Método ¨multirresiduo¨ para la determinación de pesticidas

ARS PHARMACEUTICA Instituto "López-Neyra" de Parasitología Sección de Fisiología y Bíoquímica del Parasitismo 371 METODO "MULTIRRESIDUNO" PARA LA DETERMINACION DE PESTICIDAS por JOSE MARIA ABENZA y MIGUEL MONTE OLIVA INTRODUCCION Una reciente Orden (1) del Minist.erio de Agricultura, limita el libre uso de los pesticidas dorados' (DDT, lindano, aldrín, etc.) hasta el 1 de ene.ro de 1977. Desde esta fecha sólo podrán emplearse en campañas de tipo oficial. Esta Orden que simplemente formula la prohibiciones que ya existían en otros países, es consecuencia de los efectos nocivos secundarios que presentan estos plaguicidas en razón a sus ·característiC'as de persistencia y acumulaCÍlón. El tiempo me dio que requiere un pesticida para desaparecer del medio ambiente es muy variado. E71 malation necesita 5 'a 8 días, mientras que el DDT y el drieldrin requier'en de 5 a 30 años para desaparecer (2). Ahora bien, prohibir el uso de estos plaguicidas no elimina las acu mul'aciones ya producidas porque es de suponer ,que se seguirán de tectando estos plaguicidas por muchos años, conforme se vayan mo vilizando de sus depósitos. Síguen siendo de actualidad los métodos de deter:mfnación de pesticidas clorados y más concretamente los de nominados métodos multirresiduo, por cuanto que, en tratamientos conc,retos donde se conozca la natumleza del pesticida empleado só lo resta determinar su concentraCÍoón, pero en análisis de residuos am biental,es hay que conjuntar la identificación con la determinación. Estas condiciones las reúnen los métodos cromatográficos, tanto de capa fina (3.-7), la de columna (4) (6-8) o gaseosa (8-16). Mejor iden tifica'C'Íón en muestras desconocidas puede obtenerse c·onjugando dos técnicas: cromatografía en columna y gaseosa (4) (7) (8) bien columArs Pharmacéutica. Tomo XVII. Núm. 2-3. 1976. 372 ARS PHARMACEUTICA na y capa fina (6). En este trabajo hemos intentado conjugar el fl'ac cionado ·en cromato@rafía en columna de fiorisil con la cromatografía gaseosa empleando un detector de captul'a electrónica para diferen citar los pesticidas de más frecuente uso. MA TERIAL Y METO DOS Instrumentación. Se ha utilizado un Cromatlógrafo de Carbo Er ba, modelo FTV 2.200 equipado con un detector de captura de elec trones con Ni63 como fuente radíactiva. La columna de vidrio de 2 metros y de 3 X 6 de diámetro, r'ellena con Gas' Chrom Pcon el 2% de SE-30 como fase estacionaria. Otras condiciones de empleo son: Temperatura de la columna = 18Q.°C; Flujo de nitrógeno = 60 ml./minuto. Temperatura del dete'Ctor 2'10°C. Atenuación 100 X 16 en el electrómetro. Temperatura del inyector = 25Q.°C; En el registrador = 1 mV anchura de papel,. Velocidad registro: Determinación de tiempos de retención = 1 cm/m.; otras medidas = 0,1 cm/m. Reactivos. Todos los reactivos empleados son de calidad croma tográfica. P:esticidias. Los pestiddas utilizados son muestras patrones sumi nistradas por casas comerciales. Relleno de la oolumna. Florisil 60-100 manas, BDH. Método de extracción. Para los ensayos de recuperación, se han empleado 100 g. peras, que previamente mondadas y lavadas se les ha añadido 5 mI,. de l'as soluciones de pesticidas a ensayar y a la con centración adecuada, y 100 m1. de acetonitrilo. Se tritura y homoge neiza en un Turmix a la máxima velocidad durante 2 minutos y des pués se filtra a vaCÍo empleando papel de jarabes. El vaso y el fil tro se lavan varias veces con 25 mI. de