Papel de la microglía asociada a neurodegeneración en un modelo atáxico

TRABAJO FIN DE GRADO DE CARÁCTER EXPERIMENTAL PAPEL DE LA MICROGLÍA ASOCIADA A NEURODEGENERACIÓN EN UN MODELO ATÁXICO Ma ía de los San os Le án Sánchez G ado en Fa macia Facul ad de Fa macia · Uni e sidad de Se illa Cu so 2022/2023 1 TRABAJO FIN DE GRADO DE CARÁCTER EXPERIMENTAL PAPEL DE LA MICROGLÍA ASOCIADA A NEURODEGENERACIÓN EN UN MODELO ATÁXICO Ma ía de los San os Le án Sánchez G ado en Fa macia Facul ad de Fa macia · Uni e sidad de Se illa Cu so 2022/2023 Tu o a - D a. Rocío Ruiz Laza Depa amen o de Bioquímica y Biología Molecula 2 AGRADECIMIENTOS Me sien o a o unada, es a e apa que hoy culmina me ha dejado una huella en el alma, y es po odas las pe sonas que me han acompañado du an e el camino en el que he enido la eno me opo unidad de apo a mi g ani o de a ena. La elicidad sólo es eal cuando se compa e, po eso, me gus a ía ag adece os odos aquellos momen os que me habéis egalado du an e es os cinco in ensos años. G acias Rocío po ansmi i me esa inmensa pasión que ienes po la ciencia desde el p ime día que coincidimos en clase y po b inda me u con ianza du an e es os años en los que he enido la sue e de se u alumna in e na y ealiza es e abajo bajo u u ela. G acias po c ee siemp e en mí y hace me sen i aliosa. A i Paco, po guia me en cada paso que he dado du an e es e iempo, po hace me dis u a de cada ins an e y po enseña me a con ia en mí misma. Po encima de odo es o, quie o ag adece e que hayas es ado a mi lado, has sido luz y has sabido cómo saca me una son isa, especialmen e en aquellos momen os más du os. G acias Albe o po p eocupa e an o, po ene siemp e unas boni as palab as pa a mí y po o ece me ese ab azo cuando más lo necesi aba. A i Sonia, po se más que amiga, mi mi ad, po habe compa ido odo es e iempo conmigo, po da me an as anécdo as que con a y po apo a me esa segu idad que en muchas ocasiones me al a. A oso os y a odos los que o máis pa e del labo a o io BIO-113, g acias po ab i nos las pue as y pe mi i nos da nues os p ime os pasos en la in es igación, po compa i ues o p ecioso abajo y hace que nos emocione la Neu ociencia. G acias po se amilia. También me gus a ía da las g acias a odos los que han sido compañe os y aho a son amigos. A los que han es ado jun o a mi du an e la ca e a, a los que llega on más a de, y a los que, po casualidad, he conocido hace poco. G acias po hace me más ácil el eco ido enseñándome a dis u a de él y po con agia me de ues a aleg ía in ini a. A cada uno de oso os, os gua do un hueco en mi co azón pa a siemp e. Po úl imo, me gus a ía ag adece a mis abuelos, po habe me educado en alo es, po su dedicación, es ue zo y en ega. A Raúl, po se cómplice, po sabe escucha me y po o ien a me en cada umbo que omo en la ida. Y a i mamá, g acias po mos a me u o gullo y admi ación a a és de esos ojos b illan es que lle a é e e namen e en el ecue do, y po da me ue zas pa a segui luchando po consegui mis sueños. A los que, po sue e, puedo ab aza con ue za y a los que no es án, pe o sé que no me suel an de la mano, G acias de e dad. 3 RESUMEN La mu ación au osómica ecesi a Gly483Glu, que ocu e espon áneamen e en la p o eína mu ina He c1, conduce a su sob eexp esión en el ce ebelo del a ón ambalean e ( bl). Es o p o oca un descon ol de la mue e po au o agia de las células de Pu kinje a pa i de los dos meses de edad, así como una des egulación de la ía de señalización PI3K/AKT/mTOR enca gada de la co ec a mielinización axonal. Ambas si uaciones desencadenan la apa ición de un sínd ome neu omuscula a áxico ca ac e izado po al e aciones en el con ol mo o . An e es a pe u bación homeos á ica, incluso an es de que ocu a la mue e de las células de Pu kinje, la mic oglía p esen e en el ce ebelo es capaz de inicia una po en e espues a inmuni a ia adqui iendo un pe il de eno ipo DAM con una sob eexp esión de Galec ina-3 (Gal3). Con el obje i o de es udia el papel de es a mic oglía en el p oceso degene a i o que iene como consecuencia la mue e de las células de Pu kinje en el modelo bl, se ha eliminado el gen lgals3 pa a sup imi la exp esión de Gal3. Una ez gene ado el nue o modelo mu ino, se cuan i ica on median e inmunohis oquímica las células de Pu kinje y la densidad que ocupaban en el ce ebelo de a ones de dos meses en mues as p oceden es de es g upos expe imen ales, WT, bl y bl/Gal3KO, así como el núme o de células mic ogliales p esen es en la co eza y en la sus ancia blanca de las secciones co onales de los mismos. Así se con i mó la hipó esis inicial en an o que, al sup imi la exp esión de Gal3, se ecupe aba pa cialmen e la población de células de Pu kinje. No se obse a on cambios en la can idad de células mic ogliales en e los g upos bl y bl/Gal3KO, pe o sí en e ambos y el WT p esen ando los g upos expe imen ales una mayo can idad en compa ación con el con ol, siendo es a di e encia mayo en co eza a causa de la espues a in lama o ia o iginada po el daño neu onal. PALABRAS CLAVE HERC1, ambalean e, Pu kinje, Galec ina-3, mic oglía 4 ÍNDICE RESUMEN Y PALABRAS CLAVE 3 INTRODUCCIÓN 5 Sis ema Ne ioso Cen al (SNC) y el mo imien o 5 Sis ema Ubiqui ina-P o easoma (UPS) 6 P o eínas HERC 7 Ra ones ambalean es 10 Mani es aciones clínicas 12 Mic oglía asociada a en e medad (DAM) 13 Galec ina-3 (Gal3) 14 OBJETIVOS 16 MATERIALES Y MÉTODOS 17 Animales expe imen ales 17 Ob ención y p epa ación de mues as 18 Inmunohis oquímica (IHC) 19 Adquisición y análisis de imágenes 21 IHC con an icue po p ima io An i-Calbindin 21 IHC con an icue po p ima io An i-Iba1 22 Análisis es adís ico 23 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 24 Dis ibución de células de Pu kinje y mic oglía en el eje an e opos e io del ce ebelo 24 Cuan i icación de células de Pu kinje 26 Va iación de la densidad de células de Pu kinje (%) con espec o al núme o de células de Pu kinje en el á ea medida (mm2) 28 Cuan i icación de mic oglía 29 Co eza ce ebelosa 30 Sus ancia blanca ce ebelosa 31 Va iación de la can idad de mic oglía en co eza con espec o al núme o de células de Pu kinje en el á ea medida (mm2) y a la densidad de células de Pu kinje (%) 33 Va iación de la can idad de mic oglía en sus ancia blanca con espec o al núme o de células de Pu kinje en el á ea medida (mm2) y a la densidad de células de Pu kinje (%) 34 Va iación de la can idad de mic oglía en sus ancia blanca con espec o a la can idad de mic oglía en co eza po á ea medida (mm2) 35 CONCLUSIONES 37 ABREVIATURAS 38 BIBLIOGRAFÍA 39 5 INTRODUCCIÓN Desde inales del siglo XIX, g acias a los a ances cien í icos que han enido luga has a día de hoy, la espe anza de ida ha aumen ado a un i mo conside ablemen e ápido, lo que ha impulsado la apa ición de una población no ablemen e en ejecida con una al a asa de mo bilidad. Po es a azón, las en e medades neu odegene a i as p esen an cada ez una mayo incidencia en dicha población y, como consecuencia, suponen un impac o sociosani a io y económico e dade amen e ele an e. La ciencia se es á ocupando de in es iga el o igen de es as pa ologías con el obje i o de e i a , e a da su apa ición y mejo a la calidad de ida de los pacien es, pe o aún queda una g an pa e e iológica que sigue siendo desconocida. El modelo mu ino ambalean e ( bl) u ilizado pa a la ealización de es e es udio p esen a un sínd ome complejo de a axia ca ac e izado po al e aciones en el con ol mo o como consecuencia de la degene ación y mue e de las células de Pu kinje en el ce ebelo (Bachille e al., 2020). Es e modelo nos pe mi i á es udia el papel de la mic oglía en la degene ación y mue e de las células de Pu kinje. Sis ema Ne ioso Cen al (SNC) y el mo imien o El ce ebelo es la po ción del encé alo ubicada en la pa e pos e io del c áneo, en e el ce eb o y el onco ence álico, enca gada p incipalmen e de la unción mo o a del o ganismo. En el co e his ológico ans e sal (Figu a 1), se pueden obse a dos capas bien di e enciadas que o man su cos a lo la go de oda la es uc u a, la sus ancia g is y blanca. La sus ancia g is es á cons i uida po la co eza, que es la capa más supe icial, y hacia el in e io de la misma se disponen la capa molecula , un es a o de células de Pu kinje y la capa g anula . Las células de Pu kinje se encuen an bo deando la capa g anula y p oyec an su á bol dend í ico hacia la capa molecula donde se colocalizan con o as células neu ogliales como las neu onas es elladas y en ces a. Su axón a a iesa la capa g anula has a alcanza la sus ancia blanca donde se mieliniza pa a ealiza la sinapsis con o as neu onas que componen los núcleos in ace ebelosos (T eu ing e al., 2017). Po o a pa e, la sus ancia blanca es á o mada undamen almen e po axones ecubie os de ainas de mielina, una es uc u a mul ilamina ica en lípidos que es gene ada po los oligodend oci os pa a acili a la ansmisión del impulso ne ioso, y que es la que con ie e el colo blanco a es a egión ce ebela (Sa aiyan e al., 2021). Dadas las simili udes en la his ología ce ebela en e a ones y humanos, se u ilizan modelos mu inos pa a es udia la isiopa ología humana de es a es uc u a ence álica. 