UNIVERSIDAD DE SEVILLA
FACULTAD DE FARMACIA
TESIS DOCTORAL
NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS PARA VEHICULIZAR ACTIVOS
FARMACÉUTICOS AL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL
Memo ia p esen ada po la licenciada Mª DOLORES
CAYERO OTERO pa a op a el Tí ulo de Doc o po la
Uni e sidad de Se illa.
Se illa, sep iemb e 2018
Memo ia p esen ada po Mª Dolo es Caye o O e o pa a op a al
Tí ulo de Doc o po la Uni e sidad de Se illa
Fdo.: Mª Dolo es Caye o O e o
VºBº
Las Di ec o as del T abajo
Fdo.: D a Me cedes Fe nández A é alo Fdo.: Lucía Ma ín Bande as
FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE FARMACIA Y TECNOLOGÍA
FARMACÉUTICA
C/ P o eso Ga cía González, 2
41012 Se illa (España)
Telé ono: 954 55 67 26
Fax: 954 55 60 85
E-mail: [email p o ec ed]
h p://depa amen o.us.es/ ecno a ma/
C/ P o eso Ga cía González, 2
41012 Se illa (España)
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Índice de con enidos
RESUMEN……………………………………………………………………………………………2
1 INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 5
NANOMEDICINA Y NANOTECNOLOGÍA ................................................ 5
1.1.1 NPs como ehículos de á macos .................................................... 7
1.1.2 Políme os empleados ........................................................................... 8
BARRERA HEMATOENEFÁLICA (BHE) .................................................. 9
1.2.1 Mo ología y unciones de la BHE ................................................ 10
1.2.2 Sis emas de anspo e a a és de la BHE ............................... 16
ESTRATEGIAS PARA EL DIRECCIONAMIENTO DE ACTIVOS
HACIA EL SNC…………………………………………………………………...……………21
1.3.1 Mé odos in asi os .............................................................................. 22
1.3.2 Mé odos no in asi os ........................................................................ 26
1.3.3 Funcionalización supe icial de las NPs..................................... 31
1.3.4 Nose- o-b ain ........................................................................................ 48
VENLAFAXINA (VLX) COMO FÁRMACO MODELO .......................... 56
2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 59
3 HIPÓTESIS ................................................................................................................. 61
4 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 63
MATERIALES .................................................................................................. 63
MÉTODOS ........................................................................................................ 66
4.2.1 P epa ación de las NPs ..................................................................... 66
4.2.2 Modi icación supe icial de las NPs de PLGA........................... 70
4.2.3 P epa ación de NPS luo escen es pa a es udios in i o de
cap ación celula ..................................................................................................... 72
4.2.4 P epa ación de las NPs luo escen es pa a es udios de
pe meabilidad ......................................................................................................... 73
4.2.5 P epa ación de NPs luo escen es con FITC encapsulado
pa a es udios de biodis ibución ..................................................................... 74
4.2.6 Es udios de ca ac e ización isicoquímica de las NPs ......... 75
4.2.7 De e minación de la e iciencia de encapsulación y ca ga de
á maco………………………....………………………………………………………..….77
4.2.8 De e minación de la e icacia de uncionalización ................. 79
4.2.9 Es udio de la in luencia de la congelación en las NPs.
Op imización de las condiciones de lio ilización. ...................................... 80
4.2.10 Es udios de libe ación in i o ....................................................... 82
4.2.11 Es abilidad de las o mulaciones de NPs en líquido
ce alo aquídeo (LCR) a i icial ....................................................................... 83
4.2.12 Es udios celula es in i o ............................................................... 84
4.2.13 Es udios in i o en animales de expe imen ación ................. 95
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 100
Es udios de ca ac e ización de las NPs p epa adas .................... 100
5.1.1 De e minación del amaño medio y dis ibución de
amaños……. ........................................................................................................... 100
5.1.2 De e minación de la ca ga eléc ica supe icial de las NPs
105
5.1.3 Es udio de la mo ología ............................................................... 110
5.1.4 De e minación del con enido en á maco (VLX) ................ 110
5.1.5 Análisis de la e icacia de uncionalización ............................. 112
5.1.6 Es udio de la in luencia de la congelación en las NPs.
Op imización de las condiciones de lio ilización.................................... 114
5.1.7 Es udio de libe ación in i o ...................................................... 119
5.1.8 Es abilidad de las NPs en líquido ce alo aquídeo ............ 121
5.1.9 Es udios in i o de oxicidad celula ...................................... 122
5.1.10 Es udios in i o de in e nalización celula ........................... 124
5.1.11 Es udios de pe meabilidad a a és de un modelo de
ba e a in i o….. ................................................................................................ 129
6 CONCLUSIONS ...................................................................................................... 148
7 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 152

ÍNDICE DE FIGURAS
Figu a 1
Esquema de la BHE
11
Figu a 2
Rep esen ación esquemá ica de allada de las
p o eínas que componen las uniones es echas
y adhe en es
12
Figu a 3
Esquema del ecep o de ans e ina
18
Figu a 4
P incipales sis emas de anspo e a a és de
la BHE
21
Figu a 5
Esquema del mecanismo de acción de los
p o á macos a a és de la BHE.
27
Figu a 6
Rep esen ación esquemá ica de las u as de
acceso al sis ema ne ioso cen al po ía
in anasal (Nose- o-b ain)
51
Figu a 7
P incipales e apas del mé odo de e apo ación
del disol en e de una emulsión.
67
Figu a 8
Esquema de las eacciones que comp enden la
uncionalización de NPs a a és del mé odo
ca bodiimida.
71
Figu a 9
P incipales es uc u as de modelos celula es de
ba e a. (A) Modelo monocu i o; (B-C) Modelos
cocul i o con con ac o; (D-E) Moelos cocul i o
sin con ac o y (F-G) Modelos de cocul i o iple.
91
Figu a 10
Rep esen ación esquemá ica del modelo in
i o de BHE empleado en los ensayos de
pe meabilidad ( ipo monocapa).
92
Figu a 11
His og amas de los amaños de las
o mulaciones de NPs blancas, uncionalizadas
y sin uncionaliza .
102
Figu a 12
His og amas de los amaños de las
o mulaciones de NPs ca gadas con á maco,
uncionalizadas y sin uncionaliza .
102
Figu a 13
Valo es de po encial ze a de NPs de PLGA
blancas y ca gadas con á maco ob enidos pa a
las NPs ecién p epa adas, as un p ime
la ado po ul acen i ugación y as un segundo
la ado.
108
Figu a 14
Valo es de e icacia de encapsulación (EE%) y
ca ga de á maco ob enidos pa a pa ículas
p epa adas con di e en e concen ación inicial
de á maco.
112
Figu a 15
E ec o de la adición de di e en es
concen aciones de ealosa en el amaño y
dispe sión de las pa ículas as un p oceso de
congelación.
116
Figu a 16
His og amas de amaños pa a las NPs después
de un p oceso de congelación esuspendidas en
di e en es medios.
117
Figu a 17
In luencia de la adición de di e en es
concen aciones de ealosa en el amaño y
dispe sión de las pa ículas as un p oceso de
li ilización.
118
Figu a 18
His og amas de amaños pa a las NPs después
de un p oceso de lio ilización esuspendidas en
di e en es medios.
119
Figu a 19
Pe iles de libe ación in i o pa a NPs no
modi icadas y modi icadas supe icialmen e.
120
Figu a 20
Tamaño y PdI de las pa ículas an es y después
de la incubación en LCR du an e 24 h.
122
Figu a 21
Viabilidad celula en células hCMEC/D3 as la
incubación con NPs de PLGA sin modi ica y
modi icadas supe icialmen e, blancas y
ca gadas con VLX, a di e en es concen aciones
du an e 24 h.
124
Figu a 22
Es udio cuali a i o de cap ación celula .
Imágenes ob enidas po mic oscopía con ocal
de células hCMEC/D3 después de 30 minu os
de incubación con di e en es o mulaciones de
NPs de PLGA ca gadas con NR a 37 ºC. (A) NPs
no modi icadas supe icialmen e; (B) NPs
modi icadas con T ; (C) NPs modi icadas con
T Rp
127
Figu a 23
His og amas ob enidos as el es udio
cuan i a i o de la luo escencia po ci ome ía
de lujo en las células hCMEC/D3 as 30
minu os de incubación con di e en es
o mulaciones de NPs ca gadas con NR. (A)
Con ol (células sin NPs); (B) NPs de PLGA no
modi icadas supe icialmen e; (C) NPs de PLGA
modi icadas con T ; (D) NPs de PLGA
modi icadas con T Rp.
129
Figu a 24
Valo es de TEER de las células hCMEC/D3
cul i adas en inse os T answell de 0.4 µm pa a
ambos expe imen os.
131
Figu a 25
Valo es de TEER pa a ambos expe imen os de
pe meabilidad (NPs y á maco) an es y después
de la incubación con las NPs
132
Figu a 26
Po cen aje de NPs luo escen es
( uncionalizadas y no uncionalizadas) en el
lado basola e al después de los iempos
p ede e minados
134
Figu a 27
Concen aciones de á maco en el lado
basola e al de di e en es o mulaciones (VLX
lib e, NPs ca gadas con VLX sin uncionaliza y
uncionalizadas con T o T Rp)
136
Figu a 28
Imágenes de mic oscopía con ocal de secciones
de ce eb o en a ones con ol (A) y as 24 h de
una adminis ación aguda (130mg/kg) de NPs
luo escen es no uncionalizadas (B),
uncionalizadas con T (C) y uncionalizadas
con T Rp (D).
139
ans e ina
PBS
Tampón os a o salino
PCL
Poli-ε-cap olac onas
PDGFRβ
Fac o de c ecimien o de i ado de plaque as
PEG
Polie ilenglicol
Pép ido Aβ
Pép ido β-amieloide
PFA
Pa a o maldehído
PLA
Ácido polilác ico
PLGA
Ácido poli-(D,L-lác ico-co-glicólico)
PLGA-PEG
Ácido poli-(D,L-lác ico-co-glicólico) con cadenas de
polie ilenglicol
PVA
Alcohol poli inílico
RG2
Células de glioma de a a
RMP-7
Agonis a de la b adicinina
S1
Pép ido co o inhibido de las placas β-amieloide
SH-SY5Y
Línea celula de neu oblas oma
SNC
Sis ema ne ioso cen al
SRE
Sis ema e iculoendo elial
Tc-99m
Tecnecio 99 me aes able
TEER
Resis encia eléc ica ansendo elial
T
T ans e ina
T Rp
Pép ido especí ico del ecep o de ans e ina
TGN
Pép ido de 12 aminoácidos pa a di eccionamien o
ce eb al
U-87 MG
Línea cellula humana de glioblas oma
UHPLC-
MS/MC
C oma og a ía líquida de ul a-al a esolución
acoplada a espec ome ía de masas
VLX
Venla axina

1
ABSTRACT
2
Cu en ly, nano echnology has become in an eme gen
science. I o e s he possibili y o de elopmen o no el p oduc s
and nume ous applica ions o se e al ields like alimen a y,
cosme ic o enginee indus y. In his sense, nanomedicine is an
inno a i e al e na i e ocused in he imp o emen o adi ional
he apies, a use ul ool o sol e nume ous pha macokine ics and
pha macodynamics d awbacks o con en ional ea men s and i
can be able o con ol he physicochemical and biopha maceu ical
beha io . Speci ically, polyme ic nanopa icles (NPs) a e widely
used as d ug anspo sys em in a nanome ic scale and p esen
a ious ad an ages compa ed o adi ional pha maceu ical o ms.
On he o he hand, he ea men o di e en diseases which
a ec o he b ain esul s e y di icul due o he p esence o
blood-b ain ba ie (BBB). This ba ie es ic he passage o oxic
subs ances and i us which can be ha m ul o ne ous sys em
(CNS) bu , un o una ely, i also impede ha d ugs and he apeu ic
ac i es can c oss i , p e en ing an e ec i e ea men o neu onal
diso de s. Speci ically, dep ession is a majo in e na ional heal h
p oblem; a ec ing millions o people wo ldwide. Ac ually, no d ugs
p o ide he apeu ic bene i o app oxima ely one hi d o
dep essed pa ien s. Wi h dep ession p edic ed o become he
numbe one global disease bu den by 2030, i is impe a i e ha
new he apeu ic in e en ions a e es ablished. In he p esen wo k
we used enla axine as an idep essan d ug model.
The e o e, he main objec i e o his doc o al hesis has
been he de elopmen o biodeg adable and biocompa ible
polyme ic sys em in a nanome ic ange o imp o e he d ug
3
deli e y in CNS which is limi ed by he p esence o BBB using a
dual ac ion an idep essan as model d ug.
Fi s ly, we de eloped a VLX loaded-polyme ic nanosys em
based on poly(lac ic-co-glycolic acid)(PLGA), a US Food & D ug
Adminis a ion (US FDA)-app o ed biocompa ible and
biodeg adable polyme . Pa icles we e su ace unc ionalized wi h
wo di e en ligands agains ans e in ecep o : ans e in (T )
and speci ic cell-pene a ing pep ide o his ecep o (T Rp).
Pa icles we e p epa ed using a double emulsion-sol en
e apo a ion me hod and unc ionalized employing ca bodiimide
s a egy. Plain and unc ionalized NPs we e e alua ed and
cha ac e ized o pa icle size and size dis ibu ion, ze a po en ial
and mo phology. Encapsula ion e iciency was calcula ed by a
alida ed HPLC me hod and conjuga ion e iciency was es ima ed
using a BCA ki .
In o de o de e mine he elease p o ile, an in i o d ug
deli e y assay was pe o med and he s abili y o NPs was analyzed
a e incuba ion in a i icial ce eb ospinal luid and a e eezing
and lyophiliza ion p ocess.
Fo in i o cy o oxici y s udy, a colo ime ic assay was
ca ied ou in o de o quan i y he cell iabili y a e incuba ion
wi h NPs. Cell up ake o polyme ic pa icles was e alua ed by
quali a i e and quan i a i e s udies. Fo quan i a i e analysis,
con ocal lase scanning mic oscopy was used and quali a i e
de e mina ion was achie ed by low cy ome y. To isualize NPs, a
4
luo opho e loaded-pa icles (Nile-Red) we e employed as a
ma ke and he nuclei was s ained wi h Hoechs ® 33342.
Fo he s udy o pe meabili y ac oss he BBB, an in i o
model was de eloped, employing FITC-PLGA NPs o his pu pose.
D ug pe meabili y was e alua ed by ul a-high-p essu e liquid
ch oma og aphy/ andem mass spec ome y (UHPLC-MS/MS) and
NPs pe meabili y was es ima ed measu ing he luo escence in
basola e al side.
Fo all cell s udies, immo alized human ce eb al mic o ascula
endo helial cell line (hCMEC/D3) was used.
Rega ding in i o s udies, he abili y o NPs o c oss he BBB
was e alua ed. Fo his, C57/bl6 mice we e adminis e ed
in a enously du ing 7 days o ch onic adminis a ion and wi h
wo di e en pa icle concen a ions o single-dose. B ain and
spleen we e collec ed in o de o quan i y he luo escence by
con ocal mic oscopy and low cy ome y.
In i o biodis ibu ion s udies we e pe o med using
C57/bl6 mice. Fo his, luo escen NPs wi h encapsula ed-FITC as
luo opho e we e adminis e ed in anasally using nose- o-b ain
p ahway and, a e 30 minu es, spleen, b ain, hea , lungs, li e and
kidneys we e collec ed and analyzed by low cy ome y. The
pe cen age o pa icles de ec ed was exp essed as he a io o he
luo escence uni o each issue ela i e o he sum o luo escence
uni s o all he issue analyzed and luo escence o each o gan om
ea men g oup was compa ed o luo escence o con ol g oup.
5
1 INTRODUCCIÓN
NANOMEDICINA Y NANOTECNOLOGÍA
En la ac ualidad, la ocalización del campo a macéu ico se
cen a en la pe sonalización de los a amien os según pacien e y
pa ología, así como en el desa ollo de nue os sis emas de
adminis ación de á macos, capaci ados pa a con ola los
compo amien os isicoquímico y bio a macéu ico, Lo que pa ece
e iden e es que, sal o pa a cie as si uaciones, ac ualmen e esul a
insu icien e el descub imien o y desa ollo de nue as moléculas
con una de e minada ac i idad a macológica pa a p opo ciona
una mejo a en las e apias si no an acompañadas de sis emas de
adminis ación más e icaces. La azón del acaso en la e apéu ica
ac ual puede debe se a nume osas causas de ca ác e ísico-
químico y biológico que se aducen en baja o inco ec a
biodisponibilidad, mo i ada po una abso ción y/o solubilidad
limi ada del á maco, ápido me abolismo y co a du ación del
e ec o a macológico, p esencia de e ec os secunda ios no deseados
y llegada de ac i os a localizaciones no deseadas del o ganismo,
en e o as.
En es e sen ido, la nano ecnología, desc i a gene almen e
como el es udio de ma e iales y enómenos ísicos, químicos,
bio ísicos y bioquímicos en la escala nanomé ica (Sweeney 2015)
juega un papel des acado, p opo cionando nue as al e na i as pa a
ehiculiza ac i os a macéu icos, p oduc os de in e és alimen a io
o cosmé icos, po pone algunos ejemplos. Aunque los angos de
amaño pa a la de inición siguen siendo, a día de hoy, obje o de

