Estudio fitoquímico de Juníperus Oxycedrus, L. subsp. Macrocarpa

DEPARTAMENTO DE QUIMICA ORGANICA FACULTAD DE CIENCIAS. UNIVERSIDAD DE GRANADA ESTUDIO FITOQUIMICO DE JUNIPERUS OXYCEDRUS L. subsp. MACROCARPA A. F. Barrero, A. RamÍrez y S. Salido RESUMEN Se han estudiado los componentes ácidos de las arcésticas de Juniperus oxycedrus L. subsp. macrocarpa, encontrándose fundamentalmente ácidos di terpénicos de esqueleto labdano; trans-comúnico (mayoritario), mirceocomúni co, cis-comúnico, junicédrico, 15-metil-imbricatálico, 12(R)-hidroximirceoco múnico, imbricatólico e isocuprésico. También se han identificado los ácidos sandaracopimárico e isopimárico, con esqueleto pimarano y el abietano, éter metílico de sugiol. Este estudio ha permitido establecer las analogías y diferen cias fitoquímicas con la subespecie oxycedrus, así como su quimiotaxonomía dentro del género Juníperus. SUMMARY Acid components from berries of Juniperus oxycedrus L. subsp. mac rocarpa, have been studied. They mainly contain diterpenes with labdane skeleton: trans-communic, myrceocommunic, cis-communic, junicedric, 15methyl-imbricatalic, 12(R)-hydroxy-myrceocommunic, imbricatolic and isocup ressic acids. We have al so identified sandaracopimaric and isopimaric acids. (pimarane skeleton), and sugiyl methyl ether (abietane skeleton). This work have established the phytochemical analogies and differences with the subspecie oxycedrus, and its chemotaxonomy in the genus Juniperus. Ars Pharmaceutica. Tomo XXIX, Núms. 3-4, 1988 264 ARS PHARMACEUTICA INTRODUCCION Juniperus oxycedrus L. subsp. macro carpa es un arbusto postrado o erecto de hasta 3 m. de altura, muy ramoso y de copa amplia. cuyas hojas de 20-25 x 2-2,5 mm son atenuadas desde la base hasta un ápice punzante; el tamaño de las arcésticas es de 12 a 15 mm, presentando color glauco de joven y castaño purpúreo al madurar. Se encuentra en las dunas y arenales del litoral, a veces en lugares rocosos, región mediterránea, oeste de Asia, suroeste y este de la península y Mallorca. La subespecie en estudio presenta marcadas diferencias morfológicas y de ubicación geográfica con la subespecie oxyceárus, siendo esta última un arbus to de mayor altura, con hojas y arcéstidas de menor tamaño, además de ser típica de zonas más interiores y xerofíticas dentro del área de la especie. No existen referencias bibliográficas de estudios acerca de la composición química de la subespecie macrocarpa. Este trabajo continúa la investigación que se viene desarrollando en el campo de la quimiotaxonomía de las especies del género Juníperus presentes en la Península Ibérica, y trata de establecer unos resultados comparativos entre los componentes químicos de la subespecie tratada y los de 1. oxycedrus L. subsp. oxycedrus [1-3]. RESULTADOS Y DISCUSION.- Las bayas trituradas se extrajeron con hexano en sistema Soxhlet. Después de descerar con metanol en frío y formación de clatratos de urea, resulta un extracto (5,8% de peso de bayas) que se fracciona con disolución acuosa de hidróxido sódico, constituyendo el estudio de la fracción ácida el objeto de este trabajo. Para facilitar la separación cromatográfica de los componentes ácidos, previamente se esterifican con diazometano. De la agrupación menos polar y por cristalización en metanol se separa el ácido mayoritario (52,7% de