Die Gewinnung von Einzellerprotein unter Verwendung von Knallgasbakterien

Die Gewinnung von Einzellerprotein unter Verwendung von Knallgasbakterien R.M.Lafferty, A.Moser, W.Steiner Institut für Biochemische Technologie und Lebensmittelchemie Technische Hochschule Graz / Österreich Charakterisierung der Knallgasbakterien Unter den diversen Gruppen von Mikroorganismen, die für die Gewinnung von Einzellerprotein (EZP) eingesetzt werden könnten, nehmen die Gruppe der aeroben wasserstoff-verwertenden Mikroorganismen eine Sonderstellung ein. Im Vergleich zu den meisten anderen Mikroorganismen, die durch chemoorganotrophes Wachstum der EZP-Gewinnung dienen, sind die wasserstoff-verwertenden Organismen durch die Fähigkeit chemolitotroph zu wachsen gekennzeichnet. Die "Knallgasbakterien" können molekularen Wasserstoff oxydieren, Sauerstoff als Elektron-Akzeptor verwenden, und die im Stoffwechsel gewonnene Energie bzw. Reduktionskraft ausnutzen, um CO» zu reduzieren und in Form von Zellmaterial festzulegen. Die Fähigkeit, molekularenWasserstoff zu aktivieren, ist innerhalb mehrerer taxonomischer Gruppen von Mikroorganismen anzutreffen. Dies gilt z.B. für gewisse phototrophe Organismen, Clostridium aceticum, Micrococcus denitrificans, Mycobakterien, Corynebakterien und einige Actinomyceten z.B. Nocadia species. Die relätiv niedrigen Wachstumsraten vieler dieser Organismen schließen meistens eine praktische Anwendung für Zweckeder Einzellerprotein-Gewinnung jedoch aus. Diejenigen aeroben wasserstoff-verwertenden Mikroorganismen, die ambesten für die EZP-Produktion geeignet sind, gehören entweder zur Gattung Hydroge nomonas oder Alcaligenes (1). Diese "Knallgasbakterien" sind fakultativ chemolithotrophe Organismen. Chemoorganotrophes Wachstum kann aber auch mit mehreren organischen Substraten erfolgen. Werden chemoorganotroph wachsende Knallgasbakterien mit z.B. Fructose, Acetat oder Glutamat als Substrat in eine Wasserstoffatmosphäre gebracht, so wird die Verwertung dieser organischen Substrate durch einen Regulationsprozeß (2) unterbunden. Dieser "Wasserstoff-Effekt" ist scheinbar das Ergebnis einer KatabolitRepression. Problematik der Substratversorgung bei chemolithotroph wachsenden Knallgasbakterien Chemolithotrophes Wachstum erfolgt unter einer Atmosphäre von Hp, 0),und C0, in einem einfachen Mineralmedium mit folgender Zusammensetzung : NHC] ... 1.0 g, NagHPOg.12 HO ... 9.0 g, K HoPOg... 1.5 9, MgSQq-7,H90)...,0.2.g5 FeNH,-Citrat 0.008: 9, CaCL2.Hz0 0.0109, NaHCOz3 ... 0.5 g, Spurenelemente, aqua dest. ... ad 1000 1. Die Organismen sind mesophil, d.h. optimales Wachstum findet zwischen 280 und 35 0 statt; das pH-Optimum liegt zwischen 6,8 und 7,2. Das mögliche Spektrum der verwertbaren Stickstoffquellen umfaßt Ammoniak, Ammonsalze, Nitrat und Harnstoff. Sowohl die Zusammensetzung der Gasatmosphäre, insbesondere das Verhältnis Ho : 02, als auch die relativen Eintragsraten dieser beiden Gase im verwendeten Bioreaktor können die Wachstumsraten und auch die Anhäufung von intrazelluldren Speicherstoffen wie Poly-B-hydroxybuttersäure im Fall von wild-typ-Zellen der Gattung Hydrogenomonas stark beeinflussen. Molekularer Wasserstoff wird durch zwei