Nanopartículas poliméricas para vehiculizar activos farmacéuticos al sistema nervioso central.

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TESIS DOCTORAL NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS PARA VEHICULIZAR ACTIVOS FARMACÉUTICOS AL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL Memoria presentada por la licenciada Mª DOLORES CAYERO OTERO para optar el Título de Doctor por la Universidad de Sevilla. Sevilla, septiembre 2018 Memoria presentada por Mª Dolores Cayero Otero para optar al Título de Doctor por la Universidad de Sevilla Fdo.: Mª Dolores Cayero Otero VºBº Las Directoras del Trabajo Fdo.: Dra Mercedes Fernández Arévalo Fdo.: Lucía Martín Banderas FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FARMACIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA C/ Profesor García González, 2 41012 Sevilla (España) Teléfono: 954 55 67 26 Fax: 954 55 60 85 E-mail: [email protected] http://departamento.us.es/tecnofarma/ C/ Profesor García González, 2 41012 Sevilla (España) Teléfono: 954 55 67 26 Fax: 954 55 60 85 E-mail: [email protected] http://departamento.us.es/tecnofarma/ Índice de contenidos RESUMEN……………………………………………………………………………………………2 1 INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 5 NANOMEDICINA Y NANOTECNOLOGÍA ................................................ 5 1.1.1 NPs como vehículos de fármacos .................................................... 7 1.1.2 Polímeros empleados ........................................................................... 8 BARRERA HEMATOENEFÁLICA (BHE) .................................................. 9 1.2.1 Morfología y funciones de la BHE ................................................ 10 1.2.2 Sistemas de transporte a través de la BHE ............................... 16 ESTRATEGIAS PARA EL DIRECCIONAMIENTO DE ACTIVOS HACIA EL SNC…………………………………………………………………...……………21 1.3.1 Métodos invasivos .............................................................................. 22 1.3.2 Métodos no invasivos ........................................................................ 26 1.3.3 Funcionalización superficial de las NPs..................................... 31 1.3.4 Nose-to-brain ........................................................................................ 48 VENLAFAXINA (VLX) COMO FÁRMACO MODELO .......................... 56 2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 59 3 HIPÓTESIS ................................................................................................................. 61 4 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 63 MATERIALES .................................................................................................. 63 MÉTODOS ........................................................................................................ 66 4.2.1 Preparación de las NPs ..................................................................... 66 4.2.2 Modificación superficial de las NPs de PLGA........................... 70 4.2.3 Preparación de NPS fluorescentes para estudios in vitro de captación celular..................................................................................................... 72 4.2.4 Preparación de las NPs fluorescentes para estudios de permeabilidad ......................................................................................................... 73 4.2.5 Preparación de NPs fluorescentes con FITC encapsulado para estudios de biodistribución ..................................................................... 74 4.2.6 Estudios de caracterización fisicoquímica de las NPs ......... 75 4.2.7 Determinación de la eficiencia de encapsulación y carga de fármaco………………………....………………………………………………………..….77 4.2.8 Determinación de la eficacia de funcionalización ................. 79 4.2.9 Estudio de la influencia de la congelación en las NPs. Optimización de las condiciones de liofilización. ...................................... 80 4.2.10 Estudios de liberación in vitro ....................................................... 82 4.2.11 Estabilidad de las formulaciones de NPs en líquido cefalorraquídeo (LCR) artificial ....................................................................... 83 4.2.12 Estudios celulares in vitro ............................................................... 84 4.2.13 Estudios in vivo en animales de experimentación ................. 95 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 100 Estudios de caracterización de las NPs preparadas .................... 100 5.1.1 Determinación del tamaño medio y distribución de tamaños……. ........................................................................................................... 100 5.1.2 Determinación de la carga eléctrica superficial de las NPs 105 5.1.3 Estudio de la morfología ............................................................... 110 5.1.4 Determinación del contenido en fármaco (VLX) ................ 110 5.1.5 Análisis de la eficacia de funcionalización ............................. 112 5.1.6 Estudio de la influencia de la congelación en las NPs. Optimización de las condiciones de liofilización.................................... 114 5.1.7 Estudio de liberación in vitro ...................................................... 119 5.1.8 Estabilidad de las NPs en líquido cefalorraquídeo ............ 121 5.1.9 Estudios in vitro de toxicidad celular ...................................... 122 5.1.10 Estudios in vitro de internalización celular........................... 124 5.1.11 Estudios de permeabilidad a través de un modelo de barrera in vitro….. ................................................................................................ 129 6 CONCLUSIONS ...................................................................................................... 148 7 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 152 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Esquema de la BHE 11 Figura 2 Representación esquemática detallada de las proteínas que componen las uniones estrechas y adherentes 12 Figura 3 Esquema del receptor de transferrina 18 Figura 4 Principales sistemas de transporte a través de la BHE 21 Figura 5 Esquema del mecanismo de acción de los profármacos a través de la BHE. 27 Figura 6 Representación esquemática de las rutas de acceso al sistema nervioso central por vía intranasal (Nose-to-brain) 51 Figura 7 Principales etapas del método de evaporación del disolvente de una emulsión. 67 Figura 8 Esquema de las reacciones que comprenden la funcionalización de NPs a través del método carbodiimida. 71 Figura 9 Principales estructuras de modelos celulares de barrera. (A) Modelo monocutivo; (B-C) Modelos cocultivo con contacto; (D-E) Moelos cocultivo sin contacto y (F-G) Modelos de cocultivo triple. 91 Figura 10 Representación esquemática del modelo in vitro de BHE empleado en los ensayos de permeabilidad (tipo monocapa). 92 Figura 11 Histogramas de los tamaños de las formulaciones de NPs blancas, funcionalizadas y sin funcionalizar. 102 Figura 12 Histogramas de los tamaños de las formulaciones de NPs cargadas con fármaco, funcionalizadas y sin funcionalizar. 102 Figura 13 Valores de potencial zeta de NPs de PLGA blancas y cargadas con fármaco obtenidos para las NPs recién preparadas, tras un primer lavado por ultracentifugación y tras un segundo lavado. 108 Figura 14 Valores de eficacia de encapsulación (EE%) y carga de fármaco obtenidos para partículas preparadas con diferente concentración inicial de fármaco. 112 Figura 15 Efecto de la adición de diferentes concentraciones de trealosa en el tamaño y dispersión de las partículas tras un proceso de congelación. 116 Figura 16 Histogramas de tamaños para las NPs después de un proceso de congelación resuspendidas en diferentes medios. 117 Figura 17 Influencia de la adición de diferentes concentraciones de trealosa en el tamaño y dispersión de las partículas tras un proceso de lifilización. 118 Figura 18 Histogramas de tamaños para las NPs después de un proceso de liofilización resuspendidas en diferentes medios. 119 Figura 19 Perfiles de liberación in vitro para NPs no modificadas y modificadas superficialmente. 120 Figura 20 Tamaño y PdI de las partículas antes y después de la incubación en LCR durante 24 h. 122 Figura 21 Viabilidad celular en células hCMEC/D3 tras la incubación con NPs de PLGA sin modificar y modificadas superficialmente, blancas y cargadas con VLX, a diferentes concentraciones durante 24 h. 124 Figura 22 Estudio cualitativo de captación celular. Imágenes obtenidas por microscopía confocal de células hCMEC/D3 después de 30 minutos de incubación con diferentes formulaciones de NPs de PLGA cargadas con NR a 37 ºC. (A) NPs no modificadas superficialmente; (B) NPs modificadas con Tf; (C) NPs modificadas con TfRp 127 Figura 23 Histogramas obtenidos tras el estudio cuantitativo de la fluorescencia por citometría de flujo en las células hCMEC/D3 tras 30 minutos de incubación con diferentes formulaciones de NPs cargadas con NR. (A) Control (células sin NPs); (B) NPs de PLGA no modificadas superficialmente; (C) NPs de PLGA modificadas con Tf; (D) NPs de PLGA modificadas con TfRp. 129 Figura 24 Valores de TEER de las células hCMEC/D3 cultivadas en insertos Transwell de 0.4 µm para ambos experimentos. 131 Figura 25 Valores de TEER para ambos experimentos de permeabilidad (NPs y fármaco) antes y después de la incubación con las NPs 132 Figura 26 Porcentaje de NPs fluorescentes (funcionalizadas y no funcionalizadas) en el lado basolateral después de los tiempos predeterminados 134 Figura 27 Concentraciones de fármaco en el lado basolateral de diferentes formulaciones (VLX libre, NPs cargadas con VLX sin funcionalizar y funcionalizadas con Tf o TfRp) 136 Figura 28 Imágenes de microscopía confocal de secciones de cerebro en ratones control (A) y tras 24 h de una administración aguda (130mg/kg) de NPs fluorescentes no funcionalizadas (B), funcionalizadas con Tf (C) y funcionalizadas con TfRp (D). 139 transferrina PBS Tampón fosfato salino PCL Poli-ε-caprolactonas PDGFRβ Factor de crecimiento derivado de plaquetas PEG Polietilenglicol Péptido Aβ Péptido β-amieloide PFA Paraformaldehído PLA Ácido poliláctico PLGA Ácido poli-(D,L-láctico-co-glicólico) PLGA-PEG Ácido poli-(D,L-láctico-co-glicólico) con cadenas de polietilenglicol PVA Alcohol polivinílico RG2 Células de glioma de rata RMP-7 Agonista de la bradicinina S1 Péptido corto inhibidor de las placas β-amieloide SH-SY5Y Línea celular de neuroblastoma SNC Sistema nervioso central SRE Sistema reticuloendotelial Tc-99m Tecnecio 99 metaestable TEER Resistencia eléctrica transendotelial Tf Transferrina TfRp Péptido específico del receptor de transferrina TGN Péptido de 12 aminoácidos para direccionamiento cerebral U-87 MG Línea cellular humana de glioblastoma UHPLCMS/MC Cromatografía líquida de ultra-alta resolución acoplada a espectrometría de masas VLX Venlafaxina 1 ABSTRACT 2 Currently, nanotechnology has become in an emergent science. It offers the possibility of development of novel products and numerous applications for several fields like alimentary, cosmetic or engineer industry. In this sense, nanomedicine is an innovative alternative focused in the improvement of traditional therapies, a useful tool to solve numerous pharmacokinetics and pharmacodynamics drawbacks of conventional treatments and it can be able to control the physicochemical and biopharmaceutical behavior. Specifically, polymeric nanoparticles (NPs) are widely used as drug transport system in a nanometric scale and present various advantages compared to traditional pharmaceutical forms. On the other hand, the treatment of different diseases which affect to the brain results very difficult due to the presence of blood-brain barrier (BBB). This barrier restrict the passage of toxic substances and virus which can be harmful for nervous system (CNS) but, unfortunately, it also impede that drugs and therapeutic actives can cross it, preventing an effective treatment of neuronal disorders. Specifically, depression is a major international health problem; affecting millions of people worldwide. Actually, no drugs provide therapeutic benefit to approximately one third of depressed patients. With depression predicted to become the number one global disease burden by 2030, it is imperative that new therapeutic interventions are established. In the present work we used venlafaxine as antidepressant drug model. Therefore, the main objective of this doctoral thesis has been the development of biodegradable and biocompatible polymeric system in a nanometric range to improve the drug 3 delivery in CNS which is limited by the presence of BBB using a dual action antidepressant as model drug. Firstly, we developed a VLX loaded-polymeric nanosystem based on poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA), a US Food & Drug Administration (US FDA)-approved biocompatible and biodegradable polymer. Particles were surface functionalized with two different ligands against transferrin receptor: transferrin (Tf) and specific cell-penetrating peptide for this receptor (TfRp). Particles were prepared using a double emulsion-solvent evaporation method and functionalized employing carbodiimide strategy. Plain and functionalized NPs were evaluated and characterized for particle size and size distribution, zeta potential and morphology. Encapsulation efficiency was calculated by a validated HPLC method and conjugation efficiency was estimated using a BCA kit. In order to determine the release profile, an in vitro drug delivery assay was performed and the stability of NPs was analyzed after incubation in artificial cerebrospinal fluid and after freezing and lyophilization process. For in vitro cytotoxicity study, a colorimetric assay was carried out in order to quantify the cell viability after incubation with NPs. Cell uptake of polymeric particles was evaluated by qualitative and quantitative studies. For quantitative analysis, confocal laser scanning microscopy was used and qualitative determination was achieved by flow cytometry. To visualize NPs, a 4 fluorophore loaded-particles (Nile-Red) were employed as a marker and the nuclei was stained with Hoechst® 33342. For the study of permeability across the BBB, an in vitro model was developed, employing FITC-PLGA NPs for this purpose. Drug permeability was evaluated by ultra-high-pressure liquid chromatography/tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) and NPs permeability was estimated measuring the fluorescence in basolateral side. For all cell studies, immortalized human cerebral microvascular endothelial cell line (hCMEC/D3) was used. Regarding in vivo studies, the ability of NPs to cross the BBB was evaluated. For this, C57/bl6 mice were administered intravenously during 7 days for chronic administration and with two different particle concentrations for single-dose. Brain and spleen were collected in order to quantify the fluorescence by confocal microscopy and flow cytometry. In vivo biodistribution studies were performed using C57/bl6 mice. For this, fluorescent NPs with encapsulated-FITC as fluorophore were administered intranasally using nose-to-brain ptahway and, after 30 minutes, spleen, brain, heart, lungs, liver and kidneys were collected and analyzed by flow cytometry. The percentage of particles detected was expressed as the ratio of the fluorescence unit of each tissue relative to the sum of fluorescence units of all the tissue analyzed and fluorescence of each organ from treatment group was compared to fluorescence of control group. 