la fracción ácida), que se ha identificado como trans-comunato de metilo 1 al contrastar sus propiedades físicas y sus valores espectroscópicos con los datos bibliográficos [4-6]. ARS PHARMACEUTlCA 265 En las aguas madres de cristalización de 1, se identifican mediante espec troscopía de RMN'H los siguientes compuestos: mirceocomunato de metilo 2a (7,9%), sandaracopimarato de metilo 3 (3,2%) e isopimarato de metilo 4 (3,2%), con ayuda de espectros de sustancias patrón [3,6-8]. Entre las sustancias de polaridad intermedia del extracto se aíslan, tras varias cromatografías sobre Si02 y Si02-AgN03 como soporte, otros compo nentes minoritarios (porcentajes inferiores al 1 %) que se identificaron por sus propiedades físicas y espectroscópicas: cis-comunato de metilo 5 [l-4], éter me tílico de sugiol 6, junicedrato de metilo 7a [2,3], 15-metil-imbricatalato de me tilo 7b y 12(R)-hidroximirceocomunato de metilo 2b. OMe 7. R-eOOMa 7b R-CH,OH 7e R-COCH. R El éter metílico de sugiol 6 es un producto cristalino de [<X]o=+24°. Su espectro de masas presenta ión molecular a m/e=314 (74%), concordante con la fórmula C2,H3002 de un derivado diterpénico metilado. En el espectro IR, se observan absorciones de anillo aromático a 1602 y 1563 cm-', además de una banda adicional a 1497 cm-' debida a la conjuga ción con cetona, la cual absorbe fuertemente a 1669 cm-', y otras bandas a . 1277, 1263, 1246, 1065, 1053 Y 1039 cm-' propias de metoxilo. El espectro de RMN'H pone de manifiesto la presencia de esqueleto abie tano. Se observan tres señales singlete, a 0,92 y 0,98 ppm de metilos geminales en C4 (correspondiendo el valor más desapantallado al que presenta disposi ción ecuatorial) y a 1,24 ppm de metilo en ClO; el conjunto de señales formado por dos dobletes a 1,18 y 1,21 ppm y un heptuplete a 3,23 ppm con iguales constantes de acoplamiento es indicativo de la agrupación isopropilo. Otras se- 266 ARS PHARMACEUTICA ñales significativas son: un singlete a 3,88 ppm, de metoxilo sobre anillo aromá tico, que junto con dos singletes más, de dos protones aromáticos a 6,74 y 7,88 ppm, ubica un grupo cetónico conjugado con el sistema aromático en la posi ción C¡ [9], además, un sistema ABX, cuya pa.rte X (H-5) queda a 1,86 ppm como doble doblete (J]=13,l Hz, J2=4,7 Hz) Y los dos protones H-6 y H-6' (dos dobles dobletes) que resuenan más desapantallados, a 2,58 ppm (J,=18,1 Hz, J2=13,1 Hz) y 2,68 ppm 0]=18,1 Hz, J2=4,7 Hz). Esta sustancia se encuentra descrita como componente de la corteza de Podocarpus ferrugineus [10], pero no quedan recogidas sus características es pectroscópicas. 15-metil-imbricatalato de metilo 7b es la segunda vez que se describe como producto natural, anteriormente había sido identificado y caracterizado par cialmente en el estudio sobre la composición química de las arcéstidas de 1. phoenicea [6]. Este producto es un aceite viscoso de [n-]D=+35°. En su especTABLA 1 Desplazamientos químicos de 13 e expresados en ppm, empleando TMS como referencia interna. n.O e 2b 7b 38,95 39,17 2 19,86 19,95 3 38,14 38,24 4 44,28 44,29 5 56,21 56,46' 6 26,26 26,23 7 38,72 38,76 8 148,75 148,20 9 51,73 56,35' 10 39,88 40,33 11 31,23 21,19 12 69,84 36,11 13 150,51 30,35 14 136,01 51,02 15 113,15' 209,07 15a 29,98 16 114,65' 20,00 17 106,39 106,30 18 28,76 28,80 19 177,72 177,74 20 12,63 12,54 