Inter- und intramolekulare Assoziationsreaktionen als zentrale Prozesse im Verlauf der Faltung und Stabilisierung von Proteinen

Interund intramolekulare Assoziationsreaktionen als zentrale Prozesse im Verlauf der Faltung und Stabilisierung von Proteinen DISSERTATION zur Erlangung des Grades - Doktor der Naturwissenschaften - der Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth vorgelegt von Diplom-Biochemikerin Stephanie Hoffmann-Thoms Bayreuth 2012 Die vorliegende Arbeit wurde von Mai 2007 bis Februar 2012 am Lehrstuhl für Biochemie der Universität Bayreuth unter der Anleitung von Prof. Dr. Franz X. Schmid angefertigt. Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth genehmigten Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.). Amtierender Dekan: Prof. Dr. Beate Lohnert Promotionsgesuch eingereicht am: 29. Februar 2012 Zulassung durch die Prüfungskommission: 14. März 2012 Tag des wissenschaftlichen Kolloquiums: 15. Juni 2012 Prüfungsausschuss: Prof. Dr. Franz-Xaver Schmid (Erstgutachter) Prof. Dr. Wulf Blankenfeldt (Zweitgutachter) Prof. Dr. Andreas Fery (Vorsitzender) Prof. Dr. Benedikt Westermann Inhaltsverzeichnis i Inhaltsverzeichnis 1Einleitung ........................................................................................................................................ 1 1.1 Aufbau und Vermehrung der Ff-Phagen ................................................................................... 1 1.2 Phage display zur Selektion auf erhöhte Bindungsaffinität ...................................................... 2 1.3Selektion auf erhöhte Stabilität – das Proside-Verfahren ......................................................... 3 1.4Die Rolle des G3P des fd Phagen bei der Infektion von E. coli Zellen .................................... 5 1.5 Prolylisomerisierung als limitierender Schritt der Phageninfektion ......................................... 9 1.6 Die Faltung des G3P* korreliert mit dem Infektionsmechanismus des fd Phagen ................. 10 1.7Problemstellung ...................................................................................................................... 12 2Material und Methoden ..................................................................................................................15 2.1Material ................................................................................................................................... 15 2.1.1Bakterienstämme und Plasmide ...................................................................................... 15 2.1.2Nährmedien ..................................................................................................................... 15 2.1.3Enzyme, Proteine und Peptide ........................................................................................ 15 2.1.4Oligodesoxyribonukleotide ............................................................................................. 16 2.1.5Chemikalien .................................................................................................................... 16 2.1.6Verbrauchsmaterialien .................................................................................................... 16 2.1.7Geräte .............................................................................................................................. 17 2.1.8Computerprogramme ...................................................................................................... 17 2.2Gelelektrophoretische Methoden ............................................................................................ 18 2.2.1Agarose-Gelelektrophorese ............................................................................................. 18 2.2.2Diskontinuierliche Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ............................. 18 2.3Isolierung und Reinigung von DNA ....................................................................................... 19 2.3.1Präparation doppelsträngiger DNA ................................................................................. 19 2.3.2Präparation einzelsträngiger DNA .................................................................................. 19 2.3.3Elution von DNA aus Agarose-Gelen ............................................................................. 19 2.4Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ......................................................................................... 20 2.4.1Kolonie-PCR ................................................................................................................... 20 2.4.2Einführung von Mutationen mittels blunt-end Mutagenese ............................................ 20 2.4.3Amplifikation von DNA-Fragmenten ............................................................................. 21 2.4.4Erzeugung von Genfragmenten anhand von overlap extension PCR ............................. 21 2.5Klonierung verschiedener Proteinvarianten ............................................................................ 21 2.5.1Restriktion der DNA-Fragmente und des Vektors pET11a ............................................ 21 2.5.2Ligation ........................................................................................................................... 22 2.6Herstellung und Transformation von E. coli Zellen ............................................................... 22 2.6.1Herstellung und Transformation elektrokompetenter E. coli XL1 Blue Zellen .............. 22 2.6.2Herstellung und Transformation CaCl2-kompetenter E. coli BL21 (DE3)-Zellen .......... 22 2.7Arbeiten mit Phagen ............................................................................................................... 23 2.7.1Propagation und Isolierung von fd Phagen ..................................................................... 23 2.7.2Infektion pilushaltiger E. coli XL1 Blue bzw. E. coli TG1 Zellen ................................. 23 2.7.3Infektion des pilusfreien E. coli HB2156 Stammes ........................................................ 23 2.7.4Vergleich der Infektiositäten verschiedener fd Phagen ................................................... 24 2.7.5Kompetitionsexperimente ............................................................................................... 24 2.8Expression der Protein-Varianten ........................................................................................... 25 2.8.1Test auf die Überexpression eines Proteins ..................................................................... 25 2.8.2Fermentation und Zellaufschluss .................................................................................... 25 Inhaltsverzeichnis ii 2.9Reinigung der Proteine ........................................................................................................... 25 2.9.1Reinigung der G1-Varianten ........................................................................................ 25 2.9.2Isolierung der G3P*-Varianten und der isolierten N1-Domäne aus inclusion bodies .... 26 2.9.3Reinigung der isolierten N1-Domäne des G3P des IF1 Phagen als SUMO-Fusion ....... 27 2.9.4Reinigung der C-terminalen Domäne des TolA-Proteins ............................................... 28 2.9.5Markierung des Rezeptorproteins TolAC mit IAEDANS .............................................. 29 2.10Probenvorbereitung und Konzentrationsbestimmung ............................................................ 30 2.11Untersuchung der konformationellen Stabilität der Proteine ................................................. 30 2.11.1Thermisch-induzierte Denaturierung .............................................................................. 30 2.11.2Denaturierungsmittel-induzierte Entfaltungsübergänge ................................................. 35 2.12Analyse des Faltungsmechanismus der Proteine ................................................................... 37 2.12.1Kinetische Messungen zur Faltung der G3P*-Varianten bzw. isolierten Domänen ...... 37 2.12.3Auswertung der kinetischen Messungen ........................................................................ 40 2.12.2Analyse der Faltung der G1-Varianten ........................................................................ 41 2.13Charakterisierung der Interaktion der N1-Domäne des G3P* mit TolAC-AEDANS ........... 44 2.13.1Messung von Fluoreszenzspektren ................................................................................. 44 2.13.2Kinetik der Bindung der N1-Domäne des G3P* an TolAC-AEDANS .......................... 44 2.13.3Rückfaltung des G3P* in Gegenwart von TolAC-AEDANS ......................................... 