acetonitrilo. Se recoge el fil trado que se pasa a una ampolla de decantadón, agll"eg.ando 100 mI. de eter de petróleo agitando durante 2 minutos. Después se agrega 400 mI. de solución de CINA al 2% en agua destilada, se agita suavemen te y se deja reposar para que separe la capa acuosa de la etérea. Esta última se pasa 'a otra ampolla de decantación donde se lava dos v'eces con lQ,O mI. de agua destilada. Por último la capa eterea se tra ta con unos 10 ,g. de sulfato sódico anhidro para deshidratarla. El ex tracto etéreo se concentra en un Kuderna-Danish hasta un volumen de 2 ml. ARS PHARMACEUTICA 373 Fr:accitmado en columna. Se emplea una columna de vidrio de 10 cm. de altura y 5 mm. 0 interior rellena de F10risil (éste previamen te ha sido activado a 65'ÜoC durante 24 horas y mantenido a 180°C hasta el momento de su uso). Sobi'e la columna de Florisil, se colo'ca siempre unos gramos de sulfato sódico anhidro. En primer lugar la columna se lava ·con eter de petróteo. Después se introduce en la co lumna los 2 mI. del extracto anterior o bien 2 mI. de soluciones pa trones y posteriormente se procede a la elucÍón de los pesticidas pa sando sucesiv'amente 100 mI. de las siguientes soluciones. (1) Eter de petróleo/eter sulfúrico (94: 6) (II) Eter de petróleo / eter sulfúrico (85: 15) (III) Eter de petrlóleo/eter ·sulfúrico (65: 35) (IV) Eter de petróleoleter sulfúrico (50: 50) Para los ensayos de .recuperación, se rec.ogen juntos los 100. mI. de cada fracción, 'que se ·concentran a 2 mI. en el Kuderna-Danish, que mediante vacío se llevan a sequedad y el resíduo se redisuelve en 5 ml. de hexano, del cual se toman 5 microlitros qu se inyectan en el cromatógrafo. Para los ensayos de comportamiento de la columna de Florisil, los ·eluatos .Ee recogen en fracciones de 1'0 ml. de hexano y de esta solución se toman 5 microlitros que se inyectan en ·el cromatógrafo. PESTICIDAS ESTUDIADOS: Nombre común Sinonimia Aldrin HHDN Clorobencilato Akar DDT Zeidano, Gerasol Diazlnon Neocidol TABLA NUM. 1 Nombre sitstemático (BSl) 1, 2, 3, 4, lO, 10-hexacloro-1, 4, 4a, 5, 8, 8a-hexahidro-exo-1, 4-endo-5, 8-dime. tanonaftaleno. 4,4' .diclorodifenilglicolato de etilo 1, 1, 1-tricloro-2, 2, -di-(4-clorofenil) etano. dietil 2-isopropil • 6 - metU-4-pirimidinil fosforotonato 374 ARS PHARMACEUTICA (Continuación de la Tabla núm. 1) Nombre común. Sinonimia Nombre siostemático (BS1) Endrin Etion Fenitrotion Heptacloro Lindano Malation Metidation Metoxicloro Tetradifon DDE TDE Imidan Quinotionato Nialato Folition, Sumition gamma-BHC, g. HCH gamma-hexano Malaton, carbofos Supracide 1, 2, 3, 4, 10, 10-hexacloro-6, 7-epoxi1, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 8a-octahidro.exo-1, 4-exo-5, 8-dimetanonaftaleno. tetraetil. SS'-metilen-bis (fosforotiolo tionato). dimetil 3.metil-4-nitrofenil fosforotio nato. 1, 4, 5, 6, 7, 8, 8-heptacloro-3a, 4, 7, 7a. -tetrahidro-4, 7-metano indeno. 1, 2, 3, 4, 5, 6-hexaclorociclohexano. S_ 0, l2-dH etoxicarbonll)etil) dimetilfos forotioJotionato. S-(2, 3-dihdro-5-meetoxi-2-oxo.1, 3, 4- -tiadiazoL3-iletil) dimetil fosforotiolotionato. DMDT, Marlate 1, 1, 1-tricloro-2, 2-di (4-metoxifeniDeta no. Tedion DDD, Rotano Fosmet Eradex, Tioquinox 2, 4, 4', 5-tetraclorodifenil sulfona. 1, 1.dicloro-2, 2-di-( 4-clomfenil)eteno. 1, 1-dicloro-2, 2-di-(4-clorofen1l) etano. OO--dimetll ftalimido.metil fosforotiolo tionato. 