5 1 INTRODUCCIÓN NANOMEDICINA Y NANOTECNOLOGÍA En la actualidad, la focalización del campo farmacéutico se centra en la personalización de los tratamientos según paciente y patología, así como en el desarrollo de nuevos sistemas de administración de fármacos, capacitados para controlar los comportamientos fisicoquímico y biofarmacéutico, Lo que parece evidente es que, salvo para ciertas situaciones, actualmente resulta insuficiente el descubrimiento y desarrollo de nuevas moléculas con una determinada actividad farmacológica para proporcionar una mejora en las terapias si no van acompañadas de sistemas de administración más eficaces. La razón del fracaso en la terapéutica actual puede deberse a numerosas causas de carácter físicoquímico y biológico que se traducen en baja o incorrecta biodisponibilidad, motivada por una absorción y/o solubilidad limitada del fármaco, rápido metabolismo y corta duración del efecto farmacológico, presencia de efectos secundarios no deseados y llegada de activos a localizaciones no deseadas del organismo, entre otras. En este sentido, la nanotecnología, descrita generalmente como el estudio de materiales y fenómenos físicos, químicos, biofísicos y bioquímicos en la escala nanométrica (Sweeney 2015) juega un papel destacado, proporcionando nuevas alternativas para vehiculizar activos farmacéuticos, productos de interés alimentario o cosméticos, por poner algunos ejemplos. Aunque los rangos de tamaño para la definición siguen siendo, a día de hoy, objeto de 6 debate y la legislación que lo regula muy escasa (Bregoli et al. 2016), la nanociencia y sus aplicaciones constituyen sin duda una interesante plataforma para el control y la manipulación de los materiales a nanoescala (Fatehi et al. 2012), al posibilitar el desarrollo de sistemas de administración más eficientes comparados con la farmacoterapéutica tradicional. Además, la nanotecnología farmacéutica también ofrece beneficios importantes en otras áreas como pueden ser el empleo de imágenes para diagnóstico, la valoración de la eficacia de un tratamiento en tiempo real o la aplicación en odontología (Demetzos and Pippa 2014), por poner sólo algunos ejemplos. La nanomedicina, definida por European Technology Platform of Nanomedicine (ETPN) como “la aplicación de la nanotecnología para lograr avances en el cuidado de la salud que explota las propiedades físicas, químicas y biológicas de los materiales a escala nanométrica” (Fornaguera and José GarcíaCelma, 2017), se ha convertido en los últimos años en una ciencia emergente que permite fabricar, caracterizar y modificar de forma controlada las propiedades de los materiales nanométricos con fines diagnósticos y biomédicos (Mirza and Siddiqui 2014). Por tanto, aunque el concepto no posee una definición oficial, la ETPN y la Food and Drugs Administration (FDA) aceptan que la nanomedicina engloba cinco principales disciplinas: (a) herramientas analíticas; (b) herramientas de imágenes; (c) nanomateriales y nanodispositivos; (d) nuevos sistemas terapéuticos de administración de fármacos; y (e) todas aquellas implicaciones sobre su regulación y seguridad (Webster 2006). 7 En la actualidad, numerosos activos farmacéuticos integrados en nanosistemas, aprobados por la FDA y la Agencia Europea del Medicamento (EMA), ya están disponibles para su administración en humanos. Caelyx®, Mepact® y Myocet®, vehiculizados en liposomas o Abraxane®, Rapamune® y Sinerem®, comercializados en nanopartículas (NPs)(European Medicines Agency 2014), son algunos ejemplos de nanomedicinas, desarrollados para el tratamiento del cáncer, el rechazo de órganos en pacientes trasplantados o el diagnóstico de tumores. NPs como vehículos de fármacos El potencial de estos nuevos sistemas de administración es enorme; entre ellos caben destacar liposomas, NPs (inorgánicas, poliméricas, lipídicas, metálicas), nanocristales, nanotubos de carbono o dendrímeros (Caban et al. 2014). Concretamente, las NPs poliméricas se han convertido en objeto de investigación debido a su gran capacidad para transportar y liberar, de manera sostenida, una extensa variedad de fármacos hasta numerosas regiones del organismo (Bari et al. 2015). Las NPs poliméricas pueden ser administradas por numerosas rutas, y, debido a su tamaño, pueden alcanzar las áreas más pequeñas del organismo (Kashi et al. 2012b), mejorar las propiedades farmacocinéticas del compuesto y su solubilidad, aumentar su vida media y reducir los efectos adversos, liberándose únicamente en los tejidos diana y minimizando la toxicidad en el resto de órganos (Mahajan et al. 2012), por comentar sólo algunas posibilidades, lo que se traduce en un aumento de la eficacia 8 terapéutica (Cetin et al. 2013)(Saraiva et al. 2016). Por resaltar alguna de las posibilidades, juegan un papel fundamental en la liberación de fármacos en el cerebro y pueden emplearse como una herramienta útil para mejorar la eficacia de los tratamientos convencionales y el diagnóstico de las enfermedades que afectan al Sistema Nervioso Central (SNC) (Zhang et al., 2016), hecho muy limitado, principalmente, por la presencia de la barrera hematoencefálica (BHE). Polímeros empleados Actualmente hay disponible una amplia de gama de polímeros, tales como quitosano, gelatinas, ácido poliláctico (PLA), copolímeros de láctico y glicólico (PLGA) o poli-ε-caprolactonas (PCL), para su uso en la preparación de NPs poliméricas, mostrando una excelente compatibilidad tanto con células como con tejidos humanos (Campos, Bentley, and Torchilin 2016)(Kashi et al. 2012a). Uno de los polímeros más empleados es el PLGA, un copolímero de los ácidos láctico y glicólico, metabolizado fácilmente por el organismo vía ciclo de Krebs (Gaillard, Visser, and de Boer 2005), que se presenta en el mercado con diferentes proporciones de cada ácido y distintos pesos moleculares, lo que le otorga capacidad para ejercer control sobre la liberación del activo, pudiendo abarcar desde días, semanas o incluso meses (Danhier et al. 2012a)(Berrocoso et al. 2017). Globalmente, la degradación del PLGA depende de su peso molecular y de la relación entre los dos ácidos que lo forman (Danhier et al. 2012b). Los copolímeros 9 formados por polímeros amorfos, más hidrófilos y de bajo peso molecular que posean mayor cantidad de glicólico exhiben un tiempo de degradación más corto puesto que el ácido glicólico posee mayor grado de hidrofilia que el ácido láctico. Luego, los polímeros hidrófobos con un mayor contenido de ácido láctico absorben menos agua y por consiguiente, muestran un tiempo de degradación más prolongado (Dinarvand et al. 2011). Aunque una de las características más ventajosas de este polímero es su degradación en agua, también posee numerosas propiedades de interés farmacéutico destacando (i) biocompatibilidad y biodegradabilidad, (ii) está aprobado como vehículo de fármacos por la FDA y la EMA, (iii) permite una liberación controlada (iv) es fácilmente modificable, según sus grupos terminales, para lograr mayor efectividad lo que posibilita su llegada a órganos o células diana (v) protege al activo frente a degradaciones externas e internas y (vi) permite encapsular fármacos de diversa naturaleza (hidrófobos e hidrófilos) (Mir, Ahmed, and Rehman 2017). BARRERA HEMATOENEFÁLICA (BHE) Las enfermedades o trastornos del SNC suponen un problema de salud a nivel mundial debido al aumento de envejecimiento en la población y la falta de tratamientos efectivos para las mismas. Para el año 2020, la cifra de personas afectadas por trastornos neurológicos podría rondar los 2 billones en todo el mundo (Brasnjevic et al. 2009). 16 incapaces de atravesarla y sólo alrededor de un 2% de las pequeñas moléculas serían capaces de alcanzar el cerebro (M. M. Patel et al. 2009). Dicha barrera ofrece un transporte muy pobre de moléculas solubles en agua (T Yoshikawa and Pardridge 1992) y, de manera excepcional, únicamente moléculas pequeñas (<500 Da) y con un marcado carácter hidrófobo podrían atravesarla (Blasi et al. 2007). Ante esta situación, como se ha indicado con anterioridad, es importante destacar que las NPs poliméricas se presentan como un mecanismo eficiente para la administración de agentes terapéuticos y de diagnóstico (incluyendo moléculas de gran tamaño) a nivel cerebral cuyas propiedades superficiales desempeñan una tarea fundamental en este propósito (Kreuter 2014). Por suerte, las células capilares del endotelio cerebral muestran numerosos mecanismos de transporte mediados por receptores, existiendo diversas rutas de paso a través de la BHE. En base a ello, se han desarrollado múltiples estrategias para poder atravesarla. A continuación, se describe brevemente los mecanismos de transporte a través de la BHE y las principales estrategias desarrolladas para evitarla. Sistemas de transporte a través de la BHE Entre las vías de acceso al cerebro cabe distinguir entre mecanismos pasivos (difusión paracelular y transcelular) o activos 17 (endocitosis mediada por receptores, transportadores o células y transcitosis por adsorción) en función de los requerimientos de energía. Como sistema de transporte, se incluyen también las bombas de eflujo (citadas en el apartado anterior)(ver figura 3). La difusión pasiva es un proceso insaturable y posee la mayor tasa de transporte, seguido de la endocitosis adsortiva que, aunque sí es un mecanismo saturable, se necesitan concentraciones tres veces más altas que para los procesos mediados por receptor (Oller-Salvia et al. 2016). Difusión pasiva Dentro de este tipo de transporte se puede distinguir entre dos formas diferentes para atravesar la BHE dependiendo de la naturaleza de la sustancia. En la vía paracelular, pequeñas moléculas hidrófilas acceden a través de las uniones estrechas mientras que las sustancias de carácter hidrófobo pueden ingresar a las células endoteliales a través de la membrana de las mismas, es decir, vía transcelular (Brasnjevic et al. 2009). Dicho paso está influenciado por diferentes factores como pueden ser la características fisicoquímicas y estructurales de la molécula (tamaño, carga, número de enlaces de hidrógeno y grado de lipofilia)(Dong 2018). Endocitosis mediada por receptor La endocitosis mediada por receptor es un tipo de transporte altamente específico (Bhaskar et al. 2010). Requiere un 18 aporte de energía (dependiente de ATP)(Bickel, Yoshikawa, and Pardridge 2001) y su mecanismo implica la unión del ligando específico a los receptores presentes en la membrana apical de la barrera (Fullstone et al. 2016). La BHE expresa de manera fisiológica numerosos receptores como el receptor de lipoproteína, insulina o transferrina (Tf), entre otros (Parashar and Nema 2012). De manera destacada, el receptor de Tf está formado por dos monómeros glicoprotéicos (760 aminoácidos cada uno) de unos 90 kDa unidos por puentes disulfuro y tres dominios principales (proteasa, helicoidal y apical) dispuestos en forma de mariposa (Macedo and Sousa 2008) (Figura 3). Cada subunidad se une a una molécula de Tf en un proceso reversible y dependiente de pH (Moos and Morgan 2000). Figura 3. Esquema del receptor de Tf (Lawrence et al. 1999). Se encarga de mantener la homeostasis del hierro, proporcionándoselo a las células a través de la unión específica con 19 la Tf, regulando la cantidad del oligoelemento en función de las necesidades metabólicas celulares (H. Li and Ming Qian 2002). Un nuevo receptor de Tf, conocido como receptor de Tf II, ha sido investigado y se cree que tiene un papel en la homeostasis del hierro, aunque su función no se conoce con exactitud (Calzolari et al. 2010). La diferencia principal con el receptor de Tf I reside en su localización. Mientras que el I está presente prácticamente en todas las células, el II se encuentra primordialmente en hígado y eritrocitos aunque, en menor medida, puede hallarse en otras células del organismo. Sin embargo, existen varias similitudes entre ellos ya que ambos se sobreexpresan en células tumorales y sus dominios extracelulares son semejantes (Voth et al. 2015). Transcitosis por adsorción Este tipo de mecanismo transportador no específico que depende de interacciones electrostáticas, la endocitosis se desencadena por la unión entre moléculas con carga positiva las partes aniónicas de la membrana apical de las células endoteliales (concretamente con el glucocáliz) (Pehlivan, 2013) ya que, a pH fisiológico, tanto la membrana apical como la basolateral exhiben una carga negativa (Hervé, Ghinea, and Scherrmann 2008). El proceso de endocitosis sigue pasos similares a los producidos cuando interviene un receptor, la diferencia radica en la afinidad y la capacidad de cada tipo. El mecanismo mediado por receptor, aunque con mayor afinidad ofrece menos capacidad de 20 transporte ya que es saturable a concentraciones más bajas (Yan Chen and Liu 2012). Transcitosis mediada por transportador El aporte de nutrientes como glucosa o aminoácidos necesarios para el buen funcionamiento de la BHE se realiza a través de proteínas de transporte expresadas en su superficie (tanto apical como basolateral). El ejemplo más conocido es el transportador de glucosa (GLUT1)(Sanchez-Covarrubias et al. 2014). Para que los fármacos puedan acceder al cerebro a través de este sistema, deben tener un tamaño pequeño y poseer una estructura análoga a la de los nutrientes que transportan lo que limita su explotación (Béduneau, Saulnier, and Benoit 2007). Endocitosis mediada por células La movilidad de las células inmunitarias les permite viajar con facilidad desde el torrente sanguíneo hasta focos inflamatorios, síntoma común para la mayoría de numerosos trastornos neurodegenerativos (M. M. Patel and Patel 2017). Las células encargadas de este tipo de transporte son células específicas del sistema inmunitario como macrófagos, neutrófilos, linfocitos y monocitos que, condicionados por la presencia de inflamación, llevan a cabo el paso a través de la capa endotelial por dos procesos llamados quimiotaxis y diapédesis (E. V. Batrakova and Kabanov 2013). 21 Aunque puede presentarse como un método exitoso para la liberación de fármacos en lugares de inflamación, su empleo se ve reducido por los inconvenientes que presenta ya que: (a) las células pueden transportar una cantidad de fármaco baja, (b) los inmunocitos no tienen buena capacidad de liberar las moléculas terapéuticas que, además, debe ser de manera controlada una vez alcanzado el lugar de acción, (c) la cantidad de células que migran a la zona inflamatoria no es elevada y (d) las formulaciones no pueden ser tóxicas ni perjudiciales para el portador celular (E. V Batrakova, Gendelman, and Kabanov 2011). Figura 4. Principales sistemas de transporte a través de la BHE ESTRATEGIAS PARA EL DIRECCIONAMIENTO DE ACTIVOS HACIA EL SNC Por todas las razones mencionadas con anterioridad, la llegada de fármacos al SNC está muy limitada actualmente pero, afortunadamente, se están desarrollando numerosas estrategias para atravesarla. Estas estrategias podrían dividirse en dos grandes grupos: métodos invasivos y no invasivos. 22 Adicionalmente, existe una ruta alternativa para la llegada de fármacos al cerebro denominada nose-to-brain tras una administración vía intranasal. En los siguientes apartados se describe brevemente cada una de ellas. Métodos invasivos En las técnicas invasivas el agente terapéutico ingresa al SNC por una apertura provocada en la BHE, o es administrado directamente en el cerebro. Los procedimientos invasivos poseen notables desventajas, ya que son relativamente costosos y peligrosos requiriéndose la hospitalización del paciente, anestesia y/o cirugía, y además se posibilita el que pueden acceder al cerebro sustancias no deseables perjudiciales para el ambiente cerebral (Soddu et al. 2015). Dentro de esta clasificación se incluyen la disrupción de la barrera, la entrada por convección o la inyección directa en el SNC. Disrupción de la BHE La finalidad es abrir las uniones estrechas que se encuentran sellando las células endoteliales que formas la barrera. La apertura debe ser reversible, provisional y momentánea y controlada en extensión para evitar posibles efectos no deseados (Martin-Banderas et al. 2011). Existen numerosas técnicas para lograrlo: 23 1. Disrupción osmótica: la disrupción hiperosmótica se comenzó a explotar en los años 70 cuando Rapoport et al. observaron que las soluciones hiperosmóticas aplicadas en el córtex cerebral de conejo permitían el paso del colorante azul Evans al interior del cerebro (Rapoport and Hori, 1972). Tras una administración intravenosa de la solución hiperosmótica, el proceso de apertura por hiperósmosis se desencadenaba por la salida del agua de las células endoteliales hacia la sangre, provocando la crenación de las mismas. Seguidamente, el aumento de agua en los vasos sanguíneos produce vasodilatación y, finalmente, el citoesqueleto celular se contrae conduciendo a una expansión de las uniones estrechas (Rapoport and Robinson, 1986)(Chavan and D ’souza, 2010). Este procedimiento manifiesta claras mejoras en la terapia neurooncológica, aumentando los niveles de los fármacos quimioterápicos en el SNC tras una administración intravenosa, sin embargo, las concentraciones pueden alcanzar niveles tóxicos (Doolittle et al. 2000). Uno de los agentes hiperosmóticos más usados es el manitol, aunque también se han empleado otros como la urea y la arabinosa. Las limitaciones en el uso de manitol residen en los efectos secundarios que presenta, ya que puede provocar convulsiones, infecciones, entrada de toxinas al cerebro o el paso de proteínas plasmáticas (Martin-Banderas et al. 2011). 