46 3Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................................ 47 3.1Die Faltung des Gen-3-Proteins des filamentösen Phagen fd ................................................ 47 3.1.1Die Faltung des globulären Teils der N2-Domäne erfolgt in der Totzeit der manuellen Mischung ...................................................................................................... 49 3.1.2 Die transcis-Isomerisierung von Pro213 ist der konformationellen Entfaltung von N2 aus dem gedockten Zustand nachgelagert ................................................................ 52 3.1.3 Anhand von Doppelmischexperimenten kann die Rückfaltung des G3P* direkt in die native Form verfolgt werden .................................................................................... 55 3.1.4 Die Substitution des Pro161 gegen Alanin hat keine Auswirkung auf den gedockten Zustand .......................................................................................................... 59 3.1.5 Durch den Austausch des Pro213 gegen Glycin liegt das WT fd G3P* teilweise in nicht assoziierter Form vor ............................................................................................. 65 3.1.6 Die Geschwindigkeit der Assoziation der Domänen im fd G3P* P213G ist gegenüber der transcis-Isomerisierung von Pro213 deutlich beschleunigt ................ 67 3.1.7 Die Assemblierung des fd G3P* P213G kann durch den Faltungshelfer hFKBP12+IF beschleunigt werden ................................................................................ 69 3.1.8 Die Rückfaltung der N2-Domäne in der stabilisierten Variante fd G3P* IIHY erfolgt unmittelbar in den lose-assoziierten Zustand ...................................................... 74 3.2 Aktivierung des fd Phagen G3P* durch Prolin-gekoppelte Entfaltung ................................. 82 3.2.1 Die Population des aktiven Intermediates erhöht die Affinität der N1-Domäne des G3P* für TolAC ............................................................................................................. 82 3.2.2 Im aktiven Intermediat des WT fd G3P* liegen die beiden Domänen N1 und N2 unabhängig voneinander vor .......................................................................................... 86 3.2.3 Sequenzvariationen um den Prolinschalter führen zur Dissoziation der N-terminalen Domänen .................................................................................................. 90 3.2.4 Die Substitution der Schaltersequenz hat gravierende Auswirkungen auf die Interaktion mit TolAC-AEDANS................................................................................... 94 3.2.5 Durch den Austausch der zu Pro213 benachbarten Reste liegt der entsprechende Phage permanent in der geöffneten Form vor ................................................................ 97 3.3 Der Einfluss der ersten Schleife von N1 auf die Assemblierung der N-terminalen Domänen des fd G3P* .................................................................................................. 100 Inhaltsverzeichnis iii 3.3.1 Der Austausch der ersten Schleife in N1 stabilisiert diese Domäne, führt aber gleichzeitig auch zur starken Destabilisierung der N2-Domäne ................................... 102 3.3.2 Im fd G3P* EGDS sind die Wechselwirkungen zwischen den N-terminalen Domänen drastisch vermindert ..................................................................................... 107 3.3.3 Durch die Substitution der Schleifenregion wird das aktive Intermediat populiert ...... 111 3.3.4 Der fd Phage geht durch den Austausch der Schleifenregion und den damit verbundenen Verlust der Domäneninteraktionen in den aktiven Zustand über ........... 114 3.3.5 Der Austausch der ersten Schleife von N1 kompensiert die Verbesserung der Domäneninteraktion durch die zusätzlichen Substitutionen des fd G3P* IIHY ........... 116 3.4Austausch der TolAC-Bindedomäne im fd G3P* durch die homologe N1-Domäne des filamentösen Phagen IF1 ............................................................................................... 121 3.4.1 Durch den Einbau von IF1-N1 in die stabilisierte Variante fd G3P* IIHY werden beide Domänen destabilisiert ........................................................................................ 122 3.4.2 In der Chimäre fd G3P* IF1-N1DDKTLD IHY liegen die Domänen IF1-N1DDKTLD und N2 in nicht assoziierter Form vor .................................................................................. 125 3.4.3 Durch die Gegenwart der N2-Domäne wird die Affinität der IF1-N1-Domäne in der Chimäre für TolAC-AEDANS nicht beeinflusst .................................................... 128 3.5 Die Bedeutung des distalen Serin-Glycin-reichen Linkers für die Stabilität und Funktionalität des fd G3P ............................................................................................. 134 3.5.1 Die Verkürzung des distalen Linkerbereiches hat keinen Einfluss auf die Stabilität und Faltung der N-terminalen Domänen des WT fd G3P* ........................................... 135 3.5.2 Die Affinität der N1-Domäne für TolAC ist unabhängig von der Länge des distalen Linkers des G3P* .......................................................................................................... 139 3.5.3 fd Phagen mit verkürztem distalem Linker haben bei der Propagation gegenüber dem Wildtyp-Phagen keinen Nachteil .......................................................................... 142 3.6 Strukturelle und energetische Grundlagen der Dimerisierung des G1-Proteins ................. 145 3.6.1 Die hohe Stabilität der Variante G1-M2 wird zum Teil bedingt durch die Ausbildung von Dimeren .............................................................................................. 146 3.6.2 Leucinreste an den Positionen 16 und 37 führen zur Dimerisierung des G1-Proteins ................................................................................................................. 149 3.6.3 Die Assoziation der Monomere des G1-M2 wird vermittelt über hydrophobe Wechselwirkungen und die Ausbildung eines intermolekularen -Faltblattes ............. 152 3.6.4 Die Natur des Restes an Position 33 hat keinen Einfluss auf die Tendenz des G1M2 zur Dimerisierung ................................................................................................... 156 3.6.5 Analyse des Faltungsmechanismus der hyperstabilen Variante G1-M2 ..................... 157 3.6.6 Über Doppelmischexperimente kann die Entfaltungsreaktion der monomeren Form des G1-M2 sichtbar gemacht werden .......................................................................... 161 3.6.7 Die Dissoziationskonstante des G1-M2-Dimers liegt im nanomolaren Bereich ........ 165 4.Zusammenfassende Diskussion ....................................................................................................169 4.1 Die Stabilität der Gelenkregion beeinflusst die Funktionalität des G3P .............................. 170 4.1.1Die aktive Form des WT fd G3P* liegt nicht im lose-assoziierten Zustand vor ........... 170 4.1.2 Im langlebigen Intermediat ist die Affinität der N1-Domäne des G3P* gegenüber TolAC deutlich erhöht .................................................................................................. 171 4.2Die Sequenz um Pro213 reguliert den Übergang in den gedockten Zustand des G3P ......... 172 4.2.1 Durch die Substitution des Pro213 gegen Glycin liegt das Wildtyp-G3P zum Teil in geöffneter Form vor ...................................................................................................... 172 4.2.2 Die Auswirkung der Austausche Q212A und P214A ist abhängig von der Natur des Restes an Position 213 .................................................................................................. 173 4.3Die Interaktion der ersten Schleife von N1 mit dem globulären Teil von N2 stabilisiert den assoziierten Zustand ............................................................................................... 175 iv 4.4Die N1-Domäne des IF1 Phagen kann trotz der strukturellen Ähnlichkeit zu fd-N1 diese funktionell nicht vollständig ersetzen ........................................................................... 177 4.5 Der distale Linker zwischen den N-terminalen Domänen hat keinen Einfluss auf die Infektion und Vermehrung des fd Phagen .................................................................... 178 4.6 G1 kann durch zwei Austausche in ein Dimer umgewandelt werden ............................... 179 4.6.1 Die hyperstabile Variante G1-M2 wird durch die Ausbildung von Dimeren zusätzlich stark stabilisiert ............................................................................................ 