TRABAJO FIN DE GRADO
DE CARÁCTER EXPERIMENTAL
PAPEL DE LA MICROGLÍA
ASOCIADA A NEURODEGENERACIÓN
EN UN MODELO ATÁXICO
Ma ía de los San os Le án Sánchez
G ado en Fa macia
Facul ad de Fa macia · Uni e sidad de Se illa
Cu so 2022/2023
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TRABAJO FIN DE GRADO
DE CARÁCTER EXPERIMENTAL
PAPEL DE LA MICROGLÍA
ASOCIADA A NEURODEGENERACIÓN
EN UN MODELO ATÁXICO
Ma ía de los San os Le án Sánchez
G ado en Fa macia
Facul ad de Fa macia · Uni e sidad de Se illa
Cu so 2022/2023
Tu o a - D a. Rocío Ruiz Laza
Depa amen o de Bioquímica y Biología Molecula
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AGRADECIMIENTOS
Me sien o a o unada, es a e apa que hoy culmina me ha dejado una huella en el alma, y es po
odas las pe sonas que me han acompañado du an e el camino en el que he enido la eno me
opo unidad de apo a mi g ani o de a ena. La elicidad sólo es eal cuando se compa e, po
eso, me gus a ía ag adece os odos aquellos momen os que me habéis egalado du an e es os
cinco in ensos años.
G acias Rocío po ansmi i me esa inmensa pasión que ienes po la ciencia desde el p ime día
que coincidimos en clase y po b inda me u con ianza du an e es os años en los que he enido
la sue e de se u alumna in e na y ealiza es e abajo bajo u u ela. G acias po c ee siemp e
en mí y hace me sen i aliosa. A i Paco, po guia me en cada paso que he dado du an e es e
iempo, po hace me dis u a de cada ins an e y po enseña me a con ia en mí misma. Po
encima de odo es o, quie o ag adece e que hayas es ado a mi lado, has sido luz y has sabido
cómo saca me una son isa, especialmen e en aquellos momen os más du os. G acias Albe o
po p eocupa e an o, po ene siemp e unas boni as palab as pa a mí y po o ece me ese
ab azo cuando más lo necesi aba. A i Sonia, po se más que amiga, mi mi ad, po habe
compa ido odo es e iempo conmigo, po da me an as anécdo as que con a y po apo a me
esa segu idad que en muchas ocasiones me al a. A oso os y a odos los que o máis pa e del
labo a o io BIO-113, g acias po ab i nos las pue as y pe mi i nos da nues os p ime os pasos
en la in es igación, po compa i ues o p ecioso abajo y hace que nos emocione la
Neu ociencia. G acias po se amilia.
También me gus a ía da las g acias a odos los que han sido compañe os y aho a son amigos. A
los que han es ado jun o a mi du an e la ca e a, a los que llega on más a de, y a los que, po
casualidad, he conocido hace poco. G acias po hace me más ácil el eco ido enseñándome a
dis u a de él y po con agia me de ues a aleg ía in ini a. A cada uno de oso os, os gua do
un hueco en mi co azón pa a siemp e.
Po úl imo, me gus a ía ag adece a mis abuelos, po habe me educado en alo es, po su
dedicación, es ue zo y en ega. A Raúl, po se cómplice, po sabe escucha me y po o ien a me
en cada umbo que omo en la ida. Y a i mamá, g acias po mos a me u o gullo y admi ación
a a és de esos ojos b illan es que lle a é e e namen e en el ecue do, y po da me ue zas pa a
segui luchando po consegui mis sueños.
A los que, po sue e, puedo ab aza con ue za
y a los que no es án, pe o sé que no me suel an de la mano,
G acias de e dad.
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RESUMEN
La mu ación au osómica ecesi a Gly483Glu, que ocu e espon áneamen e en la p o eína
mu ina He c1, conduce a su sob eexp esión en el ce ebelo del a ón ambalean e ( bl). Es o
p o oca un descon ol de la mue e po au o agia de las células de Pu kinje a pa i de los dos
meses de edad, así como una des egulación de la ía de señalización PI3K/AKT/mTOR enca gada
de la co ec a mielinización axonal. Ambas si uaciones desencadenan la apa ición de un
sínd ome neu omuscula a áxico ca ac e izado po al e aciones en el con ol mo o . An e es a
pe u bación homeos á ica, incluso an es de que ocu a la mue e de las células de Pu kinje, la
mic oglía p esen e en el ce ebelo es capaz de inicia una po en e espues a inmuni a ia
adqui iendo un pe il de eno ipo DAM con una sob eexp esión de Galec ina-3 (Gal3).
Con el obje i o de es udia el papel de es a mic oglía en el p oceso degene a i o que iene como
consecuencia la mue e de las células de Pu kinje en el modelo bl, se ha eliminado el gen lgals3
pa a sup imi la exp esión de Gal3. Una ez gene ado el nue o modelo mu ino, se cuan i ica on
median e inmunohis oquímica las células de Pu kinje y la densidad que ocupaban en el ce ebelo
de a ones de dos meses en mues as p oceden es de es g upos expe imen ales, WT, bl y
bl/Gal3KO, así como el núme o de células mic ogliales p esen es en la co eza y en la sus ancia
blanca de las secciones co onales de los mismos. Así se con i mó la hipó esis inicial en an o que,
al sup imi la exp esión de Gal3, se ecupe aba pa cialmen e la población de células de Pu kinje.
No se obse a on cambios en la can idad de células mic ogliales en e los g upos bl y
bl/Gal3KO, pe o sí en e ambos y el WT p esen ando los g upos expe imen ales una mayo
can idad en compa ación con el con ol, siendo es a di e encia mayo en co eza a causa de la
espues a in lama o ia o iginada po el daño neu onal.
PALABRAS CLAVE
HERC1, ambalean e, Pu kinje, Galec ina-3, mic oglía
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ÍNDICE
RESUMEN Y PALABRAS CLAVE 3
INTRODUCCIÓN 5
Sis ema Ne ioso Cen al (SNC) y el mo imien o 5
Sis ema Ubiqui ina-P o easoma (UPS) 6
P o eínas HERC 7
Ra ones ambalean es 10
Mani es aciones clínicas 12
Mic oglía asociada a en e medad (DAM) 13
Galec ina-3 (Gal3) 14
OBJETIVOS 16
MATERIALES Y MÉTODOS 17
Animales expe imen ales 17
Ob ención y p epa ación de mues as 18
Inmunohis oquímica (IHC) 19
Adquisición y análisis de imágenes 21
IHC con an icue po p ima io An i-Calbindin 21
IHC con an icue po p ima io An i-Iba1 22
Análisis es adís ico 23
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 24
Dis ibución de células de Pu kinje y mic oglía en el eje an e opos e io del ce ebelo 24
Cuan i icación de células de Pu kinje 26
Va iación de la densidad de células de Pu kinje (%) con espec o al núme o de células de
Pu kinje en el á ea medida (mm2) 28
Cuan i icación de mic oglía 29
Co eza ce ebelosa 30
Sus ancia blanca ce ebelosa 31
Va iación de la can idad de mic oglía en co eza con espec o al núme o de células de Pu kinje
en el á ea medida (mm2) y a la densidad de células de Pu kinje (%) 33
Va iación de la can idad de mic oglía en sus ancia blanca con espec o al núme o de células
de Pu kinje en el á ea medida (mm2) y a la densidad de células de Pu kinje (%) 34
Va iación de la can idad de mic oglía en sus ancia blanca con espec o a la can idad de
mic oglía en co eza po á ea medida (mm2) 35
CONCLUSIONES 37
ABREVIATURAS 38
BIBLIOGRAFÍA 39

5
INTRODUCCIÓN
Desde inales del siglo XIX, g acias a los a ances cien í icos que han enido luga has a día de hoy,
la espe anza de ida ha aumen ado a un i mo conside ablemen e ápido, lo que ha impulsado
la apa ición de una población no ablemen e en ejecida con una al a asa de mo bilidad. Po es a
azón, las en e medades neu odegene a i as p esen an cada ez una mayo incidencia en dicha
población y, como consecuencia, suponen un impac o sociosani a io y económico
e dade amen e ele an e. La ciencia se es á ocupando de in es iga el o igen de es as
pa ologías con el obje i o de e i a , e a da su apa ición y mejo a la calidad de ida de los
pacien es, pe o aún queda una g an pa e e iológica que sigue siendo desconocida.
El modelo mu ino ambalean e ( bl) u ilizado pa a la ealización de es e es udio p esen a un
sínd ome complejo de a axia ca ac e izado po al e aciones en el con ol mo o como
consecuencia de la degene ación y mue e de las células de Pu kinje en el ce ebelo (Bachille
e al., 2020). Es e modelo nos pe mi i á es udia el papel de la mic oglía en la degene ación y
mue e de las células de Pu kinje.