21 51,09 51,08 • Asignaciones intercambiables. ARS PHARMACEUTlCA 267 tro de masas está presente el ión molecular a m/e=348(2%), concordante con una fÓrmula C22H3603 y pico base a m/e= 121 característico de diterpeno de tipo labdano [11]. En el espectro de IR aparecen absorciones propias de grupo vinilideno a 3080, 1643 Y 887 cm-I y de éster metílico axial a 1721, 1227 Y 1154 cm-l. En RMNIH se observan cuatro señales singlete a 0,48, 2,10, 1,16 Y 3,60 ppm de metilo en CIO' metilcetona, metilo en C4 y metoxicarbonilo, respectiva mente, otros dos single tes anchos a 4,46 y 4,82 ppm de metileno exocíclico y un doblete (J =6 Hz) a 0,88 ppm de metilo C\3. El espectro de RMN\3C también está de acuerdo con la estructura pro puesta (tabla 1). La estereoquímica en el carbono quiral C12, para 12(R)-hidroximirceoco munato d� metilo 2b, se establece en base a los desplazamientos químicos de la señales singlete ancho del metileno exocíclico 8(17), observadas en el espec tro de RMNlH a 4,55 y 4,90 ppm y que indican una configuración R [12]. Del estudio conformacional de la cadena lateral en 12-hidroxilados [13] se deduce que ésta adopta, para una configúración 12 R (2b), la disposición en la que el grupo hidroxilo queda alejado del metileno exocíclico 8(17) (fig. 1), no modificando así apreciablemente los desplazamientos químicos observa dos para H-17 y H-I7' en mirceocomunato de metilo (4,57 y 4,83). Sin embar go, cuando se trata del epímero 12 S, la conformación preferida para la cadena lateral (fig. 2) sitúa la función alcohol en las proximidades de H-17 endo, lo cual origina el desapantallamiento de su señal [14], tomando un válor próximo a 4,7 ppm (12). OH Hg H Figura 1 Figura 2 La fracción más polar está constituida por una mezcla de imbricatolato de metilo 7c (3,4%) e isocupresato de metilo 8 (3,4%) identificados con ayuda de los espectros descritos [6, 15-18]. 268 ARS PHARMACEUTICA 8 De otras especies del género Juníperus existentes en España, hemos revi sado los antecedentes sobre la composición de las fracciones ácidas de los ex tractos hexánicos de arcéstidas [1-3,6,8,19,20], observando que los ácidos pre sentan esqueleto labdano, pimarano y/o abietano y sus proporciones relativas quedan reflejadas en la tabla JI. TABLA 11 Sección Especie LABDANO PIMARANO ABIETANO OXYCEDRUS oxycedrus [1,23] 84 16 communis [8] 90 LO SABINA sabina 119J 88 2 10 phoenicea [6] 81 16 3 thurifera [20] 82 17 Es de destacar una marcada diferencia quimiotaxonómica entre secciones según los porcentajes recogidos para ácidos con esqueleto abietano, observán dose la ausencia de estos en la sección oxycedrus y una notable presencia en la sección sabina. Estando así de acuerdo, los resultados obtenidos en el pre sente trabajo sobre la sub especie macrocarpa, con la clasificación de dicha su bespecie dentro de la sección oxycedrus. Desde la perspectiva del estudio fitoquímico comparativo que se establece entre las subespecies oxycedrus y macrocarpa (tabla III), resaltamos que si bien desde el punto de vista cualitativo, hay notables coicidencias entre los compo nentes descritos, existen marcadas diferencias en el aspecto cuantitativo, sien do el ácido mirceocomúnico mayoritario en la subespecie oxycedrus (98%), mientras que en la subespecie macrocarpa, el porcentaje de éste es un 13%, resultando como componente