6 A B Figu a 1. Co e his ológico del ce ebelo de a ón (A) y humano (B) (T eu ing e al., 2017). Capa molecula (Mo), es a o de células de Pu kinje (Pk), capa g anula (G ) y sus ancia blanca (WM). El ce ebelo o ma pa e del Sis ema Ne ioso Cen al (SNC) y unciona como un cen o de coo dinación enca gado de in eg a la in o mación que ob iene del Sis ema Ne ioso Pe i é ico (SNP) a pa i de los ne ios sensi i os sob e la posición del cue po y su mo imien o, y p opo ciona señales ne iosas a los ne ios mo o es con el obje i o de con ola la ma cha y el equilib io (Mashimo e al., 2009). Además, Dow y Mo uzzi, en 1958, plan ea on la hipó esis de que el ce ebelo no solo con ola el mo imien o como al, sino que con ibuye al ap endizaje mo o asocia i o que asegu a que los mo imien os sean p ecisos y co ec os, y pos e io men e Ma , en 1969, localizó es a unción p opiamen e en la co eza ce ebelosa (Ma , 1969). Los mo imien os olun a ios, po muy sencillos que sean, equie en de la in e acción coo dinada de múl iples es uc u as que o man pa e de la unión neu omuscula (UNM) ya que las conexiones que se es ablecen en e ellas son al amen e especializadas. La UNM se compone de una mo oneu ona (MN) en la zona p esináp ica, cuyo soma se encuen a en el as a en al de la médula espinal, una ib a muscula o placa mo o a e minal en la zona pos sináp ica y una célula de Schwann que ac úa como sopo e pa a las capas de mielina enca gadas de ansmi i el impulso ne ioso sal a o io a a és de los nódulos de Ran ie . Du an e la sinapsis, cuando un po encial de acción llega a la zona p esináp ica, se libe a ace ilcolina como neu o ansmiso a la hendidu a sináp ica, donde in e acciona con los ecep o es nico ínicos localizados en la zona pos sináp ica. Es o p o oca la en ada de ca iones y el inicio de una despola ización, con la consecuen e ape u a de canales de sodio ol aje-dependien es en la memb ana de la ib a muscula que desencadena el p oceso de con acción muscula (Bachille e al., 2020). Sis ema Ubiqui ina-P o easoma (UPS) Tan o el desa ollo como la homeos asis de es e so is icado mecanismo equie en de la coo dinación de un g an núme o de p o eínas que son codi icadas po dis in os genes que 7 con olan la his ogénesis, di e enciación y mue e celula den o del Sis ema Ne ioso. Pa a asegu a que las p o eínas implicadas uncionan co ec amen e debe man ene se la p o eos asis, lo que signi ica que debe habe un balance en e las p o eínas ecién o madas y las p o eínas en ejecidas o mal plegadas. Pa a log a es e equilib io es undamen al el p oceso de deg adación p o eica, lle ado a cabo p incipalmen e po las ías de au o agia/lisosoma y p o easoma (Pé ez-Villegas e al., 2022). La mayo ía de las en e medades neu odegene a i as cu san con una al e ación de la homeos asis p o eica, que pod ía se debido a un allo en el Sis ema Ubiqui ina-P o easoma (UPS) (Figu a 2). El mecanismo de ubiqui inación es á implicado en ambas ías de deg adación p o eica, en e o as muchas unciones. Un de ec o en el uncionamien o de és e conlle a la acumulación de p o eínas en ejecidas y mal plegadas y, po ende, una disminución en la calidad de las p o eínas que pa icipan en la ansmisión del impulso ne ioso. Po es e mo i o, el UPS esul a una diana de g an in e és pa a el es udio e in es igación de en e medades neu odegene a i as (Bachille e al., 2020). En el UPS es án in oluc ados es g upos de enzimas, enzimas ac i ado as de ubiqui ina (E1), enzimas conjugado as de ubiqui ina (E2) y enzimas ligasas de ubiqui ina (E3), que lle an a cabo una cascada de eacciones ca alí icas pa a ubiqui ina , e ique a y ansloca , espec i amen e, las p o eínas de ec uosas hacia el p o easoma pa a su pos e io deg adación y eno ación a p o eínas uncionales (Bachille e al., 2015, 2020). Figu a 2. Esquema del Sis ema Ubiqui ina-P o easoma (UPS) (Bachille e al., 2020). La enzima E1, en una eacción dependien e de ATP, ac i a a una molécula de ubiqui ina (Ub). Pos e io men e, la ubiqui ina ac i ada se conjuga con la enzima E2 pa a pode se ans e ida po la enzima E3 a la p o eína diana. Es e p oceso se epi e a ias eces has a consegui que la p o eína es é poliubiqui inada y pueda se econocida po el p o easoma pa a su deg adación en pép idos y aminoácidos. Finalmen e, las enzimas desubiqui inizan es (DUBs) son las enca gadas de desensambla la cadena de poliubiqui ina pa a que la ubiqui ina en su o ma monomé ica pueda se eciclada (Bachille e al., 2020). P o eínas HERC Las p o eínas HERC pe enecen a una de las es sub amilias de enzimas ligasas de ubiqui ina (E3) que ac úan en la e ce a e apa del p oceso de ubiqui inación econociendo la p o eína diana 8 y ca alizando la adición de las moléculas de ubiqui ina unidas a E2 a dicho sus a o. Exis en seis genes dis in os que codi ican p o eínas HERC en humanos, no obs an e, es e abajo se cen a en es udia uno de ellos, aquel que codi ica la p o eína HERC1 (Mashimo e al., 2009; Pé ez- Villegas e al., 2022). HERC1, al p incipio denominada p619 y más a de p532, ue la p ime a p o eína de la amilia en se iden i icada a a és de un c ibado que se ealizó pa a la búsqueda de secuencias oncogénicas humanas elacionadas con el cánce de mama (Ga cía-Gonzalo & Rosa, 2005). Se a a de una p o eína de g an amaño con casi 5000 esiduos de aminoácidos en una sola cadena polipep ídica, 4861 aminoácidos en Homo sapiens -Hs- y 4859 en Mus musculus -Mm-, y con un peso molecula supe io a 520 kDa (Pé ez-Villegas e al., 2022). Las seis p o eínas HERC ienen en común la p esencia de un dominio HECT (del inglés, Homologous o he E6AP Ca boxyl Te minus) y, como mínimo, un dominio RLD (del inglés, Regula o o Ch omosome Condensa ion 1 (RCC1) Like Domain) (Mashimo e al., 2009; Pé ez- Villegas e al., 2022). El p ime o de ellos iene una es uc u a bilobulada y se enca ga p opiamen e de ans e i Ub o p o eínas simila es a ella a p o eínas diana pa a que pueda ene luga el p oceso de deg adación p o eica (Mashimo e al., 2009). En un p incipio, se pensaba que e a especí ico pa a la deg adación de p53, no obs an e, es udios pos e io es han demos ado que la ac i idad ligasa de ubiqui ina no es á es ingida a condiciones pa ológicas en las que se exp esa p53 sino que ambién se desa olla en condiciones isiológicas du an e el p oceso de ubiqui inación de o as p o eínas diana (Ga cía-Gonzalo e al., 2005). Sin emba go, el segundo ipo de dominio es á cons i uido po sie e secciones de hojas β-plegadas, ac úa como ac o in e cambiado de nucleó idos de guanina (GEF, del inglés, Guanine nucleo ide Exchange Fac o ) y es á implicado en el in e cambio de nucleó idos de guanina en e p o eínas con si io de unión a GTP. Además, pa ece se más e sá il ya que p esen a la capacidad de in e acciona con di e sas p o eínas como cla ina, ARF y Rab, y con lípidos como 4,5- os a idilinosi ol que juegan un ele an e papel en el á ico de memb anas de las células (Pé ez-Villegas e al., 2022). La p o eína HERC1 (Figu a 3), además de un dominio HECT y dos dominios RLD, RLD1 y RLD2, p esen a o as ca ac e ís icas es uc u ales que la di e encia uncionalmen e de las o as cinco p o eínas HERC. Con iene un dominio SRPY (del inglés, spl A and RyR), un dominio BH3 (del inglés, Bcl-2 Homology Domain 3), sie e epe iciones de WD40 ca ac e ís icas de la subunidad β de las p o eínas G he e odimé icas, una c emalle a de leucina, secuencias icas en p olina que se unen a SH3 y a ias cadenas la e ales de ca ác e pola y ácido (Pé ez-Villegas e al., 2022). 