179 4.6.2 Stabilisierung von G1 mittels Proside – Selektion auf dimere Varianten? ................ 180 4.6.3 Über die Analyse des Faltungsmechanismus kann sowohl die Stabilität der monomeren Spezies als auch die des Komplexes ermittelt werden ............................. 180 5.Publikationsliste ........................................................................................................................... 183 6.Zusammenfassung ....................................................................................................................... 185 7.Summary ...................................................................................................................................... 189 8.Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................................ 193 9.Literaturverzeichnis ..................................................................................................................... 197 10.Anhang ......................................................................................................................................... 205 Einleitung 1 1 Einleitung Die Diskussion um umweltschonende Energiegewinnung und deren effizientere Nutzung sind aktueller denn je, vor allem vor dem Hintergrund, dass fossile Brennstoffe wie Kohle oder Erdöl die Umwelt belasten und zudem nur begrenzt verfügbar sind. Der Gebrauch der Kernenergie steht ebenfalls in der Kritik, nicht zuletzt angesichts der bislang ungeklärten Frage der Endlagerung der radioaktiven Kernbrennstäbe. Aus diesem Grund wird mittlerweile verstärkt die Nutzung von Wind-, Wasserund Sonnenenergie gefördert. Gerade die Entwicklung von Photovoltaikanlagen mit hohem Wirkungsgrad hat sich jedoch als schwierig erwiesen, weshalb mittlerweile auch ungewöhnliche Ansätze verfolgt werden. So konnte die Arbeitsgruppe um Angela Belcher durch die Verwendung von genetisch veränderten M13 Bakteriophagen zum einen als Gerüstmaterial für kohlenstoffhaltige Nanoröhren, zum anderen als Oberfläche zur Anlagerung von TiO2, einem wichtigen Bestandteil ihrer farbstoffsensibilisierten Solarzellen, deren Effizienz um fast ein Drittel von 8 auf 10,6 % steigern.1 Neben der Größe dieser für den Menschen ungefährlichen Phagen werden ihre einheitliche dreidimensionale Struktur und die über genetische Manipulation steuerbaren Eigenschaften ihrer Oberflächenproteine genutzt, um unter anderem effiziente Lithium-Batterien, Katalysatoren und halbleitende Nanodrähte zu entwickeln.2-5 Ein weiterer Vorteil des filamentösen M13 Phagen liegt in der verhältnismäßig einfachen Herstellung großer Mengen durch die Anzucht entsprechend infizierter Bakterienstämme.6; 7 Die Kenntnis der strukturellen und thermodynamischen Eigenschaften der Virusproteine sowie deren Funktion bei der Vermehrung dieser filamentösen Bakteriophagen ist daher eine wichtige Grundlage für die Entwicklung und Herstellung virus-basierter Nanotechnologieprodukte. 1.1 Aufbau und Vermehrung der Ff-Phagen Der filamentöse Phage M13 gehört innerhalb der Familie der Inoviridae zur Gattung der Inoviren.8 Die Inoviren, deren 6-7 kb große, zirkuläre Einzelstrang-DNA (ssDNA) von einem zylindrischen, jedoch flexiblen Filament umgeben ist, sind zwischen 1 und 2 µm lang .6; 9 Die meisten der bekannten Inoviren nutzen Gram-negative Bakterien verschiedener Gattungen wie z.B. Escherichia, Pseudomonas oder Salmonella als Wirtsorganismen, wobei sie zur Infektion die auf der Oberfläche der Zellen befindlichen, einziehbaren Pili als primäre Rezeptoren verwenden.6 Im Gegensatz zu den nicht filamentösen T4 oder -Phagen vermehren sie sich jedoch ohne die Bakterienzellen zu lysieren.8; 9 Die Phagenpartikel werden vielmehr über eine in der Membran der Wirtszelle gebildete Pore freigesetzt.6 Vom filamentösen Phagen Pf4 aus Pseudomonas aeruginosa ist sogar bekannt, dass er eine wichtige Rolle für die Dynamik des Biofilms der Wirtszelle und deren Virulenz spielt.10 Innerhalb der Gattung der Inoviren bildet der Bakteriophage M13 gemeinsam mit dem f1 Phagen und dem in dieser Arbeit näher untersuchten fd Phagen die Gruppe der Ff Phagen (F-Pili, filamentös), welche E. coli Zellen über deren F-Pilus infizieren.8; 11 Die drei Phagen- Einleitung 2 spezies f1, fd und M13 weisen eine Identität ihrer ssDNA von 98,5 % auf, wobei die neun enthaltenen Gene für elf Proteine codieren.6 Im Anschluss an die Infektion durch einen der Ff-Phagen, nachdem dessen ssDNA im Cytosol durch die DNA Polymerase III der E. coli Zelle zu einem Doppelstrang vervollständigt wurde, kommt es unter Einsatz des Gen-2-Proteins (G2P) des Phagen zur Replikation der DNA nach dem rolling circle Prinzip.6; 8 Die neu synthetisierte ssDNA wird zunächst durch das G10P stabilisiert und damit akkumuliert, bevor sie bis auf eine spezifische Packungssequenz vollständig von G5P-Molekülen bedeckt wird. Die Zusammensetzung des Phagen wird initiiert durch die Wechselwirkung des stabförmigen ssDNA-G5P-Komplexes mit dem aus G1P, G4P und G11P bestehenden Exportkomplex sowie den membranständigen G7P und G9P.6; 9; 12 Nachdem sich drei bis fünf Kopien dieser beiden Hüllproteine an die Spitze der Phagen-DNA gelagert haben, kommt es zur Elongation des Phagenpartikels. Gemäß dem gegenwärtigen Modell bilden das G1P und G11P einen ATP-abhängigen Kanal durch die Cytoplasmamembran, über den mit Hilfe des wirtseigenen Thioredoxin die ssDNA in das Periplasma transportiert wird.9; 13; 14 Das G5P wird dabei durch das in der Cytoplasmamembran lokalisierte G8P ersetzt, welches mit ca. 2700 Kopien den Großteil der Phagenhülle ausmacht. Sobald die Phagen-DNA vollständig von G8P umgeben ist, lagern sich drei bis fünf Kopien des G6P bzw. G3P an das untere Ende, wodurch der Phage gleichzeitig von der inneren Membran gelöst wird.15-17 Die abschließende Freisetzung in das Medium erfolgt über die aus 14 Molekülen des G4P formierte, fassförmige Pore in der äußeren Membran.18 Anzahl und Position der fünf Oberflächenproteine sind zwar bekannt, allerdings besitzt jedes Protein in Abhängigkeit seiner exponierten Seitengruppen definierte Bindungseigenschaften. Damit filamentöse Phagen als Gerüst z.B. zur spezifischen Anlagerung von TiO2 verwendet werden können, muss folglich zunächst die Affinität mindestens eines ihrer Hüllproteine gegenüber dem gewünschten Material erhöht werden. Bei den entsprechend modifizierten Viren erfolgt die Wechselwirkung mit dem Interaktionspartner nicht direkt über die Reste des Hüllproteins, sondern wird durch kurze Peptide vermittelt, die an einem Ende des Phagenproteines angefügt werden.2; 19; 20 Zur Identifizierung der am besten geeigneten Peptidsequenzen werden Selektionsverfahren auf Grundlage des sogenannten phage display angewandt.2; 7; 19; 20 1.2 Phage display zur Selektion auf erhöhte Bindungsaffinität Die Methode des phage display, welche 1985 von George P. Smith unter Verwendung des filamentösen Phagen M13 entworfen wurde21, ist mittlerweile ein sehr weit verbreitetes biotechnologisches Verfahren zur Entwicklung therapeutischer rekombinanter Antikörper, die an definierte Zielmoleküle binden.22-24 Darüber hinaus bietet das Verfahren die Möglichkeit zur Identifizierung spezifischer Inhibitoren der aktiven bzw. allosterischen Zentren von Enzymen.25; 26 Einleitung 3 Das Prinzip des phage display basiert auf dem Screening von Phagenbibliotheken nach Varianten mit erhöhter Affinität gegenüber einem spezifischen Bindungspartner.21 Dazu werden randomisierte Gensequenzen kurzer Peptide oder auch Proteine so in das Gen eines der Oberflächenproteine des Phagen integriert, dass das resultierende Fusionsprodukt nach der Assemblierung an der Oberfläche des Phagen präsentiert wird. Damit ist die Verknüpfung von Genound Phänotyp gewährleistet. Solche Bibliotheken enthalten bis zu 1011 verschiedene Phagenvarianten und werden anhand des sogenannten panning (engl. „Schwenken“) nach hochaffinen Varianten durchsucht, indem nach der Inkubation mit dem an einer festen Phase immobilisierten Zielprotein durch einen oder mehrere Waschschritte ungebundene bzw. schwach bindende Phagen entfernt werden.25 Die anschließend eluierten Phagen mit hoher Affinität gegenüber dem Bindungspartner werden teilweise durch die Infektion von Wirtszellen vervielfältigt und gegebenenfalls einer weiteren Selektionsrunde unterworfen.21; 25 Die Sequenz des selektierten Polypeptids ergibt sich durch Sequenzierung des entsprechenden Bereiches der ssDNA des Phagen. Die Methode des phage display wird hauptsächlich zur Charakterisierung bzw. Verbesserung von Protein–Protein–Interaktionen verwendet.26-28 Für industrielle Anwendungen spielen jedoch neben