Nanopartículas poliméricas para vehiculizar activos farmacéuticos al sistema nervioso central.

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TESIS DOCTORAL NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS PARA VEHICULIZAR ACTIVOS FARMACÉUTICOS AL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL Memo ia p esen ada po la licenciada Mª DOLORES CAYERO OTERO pa a op a el Tí ulo de Doc o po la Uni e sidad de Se illa. Se illa, sep iemb e 2018 Memo ia p esen ada po Mª Dolo es Caye o O e o pa a op a al Tí ulo de Doc o po la Uni e sidad de Se illa Fdo.: Mª Dolo es Caye o O e o VºBº Las Di ec o as del T abajo Fdo.: D a Me cedes Fe nández A é alo Fdo.: Lucía Ma ín Bande as FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FARMACIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA C/ P o eso Ga cía González, 2 41012 Se illa (España) Telé ono: 954 55 67 26 Fax: 954 55 60 85 E-mail: [email p o ec ed] h p://depa amen o.us.es/ ecno a ma/ C/ P o eso Ga cía González, 2 41012 Se illa (España) Telé ono: 954 55 67 26 Fax: 954 55 60 85 E-mail: [email protected] h p://depa amen o.us.es/ ecno a ma/ Índice de con enidos RESUMEN……………………………………………………………………………………………2 1 INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 5 NANOMEDICINA Y NANOTECNOLOGÍA ................................................ 5 1.1.1 NPs como ehículos de á macos .................................................... 7 1.1.2 Políme os empleados ........................................................................... 8 BARRERA HEMATOENEFÁLICA (BHE) .................................................. 9 1.2.1 Mo ología y unciones de la BHE ................................................ 10 1.2.2 Sis emas de anspo e a a és de la BHE ............................... 16 ESTRATEGIAS PARA EL DIRECCIONAMIENTO DE ACTIVOS HACIA EL SNC…………………………………………………………………...……………21 1.3.1 Mé odos in asi os .............................................................................. 22 1.3.2 Mé odos no in asi os ........................................................................ 26 1.3.3 Funcionalización supe icial de las NPs..................................... 31 1.3.4 Nose- o-b ain ........................................................................................ 48 VENLAFAXINA (VLX) COMO FÁRMACO MODELO .......................... 56 2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 59 3 HIPÓTESIS ................................................................................................................. 61 4 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 63 MATERIALES .................................................................................................. 63 MÉTODOS ........................................................................................................ 66 4.2.1 P epa ación de las NPs ..................................................................... 66 4.2.2 Modi icación supe icial de las NPs de PLGA........................... 70 4.2.3 P epa ación de NPS luo escen es pa a es udios in i o de cap ación celula ..................................................................................................... 72 4.2.4 P epa ación de las NPs luo escen es pa a es udios de pe meabilidad ......................................................................................................... 73 4.2.5 P epa ación de NPs luo escen es con FITC encapsulado pa a es udios de biodis ibución ..................................................................... 74 4.2.6 Es udios de ca ac e ización isicoquímica de las NPs ......... 75 4.2.7 De e minación de la e iciencia de encapsulación y ca ga de á maco………………………....………………………………………………………..….77 4.2.8 De e minación de la e icacia de uncionalización ................. 79 4.2.9 Es udio de la in luencia de la congelación en las NPs. Op imización de las condiciones de lio ilización. ...................................... 80 4.2.10 Es udios de libe ación in i o ....................................................... 82 4.2.11 Es abilidad de las o mulaciones de NPs en líquido ce alo aquídeo (LCR) a i icial ....................................................................... 83 4.2.12 Es udios celula es in i o ............................................................... 84 4.2.13 Es udios in i o en animales de expe imen ación ................. 95 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 100 Es udios de ca ac e ización de las NPs p epa adas .................... 100 5.1.1 De e minación del amaño medio y dis ibución de amaños……. ........................................................................................................... 100 5.1.2 De e minación de la ca ga eléc ica supe icial de las NPs 105 5.1.3 Es udio de la mo ología ............................................................... 110 5.1.4 De e minación del con enido en á maco (VLX) ................ 110 5.1.5 Análisis de la e icacia de uncionalización ............................. 112 5.1.6 Es udio de la in luencia de la congelación en las NPs. Op imización de las condiciones de lio ilización.................................... 114 5.1.7 Es udio de libe ación in i o ...................................................... 119 5.1.8 Es abilidad de las NPs en líquido ce alo aquídeo ............ 121 5.1.9 Es udios in i o de oxicidad celula ...................................... 122 5.1.10 Es udios in i o de in e nalización celula ........................... 124 5.1.11 Es udios de pe meabilidad a a és de un modelo de ba e a in i o….. ................................................................................................ 129 6 CONCLUSIONS ...................................................................................................... 148 7 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 152 ÍNDICE DE FIGURAS Figu a 1 Esquema de la BHE 11 Figu a 2 Rep esen ación esquemá ica de allada de las p o eínas que componen las uniones es echas y adhe en es 12 Figu a 3 Esquema del ecep o de ans e ina 18 Figu a 4 P incipales sis emas de anspo e a a és de la BHE 21 Figu a 5 Esquema del mecanismo de acción de los p o á macos a a és de la BHE. 27 Figu a 6 Rep esen ación esquemá ica de las u as de acceso al sis ema ne ioso cen al po ía in anasal (Nose- o-b ain) 51 Figu a 7 P incipales e apas del mé odo de e apo ación del disol en e de una emulsión. 67 Figu a 8 Esquema de las eacciones que comp enden la uncionalización de NPs a a és del mé odo ca bodiimida. 71 Figu a 9 P incipales es uc u as de modelos celula es de ba e a. (A) Modelo monocu i o; (B-C) Modelos cocul i o con con ac o; (D-E) Moelos cocul i o sin con ac o y (F-G) Modelos de cocul i o iple. 91 Figu a 10 Rep esen ación esquemá ica del modelo in i o de BHE empleado en los ensayos de pe meabilidad ( ipo monocapa). 92 Figu a 11 His og amas de los amaños de las o mulaciones de NPs blancas, uncionalizadas y sin uncionaliza . 102 Figu a 12 His og amas de los amaños de las o mulaciones de NPs ca gadas con á maco, uncionalizadas y sin uncionaliza . 102 Figu a 13 Valo es de po encial ze a de NPs de PLGA blancas y ca gadas con á maco ob enidos pa a las NPs ecién p epa adas, as un p ime la ado po ul acen i ugación y as un segundo la ado. 108 Figu a 14 Valo es de e icacia de encapsulación (EE%) y ca ga de á maco ob enidos pa a pa ículas p epa adas con di e en e concen ación inicial de á maco. 112 Figu a 15 E ec o de la adición de di e en es concen aciones de ealosa en el amaño y dispe sión de las pa ículas as un p oceso de congelación. 116 Figu a 16 His og amas de amaños pa a las NPs después de un p oceso de congelación esuspendidas en di e en es medios. 117 Figu a 17 In luencia de la adición de di e en es concen aciones de ealosa en el amaño y dispe sión de las pa ículas as un p oceso de li ilización. 118 Figu a 18 His og amas de amaños pa a las NPs después de un p oceso de lio ilización esuspendidas en di e en es medios. 119 Figu a 19 Pe iles de libe ación in i o pa a NPs no modi icadas y modi icadas supe icialmen e. 120 Figu a 20 Tamaño y PdI de las pa ículas an es y después de la incubación en LCR du an e 24 h. 122 Figu a 21 Viabilidad celula en células hCMEC/D3 as la incubación con NPs de PLGA sin modi ica y modi icadas supe icialmen e, blancas y ca gadas con VLX, a di e en es concen aciones du an e 24 h. 124 Figu a 22 Es udio cuali a i o de cap ación celula . Imágenes ob enidas po mic oscopía con ocal de células hCMEC/D3 después de 30 minu os de incubación con di e en es o mulaciones de NPs de PLGA ca gadas con NR a 37 ºC. (A) NPs no modi icadas supe icialmen e; (B) NPs modi icadas con T ; (C) NPs modi icadas con T Rp 127 Figu a 23 His og amas ob enidos as el es udio cuan i a i o de la luo escencia po ci ome ía de lujo en las células hCMEC/D3 as 30 minu os de incubación con di e en es o mulaciones de NPs ca gadas con NR. (A) Con ol (células sin NPs); (B) NPs de PLGA no modi icadas supe icialmen e; (C) NPs de PLGA modi icadas con T ; (D) NPs de PLGA modi icadas con T Rp. 129 Figu a 24 Valo es de TEER de las células hCMEC/D3 cul i adas en inse os T answell de 0.4 µm pa a ambos expe imen os. 131 Figu a 25 Valo es de TEER pa a ambos expe imen os de pe meabilidad (NPs y á maco) an es y después de la incubación con las NPs 132 Figu a 26 Po cen aje de NPs luo escen es ( uncionalizadas y no uncionalizadas) en el lado basola e al después de los iempos p ede e minados 134 Figu a 27 Concen aciones de á maco en el lado basola e al de di e en es o mulaciones (VLX lib e, NPs ca gadas con VLX sin uncionaliza y uncionalizadas con T o T Rp) 136 Figu a 28 Imágenes de mic oscopía con ocal de secciones de ce eb o en a ones con ol (A) y as 24 h de una adminis ación aguda (130mg/kg) de NPs luo escen es no uncionalizadas (B), uncionalizadas con T (C) y uncionalizadas con T Rp (D). 139 ans e ina PBS Tampón os a o salino PCL Poli-ε-cap olac onas PDGFRβ Fac o de c ecimien o de i ado de plaque as PEG Polie ilenglicol Pép ido Aβ Pép ido β-amieloide PFA Pa a o maldehído PLA Ácido polilác ico PLGA Ácido poli-(D,L-lác ico-co-glicólico) PLGA-PEG Ácido poli-(D,L-lác ico-co-glicólico) con cadenas de polie ilenglicol PVA Alcohol poli inílico RG2 Células de glioma de a a RMP-7 Agonis a de la b adicinina S1 Pép ido co o inhibido de las placas β-amieloide SH-SY5Y Línea celula de neu oblas oma SNC Sis ema ne ioso cen al SRE Sis ema e iculoendo elial Tc-99m Tecnecio 99 me aes able TEER Resis encia eléc ica ansendo elial T T ans e ina T Rp Pép ido especí ico del ecep o de ans e ina TGN Pép ido de 12 aminoácidos pa a di eccionamien o ce eb al U-87 MG Línea cellula humana de glioblas oma UHPLC- MS/MC C oma og a ía líquida de ul a-al a esolución acoplada a espec ome ía de masas VLX Venla axina 1 ABSTRACT 2 Cu en ly, nano echnology has become in an eme gen science. I o e s he possibili y o de elopmen o no el p oduc s and nume ous applica ions o se e al ields like alimen a y, cosme ic o enginee indus y. In his sense, nanomedicine is an inno a i e al e na i e ocused in he imp o emen o adi ional he apies, a use ul ool o sol e nume ous pha macokine ics and pha macodynamics d awbacks o con en ional ea men s and i can be able o con ol he physicochemical and biopha maceu ical beha io . Speci ically, polyme ic nanopa icles (NPs) a e widely used as d ug anspo sys em in a nanome ic scale and p esen a ious ad an ages compa ed o adi ional pha maceu ical o ms. On he o he hand, he ea men o di e en diseases which a ec o he b ain esul s e y di icul due o he p esence o blood-b ain ba ie (BBB). This ba ie es ic he passage o oxic subs ances and i us which can be ha m ul o ne ous sys em (CNS) bu , un o una ely, i also impede ha d ugs and he apeu ic ac i es can c oss i , p e en ing an e ec i e ea men o neu onal diso de s. Speci ically, dep ession is a majo in e na ional heal h p oblem; a ec ing millions o people wo ldwide. Ac ually, no d ugs p o ide he apeu ic bene i o app oxima ely one hi d o dep essed pa ien s. Wi h dep ession p edic ed o become he numbe one global disease bu den by 2030, i is impe a i e ha new he apeu ic in e en ions a e es ablished. In he p esen wo k we used enla axine as an idep essan d ug model. The e o e, he main objec i e o his doc o al hesis has been he de elopmen o biodeg adable and biocompa ible polyme ic sys em in a nanome ic ange o imp o e he d ug 3 deli e y in CNS which is limi ed by he p esence o BBB using a dual ac ion an idep essan as model d ug. Fi s ly, we de eloped a VLX loaded-polyme ic nanosys em based on poly(lac ic-co-glycolic acid)(PLGA), a US Food & D ug Adminis a ion (US FDA)-app o ed biocompa ible and biodeg adable polyme . Pa icles we e su ace unc ionalized wi h wo di e en ligands agains ans e in ecep o : ans e in (T ) and speci ic cell-pene a ing pep ide o his ecep o (T Rp). Pa icles we e p epa ed using a double emulsion-sol en e apo a ion me hod and unc ionalized employing ca bodiimide s a egy. Plain and unc ionalized NPs we e e alua ed and cha ac e ized o pa icle size and size dis ibu ion, ze a po en ial and mo phology. Encapsula ion e iciency was calcula ed by a alida ed HPLC me hod and conjuga ion e iciency was es ima ed using a BCA ki . In o de o de e mine he elease p o ile, an in i o d ug deli e y assay was pe o med and he s abili y o NPs was analyzed a e incuba ion in a i icial ce eb ospinal luid and a e eezing and lyophiliza ion p ocess. Fo in i o cy o oxici y s udy, a colo ime ic assay was ca ied ou in o de o quan i y he cell iabili y a e incuba ion wi h NPs. Cell up ake o polyme ic pa icles was e alua ed by quali a i e and quan i a i e s udies. Fo quan i a i e analysis, con ocal lase scanning mic oscopy was used and quali a i e de e mina ion was achie ed by low cy ome y. To isualize NPs, a 4 luo opho e loaded-pa icles (Nile-Red) we e employed as a ma ke and he nuclei was s ained wi h Hoechs ® 33342. Fo he s udy o pe meabili y ac oss he BBB, an in i o model was de eloped, employing FITC-PLGA NPs o his pu pose. D ug pe meabili y was e alua ed by ul a-high-p essu e liquid ch oma og aphy/ andem mass spec ome y (UHPLC-MS/MS) and NPs pe meabili y was es ima ed measu ing he luo escence in basola e al side. Fo all cell s udies, immo alized human ce eb al mic o ascula endo helial cell line (hCMEC/D3) was used. Rega ding in i o s udies, he abili y o NPs o c oss he BBB was e alua ed. Fo his, C57/bl6 mice we e adminis e ed in a enously du ing 7 days o ch onic adminis a ion and wi h wo di e en pa icle concen a ions o single-dose. B ain and spleen we e collec ed in o de o quan i y he luo escence by con ocal mic oscopy and low cy ome y. In i o biodis ibu ion s udies we e pe o med using C57/bl6 mice. Fo his, luo escen NPs wi h encapsula ed-FITC as luo opho e we e adminis e ed in anasally using nose- o-b ain p ahway and, a e 30 minu es, spleen, b ain, hea , lungs, li e and kidneys we e collec ed and analyzed by low cy ome y. The pe cen age o pa icles de ec ed was exp essed as he a io o he luo escence uni o each issue ela i e o he sum o luo escence uni s o all he issue analyzed and luo escence o each o gan om ea men g oup was compa ed o luo escence o con ol g oup. 5 1 INTRODUCCIÓN NANOMEDICINA Y NANOTECNOLOGÍA En la ac ualidad, la ocalización del campo a macéu ico se cen a en la pe sonalización de los a amien os según pacien e y pa ología, así como en el desa ollo de nue os sis emas de adminis ación de á macos, capaci ados pa a con ola los compo amien os isicoquímico y bio a macéu ico, Lo que pa ece e iden e es que, sal o pa a cie as si uaciones, ac ualmen e esul a insu icien e el descub imien o y desa ollo de nue as moléculas con una de e minada ac i idad a macológica pa a p opo ciona una mejo a en las e apias si no an