15 Figu a 6. Es uc u a y o ganización de Gal3. Basada en (Yang e al., 2008). [C eada en BioRende .com] Gal3 es una galec ina quime a o mada po dos dominios de econocimien o de ca bohid a os, uno C- e minal y o o N- e minal, unidos po epe iciones de esiduos de glicina y p olina. Es capaz de dime iza se e e siblemen e a a és del CRD C- e minal y de polime iza se i e e siblemen e a a és del CRD N- e minal u ilizando ca bohid a os como ligandos (Boza-Se ano e al., 2019). Gal3 es codi icada po el gen LGALS3 y ac úa como un mediado in lama o io libe ado po algunas células ac i adas, como la mic oglía, en espues a a una a ección neu odegene a i a como, po ejemplo, el p oceso de lesión isquémica. Se encuen a dis ibuida po el núcleo, ci oplasma y las memb anas, pe o an e cie os es ímulos p oin lama o ios puede se libe ado al medio ex acelula (Boza-Se ano e al., 2014). En condiciones de neu oin lamación, la mic oglía ac i ada libe a Gal3 al medio ex acelula y és a ac úa como ligando de los ecep o es TREM2 (del inglés, T igge ing Recep o Exp essed on Myeloid Cells 2) (Boza-Se ano e al., 2019) y TLR4 (del inglés, Toll-Like Recep o 4) (Bu guillos e al., 2015) p esen es en la mic oglía ci cundan e, p o ocando así una mayo exp esión del eno ipo DAM en el SNC. Po an o, Gal3 es capaz de ac ua como inmunomodulado ampli icando la eacción p oin lama o ia dependien e de TLR4 y gene ando una ac i ación mic oglial comple a en una si uación de lesión neu onal (Bu guillos e al., 2015). Dado que la p o eína Gal3 es á muy elacionada con la adquisición del eno ipo DAM po pa e de la mic oglía, en el modelo expe imen al u ilizado pa a la elabo ación de es e abajo se ha plan eado como hipó esis que, eliminando el gen lgals3 pa a sup imi la exp esión de Gal3, se pod ía ob ene un e ec o de meno mue e neu onal, un esca e mo o en los a ones bl y una de ección del p oceso neu odegene a i o en el ce ebelo. 16 OBJETIVOS Es e es udio pa e de un modelo expe imen al o mado po a ones que p esen an la mu ación au osómica ecesi a Gly483Glu en el gen que codi ica la p o eína He c1, lo que p o oca una degene ación de las células de Pu kinje en el ce ebelo y los do a de su eno ipo bl que se mani ies a como un as o no a áxico. Análisis p elimina es ealizados en nues o g upo de in es igación ponen de mani ies o que la mic oglía localizada en el ce ebelo de es os a ones i a a eno ipo DAM p e iamen e al comienzo de la mue e de las células de Pu kinje, es deci , an es de que se alcancen los dos meses de edad. Además, se conoce que la mic oglía se ac i a aún más cuando aumen a la exp esión de Gal3, lo que pod ía es a p o ocando una mayo mue e neu onal en e las células de Pu kinje y un ag a amien o del p oceso neu odegene a i o. El p esen e abajo pe sigue como p incipal obje i o es udia la epe cusión que iene la mic oglía al adqui i eno ipo DAM en p esencia de Gal3 en el anscu so de la neu odegene ación de las células de Pu kinje en el ce ebelo de los a ones bl. En es e sen ido, se ha eliminado el gen lgals3 de los a ones bl pa a consegui a ones con eno ipo bl que no exp esen Gal3. Con el in de alcanza lo, plan eamos los siguien es obje i os especí icos: 1. Ca ac e ización del a ón bl a a és de la cuan i icación de las células de Pu kinje p esen e en la co eza ce ebelosa. 2. Análisis molecula , mo ológico y cuan i a i o, de la mic oglía p esen e en el a ón bl inculada a la mue e de las células de Pu kinje en el ce ebelo. 3. Análisis molecula , mo ológico y cuan i a i o, de las células de Pu kinje y la mic oglía p esen e en el a ón bl as la eliminación de la exp esión de la p o eína Gal3 po deleción del gen lgals3. 17 MATERIALES Y MÉTODOS Animales expe imen ales Los animales de expe imen ación empleados ue on a ones p opo cionados po el Cen o de Expe imen ación Animal Ósca Pin ado ubicado en el Cen o de In es igación, Tecnología e Inno ación III (CITIUS-III) Manuel Losada Villasan e, en Se illa, España. Allí pe manecie on en un ambien e a empe a u a cons an e de 22 ± 1ºC, con una humedad ela i a del 60%, un ciclo de luz-oscu idad de 12 ho as y con acceso a comida y agua ad libi um. A los dos meses de edad ue on asladados al labo a o io del g upo BIO-113 del Depa amen o de Bioquímica y Biología Molecula si uado en la Facul ad de Fa macia de la Uni e sidad de Se illa, España, donde ue on sac i icados. Los a ones con eno ipo bl se ob u ie on median e c uces ep oduc i os de pa ejas de a ones po ado es de la mu ación que codi ica pa a He c1. Al nace , odos los a ones bl p esen an el gen lgals3 y exp esan isiológicamen e Gal3 en la mic oglía ac i ada con eno ipo DAM. Pa a consegui la exp esión del eno ipo bl/Gal3KO (del inglés, Gal3 Knock-Ou ) se equie en a ones con deleción en el gen lgals3 y en los que se encuen a sup imida la libe ación de Gal3 en la mic oglía DAM. En es e sen ido, se c uza on a ones he e ocigó icos pa a He c1 con a ones homocigo os pa a Gal3KO. Todos los a ones que o man la descendencia ue on geno ipados median e PCR a a és del Cen o de In es igación, Tecnología e Inno ación II (CITIUS-II) Celes ino Mu is, en Se illa, España, pa a pode se o ganizados. Pa a la ealización de es e es udio, los a ones se clasi ica on en es g upos expe imen ales en unción de su geno ipo (Tabla 1). El p ime o de ellos ue denominado WT (del inglés, Wild-Type) y en él se incluían a ones con ondo gené ico C57BL/6, que e an WT pa a la mu ación en el gen que codi ica He c1 bl y pa a Gal3KO o bien WT pa a He c1 bl y la exp esión de Gal3KO en he e ocigosis. El segundo g upo expe imen al, llamado bl, comp endía a ones que exp esaban He c1 bl en homocigosis y e an WT o he e ocigó icos pa a Gal3KO. Po úl imo, el e ce g upo, bl/Gal3KO, lo componían a ones que exp esaban an o He c1 bl como Gal3KO en homocigosis. Tabla 1. G upos expe imen ales según los geno ipos del animal pa a He c1 bl y Gal3KO. El código de colo es u ilizado en adelan e es ama illo pa a WT, e de pa a bl y mo ado pa a bl/Gal3KO. G upo expe imen al He c1 bl Gal3KO WT WT WT WT he e ocigosis bl homocigosis WT homocigosis he e ocigosis bl/Gal3KO homocigosis homocigosis 18 Del p ime g upo expe imen al, o g upo con ol, se selecciona on seis a ones, de los cuales dos e an macho y cua o e an hemb as. Po o a pa e, de los dos g upos expe imen ales es an es, se selecciona on cinco a ones, del segundo se escogie on al aza es machos y dos hemb as mien as que del e ce o se eligie on ambién alea o iamen e dos machos y es hemb as, haciendo un o al de 16 a ones, con el in de consegui una dis ibución homogénea en e sexos y e i a que sea un ac o que suponga una g an in luencia en los esul ados del es udio. Todos los ensayos se lle a on a cabo de acue do con el documen o “Guidelines o he Eu opean Union Di ec i e” (2010/63/EU) y la legislación española igen e RD 53/2013 (BOE 34/11370-421, 2013) sob e el uso de animales de expe imen ación. Los p o ocolos ue on ap obados po el Comi é É ico de la Uni e sidad de Se illa. Ob ención y p epa ación de mues as Tan o los a ones pe enecien es a los g upos expe imen ales bl y bl/Gal3KO como sus compañe os de camada isogénicos que se incluyen en el g upo WT se sac i ica on a los dos meses de edad, pa a asegu a que el eno ipo mic oglial es u ie a comple amen e alcanzado y que se hubie a p oducido degene ación en las células de Pu kinje de la co eza ce ebelosa. En p ime luga , los a ones se anes esia on con ke amina Ke amido ® de Rich e Pha ma® (Re . 580395.1) y mede omidina Sedin® de Labo a o ios Calie S.A. (Re . 