Sis ema Ne ioso Cen al (SNC) y el mo imien o
El ce ebelo es la po ción del encé alo ubicada en la pa e pos e io del c áneo, en e el ce eb o
y el onco ence álico, enca gada p incipalmen e de la unción mo o a del o ganismo. En el co e
his ológico ans e sal (Figu a 1), se pueden obse a dos capas bien di e enciadas que o man
su cos a lo la go de oda la es uc u a, la sus ancia g is y blanca. La sus ancia g is es á cons i uida
po la co eza, que es la capa más supe icial, y hacia el in e io de la misma se disponen la capa
molecula , un es a o de células de Pu kinje y la capa g anula . Las células de Pu kinje se
encuen an bo deando la capa g anula y p oyec an su á bol dend í ico hacia la capa molecula
donde se colocalizan con o as células neu ogliales como las neu onas es elladas y en ces a. Su
axón a a iesa la capa g anula has a alcanza la sus ancia blanca donde se mieliniza pa a ealiza
la sinapsis con o as neu onas que componen los núcleos in ace ebelosos (T eu ing e al., 2017).
Po o a pa e, la sus ancia blanca es á o mada undamen almen e po axones ecubie os de
ainas de mielina, una es uc u a mul ilamina ica en lípidos que es gene ada po los
oligodend oci os pa a acili a la ansmisión del impulso ne ioso, y que es la que con ie e el
colo blanco a es a egión ce ebela (Sa aiyan e al., 2021). Dadas las simili udes en la his ología
ce ebela en e a ones y humanos, se u ilizan modelos mu inos pa a es udia la isiopa ología
humana de es a es uc u a ence álica.
6
A B
Figu a 1. Co e his ológico del ce ebelo de a ón (A) y humano (B) (T eu ing e al., 2017).
Capa molecula (Mo), es a o de células de Pu kinje (Pk), capa g anula (G ) y sus ancia blanca (WM).
El ce ebelo o ma pa e del Sis ema Ne ioso Cen al (SNC) y unciona como un cen o de
coo dinación enca gado de in eg a la in o mación que ob iene del Sis ema Ne ioso Pe i é ico
(SNP) a pa i de los ne ios sensi i os sob e la posición del cue po y su mo imien o, y
p opo ciona señales ne iosas a los ne ios mo o es con el obje i o de con ola la ma cha y el
equilib io (Mashimo e al., 2009). Además, Dow y Mo uzzi, en 1958, plan ea on la hipó esis de
que el ce ebelo no solo con ola el mo imien o como al, sino que con ibuye al ap endizaje
mo o asocia i o que asegu a que los mo imien os sean p ecisos y co ec os, y pos e io men e
Ma , en 1969, localizó es a unción p opiamen e en la co eza ce ebelosa (Ma , 1969).
Los mo imien os olun a ios, po muy sencillos que sean, equie en de la in e acción coo dinada
de múl iples es uc u as que o man pa e de la unión neu omuscula (UNM) ya que las
conexiones que se es ablecen en e ellas son al amen e especializadas. La UNM se compone de
una mo oneu ona (MN) en la zona p esináp ica, cuyo soma se encuen a en el as a en al de la
médula espinal, una ib a muscula o placa mo o a e minal en la zona pos sináp ica y una célula
de Schwann que ac úa como sopo e pa a las capas de mielina enca gadas de ansmi i el
impulso ne ioso sal a o io a a és de los nódulos de Ran ie . Du an e la sinapsis, cuando un
po encial de acción llega a la zona p esináp ica, se libe a ace ilcolina como neu o ansmiso a la
hendidu a sináp ica, donde in e acciona con los ecep o es nico ínicos localizados en la zona
pos sináp ica. Es o p o oca la en ada de ca iones y el inicio de una despola ización, con la
consecuen e ape u a de canales de sodio ol aje-dependien es en la memb ana de la ib a
muscula que desencadena el p oceso de con acción muscula (Bachille e al., 2020).
Sis ema Ubiqui ina-P o easoma (UPS)
Tan o el desa ollo como la homeos asis de es e so is icado mecanismo equie en de la
coo dinación de un g an núme o de p o eínas que son codi icadas po dis in os genes que
7
con olan la his ogénesis, di e enciación y mue e celula den o del Sis ema Ne ioso. Pa a
asegu a que las p o eínas implicadas uncionan co ec amen e debe man ene se la
p o eos asis, lo que signi ica que debe habe un balance en e las p o eínas ecién o madas y
las p o eínas en ejecidas o mal plegadas. Pa a log a es e equilib io es undamen al el p oceso
de deg adación p o eica, lle ado a cabo p incipalmen e po las ías de au o agia/lisosoma y
p o easoma (Pé ez-Villegas e al., 2022).
La mayo ía de las en e medades neu odegene a i as cu san con una al e ación de la
homeos asis p o eica, que pod ía se debido a un allo en el Sis ema Ubiqui ina-P o easoma
(UPS) (Figu a 2). El mecanismo de ubiqui inación es á implicado en ambas ías de deg adación
p o eica, en e o as muchas unciones. Un de ec o en el uncionamien o de és e conlle a la
acumulación de p o eínas en ejecidas y mal plegadas y, po ende, una disminución en la calidad
de las p o eínas que pa icipan en la ansmisión del impulso ne ioso. Po es e mo i o, el UPS
esul a una diana de g an in e és pa a el es udio e in es igación de en e medades
neu odegene a i as (Bachille e al., 2020).
En el UPS es án in oluc ados es g upos de enzimas, enzimas ac i ado as de ubiqui ina (E1),
enzimas conjugado as de ubiqui ina (E2) y enzimas ligasas de ubiqui ina (E3), que lle an a cabo
una cascada de eacciones ca alí icas pa a ubiqui ina , e ique a y ansloca , espec i amen e,
las p o eínas de ec uosas hacia el p o easoma pa a su pos e io deg adación y eno ación a
p o eínas uncionales (Bachille e al., 2015, 2020).
Figu a 2. Esquema del Sis ema Ubiqui ina-P o easoma (UPS) (Bachille e al., 2020).
La enzima E1, en una eacción dependien e de ATP, ac i a a una molécula de ubiqui ina (Ub). Pos e io men e, la
ubiqui ina ac i ada se conjuga con la enzima E2 pa a pode se ans e ida po la enzima E3 a la p o eína diana. Es e
p oceso se epi e a ias eces has a consegui que la p o eína es é poliubiqui inada y pueda se econocida po el
p o easoma pa a su deg adación en pép idos y aminoácidos. Finalmen e, las enzimas desubiqui inizan es (DUBs) son
las enca gadas de desensambla la cadena de poliubiqui ina pa a que la ubiqui ina en su o ma monomé ica pueda
se eciclada (Bachille e al., 2020).
P o eínas HERC
Las p o eínas HERC pe enecen a una de las es sub amilias de enzimas ligasas de ubiqui ina
(E3) que ac úan en la e ce a e apa del p oceso de ubiqui inación econociendo la p o eína diana
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y ca alizando la adición de las moléculas de ubiqui ina unidas a E2 a dicho sus a o. Exis en seis
genes dis in os que codi ican p o eínas HERC en humanos, no obs an e, es e abajo se cen a
en es udia uno de ellos, aquel que codi ica la p o eína HERC1 (Mashimo e al., 2009; Pé ez-
Villegas e al., 2022).
HERC1, al p incipio denominada p619 y más a de p532, ue la p ime a p o eína de la amilia en
se iden i icada a a és de un c ibado que se ealizó pa a la búsqueda de secuencias oncogénicas
humanas elacionadas con el cánce de mama (Ga cía-Gonzalo & Rosa, 2005). Se a a de una
p o eína de g an amaño con casi 5000 esiduos de aminoácidos en una sola cadena
polipep ídica, 4861 aminoácidos en Homo sapiens -Hs- y 4859 en Mus musculus -Mm-, y con un
peso molecula supe io a 520 kDa (Pé ez-Villegas e al., 2022).