acompañadas de sis emas de adminis ación más e icaces. La azón del acaso en la e apéu ica ac ual puede debe se a nume osas causas de ca ác e ísico- químico y biológico que se aducen en baja o inco ec a biodisponibilidad, mo i ada po una abso ción y/o solubilidad limi ada del á maco, ápido me abolismo y co a du ación del e ec o a macológico, p esencia de e ec os secunda ios no deseados y llegada de ac i os a localizaciones no deseadas del o ganismo, en e o as. En es e sen ido, la nano ecnología, desc i a gene almen e como el es udio de ma e iales y enómenos ísicos, químicos, bio ísicos y bioquímicos en la escala nanomé ica (Sweeney 2015) juega un papel des acado, p opo cionando nue as al e na i as pa a ehiculiza ac i os a macéu icos, p oduc os de in e és alimen a io o cosmé icos, po pone algunos ejemplos. Aunque los angos de amaño pa a la de inición siguen siendo, a día de hoy, obje o de 6 deba e y la legislación que lo egula muy escasa (B egoli e al. 2016), la nanociencia y sus aplicaciones cons i uyen sin duda una in e esan e pla a o ma pa a el con ol y la manipulación de los ma e iales a nanoescala (Fa ehi e al. 2012), al posibili a el desa ollo de sis emas de adminis ación más e icien es compa ados con la a maco e apéu ica adicional. Además, la nano ecnología a macéu ica ambién o ece bene icios impo an es en o as á eas como pueden se el empleo de imágenes pa a diagnós ico, la alo ación de la e icacia de un a amien o en iempo eal o la aplicación en odon ología (Deme zos and Pippa 2014), po pone sólo algunos ejemplos. La nanomedicina, de inida po Eu opean Technology Pla o m o Nanomedicine (ETPN) como “la aplicación de la nano ecnología pa a log a a ances en el cuidado de la salud que explo a las p opiedades ísicas, químicas y biológicas de los ma e iales a escala nanomé ica” (Fo nague a and José Ga cía- Celma, 2017), se ha con e ido en los úl imos años en una ciencia eme gen e que pe mi e ab ica , ca ac e iza y modi ica de o ma con olada las p opiedades de los ma e iales nanomé icos con ines diagnós icos y biomédicos (Mi za and Siddiqui 2014). Po an o, aunque el concep o no posee una de inición o icial, la ETPN y la Food and D ugs Adminis a ion (FDA) acep an que la nanomedicina engloba cinco p incipales disciplinas: (a) he amien as analí icas; (b) he amien as de imágenes; (c) nanoma e iales y nanodisposi i os; (d) nue os sis emas e apéu icos de adminis ación de á macos; y (e) odas aquellas implicaciones sob e su egulación y segu idad (Webs e 2006). 7 En la ac ualidad, nume osos ac i os a macéu icos in eg ados en nanosis emas, ap obados po la FDA y la Agencia Eu opea del Medicamen o (EMA), ya es án disponibles pa a su adminis ación en humanos. Caelyx®, Mepac ® y Myoce ®, ehiculizados en liposomas o Ab axane®, Rapamune® y Sine em®, come cializados en nanopa ículas (NPs)(Eu opean Medicines Agency 2014), son algunos ejemplos de nanomedicinas, desa ollados pa a el a amien o del cánce , el echazo de ó ganos en pacien es asplan ados o el diagnós ico de umo es. NPs como ehículos de á macos El po encial de es os nue os sis emas de adminis ación es eno me; en e ellos caben des aca liposomas, NPs (ino gánicas, polimé icas, lipídicas, me álicas), nanoc is ales, nano ubos de ca bono o dend íme os (Caban e al. 2014). Conc e amen e, las NPs polimé icas se han con e ido en obje o de in es igación debido a su g an capacidad pa a anspo a y libe a , de mane a sos enida, una ex ensa a iedad de á macos has a nume osas egiones del o ganismo (Ba i e al. 2015). Las NPs polimé icas pueden se adminis adas po nume osas u as, y, debido a su amaño, pueden alcanza las á eas más pequeñas del o ganismo (Kashi e al. 2012b), mejo a las p opiedades a macociné icas del compues o y su solubilidad, aumen a su ida media y educi los e ec os ad e sos, libe ándose únicamen e en los ejidos diana y minimizando la oxicidad en el es o de ó ganos (Mahajan e al. 2012), po comen a sólo algunas posibilidades, lo que se aduce en un aumen o de la e icacia 8 e apéu ica (Ce in e al. 2013)(Sa ai a e al. 2016). Po esal a alguna de las posibilidades, juegan un papel undamen al en la libe ación de á macos en el ce eb o y pueden emplea se como una he amien a ú il pa a mejo a la e icacia de los a amien os con encionales y el diagnós ico de las en e medades que a ec an al Sis ema Ne ioso Cen al (SNC) (Zhang e al., 2016), hecho muy limi ado, p incipalmen e, po la p esencia de la ba e a hema oence álica (BHE). Políme os empleados Ac ualmen e hay disponible una amplia de gama de políme os, ales como qui osano, gela inas, ácido polilác ico (PLA), copolíme os de lác ico y glicólico (PLGA) o poli-ε-cap olac onas (PCL), pa a su uso en la p epa ación de NPs polimé icas, mos ando una excelen e compa ibilidad an o con células como con ejidos humanos (Campos, Ben ley, and To chilin 2016)(Kashi e al. 2012a). Uno de los políme os más empleados es el PLGA, un copolíme o de los ácidos lác ico y glicólico, me abolizado ácilmen e po el o ganismo ía ciclo de K ebs (Gailla d, Visse , and de Boe 2005), que se p esen a en el me cado con di e en es p opo ciones de cada ácido y dis in os pesos molecula es, lo que le o o ga capacidad pa a eje ce con ol sob e la libe ación del ac i o, pudiendo aba ca desde días, semanas o incluso meses (Danhie e al. 2012a)(Be ocoso e al. 2017). Globalmen e, la deg adación del PLGA depende de su peso molecula y de la elación en e los dos ácidos que lo o man (Danhie e al. 2012b). Los copolíme os 9 o mados po políme os amo os, más hid ó ilos y de bajo peso molecula que posean mayo can idad de glicólico exhiben un iempo de deg adación más co o pues o que el ácido glicólico posee mayo g ado de hid o ilia que el ácido lác ico. Luego, los políme os hid ó obos con un mayo con enido de ácido lác ico abso ben menos agua y po consiguien e, mues an un iempo de deg adación más p olongado (Dina and e al. 2011). Aunque una de las ca ac e ís icas más en ajosas de es e políme o es su deg adación en agua, ambién posee nume osas p opiedades de in e és a macéu ico des acando (i) biocompa ibilidad y biodeg adabilidad, (ii) es á ap obado como ehículo de á macos po la FDA y la EMA, (iii) pe mi e una libe ación con olada (i ) es ácilmen e modi icable, según sus g upos e minales, pa a log a mayo e ec i idad lo que posibili a su llegada a ó ganos o células diana ( ) p o ege al ac i o en e a deg adaciones ex e nas e in e nas y ( i) pe mi e encapsula á macos de di e sa na u aleza (hid ó obos e hid ó ilos) (Mi , Ahmed, and Rehman 2017). BARRERA HEMATOENEFÁLICA (BHE) Las en e medades o as o nos del SNC suponen un p oblema de salud a ni el mundial debido al aumen o de en ejecimien o en la población y la al a de a amien os e ec i os pa a las mismas. Pa a el año 2020, la ci a de pe sonas a ec adas po as o nos neu ológicos pod ía onda los 2 billones en odo el mundo (B asnje ic e al. 2009). 16 incapaces de a a esa la y sólo al ededo de un 2% de las pequeñas moléculas se ían capaces de alcanza el ce eb o (M. M. Pa el e al. 2009). Dicha ba e a o ece un anspo e muy pob e de moléculas solubles en agua (T Yoshikawa and Pa d idge 1992) y, de mane a excepcional, únicamen e moléculas pequeñas (<500 Da) y con un ma cado ca ác e hid ó obo pod ían a a esa la (Blasi e al. 2007). An e es a si uación, como se ha indicado con an e io idad, es impo an e des aca que las NPs polimé icas se p esen an como un mecanismo e icien e pa a la adminis ación de agen es e apéu icos y de diagnós ico (incluyendo moléculas de g an amaño) a ni el ce eb al cuyas p opiedades supe iciales desempeñan una a ea undamen al en es e p opósi o (K eu e 2014). Po sue e, las células capila es del endo elio ce eb al mues an nume osos mecanismos de anspo e mediados po ecep o es, exis iendo di e sas u as de paso a a és de la BHE. En base a ello, se han desa ollado múl iples es a egias pa a pode a a esa la. A con inuación, se desc ibe b e emen e los mecanismos de anspo e a a és de la BHE y las p incipales es a egias desa olladas pa a e i a la. Sis emas de anspo e a a és de la BHE En e las ías de acceso al ce eb o cabe dis ingui en e mecanismos pasi os (di usión pa acelula y anscelula ) o ac i os 17 (endoci osis mediada po ecep o es, anspo ado es o células y ansci osis po adso ción) en unción de los eque imien os de ene gía. Como sis ema de anspo e, se incluyen ambién las bombas de e lujo (ci adas en el apa ado an e io )( e igu a 3). La di usión pasi a es un p oceso insa u able y posee la mayo asa de anspo e, seguido de la endoci osis adso i a que, aunque sí es un mecanismo sa u able, se necesi an concen aciones es eces más al as que pa a los p ocesos mediados po ecep o (Olle -Sal ia e al. 2016). Di usión pasi a Den o de es e ipo de anspo e se puede dis ingui en e dos o mas di e en es pa a a a esa la BHE dependiendo de la na u aleza de la sus ancia. En la ía pa acelula , pequeñas moléculas hid ó ilas acceden a a és de las uniones es echas mien as que las sus ancias de ca ác e hid ó obo pueden ing esa a las células endo eliales a a és de la memb ana de las mismas, es deci , ía anscelula (B asnje ic e al. 2009). Dicho paso es á in luenciado po di e en es ac o es como pueden se la ca ac e ís icas isicoquímicas y es uc u ales de la molécula ( amaño, ca ga, núme o de enlaces de hid ógeno y g ado de lipo ilia)(Dong 2018). Endoci osis mediada po ecep o La endoci osis mediada po ecep o es un ipo de anspo e al amen e especí ico (Bhaska e al. 2010). Requie e un 18 apo e de ene gía (dependien e de ATP)(Bickel, Yoshikawa, and Pa d idge 2001) y su mecanismo implica la unión del ligando especí ico a los ecep o es p esen es en la memb ana apical de la ba e a (Fulls one e al. 2016). La BHE exp esa de mane a isiológica nume osos ecep o es como el ecep o de lipop o eína, insulina o ans e ina (T ), en e o os (Pa asha and Nema 2012). De mane a des acada, el ecep o de T es á o mado po dos monóme os glicop o éicos (760 aminoácidos cada uno) de unos 90 kDa unidos po puen es disul u o y es dominios p incipales (p o easa, helicoidal y apical) dispues os en o ma de ma iposa (Macedo and Sousa 2008) (Figu a 3). Cada subunidad se une a una molécula de T en un p oceso e e sible y dependien e de pH (Moos and Mo gan 2000). Figu a 3. Esquema del ecep o de T (Law ence e al. 1999). Se enca ga de man ene la homeos asis del hie o, p opo cionándoselo a las células a a és de la unión especí ica con 19 la T , egulando la can idad del oligoelemen o en unción de las necesidades me abólicas celula es (H. Li and Ming Qian 2002). Un nue o ecep o de T , conocido como ecep o de T II, ha sido in es igado y se c ee que iene un papel en la homeos asis del hie o, aunque su unción no se conoce con exac i ud (Calzola i e al. 2010). La di e encia p incipal con el ecep o de T I eside en su localización. Mien as que el I es á p esen e p ác icamen e en odas las células, el II se encuen a p imo dialmen e en hígado y e i oci os aunque, en meno medida, puede halla se en o as células del o ganismo. Sin emba go, exis en a ias simili udes en e ellos ya que ambos se sob eexp esan en células umo ales y sus dominios ex acelula es son semejan es (Vo h e al. 2015). T ansci osis po adso ción Es e ipo de mecanismo anspo ado no especí ico que depende de in e acciones elec os á icas, la endoci osis se desencadena po la unión en e moléculas con ca ga posi i a las pa es aniónicas de la memb ana apical de las células endo eliales (conc e amen e con el glucocáliz) (Pehli an, 2013) ya que, a pH isiológico, an o la memb ana apical como la basola e al exhiben una ca ga nega i a (He é, Ghinea, and Sche mann 2008). El p oceso de endoci osis sigue pasos simila es a los p oducidos cuando in e iene un ecep o , la di e encia adica en la a inidad y la capacidad de cada ipo. El mecanismo mediado po ecep o , aunque con mayo a inidad o ece menos capacidad de 20 anspo e ya que es sa u able a concen aciones más bajas (Yan Chen and Liu 2012). T ansci osis mediada po anspo ado El apo e de nu ien es como glucosa o aminoácidos necesa ios pa a el buen uncionamien o de la BHE se ealiza a a és de p o eínas de anspo e exp esadas en su supe icie ( an o apical como basola e al). El ejemplo más conocido es el anspo ado de glucosa (GLUT1)(Sanchez-Co a ubias e al. 2014). Pa a que los á macos puedan accede al ce eb o a a és de es e sis ema, deben ene un amaño pequeño y posee una es uc u a análoga a la de los nu ien es que anspo an lo que limi a su explo ación (Béduneau, Saulnie , and Benoi 2007). Endoci osis mediada po células La mo ilidad de las células inmuni a ias les pe mi e iaja con acilidad desde el o en e sanguíneo has a ocos in lama o ios, sín oma común pa a la mayo ía de nume osos as o nos neu odegene a i os (M. M. Pa el and Pa el 2017). Las células enca gadas de es e ipo de anspo e son células especí icas del sis ema inmuni a io como mac ó agos, neu ó ilos, lin oci os y monoci os que, condicionados po la p esencia de in lamación, lle an a cabo el paso a a és de la capa endo elial po dos p ocesos llamados quimio axis y diapédesis (E. V. Ba ako a and Kabano 2013). 21 Aunque puede p esen a se como un mé odo exi oso pa a la libe ación de á macos en luga es de in lamación, su empleo se e educido po los incon enien es que p esen a ya que: (a) las células pueden anspo a una can idad de á maco baja, (b) los inmunoci os no ienen buena capacidad de libe a las moléculas e apéu icas que, además, debe se de mane a con olada una ez alcanzado el luga de acción, (c) la can idad de células que mig an a la zona in lama o ia no es ele ada y (d) las o mulaciones no pueden se óxicas ni pe judiciales pa a el po ado celula (E. V Ba ako a, Gendelman, and Kabano 2011). Figu a 4. P incipales sis emas de anspo e a a és de la BHE ESTRATEGIAS PARA EL DIRECCIONAMIENTO DE ACTIVOS HACIA EL SNC Po odas las azones mencionadas con an e io idad, la llegada de á macos al SNC es á muy limi ada ac ualmen e pe o, a o unadamen e, se es án desa ollando nume osas es a egias pa a a a esa la. Es as es a egias pod ían di idi se en dos g andes g upos: mé odos in asi os y no in asi os. 22 Adicionalmen e, exis e una u a al e na i a pa a la llegada de á macos al ce eb o denominada nose- o-b ain as una adminis ación ía in anasal. En los siguien es apa ados se desc ibe b e emen e cada una de ellas. Mé odos in asi os En las écnicas in asi as el agen e e apéu ico ing esa al SNC po una ape u a p o ocada en la BHE, o es adminis ado di ec amen e en el ce eb o. Los p ocedimien os in asi os poseen no ables des en ajas, ya que son ela i amen e cos osos y pelig osos equi iéndose la hospi alización del pacien e, anes esia y/o ci ugía, y además se posibili a el que pueden accede al ce eb o sus ancias no deseables pe judiciales pa a el ambien e ce eb al (Soddu e al. 2015). Den o de es a clasi icación se incluyen la dis upción de la ba e a, la en ada po con ección o la inyección di ec a en el SNC. Dis upción de la BHE La inalidad es ab i las uniones es echas que se encuen an sellando las células endo eliales que o mas la ba e a. La ape u a debe se e e sible, p o isional y momen ánea y con olada en ex ensión pa a e i a posibles e ec os no deseados (Ma in-Bande as e al. 2011). Exis en nume osas écnicas pa a log a lo: 23 1. Dis upción osmó ica: la dis upción hipe osmó ica se comenzó a explo a en los años 70 cuando Rapopo e al. obse a on que las soluciones hipe osmó icas aplicadas en el có ex ce eb al de conejo pe mi ían el paso del colo an e azul E ans al in e io del ce eb o (Rapopo and Ho i, 1972). T as una adminis ación in a enosa de la solución hipe osmó ica, el p oceso de ape u a po hipe ósmosis se desencadenaba po la salida del agua de las células endo eliales hacia la sang e, p o ocando la c enación de las mismas. Seguidamen e, el aumen o de agua en los asos sanguíneos p oduce asodila ación y, inalmen e, el ci oesquele o celula se con ae conduciendo a una expansión de las uniones es echas (Rapopo and Robinson, 1986)(Cha an and D ’souza, 2010). Es e p ocedimien o mani ies a cla as mejo as en la e apia neu ooncológica, aumen ando los ni eles de los á macos quimio e ápicos en el SNC as una adminis ación in a enosa, sin emba go, las concen aciones pueden alcanza ni eles óxicos (Dooli le e al. 2000). Uno de los agen es hipe osmó icos más usados es el mani ol, aunque ambién se han empleado o os como la u ea y la a abinosa. Las limi aciones en el uso de mani ol esiden en los e ec os secunda ios que p esen a, ya que puede p o oca con ulsiones, in ecciones, en ada de oxinas al ce eb o o el paso de p o eínas plasmá icas (Ma in-Bande as e al. 2011). 