572768) po ía in ape i oneal, y se comp obó que el plano anes ésico e a adecuado median e la pé dida de la espues a e leja podal en las ex emidades in e io es. Pos e io men e, se lle ó a cabo el p ocedimien o de pe usión in aca diaca u ilizando 40 ml de sue o salino isiológico p epa ado a una concen ación de NaCl del 0,9% y en iado con hielo p e iamen e. Pasados unos minu os, los animales se decapi a on pa a p ocede a la ex acción del ce eb o y ce ebelo. Sob e una placa de hielo, se diseccionó y sepa ó el ce eb o del ce ebelo. Ambas pa es del hemis e io izquie do se congela on a una empe a u a de -80ºC pa a pode se u ilizadas en pos e io es p uebas de Biología Molecula y las del hemis e io de echo se ija on median e inme sión en una solución de pa a o maldehído (PFA) al 4% en solución salina amponada con os a o 1x (PBS, del inglés Phospha e Bu e ed Saline) Q Pa h® de VWR Chemicals® (Re . 11699408) du an e 24 ho as a 4ºC. Pos e io men e, el ejido se c iop o egió en una solución de saca osa de Labbox® (Re . SUCR- 00A-5K0) al 30% en PBS 1x con azida sódica de Sigma-Ald ich® (Re . 26628-22-8) pa a e i a con aminación ex e na, y se conse ó en cáma a ía a 4ºC has a que se hundió en el ubo cónico de 15 ml. Una ez en el ondo, se p ocedió a su congelación u ilizando hielo seco y se almacenó en congelado a -20ºC. 19 Del hemis e io de echo de cada ce ebelo se ob u ie on secciones co onales a un g oso de 20 µm y a una empe a u a de -20ºC, haciendo uso del C ios a o Leica® CM 1850 UV. Se coloca on cua o secciones consecu i as, siguiendo siemp e el mismo o den de posición (Figu a 7), en po aobje os p e iamen e gela inizados. Una ez ob enidas odas las mues as en los po aobje os, se gua da on en cajas den o de un a cón a -20ºC pa a su pos e io p ocesado en los espec i os análisis his ológicos. Figu a 7. O den de posición de los co es his ológicos del hemis e io de echo del ce ebelo en el po aobje os. Pa a lle a a cabo la gela inización de los po aobje os, se calen ó agua des ilada en una es u a y, cuando alcanzó una empe a u a de 52ºC, se añadió gela ina ipo A de Sigma-Ald ich® (Re . G2500) en pequeñas po ciones y en con inua agi ación. Una ez disuel a, se añadió la misma can idad de agua des ilada calen ada p e iamen e y sul a o de c omo po ásico dodecahid a ado de Pan eac® (Re . 141284). Cuando la mezcla quedó anspa en e, se apa ó de agi ación y se ese ó a empe a u a ambien e has a que es u o emplada. Luego, se il ó y se e ió en cube as pa a pode in oduci las ejillas de inción con los po aobje os sin gela iniza du an e 1 minu o. Finalmen e, las ejillas de inción con los po aobje os ya gela inizados se seca on en la es u a a 45ºC du an e 24 ho as. Inmunohis oquímica (IHC) Pa a la ealización de la écnica de inmunohis oquímica (IHC), se selecciona on es po aobje os po cada a ón a es al u as del ce ebelo dis in as. Dado que se sac i ica on 16 a ones, se ob u ie on un o al de 48 po aobje os. El p ime po aobje os ue escogido de la zona pos e io del ce ebelo, en e los p ime os quince po aobje os ob enidos; el segundo, de la zona media, que co esponde a los po aobje os que se encon aban en e la decimoquin a y igésima posición; y el e ce o, de la zona an e io , en e los po aobje os ob enidos más allá de la posición ein ea a. De es a o ma, se ga an iza que las es uc u as isula es escogidas sean equi alen es en odas las mues as. Se ealiza on seis epe iciones de la écnica siguiendo el mismo p o ocolo, una pa a cada conjun o de po aobje os que pe enecían a la misma al u a del ce ebelo. En las es p ime as IHC se es udió la degene ación de las células de Pu kinje en la co eza ce ebelosa u ilizando un an icue po monoclonal de a ón que se une a la calbindina (Tabla 2). Las o as es IHC es an es se ealiza on con el in de obse a y cuan i ica la mic oglía p esen e en la co eza y sus ancia blanca del ce ebelo, pa a lo que se usó un an icue po policlonal de conejo que se une a Iba1 (del 20 inglés, Ionized calcium-Binding Adap o molecule 1), un ma cado que se exp esa en la supe icie de es as células gliales (Tabla 2). Los po aobje os p e iamen e seleccionados se coloca on sob e una placa cale ac o a de Axel Johnson Lab Sys em® a unos 40ºC ap oximadamen e du an e 10 minu os. Después, u ilizando ImmEdge® Pen de Vec o Labo a o ies® (Re . H-4000), se aza on ci cun e encias al ededo de cada co e con el obje i o de c ea una capa hid o óbica pa a delimi a la zona donde quedan los eac i os sob e el ejido. Los po aobje os se coloca on en una cube a donde se la a on con PBS 1x (3 x 5 minu os) pa a el acondicionamien o de los co es his ológicos. A con inuación, se incuba on en una disolución de pe óxido de hid ógeno al 1% / en me anol du an e 15 minu os a empe a u a ambien e, y se la a on de nue o con PBS 1x (3 x 5 minu os). Una ez p epa ado el ejido, se eliminó el líquido sob an e sob e los po aobje os y se coloca on sob e una cáma a húmeda pa a p osegui con el p o ocolo de IHC. En p ime luga , se bloquea on las uniones inespecí icas del an icue po p ima io incubando las secciones en una solución de albúmina bo ina sé ica (BSA, del inglés Bo ine Se um Albumin) de Sigma-Ald ich® (Re . A7906) al 5% p/ en PBS-T i ón al 2,5% du an e 1 ho a a empe a u a ambien e. La solución de bloqueo u iliza PBS con T i ón pa a pode pe meabiliza las memb anas plasmá icas de las células del ejido y pe mi i que los an icue pos deposi ados pos e io men e sob e los co es puedan pene a al in e io de las mismas y, de es a o ma, ob ene un buen ma caje pa a la pos e io isualización. Seguidamen e, se añadió el an icue po p ima io (Tabla 2) diluido en una solución de BSA al 2,5% p/ en PBS-T i ón al 2,5% du an e oda la noche a 4ºC. Al día siguien e, las secciones se incuba on du an e 30 minu os a empe a u a ambien e an es de ealiza los la ados con PBS 1x (3 x 5 minu os) en la cube a. Una ez e minados, los po aobje os se ol ie on a coloca en la cáma a húmeda pa a incuba las secciones con el an icue po secunda io (Tabla 2) en una solución de BSA al 1% p/ en PBS-T i ón al 2,5% du an e 2 ho as a empe a u a ambien e. Luego, se la a on de nue o con PBS 1x (3 x 5 minu os) en la cube a. Tabla 2. An icue pos u ilizados en la écnica de IHC. Ac p ima io O igen Labo a o io Dilución Ac secunda io O igen Labo a o io Dilución An i- Calbindin Mouse Sigma-Ald ich® (Re . ABN2192) 1:1000 An i-Mouse IgG (H+L) Bio inyla ed Goa Vec o Labs.® (Re . BA-9200) 1:200 An i- Iba1 Rabbi FUJIFILM Wako® (Re . 019-19741) 1:1000 An i-Rabbi IgG (H+L) Bio inyla ed Goa Vec o Labs.® (Re . BA-1000) 1:200 21 Pos e io men e, se incuba on las mues as con un ki de inción ABC VECTASTAIN® Eli e® de Vec o Labo a o ies® (Re . PX-6100) du an e 1 ho a. Es e ki incluye los eac i os pa a lle a a cabo la écnica del complejo a idina-bio ina, así como la enzima pe oxidasa, y de es a o ma pode ampli ica la in ensidad de inción y mejo a la sensibilidad en la pos e io de ección de las di e en es es uc u as en el ejido. Después, los co es se la a on de nue o con PBS 1x (3 x 5 minu os) en la cube a. T as los la ados, se u ilizó o o ki pa a p epa a una solución que incluía 3,3’-diaminobencidina (DAB), enzima pe oxidasa y clo u o de níquel de Vec o Labo a o ies® (Re . SK-4100). Se dejó ac ua de 2 a 4 minu os sob e las secciones pa a lle a a cabo una eacción en el que el p oduc o p ecipi ado es de colo ma ón y así eñi el ejido. Jus o a con inuación, las mues as se la a on con PBS 1x (3 x 5 minu os) en la cube a y los esiduos de los eac i os se desecha on en los depósi os des inados a ello en el a ma io de segu idad del labo a o io. Finalmen e, los co es se deshid a a on con disoluciones de e anol a concen aciones c ecien es, se acla a on con xileno y se mon a on con la esina ac ílica DPX de Sigma-Ald ich® (Re . 