6
deba e y la legislación que lo egula muy escasa (B egoli e
al. 2016), la nanociencia y sus aplicaciones cons i uyen sin duda
una in e esan e pla a o ma pa a el con ol y la manipulación de los
ma e iales a nanoescala (Fa ehi e al. 2012), al posibili a el
desa ollo de sis emas de adminis ación más e icien es
compa ados con la a maco e apéu ica adicional.
Además, la nano ecnología a macéu ica ambién o ece
bene icios impo an es en o as á eas como pueden se el empleo
de imágenes pa a diagnós ico, la alo ación de la e icacia de un
a amien o en iempo eal o la aplicación en odon ología
(Deme zos and Pippa 2014), po pone sólo algunos ejemplos.
La nanomedicina, de inida po Eu opean Technology
Pla o m o Nanomedicine (ETPN) como “la aplicación de la
nano ecnología pa a log a a ances en el cuidado de la salud que
explo a las p opiedades ísicas, químicas y biológicas de los
ma e iales a escala nanomé ica” (Fo nague a and José Ga cía-
Celma, 2017), se ha con e ido en los úl imos años en una ciencia
eme gen e que pe mi e ab ica , ca ac e iza y modi ica de o ma
con olada las p opiedades de los ma e iales nanomé icos con
ines diagnós icos y biomédicos (Mi za and Siddiqui 2014). Po
an o, aunque el concep o no posee una de inición o icial, la ETPN y
la Food and D ugs Adminis a ion (FDA) acep an que la
nanomedicina engloba cinco p incipales disciplinas: (a)
he amien as analí icas; (b) he amien as de imágenes; (c)
nanoma e iales y nanodisposi i os; (d) nue os sis emas
e apéu icos de adminis ación de á macos; y (e) odas aquellas
implicaciones sob e su egulación y segu idad (Webs e 2006).
7
En la ac ualidad, nume osos ac i os a macéu icos
in eg ados en nanosis emas, ap obados po la FDA y la Agencia
Eu opea del Medicamen o (EMA), ya es án disponibles pa a su
adminis ación en humanos. Caelyx®, Mepac ® y Myoce ®,
ehiculizados en liposomas o Ab axane®, Rapamune® y Sine em®,
come cializados en nanopa ículas (NPs)(Eu opean Medicines
Agency 2014), son algunos ejemplos de nanomedicinas,
desa ollados pa a el a amien o del cánce , el echazo de ó ganos
en pacien es asplan ados o el diagnós ico de umo es.
NPs como ehículos de á macos
El po encial de es os nue os sis emas de adminis ación es
eno me; en e ellos caben des aca liposomas, NPs (ino gánicas,
polimé icas, lipídicas, me álicas), nanoc is ales, nano ubos de
ca bono o dend íme os (Caban e al. 2014). Conc e amen e, las NPs
polimé icas se han con e ido en obje o de in es igación debido a
su g an capacidad pa a anspo a y libe a , de mane a sos enida,
una ex ensa a iedad de á macos has a nume osas egiones del
o ganismo (Ba i e al. 2015).
Las NPs polimé icas pueden se adminis adas po
nume osas u as, y, debido a su amaño, pueden alcanza las á eas
más pequeñas del o ganismo (Kashi e al. 2012b), mejo a las
p opiedades a macociné icas del compues o y su solubilidad,
aumen a su ida media y educi los e ec os ad e sos, libe ándose
únicamen e en los ejidos diana y minimizando la oxicidad en el
es o de ó ganos (Mahajan e al. 2012), po comen a sólo algunas
posibilidades, lo que se aduce en un aumen o de la e icacia
8
e apéu ica (Ce in e al. 2013)(Sa ai a e al. 2016). Po esal a
alguna de las posibilidades, juegan un papel undamen al en la
libe ación de á macos en el ce eb o y pueden emplea se como una
he amien a ú il pa a mejo a la e icacia de los a amien os
con encionales y el diagnós ico de las en e medades que a ec an al
Sis ema Ne ioso Cen al (SNC) (Zhang e al., 2016), hecho muy
limi ado, p incipalmen e, po la p esencia de la ba e a
hema oence álica (BHE).
Políme os empleados
Ac ualmen e hay disponible una amplia de gama de
políme os, ales como qui osano, gela inas, ácido polilác ico (PLA),
copolíme os de lác ico y glicólico (PLGA) o poli-ε-cap olac onas
(PCL), pa a su uso en la p epa ación de NPs polimé icas,
mos ando una excelen e compa ibilidad an o con células como
con ejidos humanos (Campos, Ben ley, and To chilin 2016)(Kashi
e al. 2012a).
Uno de los políme os más empleados es el PLGA, un
copolíme o de los ácidos lác ico y glicólico, me abolizado
ácilmen e po el o ganismo ía ciclo de K ebs (Gailla d, Visse , and
de Boe 2005), que se p esen a en el me cado con di e en es
p opo ciones de cada ácido y dis in os pesos molecula es, lo que le
o o ga capacidad pa a eje ce con ol sob e la libe ación del ac i o,
pudiendo aba ca desde días, semanas o incluso meses (Danhie e
al. 2012a)(Be ocoso e al. 2017). Globalmen e, la deg adación del
PLGA depende de su peso molecula y de la elación en e los dos
ácidos que lo o man (Danhie e al. 2012b). Los copolíme os
9
o mados po políme os amo os, más hid ó ilos y de bajo peso
molecula que posean mayo can idad de glicólico exhiben un
iempo de deg adación más co o pues o que el ácido glicólico
posee mayo g ado de hid o ilia que el ácido lác ico. Luego, los
políme os hid ó obos con un mayo con enido de ácido lác ico
abso ben menos agua y po consiguien e, mues an un iempo de
deg adación más p olongado (Dina and e al. 2011).
Aunque una de las ca ac e ís icas más en ajosas de es e
políme o es su deg adación en agua, ambién posee nume osas
p opiedades de in e és a macéu ico des acando (i)
biocompa ibilidad y biodeg adabilidad, (ii) es á ap obado como
ehículo de á macos po la FDA y la EMA, (iii) pe mi e una
libe ación con olada (i ) es ácilmen e modi icable, según sus
g upos e minales, pa a log a mayo e ec i idad lo que posibili a
su llegada a ó ganos o células diana ( ) p o ege al ac i o en e a
deg adaciones ex e nas e in e nas y ( i) pe mi e encapsula
á macos de di e sa na u aleza (hid ó obos e hid ó ilos) (Mi ,
Ahmed, and Rehman 2017).
BARRERA HEMATOENEFÁLICA (BHE)
Las en e medades o as o nos del SNC suponen un
p oblema de salud a ni el mundial debido al aumen o de
en ejecimien o en la población y la al a de a amien os e ec i os
pa a las mismas. Pa a el año 2020, la ci a de pe sonas a ec adas
po as o nos neu ológicos pod ía onda los 2 billones en odo el
mundo (B asnje ic e al. 2009).
16
incapaces de a a esa la y sólo al ededo de un 2% de las
pequeñas moléculas se ían capaces de alcanza el ce eb o (M. M.
Pa el e al. 2009). Dicha ba e a o ece un anspo e muy pob e de
moléculas solubles en agua (T Yoshikawa and Pa d idge 1992) y,
de mane a excepcional, únicamen e moléculas pequeñas (<500 Da)
y con un ma cado ca ác e hid ó obo pod ían a a esa la (Blasi e
al. 2007).
An e es a si uación, como se ha indicado con an e io idad, es
impo an e des aca que las NPs polimé icas se p esen an como un
mecanismo e icien e pa a la adminis ación de agen es
e apéu icos y de diagnós ico (incluyendo moléculas de g an
amaño) a ni el ce eb al cuyas p opiedades supe iciales
desempeñan una a ea undamen al en es e p opósi o (K eu e
2014).
Po sue e, las células capila es del endo elio ce eb al
mues an nume osos mecanismos de anspo e mediados po
ecep o es, exis iendo di e sas u as de paso a a és de la BHE. En
base a ello, se han desa ollado múl iples es a egias pa a pode
a a esa la.
A con inuación, se desc ibe b e emen e los mecanismos de
anspo e a a és de la BHE y las p incipales es a egias
desa olladas pa a e i a la.
Sis emas de anspo e a a és de la BHE
En e las ías de acceso al ce eb o cabe dis ingui en e
mecanismos pasi os (di usión pa acelula y anscelula ) o ac i os

17
(endoci osis mediada po ecep o es, anspo ado es o células y
ansci osis po adso ción) en unción de los eque imien os de
ene gía. Como sis ema de anspo e, se incluyen ambién las
bombas de e lujo (ci adas en el apa ado an e io )( e igu a 3).
La di usión pasi a es un p oceso insa u able y posee la
mayo asa de anspo e, seguido de la endoci osis adso i a que,
aunque sí es un mecanismo sa u able, se necesi an concen aciones
es eces más al as que pa a los p ocesos mediados po ecep o
(Olle -Sal ia e al. 2016).
Di usión pasi a
Den o de es e ipo de anspo e se puede dis ingui en e
dos o mas di e en es pa a a a esa la BHE dependiendo de la
na u aleza de la sus ancia. En la ía pa acelula , pequeñas
moléculas hid ó ilas acceden a a és de las uniones es echas
mien as que las sus ancias de ca ác e hid ó obo pueden ing esa
a las células endo eliales a a és de la memb ana de las mismas, es
deci , ía anscelula (B asnje ic e al. 2009). Dicho paso es á
in luenciado po di e en es ac o es como pueden se la
ca ac e ís icas isicoquímicas y es uc u ales de la molécula
( amaño, ca ga, núme o de enlaces de hid ógeno y g ado de
lipo ilia)(Dong 2018).
Endoci osis mediada po ecep o
La endoci osis mediada po ecep o es un ipo de
anspo e al amen e especí ico (Bhaska e al. 2010). Requie e un
18
apo e de ene gía (dependien e de ATP)(Bickel, Yoshikawa, and
Pa d idge 2001) y su mecanismo implica la unión del ligando
especí ico a los ecep o es p esen es en la memb ana apical de la
ba e a (Fulls one e al. 2016).
La BHE exp esa de mane a isiológica nume osos ecep o es
como el ecep o de lipop o eína, insulina o ans e ina (T ), en e
o os (Pa asha and Nema 2012).
De mane a des acada, el ecep o de T es á o mado po
dos monóme os glicop o éicos (760 aminoácidos cada uno) de
unos 90 kDa unidos po puen es disul u o y es dominios
p incipales (p o easa, helicoidal y apical) dispues os en o ma de
ma iposa (Macedo and Sousa 2008) (Figu a 3). Cada subunidad se
une a una molécula de T en un p oceso e e sible y dependien e
de pH (Moos and Mo gan 2000).
Figu a 3. Esquema del ecep o de T (Law ence e al. 1999).
Se enca ga de man ene la homeos asis del hie o,
p opo cionándoselo a las células a a és de la unión especí ica con
19
la T , egulando la can idad del oligoelemen o en unción de las
necesidades me abólicas celula es (H. Li and Ming Qian 2002).
Un nue o ecep o de T , conocido como ecep o de T II, ha
sido in es igado y se c ee que iene un papel en la homeos asis del
hie o, aunque su unción no se conoce con exac i ud (Calzola i e
al. 2010). La di e encia p incipal con el ecep o de T I eside en su
localización. Mien as que el I es á p esen e p ác icamen e en odas
las células, el II se encuen a p imo dialmen e en hígado y
e i oci os aunque, en meno medida, puede halla se en o as
células del o ganismo. Sin emba go, exis en a ias simili udes en e
ellos ya que ambos se sob eexp esan en células umo ales y sus
dominios ex acelula es son semejan es (Vo h e al. 2015).
T ansci osis po adso ción
Es e ipo de mecanismo anspo ado no especí ico que
depende de in e acciones elec os á icas, la endoci osis se
desencadena po la unión en e moléculas con ca ga posi i a las
pa es aniónicas de la memb ana apical de las células endo eliales
(conc e amen e con el glucocáliz) (Pehli an, 2013) ya que, a pH
isiológico, an o la memb ana apical como la basola e al exhiben
una ca ga nega i a (He é, Ghinea, and Sche mann 2008).
El p oceso de endoci osis sigue pasos simila es a los
p oducidos cuando in e iene un ecep o , la di e encia adica en
la a inidad y la capacidad de cada ipo. El mecanismo mediado po
ecep o , aunque con mayo a inidad o ece menos capacidad de
20
anspo e ya que es sa u able a concen aciones más bajas (Yan
Chen and Liu 2012).
T ansci osis mediada po anspo ado
El apo e de nu ien es como glucosa o aminoácidos
necesa ios pa a el buen uncionamien o de la BHE se ealiza a
a és de p o eínas de anspo e exp esadas en su supe icie
( an o apical como basola e al). El ejemplo más conocido es el
anspo ado de glucosa (GLUT1)(Sanchez-Co a ubias e al.
2014). Pa a que los á macos puedan accede al ce eb o a a és de
es e sis ema, deben ene un amaño pequeño y posee una
es uc u a análoga a la de los nu ien es que anspo an lo que
limi a su explo ación (Béduneau, Saulnie , and Benoi 2007).
Endoci osis mediada po células
La mo ilidad de las células inmuni a ias les pe mi e iaja
con acilidad desde el o en e sanguíneo has a ocos in lama o ios,
sín oma común pa a la mayo ía de nume osos as o nos
neu odegene a i os (M. M. Pa el and Pa el 2017). Las células
enca gadas de es e ipo de anspo e son células especí icas del
sis ema inmuni a io como mac ó agos, neu ó ilos, lin oci os y
monoci os que, condicionados po la p esencia de in lamación,
lle an a cabo el paso a a és de la capa endo elial po dos p ocesos
llamados quimio axis y diapédesis (E. V. Ba ako a and Kabano
2013).
21
Aunque puede p esen a se como un mé odo exi oso pa a la
libe ación de á macos en luga es de in lamación, su empleo se e
educido po los incon enien es que p esen a ya que: (a) las células
pueden anspo a una can idad de á maco baja, (b) los
inmunoci os no ienen buena capacidad de libe a las moléculas
e apéu icas que, además, debe se de mane a con olada una ez
alcanzado el luga de acción, (c) la can idad de células que mig an
a la zona in lama o ia no es ele ada y (d) las o mulaciones no
pueden se óxicas ni pe judiciales pa a el po ado celula (E. V
Ba ako a, Gendelman, and Kabano 2011).
Figu a 4. P incipales sis emas de anspo e a a és de la BHE
ESTRATEGIAS PARA EL DIRECCIONAMIENTO DE ACTIVOS
HACIA EL SNC
Po odas las azones mencionadas con an e io idad, la
llegada de á macos al SNC es á muy limi ada ac ualmen e pe o,
a o unadamen e, se es án desa ollando nume osas es a egias
pa a a a esa la. Es as es a egias pod ían di idi se en dos g andes
g upos: mé odos in asi os y no in asi os.