2. Dis upción bioquímica: se basa en la adminis ación in a e ial de sus ancias asoac i as que p o ocan una eacción in lama o ia en las células endo eliales. En e las sus ancias 24 asoac i as más conocidas se encuen an la b adiquinina jun o con su análogo RMP-7 y la his amina. La b adiquinina es un nonapép ido que aumen a la pe meabilidad de las uniones es echas as una ac i ación del ecep o B2, p esen e en las células endo eliales (Ding-Zhou e al. 2003). T as la ac i ación, se desencadenan una se ie de p ocesos que desembocan en un aumen o de óxido ní ico, que p oduce asodila ación. La adenosina es o a sus ancia asoac i a que ac úa sob e los ecep o es de adenosina 2A que se encuen an en las células endo eliales. Pe enecen a la amilia de los ecep o es acoplados a p o eína G y su ac i ación conlle a un aumen o de la pe meabilidad de la BHE po la ape u a de las uniones es echas (M. M. Pa el and Pa el 2017). Po úl imo, los alquilglice oles han su gido como una al e na i a no óxica pa a acili a el acceso al SNC. G acias a su ca ác e an i ílico no iónico (He sh e al. 2016), pueden inco po a se a la memb ana y deses abiliza la, p o ocando su ape u a, cuya ex ensión depende á de la es uc u a y concen ación del compues o (E dlenb uch e al. 2003). 3. Dis upción po ul asonidos: una al e na i a eme gen e pa a p oduci la dis upción de la memb ana es la aplicación de ul asonidos. Pa a ello, se inyec an mic obu bujas de amaño mic omé ico (Dube e al. 2017) que, as la aplicación de ul asonidos, son capaces de ans o ma la ene gía acús ica en ene gía mecánica (Gao 2016). La al e ación de la ba e a puede alcanza se con olando el iempo de aplicación de ul asonidos, así como su ecuencia (Ma in-Bande as e al. 2011). 25 4. Dis upción inducida po adiación: un uso al e na i o de la adio e apia puede se su empleo pa a log a una dis upción ocalizada de la BHE. La adiación p oduce un daño en el ADN que p o oca la mue e celula y puede se u ilizada en el a amien o de umo es ce eb ales (Azad e al. 2015). Adminis ación de á macos po con ección Es e mé odo in asi o pe mi e la adminis ación de agen es e apéu icos di ec amen e en pa énquima ce eb al o ejido especí ico. Pa a ello, uno o más ca é e es de pequeño calib e se colocan es e eo ác icamen e en el ce eb o a a és de su cos pe o ados en el c áneo y los agen es e apéu icos son adminis ados a a és de una bomba de mic oin usión median e p esión posi i a (Ra li and Old ield 2001). Hoy en día, es e ipo de adminis ación equie e la op imización de las ca ac e ís icas de in usión, unas p opiedades de e minadas de ca é e y écnicas de colocación especí icas, así como un seguimien o p eciso y en iempo eal de la dis ibución de in usiones, po lo que es a écnica no esul a con iable y ep oducible (Vogelbaum and Ianno i 2012). A di e encia de o as écnicas in asi as ac ualmen e disponibles pa a la adminis ación de á macos al SNC, es a es a egia consigue una dis ibución uni o me de los á macos cuya can idad adminis ada coincide con la can idad in undida, lo que 32 Ap áme os Los ap áme os son pequeñas secuencias de oligonucleó idos con 20-60 nucleó idos en una sola cadena de ADN o ARN. Se de inen po su es uc u a idimensional, que les pe mi e uni moléculas diana (desde pequeñas moléculas ino gánicas a moléculas complejas) con al a a inidad y especi icidad (Lakhin, Ta an ul, and Gening 2013). Desc i os po p ime a ez en 1990, su nomb e es á o mado po dos palab as p o enien es del g iego: ap us, que se aduce como “encaja ” y me us que signi ica “pa ícula” (Da mos uk e al. 2015). Mayo i a iamen e, los ap áme os suelen ob ene se po una écnica denominada SELEX o selección in i o y p esen an nume osas en ajas: (1) en eo ía, pueden diseña se pa a se econocidos po cualquie ecep o de mane a selec i a, (2) su sín esis química es al amen e ep oducible, (3) son más es ables que las p o eínas y no suelen pe de su capacidad de unión, (4) poseen una baja inmunogenicidaad y oxicidad y (5) g acias a su pequeño amaño, pueden uni se a epí opos a los que no pod ían accede los an icue pos (W. Zhou e al. 2014). Compa ado con los an icue pos, aunque la secuencia de nucleó idos sea análoga, la sín esis de ap áme os es más ba a a y ácil, p esen an mayo es abilidad, meno amaño y baja inmunogenicidad y nula oxicidad (Kulbachinskiy 2007, Boucha d, Hu aba a , and Thompson 2010). Debido a es o, los ap áme os son una buena al e na i a a los an icue pos y excelen es candida os pa a el di eccionamien o especí ico de á macos y el diagnós ico de en e medades. 33 En la lucha con a el cánce , los ap áme os pueden uni se especí icamen e a moléculas sob eexp esadas en células cance osas. Pa a el a amien o del glioma, las NPs pueden uncionaliza se con ligandos especí icos y acili a el acceso de los agen es quimio e ápicos al umo . Uno de ellos, llamado Gin 4.T (an i-PDGFRβ), conjugado en nanosis emas (Monaco e al. 2017), es un ligando capaz de uni se de o ma especí ica y selec i a al ecep o β del ac o de c ecimien o de i ado de plaque as (PDGFRβ), un ecep o exp esado en la supe icie de las células cance osas, incluidas las células de glioma. O o conocido ap áme o, AS1411, es ico en G (Shan 2004) y se une a la nucleolina con al a a inidad, una p o eína al amen e exp esada en la memb ana de las células cance osas, incluidas las células C6 del glioma. T as pene a en la célula cance osa, el complejo AS1411-nucleolina p oduce, en e o os, la inhibición de la sín esis de ADN o la inducción de la apop osis celula (Luo e al. 2017). Los es udios in i o desa ollados po Guo y cols., demos a on que las NPs no modi icadas mues an una meno asociación con las células C6 que las NPs conjugadas con el ap áme o. De mane a simila , la can idad de pa ículas conjugadas acumuladas en el ce eb o ue mayo que la de las pa ículas no conjugadas o el á maco lib e (J. Guo e al. 2011). 34 Pép idos En los úl imos años, se es án es udiando nue as moléculas pep ídicas pa a el a amien o de en e medades, llamados pép idos lanzade a. Uno de los más popula es es el glu a ión (GSH), un ipép ido endógeno hid ó ilo o mado po glu ama o, cis eína y glicina (G. H. Kim e al. 2015),de especial ele ancia debido a su papel en los p ocesos de desin oxicación. Es el agen e p o ec o más impo an e con a los adicales lib es y p o ege a las células en e a especies eac i as del oxígeno y xenobió icos, así como a los ó ganos más expues os a los mismos ( iñón, pulmón, hígado o in es ino) (Koo e al. 2011). La concen ación de glu a ión en el ce eb o es ap oximadamen e 2-3 mM, a disminuyendo con el en ejecimien o y puede asocia se con la apa ición de en e medades ligadas al mismo y en ó ganos con unciones depu a i as (Valdo inos-Flo es and Gonseba 2012). El glu a ión, ayudado po la glicop o eína-P es capaz de a a esa la BHE y es una u a ampliamen e explo ada po nume osos au o es pa a una adminis ación e icaz de á macos en el ce eb o (G. H. Kim e al. 2015). Acha ya e al. (Acha ya and Reddy 2016) es udia on la in luencia de la uncionalización de NPs de PLGA ca gadas de placli axel pa a el a amien o del cánce ce eb al. Las NPs con glu a ión mos a on un di eccionamien o más e ec i o hacia el ce eb o que las NPs no conjugadas. Del mismo modo, en un es udio simila , ambos ipos de NPs p esen aban una endoci osis más al a 35 que la suspensión de pacli axel. Se ob u ie on esul ados simila es pa a las NPs de PLGA ca gadas con cu cumina. Los esul ados de cap ación celula (cuali- y cuan i a i os) mos a on que la acumulación de NPs uncionalizadas y no uncionalizadas en el in e io de las células neu onales e a más al a que la del á maco lib e (Paka and Ramassamy 2016). O os au o es es udia on la capacidad de las NPs uncionalizadas con glu a ión pa a c uza la BHE u ilizando un modelo in i o de ba e a, demos ando que la pene ación de NPs ecubie as de glu a ión e a mayo que la del compues o sin encapsula (G o e e al. 2014). O os pép idos pequeños han sido empleados pa a mejo a el acceso al SNC. Uno de ellos es Angiopep-2 (ANG), capaz de uni se al ecep o de lipop o eínas, que es á sob eexp esado en células endo eliales capila es del ce eb o y células umo ales malignas (Demeule e al. 2007). Las NPs de PLGA conjugadas con ANG pueden se una pla a o ma p ome edo a pa a el a amien o del glioma. Wang e al. compa a on la capacidad de cap ación celula de NPs uncionalizadas con ANG y NPs no uncionalizadas. Los es udios in i o con i ma on que las NPs modi icadas supe icialmen e exhibían una mayo cap ación po las células U- 87MG que las no uncionalizadas, an o cuali a i a como cuan i a i amen e (L. Wang e al. 2015). De mane a pa alela, los ensayos in i o mos a on que an o las NPs uncionalizadas como las no uncionalizadas podían a a esa la BHE, y a ibuye on la capacidad de las NPs no conjugadas a las in e acciones elec os á icas inespecí icas en e la ca ga supe icial posi i a de las NPs y las células endo eliales de los capila es ce eb ales. 36 Finalmen e, se ha es udiado un pequeño pép ido especí ico con a el ecep o de T (T Rp)(secuencia H - Th - His - A g - P o - P o - Me - T p - Se - P o - Val - T p - P o – OH). Los es udios in i o indica on que las NPs conjugadas con el pép ido exhibie on una mejo in e acción con las células endo eliales del ce eb o humano (hCMEC) que las NPs no conjugadas (Gomes e al. 2017). Más ecien emen e, Huang e al. (Huang e al. 2017) ealiza on es udios in i o con NPs de PLGA ca gadas con cu cumina y un inhibido de la p oducción de placas Aβ (S1, pép ido co o con la secuencia PQVGHL). Las pa ículas se uncionaliza on con el pép ido CRT (pép ido CRTIGPSVC cíclico), un pép ido uncionalmen e simila al hie o que se di ige al ecep o de T que induce un cambio alos é ico. Las pa ículas, que enían menos de 150 nm de diáme o y p esen aban alo es de po encial ze a nega i o, exhibie on una cap ación celula no ablemen e mejo ada y una capacidad de pene ación de la ba e a in i o; las imágenes in i o con i ma on es o, y las p uebas con animales demos a on una educción de la gene ación de placas Aβ y la disminución de la p oducción de gliosis, p oin lamación y ci oquinas. Es e pép ido, ue usado ambién po o os in es igado es pa a uncionaliza NPs de PLGA-PEG e in e eni en el anspo e de á macos a a és de la BHE y su pene ación en las células del glioma. La pa ículas conjugadas mos a on que la in e acción con las células C6 y BCEC median e endoci osis ue ele ada así como el paso a a és de un modelo in i o de BHE. Los ensayos in i o a 37 a és de imágenes en iempo eal, mos a on la acumulación de mane a selec i a en el glioma (Kang e al. 2015). An icue pos y o as p o eínas La supe icie de los nanosis emas puede uncionaliza se con moléculas que se unen a ecep o es especí icos p esen es en la BHE a in de mejo a su acceso al SNC. Un ipo especial de p o eínas, los an icue pos monoclonales (moléculas hid ó ilas y de ida media la ga), se usan conjugados en la supe icie de NPs di igidas a la BHE pa a uni se a ligandos especí icos de la misma. Debido a su g an amaño (al ededo de 150 KDa), los an icue pos no pueden a a esa la BHE median e ansci osis mediada po adso ción. Sin emba go, pueden usa se como ligandos especí icos de los ecep o es de la BHE, ing esando al SNC po endoci osis mediada po ecep o como se desc ibió an e io men e (J. a Lou ei o e al. 2014). Es a es a egia es p obablemen e uno de los en oques más e icaces pa a el di eccionamien o de las NPs. Fo nague a e al. (C. Fo nague a e al. 2015) desa olla on un nano ehículo di igido a la BHE, ca gado con lope amida y uncionalizado con el an icue po 8D3 (an icue po con a el ecep o de T ) como molécula diana. Después de su inyección in a enosa en la ena de la cola, los in es igado es e alua on la llegada de las NPs al ce eb o midiendo el po cen aje de e ec os an inocicep i os p oducidos po la lope amida. La lope amida, usualmen e come cializada en cápsulas adicionales pa a el a amien o de la dia ea, no puede c uza la BHE. Sin emba go, incluida en un sis ema de adminis ación nanomé ico adecuado 38 (po ejemplo, encapsulado en NPs uncionalizadas) puede p oduci e ec os cen ales y analgesia (Tosi e al. 2007). El e ec o an inocicep i o después de la adminis ación de NPs uncionalizadas con an icue pos ue mayo que el de las NPs no modi icadas (50% en e a ~ 25%), lo que con i ma la capacidad de 8D3 pa a ac ua como un caballo de T oya a a és de la BHE (C. Fo nague a e al. 2015). OX26 es un an icue po monoclonal de oedo que se une selec i amen e a ecep o es de T p esen es en las células endo eliales de los capila es ce eb ales de la BHE (Monsal e e al. 2015). Es e an icue po es capaz de uni se a un dominio ex acelula del ecep o y pene a en la BHE (X. Tang e al. 2015). Ca ol e al. (Ca oll e al. 2010) desa olla on NPs de PLGA ca gadas con empol (4-hid oxi-2,2,6,6- e ame ilpipe idin- 1-oxilo), un á maco he e ocíclico neu op o ec o que puede elimina el pe oxini i o, que en asociación con o as especies eac i as puede ene un papel en as o nos neu odegene a i os como Alzheime o Pa kinson. Pa a mejo a la cap ación celula y el acceso al SNC, se p epa a on NPs de PLGA-polie ilenglicol (PEG) po nanop ecipi ación y se uncionaliza on con OX26. Los es udios in i o usando RG2 (células del glioma de a a) mos a on que las NPs modi icadas supe icialmen e con OX26 en a on en las células de mane a más e icien e que las NPs no conjugadas. Po o a pa e, Bao e al. (Bao e al. 2012), usando endomo inas como á maco analgésico modelo, es udia on la capacidad de un nanosis ema hipe ami icado modi icado en la supe icie con OX26. Los au o es lle a on a cabo expe imen os de cap ación de células in i o en células BMEC. Los esul ados 39 mos a on que la cap ación de NPs dependía an o del iempo como de la concen ación y que la cap ación se p odujo a a és de un p oceso de endoci osis ca eola . Pa a es udia el c uce de la BHE después de la inyección in a enosa y usando la conjugación con OX26, los au o es e alua on el e ec o analgésico de las endomo inas usando un modelo de lesión de cons icción c ónica en a as. T as la adminis ación in a enosa del á maco lib e no se obse ó ningún e ec o y las NPs sin OX26 mos a on un e ec o analgésico le e (debido a su pequeño amaño). Sin emba go, las NPs con OX26 p oduje on un e ec o analgésico mayo y du an e más iempo. Además de los an icue pos, se han u ilizado o as p o eínas pa a la uncionalización de nanosis emas como las que componen la amilia de las T s es án en e las más ampliamen e u ilizadas como ligandos pa a di igi nanosis emas al ce eb o. Las más conocidas son: (a) la T sé ica humana p esen e en la sang e y o os líquidos co po ales (líquido amnió ico, líquido ce alo aquídeo, lin a, leche, bilis), (b) la o o ans e ina (o o-T ) de la cla a de hue o, (c) la lac o e ina localizada en leche de mamí e os, lág imas, sali a, moco y glóbulos blancos y (d) la melano ans e ina (melano-T ), en la memb ana de los melanoci os, p incipalmen e. A excepción de la lac o e ina (pun o isoeléc ico = 8.7), el es o son p o eínas ácidas con un pun o isoeléc ico en e 5.6-5.8 (H. Li and Ming Qian 2002). 