ENZYMATISCHE MODIFIZIERUNG VON ENZYMEN GLUCOAMYLASE ALS BEISPIEL AUS DER STÄRKEVERARBEITUNG

ENZYMATISCHE MODIFIZIERUNG VON ENZYMEN GLUCOAMYLASE ALS BEISPIEL AUS DER STARKEVERARBEITUNG G. Konieczny-Janda Miles Kali-Chemie GmbH & Co. KG Biochemisches Werk Hans-Böckler-Allee 20 D - 3000 Hannover 1 The chemical modification of microbial enzymes has gained increased importance. A controlled enzymatic treatment of biocatalysts can be another step towards "taylor-made" enzymes for use in food industry. The transformation of starch containing raw materials in maltose, glucose and fructose are established processes. Anyhow, it will be shown in this presentation, how a specific modification of ASPERGILLUS NIGER-Glucoamylases can lead to interesting properties in the application of industrial saccharification. During the late stage of the submerse production of glucoamylase from ASPERGILLUS NIGER, a proteolytic modification of the enzyme molecule happens. The formed enzyme shows a slightly different substrate specificity than the original enzyme. The properties of the purified glucoamylase-isoenzymes are demonstrated by means of degradation trials with branched and linear oligosaccharides. Isomaltose is formed as the main product of the reverse action from glucose as substrate by both isoenzymes. Both glucoamylases are able to split alpha-1-6-glucosidic bonds of maltooligosaccharides. The practical importance and possible influences of a certain isoenzyme ratio of commercial glucoamylases are explained with comparative saccharification trials using enzymatically liquefied wheat starch as substrate. 144 G. Konieczny-Janda Die industrielle Verzuckerung von Stärkehydrolysaten zur Produktion von Dextrose mit ASPERGILLUS NIGER Glucoamylasen wird seit vielen Jahren mit Erfolg durchgeführt. Eine kontinuierliche Weiterentwicklung dieser Verzuckerungsenzyme - wie z. B. die Entwicklung Transglucosidase-freier Glucoamylasen - hat zu einer wesentlichen Verbesserung der Glucoseausbeuten geführt. Eine weitere Optimierung dieses Enzymsystens ist jedoch nur über eine genaue Kenntnis der biochemischen Vorgänge bei der Produktion von Glucoamylasen, der Eigenschaften der gebildeten Proteine und deren anwendungstechnischer Bedeutung möglich. Aber auch eine Änderung des Rohstoffes - ein Teil des nach Europa zu importierenden Maises wird durch den heimischen Rohstoff Weizen ersetzt - führt durch die notwendig werdende Modifizierung der Prozeßbedingungen zu anderen Anforderungen an die verwendeten Enzyme. Der bekannte Forscher Ueda [1] fand 1957 in Japan, daß in Kulturfiltraten von ASPERGILLUS AWAMORI verschiedene Formen der Glucoamylase vorkommen. Inzwischen ist auch bei der Fermentation anderer Schimmelpilze, wie MUCOR [2], PENICILLIUM [3] und auch ASPERGILLUS NIGER [4,5] die Bildung mehrerer exogen wirkender Glucose-abspaltender Amylasen nachgewiesen worden. Eine Reihe interessanter Unterschiede in den Eigenschaften dieser Glucoamylase-Isoenzyme sind berichtet worden. Über die Bedeutung des einen oder anderen Isoenzyms beim technischen Prozeß der Verzuckerung ist allerdings wenig bekannt, obwohl in allen kommerziellen Glucoamylasen mehrere aktive Enzymfraktionen vorkommen. Man kann je nach Produzenten eine unterschiedliche Zusammensetzung der Isoenzymverteilung feststellen, z. T. von Charge zu Charge unterschiedlich. Eine Veränderung der Isoenzymverteilung schon während der Lagerung eines bestimmten Handelspräparates wurde von Svensson 1982 [5] beschrieben. In ASPERGILLUS NIGER-Glucoamylasepräparaten wurden bisher bis zu drei aktive Glucoamylasefraktionen