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SlRD,&una&p o eína&con&dominio&UspA&y&
sus a o&de&SlCIPK6,®ula&la& espues a&
inmune&en&Solanáceas&
Ins i u o!de!Bioquímica!Vege al!y!Fo osín esis!
Depa amen o!de!Bioquímica!Vege al!y!Biología!
Molecula !
Uni e sidad!de!Se illa=CSIC!
T abajo! ealizado!pa a!op a !al!g ado!de!
Doc o !po !la!Uni e sidad!de!Se illa!po !el!
Licenciado!
!
Emilio&Gu ié ez&Bel án&
!
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Di ec o a!de!Tesis!
!
D a.!Olga!del!Pozo!Cañas!
Cien í ico! i ula !
!
Tu o !
!!
D .!José!Ma ía!Rome o!Rod íguez!
P o eso ! i ula !de!la!US!
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1!
Índice'gene al'
In oducción··································································································7'
I.!1. Sis ema!de!de ensa! ege al············································································9!
I.!1.1. De ensa!basal!o!PTI············································································10!
I.!1.2. Respues a!especí ica!de!la!plan a!o!ETI················································11!
I.!1.3. De ensa!sis émica···············································································15!
I.!1.4. P o eínas! elacionadas!con!la!pa ogénesis···········································16!
I.!2. Papel!de!las!ho monas!en!la! espues a!inmune!de!la!plan a························16!
I.!2.1. Ácido!salicílico,!ácido!jasmónico!y!e ileno·········································17!
I.!2.2. Auxinas···························································································18!
I.!2.3. Ácidos!abscísico···············································································19!
I.!3. Respues as!de ensi as·················································································20!
I.!3.1. P oducción!de!especies! eac i as!de!oxígeno!(ROS)·····························20!
I.!3.2. Óxido!ní ico······················································································21!
I.!3.3. MAPKKKs··························································································21!
I.!3.4. El!Ca2+!como!segundo!mensaje o························································22!
I.!4. P o eínas!senso as!de!Ca2+···········································································23!
I.!4.1. Función!de!los!complejos!CBL/CIPK····················································26!
I.!4.2. Mecanismos!de!especi icidad!en!la! espues a!CBL/CIPK······················26!
I.!5. Uni e sal*s ess*p o ein!(Usp)·······································································29!
Bibliog a ía····································································································35!
Obje i os·······································································································47'
Capí ulo'1:!Ca ac e ización!molecula !de!!SlCIPK6!y!SlCBL10·························51!
Resul ados·····································································································53!
1.1. Análisis!de!la!exp esión!génica!de!SlCBL10!y!SlCIPK6!!en! oma e!············53!
1.1.1. Acumulación!de! ansc i o!en!di e en es! ejidos····························53!
1.1.2. Acumulación!de! ansc i o!en! espues a!a*Ps *DC3000···················54!
1.1.3. Acumulación!de! ansc i o!en! espues a!a!di e en es!ho monas·····56!

!
2!
1.1.4. Acumulación!de! ansc i o!en! espues a!a!es és!abió ico··············58!
1.2. Localización!subcelula !de!SlCBL10!y!SlCIPK6!en!N.*ben hamiana···········59!
1.3. Ca ac e ización!de!la!in e acción!SlCBL10/SlCIPK6!median e!doble···········.!!!!!!
híb ido!en!le adu as············································································63!
1.4. Gene ación!de!plan as! ansgénicas!!que!sob eexp esan!SlCBL10!en!..............!!!!!!!!!!!!!!!
N.*ben hamiana····················································································65!
1.4.1. Sensibilidad!a!sal!de!las!plan as! ansgénicas!SlCBL10!en.........................!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
N.*ben hamiana············································································67!
Discusión·······································································································72!
Bibliog a ía····································································································81!
Capí ulo'2:!Iden i icación!de!p o eínas!que!in e accionan!con!SlCIPK6!median e.!
doble!híb ido!en!le adu as·················································································85!
Resul ados·····································································································87!
2.1. An eceden es·······················································································87!
2.2. Ca ac e ización!bioquímica!de!SlCIPK6·················································88!
2.3. Esc u inio!gené ico!de!doble!híb ido!en!le adu as································91!
2.4. Selección!de!candida os·······································································96!
2.4.1. Pa icipación!en!la! espues a!inmune!en! oma e····························96!
2.4.2. Iden idad!de!los!clones·································································98!
2.4.3. Es udio!de!in e acción!in* i o!con!SlCIPK6··································102!
Discusión·····································································································104!
Bibliog a ía··································································································108!
Capí ulo'3!Ca ac e ización!de!SlRD······························································113!
Resul ados···································································································115!
3.1. Análisis!bioin o má ico!de!SlRD···························································115!
3.2. Es udio!de!la!in e acción!en e!SlRD!y!SlCIPK6·····································117!
!
3!
3.3. Análisis!de!la!exp esión!génica!de!SlRD!en! oma e································123!
3.3.1. Acumulación!de! ansc i o!en!di e en es! ejidos!y!en! espues a!a!.......!!!!!!!
Ps !DC3000················································································124!
3.3.2. Acumulación!de! ansc i o! espues a!a!es és!abió ico················126!
3.4. Es udio!de!la! os o ilación!de!SlRD!po !SlCIPK6····································128!
3.5. Es udio!de!la!implicación!de!SlRD!en!la! espues a!inmune!en..............................!
Solanáceas·························································································129!
3.5.1. Implicación!en!el!desa ollo!de!los!sín omas!de!en e medad!en.............!!!!!!!!!!
N.*ben hamiana··········································································132!
3.5.2. Papel!en!la! espues a!ETI!mediada!po !P o/A P o·····················133!
3.5.3. Papel!en!la! espues a!ETI!mediada!po !múl iples!elici o es··········135!
3.5.4. Implicación!en!la!PCD! as!la!in ección!con!Ps * abaci!(A P o)····137!
3.6. Es udio!de!la!homodime ización!de!SlRD·············································138!
3.6.1. Localización!del!díme o!SlRDcSlRD!median e!BiFC······················140!
3.6.2. Implicación!de!la!dime ización!en!la!unión!a!SlCIPK6··················142!
3.7. Es udio!de!la!unión!de!ATP!a!SlRD·······················································147!
3.8. Es udio!de!la!complemen ación!de!SlRD!en!el!mu an e!ΔuspA*de!E.*coli·150!
3.9. Es udio!de!la!gene ación!de!especies! eac i as!de!oxígeno!(ROS)!en................!!!!!!!!!!!!!!!!!!
N.*ben hamiana··················································································152*
3.9.1. Implicación!de!la!pe dida!de! unción!de!SlRD!en!la!gene ación!de.........!
ROS!··························································································154*
3.9.2. Es udio!de!la!gene ación!de!ROS!en!la! espues a!PTI!y!ETI!en!plan as!
sob ecexp eso as!de!SlRD···························································155*
3.10. E ec o!de!la!sob eexp esión!de!SlRD!en!le adu as······························156!
Discusión······································································································160!
Bibliog a ía··································································································173!
Conclusiones·····························································································181'
Ma e iales'y'mé odos·············································································185!
M.1. Ma e ial!biológico·····················································································187!
M.1.1 Es i pes!bac e ianas·········································································187!
!
4!
M.1.2 Es i pes!de!le adu as·······································································187!
M.1.3 Plan as····························································································188!
M.2. Cul i o!y!manipulación!del!ma e ial! ege al··············································188!
M.2.1 Es e ilización!de!semillas·································································188!
M.2.2 Ge minación!y!condiciones!de!cul i o···············································188!
M.2.3 T ans o mación!es able!de!N.!ben hamiana! ía!Ag obac e ium··········189!
M.2.4 Selección!de!líneas! angénicas!de!N.*ben hamiana····························190!
M.2.5 Silenciamien o!génico!inducido!po ! i us!(VIGS)·······························190!
M.2.6 Ag ocexp esión!en!!hojas!de!N.*ben hamiana·····································191!
M.2.7 Medida!de!la!mue e!celula !median e!conduc i idad!iónica··············191!
M.3. Cul i o!y!manipulación!de!mic oo ganismos·············································192!
M.3.1 Medio!de!cul i o!líquido!y!sólido·······················································192!
M.3.2 Ob ención!de!células!compe en es····················································193!
M.3.3 T ans o mación!bac e iana······························································193!
M.3.4 Ensayo!de!complemen ación!del!mu an e!ΔuspA!de!E.*coli·················194!
M.3.5 Ensayo!c ossGlinking!en!E.*coli···························································194!
M.3.6 T ans o mación!de!le adu as···························································195!
M.3.7 Ensayo!de! esis encia!en!le adu as···················································195!
M.4. Sis ema!LexA!de!doble!híb ido··································································195!
M.4.1 Fundamen os!del!sis ema!de!doble!híb ido·······································195!
M.4.2 T ans o mación!de!la!geno éca!de! oma e!en!la!cepa!EGY48··············197!
M.4.3 Esc u inio!gené ico··········································································197!
M.4.4 Selección!y!aislamien o!de!colonias!posi i as····································198!
M.4.5 Ensayo!βcgalac osidasa····································································198!
M.5. Aislamien o!y!manipulación!de!ácidos!nucleicos········································199!
M.5.1 Pu i icación!y!manipulación!de!ADN·················································199!
M.5.1.1 Aislamien o!de!plásmidos!de!E.*coli··········································199!
M.5.1.2 Aislamien o!de!plásmido!de!le adu a·······································199!
M.5.1.3 Diges ión,!pu i icación!y!ligación!de! agmen os!de!DNA···········200!
M.5.1.4 Mu agénesis!di igida·······························································201!
M.5.1.5 Pu i icación!de!DNA!de!plan as················································201!
M.5.1.6 Elec o o esis!de!DNA!en!geles!de!aga osa.·······························201!
M.5.1.7 Reacción!en!cadena!de!la!polime asa!(PCR)······························202!
!
5!
M.5.1.8 Secuenciación!au omá ica!de!DNA···········································202!
M.5.2 Pu i icación!y!manipulación!de!RNA·················································202!
M.5.2.1 T a amien o!del!ma e ial·························································202!
M.5.2.2 Aislamien o!de!RNA!!de!plan a·················································203!
M.5.2.3 T ansc ipción! e e sa·····························································203!
M.5.2.4 PCR!semicuan i a i a.······························································203!
M.5.2.5 PCR!a! iempo! eal.···································································204!
M.6. Pu i icación!y!manipulación!de!p o eínas··················································206!
M.6.1 Ex acción!de!p o eínas!de!plan as.···················································206!
M.6.2 Elec o o esis!en!geles!de!poliac ilamida!(PAGE)·······························206!
M.6.3 T ans e encia!de!p o eína!a!memb ana!(wes e nGblo ).······················207!
M.6.4 Ensayo!de!cocinmunop ecipi ación!in* i o·········································207!
M.6.5 Exp esión!y!pu i icación!de!p o eínas! ecombinan es························208!
M.6.5.1 Pu i icación!desde!E.*coli·························································208!
M.6.5.2 Pu i icación!desde!hojas!de!N.*ben hamiana·····························209!
M.6.6 Ensayo!de! os o ilación!con!γcATP.····················································209!
M.6.7 Ensayo!de!unión!a!αcATP··································································209!
M.7. T a amien os!de!plan as···········································································209!
M.7.1 Inoculación!con!bac e ia!pa ógenas··················································209!
M.7.1.1 Inoculación!po !inme sión·······················································209!
M.7.1.2 Inoculación!po !in il ación·····················································210!
M.7.2 T a amien os!en! oma e···································································210!
M.7.3 Ensayo!de!la!gene ación!de!ROS!en!N.*ben hamiana···························211!
M.8. Mic oscopía·····························································································211!
M.8.1 Adquisición!de!imágenes!po !mic oscopía!con ocal···························211!
M.9. He amien as!bioin o má icas··································································211!
Bibliog a ía··································································································213!
!
!
!
In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
12!
es!capaz!de!desa olla !una!in ección!sa is ac o ia.!En!la!in e acción!incompa ible!
la!cepa!del!pa ógeno!es!a i ulen a!y!en!el!caso!de!la!in e acción!compa ible!la!
cepa!es! i ulen a.!
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Sin!emba go!y! as!el!a ance!del!conocimien o!del! ema!Van!de !Biezen!y!Jones!
en!1998!pos ula on!una!adap ación!algo!más!so is icada!del!modelo!gen!a!gen,!
enunciado!con!el!nomb e!de!hipó esis+gua dia.!En!ella!se!pos ula!que!no! iene!
luga !una!in e acción! ísica!en e!la!p o eína!!A !y!R!sino!que!és as!son!capaces!
de! econoce !a!de e minados!e ec o es!sin!una!unión!di ec a.!Muchas!p o eínas!
R! se! enca ga ían!de! moni o iza ! el! es ado! de! a ios! componen es! de ensi os!
ege ales!siendo!capaces!de!de ec a !el!cambio!gene ado!po !los!e ec o es!(Van!
de !Biezen!and!Jones!1998).!De!es a! o ma!se!explica ía!que!las!células! ege ales!
sean!capaces!de! esponde !a!una!g an! a iedad!de!e ec o es!pa ogénicos!con! an!
solo!unas!pocas!p o eínas!de! esis encia.!Así!po !ejemplo!se!ha!desc i o!que!las!
p o eínas! R! de! memb ana! RPM1! y! RPS2! son! capaces! de! moni o iza ! las!
modi icaciones!de!RIM4!que! ienen!luga !como! esul ado!de!la!ac i idad!de!los!
Figu a+ I.1:!Esquema+ del!modelo+ gen+ a+ gen.! Es a! eo ía! pos ula! que! cuando! iene! luga ! una!
in e acción!en e!una!p o eína!de!A i ulencia!(A )!sec e ada!po !el!pa ógeno!y!una!p o eína!de!
Resis encia! (R)! p opo cionada! po ! la! plan a! se! p oduce! un! econocimien o! incompa ible,!
imposibili ando!la!in ección!po !pa e!del!in aso .!Sin!emba go,!si! alla!alguno!de!los!elemen os!
an e io es!no!se!gene a! al! econociemen o!dando!luga !a!una!in ección.!

In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
13!
e ec o es! A Rp 2,! A Rpm1! y! A B! (Ax ell,! Chisholm! e ! al.! 2003)!y! (Mackey,!
Belkhadi !e !al.!2003).!
Recien emen e! se! ha! es ablecido! el! modelo+ zigEzag!como! esumen! de! la!
espues a!inmune!de!la!plan a!(Jones!and!Dangl!2006).!És e!se!di ide!en!cua o!
ases! di e en es! y! se! mues a! en! la! igu a! I.2.! En! la! ase! I! iene! luga ! el!
econocimien o!de!los!PAMPs!po !pa e!de!los! ecep o es!PRRs!y!se!dispa a!la!
espues a! PTI,! la! cual! pod ía! pa a ! la! in ección.! En! la! ase! 2! los! agen es!
pa ogénicos! en ían! e ec o es! que! in e ie en! con! la! PTI! de i ando! en! la!
suscep ibilidad! mediada! po ! e ec o es! (ETS).! En! la! ase! 3,! un! e ec o ! es!
econocido!po !una!p o eína!R!lo!cual!ac i a!la!inmunidad!mediada!po !e ec o es!
(ETI).!En!la! ase!4,!la!selección!na u al!hace!que!los!agen es!pa ogénicos!eliminen!
la! espues a! ETI,! bien! po ! la! pé dida! de! e ec o es! econocidos! o! bien! po ! la!
ganancia!de!nue os,!y!den!luga !a!in ección.!De!la!misma!mane a,!la!selección!
na u al!di igi á!a!las!plan as!a! econoce !nue os!e ec o es!en!su!ca e a!a mada!
hacia!la!pe pe uación!en!el! iempo.!!
!
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5!65.)
!7289)
/,*0&12*.)
#+&134-%01.) !7289)
:";2+$)#+2+)$+)<9)
:";2+$)#+2+)$+)
2*.%.&*-0%+)*,*0=7+)
Figu a+I.2:!Esquema+que+ ep esen a+el+modelo+zigEzag,+que+explica+el+sis ema+inmune+de+
plan as.+Leyenda:!PAMPs:!Pa ones!molecula es!asociados!a!pa ógenos;!PTI:!Inmunidad!inducida!
po ! los! PAMPs;! ETS:! Suscep ibilidad! inducidad! po ! e ec o es;! ETI:! Inmunidad! ac i ada! po !
e ec o es;! HR:! Respues a! Hipe sensible;! A :! P o eíanas! de! A i ulencia;! R:! P o eínas! de!
Resis encia.!
In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
14!
La!ETI!culmina!con!la! esis encia!de!la!plan a!y!no malmen e!con!una! espues a!
hipe sensible! (HR)! que! implica! mue e! celula ! p og amada! en! el! si io! de! la!
in ección.! La! HR,! que! es! con olada! gené icamen e! po ! la!plan a,! puede! ene !
luga !2! o! 3! ho as! después!del! con ac o! de! una! simple! bac e ia! con! la! célula!
ege al.! Sin! emba go,! en! la! p ác ica,! se! de ine! como! una! mue e! celula !
mac oscópica!que!ocu e!cuando!un!mínimo!del!25%!de!las!células!en!con ac o!
con! el! pa ógeno! mue en,!desa ollando!una! mue e! celula ! con luen e.! La! HR!
pod ía! inhibi ! o! e asa ! la! p opagación! del! pa ógeno,! pe o! su! signi icado!
biológico!es!di ícil!de!de e mina !debido!a!la! al a!de!plan as!mu an es!a ec adas!
en!la!mue e!celula !(Mu ,!Ken on!e !al.!2008).!En!algunas!in e acciones!plan aS
pa ógeno!la!ac i ación!de!la!HR!es!su icien e!pa a!la!con ención!de!la!in ección,!
mien as!que!en!o os!casos!no!es!su icien e!pa a!la! esis encia!a!la!en e medad.!
Se!ha!p opues o!que!la!mue e!celula ! end ía!luga !si!se!supe a!un!cie o!umb al!
de!es és.!
El!modelo!de!in e acción!plan aSpa ógeno!mejo !ca ac e izado!en!Solanáceas!es!
el! o mado! po ! la! plan a! de! oma e,! Solanum1 lycope sicum,! y! Pseudomonas1
sy ingae!p ! oma o! (Ps ),! causan e! de! la! en e medad! denominada! mancha!
bac e iana.!En!las!plan as!suscep ibles,!el!pa ógeno!se!mul iplica!en!el!espacio!
apoplás ico,! o mando!a!los!pocos!días!pequeñas!lesiones!nec ó icas! odeadas!de!
un!halo!clo ó ico.!En!casos!de!in ecciones!se e as!se!puede!llega !a!la!de oliación!
de!la!plan a.!La! esis encia!a!es a!bac e ia!es á!mediada!po !la!quinasa!P o!que!
econoce!el!e ec o !A P o!iniciando!una!cascada!de!señalización!que!culmina!en!
la!inmunidad! en e!al!pa ógeno!(Jeong,!Dijk!e !al.!2009).!
P o!es!una!se ina/ eonina!quinasa!que!ca ece!de!la! egión! ica!en! epe iciones!
de! leucina! p esen e! en! o os! genes! R.! La! p o eína! A P o! es! una! pequeña!
p o eína!hid o ílica!cuya!exp esión!es! egulada!po !una!caja!h p!(hype sensi i e.
esponse1and1pa hogenici y)!en!su!p omo o ,!inducida!en!condiciones!en!las!que!
el!c ecimien o!bac e iano!es á! a o ecido.!P o! ambién! econoce!a!o a!p o eína!
de!Ps !DC3000!denominada!A P oB!!que!no!p esen a!homología!con!A P o!y!
que! ambién! inicia! la! espues a! de! esis encia! en! oma e! (Pedley! and! Ma in!
2003).!
In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
15!
P ! es! una! p o eína! con! dominios! icos! en! leucina! necesa ia! pa a! el!
uncionamien o!de!la! esis encia!mediada!po !P o!y!es udios! ecien es!sugie en!
que! unciona! o mando!un!complejo!con!P o!y!A P o.!En!el!modelo!de! abajo!
acep ado!ac ualmen e,!P o! o ma!un!complejo!ines able!con!P !en!la!memb ana!
en! ausencia! de! pa ógeno.! ! En! es e! complejo! ambién! pod ían! es a ! p esen es!
p o eínas!implicadas!en!la!de ensa!basal!de!la!plan a.!Una! ez!que!Ps !DC3000!se!
encuen a!en!el!espacio!apoplás ico!y!sec e a!los!e ec o es!den o!de!la!célula!
ege al,! P o! de ec a! la! p esencia! de! A P o! es imulándose! así! su! ac i idad!
quinasa,!y!es ableciendo!el!complejo! P oSP .!Dicho! complejo!ac i o!inicia!una!
cascada!que!induce!la! esis encia!especí ica!de!Ps 1DC3000.!Al! a a se!P o!de!una!
quinasa,!posiblemen e!inicie!cascadas!de! os o ilación.!Se!han!iden i icado! a ios!
sus a os! de! P o! median e! ensayos! de! doble! híb ido! en! le adu as,! como! la!
quinasa! P i1! (P o1in e ac ing1 p o ein)! y! los! ac o es! de! ansc ipción! P i4/5/6!
pe enecien es!a!la! amilia!ERF!(Pedley!and!Ma in!2003).!
I.+1.3. De ensa+sis émica+
La! esis encia! sis émica! adqui ida! (SAR,! sys emic1 acqui ed1 esis ance)! es! una!
espues a!de!de ensa!ac i a,!sis émica,!de!amplio!espec o!que!se!asocia!a!una!
al a!exp esión!de!genes!PR! (pa hogenesis1 ela ed).!En! la! mayo ía! de! los! casos,!
SAR! es! igualmen e! e ec i a! con a! hongos,! bac e ias,! i us! o! nema odos,!
independien emen e! del! o ganismo! induc o ! (Ryals,! Neuenschwande ! e ! al.!
1996).! La! mani es ación! de! SAR! de! mane a! sis émica! en! la! plan a! implica! la!
exis encia!de!algún!sis ema!de!señales!capaces!de! ansmi i se!a! a és!de!los!
ejidos.!Las!in es igaciones! ealizadas!indican!que!el!ácido!salicílico!(SA)!es! la!
molécula!que!ha!mos ado!mayo es!e idencias!de!es a !in oluc ada!en!las! ías!
de!SAR.! De! es a! o ma,! la! inducción!de!SAR! gene almen e! se! co elaciona! con!
inc emen os! en! la! acumulación! de! SA! an o! localmen e! como! sis émicamen e!
(Law on,!Weymann!e !al.!1995).!
O o! ipo! de! esis encia! sis émica! inducida!se! desa olla! a! pa i ! de! la!
colonización! de! las! aíces! de! la! plan a! po ! mic oo ganismos! de! la! izos e a,!
pa icula men e! izobac e ias.! Es e! ipo! de! esis encia! es! conocida!como!
esis encia!sis émica!inducida!(ISR,!induced!sys emic! esis ance)!y!se!ca ac e iza!
In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
16!
po !es a !mediada!po ! ías!me abólicas!sensibles!al!ácido!jasmónico!y!al!e ileno!y!
se !independien e!de!la!exp esión!de!los!genes!PR!y!del!ácido!salicílico!(Pie e se!
and! an!Loon!1999).!
I.+1.4. P o eínas+ elacionadas+con+la+pa ogénesis+
Las!p o eínas! elacionadas! con! la! pa ogénesis! (p o eínas! PR)!son! un! g upo!
a iable! que! se! acumulan! en! las! plan as! después! y! du an e! la! in ección! con!
pa ógenos.! La! inducción! de! los! genes! PR! ocu e! no! solo! po ! la! in ección! con!
a ios! ipos! de! pa ógenos,! sino! ambién! en! espues a! al! a amien o! con!
elici o es,! egulado es! del! c ecimien o! de! las! plan as,! po ! la! acción! de!
compues os!me abólicos!y!di e sos!agen es!químicos!( an!Loon,!Rep!e !al.!2006).!
Las!p o eínas!PR!se!ca ac e izan!po !su!bajo!peso!molecula ,!po !la! esis encia!a!
las! p o easas,! po ! su! localización! ex acelula ! y! sus! alo es! de! pH! ex emos!
(S in zi,!Hei z!e !al.!1993).!
En e!las!p o eínas!PR!mas!es udiadas!se!encuen an!las!qui inasas!y!glucanasas!
que!pa icipan!en!la! espues as!de!de ensa!ac i a!de!la!plan as!con a!pa ógenos!
úngicos!( an!Loon,!Rep!e !al.!2006).!