40 Conc e amen e, la T se ha es udiado ampliamen e como ligando especí ico pa a mejo a la llegada de NPs al SNC a a és del ecep o de T , exp esado en las células endo eliales de la BHE. La T es una glicop o eína endógena de 679 aminoácidos y un peso de 79 kDa que puede pene a en las células del endo elio ce eb al po endoci osis mediada po ecep o a a és de los ecep o es de T p esen es en las mismas (Ce in e al. 2013), apo ando el hie o necesa io a las células ce eb ales pa a su me abolismo (Pahuja e al. 2015). En su es uc u a se di e encian hélices al a y láminas be a que comp enden los dos dominios p incipales N- e minal y C- e minal. A pH isiológico, una o dos moléculas de hie o se unen a la T po es os dominios p incipales g acias a dos i osinas, una his idina y un ácido aspá ico, siendo necesa ia ambién la p esencia de un anión (Aisen 2004). El p incipal p oduc o de T es el hígado (Vo h e al. 2015). Fundamen almen e, la T se enca ga de dis ibui el hie o po el o ganismo en o ma de Fe3+, aunque in e iene en o as unciones como la e i opoyesis y la di isión celula (Cheng e al. 2004). Median e el empleo de ligandos con a el ecep o de T (T , an icue pos o pép idos) se puede log a la llegada e ec i a de á macos al ce eb o. En es e sen ido, Chang e al. (Chang e al. 2009) desa olla on una nanopla a o ma de PLGA ecubie o con di e en es es abilizado es (pa a e i a la ag egación) y demos a on que la endoci osis de las NPs conjugadas con T ue mayo que la de las NPs no modi icadas. 41 En o o es udio pa a el a amien o de gliomas, combina on la uncionalización supe icial con T y la aplicación de un campo magné ico, ob eniéndose las mayo es asas de cap ación celula usando ambas es a egias, hecho que se ep oduce en el ensayo pa a la e aluación del anspo e paso a a és de la BHE u ilizando un modelo de ba e a in i o, donde los mejo es esul ados se ob u ie on cuando ambas ác icas e an empleadas. Resul ados in i o con i man la capacidad de las NPs pa a a a esa la ba e a, y a la inhibición más acusada del c ecimien o umo al e a la p oducida po las NPs uncionalizadas con T (Cui e al. 2013). An e io men e nomb ada, o a de las moléculas de la amilia de las T más ampliamen e usada pa a es os p opósi os es la lac o e ina, una p o eína ca iónica de 80 KDa in oluc ada en di e sas unciones isiológicas, incluida la p o ección con a la in ección y la in lamación (Kuma i and Kondapi 2017). Como ocu e con la T , es una buena opción pa a el a amien o del glioma po que su ecep o es á sob eexp esado en células umo ales así como en las células endo eliales del ce eb o, y es capaz de a a esa la BHE, empleándose pa a mejo a el acceso ce eb al de nume osas d ogas. Hu e al. (Hu e al. 2011) es udia on el desa ollo de una nue a nanopla a o ma pa a el a amien o del Pa kinson, bioconjugando lac o e ina a la supe icie de NPs de PLGA-PEG. Es e es udio demos ó que, as la inyección en la ena caudal del a ón, el po cen aje de acumulación de NPs con lac o e ina en la co eza, la sus ancia neg a y el cue po es iado 48 Aβ (J. A. Lou ei o e al. 2016) apo ando un no edoso sis emas pa a el a amien o de es a en e medad. Nose- o-b ain Como se ha ci ado con an e io idad, la p incipal limi ación que exis e en el a amien o de las en e medades neu ológicas es la p esencia de la BHE, que es inge el acceso de la mayo ía de las moléculas e apéu icas al SNC, imposibili ando el a amien o de nume osos desó denes que a ec an al ce eb o. En es e sen ido, median e una adminis ación ía in anasal, la u a nose- o-b ain es conside ada como una posible es a egia de adminis ación de á macos que pe mi e la libe ación de ac i os de mane a ápida y e icaz en el SNC. El in e és de es a ía de adminis ación eside en la al a ascula ización y po osidad de su epi elio, la amplia supe icie disponible pa a una p on a abso ción, un ápido inicio de la acción con una mayo pe meabilidad a un mayo núme o de compues os que la mucosa in es inal. Todo es o debido undamen almen e a la al a de enzimas panc eá icas y gás icas, el pH neu o del moco y la posibilidad de e i a an o el me abolismo de p ime paso como la BHE (Pa deshi and Belgamwa 2013). Po odo ello, es conside ada como una al e na i a eal pa a la adminis ación de nume osos agen es e apéu icos de acción sis émica con baja disponibilidad y/o con un inicio de la acción no deseable, y pod ía explo a se como una ía no in asi a muy p ome edo a de adminis ación en el SNC pa a sus ancias que no 49 a a iesan la BHE (Djupesland, Messina, and Mahmoud 2014). Sin emba go, el acla amien o mucocilia p o oca que la abso ción y el iempo de esidencia del á maco sean escasos, incon enien es que pueden se sol en ados con el empleo de nanosis emas de adminis ación de á macos que p o egen al á maco de la deg adación den o de la ca idad (Ga ziandia e al. 2016). Desa ollada po F ey en 1989, la adminis ación in anasal es ápida (Hanson, F ey, and II 2008) y los á macos alcanzan el ce eb o en una can idad signi ica i a a a és de los ne ios igémino y ol a o io e i ando así la ba e a hema oence álica. En líneas gene ales, la na iz se enca ga de p epa a el ai e que se inhala pa a que llegue de mane a adecuada a las ías espi a o ias, il ándolo, calen ándolo y humedeciéndolo (Illum 2003). Además, la sec eción de mucosa apo a inmunidad en e a ba e ías y i us y es á compues a esencialmen e po agua (95%) además de mucina, sales, p o eínas y lípidos en meno p opo ción. P opo ciona un le e pH ácido (pH 5.5-6.5), y de mane a adicional, cumple o as unciones como la p o ección enzimá ica y ísica, la e ención de agua o posibili a el apo e de calo , en e o os (Alagusunda am e al. 2010). De o ma esumida, la ca idad nasal es á di idida en dos mi ades independien es longi udinalmen e po el abique nasal y se ex iende desde las osas nasales has a la naso a inge (ap oximadamen e 12-14 cm), ocupando una supe icie al ededo de 150 cm2 y con un olumen o al de 15-20 mL (Gho i e al. 2015). P incipalmen e, la ca idad es á compues a de es egiones: 50 es íbulo nasal, egión ol a i a y egión espi a o ia. En humanos, el es íbulo iene una supe icie de 0,6 cm2, seguida de la egión ol a i a que ocupa 15 cm2, un 10% de la supe icie nasal mien as que en oedo es ep esen a al ededo del 30%. El es íbulo es la zona más ex e na de la na iz. En es a egión, la abso ción de á macos es muy escasa debido a la exis encia de ib isas que ac úan como il os y la p esencia de un ecub imien o epi elial escamoso y que a inizado (Pi es e al. 2009). El es o de la ca idad nasal comp ende la egión espi a o ia cuyas pa edes se encuen an plegadas subdi idiéndose en es co ne es: supe io , medio e in e io (Illum 2004). Dicha egión se conside a el si io p incipal de abso ción de á macos hacia la ci culación sis émica y es á cons i uida po la lámina p opia y la memb ana basal que sopo an el epi elio, cambian e a medida que se p o undiza en la ca idad. Inicialmen e, un epi elio escamoso se o na a epi elio de ansición y, po úl imo se con ie e en epi elio pseudoes a i icado (o espi a o io) o mado po cua o ipos di e en es de células: células no ciliadas, ciliadas, calici o mes y basales. Las células ciliadas y no ciliadas poseen mic o ellosidades que aumen an conside ablemen e la supe icie de abso ción y las ciliadas es án ecubie as po cilios que, con su mo imien o anspo an el moco hacia la a inge (Illum 2000). La egión ol a i a, localizada en la pa e más al a de la ca idad nasal, es la única zona del sis ema ne ioso cen al 51 expues a al ex e io (Cha l on e al. 2007). Las células ol a o ias del neu oepi elio comienzan en el bulbo ol a o io del sis ema ne ioso cen al y se ex ienden has a el epi elio ol a i o lo que supone un con ac o di ec o del ex e io y el ce eb o, pe mi iendo el anspo e de á macos a és del ne io igémino y ol a o io (Wu, Hu, and Jiang 2008). El mecanismo de llegada de los á macos al ce eb o a a és de la na iz oda ía no es á comple amen e dilucidado y sigue siendo in es igado; sin emba go, se sabe que an o el ne io ol a o io como las ías ne iosas del igémino es a ían in oluc adas y que pod ía p oduci se po ía in acelula o ex acelula (Lochhead and Tho ne 2012)(Figu a 6). Figu a 6. Rep esen ación esquemá ica de las u as de acceso al sis ema ne ioso cen al po ía in anasal (Nose- o-b ain) (S ü zle e al. 2015) Pa ece que la adminis ación in anasal es una combinación de di e en es u as (S ü zle e al. 2015). De mane a gene alizada, as una inspi ación p o unda de las NPs a a és un disposi i o 52 adecuado, las pa ículas pueden segui es caminos di e en es: (I) en ada di ec a en la ci culación sis émica desde la ca idad nasal, (II) en ada en el bulbo ol a o io a a és de las neu onas y (III) llegada di ec a al ce eb o ía ne io igémino (Kuma , Pandey, and Jain 2016).Po lo an o, el anspo e di ec o de los á macos a lo la go de los ne ios ol a o io y igémino se conside a cada ez más una u a no in asi a p ome edo a. Va ios ipos de moléculas (moléculas pequeñas y g andes) y de células han alcanzado el ce eb o con éxi o a a és de es a ía in anasal(Lochhead and Tho ne 2012). Cabe menciona la insulina (Tiedemann e al. 2017)(Ramos-Rod iguez e al. 2017)(B abazon e al. 2017)(Bell and Fadool 2017), neu o o inas (como el ac o de c ecimien o ne ioso)(Chou e al. 2017)(Male ba e al. 2011)(Vaka e al. 2013)(He an e al. 2014), e i opoye ina (A. Me elli, Czo nyj, and Laza owski 2015)(Amalia Me elli, Czo nyj, and Laza owski 2013)(Rod íguez C uz e al. 2016), benzodiacepinas (Bo ne and Sin o 2011)(Inokuchi e al. 2015) y células mad e (Danielyan e al. 2011). Sin duda, el ápido p og eso de la medicina es p ome edo pa a el a amien o de en e medades neu odegene a i as, ya que p opo ciona un nue o en oque pa a el con ol de la libe ación de ac i os iejos y nue os. De hecho, la combinación de la nano ecnología y la adminis ación in anasal se es á ol iendo más a ac i a en los úl imos años (Goldsmi h, Ab amo i z, and Pee 2014)(Shah, Yada , and Amiji 2013)(Sama idou and Alonso 2018). 53 Es con enien e en a iza la u ilidad de las NPs de PLGA di igidas al ce eb o ía in anasal como una de las nano o mulaciones más p ome edo as. Recien emen e, Bonacco so e al. (Bonacco so e al. 2017) compa a on la capacidad de las NPs de PLGA y qui osano pa a llega al ce eb o as una adminis ación in anasal en a as. Pa a ello, las NPs se ma ca on con odamina y su ubicación ue de e minada po mic oscopía de luo escencia. Los expe imen os e ela on que ambas NPs, con diáme o simila pe o una ca ga supe icial opues a, llega on al ce eb o y pe sis ie on en el mismo du an e 48 h. Las NPs de PLGA con ca ga nega i a llega on al ce eb o a a és de la ía ol a i a, mien as que las ías ne iosas del igémino ue on las in oluc adas en el caso de las NPs de qui osano ca gadas posi i amen e. En algunos casos, con la adminis ación in anasal se ob ienen e ec os iguales a los esul ados alcanzados as una adminis ación po ía in a enosa. Po ejemplo, Seke da g e al. (Seke dag e al. 2017) diseña on una nanopa ícula híb ida de lípido-PLGA ca gada con ácido a nesil- iosalicílico pa a el a amien o del glioma. Después de un a amien o po un pe íodo de 5 días po adminis ación in a enosa o in anasal a las a as Wis a , obse a on que las dos u as de adminis ación p oduje on una educción impo an e y simila del umo . Es os esul ados apoyan la u ilidad po encial de la adminis ación in anasal como un no edoso mé odo no in asi o en el a amien o de glioma. 54 A eces, moléculas p ome edo as pa a el a amien o de una cie a en e medad esul an se inú iles y allan de mane a decepcionan e. Es e ue el caso del a en ub il, un compues o con g andes expec a i as de modula la ac i idad de la enzima gamma- sec e asa, cla e en la o mación del pép ido be a amiloide, implicada en la en e medad de Alzheime . P obablemen e, la escasa capacidad de pene ación del á maco condujo al acaso de su empleo pa a el a amien o de la en e medad neu odegene a i a. Con el esu gi de la nanomedicina, el a en ub il ha uel o a emplea se ecien emen e, encapsulado en NPs de PLGA o NPs sólidas lipídicas. Pa a ambas o mulaciones, el diáme o de los nanosis emas e a in e io a 200 nm, lo que acili a el anspo e anscelula a a és de los axones ol a i os (Mun imadugu e al. 2016). Los in es igado es del es udio descub ie on que ambas se di igían al ce eb o de mane a exi osa, siguiendo la u a ol a o ia as una adminis ación in anasal, aunque las o muladas con PLGA ue on más e ec i as an o pa a el di eccionamien o hacia el SNC como pa a la can idad de á maco ehiculizado. La adminis ación de agen es neu op o ec o es al ce eb o ambién es á omando una conside ación ele an e. Xiao e al. (Xiao e al. 2016) desa olla on una o mulación de imoquinona, encapsulada en NPs de PLGA-qui osano pa a e alua su e icacia en un modelo de isquemia en oedo es después de se adminis adas ía in anasal. La imoquinona es un p oduc o na u al de i ado de la especie Nigella sa i a que exhibe p opiedades an iin lama o ias y an icance ígenas pe o que p esen a una biodisponibilidad muy 55 educida. Los au o es demos a on una educción signi ica i a de la isquemia y una mejo a del pe il a macociné ico del á maco en el ce eb o. Los ensayos bioquímicos ambién mos a on una educción de la pe oxidación lipídica, un inc emen o de glu a ión, ca alasa y supe óxido dismu asa en el ce eb o, lo que sugie e el po encial de las NPs de PLGA-qui osano pa a se u ilizadas como ehículo pa a la lib ación de á macos en el ce eb o. O os in es igado es es udia on la posibilidad de emplea las NPs adminis adas ía in anasal como anspo ado es de sus ancias e apéu icas con ac i idad an iepilép ica. En es e sen ido Sha ma e al. (Sha ma e al. 2016) encapsula on el midazolam en NPs de PLGA adioma cadas con Tc-99m pa a e alua la biodis ibución de las mismas as se adminis adas ía in anasal e in a enosa a a as Sp ague-Dawley. Las imágenes de gammacáma a y la elación de cap ación en sang e/ce eb o, indica on un mayo di eccionamien o ce eb al de es os nanosis emas después de una adminis ación in anasal. Cabe señala el empleo de NPs de PLGA uncionalizadas supe icialmen e pa a se adminis adas po es a ía no in asi a. En es e sen ido, Bi e al, encapsula on o igo ina (un agonis a dopaminé gico usado pa a el a amien o del Pa kinson) en NPs de PLGA PEGiladas y uncionalizadas con lac o e ina. Tan o las uncionalizadas como las no uncionalizadas mos a on una libe ación sos enida del á maco du an e 48 h. Los es udios in i o, demos a on que la llegada al ce eb o de o igo ina as una adminis ación in anasal u o una dis ibución he e ogénea, con una mayo concen ación en el cue po es iado, la egión 56 p imo dial a ec ada en el Pa kinson. Sin emba go, la adminis ación del á maco ue mucho más e ec i a cuando se emplea on las NPs uncionalizadas con lac o e ina (Bi 2016). VENLAFAXINA (VLX) COMO FÁRMACO MODELO Usada en es e es udio como á maco modelo, la VLX ((Clo hid a o de-1-[(2-dime ilamino)-1-(4-me oxi enil) e il] ciclohexanol)) es un á maco de e ce a gene ación pa a el a amien o de la dep esión y la ansiedad (Panahi and Alaei 2014) que se p esen a como un sólido blanco de na u aleza c is alina, muy soluble en agua (S. Jain and Da a 2014). Es un an idep esi o de acción dual que inhibe selec i amen e la ecap ación neu onal de se o onina y no epine ina (ISRN), aumen ando los ni eles de los neu o ansmiso es en el espacio sináp ico (Mad akian e al. 2015). La VLX su e me abolismo hepá ico po la acción de la isoenzima CYP2D6 ans o mándose en O-desme il enla axina, ambos compues os bicíclicos (Dziu kowska and Wesolowski 2013). T as una adminis ación o al, mues a nume osas limi aciones ya que p esen a un