nachgewiesen und in der Literatur beschrieben. Mit einer Verbesserung der Analysentechnik ist das Auffinden weiterer Komponenten nicht ausgeschlossen. Zur Festlegung der Nomenklatur wird das Protein mit dem höchsten Molekulargewicht als Glucoamylase I und das Enzym mit dem etwas niedrigeren Molekulargewicht und dem höheren isoelektrischen Punkt als Glucoamylase II bezeichnet. Die Primärstruktur der Glucoamylase I wurde durch Svensson [6, 7] und Mitarbeiter (Analyse der kompletten Aminosäuresequenz) und Pazur [8] und Mitarbeiter (Analyse des Kohlenhydratanteils des Enzyms) weitgehend aufgeklärt. In der gezeigten Tabelle sind einige der Eigenschaften dieser Isoenzyme dargestellt. Enzymatische Modifizierung von Enzymen 145 Isoenzym GAI GAIl Typ Glykoprotein Glykoprotein Molekulargewicht 110000 84000 (GPC) Isoelektrischer 3.25 3.58 Punkt Kohlenhydratanteil Mannose, Glucose, Mannose, Glucose, Galaktose Galaktose Protein-Kohlenhydrat44-46/ Mol Enzym 44-46/Mol Enzym Bindungsstellen Monosaccharid99-102/Mol Enzym 99-102/Mol Enzym äquivalente Tab.ı Eigenschaften der verschiedenen Aspergillus niger-Glucoamylasen Beide Enzyme sind Glykoproteine mit einem hohen Kohlenhydratanteil. Die über Eichproteine mit der Gelpermeationschromatographie ermittelten Molekulargewichte sind wie üblicherwiese bei Glykoproteinen mit einem relativ hohen Fehler behaftet; die über die komplette Aminosäuresequenz von Svensson erhaltenen Werte von 82 000 Dalton für Glucoamylase I und der um ca. 12 000 Dalton niedrigere Wert von 70 000 für GA II dürfte zuverlässiger sein. Der Saccharidanteil ist weitgehend 0glykosidisch an die Polypeptidkette gebunden. Es überwiegt Mannose, die an ca. 44 Bindungsstellen an Serin, Threonin und Asparagin in Form von Mono-, Di-, Trioder Tetrasacchariden gebunden ist [6]. Die Saccharide sind z. T. über 1-2 und 1-6 Bindungen verzweigt. Dieser Kohlenhydratanteil wird in Zusammenhang gebracht mit der fehlenden Präzipitierbarkeit durch Elektrolyte oder Tannin und einer guten Stabilität des Enzyms gegenüber thermischen und anderen chemischen Einflüssen. So bleibt nach Abspaltung des Saccharidanteils die Aktivität weitgehend erhalten, die Thermostabilität hat dann allerdings drastisch abgenommen. Der überwiegende Teil der Saccharide wurde in einem überraschend engen Bereich von ca. 70 Aminosäuren gefunden [7] (Abb. 1). 146 G. Konieczny-Janda Isoenzym GAI GAIl Native Starke - Adsorption + - - Abbau + w Pullulan — Abbau ++ + ++++: fast vollständig Verkleisterte Stärke - Abbau ++++ +++ Co +: gering =: nicht nachweisbar Tab.2 Wirkung von Aspergillus niger-Glucoamylasen auf hochmolekulare Substrate Glucoamylase I hydrolysiert hochmolekulare Substrate erheblich schneller als Isoenzym II. Dieses gilt besonders für alpha 1-6 Bindungen enthaltende Polymere, wie z. B. Pullulan. Auch verkleisterte Stärke wird von Glucoamylase II etwas langsamer und nicht so weitgehend wie durch Isoenzym I abgebaut (Tab. 2). Zur Untersuchung, ob dieses auch auf den hochmolekularen Anteil in verflüssigten Weizenstärkehydrolysaten zutrifft, wurde handelsübliche Weizen-A-Stärke nach Säure-Enzymoder Enzym-Enzym-Verflüssigung mit einer kommerziellen BACILLUS LICHENIFORMIS Alpha-Amylase OPTITHERM-L 420 auf unterschiedliche Dextrose-Äquivalente hydrolysiert. Die Temperaturen erreichten in der ersten Verflüssigungsstufe max. 160 °C, die enzymatische Verflüssigung der zweiten Stufe wurde bei 95 °C durchgeführt. Die Hydrolysate wurden bei pH 4,2 und 60 °C und einer Trockensubstanzkonzentration von 35 - 38 % verzuckert. Die eingesetzten Glucoamylasen waren Versuchsprodukte, bei denen durch