2. Disrupción bioquímica: se basa en la administración intrarterial de sustancias vasoactivas que provocan una reacción inflamatoria en las células endoteliales. Entre las sustancias 24 vasoactivas más conocidas se encuentran la bradiquinina junto con su análogo RMP-7 y la histamina. La bradiquinina es un nonapéptido que aumenta la permeabilidad de las uniones estrechas tras una activación del receptor B2, presente en las células endoteliales (Ding-Zhou et al. 2003). Tras la activación, se desencadenan una serie de procesos que desembocan en un aumento de óxido nítrico, que produce vasodilatación. La adenosina es otra sustancia vasoactiva que actúa sobre los receptores de adenosina 2A que se encuentran en las células endoteliales. Pertenecen a la familia de los receptores acoplados a proteína G y su activación conlleva un aumento de la permeabilidad de la BHE por la apertura de las uniones estrechas (M. M. Patel and Patel 2017). Por último, los alquilgliceroles han surgido como una alternativa no tóxica para facilitar el acceso al SNC. Gracias a su carácter anfifílico no iónico (Hersh et al. 2016), pueden incorporarse a la membrana y desestabilizarla, provocando su apertura, cuya extensión dependerá de la estructura y concentración del compuesto (Erdlenbruch et al. 2003). 3. Disrupción por ultrasonidos: una alternativa emergente para producir la disrupción de la membrana es la aplicación de ultrasonidos. Para ello, se inyectan microburbujas de tamaño micrométrico (Dube et al. 2017) que, tras la aplicación de ultrasonidos, son capaces de transformar la energía acústica en energía mecánica (Gao 2016). La alteración de la barrera puede alcanzarse controlando el tiempo de aplicación de ultrasonidos, así como su frecuencia (Martin-Banderas et al. 2011). 25 4. Disrupción inducida por radiación: un uso alternativo de la radioterapia puede ser su empleo para lograr una disrupción focalizada de la BHE. La radiación produce un daño en el ADN que provoca la muerte celular y puede ser utilizada en el tratamiento de tumores cerebrales (Azad et al. 2015). Administración de fármacos por convección Este método invasivo permite la administración de agentes terapéuticos directamente en parénquima cerebral o tejido específico. Para ello, uno o más catéteres de pequeño calibre se colocan estereotácticamente en el cerebro a través de surcos perforados en el cráneo y los agentes terapéuticos son administrados a través de una bomba de microinfusión mediante presión positiva (Ratliff and Oldfield 2001). Hoy en día, este tipo de administración requiere la optimización de las características de infusión, unas propiedades determinadas de catéter y técnicas de colocación específicas, así como un seguimiento preciso y en tiempo real de la distribución de infusiones, por lo que esta técnica no resulta confiable y reproducible (Vogelbaum and Iannotti 2012). A diferencia de otras técnicas invasivas actualmente disponibles para la administración de fármacos al SNC, esta estrategia consigue una distribución uniforme de los fármacos cuya cantidad administrada coincide con la cantidad infundida, lo que 32 Aptámeros Los aptámeros son pequeñas secuencias de oligonucleótidos con 20-60 nucleótidos en una sola cadena de ADN o ARN. Se definen por su estructura tridimensional, que les permite unir moléculas diana (desde pequeñas moléculas inorgánicas a moléculas complejas) con alta afinidad y especificidad (Lakhin, Tarantul, and Gening 2013). Descritos por primera vez en 1990, su nombre está formado por dos palabras provenientes del griego: aptus, que se traduce como “encajar” y merus que significa “partícula” (Darmostuk et al. 2015). Mayoritariamente, los aptámeros suelen obtenerse por una técnica denominada SELEX o selección in vitro y presentan numerosas ventajas: (1) en teoría, pueden diseñarse para ser reconocidos por cualquier receptor de manera selectiva, (2) su síntesis química es altamente reproducible, (3) son más estables que las proteínas y no suelen perder su capacidad de unión, (4) poseen una baja inmunogenicidaad y toxicidad y (5) gracias a su pequeño tamaño, pueden unirse a epítopos a los que no podrían acceder los anticuerpos (W. Zhou et al. 2014). Comparado con los anticuerpos, aunque la secuencia de nucleótidos sea análoga, la síntesis de aptámeros es más barata y fácil, presentan mayor estabilidad, menor tamaño y baja inmunogenicidad y nula toxicidad (Kulbachinskiy 2007, Bouchard, Hutabarat, and Thompson 2010). Debido a esto, los aptámeros son una buena alternativa a los anticuerpos y excelentes candidatos para el direccionamiento específico de fármacos y el diagnóstico de enfermedades. 33 En la lucha contra el cáncer, los aptámeros pueden unirse específicamente a moléculas sobreexpresadas en células cancerosas. Para el tratamiento del glioma, las NPs pueden funcionalizarse con ligandos específicos y facilitar el acceso de los agentes quimioterápicos al tumor. Uno de ellos, llamado Gint4.T (anti-PDGFRβ), conjugado en nanosistemas (Monaco et al. 2017), es un ligando capaz de unirse de forma específica y selectiva al receptor β del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRβ), un receptor expresado en la superficie de las células cancerosas, incluidas las células de glioma. Otro conocido aptámero, AS1411, es rico en G (Shan 2004) y se une a la nucleolina con alta afinidad, una proteína altamente expresada en la membrana de las células cancerosas, incluidas las células C6 del glioma. Tras penetrar en la célula cancerosa, el complejo AS1411-nucleolina produce, entre otros, la inhibición de la síntesis de ADN o la inducción de la apoptosis celular (Luo et al. 2017). Los estudios in vitro desarrollados por Guo y cols., demostraron que las NPs no modificadas muestran una menor asociación con las células C6 que las NPs conjugadas con el aptámero. De manera similar, la cantidad de partículas conjugadas acumuladas en el cerebro fue mayor que la de las partículas no conjugadas o el fármaco libre (J. Guo et al. 2011). 34 Péptidos En los últimos años, se están estudiando nuevas moléculas peptídicas para el tratamiento de enfermedades, llamados péptidos lanzadera. Uno de los más populares es el glutatión (GSH), un tripéptido endógeno hidrófilo formado por glutamato, cisteína y glicina (G. H. Kim et al. 2015),de especial relevancia debido a su papel en los procesos de desintoxicación. Es el agente protector más importante contra los radicales libres y protege a las células frente a especies reactivas del oxígeno y xenobióticos, así como a los órganos más expuestos a los mismos (riñón, pulmón, hígado o intestino) (Koo et al. 2011). La concentración de glutatión en el cerebro es aproximadamente 2-3 mM, va disminuyendo con el envejecimiento y puede asociarse con la aparición de enfermedades ligadas al mismo y en órganos con funciones depurativas (Valdovinos-Flores and Gonsebatt 2012). El glutatión, ayudado por la glicoproteína-P es capaz de atravesar la BHE y es una ruta ampliamente explorada por numerosos autores para una administración eficaz de fármacos en el cerebro (G. H. Kim et al. 2015). Acharya et al. (Acharya and Reddy 2016) estudiaron la influencia de la funcionalización de NPs de PLGA cargadas de placlitaxel para el tratamiento del cáncer cerebral. Las NPs con glutatión mostraron un direccionamiento más efectivo hacia el cerebro que las NPs no conjugadas. Del mismo modo, en un estudio similar, ambos tipos de NPs presentaban una endocitosis más alta 35 que la suspensión de paclitaxel. Se obtuvieron resultados similares para las NPs de PLGA cargadas con curcumina. Los resultados de captación celular (cualiy cuantitativos) mostraron que la acumulación de NPs funcionalizadas y no funcionalizadas en el interior de las células neuronales era más alta que la del fármaco libre (Paka and Ramassamy 2016). Otros autores estudiaron la capacidad de las NPs funcionalizadas con glutatión para cruzar la BHE utilizando un modelo in vitro de barrera, demostrando que la penetración de NPs recubiertas de glutatión era mayor que la del compuesto sin encapsular (Grover et al. 2014). Otros péptidos pequeños han sido empleados para mejorar el acceso al SNC. Uno de ellos es Angiopep-2 (ANG), capaz de unirse al receptor de lipoproteínas, que está sobreexpresado en células endoteliales capilares del cerebro y células tumorales malignas (Demeule et al. 2007). Las NPs de PLGA conjugadas con ANG pueden ser una plataforma prometedora para el tratamiento del glioma. Wang et al. compararon la capacidad de captación celular de NPs funcionalizadas con ANG y NPs no funcionalizadas. Los estudios in vitro confirmaron que las NPs modificadas superficialmente exhibían una mayor captación por las células U87MG que las no funcionalizadas, tanto cualitativa como cuantitativamente (L. Wang et al. 2015). De manera paralela, los ensayos in vivo mostraron que tanto las NPs funcionalizadas como las no funcionalizadas podían atravesar la BHE, y atribuyeron la capacidad de las NPs no conjugadas a las interacciones electrostáticas inespecíficas entre la carga superficial positiva de las NPs y las células endoteliales de los capilares cerebrales. 36 Finalmente, se ha estudiado un pequeño péptido específico contra el receptor de Tf (TfRp)(secuencia H - Thr - His - Arg - Pro - Pro - Met - Trp - Ser - Pro - Val - Trp - Pro – OH). Los estudios in vitro indicaron que las NPs conjugadas con el péptido exhibieron una mejor interacción con las células endoteliales del cerebro humano (hCMEC) que las NPs no conjugadas (Gomes et al. 2017). Más recientemente, Huang et al. (Huang et al. 2017) realizaron estudios in vivo con NPs de PLGA cargadas con curcumina y un inhibidor de la producción de placas Aβ (S1, péptido corto con la secuencia PQVGHL). Las partículas se funcionalizaron con el péptido CRT (péptido CRTIGPSVC cíclico), un péptido funcionalmente similar al hierro que se dirige al receptor de Tf que induce un cambio alostérico. Las partículas, que tenían menos de 150 nm de diámetro y presentaban valores de potencial zeta negativo, exhibieron una captación celular notablemente mejorada y una capacidad de penetración de la barrera in vitro; las imágenes in vivo confirmaron esto, y las pruebas con animales demostraron una reducción de la generación de placas Aβ y la disminución de la producción de gliosis, proinflamación y citoquinas. Este péptido, fue usado también por otros investigadores para funcionalizar NPs de PLGA-PEG e intervenir en el transporte de fármacos a través de la BHE y su penetración en las células del glioma. La partículas conjugadas mostraron que la interacción con las células C6 y BCEC mediante endocitosis fue elevada así como el paso a través de un modelo in vitro de BHE. Los ensayos in vivo a 37 través de imágenes en tiempo real, mostraron la acumulación de manera selectiva en el glioma (Kang et al. 2015). Anticuerpos y otras proteínas La superficie de los nanosistemas puede funcionalizarse con moléculas que se unen a receptores específicos presentes en la BHE a fin de mejorar su acceso al SNC. Un tipo especial de proteínas, los anticuerpos monoclonales (moléculas hidrófilas y de vida media larga), se usan conjugados en la superficie de NPs dirigidas a la BHE para unirse a ligandos específicos de la misma. Debido a su gran tamaño (alrededor de 150 KDa), los anticuerpos no pueden atravesar la BHE mediante transcitosis mediada por adsorción. Sin embargo, pueden usarse como ligandos específicos de los receptores de la BHE, ingresando al SNC por endocitosis mediada por receptor como se describió anteriormente (J. a Loureiro et al. 2014). Esta estrategia es probablemente uno de los enfoques más eficaces para el direccionamiento de las NPs. Fornaguera et al. (C. Fornaguera et al. 2015) desarrollaron un nanovehículo dirigido a la BHE, cargado con loperamida y funcionalizado con el anticuerpo 8D3 (anticuerpo contra el receptor de Tf) como molécula diana. Después de su inyección intravenosa en la vena de la cola, los investigadores evaluaron la llegada de las NPs al cerebro midiendo el porcentaje de efectos antinociceptivos producidos por la loperamida. La loperamida, usualmente comercializada en cápsulas tradicionales para el tratamiento de la diarrea, no puede cruzar la BHE. Sin embargo, incluida en un sistema de administración nanométrico adecuado 38 (por ejemplo, encapsulado en NPs funcionalizadas) puede producir efectos centrales y analgesia (Tosi et al. 2007). El efecto antinociceptivo después de la administración de NPs funcionalizadas con anticuerpos fue mayor que el de las NPs no modificadas (50% frente a ~ 25%), lo que confirma la capacidad de 8D3 para actuar como un caballo de Troya a través de la BHE (C. Fornaguera et al. 2015). OX26 es un anticuerpo monoclonal de roedor que se une selectivamente a receptores de Tf presentes en las células endoteliales de los capilares cerebrales de la BHE (Monsalve et al. 2015). Este anticuerpo es capaz de unirse a un dominio extracelular del receptor y penetrar en la BHE (X. Tang et al. 2015). Carrol et al. (Carroll et al. 2010) desarrollaron NPs de PLGA cargadas con tempol (4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin1-oxilo), un fármaco heterocíclico neuroprotector que puede eliminar el peroxinitrito, que en asociación con otras especies reactivas puede tener un papel en trastornos neurodegenerativos como Alzheimer o Parkinson. Para mejorar la captación celular y el acceso al SNC, se prepararon NPs de PLGA-polietilenglicol (PEG) por nanoprecipitación y se funcionalizaron con OX26. Los estudios in vitro usando RG2 (células del glioma de rata) mostraron que las NPs modificadas superficialmente con OX26 entraron en las células de manera más eficiente que las NPs no conjugadas. Por otra parte, Bao et al. (Bao et al. 2012), usando endomorfinas como fármaco analgésico modelo, estudiaron la capacidad de un nanosistema hiperramificado modificado en la superficie con OX26. Los autores llevaron a cabo experimentos de captación de células in vitro en células BMEC. Los resultados 39 mostraron que la captación de NPs dependía tanto del tiempo como de la concentración y que la captación se produjo a través de un proceso de endocitosis caveolar. Para estudiar el cruce de la BHE después de la inyección intravenosa y usando la conjugación con OX26, los autores evaluaron el efecto analgésico de las endomorfinas usando un modelo de lesión de constricción crónica en ratas. Tras la administración intravenosa del fármaco libre no se observó ningún efecto y las NPs sin OX26 mostraron un efecto analgésico leve (debido a su pequeño tamaño). Sin embargo, las NPs con OX26 produjeron un efecto analgésico mayor y durante más tiempo. Además de los anticuerpos, se han utilizado otras proteínas para la funcionalización de nanosistemas como las que componen la familia de las Tfs están entre las más ampliamente utilizadas como ligandos para dirigir nanosistemas al cerebro. Las más conocidas son: (a) la Tf sérica humana presente en la sangre y otros líquidos corporales (líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, linfa, leche, bilis), (b) la ovotransferrina (ovo-Tf) de la clara de huevo, (c) la lactoferrina localizada en leche de mamíferos, lágrimas, saliva, moco y glóbulos blancos y (d) la melanotransferrina (melano-Tf), en la membrana de los melanocitos, principalmente. A excepción de la lactoferrina (punto isoeléctrico = 8.7), el resto son proteínas ácidas con un punto isoeléctrico entre 5.6-5.8 (H. Li and Ming Qian 2002). 