06522) y un cub eobje os con p ecaución de no o ma bu bujas que pudiesen de e io a el ejido. Adquisición y análisis de imágenes • IHC con an icue po p ima io An i-Calbindin Una ez comple ado el p o ocolo pa a las es IHC que u ilizan An i-Calbindin de Sigma-Ald ich® (Re . ABN2192) como an icue po p ima io (Tabla 2), se omó una imagen comple a po cada sección colocada en los po aobje os haciendo uso de la Lupa Zeiss® AxioZoom V16 a campo cla o con el obje i o de 100x, jun o al p og ama in o má ico ZEN Blue®, ubicado en el Cen o de In es igación, Tecnología e Inno ación I (CITIUS-I), en Se illa, España. Pos e io men e, u ilizando el p og ama o line FijiImageJ So wa e®, se p ocedió al análisis de las mismas. En p ime luga , pa a es ima la densidad de células de Pu kinje se cuan i icó el núme o de somas p esen es en una de e minada á ea de co eza medida en mm2. Pa a ello, de la imagen o iginal (Figu a 8A) se selecciona on es po ciones de co eza alea o ias po cada co e his ológico (Figu a 8C), ob eniéndose 576 en o al, y con la he amien a Cell Coun e se con abiliza on odos los somas isibles en ella (Figu a 8D). Se es ablecie on como c i e ios que no e a necesa io que las dend i as es u ie an apa en emen e comple as, sino que e a su icien e con la isualización del núcleo pa a con a una célula, y que las células no oca an los bo des de la po ción delimi ada. Po o a pa e, en esas mismas po ciones de co eza ambién se es imó la densidad de células de Pu kinje median e la cuan i icación del ma caje de Calbindina u ilizando un mismo 22 umb al o Th eshold (Figu a 8E), lo que se aduce en el á ea que ocupan las células de Pu kinje con espec o a una de e minada á ea de co eza medida en mm2. Es os úl imos alo es se exp esa on en o ma de po cen aje. Luego, se cons uye on g á icas donde se pod ía conoce la deg adación de las células de Pu kinje en la co eza ce ebelosa de cada g upo expe imen al. A B C D E F Figu a 8. Me odología pa a lle a a cabo la es imación de la densidad de células de Pu kinje en la co eza ce ebelosa u ilizando el p og ama o line FijiImageJ So wa e®. (A) Imagen o iginal. (B) Imagen en escala de g ises a 8 bi s. (C) Po ción de co eza seleccionada. (D) Cuan i icación de somas. (E) Aplicación del umb al o Th eshold. (F) De e minación del á ea gene ada. • IHC con an icue po p ima io An i-Iba1 Pos e io men e a las IHC con an icue po p ima io An i-Calbindin, se ealiza on es IHC con an icue po p ima io An i-Iba1 de FUJIFILM Wako® (Re . 019-19741) como an icue po p ima io (Tabla 2). Las secciones se obse a on u ilizando el Mic oscopio óp ico Olympus® BX61 a campo cla o con el obje i o de 20x y el p og ama in o má ico cellSens®, ubicado en el Cen o de In es igación, Tecnología e Inno ación I (CITIUS-I), en Se illa, España. Se oma on es imágenes de la co eza ce ebelosa, ob eniéndose 144 en o al, pa a cuan i ica la mic oglía en cada una de ellas u ilizando el p og ama o line FijiImageJ So wa e®. Po o a pa e, las mismas secciones p esen es en los po aobje os se obse a on u ilizando el Mic oscopio óp ico Leica® a campo cla o con el obje i o de 20x, ubicado en el labo a o io BIO-113 del Depa amen o de Bioquímica y Biología Molecula si uado en la Facul ad de Fa macia de la Uni e sidad de Se illa, España. Allí se isualiza on es campos de sus ancia blanca ce ebelosa, 144 en o al, en los que se cuan i ica on los somas de las células mic ogliales. Se u ie on en cuen a las células que se encon aban en el in e io y aquellas que es aban en con ac o con los má genes supe io y de echo de la celda, po an o, queda on excluidas aquellas células en los má genes in e io e 23 izquie do de la celda (Figu a 9). Pos e io men e, mul iplicando el núme o de somas po el ac o numé ico 5,9, se ob u o el núme o de células mic ogliales po á ea medida en mm2. Así, se cons uye on g á icas donde se pod ía conoce la can idad de mic oglía p esen e en la co eza y la sus ancia blanca ce ebelosas de cada g upo expe imen al. Figu a 9. Imagen de la celda del Mic oscopio óp ico Olympus a campo cla o u ilizada pa a cuan i ica las células mic ogliales p esen es en la sus ancia blanca ce ebelosa. Se cuan i ica on las que se encon aban en el in e io y aquellas que es aban en con ac o con los má genes supe io y de echo de la celda, po an o, queda on excluidas aquellas células en los má genes in e io e izquie do de la celda. Análisis es adís ico El análisis es adís ico de los da os y la pos e io con ección de las g á icas se ha ealizado u ilizando el p og ama G aphPad P ism So wa e® e sión 8.4.2. En p ime luga , se ob u ie on los alo es medios con sus co espondien es des iaciones es ánda de cada uno de los cua o pa áme os cuan i icados pa a cada a ón y al u a del ce ebelo, po lo que se de e minó una N de 16. Los da os seguían una dis ibución no mal en la mayo ía de los casos al se analizados median e los es s de Shapi o-Wilk y Kolmogo o -Smi no , po lo que se p ocedió a u iliza es pa amé icos. En odos los casos, el ni el de signi icación se es ableció en p < 0,05. A con inuación, se lle ó a cabo la p ueba -S uden con el in de obse a si exis en di e encias signi ica i as en e las zonas an e io , media y pos e io del ce ebelo den o de un mismo g upo expe imen al pa a cada pa áme o cuan i icado. En aquellos casos donde se obse a on di e encias, se aplicó un es más es ic i o, ANOVA de un ac o , pa a comp oba que ealmen e exis e una dis ibución he e ogénea de las células de Pu kinje o mic ogliales a lo la go del eje an e opos e io del ce ebelo del a ón. Pa a conoce si los g upos expe imen ales son signi ica i amen e dis in os con espec o a uno de los pa áme os, se u ilizó el es ANOVA de un ac o seguido del es pos hoc de Tukey pa a compa aciones múl iples y los esul ados se ep esen a on en diag amas de iolín. Finalmen e, se ep esen a on en g á icos de dispe sión pa ejas de da os de dos a iables dis in as con el in de ob ene ec as de eg esión y coe icien es de co elación que in o men de qué o ma pod ía in lui uno sob e o o. Además, se es udió si exis en di e encias signi ica i as en e las pendien es pa a los dis in os g upos expe imen ales. 24 RESULTADOS Y DISCUSIÓN • Dis ibución de células de Pu kinje y mic oglía en el eje an e opos e io del ce ebelo En p ime luga , se comp obó que la dis ibución de las células de Pu kinje y de la mic oglía e a homogénea a lo la go de odo el eje an e opos e io del ce ebelo del a ón. Pa a ello, se ealizó la p ueba -S uden y compa ando po pa ejas los da os ob enidos pa a cada al u a del ce ebelo, den o de un mismo g upo expe imen al y pa a una a iable conc e a. Pos e io men e, se aplicó el es ANOVA y el es pos hoc de Tukey pa a compa aciones múl iples, más es ic i os, pa a con i ma que e ec i amen e, en algunos g upos expe imen ales exis en di e encias signi ica i as en e las di e en es zonas del ce ebelo pa a un pa áme o en conc e o. Tan o en la can idad de células de Pu kinje (Figu a 10A, E y I) como en el á ea que ocupan las mismas den o de la co eza ce ebelosa e lejada a a és de á ea que ocupa el ma caje del an icue po An i-Calbindin (Figu a 10B, F y J) no se obse an di e encias signi ica i as en e las es zonas del ce ebelo pa a cada uno de los es g upos expe imen ales. De la misma o ma, ampoco exis en di e encias signi ica i as en la can idad de mic oglía p esen e en la co eza ce ebelosa (Figu a 10C, G y K) a lo la go del eje an e opos e io en los dis in os g upos expe imen ales. Sin emba go, el análisis es adís ico mues a que la can idad de mic oglía en la sus ancia blanca (Figu a 10D, H y L) es signi ica i amen e in e io en el e cio pos e io del ce ebelo de los a ones WT y bl, en compa ación con los e cios an e io y medio, es deci , el núme o de células mic ogliales dec ece a medida que se a anza en el eje an e opos e io en es os dos casos. En los a ones WT y bl se p oduce la disminución en la mic oglía de la sus ancia blanca en la zona pos e io del ce ebelo de mane a simila , al con a io de los a ones bl/Gal3KO en los que no iene luga , sino que se man iene en unos alo es cons an es a lo la go de odo el ce ebelo. Es o pod ía es a elacionado con el papel que juega Gal3 en la o mación de las ainas de mielina de los axones que con o man la sus ancia blanca. Va ios au o es desc iben que Gal3 in e iene en la madu ación y di e enciación de oligodend oci os esponsables del p oceso de mielinización ya que p omue e la ac i ación de AKT y, po an o, el anscu so de la ía PI3K/AKT/mTOR pa a el c ecimien o y p oli e ación celula (Thomas & Pasquini, 2018). En a ones WT y, p incipalmen e en a ones bl que p esen an una sob eexp esión de He c1 bl, pod ía es a p e aleciendo el e ec o inhibi o io de es a p o eína sob e la u a en e al de Gal3, disminuyendo el c ecimien o y p oli e ación celula así como dando luga a una mielina con una meno in eg idad y compac ación. Se ía in e esan e ealiza un es udio en el que se incluye an a ones con la condición WT/Gal3KO pa a pode obse a si es e e ec o ocu e especí icamen e al sup imi la exp esión de Gal3. 