I.+2.Papel+de+las+ho monas+en+la+ espues a+inmune+de+la+plan a+
Las! plan as! p oducen! una!g an! a iedad! de! ho monas! ege ales! incluyendo!
auxinas,!gibe elinas!(GA),!e ileno!(ET),!ácido!abscísico!(ABA),!ci oquininas!(CK),!
b asinos e oides!(BR)!y!ho monas!pep ídicas.!Recien emen e!se!han!desc i o!las!
es igolac onas!como!una!nue a!clase!de!ho monas! ege ales!(Umeha a,!Hanada!
e !al.!2008).!Las! i oho monas!juegan!un!impo an e!papel!en!di e sos!p ocesos!
elacionados! con! el! c ecimien o! y! desa ollo,! así! como! en! a ias! espues as! a!
es eses! bió icos! o! abió icos.! La! iden i icación! y! ca ac e ización! de! a ios!
mu an es!a ec ados!en!la!biosín esis,!pe cepción!y! ansducción!de!señales!de!las!
i oho monas!han!sido!indispensables!pa a!de e mina !su!papel!en!la! espues a!
de!de ensa.!Sin! emba go,!los! mecanismos!molecula es!median e!los! cuales! las!
plan as!in eg an!los!cambios!en!los!ni eles!ho monales!inducidos!po !el!es és!e!
inician! espues as!adap a i as!son! oda ía!poco!conocidos!(Ba i!and!Jones!2009).!
!
In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
17!
I.+2.1. Ácido+salicílico,+ácido+jasmónico+y+e ileno.+
Se!encuen a!bien!ca ac e izada!el!papel!de!las! es! i oho monas!(SA,!JA!y!ET)!en!
la! egulación!de!la!de ensa!de!la!plan a!a! a ios! ipos!de!pa ógenos!y!es eses!
abió icos,! así!como! he ida! y! exposición! a! ozono! (Balbi! and! De o o! 2008)! y!
(Loake!and!G an !2007).!
El! SA! iene! un! papel! impo an e! en! la! de ensa! ege al,! pa icipando!
p incipalmen e!en! la! ac i ación! de! la! de ensa! en! espues a! a! pa ógenos!
bio ó icos!y!hemiSbio ó icos!y!en!la! esis encia!sis émica!adqui ida!(G an !and!
Lamb!2006).!Sin!emba go,!las!ho monas!JA!y!ET!es án!asociadas!gene almen e!
con!la!de ensa!a!pa ógenos!nec o ó icos!e!insec os!he bí o os.!Aunque!las! ías!
de! señalización! de! SA! y! JA/ET! son!an agonis as,! exis en! e idencias! de!
in e acciones!siné gicas!en e!ellas!(Mu ,!Ken on!e !al.!2006).!
Uno!de!los!componen es! egulado es!más!impo an e!en!la!señalización!po !SA!
es!la!p o eína!NPR1!(non.exp esso 1o 1PR1genes11)!la!cual!in e ac úa!con!el! ac o !
de! ansc ipción! TGA,! in oluc ado! en! la! ac i ación! de! un! g upo!de! genes!
elacionados!con!la!pa ogénesis!(PR)!(Dong!2004).!La!p o eína!NPR1!supone!un!
pun o! cla e! en! la!señalización! po ! SA! y! en! la! inhibición! de! la! espues a! a!JA!
(Spoel,!Koo nnee !e !al.!2003).!Recien emen e!se!ha!desc i o!que!los!cambios!en!
el! es ado! édox! de! la! célula! juegan! un! impo an e! papel! en! la! aducción! de!
señales!de!SA!(Mou,!Fan!e !al.!2003).!De!es a! o ma!se!ha! elacionado!el!aumen o!
de! los! ni eles! de! glu a ión,! uno! de! los! componen es! esponsable! de! la!
homeos asis!celula ,!con!la!capacidad!de!SA!de!sup imi !la!exp esión!de!genes!de!
espues a!a!JA!(Koo nnee ,!LeonSReyes!e !al.!2008).!!
Aunque!el!ácido!jasmónico!se!encuen a!in oluc ado!en!p ocesos! ales!como!la!
ge minación,!el!c ecimien o!de!la! aíz,!la! o mación!del! ubé culo,!la!senescencia!
olia ! y! la! ape u a! es omá ica,! ambién! juega! un! papel! impo an e! en! la!
espues a!de!de ensa!a!insec os!y!pa ógenos!mic obianos.!Va ios!es udios!han!
demos ado!que!la!concen ación!local!de!JA!aumen a!en! espues a!a!la!in ección!
po ! pa ógenos! o! daños! en! el! ejido.! De! la! misma! o ma! se! ha! desc i o! que! la!
aplicación!exógena!de!la!ho mona!induce!la!exp esión!de!genes! elacionados!con!
la!de ensa!(Was e nack!2007).!Los!p incipales!componen es!en!la!señalización!

In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
18!
po ! JA! desc i os! has a! el! momen o! es án! o mados! po ! las! p o eínas!COI!
(co a ine! insensi i e! 1),! JAR1! (jasmona e1 esis an 1 1)! y! JIN1/MYC2! (Jasmona e1
insensi i e11/MYC2).!Recien emen e!se!iden i ica on!las!p o eínas!JAZ!(jasmona o1
ZIM.domain)! como! ep eso as! de! la! señalización! po ! JA.! Así! po ! ejemplo! la!
deg adación!de!las!p o eínas!JAZ!pe mi e!la!ac i ación!de!genes!de! espues a!a!JA!
po !el! ac o !de! ansc ipción!MYC2!(Thines,!Ka si !e !al.!2007).!
Nume osos! es udios! indican! que! la! señalización! de! JA! y! ET! ope an!
siné gicamen e!en!la!ac i ación!de!la!exp esión!de!di e sos!genes!de!de ensa! as!
la!inoculación!del!pa ógeno!(Penninckx,!Thomma!e !al.!1998).!Así!po !ejemplo!el!
ac o !de! ansc ipción!ERF1!(e hylene1 esponse1 ac o )!es!un! egulado !posi i o!
de!la!señalización!po !JA!y!ET!en!A abidopsis!(Lo enzo,!Pique as!e !al.!2003).!De!
igual! o ma! el! gen! PDF1.2! (plan 1de ensin1 gene)! de! A.1 b assicicola!es! inhibido!
an o!en!el!mu an e!insensible!a!jasmona o!coi1!como!en!el!mu an e!insensible!a!
e ileno!ein2!(Thomma,!Penninckx!e !al.!2001).!
Po ! lo! an o!las! plan as,! con! el! obje i o! de! ac i a ! una! espues a! de ensi a!
e ec i a! en e!a!di e sos!pa ógenos,!modulan!la!abundancia!de!las!ho monas!SA,!
ET!y!JA,!modi ican!la!exp esión!de!genes! elacionados!con!la!de ensa!y!coo dinan!
los!complejos!de!in e acción!en e!las!di e en es! ías!de!de ensa.!Sin!emba go!los!
mecanismos!po !los!cuales!las!plan as!lle an!a!cabo!és as!acciones!se!desconocen.!
I.+2.2. Auxinas+
Aunque! las! auxinas! son! conside adas! ho monas! egulado as! del! c ecimien o!
ege al! ecien emen e!se!las! ha!implicado! en! la! de ensa!de!la!plan a! (Yamada!
1993).!Debido!a!que!muchos!mic oo ganismos! i opa ógenos!p oducen!auxinas!
(ácido!indo!lacé ico,!IAA)!du an e!sus!in e acciones!con!las!plan as,!se!p opuso!la!
pa icipación! de! es a! ho mona! en! el! desa ollo! de! la! en e medad! (Spaepen,!
Vande leyden!e !al.!2007).!Pos e io men e!se!demos ó!que!las!auxinas! ep imen!
la!exp esión!de!los!genes!PR,!lo!que!indicó!que!pod ían!modula !la! espues a!de!
de ensa!de!la!plan a!(Jouanneau,!Lapous!e !al.!1991).!En! a ios!es udios!se!ha!
desc i o!la!ac uación!an agónica!de!la!señalización!po !auxinas!con! espec o!a!la!
señalización! po ! SA!(Ba i! and! Jones! 2009).! Es a! ac uación!an agónica!pod ía!
In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
19!
debe se!a!que!la!plan a!des ía!los! ecu sos!dedicados!al!c ecimien o! ege al!a!
p ocesos! elacionados!con!la!de ensa!cuando!ocu e!un!a aque!po !pa ógenos.!
Las! auxinas! p omue en! la! deg adación! de! una! amilia! de! ep eso es!
ansc ipcionales! llamados! Aux/IAA!(Auxin/IndoleS3Sace ic!acid),!los!cuales!se!
encuen an!unidos!en!condiciones!de!no!inducción!a!los! ac o es!de! espues as!a!
auxina!ARFs!(auxin1 esponse1 ac o s)!e!impiden!la! ansc ipción!de!de e minados!
g upos!de!genes!(Leyse !2006).!Cuando!la!p o eína!TIR1! o ma!un!complejo!con!
Aux/IAA!se! p oduce! la! deg adación! de! és e! ía! ubiqui inación.!Las! auxinas!
egulan!el!c ecimien o! ege al!median e!la!exp esión!de! a ios!g upos!de!genes,!
en e!los!que!se!encuen a!la! amilia!génica!GH3!(Woodwa d!and!Ba el!2005).!
Los! genes! GH3!codi ican! a! sin e asas! enca gadas! de! la! egulación! de! la!
homeos asis!de!las!auxinas!y! ecien emen e!se!las!ha!implicado!en!la! espues a!
de!de ensa!en!A abidopsis!y!a oz!(Zhang,!Li!e !al.!2007).!
I.+2.3. Ácido+abscísico+(ABA)+
El!ABA!es á!implicada!en!la! egulación!de!nume osos!aspec os!del!c ecimien o!y!
desa ollo! ege al!como! la! ge minación,! la! madu ación! del! emb ión,! la!
senescencia! olia ,!la!ape u a!es omá ica,!así!como! ambién!en!la!adap ación!a!
es eses! ambien ales! (Wasilewska,! Vlad! e ! al.! 2008).! Va ios! es udios! han!
demos ado!que!el!ABA!pa icipa!en!la! espues a!de!la!plan a! en e!al!a aque!
pa ogénico!y!cuya! unción! a!a!depende !del! ipo!de!in e acción!plan a!pa ógeno!
que! se! es ablezca.! En! la! mayo ía! de! los! casos! la! ho mona!ac úa! como!un!
egulado ! nega i o! de! la! espues a! de! la! plan a! a! la! in ección! po ! a ios!
pa ógenos! bio ó icos! y! nec o ó icos! (Ba i! and! Jones! 2009).! Sin! emba go!
ambién! se! ha! is o!que! en! algunos! casos! puede! ac ua ! como! un! egulado !
posi i o! de! la! espues a! de! la! plan a!a! la! in ección!(MauchSMani! and! Mauch!
2005).!
Se!ha! desc i o!que! el!ABA! pod ía!media !la! espues a!a! la!in e acción!plan aS
pa ógeno! median e! la! egulación! del! me abolismo! de!la!sín esis! de! la! pa ed!
celula !(Flo s,!Ton!e !al.!2008),!la!gene ación!de!especies! eac i as!de!oxígeno!y!
la!exp esión!de!genes!de!de ensa!(Xing,!Jia!e !al.!2008).!!
In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
20!
I.+3.Respues as+de ensi as+
La!de ección!del!pa ógeno!po !pa e!de!la!plan a,!ya!sea!en!la!PTI!o!bien!en!la!ETI,!
desencadena! una! g an! can idad! de! cambios! en! el! in e io ! de! las! células! del!
hospedado .! La! elocidad,! in ensidad! o! magni ud! con! la! que! se! desa ollan!
dichos!cambios!son!c uciales!pa a!de e mina !la!e iciencia!de!la! espues a.!En e!
los! e en os! comunes! que! se! p oducen! en!las! espues as! PTI! y! la! ETI!
encon amos:! cambios! en! el! lujo! de! iones,! sín esis! de! especies! eac i as! de!
oxígeno! y! ni ógeno,!ac i ación! de! ías! de! señalización,! al e ación! de! los!
pa ones! ansc ipcionales!y!la!alcalinización!del!espacio!ex acelula .!!
I.+3.1. P oducción+de+especies+ eac i as+de+oxígeno+(ROS)+
La! gene ación! de!especies! eac i as! de! oxígeno,! conocida! como! “explosión!
oxida i a”,! es! uno! de! los! p ime os! e en os! que! ocu e! as! la! pe cepción! del!
pa ógeno!(To es,!Jones!e !al.!2006).!Las!ROS!incluyen!el! adical!supe óxido!(O2S),!
el!pe óxido!de!hid ógeno!(H2O2)!y!el! adical!hid oxilo!(OHS).!En!condiciones!de!
no!in ección!las!ROS!se!p oducen!a!bajas!concen aciones!en! oda!la!plan a!como!
subp oduc os!de!di e sas! ías!me abólicas.!Sin!emba go!a!los!dos!o! es!minu os!
de!la!in ección!po !pa ógenos!la!p oducción!de!ROS!aumen a!conside ablemen e!
en!la!célula!y!! iene!luga !lo!que!se!ha!llamado!“explosión!oxida i a”.!La!p incipal!
enzima! esponsable!de!la!p oducción!de!ROS!en!la!célula! as!la!pe cepción!del!
pa ógeno!es!la!NADPH!oxidasa!de!memb ana!RbohD!(Zhang,!Shao!e !al.!2007).!
Las! p o eínas! NADPH! oxidasas! de! plan as! es án! o madas! po ! 6! dominios!
ansmemb ana!y!un!dominio!NS e minal!que!posee!dos!manos!EF,!sugi iendo!
una! egulación!po !Ca2+.!!
La!gene ación!de!especies! eac i as!de!oxígeno!en!la!célula! ege al!en! espues a!
a!la!in ección!po !pa ógenos!es!bi ásica!y!ambas! ases!son!dependien es!de!la!
enzima!RbohD.!En!la!p ime a! ase!la!acumulación!de!ROS! iene!dada!po !un!pico!
con!baja!ampli ud!y!de!poca!du ación,!y!en!la!segunda! ase!el!pico!posee!una!
mayo ! magni ud!y!du ación.! P obablemen e! el! p ime ! pico! sea! debido! a! la!
espues a! PTI! y! el! segundo! al! econocimien o! especí ico!de! los! e ec o es!
pa ogénicos!(To es,!Jones!e !al.!2006).!!
In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
21!
I.+3.2. Óxido+ní ico+(NO)+
El!óxido!ní ico!es á!in oluc ado!en!nume osos!p ocesos!du an e!el!ciclo! i al!de!
las! plan as.! In e iene! en! el! c ecimien o! y! la! di e enciación! celula ,! en! la!
es imulación!de!la!ge minación!de!las!semillas,!en!el!c ecimien o!de!la! aíz,!en!la!
madu ación! del! u o,! en! el! cie e!es omá ico! y! la! senescencia! (Wendehenne,!
Du ne !e !al.!2004).!Además!exis en!nume osas!e idencias!que!indican!que!el!NO!
u!o os!me aboli os! elacionados!con!el!NO,! ales!como!los!SSni oso ioles,!juegan!
un!impo an e!papel!en!las! ías!de!señalización!iniciadas! as!la!pe cepción!del!
pa ógeno!(Hong,!Yun!e !al.!2008).!Así!po !ejemplo!se!ha!desc i o!que!el!NO!es!
esencial!pa a!que!se!p oduzca!la!HR!inducida!po !pa ógenos!(Yoshioka,!Asai!e !al.!
2009).! Además,! muchos! genes! de! de ensa! ales! como! el! que! codi ica! pa a! la!
enilalanina! amino! liasa! (PAL),! glu a ión! SS ans e asa! (GST)!y! p o eínas!
elacionadas! con! la! pa ogénesis! (PR)! son! inducidos! po ! la! adminis ación! de!
donado es!de!NO!(Du ne ,!Wendehenne!e !al.!1998).!
I.+3.3. MAPKKKs+
Las!cascadas!de!ac i ación!po !MAPKs!son!muy!comunes!en!euca io as!y! ienen!
una! g an! impo ancia! en! la!pe cepción,! p ocesamien o,! aducción! y!
ampli icación! de! señales! in a! y! ex acelula es.! Como! esquema! gene al,! la!
cascada!MAPK!comienza!con!la! os o ilación!y!ac i ación!de!la!p o eína!MAPKKK!
que!pos e io men e! os o ila!y!ac i a!a!una!MAPKK,!la!cual!hace!lo!mismo!con!
una! MAPK.! Po ! úl imo! és a!MAPK! os o ila!y! ac i a!a! o as! p o eínas!de! la!
señalización! ansmi iendo!la!señal!agua!abajo.!Se!ha!desc i o!que!las!p o eínas!
de!A abidopsis!A MAPK6,!3!y!4!se!ac i an!en! espues a!a!una!g an! a iedad!de!
es ímulos!di e en es.!Po !lo! an o!se!pos uló!que!la!cascada!MAPK!apa ece!como!
un! pun o! de! con e gencia! en! la! señalización! a! di e en es! ipos! de! es eses!
(Pedley!and!Ma in!2005).!
En! la! in e acción! plan aSpa ógeno! se! han! desc i o! mul i ud! de! e idencias! que!
apun alan!la!impo ancia!de!las!cascadas!MAPK!en!las! espues as!de ensi as.!Así!
po !ejemplo!la!pe cepción!de! lg22!da!luga !a!la!ac i ación!de!la!cascada!MAPK!
en!la!que!pa icipan!MEKK1!(MAPKKK),!MAPKK4/5!y!MAPK3/4!(Asai,!Tena!e !al.!
2002).!
In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
28!
S Di e encias!en!la!in e acción!y!ac i ación!de!los!complejos!
O o! aspec o! que! pe mi e! aumen a ! la! especi icidad! de! la! espues a! es! la!
di e en e! in e acción! en e! miemb os! de! la! amilia! de! las! p o eínas! CBLs! con!
CIPKs.!Median e!análisis!de!doble!híb ido!se!ha!comp obado!que,!al!menos!en!
le adu as,!las!CBLs!no!in e accionan!con! odas!las!CIPKs!y! ice e sa!(Alb ech ,!
Ri z! e ! al.! 2001).! Es as! mismas! obse aciones! se! han! con i mado! en!
expe imen os!in1 i o.!Es os! esul ados!sugie en!que!uno!de!los!mecanismos!que!
gene a!especi icidad!espacial!y! empo al!en!la!señalización!a!Ca2+!es!la!di e en e!
a inidad! de! in e acción! que! p esen an! en e! sí! las! CBLs! y! las! CIPKs.! Es as!
di e encias!da án!luga !a!la! o mación!de!di e en es!complejos!en!la!plan a.!
También!se!ha!podido!comp oba !que!el!dominio!quinasa!pa ece! ene !un!papel!
impo an e! en! la! es abilización! y! en! la! especi icidad! de! la! in e acción.! Así,!
median e!análisis!de!doble!híb ido!se! io!que!A CBL3!puede!in e acciona !con!el!
dominio! egulado !de!A CIPK6!y!A CIPK5!(Kim,!Cheong!e !al.!2000).!Sin!emba go,!
cuando! se! emplea on! las! p o eínas! in eg as,! sólo! A CIPK6! in e accionaba! con!
A CBL3!en!le adu as.!También!se!obse ó!que!la!p o eína!quimé ica!A CIPK5/6!
(dominio!quinasa/dominio! egulado )!no!e a!capaz!de!in e acciona !con!A CBL3,!
indicando! una! in luencia! nega i a! del! dominio! quinasa! de! A CIPK5! en! la!
in e acción!(Kim,!Cheong!e !al.!2000).!
S Di e encias!en!la!ac i ación!de!p o eínas!dianas!
La! o mación! conc e a!de! de e minados! complejos! CBL/CIPKs! da! luga ! a! la!
in e acción! especí ica! con!p o eínas! dianas! y! cons i uye! el! úl imo! aspec o! que!
ayuda ía!a!gene a !especi icidad!en!la! espues a!de!la!señalización!a!Ca2+.!Así!po !
ejemplo!A CIPK1!es! egulada!de!di e en e!mane a!po !dos!A CBLs.!Mien as!que!
la!in e acción!de!A CBL1!con!A CIPK1!es!impo an e!en!la! egulación!de!p ocesos!
aguaSabajo!du an e!la!señalización!a!es és!salino,!el!complejo!A CBL9/A CIPK1!
media!la! espues a!a!ABA!(Cheong,!Pandey!e !al.!2007)!y!(Pandey,!Cheong!e !al.!
2004).!De!igual! o ma!se!ha! is o!que!A CBL1!y!A CBL9!ac i an!a!A CIPK23!con!la!
consecuen e! os o ilación!de!AKT1,!mien as!que!A CBL5!y!A CBL8,!que! ambién!
o man!complejo!con!A CIPK23,!no!son!capaces!de!ac i a !a!AKT1!(Xu,!Li!e !al.!

In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
29!
2006).! Es o! implica! que! la! in e acción! de! las! CIPKs! con! las! CBLs! modula! la!
especi icidad!de!unión!a!las!dianas!de!CIPKs.!
I.+5.Uni e sal*s ess*p o ein+(Usp)+
En!un!es udio! ecien e! ealizado!en!nues o!labo a o io!se!iden i icó!la!p o eína!
SlRD!como!diana!de! os o ilación!de!la!quinasa!SlCIPK6.!La!compa ación!de!la!
secuencia! de! aminoácidos!de! es e! clon!con! las! secuencias! deposi adas! en! las!
bases!de!da os! e ela on!que!SlRD! iene!una! al a!homología!con!la! amilia!de!
p o eínas!UspA!(Uni e sal1s ess1p o ein1A).!
Uni e sal1 s ess1 p o eína1A1 (UspA)! ue! el! nomb e! que! se! le! dio! a! la! p o eína!
inicialmen e! conocida! como! C13.5,! ya! que! se! su! exp esión! e a! ue emen e!
inducida!po !una!g an! a iedad!de!es ímulos!(VanBogelen,!Hu on!e !al.!1990).!
En!1992!se!clonó!el!gen!y!pos e io men e! ue! egis ado!como!dominio!(P am!
núme o!de!acceso!PF0582).!Has a!el!momen o!se!han!iden i icado!más!de!2000!
p o eínas!que!con ienen!el!dominio!Usp!y!que! o man!pa e!del!genoma!de!una!
g an! a iedad!de!o ganismos! ales!como!bac e ias,!a queas,!hongos,!p o ozoos!y!
plan as!(A a ind,!Anan ha aman!e !al.!2002).!
Los! genes! usp1 pueden! codi ica ! a! p o eínas! con! di e en e! amaño! y! di e en e!
ca ga!de!dominios!Usp.!Pueden!da !luga !a!pequeñas!p o eínas!con! an!solo!un!
dominio,!a!p o eínas!de!mayo ! amaño!y!con!dos!dominios!dispues os!en! anden!
o!po !úl imo!codi ica !a!p o eínas!de!mayo !complejidad!y!con! a ios!dominios!
uncionales! siendo! uno! de! ellos! el! Usp.! El! genoma! de! E.1 coli!codi ica! a! seis!
p o eínas!Usps!di e en es!denominadas!UspA,!UspC,!UspD,!UspE,!UspF!y!UspG!y!
di ididas!en!cua o!clases!en!base!a!la!simili ud!del!dominio!Usp.!!UspA,!UspC!y!
UspD!!pe enecen!a!la!clase!I!mien as!que!UspF!y!UspG!pe enecen!a!la!clase!II!
(Figu a!I.6).!La!UspE!es!una!p o eína!con!dos!dominios!Usp! epe idos!en! anden!
que!pa ece!se !el! esul ado!de!una!duplicación!génica.!Po !una!pa e!el!dominio!2!
de! la! UspE! se! encuen a! ilogené icamen e! mas! elacionado! con! la! sub amilia!
UspFG!y!pe enece!a!la!clase!IV!mien as!que!el!dominio!1!es á!mas! elacionado!
con!la!sub amilia!UspA!y! o ma!pa e!de!la!clase!III.!
!
In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
30!
!
!
!
!
!
!
!
!
El!gen!UspA!es!el!mejo !ca ac e izado!de!la! amilia!Usp!de!E.1coli.!La!p o eína!se!
sin e iza!du an e!la! ase!es aciona ia!y!en! espues a!a!nume osos!agen es!que!
causan! inhibición! del! c ecimien o! (Nys om! and! Neidha d ! 1992).! El! mu an e!
uspA!de iene!su!c ecimien o!cuando!se!expone!a!di e sos!!agen es!de!es és!y!en!
condiciones!p olongadas!de!ausencia!de! uen e!de!ca bono.!Además!se!obse ó!
que!en!el!mu an e!el! iempo!de!exp esión!de!los!genes!de! espues a!a!hamb e!es!
di e en e!que!el!mos ado!en!el!sil es e,!dando!luga !a!un!di e en e!pa ón!en!la!
sín esis! de! p o eínas! (Nys om! and! Neidha d ! 1994).! Po ! o o! lado! la!
sob eexp esión! del! gen! UspA!gene a! cambios! en! el! pun o! isoeléc ico! (pI)! de!
de e minadas!p o eínas!po !lo!que!se!ha!pos ulado!que!pod ía!es a !in oluc ada!
en!las!modi icaciones!pos aduccionales!de!és as!(Nys om!and!Neidha d !1996).!!