gezielte Fermentation eines ASPERGILLUS NIGER Stammes ein bestimmtes Isoenzymverhältnis erhalten wurde. Die relative Alpha-Amylase-Aktivität in den Glucoamylasen war gleich hoch. Die verschiedenen Verflüssigungsverfahren zeigten zwar nach Verzuckerung unterschiedliche DX-Werte, der Einfluß der Isoenzymverteilung auf die Verzuckerung war aber in der Tendenz gleich. Enzymatische Modifizierung von Enzymen 147 NH2 NH> = ___ Kohlenhydratey seitenkette PolypeptidRiickgrat — Bereich (Ee = | \ = Sf COOH Protease COOH GLUCOAMYLASE | | [ GLUCOAMYLASE II Abb.1 Schematische Darstellung der Struktur und Bildung von Aspergillus niger-Glucoamylase GAI und GAIl (modifiziert nach B.Svensson et al) Dieses sehr einfache Modell zeigt, daß dieser hochglykosidierte Bereich ungefähr 100 Aminosäuren vom C-terminalen Ende lokalisiert ist. Die Glucoamylase II ist weitgehend identisch und unterscheidet sich nur durch ein fehlendes Stück von ca. 100 Aminosäuren, die immunologischen Eigenschaften sind gleich. Als Erklärung für diese große Ähnlichkeit kann z. B. das von Boel [9] und Mitarbeitern beschriebene splicing der Glucoamylase I-mRNA herangezogen werden, das zu sehr ähnlichen Proteinen führen kann. Allerdings deuten eine Vielzahl von Publikationen - besonders durch Hayashida [10, 11, 12] - auch auf die hier schematisch dargestellte Möglichkeit der proteolytischen Bildung vonn niedermolekularen Derivaten der Glucoamylase I während der submersen Fermentation hin. In der Tat gibt es viele andere Beispiele für eine spezifische Proteolyse, die eine große Rolle in vielen physiologischen Prozessen spielt. Die Aktivierung von Trypsinogen, des Diphterie Toxins oder die Umwandlung von Proglucagon in Glucagon oder Pro- 148 G. Konieczny-Janda insulin in Insulin sind nur einige Beispiele der Bedeutung der limitierten Proteolyse. A280 nm oe Retentionszeit (min) Abb.2 Gelpermeationschromatographische Analysen der Umwandiung von Aspergillus niger-Glucoamylase | in Glucoamylase II während einer Modellfermentation zur Produktion von Glucoamylase (2x Bio Rad TSK 250 -30 x 0.75 cm-. 0 5 mi/min Phosphatputfer pH 68) Tatsächlich läßt sich - auch bei der submersen Fermentation von ASPERGILLUS NIGR - mit der Gelpermeationschromatographie unter bestimmten Umständen mit fortschreitender Fermentationszeit ein zunehmender Umbau der zuerst gebildeten höhermolekularen Glucoamylase I in ein Enzym mit niedrigerem Molekulargewicht verfolgen (Abb. 2). Gleichzeitig steigt die Konzentration niedermolekularer Peptide im Nährmedium an. Dieser Abbau kann auch in vitro mit gereinigter Glucoamylase I und Protease stattfinden. Unter bestimmten Umständen kommt es zu einer weitergehenGen Hydrolyse, der Kohlenhydratgehalt kann dann abnehmen. Ein derartiger Mechanismus könnte auch die vorher erwähnte Verschiebung der Isoenzymverteilung während der Lagerung dieser bestimmten Glucoamylase herbeiführen. Zur näheren Untersuchung der anwendungstechnischen Eigenschaften der beiden hier gezeigten Glucoamylase-Isoenzyme wurden die Proteine aus unserem kommerziellen A. NIGER-Glucoamylasepräparat OPTIDEX durch Sephadex-G 25 und DEAE-Cellulose-Chromatographie präparativ gewonnen und über Rechromatographie mit einem Salzgradienten und weitgehender Ultrafiltration gereinigt. Die gefriergetrockneten Fraktionen zeigten sowohl mit der Ionenaustauschchromatographie als auch mit der Gelpermeationschromatographie einen homogenen Peak, bei der isoelektrischen Fokussierung wurde jeweils nur eine Bande gefunden. Die beiden hier Enzymatische Modifizierung von Enzymen 149 gezeigten Enzyme zeigen geringe Unterschiede im