den Bindungsvor allem auch die enzymatischen Eigenschaften von Proteinen eine wichtige Rolle, da sie in der Regel eine hohe Selektivität besitzen.29; 30 Die natürliche Evolution der Proteine ist allerdings auf ein ausgewogenes Verhältnis zwischen konformationeller Stabilität und der für die Funktion wichtigen Flexibilität ausgerichtet, weshalb in vielen Industriezweigen zur biotechnologischen Herstellung von Produkten Enzyme thermophiler bzw. hyperthermophiler Organismen verwendet werden.31-33 Dies hat den Vorteil, dass technische Verfahren bei höheren Temperaturen durchgeführt werden können, wodurch die Löslichkeit der Reaktanten sowie die Reaktionsraten gesteigert und gleichzeitig mikrobiologische Kontaminationen reduziert werden.34; 35 Zudem beschäftigt sich der Forschungsbereich des sogenannten protein engineering mit der Entwicklung maßgeschneiderter Proteine mit optimierten oder vollkommen neuen Eigenschaften. Neben der rationalen Mutagenese 36-38 und dem computergestützten Design39-41 werden dabei auch (Phagen-)Displayverfahren zur gerichteten Evolution verwendet, um nicht nur Enzyme mit gesteigerter Aktivität sondern auch hoher thermischer Stabilität zu erhalten.42-46 1.3 Selektion auf erhöhte Stabilität – das Proside-Verfahren Das phage display auf erhöhte Stabilität basiert auf der selektiven Bindung stabilisierter Varianten eines Proteins an immobilisierte Liganden und ist daher abhängig von dessen Bindungseigenschaften.44; 47 Eine Alternative dazu stellt das Selektionssystem Proside (Protein stability increased by directed evolution) dar.48; 49 Es verknüpft die Infektiosität des filamentösen Phagen fd mit der proteolytischen Stabilität des in das phageneigene G3P eingebauten Gastproteins (Abbildung 1.1a). Dabei wird die Tatsache ausgenutzt, dass Proteine im nativen, gefalteten Zustand üblicherweise weniger empfindlich gegenüber Einleitung 10 lokal entfaltete Umgebung des Prolinrestes, wodurch aufgrund der höheren Flexibilität der isomere Zustand nicht fixiert werden kann.111; 112 Es gibt jedoch auch Hinweise darauf, dass die Isomerisierung zwischen den beiden Konformationen als molekularer Schalter eingesetzt wird. So zeigt die SH2-Domäne der Tyrosinkinase Itk in Abhängigkeit von der Konformation des Prolinrestes 287 eine unterschiedlich starke Affinität zu seinen alternativen Substraten, der Itk-SH3-Domäne und einem phosphotyrosinhaltigen Peptid.113; 114 Entgegen früherer Vermutungen ist in der Regel der Übergang vom entfalteten Zustand in ein teilweise gefaltetes Intermediat auch dann möglich, wenn einige der Prolinreste noch in ihrer nicht-nativen Konfiguration vorliegen. Die anschließende Einnahme der nativen Konformation wird limitiert durch die Isomerisierung der unkorrekten Peptidylprolylbindung. Aufgrund des partiellen Doppelbindungscharakters der Bindung ist die Energiebarriere zwischen den Isomeren allerdings sehr hoch (etwa 80 kJ mol-1) und daher läuft die Reaktion mit Zeitkonstanten zwischen 10 und 100 s (bei 25 °C) langsam ab.106; 115 Sie ist jedoch durch sogenannte Prolylisomerasen wie Cyclophilin, den Triggerfaktor oder SlyD katalysierbar. 116-119 Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass auch die Zeitkonstante der Inaktivierung des fd Phagen, dessen N2-Domäne des G3P mit Pro161 im globulären Teil und Pro213 in der Gelenkregion gleich zwei cis-Prolinreste enthält (Abbildung 1.2), durch Cyclophilin18 deutlich beschleunigt wird.96; 120 Da zudem der fd Phage, in dessen G3P Pro213 gegen Glycin ausgetauscht wurde, deutlich schneller in die assoziierte Form übergeht als der WildtypPhage, konnte dieser in der Gelenkregion gelegene Prolinrest eindeutig als Zeitgeber der Lebensdauer des aktiven, geöffneten Zustandes identifiziert werden.96 Die auch im Vergleich zu bekannten Prolylisomerisierungen in Peptiden und Proteinen verhältnismäßig langsame Rate von 5700 s wird dabei verursacht durch die lokale Sequenz um Pro213. Der Austausch eines der beiden flankierenden Reste Gln212 bzw. Pro214 (Abbildung 1.2) führt ebenfalls zu einer beschleunigten Einnahme der inaktiven Form des Phagen. Die lokale Sequenz um Pro213 des G3P fungiert demnach als Schalter der Infektion von E. coli Zellen durch den fd Phagen.96 1.6 Die Faltung des G3P* korreliert mit dem Infektionsmechanismus des fd Phagen Die Einstellung des cis/trans-Gleichgewichtes an Pro213 ist nicht nur der Zeitgeber für den Infektionsprozess sondern auch der ratenlimitierende Schritt während der Einnahme des nativen Zustandes des G3P. Dies konnte unter anderem anhand des Faltungsmechanismus des N1N2-Fragmentes der über die Proside-Methode stabilisierten Variante fd G3P* IIHY gezeigt werden, in der teilgefaltete Intermediate besser charakterisiert werden konnten, da sie stabiler sind.121; 122 Dieses Protein, in dem vor allem die N2-Domäne stark stabilisiert ist, beinhaltet mit T101I und Q129H zwei Substitutionen in der Gelenkregion. Die anderen beiden Austausche T13I und D209Y sind in der N1-Domäne bzw. dem globulären Teil der N2-Domäne lokalisiert (Abbildung 1.4a). Einleitung 11 Abbildung 1.4: Der Faltungsmechanismus der stabilisierten Variante fd G3P* IIHY. a) Tertiärstruktur des N1N2-Fragments von WT fd G3P*. Die Reste Pro161, Gln212, Pro213 und Pro214 sowie die Positionen der stabilisierenden Substitutionen im fd G3P* IIHY sind als Stäbchen-Modelle gezeigt. Die N1Domäne ist in rot, der globuläre Teil von N2 in blau und die Gelenkregion in grün dargestellt. Die Abbildung wurde anhand der PDB-Struktur 2G3P60 mit dem Programm Pymol123 erstellt. b) Modell des Faltungsmechanismus von fd G3P* IIHY. Angegeben sind die Zeitkonstanten  der Entfaltungsreaktionen der beiden N-terminalen Domänen bei 3,0 bzw. 4,5 M GdmCl sowie die Rückfaltungsreaktionen in 0,5 M GdmCl. Zu Beginn der Rückfaltung geht zunächst die N1-Domäne in den nativen Zustand über (rotes Quadrat). Die Faltung der N2-Domäne (blaues Quadrat) erfolgt in zwei sequenziellen Schritten. Nach der konformationellen Faltung des globulären Teils kommt es nach dem Modell zur losen Assoziation der Domänen. Die Einnahme der nativen Konformation wird durch die transcis-Isomerisierung von Pro213 verursacht, wodurch die Gelenkregion (grünes Rechteck) gefaltet wird. Aufgrund der Assoziation der Domänen ist ihre Entfaltung nicht nur deutlich verlangsamt, sondern auch gekoppelt. Die Abbildung wurde nach Referenz 122 modifiziert. Nach dem gegenwärtigen Modell umfasst die Faltung des G3P* einen Zeitbereich von wenigen Millisekunden bis zu mehreren Stunden, wobei der letzte Schritt durch die Isomerisierung von Pro213 in die cis-Konformation limitiert wird (Abbildung 1.4b).122 Während der frühen Phase der Rückfaltung ausgehend von vollständig denaturiertem Protein (U) faltet zunächst die stabilere N1-Domäne ( = 9,4 ms in 0,5 M GdmCl). Die Zeitkonstante entspricht dabei der der isolierten N1-Domäne, was zeigt, dass die Strukturierung von N1 im G3P* unabhängig von der noch immer entfalteten N2-Domäne erfolgt. Diese faltet mit deutlicher Verzögerung in zwei sequenziellen Schritten. Die schnellere der beiden Phasen mit einer Zeitkonstante von 7 s spiegelt dabei die konformationelle Faltung ihres globulären Teils wider. Der zweite Schritt ( = 42 s in 0,5 M GdmCl) wird der losen Assoziation der beiden gefalteten Domänen zugeschrieben.122 Anhand von NMR-Experimenten konnte zeigt werden, dass in diesem Zustand ein großer Teil der Reste der Gelenkregion noch nicht in der nativen Konformation vorliegt.62 Die Thr13 Pro161 Pro213 Asp209Thr101 Gln129 Pro214 Gln212 a) b) Einleitung 12 Bindungsstelle für den Membranrezeptor TolA auf der N1-Domäne ist in dieser Form folglich zugänglich. Da das Intermediat zudem langlebig ist, wird davon ausgegangen, dass es der aktiven Form des G3P des fd Phagen entspricht. Die abschließende Einnahme des nativen Zustandes (N) erfolgt durch die transcis-Isomerisierung des Pro213, wodurch die Gelenkregion in den nativen Zustand übergeht. Mit einer Zeitkonstante von 6200 s liegt die Geschwindigkeit der Reaktion im Zeitbereich der Inaktivierung des fd Phagen ( = 5700 s).96 Auch die Entfaltung des fd G3P* IIHY wird durch die Konformation seines Pro213 beeinflusst. Ausgehend von nativem Protein mit cis-Pro213 entfalten die assemblierten Domänen in einphasigen Prozessen mit der gleichen langsamen Geschwindigkeit ( = 2500 s in 3 M GdmCl, Abbildung 1.4).122 Die Isomerisierung des Prolinrestes in der Gelenkregion ist unter diesen Bedingungen demnach der ratenlimitierende Schritt der Entfaltung beider Domänen. Während der Infektion werden dagegen durch die Interaktion der N2-Domäne mit dem Pilus die cistrans-Isomerisierung des Pro213 und damit Dissoziation der Domänen initiiert. Aus dem entsprechenden Intermediatszustand des