intrazelluläre Enzymsysteme aktiviert - eine membrangebundene Hydrogenase und eine 1ösliche Hydrogenase. Scheinbar bewirkt das partikelgebundene System Wasserstoff- 88 R.M. Lafferty, A. Moser und W. Steiner oxydation mit Hilfe einer vollständigen Atmungskette, während die lösliche Hydrogenase, auch "Hydrogen-Dehydrogenase" genannt, lediglich die Reduktion von NAD durch Wasserstoff katalysiert (3). Das reduzierte NAD ist wahrscheinlich für das Funktionieren des reduktiven Pentose-Phosphat-Zyklus, in dem C02 inkorporiert wird, notwendig. Fig.1 stellt in schematischer Form das chemolithotrophe Wachstum der Knallgasbakterien dar. 0, Elektronena a nenese transportsystem ? H20 TP mre ADP+P, A Hy, py crogepDehydrogenase reduktiver PentosephosphatNAD NADH, | zyktus v co, (CH,0) Zellmaterial Fig.1. Chemolithotropher Stoffwechsel der Knallgasbakterien Bilanzmäßig kann man folgende Bruttogleichung für das chemolithotrophe Wachstum von Knallgasbakterien aufstellen : 6H, + 202 + 10 — —> (CH20) + 5 H20. Diese stoichiometrischen Verhältnisse können jedoch eine gewisse Variation aufzeigen. In Versuchen mit Hydrogenomonas eutropha in Kulturen im Turbidostat wurden C02 : O09 : Hp Aufnahmeraten von 1 : 1,2 : 4,5 bis 1 : 1,9 : 6,6 gemessen (4). Neuere Ergebnisse mit Hydrogenomonas eutropha Stamm H 16 (Alcaligenes eutrophus) zeigten jedoch, daß 4 Mol H sowohl für die energieliefernde Knallgasreaktion, als auch für die Reduktion von 1 Mol COg zur Zellsubstanz unter den angegebenen Bedingungen ausreichen (5). Auch friiher wurden von einer anderen Arbeitsgruppe mit dem Organismus Hydrogenomonas ruhlandii ähnliche Ergebnisse d.h. ein Verhältnis von 1: 1:4 für CO2 : 09 : Ho - Aufnahmsraten gemessen (6). Die Versorgung der chemolithotroph wachsenden Kultur von Knallgasbakterien mit den drei gasfdrmigen Substraten Ho, 02 und CO» stellt höhere Ansprüche hinsichtlich Gastransferraten an den Bioreaktor aie im gewöhnlichen Falle bei der Züchtung von aeroben Mikroorganismen, wobei lediglich die Sauerstoffeintragsgeschwindigkeit begrenzend auf das Wachstum der Zellen wirken könnte. Im Falle der Begasung mit Ha, O2 und CO2 kann die CO,-Versorgung der Zellen wegen der hohen Löslichkeit Giaces Gases als völlig ausreichend betrachtet werden. Dagegen können die Konzentrationen von gelösten Hy und 0, in der Nährlösung die begrenzenden Faktoren für das Wachstum der Knallgasbakterien sein. Die Versorgung der Knallgasbakterien mit Ho und 0, in einer Fermenteranlage d.h. mit einer explosiven Gasmischung verursacht &inige technische Problene. Die Beseitigung der möglichen Gefahrenquellen läßtsich jedoch durch Einhalten der normalen Vorschriften für das Arbeiten mit explosiven Gasen erreichen. Für kleinere Laborversuche bzw. fürdie Anzucht von Fermenter-Vorkulturen von Knallgasbakterien können spezielle Schüttelkolben mit Schikanen verwendet werden. Die Begasung der Kulturen erfolgt mittels eines Gasreservoirs, das unter einem geringen hydrostatischen Druck steht. Einzellerprotein durch Knallgasbakterien 89 Das Animpfen von Laborfermentern erfolgt in der üblichen Weise mit Ansteckkanüle. Da Knallgasbakterien - EZP bei Tierfütterungsversuchen eingesetzt wird, sollte die Verwendung von Antischaummitteln