22
Adicionalmen e, exis e una u a al e na i a pa a la llegada
de á macos al ce eb o denominada nose- o-b ain as una
adminis ación ía in anasal. En los siguien es apa ados se
desc ibe b e emen e cada una de ellas.
Mé odos in asi os
En las écnicas in asi as el agen e e apéu ico ing esa al
SNC po una ape u a p o ocada en la BHE, o es adminis ado
di ec amen e en el ce eb o.
Los p ocedimien os in asi os poseen no ables des en ajas,
ya que son ela i amen e cos osos y pelig osos equi iéndose la
hospi alización del pacien e, anes esia y/o ci ugía, y además se
posibili a el que pueden accede al ce eb o sus ancias no deseables
pe judiciales pa a el ambien e ce eb al (Soddu e al. 2015).
Den o de es a clasi icación se incluyen la dis upción de la
ba e a, la en ada po con ección o la inyección di ec a en el SNC.
Dis upción de la BHE
La inalidad es ab i las uniones es echas que se
encuen an sellando las células endo eliales que o mas la ba e a.
La ape u a debe se e e sible, p o isional y momen ánea y
con olada en ex ensión pa a e i a posibles e ec os no deseados
(Ma in-Bande as e al. 2011).
Exis en nume osas écnicas pa a log a lo:
23
1. Dis upción osmó ica: la dis upción hipe osmó ica se
comenzó a explo a en los años 70 cuando Rapopo e al.
obse a on que las soluciones hipe osmó icas aplicadas en el
có ex ce eb al de conejo pe mi ían el paso del colo an e azul
E ans al in e io del ce eb o (Rapopo and Ho i, 1972). T as una
adminis ación in a enosa de la solución hipe osmó ica, el
p oceso de ape u a po hipe ósmosis se desencadenaba po la
salida del agua de las células endo eliales hacia la sang e,
p o ocando la c enación de las mismas. Seguidamen e, el aumen o
de agua en los asos sanguíneos p oduce asodila ación y,
inalmen e, el ci oesquele o celula se con ae conduciendo a una
expansión de las uniones es echas (Rapopo and Robinson,
1986)(Cha an and D ’souza, 2010).
Es e p ocedimien o mani ies a cla as mejo as en la e apia
neu ooncológica, aumen ando los ni eles de los á macos
quimio e ápicos en el SNC as una adminis ación in a enosa, sin
emba go, las concen aciones pueden alcanza ni eles óxicos
(Dooli le e al. 2000).
Uno de los agen es hipe osmó icos más usados es el mani ol,
aunque ambién se han empleado o os como la u ea y la
a abinosa. Las limi aciones en el uso de mani ol esiden en los
e ec os secunda ios que p esen a, ya que puede p o oca
con ulsiones, in ecciones, en ada de oxinas al ce eb o o el paso
de p o eínas plasmá icas (Ma in-Bande as e al. 2011).
2. Dis upción bioquímica: se basa en la adminis ación
in a e ial de sus ancias asoac i as que p o ocan una eacción
in lama o ia en las células endo eliales. En e las sus ancias
24
asoac i as más conocidas se encuen an la b adiquinina jun o con
su análogo RMP-7 y la his amina. La b adiquinina es un
nonapép ido que aumen a la pe meabilidad de las uniones
es echas as una ac i ación del ecep o B2, p esen e en las
células endo eliales (Ding-Zhou e al. 2003). T as la ac i ación, se
desencadenan una se ie de p ocesos que desembocan en un
aumen o de óxido ní ico, que p oduce asodila ación.
La adenosina es o a sus ancia asoac i a que ac úa sob e
los ecep o es de adenosina 2A que se encuen an en las células
endo eliales. Pe enecen a la amilia de los ecep o es acoplados a
p o eína G y su ac i ación conlle a un aumen o de la
pe meabilidad de la BHE po la ape u a de las uniones es echas
(M. M. Pa el and Pa el 2017).
Po úl imo, los alquilglice oles han su gido como una
al e na i a no óxica pa a acili a el acceso al SNC. G acias a su
ca ác e an i ílico no iónico (He sh e al. 2016), pueden
inco po a se a la memb ana y deses abiliza la, p o ocando su
ape u a, cuya ex ensión depende á de la es uc u a y
concen ación del compues o (E dlenb uch e al. 2003).
3. Dis upción po ul asonidos: una al e na i a
eme gen e pa a p oduci la dis upción de la memb ana es la
aplicación de ul asonidos. Pa a ello, se inyec an mic obu bujas de
amaño mic omé ico (Dube e al. 2017) que, as la aplicación de
ul asonidos, son capaces de ans o ma la ene gía acús ica en
ene gía mecánica (Gao 2016). La al e ación de la ba e a puede
alcanza se con olando el iempo de aplicación de ul asonidos, así
como su ecuencia (Ma in-Bande as e al. 2011).
25
4. Dis upción inducida po adiación: un uso al e na i o
de la adio e apia puede se su empleo pa a log a una dis upción
ocalizada de la BHE. La adiación p oduce un daño en el ADN que
p o oca la mue e celula y puede se u ilizada en el a amien o de
umo es ce eb ales (Azad e al. 2015).
Adminis ación de á macos po con ección
Es e mé odo in asi o pe mi e la adminis ación de agen es
e apéu icos di ec amen e en pa énquima ce eb al o ejido
especí ico. Pa a ello, uno o más ca é e es de pequeño calib e se
colocan es e eo ác icamen e en el ce eb o a a és de su cos
pe o ados en el c áneo y los agen es e apéu icos son
adminis ados a a és de una bomba de mic oin usión median e
p esión posi i a (Ra li and Old ield 2001).
Hoy en día, es e ipo de adminis ación equie e la
op imización de las ca ac e ís icas de in usión, unas p opiedades
de e minadas de ca é e y écnicas de colocación especí icas, así
como un seguimien o p eciso y en iempo eal de la dis ibución de
in usiones, po lo que es a écnica no esul a con iable y
ep oducible (Vogelbaum and Ianno i 2012).
A di e encia de o as écnicas in asi as ac ualmen e
disponibles pa a la adminis ación de á macos al SNC, es a
es a egia consigue una dis ibución uni o me de los á macos cuya
can idad adminis ada coincide con la can idad in undida, lo que
32
Ap áme os
Los ap áme os son pequeñas secuencias de oligonucleó idos
con 20-60 nucleó idos en una sola cadena de ADN o ARN. Se
de inen po su es uc u a idimensional, que les pe mi e uni
moléculas diana (desde pequeñas moléculas ino gánicas a
moléculas complejas) con al a a inidad y especi icidad (Lakhin,
Ta an ul, and Gening 2013). Desc i os po p ime a ez en 1990, su
nomb e es á o mado po dos palab as p o enien es del g iego:
ap us, que se aduce como “encaja ” y me us que signi ica
“pa ícula” (Da mos uk e al. 2015). Mayo i a iamen e, los
ap áme os suelen ob ene se po una écnica denominada SELEX o
selección in i o y p esen an nume osas en ajas: (1) en eo ía,
pueden diseña se pa a se econocidos po cualquie ecep o de
mane a selec i a, (2) su sín esis química es al amen e
ep oducible, (3) son más es ables que las p o eínas y no suelen
pe de su capacidad de unión, (4) poseen una baja
inmunogenicidaad y oxicidad y (5) g acias a su pequeño amaño,
pueden uni se a epí opos a los que no pod ían accede los
an icue pos (W. Zhou e al. 2014).
Compa ado con los an icue pos, aunque la secuencia de
nucleó idos sea análoga, la sín esis de ap áme os es más ba a a y
ácil, p esen an mayo es abilidad, meno amaño y baja
inmunogenicidad y nula oxicidad (Kulbachinskiy 2007, Boucha d,
Hu aba a , and Thompson 2010). Debido a es o, los ap áme os son
una buena al e na i a a los an icue pos y excelen es candida os
pa a el di eccionamien o especí ico de á macos y el diagnós ico de
en e medades.

33
En la lucha con a el cánce , los ap áme os pueden uni se
especí icamen e a moléculas sob eexp esadas en células
cance osas. Pa a el a amien o del glioma, las NPs pueden
uncionaliza se con ligandos especí icos y acili a el acceso de los
agen es quimio e ápicos al umo . Uno de ellos, llamado Gin 4.T
(an i-PDGFRβ), conjugado en nanosis emas (Monaco e al. 2017),
es un ligando capaz de uni se de o ma especí ica y selec i a al
ecep o β del ac o de c ecimien o de i ado de plaque as
(PDGFRβ), un ecep o exp esado en la supe icie de las células
cance osas, incluidas las células de glioma.
O o conocido ap áme o, AS1411, es ico en G (Shan 2004) y
se une a la nucleolina con al a a inidad, una p o eína al amen e
exp esada en la memb ana de las células cance osas, incluidas las
células C6 del glioma. T as pene a en la célula cance osa, el
complejo AS1411-nucleolina p oduce, en e o os, la inhibición de
la sín esis de ADN o la inducción de la apop osis celula (Luo e al.
2017).
Los es udios in i o desa ollados po Guo y cols.,
demos a on que las NPs no modi icadas mues an una meno
asociación con las células C6 que las NPs conjugadas con el
ap áme o. De mane a simila , la can idad de pa ículas conjugadas
acumuladas en el ce eb o ue mayo que la de las pa ículas no
conjugadas o el á maco lib e (J. Guo e al. 2011).
34
Pép idos
En los úl imos años, se es án es udiando nue as moléculas
pep ídicas pa a el a amien o de en e medades, llamados pép idos
lanzade a. Uno de los más popula es es el glu a ión (GSH), un
ipép ido endógeno hid ó ilo o mado po glu ama o, cis eína y
glicina (G. H. Kim e al. 2015),de especial ele ancia debido a su
papel en los p ocesos de desin oxicación. Es el agen e p o ec o
más impo an e con a los adicales lib es y p o ege a las células
en e a especies eac i as del oxígeno y xenobió icos, así como a
los ó ganos más expues os a los mismos ( iñón, pulmón, hígado o
in es ino) (Koo e al. 2011).
La concen ación de glu a ión en el ce eb o es
ap oximadamen e 2-3 mM, a disminuyendo con el en ejecimien o
y puede asocia se con la apa ición de en e medades ligadas al
mismo y en ó ganos con unciones depu a i as (Valdo inos-Flo es
and Gonseba 2012).
El glu a ión, ayudado po la glicop o eína-P es capaz de
a a esa la BHE y es una u a ampliamen e explo ada po
nume osos au o es pa a una adminis ación e icaz de á macos en
el ce eb o (G. H. Kim e al. 2015).
Acha ya e al. (Acha ya and Reddy 2016) es udia on la
in luencia de la uncionalización de NPs de PLGA ca gadas de
placli axel pa a el a amien o del cánce ce eb al. Las NPs con
glu a ión mos a on un di eccionamien o más e ec i o hacia el
ce eb o que las NPs no conjugadas. Del mismo modo, en un es udio
simila , ambos ipos de NPs p esen aban una endoci osis más al a
35
que la suspensión de pacli axel. Se ob u ie on esul ados simila es
pa a las NPs de PLGA ca gadas con cu cumina. Los esul ados de
cap ación celula (cuali- y cuan i a i os) mos a on que la
acumulación de NPs uncionalizadas y no uncionalizadas en el
in e io de las células neu onales e a más al a que la del á maco
lib e (Paka and Ramassamy 2016). O os au o es es udia on la
capacidad de las NPs uncionalizadas con glu a ión pa a c uza la
BHE u ilizando un modelo in i o de ba e a, demos ando que la
pene ación de NPs ecubie as de glu a ión e a mayo que la del
compues o sin encapsula (G o e e al. 2014).
O os pép idos pequeños han sido empleados pa a mejo a
el acceso al SNC. Uno de ellos es Angiopep-2 (ANG), capaz de uni se
al ecep o de lipop o eínas, que es á sob eexp esado en células
endo eliales capila es del ce eb o y células umo ales malignas
(Demeule e al. 2007). Las NPs de PLGA conjugadas con ANG
pueden se una pla a o ma p ome edo a pa a el a amien o del
glioma. Wang e al. compa a on la capacidad de cap ación celula
de NPs uncionalizadas con ANG y NPs no uncionalizadas. Los
es udios in i o con i ma on que las NPs modi icadas
supe icialmen e exhibían una mayo cap ación po las células U-
87MG que las no uncionalizadas, an o cuali a i a como
cuan i a i amen e (L. Wang e al. 2015). De mane a pa alela, los
ensayos in i o mos a on que an o las NPs uncionalizadas como
las no uncionalizadas podían a a esa la BHE, y a ibuye on la
capacidad de las NPs no conjugadas a las in e acciones
elec os á icas inespecí icas en e la ca ga supe icial posi i a de
las NPs y las células endo eliales de los capila es ce eb ales.
36
Finalmen e, se ha es udiado un pequeño pép ido especí ico
con a el ecep o de T (T Rp)(secuencia H - Th - His - A g - P o -
P o - Me - T p - Se - P o - Val - T p - P o – OH). Los es udios in
i o indica on que las NPs conjugadas con el pép ido exhibie on
una mejo in e acción con las células endo eliales del ce eb o
humano (hCMEC) que las NPs no conjugadas (Gomes e al. 2017).
Más ecien emen e, Huang e al. (Huang e al. 2017)
ealiza on es udios in i o con NPs de PLGA ca gadas con
cu cumina y un inhibido de la p oducción de placas Aβ (S1,
pép ido co o con la secuencia PQVGHL). Las pa ículas se
uncionaliza on con el pép ido CRT (pép ido CRTIGPSVC cíclico),
un pép ido uncionalmen e simila al hie o que se di ige al
ecep o de T que induce un cambio alos é ico. Las pa ículas, que
enían menos de 150 nm de diáme o y p esen aban alo es de
po encial ze a nega i o, exhibie on una cap ación celula
no ablemen e mejo ada y una capacidad de pene ación de la
ba e a in i o; las imágenes in i o con i ma on es o, y las
p uebas con animales demos a on una educción de la gene ación
de placas Aβ y la disminución de la p oducción de gliosis,
p oin lamación y ci oquinas.
Es e pép ido, ue usado ambién po o os in es igado es
pa a uncionaliza NPs de PLGA-PEG e in e eni en el anspo e
de á macos a a és de la BHE y su pene ación en las células del
glioma. La pa ículas conjugadas mos a on que la in e acción con
las células C6 y BCEC median e endoci osis ue ele ada así como el
paso a a és de un modelo in i o de BHE. Los ensayos in i o a
37
a és de imágenes en iempo eal, mos a on la acumulación de
mane a selec i a en el glioma (Kang e al. 2015).
An icue pos y o as p o eínas
La supe icie de los nanosis emas puede uncionaliza se con
moléculas que se unen a ecep o es especí icos p esen es en la BHE
a in de mejo a su acceso al SNC. Un ipo especial de p o eínas, los
an icue pos monoclonales (moléculas hid ó ilas y de ida media
la ga), se usan conjugados en la supe icie de NPs di igidas a la BHE
pa a uni se a ligandos especí icos de la misma.
Debido a su g an amaño (al ededo de 150 KDa), los
an icue pos no pueden a a esa la BHE median e ansci osis
mediada po adso ción. Sin emba go, pueden usa se como ligandos
especí icos de los ecep o es de la BHE, ing esando al SNC po
endoci osis mediada po ecep o como se desc ibió an e io men e
(J. a Lou ei o e al. 2014). Es a es a egia es p obablemen e uno de
los en oques más e icaces pa a el di eccionamien o de las NPs.
Fo nague a e al. (C. Fo nague a e al. 2015) desa olla on un
nano ehículo di igido a la BHE, ca gado con lope amida y
uncionalizado con el an icue po 8D3 (an icue po con a el
ecep o de T ) como molécula diana. Después de su inyección
in a enosa en la ena de la cola, los in es igado es e alua on la
llegada de las NPs al ce eb o midiendo el po cen aje de e ec os
an inocicep i os p oducidos po la lope amida. La lope amida,
usualmen e come cializada en cápsulas adicionales pa a el
a amien o de la dia ea, no puede c uza la BHE. Sin emba go,
incluida en un sis ema de adminis ación nanomé ico adecuado

38
(po ejemplo, encapsulado en NPs uncionalizadas) puede p oduci
e ec os cen ales y analgesia (Tosi e al. 2007). El e ec o
an inocicep i o después de la adminis ación de NPs
uncionalizadas con an icue pos ue mayo que el de las NPs no
modi icadas (50% en e a ~ 25%), lo que con i ma la capacidad de
8D3 pa a ac ua como un caballo de T oya a a és de la BHE (C.
Fo nague a e al. 2015). OX26 es un an icue po monoclonal de
oedo que se une selec i amen e a ecep o es de T p esen es en
las células endo eliales de los capila es ce eb ales de la BHE
(Monsal e e al. 2015). Es e an icue po es capaz de uni se a un
dominio ex acelula del ecep o y pene a en la BHE (X. Tang e
al. 2015). Ca ol e al. (Ca oll e al. 2010) desa olla on NPs de
PLGA ca gadas con empol (4-hid oxi-2,2,6,6- e ame ilpipe idin-
1-oxilo), un á maco he e ocíclico neu op o ec o que puede
elimina el pe oxini i o, que en asociación con o as especies
eac i as puede ene un papel en as o nos neu odegene a i os
como Alzheime o Pa kinson. Pa a mejo a la cap ación celula y el
acceso al SNC, se p epa a on NPs de PLGA-polie ilenglicol (PEG)
po nanop ecipi ación y se uncionaliza on con OX26. Los es udios
in i o usando RG2 (células del glioma de a a) mos a on que las
NPs modi icadas supe icialmen e con OX26 en a on en las células
de mane a más e icien e que las NPs no conjugadas.
Po o a pa e, Bao e al. (Bao e al. 2012), usando
endomo inas como á maco analgésico modelo, es udia on la
capacidad de un nanosis ema hipe ami icado modi icado en la
supe icie con OX26. Los au o es lle a on a cabo expe imen os de
cap ación de células in i o en células BMEC. Los esul ados
39
mos a on que la cap ación de NPs dependía an o del iempo como
de la concen ación y que la cap ación se p odujo a a és de un
p oceso de endoci osis ca eola . Pa a es udia el c uce de la BHE
después de la inyección in a enosa y usando la conjugación con
OX26, los au o es e alua on el e ec o analgésico de las
endomo inas usando un modelo de lesión de cons icción c ónica
en a as. T as la adminis ación in a enosa del á maco lib e no se
obse ó ningún e ec o y las NPs sin OX26 mos a on un e ec o
analgésico le e (debido a su pequeño amaño). Sin emba go, las
NPs con OX26 p oduje on un e ec o analgésico mayo y du an e
más iempo.
Además de los an icue pos, se han u ilizado o as p o eínas
pa a la uncionalización de nanosis emas como las que componen
la amilia de las T s es án en e las más ampliamen e u ilizadas
como ligandos pa a di igi nanosis emas al ce eb o.
Las más conocidas son: (a) la T sé ica humana p esen e en
la sang e y o os líquidos co po ales (líquido amnió ico, líquido
ce alo aquídeo, lin a, leche, bilis), (b) la o o ans e ina (o o-T )
de la cla a de hue o, (c) la lac o e ina localizada en leche de
mamí e os, lág imas, sali a, moco y glóbulos blancos y (d) la
melano ans e ina (melano-T ), en la memb ana de los
melanoci os, p incipalmen e.
A excepción de la lac o e ina (pun o isoeléc ico = 8.7), el
es o son p o eínas ácidas con un pun o isoeléc ico en e 5.6-5.8
(H. Li and Ming Qian 2002).
40
Conc e amen e, la T se ha es udiado ampliamen e como
ligando especí ico pa a mejo a la llegada de NPs al SNC a a és
del ecep o de T , exp esado en las células endo eliales de la BHE.
La T es una glicop o eína endógena de 679 aminoácidos y
un peso de 79 kDa que puede pene a en las células del endo elio
ce eb al po endoci osis mediada po ecep o a a és de los
ecep o es de T p esen es en las mismas (Ce in e al. 2013),
apo ando el hie o necesa io a las células ce eb ales pa a su
me abolismo (Pahuja e al. 2015). En su es uc u a se di e encian
hélices al a y láminas be a que comp enden los dos dominios
p incipales N- e minal y C- e minal. A pH isiológico, una o dos
moléculas de hie o se unen a la T po es os dominios p incipales
g acias a dos i osinas, una his idina y un ácido aspá ico, siendo
necesa ia ambién la p esencia de un anión (Aisen 2004).
El p incipal p oduc o de T es el hígado (Vo h e al. 2015).
Fundamen almen e, la T se enca ga de dis ibui el hie o
po el o ganismo en o ma de Fe3+, aunque in e iene en o as
unciones como la e i opoyesis y la di isión celula (Cheng e al.
2004).
Median e el empleo de ligandos con a el ecep o de T (T ,
an icue pos o pép idos) se puede log a la llegada e ec i a de
á macos al ce eb o. En es e sen ido, Chang e al. (Chang e al.
2009) desa olla on una nanopla a o ma de PLGA ecubie o con
di e en es es abilizado es (pa a e i a la ag egación) y
demos a on que la endoci osis de las NPs conjugadas con T ue
mayo que la de las NPs no modi icadas.
41
En o o es udio pa a el a amien o de gliomas, combina on
la uncionalización supe icial con T y la aplicación de un campo
magné ico, ob eniéndose las mayo es asas de cap ación celula
usando ambas es a egias, hecho que se ep oduce en el ensayo
pa a la e aluación del anspo e paso a a és de la BHE
u ilizando un modelo de ba e a in i o, donde los mejo es
esul ados se ob u ie on cuando ambas ác icas e an empleadas.
Resul ados in i o con i man la capacidad de las NPs pa a a a esa
la ba e a, y a la inhibición más acusada del c ecimien o umo al
e a la p oducida po las NPs uncionalizadas con T (Cui e al.
2013).
An e io men e nomb ada, o a de las moléculas de la amilia
de las T más ampliamen e usada pa a es os p opósi os es la
lac o e ina, una p o eína ca iónica de 80 KDa in oluc ada en
di e sas unciones isiológicas, incluida la p o ección con a la
in ección y la in lamación (Kuma i and Kondapi 2017). Como
ocu e con la T , es una buena opción pa a el a amien o del
glioma po que su ecep o es á sob eexp esado en células
umo ales así como en las células endo eliales del ce eb o, y es
capaz de a a esa la BHE, empleándose pa a mejo a el acceso
ce eb al de nume osas d ogas.
Hu e al. (Hu e al. 2011) es udia on el desa ollo de una
nue a nanopla a o ma pa a el a amien o del Pa kinson,
bioconjugando lac o e ina a la supe icie de NPs de PLGA-PEG.
Es e es udio demos ó que, as la inyección en la ena
caudal del a ón, el po cen aje de acumulación de NPs con
lac o e ina en la co eza, la sus ancia neg a y el cue po es iado
48
Aβ (J. A. Lou ei o e al. 2016) apo ando un no edoso sis emas pa a
el a amien o de es a en e medad.
Nose- o-b ain
Como se ha ci ado con an e io idad, la p incipal limi ación
que exis e en el a amien o de las en e medades neu ológicas es la
p esencia de la BHE, que es inge el acceso de la mayo ía de las
moléculas e apéu icas al SNC, imposibili ando el a amien o de
nume osos desó denes que a ec an al ce eb o.
En es e sen ido, median e una adminis ación ía in anasal,
la u a nose- o-b ain es conside ada como una posible es a egia de
adminis ación de á macos que pe mi e la libe ación de ac i os de
mane a ápida y e icaz en el SNC.
El in e és de es a ía de adminis ación eside en la al a
ascula ización y po osidad de su epi elio, la amplia supe icie
disponible pa a una p on a abso ción, un ápido inicio de la acción
con una mayo pe meabilidad a un mayo núme o de compues os
que la mucosa in es inal. Todo es o debido undamen almen e a la
al a de enzimas panc eá icas y gás icas, el pH neu o del moco y la
posibilidad de e i a an o el me abolismo de p ime paso como la
BHE (Pa deshi and Belgamwa 2013).
Po odo ello, es conside ada como una al e na i a eal pa a
la adminis ación de nume osos agen es e apéu icos de acción
sis émica con baja disponibilidad y/o con un inicio de la acción no
deseable, y pod ía explo a se como una ía no in asi a muy
p ome edo a de adminis ación en el SNC pa a sus ancias que no