inicio len o de acción, una biodisponibilidad pob e (40-45%)(Haque e al. 2014) y necesi a se adminis ada de mane a ecuen e pa a man ene los ni eles e apéu icos, ya que ambién posee una co a ida media (4-5 h) (Pund, Ras e, and Bo ade 2013). Es una de las sus ancias e apéu icas más ampliamen e usadas como á maco an idep esi o; sin emba go, después de la adminis ación o al, p esen a e ec os secunda ios no deseables 57 como nauseas, es eñimien o, debilidad, somnolencia, insomnio, aquica dia, dolo de cabeza, a iga y sequedad bucal (J. Tang e al. 2012). Como incon enien e añadido, se c ee que el á maco es un induc o de la glicop o eína P, lo que p o oca el e lujo del mismo hacia el lado apical de la memb ana hema oence álica (Eh e e al. 2007)(O’B ien e al. 2012). Ap obada en 1993 po la FDA como el p ime ISRN pa a el a amien o del as o no dep esi o mayo (TDM), en la ac ualidad es á disponible en más de 90 países (Wa anabe e al. 2018). La dosis dia ia de VLX puede a ia en e 75 y 375 mg en unción del ipo de o mulación adminis ada (Ha ison, Fe ie , and Young 2004) y es á come cializada como una mezcla acémica de las o mas enan iomé icas S - (+) y R- (-) en can idades iguales (Dziu kowska and Wesolowski 2013). En el me cado, es á disponible bajo dos o mulaciones de adminis ación: o mas de libe ación inmedia a (37.5, 50 y 75 mg) y sis emas de libe ación con olada (75, 150 y 225 mg (“Venla axina” n.d.). Como se ha ci ado an e io men e, posee una ida media co a y debe se adminis ada en e 2 y 3 eces al día pa a man ene las concen aciones en el in e alo e apéu ico. Ello desemboca en el incumplimien o del a amien o po pa e del pacien e y, po ello, la o mulación de libe ación con olada su ge como una al e na i a pa a aumen a la ole ancia del pacien e y mejo a el bene icio/ iesgo con espec o a las o mas de libe ación inmedia a (H. A. Pa el e al. 2011). Sin emba go, las p esen aciones de libe ación e a dada siguen p o ocando nume osos e ec os secunda ios y po ello, nume osos au o es han es udiado la 64 Química (Ba celona, España) y el ace oni ilo con calidad HPLC se ob u o de VWR. El agua u ilizada en los expe imen os ue desionizada y il ada (Milli-Q Academic, Me ck Millipo e, Massachuse s, EE.UU.). Cul i os celula es Pa a los expe imen os celula es, las células endo eliales mic o ascula es ce eb ales humanas (línea celula hCMEC/D3) ue on amablemen e donadas po el g upo de in es igación del D . Sa men o (Ins i u o de In es igaçao e Inno açao em Saúde, i3s, Uni e sidade do Po o, Po ugal). El medio de cul i o basal (EBM- 2) se ob u o de Lonza (Basilea, Suiza) y ue suplemen ado con sue o e al bo ino inac i ado (FBS) adqui ido de Biowes (Missou i, EE.UU.), penicilina/es ep omicina, hid oco isona, ácido ascó bico, HEPES y ac o básico de c ecimien o de ib oblas os (bFGF) que se ob u ie on de Sigma-Ald ich y concen ado lipídico químicamen e de inido (CD lipid concen a e) de Gibco, The mo Fishe Scien i ic (Massachuse s, EE.UU.). T i on® x-100®, B omu o de 3- (4,5-dime il iazol-2-il) -2,5- di enil e azolio ( eac i o MTT) y pa a o maldehído (PFA) ue on ob enidos de Sigma-Ald ich (S . Louis, EE.UU.). La solución de colágeno ipo I de la cola de a a (Gibco) y el colo an e luo escen e de ADN, Hoechs ® 33342 (In i ogen) se adqui ie on de The mo Scien i ic (Massachuse s, EE.UU.). 65 Animales En los ensayos expe imen ales in i o pa a es udia la llegada de las pa ículas al ce eb o as adminis ación in a enosa desa ollados en la Uni e sidad de Ve ona (I alia) se usa on a ones adul os C57bl/6 machos adul os (3-6 meses) de i ados de la colonia de c ía de las ins alaciones de animales de la Facul ad de Medicina de la p opia uni e sidad. Como anes ésico se empleó 2,2,2- ib omoe anol. Todos los expe imen os ue on ap obados po el Comi é de Cuidado y Uso de Animales de la Uni e sidad de Ve ona (CIRSAL) y se ealiza on siguiendo los "P incipios de cuidado de animales de labo a o io" (publicación NIH No. 86-23) con el in de minimiza el núme o de animales u ilizados y pa a e i a su su imien o. Además, los expe imen os se lle a on a cabo bajo la au o ización é ica del Minis e io de Salud i aliano, en es ic o cumplimien o de las di ec i as del Consejo de Comunidades Eu opeas (86/609/CEE) y las di ec ices ARRIVE. Los animales se man u ie on en condiciones ambien ales es ánda ( empe a u a y humedad) y un ciclo de luz/oscu idad de 12h/12h y acceso lib e a alimen os y agua. Pa a los es udios en animales desa ollados en la Uni e sidad de Se illa (es udios de biodis ibución in i o as adminis ación in anasal), se emplea on a ones de la cepa C57BL/6J. Ke amido (ke amina, 100 mg/mL)(Labo a o ios Rich e Pha ma, Wels, Aus ia) y Sedín (hid oclo u o de 66 mede odimida, 1mg/mL)(Labo a o ios Calie , Ba celona, España) ue on empleados como anes ésicos. Los expe imen os desa ollados ue on ap obados po el Comi é É ico de In es igación Expe imen al de la Uni e sidad de Se illa. El p oyec o au o izado po la Jun a de Andalucía con núme o 20/03/2017/046, cumplió los equisi os pa a la in es igación con animales expe imen ales de acue do con la Di ec i a de la Comunidad Eu opea (2012/707/UE) y con el a ículo 41.1 del RD 53/2013 de la no ma i a española pa a el uso de animales de labo a o io. Ra ones C57bl/6 de 3-4 semanas de ida (machos y hemb as) con un peso comp endido en e 18-20 g. Los animales ue on a ados humanamen e y se aloja on en jaulas especí icas en el animala io de la Facul ad de Fa macia con ciclos de luz/oscu idad de 12 h y acceso lib e a alimen os y agua a una empe a u a cons an e de 25 ± 0.5ºC. MÉTODOS P epa ación de las NPs La elección de un mé odo de p epa ación de NPs depende p incipalmen e de la solubilidad del á maco a encapsula y de la aplicación inal (M. Li, Rouaud, and Poncele 2008). La écnica de e apo ación del disol en e de una emulsión o ece g an e sa ilidad a la ho a de inco po a el ac i o, ya que pe mi e encapsula ac i os an o hid ó ilos como lipó ilos. Sin 67 emba go, pa a á macos hid ó ilos que se p e enden encapsula en una ma iz lipó ila, es a écnica no esul a an e icien e ya que pueden p oduci se pé didas de la sus ancia ac i a disuel a en la ase acuosa ex e na po di usión (Iqbal e al. 2015). Pa a sol en a es e p oblema, se emplean emulsiones múl iples (W1/O/W2), en la que el á maco hid ó ilo a disuel o en una ase acuosa in e na (W1) (Ib aheem e al. 2014). Cuando se a a de á macos poco solubles en agua o insolubles, gene almen e se emplea una emulsión simple de ase ex e na acuosa O/W. De mane a gene al, pa a la p epa ación de pa ículas po es a écnica empleando ma ices polimé icas lipo ilas, es necesa ia la p epa ación p e ia de a ias disoluciones: una solución acuosa W1, que con iene ensioac i o y en la que i á disuel o el á maco pa a las NPs ca gadas, una solución o gánica del políme o y, inalmen e, una segunda solución acuosa de emulsionan e (W2). B e emen e, la solución acuosa W1 se homogeneiza con la solución o gánica pa a o ma una p ime a emulsión de ase ex e na oleosa (W1/O) y és a emulsión p ima ia se adiciona a la ase W2 pa a da luga a una emulsión inal múl iple (W1/O/W2)(R. Liu e al. 2005)(Ve igu a 7). Pa a la o mación de ambas emulsiones, es p imo dial el apo e de ene gía. 68 Figu a 7. P incipales e apas del mé odo de e apo ación del disol en e de una emulsión. Es a écnica ha sido p e iamen e empleada po nues o g upo de in es igación (Ma ín-Bande as e al. 2013) pa a la elabo ación de NPs de gemci abina. Algunas modi icaciones se han lle ado a cabo du an e el p oceso con obje o de consegui NPs con unas ca ac e ís icas isicoquímicas ( amaño, p opiedades supe iciales, e c.) óp imas pa a alcanza el obje i o plan eado. En es e abajo, la p oducción de las pa ículas po el mé odo de e apo ación del disol en e de una doble emulsión se lle ó a cabo en dos pasos p incipales: 69 (1) Adición go a a go a de 100 µL de una solución acuosa de PVA al 0.5% p/ ( ase W1) a 2 mL de una solución o gánica de PLGA en ace a o de e ilo a una concen ación de 4% p/ ( ase O) en agi ación cons an e y dejando sonica du an e 1 minu o. La ase W1 se á la que con enga el á maco en las NPs ca gadas. En el p esen e abajo, se ensayan di e en es concen aciones de á maco (5%, 10%, 15%, 20% y 25% p/ ). (2) La emulsión esul an e del paso an e io es añadida de mane a inmedia a a 10 mL de una segunda disolución acuosa de PVA al 0.5% p/ ( ase W2) en cons an e agi ación (24.000 pm), empleando un homogeneizado de al a elocidad, Poly on® PT 2500E (Poly on, Mon eal, Canadá). Una ez o mada la emulsión múl iple, se man iene 1 minu o más en agi ación. Seguidamen e, la suspensión de pa ículas se dejó en bajo agi ación magné ica du an e 2 h a empe a u a ambien e en campana de ex acción has a la comple a e apo ación del disol en e o gánico. A con inuación, las NPs se ecogie on po ul acen i ugación (Cen í uga Eppendo 504R; Eppendo AG, Hambu go, Alemania) a 15557 c du an e 30 min, a 4ºC. T as dos la ados, las NPs se esuspendie on en una solución de ealosa al 5% p/ , empleada como agen e c iop o ec o . Finalmen e, la suspensión de NPs se congeló y ue on lio ilizadas pa a usa las pos e io men e (-80±0.5ºC y 0.054 mBa ; 70 C yodos-50, Tels a Indus ial S.L., Ta asa, España). Todas las o mulaciones se p epa a on po iplicado pa a asegu a la ep oducibilidad de las mismas. Modi icación supe icial de las NPs de PLGA El obje i o de la uncionalización supe icial de las NPs es el di eccionamien o de las mismas hacia un ó gano especí ico (en es e caso, el ce eb o), uncionalizándolas con ligandos especí icos pa a ecep o es que se exp esan en ó ganos, ejidos o células diana. Pa a ac ecen a la in e nalización de las NPs en las células endo eliales de la BHE, dos biomoléculas di e en es de na u aleza pep ídica (ligandos especí icos del ecep o de T ), se conjuga on en la supe icie de las pa ículas: T o T Rp. Como ya se ha ci ado con an e io idad, abajos de in es igación de nume osos au o es a alan la capacidad de ambos ligandos pa a mejo a la capacidad de las NPs pa a a a esa la ba e a (Chang e al. 2009)(Cui e al. 2013)(W. Guo e al. 2013)(Yan e al. 2013)(Gomes e al. 2017). La uncionalización de las NPs de PLGA se lle ó a cabo siguiendo el mé odo de la ca bodiimida, ap o echando los g upos ca boxilos e minales del PLGA pa a la o mación de un enlace amida con el g upo amino de las moléculas pep ídicas (Das, Dilnawaz, and Sahoo 2011) con algunas modi icaciones ( e igu a 8). 71 Figu a 8. Esquema de las eacciones que comp enden la uncionalización de NPs a a és del mé odo ca bodiimida. La conjugación se lle a a cabo en dos pasos: el p ime paso incluye la ac i ación de los ácidos ca boxílicos de la supe icie de las NPs polimé icas. Pa a ello, 20 mg de NPs se dispe sa on en 1 mL de agua Milli-Q, seguidamen e, go a a go a se añadie on 500 µL de EDC (1mg/mL) y 500 µL de NHS (1mg/mL) a la suspensión de NPs, man eniendo en agi ación cons an e du an e 4 h a empe a u a ambien e y en a mós e a ine e. Pa a elimina el exceso de EDC y NHS, la suspensión de NPs se ecogie on po ul acen i ugación (Cen í uga Eppendo 504R; Eppendo AG, Hambu go, Alemania) a 15557 c du an e 30 minu os a 4ºC. En la siguien e e apa, las NPs ac i adas se edispe sa on en 2 mL de agua Milli-Q y se añadie on 200 µL de una solución acuosa de T (1 mg/mL). La suspensión se man u o en agi ación cons an e du an e oda la noche. T as es e iempo, la can idad de T no unida a las NPs se eliminó po ul acen i ugación en las condiciones mencionadas an e io men e. La can idad de ligando no unida se analizó 72 pos e io men e pa a comp oba la e icacia de conjugación ( e apa ado 4.2.8). El mismo p o ocolo ue empleado pa a la uncionalización de las NPs polimé icas con T Rp. Pa alelamen e, se ealizó un es udio de modi icación supe icial sin emplea el mé odo de la ca bodiimida, incubando la suspensión de NPs (2 mg/mL) únicamen e con la solución de los ligandos (sin EDC ni NHS) con el in de comp oba que los ligandos se unían co alen emen e en luga de queda adso bidos en la supe icie de las pa ículas. P epa ación de NPS luo escen es pa a es udios in i o de cap ación celula . Pa a consegui la isualización de las pa ículas en los ensayos de cap ación celula , se usó NR como luo ó o o, siguiendo un p o ocolo simila al desa ollado en el apa ado 4.2.1 con algunas modi icaciones. De mane a b e e, 100 µL de una solución de NR en DMSO (1 mM) se disol ie on en 2 mL de una solución de PLGA en ace a o de e ilo. La solución o mada se añadió go a a go a a 10 mL de una solución de PVA (0.5% p/ ) en agi ación in ensa cons an e (24.000 pm) empleando un homogeneizado de al a elocidad (Poly on® PT 2500 E)(Poly on, Mon eal, Canadá). La suspensión de NPs se dejó en agi ación magné ica cons an e has a la comple a e apo ación del disol en e o gánico. T as es o, se siguie on los 73 mismos pasos que pa a la p epa ación y modi icación supe icial de las NPs ca gadas con VLX (Apa ados 4.2.1 y 4.2.2). P epa ación de las NPs luo escen es pa a es udios de pe meabilidad La e aluación de la pe meabilidad de las NPs a a és de un modelo in i o de BHE se lle ó a cabo usando pa ículas p epa adas con PLGA p e iamen e conjugado con FITC. Pa a la o mación del conjugado PLGA-FITC se empleó el mé odo de ca bodiimida (Yin e al. 2007) con lige as modi icaciones, es ableciendo una unión co alen e en e políme o y luo oc omo. El p ime paso implica la ac i ación de los g upos ca boxilos del PLGA, pa a es o, a un 1 mL de una solución de PLGA (20% p/ ) en diclo ome ano (DCM), se añadie on go a a go a 2 mL de una solución de DCM que con enía EDC (1.02% p/ ) y NHS (0.8% p/ ), incubándose du an e 2 h a empe a u a ambien e. Después, se añadió go a a go a 200 μL de una solución de FITC 0,1 M en DCM: pi idina (1:1). La mezcla se agi ó du an e 2 h en la oscu idad y, pos e io men e, se incubó du an e la noche a 4º C. Pa a ob ene el PLGA ma cado, se usa on 30 mL de me anol, añadidos go a a go a en ío, p o ocando la p ecipi ación del políme o. Finalmen e, el conjugado FITC-PLGA se la ó con me anol pa a elimina la luo esceína no conjugada y, pos e io men e con agua Mili-Q pa a elimina los esiduos de me anol. El políme o ma cado se congeló, lio ilizó y almacenó en la oscu idad a 4 ºC. 80 del c omó o o apo a sencillez, apidez y sensibilidad, mos ando g an ole ancia a compues os que in e ie en en o os mé odos de cuan i icación (B own, Ja is, and Hyland 1989). Pa a el cálculo can idad de ligando pep ídico unido a la supe icie de las NPs, se es ableció una ec a de calib ado en un in e alo de concen aciones en e 0-250 µg/mL pa a ambas biomoléculas (R2 = 0,999). La cuan i icación se lle ó a cabo de mane a indi ec a, midiendo la can idad de ligando no unido co alen emen e a la pa ícula. La e icacia del p oceso ambién se exp esa en µg de ligando unido po g amos de NPs (Das, Dilnawaz, and Sahoo 2011). Es udio de la in luencia de la congelación en las NPs. Op imización de las condiciones de lio ilización. La lio ilización es un p oceso que comp ende es e apas di e enciadas: la p ime a e apa consis e en la congelación de la suspensión acuosa de NPs, du an e es a e apa la suspensión se en ía y comienzan a o ma se los c is ales de agua gene ando ensiones que pueden conduci a su pé dida de es abilidad. Seguidamen e, el paso de secado p ima io, implica la sublimación del hielo del p oduc o congelado. T as la comple a sublimación, se o man po os que se co esponden con los si ios ocupados po el hielo an e io men e. Finalmen e, el agua abso bida po el p oduc o es eliminada en un secado secunda io (X. (Cha lie) Tang and Pikal 2004). Una ez lio ilizadas, (a) las NPs deben p ese a las ca ac e ís icas iniciales, (b) los amaños y la dis ibución de amaños deben se simila es a los del p oduc o p e io sin lio iliza , 81 (c) la esuspensión debe se acep able con un iempo co o de econs i ución y (d) la ac i idad a macológica del ac i o debe pe manece inal e ada. Se a a de una écnica len a y cos osa, ampliamen e usada pa a mejo a la es abilidad de di e sos ac i os a macéu icos (Abdelwahed e al. 2006). La congelación es un p oceso muy ag esi o pa a las NPs po an o, es de i al impo ancia el empleo de un c iop o ec o pa a asegu a la calidad inal del p oduc o, ya que el políme o, as su i un p oceso de congelación iende a o ma un gel di ícil de esuspende (Abdelwahed e al. 2006). Los c iop o ec o es más comúnmen e usados son: alcoholes de bajo peso molecula como el polie ilenglicol o azúca es como mani ol, ealosa o saca osa (Almalik e al. 2017). En el p esen e abajo, se e aluó la in luencia de las di e en es p opo ciones de ealosa:NPs, es udiándose el e ec o en agua, y 1:1.5, 1:3, 1:9, 1:15 de ealosa:NPs espec i amen e, que se añadie on di ec amen e a una suspensión de NPs blancas sin uncionaliza as los la ados po ul acen i ugación, an es de congela las. El amaño de las NPs se midió as un p oceso comple o de lio ilización, esuspendiéndolas en agua Milli-Q. También se e aluó el e ec o del c iop o ec o midiendo el amaño de las NPs después de descongela las, sin lio iliza . 