Has a! el! momen o! se! han! iden i icado! una! se ie! de! ac o es! que! con olan! la!
exp esión!de!UspA!y!en e!las!que!se!encuen a!la!p o eína!FadR,!la!cual! ep ime!
su!exp esión!(K in ,!Hosbond!e !al.!2000).!FadR! iene!una!acción!dual,!po !una!
pa e!ac úa!como!un! ep eso !de!genes!in oluc ados!en!la!deg adación!de!ácidos!
g asos! (genes! ad)! y! po ! o a! pa e! ac úa! como! un! ac i ado ! de! los! genes!
in oluc ados!en! su!biosín esis!(genes! ab).!Al!igual! que!UspA,!los!genes! ad!se!
inducen!du an e!la! ase!es aciona ia!de!E.1coli,!lo!que!condujo!a!la!hipó esis!de!
que! el! aumen o! de! la! exp esión! de! UspA! en! las! condiciones! de! ! c ecimien o!
de enido!e a!debido!a!la!inac i ación!como! ep eso !de!FadR.!Sin!emba go!es a!
!"#$
!"#$%&'&
!"#$%&''&
!"#$%&'''&
!"#$%&'(&
Figu a+I.5:!Clasi icación+de+las+Usps+de+bac e ias+en+4+Clases.!Análisis! ilogené ico!de!las!seis!
p o eínas!Usps!p esen es!en!E.1coli.!Las!p o eínas!UspA,!UspD!y!UspC!pe enecen!a!la!clase!I,!UspF!
y! UspG! o man! la! clase! II,! el! p ime ! dominio! Usp! de! UspE! o ma! la! clase! III! y! po ! úl imo,! el!
segundo!dominio!Usp!de!UspE! o ma!la!clese!IV.!+
In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
31!
dependencia!solo! iene!luga !pa cialmen e.!El!papel!de!UspA!en!la!biosín esis!de!
ácidos!g asos!aún!no!es á!cla o!(Fa ewell,!Diez!e !al.!1996).!!
Además!uspA! ambién!pa ece!se !que!es! egulada!po !la!p o eínas!F sK!y!RecA.!
La! p o eína! F sK! se! enca ga! de! coo dina ! la! sepa ación! de! los! c omosomas!
du an e!la!di isión!celula !y!en!donde!la!pa e!ci oplasmá ica!CS e minal!de!la!
p o eína!juega!un!impo an e!papel.!(Aussel,!Ba e!e !al.!2002).!Las!cepas!de!E.1
coli!que!ca ecen!de!es e!ex emo!dan!luga !a!una!supe inducción!del!gen!uspA!y!
de!los!genes!implicados!en!la! espues a!SOS.!La! espues a!SOS!es!un!sis ema!que!
con iene!la!bac e ia!pa a!p o ege la!de!agen es!que!causan!daños!en!el!DNA!y!en!
la!que!pa icipan!las!p o eínas!RecA!y!LexA.!La!inducción!de!uspA!en!el!mu an e!
sK!es!dependien e!únicamen e!de!RecA!y!no!de!LexA.!Tan o!el!mu an e! sK!con!
el!uspA!mues an!una! ue e!inhinibición!del!c ecimien o!en!con ac o!con!luz!U.V!
y!mi omicina!C,!dos!agen es!que!dan!luga !a!daños!en!el!DNA.!Po !es e!mo i o!se!
pos uló! que! el! gen!UspA1 e a! eque ido! pa a! la! esis encia! al! daño! del! DNA! y!
egulada!po !una! ía!dependien e!de!las!p o eínas!RecA!y!F sK!(Diez,!Gus a sson!
e !al.!2000).!!
En!un!es udio! ecien e!se!ha!demos ado!que!la!es abilidad!del!mRNA!de!uspA!
disminuye!d ás icamen e!en!el!mu an e!ΔcspC!ΔcspE!y!aumen a!en!la!cepa!que!
sob eSexp esa!CspC.!Las!p o eínas!CspC!y!CspE!son!homólogas!a!la!p o eína!CspA!
(cold.shock1p o ein)!que!se!exp esan!de! o ma!cons i u i a!a!37ºC!(Phad a e!and!
Inouye! 2001).! Tan o! CspC! como! CspE! ! acili an! un! en o no! idóneo! pa a! la!
exp esión!de!uspA,!pe o!no!es án!implicados!en!su!inducción.!
Se! ha! desc i o! que! UspA! es! os o ilada! en! esiduos! de! se ina! o! eonina! en!
espues a!a!agen es!que!causan!inhibición!del!c ecimien o!(F ees one,!Nys om!
e ! al.! 1997).! Inicialmen e! se! iden i icó! como! una! p o eína! con! capacidad! de!
au o os o ilación,!sin!emba go!pos e io men e!se!desc ibió!que!la! os o ilación!
es! dependien e! de! la! os op o eína! ibosomal! TypA! (F ees one,! T inei! e ! al.!
1998).! Se! ha! pos ulado! que! es a! modi icación! pos aduccional! ac úa! como! un!
in e up o !lo!cual!ac i a!a!UspA!pa a!lle a !a!cabo!su! unción!biológica.!
En! 1998! se!ob u o! el! c is al! de! la!p o eína! con! dominio! UspA! MJ0577! de! la!
bac e ia! Me hanococcus1 jannaschii!(Za embinski,! Hung! e ! al.! 1998).!
In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
32!
So p enden emen e!la!p o eína!c is alizó!en! o ma!de!homodíme os!y!con!una!
molécula! de! ATP! unido! a! cada! monóme o.! Median e! análisis! bioquímicos!
pos e io es!se!obse ó!que!aunque!MJ0577!se!pu i icaba!con!ATP!unido,!és a!e a!
incapaz!de!hid oliza la.!El!p ocesamien o!del!ATP!solo! enía!luga !en!p esencia!
de! una! p o eína! desconocida! p esen e! en! el! ex ac o! c udo! celula ! de! M.1
jannaschii,! po ! lo! que! se! sugi ió! que! la! unción! biológica! de! MJ0577! e a!
dependien e!de!su!capacidad!de!unión!a!ATP!(Za embinski,!Hung!e !al.!1998).!
Pos e io men e!se!c is alizó!la!UspA!de!Haemophilus1in luenzae,!la!cual!compa e!
un!68%!de!simili ud!con!la!UspA!de!E.1coli!(Sousa!and!McKay!2001).!A!di e encia!
de!MJ0577!es a! ez!la!p o eína!no!se!pu i icó!con!ATP!unido.!Es os! esul ados!
die on!pie!a!suge i !la!exis encia!de!dos!clases!di e en es!den o!de!la! amilia!de!
p o eínas!con!dominio!Usp:!aquellas!que!unen!ATP!y!se!asemejan!a!MJ0577!y!las!
que!no!lo!unen!y!es uc u almen e!se!asimilan!a!HiUspA.!!
Aunque! exis e! una! cie a! conse ación! en! los! aminoácidos! p esen es! en! los!
mo i os!de!unión!a!ATP!en e!EcUspA!y!MJ0577!se!obse ó!que!ha! enido!luga !
la! sus i ución! de! esiduos! de! glicina! po ! glu amina! y! me ionina! en! el! lazo! de!
unión!al! i os a o.!Median e!alineamien os!múl iples!con!o os! o ganismos!se!
llegó! a! la! conclusión! que! el! mo i o! cuya! secuencia! co esponde! a! GS2XSGS9X!
(S/T)!es!un!elemen o!esencial!pa a!la!unión!a!ATP!y!en!el!que!las!glicinas!127!y!
141!de!MJ0577!son!sus i uidas!po !glu amina!y!me ionina!en!la!UspA!de!E.1coli!
(Sousa!and!McKay!2001)En! unción!a!es os!da os!se!!concluyó!que!la!p esencia!
de! esiduos! oluminosos! en! los! mo i os! de! unión! a! ATP! impiden! la! unión! al!
nucleó ido.! O os! esiduos! conse ados! y! que! in e ac úan! con! la! molécula! de!
ATP! en! la! p o eína! MJ0577! es! el! aspa a o! en! la! posición! 13! y! la! alina! 41!
(Za embinski,!Hung!e !al.!1998).!!
En!plan as!se!han!desc i o!nume osas!p o eínas!con!dominio!Usp!que! esponden!
a!una!g an! a iedad!de!es ímulos!di e en es.!Sin!emba go!has a!el!momen o!no!
se!ha!desc i o!el!modo!exac o!de!ac uación!de!ninguna!de!ellas.!Así!po !ejemplo!
Ke k!y!colabo ado es!en!el!año!2003!iden i ica on!44!p o eínas!en!A abidopsis!
con! simili ud! al! dominio! UspA! de! bac e ias.! El! alineamien o! múl iple! de! las!
secuencias!iden i icadas!mos ó!que! odas!de i an!de!la!p o eína!MJ5077!de!M.1
jannaschii!(Ke k,!Bulg ien!e !al.!2003).!Algunas!de!ellas!han!sido!es udiadas!con!
In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
33!
mayo ! p o undidad.! Así! po ! ejemplo! las! p o eínas! A 5g54430! (A PHOS32)! y!
A 4g27320!(A PHOS34)!son! os o iladas!en! espues a!a!elici o es!mic obianos!en!
células! de! A abidopsis!y! además! A PHOS23! es! capaz! de! in e acciona ! con!
A MPK3! y! A MPK6! (Me kou opoulos,! And easson! e ! al.! 2008).! En! un! es udio!
pos e io ! se! io! que! A 2g03720! es aba! in oluc ada! en! la! mo ogénesis! de! las!
aíces! aé eas! (Jones,! Raymond! e ! al.! 2006)!y! que! el! gen! A RD2! se! inducía!
ue emen e! en! espues a! al! a amien o! de! deshid a ación! (YamaguchiS
Shinozaki,!Koizumi!e !al.!1992).!
No!solo!en!A abidopsis!se!han!iden i icado!p o eínas!con!dominio!Usp.!En!el!año!
2000!Hohnjec!y!colabo ado es!demos a on!que!la!p o eína!V ENOD18!de!Vicia1
aba!es aba!implicada!en!la! o mación!de!nódulos!en!la! aíz!y!que!además!e a!
capaz! de! uni ! ATP,! p ime a! e idencia! de! la! unión! al! nucleó ido! en! plan as!
(Becke ,!Mo ei a!e !al.!2001).!Al!mismo! iempo!se!iden i ica on!los!genes!ER6!de!
oma e!y!OsUSP1!de!a oz!en! espues a!a!la! i oho mona!e ileno!(Zegzou i,!Jones!
e !al.!1999)!y!(Sau e ,!Rzewuski!e !al.!2002).!Además!de!A RD2!en!A abidopsis!se!
iden i ica on! a ios!genes!que! esponden!a!desecación,!como!po !ejemplo!GUSP1!
y!GUSP2!de!Gossypium1a bo eum!(Zahu ,!Maqbool!e !al.!2009).!En!el!mismo!año!
se! ealizó!un!análisis! uncional!del!p omo o !de!GUSP!de!algodón!y!se!comp obó!
que!es e! espondía!a!sequía,!ABA,!sal,!me ales!pesados,!gibe elina!y!oscu idad!
(Zahu ,!Maqbool!e !al.!2009).!
La!supe amilia!UspA!se!encuen a!ex ensamen e! ep esen ada,!sin!emba go!su!
unción!biológica!exac a!se!desconoce.!Se!ha!pos ulado!que! an o!la!unión!a!ATP!
como!su! os o ilación!son!impo an es!pa a!su! unción!(F ees one,!Nys om!e !al.!
1997)!y! (Za embinski,! Hung! e ! al.! 1998).! Al! no! posee ! ac i idad! enzimá ica!
in ínseca!se!ha!suge ido!que!su!papel!biológico!depende!de!la!in e acción!con!
una!segunda!p o eína,!en e!las!que!pod ía!es a !una!ATPasa!(Za embinski,!Hung!
e !al.!1998).!Po !ello!no!es!de!ex aña !que! ambién!el!dominio!Usp!se!encuen e!
o mando!pa e!de!p o eínas!de!mayo !complejidad!que!posean!o os!dominios!
uncionales.!Así!po !ejemplo!en!A abidopsis!exis en!22!p o eínas!quinasas!que!
con ienen! además! un! dominio! UspA! en! su! secuencia.! El! sis ema! mejo !
ca ac e izado!es!el!de!la!p o eína!quinasa!KdpD!de!E.1coli,!en!el!que!la!unión!del!

In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
34!
ligando!a! a és!de!su!dominio!UspA!da!luga !a!un!cambio!con o macional!que!
a ec a!a!la!ac i idad!quinasa!(Hee mann,!Webe !e !al.!2009).!
!
+ +
In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
35!
Bibliog a ía+
Alb ech ,!V.,!O.!Ri z,!e !al.!(2001).!"The!NAF!domain!de ines!a!no el!p o einS
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RNA!syn he ase,!USPA,!ETFP,!pho olyase,!and!PPSATPase!nucleo ideS
binding!domains:!implica ions! o !p o ein!e olu ion!in! he!RNA."!
P o eins!48(1):!1S14.!
Asai,!T.,!G.!Tena,!e !al.!(2002).!"MAP!kinase!signalling!cascade!in!A abidopsis!
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Aussel,!L.,!F.!X.!Ba e,!e !al.!(2002).!"F sK!Is!a!DNA!mo o !p o ein! ha !ac i a es!
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!
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In oducción!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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46!
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Obje i os!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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47!
Obje i os* *
Obje i os!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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48!
* *
Obje i os!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
!
49!
Obje i os*!
En! nues o! labo a o io! se! ha! desc i o! que! la! pé dida! de! unción!de! SlCBL10!y!
SlCIPK6!inhibe!e en os!de!PCD!asociados!a!la! espues a!ETI!y!de!suscep ibilidad!
causadas!po !la!bac e ia!pa ógena!Ps 5DC3000!en!N.5ben hamiana!y! oma e.!Sin!
emba go! las! dianas! a! las! que! se! une! SlCIPK6! pa a! media ! la! espues a! a! la!
in ección! po ! pa ógenos! se! desconocen.! Po ! ello! en! nues o! labo a o io! se!
ealiza on! dos!esc u inios! de! doble! híb ido! con! el! in! de!iden i ica ! posibles!
p o eínas! egulado as!de!la!ac i idad!y/o!dianas!de! os o ilación!de!SlCIPK6.!De!
los! 50! in e ac o es! inicialmen e! iden i icados! en! el! doble!híb ido!se! ealizó!un!
segundo! esc u inio! median e! ecnología! VIGS! en! plan as! de! oma e! con! el!
obje i o!de!selecciona !aquellos!que!es u ie an!implicados,!al!igual!que!SlCIPK6,!
en!suscep ibilidad.!Finalmen e!de!los!20!clones!que!se!encon aban!in oluc ados!
en!la! espues a!suscep ible!se!seleccionó!CIP29!pa a!su!pos e io !ca ac e ización!
en!de alle.!CIP29!p esen ó!una!al a!homología!a!la!p o eína!A RD2!de!A abidopsis!
po !lo!que!se!le! enomb ó!como!SlRD.!
A!con inuación!se!de allan!los!obje i os!gene ales!de!cada!uno!de!los!capí ulos!en!
los!que!se!encuen a!di idido!el!p esen e! abajo!de! esis:!
1. El! capí ulo! 1! se! cen ó! en! la! ca ac e ización! inicial! de! SlCBL10! y! SlCIPK6!
Solanáceas.!
!
2. En! el! capí ulo! 2! el! obje i o! p incipal! ue! la! iden i icación! de! p o eínas!
in e ac o as!de!SlCIPK6!implicadas,!al!igual!que!la!quinasa,!en!inmunidad.!
!
3. El!capí ulo!3!se!dedicó!a!la!ca ac e ización!en!de alle!de!SlRD,!la! diana! de!
SlCIPK6!seleccionada!p e iamen e.!
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!

Obje i os!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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50!
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Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
51!
Capí ulo)1:))
Ca ac e ización)molecula )de)
SlCBL10)y)SlCIPK6) )
Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
!
52!
) )
Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
53!
Resul ados)
)
1.1. Análisis)de)la)exp esión)génica)de)SlCIPK6)y)SlCBL10)en) oma e)
Como!p ime a!ap oximación!a!la!ca ac e ización!molecula !de!SlCIPK6!y!SlCBL10!
se!analizó!la!acumulación! ansc ipcional!median e!PCR!a! iempo! eal,!u ilizando!
pa a!ello!oligonucleó idos!especí icos!pa a!cada!uno!de!los!genes,!así!como!pa a!
el!gen!de!la!ac ina!(u ilizado!como!con ol!endógeno!de!la!exp esión).!
Se! ha! ca ac e izado! el! pa ón! en! la! acumulación! de! ansc i o! de! SlCIPK6!y!
SlCBL10!en! oma e! du an e! la! espues a! ETI!y! suscep ible!desencadenada! po !!
Ps !DC3000,!en!los!dis in os!es adios!de!desa ollo,!en! espues a!al! a amien o!
con! clo u o! sódico! y! con! mani ol! (choque!osmó ico)! y! al! a amien o! con!
dis in as!ho monas! ege ales!mediado as!de!la! espues a!de!de ensa!de!la!plan a.!!
1.1.1. Acumulación!de! ansc i o!en!di e en es! ejidos!
Tan o!NbCIPK6!como!NbCBL10!se!iden i ica on!en!un!esc u inio!median e!VIGS!
(Vi us?Induced?Gene?Silencing)! ealizado!en!hojas!de!N.+ben hamiana,!po !lo! an o!
e a!impo an e! e i ica !su!exp esión!en!hojas!y,!po !ex ensión,!!en!o os! ejidos!
de! oma e.!!
En!la! igu a!1.1!se!ap ecia!como!el! ansc i o!de!SlCIPK6!y!SlCBL10!se!acumula!en!
odos!los! ejidos!analizados.!Los!ni eles!de!mensaje o!en!la! aíz!y!en!el! allo!de!
SlCIPK6!y!SlCBL10!con as a!con!la!le e!acumulación!de! ansc i o!en!la! aíz!y!su!
ele ada! exp esión! en! el! allo! de ec adas! en! sus! o ólogos! A CBL10!y! A CIPK6+
(Quan,!Lin!e !al.!2007)!y!(T ipa hi,!Pa asu aman!e !al.!2009).)Las!di e encias!en!el!
pa ón! de! acumulación! de! ansc i o!de! SlCBL10!y! SlCIPK6!en! los! ejidos!
analizados!pod ían!explica se!po !una!di e gencia! uncional!adqui ida!du an e!
la!e olución.!
!
!
!
Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
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60!
median e!mic oscopía!con ocal.!La!p o eína!de! usión! SlCBL10[GFP!se!localiza!
p incipalmen e!en!la!pe i e ia!celula !como!se!puede!obse a !en!la! igu a!1.6.!
Es a!localización!pod ía!se !ci oplasmá ica!o! onoplas ídica!ya!que!se!desca ó!la!
localización! en! la! memb ana! plasmá ica! al! no! colocaliza ! con! el! ma cado ! de!
memb ana! FM4[64!( igu a! 1.6.C).! A! di e encia! de! la! localización! is a!pa a! su!
o ólogo! en! A abidopsis!po ! Quan! y! colabo ado es,! que! desc ibie on!que!
A CBL10!in e accionan!con!A CIPK24!(SOS2)!en!la!memb ana!plasmá ica!(Quan,!
Lin!e !al.!2007).!Se!pod ía!conside a !que!SlCBL10!se!localiza!p incipalmen e!en!
el! onoplas o!en! las! condiciones! ensayadas! ya! que! an o! las!in aginaciones!
in acelula es! como! el! bolsillo! nuclea ! obse ado! en! la! igu a!1.6.A!son!
ca ac e ís icos! de! una! localización!en! la! memb ana! onoplas ídica.! Es a!
localización! obse ada! pa a! SlCBL10[GFP! es! simila ! a! la! desc i a! pa a! su!
o ólogo!en!A abidopsis!po !Kim!y!colabo ado es!(Kim,!Waad !e !al.!2007).!
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Figu a) 1.6:!Localización) in acelula ) de) SlCBL10XGFP) en) células) epidé micas) de) N..
ben hamiana.)A))Localización!subcelula !de!SlCBL10[GFP!( e de).)B))Fluo escencia!de i ada!del!
ma cado !de!memb ana!FM4[64!( ojo).)C))Colocalización!de!A!y!B.)!La!cons ucción!SlCBL10[GFP!
en! el! ec o ! pBIBA7! se! exp esó! de! o ma! ansi o ia! en! hojas! de! N.+ ben hamiana! ía!
Ag obac e ium.!Pasados!dos!días!se! isualizó!la!exp esión!en!un!mic oscopio!con ocal.!Las! lechas!
mues an!la!localización!obse ada!pa a!SlCBL10[GFP.!)
!" #"
!"#$!!
!"#$!!
$"

Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
61!
Pos e io men e,! pa a! con i ma ! los! esul ados! obse ados! en! hojas! de! N.+
ben hamiana,!se! ealizó!un!ensayo!de!localización!celula !en!células!de!epi elio!
de!cebolla!median e! bomba deo!de! pa ículas!de! o o.!Pa a!ello!se! clonó!en! el!
ec o ! pGEM[T! el! agmen o!comp endido! desde! el! p omo o ! 35S! has a! el!
e minado !OCS!de!la!cons ucción!SlCBL10[GFP!en!pBIBA7.!!
Como!mues a!la! igu a!1.7,!SlCBL10!se!localiza!p incipalmen e!en!la!memb ana!
acuola .!La!localización! onoplas ídica!es!ca ac e izada!po !un!ensanchamien o!
de!la!memb ana!plasmá ica!y!de!la! acuola!en!aquel!luga !donde!se!localiza!el!
núcleo! y! que! es! obse ado! de! nue o! en! es e! ensayo! ( lecha! igu a! 1.7.B).! Los!
esul ados! ob enidos! se! asemejan!al! is o! pa a! su! o ólogo! po ! Kim! y!
colabo ado es,! en! el! que! A CBL10! p esen a! ambién! una! localización!
onoplas ídica!(Kim,!Waad !e !al.!2007).!!
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Figu a)1.7:!Exp esión) ansi o ia)de)SlCBL10)en)células)epi eliales)de)cebolla,) isualizada)
median e)mic oscopía)de) luo escencia.)!A)!Localización!de!SlCB10[GFP!en!la!células!epi elial!
de! cebolla.! B)!Aumen o! de! la! zona! de! in e és! de! A.! C)!Imagen! de! campo! cla o! de! B.! La!
cons ucción! SlCBL10[GFP! en! el! ec o ! pGEM[T! se! exp esó! de! o ma! ansi o ia! en! células! de!
epi elio!de!cebolla!median e!bomba deo!con!pa ículas!de!o o.!Pasadas!48!ho as!se! isualizó!la!
exp esión! en! un! mic oscopio! de! luo escencia.! ! La! luo escencia! de! GFP! se! concen ó! en! la!
memb ana! acuola ,!que!sigue!al!con o no!celula !excep o!en!aquel!luga !en!el!que!se!encuen a!
el!núcleo,!donde!se!ensancha!(mos ado!con!una! lecha).!
Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
!
62!
Pa a!de e mina ! la! localización! subcelula ! de! SlCIPK6! en! hojas! de! N.+
ben hamiana!se!siguie on!las!mismas!pau as!que!en!el!caso!de!SlCBL10[GFP!y!los!
esul ados!ob enidos!se!pueden!obse a !en!la! igu a!1.8.!
La!p o eína!SlCIPK6[GFP!se!localiza!p edominan emen e!en!la!pe i e ia!celula !
( igu a!1.8.A).!Podemos!desca a !la!localización!en!la!memb ana!plasmá ica,!ya!
que! no! se! ap ecia! un! solapamien o! con! el! ma cado ! de! memb ana! FM4[64.!
Además,! la! dis ibución! de! la! p o eína! de! usión! SlCIPK6[GFP! ( igu a!1.8.A,!
lechas! blancas)! no! mues a! un! g oso ! homogéneo!como! ocu e! con! SlCBL10[
GFP,!po !lo!que!se!pod ía!asumi !que!no!p esen a!una!localización! onoplas ídica.!
T as! desca a ! la! memb ana! plasmá ica! y! el! onoplas o! y! obse a ! que! la!
luo escencia! ocu e! en e! es as! dos! es uc u as! se! puede! a i ma ! que! la!
dis ibución!de!la!p o eína!de! usión!se!localiza!en!el!ci oplasma.!Así!mismo!en!la!
igu a!1.8.A!se!obse a!que!SlCIPK6!se!encuen a!en!el!núcleo.!
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!
Figu a) 1.8:!Localización) in acelula ) de) SlCIPK6XGFP) en) células) epidé micas) de) N..
ben hamiana.)A))Localización!subcelula !de!SlCBL10[GFP!( e de).)B))Fluo escencia!de i ada!del!
ma cado !de!memb ana!FM4[64!( ojo).)C)) Colocalización!de!A!y!B!La!cons ucción!SlCIPK6[GFP!
en! el! ec o ! pBIBA7! se! exp esó! de! o ma! ansi o ia! en! hojas! de! N.+ ben hamiana! ía!