49
a a iesan la BHE (Djupesland, Messina, and Mahmoud 2014). Sin
emba go, el acla amien o mucocilia p o oca que la abso ción y el
iempo de esidencia del á maco sean escasos, incon enien es que
pueden se sol en ados con el empleo de nanosis emas de
adminis ación de á macos que p o egen al á maco de la
deg adación den o de la ca idad (Ga ziandia e al. 2016).
Desa ollada po F ey en 1989, la adminis ación in anasal
es ápida (Hanson, F ey, and II 2008) y los á macos alcanzan el
ce eb o en una can idad signi ica i a a a és de los ne ios
igémino y ol a o io e i ando así la ba e a hema oence álica.
En líneas gene ales, la na iz se enca ga de p epa a el ai e
que se inhala pa a que llegue de mane a adecuada a las ías
espi a o ias, il ándolo, calen ándolo y humedeciéndolo (Illum
2003). Además, la sec eción de mucosa apo a inmunidad en e a
ba e ías y i us y es á compues a esencialmen e po agua (95%)
además de mucina, sales, p o eínas y lípidos en meno p opo ción.
P opo ciona un le e pH ácido (pH 5.5-6.5), y de mane a adicional,
cumple o as unciones como la p o ección enzimá ica y ísica, la
e ención de agua o posibili a el apo e de calo , en e o os
(Alagusunda am e al. 2010).
De o ma esumida, la ca idad nasal es á di idida en dos
mi ades independien es longi udinalmen e po el abique nasal y se
ex iende desde las osas nasales has a la naso a inge
(ap oximadamen e 12-14 cm), ocupando una supe icie al ededo
de 150 cm2 y con un olumen o al de 15-20 mL (Gho i e al. 2015).
P incipalmen e, la ca idad es á compues a de es egiones:
50
es íbulo nasal, egión ol a i a y egión espi a o ia. En humanos,
el es íbulo iene una supe icie de 0,6 cm2, seguida de la egión
ol a i a que ocupa 15 cm2, un 10% de la supe icie nasal mien as
que en oedo es ep esen a al ededo del 30%.
El es íbulo es la zona más ex e na de la na iz. En es a
egión, la abso ción de á macos es muy escasa debido a la
exis encia de ib isas que ac úan como il os y la p esencia de un
ecub imien o epi elial escamoso y que a inizado (Pi es e al.
2009).
El es o de la ca idad nasal comp ende la egión
espi a o ia cuyas pa edes se encuen an plegadas
subdi idiéndose en es co ne es: supe io , medio e in e io (Illum
2004). Dicha egión se conside a el si io p incipal de abso ción de
á macos hacia la ci culación sis émica y es á cons i uida po la
lámina p opia y la memb ana basal que sopo an el epi elio,
cambian e a medida que se p o undiza en la ca idad. Inicialmen e,
un epi elio escamoso se o na a epi elio de ansición y, po úl imo
se con ie e en epi elio pseudoes a i icado (o espi a o io)
o mado po cua o ipos di e en es de células: células no ciliadas,
ciliadas, calici o mes y basales. Las células ciliadas y no ciliadas
poseen mic o ellosidades que aumen an conside ablemen e la
supe icie de abso ción y las ciliadas es án ecubie as po cilios
que, con su mo imien o anspo an el moco hacia la a inge (Illum
2000).
La egión ol a i a, localizada en la pa e más al a de la
ca idad nasal, es la única zona del sis ema ne ioso cen al
51
expues a al ex e io (Cha l on e al. 2007). Las células ol a o ias del
neu oepi elio comienzan en el bulbo ol a o io del sis ema ne ioso
cen al y se ex ienden has a el epi elio ol a i o lo que supone un
con ac o di ec o del ex e io y el ce eb o, pe mi iendo el
anspo e de á macos a és del ne io igémino y ol a o io
(Wu, Hu, and Jiang 2008).
El mecanismo de llegada de los á macos al ce eb o a a és
de la na iz oda ía no es á comple amen e dilucidado y sigue
siendo in es igado; sin emba go, se sabe que an o el ne io
ol a o io como las ías ne iosas del igémino es a ían
in oluc adas y que pod ía p oduci se po ía in acelula o
ex acelula (Lochhead and Tho ne 2012)(Figu a 6).
Figu a 6. Rep esen ación esquemá ica de las u as de acceso al sis ema ne ioso
cen al po ía in anasal (Nose- o-b ain) (S ü zle e al. 2015)
Pa ece que la adminis ación in anasal es una combinación
de di e en es u as (S ü zle e al. 2015). De mane a gene alizada,
as una inspi ación p o unda de las NPs a a és un disposi i o
52
adecuado, las pa ículas pueden segui es caminos di e en es: (I)
en ada di ec a en la ci culación sis émica desde la ca idad nasal,
(II) en ada en el bulbo ol a o io a a és de las neu onas y (III)
llegada di ec a al ce eb o ía ne io igémino (Kuma , Pandey,
and Jain 2016).Po lo an o, el anspo e di ec o de los á macos a
lo la go de los ne ios ol a o io y igémino se conside a cada ez
más una u a no in asi a p ome edo a.
Va ios ipos de moléculas (moléculas pequeñas y g andes) y
de células han alcanzado el ce eb o con éxi o a a és de es a ía
in anasal(Lochhead and Tho ne 2012). Cabe menciona la insulina
(Tiedemann e al. 2017)(Ramos-Rod iguez e al. 2017)(B abazon
e al. 2017)(Bell and Fadool 2017), neu o o inas (como el ac o
de c ecimien o ne ioso)(Chou e al. 2017)(Male ba e al.
2011)(Vaka e al. 2013)(He an e al. 2014), e i opoye ina (A.
Me elli, Czo nyj, and Laza owski 2015)(Amalia Me elli, Czo nyj,
and Laza owski 2013)(Rod íguez C uz e al. 2016),
benzodiacepinas (Bo ne and Sin o 2011)(Inokuchi e al. 2015) y
células mad e (Danielyan e al. 2011).
Sin duda, el ápido p og eso de la medicina es p ome edo
pa a el a amien o de en e medades neu odegene a i as, ya que
p opo ciona un nue o en oque pa a el con ol de la libe ación de
ac i os iejos y nue os. De hecho, la combinación de
la nano ecnología y la adminis ación in anasal se es á ol iendo
más a ac i a en los úl imos años (Goldsmi h, Ab amo i z, and Pee
2014)(Shah, Yada , and Amiji 2013)(Sama idou and Alonso 2018).
53
Es con enien e en a iza la u ilidad de las NPs de PLGA
di igidas al ce eb o ía in anasal como una de las
nano o mulaciones más p ome edo as.
Recien emen e, Bonacco so e al. (Bonacco so e al. 2017)
compa a on la capacidad de las NPs de PLGA y qui osano pa a
llega al ce eb o as una adminis ación in anasal en a as. Pa a
ello, las NPs se ma ca on con odamina y su ubicación ue
de e minada po mic oscopía de luo escencia. Los expe imen os
e ela on que ambas NPs, con diáme o simila pe o una ca ga
supe icial opues a, llega on al ce eb o y pe sis ie on en el mismo
du an e 48 h. Las NPs de PLGA con ca ga nega i a llega on al
ce eb o a a és de la ía ol a i a, mien as que las ías ne iosas
del igémino ue on las in oluc adas en el caso de las NPs de
qui osano ca gadas posi i amen e.
En algunos casos, con la adminis ación in anasal se
ob ienen e ec os iguales a los esul ados alcanzados as una
adminis ación po ía in a enosa. Po ejemplo, Seke da g e al.
(Seke dag e al. 2017) diseña on una nanopa ícula híb ida de
lípido-PLGA ca gada con ácido a nesil- iosalicílico pa a el
a amien o del glioma. Después de un a amien o
po un pe íodo de 5 días po adminis ación in a enosa o
in anasal a las a as Wis a , obse a on que las dos u as de
adminis ación p oduje on una educción impo an e y simila del
umo . Es os esul ados apoyan la u ilidad po encial de la
adminis ación in anasal como un no edoso mé odo no in asi o
en el a amien o de glioma.

54
A eces, moléculas p ome edo as pa a el a amien o de una
cie a en e medad esul an se inú iles y allan de mane a
decepcionan e. Es e ue el caso del a en ub il, un compues o con
g andes expec a i as de modula la ac i idad de la enzima gamma-
sec e asa, cla e en la o mación del pép ido be a amiloide,
implicada en la en e medad de Alzheime . P obablemen e, la
escasa capacidad de pene ación del á maco condujo al acaso de
su empleo pa a el a amien o de la en e medad
neu odegene a i a. Con el esu gi de la nanomedicina, el
a en ub il ha uel o a emplea se ecien emen e, encapsulado en
NPs de PLGA o NPs sólidas lipídicas. Pa a ambas o mulaciones, el
diáme o de los nanosis emas e a in e io a 200 nm, lo que acili a
el anspo e anscelula a a és de los axones ol a i os
(Mun imadugu e al. 2016). Los in es igado es del es udio
descub ie on que ambas se di igían al ce eb o de mane a exi osa,
siguiendo la u a ol a o ia as una adminis ación in anasal,
aunque las o muladas con PLGA ue on más e ec i as an o pa a el
di eccionamien o hacia el SNC como pa a la can idad de á maco
ehiculizado.
La adminis ación de agen es neu op o ec o es al ce eb o
ambién es á omando una conside ación ele an e. Xiao e al.
(Xiao e al. 2016) desa olla on una o mulación de imoquinona,
encapsulada en NPs de PLGA-qui osano pa a e alua su e icacia en
un modelo de isquemia en oedo es después de se adminis adas
ía in anasal. La imoquinona es un p oduc o na u al de i ado de
la especie Nigella sa i a que exhibe p opiedades an iin lama o ias y
an icance ígenas pe o que p esen a una biodisponibilidad muy
55
educida. Los au o es demos a on una educción signi ica i a de
la isquemia y una mejo a del pe il a macociné ico del á maco en
el ce eb o. Los ensayos bioquímicos ambién mos a on una
educción de la pe oxidación lipídica, un inc emen o de glu a ión,
ca alasa y supe óxido dismu asa en el ce eb o, lo que sugie e el
po encial de las NPs de PLGA-qui osano pa a se u ilizadas como
ehículo pa a la lib ación de á macos en el ce eb o.
O os in es igado es es udia on la posibilidad de emplea
las NPs adminis adas ía in anasal como anspo ado es de
sus ancias e apéu icas con ac i idad an iepilép ica. En es e
sen ido Sha ma e al. (Sha ma e al. 2016) encapsula on el
midazolam en NPs de PLGA adioma cadas con Tc-99m pa a
e alua la biodis ibución de las mismas as se adminis adas ía
in anasal e in a enosa a a as Sp ague-Dawley. Las imágenes de
gammacáma a y la elación de cap ación en sang e/ce eb o,
indica on un mayo di eccionamien o ce eb al de es os
nanosis emas después de una adminis ación in anasal.
Cabe señala el empleo de NPs de PLGA uncionalizadas
supe icialmen e pa a se adminis adas po es a ía no in asi a.
En es e sen ido, Bi e al, encapsula on o igo ina (un agonis a
dopaminé gico usado pa a el a amien o del Pa kinson) en NPs de
PLGA PEGiladas y uncionalizadas con lac o e ina. Tan o las
uncionalizadas como las no uncionalizadas mos a on una
libe ación sos enida del á maco du an e 48 h. Los es udios in i o,
demos a on que la llegada al ce eb o de o igo ina as una
adminis ación in anasal u o una dis ibución he e ogénea, con
una mayo concen ación en el cue po es iado, la egión
56
p imo dial a ec ada en el Pa kinson. Sin emba go, la
adminis ación del á maco ue mucho más e ec i a cuando se
emplea on las NPs uncionalizadas con lac o e ina (Bi 2016).
VENLAFAXINA (VLX) COMO FÁRMACO MODELO
Usada en es e es udio como á maco modelo, la VLX
((Clo hid a o de-1-[(2-dime ilamino)-1-(4-me oxi enil) e il]
ciclohexanol)) es un á maco de e ce a gene ación pa a el
a amien o de la dep esión y la ansiedad (Panahi and Alaei 2014)
que se p esen a como un sólido blanco de na u aleza c is alina,
muy soluble en agua (S. Jain and Da a 2014). Es un an idep esi o
de acción dual que inhibe selec i amen e la ecap ación neu onal
de se o onina y no epine ina (ISRN), aumen ando los ni eles de
los neu o ansmiso es en el espacio sináp ico (Mad akian e al.
2015).
La VLX su e me abolismo hepá ico po la acción de la
isoenzima CYP2D6 ans o mándose en O-desme il enla axina,
ambos compues os bicíclicos (Dziu kowska and Wesolowski 2013).
T as una adminis ación o al, mues a nume osas limi aciones ya
que p esen a un inicio len o de acción, una biodisponibilidad pob e
(40-45%)(Haque e al. 2014) y necesi a se adminis ada de
mane a ecuen e pa a man ene los ni eles e apéu icos, ya que
ambién posee una co a ida media (4-5 h) (Pund, Ras e, and
Bo ade 2013).
Es una de las sus ancias e apéu icas más ampliamen e
usadas como á maco an idep esi o; sin emba go, después de la
adminis ación o al, p esen a e ec os secunda ios no deseables
57
como nauseas, es eñimien o, debilidad, somnolencia, insomnio,
aquica dia, dolo de cabeza, a iga y sequedad bucal (J. Tang e al.
2012). Como incon enien e añadido, se c ee que el á maco es un
induc o de la glicop o eína P, lo que p o oca el e lujo del mismo
hacia el lado apical de la memb ana hema oence álica (Eh e e al.
2007)(O’B ien e al. 2012).
Ap obada en 1993 po la FDA como el p ime ISRN pa a el
a amien o del as o no dep esi o mayo (TDM), en la ac ualidad
es á disponible en más de 90 países (Wa anabe e al. 2018). La
dosis dia ia de VLX puede a ia en e 75 y 375 mg en unción del
ipo de o mulación adminis ada (Ha ison, Fe ie , and Young
2004) y es á come cializada como una mezcla acémica de las
o mas enan iomé icas S - (+) y R- (-) en can idades iguales
(Dziu kowska and Wesolowski 2013).
En el me cado, es á disponible bajo dos o mulaciones de
adminis ación: o mas de libe ación inmedia a (37.5, 50 y 75 mg)
y sis emas de libe ación con olada (75, 150 y 225 mg
(“Venla axina” n.d.). Como se ha ci ado an e io men e, posee una
ida media co a y debe se adminis ada en e 2 y 3 eces al día
pa a man ene las concen aciones en el in e alo e apéu ico. Ello
desemboca en el incumplimien o del a amien o po pa e del
pacien e y, po ello, la o mulación de libe ación con olada su ge
como una al e na i a pa a aumen a la ole ancia del pacien e y
mejo a el bene icio/ iesgo con espec o a las o mas de libe ación
inmedia a (H. A. Pa el e al. 2011). Sin emba go, las p esen aciones
de libe ación e a dada siguen p o ocando nume osos e ec os
secunda ios y po ello, nume osos au o es han es udiado la
64
Química (Ba celona, España) y el ace oni ilo con calidad
HPLC se ob u o de VWR.
El agua u ilizada en los expe imen os ue desionizada y
il ada (Milli-Q Academic, Me ck Millipo e, Massachuse s, EE.UU.).
Cul i os celula es
Pa a los expe imen os celula es, las células endo eliales
mic o ascula es ce eb ales humanas (línea celula hCMEC/D3)
ue on amablemen e donadas po el g upo de in es igación del D .
Sa men o (Ins i u o de In es igaçao e Inno açao em Saúde, i3s,
Uni e sidade do Po o, Po ugal). El medio de cul i o basal (EBM-
2) se ob u o de Lonza (Basilea, Suiza) y ue suplemen ado con
sue o e al bo ino inac i ado (FBS) adqui ido de Biowes
(Missou i, EE.UU.), penicilina/es ep omicina, hid oco isona, ácido
ascó bico, HEPES y ac o básico de c ecimien o de ib oblas os
(bFGF) que se ob u ie on de Sigma-Ald ich y concen ado lipídico
químicamen e de inido (CD lipid concen a e) de Gibco, The mo
Fishe Scien i ic (Massachuse s, EE.UU.).
T i on® x-100®, B omu o de 3- (4,5-dime il iazol-2-il) -2,5-
di enil e azolio ( eac i o MTT) y pa a o maldehído (PFA) ue on
ob enidos de Sigma-Ald ich (S . Louis, EE.UU.). La solución de
colágeno ipo I de la cola de a a (Gibco) y el colo an e luo escen e
de ADN, Hoechs ® 33342 (In i ogen) se adqui ie on de The mo
Scien i ic (Massachuse s, EE.UU.).