G3P* mit trans-Pro213 ist die Entfaltung der beiden Domänen nicht nur deutlich beschleunigt sondern auch voneinander entkoppelt.122 1.7 Problemstellung Der Faltungsmechanismus des fd G3P* IIHY bestätigt, dass das G3P des Phagen für die Infektion der E. coli Zellen zunächst aktiviert werden muss. Die dafür notwendige Dissoziation von N1 und N2 wird hervorgerufen durch die cistrans-Isomerisierung des Pro213, in Folge der es zur partiellen Entfaltung der Gelenkregion und damit der Destabilisierung der N2-Domäne kommt. Bei der Untersuchung der Auswirkungen zusätzlicher destabilisierender Austausche in der N2-Domäne auf die Stabilität und den Faltungsmechanismus des G3P* hat sich jedoch gezeigt, dass diese sehr stark vom jeweiligen Substitutionshintergrund abhängen. Während einige Austausche im Wildtyp-G3P* (WT fd G3P*) zu einer drastischen Abnahme der Stabilität der N2-Domäne und der Entkopplung der Entfaltung der Domänen führte, wurde ihr Effekt durch die in der stabilisierten Variante enthaltenen Substitutionen fast vollständig kompensiert. Aus diesem Grund sollte in Rahmen der vorliegenden Arbeit zunächst die von Roman Jakob begonnene Untersuchung der Faltung des natürlichen G3P* abgeschlossen werden. Anhand der Analyse wurde deutlich, dass das natürliche G3P* im Gegensatz zur stabilisierten Variante während der Rückfaltung keine lose-assoziierte Konformation einnimmt. Die N2-Domäne in WT fd G3P* wird analog zu ihrer isolierten Form lediglich durch die Isomerisierung des Prolinrestes 161 in seine native cis-Konformation stabilisiert. Es stellte sich daher die Frage, inwieweit die Entund Rückfaltungsreaktionen des WT fd G3P* nicht nur durch die Isomerisierung des Pro213 sondern auch des Pro161 beeinflusst werden. Um dies zu klären, wurden zusätzlich die Faltung der G3P*-Varianten mit den Substitutionen P161A bzw. P213G untersucht. Einleitung 13 Von der Wechselwirkung zwischen den beiden N-terminalen Domänen hängt nicht nur die Stabilität der N2-Domäne, sondern auch die Zugänglichkeit der Bindungsfläche für TolAC auf der N1-Domäne ab. Daher war zu erwarten, dass die geöffnete Form des WT fd G3P* deutlich besser mit TolAC interagieren kann als die des fd G3P* IIHY. Die Schaltersequenz Gln212-Pro213-Pro214 beeinflusst ebenfalls die Population des aktiven Zustandes, da sie über die Geschwindigkeit der Prolylisomerisierung die Öffnungsund Schließrate der Domänen vorgibt. Durch die Kombination von in vivo und in vitro Experimenten sollte daher analysiert werden, wie sich der Faltungszustand des G3P* und die Variation der lokalen Sequenz um Pro213 auf die Affinität des G3P für TolAC auswirkt. Während der Infektion werden die notwendige Isomerisierung von Pro213 und die daran gekoppelte Dissoziation der Domänen durch die Bindung der N2-Domäne an die Spitze des Pilus ausgelöst. Welche strukturellen Veränderungen durch diese Interaktion hervorgerufen werden und welche Bereiche des G3P an der Weiterleitung des Signals zur Gelenkregion beteiligt sind, ist jedoch nicht bekannt. Anhand der Substitution einer Schleifensequenz in der Interaktionsfläche der beiden Domänen, die Deletion des distalen Glycin-Serin-reichen Linkers sowie den Austausch der N1-Domäne durch die homologe N1-Domäne des Phagen IF1 sollte der Einfluss dieser Strukturelemente auf die Assoziationsfähigkeit der N-terminalen Domänen analysiert werden. Diese Information ermöglicht Rückschlüsse auf weitere, für die Stabilisierung des gedockten Zustandes essentielle, Interaktionen im G3P, die folglich während der Dissoziation der Domänen aufgehoben werden müssen. Mit Hilfe des Selektionssystems Proside, das die Infektiosität des fd Phagen an die proteolytische Stabilität des eingebauten Gastproteins koppelt, konnten für das G1-Protein mehrere stabilisierende Substitutionen identifiziert werden. Die Kombination der besten Austausche ergab die Variante G1-M2, die im Vergleich zum Wildtyp-Protein einen deutlich höheren Schmelzpunkt besitzt. Im zweiten Teil der Arbeit sollten die energetischen und strukturellen Grundlagen dieser Stabilisierung analysiert werden. Dabei zeigte sich, dass diese unter anderem durch die Ausbildung von Dimeren verursacht wird, die auch durch die Variation der Lösungsmittelbedingungen nicht unterbunden werden konnte. Da die Stabilität der monomeren Form über Gleichgewichtsentfaltung nicht zugänglich war, sollte anhand der Faltungskinetiken der Variante versucht werden, die konformationelle Faltung des Monomers von der Assoziationsbzw. Dissoziationsreaktion der Moleküle zu trennen. Aus dem Verlauf der Entund Rückfaltungsraten könnte dann unter anderem die freie Enthalpie der Entfaltung des Monomers bestimmt und damit eine Aussage über den stabilisierenden Effekt der vier enthaltenen Substitutionen getroffen werden. 14 Materialien und Methoden 15 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Bakterienstämme und Plasmide In der vorliegenden Arbeit wurden folgende Bakterienstämme verwendet: Der E. coli Stamm XL1 Blue wurde zur Produktion von Plasmid-DNA und zur Propagation des fd Phagen verwendet. Der Stamm wurde genauso wie die E. coli TG1 Zellen und der pilusfreie E. coli HB2156 Stamm für Infektionsexperimente benutzt. Der in dieser Arbeit näher untersuchte fd Phage basiert auf dem Phagemid fCKCBS.48; 125 Die Expression von Proteinen erfolgte in E. coli BL21 (DE3) Zellen. Als Vektor für die Klonierung und Expression der Protein-Varianten wurde das Plasmid pET11a (AmpR, NOVAGEN, Madison, USA) verwendet. Das in diesen Vektor klonierte Gen wurde dabei unter Kontrolle eines T7-Promotors gebracht. 2.1.2 Nährmedien dYT-Medium: 5 g l-1 NaCl; 10 g l-1 Hefeextrakt; 16 g l-1 Pepton aus Casein Nährböden: dYT-Medium mit 1,5 % (w/v) Agar-Agar Die Nährmedien wurden durch Autoklavieren (120 °C; 20 min; 2 bar) sterilisiert. Antibiotika zur Selektion auf Resistenzen wurden nach dem Autoklavieren als steril filtrierte Stammlösungen zu den Nährmedien gegeben (Amp: 300 µg ml-1, Cm: 25 µg ml-1). 2.1.3 Enzyme, Proteine und Peptide Taq-DNA-Polymerase (6 U/µl) S. Hoffmann-Thoms (Bayreuth) Pfu-DNA-Polymerase (3 U/µl) MBI Fermentas (Vilnius, LT) T4-DNA-Ligase (1 Weiss U/µl) T4-Polynukleotidkinase (10 U/µl) Restriktionsenzyme: BamHI, NdeI (20 U/µl) BenchMarkTM Proteinstandard bovines Serumalbumin (BSA 100x, 100 mg/ml) NEB (Frankfurt a. Main) Abz-Ala-Ala-Pro-Ala-Ala-pNa Dr. G. Jahreis (MPI, Halle) Die im Rahmen der Arbeit für Messungen verwendeten Proteine fd G3P* G153D, fd G3P* Q212A, fd G3P* P212A, fd G3P* P213G, sowie fd G3P* IIHY P213G und fd G3P* IIHY P161A wurden von E. coli XL1 Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 relA1 lac [F`proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (TetR)] Stratagene (La Jolla, USA) E. coli BL21 (DE3) B Fdcm ompT hsdS (rB– mB–) gal λ(DE3) E. coli TG1 F´ traD36 lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+/supE Δ(hsdM-mcrB) 5 ( rk-, mk+McrB-), thiΔ (lac-proAB) E. coli HB 2156 supE thi-1 (lac-pro-AB)  (mcrB-hsdSM)5 (rk-, mk+) Referenz 124 Materialien und Methoden 16 Barbara Eckert zur Verfügung gestellt.79 Vor der Verwendung wurden diese Varianten, wie unter 2.9.2.3 beschrieben, einer Gelfiltrationschromatographie unterzogen. Die Varianten fd G3P* AGA und isolierte N2-Domäne bzw. fd G3P* APA wurden von Roman Jakob bzw. Johanna Koch hergestellt. Die Proteine fd G3P* IIHY 6 und fd G3P* IIHY APA wurden von Stefan Lorenz bzw. Christian Wunschel erhalten.80; 126 Von Anna Schneider wurde im Rahmen eines von mir betreuten Praktikums die Variante fd G3P* EGDS gereinigt. Die Prolylisomerase hFKBP12+IF127 wurde von Anne-Juliane Geitner zur Verfügung gestellt. Einige der G1-Proteine wurden von Michael Wunderlich erhalten.128 2.1.4 Oligodesoxyribonukleotide Die zur Klonierung der jeweiligen Protein-Varianten bzw. zur Herstellung von Phagenvarianten verwendeten Oligodesoxyribonukleotide wurden von der Firma INVITROGEN (Karlsruhe, D) bezogen und sind in Tabelle 10.5 im Anhang aufgeführt. DNA-Längenstandards: λ-DNA/Eco 130 I: 421-19329 bp MBI Fermentas (Vilnius; LT) bp-Leiter: 100-1500 bp Johanna Koch (Bayreuth) 2.1.5 Chemikalien Imidazol, Chloroform/Isoamylalkohol, PEG-8000 Fluka (Neu-Ulm) Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG), Harnstoff Gerbu (Gaiberg) 1,5-IAEDANS ( > 90%) Guanidiniumchlorid (ultra pure) MP (Biomedicals, Irvine, USA) Adenosin-5’-Triphosphat, Ampicillin, Acrylamid/ N,N’- Roth (Karlsruhe) Methylenbisacrylamidlösung (37,5:1 “Rotiphorese 30”), Desoxyribonukleotide, EDTA, Ethidiumbromid, Glutathion ox. (GSSG), Glutathion red. (GSH), N,N,N´,N´-Tetramethylenethylendiamin (TEMED), N-(Tri(hydroxymethyl)methyl)glycin (Tricin), Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), Tris-(2-carboxyethyl)-phosphinhydrochlorid (TCEP) Agarose, APS, SDS Serva (Heidelberg) Coomassie Brillinat Blue G-250, Silica (S-5631), Sigma Aldrich (Deisenhofen) Bromphenolblau Alle weiteren Chemikalien wurden im Reinheitsgrad p.A. von der Firma VWR (Darmstadt) bezogen. Das für Puffer und Lösungen verwendete Wasser wurde mit einer Seralpur-Reinstwasseranlage deionisiert (ddH2O, Leitfähigkeit < 0,1 μS cm-1). Puffer für spektroskopische Messungen wurden durch 0,45 μm-Nylonfilter filtriert und vor Gebrauch mindestens 30 min lang entgast. 