Ag obac e ium.!Pasados!dos!días!se! isualizó!la!exp esión!en!un!mic oscopio!con ocal.!Las! lechas!
mues an!la!localización!obse ada!pa a!SlCIPK6[GFP)
!"#$%%
!"
#"
!&#$%%
$"
Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
63!
A! con inuación! se! lle ó! a! cabo! el! es udio! de! la! localización! celula ! !de!!!!!!!!
SlCIPK6[GFP!en!células!de!epi elio!de!cebolla.!La!p o eína!de! usión!SlCIPK6[GFP!
p esen a! una! localización! nuclea ! (1.9.B)! y! ci oplasmá ica! (1.9.C),! simila ! a! la!
obse ada!en!N.+ben hamiana.!La!g an! acuola!de!las!células!de!cebolla!deja!un!
pequeño!hueco!en!el!polo!celula !donde!se!encuen a!el!ci oplasma!y!se!puede!
ap ecia !y!di e encia !la!localización!de!p o eínas!ci oplasmá icas!median e!GFP.!
La!localización!en!el!ci oplasmas!y!núcleo!es!semejan e!a!la!obse ada!con!o o!
miemb o!de!la! amilia!de!las!CIPKs!en!A abidopsis!(Cheong,!Pandey!e !al.!2007).!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
1.3. Ca ac e ización) de) la) in e acción) SlCBL10/SlCIPK6) ) median e)
doble)híb ido)en)le adu as)
SlCBL10! y! SlCIPK6! se! iden i ica on! en! un! esc u inio! gené ico! median e!
silenciamien o!génico!inducido!po ! i us,!en!el!que!las!plan as!silenciadas!pa a!
cada! uno! de! los! genes!mos aban! una! inhibición! de!la!PCD! asociada! a! la! ETI!
Figu a)1.9:!Exp esión) ansi o ia)de)SlCIPK6)en)células)epidé micas)de)cebolla,) isualizada)
median e)mic oscopía)de) luo escencia.)A))Localización!de!SlCIPK6[GFP!en!la!célula!epi elial!
de!cebolla.!B!y!C)!Aumen o!de!las!zonas!de!in e és!de!A.!D!y!E)!Imagen!en!campo!cla o!de!B!y!C!
espec i amen e.! La! cons ucción! SlCIPK6[GFP! en! el! ec o ! pGEM[T! se! exp esó! de! o ma!
ansi o ia!en!células!de!epi elio!de!cebolla!median e!bomba deo!con!pa ículas!de!o o.!Pasadas!
48!ho as!se! isualizó!la!exp esión!en!un!mic oscopio!de! luo escencia.!!La! luo escencia!de!GFP!se!
concen ó!en!el!núcleo!(B,! lecha!blanca)!y!el!ci oplasma!(C,! lecha!blanca).!)
Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
!
64!
desencadenada! po !P o/A P o.! Ambas!p o eínas! pod ían!ac ua !en! el! mismo!
módulo!de!señalización!median e!su!in e acción.!Pa a!demos a !es o!se!lle ó!a!
cabo!un!ensayo!de!in e acción!median e!doble!híb ido!en!le adu as!basado!en!el!
sis ema! LexA! (Gyu is,! Golemis! e ! al.! 1993).! Pa a! ello! se! clona on! en! el! ec o !
pEG202! la! e sión! sil es e!de! SlCIPK6! y! una! e sión! mu an e! ca en e! del!
dominio!NAF,! esponsable!de!la!unión!a!las!CBLs!(SlCIPK6ΔNAF).!Po !o o!lado,!
en!el! ec o !pJG4[5!se!clonó!el!cDNA!co espondien e!a!SlCBL10.!Los!ensayos!de!
in e acción! se! ealiza on! en! la! cepa! de! S.+ ce e isiae!EGY48! y! los! esul ados!
ob enidos!se!mues an!en!la! igu a!1.10.!
!
!
!
!
!
!
!
!!
!
!
!
!
Según! es os! esul ados! SlCBL10! in e acciona! median e! doble! híb ido! con! la!
o ma!sil es e!de!SlCIPK6,!mien as!que!no!lo!hace!con!la! o ma!que!ca ece!del!
dominio! NAF! (necesa io! pa a!su! in e acción! con! la! CBL).! Análisis!p e ios!
Figu a)1.10:!Ensayo)de)doble)híb ido)en e!SlCIPK6)y)SlCBL10)en)le adu as.)A)!Ensayos!de!
doble! híb ido! ealizados! con! SlCIPK6! y! SlCIPK6ΔNAF! como! cebos! y! SlCBL10! como! p esa.)B)!
Wes e n?blo !que! con i ma! la! exp esión! en! le adu as! de! SlCIPK6! y! SlCBL10,! usando! como!
an icue pos! an i[LexA! y! an i[HA! espec i amen e.! La! cepa! de! le adu as! EGY48! se! usó! ! pa a!
comp oba !la!in e acción!en e!SlCIPK6!(clonada!en!el! ec o !pEG202)!y!SlCBL10!(clonada!en!el!
ec o !pJG4[5).!Los!ensayos!se! ealiza on!sob e!placas!que! ue zan!la!in e acción!(sin!LEU).!Los!
cul i os!se!hicie on!c ece !du an e! oda!la!noche!en!medio!mínimo!SD!(SD!Glu!–URA,![HIS!y!–
TRP),!se!diluye on!en!agua!es é il!y!se!semb a on!sob e!el!medio!co espondien e!a!una!DO600=!
0.1!y!0.01.!!
!
!"
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#$%&'()*+!," #$%-./0"
#$%-./0"
#$%&'()"
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123404"
153678"
135678"
#$%-./0"
9%:;<="9'>:?@=" 0A/" 0A0/"
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1200
3200
4400
!"#$%&',-./*0
!"#5-67,8*0
!,8*0
!,-./*0
9:0
50
Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
65!
median e!doble!híb ido!demos a on!que!cada!CBL!une!un!de e minado!núme o!
de!CIPKs! con! di e en e!a inidad!(Das! y!Pandey! 2010).! Pa a! comp oba ! que! la!
in e acción!SlCBL10/SlCIPK6!es!especí ica!se! ealizó!un!ensayo!de!doble!híb ido!
en e!SlCBL10!y!dos!miemb os!ce canos!de!la! amilia!de!las!CIPKs,!SlCIPK11!y!
SlCIPK14.! Como! se! mues a! en! la! igu a!1.11,! no! se! obse a! c ecimien o! en!
ninguno!de!las!dos!casos,!po !lo! an o!no!in e accionan!y!asumimos!que!!SlCBL10!
y!SlCIPK6!se!unen!de! o ma!especí ica.!
!
!!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
1.4. Gene ación) de) plan as) ansgénicas) ) que) sob eexp esan) SlCBL10)
en)N..ben hamiana)
Con! el! obje i o! de! in es iga ! la! unción! especí ica! de! SlCIPK6! y! SlCBl10! en!
Solanaceas,! se! gene a on! plan as! ansgénicas! pa a! ambos! genes! en! N.+
Figu a) 1.11:!Ensayo) de) doble) híb ido) en e!SlCPK11) y) SlCIPK14) y) SlCBL10) en) le adu as.)))))
A)!Ensayos!de!doble!híb ido! ealizados!con!SlCIPK11!y!SlCIPK14!como!cebos!y!SlCBL10!como!
p esa.)B)!Wes e n?blo !que!con i ma!la!exp esión!en!le adu as!de!SlCIPK11!y!SlCIPK14!y!SlCBL10,!
usando!como!an icue pos!an i[LexA!y!an i[HA! espec i amen e.!La!cepa!de!le adu as!EGY48!se!
usó!!pa a!comp oba !la!in e acción!en e!SlCIPK11!y!SlCIPK14!(clonadas!en!el! ec o !pEG202)!y!
SlCBL10! (clonada! en! el! ec o ! pJG4[5).! Los! ensayos! se! ealiza on! sob e! placas! que! ue zan! la!
in e acción!(sin!LEU).!Los!cul i os!se!hicie on!c ece !du an e! oda!la!noche!en!medio!mínimo!SD!
(SD! Glu! –URA,! [HIS! y! –TRP),! se! diluye on! en! agua! es é il! y! se! semb a on! sob e! el! medio!
co espondien e!a!una!DO600=!0.1!y!0.01.!!
)
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!*+,-."
34"
56"
76""
/"

Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
!
66!
ben hamiana.!Pa a!ello!se!emplea on!las!cons ucciones! ealizadas!en!el! ec o !
pBIBA7!( igu a!1.5)!que!es án! usionadas!a!GFP!y!bajo!el!p omo o !CaMV!35S.!
Como! con ol! expe imen al! se! ans o mó! el! ec o ! acío! pBIBA7.! La!
ans o mación! en! plan a! se! ealizó! median e! discos! de! N.+ ben hamiana! ía!
Ag obac e ium!(apa ado! 2.3! de! ma e iales! y! mé odos).! Inicialmen e! se!
ob u ie on! 25! ans o man es! pa a! SlCLB10,! 53! pa a! SlCBPK6! y! 15!pa a! GFP!
(F0).! Se! nomb ó! como! F0!a! la! gene ación! ob enida! di ec amen e! del! callo.! A!
con inuación,!pa a!con i ma !la!exp esión!del! ansgén,!se!analizó!la!F1!median e!
mic oscopía!con ocal.!T as!el!análisis!po !mic oscopía!se!con i mó!que!un! o al!
de! 7! plan as! sob e[exp esaban! SlCBL10,! 5!plan as! sob e[exp esaban! GFP! y!
ninguna!lo!hacía!pa a!SlCIPK6.!Ni!en!es a!p ime a! ans o mación!ni!en!los! es!
in en os!pos e io es!se!consiguió!ob ene !plan as!que!sob e[exp esa an!SlCIPK6[
GFP!de! o ma!es able.!Debido!a!es e! esul ado,!el!es udio!de!la!sob e[exp esión!
en!plan as!de!N.+ben hamiana!se!con inuó!exclusi amen e!con!SlCBL10.!
De! las! 7! plan as! que! inicialmen e! sob e[exp esaban! SlCLB10[GFP! se!
selecciona on!cua o!líneas!independien es!que!p esen aban!una!sola!inse ción!
del! ansgén! en!su! genoma.! Pos e io men e! se!ob u ie on! homocigo as!de! las!
líneas!1.1!y!6.5!de!SlCBL10[GFP.!Po !o o!lado!se!eligió!la!línea!homocigo a!2.4!de!
GFP!como!con ol!pa a!pos e io es!expe imen os.!A!con inuación!se!comp ob ó!
los! ni eles! de! p o eínas! pa a! cada! una! de! las! líneas! seleccionadas! median e!
wes e n?blo .!!Pa a!ello!se!ca ga on!30!μg!del!ex ac o!c udo!de!cada!una!de!las!
líneas!analizadas.!Los! esul ados!ob enidos!se!mues a!en!la! igu a!1.12.!
!
!
!
!
!
!
!
Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
67!
!
!
!
!
!
Como!mues a!la! igu a!1.12!los!ni eles!de!las!p o eínas!sob e[exp esada!!de!la!
línea! SlCBL10[GFP!6.5! son! le emen e! supe io es! a! los! mos ados! en! la! línea!
SlCBL10[GFP!1.1.!La! can idad! de! p o eína! ans e ida! a! la! memb ana! se!
cuan i icó!median e! inción!con! ojo!de!Ponceau!(paneles!in e io es! igu a!1.12).!
1.4.1. Sensibilidad! a! sal! de! las! plan as! ansgénicas! SlCBL10! en! N.+
ben hamiana!
En!A abidopsis,!la!pa icipación!de!A CBL10!en!es és!salino!se!encuen a!bien!
es ablecida.!El!mu an e!A cbl10!mues a!una! ue e!inhibición!en!el!desa ollo!
olia !cuando!el!medio!es!suplemen ado!con!100!mM!de!NaCl!(Quan,!Lin!e !al.!
2007).! Po ! es e! mo i o,! la! p ime a! ap oximación! que! se! ealizó! ue! p oba ! la!
esis encia!a!sal!de!las!líneas!sob e[exp eso as.!!!
Inicialmen e! se! obse ó! que,! en! condiciones! de! c ecimien o! de! día! la go,!no!
exis ían!di e encias!de!c ecimien o!en e!la!línea!GFP2.4!y!las!sob e[exp eso as!
de!SlCBL10[GFP.!A!con inuación!se! ealiza on!ensayos!de!ge minación!bajo!dos!
concen aciones!di e en es!de!NaCl,!50!y!100!mM.!Los! esul ados!ob enidos!se!
mues an!en!la! igu a!1.13.!!
!
Figu a)1.12:)Wes e n:blo )de)las)líneas)sob eXexp eso as)SlCBL10XGFP)1.1,)SlCBL10XGFP)6.5)
y)GFP)2.4.)Se)!Los!ni eles!de!las!p o eínas!sob e[exp esadas!se!cuan i ica on!median e!wes e n?
blo ,!usando!pa a!ello!el!an icue po!an i[GFP.!Se!ca ga on! es! éplicas!expe imen ales!idén icas.!
La! inción!con! ojo!Ponceau!(imágenes!in e io es)!mues an!la!can idad!de!p o eína! ans e ida!
en!cada!ensayo.!)
!"#$%&'()*+,-*
!"#$%&'()*.,.*
/0*
12*
'()*3,4*
54*
3+**
/0*
6&'()*
6&'()*
Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
!
68!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
En!gene al!la! elocidad!de!ge minación!en!los!medios!suplemen ados!con!NaCl!
de!las!plan as!sob e[exp eso as!SlCBL10[GFP! ue!mayo !que!la!obse ada!pa a!
las! plan as!con oles!(GFP!2.4).! En! condiciones! de! no! es és! la! elocidad! de!
ge minación!de! las! es! líneas! ansgénicas! no! mos ó! ninguna! di e encia!
conside able!( igu a!1.13.C,!O!mM).!!
Como!se!obse a!en!la! igu a!1.13.A,!en!el!medio!suplemen ado!con!50!mM!de!
NaCl,! la! elocidad! de! ge minación! de! SlCBL[GFP! 6.6! y! 1.1! ue!mayo ! que! la!
mos ada! po ! las! plan as!GFP! 2.4.! Al! cua o! día!de! la! exposición! al! es és!se!
p odujo!la!ge minación!del!100%!de!las!semillas!de! odas!las!líneas!empleadas!
en!el!expe imen o.!En! el!ensayo! ealizado!en! el!medio! suplemen ado!con!100!
mM!de!NaCl!la! di e encia! en! la! ge minación! en e! las! líneas! sob e[exp eso as!
pa a!SlCBL10[GFP!y!GFP! ue!mayo !( igu a!1.13.B).!Además!al!cua o!día!de!la!
exposición!del!es és!solo!se!p odujo!la!ge minación!del!20%!de!las!semillas!de!
Figu a)1.13:!Velocidad)de)ge minación)de)las)líneas) ansgénicas)SlCBL10XGFP1.1)y)6.5)y)
GFP) 2.4.) !A)!Ensayo!de!ge minación!en!p esencia!de!50!mM!de!NaCl!de!las!líneas! ansgénicas!
SlCBL10!1.1,!SlCBL10!6.5!y!GFP!2.4.!B)!Ensayo!de!ge minación!en!100!mM!de!NaCl!de!las!líneas!
ansgénicas!SlCBL10!1.1,!SlCBL10!6.5!y!GFP!2.4.!C)!Fo og a ía!del!ensayo!con ol!(0!mM!NaCl).!El!
expe imen o!se! epi ió!un!mínimo!de! es! eces.)
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Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
69!
la!plan a!con ol!GFP!2.4,!a!di e encia!de!los! esul ados!ob enidos!en!el!ensayo!
ealizado!con!50!mM!de!NaCl.!
Pa a!de e mina !si!el!aumen o!de!la!exp esión!de!SlCBL10!a ec a!al!desa ollo!de!
la! aíz!en!condiciones!de!es és!salino,!se! ealizó!un!ensayo!de! ans e encia!a!
medios! suplemen ados! con! di e en es! concen aciones! de! NaCl.! Pa a! ello,! las!
plán ulas!ge minadas!en!MS!con!cua o!días!de!edad!se! ans i ie on!a!medios!
suplemen ado! con! 0,! 50,! 100! y! 150! mM! de! NaCl.! Los! esul ados! ob enidos! se!
pueden!obse a !en!la! igu a)1.14.!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
Las! plan as! SlCBL10[GFP! 1.1! y! 6.5!en! N.+ ben hamiana!mos a on! di e encia!
signi ica i as!en!la!longi ud!de!las! aíces!en!el!medio!suplemen ado!con!100!mM!
de! NaCl! con! espec o! a! la! plan a! con ol! ( igu a! 1.14).! Sin! emba go! a!
concen aciones!meno es!o!mayo es!a!100!mM!no!se!ob u o!ninguna!di e encia!
conside able!en!la!longi ud!de!las! aíces..!!
Figu a)1.14:!Respues a)a)NaCl)de)las)plan as) ansgénicas)pa a)SlCBL10.)A)!Longi ud!de!las!
aíces!de!las!líneas!SlCBL10[GFP!1.1!y!6.5!y!GFP!2.4!en! espues a!a!0,!50,!100!y!150!mM!de!NaCl.!
B)!Fo og a ía! ealizada!a!los!nue e!días!de!la! ans e encia.!Cua o!días!después!de!la!ge minación!
en!medio!MS!sólido,!las!plán ulas!de!SlCBL[GFP!6.5,!1.1!y!GFP!2.4!se! ans i ie on!a!un!medio!
suplemen ado!con!0,!50,!100!y!150!mM!de!NaCl.!La!longi ud!de!la! aíz!se!midió!pasados!nue e!
días!de!la! ans e encia.!Al!expe imen o!se! epi ió!un!mínimo!de!4! eces.)
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Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
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76!
es és,!iniciando!una!cascada!de! os o ilación! as!la!unión!a!alguna!SlCBL!u!o o!
sus a o.!Po !o a!pa e,!el!papel!de!A CBL10!en!la! espues a!a!NaCl!en! aíz!es á!
muy!es udiado.!T as!la!pe cepción!del!es ímulo!se!p oduce!un! aumen o! en! la!
concen ación!de!calcio!ci osólico!que!ac i a!a!A CBL10!y! o ma,!pos e io men e,!
un!complejo!con!A CIPK24!en!el! onoplas o,!donde! anspo a!sodio!al!in e io !
de!la! acuola.!De!igual! o ma!SlCBL10!pod ía!ac ua !en!la!plan a!de! oma e!(Kim,!
Waad !e !al.!2007).!
En!conclusión,!los! esul ados!ob enidos!mues an!que!SlCIPK6!y!SlCBL10!inducen!
su! exp esión! en! espues a! a! pa ógenos,! ho monas! y! es eses! abió icos.! En!
algunos! de! los! a amien os! analizados! el! pa ón! de! exp esión! ob enido! pa a!
ambos! genes! no! es! el!mismo,! indicándonos! un!! iempo! de!ac uación!desigual.!
Es os! esul ados! se! pod ían! explica ! po ! la! posible! o mación! de! di e en es!
complejos!SCBL10/SlCIPK!o!SlCBL/SlCIPK6!en! espues a!a!los!dis in os!es eses!
u!ó ganos! ege ales.!
Localización)subcelula )en)N..ben hamiana)
Una! ez!es ablecido!el!pa ón!de!exp esión!de!SlCIPK6!y!SlCBL10!en! oma e!se!
p ocedió! a! es udia ! la! localización! subcelula ! de! ambas! p o eínas,! hecho!
impo an e!pa a!limi a !las!posibles! unciones!en!la!célula.!!
El!análisis!de!la!exp esión! ansi o ia!de!la! usión!SlCBL10[GFP! an o!en!células!
epidé micas! de! N.+ben hamiana!como! en! células! epi eliales! de! cebolla! e elan!
una! localización! onoplas ídica,! que! es! simila ! a! la! mos ada! pa a! su! o ólogo+
A CBL10!po !Kim!y!colabo ado es!(Kim,!Waad !e !al.!2007).!En!A abidopsis,!la!
dis ibución! celula ! de! las! CBLs! se! encuen a! elacionada! con! su! sepa ación!
ilogené ica!en!2!g upos!di e en es.!Mien as!que!A CBL2!y!A CBL10!(g upo!2)!se!
encuen an! localizadas!en! la! memb ana! acuola ,! A CBL1! y!A CBL9! (g upo! 1)!
es án! localizadas! en! la! memb ana! plasmá ica.! En! es e! úl imo! caso! las!
modi icaciones!lipídicas!son!impo an es!pa a!su!localización!(Ba is ic,!Waad !e !
al.! 2010).! Se! ha! comp obado! ! que! A CBL1,! A CBL4,! A CBL5! y! A CBL9! se!
me is oilan!en!su!ex emo!N[ e minal,!mien as!que!A CBL1!se!S[ace ila.!Po !o o!
lado! A CBL10! es! la! única! que! albe ga! un! dominio! ansmemb ana! en! su! N[
e minal! y! que! ambién! se! encuen a! p esen e! en! SlCBL10.! Es a! singula idad!

Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
77!
pa ece! se ! de e minan e! pa a! su! localización! en! la! memb ana! del! onoplas o!
(Ba is ic,! Waad ! e !al.! 2010).!Además! se! ha! demos ado! que! el! ex emo! N[
e minal!de!las!CBLs!es!impo an e!y!de e mina!su!dis ibución!espacial.!
Po ! o o! lado! la! usión! CIPK6[GFP! an o! en! células! epidé micas! de! N.+
ben hamiana+como!en!células!epi eliales!de!cebolla!mos ó!una!localización!en!el!
núcleo!y!el!ci oplasma,!simila !a!la!obse ada!pa a!A CIPK1,!A CIPK24!y!A CIPK8!
(Kim,!Waad !e !al.!2007)!y!(Ba is ic,!So ek!e !al.!2008).!A!di e encia!de!las!CBLs,!
las!!CIPKs!no!poseen!una!señal!de!localización! econocible.!Es udios!p e ios!!de!
usiones!a!GFP!con!di e en es!CIPKs!de!A abidopsis!mos a on!una!localización!
en!el!ci oplasma!y/o!el!núcleo.!Sin!emba go,!median e!es udios!de!localización!de!
los!complejos!CBL/CIPKs!!en!la!célula!median e!BIFC!(Bimolecula + luo escence+
complemen a ion),! se! obse ó! que! las! CIPKs! son! di igidas! a! di e en es!
compa imen os! memb anosos! cuando! unen! CBL.! Además,! dependiendo! del!
complejo!que!se! o me!la!localización! a ia á.!Así!aunque!A CIPK24!se!encuen a!
no malmen e! en! el! núcleo! y! el! ci oplasma,! cuando! o ma! el! complejo! con!
A CBL10!se! isualiza!en!el! onoplas o,!!pe o!si!el!complejo!se! o ma!con!A CBL4!
su!localización!se!p oduce!en!la!memb ana!plasmá ica!(Kim,!Waad !e !al.!2007).!
Po !o a!pa e,!en!nues o!labo a o io!se!ha! desc i o!la! implicación!di ec a!de!
SlCBL10! y! SlCIPK6! en! la! inmunidad! inna a! en! Solanáceas.! Además! se! ha!
comp obado,!median e!BiFC,!que!la!in e acción!en e!SlCBL10!y!SlCIPK6! iene!
luga !en!el! onoplas o!en!las!condiciones!ensayadas.!Aunque!has a!el!momen o!
no! hay! mucho! discu ido! sob e! la! implicación! de! p o eínas! localizadas! en! el!
onoplas o! en! la! de ensa! ege al,! ecien emen e! se! ha! comp obado! que! el!
con enido! de! la! acuola! es! libe ado! y! acumulado! en! el! espacio! ex acelula !
inducido! po ! HR! (Zhou,! Cheung! e ! al.! 2010).! Sin! emba go! se! desconoce! la!
implicación!biológica!de!las!p o eínas!localizadas!en!la!memb ana! acuola !en!
es e!p oceso.!O a!posibilidad!es!que!el!complejo!SlCBL10/SlCIPK6!se!localice!en!
o o!compa imen o! as!la!pe cepción!del!pa ógeno.!
!
!
Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
!
78!
Ca ac e ización)de)la)in e acción)SlCIPK6/SlCBL10)median e)doble)híb ido)
en)le adu as)
Los! esul ados!ob enidos!en!el!doble!híb ido!mues an!que!SlCBL10!in e acciona!
con!la! o ma!sil es e!de!SlCIPK6,!mien as!que!no!lo!hace!con!la! o ma!!que! iene!
eliminado!el!dominio!NAF,!necesa io!pa a!su!unión!con!las!CBLs!(Alb ech ,!Ri z!
e ! al.! 2001).! Además,! se! ha! e i icado! que! es a! unión! es! especí ica,! ya! que!