40 Concretamente, la Tf se ha estudiado ampliamente como ligando específico para mejorar la llegada de NPs al SNC a través del receptor de Tf, expresado en las células endoteliales de la BHE. La Tf es una glicoproteína endógena de 679 aminoácidos y un peso de 79 kDa que puede penetrar en las células del endotelio cerebral por endocitosis mediada por receptor a través de los receptores de Tf presentes en las mismas (Cetin et al. 2013), aportando el hierro necesario a las células cerebrales para su metabolismo (Pahuja et al. 2015). En su estructura se diferencian hélices alfa y láminas beta que comprenden los dos dominios principales N-terminal y C-terminal. A pH fisiológico, una o dos moléculas de hierro se unen a la Tf por estos dominios principales gracias a dos tirosinas, una histidina y un ácido aspártico, siendo necesaria también la presencia de un anión (Aisen 2004). El principal productor de Tf es el hígado (Voth et al. 2015). Fundamentalmente, la Tf se encarga de distribuir el hierro por el organismo en forma de Fe3+, aunque interviene en otras funciones como la eritropoyesis y la división celular (Cheng et al. 2004). Mediante el empleo de ligandos contra el receptor de Tf (Tf, anticuerpos o péptidos) se puede lograr la llegada efectiva de fármacos al cerebro. En este sentido, Chang et al. (Chang et al. 2009) desarrollaron una nanoplataforma de PLGA recubierto con diferentes estabilizadores (para evitar la agregación) y demostraron que la endocitosis de las NPs conjugadas con Tf fue mayor que la de las NPs no modificadas. 41 En otro estudio para el tratamiento de gliomas, combinaron la funcionalización superficial con Tf y la aplicación de un campo magnético, obteniéndose las mayores tasas de captación celular usando ambas estrategias, hecho que se reproduce en el ensayo para la evaluación del transporte paso a través de la BHE utilizando un modelo de barrera in vitro, donde los mejores resultados se obtuvieron cuando ambas tácticas eran empleadas. Resultados in vivo confirman la capacidad de las NPs para atravesar la barrera, y a la inhibición más acusada del crecimiento tumoral era la producida por las NPs funcionalizadas con Tf (Cui et al. 2013). Anteriormente nombrada, otra de las moléculas de la familia de las Tf más ampliamente usada para estos propósitos es la lactoferrina, una proteína catiónica de 80 KDa involucrada en diversas funciones fisiológicas, incluida la protección contra la infección y la inflamación (Kumari and Kondapi 2017). Como ocurre con la Tf, es una buena opción para el tratamiento del glioma porque su receptor está sobreexpresado en células tumorales así como en las células endoteliales del cerebro, y es capaz de atravesar la BHE, empleándose para mejorar el acceso cerebral de numerosas drogas. Hu et al. (Hu et al. 2011) estudiaron el desarrollo de una nueva nanoplataforma para el tratamiento del Parkinson, bioconjugando lactoferrina a la superficie de NPs de PLGA-PEG. Este estudio demostró que, tras la inyección en la vena caudal del ratón, el porcentaje de acumulación de NPs con lactoferrina en la corteza, la sustancia negra y el cuerpo estriado 48 Aβ (J. A. Loureiro et al. 2016) aportando un novedoso sistemas para el tratamiento de esta enfermedad. Nose-to-brain Como se ha citado con anterioridad, la principal limitación que existe en el tratamiento de las enfermedades neurológicas es la presencia de la BHE, que restringe el acceso de la mayoría de las moléculas terapéuticas al SNC, imposibilitando el tratamiento de numerosos desórdenes que afectan al cerebro. En este sentido, mediante una administración vía intranasal, la ruta nose-to-brain es considerada como una posible estrategia de administración de fármacos que permite la liberación de activos de manera rápida y eficaz en el SNC. El interés de esta vía de administración reside en la alta vascularización y porosidad de su epitelio, la amplia superficie disponible para una pronta absorción, un rápido inicio de la acción con una mayor permeabilidad a un mayor número de compuestos que la mucosa intestinal. Todo esto debido fundamentalmente a la falta de enzimas pancreáticas y gástricas, el pH neutro del moco y la posibilidad de evitar tanto el metabolismo de primer paso como la BHE (Pardeshi and Belgamwar 2013). Por todo ello, es considerada como una alternativa real para la administración de numerosos agentes terapéuticos de acción sistémica con baja disponibilidad y/o con un inicio de la acción no deseable, y podría explotarse como una vía no invasiva muy prometedora de administración en el SNC para sustancias que no 49 atraviesan la BHE (Djupesland, Messina, and Mahmoud 2014). Sin embargo, el aclaramiento mucociliar provoca que la absorción y el tiempo de residencia del fármaco sean escasos, inconvenientes que pueden ser solventados con el empleo de nanosistemas de administración de fármacos que protegen al fármaco de la degradación dentro de la cavidad (Gartziandia et al. 2016). Desarrollada por Frey en 1989, la administración intranasal es rápida (Hanson, Frey, and II 2008) y los fármacos alcanzan el cerebro en una cantidad significativa a través de los nervios trigémino y olfatorio evitando así la barrera hematoencefálica. En líneas generales, la nariz se encarga de preparar el aire que se inhala para que llegue de manera adecuada a las vías respiratorias, filtrándolo, calentándolo y humedeciéndolo (Illum 2003). Además, la secreción de mucosa aporta inmunidad frente a baterías y virus y está compuesta esencialmente por agua (95%) además de mucina, sales, proteínas y lípidos en menor proporción. Proporciona un leve pH ácido (pH 5.5-6.5), y de manera adicional, cumple otras funciones como la protección enzimática y física, la retención de agua o posibilitar el aporte de calor, entre otros (Alagusundaram et al. 2010). De forma resumida, la cavidad nasal está dividida en dos mitades independientes longitudinalmente por el tabique nasal y se extiende desde las fosas nasales hasta la nasofaringe (aproximadamente 12-14 cm), ocupando una superficie alrededor de 150 cm2 y con un volumen total de 15-20 mL (Ghori et al. 2015). Principalmente, la cavidad está compuesta de tres regiones: 50 vestíbulo nasal, región olfativa y región respiratoria. En humanos, el vestíbulo tiene una superficie de 0,6 cm2, seguida de la región olfativa que ocupa 15 cm2, un 10% de la superficie nasal mientras que en roedores representa alrededor del 30%. El vestíbulo es la zona más externa de la nariz. En esta región, la absorción de fármacos es muy escasa debido a la existencia de vibrisas que actúan como filtros y la presencia de un recubrimiento epitelial escamoso y queratinizado (Pires et al. 2009). El resto de la cavidad nasal comprende la región respiratoria cuyas paredes se encuentran plegadas subdividiéndose en tres cornetes: superior, medio e inferior (Illum 2004). Dicha región se considera el sitio principal de absorción de fármacos hacia la circulación sistémica y está constituida por la lámina propia y la membrana basal que soportan el epitelio, cambiante a medida que se profundiza en la cavidad. Inicialmente, un epitelio escamoso se torna a epitelio de transición y, por último se convierte en epitelio pseudoestratificado (o respiratorio) formado por cuatro tipos diferentes de células: células no ciliadas, ciliadas, caliciformes y basales. Las células ciliadas y no ciliadas poseen microvellosidades que aumentan considerablemente la superficie de absorción y las ciliadas están recubiertas por cilios que, con su movimiento transportan el moco hacia la faringe (Illum 2000). La región olfativa, localizada en la parte más alta de la cavidad nasal, es la única zona del sistema nervioso central 51 expuesta al exterior (Charlton et al. 2007). Las células olfatorias del neuroepitelio comienzan en el bulbo olfatorio del sistema nervioso central y se extienden hasta el epitelio olfativo lo que supone un contacto directo del exterior y el cerebro, permitiendo el transporte de fármacos través del nervio trigémino y olfatorio (Wu, Hu, and Jiang 2008). El mecanismo de llegada de los fármacos al cerebro a través de la nariz todavía no está completamente dilucidado y sigue siendo investigado; sin embargo, se sabe que tanto el nervio olfatorio como las vías nerviosas del trigémino estarían involucradas y que podría producirse por vía intracelular o extracelular (Lochhead and Thorne 2012)(Figura 6). Figura 6. Representación esquemática de las rutas de acceso al sistema nervioso central por vía intranasal (Nose-to-brain) (Stützle et al. 2015) Parece que la administración intranasal es una combinación de diferentes rutas (Stützle et al. 2015). De manera generalizada, tras una inspiración profunda de las NPs a través un dispositivo 52 adecuado, las partículas pueden seguir tres caminos diferentes: (I) entrada directa en la circulación sistémica desde la cavidad nasal, (II) entrada en el bulbo olfatorio a través de las neuronas y (III) llegada directa al cerebro vía nervio trigémino (Kumar, Pandey, and Jain 2016).Por lo tanto, el transporte directo de los fármacos a lo largo de los nervios olfatorio y trigémino se considera cada vez más una ruta no invasiva prometedora. Varios tipos de moléculas (moléculas pequeñas y grandes) y de células han alcanzado el cerebro con éxito a través de esta vía intranasal(Lochhead and Thorne 2012). Cabe mencionar la insulina (Tiedemann et al. 2017)(Ramos-Rodriguez et al. 2017)(Brabazon et al. 2017)(Bell and Fadool 2017), neurotrofinas (como el factor de crecimiento nervioso)(Chou et al. 2017)(Malerba et al. 2011)(Vaka et al. 2013)(Herran et al. 2014), eritropoyetina (A. Merelli, Czornyj, and Lazarowski 2015)(Amalia Merelli, Czornyj, and Lazarowski 2013)(Rodríguez Cruz et al. 2016), benzodiacepinas (Botner and Sintov 2011)(Inokuchi et al. 2015) y células madre (Danielyan et al. 2011). Sin duda, el rápido progreso de la medicina es prometedor para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, ya que proporciona un nuevo enfoque para el control de la liberación de activos viejos y nuevos. De hecho, la combinación de la nanotecnología y la administración intranasal se está volviendo más atractiva en los últimos años (Goldsmith, Abramovitz, and Peer 2014)(Shah, Yadav, and Amiji 2013)(Samaridou and Alonso 2018). 53 Es conveniente enfatizar la utilidad de las NPs de PLGA dirigidas al cerebro vía intranasal como una de las nanoformulaciones más prometedoras. Recientemente, Bonaccorso et al. (Bonaccorso et al. 2017) compararon la capacidad de las NPs de PLGA y quitosano para llegar al cerebro tras una administración intranasal en ratas. Para ello, las NPs se marcaron con rodamina y su ubicación fue determinada por microscopía de fluorescencia. Los experimentos revelaron que ambas NPs, con diámetro similar pero una carga superficial opuesta, llegaron al cerebro y persistieron en el mismo durante 48 h. Las NPs de PLGA con carga negativa llegaron al cerebro a través de la vía olfativa, mientras que las vías nerviosas del trigémino fueron las involucradas en el caso de las NPs de quitosano cargadas positivamente. En algunos casos, con la administración intranasal se obtienen efectos iguales a los resultados alcanzados tras una administración por vía intravenosa. Por ejemplo, Sekerdarg et al. (Sekerdag et al. 2017) diseñaron una nanopartícula híbrida de lípido-PLGA cargada con ácido farnesil-tiosalicílico para el tratamiento del glioma. Después de un tratamiento por un período de 5 días por administración intravenosa o intranasal a las ratas Wistar, observaron que las dos rutas de administración produjeron una reducción importante y similar del tumor. Estos resultados apoyan la utilidad potencial de la administración intranasal como un novedoso método no invasivo en el tratamiento de glioma. 54 A veces, moléculas prometedoras para el tratamiento de una cierta enfermedad resultan ser inútiles y fallan de manera decepcionante. Este fue el caso del tarenfubril, un compuesto con grandes expectativas de modular la actividad de la enzima gammasecretasa, clave en la formación del péptido beta amiloide, implicada en la enfermedad de Alzheimer. Probablemente, la escasa capacidad de penetración del fármaco condujo al fracaso de su empleo para el tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa. Con el resurgir de la nanomedicina, el tarenfubril ha vuelto a emplearse recientemente, encapsulado en NPs de PLGA o NPs sólidas lipídicas. Para ambas formulaciones, el diámetro de los nanosistemas era inferior a 200 nm, lo que facilita el transporte transcelular a través de los axones olfativos (Muntimadugu et al. 2016). Los investigadores del estudio descubrieron que ambas se dirigían al cerebro de manera exitosa, siguiendo la ruta olfatoria tras una administración intranasal, aunque las formuladas con PLGA fueron más efectivas tanto para el direccionamiento hacia el SNC como para la cantidad de fármaco vehiculizado. La administración de agentes neuroprotectores al cerebro también está tomando una consideración relevante. Xiao et al. (Xiao et al. 2016) desarrollaron una formulación de timoquinona, encapsulada en NPs de PLGA-quitosano para evaluar su eficacia en un modelo de isquemia en roedores después de ser administradas vía intranasal. La timoquinona es un producto natural derivado de la especie Nigella sativa que exhibe propiedades antiinflamatorias y anticancerígenas pero que presenta una biodisponibilidad muy 55 reducida. Los autores demostraron una reducción significativa de la isquemia y una mejora del perfil farmacocinético del fármaco en el cerebro. Los ensayos bioquímicos también mostraron una reducción de la peroxidación lipídica, un incremento de glutatión, catalasa y superóxido dismutasa en el cerebro, lo que sugiere el potencial de las NPs de PLGA-quitosano para ser utilizadas como vehículo para la libración de fármacos en el cerebro. Otros investigadores estudiaron la posibilidad de emplear las NPs administradas vía intranasal como transportadores de sustancias terapéuticas con actividad antiepiléptica. En este sentido Sharma et al. (Sharma et al. 2016) encapsularon el midazolam en NPs de PLGA radiomarcadas con Tc-99m para evaluar la biodistribución de las mismas tras ser administradas vía intranasal e intravenosa a ratas Sprague-Dawley. Las imágenes de gammacámara y la relación de captación en sangre/cerebro, indicaron un mayor direccionamiento cerebral de estos nanosistemas después de una administración intranasal. Cabe señalar el empleo de NPs de PLGA funcionalizadas superficialmente para ser administradas por esta vía no invasiva. En este sentido, Bi et al, encapsularon rotigotina (un agonista dopaminérgico usado para el tratamiento del Parkinson) en NPs de PLGA PEGiladas y funcionalizadas con lactoferrina. Tanto las funcionalizadas como las no funcionalizadas mostraron una liberación sostenida del fármaco durante 48 h. Los estudios in vivo, demostraron que la llegada al cerebro de rotigotina tras una administración intranasal tuvo una distribución heterogénea, con una mayor concentración en el cuerpo estriado, la región 56 primordial afectada en el Parkinson. Sin embargo, la administración del fármaco fue mucho más efectiva cuando se emplearon las NPs funcionalizadas con lactoferrina (Bi 2016). VENLAFAXINA (VLX) COMO FÁRMACO MODELO Usada en este estudio como fármaco modelo, la VLX ((Clorhidrato de-1-[(2-dimetilamino)-1-(4-metoxifenil) etil] ciclohexanol)) es un fármaco de tercera generación para el tratamiento de la depresión y la ansiedad (Panahi and Alaei 2014) que se presenta como un sólido blanco de naturaleza cristalina, muy soluble en agua (S. Jain and Datta 2014). Es un antidepresivo de acción dual que inhibe selectivamente la recaptación neuronal de serotonina y norepinefrina (ISRN), aumentando los niveles de los neurotransmisores en el espacio sináptico (Madrakian et al. 2015). La VLX sufre metabolismo hepático por la acción de la isoenzima CYP2D6 transformándose en O-desmetilvenlafaxina, ambos