82 Es udios de libe ación in i o Conoce la libe ación in i o del ac i o desde los nanosis emas es imp escindible pa a con ola el po cen aje libe ado en unción del iempo. El es udio se lle ó a cabo median e un mé odo de diálisis empleando ampón os a o (PBS) a pH 7.4 ± 0.1 como medio de libe ación a 37 ± 0.5ºC. P e iamen e, las bolsas ue on hid a adas con agua du an e 12 h (an es de su uso), as es o, 5 mL de cada suspensión de NPs (VLX-PLGA, T -VLX-PLGA y T Rp-VLX-PLGA) en PBS a azón de 5 mg pa ículas/mL (equi alen e ap oximadamen e a 490 µg de á maco) se in oduje on en la bolsa de diálisis (2 KDa, ubos de memb ana de diálisis Spec um®Spec a/Po ® 6, Cali o nia, EE.UU.) ijadas en los ex emos con pinzas y se coloca on en el in e io de un E lenmeye cónico con 100 mL de ampón. Las mues as se agi a on a 200 pm du an e odo el ensayo y, a los iempo p e- ijados (0.5, 2, 4, 8, 12, 24 h) se e i a on alícuo as de 0.5 mL de mues a del medio de libe ación, suplidos con un olumen igual de PBS a la misma empe a u a pa a ga an iza las condiciones sink. El ensayo se ealizó po iplicado. Finalmen e las mues as se il a on y se inyec a on (20 µL) en el sis ema de HPLC con las condiciones desc i as en el apa ado 4.2.7.1 pa a e alua el po cen aje de ac i o libe ado. En es e expe imen o, se es udió la posible in luencia de la p esencia de los ligandos en la supe icie de las NPs uncionalizadas con espec o a las NPs simples. 83 Es abilidad de las o mulaciones de NPs en líquido ce alo aquídeo (LCR) a i icial Pa a desa olla es udios in i o, es necesa io alo a la es abilidad de las pa ículas en los medios p incipales en los que se an a encon a en el o ganismo. Po an o, se desa olló un es udio pa a e alua la pe du abilidad de las NPs en LCR, uno de los p incipales líquidos del SNC. Pa a ello, se p epa ó un LCR a i icial siguiendo la o mulación empleada po Ga ziandia e al. B e emen e, en 1 L de agua Mili-Q se disol ió: 6.15 g NaCl, 0.216 g KCl, 0.447 g MgCl2, 0.255 g CaCl2, 6.009 g Na2CO3, 0.057 g Na2HPO4, 0.613 g D-glucosa, 0.2 g de ácido ascó bico y 0.3 g de albúmina sé ica bo ina (BSA) y el pH se ajus ó a 7.35 (Ga ziandia e al. 2016). Po an o, 1 mg de cada o mulación de NPs (PLGA-, VLX- PLGA-, T -PLGA-, T Rp-PLGA-, T -VLX-PLGA-, T Rp-VLX-PLGA-NPs) se dispe sa on en 5 mL del luido a i icial y la suspensión se man u o en agi ación magné ica du an e 24 h a 37ºC. An es de comenza el ensayo, se midió el amaño y la dis ibución de amaños (PdI) de las pa ículas usando un Ze asize Mal e n ZS90 (Mal e n Ins umen s, UK), as el iempo de incubación, se ol ió a medi el amaño y PdI de las pa ículas. 84 Es udios celula es in i o Cul i os celula es Las células endo eliales mic o ascula es ce eb ales humanas (línea celula hCMEC/D3) de i an de los mic o asos del lóbulo empo al humanos, aislándolos del ejido ex i pado, con al o ni el de exp esión del anspo ado de glucosa (GLUT1) y el ecep o de T (Weksle , Rome o, and Cou aud 2013). Las células ue on cul i adas en medio basal de c ecimien o endo elial (EBM- 2) suplemen ado con FBS (5% / ), penicilina-es ep omicina (1% / ), ácido ascó bico (5 µg/mL), hid oco isona (1.4 µM), concen ado lipídico químicamen e de inido (CD Lipid concen a ed) (1/100 / ), HEPES (10 mM) y ac o básico de c ecimien o de ib oblas os (bFGF). Es e úl imo suplemen o se añadió en el úl imo momen o, a la ho a de usa el medio. El cul i o celula se man u o a 37ºC en un ambien e humidi icado con 5% de CO2 (Incubado a de CO2Au oFlow UN-4750 Wa e Jacke ; Nuai e, EE.UU.). El medio ue eemplazado cada dos días y las células ue on subcul i adas después de alcanza , ap oximadamen e, un 80% de con luencia (Gomes e al. 2017). Es udios in i o de oxicidad celula Pa a e alua la iabilidad de las células expues as al con ac o con las NPs se ealizó el ensayo de educción del B omu o de 3 (4,5 dime il-2- iazoil)-2,5-di enil e azólico (MTT), un ensayo colo imé ico ácil y cómodo que mide cuan i a i amen e la ac i idad me abólica de las células iables y que se basa en la 85 capacidad de las enzimas deshid ogenasas mi ocond iales de las células me abólicamen e ac i as de educi un compues o ama illo e hid ó ilo, la sal de b omu o de e azolio (3- (4,5-dime il iazol-2- il) -2,5-di enil e azolio), a un compues o insoluble ( o mazán), de colo pú pu a. Cuando las células cap an la sal de b omu o de e azolio (MTT) se ompen y los c is ales de o mazán se solubilizan con DMSO, dando como esul ado una solución de colo mo ado, cuya in ensidad depende á del g ado de iabilidad celula (Kong e al. 2011). El ensayo de ec a células i as y debe hace se en la oscu idad, ya que el eac i o MTT es sensible a la luz (Mosmann 1983). La iabilidad celula se e aluó po es e ensayo, poniendo en con ac o las células con los di e en es nanosis emas y la VLX lib e du an e 24 h a dis in as concen aciones: 0.1, 1, 10, 100 y 1000 µg/mL de NPs, equi alen es a 0.014, 0.14, 1.4, 14 y 140 µg/mL de VLX espec i amen e. El á maco lib e se añadió bajo las mismas condiciones. Las células hCMEC/D3 ue on semb adas con una densidad de 1 x 105 células/pocillo en una placa de 96 pocillos (Nunclon®; The moScien i ic, Wal ham, EE.UU.) e incubadas du an e 24 h (37ºC) pa a pe mi i la adhesión de las células. El medio se e i ó comple amen e y las células se la a on dos eces con 200 µL de PBS (pH 7.4). Después, las células se incuba on con las di e en es concen aciones de NPs y á maco lib e esuspendidas en medio de cul i o du an e 24 h. T as es e iempo, las suspensiones se 86 e i a on y las células se la a on dos eces con 200 µL de PBS. Seguidamen e, se añadie on 200 µL de una solución de MTT (0.5 mg/mL en medio de cul i o) a cada pocillo du an e 4 h, en la oscu idad. Finalmen e, la solución de MTT ue desca ada y los c is ales de o mazán ue on disuel os con 200 µL de DMSO, agi ando en oscu idad du an e 10 min, a empe a u a ambien e pa a acili a la disolución de los c is ales. La abso bancia se midió en un lec o de mic oplacas (Syne gy HT, Bio ek, Ve mon , EE.UU.) a 590 nm y la iabilidad celula se calculó siguiendo la siguien e ecuación (3): 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 (%)= 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙− 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜−𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑥 100 (Ec.3) Las células incubadas solo con medio basal EBM-2 se empleó como con ol nega i o ( odas las células se man ienen iables) y una solución de T i on® X-100 como con ol posi i o ( odas las células mue en). Es udios in i o de in e nalización celula Una de las en ajas de los nanosis emas anspo ado es de á macos es su capacidad pa a in e naliza se en luga es no accesibles pa a o as o mas a macéu icas adicionales debido a su amaño y su éxi o depende en g an medida de su capacidad de in e acción con las células u ó ganos diana. En el caso que nos ocupa, es de i al impo ancia e alua la pene ación de las pa ículas en las células endo eliales que o man la BHE pa a alcanza el ce eb o ya que, de ello, depende á en g an medida su e ec o e apéu ico. Sin emba go, no siemp e buenos esul ados in 87 i o se aducen en esul ados in i o de calidad pe o pueden p opo ciona algunas e idencias p elimina es del po encial de las o mulaciones nanomé icas. En es e es udio, se empleó la línea celula hCMEC/D3 y se e aluó la cap ación de las pa ículas (NPs sin modi ica y modi icadas supe icialmen e con el T o T Rp) po pa e de las mismas. La in e nalización de las pa ículas en las células se de e minó po análisis cuali a i o y cuan i a i o. Pa a isualiza las NPs en los ensayos de in e nalización celula in i o se p epa a on pa ículas luo escen es con NR como luo ó o o (p o ocolo desc i o en el apa ado 4.2.3). Análisis cuali a i o po mic oscopía con ocal Pa a el análisis cuali a i o, las células hCMEC ue on semb adas en co e -slips (1x105 células/co e -slip). P e iamen e, los co e -slips (12 mm) se si ua on en un placa de 24 pocillos (Nunclon®; The moScien i ic, Wal ham, EE.UU.), p ecubie as con colágeno ipo I (50 µg/mL) du an e oda la noche pa a log a la adhesión de las células. Después de es o, las células ue on la adas dos eces con PBS e incubadas con una suspensión de NPs (no uncionalizadas y uncionalizadas con T o T Rp) ca gadas con NR (50 µg/mL en medio sin FBS) du an e 30 min a 37ºC. T as la incubación, las células se la a on dos eces con PBS con el in de elimina las NPs no in e nalizadas y los núcleos de las células se iñe on con Hoechs ® 33342 du an e 10 min. A con inuación, las células se ol ie on a la a dos eces con PBS pa a elimina el 88 exceso de Hoechs ® 33342 y se ija on con PFA (4% p/ en PBS) du an e 20 min. Finalmen e, las células se la a on dos eces con PBS y se mon a on en un po aobje os con PBS:glice ol (20:80) pa a se obse adas en el mic oscopio con ocal de ba ido láse (CLSM)(Zeiss LSM 410, LSM Tech, E e s, EE.UU.) con el so wa e (Image B owse ZEN con ocal Zeiss) pa a la o mación de imágenes. Las células sin NPs ue on u ilizadas como con ol. Análisis cuan i a i o po ci ome ía de lujo Pa a con i ma cuan i a i amen e los esul ados ob enidos en los ensayos cuali a i os, la cap ación celula se es udió po ci ome ía de lujo. Pa a ello, p e iamen e las células se cul i a on en ascos de cul i o de 25 cm2 (Nunclon®; The mo Scien i ic, Wal ham, EE.UU.) has a alcanza un 80% de con luencia (ap oximadamen e 2.5 x 106 células). En onces, el medio se e i ó y las células se incuba on con la suspensión de NPs ca gadas con NR ( uncionalizadas con T o T Rp y no uncionalizadas) (50 µg/mL en medio sin FBS) du an e 30 min. Pasado el iempo de incubación, la suspensión ue e i ada y las células ue on la adas dos eces con PBS pa a elimina las pa ículas no in e nalizadas de la suspensión de NPs. Las células se le an a on con ipsina-EDTA (1 mL) du an e 3 min. Después, se la a on 2 eces con PBS y se ija on con PFA al 4% p/ en PBS du an e 15 min. Po úl imo, pa a elimina el PFA, las células se la a on dos eces con PBS po cen i ugación y la suspensión celula esuspendida se añadió a ubos de ci ome ía. La can idad de NPs luo escen es en el in e io de las células ue medida po 89 ci ome ía de lujo (FC 500 Cy omics MPL; Beckman Coul e Inc., B ea, EE.UU.) y los da os se analiza on con el so wa e MXP. Es udios de pe meabilidad a a és de un modelo de BHE in i o Modelos de BHE in i o Los modelos de BHE in i o su gen con la idea de educi el empleo de animales pa a e alua la pe meabilidad de la misma y acili a los es udios in i o de anspo e de á macos y la isiopa ología de las células que componen la ba e a (Helms e al. 2016). Sin emba go, la me a es desa olla un modelo con unas ca ac e ís icas que ep oduzcan de la mane a más ajus ada posible la si uación in i o ya que no exis e un modelo de ba e a pe ec o que posea las mismas ca ac e ís icas que los modelo in i o (Czupalla, Liebne , and De aj 2014). La Resis encia Eléc ica T ansepi elial (TEER) es una medida de la impedancia de la ba e a a las sus ancias que p e enden alcanza el ce eb o, nos in o ma de la obus ez de la memb ana y puede medi se colocando un elec odo en el lado apical (sang e) y el o o en la pa e basola e al (ce eb o). De mane a gene al, se emplean líneas celula es inmo ales pa a supli el uso de células ce eb ales p ima ias humanas (di ícilmen e accesibles) que pueden ob ene se de di e en es especies. Las líneas inmo ales, en e las que se incluye la línea celula humana hCMEC/D3 u ilizada en es e es udio, o man monocapas de células con alo es de TEER comp endidos en e 20-200 Ω·cm2, muy in e io a los alo es de TEER in i o (>1000 96 seguido de PFA al 4% en PBS. El ce eb o y el bazo (como ó ganos con ol) ue on ex aídos y se almacena on du an e al menos dos días en saca osa (usado como c iop o ec o ) al 30% en PBS a 4º C. T anscu ido es e iempo, se usó un mic ó omo de congelación pa a co a los ejidos en secciones de 40 µm. En cuan o a los ce eb os, se mon a on es secciones po animal, co espondien es a los ni eles an e io , medio y pos e io con un medio de mon aje que con enía P- enilendiamina (como neu alizado de adicales lib es). Los po aobje os se obse a on con un mic oscopio con ocal Leica SP5 (Leica, Mannheim, Alemania) usando un obje i o de inme sión en glice ol 63X (N.A. 1.3) en combinación con un zoom de 2.4X ( amaño de píxel de 100 nm). Las imágenes en se ie de planos Z (0,46 μm) se cap u a on con el so wa e LAS con una esolución de 1024 po 1024 píxeles. Análisis ci o luo imé ico En el momen o del sac i icio, los animales ue on sac i icados po dislocación ce ical y los ó ganos (ce eb o y bazo) se disecciona on ápidamen e y se homogeneiza on en PBS usando un mezclado de mano. Después de la cen i ugación pa a elimina los es os, los sob enadan es se il a on a a és de di e en es il os de células (40 μm pa a mues as de ce eb o, 70 μm pa a las del bazo). El il ado se analizó po ci ome ía de lujo empleando un ci óme o FACS Can o I (Bec on Dickinson, San Jose, Cali o nia, EE.UU.), adqui iéndose en e 2x104 y 4x104 e en os. Los da os de 97 ci ome ía de lujo se a a on usando el so wa e FlowJo (T eeS a , Ashland, O egon, EE.UU.). E aluación de la biodis ibución de las NPs en el o ganismo ía nose- o-b ain as adminis ación in anasal Adicionalmen e, en base a los esul ados ob enidos as la adminis ación in a enosa, se lle a on a cabo ensayos de biodis ibución empleando la u a nose- o-b ain, una ía p ome edo a pa a mejo a el acceso nume osos ac i os e apéu icos al SNC. Pa a ello, se e alua on cua o o mulaciones de NPs luo escen es (FITC-PLGA-, FITC-PLGA-PEG, T -FITC-PLGA- y T Rp- FITC-PLGA-NPs), encapsulando FITC como luo ó o o en es as o mulaciones de NPs. Las pa ículas polimé icas se ca ac e iza on po su amaño, PdI y po encial ze a. Pa a el ensayo, odas las o mulaciones se adminis a on a a és de la u a nose- o-b ain empleando la adminis ación in anasal usando una mic opipe a, adminis ando un olumen o al de 15 µL (7.5µL en cada osa nasal) de la suspensión de las pa ículas en es udio. Las NPs se esuspendie on en sue o isiológico es é il (ap oximadamen e 30 mg/kg) y se adminis a on a azón de 2.5 µL con in e alos de 3 minu os en e cada adminis ación, en osas nasales al e nas. An es de la adminis ación, los animales ue on anes esiados median e inyección in ape i oneal con una mezcla de ke amina (15% / ) y mede omidina (10% / ). Vein e animales ue on 98 di ididos en cinco g upos (4 animales po g upo). Los g upos 1, 2, 3 y 4 se a a on con las pa ículas luo escen es (FITC-PLGA-, FITC-PLGA-PEG, T -FITC-PLGA- y T Rp-FITC-PLGA-, espec i amen e). Un quin o g upo se u ilizó como g upo con ol, a ándose con PBS en las mismas condiciones. T as 30 minu os, a los a ones se les ealizó una pe usión con PBS es é il pa a limpia los ó ganos y ejidos de sang e y, educi así las posibles in e e encias en el ci óme o con las células sanguíneas. Después co azón, ce eb o, iñones, pulmones, bazo e hígado ue on ecogidos y conse ados congelados en una solución de saca osa al 30%, usado como c iop o ec o . Adicionalmen e, se añadió un g upo de animales con el in de e alua la luo escencia o al p o enien e de las NPs que llega ía al ce eb o en caso de que odas las NPs alcanza an el ejido. Pa a ello, los a ones ue on anes esiados con una mezcla de ke amina (15% / ) y mede omidina (10% / ) y pe undidos con PBS es é il. T as es o, se ex aje on los ce eb os y se inyec a on con la dosis o al de cada ipo de pa ículas (FITC-PLGA-, FITC-PLGA-PEG, T -FITC-PLGA- y T Rp-FITC-PLGA NPs) adminis ada en los ensayos de nose- o-b ain, con el in de comp oba la luo escencia de la mues a o al. Pa a el análisis, los ejidos se homogeneiza on en 1 mL de PBS empleando un homogeneizado P ecellys 24® (Be in Ins umen s, Mon igny-le-B e onneux, F ancia) y el homogeneizado se il ó con il os celula es de 70µm (BD Falcon, Co ning, Nue a Yo k, EE.UU.). Todas las mues as se analiza on 99 median e ci ome ía de lujo (Cy omics FC 500 MPL; Beckman Coul e , EE. UU.). 