im Fermenter vermieden werden. Bedingt durch die Anforderung eines effektiven Gastransports, um möglichst hohe Wachstumsraten zu erreichen, entsteht das Problem der Schaumbildung als Folge einerintensiven Mischung auch mit einem einfachen Mineralmedium wegen Ausscheidung bzw. Bildung von Kapselsubstanzen. Ein mechanisches Schaumbekämpfungssystem ist also erforderlich. Die bisherige Erfahrung hat gezeigt, daß entweder ein Umlauf, bzw. ein UmwurfMischsystem im Kleinfermenter (Fig.2) diese Anforderungen erfüllt. Der Fermenter wird mit Meßsonden für 02, CO2, pH und Redox-Messungen ausgestattet. Die Regelung der Gasversorgung der Knallgasbakterien-Kultur im Kleinfermenter mitden drei Gasen Hn, O0» und CO, kann entweder mittels Durchflußmesser mit Rückitffepenzregfer oder mittels Gaspumpen (Fa. Wösthoff/Bochum), die kontinuierlich variable Gasförderraten erlauben, erfolgen. — Cg ,0g,Hg = Ht SRI —o, CAR» ru =x Antrieb A —<)—H, EG, @ Nährlösungs- (4) ä pumpe > 4)—co, Gaspumpen Fig.2. Schema der kontinuierlichen Ziichtung von Knallgasbakterien im Fermenter. Aufstellen der Modellgleichungen für die Makrokinetik Basierend auf den bisherigen Ergebnissen wurde der Versuch unternommen, ein makrokinetisches Modell des chemolithotrophen Wachstums von Knallgasbakterien aufzustellen. Ein Zweck solcher Modellbildung ist es, gezielte Experimente durchzuführen, welche es ermöglichen, die prozeßbestimmenden Größen, die Modellparameter zu messen. Damit sollte dann auch eine Verbesserung des Modelles vorgenommen werden können, um die Produktivität sowie das Verhalten des Prozesses vorauszuberechnen. Die Modellgleichungen für kontinuierliche Züchtungen beziehen sich aufdie Konzentrationsänderung von Zellmasse X in Abhängigkeit der drei gasformigen Substrate Hp, 02, COo (H, 0, C) und eines möglichen limitierenden Substrates in der Flüssigkeit S. Dieses limitierende Substrat S konnte entweder 90 R.M. Lafferty, A. Moser und W. Steiner Magnesium-, Eisenoder die Stickstoffquelle sein. Mit Hilfe der MonodBeziehung wurden folgende Modellgleichungen fiir diese Multisubstratkinetik aufgestellt : ty nr len | A ES N 1) ae FR KO 1+O/K, Kec KeS 2) an - Be “pX + ka-(HH) +D-(H,- H) 3) $0. “x +fcalOQ) +D-(Q,- 0) 4) ee. = ye +alCale +D-C,-C) 5) $$--+ ux .pis-s) sx In der Gleichung (1) bedeuten die K-Werte (Ky, Kg»Kes Ks) die Monod-Konstanten fürdie verschiedenen Substrate und Jm die maximale relative Wachstumsgeschwindigkeit. In dieser Gleichung wurde der bereits bekannte Effekt der Sauerstoffinhibition im Falle der Knallgasbakterien durch den Term Ky berücksichtigt. Weiters wurden die Massentransporte, welche beim kontinu - ierlichen System durch Zuund Abfluß hervorgerufen werden, durch einen Termder Verdünnungsgeschwindigkeit D in die Gleichungen einbezogen. In den Gleichungen 2-4 wurden für die gasförmigen Substrate die Transportvorgänge durch die Stofftransportkoeffizienten (ky He ky Q> k c) beschrieben. Zusätzlich ist beim CO,-Transport in Gleichung 4 prinzipiell auch der Vorgang der chemischen Reaktion mit einer Geschwindigkeitskonstante ky, einer Reaktionsordnung n und einem Diffusionskoeffizienten D in Betracht zu ziehen, wodurch der Term des Stofftransportes entsprechend