mayoritario el ácido trans-comúnico (86%). Es tos resultados refuerzan su diferenciación en subespecies. ARS PHARMACEUTICA 269 TABLA 111 JUNIPERUS OXYCEDRUS Esqueleto Compuesto Subsp. Subsp. oxycedrus macro carpa LABDANO trans-comunato l * 86 de metilo 1 mirceocomunato 98 13 de metilo 2a cis-comunato de metilo S junicedrato de metilo 7a X** X 15-metilimbricatalato X de metilo 7b 12 R -hidroxi mirceocomunato X de metilo 2b imbricatolato de metilo 7c X X isocupresato de metilo 8 X imbricatalato de metilo X dimero de mirceocomunato X de metilo PIMARANO sandaracopi marato de metilo 3 X X isopimarato de metilo 4 X '* Proporciones relativas de ácidos comúnios. ** Presencia (X) o ausencia (-) de tales componentes. 270 ARS PHARMACEUTICA PARTE EXPERIMENT AL.- Los puntos de fusión están sin corregir y han sido determinados en un mi croscopio de platina caliente REICHERT y en un aparato BUCHI, tipo TOTTO LI. Los poderes rotatorios se midieron en un polarímetro PERKIN-ELMER modo 141, en disolución de CHCl3. Los espectros UV se ralizaron en un espec trofotómetro UV-VIS PERKIN-ELMER modo LAMBDA 5, en etanol. Los espec tros IR fueron realizados en un espectrómetro PYE UNICAM SP 1000 y en un PERKIN-ELMER modo 782, en película. Los espectros de RMNIH se realizaron en un BRUKER WP 80 SY de 80 MHz y en un BRUCKER AM 300 de 300 MHz en CDCI3. Los espectros de RMNI3 se realizaron en un BRUKER AM 300 de 75 MHz en CDCI3. Los espectros de masas se han realizado en un es pectrómetro HEWLETT-PACKARD 5980 A, trabajando a 70 eVo Extracción, fraccionamiento e identificación. 1,30 Kg de baya triturada se extrae en Soxhlet con hexano durante 24 ho ras. El tratamiento del extracto hexánico (101,11 g) disuelto en 160 mI de CHCI3 con metanol en caliente, conduce a la separación por insolubilización en frío de 5,23 g de "ceras" (5,2% en peso respecto del extracto). La disolu ción metanólica se satura con 79,6 g de urea en caliente, separándose en frío y mediante formación de c1atratos 16,12 g (15,9% de extracto) de componentes lineales. El extracto descerado se evapora a sequedad, suspende en agua aci dulada con HCI 2N, extrae con éter y después con NaOH 4%, quedando en la fase etérea los compuestos neutros. La fracción resultante de la extracción alcalina se acidula con HCI concentrado hasta pH=1 y se extrae con éter, la vando a continuación las fases etéreas con agua hasta pH neutro. La fracción ácida se esterifica con diazometano, resultando 54,08 g de ésteres metílicos que se cromatografían sobre 300 g de gel de sílice (CROMATOGRAFIA A). De las fracciones eluidas con hexano en la cromatografía A y por cristali zación en metanol se separan 28,54 g de frans-comunato de metilo (1). P. f. 105-6°C, [0:]0=+45° (c. 1,5 CHCI3). UV Arnax.(EtOH)=232 nm (c=25000). IRvrnax': 3090, 3038, 1720, 1640, 1605, 1225, 1200, 1150, 985 Y 885 cm-l. RMNIH (80 MHz) (6 ppm): 0,55 (3H, s, Me-lO); 1,17 (3H, s, Me-4); 1,75 (3H, s, Me-13); 3,62 (3H, s, OMe); 4,47 y 4,83 (2H, 2 sa, H-17); 4,87 (IH, da, J=lOHz, H-15); 5,04 (IH, da, J=17Hz, H-l5'; 5.41 (IH, t, J=7 Hz, H-12); 6,34 (lH, dd, JI=17 Hz, J2=1O Hz, H-14). En las aguas madres de cristalización de la sustancia 1 (8,52 g) se identifica mirceocomunato de metilo 2a, sandaracopimarato de metilo 3 e isopimarato de metilo 4, según los desplazamientos químicos de las siguientes señales