65
Animales
En los ensayos expe imen ales in i o pa a es udia la
llegada de las pa ículas al ce eb o as adminis ación in a enosa
desa ollados en la Uni e sidad de Ve ona (I alia) se usa on
a ones adul os C57bl/6 machos adul os (3-6 meses) de i ados de
la colonia de c ía de las ins alaciones de animales de la Facul ad de
Medicina de la p opia uni e sidad. Como anes ésico se empleó
2,2,2- ib omoe anol.
Todos los expe imen os ue on ap obados po el Comi é de
Cuidado y Uso de Animales de la Uni e sidad de Ve ona (CIRSAL) y
se ealiza on siguiendo los "P incipios de cuidado de animales de
labo a o io" (publicación NIH No. 86-23) con el in de minimiza el
núme o de animales u ilizados y pa a e i a su su imien o.
Además, los expe imen os se lle a on a cabo bajo la au o ización
é ica del Minis e io de Salud i aliano, en es ic o cumplimien o de
las di ec i as del Consejo de Comunidades Eu opeas (86/609/CEE)
y las di ec ices ARRIVE.
Los animales se man u ie on en condiciones ambien ales
es ánda ( empe a u a y humedad) y un ciclo de luz/oscu idad de
12h/12h y acceso lib e a alimen os y agua.
Pa a los es udios en animales desa ollados en la
Uni e sidad de Se illa (es udios de biodis ibución in i o as
adminis ación in anasal), se emplea on a ones de la cepa
C57BL/6J. Ke amido (ke amina, 100 mg/mL)(Labo a o ios
Rich e Pha ma, Wels, Aus ia) y Sedín (hid oclo u o de
66
mede odimida, 1mg/mL)(Labo a o ios Calie , Ba celona, España)
ue on empleados como anes ésicos.
Los expe imen os desa ollados ue on ap obados po el
Comi é É ico de In es igación Expe imen al de la Uni e sidad de
Se illa. El p oyec o au o izado po la Jun a de Andalucía con
núme o 20/03/2017/046, cumplió los equisi os pa a la
in es igación con animales expe imen ales de acue do con la
Di ec i a de la Comunidad Eu opea (2012/707/UE) y con el
a ículo 41.1 del RD 53/2013 de la no ma i a española pa a el uso
de animales de labo a o io.
Ra ones C57bl/6 de 3-4 semanas de ida (machos y hemb as)
con un peso comp endido en e 18-20 g. Los animales ue on
a ados humanamen e y se aloja on en jaulas especí icas en el
animala io de la Facul ad de Fa macia con ciclos de luz/oscu idad
de 12 h y acceso lib e a alimen os y agua a una empe a u a
cons an e de 25 ± 0.5ºC.
MÉTODOS
P epa ación de las NPs
La elección de un mé odo de p epa ación de NPs depende
p incipalmen e de la solubilidad del á maco a encapsula y de la
aplicación inal (M. Li, Rouaud, and Poncele 2008).
La écnica de e apo ación del disol en e de una emulsión
o ece g an e sa ilidad a la ho a de inco po a el ac i o, ya que
pe mi e encapsula ac i os an o hid ó ilos como lipó ilos. Sin
67
emba go, pa a á macos hid ó ilos que se p e enden encapsula en
una ma iz lipó ila, es a écnica no esul a an e icien e ya que
pueden p oduci se pé didas de la sus ancia ac i a disuel a en la
ase acuosa ex e na po di usión (Iqbal e al. 2015). Pa a sol en a
es e p oblema, se emplean emulsiones múl iples (W1/O/W2), en la
que el á maco hid ó ilo a disuel o en una ase acuosa in e na
(W1) (Ib aheem e al. 2014).
Cuando se a a de á macos poco solubles en agua o
insolubles, gene almen e se emplea una emulsión simple de ase
ex e na acuosa O/W.
De mane a gene al, pa a la p epa ación de pa ículas po
es a écnica empleando ma ices polimé icas lipo ilas, es necesa ia
la p epa ación p e ia de a ias disoluciones: una solución acuosa
W1, que con iene ensioac i o y en la que i á disuel o el á maco
pa a las NPs ca gadas, una solución o gánica del políme o y,
inalmen e, una segunda solución acuosa de emulsionan e (W2).
B e emen e, la solución acuosa W1 se homogeneiza con la solución
o gánica pa a o ma una p ime a emulsión de ase ex e na oleosa
(W1/O) y és a emulsión p ima ia se adiciona a la ase W2 pa a da
luga a una emulsión inal múl iple (W1/O/W2)(R. Liu e al.
2005)(Ve igu a 7). Pa a la o mación de ambas emulsiones, es
p imo dial el apo e de ene gía.
68
Figu a 7. P incipales e apas del mé odo de e apo ación del disol en e de una
emulsión.
Es a écnica ha sido p e iamen e empleada po nues o
g upo de in es igación (Ma ín-Bande as e al. 2013) pa a la
elabo ación de NPs de gemci abina. Algunas modi icaciones se han
lle ado a cabo du an e el p oceso con obje o de consegui NPs con
unas ca ac e ís icas isicoquímicas ( amaño, p opiedades
supe iciales, e c.) óp imas pa a alcanza el obje i o plan eado.
En es e abajo, la p oducción de las pa ículas po el
mé odo de e apo ación del disol en e de una doble emulsión se
lle ó a cabo en dos pasos p incipales:
69
(1) Adición go a a go a de 100 µL de una solución acuosa de
PVA al 0.5% p/ ( ase W1) a 2 mL de una solución
o gánica de PLGA en ace a o de e ilo a una concen ación
de 4% p/ ( ase O) en agi ación cons an e y dejando
sonica du an e 1 minu o. La ase W1 se á la que
con enga el á maco en las NPs ca gadas. En el p esen e
abajo, se ensayan di e en es concen aciones de
á maco (5%, 10%, 15%, 20% y 25% p/ ).
(2) La emulsión esul an e del paso an e io es añadida de
mane a inmedia a a 10 mL de una segunda disolución
acuosa de PVA al 0.5% p/ ( ase W2) en cons an e
agi ación (24.000 pm), empleando un homogeneizado
de al a elocidad, Poly on® PT 2500E (Poly on,
Mon eal, Canadá). Una ez o mada la emulsión
múl iple, se man iene 1 minu o más en agi ación.
Seguidamen e, la suspensión de pa ículas se dejó en bajo
agi ación magné ica du an e 2 h a empe a u a ambien e en
campana de ex acción has a la comple a e apo ación del
disol en e o gánico.
A con inuación, las NPs se ecogie on po
ul acen i ugación (Cen í uga Eppendo 504R; Eppendo AG,
Hambu go, Alemania) a 15557 c du an e 30 min, a 4ºC. T as dos
la ados, las NPs se esuspendie on en una solución de ealosa al
5% p/ , empleada como agen e c iop o ec o .
Finalmen e, la suspensión de NPs se congeló y ue on
lio ilizadas pa a usa las pos e io men e (-80±0.5ºC y 0.054 mBa ;

70
C yodos-50, Tels a Indus ial S.L., Ta asa, España). Todas las
o mulaciones se p epa a on po iplicado pa a asegu a la
ep oducibilidad de las mismas.
Modi icación supe icial de las NPs de PLGA
El obje i o de la uncionalización supe icial de las NPs es el
di eccionamien o de las mismas hacia un ó gano especí ico (en es e
caso, el ce eb o), uncionalizándolas con ligandos especí icos pa a
ecep o es que se exp esan en ó ganos, ejidos o células diana.
Pa a ac ecen a la in e nalización de las NPs en las células
endo eliales de la BHE, dos biomoléculas di e en es de na u aleza
pep ídica (ligandos especí icos del ecep o de T ), se conjuga on
en la supe icie de las pa ículas: T o T Rp. Como ya se ha ci ado
con an e io idad, abajos de in es igación de nume osos au o es
a alan la capacidad de ambos ligandos pa a mejo a la capacidad
de las NPs pa a a a esa la ba e a (Chang e al. 2009)(Cui e al.
2013)(W. Guo e al. 2013)(Yan e al. 2013)(Gomes e al. 2017).
La uncionalización de las NPs de PLGA se lle ó a cabo
siguiendo el mé odo de la ca bodiimida, ap o echando los g upos
ca boxilos e minales del PLGA pa a la o mación de un enlace
amida con el g upo amino de las moléculas pep ídicas (Das,
Dilnawaz, and Sahoo 2011) con algunas modi icaciones ( e igu a
8).
71
Figu a 8. Esquema de las eacciones que comp enden la uncionalización de NPs
a a és del mé odo ca bodiimida.
La conjugación se lle a a cabo en dos pasos: el p ime paso
incluye la ac i ación de los ácidos ca boxílicos de la supe icie de
las NPs polimé icas. Pa a ello, 20 mg de NPs se dispe sa on en 1
mL de agua Milli-Q, seguidamen e, go a a go a se añadie on 500 µL
de EDC (1mg/mL) y 500 µL de NHS (1mg/mL) a la suspensión de
NPs, man eniendo en agi ación cons an e du an e 4 h a
empe a u a ambien e y en a mós e a ine e. Pa a elimina el
exceso de EDC y NHS, la suspensión de NPs se ecogie on po
ul acen i ugación (Cen í uga Eppendo 504R; Eppendo AG,
Hambu go, Alemania) a 15557 c du an e 30 minu os a 4ºC.
En la siguien e e apa, las NPs ac i adas se edispe sa on en
2 mL de agua Milli-Q y se añadie on 200 µL de una solución acuosa
de T (1 mg/mL). La suspensión se man u o en agi ación cons an e
du an e oda la noche.
T as es e iempo, la can idad de T no unida a las NPs se eliminó
po ul acen i ugación en las condiciones mencionadas
an e io men e. La can idad de ligando no unida se analizó
72
pos e io men e pa a comp oba la e icacia de conjugación ( e
apa ado 4.2.8).
El mismo p o ocolo ue empleado pa a la uncionalización
de las NPs polimé icas con T Rp.
Pa alelamen e, se ealizó un es udio de modi icación
supe icial sin emplea el mé odo de la ca bodiimida, incubando la
suspensión de NPs (2 mg/mL) únicamen e con la solución de los
ligandos (sin EDC ni NHS) con el in de comp oba que los ligandos
se unían co alen emen e en luga de queda adso bidos en la
supe icie de las pa ículas.
P epa ación de NPS luo escen es pa a es udios in
i o de cap ación celula .
Pa a consegui la isualización de las pa ículas en los
ensayos de cap ación celula , se usó NR como luo ó o o, siguiendo
un p o ocolo simila al desa ollado en el apa ado 4.2.1 con
algunas modi icaciones.
De mane a b e e, 100 µL de una solución de NR en DMSO
(1 mM) se disol ie on en 2 mL de una solución de PLGA en ace a o
de e ilo. La solución o mada se añadió go a a go a a 10 mL de una
solución de PVA (0.5% p/ ) en agi ación in ensa cons an e (24.000
pm) empleando un homogeneizado de al a elocidad (Poly on®
PT 2500 E)(Poly on, Mon eal, Canadá). La suspensión de NPs se
dejó en agi ación magné ica cons an e has a la comple a
e apo ación del disol en e o gánico. T as es o, se siguie on los
73
mismos pasos que pa a la p epa ación y modi icación supe icial de
las NPs ca gadas con VLX (Apa ados 4.2.1 y 4.2.2).
P epa ación de las NPs luo escen es pa a es udios de
pe meabilidad
La e aluación de la pe meabilidad de las NPs a a és de un
modelo in i o de BHE se lle ó a cabo usando pa ículas
p epa adas con PLGA p e iamen e conjugado con FITC.
Pa a la o mación del conjugado PLGA-FITC se empleó el
mé odo de ca bodiimida (Yin e al. 2007) con lige as
modi icaciones, es ableciendo una unión co alen e en e políme o
y luo oc omo.
El p ime paso implica la ac i ación de los g upos ca boxilos
del PLGA, pa a es o, a un 1 mL de una solución de PLGA (20% p/ )
en diclo ome ano (DCM), se añadie on go a a go a 2 mL de una
solución de DCM que con enía EDC (1.02% p/ ) y NHS (0.8% p/ ),
incubándose du an e 2 h a empe a u a ambien e.
Después, se añadió go a a go a 200 μL de una solución de
FITC 0,1 M en DCM: pi idina (1:1). La mezcla se agi ó du an e 2 h
en la oscu idad y, pos e io men e, se incubó du an e la noche a 4º
C. Pa a ob ene el PLGA ma cado, se usa on 30 mL de me anol,
añadidos go a a go a en ío, p o ocando la p ecipi ación del
políme o. Finalmen e, el conjugado FITC-PLGA se la ó con me anol
pa a elimina la luo esceína no conjugada y, pos e io men e con
agua Mili-Q pa a elimina los esiduos de me anol. El políme o
ma cado se congeló, lio ilizó y almacenó en la oscu idad a 4 ºC.
80
del c omó o o apo a sencillez, apidez y sensibilidad, mos ando
g an ole ancia a compues os que in e ie en en o os mé odos de
cuan i icación (B own, Ja is, and Hyland 1989).
Pa a el cálculo can idad de ligando pep ídico unido a la
supe icie de las NPs, se es ableció una ec a de calib ado en un
in e alo de concen aciones en e 0-250 µg/mL pa a ambas
biomoléculas (R2 = 0,999). La cuan i icación se lle ó a cabo de
mane a indi ec a, midiendo la can idad de ligando no unido
co alen emen e a la pa ícula. La e icacia del p oceso ambién se
exp esa en µg de ligando unido po g amos de NPs (Das, Dilnawaz,
and Sahoo 2011).
Es udio de la in luencia de la congelación en las NPs.
Op imización de las condiciones de lio ilización.
La lio ilización es un p oceso que comp ende es e apas
di e enciadas: la p ime a e apa consis e en la congelación de la
suspensión acuosa de NPs, du an e es a e apa la suspensión se
en ía y comienzan a o ma se los c is ales de agua gene ando
ensiones que pueden conduci a su pé dida de es abilidad.
Seguidamen e, el paso de secado p ima io, implica la sublimación
del hielo del p oduc o congelado. T as la comple a sublimación, se
o man po os que se co esponden con los si ios ocupados po el
hielo an e io men e. Finalmen e, el agua abso bida po el p oduc o
es eliminada en un secado secunda io (X. (Cha lie) Tang and Pikal
2004). Una ez lio ilizadas, (a) las NPs deben p ese a las
ca ac e ís icas iniciales, (b) los amaños y la dis ibución de
amaños deben se simila es a los del p oduc o p e io sin lio iliza ,