2.1.6 Verbrauchsmaterialien Ni-NTA-Superflow-Agarose-Säule Qiagen (Hilden) NAP-5 und -10 Säulen (Sephadex G-25 DNA-grade), GE Healthcare (Freiburg, D) Materialien und Methoden 17 Gelfiltrationssäule HiLoad Superdex 75 (16/60 und 26/60 prep grade) Fractogel EMI TMAE-650 Anionenaustauschersäule Konzentratoren Amicon Ultra-15(3,5 kDa Ausschluss), Millipore (Billerica, USA) Millipore Filter Typ VS 0,025 µm Spectropor Dialyseschläuch (>3,5 kDa) Spectrum (Los Angeles, USA) Rotilabor Spritzenfilter (0,45; 0,2 µm) Sarstedt (Nürnbrecht) Membranfilter (0,2 µm) Schleicher & Schuell (Dassel) 2.1.7 Geräte DX.17MV sequential Applied Photophysics, stopped-flow-Fluoreszenzspektrometer (Leatherhead, GB) Transilluminator 302 nm Bachhofer (Reutlingen) Kühlzentrifuge Sorvall RC-5Bplus Du Pont (Bad Homburg) Rotoren GS-3 und SS-34 Zentrifuge 5415 R, Mastercycler Gradient, Eppendorf (Hamburg) Thermomixer 5436 FPLC-Anlage, ÄKTA-FPLC (academic edition), GE Healthcare (Freiburg) Vertikalelektrophoresekammer 2050 MIDGET und Netzgerat 2301 Macro Präzisionsküvetten aus Quarzglas Suprasil Hellma (Mühlheim) Laborfuge 400 R Heraeus (Hanau) Zentrifuge Z 216 MK Hermle (Wehingen) Zentrifuge 5415 R Eppendorf (Hamburg) Refraktometer Krüss (Hamburg) Bio-Print Darkroom CN-UV/Vis LTF-Labortechnik (Wasserburg) Microfluidizer M-110L Microfluidics (Newton, USA) Thermocycler PTC 100 MJ Research (Watertown, USA) environmental incubator shaker G24, New Brunswick Scientific Innova 3000, incubator shaker C24 (Edison, USA) Easyject Prima Elektroporationsapparatur Peqlab (Erlangen) Laborwaage L610D, Analysenwaage R200D Sartorius (Göttingen) Wasseraufbereitung: Seralpur pro 90 CN Seral (Ransbach) UV/VIS-Dioden-Array Spectrometer 8452A Hewlett-Packard (Waldbronn) Hitachi-Fluoreszenzspektrophotometer F-4010 Hitachi (Tokio, J) Spektropolarimeter Jasco J-600, Peltierelement PTC-348 Jasco (Groß-Umstadt) Jasco-Fluoreszenzpektrophotometer FP-6500 VP-DSC Mikrokalorimeter MicroCal (Northampton, USA) UV/Vis-Spektrophotometer: Cary 100 Bio Varian (Darmstadt) Membran-Vakuumpumpe Vakuubrand (Wertheim) Mikroprozessor pH-Meter: WTW pH 537 WTW (Weilheim) 2.1.8 Computerprogramme Biocapt LTF-Labortechnik (Wasserburg) BioEdit Hall, T. (Ibis Therapeutics, USA) Materialien und Methoden 18 Chromas 1.4.5 Technelysium (Helensvale, AUS) Grafit 3.0 / 5.0 Erithacus (Middlesex, UK) ImageJ 1.30v Rasband, W. (NIH, Bethesda, USA) Origin 5.0 OriginLab Corporation (USA) Pymol DeLanoScientific (San Francisco, USA) Scientist 2.01 Micromath (St. Louis, USA) Swiss-Pdb Viewer Version 3.7 GlaxoSmithKline (München, D)129 DynaFit Referenz 130; 131 2.2 Gelelektrophoretische Methoden 2.2.1 Agarose-Gelelektrophorese TAE-Puffer (1x): 40 mM Tris/HCl, pHRT 8,0; 20 mM Eisessig; 1 mM EDTA Probenpuffer (6x): 4 M Harnstoff; 10 mM EDTA; 0,1 % (w/v) Bromphenolblau; 50 % (v/v) Glycerin Zur präparativen Reinigung von DNA-Fragmenten und Plasmide sowie der Auftrennung und Identifizierung von DNA-Fragmenten wurde die Methode der horizontalen AgaroseGelelektrophorese verwendet. Je nach Größe der zu analysierenden Fragmente wurde die Konzentration an Agarose zwischen 0,6 und 3,0 % (w/v) variiert. Die Proben wurden mit 16  Volumen an Probenpuffer gemischt und auf das Gel aufgetragen. Die Gelelektrophorese erfolgte 30 min lang in einer horizontalen Elektrophoresekammer mit 0,5x TAE-Puffer und einer angelegten Spannung von 6 V pro cm Elektrodenabstand. Zur Färbung der DNA-Banden wurde das Gel in EthidiumbromidFärbelösung (ca. 2 µg ml-1) 5 min lang gelegt. Nach kurzer Entfärbung in 0,5x TAE-Puffer wurden die DNA-Banden unter UV-Licht ( = 302 nm) identifiziert. 2.2.2 Diskontinuierliche Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Sammelgel: 4,2 % (w/v) Acrylamid (Stammlösung mit 37,5:1 Acrylamid/N,N’- Methylenbisacrylamid); 0,75 M Tris/HCl, pHRT 8,45; 0,07 % (w/v) SDS Trenngel: 2,5 % (w/v) Acrylamid (Stammlösung s.o.); 1 M Tris/HCl, pHRT 8,45; 0,1 % (w/v) SDS Probenpuffer (4x): 0,2 M Tris/HCl pHRT 7,0; 0,12 M DTE; 40 mM EDTA; 48 % (v/v) Glycerin; 15 % (w/v) SDS; 0,04 % (w/v) Bromphenolblau Anoden-Puffer: 0,2 M Tris/HCl pHRT 8,9 Kathoden-Puffer: 0,1 M Tris/HCl pHRT 8,2; 0,1 M Tricin; 0,1 % (w/v) SDS Färbelösung: 25 % (v/v) Isopropanol; 10 % (v/v) Essigsäure; 0,05 % (w/v) CoomassieBrilliant Blue G Entfärbelösung: 10 % (v/v) Essigsäure Die Methode der Gelelektrophorese nach Schägger und von Jagow132 wird verwendet, um denaturierte Proteine nach ihrer relativen Größe zwischen fünf und 100 kDa aufzutrennen, wobei Tricin als Folgeion eingesetzt wird. Zur Vorbereitung der Proben wurden die Proteinlösungen (etwa 2,5 µg) jeweils mit 14  Probenpuffer versetzt und zur Denaturierung für 10 min in einem Wasserbad erhitzt. Die Gelelektrophorese wurde in einer gekühlten MIDGET-Vertikalelektrophoresekammer bei 7 °C durchgeführt. Für den Lauf der Proben durch das Sammelgel wurde eine Spannung von 20 mA angelegt, welche zum Auftrennen der Proteine im Trenngel auf 45 mA erhöht wurde. Nach Materialien und Methoden 19 Beendigung der Gelelektrophorese wurden die Proteinbanden im Gel durch kurzes Erhitzen und 10-minütige Inkubation mit Färbelösung angefärbt. Die Entfärbung in Entfärbelösung erfolgte durch Erhitzen und anschließende Inkubation des Gels für mehrere Stunden bei RT. 2.3 Isolierung und Reinigung von DNA 2.3.1 Präparation doppelsträngiger DNA Um doppelsträngige Plasmidbzw. Phagen-DNA zu präparieren wurden Kulturen der jeweiligen E. coli Zellen über Nacht bei 37 °C inkubiert. Von dieser Übernachtkultur wurden 1,5 ml entnommen, abzentrifugiert und aus dem resultierenden Zellpellet mit Hilfe des Pharmacia-FlexiPrep-Kit (GE Healthcare, Freiburg, D) gemäß den Herstellerangaben die DNA präpariert. Die Elution der DNA von der Anionenaustauschermatrix erfolgte mit 50 µl ddH2O. 2.3.2 Präparation einzelsträngiger DNA TE-Puffer: 10 mM Tris/HCl, pHRT 8,0; 1 mM EDTA Zur Isolierung einzelsträngiger Phagen-DNA wurde das nach 2.7.1 erhaltene Phagenpellet in 100 μl TE-Puffer resuspendiert. Um die Proteinhülle des Phagen zu entfernen, wurden 50 μl Phenol/Tris zugegeben, der Ansatz 30 s lang geschüttelt und anschließend zur Phasentrennung zentrifugiert (13000 rpm, 4 °C, 1 min). Die ssDNA-haltige Oberphase wurde abgenommen und unter den gleichen Bedingungen eine Chloroform/Isoamylalkohol-Fällung (Verhältnis 24:1) durchgeführt. Der Überstand wurde mit 300 µl Ethanol/ 3 M Na-Acetat (25:1), pH 5,2 versetzt und 15 min lang bei RT zur Präzipitation der ssDNA inkubiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation (13000 rpm, 4 °C) wurde das ssDNA-Pellet mit 200 μl 70 % Ethanol gewaschen, 10 min bei RT getrocknet und in 30 μl ddH2O resuspendiert. 2.3.3 Elution von DNA aus Agarose-Gelen Waschpuffer: 50 mM NaCl; 10 mM Tris/HCl pHRT 7,5; 2,5 mM EDTA; 50 % (v/v) Ethanol Silica-Suspension: 1 g Silica in 10 ml 3 M NaI Zur Reinigung und Abtrennung von DNA-Fragmenten von solchen anderer Länge nach einem Restriktionsschnitt oder einer PCR wurde die DNA im Agarosegel aufgetrennt (2.2.1), das gewünschte Fragment ausgeschnitten und in ein Reaktionsgefäß überführt. Zu dem Fragment wurden zwei Volumina 6 M NaI zugegeben und der Ansatz bei 55 °C 5 min lang geschüttelt, um das Gelstück vollständig zu lösen. Anschließend wurde ein geeignetes Volumen Silica-Suspension (10 µl enthalten 1 mg Silica, an das bei genügend hoher Ionenstärke ca. 3 µg DNA binden) hinzugefügt und der Ansatz 5 min auf Eis inkubiert. Nach kurzem Zentrifugieren wurde das resultierende Pellet dreimal mit je 500 µl Waschpuffer gewaschen. Nach vollständiger Entfernung des Puffers wurde das in 30 µl ddH2O aufgenommene Pellet zur Elution der DNA bei 45 °C 5 min lang unter Schütteln eluiert. Nach erneuter Zentrifugation wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bei -20 °C gelagert. Das gleiche Verfahren wurde in leicht abgewandelter Form auch zur Entsalzung von DNA z.B. nach Materialien und Methoden 26 2.9.1.2 Anionenaustauschchromatographie Auftragspuffer: 20 mM Tris/HCl, pHRT 8,0 Elutionspuffer: 20 mM Tris/HCl, pHRT 8,0; 1 M NaCl Nach dem Hitzeschritt wurde der Zellextrakt zunächst in Auftragspuffer einfach verdünnt und dann mit Hilfe einer P1-Pumpe (GE Healthcare, Freiburg, D) mit einer Flussgeschwindigkeit von 5 ml min-1 auf eine mit Auftragspuffer äquilibrierte Fractogel EMI TMAE-650 Anionenaustauschersäule aufgetragen. Nach Waschen mit Auftragspuffer für 70 min wurde durch einen gleichmäßig ansteigenden Gradienten an Elutionspuffer mit der Elution begonnen, wobei das Eluat in 5 ml Fraktionen (Elutionsgeschwindigkeit: 5 ml min-1) gesammelt wurde. Das Vorhandensein von Protein in den einzelnen Fraktionen wurde detektiert durch die gleichzeitige Messung der Absorption bei 280 nm. Die Fraktionen, in denen das G1-Protein enthalten war, wurden vereinigt und mit Hilfe von Konzentratoren mit einem Ausschlussgewicht von fünf kDa (Amicon Ultra, Millipore) konzentriert. 