compuestos bicíclicos (Dziurkowska and Wesolowski 2013). Tras una administración oral, muestra numerosas limitaciones ya que presenta un inicio lento de acción, una biodisponibilidad pobre (40-45%)(Haque et al. 2014) y necesita ser administrada de manera frecuente para mantener los niveles terapéuticos, ya que también posee una corta vida media (4-5 h) (Pund, Rasve, and Borade 2013). Es una de las sustancias terapéuticas más ampliamente usadas como fármaco antidepresivo; sin embargo, después de la administración oral, presenta efectos secundarios no deseables 57 como nauseas, estreñimiento, debilidad, somnolencia, insomnio, taquicardia, dolor de cabeza, fatiga y sequedad bucal (J. Tang et al. 2012). Como inconveniente añadido, se cree que el fármaco es un inductor de la glicoproteína P, lo que provoca el eflujo del mismo hacia el lado apical de la membrana hematoencefálica (Ehret et al. 2007)(O’Brien et al. 2012). Aprobada en 1993 por la FDA como el primer ISRN para el tratamiento del trastorno depresivo mayor (TDM), en la actualidad está disponible en más de 90 países (Watanabe et al. 2018). La dosis diaria de VLX puede variar entre 75 y 375 mg en función del tipo de formulación administrada (Harrison, Ferrier, and Young 2004) y está comercializada como una mezcla racémica de las formas enantioméricas S - (+) y R- (-) en cantidades iguales (Dziurkowska and Wesolowski 2013). En el mercado, está disponible bajo dos formulaciones de administración: formas de liberación inmediata (37.5, 50 y 75 mg) y sistemas de liberación controlada (75, 150 y 225 mg (“Venlafaxina” n.d.). Como se ha citado anteriormente, posee una vida media corta y debe ser administrada entre 2 y 3 veces al día para mantener las concentraciones en el intervalo terapéutico. Ello desemboca en el incumplimiento del tratamiento por parte del paciente y, por ello, la formulación de liberación controlada surge como una alternativa para aumentar la tolerancia del paciente y mejorar el beneficio/riesgo con respecto a las formas de liberación inmediata (H. A. Patel et al. 2011). Sin embargo, las presentaciones de liberación retardada siguen provocando numerosos efectos secundarios y por ello, numerosos autores han estudiado la 64 Química (Barcelona, España) y el acetonitrilo con calidad HPLC se obtuvo de VWR. El agua utilizada en los experimentos fue desionizada y filtrada (Milli-Q Academic, Merck Millipore, Massachusetts, EE.UU.). Cultivos celulares Para los experimentos celulares, las células endoteliales microvasculares cerebrales humanas (línea celular hCMEC/D3) fueron amablemente donadas por el grupo de investigación del Dr. Sarmento (Instituto de Investigaçao e Innovaçao em Saúde, i3s, Universidade do Porto, Portugal). El medio de cultivo basal (EBM2) se obtuvo de Lonza (Basilea, Suiza) y fue suplementado con suero fetal bovino inactivado (FBS) adquirido de Biowest (Missouri, EE.UU.), penicilina/estreptomicina, hidrocortisona, ácido ascórbico, HEPES y factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) que se obtuvieron de Sigma-Aldrich y concentrado lipídico químicamente definido (CD lipid concentrate) de Gibco, Thermo Fisher Scientific (Massachusetts, EE.UU.). Triton® x-100®, Bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5difeniltetrazolio (reactivo MTT) y paraformaldehído (PFA) fueron obtenidos de Sigma-Aldrich (St. Louis, EE.UU.). La solución de colágeno tipo I de la cola de rata (Gibco) y el colorante fluorescente de ADN, Hoechst® 33342 (Invitrogen) se adquirieron de Thermo Scientific (Massachusetts, EE.UU.). 65 Animales En los ensayos experimentales in vivo para estudiar la llegada de las partículas al cerebro tras administración intravenosa desarrollados en la Universidad de Verona (Italia) se usaron ratones adultos C57bl/6 machos adultos (3-6 meses) derivados de la colonia de cría de las instalaciones de animales de la Facultad de Medicina de la propia universidad. Como anestésico se empleó 2,2,2-tribromoetanol. Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Verona (CIRSAL) y se realizaron siguiendo los "Principios de cuidado de animales de laboratorio" (publicación NIH No. 86-23) con el fin de minimizar el número de animales utilizados y para evitar su sufrimiento. Además, los experimentos se llevaron a cabo bajo la autorización ética del Ministerio de Salud italiano, en estricto cumplimiento de las directivas del Consejo de Comunidades Europeas (86/609/CEE) y las directrices ARRIVE. Los animales se mantuvieron en condiciones ambientales estándar (temperatura y humedad) y un ciclo de luz/oscuridad de 12h/12h y acceso libre a alimentos y agua. Para los estudios en animales desarrollados en la Universidad de Sevilla (estudios de biodistribución in vivo tras administración intranasal), se emplearon ratones de la cepa C57BL/6J. Ketamidor (ketamina, 100 mg/mL)(Laboratorios Richter Pharma, Wels, Austria) y Sedín (hidrocloruro de 66 medetodimida, 1mg/mL)(Laboratorios Calier, Barcelona, España) fueron empleados como anestésicos. Los experimentos desarrollados fueron aprobados por el Comité Ético de Investigación Experimental de la Universidad de Sevilla. El proyecto autorizado por la Junta de Andalucía con número 20/03/2017/046, cumplió los requisitos para la investigación con animales experimentales de acuerdo con la Directiva de la Comunidad Europea (2012/707/UE) y con el artículo 41.1 del RD 53/2013 de la normativa española para el uso de animales de laboratorio. Ratones C57bl/6 de 3-4 semanas de vida (machos y hembras) con un peso comprendido entre 18-20 g. Los animales fueron tratados humanamente y se alojaron en jaulas específicas en el animalario de la Facultad de Farmacia con ciclos de luz/oscuridad de 12 h y acceso libre a alimentos y agua a una temperatura constante de 25 ± 0.5ºC. MÉTODOS Preparación de las NPs La elección de un método de preparación de NPs depende principalmente de la solubilidad del fármaco a encapsular y de la aplicación final (M. Li, Rouaud, and Poncelet 2008). La técnica de evaporación del disolvente de una emulsión ofrece gran versatilidad a la hora de incorporar el activo, ya que permite encapsular activos tanto hidrófilos como lipófilos. Sin 67 embargo, para fármacos hidrófilos que se pretenden encapsular en una matriz lipófila, esta técnica no resulta tan eficiente ya que pueden producirse pérdidas de la sustancia activa disuelta en la fase acuosa externa por difusión (Iqbal et al. 2015). Para solventar este problema, se emplean emulsiones múltiples (W1/O/W2), en la que el fármaco hidrófilo va disuelto en una fase acuosa interna (W1) (Ibraheem et al. 2014). Cuando se trata de fármacos poco solubles en agua o insolubles, generalmente se emplea una emulsión simple de fase externa acuosa O/W. De manera general, para la preparación de partículas por esta técnica empleando matrices poliméricas lipofilas, es necesaria la preparación previa de varias disoluciones: una solución acuosa W1, que contiene tensioactivo y en la que irá disuelto el fármaco para las NPs cargadas, una solución orgánica del polímero y, finalmente, una segunda solución acuosa de emulsionante (W2). Brevemente, la solución acuosa W1 se homogeneiza con la solución orgánica para formar una primera emulsión de fase externa oleosa (W1/O) y ésta emulsión primaria se adiciona a la fase W2 para dar lugar a una emulsión final múltiple (W1/O/W2)(R. Liu et al. 2005)(Ver figura 7). Para la formación de ambas emulsiones, es primordial el aporte de energía. 68 Figura 7. Principales etapas del método de evaporación del disolvente de una emulsión. Esta técnica ha sido previamente empleada por nuestro grupo de investigación (Martín-Banderas et al. 2013) para la elaboración de NPs de gemcitabina. Algunas modificaciones se han llevado a cabo durante el proceso con objeto de conseguir NPs con unas características fisicoquímicas (tamaño, propiedades superficiales, etc.) óptimas para alcanzar el objetivo planteado. En este trabajo, la producción de las partículas por el método de evaporación del disolvente de una doble emulsión se llevó a cabo en dos pasos principales: 69 (1) Adición gota a gota de 100 µL de una solución acuosa de PVA al 0.5% p/v (fase W1) a 2 mL de una solución orgánica de PLGA en acetato de etilo a una concentración de 4% p/v (fase O) en agitación constante y dejando sonicar durante 1 minuto. La fase W1 será la que contenga el fármaco en las NPs cargadas. En el presente trabajo, se ensayan diferentes concentraciones de fármaco (5%, 10%, 15%, 20% y 25% p/v). (2) La emulsión resultante del paso anterior es añadida de manera inmediata a 10 mL de una segunda disolución acuosa de PVA al 0.5% p/v (fase W2) en constante agitación (24.000 rpm), empleando un homogeneizador de alta velocidad, Polytron® PT 2500E (Polytron, Montreal, Canadá). Una vez formada la emulsión múltiple, se mantiene 1 minuto más en agitación. Seguidamente, la suspensión de partículas se dejó en bajo agitación magnética durante 2 h a temperatura ambiente en campana de extracción hasta la completa evaporación del disolvente orgánico. A continuación, las NPs se recogieron por ultracentrifugación (Centrífuga Eppendorf 504R; Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) a 15557 rcf durante 30 min, a 4ºC. Tras dos lavados, las NPs se resuspendieron en una solución de trealosa al 5% p/v, empleada como agente crioprotector. Finalmente, la suspensión de NPs se congeló y fueron liofilizadas para usarlas posteriormente (-80±0.5ºC y 0.054 mBar; 70 Cryodos-50, Telstar Industrial S.L., Tarrasa, España). Todas las formulaciones se prepararon por triplicado para asegurar la reproducibilidad de las mismas. Modificación superficial de las NPs de PLGA El objetivo de la funcionalización superficial de las NPs es el direccionamiento de las mismas hacia un órgano específico (en este caso, el cerebro), funcionalizándolas con ligandos específicos para receptores que se expresan en órganos, tejidos o células diana. Para acrecentar la internalización de las NPs en las células endoteliales de la BHE, dos biomoléculas diferentes de naturaleza peptídica (ligandos específicos del receptor de Tf), se conjugaron en la superficie de las partículas: Tf o TfRp. Como ya se ha citado con anterioridad, trabajos de investigación de numerosos autores avalan la capacidad de ambos ligandos para mejorar la capacidad de las NPs para atravesar la barrera (Chang et al. 2009)(Cui et al. 2013)(W. Guo et al. 2013)(Yan et al. 2013)(Gomes et al. 2017). La funcionalización de las NPs de PLGA se llevó a cabo siguiendo el método de la carbodiimida, aprovechando los grupos carboxilos terminales del PLGA para la formación de un enlace amida con el grupo amino de las moléculas peptídicas (Das, Dilnawaz, and Sahoo 2011) con algunas modificaciones (ver figura 8). 71 Figura 8. Esquema de las reacciones que comprenden la funcionalización de NPs a través del método carbodiimida. La conjugación se lleva a cabo en dos pasos: el primer paso incluye la activación de los ácidos carboxílicos de la superficie de las NPs poliméricas. Para ello, 20 mg de NPs se dispersaron en 1 mL de agua Milli-Q, seguidamente, gota a gota se añadieron 500 µL de EDC (1mg/mL) y 500 µL de NHS (1mg/mL) a la suspensión de NPs, manteniendo en agitación constante durante 4 h a temperatura ambiente y en atmósfera inerte. Para eliminar el exceso de EDC y NHS, la suspensión de NPs se recogieron por ultracentrifugación (Centrífuga Eppendorf 504R; Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) a 15557 rcf durante 30 minutos a 4ºC. En la siguiente etapa, las NPs activadas se redispersaron en 2 mL de agua Milli-Q y se añadieron 200 µL de una solución acuosa de Tf (1 mg/mL). La suspensión se mantuvo en agitación constante durante toda la noche. Tras este tiempo, la cantidad de Tf no unida a las NPs se eliminó por ultracentrifugación en las condiciones mencionadas anteriormente. La cantidad de ligando no unida se analizó 72 posteriormente para comprobar la eficacia de conjugación (ver apartado 4.2.8). El mismo protocolo fue empleado para la funcionalización de las NPs poliméricas con TfRp. Paralelamente, se realizó un estudio de modificación superficial sin emplear el método de la carbodiimida, incubando la suspensión de NPs (2 mg/mL) únicamente con la solución de los ligandos (sin EDC ni NHS) con el fin de comprobar que los ligandos se unían covalentemente en lugar de quedar adsorbidos en la superficie de las partículas. Preparación de NPS fluorescentes para estudios in vitro de captación celular. Para conseguir la visualización de las partículas en los ensayos de captación celular, se usó NR como fluoróforo, siguiendo un protocolo similar al desarrollado en el apartado 4.2.1 con algunas modificaciones. De manera breve, 100 µL de una solución de NR en DMSO (1 mM) se disolvieron en 2 mL de una solución de PLGA en acetato de etilo. La solución formada se añadió gota a gota a 10 mL de una solución de PVA (0.5% p/v) en agitación intensa constante (24.000 rpm) empleando un homogeneizador de alta velocidad (Polytron® PT 2500 E)(Polytron, Montreal, Canadá). La suspensión de NPs se dejó en agitación magnética constante hasta la completa evaporación del disolvente orgánico. Tras esto, se siguieron los 73 mismos pasos que para la preparación y modificación superficial de las NPs cargadas con VLX (Apartados 4.2.1 y 4.2.2). Preparación de las NPs fluorescentes para estudios de permeabilidad La evaluación de la permeabilidad de las NPs a través de un modelo in vitro de BHE se llevó a cabo usando partículas preparadas con PLGA previamente conjugado con FITC. Para la formación del conjugado PLGA-FITC se empleó el método de carbodiimida (Yin et al. 2007) con ligeras modificaciones, estableciendo una unión covalente entre polímero y fluorocromo. El primer paso implica la activación de los grupos carboxilos del PLGA, para esto, a un 1 mL de una solución de PLGA (20% p/v) en diclorometano (DCM), se añadieron gota a gota 2 mL de una solución de DCM que contenía EDC (1.02% p/v) y NHS (0.8% p/v), incubándose durante 2 h a temperatura ambiente. Después, se añadió gota a gota 200 μL de una solución de FITC 0,1 M en DCM: piridina (1:1). La mezcla se agitó durante 2 h en la oscuridad y, posteriormente, se incubó durante la noche a 4º C. Para obtener el PLGA marcado, se usaron 30 mL de metanol, añadidos gota a gota en frío, provocando la precipitación del polímero. Finalmente, el conjugado FITC-PLGA se lavó con metanol para eliminar la fluoresceína no conjugada y, posteriormente con agua Mili-Q para eliminar los residuos de metanol. El polímero marcado se congeló, liofilizó y almacenó en la oscuridad a 4 ºC. 80 del cromóforo aporta sencillez, rapidez y sensibilidad, mostrando gran tolerancia a compuestos que interfieren en otros métodos de cuantificación (Brown, Jarvis, and Hyland 1989). Para el cálculo cantidad de ligando peptídico unido a la superficie de las NPs, se estableció una recta de calibrado en un intervalo de concentraciones entre 0-250 µg/mL para ambas biomoléculas (R2 = 0,999). La cuantificación se llevó a cabo de manera indirecta, midiendo la cantidad de ligando no unido covalentemente a la partícula. La eficacia del proceso también se expresa en µg de ligando unido por gramos de NPs (Das, Dilnawaz, and Sahoo 2011). Estudio de la influencia de la congelación en las NPs. Optimización de las condiciones de liofilización. La liofilización es un proceso que comprende tres etapas diferenciadas: la primera etapa consiste en la congelación de la suspensión acuosa de NPs, durante esta etapa la suspensión se enfría y comienzan a formarse los cristales de agua generando tensiones que pueden conducir a su pérdida de estabilidad. Seguidamente, el paso de secado primario, implica la sublimación del hielo del producto congelado. Tras la completa sublimación, se forman poros que se corresponden con los sitios ocupados por el hielo anteriormente. Finalmente, el agua absorbida por el producto es eliminada en un secado secundario (X. (Charlie) Tang and Pikal 2004). Una vez liofilizadas, (a) las NPs deben preservar las características iniciales, (b) los tamaños y la distribución de tamaños deben ser similares a los del producto previo sin liofilizar, 81 (c) la resuspensión debe ser aceptable con un tiempo corto de reconstitución y (d) la actividad farmacológica del activo debe permanecer inalterada. Se trata de una técnica lenta y costosa, ampliamente usada para mejorar la estabilidad de diversos activos farmacéuticos (Abdelwahed et al. 2006). La congelación es un proceso muy agresivo para las NPs por tanto, es de vital importancia el empleo de un crioprotector para asegurar la calidad final del producto, ya que el polímero, tras sufrir un proceso de congelación tiende a formar un gel difícil de resuspender (Abdelwahed et al. 2006). Los crioprotectores más comúnmente usados son: alcoholes de bajo peso molecular como el polietilenglicol o azúcares como manitol, trealosa o sacarosa (Almalik et al. 2017). En el presente trabajo, se evaluó la influencia de las diferentes proporciones de trealosa:NPs, estudiándose el efecto en agua, y 1:1.5, 1:3, 1:9, 1:15 de trealosa:NPs respectivamente, que se añadieron directamente a una suspensión de NPs blancas sin funcionalizar tras los lavados por ultracentrifugación, antes de congelarlas. El tamaño de las NPs se midió tras un proceso completo de liofilización, resuspendiéndolas en agua Milli-Q. También se evaluó el efecto del crioprotector midiendo el tamaño de las NPs después de descongelarlas, sin liofilizar. 