Temperatur-Aktivitäts profil. Relative Aktivität %) 100— ee ges a3 4 60 40 e Isoenzym | 4 Isoenzym Il = 4% lösliche Stärke 2— 1'h Reaktionszeit 0 TTS ae ] ] 60 62 64 66 68 70 Temperatur (°C) Abb.3 Einfluß der Temperatur auf die Aktivität von A.niger-Glucoamylase | und I! Unter diesen Bedingungen wurde das Optimum fiir beide Proteine bei 66 °C gefunden (Abb. 3). Bei höheren Temperaturen ist der Abfall der Aktivität bei Isoenzym I geringer. Der hier gefundene Unterschied in der Temperaturstabilität ist in Übereinstimmung mit den in der Literatur publizierten Daten. Wie bekannt, spielt die Reaktionszeit eine erhebliche Rolle, so liegt unter Verzuckerungsbedingungen die Optimaltemperatur bei 60 - 62 °C. Relative Aktivität (%) 100 oa 5 a > % 80— a 6o— 40— e Isoenzym | 4 Isoenzym Il = 4% lösliche Stärke 60°C 20-4 1h Reaktionszeit Abb.4 Einfluß des pH-Wertes auf die Aktivität von A.niger-Glucoamylase I und Il 150 G. Konieczny-Janda Das pH-Aktivitätsprofil (Abb. 4) der beiden Glucoamylasen zeigt Optima um pH 4,4 mit hohen Aktivitäten von Isoenzym I auch im stark sauren Bereich. Dieses mag beim Abbau der Stärke in Fruchtsäften von Bedeutung sein, ein positiver oder negativer Einfluß auf den DX-Wert bei der Verzuckerung konnte nicht gefunden werden. Allerdings liegt in der industriellen Praxis kein Acetatpuffer vor. Restaktivität pH (%) 100— 80 60 404 e lsoenzym | 204 4 Isoenzym Il Er ı T T | o 10 20 30 40 50 60 70 Inkubationszeit ıhı Abb.5 Aktivitätsabfall von A.niger-Glucoamylase | und Il in Gegenwart von Glucose und bei einem simulierten pH-Abfall während der Inkubation (30%-w/w-Glucose. 60°C. 180 GAU/kg Trockensubstanz) Mit 30 %iger Glucose und einem simulierten pH-Abfall von 4,2 auf 3,8 als Modell für die Bedingungen bei der enzymatischen Verzuckerung ist ein signifikanter Unterschied in der Restaktivität (Abb. 5) nicht zu beobachten. Nach 72 Stunden zeigen beide Glucoamylasen die gleiche Restaktivität. Der hier simulierte pH-Abfall von 0,4 Einheiten ist in der Praxis ebenfalls zu beobachten. Durch Bildung organischer Säuren kann er besonders bei der Verzuckerung von Weizenstärkehydrolysaten bis zu 0,6 Einheiten innerhalb 72 Stunden fallen. Enzymatische Modifizierung von Enzymen 151 Abb.6 Hydrolysegeschwindigkeiten unverzweigter Maltosacharide als Funktion des Polymerisationsgrades n - Abbau mit A.niger-Glucoamylase | und II - (100 mmol/l, 60°C, pH 4.2, 90 GAU/mol) Die Wirkung der Glucoamylase auf alpha-glykosidische 1-4 Bindungen steigt mit zunehmender Kettenlänge der Maltosaccharide an (Abb. 6), die Michaeliskonstante nimmt ab. Die Anfangshydrolysegeschwindigkeit nimmt allerdings nicht unbegrenzt zu, sie erreicht bei den hier gereinigten Alpha-Amylase-freien Glucoamylasen ein Maximum bei Maltotetraose und fällt danach wieder etwas ab. Dieser Abfall der Abbaurate läßt sich mit der Bildung nichtproduktiver Enzym-Substrat-Komplexe, besonders mit Substraten größerer Kettenlänge, erklären. Ein sehr ähnliches Verhalten wurde von Hiromi [13] für RHIZOPUS-Glucoamylasen beschrieben. Die Abbildung zeigt bei Maltose und besonders Maltotriose leicht höhere Abbaurraten mit Isoenzym II. Die Dosierung der Enzyme war aktivitätsgleich, gemessen an der Wirkung gegenüber löslicher Stärke; eine übliche Methode mit der wir auch unsere kommerziellen Glucoamylasen standardisieren. Der Abbau der in enzymverflüssigten Stärken praktisch vollständig erhaltenen 1-6 Bindungen stellt eine wesentliche Limitierung der Hydrolysegeschwindigkeit verflüssigter Stärke dar. Selbst die Abbauraten der den Verzweigungsstellen benachbarten 1-4 Bindungen sind deutlich herabgesetzt.