2-tio-1, 3-ditiolo-(4, 5-b) quinoxalina. TABLA NUM. II RESPUESTA DEL DETECTOR DE CAPTURA DE ELECTRONES: Altura del pico en mm. en función de los nano. gramos inyectados. nanogramos inyectados Pesticida 25,00 120,00 15,00 10,00 7,50 5,00 3,75 2,50 1,87 1,25 0,63 0,31 Aldrin 155 133 111 61 31 Heptacloro 166 146 124 74 36 > Lindano 180 169 124 105 64 l" en DDE 160 140 1'20 70 37 '"el ¡:: Endrin 152 131 110 63 33 l" I!: Clorobencilato 49 41 33 25 18 10 > � Diazinon 65 56 45 25 22 15 c:: >'1 ... Metidation 109 97 81 67 53 32 a > Metoxicloro 140 124 100 76 38 18 TDE 145 124 103 59 30 DDT 160 135 110 61 30 Folition 157 153 142 134 118 96 65 Etion 134 127 120 114 86 58 37 Tetradifon 105 95 84 76 65 51 33 Quinotionato 96 81 65 51 31 18 9 Malation 84 77 70 63 51 38 23 Imidan 37 32 28 23 17 6 CA> ...;¡ C11 TABLA NUM. m c.> -:¡ C) LIMITES DE DETECCION EN LAS CONDICIONES ENSAYADAS: nanogramos para una altura de pico de 10 mm. Composición centesimal Pesticida nano gramos naturaleza C H Cl N N S O Lindano 0,07 organoclorado 24,74 2,08 73,14 Heptacloro 0,09 32,17 1,35 66,48 :>- Aldrin 0,10 39,50 2,21 58,30 " I:/l Endrin 0,20 37,84 2,12 55,85 4,20 '"d ti: :>- DDT 0,42 47,43 2,56 50,01 " a: DDE 0,18 52,83 2,51 46,65 :>- n � TDE 0,44 52,54 3,15 44,31 '" ... Tetradifon 0,54 40,48 1,70 39,83 9,01 n 8,99 :>- Metoxicloro 1,34 55,59 4,37 39,77 9,26 Clorobencilato 3,09 59,09 4,34 21,81 14,76 Folition 0,20 organofosforado 38,99 4,36 5,05 11,17 11,57 28,85 Etion 0,45 28,11 5,77 16,11 33,36 16,65 Malation 0,72 36,35 5,80 9,38 19,41 29,06 Meitidation 1,07 23,84 3,64 9,27 10,26 31,78 21,19 Diazinon 2,64 47,36 6,95 9,20 10,18 10,54 15,77 !midan 3,81 41,64 3,78 4,41 9,77 20,18 20,18 Quinotionato 1,46 ttiocarbonato 45,76 1,69 11,66 40,67 ARS PHARMACEUTICA 377 TABLA NUM. IV FRACCIONADO EN COLUMNA DE FLORISIL y tiempos de retención en minutos y segundas Pesticida T. R. Característica de elución Máxima altura pico de la columna dentro de la fracción Fracción I: 10 mI. eter petróleo/eter sulfúrico 94/6 Lindano 1,24" pico simétrico Diazinon 1'36" pico simétrico difuso Heptacloro 2'12" pico simétrico Aldrin 2'42" ligera cola DDE 4'50" pico simétrico Endrin 5'1'2" ligera cola Quinotionato 5'48" pico simétrico TDE 6'05" Etion 6'48" DDT 8'00" Metoxicloro 12'48" Fracción II: 100 mI. de eter petróleo/eter sulfúrico 85/15 Diazinon Folition Clorobencllate Tetradifon 1'36" Q'15" 6'05" 13'36" difuso difuso larga cola larga cola Fracción III: 100 mI. eter petróleo / eter sulfúrico 65/35 Folition Malation Metidation Clorobencllate Tetradifon Fracción IV: Metidation Imidan \2'15" difuso 2'36" difuso 3'30" larga cola 6'05" larga cola 13'36" larga cola 100 m!. eter petróleo/eter sulfúrico 3'30" 10'20" larga cola corta cola 50/50 F-3 F-7 a F-15 F-4 F-2 F-3 F-4 F-2 F-2 F-3 F-4 F-5 F-7 a F-15 F-17 a F-24 F-16 a F-22 F-17 F-17 a F-24 F-21 a F-28 F-27 F-16 a F-22 F-34 378 ARS PHARMACEUTICA TABLA NUM. V TANTO POR CIENTO DE RECUPERACION (5 ensayos) Pesticida Media SD Pesticida Media Lindano 87,4% 5,4 Quinotionato 77,5 Diazinon 77,1 3,0 TDE 86,5 Heptacloro 91,1 3,6 Clorobencilato 64,8 FoUtion 89,7 6,7 Etion 89'1 Malatlon 80,2 5,5 DDT 90,3 Aldrin 84,6 3,6 Imidan 53,8 Metidation 75,7 6,0 Metoxicloro 83,0 DDE 88,1 4,7 Tetradifon 103,9 Endrin 88,6 4,6 DISCUSION SD 3,8 4,4 6,6 4,6 3,8 3,0 2,8 3.7 El detector de captura de electrones especialmente diseñado para la detección de compuestos halogenados (pesticidasl organoclo raclos) es capaz de detectar también otros pesticidas que contengan en su molécula oxígeno, azuf.re o fósforo aunque su sensibilidad sea menor en estos últimos. En la tabla III puede observarse que hay una