31 o Sus ancia blanca ce ebelosa Po o o lado, se ealizó el mismo p ocedimien o pa a analiza la can idad de células mic ogliales p esen es en la sus ancia blanca ce ebelosa. Los esul ados e lejan que la población mic oglial en la sus ancia blanca ce ebelosa de los a ones WT (89,3 ± 3,9) es signi ica i amen e meno a la de a ones bl (99,7 ± 5,0) y bl/Gal3KO (101,5 ± 5,2), al igual que ocu e en la co eza ce ebelosa. Sin emba go, en es e caso, el núme o de células mic ogliales es solo un 11,7% supe io en los a ones bl y un 13,7% en los a ones bl/Gal3KO con espec o a los a ones WT, ampoco exis iendo di e encias signi ica i as en e los g upos expe imen ales (Figu a 13D). Es e aumen o signi ica i o, aunque en meno medida que en la co eza ce ebelosa, en el núme o de células mic ogliales en la sus ancia blanca del ce ebelo de los a ones bl y bl/Gal3KO con espec o a los WT pod ía es a elacionado con de ec os en el p oceso de mielinización a causa de la sob eexp esión de la p o eína He c1 bl. Como se ha comen ado an e io men e, el co ec o uncionamien o de dicha p o eína es necesa io pa a una mielinización axonal adecuada. Sin emba go, cuando se encuen a mu ada, es abiliza a AKT os o ilada y p o oca allos en la ía de señalización PI3K/AKT/mTOR que desencadenan de ec os en la mielinización y, en consecuencia, en la conducción del impulso ne ioso (Bachille e al., 2018 [B]). Po o a pa e, algunos au o es sugie en que el ecep o TREM2 y la mic oglía DAM es án implicados en la mediación de la espues a inmuni a ia necesa ia pa a me aboliza los es os de mielina (Sa aiyan e al., 2021). Sin emba go, al no obse a di e encias en e los g upos bl y bl/Gal3KO, es posible que es e mecanismo no se encuen e implicado en nues o modelo mu ino en el que se bloquea lgals3, ya que la ausencia de exp esión de Gal3 pa ece no a ec a al núme o de mic oglía en la sus ancia blanca. En es udios pos e io es donde se midan los ni eles de ma cado es especí icos comen ados an e io men e pe mi i án p o undiza en el papel de Gal3 en la mielinización. En esumen de lo obse ado con espec o a la mic oglía, podemos conclui que hay indicios cla os de que la mic oglía que se encuen a en la co eza es echamen e asociada a las células de Pu kinje adquie e un eno ipo DAM más eac i o inmunológicamen e que en condiciones de degene ación mielínica en los axones neu onales p esen es en la sus ancia blanca. Del mismo modo, al como a anzamos an e io men e, en e los a ones bl (99,7 ± 5,0) y bl/Gal3KO (101,5 ± 5,2) la can idad de mic oglía p esen e en la sus ancia blanca ce ebelosa aumen a en un 2% únicamen e con espec o al con ol (Figu a 13D). Dado que, de nue o, no exis e una di e encia signi ica i a en e los dos g upos expe imen ales, se ea i ma que la sup esión de la exp esión de Gal3 no conlle a un cambio en la p oli e ación mic oglial que pod ía es a asociado a p ocesos neu oin lama o ios en los a ones con dos meses de edad. 32 A C B D Figu a 13. Es udio del ma caje especí ico de mic oglía en el ce ebelo de a ones de 2 meses. (A) Imagen de mic oscopía óp ica a campo cla o con obje i o 20x de co eza en el ce ebelo de a ones WT, bl y bl/Gal3KO. La mic oglía se ha ma cado con un an icue po An i-Iba1. Ba a de escala: 200 µm. (B) Núme o de mic oglía en el á ea medida (mm2) en la co eza del ce ebelo de a ones WT, bl y bl/Gal3KO. (C) Imagen de mic oscopía óp ica a campo cla o con obje i o 20x de sus ancia blanca en el ce ebelo de a ones WT, bl y bl/Gal3KO. La mic oglía se ha ma cado con un an icue po An i-Iba1. Ba a de escala: 200 µm. (D) Núme o de mic oglía en el á ea medida (mm2) en la sus ancia blanca del ce ebelo de a ones WT, bl y bl/Gal3KO. Los esul ados se ep esen an en diag amas de iolín que e lejan la dispe sión de los da os con espec o a la media con una N=16. La signi icación es adís ica se calculó con el es ANOVA de un ac o seguido del es pos hoc de Tukey pa a compa aciones múl iples. Se es ablece * en p<0,05, ** en p<0,01, *** en p<0,001 y **** en p<0,0001. WT WT bl bl bl/Gal3KO / bl/Gal3KO / 33 • Va iación de la can idad de mic oglía en co eza con espec o al núme o de células de Pu kinje en el á ea medida (mm2) y a la densidad de células de Pu kinje (%) Se han ep esen ado en dos diag amas de dispe sión las pa ejas de da os y sus co espondien es ec as de eg esión con el obje o de conoce de qué o ma a ía la can idad de mic oglía en la co eza con espec o al núme o de células de Pu kinje po á ea (Figu a 14A) y a la densidad que ocupan en cada g upo expe imen al (Figu a 14B). A pa i de los mismos, se calcula on las pendien es de las ec as y los coe icien es de co elación, y se analiza on es adís icamen e. Ambos diag amas e lejan cómo el núme o de células de Pu kinje po á ea y la densidad que ocupan en la sus ancia blanca del ce ebelo es mayo en a ones WT que en a ones bl/Gal3KO y bl (Figu a 14). Es o signi ica que, de nue o, aunque en el ce ebelo de los a ones bl exis e una disminución en el núme o de células de Pu kinje, la sup esión de la exp esión de Gal3 implica un esca e en la población de dichas células en los a ones del g upo expe imen al bl/Gal3KO. Según el análisis es adís ico, el alo pa a la pendien e de la ec a pa a los a ones bl (7,0270; R2=0,9672 (A) 14,8100; R2=0,9728 (B)) y bl/Gal3KO (6,5550; R2=0,9908 (A) 6,9230; R2=0,9547 (B)) es signi ica i amen e mayo que en los a ones WT (0,7417; R2=0,9881 (A) 2,0800; R2=0,9003 (B)). Po an o, pa a un mismo núme o de células de Pu kinje po á ea o densidad de las mismas en el ce ebelo, exis e una mayo can idad de mic oglía en la co eza los a ones bl y bl/Gal3KO que en a ones WT, lo que quie e deci que la espues a mic oglial es á más p esen e en condiciones pa ológicas que en el g upo con ol, p obablemen e po la degene ación de las células de Pu kinje en ellas. Aunque la pendien e de la ec a pa a los a ones bl es mayo que pa a los a ones bl/Gal3KO en ambos casos, en el diag ama donde se ep esen a la densidad de células de Pu kinje en el eje de abscisas (Figu a 14B), la di e encia en e las pendien es pa a los g upos bl y bl/Gal3KO es más no able que en el que se ep esen a la can idad de células de Pu kinje po á ea (Figu a 14A). Es o signi ica que pod ía exis i una meno ac i ación de las células de la mic oglía al habe un esca e de la población de las células de Pu kinje en los a ones bl/Gal3KO. No obs an e, eniendo en cuen a los esul ados desc i os an e io men e, es a a iación en e las pendien es pod ía debe se al aumen o de la ami icación de las células de Pu kinje en los a ones bl/Gal3KO, que hace que la densidad de las mismas en la co eza ce ebelosa sea mayo y, po an o, la p opo ción con espec o a la can idad de mic oglía p esen e en es a zona disminuya. 