100 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Es udios de ca ac e ización de las NPs p epa adas La sín esis de NPs se lle ó a cabo po el mé odo de e apo ación del disol en e de una emulsión siguiendo los pasos desc i os en la sección 2.2.1. de Ma e iales y Mé odos y ue on ca ac e izadas po su amaño, índice de polidispe sión, po encial ze a, mo ología, e icacia de encapsulación y ca ga de á maco. La emulsión ob enida no p esen ó ines abilidad ni o mación de ag egados du an e el iempo de e apo ación de disol en e. T as la conjugación con ambos ligandos, se es udió la e icacia de conjugación y las NPs se ol ie on a ca ac e iza po amaño, dis ibución de amaños y po encial ze a pa a e alua la in luencia de la conjugación supe icial. De e minación del amaño medio y dis ibución de amaños El amaño y la dis ibución de amaños de las NPs se de e mina on po dispe sión láse . Los esul ados ob enidos se exp esan como el alo del amaño medio (diáme o hid odinámico) y su des iación es ánda (DE). Va ias elocidades de homogeneización ue on es adas en el homoginazado de al a elocidad Poly on® pa a e alua la in luencia de la misma en el amaño de las NPs. Finalmen e, la elocidad se es ableció en 24.000 pm pa a odas las o mulaciones al no obse a se di e encias cuando se aumen aba la elocidad has a 30.000 pm (da os no mos ados). 101 T as el análisis de las mues as, las NPs mos a on un diáme o hid odinámico no supe io a 230 nm y un PdI in e io a 0.2 en odas las o mulaciones, indicando que los sis emas elabo ados son ampliamen e monodispe sos (PdI < 0.2)(S e e eld, McKenna, and Pa el 2016) (Tabla 2). Fo mulación Diáme o medio ± DE (nm) PdI ± DE PLGA NPs 192.1 ± 6.7 0.128 ± 0.033 T - PLGA NPs 228.8 ± 1.3 0.104 ± 0.029 T Rp-PLGA NPs 222.6 ± 1.2 0.078 ± 0.053 VLX+PLGA NPs 194.3 ± 3.7 0.106 ± 0.018 VLX+T -PLGA NPs 218.6 ± 0.5 0.078 ± 0.008 VLX+T Rp-PLGA 216.3 ± 2.7 0.067 ± 0.025 Tabla 2. Tamaño medio y dis ibución de amaño de NPs blancas y ca gadas ( uncionalizadas y no uncionalizadas) (n=9; DE = des iación es ánda ; PdI: índice de polidispe sión). Según los da os de la abla, el amaño medio de las NPs de PLGA blancas ue de 192.1 ± 6.7 nm y su PdI ue 0.128 ± 0.033, lo que se aduce en una al a homogeneidad de la población. También se es udió la in luencia de la ca ga de á maco y la p esencia de ligandos en la supe icie de las pa ículas en el amaño de las pa ículas. Las NPs ca gadas con VLX mos a on un amaño medio de 194.3 ± 3.7 nm y una dis ibución de amaños media de 0.106 ± 0.018. G á icamen e, los esul ados pueden obse a se en las igu as 11 y 12. 102 Figu a 11. His og amas de los amaños de las o mulaciones de NPs blancas, uncionalizadas y sin uncionaliza ( ojo: NPs blancas; e de: NPs uncionalizadas con T ; azul: NPs uncionalizadas con T Rp) Figu a 12. His og amas de los amaños de las o mulaciones de NPs ca gadas con á maco, uncionalizadas y sin uncionaliza ( ojo: NPs no uncionalizadas; e de: NPs uncionalizadas con T ; azul: NPs uncionalizadas con T Rp) Pa a log a alcanza el ce eb o as a a esa la BHE, la supe icie de las NPs se uncionalizó con dos ligandos especí icos del ecep o de T . De acue do con la li e a u a publicada, las NPs conjugadas exhibie on un lige o inc emen o de amaño medio (11- 13%) compa ada con las NPs no uncionalizadas. Dicho inc emen o puede explica se po la p esencia de las biomoléculas en la supe icie (Ulb ich e al. 2009)(Pi ek e al. 2012). Pa a las NPs p epa adas pa a la isualización de los ensayos celula es in i o, se encapsuló NR como luo ó o o. La misma endencia que pa a las pa ículas p epa adas con el ac i o se obse a con es e ipo de pa ículas, exhibiendo un lige o aumen o de amaño cuando se modi icaban supe icialmen e (Tabla 3). 103 Fo mulación Diáme o medio ± DE (nm) PdI ± DE NR+PLGA NPs 215.6 ± 2.2 0.048 ± 0.022 NR+T -PLGA NPs 234.9 ± 1.5 0.078 ± 0.053 NR+T Rp-PLGA NPs 228.8 ± 4.8 0.092 ± 0.071 Tabla 3. Tamaño medio y dis ibución de amaño de NPs de NR ( uncionalizadas y no uncionalizadas) (n=9; DE = des iación es ánda ; PdI: índice de polidispe sión). Pa a los ensayos de pe meabilidad in i o de las NPs, se p epa a on NPs luo escen es empleando FITC como luo ó o o. Pa a ello, el políme o se conjugó con el luo ó o o al y como se desc ibe en el apa ado 4.2.4. Como paso p e io a la p epa ación de las pa ículas y con el in de e alua el endimien o de asociación en e el políme o y FITC, se cons uyó una cu a de calib ación (0- 2 μg / mL) (R2 = 0,998). Después del p oceso de conjugación, se ob u o un endimien o de asociación del 2.390%, lo que supone 0,956 μg de FITC po mg de políme o. Las NPs de FITC-PLGA se p epa a on median e DE-SEV siguiendo el mismo p ocedimien o que pa a las nanopa ículas ca gadas con á maco (sin inclui el ac i o) y se uncionaliza on empleando el mé odo de ca bodiimida (desa ollado en el apa ado 4.2.2). Los amaños ob enidos as la p epa ación se mues an en la abla 4. 104 Fo mulación Diáme o medio ± DE (nm) PdI ± DE cFITC-PLGA NPs 203.6 ± 1.9 0.068 ± 0.018 T -cFITC-PLGA NPs 210.3 ± 1.2 0.040 ± 0.033 T Rp-cFITC-PLGA NPs 207.3 ± 0.8 0.034 ± 0.023 Tabla 4. Tamaño y dis ibución de amaños de las pa ículas luo escen es de cFITC-PLGA ( uncionalizadas y no uncionalizadas) (n = 9; DE: des iación es ánda ; PdI: índice de polidispe sión; cFITC: FITC conjugado). Igual que ocu e con las o mulaciones no luo escen es, las NPs aumen an de amaño lige amen e (2-4%) cuando son supe icialmen e modi icadas con los ligandos especí icos. Po úl imo, pa a los ensayos de biodis ibución in i o, además de las NPs de PLGA ( uncionalizadas con ambos ligandos y sin uncionaliza ), se p epa a on pa ículas luo escen es PEGiladas con FITC, usando el políme o PLGA-PEG. En es e caso, el luo ó o o ue encapsulado (no conjugado) pa a e i a in e e encias en la supe icie con las cadenas de PEG. También p esen es en la supe icie. Los esul ados se mues an en la abla 5. Fo mulación Diáme o medio ± DE (nm) PdI ± DE FITC+PLGA NPs 189.5 ± 3.8 0.025 ± 0.023 FITC+T -PLGA NPs 205.4 ± 1.3 0.025 ± 0.023 FITC+T RpPLGA NPs 202.4 ± 3.9 0.058 ± 0.015 FITC+PLGA-PEG NPs 231.2 ± 3.2 0.154 ± 0.007 Tabla 5. Tamaño y dis ibución de amaños de las pa ículas luo escen es de FITC encapsulado ( uncionalizadas y no uncionalizadas) (n = 9; DE: des iación es ánda ; PdI: índice de polidispe sión). 105 Todas las o mulaciones de NPs p epa adas pa a es e ensayo mos a on una es echa dis ibución de amaños, lo que indica el al o g ado de homogeneidad de las NPs p epa adas. Las NPs luo escen es sin uncionaliza mos a on un amaño in e io a 200 nm que, as la uncionalización, aumen a on lige amen e de amaño (6-8%). Sin emba go, las NPs PEGiladas exhibie on un amaño mayo , po encima de 230 nm de diáme o. T as el análisis de es os esul ados, se puede esumi que, siguiendo los p o ocolos desa ollados en los co espondien es apa ados de Ma e iales y Mé odos, odas las o mulaciones elabo adas mues an índice de polidispe sión in e io a 0.2 lo que indica un al o g ado de homogeneidad. Las o mulaciones de NPs sin modi icación supe icial des inada a los ensayos de biodis ibución in i o así como las ca gadas con VLX mos a on amaños in e io es a 200 nm, po lo que se conside an adecuadas pa a es e ipo de adminis ación ya que, según la li e a u a publicada (Tong, Qin, and Sun 2017), pa ículas con amaño in e io a 200 nm son capaces de alcanza el sis ema ne ioso cen al de mane a más e icien e. De e minación de la ca ga eléc ica supe icial de las NPs El po encial ze a de las pa ículas es á elacionado con la ca ga eléc ica supe icial de las mismas. El alo de dicho pa áme o puede in lui en sus p opiedades isicoquímicas, en e las que des aca la es abilidad del sis ema o la in e acción con o os compues os ca gados. Po lo an o, jun o con amaño y dis ibución 112 Figu a 14. Valo es de e icacia de encapsulación (EE%) y ca ga de á maco ob enidos pa a pa ículas p epa adas con di e en e concen ación inicial de á maco (n=9; ba as de e o = des iación es ánda ). En unción de los esul ados ob enidos has a el momen o, se seleccionó aquella o mulación p epa ada con la mayo concen ación de ac i o pa a con inua con los es udios pos e io es. Ambos pa áme os ambién se e alua on as el p oceso de uncionalización supe icial pa a de e mina si se p oducía una libe ación del á maco du an e el iempo de incubación. T as el análisis de HPLC, las mues as no mos a on una libe ación de á maco a concen aciones de ec ables po el equipo. Análisis de la e icacia de uncionalización Una modi icación supe icial e ec i a es un equisi o indispensable pa a log a una in e acción ligando- ecep o 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 70 80 5% 10% 15% 20% 25% Ca ga de á maco (% p/p) EE (%) Concen ación inicial de á maco (%p/ ) EE% Ca ga de á maco (%) 113 adecuada. Po an o, pa a e alua la can idad de ligando unida a la supe icie de las pa ículas, se empleó un mé odo colo imé ico basado en la abso bancia que pe mi e de ec a moléculas p o eicas en unción de su concen ación en el medio pa a e alua la e ec i idad de la unión co alen e en e políme o cuando la supe icie de las pa ículas su ía la ac i ación de sus g upos uncionales. De mane a adicional, se es udió la modi icación supe icial sin la p e ia ac i ación de los g upos ca boxilo, con el in de comp oba que los ligando se unían co alen emen e en luga de queda adso bidos en la supe icie. La can idad de ligando conjugado supe icialmen e se de e minó median e el mé odo de BCA (desa ollado en el apa ado 4.2.8) de mane a indi ec a, es deci , midiendo la p esencia de ligando lib e no unido en el sob enadan e de la suspensión de pa ículas as la incubación con el ligando. En las pa ículas modi icadas con T , se conjugó ap oximadamen e 7.5-8 µg de T po mg de pa ícula, lo que equi ale a una e icacia de conjugación (EC%) de 75 – 80% mien as que pa a las modi icadas con T Rp es e alo ue de 7 µg de pép ido po mg de NPs (al ededo del 70% de e icacia). Dichos alo es no di i ie on en e las o mulaciones ca gadas con á maco y las no ca gadas. En cuan o a las pa ículas luo escen es con NR empleadas en los es udios celula es in i o, la can idad media de T y T Rp conjugado se con i mó con el mismo mé odo que pa a las NPs no luo escen es. En es e caso, se de ec ó al ededo de 6.5 µg de T y 114 5.5 µg de pép ido po mg de nanopa ícula. Dichos alo es suponen, de mane a ap oximada, un 67% y 56% de e icacia de conjugación, espec i amen e. Pa a las pa ículas luo escen es p epa adas con el conjugado PLGA-FITC, as la conjugación con T se ob u o una e icacia de conjugación en o no al 85%, que se co esponde con, ap oximadamen e 8.5 µg de ligandos po mg de nanopa ícula. Pa a aquellas pa ículas uncionalizadas con T Rp, se ob u o al ededo de 8 µg de ligando po mg de nanopa ícula, ob eniéndose esul ados simila es cuando el FITC ue encapsulado. Finalmen e, cuando la modi icación supe icial se p obó sin la p e ia ac i ación de la supe icie de las nanopa ículas, ls e icacia de encapsulación esul ó baja (in e io al 30%) y no ep oducible compa ada con la mos ada po las pa ículas ac i adas p e iamen e. Po an o, a aíz de los esul ados ob enidos, se concluye que pa a odas las o mulaciones, se log an, al as e icacias en el p oceso de uncionalización (po encima de 60%, de mane a gene al). Es udio de la in luencia de la congelación en las NPs. Op imización de las condiciones de lio ilización Dado que an o la congelación como la lio ilización son p ocesos ag esi os pa a la es abilidad de las pa ículas, es necesa io es ablece las condiciones óp imas pa a ambos p ocesos y man ene la in eg idad mo ológica de las o mulaciones. En es e caso, es de i al impo ancia man ene amaños muy simila es a los 115 mos ados po las NPs escas debido a que el acceso de las mismas al ce eb o es á limi ado po su amaño. Pa a log a lo, es necesa io la adición de un c iop o ec o que conse e la o mulación in ac a y, pa a ello, se lle ó a cabo un es udio cuya inalidad ue de e mina la concen ación óp ima del mismo en disolución, e aluándose la es abilidad de las pa ículas as la congelación y/o lio ilización (- 80±0.5ºC, 0.057 mBa , C yodos-50, Tels a Indus ial, Te asa, España). La ealosa es uno de los c iop o ec o es más empleados pa a la conse ación de las pa ículas y el elegido pa a es e es udio. La p opo ción de ealosa:NPs empleadas en el es udio ue on 1:1.5, 1:3, 1:9 y 1:5, pa a la esuspensión de las o mulaciones p e ia a los p ocesos de congelación-lio ilización. La ealosa se adicionó en solución acuosa y, adicionalmen e se ensayó el e ec o cuando las pa ículas e an esuspendidas en agua (sin c iop o ec o ). En la igu a 15 se mues a el e ec o de la adición de di e en es concen aciones de ealosa en el amaño y la dis ibución de amaños de las NPs as un p oceso de congelación. 116 Figu a 15. E ec o de la adición de di e en es concen aciones de ealosa en el amaño y dispe sión de las pa ículas as un p oceso de congelación. Como se obse a en la igu a 15, sólo aquellas pa ículas congeladas en una p opo ción ealosa:NPs man u ie on an o un amaño como una dis ibución de amaños p ác icamen e iguales a las NPs escas. Las NPs esuspendidas en el es o p opo ciones ealosa:NPs aumen a on lige amen e su amaño y, en de e minados casos ( ealosa:NPs 1:3) el PdI aumen ó de mane a signi ica i a lo que indica que, aunque el amaño no aumen e des acadamen e, se a a de una mues a polidispe sas con ca ác e he e ogéneo. Las mues as esuspendidas en agua aumen a on su amaño de mane a signi ica i a, así como su índice de polidispe sión, esal ando la necesidad de la inclusión de un c iop o ec o en el medio de suspensión de las NPs pa a conse a los amaños de las o mulaciones. 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 PdI Tamaño (nm) Medio de suspensión Tamaño PdI 117 De mane a ilus a i a, la igu a 16 mues a los his og amas de los amaños y dis ibución de amaños ob enidos pa a las NPs an es de la congelación, as la congelación sin c iop o ec o y después del p oceso con di e en es concen aciones de c iop o ec o . Como se puede obse a , sólo las pa ículas congeladas con una p opo ción de ealosa:NPs de 1:1.5, man ienen un amaño p ác icamen e igual al que p esen aban an es de la congelación. Figu a 16. His og amas de amaños pa a las NPs después de un p oceso de congelación esuspendidas en di e en es medios. Pa a es udia la in luencia de la adición de c iop o ec o a las o mulaciones sob e el p oceso de lio ilización, se lle ó a cabo el mismo es udio, ep esen ado en la igu a 17. 