cierta correlación entre los límites de detección de los pesticidas do rados y el tanto por dent.o de cloto que entra en la molécula. En el grupo de fosforados es más difícil encontra.r esta relación puesto que en la captación de electrones influyen de forma diferente los diversos elementos que entran ,en la molécula. Sin embargo la pér dida de sensibilidad para los oI1ganofosforados no es obstáculo pa ra utilizar este detector como detector general dado a que en tér minos de aplicación es mucho más importante la identicaci'Ón de la naturaleza del pesticida (por su distinta toxicidad) que la cuantifi cación exacta del mismo. Prácticamente la determinación cuantita tiva sólo requiere tener la seguridad de que los residuos encontra dos no superan los límites de resi,duos ,recomendados por los Orga nismos Saniarios. Los límites prácticos de residuos en alimentos de la OMS (17) oscilan entre 0,002 ,a 1,0 partes por millón en alimen tos de origen vegetal o animal o sea de 2 a 1.000 microgramos por kilo {) litro. En análisis directo la concentraÓlón límite mínima está a nivel de la sensibilidad del método (ta'bla III) para los plaguicidas fosfo- ARS PHARMACEUTICA 379 radas, pero los métodos de extracci!ón normalmente utilizados con centran el pesticida 20 a 100. veces lo que hace factible la determina ción cuantitativ'a. De la observación de la tabla II se deduce que no hay una li nearidad absoluta en la .respuesta del detector a la concentración del plaguicida. No es inconveniente puesto que para una mayor €xactitud en las medidas puede diluirse la muestra hasta obtener la concentración que cae dentro de la zona de proporcionalidad. En la tabla IV se exponen los resultados obtenidos en ·el frac cionamiento de los pesticidas estudiados en columna de Florisil. Hay una primera fracción que eluye con 100 mI. de eter de petróleo/ eter sulfúrico (94/6) que algrupa casi todos los clorados así como el Eradex yel Etiou. Su elución de la columna en pequeñas fraccio nes de 5 Ó 10 mI. da un fraccionado con picos simétricos y algunas diferencias en el volumen de retención y que pueden permitir su diferenciación en caso de no identifkarse por los tiempos de reten ción. El incremento de polaridad del eluyente aumentando el por centaje de eter sulfúrico permit.e eluir de la columna otros pestici das pero con pérdida de la definición de los picos en el fraccionado, yen algunos casos incluso montan sobre dos fracdones generales. En conse·cuencia ,cuando se trata de analizar una mezcla desco nocida hay que fraccionar en .columna de Flo.risil con los cuatro elu yentes indicados y una vez concentrados someter cada grupo por separado a la cromatografía gaseosa. El valor cuantitativo total de cada pesticida s·e obiene sumando los valores parciales correspon dienes a cada fra·cción. Los ensayos de recuperación se han realizado empleando lotes de peras a los que previamente se les ha hecho un análisis en blan co para asegurarse de la inexistencia de pesticidas en las mismas. Los lotes así controlados se han adicionado de cantidades conocidas de los plaguicidas estudiados y se han sometido a la técnica de ex tTaclCión y análisis indicadas en los métodos. Los resultados se ex presan en la tabla V. Las recuperaciones son del orden del 80% o más, salvo en el caso del clorobencilato (64,8%) y del Imidan del que sólo se recupera la mitad. RESUMEN Se ha estudiado un método general de identificación y determi nación de pesticida:s combinando la cromatografía gaseosa con el