Las seis p o eínas HERC ienen en común la p esencia de un dominio HECT (del inglés,
Homologous o he E6AP Ca boxyl Te minus) y, como mínimo, un dominio RLD (del inglés,
Regula o o Ch omosome Condensa ion 1 (RCC1) Like Domain) (Mashimo e al., 2009; Pé ez-
Villegas e al., 2022). El p ime o de ellos iene una es uc u a bilobulada y se enca ga
p opiamen e de ans e i Ub o p o eínas simila es a ella a p o eínas diana pa a que pueda ene
luga el p oceso de deg adación p o eica (Mashimo e al., 2009). En un p incipio, se pensaba que
e a especí ico pa a la deg adación de p53, no obs an e, es udios pos e io es han demos ado
que la ac i idad ligasa de ubiqui ina no es á es ingida a condiciones pa ológicas en las que se
exp esa p53 sino que ambién se desa olla en condiciones isiológicas du an e el p oceso de
ubiqui inación de o as p o eínas diana (Ga cía-Gonzalo e al., 2005). Sin emba go, el segundo
ipo de dominio es á cons i uido po sie e secciones de hojas β-plegadas, ac úa como ac o
in e cambiado de nucleó idos de guanina (GEF, del inglés, Guanine nucleo ide Exchange Fac o )
y es á implicado en el in e cambio de nucleó idos de guanina en e p o eínas con si io de unión
a GTP. Además, pa ece se más e sá il ya que p esen a la capacidad de in e acciona con
di e sas p o eínas como cla ina, ARF y Rab, y con lípidos como 4,5- os a idilinosi ol que juegan
un ele an e papel en el á ico de memb anas de las células (Pé ez-Villegas e al., 2022).
La p o eína HERC1 (Figu a 3), además de un dominio HECT y dos dominios RLD, RLD1 y RLD2,
p esen a o as ca ac e ís icas es uc u ales que la di e encia uncionalmen e de las o as cinco
p o eínas HERC. Con iene un dominio SRPY (del inglés, spl A and RyR), un dominio BH3 (del
inglés, Bcl-2 Homology Domain 3), sie e epe iciones de WD40 ca ac e ís icas de la subunidad β
de las p o eínas G he e odimé icas, una c emalle a de leucina, secuencias icas en p olina que
se unen a SH3 y a ias cadenas la e ales de ca ác e pola y ácido (Pé ez-Villegas e al., 2022).
15
Figu a 6. Es uc u a y o ganización de Gal3. Basada en (Yang e al., 2008). [C eada en BioRende .com]
Gal3 es una galec ina quime a o mada po dos dominios de econocimien o de ca bohid a os, uno C- e minal y o o
N- e minal, unidos po epe iciones de esiduos de glicina y p olina. Es capaz de dime iza se e e siblemen e a a és
del CRD C- e minal y de polime iza se i e e siblemen e a a és del CRD N- e minal u ilizando ca bohid a os como
ligandos (Boza-Se ano e al., 2019).
Gal3 es codi icada po el gen LGALS3 y ac úa como un mediado in lama o io libe ado po
algunas células ac i adas, como la mic oglía, en espues a a una a ección neu odegene a i a
como, po ejemplo, el p oceso de lesión isquémica. Se encuen a dis ibuida po el núcleo,
ci oplasma y las memb anas, pe o an e cie os es ímulos p oin lama o ios puede se libe ado al
medio ex acelula (Boza-Se ano e al., 2014).
En condiciones de neu oin lamación, la mic oglía ac i ada libe a Gal3 al medio ex acelula y
és a ac úa como ligando de los ecep o es TREM2 (del inglés, T igge ing Recep o Exp essed on
Myeloid Cells 2) (Boza-Se ano e al., 2019) y TLR4 (del inglés, Toll-Like Recep o 4) (Bu guillos
e al., 2015) p esen es en la mic oglía ci cundan e, p o ocando así una mayo exp esión del
eno ipo DAM en el SNC. Po an o, Gal3 es capaz de ac ua como inmunomodulado
ampli icando la eacción p oin lama o ia dependien e de TLR4 y gene ando una ac i ación
mic oglial comple a en una si uación de lesión neu onal (Bu guillos e al., 2015).
Dado que la p o eína Gal3 es á muy elacionada con la adquisición del eno ipo DAM po pa e
de la mic oglía, en el modelo expe imen al u ilizado pa a la elabo ación de es e abajo se ha
plan eado como hipó esis que, eliminando el gen lgals3 pa a sup imi la exp esión de Gal3, se
pod ía ob ene un e ec o de meno mue e neu onal, un esca e mo o en los a ones bl y una
de ección del p oceso neu odegene a i o en el ce ebelo.

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OBJETIVOS
Es e es udio pa e de un modelo expe imen al o mado po a ones que p esen an la mu ación
au osómica ecesi a Gly483Glu en el gen que codi ica la p o eína He c1, lo que p o oca una
degene ación de las células de Pu kinje en el ce ebelo y los do a de su eno ipo bl que se
mani ies a como un as o no a áxico. Análisis p elimina es ealizados en nues o g upo de
in es igación ponen de mani ies o que la mic oglía localizada en el ce ebelo de es os a ones
i a a eno ipo DAM p e iamen e al comienzo de la mue e de las células de Pu kinje, es deci ,
an es de que se alcancen los dos meses de edad. Además, se conoce que la mic oglía se ac i a
aún más cuando aumen a la exp esión de Gal3, lo que pod ía es a p o ocando una mayo
mue e neu onal en e las células de Pu kinje y un ag a amien o del p oceso neu odegene a i o.
El p esen e abajo pe sigue como p incipal obje i o es udia la epe cusión que iene la
mic oglía al adqui i eno ipo DAM en p esencia de Gal3 en el anscu so de la
neu odegene ación de las células de Pu kinje en el ce ebelo de los a ones bl. En es e sen ido,
se ha eliminado el gen lgals3 de los a ones bl pa a consegui a ones con eno ipo bl que no
exp esen Gal3. Con el in de alcanza lo, plan eamos los siguien es obje i os especí icos:
1. Ca ac e ización del a ón bl a a és de la cuan i icación de las células de Pu kinje
p esen e en la co eza ce ebelosa.
2. Análisis molecula , mo ológico y cuan i a i o, de la mic oglía p esen e en el a ón bl
inculada a la mue e de las células de Pu kinje en el ce ebelo.
3. Análisis molecula , mo ológico y cuan i a i o, de las células de Pu kinje y la mic oglía
p esen e en el a ón bl as la eliminación de la exp esión de la p o eína Gal3 po
deleción del gen lgals3.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Animales expe imen ales
Los animales de expe imen ación empleados ue on a ones p opo cionados po el Cen o de
Expe imen ación Animal Ósca Pin ado ubicado en el Cen o de In es igación, Tecnología e
Inno ación III (CITIUS-III) Manuel Losada Villasan e, en Se illa, España. Allí pe manecie on en un
ambien e a empe a u a cons an e de 22 ± 1ºC, con una humedad ela i a del 60%, un ciclo de
luz-oscu idad de 12 ho as y con acceso a comida y agua ad libi um. A los dos meses de edad
ue on asladados al labo a o io del g upo BIO-113 del Depa amen o de Bioquímica y Biología
Molecula si uado en la Facul ad de Fa macia de la Uni e sidad de Se illa, España, donde ue on
sac i icados.
Los a ones con eno ipo bl se ob u ie on median e c uces ep oduc i os de pa ejas de a ones
po ado es de la mu ación que codi ica pa a He c1. Al nace , odos los a ones bl p esen an el
gen lgals3 y exp esan isiológicamen e Gal3 en la mic oglía ac i ada con eno ipo DAM. Pa a
consegui la exp esión del eno ipo bl/Gal3KO (del inglés, Gal3 Knock-Ou ) se equie en a ones
con deleción en el gen lgals3 y en los que se encuen a sup imida la libe ación de Gal3 en la
mic oglía DAM. En es e sen ido, se c uza on a ones he e ocigó icos pa a He c1 con a ones
homocigo os pa a Gal3KO. Todos los a ones que o man la descendencia ue on geno ipados
median e PCR a a és del Cen o de In es igación, Tecnología e Inno ación II (CITIUS-II)
Celes ino Mu is, en Se illa, España, pa a pode se o ganizados.
Pa a la ealización de es e es udio, los a ones se clasi ica on en es g upos expe imen ales en
unción de su geno ipo (Tabla 1). El p ime o de ellos ue denominado WT (del inglés, Wild-Type)
y en él se incluían a ones con ondo gené ico C57BL/6, que e an WT pa a la mu ación en el gen
que codi ica He c1 bl y pa a Gal3KO o bien WT pa a He c1 bl y la exp esión de Gal3KO en
he e ocigosis. El segundo g upo expe imen al, llamado bl, comp endía a ones que exp esaban
He c1 bl en homocigosis y e an WT o he e ocigó icos pa a Gal3KO. Po úl imo, el e ce g upo,
bl/Gal3KO, lo componían a ones que exp esaban an o He c1 bl como Gal3KO en homocigosis.
Tabla 1. G upos expe imen ales según los geno ipos del animal pa a He c1 bl y Gal3KO.