SlCBL10! no! in e acciona! ni! con! SlCIPK11! ni! con! SlCIPK14,! dos! miemb os!
ce canos! a! SlCIPK6.! Sin! emba go! no! se! puede! desca a ! la! unión! de! ambos! a!
o os!miemb os!de!la! amilia.!Así!po !ejemplo,!A CIPK6!in e acciona!con!A CBL3!
y! A CBL4! (Kolukisaoglu,! Weinl! e ! al.! 2004)!mien as! que! A CBL10! se! une! a!
A CIPK24,!como!ya!se!ha!mencionado!en!nume osas!ocasiones.!Segu amen e!la!
especi icidad! a! la! ho a! de! o ma ! complejos! SlCIPK6/SlCBL! o! SlCIPK/SlCBL10!
end á!de e minada!po !el!es ímulo!pe cibido.!Como!ya!se!ha!mos ado!en!es e!
abajo,! ambos! genes! son! inducidos! en! espues a! a! nume osos! a amien os! y!
además!el!pa ón!de!exp esión!obse ado!es!di e en e!en!algunos!de!los!casos,!
sugi iendo!el!di e en e!pun o!de!ac uación!pa a!SlCIPK6!y!SlCBL10.!Además,!la!
o mación!de!di e en es!complejos!CIPK/CBL!conlle a ía!la!in e acción!de!cada!
uno! de! ellos! con! nume osas! p o eínas! con olando! de! es a! o ma! un! g an!
abanico!de! u as!me abólicas.!
Gene ación) de) plan as) ansgénicas) que) sob eexp esan) SlCBL10) en) N..
ben hamiana)
Con! el!obje i o! de! in es iga ! la! unción! especí ica! de! SlCIPK6! y! SlCBL10! en!
Solanáceas,! se! gene a on! plan as! que! sob e[exp esen! de! o ma! es able! ambos!
genes.!Desa o unadamen e!solo!se!consiguió!ob ene !plan as! ansgénicas!de!N.+
ben hamiana!pa a!SlCBL10[GFP.!Al!se !SlCIPK6!una!quinasa,!posiblemen e!ac i e!
nume osas! u as! de! os o ilación! que! hagan! que! sea! in iable! su! con inua!
ac uación.!!
Cuando!la!plan a!se!encuen a!expues a!a!al as!concen aciones!de!sal!se!p oduce!
un! aumen o! en! la! concen ación! de! Ca2+!ci osólico,! iniciándose! en onces! los!
mecanismos! eque idos!pa a!la!de oxi icación!dependien es!de!Ca2+!(Luan,!Kudla!
e ! al.! 2002).! En! la! célula! ege al! la! de oxi icación! iene! luga ! po ! dos! ías!
Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
79!
di e en es.!En!una!de!ellas!ocu e!la!expo ación!de!los!iones! óxicos!al!ex e io !
de!la!célula!median e! anspo ado es!especí icos!localizados!en! la!memb ana!
plasmá ica.! El! o o! mecanismo! consis e! en! el! almacenamien o! de! los! iones! en!
o gánulos! especí icos! (Hasegawa,! B essan! e ! al.! 2000).! En! A abidopsis,! el!
complejo! A CBL10/A CIPK24! se! iden i icó! como! un! componen e! en! la!
señalización!po !Ca2+!que! egula!la!de oxi icación!a!sal!median e!la!acumulación!
de! iones! en! el! in e io ! de! la! acuola.! ! Po ! ello,! la! p ime a! ap oximación! pa a!
es ablece ! la! unción! especí ica! de! SlCBL10! en! Solanaceas! ue! p oba ! la!
sensibilidad!a!sal!de!las!líneas!sob eexp eso as.!
Como! p ime ! ensayo! se! ealizó! un! es ! de! ge minación! en! medio! con! al as!
concen aciones!de!NaCl.!El! esul ado!ob enido!mues a!una!mayo ! esis encia!
de!las!líneas!sob eexp eso as!SlCBL10[GFP!1.1!y!6.5!con! espec o!al!con ol!(GFP!
2.4).! La! ge minación! en! A abidopsis!se! encuen a! con olada! po ! di e en es!
i oho monas!como!ABA!y!gibe elinas!(GA).!En!la!semilla!el!ABA!p e iene!de!la!
pe dida!de!la!pa ed!celula !y!como!consecuencia!e i a!la!cap u a!de!agua!y,!de!
es a! o ma,!aumen a!la!du mancia!de!la!semilla.!La!ge minación!se!p oduce!si!la!
semilla! es! capaz! de! educi ! los! ni eles! de! ABA.! Como! ya! se! ha! is o!
an e io men e,! SlCBL10,! es! al amen e! inducida! po ! ABA,! pudiendo! es a !
in oluc ada!en!p ocesos!de!ge minación!dependien es!de!es a!ho mona.!
Po !o o!lado,! ambién!se!ha! is o!que!las!plan as!de!N.+ben hamiana!SlCBL10[
GFP!1.1!y!6.5!mues an!una!mayo ! esis encia!a!al as!concen aciones!de!NaCl.!A!
concen aciones!de!100!mM!de!NaCl!las!plan as!! ansgénicas!pa a!SlCBL10[GFP!
mos a on!una!mayo !longi ud!de!las! aíces.!En!A abidopsis!el!mu an e!a cbl10+
mues a!una!impo an e!inhibición!del!c ecimien o!del! ejido!aé eo!y!no!en!la!
aíz,!cuando!el!medio!es!suplemen ado!con!al a!concen ación!de!NaCl!(Quan,!Lin!
e ! al.! 2007).! Es o! es! debido! a! que! la! ac uación! de! A CBL10! en! la! plan a! es!
exclusi a! de! la! pa e! aé ea.! Se! ha! desc i o! que! la! CBL! esponsable! de! la!
de oxi icación!en!la! aíz!es!A CBL4.!Además,!la!exp esión!de!A CBL10!en!la! aíz!
es!inde ec able,!a! di e encia!de! lo!que! ocu e!en! oma e.!Es a! di e encia!en! la!
acumulación! de! ansc i o! pod ía! indica ! una! di e gencia! uncional! en! ambos!
genes.!
Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
!
80!
Es os! esul ados! mues an! la! implicación! di ec a! de! SlCBL10! en! la! u a! de!
señalización!iniciada!en! espues a!a!al as!concen aciones!de!sal!en!Solanáceas.!A!
di e encia! de! A abidopsis,!SlCBL10! se! exp esa! en! la! aíz! y! posiblemen e! sea!
esponsable!del! eno ipo!de! esis encia!a!sal!ob enido.!Como!ya!se!ha!nomb ado!
an e io men e,!los!complejos!A CIPK23/A CBL4!en!la! aíz!y!A CIPK23/A CBL10!
en!la!hoja!son!los! esponsables!de!la!de oxi icación!a!NaCl!en!A abidopsis.!Sin!
emba go,!en! oma e!se!desconoce!la!SlCIPK!que! o ma ía!complejo!con!SlCBL10!
bajo!es as!condiciones.!Po !o o!lado,! an o!la!mayo !acumulación!de! ansc i o!
en! espues a! a! ABA! como! la! mayo ! elocidad! de! ge minación! de! las! plan as!
ansgénicas!en! espues a!a!NaCl!pod ía!indica !la!implicación!de!SlCBL10!en!la!
u a! de! señalización! mediada! po ! ABA.! En! A abidopsis!se! ha! desc i o! la!
pa icipación!de! a ias!CIPKs!y!CBLs!en!la!señalización!po !ABA.!Po !ejemplo,!el!
mu an e!A cipk3!y+A cipk14!p esen aban!una!mayo !inhibición!en!la!ge minación!
en! espues a! a! ABA!y! NaCl! en! compa ación! al! sil es e! (Pandey,! G an ! e ! al.!
2008).! Además,! A CIPK14! mos ó! una! ue e! inducción! en! espues a! a!
a amien os!con!NaCl!y!ABA!(Qin,!X!e !al.!2008).!
La! u u a! iden i icación! de! las! CIPKs! que! o man! complejos! con! SlCBL10! en!
oma e,! así! como! la! iden i icación! de! dianas! de! os o ilación! de! SlCIPK6,!
ayuda ían! a! p o undiza ! en! el! en endimien o! de! la! unción! que! ambos! genes!
ealizan!en!Solanáceas.!
!
!
!
!
!
) )
Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
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!
!
Ca ac e ización+molecula +de+SlCBL10+y+SlCIPK6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!1!
!
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84!
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Iden i icación+de+p o eínas+que+in e accionan+con+SlCIPK6+median e+doble+híb ido!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!2!
!
!
85!
Capí ulo)2:))
Iden i icación)de)p o eínas)que)
in e accionan)con)SlCIPK6)
median e)doble)híb ido) )
Iden i icación+de+p o eínas+in e ac o as+de+SlCIPK6+median e+doble+híb ido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capí ulo!2!
!
!
92!
La! cepa! EGY48! de! S.+ ce e isae!que!po aba!el! plásmido! pSH18B34! (con!el! gen!
epo e o!LacZ)!y!la!cons ucción!pEG202BSlCIPK6/SlCIPK6T172D!se! ans o mó!
con!la!geno eca!de! oma e.!Pos e io men e!un! o al!de!4,5!·!103! ans o man es!
pa a! SlCIPK6T172D!y! 1,1! ·! 103! ans o man es! pa a! SlCIPK6! se! some ie on! a!
condiciones! selec i as!que! o zaban!la! in e acción![SD! 2%! (p/ )!
Galac osa/Ra inosa!sin!U a,!T p,!His!ni!Leu]!du an e!3B4!días!a!30ºC.!Las!colonias!
c ecidas!se!some ie on!a!un!segundo! es !de!selección!y!se!eligie on!aquellas!que!
c ecie on!en!un!medio!sin!Leu!y!p esen aban!una!colo ación!azul!en!p esencia!de!
XBGal!( e !apa ado!4!de!ma e iales!y!mé odos).!!
Las! colonias! esponsables! de! c ece ! en! los! dos! a amien os! selec i os! se! les!
ex ajo! el! DNA! y!se! manda on! a! secuencia !los! plásmidos.! Es os! plásmidos!
con enían!los! agmen os!de!cDNA!co espondien es!a!las!p o eínas!capaces!de!
in e acciona ! con! SlCIPK6.! La! iden i icación! de! las! secuencias! se! ealizó! po !
compa ación! con! las!secuencias! deposi adas! en! las!bases! de! da os! del! NCBI!
u ilizando!la!aplicación!in o má ica!BLAST.!!
En!la! abla!2.1!se!mues a!la!iden idad!de!los!clones!iden i icados!en!el!esc u inio!
de!doble!híb ido!con!la! o ma!cons i u i o!ac i a!de!SlCIPK6.!Se!iden i ica on!un!
o al! de! 34!clones! di e en es! que! in e accionan! con! SlCIPK6.! Los! posibles!
in e ac o es! ue on!nomb adas!como!CIPK+In e ac ing+P o ein!(CIP)!seguidas!de!
un!núme o,!que!co esponde!al!núme o!de!clon!secuenciado.!!
!
!
!
!
!
!
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!

Iden i icación+de+p o eínas+que+in e accionan+con+SlCIPK6+median e+doble+híb ido!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!2!
!
!
93!
Doble!híb ido!con!SlCIPK6T172D!
CIP!
Iden idad!del!clon!
Homología!
Nº!acceso!
1!
Subunidad!be a!3!del!p o eosoma!
N.+ abacum+
AJ291739!
4!
P o eína!con!dominio! udo !
P.+sa i um+
AB078603!
6!
Execu e !
R.+communis+
XP_002511410!
7!
P o eína!14B3B3!( !10)!
S.+lycope sicum+
X98866!
8!
P o eína!desconocida!1!
+
!
12!
T iosa! os a o!isome asa!
A.+ haliana+
AY087893.1!
13!
NAD(P)H!quinona!oxido educ asa!
S.+ ube osum+
AB061251!
14!
CDC48!1!
N.+glu inosa+
GQ131539!
16!
4BCuma a oBCoA!ligasa!
P.+ ichoca pa+
XP_002318707!
25!
P o eína!ISPH!
S.+lycope sicum+
ACY27516!
30!
T eonina!deaminasa!
S.+lycope sicum+
M61914!
31!
Deoxiu idina! i os a asa!
S.+lycope sicum+
S40549!
32!
P o eina!desconocida!2!
+
!
34!
T iosa! os a o!isome asa!
S.+ une osum+
DQ222496.1!
46!
P o eína!desconocida!3!
+
!
48!
P o easa!F sH!
S.+lycope sicum+
AY334306!
53!
Pi o os a asa!ino gánica!
A.+ haliana+
AY079355!
55!
CDC48!2!
N.+ abacum+
DQ515925!
64!
P o eína!desconocida!4!
+
!
67!
P o eína!desconocida!5!
+
!
70!
P o eína!LRRBRLK!
A.+ haliana+
FJ708817!
90!
Anexina!p35!
S.+lycope sicum+
AF079231!
100!
P o eína! ibosomal! pS1!
S.+ole acea+
M82923!
102!
Adenila o!quinasa!
A.+ haliana+
AK227882!
103!
P o eína!de!unión!a!calmodulina!
R.+communis+
XM_002524860!
106!
DnaJ!
S.+ ube osum+
DQ228340!
112!
SBAdenosilBL_me ionina!sin asa!
S.+lycope sicum+
Z24741!
115!
P o eína!14B3B3!( 7)!
S.+lycope sicum+
X95905!
118!
P o eína!SHEPHERD!
A.+ haliana+
AB064528!
123!
P o eína!desconocida!6!
+
!
139!
Cis eina!sin asa!ci osólica!
S.+ ube osum+
AB029511!
140!
P o eína! os a sa!2C!
N.+ abacum+
AJ309007!
141!
P o eína!desconocida!6!
+
!
143!
DDB1(UV+damaged+DNA+binding+p o ein+1)!
S.+lycope sicum+
AY452480!
!
!
!
Pos e io men e!en!el!doble!híb ido! ealizado!con!la! o ma!sil es e!de!SlCIPK6!se!
ob u o!un!núme o!meno !de!clones.!Recien emen e!se!ha!desc i o!que! e siones!
cons i u i a! ac i as! de! quinasas!mejo a! la! in e acción! p o eínaBp o eína! con!
Tabla)2.1:!Clones)iden i icados)en)el)doble)híb ido)empleando))SlCIPK6T172D)como)cebo.!
La!iden idad!de!los!clones!se!ob u o!po !compa ación!con!las!secuencias!deposi adas!en!la!base!
de! da os! del! NCBI! (h p://www.ncbi.nlm.nih.go /guide/)! u ilizando! la! aplicación! in o má ica!
BLAST.!!!
Iden i icación+de+p o eínas+in e ac o as+de+SlCIPK6+median e+doble+híb ido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capí ulo!2!
!
!
94!
espec o!a!la! e sión!sil es e!(Uno,!Rod iguez!Milla!e !al.!2009).!Posiblemen e!
po !es e!mo i o!se!hayan!ob enido!un!núme o!in e io !de!clones!en!el!esc u inio!
ealizado!con!la! o ma!sil es e.!Además!muchos!de!ellos!se!iden i ica on!en!los!
dos! esc u inios! como! po ! ejemplo!los! clones! CIP48,! CIP55,! CIP90,! CIP100! y!
CIP112.!La! abla!2.2!mues a!los!CIPs,!di e en es!al!p ime !esc u inio,!ob enidos!
en!el!segundo!ensayo.!
Doble!híb ido!con!SlCIPK6!
CIP!
Iden idad!del!clon!
Homología!
Nº!acceso!
22!
T anspo ado !ABC!
R.!communis!
XM_002523649!
23!
UBQ!(Ubiqui in!like!p o ein)!
A.! haliana!
AF370527!
24!
P o eina!LEA!
S.!lycope sicum!
Z46654!
29!
RD2!
A.! haliana!
AB039925!
32!
Pep3/Vps18/o ange! amily!p o ein!
A.! haliana!
NM_101119!
61!
CDM1(cell+dea h?associa ed+p o ein)!
N.!glu aminosa!
AF208022!
!
!
!
En! esumen,! se! iden i ica on!un! o al! de! 40! clones! di e en es! en! los! dos!
esc u inios! ealizados,! de! los! cuales! 34! se! ob u ie on! en! el! ensayo! de! doble!
híb ido! con! la! o ma! cons i u i a! ac i a! y! an! solo! 6! con! la! o ma! sil es e.!
Algunos! de! los! in e ac o es! como! po ! ejemplo! CIP90! y! CIP25! se! iden i ica on!
a ias! eces! y! de! o ma! independien e.! Se! decidió! no! analiza ! mas! colonias!
cuando!se!consiguió!un!núme o!ele ado!de!in e ac o es,!po !lo!que!los!ensayos!
no! llega on! a! se ! sa u an es.!La! abla! 2.3! mues a! de! o ma! esquemá ica! !los!
esul ados!ob enidos.!!
!
!
!
!
Tabla)2.2:!Clones)di e en es)iden i icados)en)el)doble)híb ido)u ilizando)la) o ma)SlCIPK6)
como)cebo.!!La!iden idad!de!los!clones!se!ob u o!po !compa ación!con!las!secuencias!deposi adas!
en! la! base! de! da os! del! NCBI! (h p://www.ncbi.nlm.nih.go /guide/)! u ilizando! la! aplicación!
in o má ica!BLAST.!!!
!!!
Iden i icación+de+p o eínas+que+in e accionan+con+SlCIPK6+median e+doble+híb ido!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!2!
!
!
95!
!
!
!
!
!
Con!el!obje i o!de!elimina ! alsos!posi i os!se! ealizó!un!segundo!con ol!en!la!
especi icidad!de!la!in e acción.!Pa a!ello!se! e ans o mó!cada!uno!de!los!clones!
en!la!cepa!de!le adu as!que!con enía!el!cebo!co espondien e.!!De!es a! o ma!
pod íamos!desca a !aquellos!clones!que!no!c ecie an!en!ausencia!de!Leu!o!no!se!
colo ea on!de!azul!en!p esencia!de!XBGal!( igu a!2.4).!!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!!
!
SlCIPK6T172D!
SlCIPK6!
T ans o man es!iniciales!(UFC)!
1.3!·!105!
2.1!·!105!
Clones!analizados!(UFC)!
4.5!·!103!
1.1!·!103!
CIPs!ob enidos!
34!
11!
CIPs!di e en es!
34)
6)
Figu a) 2.4:!Re ans o mación) de) los!clones) iden i icados) en) el) doble) híb ido.!!Los! clones!
iden i icados!en!el!doble!híb ido!se! e ans o ma on!en!la!cepa!EGY48!con!los! ec o es!pEG202B
SlCIPK6T172D/SlCIPK6!y! pSH18B34.! A! con inuación,! cada! uno! de! los! cul i os! c ecidos! oda! la!
noche!en!medio!SD!se!diluye on!en!agua!es é il!y!se!plaquea on!a!una!DO600!de!0,1.!!La!colo ación!
azul!en!p esencia!de!XBGal!(1)!y!el!c ecimien o!en!un!medio!ca en e!de!Leu!(2)!indican!in e acción!
en a!ambas!p o eínas.!!!
Tabla) 2.3:!Resumen) de) los) esul ados) ob enidos) en) los) esc u inios) de) doble)
híb ido)en)le adu as.!
!!!
Iden i icación+de+p o eínas+in e ac o as+de+SlCIPK6+median e+doble+híb ido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capí ulo!2!
!
!
96!
En!la! e ans o mación!a!excepción!de!los!clones!CIP122!y!CIP32! odos!los!CIPs!
analizados!die on!luga !a!un! eno ipo!de!in e acción!con!SlCIPK6!( igu a!2.4).!!
Cabe!des aca !que!en!los!esc u inios!de!doble!híb ido! ealizados!no!se!ob u o!
ningún! clon! pe enecien e! a! la! amilia! génica! de! las! CBLs,! indicando! que! los!
ensayos! no! llega on! a! la! sa u ación.! Sin! emba go! si! se! iden i ica on!o as!
p o eínas!cuya!in e acción!ha!sido!desc i a!con!algún!miemb o!de!la! amilia!de!
las!CIPKs!y!en e!las!que!se!encuen an!una! os a asa!(CIP140)!(Oh a,!Guo!e !al.!
2003)!y!una!chape ona!DnaJ!(CIP106)!(Yang,!Qin!e !al.!2010).!La!di e sidad!de!
clones! iden i icados! pone! de! mani ies o! las!di e sas! unciones! celula es!que!
SlCIPK6!pod ía! egula .!
2.4. Selección)de)candida os)
Una! ez! ealizados!los!ensayos!de!doble!híb ido!el!siguien e!paso!se!cen ó!en!la!
selección!de!candida os!pa a!su!pos e io !ca ac e ización!en!de alle.!Pa a!ello!se!
emplea on! p incipalmen e! es! c i e ios:! (1))pa icipación!en!la! espues a!
inmune,!!(2)!iden idad!conocida!del!gen!y!(3)! e i icación!de!la!in e acción!in+
i o!con!SlCIPK6.!!
Teniendo! en! cuen a! el! g an! núme o!de! clones! iden i icados!se! hizo! necesa io!
diseña ! un!segundo! esc u inio!gené ico.! Pa a! ello! se! diseñó! una! es a egia!
expe imen al!basada!en!el!silenciamien o!génico!inducido!po ! i us!(VIGS)!con!el!
obje i o!de!selecciona !clones!implicados!en!la! espues a!inmune!en! oma e!y!el!
cual!se!explica!a!con inuación.!
2.4.1. Pa icipación!en!la! espues a!inmune!en! oma e!(1)!
P e iamen e!en!nues o!labo a o io!se!demos ó!la!pa icipación!de!SlCIPK6!en!
la! espues a! ETI! y! suscep ible!en! oma e!causadas! po ! la! bac e ia! pa ógena!!!!!!!!!!
Ps !DC3000.!!Se!buscaban!clones!que!es u ie an!implicados!en!la!misma! u a!de!
señalización!que!SlCIPK6.!Se!op ó!po !selecciona !aquellos!clones!implicados!en!
la! espues a! suscep ible! en! oma e! ya! que! los! ensayos! esul a on! se ! más!
epe i i os!y!cla os.!En!las!plan as!suscep ibles!el!pa ógeno!en a!en!el!espacio!
apoplás ico! donde! se! mul iplica,! dando! luga ! a! los! pocos! días,! a! pequeñas!
Iden i icación+de+p o eínas+que+in e accionan+con+SlCIPK6+median e+doble+híb ido!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!2!
!
!
97!
lesiones!nec ó icas! odeadas!de!un!halo!clo ó ico,!conocidas!con!el!nomb e!de!
pecas!a!manchas!bac e ianas.!!
Pa a!el!esc u inio!se!lle ó!a!cabo!el!silenciamien o!de!plan as!de! oma e!RGBP oS!
(ca en es! del! gen! P o),!(Salme on,!Old oyd! e ! al.!1996)!median e! ec o es!del!
silenciamien o!con!cada!uno!de!los!clones!iden i icados!en!el!doble!híb ido!(Liu,!
Schi !e !al.!2002).!Una! ez!silenciadas,!las!plan as!con!seis!semanas!de!edad,!se!
in ec a on!con! Ps !DC3000! y! cua o! días! después!se! analizó!el! c ecimien o!
bac e iano!median e! con eo! bac e iano!como! ma cado ! de! la! incidencia! de! la!
en e medad.!Como!con ol!se!emplea on!plan as!silenciadas!con!el! ec o ! acío!
(TRVBC)!que!se!lle a on!en!pa alelo.!Debido!al!g an!núme o!de!clones!a!analiza ,!
el!esc u inio!se!dis ibuyó!en! es! andas!di e en es.!Cada!expe imen o!se! epi ió!
al!menos!cua o! eces!po ! anda.!La! igu a!2.5!mues a!los! esul ados!ob enidos!
en!uno!de!los!expe imen os! ealizados!y!que!sigue!la!misma! endencia!que!los!
o os.!
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Iden i icación+de+p o eínas+in e ac o as+de+SlCIPK6+median e+doble+híb ido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capí ulo!2!
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98!
!
!
!
!
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!
!
!
!
!
!
En! la! anda! 1! los! clones! CIP34,! CIP25,! CIP70,! CIP48!y! CIP6!mos a on!un!
c ecimien o! bac e iano! con! un! o den! de! magni ud! in e io !en! la! escala!
loga í mica!que!al!obse ado!en!la!plan a!TRVBC.!El!mismo!compo amien o!se!
obse ó!en!los!clones!CIP30,!CIP31,!CIP53,!CIP90,!CIP103,!CIP24,!CIP90,!CIP61!y!
CIP29,+siendo!es e!úl imo!el!de!mayo !di e encia!con! espec o!al!con ol.!T as!el!
análisis!de!los!da os!ob enidos!en!el!esc u inio! ealizado!en!plan as!de! oma e!