118 Figu a 17. In luencia de la adición de di e en es concen aciones de ealosa en el amaño medio de las pa ículas as un p oceso de lio ilización. En es e caso, y de o ma simila al es udio del e ec o de la congelación, aquellas pa ículas lio ilizadas con una p opo ción de ealosa:NPs 1:1.5 man u ie on un amaño muy simila al de las pa ículas escas. El es o de o mulaciones exhibie on un aumen o de amaño, con alo es al os de polidispe sión que se aducen en un aumen o de la he e ogenidad de la mues a. Tal y como se expone en el caso an e io , la igu a 18 ilus a los esul ados del es udio a a és de los his og amas ob enidos as el p oceso de lio ilización pa a odas las condiciones, y como se ap ecia, el his og ama pe enecien e a las NPs lio ilizadas con una p opo ción de ealosa:NPs de 1:1.5 coincide con el 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 PdI Tamaño (nm) Medio de suspensión Tamaño PdI 119 co espondien e p e io a la lio ilización. Pa a ambos ensayos, el es udio de la in luencia de c iop o ec o se midió con un Ze asize ZS90 (Mal e n Ins umen s). Figu a 18. His og amas de amaños pa a las NPs después de un p oceso de lio ilización esuspendidas en di e en es medios. Po an o, según los esul ados ob enidos, se es ablece que la p opo ción óp ima de ealosa:NPs pa a man ene la in eg idad mo ológica de las NPs es de1:1.5. Es udio de libe ación in i o Los p incipales mecanismos de libe ación de á macos desde pa ículas polimé icas son: (a) e osión de la supe icie de la ma iz polimé ica, (b) o u a de los enlaces en e monóme os y (c) di usión del á maco encapsulado o en la supe icie de la pa ícula a a és de po os o a a és de la ma iz polimé ica. Gene almen e, cuando se a a de políme os hid ó obos, la libe ación es á gobe nada p incipalmen e po la e osión, no obs an e, la libe ación del á maco suele da se po una combinación de los es mecanismos (Kamaly e al. 2016). De acue do con F edenbe g e al. (F edenbe g e al. 2011), nume osos ac o es como las in e acciones en e moléculas de ac i o y á maco-políme o o la abso ción de agua, pueden in lui 120 en la elocidad de libe ación y el compo amien o ciné ico de los á macos encapsulados en pa ículas polimé icas de PLGA. Los pe iles de libe ación de VLX encapsulada en NPs (5,5% de ca ga de á maco) polimé icas de PLGA es án ep esen ados en la igu a 19. Figu a 19. Pe iles de libe ación in i o pa a NPs no modi icadas y modi icadas supe icialmen e (n=3: ba as de e o :DE). T as 30 minu os, las NPs ca gadas con VLX mues an una libe ación ma cada (sob e el 23%) a pH isiológico (pH 7.4) lo que puede se a ibuido al ca ác e hid o ílico del ac i o. La libe ación con inúa de o ma g adual has a las 48 h. Al inal del es udio, el po cen aje de á maco libe ado es, supe io al 90%, mien as que pa a las NPs uncionalizadas el % de á maco libe ado ue in e io al 85% anscu idas las 48 h. Tomando las NPs no uncionalizadas como e e encia, la p esencia de ligandos en la supe icie de las pa ículas puede conlle a un descenso en la asa de libe ación cuando se compa an con pa ículas no modi icadas supe icialmen e (Zhu, Zhang, and Yu 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 00,5 24812 24 48 Libe ación de á maco (%) Tiempo (h) VLX+PLGA NPs VLX+T -PLGA NPs VLF+T Rp PLGA NPs 121 2017). Así, pa a cada iempo es ablecido, se obse a una disminución de la libe ación, que puede es a asociada a la p esencia de una “ba e a adicional” o mada po los ligandos de la supe icie. Es abilidad de las NPs en líquido ce alo aquídeo Los sis emas nano anspo ado es de á macos de ipo polimé ico son excelen es pla a o mas pa a la libe ación con olada del ac i o. Dicha libe ación puede ex ende se ho as, días o semanas (Be ocoso e al. 2017) en unción del ipo de políme o empleado po ello, es de i al impo ancia es udia la es abilidad de las pa ículas en los luidos biológicos a lo la go del iempo. En es e abajo, la es abilidad se e aluó en el luido de mayo p esencia en el sis ema ne ioso cen al, el líquido ce alo aquídeo du an e 24 h con el in de ga an iza amaños e índices de polidispe sión simila es as el iempo de incubación cuando las NPs sean empleadas pa a los ensayos in i o. El es udio se lle ó a cabo a 37 ºC y, como se esume en la Fig. 20, odas las o mulaciones es udiadas mos a on al a es abilidad con amaños e índices de polidispe sión semejan es a los obse ados an es de las 24 h de incubación, demos ando que las pa ículas pueden emplea se con ga an ía en aplicaciones in i o. 128 Con el in de con i ma el es udio isual y alo a de mane a cuan i a i a la cap ación celula , se empleó la ci ome ía de lujo. Pa a ello, 1 mL de los di e en es ipos de NPs (50 µg/mL) se incuba on du an e 30 minu os con las células hCMEC y las células sin NPs ue on usadas como con ol nega i o. Como ilus a la igu a 23, la in ensidad de luo escencia es mayo pa a las NPs uncionalizadas ( igu as 23C-23D) en compa ación con las NPs sin uncionaliza , sin emba go, en conco dancia con los es udios cuali a i os, el alo más in enso de luo escencia se alcanzó as la incubación con NPs modi icadas supe icialmen e con T Rp. El aumen o de la cap ación celula in i o de NPs uncionalizadas con di e en es ligandos como p o eínas, pép idos, an icue pos, ap áme os o políme os ha sido p e iamen e in o mado po o os in es igado es (Hu e al. 2011)(Huang e al. 2017)(Ca oll e al. 2010)(Tosi e al. 2007)(Monaco e al. 2017)(J. Guo e al. 2011). 129 Figu a 23. His og amas ob enidos as el es udio cuan i a i o de la luo escencia po ci ome ía de lujo en las células hCMEC/D3 as 30 minu os de incubación con di e en es o mulaciones de NPs ca gadas con NR. (A) Con ol (células sin NPs); (B) NPs de PLGA no modi icadas supe icialmen e; (C) NPs de PLGA modi icadas con T ; (D) NPs de PLGA modi icadas con T Rp. Po an o, como esumen de es a sección se puede conclui que ambos es udios espaldan la hipó esis de que la uncionalización con ligandos especí icos pa a ecep o es localizados en el luga de acción puede con ibui a mejo a la in e acción célula-nanopa ícula, p omo iendo así la cap ación celula de las mismas po endoci osis mediada po ecep o . Es udios de pe meabilidad a a és de un modelo de ba e a in i o La BHE es uno de los p incipales obs áculos que deben supe a los ac i os a macéu icos pa a accede al SNC. Dicha 130 ba e a p o ege al ce eb o de la en ada de sus ancias pa ógenas pe o, al mismo iempo limi a el ing eso de nume osos á macos. Po an o, aunque la pe meabilidad a a és de la misma puede e se a ec ada po nume osas en e medades como el in a o ce eb al, la escle osis múl iple, epilepsia o umo es ce eb ales (Weiss e al. 2009), la p esencia de la misma supone una di icul ad pa a el a amien o de los as o nos neu ológicos. Pa a e idencia la llegada de las NPs y á maco al ce eb o a a és de la BHE, se desa olló un modelo de ba e a in i o de ipo monocul i o empleando las mismas células endo eliales empleadas pa a los ensayos de cap ación celula . 4.1.1.1 Modelo in i o de BHE Pa a de e mina la in eg idad y la calidad de la BHE, se midió la esis encia ansendo elial eléc ica (TEER) cada dos días, du an e 8 días. Es e pa áme o es esencial pa a asegu a unas ca ac e ís icas ap opiadas de ba e a y e i a alsos posi i os (S ab e al. 2016). 131 Figu a 24. Valo es de TEER de las células hCMEC/D3 cul i adas en inse os T answell de 0.4 µm pa a ambos expe imen os. (n=9) (ba as de e o :DE) T as la cons ucción de la ba e a, el día del expe imen o (8º día) los alo es de TEER oscila on en e 110-120 Ω*cm2. Dichos alo es esul an adecuados ya que, de acue do con la li e a u a publicada, es os alo es son su icien es pa a es udia la pe meabilidad de los ac i os a macéu icos ya que, alo es de TEER po encima de 150 Ω*cm2 no in e ie en en la pe meabilidad del á maco, no se aduce necesa iamen e en una disminución de la misma cuando se emplean modelos monocul i os (Wilhelm and K izbai 2014). Pasado el iempo de incubación (en medio de cul i o) de las di e en es o mulaciones de NPs en el modelo de ba e a in i o, la TEER se midió de nue o pa a e i ica que la ba e a se man iene in ac a, mos ando la misma in eg idad y calidad que al inicio del expe imen o. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 2 4 6 8 TEER (Ω*cm2) Tiempo (días) Valo es de TEER pa a modelo de pe meabilidad de FITC-PLGA NPs Valo es de TEER pa a modelo de pe meabilidad de VLX+PLGA NPs 132 Los alo es de TEER (p e- y pos -incubación) pa a ambos expe imen os es án ep esen ados en la igu a 25. Figu a 25. Valo es de TEER pa a ambos expe imen os de pe meabilidad (NPs y á maco) an es y después de la incubación con las NPs. Como puede dilucida se, a pa i de la igu a 25, la in eg idad de la ba e a no se io a ec ada as el con ac o con las di e en es o mulaciones de NPs, po lo que se de e mina que la TEER se man iene du an e odo el expe imen o y los esul ados de pe meabilidad son iables. La p incipal en aja de los modelos endo eliales de ba e a de ipo monocul i o es la simplicidad (Wilhelm and K izbai 2014), sin emba go, pueden mos a alo es bajos de TEER debido a la ausencia de pe ici os, as oci os y o os elemen os de la unidad neu o ascula . Pa a sol en a lo, pueden emplea se modelos co- cul i os pe o és os p esen an nume osas des en ajas ya que no man ienen el ambien e neu onal de mane a pe manen e y 0 20 40 60 80 100 120 140 Ensayo de pe meabiliad de NPs de FITC-PLGA Ensayo de pe meabiliad de NPs ca gadas con VLX Valo es de TEER p e-incubación Valo es de TEER pos -incubación 133 mani ies an baja ep oducibilidad, son más cos oso y su ca ac e ización es compleja (Kaisa e al. 2017). Po lo an o, los modelos monocul i os esul an más adecuados y ú iles pa a ealiza e aluaciones p elimina es de pe meabilidad de á macos a a és de la BHE (Wol e al. 2015). Inicialmen e, según el p ocedimien o desc i o en la sección 3.2.12.3.2 se midió la in ensidad de luo escencia y se calculó el po cen aje de NPs en el lado basola e al (Figu a 26). Pa a ello, se omó como e e encia de luo escencia o al la mos ada po la misma concen ación de los di e en es ipos de pa ículas luo escen es (3 mg/mL) añadida di ec amen e al lado basola e al. Se asume que dicha concen ación supone el 100% de luo escencia si odas las NPs a a esa an la ba e a. Los esul ados se p esen an como po cen aje de pa ículas en unción del po cen aje de luo escencia mos ado po la concen ación o al. La pe meabilidad se e aluó as 1, 6, 8, 12 y 24 h. 134 Figu a 26. Po cen aje de NPs luo escen es ( uncionalizadas y no uncionalizadas) en el lado basola e al despúes de los iempos p ede e minados. Tal y como se obse a en el g á ico, las NPs uncionalizadas con el T Rp mos a on una capacidad mayo pa a a a esa la BHE. Tal y como se demos ó en los ensayos in i o de cap ación celula , las NPs uncionalizadas con T Rp ue on las que exhibie on la mayo capacidad de cap ación, lo que pod ía explica es a mayo habilidad pa a a a esa la ba e a. Pa a odas las o mulaciones, el po cen aje de pa ículas luo escen es aumen ó a lo la go del iempo en la pa e basola e al. A las 24 h, ap oximadamen e el 45% de las NPs luo escen es uncionalizadas con T Rp a a esa on la ba e a del modelo. Se ealizó un análisis mul i ac o ial pa a e i ica el e ec o sob e la pe meabilidad de las NPs de ambos ac o es, an o el ipo de o mulación es ada como el iempo p e ijado pa a lee la luo escencia. Los esul ados mues an un e ec o signi ica i o sob e 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1 6 8 12 24 h Tiempo (ho as) FITC-PLGA NPs T -cFITC-PLGA NPs T Rp-cFITC-PLGA NPs 135 la pe meabilidad cuando se emplean di e en es o mulaciones, F (3, 75) = 186.549 y p <0.001 y di e en es iempos, F (4, 75) = 3838.531 y p <0.001. Así mismo, se obse ó una in e acción signi ica i a en e ambos ac o es (F (8, 75) = 34.078), indicando que la in luencia de la a iable iempo sob e la pe meabilidad es di e en e pa a las di e en es o mulaciones ensayadas. Pa a la e aluación de la pe meabilidad del á maco, el mismo p o ocolo ue lle ado, aunque, en es e caso, el ensayo se ex endió has a las 72 h con el in de e alua la posible inducción de la glicop o eína-P po pa e del ac i o. T as la incubación con las NPs ca gadas con VLX sin uncionaliza y uncionalizadas y VLX lib e (añadida en la misma concen ación que la encapsulada en NPs), alos iempos p e ijados (1, 6, 8, 12, 24, 48 y 72 h), se midió la concen ación de á maco en el lado basola e al. Pa a ese in, se empleó un mé odo doble de c oma og a ía líquida de al a p esión y espec ome ía de masas (UHPLC-MS/MC), de allado en el apa ado 4.2.12.4.2. El compo amien o obse ado en el ensayo de pe meabilidad es simila al que se de e minó en el es udio de libe ación. Aunque las pa ículas uncionalizadas con el pép ido demos a on una mayo capacidad pa a alcanza la pa e basola e al, mues an la libe ación más len a de á maco (Figu a 27). De acue do con Zhu e al. (Zhu, Zhang, and Yu 2017), las NPs uncionalizadas mos a on una elocidad de libe ación más len a compa adas con las que no uncionalizadas. 136 Figu a 27. Concen aciones de á maco en lado basola e al de di e en es o mulaciones (VLX lib e, NPs ca gadas con VLX sin uncionaliza y uncionalizadas con T o T Rp). A las 8 y 12 h, la libe ación de á maco a pa i de las NPs uncionalizadas es simila pa a ambas o mulaciones mien as que la mayo di e encia se encuen a a las 24 h. Bachmeie e al (Bachmeie e al. 2011), demos a on que a de e minadas concen aciones (1 - 50 µM), la VLX es un induc o de las bombas de e lujo como la glicop o eína-P. Un compo amien o semejan e se demues a en es e es udio ya que, as alcanza se una concen ación de á maco lib e supe io a 1 µM en el lado basola e al (24 h), se obse a un descenso en la concen ación de ac i o en dicho compa imen o (48 y 72 h). Dicho descenso puede es a mo i ado po la acción de la glicop o eína-P, que, as se inducida p o oca la salida del ac i o en sen ido basola e al-apical. 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 1 6 8 12 24 48 72 H Concen ación VLF encapsulada en NPs (µM) Tiempo (ho as) VLF+PLGA NPs VLF+T -PLGA NPs 137 Sin emba go, cuando la VLX es á encapsulada en NPs, la concen ación en el lado basola e al no alcanza concen aciones que p o oquen la inducción de la glicop o eína-P y la concen ación de VLX sigue aumen ando de mane a g adual con el iempo. T as el iempo ensayo (24h pa a en ensayo de pe meabilidad de las NPs y 72 h pa a el de la VLX), se comp obó que los alo es de TEER pe manecie on en e 105-11 Ω·cm2, lo que indica que la in eg idad de la ba e a se man u o y no se io a ec ada po la p esencia de las pa ículas (ni á maco). 4.1.1.2 E aluación de la llegada de las NPs al sis ema ne ioso cen al as adminis ación in a enosa La BHE es una de las ba e as más es ic i as del o ganismo di icul ando el acceso de nume osos ac i os e apéu icos al SNC. T as los esul ados en los es udios p e ios in i o de modelo de ba e a, aquellas pa ículas uncionalizadas con el pép ido ue on las que mos a on una mayo capacidad pa a a a esa la ba e a. Pa a con i ma es os esul ados, se diseñó un ensayo in i o que con i ma a la llegada de las pa ículas uncionalizadas al ce eb o as una adminis ación in a enosa. Pa a ello, se adminis a on nanopa ículas de FITC-PLGA no uncionalizadas y uncionalizadas con T y T Rp en a ones C57bl/6 (12-15 semanas de ida) ía in a enosa en la ena de la cola a una concen ación de 65 o 130 mg/kg de NPs (equi alen es a 9 y 18 mg/kg de VLX, espec i amen e) en una adminis ación aguda y 65 mg/kg de NPs (9 mg VLX) y as se pe undidos ( e apa ado 4.2.13.1), las secciones de ce eb o y bazo se c iba on usando un