El código de colo es u ilizado en adelan e es ama illo pa a WT, e de pa a bl y mo ado pa a bl/Gal3KO.
G upo expe imen al
He c1 bl
Gal3KO
WT
WT
WT
WT
he e ocigosis
bl
homocigosis
WT
homocigosis
he e ocigosis
bl/Gal3KO
homocigosis
homocigosis
18
Del p ime g upo expe imen al, o g upo con ol, se selecciona on seis a ones, de los cuales dos
e an macho y cua o e an hemb as. Po o a pa e, de los dos g upos expe imen ales es an es,
se selecciona on cinco a ones, del segundo se escogie on al aza es machos y dos hemb as
mien as que del e ce o se eligie on ambién alea o iamen e dos machos y es hemb as,
haciendo un o al de 16 a ones, con el in de consegui una dis ibución homogénea en e sexos
y e i a que sea un ac o que suponga una g an in luencia en los esul ados del es udio.
Todos los ensayos se lle a on a cabo de acue do con el documen o “Guidelines o he Eu opean
Union Di ec i e” (2010/63/EU) y la legislación española igen e RD 53/2013 (BOE 34/11370-421,
2013) sob e el uso de animales de expe imen ación. Los p o ocolos ue on ap obados po el
Comi é É ico de la Uni e sidad de Se illa.
Ob ención y p epa ación de mues as
Tan o los a ones pe enecien es a los g upos expe imen ales bl y bl/Gal3KO como sus
compañe os de camada isogénicos que se incluyen en el g upo WT se sac i ica on a los dos
meses de edad, pa a asegu a que el eno ipo mic oglial es u ie a comple amen e alcanzado y
que se hubie a p oducido degene ación en las células de Pu kinje de la co eza ce ebelosa.
En p ime luga , los a ones se anes esia on con ke amina Ke amido ® de Rich e Pha ma® (Re .
580395.1) y mede omidina Sedin® de Labo a o ios Calie S.A. (Re . 572768) po ía
in ape i oneal, y se comp obó que el plano anes ésico e a adecuado median e la pé dida de la
espues a e leja podal en las ex emidades in e io es. Pos e io men e, se lle ó a cabo el
p ocedimien o de pe usión in aca diaca u ilizando 40 ml de sue o salino isiológico p epa ado
a una concen ación de NaCl del 0,9% y en iado con hielo p e iamen e. Pasados unos minu os,
los animales se decapi a on pa a p ocede a la ex acción del ce eb o y ce ebelo. Sob e una placa
de hielo, se diseccionó y sepa ó el ce eb o del ce ebelo. Ambas pa es del hemis e io izquie do
se congela on a una empe a u a de -80ºC pa a pode se u ilizadas en pos e io es p uebas de
Biología Molecula y las del hemis e io de echo se ija on median e inme sión en una solución
de pa a o maldehído (PFA) al 4% en solución salina amponada con os a o 1x (PBS, del inglés
Phospha e Bu e ed Saline) Q Pa h® de VWR Chemicals® (Re . 11699408) du an e 24 ho as a 4ºC.
Pos e io men e, el ejido se c iop o egió en una solución de saca osa de Labbox® (Re . SUCR-
00A-5K0) al 30% en PBS 1x con azida sódica de Sigma-Ald ich® (Re . 26628-22-8) pa a e i a
con aminación ex e na, y se conse ó en cáma a ía a 4ºC has a que se hundió en el ubo cónico
de 15 ml. Una ez en el ondo, se p ocedió a su congelación u ilizando hielo seco y se almacenó
en congelado a -20ºC.
19
Del hemis e io de echo de cada ce ebelo se ob u ie on secciones co onales a un g oso de 20
µm y a una empe a u a de -20ºC, haciendo uso del C ios a o Leica® CM 1850 UV. Se coloca on
cua o secciones consecu i as, siguiendo siemp e el mismo o den de posición (Figu a 7), en
po aobje os p e iamen e gela inizados. Una ez ob enidas odas las mues as en los
po aobje os, se gua da on en cajas den o de un a cón a -20ºC pa a su pos e io p ocesado en
los espec i os análisis his ológicos.
Figu a 7. O den de posición de los co es his ológicos del hemis e io de echo del ce ebelo en el po aobje os.
Pa a lle a a cabo la gela inización de los po aobje os, se calen ó agua des ilada en una es u a
y, cuando alcanzó una empe a u a de 52ºC, se añadió gela ina ipo A de Sigma-Ald ich® (Re .
G2500) en pequeñas po ciones y en con inua agi ación. Una ez disuel a, se añadió la misma
can idad de agua des ilada calen ada p e iamen e y sul a o de c omo po ásico dodecahid a ado
de Pan eac® (Re . 141284). Cuando la mezcla quedó anspa en e, se apa ó de agi ación y se
ese ó a empe a u a ambien e has a que es u o emplada. Luego, se il ó y se e ió en
cube as pa a pode in oduci las ejillas de inción con los po aobje os sin gela iniza du an e
1 minu o. Finalmen e, las ejillas de inción con los po aobje os ya gela inizados se seca on en
la es u a a 45ºC du an e 24 ho as.
Inmunohis oquímica (IHC)
Pa a la ealización de la écnica de inmunohis oquímica (IHC), se selecciona on es po aobje os
po cada a ón a es al u as del ce ebelo dis in as. Dado que se sac i ica on 16 a ones, se
ob u ie on un o al de 48 po aobje os. El p ime po aobje os ue escogido de la zona pos e io
del ce ebelo, en e los p ime os quince po aobje os ob enidos; el segundo, de la zona media,
que co esponde a los po aobje os que se encon aban en e la decimoquin a y igésima
posición; y el e ce o, de la zona an e io , en e los po aobje os ob enidos más allá de la posición
ein ea a. De es a o ma, se ga an iza que las es uc u as isula es escogidas sean equi alen es
en odas las mues as.
Se ealiza on seis epe iciones de la écnica siguiendo el mismo p o ocolo, una pa a cada
conjun o de po aobje os que pe enecían a la misma al u a del ce ebelo. En las es p ime as
IHC se es udió la degene ación de las células de Pu kinje en la co eza ce ebelosa u ilizando un
an icue po monoclonal de a ón que se une a la calbindina (Tabla 2). Las o as es IHC es an es
se ealiza on con el in de obse a y cuan i ica la mic oglía p esen e en la co eza y sus ancia
blanca del ce ebelo, pa a lo que se usó un an icue po policlonal de conejo que se une a Iba1 (del
20
inglés, Ionized calcium-Binding Adap o molecule 1), un ma cado que se exp esa en la supe icie
de es as células gliales (Tabla 2).
Los po aobje os p e iamen e seleccionados se coloca on sob e una placa cale ac o a de Axel
Johnson Lab Sys em® a unos 40ºC ap oximadamen e du an e 10 minu os. Después, u ilizando
ImmEdge® Pen de Vec o Labo a o ies® (Re . H-4000), se aza on ci cun e encias al ededo de
cada co e con el obje i o de c ea una capa hid o óbica pa a delimi a la zona donde quedan
los eac i os sob e el ejido.
Los po aobje os se coloca on en una cube a donde se la a on con PBS 1x (3 x 5 minu os) pa a
el acondicionamien o de los co es his ológicos. A con inuación, se incuba on en una disolución
de pe óxido de hid ógeno al 1% / en me anol du an e 15 minu os a empe a u a ambien e, y
se la a on de nue o con PBS 1x (3 x 5 minu os). Una ez p epa ado el ejido, se eliminó el líquido
sob an e sob e los po aobje os y se coloca on sob e una cáma a húmeda pa a p osegui con el
p o ocolo de IHC.
En p ime luga , se bloquea on las uniones inespecí icas del an icue po p ima io incubando las
secciones en una solución de albúmina bo ina sé ica (BSA, del inglés Bo ine Se um Albumin) de
Sigma-Ald ich® (Re . A7906) al 5% p/ en PBS-T i ón al 2,5% du an e 1 ho a a empe a u a
ambien e. La solución de bloqueo u iliza PBS con T i ón pa a pode pe meabiliza las memb anas
plasmá icas de las células del ejido y pe mi i que los an icue pos deposi ados pos e io men e
sob e los co es puedan pene a al in e io de las mismas y, de es a o ma, ob ene un buen
ma caje pa a la pos e io isualización.
Seguidamen e, se añadió el an icue po p ima io (Tabla 2) diluido en una solución de BSA al 2,5%
p/ en PBS-T i ón al 2,5% du an e oda la noche a 4ºC. Al día siguien e, las secciones se incuba on
du an e 30 minu os a empe a u a ambien e an es de ealiza los la ados con PBS 1x (3 x 5
minu os) en la cube a. Una ez e minados, los po aobje os se ol ie on a coloca en la cáma a
húmeda pa a incuba las secciones con el an icue po secunda io (Tabla 2) en una solución de
BSA al 1% p/ en PBS-T i ón al 2,5% du an e 2 ho as a empe a u a ambien e. Luego, se la a on
de nue o con PBS 1x (3 x 5 minu os) en la cube a.