RGBP oS,! se! pudo!llega ! a! la! conclusión! de! que! nume osas! de! las! dianas!
iden i icadas! en! el! ensayo! de! doble! híb ido! se! encon aban! implicadas! en! la!
espues a!suscep ible!en! oma e.!A!pesa !de!habe !desca ado!clones!como!CIP7,!
CIP8,!CIP102,!CIP123,!CIP64!y!CIP141!la!lis a!de!posibles!dianas!a!ca ac e iza !
aún!e a!g ande.!
2.4.2. Iden idad!de!los!clones!(2)!
Pos e io men e! se! ealizó! un! es udio! bibliog á ico!de! los! candida os!que!
mos a on!un!c ecimien o!bac e iano!más! educido!y!que!co espondie on!con!
los! clones:!CIP6,+ CIP22,+ CIP24,+ CIP25,+CIP29,+CIP31,+ CIP32,+ CIP34,+ CIP53,+ CIP61,+
Figu a)2.5:!C ecimien o)bac e iano)en)plan as)de) oma e)RGTP oS.!A,!B!y!C!co esponden!con!
los!da os!ob enidos! as!el!silenciamien o!de!la! anda!1,!2!y!3! espec i amen e.!C ecimien o!de!la!
bac e ia! pa ógena! Ps !DC3000! en! plan as! de! oma es! silenciadas! con! clones! p oceden es! del!
esc u inio!de!doble!híb ido.!Como!con ol!de!la!in ección!se!emplea on!plan as!silenciadas!con!el!
ec o ! acío!(TRVBC).! Se! ep esen a!el! alo ! medio!de!un!ensayo!con! cinco! éplicas!biológicas!
independien es.!La!ba a!de!e o !co esponde!al!e o !es ánda !de!la!media.)
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Iden i icación+de+p o eínas+que+in e accionan+con+SlCIPK6+median e+doble+híb ido!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!2!
!
!
99!
CIP70,+ CIP90,+ CIP103,+ CIP106,+ CIP13,+ CIP140.! Se! buscaban! in e ac o es! cuyos!
homólogos!desc i os!en! las!bases! de! da os! mos a an!una! unción! es ablecida!
que! pudie a! encaja ! den o! del! sis ema! de! es udio.! De! en e! odos! los! clones!
p eseleccionados! inalmen e!se!eligie on!los!in e ac o es+CIP70,!CIP90!y!CIP29.!
Como! se! obse a! en! la! igu a! 2.6! las! plan as! silenciada! pa a! es os! clones!
mos a on!menos!sín omas!de!en e medad!que!las!plan as!TRVBC.!Como!con ol!
del! silenciamien o!se! ealiza on! PCRs! semicuan i a i as! con! oligonucleó idos!
especí icos!de!la!secuencia!codi ican e.!!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
A! con inuación! se! hace! un! b e e! esumen! de! los! da os! más! ele an es!
encon ados!en!la!bibliog a ía!de!cada!uno!de!los!in e ac o es!p eseleccionados.!
El!clon!CIP70!pe enece!a!la! amilia!de!las!RLKs!( ecep o ?like+ p o ein+ kinases)!
que!son!p o eínas!de!memb ana!con!un!dominio!ex acelula ! ico!en!leucinas!y!
o o!in acelula !con!ac i idad!quinasa.!Su!o ólogo!en!A abidopsis!se!denomina!
HSL2! y! se! ha! demos ado! su! implicación!di ec a!en! el! con ol! de! la! abscisión!
lo al! (S en ik,! Bu enko! e ! al.! 2008).! En! plan as,! la! unción! de! las! RLKs! es á!
Figu a) 2.6:) Desa ollo) de) los) sín omas) de) en e medad) en) plan as) de) oma e) RG) P oS)
silenciadas)con)los)clones)CIP70,)CIP90)y)CIP29.!A)!Las!plan as!de! oma es!RGBP oS! ue on!
silenciadas! pa a! los! clones! CIP70,! CIP90,! CIP29!y! como! con ol! TRV.! Pos e io men e,! ue on!
inoculados! con!P.+ sy inagea!DC3000! y! 4! días! después! las! hojas! ue on! des eñidas! y!
o og a iadas.!B)!Acumulación!de! ansc i o!de!cada!uno!de!los!clones!en!plan as!silenciadas!
con! espec o!al!con ol!(TRVBC).!Como!con ol!in e no!se!empleó!el!gen!de!la!ac ina.!
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*+*,-.%
Iden i icación+de+p o eínas+in e ac o as+de+SlCIPK6+median e+doble+híb ido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capí ulo!2!
!
!
100!
elacionada! con! la! ! de ección! y! ansducción! de! de e minadas! señales! in a! y!
ex acelula es.! Es a! amilia! de! p o eínas! es á!implicada! en! la! espues a! a!
pa ógenos,!pe cepción!ho monal,!señalización!y!desa ollo.!Se!ha!p opues o!que!
las! CIPKs! pod ían! se ! os o iladas! po ! quinasas! si uadas!aguaBa iba!en! la!
cascada! de! señalización,! sin! emba go! has a! el! momen o! no! se! ha! iden i icado!
ningún!candida o.!Las!RLKs!son!p o eínas!de!memb ana!que!inician!una!cascada!
de! os o ilación! as!la!pe cepción!del!es ímulo!(Pi oux,!Saunde s!e !al.!2007).!De!
alguna! o ma! la! RLK! pod ía! in lui ! sob e! la! ac i idad! de! SlCIPK6! as! la!
pe cepción!del!es ímulo.!
CIP90!es!una!Anexina!que! ue!iden i icada! an o!en!el!esc u inio!de!doble!híb ido!
ealizado!con!la! o ma!sil es e!como!con!la! o ma!cons i u i a!ac i a!de!SlCIPK6.!
Las!Anexinas!cons i uyen!una! amilia!de!p o eínas!que!se!encuen an! an o!en!
células! animales! como! en! células! ege ales! y! se! unen! a! os olípidos! de!
memb anas!de!una! o ma!dependien e!de!Ca2+.!En!plan as,!el!Ca2+!es!un!segundo!
mensaje o! en! la! señalización! iniciada! en! espues a! a! nume osos! es eses,!
incluyendo!la! espues a!a!pa ógenos.!Se!ha!demos ado!la!implicación!di ec a!de!
de e minadas!Anexinas!de!plan as!en!la! ole ancia!a!es és,! an o!abió ico!como!
bió ico!(Jami,!Cla k!e !al.!2008).!En! oma e,!se!ha!desc i o!que!la!ac i idad!de!la!
anexina! p35! (CIP90)! se! inhibe! as! uni se! a! os olípidos! de! memb ana! (Lim,!
Robe s!e !al.!1998).!Po !o a!pa e!se!ha!comp obado!que!la!g an!mayo ía!de!las!
anexinas! ienen! ac i idad! pe oxidasa! y! que! és a! es! dependien e! de!una!
egulación! pos aduccional,! así! po ! ejemplo! la! ac i idad! pe oxidasa! de! la!!!
anexina!1!de!A abidopsis!disminuye!con!la!de os o ilación!(Go ecka,!KonopkaB
Pos upolska! e ! al.! 2005).! En! nues o! labo a o io!se! ha! demos ado! la!
pa icipación!de!SlCIPK6!en!la! espues a!PTI!y!ETI!así!como!en!la! o mación!de!
especies! eac i as!de!oxígeno,!po !lo!que!CIP90!pod ía!es a !in oluc ada!en!la!
señalización!de i ada!de!!ROS.!
Po ! úl imo,! CIP29! es! una! pequeña! p o eína! que! posee! un! dominio! UspA!
(uni e sal+ s ess+ p o ein+ A)! que! ocupa! el! 90%! de! su! amaño.! El! nomb e! del!
dominio!p o iene!de!la!p o eína!inicialmen e!desc i a!en!E.+coli!y!!denominada!
UspA! (Nys om! and! Neidha d ! 1992).! EcUspA! es! sin e izada! y! os o ilada! en!
epues a! a! nume osos! agen es! que! inhiben! el! c ecimien o! bac e iano! como!
Iden i icación+de+p o eínas+que+in e accionan+con+SlCIPK6+median e+doble+híb ido!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!2!
!
!
101!
me ales! pesados,! an ibió icos,! pH! al o,! shock! osmó ico! o! calo ! (Yohannes,!
Ba nha !e !al.!2004).!Además!EcUspA!es!necesa ia!pa a!la!supe i encia!de!la!
célula!en!condiciones!de!es és!(Nys om!and!Neidha d !1992).!RD2!( esponsi e+
o+desecca ion)!es!el!nomb e!del!o ólogo!de!CIP29!en!A abidopsis!cuyo!cDNA!se!
aisló,!jun o!con!o os!genes,!en! espues a!a!desecación.!En!el!esc u inio! ealizado!
en! oma e! las! plan as! silenciadas! pa a! CIP29! mos a on!un! c ecimien o!
bac e iano!muy! educido!po !lo!que!es e!clon!pod ía!se !un!buen!candida o!si!
además!se!demues a!que!in e acciona!in+ i o!con!SlCIPK6!y!es! os o ilada!po !
és a.!
El!clon!CIP29!se!iden i icó!únicamen e!en!el!ensayo!de!doble!híb ido! ealizado!
con! la! o ma! sil es e!mien as! que! CIP70! lo! hizo! con! la! e sión! cons i u i o!
ac i a!y! CIP90!se! ob u o! en! los! dos! esc u inios.! Pa a! de e mina ! si! CIP70!
in e acciona!con!la! o ma!sil es e!y!si!CIP29!lo!hace!con!la! o ma!cons i u i a!
ac i a! de! SlCIPK6!se! ealizó! un! ensayo! de! doble! híb ido! con! las! o mas!
co espondien es!y!los! esul ados!ob enidos!se!mues an!en!la! igu a!2.7.!
!
!
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!
!
!
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Como!se!puede!comp oba !en!la! igu a! an o!CIP70!como!CIP29!in e accionan!
an o!con!la! o ma!sil es e!como!con!la! o ma!cons i u i a!ac i a!de!SlCIPK6.!
Es os! esul ados! uel en!a!indica !que!los!ensayos!de!doble!híb ido!no! ue on!
sa u an es.!
!
Figu a) 2.7:!Ensayo) de) doble) híb ido) con) CIP29) y) CIP70.! ! Los! clones! CIP70! y! CIP29! se!
e ans o ma on!en!la!cepa!EGY48!que!exp esaba!SlCIPK6!y!SlCIPK6T149D.!Los!cul i os!c ecidos!
oda!la!noche!a!30ºC!en!medio!SD!se!diluye on!en!agua!es é il!y!se!plaquea on!a!una!DO600!de!0,1!y!
0,01.! La! colo ación! en! medio! con! XBgal! (1)! y! el! c ecimien o! en! un! medio! ca en e! de! Leu! (2)!
indican!in e acción!en e!las!p o eínas!p obadas.!
Iden i icación+de+p o eínas+in e ac o as+de+SlCIPK6+median e+doble+híb ido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capí ulo!2!
!
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Iden i icación+de+p o eínas+in e ac o as+de+SlCIPK6+median e+doble+híb ido+++++++++++++++++++!!!!!!!!!!Capí ulo!2!
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!
!
!
!
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Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
113!
Capí ulo)3:))
Ca ac e ización)de)SlRD) )

Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
114!
) )
Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
115!
Resul ados)
)
3.1. Análisis)bioin o má ico)de)SlRD!
La!compa ación!de!la!secuencia!de!nucleó idos!de!CIP29!con!las!deposi adas!en!
las!bases!de!da os!mos ó!que!es e!clon!p esen a!una!homología!del!72%!con!el!
gen!A RD2!de!A abidopsis,!po !lo!que!se! enomb ó!como!SlRD.!La!p o eína!A RD2!
con iene!un!dominio!UspA!iden i icado!inicialmen e!en!E.+coli.!En! unción!de!su!
es uc u a!las!p o eínas!con!dominio!Usp!se!clasi ica on!en!dos!g upos,!aquellas!
que!unen!ATP!y!son!semejan es!a!la!p o eína!MJ0577!(Za embinski,!Hung!e !al.!
1998)!y!las!que!no!unen!ATP!y!se!asemejan!a!HiUspA!(Sousa!y!McKay!2001).!La!
mayo ía!de!los!aminoácidos! esponsables!de!la!unión!a!ATP!se!compa en!en e!
ambos! g upos.! Además! ambas! amilias! poseen! un! mo i o! de! dime ización!
localizado!en!el!ex emo!C[ e minal.!
Pos e io men e! se! ealizó! un! á bol! ilogené ico! con!las! secuencias! de!
aminoácidos!de!CIP29,! su!o ólogo! A RD2!de!A abidopsis!y!N RD!de!Nico iana+
abacum+(N.+ abacum),!la!UspAs! de!E.+coli!H.+in luenzae!y!M.+jannaschii!y!o as!
p o eínas!de!plan as!con!dominio!UspA.!En!la! igu a!3.1.A!se!puede!obse a !que!
CIP29! y! sus! o ólogos! A RD2!y! N RD!se! localizan! en! el! mismo! clús e .! El!
alineamien o! múl iple! de! SlRD! con!dis in as! p o eínas! con! dominio! UspA!
iden i icó! egiones! muy! conse adas! y! simila es! a! la! p o eína! MJ0577!que!
co esponden!con!los! esiduos!de!unión!a!ATP!y!de!dime ización!( igu a!3.1.B).!
El!análisis!bioin o má ico!de!la!secuencia!deposi ada!en!la!base!de!da os!del!gen!
SlRD!(AK321106)!mos ó!que!codi ica!a!una!p o eína!de!177!aminoácidos!con!un!
peso!molecula !de!19.5!kD!y!un!pun o!isoeléc ico!(PI)!de!5.98.!
!
!
!
!
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Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
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116!
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! !
Figu a) 3.1:!Análisis) ilogené ico) y) alineamien o) múl iple) de) SlRD.! Compa ación! de! las!
secuencias! de! aminoácidos! de! p o eínas! con! dominio! Usp! de! los! siguien es! o ganismos:! E.+ coli!
(EcUspA,!NC_000913),!H.+Im luenzae!(HiUspA,!CP002276.1),!M.+Jannaschii!(MJ0577,!NC_000909),!O.+
sa i a!(OsUSP1,!AF491815.1),!S.+licope sicum!(LeER6,!AF096262.1!y!SlRD,!AK321100.1),!Vicia+ aba!
(V ENOD18,!AJ271815.1),!A abidopsis!(A RD2,!NC_003071)!y!N.+ abacum!(N RD).!SlCBL10!(!se!usó!
como! componen e! alejado! ilogené icamen e! de! la! amilia! Usp! A)!Análisis! ilogené ico! de! las!
secuencias! nomb adas! an e io men e! ealizado! con! el!p og ama! MEGA! 4! (median e! CLUSTALW)!
(Thompson,!Higgins!e !al.!1994).!B))Alineamien o!múl iple!de!la!secuencia!de!aminoácidos!de!SlRD,!
OsUSP1,! LeER6,! V ENOD18,! MJ0577,! HiUspA! y! EcUspA.! El! ondo! neg o! mues as! los! esiduos!
idén icos!en!ambas!secuencias,!en!g is!los! esiduos!muy!conse ados!y!en!blanco!los! esiduos!no!
conse ados.!Lo! esiduos!de!unión!a!ATP!se!mues as!en!la! igu a!y!en!los!que!la!(A)! ep esen a!el!
luga !de!unión!a!de!la!adenina,!la!(P)!al! os a o!y!la!(R)!a!la! ibosa.!Los! esiduos!implicados!en!la!
dime ización!se!mues an!con!una!(D).!
!"
!"
#$%"
%"
&"
SlRD --------RGRDIVIAIDHGPNSKHAFDWAVTHLCRLADTLHLVHAVSSLKN-------- 44
OsUSP1 MAAAEGEQRKTVVVVGVDDSEHSNYALEWTMQHLASGMAGGGGAELVIVHAKPSPSSVVG 60
LeER6 MNALNWTLDNIKLKPHDPDSPESQGFIVILHVQSPPSIAAG-LNPGAIPFGGPSDVEVPA 59
V Enod18 ------MVEDRKVGVGIDFSKNSKNALKWAIVNMADKGDTFYLIHINSNSSDESRSKLFA 54
MJ0577 -----MSVMYKKILYPTDFSETAEIALKHVKAFKTLKAEEVILLHVIDEREIKKRDIFSL 55
HiUspA --------MYKHILVAVDLSEESP-----ILLKKAVGIAKRHDAKLSIIHVDVNFSDLYT 47
EcUspA -------MAYKHILIAVDLSPESK-----VLVEKAVSMARPYNAKVSLIHVDVNYSDLYT 48
SlRD --------------EIVYEA---TQGLMEKLAVEAFSVAMV--KTVARIVEGDAGKVICK 85
OsUSP1 FGAGPGSGEVVRYVEADLRK--TAEDVVEKARRLCIANAMH--ALIEVIE-GEPRYVLCN 115
LeER6 FTAA---------IEAHQKR--ITQAILDHALGICAKKNAN--VKTQVVI-GDPKEKICD 105
V Enod18 KTGSPLIPLELKEAGVMKQYGVQTDVEVIDLLEIAATQKEV--SVVAKLYWGDARQKLMD 112
MJ0577 LLGVAGLNKSVEEFENELKN-KLTEEAKNKMENIKKELEDVGFKVKDIIVVGIPHEEIVK 114
HiUspA GLIDVN-------MSSMQDR--ISTETQKALLDLAESVDYP--ISEKLSGSGDLGQVLSD 96
EcUspA GLIDVN-------LGDMQKR--ISEETHHALTELSTNAGYP--ITETLSGSGDLGQVLVD 97
SlRD EAERLKPSAVVMGTRGRGIIQSVLQGSVAEYCLHNCKIAPVIIVPGKEAGEVSVI- 140
OsUSP1 AVEKHSAGLLVVGSHGYGAIKRAFLGSVSDYCAHHAHCSVMIVKQPKAKRSRAETA 171
LeER6 AVEEMNADLLVMGSRAFGPIKRMFLGSVSNYCTNHAQCPVIIVKATP--------- 152
V Enod18 SIEDLKLDALVLGSRGLSTIKRILLGSVSNFVMVHSPCPVTIVKDYSSSSSD---- 164
MJ0577 IAEDEGVDIIIMGSHGKTNLKEILLGSVTENVIKKSNKPVLVVKRKNS-------- 162
HiUspA AIEQYDVDLLVTGHHQDFWSK---LMSSTRQVMNTIKIDMLVVPLRDE-------- 141
EcUspA AIKKYDMDLVVCGHHQDFWSK---LMSSARQLINTVHVDMLIVPLRDEEES----- 145
!
!
Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
117!
3.2. Ca ac e ización)de)la)in e acción)en e)SlRD)y)SlCIPK6)
P e iamen e!se!ha! is o!que!SlRD!in e acciona!en!le adu as! an o!con!la! o ma!
sil es e!como!con!la! o ma!cons i u i a!ac i a!de!SlCIPK6.!Pa a!ca ac e iza !la!
in e acción! en e! ambas!p o eínas!se! lle ó! a!cabo!un!ensayo!de!doble!híb ido!
en e! SlRD! y! las! siguien es! e siones!de! SlCIPK6:! SlCIPK6! (sil es e),!
SlCIPK6T172D!( o ma! cons i u i a! ac i a),! SlCIPK6ΔNAF!( o ma! cons i u i a!
ac i a! as! elimina ! el! dominio! de! unión! a! las! CBLs),! SlCIPK6K34M! ( o ma!
quinasa!inac i a)! y! SlCIPKΔC e m!( o ma! cons i u i a! ac i a! esul an e! as! la!
eliminación! del! dominio! egulado ! C[ e minal).!La! in e acción! se! cuan i icó!
median e!ensayo!β[galac osidasa!( e !ma e iales!y!mé odos!apa ado!M.4.5).!En!
el!doble!híb ido!se!emplea on!como!p esa!el!cDNA!comple o!de!SlRD!clonado!en!
el! ec o !pJG4[5!y!como!cebo!las! a ian es!de!SlCIPK6!clonadas!en!el!plásmido!
pEG202.!Se!empleó!el!ensayo!de!doble!híb ido!basado!en!el!sis ema!LexA!( e !
apa ado!M4!de!ma e iales!y!mé odos).!!
En!la! igu a!3.2!se!puede!obse a !que!SlRD!es!capaz!de!in e acciona ! an o!con!
la! o ma! sil es e! como! con!las! o mas! cons i u i as! ac i as! de! SlCIPK6.!Sin!
emba go! la!in e acción!con!la! o ma! inac i a! de! la! quinasa! (SlCIPK6K34M)! es!
muy! educida!( igu a!3.2.A).!Es os! esul ados!se!cuan i ica on!median e!ensayo!
β[galac osidasa! ( igu a! 3.2.C)! y! la! exp esión! de!las! p o eínas!se! con i mó! po !
wes e nHblo !( igu a!3.2.B).!Una! ez!analizados!los! esul ados!se!puede!conclui !
que:! (1)! SlRD! in e acciona! de! o ma! más! a o able! con! la! o ma! sil es e! de!
SlCIPK6,!(2)!la!ac i idad!quinasa!pa ece!se !impo an e!pa a!la!in e acción!y!(3)!
el!dominio!quinasa!es!impo an e!pa a!la!unión!en e!SlCIPK6!y!SlRD!ya!que!la!
o ma!SlCIPK6ΔC e m!man iene!la!in e acción.!
!
!
!
!
!
Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
124!
iempo! eal!u ilizando!oligonucleó idos!especí icos!pa a!SlRD!y!pa a!el!gen!de!la!
ac ina,!empleado!como!con ol!endógeno!de!la!exp esión.!
3.3.1. Acumulación!de! ansc i o!en!di e en es! ejidos!y!en! espues as!a!
Ps !DC3000!
En!el!capí ulo!an e io !se!comp obó!la!pa icipación!de!SlRD!en!el!desa ollo!de!
los!sín omas!de!en e medad!desencadenada!po !la!bac e ia!pa ógena!Ps !DC3000!
en! oma e.!La!hoja!es!el!pun o!p incipal!de!en ada!en!la!plan a!de!dicha!bac e ia,!
po ! lo! que! e a!impo an e! e i ica ! la!exp esión! de! SlRD!en! es e! ejido!y,! po !
ex ensión,!en!o os! ejidos!de! oma e.!Pa a!ello!se! oma on!mues as!de!cada!uno!
de!los!ó ganos!y!se!analizó!la!acumulación!de! ansc i o!median e!PCR!a! iempo!
eal!Los! esul ados!ob enidos!se!pueden!obse a !en!la! igu a!3.6.!!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
Como!se!obse a!en!la! igu a!3.6!SlRD!se!exp esa!en! odos!los! ejidos!analizados.!
Cabe! des aca ! que! la! acumulación! de! ansc i o! obse ada!en! aíz! es! muy!
ele ada,! especialmen e!si! compa amos! con! la! ob enida!en! hojas!(26! eces!
!"
#"
$!"
$#"
%!"
%#"
&!"
'()*" +,-.(/(" 0*//(" 1/(2" 3*45"
6.7,/,8"2,/*97(8":,"";36<"
=2>*?(8"
!"
#"
$!"
'()*" +,-.(/(" 0*//(" 1/(2" 3*45"
6.7,/,8"2,/*97(8":,";36<"
=2>*?(8"
Figu a)3.6:) Pa ón) de) exp esión) de) SlRD)en) di e en es) ó ganos) de) oma e.!Los!ni eles!de!
mensaje o!de!SlRD!se!analiza on!median e!PCR!a! iempo! eal!a!pa i !de!40!ng!de!cDNA!ob enidos!
as!aisla !RNA!de!los!di e en es!ó ganos.!Los!ni eles!de!exp esión!se!encuen an! e e idos!a!la!
acumulación!de! ansc i o! en! hojas.!Se! ep esen a!el! alo !medio!de! es!ensayos!con! éplicas!
biológicas!independien es.!La!ba a!de!e o !co esponde!al!e o !es ánda !de!la!media.!

Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
125!
supe io ).!Es e!da o!sugie e!que!SlRD!pod ía! ene !una! unción!impo an e!en!
aíz!que!debe á!se !es udiada!en!mayo !p o undidad.!En!gene al,!la!acumulación!
de! ansc i o!obse ada,! en! condiciones! no males! de! c ecimien o,!en! peciolo,!
allo,! lo !y! aíz!es!unas!3! eces!mayo !que!la!ob enida!en!hojas.!Fue!impo an e!
con i ma !la!exp esión!en!hojas!ya!que!se!ha!demos ado!que!SlRD!pa icipa!en!
la! esis encia!a!la!in ección!po !Ps !DC3000!en!es e!ó gano.!Sin!emba go!no!se!
puede!desca a !que!la!exp esión!de!SlRD+se!induzca!en! espues a!a!es és.!