81
(c) la esuspensión debe se acep able con un iempo co o de
econs i ución y (d) la ac i idad a macológica del ac i o debe
pe manece inal e ada. Se a a de una écnica len a y cos osa,
ampliamen e usada pa a mejo a la es abilidad de di e sos ac i os
a macéu icos (Abdelwahed e al. 2006).
La congelación es un p oceso muy ag esi o pa a las NPs po
an o, es de i al impo ancia el empleo de un c iop o ec o pa a
asegu a la calidad inal del p oduc o, ya que el políme o, as
su i un p oceso de congelación iende a o ma un gel di ícil de
esuspende (Abdelwahed e al. 2006). Los c iop o ec o es más
comúnmen e usados son: alcoholes de bajo peso molecula como el
polie ilenglicol o azúca es como mani ol, ealosa o saca osa
(Almalik e al. 2017).
En el p esen e abajo, se e aluó la in luencia de las
di e en es p opo ciones de ealosa:NPs, es udiándose el e ec o en
agua, y 1:1.5, 1:3, 1:9, 1:15 de ealosa:NPs espec i amen e, que
se añadie on di ec amen e a una suspensión de NPs blancas sin
uncionaliza as los la ados po ul acen i ugación, an es de
congela las.
El amaño de las NPs se midió as un p oceso comple o de
lio ilización, esuspendiéndolas en agua Milli-Q. También se e aluó
el e ec o del c iop o ec o midiendo el amaño de las NPs después
de descongela las, sin lio iliza .
82
Es udios de libe ación in i o
Conoce la libe ación in i o del ac i o desde los
nanosis emas es imp escindible pa a con ola el po cen aje
libe ado en unción del iempo.
El es udio se lle ó a cabo median e un mé odo de diálisis
empleando ampón os a o (PBS) a pH 7.4 ± 0.1 como medio de
libe ación a 37 ± 0.5ºC. P e iamen e, las bolsas ue on hid a adas
con agua du an e 12 h (an es de su uso), as es o, 5 mL de cada
suspensión de NPs (VLX-PLGA, T -VLX-PLGA y T Rp-VLX-PLGA) en
PBS a azón de 5 mg pa ículas/mL (equi alen e ap oximadamen e
a 490 µg de á maco) se in oduje on en la bolsa de diálisis (2 KDa,
ubos de memb ana de diálisis Spec um®Spec a/Po ® 6,
Cali o nia, EE.UU.) ijadas en los ex emos con pinzas y se
coloca on en el in e io de un E lenmeye cónico con 100 mL de
ampón. Las mues as se agi a on a 200 pm du an e odo el
ensayo y, a los iempo p e- ijados (0.5, 2, 4, 8, 12, 24 h) se e i a on
alícuo as de 0.5 mL de mues a del medio de libe ación, suplidos
con un olumen igual de PBS a la misma empe a u a pa a
ga an iza las condiciones sink. El ensayo se ealizó po iplicado.
Finalmen e las mues as se il a on y se inyec a on (20 µL)
en el sis ema de HPLC con las condiciones desc i as en el apa ado
4.2.7.1 pa a e alua el po cen aje de ac i o libe ado.
En es e expe imen o, se es udió la posible in luencia de la
p esencia de los ligandos en la supe icie de las NPs
uncionalizadas con espec o a las NPs simples.
83
Es abilidad de las o mulaciones de NPs en líquido
ce alo aquídeo (LCR) a i icial
Pa a desa olla es udios in i o, es necesa io alo a la
es abilidad de las pa ículas en los medios p incipales en los que se
an a encon a en el o ganismo. Po an o, se desa olló un es udio
pa a e alua la pe du abilidad de las NPs en LCR, uno de los
p incipales líquidos del SNC.
Pa a ello, se p epa ó un LCR a i icial siguiendo la
o mulación empleada po Ga ziandia e al. B e emen e, en 1 L de
agua Mili-Q se disol ió: 6.15 g NaCl, 0.216 g KCl, 0.447 g MgCl2,
0.255 g CaCl2, 6.009 g Na2CO3, 0.057 g Na2HPO4, 0.613 g D-glucosa,
0.2 g de ácido ascó bico y 0.3 g de albúmina sé ica bo ina (BSA) y
el pH se ajus ó a 7.35 (Ga ziandia e al. 2016).
Po an o, 1 mg de cada o mulación de NPs (PLGA-, VLX-
PLGA-, T -PLGA-, T Rp-PLGA-, T -VLX-PLGA-, T Rp-VLX-PLGA-NPs)
se dispe sa on en 5 mL del luido a i icial y la suspensión se
man u o en agi ación magné ica du an e 24 h a 37ºC. An es de
comenza el ensayo, se midió el amaño y la dis ibución de
amaños (PdI) de las pa ículas usando un Ze asize Mal e n ZS90
(Mal e n Ins umen s, UK), as el iempo de incubación, se ol ió
a medi el amaño y PdI de las pa ículas.
84
Es udios celula es in i o
Cul i os celula es
Las células endo eliales mic o ascula es ce eb ales
humanas (línea celula hCMEC/D3) de i an de los mic o asos del
lóbulo empo al humanos, aislándolos del ejido ex i pado, con al o
ni el de exp esión del anspo ado de glucosa (GLUT1) y el
ecep o de T (Weksle , Rome o, and Cou aud 2013). Las células
ue on cul i adas en medio basal de c ecimien o endo elial (EBM-
2) suplemen ado con FBS (5% / ), penicilina-es ep omicina (1%
/ ), ácido ascó bico (5 µg/mL), hid oco isona (1.4 µM),
concen ado lipídico químicamen e de inido (CD Lipid
concen a ed) (1/100 / ), HEPES (10 mM) y ac o básico de
c ecimien o de ib oblas os (bFGF). Es e úl imo suplemen o se
añadió en el úl imo momen o, a la ho a de usa el medio. El cul i o
celula se man u o a 37ºC en un ambien e humidi icado con 5% de
CO2 (Incubado a de CO2Au oFlow UN-4750 Wa e Jacke ; Nuai e,
EE.UU.). El medio ue eemplazado cada dos días y las células
ue on subcul i adas después de alcanza , ap oximadamen e, un
80% de con luencia (Gomes e al. 2017).
Es udios in i o de oxicidad celula
Pa a e alua la iabilidad de las células expues as al
con ac o con las NPs se ealizó el ensayo de educción del B omu o
de 3 (4,5 dime il-2- iazoil)-2,5-di enil e azólico (MTT), un ensayo
colo imé ico ácil y cómodo que mide cuan i a i amen e la
ac i idad me abólica de las células iables y que se basa en la
85
capacidad de las enzimas deshid ogenasas mi ocond iales de las
células me abólicamen e ac i as de educi un compues o ama illo
e hid ó ilo, la sal de b omu o de e azolio (3- (4,5-dime il iazol-2-
il) -2,5-di enil e azolio), a un compues o insoluble ( o mazán), de
colo pú pu a. Cuando las células cap an la sal de b omu o de
e azolio (MTT) se ompen y los c is ales de o mazán se
solubilizan con DMSO, dando como esul ado una solución de colo
mo ado, cuya in ensidad depende á del g ado de iabilidad celula
(Kong e al. 2011).
El ensayo de ec a células i as y debe hace se en la
oscu idad, ya que el eac i o MTT es sensible a la luz (Mosmann
1983).
La iabilidad celula se e aluó po es e ensayo, poniendo en
con ac o las células con los di e en es nanosis emas y la VLX lib e
du an e 24 h a dis in as concen aciones: 0.1, 1, 10, 100 y 1000
µg/mL de NPs, equi alen es a 0.014, 0.14, 1.4, 14 y 140 µg/mL de
VLX espec i amen e. El á maco lib e se añadió bajo las mismas
condiciones.
Las células hCMEC/D3 ue on semb adas con una densidad
de 1 x 105 células/pocillo en una placa de 96 pocillos (Nunclon®;
The moScien i ic, Wal ham, EE.UU.) e incubadas du an e 24 h
(37ºC) pa a pe mi i la adhesión de las células. El medio se e i ó
comple amen e y las células se la a on dos eces con 200 µL de
PBS (pH 7.4). Después, las células se incuba on con las di e en es
concen aciones de NPs y á maco lib e esuspendidas en medio de
cul i o du an e 24 h. T as es e iempo, las suspensiones se

86
e i a on y las células se la a on dos eces con 200 µL de PBS.
Seguidamen e, se añadie on 200 µL de una solución de MTT (0.5
mg/mL en medio de cul i o) a cada pocillo du an e 4 h, en la
oscu idad. Finalmen e, la solución de MTT ue desca ada y los
c is ales de o mazán ue on disuel os con 200 µL de DMSO,
agi ando en oscu idad du an e 10 min, a empe a u a ambien e
pa a acili a la disolución de los c is ales.
La abso bancia se midió en un lec o de mic oplacas
(Syne gy HT, Bio ek, Ve mon , EE.UU.) a 590 nm y la iabilidad
celula se calculó siguiendo la siguien e ecuación (3):
𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 (%)= 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙− 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜
𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜−𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑥 100 (Ec.3)
Las células incubadas solo con medio basal EBM-2 se
empleó como con ol nega i o ( odas las células se man ienen
iables) y una solución de T i on® X-100 como con ol posi i o
( odas las células mue en).
Es udios in i o de in e nalización celula
Una de las en ajas de los nanosis emas anspo ado es de
á macos es su capacidad pa a in e naliza se en luga es no
accesibles pa a o as o mas a macéu icas adicionales debido a
su amaño y su éxi o depende en g an medida de su capacidad de
in e acción con las células u ó ganos diana. En el caso que nos
ocupa, es de i al impo ancia e alua la pene ación de las
pa ículas en las células endo eliales que o man la BHE pa a
alcanza el ce eb o ya que, de ello, depende á en g an medida su
e ec o e apéu ico. Sin emba go, no siemp e buenos esul ados in
87
i o se aducen en esul ados in i o de calidad pe o pueden
p opo ciona algunas e idencias p elimina es del po encial de las
o mulaciones nanomé icas.
En es e es udio, se empleó la línea celula hCMEC/D3 y se
e aluó la cap ación de las pa ículas (NPs sin modi ica y
modi icadas supe icialmen e con el T o T Rp) po pa e de las
mismas.
La in e nalización de las pa ículas en las células se
de e minó po análisis cuali a i o y cuan i a i o. Pa a isualiza las
NPs en los ensayos de in e nalización celula in i o se p epa a on
pa ículas luo escen es con NR como luo ó o o (p o ocolo
desc i o en el apa ado 4.2.3).
Análisis cuali a i o po mic oscopía con ocal
Pa a el análisis cuali a i o, las células hCMEC ue on
semb adas en co e -slips (1x105 células/co e -slip). P e iamen e,
los co e -slips (12 mm) se si ua on en un placa de 24 pocillos
(Nunclon®; The moScien i ic, Wal ham, EE.UU.), p ecubie as con
colágeno ipo I (50 µg/mL) du an e oda la noche pa a log a la
adhesión de las células. Después de es o, las células ue on la adas
dos eces con PBS e incubadas con una suspensión de NPs (no
uncionalizadas y uncionalizadas con T o T Rp) ca gadas con NR
(50 µg/mL en medio sin FBS) du an e 30 min a 37ºC. T as la
incubación, las células se la a on dos eces con PBS con el in de
elimina las NPs no in e nalizadas y los núcleos de las células se
iñe on con Hoechs ® 33342 du an e 10 min. A con inuación, las
células se ol ie on a la a dos eces con PBS pa a elimina el
88
exceso de Hoechs ® 33342 y se ija on con PFA (4% p/ en PBS)
du an e 20 min. Finalmen e, las células se la a on dos eces con
PBS y se mon a on en un po aobje os con PBS:glice ol (20:80)
pa a se obse adas en el mic oscopio con ocal de ba ido láse
(CLSM)(Zeiss LSM 410, LSM Tech, E e s, EE.UU.) con el so wa e
(Image B owse ZEN con ocal Zeiss) pa a la o mación de
imágenes. Las células sin NPs ue on u ilizadas como con ol.
Análisis cuan i a i o po ci ome ía de lujo
Pa a con i ma cuan i a i amen e los esul ados ob enidos
en los ensayos cuali a i os, la cap ación celula se es udió po
ci ome ía de lujo. Pa a ello, p e iamen e las células se cul i a on
en ascos de cul i o de 25 cm2 (Nunclon®; The mo Scien i ic,
Wal ham, EE.UU.) has a alcanza un 80% de con luencia
(ap oximadamen e 2.5 x 106 células). En onces, el medio se e i ó y
las células se incuba on con la suspensión de NPs ca gadas con NR
( uncionalizadas con T o T Rp y no uncionalizadas) (50 µg/mL en
medio sin FBS) du an e 30 min.
Pasado el iempo de incubación, la suspensión ue e i ada y
las células ue on la adas dos eces con PBS pa a elimina las
pa ículas no in e nalizadas de la suspensión de NPs. Las células se
le an a on con ipsina-EDTA (1 mL) du an e 3 min. Después, se
la a on 2 eces con PBS y se ija on con PFA al 4% p/ en PBS
du an e 15 min. Po úl imo, pa a elimina el PFA, las células se
la a on dos eces con PBS po cen i ugación y la suspensión
celula esuspendida se añadió a ubos de ci ome ía. La can idad
de NPs luo escen es en el in e io de las células ue medida po
89
ci ome ía de lujo (FC 500 Cy omics MPL; Beckman Coul e Inc.,
B ea, EE.UU.) y los da os se analiza on con el so wa e MXP.
Es udios de pe meabilidad a a és de un modelo de
BHE in i o
Modelos de BHE in i o
Los modelos de BHE in i o su gen con la idea de educi el
empleo de animales pa a e alua la pe meabilidad de la misma y
acili a los es udios in i o de anspo e de á macos y la
isiopa ología de las células que componen la ba e a (Helms e al.
2016). Sin emba go, la me a es desa olla un modelo con unas
ca ac e ís icas que ep oduzcan de la mane a más ajus ada posible
la si uación in i o ya que no exis e un modelo de ba e a pe ec o
que posea las mismas ca ac e ís icas que los modelo in i o
(Czupalla, Liebne , and De aj 2014).
La Resis encia Eléc ica T ansepi elial (TEER) es una
medida de la impedancia de la ba e a a las sus ancias que
p e enden alcanza el ce eb o, nos in o ma de la obus ez de la
memb ana y puede medi se colocando un elec odo en el lado
apical (sang e) y el o o en la pa e basola e al (ce eb o).
De mane a gene al, se emplean líneas celula es inmo ales
pa a supli el uso de células ce eb ales p ima ias humanas
(di ícilmen e accesibles) que pueden ob ene se de di e en es
especies. Las líneas inmo ales, en e las que se incluye la línea
celula humana hCMEC/D3 u ilizada en es e es udio, o man
monocapas de células con alo es de TEER comp endidos en e
20-200 Ω·cm2, muy in e io a los alo es de TEER in i o (>1000
96
seguido de PFA al 4% en PBS. El ce eb o y el bazo (como ó ganos
con ol) ue on ex aídos y se almacena on du an e al menos dos
días en saca osa (usado como c iop o ec o ) al 30% en PBS a 4º C.
T anscu ido es e iempo, se usó un mic ó omo de congelación
pa a co a los ejidos en secciones de 40 µm.
En cuan o a los ce eb os, se mon a on es secciones po
animal, co espondien es a los ni eles an e io , medio y pos e io
con un medio de mon aje que con enía P- enilendiamina (como
neu alizado de adicales lib es).
Los po aobje os se obse a on con un mic oscopio con ocal
Leica SP5 (Leica, Mannheim, Alemania) usando un obje i o de
inme sión en glice ol 63X (N.A. 1.3) en combinación con un zoom
de 2.4X ( amaño de píxel de 100 nm). Las imágenes en se ie de
planos Z (0,46 μm) se cap u a on con el so wa e LAS con una
esolución de 1024 po 1024 píxeles.
Análisis ci o luo imé ico
En el momen o del sac i icio, los animales ue on
sac i icados po dislocación ce ical y los ó ganos (ce eb o y bazo)
se disecciona on ápidamen e y se homogeneiza on en PBS usando
un mezclado de mano. Después de la cen i ugación pa a elimina
los es os, los sob enadan es se il a on a a és de di e en es
il os de células (40 μm pa a mues as de ce eb o, 70 μm pa a las
del bazo). El il ado se analizó po ci ome ía de lujo empleando
un ci óme o FACS Can o I (Bec on Dickinson, San Jose, Cali o nia,
EE.UU.), adqui iéndose en e 2x104 y 4x104 e en os. Los da os de