2.9.1.3 Gelfiltrationschromatographie Gelfiltrationspuffer: 20 mM Tris/HCl, pHRT 8,0 Die auf ein Volumen von 5 ml konzentrierte Proteinlösung wurde auf eine in Gelfiltrationspuffer äquilibrierte Hiload-SuperdexTM 75 26/60 prep grade-Gelfiltrationssäule (GE Healthcare, Freiburg, D) aufgespritzt und aufgetrennt. Dazu wurde die beladene Säule zunächst 70 min lang mit Gelfiltrationspuffer gewaschen (Flussrate 2,5 ml min-1) und danach mit der Sammlung von 80 2,5 ml Fraktionen begonnen. Die Detektion des Proteins erfolgte wiederum durch Messung der Absorption bei 280 nm. Für die anschließenden Messungen wurden die Fraktionen, in denen das G1-Protein enthalten war, vereinigt, auf ein Volumen von 2 ml konzentriert und bei -20 °C gelagert. 2.9.2 Isolierung der G3P*-Varianten und der isolierten N1-Domäne aus inclusion bodies 2.9.2.1 Reinigung der inclusion bodies Waschpuffer 1: 1 mM EDTA; 1 mg ml-1 Desoxycholat; 20 mM DTT; pHRT 8,0 Lyse-Puffer: 50 mM Tris/HCl pHRT 8,0; 50 mM NaCl; 10 mM EDTA; 20 mM DTT Waschpuffer 2: 0,1 M Tris/HCl, pHRT 8,5; 1 mM EDTA; 50 mM GSH Die G3P*-Varianten und die isolierte N1-Domäne des fd Phagen wurden nach dem Zellaufschluss und der anschließenden Zentrifugation (2.8.2) aus dem resultierenden Pellet gereinigt. Dazu wurde dieses in 15 ml Waschpuffer mit zusätzlich 0,2 mg ml-1 Lysozym gründlich resuspendiert und erneut zentrifugiert (20 min, 12000 rpm, 4 °C, SS-34-Rotor). Um die Zelltrümmer vollständig zu entfernen, wurden dieser Waschschritt noch dreimal mit je 10 ml Waschpuffer ohne Lysozym und dreimal mit je 10 ml Lysepuffer wiederholt. Abschließend wurden die inclusion bodies mit Waschpuffer 2 gewaschen, um das DTT zu entfernen. Materialien und Methoden 27 2.9.2.2 Reduktive Entfaltung und oxidative Rückfaltung Entfaltungspuffer: 0,1 M Tris/HCl, pHRT 8,0; 1 mM EDTA; 6 M GdmCl; 50 mM GSH Rückfaltungspuffer: 0,1 M Tris/HCl, pHRT 8,5; 1 mM EDTA; 0,5 mM GSSG Die in 2.9.2.1 gereinigten inclusion bodies wurden in 15 ml Entfaltungspuffer resuspendiert und unter ständigem Rühren 2 h lang bei RT inkubiert, um sie unter reduktiven Bedingungen zu entfalten. Die oxidative Rückfaltung der Proteine wurde durch schrittweise Überführung des Entfaltungsansatzes in Rückfaltungspuffer initiiert, wodurch die Proteinlösung zehnfach verdünnt wurde. Im Fall der G3P*- Varianten wurde der Ansatz mindestens 6 h lang bei RT inkubiert, um die Einnahme des nativen Zustandes zu ermöglichen. Die bei der Rückfaltung auftretenden Aggregate wurden durch Zentrifugation entfernt (SS34-Rotor, 15000 rpm, 20 min, 4 °C). 2.9.2.3 Affinitätschromatographie und Gelfiltration Puffer A: 50 mM Tris/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl, 10 mM Imidazol Puffer B: 50 mM Tris/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl; 0,5 M Imidazol Gelfiltrationspuffer: 0,1 M Kaliumphosphat (KP), pH 7,0 Der nach der Zentrifugation in 2.9.2.2 erhaltene Überstand wurde zur Komplexierung des EDTA mit 50 mM MgCl2 versetzt und mit Hilfe eines Membranfilters (Porengröße 0,45 µm) filtriert. Der Ansatz wurde anschließend in 10 mM Imidazol mit einer Flussrate von 4 ml min-1 auf eine mit Puffer A äquilibrierte Ni-NTA-Säule aufgetragen. Schwach bindende Proteine wurden durch Waschen mit Puffer A bei einer Flussrate von 4 ml min-1 entfernt. Die Elution des Proteins erfolgte durch die Erhöhung der Imidazolkonzentration auf 250 mM. Das Totvolumen der Säule (5 ml) wurde verworfen und anschließend 25 ml als Eluat gesammelt. Zur Reinigung der Säule wurde diese mit 30 ml Puffer B und abschließend mit ddH2O gewaschen. Das proteinhaltige Eluat wurde auf 5 ml konzentriert und auf eine mit Gelfiltrationspuffer äquilibrierte HiLoad Superdex 75 (16/60) prep grade-Säule aufgetragen und das gewünschte Protein mit einer Flussrate von 1,7 ml min-1 eluiert. Die vereinigten Fraktionen aus der Gelfiltration wurden auf ein Volumen von 1,5 ml konzentriert und bei -20 °C gelagert. 2.9.3 Reinigung der isolierten N1-Domäne des G3P des IF1 Phagen als SUMO-Fusion 2.9.3.1 Affinitätschromatographie zur Reinigung der SUMO-Fusionsproteine Entfaltungspuffer: 50 mM Tris/HCl, pHRT 8,0; 0,1 M KCl; 50 mM -Mercaptoethanol; 6 M GdmCl Waschpuffer: 50 mM Tris/HCl, pHRT 8,0; 0,1 M KCl; 6 M GdmCl Rückfaltungspuffer: 50 mM Tris/HCl, pHRT 8,0; 0,1 M KCl; 6 M GdmCl; 5 mM GSH; 1 mM GSSG Puffer A: 50 mM Tris/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl; 10 mM Imidazol Puffer B: 50 mM Tris/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl; 0,5 M Imidazol Materialien und Methoden 28 Die N1-Domäne des G3P des Phagen IF1 wurde als SUMO-Fusionsprotein isoliert. In diesem Konstrukt befindet sich der zur Reinigung verwendete (His)6-tag am N-terminalen Ende des SUMOProteins wodurch nach der Reinigung und Proteolyse tag-freie IF1-N1-Domäne erhalten wurde. Trotz des zusätzlichen SUMO-Proteins bildet auch die IF1-N1-Domäne bei Überexpression inclusion bodies. Diese wurden, wie unter 2.9.2.1 für das G3P beschrieben, gereinigt und in 50 ml Entfaltungspuffer gelöst. Nach 2 h wurden verbliebene Zellfragmente durch Zentrifugation entfernt (SS34-Rotor, 15000 rpm, 20 min, 4 °C) und der Überstand über einen Membranfilter (Porengröße 0,45 µm) filtriert. Der Ansatz wurde mit einer Flussrate von 4 ml min-1 auf eine in Entfaltungspuffer äquilibrierte Ni-NTA-Säule aufgetragen und mit 30 ml Waschpuffer gewaschen, um nichtbindende Proteine zu entfernen. Die Rückfaltung wurde induziert durch das Spülen der Säule mit 50 ml Rückfaltungspuffer (Flussrate: 2,5 ml min-1). Nach einem weiteren Waschschritt (30 ml Puffer A) wurde das Fusionsprotein in 250 mM Imidazol von der Säule eluiert. Die Konzentration des Proteins wurde über die Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt. 2.9.3.2 Abspaltung des SUMO-Proteins und weitere Reinigung der IF1-N1-Domäne Dialysepuffer: 50 mM Tris/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl Puffer A: 50 mM Tris/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl; 10 mM Imidazol Puffer B: 50 mM Tris/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl; 0,5 M Imidazol Gelfiltrationspuffer: 0,1 M Kaliumphosphat (KP), pH 7,0 Das in 2.9.3.1 eluierte Fusionsprotein wurde in einen Dialyseschlauch gegeben (Auschlussgröße 3,5 kDa) und über Nacht bei 4 °C in Gegenwart einer ausreichenden Menge der SUMO-Protease SenP2 (1 g Protease spaltet 150 g Fusionsprotein) gegen 1,5 l Dialysepuffer dialysiert. Dadurch wurde zum einen die IF1-N1-Domäne hydrolytisch vom SUMO-Protein abgespalten und gleichzeitig die Imidazolkonzentration verringert. Während der anschließenden Affinitätschromatographie der dialysierten Lösung blieben sowohl das SUMO-Protein als auch die mit einem (His)6-tag versehene SUMO-Protease an der Säule gebunden, das gewünschte Protein befand sich dagegen im Durchbruch. Dieser wurde auf ein Volumen von 5 ml konzentriert und, wie unter 2.9.2.3 beschrieben, einer Gelpermeationschromatographie unterzogen. Die vereinigten Fraktionen aus der Gelfiltration wurden wiederum auf ein Volumen von 1,5 ml konzentriert und bei -20 °C gelagert. 2.9.4 Reinigung der C-terminalen Domäne des TolA-Proteins 2.9.4.1 Affinitätschromatographie Puffer A: 50 mM Tris/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl; 10 mM Imidazol Puffer B: 50 mM Tris/HCl, pHRT 7,8; 0,1 M KCl; 0,5 M Imidazol Das TolAC-Protein (TolA AS 295-421+Cys-(Ala)3-(His)6) besitzt neben dem für die Markierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff IAEDANS zusätzlich eingefügten Cysteinrest am C-Terminus einen (His)6tag, der verwendet wurde, um das Protein aus der nach 2.8.2 erhaltenen, cytosolischen Fraktion zu isolieren. Dazu wurde diese mit 50 mM MgCl2 versetzt und anschließend mit Hilfe eines Membranfilters (Porengröße 0,45 µm) filtriert. Nach dem Auftrag des Ansatzes auf eine mit Puffer A Materialien und Methoden 29 äquilibrierte Ni-NTA-Säule (Flussrate 4 ml min-1) wurde diese zunächst mit 40 ml Puffer A gewaschen. Die Elution erfolgt analog zu 2.9.2.3 durch Erhöhung der Imidazolkonzentration auf 250 mM in einem Volumen von 25 ml, das durch Konzentration auf 1 ml verringert wurde. 