82 Estudios de liberación in vitro Conocer la liberación in vitro del activo desde los nanosistemas es imprescindible para controlar el porcentaje liberado en función del tiempo. El estudio se llevó a cabo mediante un método de diálisis empleando tampón fosfato (PBS) a pH 7.4 ± 0.1 como medio de liberación a 37 ± 0.5ºC. Previamente, las bolsas fueron hidratadas con agua durante 12 h (antes de su uso), tras esto, 5 mL de cada suspensión de NPs (VLX-PLGA, Tf-VLX-PLGA y TfRp-VLX-PLGA) en PBS a razón de 5 mg partículas/mL (equivalente aproximadamente a 490 µg de fármaco) se introdujeron en la bolsa de diálisis (2 KDa, tubos de membrana de diálisis Spectrum®Spectra/Por® 6, California, EE.UU.) fijadas en los extremos con pinzas y se colocaron en el interior de un Erlenmeyer cónico con 100 mL de tampón. Las muestras se agitaron a 200 rpm durante todo el ensayo y, a los tiempo pre-fijados (0.5, 2, 4, 8, 12, 24 h) se retiraron alícuotas de 0.5 mL de muestra del medio de liberación, suplidos con un volumen igual de PBS a la misma temperatura para garantizar las condiciones sink. El ensayo se realizó por triplicado. Finalmente las muestras se filtraron y se inyectaron (20 µL) en el sistema de HPLC con las condiciones descritas en el apartado 4.2.7.1 para evaluar el porcentaje de activo liberado. En este experimento, se estudió la posible influencia de la presencia de los ligandos en la superficie de las NPs funcionalizadas con respecto a las NPs simples. 83 Estabilidad de las formulaciones de NPs en líquido cefalorraquídeo (LCR) artificial Para desarrollar estudios in vivo, es necesario valorar la estabilidad de las partículas en los medios principales en los que se van a encontrar en el organismo. Por tanto, se desarrolló un estudio para evaluar la perdurabilidad de las NPs en LCR, uno de los principales líquidos del SNC. Para ello, se preparó un LCR artificial siguiendo la formulación empleada por Gartziandia et al. Brevemente, en 1 L de agua Mili-Q se disolvió: 6.15 g NaCl, 0.216 g KCl, 0.447 g MgCl2, 0.255 g CaCl2, 6.009 g Na2CO3, 0.057 g Na2HPO4, 0.613 g D-glucosa, 0.2 g de ácido ascórbico y 0.3 g de albúmina sérica bovina (BSA) y el pH se ajustó a 7.35 (Gartziandia et al. 2016). Por tanto, 1 mg de cada formulación de NPs (PLGA-, VLXPLGA-, Tf-PLGA-, TfRp-PLGA-, Tf-VLX-PLGA-, TfRp-VLX-PLGA-NPs) se dispersaron en 5 mL del fluido artificial y la suspensión se mantuvo en agitación magnética durante 24 h a 37ºC. Antes de comenzar el ensayo, se midió el tamaño y la distribución de tamaños (PdI) de las partículas usando un Zetasizer Malvern ZS90 (Malvern Instruments, UK), tras el tiempo de incubación, se volvió a medir el tamaño y PdI de las partículas. 84 Estudios celulares in vitro Cultivos celulares Las células endoteliales microvasculares cerebrales humanas (línea celular hCMEC/D3) derivan de los microvasos del lóbulo temporal humanos, aislándolos del tejido extirpado, con alto nivel de expresión del transportador de glucosa (GLUT1) y el receptor de Tf (Weksler, Romero, and Couraud 2013). Las células fueron cultivadas en medio basal de crecimiento endotelial (EBM2) suplementado con FBS (5% v/v), penicilina-estreptomicina (1% v/v), ácido ascórbico (5 µg/mL), hidrocortisona (1.4 µM), concentrado lipídico químicamente definido (CD Lipid concentrated) (1/100 v/v), HEPES (10 mM) y factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF). Este último suplemento se añadió en el último momento, a la hora de usar el medio. El cultivo celular se mantuvo a 37ºC en un ambiente humidificado con 5% de CO2 (Incubadora de CO2AutoFlow UN-4750 Water Jacket; Nuaire, EE.UU.). El medio fue reemplazado cada dos días y las células fueron subcultivadas después de alcanzar, aproximadamente, un 80% de confluencia (Gomes et al. 2017). Estudios in vitro de toxicidad celular Para evaluar la viabilidad de las células expuestas al contacto con las NPs se realizó el ensayo de reducción del Bromuro de 3 (4,5 dimetil-2-tiazoil)-2,5-difeniltetrazólico (MTT), un ensayo colorimétrico fácil y cómodo que mide cuantitativamente la actividad metabólica de las células viables y que se basa en la 85 capacidad de las enzimas deshidrogenasas mitocondriales de las células metabólicamente activas de reducir un compuesto amarillo e hidrófilo, la sal de bromuro de tetrazolio (3- (4,5-dimetiltiazol-2il) -2,5-difeniltetrazolio), a un compuesto insoluble (formazán), de color púrpura. Cuando las células captan la sal de bromuro de tetrazolio (MTT) se rompen y los cristales de formazán se solubilizan con DMSO, dando como resultado una solución de color morado, cuya intensidad dependerá del grado de viabilidad celular (Kong et al. 2011). El ensayo detecta células vivas y debe hacerse en la oscuridad, ya que el reactivo MTT es sensible a la luz (Mosmann 1983). La viabilidad celular se evaluó por este ensayo, poniendo en contacto las células con los diferentes nanosistemas y la VLX libre durante 24 h a distintas concentraciones: 0.1, 1, 10, 100 y 1000 µg/mL de NPs, equivalentes a 0.014, 0.14, 1.4, 14 y 140 µg/mL de VLX respectivamente. El fármaco libre se añadió bajo las mismas condiciones. Las células hCMEC/D3 fueron sembradas con una densidad de 1 x 105 células/pocillo en una placa de 96 pocillos (Nunclon®; ThermoScientific, Waltham, EE.UU.) e incubadas durante 24 h (37ºC) para permitir la adhesión de las células. El medio se retiró completamente y las células se lavaron dos veces con 200 µL de PBS (pH 7.4). Después, las células se incubaron con las diferentes concentraciones de NPs y fármaco libre resuspendidas en medio de cultivo durante 24 h. Tras este tiempo, las suspensiones se 86 retiraron y las células se lavaron dos veces con 200 µL de PBS. Seguidamente, se añadieron 200 µL de una solución de MTT (0.5 mg/mL en medio de cultivo) a cada pocillo durante 4 h, en la oscuridad. Finalmente, la solución de MTT fue descartada y los cristales de formazán fueron disueltos con 200 µL de DMSO, agitando en oscuridad durante 10 min, a temperatura ambiente para facilitar la disolución de los cristales. La absorbancia se midió en un lector de microplacas (Synergy HT, Biotek, Vermont, EE.UU.) a 590 nm y la viabilidad celular se calculó siguiendo la siguiente ecuación (3): 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 (%)= 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙− 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜−𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑥 100 (Ec.3) Las células incubadas solo con medio basal EBM-2 se empleó como control negativo (todas las células se mantienen viables) y una solución de Triton® X-100 como control positivo (todas las células mueren). Estudios in vitro de internalización celular Una de las ventajas de los nanosistemas transportadores de fármacos es su capacidad para internalizarse en lugares no accesibles para otras formas farmacéuticas tradicionales debido a su tamaño y su éxito depende en gran medida de su capacidad de interacción con las células u órganos diana. En el caso que nos ocupa, es de vital importancia evaluar la penetración de las partículas en las células endoteliales que forman la BHE para alcanzar el cerebro ya que, de ello, dependerá en gran medida su efecto terapéutico. Sin embargo, no siempre buenos resultados in 87 vitro se traducen en resultados in vivo de calidad pero pueden proporcionar algunas evidencias preliminares del potencial de las formulaciones nanométricas. En este estudio, se empleó la línea celular hCMEC/D3 y se evaluó la captación de las partículas (NPs sin modificar y modificadas superficialmente con el Tf o TfRp) por parte de las mismas. La internalización de las partículas en las células se determinó por análisis cualitativo y cuantitativo. Para visualizar las NPs en los ensayos de internalización celular in vitro se prepararon partículas fluorescentes con NR como fluoróforo (protocolo descrito en el apartado 4.2.3). Análisis cualitativo por microscopía confocal Para el análisis cualitativo, las células hCMEC fueron sembradas en cover-slips (1x105 células/cover-slip). Previamente, los cover-slips (12 mm) se situaron en un placa de 24 pocillos (Nunclon®; ThermoScientific, Waltham, EE.UU.), precubiertas con colágeno tipo I (50 µg/mL) durante toda la noche para lograr la adhesión de las células. Después de esto, las células fueron lavadas dos veces con PBS e incubadas con una suspensión de NPs (no funcionalizadas y funcionalizadas con Tf o TfRp) cargadas con NR (50 µg/mL en medio sin FBS) durante 30 min a 37ºC. Tras la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS con el fin de eliminar las NPs no internalizadas y los núcleos de las células se tiñeron con Hoechst® 33342 durante 10 min. A continuación, las células se volvieron a lavar dos veces con PBS para eliminar el 88 exceso de Hoechst® 33342 y se fijaron con PFA (4% p/v en PBS) durante 20 min. Finalmente, las células se lavaron dos veces con PBS y se montaron en un portaobjetos con PBS:glicerol (20:80) para ser observadas en el microscopio confocal de barrido láser (CLSM)(Zeiss LSM 410, LSM Tech, Etters, EE.UU.) con el software (Image Browser ZEN confocal Zeiss) para la formación de imágenes. Las células sin NPs fueron utilizadas como control. Análisis cuantitativo por citrometría de flujo Para confirmar cuantitativamente los resultados obtenidos en los ensayos cualitativos, la captación celular se estudió por citometría de flujo. Para ello, previamente las células se cultivaron en frascos de cultivo de 25 cm2 (Nunclon®; Thermo Scientific, Waltham, EE.UU.) hasta alcanzar un 80% de confluencia (aproximadamente 2.5 x 106 células). Entonces, el medio se retiró y las células se incubaron con la suspensión de NPs cargadas con NR (funcionalizadas con Tf o TfRp y no funcionalizadas) (50 µg/mL en medio sin FBS) durante 30 min. Pasado el tiempo de incubación, la suspensión fue retirada y las células fueron lavadas dos veces con PBS para eliminar las partículas no internalizadas de la suspensión de NPs. Las células se levantaron con tripsina-EDTA (1 mL) durante 3 min. Después, se lavaron 2 veces con PBS y se fijaron con PFA al 4% p/v en PBS durante 15 min. Por último, para eliminar el PFA, las células se lavaron dos veces con PBS por centrifugación y la suspensión celular resuspendida se añadió a tubos de citometría. La cantidad de NPs fluorescentes en el interior de las células fue medida por 89 citometría de flujo (FC 500 Cytomics MPL; Beckman Coulter Inc., Brea, EE.UU.) y los datos se analizaron con el software MXP. Estudios de permeabilidad a través de un modelo de BHE in vitro Modelos de BHE in vitro Los modelos de BHE in vitro surgen con la idea de reducir el empleo de animales para evaluar la permeabilidad de la misma y facilitar los estudios in vitro de transporte de fármacos y la fisiopatología de las células que componen la barrera (Helms et al. 2016). Sin embargo, la meta es desarrollar un modelo con unas características que reproduzcan de la manera más ajustada posible la situación in vivo ya que no existe un modelo de barrera perfecto que posea las mismas características que los modelo in vivo (Czupalla, Liebner, and Devraj 2014). La Resistencia Eléctrica Transepitelial (TEER) es una medida de la impedancia de la barrera a las sustancias que pretenden alcanzar el cerebro, nos informa de la robustez de la membrana y puede medirse colocando un electrodo en el lado apical (sangre) y el otro en la parte basolateral (cerebro). De manera general, se emplean líneas celulares inmortales para suplir el uso de células cerebrales primarias humanas (difícilmente accesibles) que pueden obtenerse de diferentes especies. Las líneas inmortales, entre las que se incluye la línea celular humana hCMEC/D3 utilizada en este estudio, forman monocapas de células con valores de TEER comprendidos entre 20-200 Ω·cm2, muy inferior a los valores de TEER in vivo (>1000 96 seguido de PFA al 4% en PBS. El cerebro y el bazo (como órganos control) fueron extraídos y se almacenaron durante al menos dos días en sacarosa (usado como crioprotector) al 30% en PBS a 4º C. Transcurrido este tiempo, se usó un micrótomo de congelación para cortar los tejidos en secciones de 40 µm. En cuanto a los cerebros, se montaron tres secciones por animal, correspondientes a los niveles anterior, medio y posterior con un medio de montaje que contenía P-fenilendiamina (como neutralizador de radicales libres). Los portaobjetos se observaron con un microscopio confocal Leica SP5 (Leica, Mannheim, Alemania) usando un objetivo de inmersión en glicerol 63X (N.A. 1.3) en combinación con un zoom de 2.4X (tamaño de píxel de 100 nm). Las imágenes en serie de planos Z (0,46 μm) se capturaron con el software LAS con una resolución de 1024 por 1024 píxeles. Análisis citofluorimétrico En el momento del sacrificio, los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y los órganos (cerebro y bazo) se diseccionaron rápidamente y se homogeneizaron en PBS usando un mezclador de mano. Después de la centrifugación para eliminar los restos, los sobrenadantes se filtraron a través de diferentes filtros de células (40 μm para muestras de cerebro, 70 μm para las del bazo). El filtrado se analizó por citometría de flujo empleando un citómetro FACS Canto I (Becton Dickinson, San Jose, California, EE.UU.), adquiriéndose entre 2x104 y 4x104 eventos. Los datos de 97 citometría de flujo se trataron usando el software FlowJo (TreeStar, Ashland, Oregon, EE.UU.). Evaluación de la biodistribución de las NPs en el organismo vía nose-to-brain tras administración intranasal Adicionalmente, en base a los resultados obtenidos tras la administración intravenosa, se llevaron a cabo ensayos de biodistribución empleando la ruta nose-to-brain, una vía prometedora para mejorar el acceso numerosos activos terapéuticos al SNC. Para ello, se evaluaron cuatro formulaciones de NPs fluorescentes (FITC-PLGA-, FITC-PLGA-PEG, Tf-FITC-PLGAy TfRpFITC-PLGA-NPs), encapsulando FITC como fluoróforo en estas formulaciones de NPs. Las partículas poliméricas se caracterizaron por su tamaño, PdI y potencial zeta. Para el ensayo, todas las formulaciones se administraron a través de la ruta nose-to-brain empleando la administración intranasal usando una micropipeta, administrando un volumen total de 15 µL (7.5µL en cada fosa nasal) de la suspensión de las partículas en estudio. Las NPs se resuspendieron en suero fisiológico estéril (aproximadamente 30 mg/kg) y se administraron a razón de 2.5 µL con intervalos de 3 minutos entre cada administración, en fosas nasales alternas. Antes de la administración, los animales fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal con una mezcla de ketamina (15% v/v) y medetomidina (10% v/v). Veinte animales fueron 98 divididos en cinco grupos (4 animales por grupo). Los grupos 1, 2, 3 y 4 se trataron con las partículas fluorescentes (FITC-PLGA-, FITC-PLGA-PEG, Tf-FITC-PLGAy TfRp-FITC-PLGA-, respectivamente). Un quinto grupo se utilizó como grupo control, tratándose con PBS en las mismas condiciones. Tras 30 minutos, a los ratones se les realizó una perfusión con PBS estéril para limpiar los órganos y tejidos de sangre y, reducir así las posibles interferencias en el citómetro con las células sanguíneas. Después corazón, cerebro, riñones, pulmones, bazo e hígado fueron recogidos y conservados congelados en una solución de sacarosa al 30%, usado como crioprotector. Adicionalmente, se añadió un grupo de animales con el fin de evaluar la fluorescencia total proveniente de las NPs que llegaría al cerebro en caso de que todas las NPs alcanzaran el tejido. Para ello, los ratones fueron anestesiados con una mezcla de ketamina (15% v/v) y medetomidina (10% v/v) y perfundidos con PBS estéril. Tras esto, se extrajeron los cerebros y se inyectaron con la dosis total de cada tipo de partículas (FITC-PLGA-, FITC-PLGA-PEG, Tf-FITC-PLGAy TfRp-FITC-PLGA NPs) administrada en los ensayos de nose-to-brain, con el fin de comprobar la fluorescencia de la muestra total. Para el análisis, los tejidos se homogeneizaron en 1 mL de PBS empleando un homogeneizador Precellys 24® (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, Francia) y el homogeneizado se filtró con filtros celulares de 70µm (BD Falcon, Corning, Nueva York, EE.UU.). Todas las muestras se analizaron 99 mediante citometría de flujo (Cytomics FC 500 MPL; Beckman Coulter, EE. UU.). 