97
ci ome ía de lujo se a a on usando el so wa e FlowJo (T eeS a ,
Ashland, O egon, EE.UU.).
E aluación de la biodis ibución de las NPs en el
o ganismo ía nose- o-b ain as adminis ación in anasal
Adicionalmen e, en base a los esul ados ob enidos as la
adminis ación in a enosa, se lle a on a cabo ensayos de
biodis ibución empleando la u a nose- o-b ain, una ía
p ome edo a pa a mejo a el acceso nume osos ac i os
e apéu icos al SNC.
Pa a ello, se e alua on cua o o mulaciones de NPs
luo escen es (FITC-PLGA-, FITC-PLGA-PEG, T -FITC-PLGA- y T Rp-
FITC-PLGA-NPs), encapsulando FITC como luo ó o o en es as
o mulaciones de NPs. Las pa ículas polimé icas se ca ac e iza on
po su amaño, PdI y po encial ze a.
Pa a el ensayo, odas las o mulaciones se adminis a on a
a és de la u a nose- o-b ain empleando la adminis ación
in anasal usando una mic opipe a, adminis ando un olumen
o al de 15 µL (7.5µL en cada osa nasal) de la suspensión de las
pa ículas en es udio. Las NPs se esuspendie on en sue o
isiológico es é il (ap oximadamen e 30 mg/kg) y se adminis a on
a azón de 2.5 µL con in e alos de 3 minu os en e cada
adminis ación, en osas nasales al e nas.
An es de la adminis ación, los animales ue on anes esiados
median e inyección in ape i oneal con una mezcla de ke amina
(15% / ) y mede omidina (10% / ). Vein e animales ue on
98
di ididos en cinco g upos (4 animales po g upo). Los g upos 1, 2,
3 y 4 se a a on con las pa ículas luo escen es (FITC-PLGA-,
FITC-PLGA-PEG, T -FITC-PLGA- y T Rp-FITC-PLGA-,
espec i amen e). Un quin o g upo se u ilizó como g upo con ol,
a ándose con PBS en las mismas condiciones. T as 30 minu os, a
los a ones se les ealizó una pe usión con PBS es é il pa a limpia
los ó ganos y ejidos de sang e y, educi así las posibles
in e e encias en el ci óme o con las células sanguíneas. Después
co azón, ce eb o, iñones, pulmones, bazo e hígado ue on
ecogidos y conse ados congelados en una solución de saca osa al
30%, usado como c iop o ec o .
Adicionalmen e, se añadió un g upo de animales con el in
de e alua la luo escencia o al p o enien e de las NPs que llega ía
al ce eb o en caso de que odas las NPs alcanza an el ejido. Pa a
ello, los a ones ue on anes esiados con una mezcla de ke amina
(15% / ) y mede omidina (10% / ) y pe undidos con PBS
es é il. T as es o, se ex aje on los ce eb os y se inyec a on con la
dosis o al de cada ipo de pa ículas (FITC-PLGA-, FITC-PLGA-PEG,
T -FITC-PLGA- y T Rp-FITC-PLGA NPs) adminis ada en los
ensayos de nose- o-b ain, con el in de comp oba la luo escencia
de la mues a o al.
Pa a el análisis, los ejidos se homogeneiza on en 1 mL de
PBS empleando un homogeneizado P ecellys 24® (Be in
Ins umen s, Mon igny-le-B e onneux, F ancia) y el
homogeneizado se il ó con il os celula es de 70µm (BD Falcon,
Co ning, Nue a Yo k, EE.UU.). Todas las mues as se analiza on
99
median e ci ome ía de lujo (Cy omics FC 500 MPL; Beckman
Coul e , EE. UU.).
100
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Es udios de ca ac e ización de las NPs p epa adas
La sín esis de NPs se lle ó a cabo po el mé odo de
e apo ación del disol en e de una emulsión siguiendo los pasos
desc i os en la sección 2.2.1. de Ma e iales y Mé odos y ue on
ca ac e izadas po su amaño, índice de polidispe sión, po encial
ze a, mo ología, e icacia de encapsulación y ca ga de á maco. La
emulsión ob enida no p esen ó ines abilidad ni o mación de
ag egados du an e el iempo de e apo ación de disol en e. T as la
conjugación con ambos ligandos, se es udió la e icacia de
conjugación y las NPs se ol ie on a ca ac e iza po amaño,
dis ibución de amaños y po encial ze a pa a e alua la in luencia
de la conjugación supe icial.
De e minación del amaño medio y dis ibución de
amaños
El amaño y la dis ibución de amaños de las NPs se
de e mina on po dispe sión láse . Los esul ados ob enidos se
exp esan como el alo del amaño medio (diáme o
hid odinámico) y su des iación es ánda (DE).
Va ias elocidades de homogeneización ue on es adas en
el homoginazado de al a elocidad Poly on® pa a e alua la
in luencia de la misma en el amaño de las NPs. Finalmen e, la
elocidad se es ableció en 24.000 pm pa a odas las o mulaciones
al no obse a se di e encias cuando se aumen aba la elocidad
has a 30.000 pm (da os no mos ados).
101
T as el análisis de las mues as, las NPs mos a on un
diáme o hid odinámico no supe io a 230 nm y un PdI in e io a
0.2 en odas las o mulaciones, indicando que los sis emas
elabo ados son ampliamen e monodispe sos (PdI < 0.2)(S e e eld,
McKenna, and Pa el 2016) (Tabla 2).
Fo mulación
Diáme o medio
± DE (nm)
PdI ± DE
PLGA NPs
192.1 ± 6.7
0.128 ± 0.033
T - PLGA NPs
228.8 ± 1.3
0.104 ± 0.029
T Rp-PLGA NPs
222.6 ± 1.2
0.078 ± 0.053
VLX+PLGA NPs
194.3 ± 3.7
0.106 ± 0.018
VLX+T -PLGA NPs
218.6 ± 0.5
0.078 ± 0.008
VLX+T Rp-PLGA
216.3 ± 2.7
0.067 ± 0.025
Tabla 2. Tamaño medio y dis ibución de amaño de NPs blancas y ca gadas
( uncionalizadas y no uncionalizadas) (n=9; DE = des iación es ánda ; PdI:
índice de polidispe sión).
Según los da os de la abla, el amaño medio de las NPs de
PLGA blancas ue de 192.1 ± 6.7 nm y su PdI ue 0.128 ± 0.033, lo
que se aduce en una al a homogeneidad de la población.
También se es udió la in luencia de la ca ga de á maco y la
p esencia de ligandos en la supe icie de las pa ículas en el amaño
de las pa ículas.
Las NPs ca gadas con VLX mos a on un amaño medio de
194.3 ± 3.7 nm y una dis ibución de amaños media de 0.106 ±
0.018.
G á icamen e, los esul ados pueden obse a se en las igu as 11 y
12.

102
Figu a 11. His og amas de los amaños de las o mulaciones de NPs blancas,
uncionalizadas y sin uncionaliza ( ojo: NPs blancas; e de: NPs
uncionalizadas con T ; azul: NPs uncionalizadas con T Rp)
Figu a 12. His og amas de los amaños de las o mulaciones de NPs ca gadas
con á maco, uncionalizadas y sin uncionaliza ( ojo: NPs no uncionalizadas;
e de: NPs uncionalizadas con T ; azul: NPs uncionalizadas con T Rp)
Pa a log a alcanza el ce eb o as a a esa la BHE, la
supe icie de las NPs se uncionalizó con dos ligandos especí icos
del ecep o de T . De acue do con la li e a u a publicada, las NPs
conjugadas exhibie on un lige o inc emen o de amaño medio (11-
13%) compa ada con las NPs no uncionalizadas. Dicho inc emen o
puede explica se po la p esencia de las biomoléculas en la
supe icie (Ulb ich e al. 2009)(Pi ek e al. 2012).
Pa a las NPs p epa adas pa a la isualización de los ensayos
celula es in i o, se encapsuló NR como luo ó o o. La misma
endencia que pa a las pa ículas p epa adas con el ac i o se
obse a con es e ipo de pa ículas, exhibiendo un lige o aumen o
de amaño cuando se modi icaban supe icialmen e (Tabla 3).
103
Fo mulación
Diáme o medio
± DE (nm)
PdI ± DE
NR+PLGA NPs
215.6 ± 2.2
0.048 ± 0.022
NR+T -PLGA NPs
234.9 ± 1.5
0.078 ± 0.053
NR+T Rp-PLGA NPs
228.8 ± 4.8
0.092 ± 0.071
Tabla 3. Tamaño medio y dis ibución de amaño de NPs de NR ( uncionalizadas
y no uncionalizadas) (n=9; DE = des iación es ánda ; PdI: índice de
polidispe sión).
Pa a los ensayos de pe meabilidad in i o de las NPs, se
p epa a on NPs luo escen es empleando FITC como luo ó o o.
Pa a ello, el políme o se conjugó con el luo ó o o al y como se
desc ibe en el apa ado 4.2.4. Como paso p e io a la p epa ación de
las pa ículas y con el in de e alua el endimien o de asociación
en e el políme o y FITC, se cons uyó una cu a de calib ación (0-
2 μg / mL) (R2 = 0,998). Después del p oceso de conjugación, se
ob u o un endimien o de asociación del 2.390%, lo que supone
0,956 μg de FITC po mg de políme o.
Las NPs de FITC-PLGA se p epa a on median e DE-SEV
siguiendo el mismo p ocedimien o que pa a las nanopa ículas
ca gadas con á maco (sin inclui el ac i o) y se uncionaliza on
empleando el mé odo de ca bodiimida (desa ollado en el apa ado
4.2.2). Los amaños ob enidos as la p epa ación se mues an en la
abla 4.
104
Fo mulación
Diáme o medio
± DE (nm)
PdI ± DE
cFITC-PLGA NPs
203.6 ± 1.9
0.068 ± 0.018
T -cFITC-PLGA NPs
210.3 ± 1.2
0.040 ± 0.033
T Rp-cFITC-PLGA NPs
207.3 ± 0.8
0.034 ± 0.023
Tabla 4. Tamaño y dis ibución de amaños de las pa ículas luo escen es de
cFITC-PLGA ( uncionalizadas y no uncionalizadas) (n = 9; DE: des iación
es ánda ; PdI: índice de polidispe sión; cFITC: FITC conjugado).
Igual que ocu e con las o mulaciones no luo escen es, las
NPs aumen an de amaño lige amen e (2-4%) cuando son
supe icialmen e modi icadas con los ligandos especí icos.
Po úl imo, pa a los ensayos de biodis ibución in i o,
además de las NPs de PLGA ( uncionalizadas con ambos ligandos y
sin uncionaliza ), se p epa a on pa ículas luo escen es
PEGiladas con FITC, usando el políme o PLGA-PEG. En es e caso, el
luo ó o o ue encapsulado (no conjugado) pa a e i a
in e e encias en la supe icie con las cadenas de PEG. También
p esen es en la supe icie.
Los esul ados se mues an en la abla 5.
Fo mulación
Diáme o medio
± DE (nm)
PdI ± DE
FITC+PLGA NPs
189.5 ± 3.8
0.025 ± 0.023
FITC+T -PLGA NPs
205.4 ± 1.3
0.025 ± 0.023
FITC+T RpPLGA NPs
202.4 ± 3.9
0.058 ± 0.015
FITC+PLGA-PEG NPs
231.2 ± 3.2
0.154 ± 0.007
Tabla 5. Tamaño y dis ibución de amaños de las pa ículas luo escen es de
FITC encapsulado ( uncionalizadas y no uncionalizadas) (n = 9; DE: des iación
es ánda ; PdI: índice de polidispe sión).
105
Todas las o mulaciones de NPs p epa adas pa a es e
ensayo mos a on una es echa dis ibución de amaños, lo que
indica el al o g ado de homogeneidad de las NPs p epa adas. Las
NPs luo escen es sin uncionaliza mos a on un amaño in e io a
200 nm que, as la uncionalización, aumen a on lige amen e de
amaño (6-8%). Sin emba go, las NPs PEGiladas exhibie on un
amaño mayo , po encima de 230 nm de diáme o.
T as el análisis de es os esul ados, se puede esumi que,
siguiendo los p o ocolos desa ollados en los co espondien es
apa ados de Ma e iales y Mé odos, odas las o mulaciones
elabo adas mues an índice de polidispe sión in e io a 0.2 lo que
indica un al o g ado de homogeneidad. Las o mulaciones de NPs
sin modi icación supe icial des inada a los ensayos de
biodis ibución in i o así como las ca gadas con VLX mos a on
amaños in e io es a 200 nm, po lo que se conside an adecuadas
pa a es e ipo de adminis ación ya que, según la li e a u a
publicada (Tong, Qin, and Sun 2017), pa ículas con amaño
in e io a 200 nm son capaces de alcanza el sis ema ne ioso
cen al de mane a más e icien e.
De e minación de la ca ga eléc ica supe icial de las
NPs
El po encial ze a de las pa ículas es á elacionado con la
ca ga eléc ica supe icial de las mismas. El alo de dicho
pa áme o puede in lui en sus p opiedades isicoquímicas, en e
las que des aca la es abilidad del sis ema o la in e acción con o os
compues os ca gados. Po lo an o, jun o con amaño y dis ibución
112
Figu a 14. Valo es de e icacia de encapsulación (EE%) y ca ga de á maco
ob enidos pa a pa ículas p epa adas con di e en e concen ación inicial de
á maco (n=9; ba as de e o = des iación es ánda ).
En unción de los esul ados ob enidos has a el momen o, se
seleccionó aquella o mulación p epa ada con la mayo
concen ación de ac i o pa a con inua con los es udios
pos e io es.
Ambos pa áme os ambién se e alua on as el p oceso de
uncionalización supe icial pa a de e mina si se p oducía una
libe ación del á maco du an e el iempo de incubación. T as el
análisis de HPLC, las mues as no mos a on una libe ación de
á maco a concen aciones de ec ables po el equipo.
Análisis de la e icacia de uncionalización
Una modi icación supe icial e ec i a es un equisi o
indispensable pa a log a una in e acción ligando- ecep o
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0
10
20
30
40
50
60
70
80
5% 10% 15% 20% 25%
Ca ga de á maco (% p/p)
EE (%)
Concen ación inicial de á maco (%p/ )
EE% Ca ga de á maco (%)

113
adecuada. Po an o, pa a e alua la can idad de ligando unida a la
supe icie de las pa ículas, se empleó un mé odo colo imé ico
basado en la abso bancia que pe mi e de ec a moléculas p o eicas
en unción de su concen ación en el medio pa a e alua la
e ec i idad de la unión co alen e en e políme o cuando la
supe icie de las pa ículas su ía la ac i ación de sus g upos
uncionales. De mane a adicional, se es udió la modi icación
supe icial sin la p e ia ac i ación de los g upos ca boxilo, con el
in de comp oba que los ligando se unían co alen emen e en luga
de queda adso bidos en la supe icie.
La can idad de ligando conjugado supe icialmen e se
de e minó median e el mé odo de BCA (desa ollado en el
apa ado 4.2.8) de mane a indi ec a, es deci , midiendo la
p esencia de ligando lib e no unido en el sob enadan e de la
suspensión de pa ículas as la incubación con el ligando.
En las pa ículas modi icadas con T , se conjugó
ap oximadamen e 7.5-8 µg de T po mg de pa ícula, lo que
equi ale a una e icacia de conjugación (EC%) de 75 – 80% mien as
que pa a las modi icadas con T Rp es e alo ue de 7 µg de pép ido
po mg de NPs (al ededo del 70% de e icacia). Dichos alo es no
di i ie on en e las o mulaciones ca gadas con á maco y las no
ca gadas.
En cuan o a las pa ículas luo escen es con NR empleadas
en los es udios celula es in i o, la can idad media de T y T Rp
conjugado se con i mó con el mismo mé odo que pa a las NPs no
luo escen es. En es e caso, se de ec ó al ededo de 6.5 µg de T y
114
5.5 µg de pép ido po mg de nanopa ícula. Dichos alo es
suponen, de mane a ap oximada, un 67% y 56% de e icacia de
conjugación, espec i amen e.
Pa a las pa ículas luo escen es p epa adas con el
conjugado PLGA-FITC, as la conjugación con T se ob u o una
e icacia de conjugación en o no al 85%, que se co esponde con,
ap oximadamen e 8.5 µg de ligandos po mg de nanopa ícula. Pa a
aquellas pa ículas uncionalizadas con T Rp, se ob u o al ededo
de 8 µg de ligando po mg de nanopa ícula, ob eniéndose
esul ados simila es cuando el FITC ue encapsulado.
Finalmen e, cuando la modi icación supe icial se p obó sin
la p e ia ac i ación de la supe icie de las nanopa ículas, ls e icacia
de encapsulación esul ó baja (in e io al 30%) y no ep oducible
compa ada con la mos ada po las pa ículas ac i adas
p e iamen e.
Po an o, a aíz de los esul ados ob enidos, se concluye que
pa a odas las o mulaciones, se log an, al as e icacias en el p oceso
de uncionalización (po encima de 60%, de mane a gene al).
Es udio de la in luencia de la congelación en las NPs.
Op imización de las condiciones de lio ilización
Dado que an o la congelación como la lio ilización son
p ocesos ag esi os pa a la es abilidad de las pa ículas, es
necesa io es ablece las condiciones óp imas pa a ambos p ocesos
y man ene la in eg idad mo ológica de las o mulaciones. En es e
caso, es de i al impo ancia man ene amaños muy simila es a los
115
mos ados po las NPs escas debido a que el acceso de las mismas
al ce eb o es á limi ado po su amaño. Pa a log a lo, es necesa io
la adición de un c iop o ec o que conse e la o mulación in ac a
y, pa a ello, se lle ó a cabo un es udio cuya inalidad ue de e mina
la concen ación óp ima del mismo en disolución, e aluándose la
es abilidad de las pa ículas as la congelación y/o lio ilización (-
80±0.5ºC, 0.057 mBa , C yodos-50, Tels a Indus ial, Te asa,
España).
La ealosa es uno de los c iop o ec o es más empleados
pa a la conse ación de las pa ículas y el elegido pa a es e es udio.
La p opo ción de ealosa:NPs empleadas en el es udio ue on
1:1.5, 1:3, 1:9 y 1:5, pa a la esuspensión de las o mulaciones
p e ia a los p ocesos de congelación-lio ilización. La ealosa se
adicionó en solución acuosa y, adicionalmen e se ensayó el e ec o
cuando las pa ículas e an esuspendidas en agua (sin
c iop o ec o ).
En la igu a 15 se mues a el e ec o de la adición de
di e en es concen aciones de ealosa en el amaño y la
dis ibución de amaños de las NPs as un p oceso de congelación.
116
Figu a 15. E ec o de la adición de di e en es concen aciones de ealosa en el
amaño y dispe sión de las pa ículas as un p oceso de congelación.
Como se obse a en la igu a 15, sólo aquellas pa ículas
congeladas en una p opo ción ealosa:NPs man u ie on an o un
amaño como una dis ibución de amaños p ác icamen e iguales a
las NPs escas. Las NPs esuspendidas en el es o p opo ciones
ealosa:NPs aumen a on lige amen e su amaño y, en
de e minados casos ( ealosa:NPs 1:3) el PdI aumen ó de mane a
signi ica i a lo que indica que, aunque el amaño no aumen e
des acadamen e, se a a de una mues a polidispe sas con
ca ác e he e ogéneo. Las mues as esuspendidas en agua
aumen a on su amaño de mane a signi ica i a, así como su índice
de polidispe sión, esal ando la necesidad de la inclusión de un
c iop o ec o en el medio de suspensión de las NPs pa a conse a
los amaños de las o mulaciones.
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0,20
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800
900
PdI
Tamaño (nm)
Medio de suspensión
Tamaño PdI
117
De mane a ilus a i a, la igu a 16 mues a los his og amas
de los amaños y dis ibución de amaños ob enidos pa a las NPs
an es de la congelación, as la congelación sin c iop o ec o y
después del p oceso con di e en es concen aciones de
c iop o ec o . Como se puede obse a , sólo las pa ículas
congeladas con una p opo ción de ealosa:NPs de 1:1.5,
man ienen un amaño p ác icamen e igual al que p esen aban
an es de la congelación.
Figu a 16. His og amas de amaños pa a las NPs después de un p oceso de
congelación esuspendidas en di e en es medios.
Pa a es udia la in luencia de la adición de c iop o ec o a
las o mulaciones sob e el p oceso de lio ilización, se lle ó a cabo el
mismo es udio, ep esen ado en la igu a 17.

