estatinas lipofílicas (fluvastatina, atorvastatina y lovastatina), pero no con la estatina hidrofílica (pravastatina), indicando con ello la selectividad en la acción de este subtipo de estatinas. 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