en el espectro de RMNIH (60 MHz) yen las proporciones relativas 2,5:1:1, res pectivamente. Valores asignables a mirceocomunafO de metilo (2a) (ppm): 0,50 (s, Me-lO); 4,58 y 4,85 (2 sa, H-17); 4,90 (sa, H-16); 6,35 (dd, JI=17 Hz, J2=1O Hz, H-14). Valores asignables a sandaracopimarato de metilo (3) (ppm): 1,03 ARS PHARMACEUTICA 271 (s, Me-13); 5,20 (sa, H-14); 5,70 (q, H-15). Valores asignables a isopimarato de metilo (4) (ppm): 0,90 (s, Me-13); 5,30 (sa, H-7); 5,75 (q, H-15). La señal a 0,85 ppm (s, Me-lO) es asignable a 3 y 4, Y las tres sustancias presentan dos singletes a 1,20 ppm de metilo en C4 y a 3,60 ppm de OMe. La agrupación de fracciones eluidas en la cromatografía A con hexano: éter (98:2, 95:5, 92:8) (3,02 g) se ponen en columna con 150 g de silicagel como soporte (CROMATOGRAFIA B). De la cromatografía B, con polaridad hexano: éter (9: 1) se separan 20 mg de cis-comunato de metilo (5). P. f. 42-3°C, [<X]o=+48 (c. 1,0, CHCI,). UV Amax. (EtOH)=236 nm (E=21300). IR vmax.: 3080, 1728,1642, 1595, 1225, 1152, 990 Y 895 cm-l. RMNIH (80 MHz) (6 ppm): 0,57 (3H, s, Me-lO); 1,20 (3H, s, Me-4); 1,78 (3H, s, Me-13); 3,62 (3H, s, OMe); 4,51 y 4,87 (2H, 2 sa, H-17); 4,84-5,30 (2H, m, H-15); 5,32 (1H, t, J=7 Hz, H-12); 6,80 (IH, dd, JI=18 Hz, J2=1O Hz, H-14). En las fracciones de la cromatografía B eluidas con hexano: éter (8:2) se detecta una mezcla de los productos 6 y 7a, que consiguen separarse en colum na con 4,5 g de Si02-AgN03 al 20% (CROMATOGRAFIA C). Eter metílico de sugiol (6). Eluido con hexano: éter (98:2) (7 mg), [<xlo=+24 (c. 0,6, CHCI3). EM (m/e, intensidad relativa): 314 (74) (M+), 299 (99) (M+-CH3), 257 (17), 231 (29), 229 (25), 128 (27), 83 (lOO), IRvmax.: 1669, 1602, 1563, 1497, 1277, 1263, 1246, 1065. 1053, 1039, 905, 869 Y 854 cm-l. RMNIH (300 MHz) (b ppm): 0,92 (3H, s, Me-4 axial); 0,98 (3H, s, Me-4 ecua torial); 1,18 y 1,21 (6H, 2d, 1=7 Hz, 2 Me-15); 1,24 (3H, s, Me-lO); 1,86 (lH, dd, JI=13,O Hz, 12=4,7 Hz, H-5); 2,29 (IH, da, H-3 ecuatorial); 2,58 (IH, dd, JI=18,1 Hz, J2=13,1 Hz, H-6); 2,68 (IH, dd, JI=18,1 Hz, J2=4,7 Hz, H6'); 3,23 (lH, h, J=7 Hz, H-15); 3,88 (3H, s, OMe); 6,74 (lH, s, H-Il); 7,88 (lH, s, H-14). Junicedrato de dimetilo (labd-8(l7)-en-15, 19-dioato de dimetilo) (7a). Se obtienen 15 mg por elución con hexano: éter (94:6). RMN 1 H (80 MHz) (b ppm): 0,50 (3H, s, Me-lO); 0,93 (3H, d, J=6 Hz, Me-13); 1,17 (3H, s, MeA); 3,62 (3H, s, MeO-19); 3,67 (3H, s, MeO-15); 4,50 y 4,85 (2H,2 sa, H-17). 15-metil-imbricatolato de metilo (7b). Eluido con hexano: éter (8:2) de la cromatografía B (240 mg). [<xlo=+63 (c. 1,0, CHCI3). EM (m/e, intensidad relativa): 332 (1) (M+), 289 (2), 189 (13), 121 (100). IR vOlax.: 3430, 3080, 1722, 1641, 1591, 1229, 1155, 1092, 988 Y 891 cm-l. RMNIH (80 MHz) (b ppm): 0,50 (3H, s, Me-lO); 1,18 (3H, s, Me-4); 3,60 (3H, s, OMe); 4,39 (IH, dd, 11=7 Hz, J2=4 Hz, H-12); 4,55 Y 4,90 (2H, sa, H-17); 5,]2 (lH, da, J=lO Hz, H-15); 5,14 Y 5,19 (2H, 2 sa, H-16); 5,39 (lH, da, J=17 Hz, H-l5'); 6,35 (lH, dd, JI=17 Hz, 12=10 Hz, H-14). De la cromatografía A y por elución con hexano: éter (7:3) y éter se se paran 3,73 g de una mezcla de imbricatolato de metilo (7c) e isocupresato de metilo (8) en una proporción 7:3 respectivamente. RMNIH (80 MHz) (b ppm): valo res asignables a ambas sustancias: 0,50 (s, Me-lO); 1,20 (s, MeA); 3,62 (s,