zu erweitern ist. Fur die Anderungsgeschwindigkeit der Substrate wurden Ertragskonstanten (Yx,H> Yx,0> Yx,c> Yx,s) herangezogen, welche die Relation zur relativen Wachstumsgeschwindigkett Y herstellen. Sämtliche Modellparameter, die in den Modellgleichungen vorkommen, sind nun experimentell in einerSerie von Versuchen bestimmbar, wenn die Voraussetzungen hinsichtlich Stofftransport erfüllt sind. Diese betreffen neben dem Mischverhalten des Fermenters vor allem die Eintragsgeschwindigkeit von Wasserstoff und Sauerstoff. In allen bisher bekannten Arbeiten waren diese Transporte limitierend, so daß eine lange lineare statt exponentielle Wachstumsphase auftrat. Daherwaren die kinetischen Parameter verfälscht. Um nun die Eintragsgeschwindigkeit von Wasserstoff und Sauerstoff zu verbessern, stehen die bekannten drei Möglichkeiten zur Verfügung: l. Erhöhen des Konzentrationsgradienten (c¥ - c_) durch z.B. :Anwenden höherer Drücke. 2. Vergrößern der spezifischen Austauschoberfläche a durch z. B.: Verkleinern der Blasengröße. 3. Vergrößern des Stofftransportkoeffizienten k, durch Verbessern der Turbulenz in der Phasengrenzfläche. Als Schlußfolgerung dieser Überlegungen sollte ein Fermenter eingesetzt werden, der diese Voraussetzungen hinsichtlich Stofftransport und Mischverhalten hat und der entsprechend der Makrokinetik eine Verweilzeit aufweist, so daß ein optimaler Umsatz gewährleistet ist. Falls alle Substrate im Überschuß d.h. über dem Wert der kritischen Konzentrationen angeboten werden, sollte zu erwarten sein, daß ein Fermenter mit Mischung und Rührnn esesesi‘“‘“ai‘“<i<i<i<i<i<i‘<i‘i‘i‘i‘i Einzellerprotein durch Knallgasbakterien 91 kesselcharakteristik den besten Umsatz ergibt. Aus wirtschaftlichen Überlegungen heraus dürfte weiters zu empfehlen sein, die Gase in einem geschlossenen Gaskreislauf (d.h. Regelung des Zuflusses nach dem Partialdruck des Gases im Kreislauf) zu führen. Um das Problem des Stofftransportes, dem bei Multisubstratbedingungen eine besondere Bedeutung zukommt, und der Explosionsgefahr im Falle der Knallgasbakterien zu lösen, ist es notwendig, neue Arten von Fermenteranlagen einzusetzen. Ein Bioreaktor,der sowohl einen verbesserten Stofftransport, als auch die Möglichkeit der Anwendung eines geschlossenen Gaskreislaufes ermöglichen könnte, ist das "Tauchstrahl-Begasungssystem" (Fa. Vogelbusch/Wien). Bei diesemSystem (Fig.3) wäre das Problem der Explosionsgefahr durch die Abwesenheit eines mechanischen Rührsystemes besonders gut gelöst. Zudem ist die inhärente Schaumvernichtung in diesem Mischsystem besonders effektiv, so daß weder die Zugabe von chemischen Antischaummitteln, noch eine zusätzliche mechanische Schaumzerstörungseinrichtung erforderlich wären. 