Pos e io men e!se! p ocedió! al! es udio! del! pa ón! de! exp esión! de! SlRD!en! la!
espues a!ETI!y!suscep ible!en! oma e.!El!p ocedimien o!expe imen al!se! ealizó!
siguiendo!las!mismas!pau as!desc i as!pa a!SlCIPK6!(apa ado!2.2!del!capí ulo!1).!!
!!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
Tan o!en!la! espues a!suscep ible!( igu a!3.7.A)!como!en!la! espues a!ETI!( igu a!
3.7.B)!se! ap ecia! una! ele ada! acumulación! de! ansc i o! de! SlRD.! Aunque! la!
exp esión!de!SlRD!en!hojas!en!condiciones!no males!de!c ecimien o!no!es!muy!
ele ada! és e!se! induce! ápidamen e! cuando! la! plan a! es! in ec ada! po !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Ps !DC3000.!!
Figu a)3.7:)Pa ón)de)la)acumulación) ansc ipcional)de)SlRD)en)plan as)de) oma e)(A))RGR
P oS)in ec adas)con)Ps )DC3000)(104)UFC/ml))du an e)la) espues a)suscep ible)y)(B))RGR
P oR)in ec adas)con)Ps )DC3000)(107)UFC/ml))en)la) espues a)ETI.!Los!ni eles!de!mensaje o!
de!SlRD!se!analiza on!median e!PCR!a! iempo! eal!a!pa i !de!40!ng!de!cDNA!ob enidos! as!aisla !
RNA!de!hojas!de! oma e!du an e!el!desa ollo!de!los!sín omas!de!en e medad!o!du an e!la!HR.!Los!
ni eles!de!exp esión!se!encuen an! e e idos!a!la!acumulación!de! ansc i o!en!el!pun o!ce o.!Se!
ep esen a! el! alo !medio!de! es!ensayos!con! éplicas!biológicas!independien es.! La!ba a!de!
e o !co esponde!al!e o !es ánda !de!la!media!
!"
#"
$"
%"
&"
'!"
!" '" #" (" $"
)*+,-./01",-23453"
6/-7+8"9:;3.<"
=>8?"
@
!"
#"
$!"
$#"
%!"
%#"
&!"
!" '" (" $)"
*+,-./012"-.34564"
70.8,9":;9-4/<"
=>9?"
@
Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
126!
En! el! caso! de! la! espues a! suscep ible! ( igu a!3.6.A)! la! acumulación!
ansc ipcional!del!gen!es!menos!abundan e!que!en!la! espues a!ETI,!ocu e!a!
iempos!muy! emp anos!(día!1)!y!se!man iene!a!lo!la go!del! iempo.!La!ele ada!
acumulación!de! ansc i o!ob enida!en!el!día!1! as!la!in ección!sugie e!que!SlRD!
pod ía!pa icipa !en!la!señalización!iniciada!an es!de!la! o mación!de!las!lesiones,!
obse adas!en!el!día! es.!Es e!da o!apoya!los! esul ados!p e ios!en!los!que!la!
pé dida!de! unción!de!SlRD!disminuye!los!sín omas!de!en e medad!desa ollados!
en! oma e.!!
Po !o o!lado,! du an e!la! espues a!ETI!( igu a!3.7.B),! el! ansc i o!de!SlRD!se!
acumula!a!ni eles!muy!ele ados!llegando!a!su!pico!máximo!a!las!ocho!ho as! as!
la!in ección!(25! eces!supe io !al!pun o!ce o),!momen o!en!el!que!se!obse a!una!
PCD! isible.! Pos e io men e! iene! luga ! un! disminución! d ás ica! que! pod ía!
debe se! a! una! mue e! celula ! masi a! en! la! zona! de! in il ación.! Aunque! los!
ni eles!de! ansc i o!obse ados!pa a!SlRD!en!la! espues a!ETI!son!mayo es!que!
los!obse ados!pa a!SlCIPK6,!el!pa ón!de!la!acumulación!de! ansc i o!es!simila .!
Es os!da os!apoyan!una!posible!ac uación!coo dinada!de!ambas!p o eínas!en!la!
espues a!ETI.!
3.3.2. Acumulación!de! ansc i o!en! espues a!a!es és!abió ico.!
En!el!capí ulo!1!se!mos ó!que!SlCIPK6!se!exp esa!en!condiciones!de!es és!salino!
y! osmó ico.!Además!se! ha! desc i o! que! la! sob e[exp esión! de! la! e sión!
cons i u i a!ac i a!CaCIPK6!(CaCIPK6T172D)!en!N.+ abacum!p esen a!una!mayo !
ole ancia!a!es és!salino!y!p esión!osmó ica!(PO)!(T ipa hi,!Pa asu aman!e !al.!
2009).! Po ! es os! mo i os! se! decidió!analiza ! la! acumulación! de! ansc i o! de!
SlRD!en! espues a! a!clo u o! sódico!(NaCl)!y!mani ol.! El!es udio!del!pa ón! de!
exp esión!se! ealizó! siguiendo! las! mismas! pau as! desc i as!pa a! SlCIPK6!
(apa ado!2.4!del!capí ulo!1).!
!
!
!
Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
127!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
La!acumulación!de!los!mensaje os!de!SlRD!en! espues a!a!los! a amien os!con!
NaCl!y!mani ol!es!muy!abundan e.!En!el!caso!de!la!adición!al!medio!de!NaCl!se!
obse a!que!la!acumulación! ansc ipcional!de!SlRD+ocu e!a! iempos!co os!(2!
ho as)! y! és a! se! man iene! has a! las! 24! ho as,! donde! decae! ( igu a! 3.8.A).! Sin!
emba go!la! espues a!mos ada!po !el! ansc i o!de!SlRD!en! espues a!al!medio!
suplemen ado! con! mani ol! es! bien! di e en e.! La! mayo ! abundancia! de!
mensaje os!de!SlRD! iene!luga !a!un! iempo!mas! a dío!(12!ho as)!y!los!ni eles!
de! ansc i os!ob enidos!son!supe io es,!llegando!a!se !40! eces!mayo !que!el!
iempo!ce o!( igu a!3.8.B).!!
Es os! da os! son! simila es! a! los! que! se! ha! obse ado!pa a!su! o ólogo! de!
A abidopsis!(A RD2),!el!cual!mues a!una!acumulación! ansc ipcional!de! o ma!
a día!en! espues a!a!sequía!(Yamaguchi[Shinozaki,!Koizumi!e !al.!1992).!Un!da o!
ele an e! es! que! el! pa ón! de!la! acumulación! ansc ipcional! obse ado! pa a!
SlRD!es!simila !al!ob enido!pa a!SlCIPK6!en! espues a!a!NaCl!y!PO.!Tan o!SlRD!
como! SlCIPK6! mues an! una! acumulación! de! ansc i o! en! espues a! a! NaCl! a!
iempos! co os! (1! ho a),! mien as! que! pa a! el! a amien o! con! mani ol! la!
acumulación!ob enida!es! a día!(12!ho as).!
!"
#"
$"
%"
&"
'!"
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'$"
'%"
!" #" $" &" '#" #$"
()*+,-./0"+,12342"
5.,6*7"897+2-:"
;2<1"
=
!"
#!"
$!"
%!"
&!"
'!"
!" $" &" (" #$" $&"
)*+,-./01",-23453"
6/-7+8"9:8,3.;"
<="
>
Figu a)3.8:)Pa ón)de)la)acumulación)de) ansc i o)de)SlRD)en) oma e) espues a)a)NaCl)(A))y)
PO)(B).!Los!ni eles!de!mensaje o!de!SlRD!se!analiza on!median e!PCR!a! iempo! eal!a!pa i !de!40!
ng!de!cDNA!ob enido! as!aisla !RNA!de!hojas!de! oma e! a adas!con!NaCl!(100!mM,!A)!o!mani ol!
(300! mM,! B)! a! los! iempos! de! a amien o! indicados.! Los! ni eles! de! exp esión! se! encuen an!
e e idos!a!la!acumulación!de! ansc i o!en!el!pun o!ce o.!Se! ep esen a!el! alo !medio!de! es!
ensayos!con! éplicas!biológicas!independien es.!La!ba a!de!e o !co esponde!al!e o !es ánda !
de!la!media!
!
Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
128!
Es os! son! los! p ime os! esul ados! que! indican! la! pa icipación! dual!en! la!
espues a!a!es és!abió ico!y!bió ico!de!una!p o eína!con!dominio!Usp!en!plan as.!
3.4. Es udio)de)la) os o ilación)de)SlRD)po )SlCIPK6)
Dado! que!SlRD! es! capaz! de! in e acciona ! con! SlCIPK6! y! es a! unión! es!
dependien e!de!la!ac i idad!quinasa!( igu a!3.2),!se!quiso!in es iga !si!SlRD!e a!
un!!sus a o!de! os o ilación!de!SlCIPK6.!!
Pa a!lle a !a!cabo!es e!obje i o!la!p o eína!SlRD!se!clonó!en!el! ec o !pDEST17!
( usión! ansc ipcional!a!un!cola!de!6!his idinas),!se!exp esó!en!la!cepa!de!E.+coli!
BL21! y! se! pu i icó!median e! columna! de! níquel.! Po ! o a! pa e! las! e siones!
sil es e! y! cons i u i a! ac i a! de! SlCIPK6! se! clona on! en! el! ec o ! pC[TAPa!
( usión! ansc ipcional!a! una! cola! de! 6! his inas! y! al! epi opo! Myc),! se! ag o[
exp esa on!en!hojas!de!N.+ben hamiana!y!se!pu i ica on!median e! esina!con!IgG!
unida!(apa ado!M.6.4!de!ma e iales!y!mé odos).!Pa a!la! eacción!de! os o ilación!
se!empleó!la!misma!can idad!de!ambas!p o eínas!(ap oximadamen e!1!μg),!las!
cuales!se!man u ie on!a!30ºC!du an e!50!minu os!en!p esencia!de![γ[32P]!ATP!
(apa ado!M.6.6!de!ma e iales!y!mé odos).!T as!de ene !la! eacción!las!mues as!
se!analiza on!po !SDS[PAGE!y!se!au o[ adiog a ía on.!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
Figu a)3.9:)Fos o ilación)in# i o)de)SlRD)po )SlCIPK6.)Pa a!el)ensayo!quinasa)se!empleó!2!μg!
de!las!p o eínas!de! usión!HIS[SlRD,!Myc[SlCIPK6!y!SlCIPK6T172D!pu i icadas.!Las!mues as!se!
analiza on!po !SDS[PAGE!y!se!au o[ adiog a ia on.!Como!con ol!de!ca ga,!la!misma!memb ana!se!
analizó!median e!wes e nHblo ,!u ilizando!los!an icue pos!desc i os!a!la!de echa!de!la! igu a.!!
SlCIPK6-Myc !
SlCIPK6T172D-Myc!
SlRD-HIS!
!
- + - + - !
- - + - +!
+ + + - - !
α-Myc"
α-HIS"
97 "
118 "
29 "
γ-ATP"
kD"
Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
129!
En!el!panel!supe io !de!la! igu a!3.9!se!obse an!dos!bandas!co espondien es!a!
los!ca iles!donde!se!ha!lle ado!a!cabo!la! eacción!de! os o ilación!con!SlCIPK6!y!
SlRD.!Es os! esul ados!indican!que!SlRD!es! os o ilada! an o!po !SlCIPK6!como!
po ! SlCIPK6T172D.! No! se! obse ó!señal! en! ausencia! de! SlRD! o!SlCIPK6! o!
SlCIPK6T172D.! Como! con ol! de! ca ga!se! ealiza on! dos!wes e nHblo s!de! la!
misma! memb ana!empleada! en! el! ensayo! quinasa,! u ilizando! pa a! ello! los!
an icue pos!an i[HIS!y!an i[Myc!(panel!medio!e!in e io ).!
El!hecho!de!que!un!miemb o!de!la! amilia!de!las!CIPKs! os o ile!a!una!p o eína!
di e en e!a!un!canal! esul a!po !sí!mismo!un!apo e!no edoso.!Los!sus a os!de!
os o ilación! mejo ! ca ac e izados!de! las! CIPKs! has a! aho a! son! canales! de!
memb ana!que!median!la! esis encia!a!es és!abió icos.!Así!po !ejemplo!se!ha!
desc i o!la! os o ilación,!po !miemb os!de!la! amilia!de!las!CIPKs,!de!las!p o eínas!
de!memb ana!AKT1!(Xu,!Li!e !al.!2006)!y!AHA!(Fuglsang,!Guo!e !al.!2007).!Sin!
emba go! ambién!se!ha!desc i o!la! os o ilación!po !PKS5!de!la!p o eína!que!no!
canal!NPR1!(Xie,!Zhou!e !al.!2010).!O o!da o!no edoso!es!el!hecho!de!que!un!
miemb o!de!la! amilia!Usp!sea! os o ilado!po !una!CIPK.!P e iamen e! an!solo!se!
había! is o!la! os o ilación!de!la!Usp!de!A abidopsis!A PHOS32!po !las!p o eínas!
A MAPK3!y!A MAPK4!(Me kou opoulos,!And easson!e !al.!2008).!Po !lo! an o!la!
iden i icación!de!un!sus a o!nó el!pa a!las!CIPKs!con! unciones!di e en es!a!las!
de!canal!de!memb ana!suponen!una!apo ación!no edosa!y!amplia!el!abanico!de!
unciones!po encialmen e! eguladas!po !es as!quinasas.!
3.5. Es udio)de) la) implicación) de) SlRD)en) la) espues a) inmune) en)
Solanáceas)
P e iamen e!hemos!desc i o!la!pa icipación!de!SlCIPK6!en!la!PCD!mediada!po !
di e en es!p o eínas!R/elici o es!en!N.+ben hamiana.! Po ! an o!e a! impo an e!
de e mina ! si!SlRD! ambién! pa icipa! en! las!mismas! ías!de! señalización.! Se!
empleó! plan as!de!N.+ben hamiana!en! ez!de! oma e! po que!el! silenciamien o!
median e!VIGS!es!más! e icien e.!Además!N.+ben hamiana!pe mi e!la!exp esión!
ansi o ia,! ía!Ag obac e ium,!de!los!dis in os!elici o es!de!la!PCD.!!
P e iamen e!al!expe imen o,! se!compa a on! las! secuencias! de! nucleó idos!del!
cDNA! de!RD!de! oma e! y!de! abaco! (único! del! géne o!cuya! secuencia! se!

Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
130!
encuen a!deposi ada!en!la!bases!de!da os,!SGN[U430618)!pa a!ga an iza !que!el!
silenciamien o!génico!de!SlRD!se!puede!lle a !a!cabo!en!N.+ben hamiana!( igu a!
3.10).!!
!
!
!
!
!
!
!
!
Pa a! que! enga! luga ! el!silenciamien o!median e! la! ecnología! VIGS,! el! gen!
endógeno! y! el! cDNA! deben! compa i ! como! mínimo! de! 21!a! 23! nucleó idos!
idén icos!a!lo!la go!de!la!secuencia!de!nucleó idos!(Baulcombe!1999).!Como!se!
mues a! en! la! igu a!3.10!la! iden idad! en e! ambos! genes! es! muy! ele ada! y!
exis en! dos! egiones! con! mas! de! 21! nucleó idos! idén icos,! po ! lo! que!el!
silenciamien o!del! o ólogo+NbRD!en!N.+ ben hamiana!se ía! a! p io i!e icien e!
empleando!SlRD!pa a!ello.!Independien emen e!se! ealizó!una!PCR!a! iempo! eal!
con!oligonucleó idos!especí icos!de!RD!con!el! in!de!con i ma !el!silenciamien o!
génico!de!NbRD!en!plan as!de!N.+ben hamiana.!!
!
!
!
!
!
Figu a) 3.10:) Alineamien o) de) la) secuencia) de) nucleó idos) de) N RD) y) SlRD.!El! ondo!neg o!
mues a!los! esiduos!idén icos!en!ambas!secuencias!y!en!blanco!los!! esiduos!no!conse ados.!El!
alineamien o!se! ealizó!median e!Clus alW!u ilizando!el!p og ama!bioEdi .!
SlRD ATGGAAACGGTTATGGAAGACGAAAAGTACAATTGGAGCGAAGTGAAGCTTCATTCTCTCATACCCATAGTGCCGGAGCC 80
N RD ATGGAAACACTAATGGAGGAAGAAGAGTACAACTGGAGAGAAGTGAAGCTTCCGTCGCTCATACCAGTGGTGCCGCCGCC 80
SlRD GGAGCTCGATAGGGAAACCGGCGAACGGCGTCGCGGCCGTGATATAGTGATCGCTATAGATCACGGTCCTAATAGCAAAC 160
N RD TGAACTGGAGAGAGAAACAGGAGAAAGGCGCCGTGGGCGTGACATAGTCATCGCTATTGATCACGGTCCTAACAGCAAGC 160
SlRD ACGCTTTTGATTGGGCCGTTACTCACCTTTGCCGTCTCGCCGATACGCTTCATCTCGTTCACGCCGTCTCCAGTCTGAAA 240
N RD ACGCTTTTGATTGGGCTGTTACTCATATTTGCCGTCTCGCTGATACCATTCATCTTGTCCACGCCGTCTCCAGTTTGAGA 240
SlRD AATGAGATAGTTTATGAGGCTACGCAAGGACTCATGGAGAAGCTTGCTGTTGAGGCTTTTTCGGTTGCTATGGTGAAGAC 320
N RD AATGAGATTGTCTATGAAGCTACACAGGCGCTCATGGAGAAGCTTGCCATCGAGGCTTTTGAGGTTGCTATGGTGAAGAC 320
SlRD AGTGGCTAGGATTGTGGAAGGAGATGCTGGAAAGGTAATTTGCAAGGAAGCAGAAAGGTTGAAGCCTTCAGCTGTGGTTA 400
N RD AGTGGCTAGGATTGTGGAAGGAGATGCTGGAAAGGTTATATGCAGGGAAGCAGAACGGTTGAAGCCTGCAGCCGTGGTTA 400
SlRD TGGGAACCAGGGGACGTGGCATAATTCAAAGTGTACTGCAAGGAAGTGTCGCTGAGTATTGCTTACACAACTGTAAGATA 480
N RD TGGGAACCAGGGGACGTAGTTTAATCAAAAGTGTACTTCAAGGAAGTGTGGGTGAGCATTGCTTTCACCACTGTAAAACA 480
SlRD GCACCGGTCATCATAGTTCCTGGAAAAGAAGCTGGGGAAGTCTCTGTGATTTAA 534
N RD GCCCCAATCATAATAGTTCCTGGAAAAGAAGCAGGGGAGGAATCTGTAATTTAA 534
Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
131!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
El! silenciamien o! de! RD! es! muy! e icien e,! con!una! educción!del! 85%! en! la!
exp esión,! espec o!a!la!plan a!con ol!TRV[C!( igu a!3.11.A).!T as!una!búsqueda!
median e! BLAST! en! la! base! de! da os! de! Solanáceas! y! de! ! A abidopsis!no! se!
iden i icó!! ningún! gen! que!compa ie a!una!semejanza!impo an e!con!SlRD!o!
A RD2! espec i amen e.!Sin!emba go!pa a!asegu a !que!en!la!plan a!TRV[SlRD!
no! enía!luga !el!co[silenciamien o!!de!o os!genes!de!la! amilia!Usp,!se! ealizó!
una!PCR!a! iempo! eal!de!dos!de!los!miemb os!más!ce canos! ilogené icamen e!a!
A RD2.! Como! se! mues a! en! la! igu a! 3.11.B! los! genes! SGNHU565777! (más!
pa ecido!a! A 3g53990)! y!SGNHU578954! (más!pa ecido!a!A 3g17020)!no!se!co[
silencian!con!RD!en!!plan as!de!N.+ben hamiana+TRV[SlRD.!
!
Figu a)3.11:)Silenciamien o)de)los)genes)SlRD,)SGNRU565777)(A 3g53990))y)SGNRU578954)
(A 3g17020))en)plan as)TRVRSlRD)de)N.#ben hamiana.)A)!Análisis!de!los!ni eles!de!mensaje o!
de!SlRD!!en!plan as!TRV[RD!con! espec o!a!TRV[C!median e!PCR!a! iempo! eal.!La!posición!de!los!
olignucleó idos!empleados!en!la! eacción!de!PCR!se!mues an!con!una! lecha.!El! agmen o!de!
cDNA!del!gen!SlRD!empleado!en!el!silenciamien o!se!nomb a!como!TRV[SlRD.!B)!Análisis!de!los!
ni eles! de! mensaje o! los! genes! SGN[U565777! y! SGN[U578954,! o ólogos! de! A 3g53990! y!
A 3g17020! espec i amen e,!en!plan as!TRV[RD!y!TRV!median e!PCR!a! iempo! eal.!Se! ep esen a!
el! alo ! medio! de! es! ensayos! con! éplicas! biológicas! independien es.! La! ba a! de! e o !
co esponde!al!e o !es ánda !de!la!media!
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4
5678!"
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Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
132!
3.5.1. Implicación! de! SlRD! en! el! desa ollo! de! los! sín omas! de!
en e medad!en!N.+ben hamiana!
En! el! capí ulo! 2!se! desc ibió!la! implicación!de! SlRD! en! el! desa ollo! de! los!
sín omas!de!en e medad!en! oma e.!Las!plan as!suscep ibles!de! oma e!P oS[RG!
silenciadas! pa a!el! gen!SlRD!mos a on!un! meno ! c ecimien o! de! la! bac e ia!
pa ógena! Ps !DC3000!con! espec o! al! con ol! (TRV[C).!Pa a!comp oba ! si! el!
eno ipo!de! esis encia!obse ado!en! oma es! e a! ex ensible! a! o as!
in e acciones! de! suscep ibilidad,! se! in ec a on!plan as!de! N.+ben hamiana,!con!
seis!semanas!de!edad,!con!la!bac e ia!Ps ! abaci!a!una!concen ación!de!5!·!105!
UFC/ml.!És a!da!luga !a!lesiones!de i adas!del!desa ollo!de!la!en e medad!4[5!
después!de!la!in ección.!!
Cua o! días! después! de!la! in ección! las! plan as! silenciadas! con! SlRD!no!
mos a on!PCD!asociada!a!la!en e medad!en!compa ación!con!las!plan as!TRV[C,!
donde!el! ejido! ege al!es aba!comple amen e!colapsado!( igu a!3.12.A).!Cuando!
comenzó!a! e se!el!colapso!celula !un!70%!de!las!plan as!TRV[SlRD!mos a on!
inhibida!la!PCD!de i a!del!p og eso!de!la!en e medad.!Sin!emba go!en!las!plan as!
TRV[C! an! solo!en! un! 10%! se! isualizó!la!inhibición! de!la! mue e! celula !
esul an e!de!la!in ección!( igu a!3.12.C).!Los! esul ados!ob enidos!se! e o za on!
con!la!cuan i icación!de!la!mue e!celula !po !mediada!de!la!conduc i idad!iónica!
( igu a!3.12.B).!!
!
!
!
!
!
!
!
!
Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
133!
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!
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!
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!
!
!
!
!
!
!
!
!
3.5.2. Papel!de!SlRD!en!la! espues a!ETI!mediada!po !P o/A P o+
En!es udios!p e ios!se!ha!desc i o!la!pa icipación!de!SlCIPK6!en!la!PCD!mediada!
po !P o/A P o,!po !lo!que!se!quiso!comp oba !si!SlRD!pod ía!es a !in oluc ada!
en!es a!misma! u a.!Con!el! in!de!de e mina !es a!posibilidad!se!ag o[exp esó!la!
combinación!A P o/P o!en!hojas!de!N.+ben hamiana!silenciadas!pa a!SlRD.!La!
u a! de! esis encia! mediada! po ! P o!es á! conse ada! en! N.+ ben hamiana:! P o!
o ma!un!complejo!con!A P o!que!es abilizado!po !P !inicia!una!ETI!que!incluye!
un!e en o!de!PCD.!Como!con ol!de!mue e!celula !se!ag o[exp esó!el!gen!p o[
apop ó ico!de! a ón!Bax+(Lacomme!y!San a!C uz!1999).!Los! esul ados!ob enidos!
as!48!ho as!de!la!in il ación!se!mues an!en!la! igu a!3.13.!
Figu a)3.12:)El)silenciamien o)de)SlRD)en)plan as)de)N.#ben hamiana) educe)los)sín omas)
de)en e medad.)A)!Fo os! omadas!cua o!días!después!de!la!in il ación!con!la!cepa!Ps + abaci!a!
una!concen ación!de!5!·!105!UFC/ml.!En!el!ensayo!se!emplea on!plan as!silenciadas!con!el!gen!
SlRD!(TRV[SlRD)! y! el! ec o ! acío! (TRV[C),! como! con ol.! B)!Medida! de! la! PCD! median e!
conduc i idad! iónica.! Se! ep esen a! el! alo ! medio! de! cua o! ensayos! con! éplicas! biológicas!
independien es.!La!ba a!de!e o !co esponde!al!e o !es ánda !de!la!media.)C)!El!po cen aje!de!
mue e!celula !obse ado!en!A!se!ca ego izó!en! es!clases:!comple a!(>80%),!pa cial!(20[80%)!y!
no!PCD!(<20%).!!