100 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estudios de caracterización de las NPs preparadas La síntesis de NPs se llevó a cabo por el método de evaporación del disolvente de una emulsión siguiendo los pasos descritos en la sección 2.2.1. de Materiales y Métodos y fueron caracterizadas por su tamaño, índice de polidispersión, potencial zeta, morfología, eficacia de encapsulación y carga de fármaco. La emulsión obtenida no presentó inestabilidad ni formación de agregados durante el tiempo de evaporación de disolvente. Tras la conjugación con ambos ligandos, se estudió la eficacia de conjugación y las NPs se volvieron a caracterizar por tamaño, distribución de tamaños y potencial zeta para evaluar la influencia de la conjugación superficial. Determinación del tamaño medio y distribución de tamaños El tamaño y la distribución de tamaños de las NPs se determinaron por dispersión láser. Los resultados obtenidos se expresan como el valor del tamaño medio (diámetro hidrodinámico) y su desviación estándar (DE). Varias velocidades de homogeneización fueron testadas en el homoginazador de alta velocidad Polytron® para evaluar la influencia de la misma en el tamaño de las NPs. Finalmente, la velocidad se estableció en 24.000 rpm para todas las formulaciones al no observarse diferencias cuando se aumentaba la velocidad hasta 30.000 rpm (datos no mostrados). 101 Tras el análisis de las muestras, las NPs mostraron un diámetro hidrodinámico no superior a 230 nm y un PdI inferior a 0.2 en todas las formulaciones, indicando que los sistemas elaborados son ampliamente monodispersos (PdI < 0.2)(Stetefeld, McKenna, and Patel 2016) (Tabla 2). Formulación Diámetro medio ± DE (nm) PdI ± DE PLGA NPs 192.1 ± 6.7 0.128 ± 0.033 TfPLGA NPs 228.8 ± 1.3 0.104 ± 0.029 TfRp-PLGA NPs 222.6 ± 1.2 0.078 ± 0.053 VLX+PLGA NPs 194.3 ± 3.7 0.106 ± 0.018 VLX+Tf-PLGA NPs 218.6 ± 0.5 0.078 ± 0.008 VLX+TfRp-PLGA 216.3 ± 2.7 0.067 ± 0.025 Tabla 2. Tamaño medio y distribución de tamaño de NPs blancas y cargadas (funcionalizadas y no funcionalizadas) (n=9; DE = desviación estándar; PdI: índice de polidispersión). Según los datos de la tabla, el tamaño medio de las NPs de PLGA blancas fue de 192.1 ± 6.7 nm y su PdI fue 0.128 ± 0.033, lo que se traduce en una alta homogeneidad de la población. También se estudió la influencia de la carga de fármaco y la presencia de ligandos en la superficie de las partículas en el tamaño de las partículas. Las NPs cargadas con VLX mostraron un tamaño medio de 194.3 ± 3.7 nm y una distribución de tamaños media de 0.106 ± 0.018. Gráficamente, los resultados pueden observarse en las figuras 11 y 12. 102 Figura 11. Histogramas de los tamaños de las formulaciones de NPs blancas, funcionalizadas y sin funcionalizar (rojo: NPs blancas; verde: NPs funcionalizadas con Tf; azul: NPs funcionalizadas con TfRp) Figura 12. Histogramas de los tamaños de las formulaciones de NPs cargadas con fármaco, funcionalizadas y sin funcionalizar (rojo: NPs no funcionalizadas; verde: NPs funcionalizadas con Tf; azul: NPs funcionalizadas con TfRp) Para lograr alcanzar el cerebro tras atravesar la BHE, la superficie de las NPs se funcionalizó con dos ligandos específicos del receptor de Tf. De acuerdo con la literatura publicada, las NPs conjugadas exhibieron un ligero incremento de tamaño medio (1113%) comparada con las NPs no funcionalizadas. Dicho incremento puede explicarse por la presencia de las biomoléculas en la superficie (Ulbrich et al. 2009)(Pitek et al. 2012). Para las NPs preparadas para la visualización de los ensayos celulares in vitro, se encapsuló NR como fluoróforo. La misma tendencia que para las partículas preparadas con el activo se observa con este tipo de partículas, exhibiendo un ligero aumento de tamaño cuando se modificaban superficialmente (Tabla 3). 103 Formulación Diámetro medio ± DE (nm) PdI ± DE NR+PLGA NPs 215.6 ± 2.2 0.048 ± 0.022 NR+Tf-PLGA NPs 234.9 ± 1.5 0.078 ± 0.053 NR+TfRp-PLGA NPs 228.8 ± 4.8 0.092 ± 0.071 Tabla 3. Tamaño medio y distribución de tamaño de NPs de NR (funcionalizadas y no funcionalizadas) (n=9; DE = desviación estándar; PdI: índice de polidispersión). Para los ensayos de permeabilidad in vitro de las NPs, se prepararon NPs fluorescentes empleando FITC como fluoróforo. Para ello, el polímero se conjugó con el fluoróforo tal y como se describe en el apartado 4.2.4. Como paso previo a la preparación de las partículas y con el fin de evaluar el rendimiento de asociación entre el polímero y FITC, se construyó una curva de calibración (02 μg / mL) (R2 = 0,998). Después del proceso de conjugación, se obtuvo un rendimiento de asociación del 2.390%, lo que supone 0,956 μg de FITC por mg de polímero. Las NPs de FITC-PLGA se prepararon mediante DE-SEV siguiendo el mismo procedimiento que para las nanopartículas cargadas con fármaco (sin incluir el activo) y se funcionalizaron empleando el método de carbodiimida (desarrollado en el apartado 4.2.2). Los tamaños obtenidos tras la preparación se muestran en la tabla 4. 104 Formulación Diámetro medio ± DE (nm) PdI ± DE cFITC-PLGA NPs 203.6 ± 1.9 0.068 ± 0.018 Tf-cFITC-PLGA NPs 210.3 ± 1.2 0.040 ± 0.033 TfRp-cFITC-PLGA NPs 207.3 ± 0.8 0.034 ± 0.023 Tabla 4. Tamaño y distribución de tamaños de las partículas fluorescentes de cFITC-PLGA (funcionalizadas y no funcionalizadas) (n = 9; DE: desviación estándar; PdI: índice de polidispersión; cFITC: FITC conjugado). Igual que ocurre con las formulaciones no fluorescentes, las NPs aumentan de tamaño ligeramente (2-4%) cuando son superficialmente modificadas con los ligandos específicos. Por último, para los ensayos de biodistribución in vivo, además de las NPs de PLGA (funcionalizadas con ambos ligandos y sin funcionalizar), se prepararon partículas fluorescentes PEGiladas con FITC, usando el polímero PLGA-PEG. En este caso, el fluoróforo fue encapsulado (no conjugado) para evitar interferencias en la superficie con las cadenas de PEG. También presentes en la superficie. Los resultados se muestran en la tabla 5. Formulación Diámetro medio ± DE (nm) PdI ± DE FITC+PLGA NPs 189.5 ± 3.8 0.025 ± 0.023 FITC+Tf-PLGA NPs 205.4 ± 1.3 0.025 ± 0.023 FITC+TfRpPLGA NPs 202.4 ± 3.9 0.058 ± 0.015 FITC+PLGA-PEG NPs 231.2 ± 3.2 0.154 ± 0.007 Tabla 5. Tamaño y distribución de tamaños de las partículas fluorescentes de FITC encapsulado (funcionalizadas y no funcionalizadas) (n = 9; DE: desviación estándar; PdI: índice de polidispersión). 105 Todas las formulaciones de NPs preparadas para este ensayo mostraron una estrecha distribución de tamaños, lo que indica el alto grado de homogeneidad de las NPs preparadas. Las NPs fluorescentes sin funcionalizar mostraron un tamaño inferior a 200 nm que, tras la funcionalización, aumentaron ligeramente de tamaño (6-8%). Sin embargo, las NPs PEGiladas exhibieron un tamaño mayor, por encima de 230 nm de diámetro. Tras el análisis de estos resultados, se puede resumir que, siguiendo los protocolos desarrollados en los correspondientes apartados de Materiales y Métodos, todas las formulaciones elaboradas muestran índice de polidispersión inferior a 0.2 lo que indica un alto grado de homogeneidad. Las formulaciones de NPs sin modificación superficial destinada a los ensayos de biodistribución in vivo así como las cargadas con VLX mostraron tamaños inferiores a 200 nm, por lo que se consideran adecuadas para este tipo de administración ya que, según la literatura publicada (Tong, Qin, and Sun 2017), partículas con tamaño inferior a 200 nm son capaces de alcanzar el sistema nervioso central de manera más eficiente. Determinación de la carga eléctrica superficial de las NPs El potencial zeta de las partículas está relacionado con la carga eléctrica superficial de las mismas. El valor de dicho parámetro puede influir en sus propiedades fisicoquímicas, entre las que destaca la estabilidad del sistema o la interacción con otros compuestos cargados. Por lo tanto, junto con tamaño y distribución 112 Figura 14. Valores de eficacia de encapsulación (EE%) y carga de fármaco obtenidos para partículas preparadas con diferente concentración inicial de fármaco (n=9; barras de error = desviación estándar). En función de los resultados obtenidos hasta el momento, se seleccionó aquella formulación preparada con la mayor concentración de activo para continuar con los estudios posteriores. Ambos parámetros también se evaluaron tras el proceso de funcionalización superficial para determinar si se producía una liberación del fármaco durante el tiempo de incubación. Tras el análisis de HPLC, las muestras no mostraron una liberación de fármaco a concentraciones detectables por el equipo. Análisis de la eficacia de funcionalización Una modificación superficial efectiva es un requisito indispensable para lograr una interacción ligando-receptor 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 70 80 5% 10% 15% 20% 25% Carga de fármaco (% p/p) EE (%) Concentración inicial de fármaco (%p/v) EE% Carga de fármaco (%) 113 adecuada. Por tanto, para evaluar la cantidad de ligando unida a la superficie de las partículas, se empleó un método colorimétrico basado en la absorbancia que permite detectar moléculas proteicas en función de su concentración en el medio para evaluar la efectividad de la unión covalente entre polímero cuando la superficie de las partículas sufría la activación de sus grupos funcionales. De manera adicional, se estudió la modificación superficial sin la previa activación de los grupos carboxilo, con el fin de comprobar que los ligando se unían covalentemente en lugar de quedar adsorbidos en la superficie. La cantidad de ligando conjugado superficialmente se determinó mediante el método de BCA (desarrollado en el apartado 4.2.8) de manera indirecta, es decir, midiendo la presencia de ligando libre no unido en el sobrenadante de la suspensión de partículas tras la incubación con el ligando. En las partículas modificadas con Tf, se conjugó aproximadamente 7.5-8 µg de Tf por mg de partícula, lo que equivale a una eficacia de conjugación (EC%) de 75 – 80% mientras que para las modificadas con TfRp este valor fue de 7 µg de péptido por mg de NPs (alrededor del 70% de eficacia). Dichos valores no difirieron entre las formulaciones cargadas con fármaco y las no cargadas. En cuanto a las partículas fluorescentes con NR empleadas en los estudios celulares in vitro, la cantidad media de Tf y TfRp conjugado se confirmó con el mismo método que para las NPs no fluorescentes. En este caso, se detectó alrededor de 6.5 µg de Tf y 114 5.5 µg de péptido por mg de nanopartícula. Dichos valores suponen, de manera aproximada, un 67% y 56% de eficacia de conjugación, respectivamente. Para las partículas fluorescentes preparadas con el conjugado PLGA-FITC, tras la conjugación con Tf se obtuvo una eficacia de conjugación en torno al 85%, que se corresponde con, aproximadamente 8.5 µg de ligandos por mg de nanopartícula. Para aquellas partículas funcionalizadas con TfRp, se obtuvo alrededor de 8 µg de ligando por mg de nanopartícula, obteniéndose resultados similares cuando el FITC fue encapsulado. Finalmente, cuando la modificación superficial se probó sin la previa activación de la superficie de las nanopartículas, ls eficacia de encapsulación resultó baja (inferior al 30%) y no reproducible comparada con la mostrada por las partículas activadas previamente. Por tanto, a raíz de los resultados obtenidos, se concluye que para todas las formulaciones, se logran, altas eficacias en el proceso de funcionalización (por encima de 60%, de manera general). Estudio de la influencia de la congelación en las NPs. Optimización de las condiciones de liofilización Dado que tanto la congelación como la liofilización son procesos agresivos para la estabilidad de las partículas, es necesario establecer las condiciones óptimas para ambos procesos y mantener la integridad morfológica de las formulaciones. En este caso, es de vital importancia mantener tamaños muy similares a los 115 mostrados por las NPs frescas debido a que el acceso de las mismas al cerebro está limitado por su tamaño. Para lograrlo, es necesario la adición de un crioprotector que conserve la formulación intacta y, para ello, se llevó a cabo un estudio cuya finalidad fue determinar la concentración óptima del mismo en disolución, evaluándose la estabilidad de las partículas tras la congelación y/o liofilización (- 80±0.5ºC, 0.057 mBar, Cryodos-50, Telstar Industrial, Terrasa, España). La trealosa es uno de los crioprotectores más empleados para la conservación de las partículas y el elegido para este estudio. La proporción de trealosa:NPs empleadas en el estudio fueron 1:1.5, 1:3, 1:9 y 1:5, para la resuspensión de las formulaciones previa a los procesos de congelación-liofilización. La trealosa se adicionó en solución acuosa y, adicionalmente se ensayó el efecto cuando las partículas eran resuspendidas en agua (sin crioprotector). En la figura 15 se muestra el efecto de la adición de diferentes concentraciones de trealosa en el tamaño y la distribución de tamaños de las NPs tras un proceso de congelación. 116 Figura 15. Efecto de la adición de diferentes concentraciones de trealosa en el tamaño y dispersión de las partículas tras un proceso de congelación. Como se observa en la figura 15, sólo aquellas partículas congeladas en una proporción trealosa:NPs mantuvieron tanto un tamaño como una distribución de tamaños prácticamente iguales a las NPs frescas. Las NPs resuspendidas en el resto proporciones trealosa:NPs aumentaron ligeramente su tamaño y, en determinados casos (trealosa:NPs 1:3) el PdI aumentó de manera significativa lo que indica que, aunque el tamaño no aumente destacadamente, se trata de una muestra polidispersas con carácter heterogéneo. Las muestras resuspendidas en agua aumentaron su tamaño de manera significativa, así como su índice de polidispersión, resaltando la necesidad de la inclusión de un crioprotector en el medio de suspensión de las NPs para conservar los tamaños de las formulaciones. 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 PdI Tamaño (nm) Medio de suspensión Tamaño PdI 117 De manera ilustrativa, la figura 16 muestra los histogramas de los tamaños y distribución de tamaños obtenidos para las NPs antes de la congelación, tras la congelación sin crioprotector y después del proceso con diferentes concentraciones de crioprotector. Como se puede observar, sólo las partículas congeladas con una proporción de trealosa:NPs de 1:1.5, mantienen un tamaño prácticamente igual al que presentaban antes de la congelación. Figura 16. Histogramas de tamaños para las NPs después de un proceso de congelación resuspendidas en diferentes medios. Para estudiar la influencia de la adición de crioprotector a las formulaciones sobre el proceso de liofilización, se llevó a cabo el mismo estudio, representado en la figura 17. 