118
Figu a 17. In luencia de la adición de di e en es concen aciones de ealosa en
el amaño medio de las pa ículas as un p oceso de lio ilización.
En es e caso, y de o ma simila al es udio del e ec o de la
congelación, aquellas pa ículas lio ilizadas con una p opo ción de
ealosa:NPs 1:1.5 man u ie on un amaño muy simila al de las
pa ículas escas. El es o de o mulaciones exhibie on un
aumen o de amaño, con alo es al os de polidispe sión que se
aducen en un aumen o de la he e ogenidad de la mues a.
Tal y como se expone en el caso an e io , la igu a 18 ilus a
los esul ados del es udio a a és de los his og amas ob enidos
as el p oceso de lio ilización pa a odas las condiciones, y como se
ap ecia, el his og ama pe enecien e a las NPs lio ilizadas con una
p opo ción de ealosa:NPs de 1:1.5 coincide con el
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3500
PdI
Tamaño (nm)
Medio de suspensión
Tamaño PdI
119
co espondien e p e io a la lio ilización. Pa a ambos ensayos, el
es udio de la in luencia de c iop o ec o se midió con un Ze asize
ZS90 (Mal e n Ins umen s).
Figu a 18. His og amas de amaños pa a las NPs después de un p oceso de
lio ilización esuspendidas en di e en es medios.
Po an o, según los esul ados ob enidos, se es ablece que
la p opo ción óp ima de ealosa:NPs pa a man ene la in eg idad
mo ológica de las NPs es de1:1.5.
Es udio de libe ación in i o
Los p incipales mecanismos de libe ación de á macos
desde pa ículas polimé icas son: (a) e osión de la supe icie de la
ma iz polimé ica, (b) o u a de los enlaces en e monóme os y (c)
di usión del á maco encapsulado o en la supe icie de la pa ícula a
a és de po os o a a és de la ma iz polimé ica. Gene almen e,
cuando se a a de políme os hid ó obos, la libe ación es á
gobe nada p incipalmen e po la e osión, no obs an e, la
libe ación del á maco suele da se po una combinación de los es
mecanismos (Kamaly e al. 2016).
De acue do con F edenbe g e al. (F edenbe g e al. 2011),
nume osos ac o es como las in e acciones en e moléculas de
ac i o y á maco-políme o o la abso ción de agua, pueden in lui
120
en la elocidad de libe ación y el compo amien o ciné ico de los
á macos encapsulados en pa ículas polimé icas de PLGA.
Los pe iles de libe ación de VLX encapsulada en NPs (5,5%
de ca ga de á maco) polimé icas de PLGA es án ep esen ados en
la igu a 19.
Figu a 19. Pe iles de libe ación in i o pa a NPs no modi icadas y modi icadas
supe icialmen e (n=3: ba as de e o :DE).
T as 30 minu os, las NPs ca gadas con VLX mues an una
libe ación ma cada (sob e el 23%) a pH isiológico (pH 7.4) lo que
puede se a ibuido al ca ác e hid o ílico del ac i o. La libe ación
con inúa de o ma g adual has a las 48 h. Al inal del es udio, el
po cen aje de á maco libe ado es, supe io al 90%, mien as que
pa a las NPs uncionalizadas el % de á maco libe ado ue in e io
al 85% anscu idas las 48 h.
Tomando las NPs no uncionalizadas como e e encia, la
p esencia de ligandos en la supe icie de las pa ículas puede
conlle a un descenso en la asa de libe ación cuando se compa an
con pa ículas no modi icadas supe icialmen e (Zhu, Zhang, and Yu
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20
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100
00,5 24812 24 48
Libe ación de á maco (%)
Tiempo (h)
VLX+PLGA NPs VLX+T -PLGA NPs VLF+T Rp PLGA NPs
121
2017). Así, pa a cada iempo es ablecido, se obse a una
disminución de la libe ación, que puede es a asociada a la
p esencia de una “ba e a adicional” o mada po los ligandos de la
supe icie.
Es abilidad de las NPs en líquido ce alo aquídeo
Los sis emas nano anspo ado es de á macos de ipo
polimé ico son excelen es pla a o mas pa a la libe ación
con olada del ac i o. Dicha libe ación puede ex ende se ho as,
días o semanas (Be ocoso e al. 2017) en unción del ipo de
políme o empleado po ello, es de i al impo ancia es udia la
es abilidad de las pa ículas en los luidos biológicos a lo la go del
iempo.
En es e abajo, la es abilidad se e aluó en el luido de
mayo p esencia en el sis ema ne ioso cen al, el líquido
ce alo aquídeo du an e 24 h con el in de ga an iza amaños e
índices de polidispe sión simila es as el iempo de incubación
cuando las NPs sean empleadas pa a los ensayos in i o. El es udio
se lle ó a cabo a 37 ºC y, como se esume en la Fig. 20, odas las
o mulaciones es udiadas mos a on al a es abilidad con amaños e
índices de polidispe sión semejan es a los obse ados an es de las
24 h de incubación, demos ando que las pa ículas pueden
emplea se con ga an ía en aplicaciones in i o.
128
Con el in de con i ma el es udio isual y alo a de
mane a cuan i a i a la cap ación celula , se empleó la ci ome ía de
lujo.
Pa a ello, 1 mL de los di e en es ipos de NPs (50 µg/mL)
se incuba on du an e 30 minu os con las células hCMEC y las
células sin NPs ue on usadas como con ol nega i o. Como ilus a
la igu a 23, la in ensidad de luo escencia es mayo pa a las NPs
uncionalizadas ( igu as 23C-23D) en compa ación con las NPs sin
uncionaliza , sin emba go, en conco dancia con los es udios
cuali a i os, el alo más in enso de luo escencia se alcanzó as la
incubación con NPs modi icadas supe icialmen e con T Rp.
El aumen o de la cap ación celula in i o de NPs
uncionalizadas con di e en es ligandos como p o eínas, pép idos,
an icue pos, ap áme os o políme os ha sido p e iamen e
in o mado po o os in es igado es (Hu e al. 2011)(Huang e al.
2017)(Ca oll e al. 2010)(Tosi e al. 2007)(Monaco e al. 2017)(J.
Guo e al. 2011).

129
Figu a 23. His og amas ob enidos as el es udio cuan i a i o de la luo escencia
po ci ome ía de lujo en las células hCMEC/D3 as 30 minu os de incubación
con di e en es o mulaciones de NPs ca gadas con NR. (A) Con ol (células sin
NPs); (B) NPs de PLGA no modi icadas supe icialmen e; (C) NPs de PLGA
modi icadas con T ; (D) NPs de PLGA modi icadas con T Rp.
Po an o, como esumen de es a sección se puede conclui
que ambos es udios espaldan la hipó esis de que la
uncionalización con ligandos especí icos pa a ecep o es
localizados en el luga de acción puede con ibui a mejo a la
in e acción célula-nanopa ícula, p omo iendo así la cap ación
celula de las mismas po endoci osis mediada po ecep o .
Es udios de pe meabilidad a a és de un modelo de
ba e a in i o
La BHE es uno de los p incipales obs áculos que deben
supe a los ac i os a macéu icos pa a accede al SNC. Dicha
130
ba e a p o ege al ce eb o de la en ada de sus ancias pa ógenas
pe o, al mismo iempo limi a el ing eso de nume osos á macos.
Po an o, aunque la pe meabilidad a a és de la misma puede
e se a ec ada po nume osas en e medades como el in a o
ce eb al, la escle osis múl iple, epilepsia o umo es ce eb ales
(Weiss e al. 2009), la p esencia de la misma supone una di icul ad
pa a el a amien o de los as o nos neu ológicos.
Pa a e idencia la llegada de las NPs y á maco al ce eb o a
a és de la BHE, se desa olló un modelo de ba e a in i o de
ipo monocul i o empleando las mismas células endo eliales
empleadas pa a los ensayos de cap ación celula .
4.1.1.1 Modelo in i o de BHE
Pa a de e mina la in eg idad y la calidad de la BHE, se
midió la esis encia ansendo elial eléc ica (TEER) cada dos días,
du an e 8 días. Es e pa áme o es esencial pa a asegu a unas
ca ac e ís icas ap opiadas de ba e a y e i a alsos posi i os (S ab
e al. 2016).
131
Figu a 24. Valo es de TEER de las células hCMEC/D3 cul i adas en inse os
T answell de 0.4 µm pa a ambos expe imen os. (n=9) (ba as de e o :DE)
T as la cons ucción de la ba e a, el día del expe imen o (8º
día) los alo es de TEER oscila on en e 110-120 Ω*cm2. Dichos
alo es esul an adecuados ya que, de acue do con la li e a u a
publicada, es os alo es son su icien es pa a es udia la
pe meabilidad de los ac i os a macéu icos ya que, alo es de TEER
po encima de 150 Ω*cm2 no in e ie en en la pe meabilidad del
á maco, no se aduce necesa iamen e en una disminución de la
misma cuando se emplean modelos monocul i os (Wilhelm and
K izbai 2014).
Pasado el iempo de incubación (en medio de cul i o) de las
di e en es o mulaciones de NPs en el modelo de ba e a in i o, la
TEER se midió de nue o pa a e i ica que la ba e a se man iene
in ac a, mos ando la misma in eg idad y calidad que al inicio del
expe imen o.
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120
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160
0 2 4 6 8
TEER (Ω*cm2)
Tiempo (días)
Valo es de TEER pa a modelo de pe meabilidad de FITC-PLGA NPs
Valo es de TEER pa a modelo de pe meabilidad de VLX+PLGA NPs
132
Los alo es de TEER (p e- y pos -incubación) pa a ambos
expe imen os es án ep esen ados en la igu a 25.
Figu a 25. Valo es de TEER pa a ambos expe imen os de pe meabilidad (NPs y
á maco) an es y después de la incubación con las NPs.
Como puede dilucida se, a pa i de la igu a 25, la
in eg idad de la ba e a no se io a ec ada as el con ac o con las
di e en es o mulaciones de NPs, po lo que se de e mina que la
TEER se man iene du an e odo el expe imen o y los esul ados de
pe meabilidad son iables.
La p incipal en aja de los modelos endo eliales de ba e a
de ipo monocul i o es la simplicidad (Wilhelm and K izbai 2014),
sin emba go, pueden mos a alo es bajos de TEER debido a la
ausencia de pe ici os, as oci os y o os elemen os de la unidad
neu o ascula . Pa a sol en a lo, pueden emplea se modelos co-
cul i os pe o és os p esen an nume osas des en ajas ya que no
man ienen el ambien e neu onal de mane a pe manen e y
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140
Ensayo de pe meabiliad de NPs
de FITC-PLGA Ensayo de pe meabiliad de NPs
ca gadas con VLX
Valo es de TEER p e-incubación Valo es de TEER pos -incubación
133
mani ies an baja ep oducibilidad, son más cos oso y su
ca ac e ización es compleja (Kaisa e al. 2017). Po lo an o, los
modelos monocul i os esul an más adecuados y ú iles pa a
ealiza e aluaciones p elimina es de pe meabilidad de á macos a
a és de la BHE (Wol e al. 2015).
Inicialmen e, según el p ocedimien o desc i o en la sección
3.2.12.3.2 se midió la in ensidad de luo escencia y se calculó el
po cen aje de NPs en el lado basola e al (Figu a 26). Pa a ello, se
omó como e e encia de luo escencia o al la mos ada po la
misma concen ación de los di e en es ipos de pa ículas
luo escen es (3 mg/mL) añadida di ec amen e al lado basola e al.
Se asume que dicha concen ación supone el 100% de luo escencia
si odas las NPs a a esa an la ba e a. Los esul ados se p esen an
como po cen aje de pa ículas en unción del po cen aje de
luo escencia mos ado po la concen ación o al. La
pe meabilidad se e aluó as 1, 6, 8, 12 y 24 h.

134
Figu a 26. Po cen aje de NPs luo escen es ( uncionalizadas y no
uncionalizadas) en el lado basola e al despúes de los iempos p ede e minados.
Tal y como se obse a en el g á ico, las NPs uncionalizadas
con el T Rp mos a on una capacidad mayo pa a a a esa la BHE.
Tal y como se demos ó en los ensayos in i o de cap ación celula ,
las NPs uncionalizadas con T Rp ue on las que exhibie on la
mayo capacidad de cap ación, lo que pod ía explica es a mayo
habilidad pa a a a esa la ba e a. Pa a odas las o mulaciones, el
po cen aje de pa ículas luo escen es aumen ó a lo la go del
iempo en la pa e basola e al. A las 24 h, ap oximadamen e el 45%
de las NPs luo escen es uncionalizadas con T Rp a a esa on la
ba e a del modelo.
Se ealizó un análisis mul i ac o ial pa a e i ica el e ec o
sob e la pe meabilidad de las NPs de ambos ac o es, an o el ipo
de o mulación es ada como el iempo p e ijado pa a lee la
luo escencia. Los esul ados mues an un e ec o signi ica i o sob e
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5
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1 6 8 12 24
h
Tiempo (ho as)
FITC-PLGA NPs T -cFITC-PLGA NPs T Rp-cFITC-PLGA NPs
135
la pe meabilidad cuando se emplean di e en es o mulaciones, F (3,
75) = 186.549 y p <0.001 y di e en es iempos, F (4, 75) = 3838.531
y p <0.001. Así mismo, se obse ó una in e acción signi ica i a
en e ambos ac o es (F (8, 75) = 34.078), indicando que la
in luencia de la a iable iempo sob e la pe meabilidad es di e en e
pa a las di e en es o mulaciones ensayadas.
Pa a la e aluación de la pe meabilidad del á maco, el
mismo p o ocolo ue lle ado, aunque, en es e caso, el ensayo se
ex endió has a las 72 h con el in de e alua la posible inducción de
la glicop o eína-P po pa e del ac i o. T as la incubación con las
NPs ca gadas con VLX sin uncionaliza y uncionalizadas y VLX
lib e (añadida en la misma concen ación que la encapsulada en
NPs), alos iempos p e ijados (1, 6, 8, 12, 24, 48 y 72 h), se midió la
concen ación de á maco en el lado basola e al. Pa a ese in, se
empleó un mé odo doble de c oma og a ía líquida de al a p esión y
espec ome ía de masas (UHPLC-MS/MC), de allado en el apa ado
4.2.12.4.2.
El compo amien o obse ado en el ensayo de
pe meabilidad es simila al que se de e minó en el es udio de
libe ación. Aunque las pa ículas uncionalizadas con el pép ido
demos a on una mayo capacidad pa a alcanza la pa e
basola e al, mues an la libe ación más len a de á maco (Figu a
27). De acue do con Zhu e al. (Zhu, Zhang, and Yu 2017), las NPs
uncionalizadas mos a on una elocidad de libe ación más len a
compa adas con las que no uncionalizadas.
136
Figu a 27. Concen aciones de á maco en lado basola e al de di e en es
o mulaciones (VLX lib e, NPs ca gadas con VLX sin uncionaliza y
uncionalizadas con T o T Rp).
A las 8 y 12 h, la libe ación de á maco a pa i de las NPs
uncionalizadas es simila pa a ambas o mulaciones mien as que
la mayo di e encia se encuen a a las 24 h.
Bachmeie e al (Bachmeie e al. 2011), demos a on que a
de e minadas concen aciones (1 - 50 µM), la VLX es un induc o de
las bombas de e lujo como la glicop o eína-P. Un compo amien o
semejan e se demues a en es e es udio ya que, as alcanza se una
concen ación de á maco lib e supe io a 1 µM en el lado
basola e al (24 h), se obse a un descenso en la concen ación de
ac i o en dicho compa imen o (48 y 72 h). Dicho descenso puede
es a mo i ado po la acción de la glicop o eína-P, que, as se
inducida p o oca la salida del ac i o en sen ido basola e al-apical.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
1 6 8 12 24 48 72
H
Concen ación VLF encapsulada
en NPs (µM)
Tiempo (ho as)
VLF+PLGA NPs VLF+T -PLGA NPs
137
Sin emba go, cuando la VLX es á encapsulada en NPs, la
concen ación en el lado basola e al no alcanza concen aciones
que p o oquen la inducción de la glicop o eína-P y la concen ación
de VLX sigue aumen ando de mane a g adual con el iempo.
T as el iempo ensayo (24h pa a en ensayo de
pe meabilidad de las NPs y 72 h pa a el de la VLX), se comp obó
que los alo es de TEER pe manecie on en e 105-11 Ω·cm2, lo que
indica que la in eg idad de la ba e a se man u o y no se io
a ec ada po la p esencia de las pa ículas (ni á maco).
4.1.1.2 E aluación de la llegada de las NPs al sis ema
ne ioso cen al as adminis ación in a enosa
La BHE es una de las ba e as más es ic i as del
o ganismo di icul ando el acceso de nume osos ac i os
e apéu icos al SNC. T as los esul ados en los es udios p e ios in
i o de modelo de ba e a, aquellas pa ículas uncionalizadas con
el pép ido ue on las que mos a on una mayo capacidad pa a
a a esa la ba e a. Pa a con i ma es os esul ados, se diseñó un
ensayo in i o que con i ma a la llegada de las pa ículas
uncionalizadas al ce eb o as una adminis ación in a enosa.
Pa a ello, se adminis a on nanopa ículas de FITC-PLGA no
uncionalizadas y uncionalizadas con T y T Rp en a ones C57bl/6
(12-15 semanas de ida) ía in a enosa en la ena de la cola a una
concen ación de 65 o 130 mg/kg de NPs (equi alen es a 9 y 18
mg/kg de VLX, espec i amen e) en una adminis ación aguda y 65
mg/kg de NPs (9 mg VLX) y as se pe undidos ( e apa ado
4.2.13.1), las secciones de ce eb o y bazo se c iba on usando un