Los!expe imen os!se! epi ie on!un!mínimo!de!cua o! eces.!
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Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
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140!
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!
En!p esencia!del!agen e!c ossHlinking!apa ece!una!nue a!banda!en!el!wes e nHblo !!
cuyo! amaño!co esponde!al!doble!de!la!banda!ob enida!pa a!la!p o eína!SlRD!en!
el! ensayo! no! a ado! ( igu a! 3.16).! Po ! lo! an o!y! a endiendo! a! los! esul ados!
obse ados!se!puede!asegu a !que!SlRD! o ma!un!homodíme o!in+ i o.!!
3.6.1. Localización!del!díme o!SlRD[SlRD!median e!BiFC!
Una! ez!obse ado!que!SlRD! o ma!homodíme os!en!le adu as!y!en!bac e ias!se!
quiso! co obo a ! si! es e! enómeno! enía! luga ! en! células! ege ales! y,! si! así!
ocu ía,!es udia !la!dis ibución!en!és as.!El!abo daje!de!es e!obje i o!se! ealizó!
median e!un!ensayo!de!BiFC,!al!igual!que!se!hizo!en!el!es udio!de!la!in e acción!
SlCIPK6/SlRD.!Pa a!ello!se!clonó!el!cDNA!comple o!de!SlRD!en!los! ec o es!del!
BiFC!y! median e! Ag obac e ium!se! exp esa on! las!cua o! combinaciones!
di e en es!en!hojas!de!N.+ben hamiana.!Dos!días!después!el! esul ado!se! isualizó!
en!un!mic oscopio!con ocal!( igu a!3.18).!
!
!
!
Figu a)3.17:)SlRD)) o ma)un)homodíme o)in# i o.!!La!sob e[exp esión!de!HIS[SlRD!en!E.+coli!se!
indujo!po !la!adición!al!medio!de!cul i o!de!1!mM!de!IPTG.!Las!células!se! a a on!du an e!30!
minu os!con!el!agen e!c osslinking!DSG!y!la!sob e[exp esión!de!la!p o eína!se!de ec ó!po !wes e nH
blo ,!empleando!el!an icue po!an i[HIS.!El!ni el!de!polime ización!se!calculó!en! unción!al!peso!
molecula ! esul an e,!!donde!1X!!co esponde!al! amaño!del!monóme o!y!2X!al!del!díme o.!
!"""""""""!""""""""#"
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Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
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141!
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!
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!
!
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!
!
La!combinación!que!mos ó!unos! esul ados!más! ep esen a i os! ue!aquella!en!
la!que!el! ozo!de!la!p o eína!YFPC!y!YFPN!se!encon ó! usionado!al!!N[ e minal!de!
SlRD.!Como!se!ap ecia!en!la! igu a!3.18!el!díme o!SlRD/SlRD!se!localiza,!en!las!
condiciones!ensayadas,!en!el!ci oplasma!( igu a!3.18.A!y!B)!y!en!el!núcleo!( igu a!
3.18.C).! P e iamen e! a! su! colocalización! con! el! ma cado ! de! ci oplasma!
A FKBP12[CFP! (cian)!se! obse ó! que! SlRD/SlRD! no! se! colocaliza! con! FM4[64!
( igu a!3.18.B),!po !lo!que!se!desca ó!su!localización!en!la!memb ana!plasmá ica.!
La!dis ibución!obse ada!pa a!el!díme o!de!SlRD/SlRD!es!simila !a!la!ob enida!a!
po ! la! usión! GFP[SlRD,! is a! en! el! apa ado! 2.2.!Es os! son! los! p ime os!
Figu a) 3.18:)Localización) celula ) del) homodíme o) o mado) po ) SlRD) en) células)
epidé micas)de)N.#ben hamiana.!A)y)C)!Colocalización!del!díme o!SlRD[SlRD!(ama illo)!con!el!
ma cado !de!memb ana!FM4[64!( ojo).!B)!Colocalización!del!díme o!SlRD[SlRD!(ama illo)!con!la!
p o eína! ci oplasmá ica! A FKBP12[CFP! (cian).! Las! cons ucciones! SlRD[YFPC!y! SlRD[YFPN!se!
exp esa on!de! o ma! ansi o ia!en!hojas!de!N.+ben hamiana! ía!Ag obac e ium.!Pasados!dos!días!
se! isualizó! la! exp esión! en! un! mic oscopio! con ocal.! Las! lechas! ema can! la! localización!
obse ada!pa a!SlRD.!
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-(.'(/%."
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"789""
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"789""
Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
142!
esul ados!que!mues an!la!dime ización!y!localización!in+ i o!de!una!p o eína!
con!dominio!Usp!de!plan as.!
3.6.2. Implicación!de!la!dime ización!en!la!unión!a!SlCIPK6!
T as!comp oba !la!capacidad!de!SlRD!de! o ma !díme os!se!p ocedió!a!es udia !
la!implicación!que!la!dime ización! enía!en!la!in e acción!a!SlCIPK6.!Pa a!ello!se!
cons uyó!un!mu an e!de!SlRD!en!el!que!se!había!eliminado!los!aminoácidos!VIIV,!
co espondien es,!a!p io i,!a!los! esiduos! esponsables!de!la!dime ización!( igu a!
3.1),!y!al!que!se!denominó!SlRDΔDIM.!Pos e io men e!se! ealizó!un!ensayo!de!
doble!híb ido!donde!las!le adu as!exp esaban!la! e sión!SlRDΔDIM!en!el! ec o !
p esa! y! cebo!simul áneamen e! (pEG202! y! pJG4[5! espec i amen e)! con! el!
obje i o!de! e i ica !que!el!dominio!eliminado! ealmen e!es aba!implicado!en!la!
dime ización.!Como!con ol!posi i o!se!emplea on!las!le adu as! ans o madas!
con!las! o mas!sil es es!de!SlRD!( igu a!3.16).!
No!se!obse ó!in e acción!en!las!le adu as! ans o madas!con!las!cons ucciones!
pEG202[SlRDΔDIM!y!pJG4[5[SlRDΔDIM!( igu a!3.19.A).!Los! esul ados!ob enidos!
se! cuan i ica on!po ! ensayo! β[galac osidasa! ( igu a! 3.19.C).! Es os! da os!
demues an! que! la! egión! eliminada! es! la! esponsable! de! la! dime ización!en!
le adu as,! ya! que! SlRDΔDIM! pie de! la! capacidad! de! o ma ! homodíme os.! La!
exp esión!de!las!p o eínas!u ilizadas!en!el!ensayo!de!doble!híb ido!se! e i icó!
median e!wes e nHblo !( igu a!3.19.B).!
!
!
!
!
!
!
!
Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
143!
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!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
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!
!
!
!
!
!
!
Figu a) 3.19:)Ensayo) de) doble) híb ido) con) la) o ma) mu an e) SlRDΔDIM)en) le adu as.!A)!
Ensayo!de!doble!híb ido!empleando!como!cebo!y!p esa!a!la!p o eína!SlRDDIM.) B)!Wes e nHblo !
que!con i ma!la!exp esión!en!le adu as!de!la! o ma!mu an e!SlRDΔDIM.!C)!Medida!de!la!ac i idad!
β[galac osidasa!exp esada!en!unidades!de!Mille .!Se! ep esen a!el! alo !medio!de! es!ensayos!
con! éplicas! biológicas! independien es.! La! ba a! de! e o ! co esponde! al! e o ! es ánda ! de! la!
media.!La!cepa!de!S.+ce e iseae!EGY48!se!usó!pa a!p oba !la!capacidad!de!dime iza !de!la! o ma!
mu an e!SlRDΔDIM!(clonada!en!los! ec o es!pEG202!y!pJG4[5).!Los!ensayos!se! ealiza on!sob e!
placas!que! ue zan!la!in e acción,!(1)!SD!Gal!con!Xgal!y!(2)!SD!Gal!sin!LEU.!Los!cul i os!que!se!
hicie on! c ece !du an e! oda! la! noche! en! medio! mínimo! SD!(SD! Glu! –URA,! [HIS! y! –TRP)!se!
diluye on!en!agua!es é il!y!se!plaquea on!a!una!DO600!de!0.1!y!0.001..!!
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Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
144!
Pa alelamen e!se!lle a on!a!cabo!ensayos!de!BIFC!con!la! e sión!SlRDΔDIM!con!
el!obje i o!de! e i ica !si!el!dominio!de!dime ización!eliminado! ambién!es aba!
implicado!en!la! o mación!de!los!díme os!en!N.+ben hamiana.!P e iamen e,!pa a!
comp oba !la!es abilidad!de!la!p o eína!SlRDΔDIM!en!la!plan a,!se!ag o[exp esó!
en!hojas!de!N.+ben hamiana!la!p o eína!de! usión!GFP[SlRDΔDIM!y!se! isualizó!su!
localización!median e!mic oscopía!con ocal.!!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
Como!se!puede!ap ecia !en!la! igu a!3.20!la!p o eína!GFP[SlRDΔDIM!se!exp esa!
pe ec amen e!en!la!plan a!y!su!localización! ue!simila !a!la!p esen ada!po !GFP[
SlRD!( igu a!3.4),!encon ándose!en!el!núcleo!( lechas!blancas,! igu a!3.21.A)!y!en!
el!ci oplasma!( lechas!blancas,! igu a!3.21.B)!!De!es os!da os!se!puede!in e p e a !
que! el! anspo e! de! SlRD! al! núcleo! es! independien e! del! es ado! de! díme o! o!
monóme o.! A! con inuación! se! clonó! la! o ma! GFP[SlRDΔDIM!en! los! cua os!
ec o es! del! BiFC! y! pos e io men e! se! ag o[exp esa on! las! di e en es!
combinaciones! en! hojas! de! N.+ ben hamiana,! iéndose! los! esul ados! dos! días!
después!median e!mic oscopía!con ocal!( igu a!3.21).!
Figu a) 3.20:)Localización) celula ) del) mu an e) SlRDΔDIM)en) células) epidé micas) de) N.#
ben hamiana.!A) y) B)!Colocalización!de!GFP[SlRDΔDIM!( e de)!con!el!ma cado !de!memb ana!
FM4[64!( ojo).!La!cons ucción!GFP[SlRDΔDIM!clonada!en!el! ec o !pGWB5!se!exp esó!de! o ma!
ansi o ia! en! hojas! de! N.+ ben hamiana! ía! Ag obac e ium.! Pasados! dos! días! se! isualizó! la!
exp esión!en!un!mic oscopio!con ocal.!Las! lechas! ema can!la!localización!obse ada!pa a!GFP[
SlRDΔDIM.!
!
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$%&'()*+,+-."
"/01""
2/01""
34)456)786579:"
.6;56<4;"
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!"#$%#&
Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
!
145!
!
!
!
!
!
!
Al!igual!que!ocu e!en!el!ensayo!de!doble!híb ido,!en! plan a!la! o ma!mu ada!
SlRDΔDIM! ambién! ha! pe dido! la! capacidad! de! dime iza .! Como! se! puede!
ap ecia !en!la! igu a!3.21!la!p o eína!SlRDΔDIM!no!es!capaz!de! econs i ui !la!
luo escencia!de i ada!de!la!YFP.!
T as! de e mina ! que! SlCIPK6! y! SlRD! in e accionan,!que!SlRD! o ma!
homodíme os! y! de e mina ! el! dominio! de! aminoácidos! necesa ios! pa a! la!
dime ización,! se! p ocedió! a! comp oba ! si! la! in e acción!SlCIPK6/SlRD! es!
dependien e! de! la! capacidad! de! dime iza ! de! SlRD.! Pa a! ello! y! como! p ime a!
ap oximación!se! ealizó!un!ensayo!de!doble!híb ido,!en!el!que!las!le adu as!se!
ans o ma on! con! la! combinaciones! siguien es:! pEG202[SlCIPK6/pGJ4[5[
SlRDΔDIM,! pEG202[SlCIPK6T172D/pGJ4[5[! SlRDΔDIM! y! como! con ol! pEG202!
(00)/pGJ4[5[!SlRDΔDIM.!
!
!
!
!
!
!
!
Figu a)3.21:)Ensayo)BIFC) ealizado)con)la) o ma)mu an e)SlRDΔDIM)en)células)epidé micas)
de) N.# ben hamiana.! Las! cons ucciones! se! exp esa on! de! o ma! ansi o ia! en! hojas! de! N.+
ben hamiana! ía!Ag obac e ium.!Pasados! dos! días! se! isualizó! la!exp esión! en! un! mic oscopio!
con ocal.!!
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Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
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146!
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!
!
En!el!ensayo!de!doble!híb ido!de!la! igu a!3.22!se!puede!ap ecia !que!las! o mas!
sil es e!y!cons i u i a!ac i a!de!SlCIPK6!no!in e accionan!con!SlRDΔDIM,!ya!que!
no! hay! ni! supe i encia! en! un! medio! sin! LEU! ni! ac i idad! β[galac osidasa! en!
p esencia!de!X[gal.!La!exp esión!de!las!p o eínas!u ilizadas!en!el!doble!híb ido!se!
con i mó!median e!wes e nHblo !( igu a!3.22B).!Po !úl imo!y!pa a!con i ma !que!
es e! enómeno! ampoco! end ía!luga !en!células! ege ales,!se! ealizó!un!ensayo!
BiFC! en e!la! o ma! mu an e! SlRDΔDIM! y! SlCIPK6.! Las! condiciones! de! ensayo!
ue on!las!mismas!que!en!el!caso!an e io .!!
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Figu a)3.22:)In e acción)en e)la) o ma)mu an e)SlRDΔDIM))y)SlCIPK6)en)le adu as.!A)!Ensayo!
de!doble!híb ido! ealizado!con!las!combinaciones!pEG202[SlCIPK6/pGJ4[5[SlRDΔDIM,!pEG202[
SlCIPK6T172D/pGJ4[5[SlRDΔDIM! y! pEG202(00)/pGJ4[5[SlRDΔDIM.! B)!Wes e nHblo !que!
con i ma!la!exp esión!en!le adu as!de!la! o ma!mu an e!SlCIPK6!(LexA)!y!SlRDΔDIM!(HA)!(1),!!
SlCIPK6T172D!(LexA)!y!SlRDΔDIM!(HA)!(2)!y!el! ec o !pGE202! acío!y!SlRDΔDIM!(HA)!(3).!La!
cepa!de!S.+ce e iseae!EGY48!se!usó!pa a!p oba !la!in e acción!en e!la! o ma!mu an e!SlRDΔDIM!
(clonada! en! el! ec o ! pJG4[5)! y! SlCIPK6! (clonada! en! el! plásmido! pEG202).! Los! ensayos! se!
ealiza on!sob e!placas!que! ue zan!la!in e acción,!(1)!SD!Gal!con!Xgal!y!(2)!SD!Gal!sin!LEU.!Los!
cul i os!que!se!hicie on!c ece !du an e! oda!la!noche!en!medio!mínimo!SD!(SD!Glu!–URA,![HIS,![
TRP)!se!diluye on!en!agua!es é il!y!se!hicie on!diluciones!a!una!DO600!de!0.1!y!0.001.!!
!
!"#$%$&'()*+
,-++
..++
/$+ 0++++++++++1+++++++++2++++++++
3(456*+
3()*+
7
Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
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147!
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Como!se!puede!ap ecia !en!la! igu a!3.23! ampoco!se!obse ó!in e acción!in+ i o!
median e!ensayo! BiFC!en e! SlRDΔDIM!y! SlCIPK6,! ya! que! no! se! isualizó!
luo escencia!de i ada!de!la!YFP.!Po ! an o!podemos!conclui !que!pa a!que!exis a!
in e acción! en e! las! p o eínas! SlCIPK6! y! SlRD! es! necesa io! que! és a! úl ima!
dime ice.!!
3.7. Es udio)de)la)unión)a)ATP)de)SlRD))
Como! se! ha! desc i o! p e iamen e!las! Usps! de! bac e ias! se! clasi ican! en! dos!
g upos,!uno! o mado!po !p o eínas!que!unen!ATP!y!se!asemejan!a!la!p o eína!
MJ5077!y!el!o o!po !p o eínas!que!no!lo!unen!y!se!asemejan!a!HiUspA.!Median e!
alineamien o! múl iple! de! las! secuencias! de! aminoácidos! de! a ias! p o eínas!
pe enecien es!a!la!supe amilia!Usp!se!comp obó!que!SlRD! iene!conse adas!
las! egiones!de!unión! a!ATP! ( igu a! 3.1).! Recien emen e,! median e!un! análisis!
ilogené ico! ealizado! con!la! secuencia! de! aminoácidos! de!al! menos!100!
p o eínas!con!homología!a!las!Usps!de!plan as!y!mic oo ganismos,!se!con i mó!
que! las! Usps! de! plan as! se! encuen an! más! ce canas! ilogené icamen e!a! la!
sub amilia!MJ0577.!Pa a! e i ica !que!SlRD!une!ATP!in+ i o!se! ealizó!un!ensayo!
de!unión!al!nucleó ido!empleando!pa a!ello!ATP!ma cado! adiac i amen e!con!
32P!en!el! os a o!α!(apa ado!M.6.7!de!ma e iales!y!mé odos).!Pa a!ello!2!μg!de!la!
p o eína!HIS[SlRD!clonada!en!el! ec o !pDEST17!y!pu i icada!median e!columna!
de!!níquel!se!incuba on!du an e!una!ho a!!en!p esencia!de!(α[32P)ATP.!T as!la!
eacción,!las!mues as!se!analiza on!po !SDS[PAGE!y!se!au o[ adiog a ia on.!!
Figu a) 3.23:)Ensayo) BIFC) ealizado) con) la) o ma) mu an e) SlRDΔDIM)y) SlCIPK6) en) células)
epidé micas)de)N.#ben hamiana.!Las!cons ucciones!se!exp esa on!de! o ma! ansi o ia!en!hojas!
de! N.+ ben hamiana! ía! Ag obac e ium.! Pasados! dos! días! se! isualizó! la! exp esión! en! un!
mic oscopio!con ocal.!!
!"#$%$&'()*+,-.
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)*+,(!"#$%$&'-.
!"/&+01()*+/.
!"#$%$&'()*+,-.
)*+/(!"/&+01.
)*+,(!"#$%$&'-.
)*+/(!"/&+01.
Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
!
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148!
En!la! igu a!3.24!se!obse a!como!SlRD!une!de! o ma!especí ica!(α[32P)ATP!en!las!
condiciones! ensayadas!(ca ail! 1,! igu a! 3.24)!a! di e encia!de! la! p o eína! GFP!
(ca il!2,! igu a!3.24),!empleada!como!con ol!nega i o!del!ensayo.!P e iamen e!
ya!se!había!demos ado!expe imen almen e!que!la!Usp!de!plan a!V ENOD18!une!
ATP! in+ i o!(Becke ,! Mo ei a! e ! al.! 2001).! Como! con ol! de! ca ga! p o eica! se!
ealizó!un!wes e nHblo !de!la!misma!memb ana!empleada!en!el!ensayo,!u ilizando!
pa a! ello! an icue pos! an i[HIS!(panel! in e io ,! igu a! 3.24).! Po ! lo! an o! y! en!
unción!de!los! esul ados!ob enidos!SlRD!puede!se !clasi ica !como!una!p o eína!
con!dominio!Usp!pe enecien e!a!la!sub amilia!MJ0577.!!
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Una! ez! e i icada! la! capacidad! de! SlRD! de!uni ! ATP! se! quiso! explo a ! la!
ele ancia! uncional! de!la!unión.! Pa a!ello!se! ealiza on!mu aciones!pun uales!
sob e! esiduos! conse ados! de! las! egiones!de! unión! a! ATP.! P e iamen e! se!
había!desc i o!que!la!sus i ución!del!ácido!aspá ico!15!po !ácido!glu ámico!y!de!
la!glicina!117!po !alanina!en!la!p o eína!R 2623!de!Mycobac e ium+ ube culosis+
daba!luga !a!una!disminución!de!la!unión!a!ATP+(D umm,!Mi!e !al.!2009).!En!base!
a!es os!da os!se!localiza on!los!mismo! esiduos!conse ados!en!la!p o eína!SlRD!
(co espondien es!a! D47! y! G135!den! SlRD,! igu a!3.25)!y! se! cons uye on! los!
siguien es! e siones!mu an es!de! la! p o eína:! SlRDD47E,! SlRDG135A! y! el!
mu an e!doble!SlRDdmu .!
Figu a) 3.24:)Unión) a) (α32P)RATP) de) SlRD#in# i o.) El)ensayo!de! unión! a! ATP)se! ealizó!
incubando! 2! μg!de! HIS[SlRD! (línea! 1)! con! (α32P)[ATP!du an e! una! ho a! a! 30ºC.! Como! con ol!
nega i o!del!ensayo!se!u iliza on!3!μg!de!la!p o eína!GFP!(línea!2).!Una! ez!pa ada!la! eacción!las!
mues as!se!analiza on!po !SDS[PAGE!y!se!au o[ adiog a ía on.!Como!con ol!de!ca ga!se! ealizó!
un! wes e nHblo !a! la! misma! memb ana! empleada! en! el! ensayo! de! unión! a! ATP,! u ilizando! el!
an icue po!an i[HIS.!!
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Ca ac e ización+de+SlRD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Capí ulo!3!
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149!
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Pos e io men e!las! es! e siones!de!SlRD!se!clona on!en!el! ec o !pDEST17,!se!
pu i ica on!median e!columna!de!níquel!y! se! ealizó!el!ensayo!de! unión!a!(α[
32P)ATP!con!cada!una!de!ellas,!siguiendo!las!misma!pau as!desc i as!que!pa a!el!
ensayo!an e io .!Una! ez!pa ada!la! eacción,!las!mues as!se!analiza on!po !SDS[
PAGE!y!se!au o[ adiog a ia on.!!
!
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En! las!condiciones! de! ensayo! ealizadas! odas! las! o mas! mu an es! de! SlRD!
p esen a on!in ac a!la!capacidad!de!unión!a!ATP!(panel!supe io ,! igu a!3.26).!
Como! con ol! de! ca ga! p o eica! se! ealizó! un! wes e nHblo !de! la! misma!
!!!"!!!!!!!!!!#!!!!!!!!!!$!!!!!!!!!!%!
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'()*+!
'(,-.!
/0!
Figu a)3.26:)Ensayo)de)unión)a)(α32P)RATP)de)los)mu an es)SlRDD47E)(2),)SLRDG135A)(3))y)
SlRDdmu )(mu an e)doble,)4)#in# i o.)El)ensayo!de!unión!a!ATP)se! ealizó!incubando!3!μg!de!
cada!una!de!las! o mas!con!(α32P)[ATP!du an e!una!ho a!a!30ºC.!Como!con ol!posi i o!del!ensayo!
se! u ilizó! la! o ma! sil es e! de! SlRD! (línea! 1).! Una! ez! pa ada! la! eacción,! las! mues as! se!
analiza on!po !SDS[PAGE!y!se!au o[ adiog a ia on.!Como!con ol!de!ca ga!se! ealizó!un!wes e nH
blo !a!la!misma!memb ana!empleada!en!el!ensayo!de!unión!a!ATP,!u ilizando!el!an icue po!an i[
HIS.!!
!
Figu a)3.25:!Alineamien o)de) la)secuencia) de) aminoácidos)en e)SlRD) y) MJ0577.!El! ondo!
neg o!mues a!los! esiduos!idén icos!en!ambas!secuencias,!en!g is!los! esiduos!muy!conse ados!
y!en!blanco!los!! esiduos!no!conse ados.!Los! esiduos!implicados!en!la!unión!a!ATP!y!mu ados!se!
indican!con!una! lecha! oja.!Los! esiduos!de!unión!a!ATP!se!mues an!en!la! igu a!y!en!los!que!la!
(A)! ep esen a!el!luga !de!unión!a!la!adenina,!la!(P)!al! os a o!y!la!(R)!a!la! ibosa.!El!alineamien o!
se! ealizó!u ilizando!el!p og ama!bioEdi .!
SlRD ---RGRDIVIAIDHGPNSKHAFDWAVTHLCRLADTLHLVHAVSS---------------- 41
MJ0577 MSVMYKKILYPTDFSETAEIALKHVKAFKTLKAEEVILLHVIDEREIKKRDIFSLLLGVA 60
SlRD --------LKNEIVYEATQGLMEKLA--VEAFSVAMVKTVARIVEGDAGKVICKEAERLK 91
MJ0577 GLNKSVEEFENELKNKLTEEAKNKMENIKKELEDVGFKVKDIIVVGIPHEEIVKIAEDEG 120
SlRD PSAVVMGTRGRGIIQSVLQGSVAEYCLHNCKIAPVIIVPGKEAGEVSVI 140
MJ0577 VDIIIMGSHGKTNLKEILLGSVTENVIKKSNK-PVLVVKRKNS------ 162
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