Tabla 2. An icue pos u ilizados en la écnica de IHC.
Ac p ima io
O igen
Labo a o io
Dilución
Ac secunda io
O igen
Labo a o io
Dilución
An i-
Calbindin
Mouse
Sigma-Ald ich®
(Re . ABN2192)
1:1000
An i-Mouse IgG (H+L)
Bio inyla ed
Goa
Vec o Labs.®
(Re . BA-9200)
1:200
An i-
Iba1
Rabbi
FUJIFILM Wako®
(Re . 019-19741)
1:1000
An i-Rabbi IgG (H+L)
Bio inyla ed
Goa
Vec o Labs.®
(Re . BA-1000)
1:200

21
Pos e io men e, se incuba on las mues as con un ki de inción ABC VECTASTAIN® Eli e® de
Vec o Labo a o ies® (Re . PX-6100) du an e 1 ho a. Es e ki incluye los eac i os pa a lle a a
cabo la écnica del complejo a idina-bio ina, así como la enzima pe oxidasa, y de es a o ma
pode ampli ica la in ensidad de inción y mejo a la sensibilidad en la pos e io de ección de
las di e en es es uc u as en el ejido. Después, los co es se la a on de nue o con PBS 1x (3 x 5
minu os) en la cube a.
T as los la ados, se u ilizó o o ki pa a p epa a una solución que incluía 3,3’-diaminobencidina
(DAB), enzima pe oxidasa y clo u o de níquel de Vec o Labo a o ies® (Re . SK-4100). Se dejó
ac ua de 2 a 4 minu os sob e las secciones pa a lle a a cabo una eacción en el que el p oduc o
p ecipi ado es de colo ma ón y así eñi el ejido. Jus o a con inuación, las mues as se la a on
con PBS 1x (3 x 5 minu os) en la cube a y los esiduos de los eac i os se desecha on en los
depósi os des inados a ello en el a ma io de segu idad del labo a o io.
Finalmen e, los co es se deshid a a on con disoluciones de e anol a concen aciones c ecien es,
se acla a on con xileno y se mon a on con la esina ac ílica DPX de Sigma-Ald ich® (Re . 06522)
y un cub eobje os con p ecaución de no o ma bu bujas que pudiesen de e io a el ejido.
Adquisición y análisis de imágenes
• IHC con an icue po p ima io An i-Calbindin
Una ez comple ado el p o ocolo pa a las es IHC que u ilizan An i-Calbindin de Sigma-Ald ich®
(Re . ABN2192) como an icue po p ima io (Tabla 2), se omó una imagen comple a po cada
sección colocada en los po aobje os haciendo uso de la Lupa Zeiss® AxioZoom V16 a campo
cla o con el obje i o de 100x, jun o al p og ama in o má ico ZEN Blue®, ubicado en el Cen o de
In es igación, Tecnología e Inno ación I (CITIUS-I), en Se illa, España. Pos e io men e, u ilizando
el p og ama o line FijiImageJ So wa e®, se p ocedió al análisis de las mismas.
En p ime luga , pa a es ima la densidad de células de Pu kinje se cuan i icó el núme o de somas
p esen es en una de e minada á ea de co eza medida en mm2. Pa a ello, de la imagen o iginal
(Figu a 8A) se selecciona on es po ciones de co eza alea o ias po cada co e his ológico
(Figu a 8C), ob eniéndose 576 en o al, y con la he amien a Cell Coun e se con abiliza on odos
los somas isibles en ella (Figu a 8D). Se es ablecie on como c i e ios que no e a necesa io que
las dend i as es u ie an apa en emen e comple as, sino que e a su icien e con la isualización
del núcleo pa a con a una célula, y que las células no oca an los bo des de la po ción
delimi ada. Po o a pa e, en esas mismas po ciones de co eza ambién se es imó la densidad
de células de Pu kinje median e la cuan i icación del ma caje de Calbindina u ilizando un mismo
22
umb al o Th eshold (Figu a 8E), lo que se aduce en el á ea que ocupan las células de Pu kinje
con espec o a una de e minada á ea de co eza medida en mm2. Es os úl imos alo es se
exp esa on en o ma de po cen aje. Luego, se cons uye on g á icas donde se pod ía conoce la
deg adación de las células de Pu kinje en la co eza ce ebelosa de cada g upo expe imen al.
A
B
C
D
E
F
Figu a 8. Me odología pa a lle a a cabo la es imación de la densidad de células de Pu kinje en la co eza ce ebelosa
u ilizando el p og ama o line FijiImageJ So wa e®.
(A) Imagen o iginal. (B) Imagen en escala de g ises a 8 bi s. (C) Po ción de co eza seleccionada. (D) Cuan i icación de
somas. (E) Aplicación del umb al o Th eshold. (F) De e minación del á ea gene ada.
• IHC con an icue po p ima io An i-Iba1
Pos e io men e a las IHC con an icue po p ima io An i-Calbindin, se ealiza on es IHC con
an icue po p ima io An i-Iba1 de FUJIFILM Wako® (Re . 019-19741) como an icue po p ima io
(Tabla 2). Las secciones se obse a on u ilizando el Mic oscopio óp ico Olympus® BX61 a campo
cla o con el obje i o de 20x y el p og ama in o má ico cellSens®, ubicado en el Cen o de
In es igación, Tecnología e Inno ación I (CITIUS-I), en Se illa, España. Se oma on es imágenes
de la co eza ce ebelosa, ob eniéndose 144 en o al, pa a cuan i ica la mic oglía en cada una de
ellas u ilizando el p og ama o line FijiImageJ So wa e®. Po o a pa e, las mismas secciones
p esen es en los po aobje os se obse a on u ilizando el Mic oscopio óp ico Leica® a campo
cla o con el obje i o de 20x, ubicado en el labo a o io BIO-113 del Depa amen o de Bioquímica
y Biología Molecula si uado en la Facul ad de Fa macia de la Uni e sidad de Se illa, España. Allí
se isualiza on es campos de sus ancia blanca ce ebelosa, 144 en o al, en los que se
cuan i ica on los somas de las células mic ogliales. Se u ie on en cuen a las células que se
encon aban en el in e io y aquellas que es aban en con ac o con los má genes supe io y
de echo de la celda, po an o, queda on excluidas aquellas células en los má genes in e io e
23
izquie do de la celda (Figu a 9). Pos e io men e, mul iplicando el núme o de somas po el ac o
numé ico 5,9, se ob u o el núme o de células mic ogliales po á ea medida en mm2. Así, se
cons uye on g á icas donde se pod ía conoce la can idad de mic oglía p esen e en la co eza y
la sus ancia blanca ce ebelosas de cada g upo expe imen al.
Figu a 9. Imagen de la celda del Mic oscopio óp ico Olympus a campo cla o u ilizada pa a cuan i ica las células
mic ogliales p esen es en la sus ancia blanca ce ebelosa.
Se cuan i ica on las que se encon aban en el in e io y aquellas que es aban en con ac o con los má genes supe io
y de echo de la celda, po an o, queda on excluidas aquellas células en los má genes in e io e izquie do de la celda.
Análisis es adís ico
El análisis es adís ico de los da os y la pos e io con ección de las g á icas se ha ealizado
u ilizando el p og ama G aphPad P ism So wa e® e sión 8.4.2.
En p ime luga , se ob u ie on los alo es medios con sus co espondien es des iaciones
es ánda de cada uno de los cua o pa áme os cuan i icados pa a cada a ón y al u a del
ce ebelo, po lo que se de e minó una N de 16. Los da os seguían una dis ibución no mal en la
mayo ía de los casos al se analizados median e los es s de Shapi o-Wilk y Kolmogo o -Smi no ,
po lo que se p ocedió a u iliza es pa amé icos. En odos los casos, el ni el de signi icación se
es ableció en p < 0,05. A con inuación, se lle ó a cabo la p ueba -S uden con el in de obse a
si exis en di e encias signi ica i as en e las zonas an e io , media y pos e io del ce ebelo den o
de un mismo g upo expe imen al pa a cada pa áme o cuan i icado. En aquellos casos donde se
obse a on di e encias, se aplicó un es más es ic i o, ANOVA de un ac o , pa a comp oba
que ealmen e exis e una dis ibución he e ogénea de las células de Pu kinje o mic ogliales a lo
la go del eje an e opos e io del ce ebelo del a ón. Pa a conoce si los g upos expe imen ales
son signi ica i amen e dis in os con espec o a uno de los pa áme os, se u ilizó el es ANOVA
de un ac o seguido del es pos hoc de Tukey pa a compa aciones múl iples y los esul ados se
ep esen a on en diag amas de iolín.