34 A 0 50 100 0 50 100 150 200 250 Células de Pu kinje / mm2 Mic oglía / mm2 CORTEZA B 0 50 100 0 50 100 150 200 250 Densidad Células de Pu kinje (%) Mic oglía / mm2 CORTEZA WT bl bl/Gal3KO Figu a 14. Va iación de la can idad de mic oglía en co eza con espec o las células de Pu kinje en el ce ebelo de a ones de 2 meses pe enecien es a los g upos expe imen ales WT, bl y bl/Gal3KO. (A) Va iación de la can idad de mic oglía en co eza con espec o al núme o de células de Pu kinje en el á ea medida (mm2). Pa a a ones WT la pendien e es 0,7417 y R2=0,9881, pa a a ones bl la pendien e es 7,0270 y R2=0,9672 y pa a a ones bl/Gal3KO la pendien e es 6,5500 y R2=0,9908. Las es pendien es son signi ica i amen e di e en es de ce o (p<0,0001, ****). (B) Va iación de la can idad de mic oglía en co eza con espec o a la densidad de células de Pu kinje (%). Pa a a ones WT la pendien e es 2,0800 y R2=0,9903, pa a a ones bl la pendien e es 14,8100 y R2=0,9728 y pa a a ones bl/Gal3KO la pendien e es 6,9230 y R2=0,9547. Las es pendien es son signi ica i amen e di e en es de ce o (p<0,0001, ****). La signi icación es adís ica se calculó con un es que de e mina si las pendien es y las in e secciones en e ec as son signi ica i amen e dis in as. Se es ablece * en p<0,05, ** en p<0,01, *** en p<0,001 y **** en p<0,0001. • Va iación de la can idad de mic oglía en sus ancia blanca con espec o al núme o de células de Pu kinje en el á ea medida (mm2) y a la densidad de células de Pu kinje (%) Al igual que en el caso an e io , se han cons uido dos diag amas de dispe sión con los da os de las dos a iables y se han dibujado las ec as de eg esión con el in de sabe cómo in luye la a iación en el núme o de células de Pu kinje po á ea (Figu a 15A) y la densidad que ocupan (Figu a 15B) en la can idad de mic oglía p esen e en la sus ancia blanca po cada g upo expe imen al. A pa i de ellos, se ob u ie on las pendien es de las ec as y sus coe icien es de co elación, y después se analiza on es adís icamen e. En ambos casos se puede e como el núme o de células de Pu kinje po á ea y la densidad que ocupan en la sus ancia blanca del ce ebelo es mayo en a ones WT que en a ones bl/Gal3KO y bl (Figu a 15). Es o con i ma que exis e un esca e en la población de las células de Pu kinje cuando se sup ime la exp esión de Gal3 en los a ones bl/Gal3KO. Una ez ealizado el análisis es adís ico, el alo pa a la pendien e de la ec a pa a los a ones bl (4,3450; R2=0,9575 (A) 9,1670; R2=0,9650 (B)) y bl/Gal3KO (3,562; R2=0,9734 (A) 4,1200; R2=0,9723 (B)) es signi ica i amen e mayo que en los a ones WT (0,8161; R2=0,9958 (A) 2,2870; R2=0,9970 (B)). Po ende, pa a un mismo núme o de células de Pu kinje po á ea o densidad ocupada po és as en el ce ebelo, hay más células mic ogliales en la sus ancia blanca ce ebelosa de los a ones bl y bl/Gal3KO que en a ones WT, lo cual signi ica que la mic oglía es más 35 abundan e en los g upos expe imen ales que incluyen eno ipo bl donde hay una disminución en la población de células de Pu kinje y una espues a neu oin lama o ia asociada a ella. Igualmen e, la pendien e de la ec a es más p onunciada pa a los a ones bl que pa a los a ones bl/Gal3KO en ambos casos. No obs an e, en el diag ama donde se ep esen a la densidad de células de Pu kinje en el eje de abscisas (Figu a 15B), la di e encia en e las pendien es pa a los g upos bl y bl/Gal3KO es más no able que en el que se ep esen a la can idad de células de Pu kinje po á ea (Figu a 15A). Al igual que en la co eza ce ebelosa, pa ece que la ac i ación mic oglial es meno en los a ones bl/Gal3KO que en los bl a causa del esca e de la población de las células de Pu kinje, aunque se debe ene en cuen a lo indicado an e io men e. A 0 50 100 0 50 100 150 Células de Pu kinje / mm2 Mic oglía / mm2 SUSTANCIA BLANCA B 0 50 100 0 50 100 150 Densidad Células de Pu kinje (%) Mic oglía / mm2 SUSTANCIA BLANCA WT bl bl/Gal3KO Figu a 15. Va iación de la can idad de mic oglía en sus ancia blanca con espec o las células de Pu kinje en el ce ebelo de a ones de 2 meses pe enecien es a los g upos expe imen ales WT, bl y bl/Gal3KO. (A) Va iación de la can idad de mic oglía en sus ancia blanca con espec o al núme o de células de Pu kinje en el á ea medida (mm2). Pa a a ones WT la pendien e es 0,8161 y R2=0,9958, pa a a ones bl la pendien e es 4,3450 y R2=0,9575 y pa a a ones bl/Gal3KO la pendien e es 3,5620 y R2=0,9734. Las es pendien es son signi ica i amen e di e en es de ce o (p<0,0001, ****). (B) Va iación de la can idad de mic oglía en sus ancia blanca con espec o a la densidad de células de Pu kinje (%). Pa a a ones WT la pendien e es 2,2870 y R2=0,9970, pa a a ones bl la pendien e es 9,1670 y R2=0,9650 y pa a a ones bl/Gal3KO la pendien e es 4,1200 y R2=0,9723. Las es pendien es son signi ica i amen e di e en es de ce o (p<0,0001, ****). La signi icación es adís ica se calculó con un es que de e mina si las pendien es y las in e secciones en e ec as son signi ica i amen e dis in as. Se es ablece * en p<0,05, ** en p<0,01, *** en p<0,001 y **** en p<0,0001. • Va iación de la can idad de mic oglía en sus ancia blanca con espec o a la can idad de mic oglía en co eza po á ea medida (mm2) Po úl imo, se ha cons uido un diag ama en el que se ep esen a cómo a ía la can idad de mic oglía p esen e en la sus ancia blanca con espec o a la exis en e en la co eza ce ebelosa (Figu a 16). Pa a ello, de nue o se han ep esen ado las pa ejas de da os como pun os y se han dibujado las ec as de eg esión, las cuales lle an asociadas una pendien e y un coe icien e de co elación, pa áme os que se u iliza án pos e io men e pa a el análisis es adís ico. Pa a los es g upos expe imen ales se cumple que el aumen o en la can idad de mic oglía localizada en la co eza ce ebelosa es di ec amen e p opo cional a la can idad de mic oglía en la 36 sus ancia blanca, po an o, a medida que aumen a el núme o de células mic ogliales en la co eza, ambién aumen a en la sus ancia blanca ce ebelosa. En es e caso, al con a io que en los an e io es, el alo pa a la pendien e de la ec a en los a ones WT (1,0920; R2=0,9925) es signi ica i amen e supe io al de los a ones bl (0,6210; R2=0,9983) y bl/Gal3KO (0,5874; R2=0,9921). Es o signi ica que, en a ones WT, po cada célula mic oglial p esen e en la co eza hay una en la sus ancia blanca, mien as que en a ones bl y bl/Gal3KO, hay una célula mic oglial en la sus ancia blanca po cada dos p esen es en la co eza ce ebelosa. Po an o, se puede conclui que, en a ones con condiciones eno ípicas bl y bl/Gal3KO, la can idad de células mic ogliales en la co eza es mayo que en la sus ancia blanca. Es o pod ía debe se a que, como se ha obse ado que la degene ación de las células de Pu kinje en los a ones bl y bl/Gal3KO se p oduce mayo i a iamen e en la co eza ce ebelosa, exis e una mayo p oli e ación mic oglial en las capas más supe iciales del ce ebelo an es de que se p oduzca en las capas más p o undas, como la sus ancia blanca. 0 50 100 150 200 0 50 100 Mic oglía / mm2 CORTEZA Mic oglía / mm2 SUSTANCIA BLANCA WT bl bl/Gal3KO Figu a 16. Va iación de la can idad de mic oglía en la sus ancia blanca con espec o a la can idad de mic oglía en co eza en el á ea medida (mm2) en el ce ebelo de a ones de 2 meses pe enecien es a los g upos expe imen ales WT, bl y bl/Gal3KO. Pa a a ones WT la pendien e es 1,0920 y R2=0,9925, pa a a ones bl la pendien e es 0,6210 y R2=0,9983 y pa a a ones bl/Gal3KO la pendien e es 0,5874 y R2=0,9921. Las es pendien es son signi ica i amen e di e en es de ce o (p<0,0001, ****). La signi icación es adís ica se calculó con un es que de e mina si las pendien es y las in e secciones en e ec as son signi ica i amen e dis in as. Se es ablece * en p<0,05, ** en p<0,01, *** en p<0,001 y **** en p<0,0001. 37 CONCLUSIONES Una ez expues os y discu idos los esul ados ob enidos en es e es udio, se puede conclui que: - La dis ibución de las células de Pu kinje y de la mic oglía es homogénea a lo la go del eje an e opos e io del ce ebelo del a ón, po lo que no exis en di e encias signi ica i as en la can idad de es as células en e las zonas an e io , media y pos e io del mismo. - La población de células de Pu kinje en el ce ebelo de los a ones bl y bl/Gal3KO es menos abundan e que la de a ones WT a causa de la degene ación de las mismas po la sob eexp esión de la p o eína mu ada He c1 bl en el ce ebelo de los a ones con dos meses de edad. - Al bloquea el gen lgals3 y sup imi la exp esión del mediado neu oin lama o io Gal3 en los a ones con eno ipo bl, se obse a cómo la mue e au o ágica de las células de Pu kinje disminuye y, po an o, exis e un posible esca e mo o en ellos. - La mic oglía es más abundan e en los a ones bl y bl/Gal3KO en espues a al p oceso neu oin lama o io, no obs an e, no exis en di e encias en es a población celula en e los a ones bl y bl/Gal3KO, po lo que la sup esión de Gal3 no supone ninguna en aja con espec o a la de ención del aumen o de la población mic oglial en el ce ebelo. - Dado que la población de células mic ogliales es mayo en la co eza que en la sus ancia blanca ce ebelosas, la degene ación de las células de Pu kinje p edominan e en la co eza ce ebelosa de los a ones bl y bl/Gal3KO pod ía es a causando una mayo ac i ación y eac i idad de la mic oglía an e es as condiciones neu oin lama