118 Figura 17. Influencia de la adición de diferentes concentraciones de trealosa en el tamaño medio de las partículas tras un proceso de liofilización. En este caso, y de forma similar al estudio del efecto de la congelación, aquellas partículas liofilizadas con una proporción de trealosa:NPs 1:1.5 mantuvieron un tamaño muy similar al de las partículas frescas. El resto de formulaciones exhibieron un aumento de tamaño, con valores altos de polidispersión que se traducen en un aumento de la heterogenidad de la muestra. Tal y como se expone en el caso anterior, la figura 18 ilustra los resultados del estudio a través de los histogramas obtenidos tras el proceso de liofilización para todas las condiciones, y como se aprecia, el histograma perteneciente a las NPs liofilizadas con una proporción de trealosa:NPs de 1:1.5 coincide con el 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 PdI Tamaño (nm) Medio de suspensión Tamaño PdI 119 correspondiente previo a la liofilización. Para ambos ensayos, el estudio de la influencia de crioprotector se midió con un Zetasizer ZS90 (Malvern Instruments). Figura 18. Histogramas de tamaños para las NPs después de un proceso de liofilización resuspendidas en diferentes medios. Por tanto, según los resultados obtenidos, se establece que la proporción óptima de trealosa:NPs para mantener la integridad morfológica de las NPs es de1:1.5. Estudio de liberación in vitro Los principales mecanismos de liberación de fármacos desde partículas poliméricas son: (a) erosión de la superficie de la matriz polimérica, (b) rotura de los enlaces entre monómeros y (c) difusión del fármaco encapsulado o en la superficie de la partícula a través de poros o a través de la matriz polimérica. Generalmente, cuando se trata de polímeros hidrófobos, la liberación está gobernada principalmente por la erosión, no obstante, la liberación del fármaco suele darse por una combinación de los tres mecanismos (Kamaly et al. 2016). De acuerdo con Fredenberg et al. (Fredenberg et al. 2011), numerosos factores como las interacciones entre moléculas de activo y fármaco-polímero o la absorción de agua, pueden influir 120 en la velocidad de liberación y el comportamiento cinético de los fármacos encapsulados en partículas poliméricas de PLGA. Los perfiles de liberación de VLX encapsulada en NPs (5,5% de carga de fármaco) poliméricas de PLGA están representados en la figura 19. Figura 19. Perfiles de liberación in vitro para NPs no modificadas y modificadas superficialmente (n=3: barras de error:DE). Tras 30 minutos, las NPs cargadas con VLX muestran una liberación marcada (sobre el 23%) a pH fisiológico (pH 7.4) lo que puede ser atribuido al carácter hidrofílico del activo. La liberación continúa de forma gradual hasta las 48 h. Al final del estudio, el porcentaje de fármaco liberado es, superior al 90%, mientras que para las NPs funcionalizadas el % de fármaco liberado fue inferior al 85% transcurridas las 48 h. Tomando las NPs no funcionalizadas como referencia, la presencia de ligandos en la superficie de las partículas puede conllevar un descenso en la tasa de liberación cuando se comparan con partículas no modificadas superficialmente (Zhu, Zhang, and Yu 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 00,5 24812 24 48 Liberación de fármaco (%) Tiempo (h) VLX+PLGA NPs VLX+Tf-PLGA NPs VLF+TfRp PLGA NPs 121 2017). Así, para cada tiempo establecido, se observa una disminución de la liberación, que puede estar asociada a la presencia de una “barrera adicional” formada por los ligandos de la superficie. Estabilidad de las NPs en líquido cefalorraquídeo Los sistemas nanotransportadores de fármacos de tipo polimérico son excelentes plataformas para la liberación controlada del activo. Dicha liberación puede extenderse horas, días o semanas (Berrocoso et al. 2017) en función del tipo de polímero empleado por ello, es de vital importancia estudiar la estabilidad de las partículas en los fluidos biológicos a lo largo del tiempo. En este trabajo, la estabilidad se evaluó en el fluido de mayor presencia en el sistema nervioso central, el líquido cefalorraquídeo durante 24 h con el fin de garantizar tamaños e índices de polidispersión similares tras el tiempo de incubación cuando las NPs sean empleadas para los ensayos in vivo. El estudio se llevó a cabo a 37 ºC y, como se resume en la Fig. 20, todas las formulaciones estudiadas mostraron alta estabilidad con tamaños e índices de polidispersión semejantes a los observados antes de las 24 h de incubación, demostrando que las partículas pueden emplearse con garantía en aplicaciones in vivo. 128 Con el fin de confirmar el estudio visual y valorar de manera cuantitativa la captación celular, se empleó la citometría de flujo. Para ello, 1 mL de los diferentes tipos de NPs (50 µg/mL) se incubaron durante 30 minutos con las células hCMEC y las células sin NPs fueron usadas como control negativo. Como ilustra la figura 23, la intensidad de fluorescencia es mayor para las NPs funcionalizadas (figuras 23C-23D) en comparación con las NPs sin funcionalizar, sin embargo, en concordancia con los estudios cualitativos, el valor más intenso de fluorescencia se alcanzó tras la incubación con NPs modificadas superficialmente con TfRp. El aumento de la captación celular in vitro de NPs funcionalizadas con diferentes ligandos como proteínas, péptidos, anticuerpos, aptámeros o polímeros ha sido previamente informado por otros investigadores (Hu et al. 2011)(Huang et al. 2017)(Carroll et al. 2010)(Tosi et al. 2007)(Monaco et al. 2017)(J. Guo et al. 2011). 129 Figura 23. Histogramas obtenidos tras el estudio cuantitativo de la fluorescencia por citometría de flujo en las células hCMEC/D3 tras 30 minutos de incubación con diferentes formulaciones de NPs cargadas con NR. (A) Control (células sin NPs); (B) NPs de PLGA no modificadas superficialmente; (C) NPs de PLGA modificadas con Tf; (D) NPs de PLGA modificadas con TfRp. Por tanto, como resumen de esta sección se puede concluir que ambos estudios respaldan la hipótesis de que la funcionalización con ligandos específicos para receptores localizados en el lugar de acción puede contribuir a mejorar la interacción célula-nanopartícula, promoviendo así la captación celular de las mismas por endocitosis mediada por receptor. Estudios de permeabilidad a través de un modelo de barrera in vitro La BHE es uno de los principales obstáculos que deben superar los activos farmacéuticos para acceder al SNC. Dicha 130 barrera protege al cerebro de la entrada de sustancias patógenas pero, al mismo tiempo limita el ingreso de numerosos fármacos. Por tanto, aunque la permeabilidad a través de la misma puede verse afectada por numerosas enfermedades como el infarto cerebral, la esclerosis múltiple, epilepsia o tumores cerebrales (Weiss et al. 2009), la presencia de la misma supone una dificultad para el tratamiento de los trastornos neurológicos. Para evidenciar la llegada de las NPs y fármaco al cerebro a través de la BHE, se desarrolló un modelo de barrera in vitro de tipo monocultivo empleando las mismas células endoteliales empleadas para los ensayos de captación celular. 4.1.1.1 Modelo in vitro de BHE Para determinar la integridad y la calidad de la BHE, se midió la resistencia transendotelial eléctrica (TEER) cada dos días, durante 8 días. Este parámetro es esencial para asegurar unas características apropiadas de barrera y evitar falsos positivos (Stab et al. 2016). 131 Figura 24. Valores de TEER de las células hCMEC/D3 cultivadas en insertos Transwell de 0.4 µm para ambos experimentos. (n=9) (barras de error:DE) Tras la construcción de la barrera, el día del experimento (8º día) los valores de TEER oscilaron entre 110-120 Ω*cm2. Dichos valores resultan adecuados ya que, de acuerdo con la literatura publicada, estos valores son suficientes para estudiar la permeabilidad de los activos farmacéuticos ya que, valores de TEER por encima de 150 Ω*cm2 no interfieren en la permeabilidad del fármaco, no se traduce necesariamente en una disminución de la misma cuando se emplean modelos monocultivos (Wilhelm and Krizbai 2014). Pasado el tiempo de incubación (en medio de cultivo) de las diferentes formulaciones de NPs en el modelo de barrera in vitro, la TEER se midió de nuevo para verificar que la barrera se mantiene intacta, mostrando la misma integridad y calidad que al inicio del experimento. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 2 4 6 8 TEER (Ω*cm2) Tiempo (días) Valores de TEER para modelo de permeabilidad de FITC-PLGA NPs Valores de TEER para modelo de permeabilidad de VLX+PLGA NPs 132 Los valores de TEER (prey post-incubación) para ambos experimentos están representados en la figura 25. Figura 25. Valores de TEER para ambos experimentos de permeabilidad (NPs y fármaco) antes y después de la incubación con las NPs. Como puede dilucidarse, a partir de la figura 25, la integridad de la barrera no se vio afectada tras el contacto con las diferentes formulaciones de NPs, por lo que se determina que la TEER se mantiene durante todo el experimento y los resultados de permeabilidad son fiables. La principal ventaja de los modelos endoteliales de barrera de tipo monocultivo es la simplicidad (Wilhelm and Krizbai 2014), sin embargo, pueden mostrar valores bajos de TEER debido a la ausencia de pericitos, astrocitos y otros elementos de la unidad neurovascular. Para solventarlo, pueden emplearse modelos cocultivos pero éstos presentan numerosas desventajas ya que no mantienen el ambiente neuronal de manera permanente y 0 20 40 60 80 100 120 140 Ensayo de permeabiliad de NPs de FITC-PLGA Ensayo de permeabiliad de NPs cargadas con VLX Valores de TEER pre-incubación Valores de TEER post-incubación 133 manifiestan baja reproducibilidad, son más costoso y su caracterización es compleja (Kaisar et al. 2017). Por lo tanto, los modelos monocultivos resultan más adecuados y útiles para realizar evaluaciones preliminares de permeabilidad de fármacos a través de la BHE (Wolff et al. 2015). Inicialmente, según el procedimiento descrito en la sección 3.2.12.3.2 se midió la intensidad de fluorescencia y se calculó el porcentaje de NPs en el lado basolateral (Figura 26). Para ello, se tomó como referencia de fluorescencia total la mostrada por la misma concentración de los diferentes tipos de partículas fluorescentes (3 mg/mL) añadida directamente al lado basolateral. Se asume que dicha concentración supone el 100% de fluorescencia si todas las NPs atravesaran la barrera. Los resultados se presentan como porcentaje de partículas en función del porcentaje de fluorescencia mostrado por la concentración total. La permeabilidad se evaluó tras 1, 6, 8, 12 y 24 h. 134 Figura 26. Porcentaje de NPs fluorescentes (funcionalizadas y no funcionalizadas) en el lado basolateral despúes de los tiempos predeterminados. Tal y como se observa en el gráfico, las NPs funcionalizadas con el TfRp mostraron una capacidad mayor para atravesar la BHE. Tal y como se demostró en los ensayos in vitro de captación celular, las NPs funcionalizadas con TfRp fueron las que exhibieron la mayor capacidad de captación, lo que podría explicar esta mayor habilidad para atravesar la barrera. Para todas las formulaciones, el porcentaje de partículas fluorescentes aumentó a lo largo del tiempo en la parte basolateral. A las 24 h, aproximadamente el 45% de las NPs fluorescentes funcionalizadas con TfRp atravesaron la barrera del modelo. Se realizó un análisis multifactorial para verificar el efecto sobre la permeabilidad de las NPs de ambos factores, tanto el tipo de formulación testada como el tiempo prefijado para leer la fluorescencia. Los resultados muestran un efecto significativo sobre 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1 6 8 12 24 h Tiempo (horas) FITC-PLGA NPs Tf-cFITC-PLGA NPs TfRp-cFITC-PLGA NPs 135 la permeabilidad cuando se emplean diferentes formulaciones, F (3, 75) = 186.549 y p <0.001 y diferentes tiempos, F (4, 75) = 3838.531 y p <0.001. Así mismo, se observó una interacción significativa entre ambos factores (F (8, 75) = 34.078), indicando que la influencia de la variable tiempo sobre la permeabilidad es diferente para las diferentes formulaciones ensayadas. Para la evaluación de la permeabilidad del fármaco, el mismo protocolo fue llevado, aunque, en este caso, el ensayo se extendió hasta las 72 h con el fin de evaluar la posible inducción de la glicoproteína-P por parte del activo. Tras la incubación con las NPs cargadas con VLX sin funcionalizar y funcionalizadas y VLX libre (añadida en la misma concentración que la encapsulada en NPs), alos tiempos prefijados (1, 6, 8, 12, 24, 48 y 72 h), se midió la concentración de fármaco en el lado basolateral. Para ese fin, se empleó un método doble de cromatografía líquida de alta presión y espectrometría de masas (UHPLC-MS/MC), detallado en el apartado 4.2.12.4.2. El comportamiento observado en el ensayo de permeabilidad es similar al que se determinó en el estudio de liberación. Aunque las partículas funcionalizadas con el péptido demostraron una mayor capacidad para alcanzar la parte basolateral, muestran la liberación más lenta de fármaco (Figura 27). De acuerdo con Zhu et al. (Zhu, Zhang, and Yu 2017), las NPs funcionalizadas mostraron una velocidad de liberación más lenta comparadas con las que no funcionalizadas. 136 Figura 27. Concentraciones de fármaco en lado basolateral de diferentes formulaciones (VLX libre, NPs cargadas con VLX sin funcionalizar y funcionalizadas con Tf o TfRp). A las 8 y 12 h, la liberación de fármaco a partir de las NPs funcionalizadas es similar para ambas formulaciones mientras que la mayor diferencia se encuentra a las 24 h. Bachmeier et al (Bachmeier et al. 2011), demostraron que a determinadas concentraciones (1 - 50 µM), la VLX es un inductor de las bombas de eflujo como la glicoproteína-P. Un comportamiento semejante se demuestra en este estudio ya que, tras alcanzarse una concentración de fármaco libre superior a 1 µM en el lado basolateral (24 h), se observa un descenso en la concentración de activo en dicho compartimento (48 y 72 h). Dicho descenso puede estar motivado por la acción de la glicoproteína-P, que, tras ser inducida provoca la salida del activo en sentido basolateral-apical. 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 1 6 8 12 24 48 72 H Concentración VLF encapsulada en NPs (µM) Tiempo (horas) VLF+PLGA NPs VLF+Tf-PLGA NPs 137 Sin embargo, cuando la VLX está encapsulada en NPs, la concentración en el lado basolateral no alcanza concentraciones que provoquen la inducción de la glicoproteína-P y la concentración de VLX sigue aumentando de manera gradual con el tiempo. Tras el tiempo ensayo (24h para en ensayo de permeabilidad de las NPs y 72 h para el de la VLX), se comprobó que los valores de TEER permanecieron entre 105-11 Ω·cm2, lo que indica que la integridad de la barrera se mantuvo y no se vio afectada por la presencia de las partículas (ni fármaco). 4.1.1.2 Evaluación de la llegada de las NPs al sistema nervioso central tras administración intravenosa La BHE es una de las barreras más restrictivas del organismo dificultando el acceso de numerosos activos terapéuticos al SNC. Tras los resultados en los estudios previos in vitro de modelo de barrera, aquellas partículas funcionalizadas con el péptido fueron las que mostraron una mayor capacidad para atravesar la barrera. Para confirmar estos resultados, se diseñó un ensayo in vivo que confirmara la llegada de las partículas funcionalizadas al cerebro tras una administración intravenosa. Para ello, se administraron nanopartículas de FITC-PLGA no funcionalizadas y funcionalizadas con Tf y TfRp en ratones C57bl/6 (12-15 semanas de vida) vía intravenosa en la vena de la cola a una concentración de 65 o 130 mg/kg de NPs (equivalentes a 9 y 18 mg/kg de VLX, respectivamente) en una administración aguda y 65 mg/kg de NPs (9 mg VLX) y tras ser perfundidos (ver apartado 4.2.13.1), las secciones de cerebro y bazo se cribaron usando un