Finalmen e, se ep esen a on en g á icos de dispe sión pa ejas de da os de dos a iables
dis in as con el in de ob ene ec as de eg esión y coe icien es de co elación que in o men de
qué o ma pod ía in lui uno sob e o o. Además, se es udió si exis en di e encias signi ica i as
en e las pendien es pa a los dis in os g upos expe imen ales.
24
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
• Dis ibución de células de Pu kinje y mic oglía en el eje an e opos e io del ce ebelo
En p ime luga , se comp obó que la dis ibución de las células de Pu kinje y de la mic oglía e a
homogénea a lo la go de odo el eje an e opos e io del ce ebelo del a ón. Pa a ello, se ealizó
la p ueba -S uden y compa ando po pa ejas los da os ob enidos pa a cada al u a del ce ebelo,
den o de un mismo g upo expe imen al y pa a una a iable conc e a. Pos e io men e, se aplicó
el es ANOVA y el es pos hoc de Tukey pa a compa aciones múl iples, más es ic i os, pa a
con i ma que e ec i amen e, en algunos g upos expe imen ales exis en di e encias
signi ica i as en e las di e en es zonas del ce ebelo pa a un pa áme o en conc e o.
Tan o en la can idad de células de Pu kinje (Figu a 10A, E y I) como en el á ea que ocupan las
mismas den o de la co eza ce ebelosa e lejada a a és de á ea que ocupa el ma caje del
an icue po An i-Calbindin (Figu a 10B, F y J) no se obse an di e encias signi ica i as en e las
es zonas del ce ebelo pa a cada uno de los es g upos expe imen ales.
De la misma o ma, ampoco exis en di e encias signi ica i as en la can idad de mic oglía
p esen e en la co eza ce ebelosa (Figu a 10C, G y K) a lo la go del eje an e opos e io en los
dis in os g upos expe imen ales. Sin emba go, el análisis es adís ico mues a que la can idad de
mic oglía en la sus ancia blanca (Figu a 10D, H y L) es signi ica i amen e in e io en el e cio
pos e io del ce ebelo de los a ones WT y bl, en compa ación con los e cios an e io y medio,
es deci , el núme o de células mic ogliales dec ece a medida que se a anza en el eje
an e opos e io en es os dos casos. En los a ones WT y bl se p oduce la disminución en la
mic oglía de la sus ancia blanca en la zona pos e io del ce ebelo de mane a simila , al con a io
de los a ones bl/Gal3KO en los que no iene luga , sino que se man iene en unos alo es
cons an es a lo la go de odo el ce ebelo. Es o pod ía es a elacionado con el papel que juega
Gal3 en la o mación de las ainas de mielina de los axones que con o man la sus ancia blanca.
Va ios au o es desc iben que Gal3 in e iene en la madu ación y di e enciación de
oligodend oci os esponsables del p oceso de mielinización ya que p omue e la ac i ación de
AKT y, po an o, el anscu so de la ía PI3K/AKT/mTOR pa a el c ecimien o y p oli e ación celula
(Thomas & Pasquini, 2018). En a ones WT y, p incipalmen e en a ones bl que p esen an una
sob eexp esión de He c1 bl, pod ía es a p e aleciendo el e ec o inhibi o io de es a p o eína
sob e la u a en e al de Gal3, disminuyendo el c ecimien o y p oli e ación celula así como
dando luga a una mielina con una meno in eg idad y compac ación. Se ía in e esan e ealiza
un es udio en el que se incluye an a ones con la condición WT/Gal3KO pa a pode obse a si
es e e ec o ocu e especí icamen e al sup imi la exp esión de Gal3.
31
o Sus ancia blanca ce ebelosa
Po o o lado, se ealizó el mismo p ocedimien o pa a analiza la can idad de células mic ogliales
p esen es en la sus ancia blanca ce ebelosa. Los esul ados e lejan que la población mic oglial
en la sus ancia blanca ce ebelosa de los a ones WT (89,3 ± 3,9) es signi ica i amen e meno a
la de a ones bl (99,7 ± 5,0) y bl/Gal3KO (101,5 ± 5,2), al igual que ocu e en la co eza
ce ebelosa. Sin emba go, en es e caso, el núme o de células mic ogliales es solo un 11,7%
supe io en los a ones bl y un 13,7% en los a ones bl/Gal3KO con espec o a los a ones WT,
ampoco exis iendo di e encias signi ica i as en e los g upos expe imen ales (Figu a 13D).
Es e aumen o signi ica i o, aunque en meno medida que en la co eza ce ebelosa, en el núme o
de células mic ogliales en la sus ancia blanca del ce ebelo de los a ones bl y bl/Gal3KO con
espec o a los WT pod ía es a elacionado con de ec os en el p oceso de mielinización a causa
de la sob eexp esión de la p o eína He c1 bl. Como se ha comen ado an e io men e, el co ec o
uncionamien o de dicha p o eína es necesa io pa a una mielinización axonal adecuada. Sin
emba go, cuando se encuen a mu ada, es abiliza a AKT os o ilada y p o oca allos en la ía de
señalización PI3K/AKT/mTOR que desencadenan de ec os en la mielinización y, en consecuencia,
en la conducción del impulso ne ioso (Bachille e al., 2018 [B]). Po o a pa e, algunos au o es
sugie en que el ecep o TREM2 y la mic oglía DAM es án implicados en la mediación de la
espues a inmuni a ia necesa ia pa a me aboliza los es os de mielina (Sa aiyan e al., 2021).
Sin emba go, al no obse a di e encias en e los g upos bl y bl/Gal3KO, es posible que es e
mecanismo no se encuen e implicado en nues o modelo mu ino en el que se bloquea lgals3,
ya que la ausencia de exp esión de Gal3 pa ece no a ec a al núme o de mic oglía en la sus ancia
blanca. En es udios pos e io es donde se midan los ni eles de ma cado es especí icos
comen ados an e io men e pe mi i án p o undiza en el papel de Gal3 en la mielinización.
En esumen de lo obse ado con espec o a la mic oglía, podemos conclui que hay indicios
cla os de que la mic oglía que se encuen a en la co eza es echamen e asociada a las células
de Pu kinje adquie e un eno ipo DAM más eac i o inmunológicamen e que en condiciones de
degene ación mielínica en los axones neu onales p esen es en la sus ancia blanca.
Del mismo modo, al como a anzamos an e io men e, en e los a ones bl (99,7 ± 5,0) y
bl/Gal3KO (101,5 ± 5,2) la can idad de mic oglía p esen e en la sus ancia blanca ce ebelosa
aumen a en un 2% únicamen e con espec o al con ol (Figu a 13D). Dado que, de nue o, no
exis e una di e encia signi ica i a en e los dos g upos expe imen ales, se ea i ma que la
sup esión de la exp esión de Gal3 no conlle a un cambio en la p oli e ación mic oglial que pod ía
es a asociado a p ocesos neu oin lama o ios en los a ones con dos meses de edad.

32
A
C
B
D
Figu a 13. Es udio del ma caje especí ico de mic oglía en el ce ebelo de a ones de 2 meses.
(A) Imagen de mic oscopía óp ica a campo cla o con obje i o 20x de co eza en el ce ebelo de a ones WT, bl y
bl/Gal3KO. La mic oglía se ha ma cado con un an icue po An i-Iba1. Ba a de escala: 200 µm. (B) Núme o de mic oglía
en el á ea medida (mm2) en la co eza del ce ebelo de a ones WT, bl y bl/Gal3KO. (C) Imagen de mic oscopía óp ica
a campo cla o con obje i o 20x de sus ancia blanca en el ce ebelo de a ones WT, bl y bl/Gal3KO. La mic oglía se ha
ma cado con un an icue po An i-Iba1. Ba a de escala: 200 µm. (D) Núme o de mic oglía en el á ea medida (mm2) en
la sus ancia blanca del ce ebelo de a ones WT, bl y bl/Gal3KO. Los esul ados se ep esen an en diag amas de iolín
que e lejan la dispe sión de los da os con espec o a la media con una N=16. La signi icación es adís ica se calculó
con el es ANOVA de un ac o seguido del es pos hoc de Tukey pa a compa aciones múl iples. Se es ablece * en
p<0,05, ** en p<0,01, *** en p<0,001 y **** en p<0,0001.