o ias en las capas más supe iciales del ce ebelo an es que en las p o undas. - El aumen o en la can idad de mic oglía en la sus ancia blanca del ce ebelo de a ones bl y bl/Gal3KO en compa ación con los WT puede debe se a p oblemas en la mielinización axonal, no obs an e, no es an no able como en la co eza ce ebelosa. - En cuan o al análisis mo ológico, pa ece que las células de Pu kinje de los a ones bl/Gal3KO p esen an un á bol dend í ico más ami icado que las de los o os dos g upos expe imen ales. Es o pod ía debe se a un mayo con ol del p oceso neu oin lama o io que iene luga en la co eza ce ebelosa p incipalmen e po la degene ación de las células de Pu kinje en los a ones bl. 38 ABREVIATURAS ARNm: ARN mensaje o BDNF: B ain De i ed Neu o ophic Fac o BH3: Bcl-2 Homology Domain 3 BSA: Bo ine Se um Albumin CITIUS: Cen o de In es igación, Tecnología e Inno ación de la Uni e sidad de Se illa CRD: Ca bohyd a e Recogni ion Domain DAB: 3,3’-diaminobencidina DAM: Disease-Associa ed Mic oglia E1: enzimas ac i ado as de ubiqui ina E2: enzimas conjugado as de ubiqui ina E3: enzimas ligasas de ubiqui ina Gal3: Galec ina-3 GEF: Guanine nucleo ide Exchange Fac o GN: Gas ocnemius GTEx: Geno ype-Tissue Exp ession HECT: Homologous o he E6AP Ca boxyl Te minus Hs: Homo sapiens Iba1: Ionized calcium-Binding Adap o molecule 1 IHC: inmunohis oquímica IL-12: in e leukin-12 IL-1β: in e leukin-1β KO: Knock-Ou LAL: Le a o Au is Longus MDFPMR: Mac ocephaly, Dysmo phic Facies and Psychomo o Re a da ion Mm: Mus musculus MN: mo oneu ona mTORC1: mammalian Ta ge O Rapamycin Complex 1 NMSC: células de Schwann no mielinizan es NO: óxido ní ico NRS: especies eac i as de ni ógeno PBS: Phospha e Bu e ed Saline PFA: pa a o maldehído PI3K: os a idilinosi ol 3-cinasa PKB: p o eína cinasa B RLD: Regula o o Ch omosome Condensa ion 1 (RCC1) Like Domain ROS: especies eac i as de oxígeno S6K1: Ribosomal P o ein S6 Kinase β-1 SNC: Sis ema Ne ioso Cen al SNP: Sis ema Ne ioso Pe i é ico SRPY: spl A and RyR bl: ambalean e TEA: T as o nos del Espec o Au is a TGF-β: T ans o ming G ow h Fac o β TLR4: Toll-Like Recep o 4 TNF-α: Tumo Nec osis Fac o α TREM2: T igge ing Recep o Exp essed on Myeloid Cells 2 TSC1: Tube ous Scle osis Complex 1 TSC2: Tube ous Scle osis Complex 2 TVA: T ans e sus Abdominis Ub: ubiqui ina UNM: unión neu omuscula UPS: Sis ema Ubiqui ina-P o easoma WT: Wild-Type 39 BIBLIOGRAFÍA Bachille S, Alonso-Bellido IM, Real LM, Pé ez-Villegas EM, Vene o JL, Deie bo g T e al. The Ubiqui in P o easome Sys em in Neu omuscula Diso de s: Mo ing Beyond Mo emen . In J Mol Sci. 2020; 21(17): 1-20. h ps://doi.o g/10.3390/ijms21176429 Bachille S, Jiménez-Fe e I, Paulus A, Yang Y, Swanbe g M, Deie bo g T e al. Mic oglia in neu ological diseases: A oad map o b ain-disease dependen -in lamma o y esponse. F on Cell Neu osci. 2018; 12(288): 1-17. h ps://doi.o g/10.3389/ ncel.2018.00488 Bachille S, Roca-Ceballos MA, Ga cía-Domínguez I, Pé ez-Villegas EM, Ma os-Ca mona D, Pé ez- Cas o MA e al. HERC1 Ubiqui in Ligase Is Requi ed o No mal Axonal Myelina ion in he Pe iphe al Ne ous Sys em. Mol Neu obiol. 2018; 55(12): 8856-8868. h ps://doi.o g/10.1007/s12035-018-1021-0 Bachille S, Rybkina T, Po as-Ga cía E, Pé ez-Villegas E, Taba es L, A mengol JA e al. The HERC1 E3 Ubiqui in Ligase is essen ial o no mal de elopmen and o neu o ansmission a he mouse neu omuscula junc ion. Cell Mol Li e Sci. 2015; 72(15): 2961-2971. h ps://doi.o g/10.1007/s00018-015-1878-2 Boza-Se ano A, Reyes JF, Rey NL, Le le H, Bousse L, Nilsson U e al. The ole o Galec in-3 in α- synuclein-induced mic oglial ac i a ion. ANC. 2014; 2(1): 1-14. h ps://doi.o g/10.1186/s40478- 014-0156-0 Boza-Se ano A, Ruiz R, Sánchez-Va o R, Ga cía-Re illa J, Yang Y, Jiménez-Fe e I e al. Galec in-3, a no el endogenous TREM2 ligand, de imen ally egula es in lamma o y esponse in Alzheime ’s disease. ANC. 2019; 138(2): 251-273. h ps://doi.o g/10.1007/s00401-019-02013-z Bu guillos MA, S ensson M, Schul e T, Boza-Se ano A, Ga cía-Quin anilla A, Ka anagh E e al. Mic oglia-Sec e ed Galec in-3 Ac s as a Toll-like Recep o 4 Ligand and Con ibu es o Mic oglial Ac i a ion. Cell Rep. 2015; 10(9): 1626-1638. h ps://doi.o g/10.1016/j.cel ep.2015.02.012 Bu o sky O, Weine HL. Mic oglial signa u es and hei ole in heal h and disease. Na Re Neu osci. 2018; 19(10): 622-635. h ps://doi.o g/10.1038/s41583-018-0057-5 Chong-Kope a H, Inoki K, Li Y, Zhu T, Ga cía-Gonzalo FR, Rosa JL e al. TSC1 S abilizes TSC2 By Inhibi ing he In e ac ion be ween TSC2 and he HERC1 Ubiqui in Ligase. JBC. 2006; 281(13): 8313-8316. h ps://doi.o g/10.1074/jbc.C500451200 Deczkowska A, Ke en-Shaul H, Weine A, Colonna M, Schwa z M, Ami I. Disease-Associa ed Mic oglia: A Uni e sal Immune Senso o Neu odegene a ion. Cell. 2018; 173(5): 1073-1081. h ps://doi.o g/10.1016/j.cell.2018.05.003 Dusa I, Guene JL, So elo C. Pu kinje cell dea h: Di e ences be ween de elopmen al cell dea h and neu odegene a i e dea h in mu an mice. Ce ebellum. 2016; 5(2): 163-173. h ps://doi.o g/10.1080/14734220600699373 Ga cía-Cano J, Ma ínez-Ma ínez A, Sala-Gas on J, Ped azza L, Rosa JL. HERCing: S uc u al and Func ional Rele ance o he La ge HERC Ubiqui in Ligases. F on . Physiol. 2019; 10(1014): 1-10. h ps://doi.o g/10.3389/ phys.2019.01014 40 Ga cía-Gonzalo FR, Rosa JL. The HERC p o eins: unc ional and e olu iona y insigh s. Cell Mol Li e Sci. 2005; 62(16): 1826-1838. h ps://doi.o g/10.1007/s00018-005-5119-y Hagemeye N, Han KM, Ak idi ou MA, Unge N, Pa k ES, S anley ER e al. Mic oglia con ibu e o no mal myelinogenesis and o oligodend ocy e p ogeni o main enance du ing adul hood. Ac a Neu opa hol. 2017; 134(3): 441-458. h ps://doi.o g/10.1007/s00401-017-1747-1 Ma , D. A heo y o ce ebella co ex. J. Physiol. 1969; 202(2): 437-470. h ps://doi.o g/10.1113/jphysiol.1969.sp008820 Mashimo T, Hadjebi O, Amai -Pinedo F, Tsu umi T, Langa F, Se ikawa T, e al. P og essi e Pu kinje cell degene a ion in ambalean e mu an mice is a consequence o a missense mu a ion in HERC1 E3 ubiqui in ligase. PLoS Gene . 2009; 5(12): 1-9. h ps://doi.o g/10.1371/jou nal.pgen.1000784 Pé ez-Villegas EM, Neg e e-Díaz JV, Po as-Ga cía ME, Ruiz R, Ca ión AM, Rod íguez-Mo eno A e al. Mu a ion O The HERC1 Ubiqui in Ligase Impai s Associa i e Lea ning In The La e al Amygdala. Mol Neu obiol. 2018; 55(2): 1157-1168. h ps://doi.o g/10.1007/s12035-016-0371-8 Pé ez-Villegas EM, Ruiz R, Bachille S, Ven u a F, A mengol JA, Rosa JL. The HERC p o eins and he ne ous sys em. Semin Cell De Biol. 2022; 132: 5-15. h ps://doi.o g/10.1016/j.semcdb.2021.11.017 Po as-Ga cía EM, Ruiz R, Pé ez-Villegas EM, A mengol JA. Mo o lea ning o mice lacking ce ebella Pu kinje cells. F on Neu oana . 2013; 7(4): 1-8. h ps://doi.o g/10.3389/ nana.2013.00004 Ruiz R, A mengol JA, Vene o JL, Ga cía-Domínguez I, Roca-Ceballos MA, Pé ez-Villegas EM. Ea ly ac i a ion o mic oglia in ambalean e mouse model p eceding neu onal ce ebella dea h. 11 h FENS Fo um O Neu oscience (Be lin). 2018. Ruiz R, Pé ez-Villegas EM, Bachille S, Rosa JL, A mengol JA. HERC1 Ubiqui in Ligase Mu a ion A ec s Neoco ical, CA3 Hippocampal and Spinal Co d P ojec ion Neu ons: An Ul as uc u al S udy. F on ie s in Neu oana omy. 2016; 10(42): 1-15. h ps://doi.o g/10.3389/ nana.2016.00042 Sa aiyan S, Besson-Gi a d S, Kaya T, Can u i-Cas el e i L, Liu L, Ji H e al. Whi e ma e aging d i es mic oglial di e si y. Neu on. 2021; 109(7): 1100-1117. h ps://doi.o g/10.1016/j.neu on.2021.01.027 Sánchez-Tena S, Cubillos-Rojas M, Schneide T, Rosa JL. Func ional and pa hological ele ance o HERC amily p o eins: A decade la e . Cell Mol Li e Sci. 2016; 73(10): 1955-1968. h ps://doi.o g/10.1007/s00018-016-2139-8 Schneide , T. Papel de la E3 Ubiqui ina Ligasa HERC1 en las ías de señalización celula de las MAPKs y en la au o agia. Ba celona: Unidad de Bioquímica y Biología Molecula del Depa amen o de Ciencias Fisiológicas; 2017. S owell RD, Wong EL, Ba chelo HN, Mendes MS, Laman ia CE, Whi elaw BS e al. Ce ebella Mic oglia a e Dynamically Unique and Su ey Pu kinje Neu ons In Vi o. De Neu obiol. 2018; 78(6): 627-644. h ps://doi.o g/10.1002/dneu.22572