619.3. Vogelbusch-IZ-TauchstrahlBegasungssystem. Biologische Bewertung von Knallgasbakterien - EZP Sowohl das vorhandene Spektrum der essentiellen Aminosäuren (Tab.1), als auch die Ergebnisse der Ernährungsversuche bei Tieren zeigen, daß Knallgasbakterien entweder fürdie direkte Tierernährung oder für Getreideanreicherungszwecke geeignet sind (7). Aminosäure - Zusammensetzung n. Calloway u. Kumar (1969) Aminosäure Hydrogenomonas eutropha Casein (g/16 g N) (g/16_g N) Threonin 4.52 4,30 Methionin 2,69 3,10 Lysin 8,61 8,06 Isoleucin 4,58 6,59 Tyrosin 35,26 5,86 Arginin 8,00 4.10 Alanin 8.80 3.38 Asparaginsäure 9,57 7,44 92 R.M. Lafferty, A. Moser und W. Steiner Biologische Verwertbarkeit in Tierversuchen n. Calloway u, Kumar (1969) Proteinquelle N-Verwertung % Biologischer Wert % Casein 93 77 Hydrogenomonas eutropha 94 77 Tab.1. Aminosäure-Zusammensetzung und Biologische Verwertbarkeit von Knallgasbakterien-Einzellerprotein. Das Lysin-Gehalt von Knallgasbakterien ist z.B. mitdem des Caseins vergleichbar. Zwei weitere kritische Probleme beim Einsatz von EZP sind erstens der hohe Nukleinsäuregehalt von Bakterien und zweitens die Speicherung von nicht verwertbaren, d.h. bei höheren Tieren, intrazellulären Speicherstoffen wie Poly-ß-hydoxybuttersäure (PHB). Im Falle von Knallgasbakterien können diese möglichen negativen Eigenschaften umgangen werden. Obwohl PHB der häufigste Speicherstoff bei Mikroorganismen ist, lassen sich Knallgasbakterien genetisch so manipulieren, daß die PHB-Synthese blockiert ist, während die Wachstumsrate der Zellen unverändert bleibt. Weiterhin läßt sich der Nukleinsäuregehalt der Zellen durch eine Hitzeschockbehandlung sehr stark herabsetzen (8). Der Verdauungskoeffizient des"Knallgas"-EZP und andere Arten von EZP hängt vom Zustand der Zellen,d.h. der Zellwand bzw.-membran, ab. Tierernährungsversuche haben gezeigt, daßdie Zerstörung der Zellwand bzw. der Zel1Imenbran die Verdaulichkeit desEZP in allen Fällen erhöht (9). Da die Knallgasbakterien (Hydrogenomonas spec.) gram-negative Mikroorganismen sind, deren Zellwandstruktur physikalisch schwächer als dieder gram-positiven Organismen ist, dürfte per se ein Zellaufschluß mit weniger Energie fe Einheit der Biomasse durchzuführen sein. Die Methoden des Zellaufschlusses und die anschließende Aufarbeitung desEZP sind zum Teil bis jetzt wenig untersucht worden. Zellaufschluß und EZP-Behandlung beeinflussen nicht nur die Wirtschaftlichkeit des Prozesses, sondern auch die biologische Wertigkeit des Produktes. Es ist z.B. bekannt, daß ein Verlust an Lysin durch zu hohe Temperaturen bei der Sprühtrocknung vonEZP auftreten kann. Knallgasbakterien als eine EZP-Quelle besitzen den Vorteil, daß unter chemolithotrophen Wachstumsbedingungen nur einfache, physiologische, unbedenkliche Substrate verwendet werden. Sicherlich können die bisher verwendeten Nährlösungen optimiert werden; auch eine mehrmalige Verwendung der Nährlösung dürfte möglich sein. Weiterhin wurde in letzter Zeit festgestellt, daßeinige Knallgasbakterien atmosphärischen Stickstoff zu fixieren vermögen (10). Dieser Aspekt des Stoffwechsels der Knallgasbakterien könnte zu einer weiteren Vereinfachung der Gewinnung von EZP mit Hilfe der Knallgasbakterien führen. Literatur (1) ochlegel,H.G. ,Lafferty,R.M. ,Adv.Biochem.Eng.1,(1970) 143-168. (2) Schlegel ,H.G. ,Eberhardt ,U.(1972) Adv.Microbiol.Physiol.7,205-242. (3) Pfitzner,J.,(1972) Zb1.Bakt.Hy.,I.Abt.Orig.A220, 396-401. (4) Ammann ,E.C.B.et al. ,(1968)App] .Microbiol.16, 822-826. 5) Robra,K.H., Vortrag 2tes Symp.Göttingen 1974. 6) Packer,L.,Vishniac,W.,(1955) J.Bacteriol.70, 216-223. 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