WT
WT
bl
bl
bl/Gal3KO
/
bl/Gal3KO
/
33
• Va iación de la can idad de mic oglía en co eza con espec o al núme o de células de
Pu kinje en el á ea medida (mm2) y a la densidad de células de Pu kinje (%)
Se han ep esen ado en dos diag amas de dispe sión las pa ejas de da os y sus co espondien es
ec as de eg esión con el obje o de conoce de qué o ma a ía la can idad de mic oglía en la
co eza con espec o al núme o de células de Pu kinje po á ea (Figu a 14A) y a la densidad que
ocupan en cada g upo expe imen al (Figu a 14B). A pa i de los mismos, se calcula on las
pendien es de las ec as y los coe icien es de co elación, y se analiza on es adís icamen e.
Ambos diag amas e lejan cómo el núme o de células de Pu kinje po á ea y la densidad que
ocupan en la sus ancia blanca del ce ebelo es mayo en a ones WT que en a ones bl/Gal3KO
y bl (Figu a 14). Es o signi ica que, de nue o, aunque en el ce ebelo de los a ones bl exis e una
disminución en el núme o de células de Pu kinje, la sup esión de la exp esión de Gal3 implica un
esca e en la población de dichas células en los a ones del g upo expe imen al bl/Gal3KO.
Según el análisis es adís ico, el alo pa a la pendien e de la ec a pa a los a ones bl (7,0270;
R2=0,9672 (A) 14,8100; R2=0,9728 (B)) y bl/Gal3KO (6,5550; R2=0,9908 (A) 6,9230; R2=0,9547
(B)) es signi ica i amen e mayo que en los a ones WT (0,7417; R2=0,9881 (A) 2,0800; R2=0,9003
(B)). Po an o, pa a un mismo núme o de células de Pu kinje po á ea o densidad de las mismas
en el ce ebelo, exis e una mayo can idad de mic oglía en la co eza los a ones bl y bl/Gal3KO
que en a ones WT, lo que quie e deci que la espues a mic oglial es á más p esen e en
condiciones pa ológicas que en el g upo con ol, p obablemen e po la degene ación de las
células de Pu kinje en ellas.
Aunque la pendien e de la ec a pa a los a ones bl es mayo que pa a los a ones bl/Gal3KO
en ambos casos, en el diag ama donde se ep esen a la densidad de células de Pu kinje en el eje
de abscisas (Figu a 14B), la di e encia en e las pendien es pa a los g upos bl y bl/Gal3KO es
más no able que en el que se ep esen a la can idad de células de Pu kinje po á ea (Figu a 14A).
Es o signi ica que pod ía exis i una meno ac i ación de las células de la mic oglía al habe un
esca e de la población de las células de Pu kinje en los a ones bl/Gal3KO. No obs an e,
eniendo en cuen a los esul ados desc i os an e io men e, es a a iación en e las pendien es
pod ía debe se al aumen o de la ami icación de las células de Pu kinje en los a ones
bl/Gal3KO, que hace que la densidad de las mismas en la co eza ce ebelosa sea mayo y, po
an o, la p opo ción con espec o a la can idad de mic oglía p esen e en es a zona disminuya.
34
A
0 50 100
0
50
100
150
200
250
Células de Pu kinje / mm2
Mic oglía / mm2
CORTEZA
B
0 50 100
0
50
100
150
200
250
Densidad Células de Pu kinje (%)
Mic oglía / mm2
CORTEZA
WT
bl
bl/Gal3KO
Figu a 14. Va iación de la can idad de mic oglía en co eza con espec o las células de Pu kinje en el ce ebelo de
a ones de 2 meses pe enecien es a los g upos expe imen ales WT, bl y bl/Gal3KO.
(A) Va iación de la can idad de mic oglía en co eza con espec o al núme o de células de Pu kinje en el á ea medida
(mm2). Pa a a ones WT la pendien e es 0,7417 y R2=0,9881, pa a a ones bl la pendien e es 7,0270 y R2=0,9672 y
pa a a ones bl/Gal3KO la pendien e es 6,5500 y R2=0,9908. Las es pendien es son signi ica i amen e di e en es de
ce o (p<0,0001, ****). (B) Va iación de la can idad de mic oglía en co eza con espec o a la densidad de células de
Pu kinje (%). Pa a a ones WT la pendien e es 2,0800 y R2=0,9903, pa a a ones bl la pendien e es 14,8100 y
R2=0,9728 y pa a a ones bl/Gal3KO la pendien e es 6,9230 y R2=0,9547. Las es pendien es son signi ica i amen e
di e en es de ce o (p<0,0001, ****). La signi icación es adís ica se calculó con un es que de e mina si las pendien es
y las in e secciones en e ec as son signi ica i amen e dis in as. Se es ablece * en p<0,05, ** en p<0,01, *** en
p<0,001 y **** en p<0,0001.
• Va iación de la can idad de mic oglía en sus ancia blanca con espec o al núme o de
células de Pu kinje en el á ea medida (mm2) y a la densidad de células de Pu kinje (%)
Al igual que en el caso an e io , se han cons uido dos diag amas de dispe sión con los da os de
las dos a iables y se han dibujado las ec as de eg esión con el in de sabe cómo in luye la
a iación en el núme o de células de Pu kinje po á ea (Figu a 15A) y la densidad que ocupan
(Figu a 15B) en la can idad de mic oglía p esen e en la sus ancia blanca po cada g upo
expe imen al. A pa i de ellos, se ob u ie on las pendien es de las ec as y sus coe icien es de
co elación, y después se analiza on es adís icamen e.
En ambos casos se puede e como el núme o de células de Pu kinje po á ea y la densidad que
ocupan en la sus ancia blanca del ce ebelo es mayo en a ones WT que en a ones bl/Gal3KO
y bl (Figu a 15). Es o con i ma que exis e un esca e en la población de las células de Pu kinje
cuando se sup ime la exp esión de Gal3 en los a ones bl/Gal3KO.
Una ez ealizado el análisis es adís ico, el alo pa a la pendien e de la ec a pa a los a ones bl
(4,3450; R2=0,9575 (A) 9,1670; R2=0,9650 (B)) y bl/Gal3KO (3,562; R2=0,9734 (A) 4,1200;
R2=0,9723 (B)) es signi ica i amen e mayo que en los a ones WT (0,8161; R2=0,9958 (A) 2,2870;
R2=0,9970 (B)). Po ende, pa a un mismo núme o de células de Pu kinje po á ea o densidad
ocupada po és as en el ce ebelo, hay más células mic ogliales en la sus ancia blanca ce ebelosa
de los a ones bl y bl/Gal3KO que en a ones WT, lo cual signi ica que la mic oglía es más
35
abundan e en los g upos expe imen ales que incluyen eno ipo bl donde hay una disminución
en la población de células de Pu kinje y una espues a neu oin lama o ia asociada a ella.
Igualmen e, la pendien e de la ec a es más p onunciada pa a los a ones bl que pa a los a ones
bl/Gal3KO en ambos casos. No obs an e, en el diag ama donde se ep esen a la densidad de
células de Pu kinje en el eje de abscisas (Figu a 15B), la di e encia en e las pendien es pa a los
g upos bl y bl/Gal3KO es más no able que en el que se ep esen a la can idad de células de
Pu kinje po á ea (Figu a 15A). Al igual que en la co eza ce ebelosa, pa ece que la ac i ación
mic oglial es meno en los a ones bl/Gal3KO que en los bl a causa del esca e de la población
de las células de Pu kinje, aunque se debe ene en cuen a lo indicado an e io men e.
A
0 50 100
0
50
100
150
Células de Pu kinje / mm2
Mic oglía / mm2
SUSTANCIA BLANCA
B
0 50 100
0
50
100
150
Densidad Células de Pu kinje (%)
Mic oglía / mm2
SUSTANCIA BLANCA
WT
bl
bl/Gal3KO
Figu a 15. Va iación de la can idad de mic oglía en sus ancia blanca con espec o las células de Pu kinje en el
ce ebelo de a ones de 2 meses pe enecien es a los g upos expe imen ales WT, bl y bl/Gal3KO.
(A) Va iación de la can idad de mic oglía en sus ancia blanca con espec o al núme o de células de Pu kinje en el á ea
medida (mm2). Pa a a ones WT la pendien e es 0,8161 y R2=0,9958, pa a a ones bl la pendien e es 4,3450 y
R2=0,9575 y pa a a ones bl/Gal3KO la pendien e es 3,5620 y R2=0,9734. Las es pendien es son signi ica i amen e
di e en es de ce o (p<0,0001, ****). (B) Va iación de la can idad de mic oglía en sus ancia blanca con espec o a la
densidad de células de Pu kinje (%). Pa a a ones WT la pendien e es 2,2870 y R2=0,9970, pa a a ones bl la pendien e
es 9,1670 y R2=0,9650 y pa a a ones bl/Gal3KO la pendien e es 4,1200 y R2=0,9723. Las es pendien es son
signi ica i amen e di e en es de ce o (p<0,0001, ****). La signi icación es adís ica se calculó con un es que
de e mina si las pendien es y las in e secciones en e ec as son signi ica i amen e dis in as. Se es ablece * en p<0,05,
** en p<0,01, *** en p<0,001 y **** en p<0,0001.
• Va iación de la can idad de mic oglía en sus ancia blanca con espec o a la can idad de
mic oglía en co eza po á ea medida (mm2)
Po úl imo, se ha cons uido un diag ama en el que se ep esen a cómo a ía la can idad de
mic oglía p esen e en la sus ancia blanca con espec o a la exis en e en la co eza ce ebelosa
(Figu a 16). Pa a ello, de nue o se han ep esen ado las pa ejas de da os como pun os y se han
dibujado las ec as de eg esión, las cuales lle an asociadas una pendien e y un coe icien e de
co elación, pa áme os que se u iliza án pos e io men e pa a el análisis es adís ico.
Pa a los es g upos expe imen ales se cumple que el aumen o en la can idad de mic oglía
localizada en la co eza ce ebelosa es di ec amen e p opo cional a la can idad de mic oglía en la
36
sus ancia blanca, po an o, a medida que aumen a el núme o de células mic ogliales en la
co eza, ambién aumen a en la sus ancia blanca ce ebelosa.
En es e caso, al con a io que en los an e io es, el alo pa a la pendien e de la ec a en los
a ones WT (1,0920; R2=0,9925) es signi ica i amen e supe io al de los a ones bl (0,6210;
R2=0,9983) y bl/Gal3KO (0,5874; R2=0,9921). Es o signi ica que, en a ones WT, po cada célula
mic oglial p esen e en la co eza hay una en la sus ancia blanca, mien as que en a ones bl y
bl/Gal3KO, hay una célula mic oglial en la sus ancia blanca po cada dos p esen es en la co eza
ce ebelosa. Po an o, se puede conclui que, en a ones con condiciones eno ípicas bl y
bl/Gal3KO, la can idad de células mic ogliales en la co eza es mayo que en la sus ancia blanca.
Es o pod ía debe se a que, como se ha obse ado que la degene ación de las células de Pu kinje
en los a ones bl y bl/Gal3KO se p oduce mayo i a iamen e en la co eza ce ebelosa, exis e una
mayo p oli e ación mic oglial en las capas más supe iciales del ce ebelo an es de que se
p oduzca en las capas más p o undas, como la sus ancia blanca.
0 50 100 150 200
0
50
100
Mic oglía / mm2
CORTEZA
Mic oglía / mm2
SUSTANCIA BLANCA
WT
bl
bl/Gal3KO
Figu a 16. Va iación de la can idad de mic oglía en la sus ancia blanca con espec o a la can idad de mic oglía en
co eza en el á ea medida (mm2) en el ce ebelo de a ones de 2 meses pe enecien es a los g upos expe imen ales
WT, bl y bl/Gal3KO.
Pa a a ones WT la pendien e es 1,0920 y R2=0,9925, pa a a ones bl la pendien e es 0,6210 y R2=0,9983 y pa a
a ones bl/Gal3KO la pendien e es 0,5874 y R2=0,9921. Las es pendien es son signi ica i amen e di e en es de ce o
(p<0,0001, ****). La signi icación es adís ica se calculó con un es que de e mina si las pendien es y las in e secciones
en e ec as son signi ica i amen e dis in as. Se es ablece * en p<0,05, ** en p<0,01, *** en p<0,001 y **** en
p<0,0001.

37
CONCLUSIONES
Una ez expues os y discu idos los esul ados ob enidos en es e es udio, se puede conclui que:
- La dis ibución de las células de Pu kinje y de la mic oglía es homogénea a lo la go del
eje an e opos e io del ce ebelo del a ón, po lo que no exis en di e encias signi ica i as
en la can idad de es as células en e las zonas an e io , media y pos e io del mismo.
- La población de células de Pu kinje en el ce ebelo de los a ones bl y bl/Gal3KO es
menos abundan e que la de a ones WT a causa de la degene ación de las mismas po
la sob eexp esión de la p o eína mu ada He c1 bl en el ce ebelo de los a ones con dos
meses de edad.
- Al bloquea el gen lgals3 y sup imi la exp esión del mediado neu oin lama o io Gal3
en los a ones con eno ipo bl, se obse a cómo la mue e au o ágica de las células de
Pu kinje disminuye y, po an o, exis e un posible esca e mo o en ellos.
- La mic oglía es más abundan e en los a ones bl y bl/Gal3KO en espues a al p oceso
neu oin lama o io, no obs an e, no exis en di e encias en es a población celula en e
los a ones bl y bl/Gal3KO, po lo que la sup esión de Gal3 no supone ninguna en aja
con espec o a la de ención del aumen o de la población mic oglial en el ce ebelo.
- Dado que la población de células mic ogliales es mayo en la co eza que en la sus ancia
blanca ce ebelosas, la degene ación de las células de Pu kinje p edominan e en la
co eza ce ebelosa de los a ones bl y bl/Gal3KO pod ía es a causando una mayo
ac i ación y eac i idad de la mic oglía an e es as condiciones neu oin lama o ias en las
capas más supe iciales del ce ebelo an es que en las p o undas.
- El aumen o en la can idad de mic oglía en la sus ancia blanca del ce ebelo de a ones
bl y bl/Gal3KO en compa ación con los WT puede debe se a p oblemas en la
mielinización axonal, no obs an e, no es an no able como en la co eza ce ebelosa.
- En cuan o al análisis mo ológico, pa ece que las células de Pu kinje de los a ones
bl/Gal3KO p esen an un á bol dend í ico más ami icado que las de los o os dos g upos
expe imen ales. Es o pod ía debe se a un mayo con ol del p oceso neu oin lama o io
que iene luga en la co eza ce ebelosa p incipalmen e po la degene ación de las
células de Pu kinje en los a ones bl.
38
ABREVIATURAS
ARNm: ARN mensaje o
BDNF: B ain De i ed Neu o ophic Fac o
BH3: Bcl-2 Homology Domain 3
BSA: Bo ine Se um Albumin
CITIUS: Cen o de In es igación, Tecnología
e Inno ación de la Uni e sidad de Se illa
CRD: Ca bohyd a e Recogni ion Domain
DAB: 3,3’-diaminobencidina
DAM: Disease-Associa ed Mic oglia
E1: enzimas ac i ado as de ubiqui ina
E2: enzimas conjugado as de ubiqui ina
E3: enzimas ligasas de ubiqui ina
Gal3: Galec ina-3
GEF: Guanine nucleo ide Exchange Fac o
GN: Gas ocnemius
GTEx: Geno ype-Tissue Exp ession
HECT: Homologous o he E6AP Ca boxyl Te minus
Hs: Homo sapiens
Iba1: Ionized calcium-Binding Adap o molecule 1
IHC: inmunohis oquímica
IL-12: in e leukin-12
IL-1β: in e leukin-1β
KO: Knock-Ou
LAL: Le a o Au is Longus
MDFPMR: Mac ocephaly, Dysmo phic Facies and
Psychomo o Re a da ion
Mm: Mus musculus
MN: mo oneu ona
mTORC1: mammalian Ta ge O Rapamycin Complex 1
NMSC: células de Schwann no mielinizan es
NO: óxido ní ico
NRS: especies eac i as de ni ógeno
PBS: Phospha e Bu e ed Saline
PFA: pa a o maldehído
PI3K: os a idilinosi ol 3-cinasa
PKB: p o eína cinasa B
RLD: Regula o o Ch omosome
Condensa ion 1 (RCC1) Like Domain
ROS: especies eac i as de oxígeno
S6K1: Ribosomal P o ein S6 Kinase β-1
SNC: Sis ema Ne ioso Cen al
SNP: Sis ema Ne ioso Pe i é ico
SRPY: spl A and RyR
bl: ambalean e
TEA: T as o nos del Espec o Au is a
TGF-β: T ans o ming G ow h Fac o β
TLR4: Toll-Like Recep o 4
TNF-α: Tumo Nec osis Fac o α
TREM2: T igge ing Recep o Exp essed on
Myeloid Cells 2
TSC1: Tube ous Scle osis Complex 1
TSC2: Tube ous Scle osis Complex 2
TVA: T ans e sus Abdominis
Ub: ubiqui ina
UNM: unión neu omuscula
UPS: Sis ema Ubiqui ina-P o easoma
WT: Wild-Type
39
BIBLIOGRAFÍA
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