2.9.4.2 Reduktive Entfaltung und oxidative Rückfaltung des TolAC-Proteins Entfaltungspuffer: 0,1 M Tris/HCl, pHRT 8,0; 1 mM EDTA; 6 M GdmCl; 50 mM GSH Rückfaltungspuffer: 0,1 M Tris/HCl, pHRT 8,5; 1 mM EDTA; 0,5 mM GSSG Gelfiltrationspuffer: 0,1 M Kaliumphosphat (KP), pH 7,0 Neben dem zusätzlichen C-terminalen Cystein enthält TolAC zwei weitere Cysteinreste. Um eventuell während der Herstellung ausgebildete Fehlverbrückungen in den TolAC-Molekülen zu beheben, wurde das Protein zunächst unter reduktiven Bedingungen in 15 ml Entfaltungspuffer für 2 h entfaltet. Die Rückfaltung wurde analog zum G3P* (2.9.2.2) durch zehnfache Verdünnung in Rückfaltungspuffer initiiert. Nach einstündiger Inkubation und anschließender Zugabe von 50 mM MgCl2 wurde der Ansatz zentrifugiert, um eventuell entstandene Aggregate zu entfernen. Die weitere Reinigung des TolAC-Proteins erfolgte, wie unter 2.9.2.3 für das G3P* beschrieben, mittels Affinitätsund Gelfiltrationschromatographie. Die Proteinfraktionen der Gelfiltration wurden vereinigt und bis auf ein Volumen von 1,5 ml konzentriert. Das gereinigte TolAC-Protein wurde bei -20 °C gelagert. 2.9.5 Markierung des Rezeptorproteins TolAC mit IAEDANS Markierungspuffer: 0,1 M Tris/HCl, pH15 °C 8,0; 10 mM EDTA TolAC-Stammlösung: 500 µM TolAC in 0,1 M Kaliumphosphat (KP), pH 7,0 Gelfiltrationspuffer: 0,1 M Kaliumphosphat (KP), pH 7,0 Im Gegensatz zur fd-N1bzw. IF1-N1-Domäne enthält der Bindungspartner TolAC keine Tryptophanreste, weshalb die Wechselwirkung der Proteine anhand von Förster-Resonanz-EnergieTransfer-(FRET)-Experimenten analysiert werden konnte. Dazu wurde das gereinigte TolAC mit dem Fluoreszenzfarbstoff IAEDANS (5-(((2-Iodacetyl)amino)ethyl)amino)-naphthalin-1-sulfonsäure) markiert, der kovalent mit dem am C-Terminus befindlichen, zusätzlichen Cysteinrest verknüpft wurde. Während der nukleophilen Substitutionsreaktion ersetzt dabei das Thiolatanion des Cysteins das Iodatom, wodurch ein stabiler Thioether entsteht. Zur Modifikation wurde die TolAC-Stammlösung mit 450 µl Markierungspuffer verdünnt und zunächst zur Reduktion des eventuell oxidierten Cysteins am C-Terminus 0,2 M TCEP zugegeben. Nach 20 min wurden 50 µl IADEDANS-Lösung (2 mg gelöst in 50 μl N,N-Dimethylformamid) zugegeben und in einem abgedunkelten Reaktionsgefäß 3 h lang bei 15 °C inkubiert. Um die Reaktion zu stoppen und überschüssiges IAEDANS bzw. niedermolekulare Substanzen zu entfernen, wurden hintereinander zwei Gelfiltrationsschritte an einer mit Gelfiltrationspuffer äquilibrierten NAPTM-10Säule durchgeführt. Die Konzentration an TolAC-AEDANS sowie die Markierungseffizienz wurden über die Messung der Absorption des Proteins bei 280 und 336 nm bestimmt. Materialien und Methoden 30 2.10 Probenvorbereitung und Konzentrationsbestimmung Zur Vorbereitung der Proteine für die spektroskopischen Untersuchungen wurden diese, falls nötig, zunächst mittels Gelfiltrationschromatographie an einer im entsprechenden Messpuffer äquilibrierten NAPTM-10bzw. NAPTM-5-Säule in die gewünschten Pufferbedingungen überführt. Um eventuell vorhandene Aggregate abzutrennen wurden alle Proteinproben 30 min lang bei 4 °C zentrifugiert (13000 rpm). Zur Bestimmung der Konzentration wurde von einer geeigneten Verdünnung der Proteinlösungen mit einem Cary 100 Bio UV-VIS-Spektrophotometer ein UV-Absorptionsspektrum im Bereich von 240 bis 350 nm (TolAC-AEDANS: 240 - 450 nm) aufgenommen. Als Referenz diente der entsprechende Messpuffer. Für die Messungen wurden Quarzküvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm verwendet. Die Aufnahmegeschwindigkeit der Absorptionsspektren betrug 100 nm min-1 bei einer Bandbreite von 2 nm und einer Auflösung von 0,5 nm. Anhand der Absorption bei 280 nm konnte mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes die Proteinkonzentration berechnet werden. Die dafür notwendigen Extinktionskoeffizienten wurden nach der Methode von Gill & v. Hippel133 bestimmt bzw. mittels des Programms ProtParam134 berechnet: fd G3P* 280 = 41900 M-1 cm-1 G3P*-Varianten mit der Substitution D209Y 280 = 43400 M-1 cm-1 isolierte N1-Domäne des fd G3P 280 = 21000 M-1 cm-1 isolierte N2-Domäne des fd G3P 280 = 19700 M-1 cm-1 AEDANS 336 = 5700 M-1 cm-1 AEDANS 280 = 880 M-1 cm-1 TolAC 280 = 5480 M-1 cm-1 Chimäre fd G3P* IF1-N1DDKTLD IHY 280 = 43400 M-1 cm-1 isolierte N1-Domäne des IF1 G3P 280 = 21095 M-1 cm-1 G1-Varianten 280 = 9970 M-1 cm-1 G1-Varianten mit Y33X Substitution 280 = 8480 M-1 cm-1 2.11 Untersuchung der konformationellen Stabilität der Proteine 2.11.1 Thermisch-induzierte Denaturierung 2.11.1.1 Messung thermisch-induzierter Entfaltungsübergänge Die thermisch-induzierte Entfaltung der G3P*-Varianten, ihrer isolierten Domänen, von TolAC sowie der verschiedenen G1-Varianten wurde mittels Circulardichroismus an einem Jasco J-600 Spektropolarimeter mit PTC-348 WI Peltier-Element untersucht. Als Signal diente jeweils die Änderung der Elliptizität bei einer definierten Wellenlänge. Die Entfaltungsübergänge wurden bei einer Bandbreite von 1 nm in Quarzküvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm gemessen. Der Übergang der isolierten N2-Domäne bzw. N2 in den G3P*-Varianten konnte selektiv anhand der Abnahme des CD-Signals von 1 µM Protein bei 210 nm gemessen werden. Die Entfaltung der isolierten N1-Domäne und N1 in den G3P*-Varianten wurde über die Änderung der Elliptizität von 4 µM Protein bei 230 nm verfolgt. Im zweiten Fall ergaben sich bis auf den Übergang der Chimäre fd G3P* IF1-N1DDKTLD IHY biphasische Verläufe, die die Denaturierung beider Domänen widerspiegeln. Die Messungen erfolgten jeweils in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit einer Heizrate von Materialien und Methoden 31 60 °C h-1 und einer Dämpfung von 8 s. Die thermischen Übergänge der isolierten N1-Domänen des G3P des IF1-Phagen sowie TolAC wurden unter den gleichen Bedingungen, jedoch bei einer Wellenlänge von 222 nm und mit einer Dämpfung von 1 s detektiert. Um die Abhängigkeit der Stabilität verschiedener G1-Varianten von der Proteinkonzentration zu bestimmen, wurden deren thermische Übergänge mit 1, 4 bzw. 10 µM Proteinlösungen anhand der Zunahme des CD-Signals bei 222,6 nm gemessen. Die Heizrate während der Messungen in 0,1 M NaCacodylatpuffer, pH 7,0 und zusätzlich 1,5 M GdmCl betrug 90 °C h-1. 2.11.1.2 Auswertung der Entfaltungsübergänge nach einem Zweizustandsmodell Die thermischen Übergänge der isolierten Domänen N1 und N2, TolAC sowie die selektiv bei 210 nm gemessene Entfaltung der N2-Domäne im G3P* des fd Phagen zeigen einen einphasigen Verlauf. Unter der Annahme des Zweizustandsmodells in Gleichung 1 steht dabei der native Zustand der Proteine im Gleichgewicht mit dem denaturierten Zustand. Der Quotient aus der Konzentration des entfalteten bzw. nativen Proteins ergibt dabei die Gleichgewichtskonstante KU der Entfaltung (Gleichung 2), aus der sich die freie Enthalpie der Entfaltung G berechnen lässt (Gleichung 3). KU selbst kann aus einer physikalischen Eigenschaft yobs, wie z.B. der temperaturabhängigen Elliptizität eines Proteins bei einer definierten Wellenlänge, bestimmt werden (Gleichung 2). NU Gl. 1 KU =     Uobs obsN )( N U yy yy    Gl. 2 G = -RT lnKU Gl. 3 KU: Gleichgewichtskonstante der Entfaltung; yN, yU: physikalische Eigenschaft des nativen bzw. denaturierten Proteins; yobs: Messgröße bei Vorliegen einer Mischung von N und U; G: freie Enthalpie der Entfaltung (in J mol-1); R: allgemeine Gaskonstante (in J mol-1 K-1); T: Temperatur (in K) Unter den zwei Annahmen, dass die Änderung der molaren Wärmekapazität Cp konstant und die Grundlinien für natives und denaturiertes Protein linear verlaufen, lässt sich aus der Kombination von Gleichung 3 mit der Gibbs-Helmholtz-Gleichung durch Integration des Enthalpieund des Entropieterms zwischen TM und T die freie Enthalpie der Enthalpie berechnen (Gleichung 4).135; 136 Gleichungen 5a und 5b geben dabei die lineare Änderung der Messgröße des nativen bzw. des entfalteten Proteins in Abhängigkeit der Temperatur wieder. G (T) = H (TM)                    M Mp M Mln T T TTTC T TT Gl. 4 yN = 0 N y + mN  T Gl. 5a yU = 0 U y + mU  T Gl. 5b G(T): freie Enthalpie des thermischen Übergangs (in J mol-1); T: Temperatur (in K); TM: Temperatur am Mittelpunkt des Übergangs (in K); H: van’t Hoff Enthalpie der Entfaltung bei TM (in J mol-1); Cp: Änderung der molaren Wärmekapazität bei Entfaltung des Proteins bei konstantem Druck (in J mol-1 K-1); yN, yU: physikalische Eigenschaft des nativen (N) bzw. denaturierten (U) Proteins; mN, mU: Steigungen der Grundlinien des nativen und des denaturierten Proteins; 0 U 0 N,yy : auf T = 0 K extrapoliert Werte für yN und yU Materialien und Methoden 32 Die Kombination der Gleichungen 2-5 ergibt Gleichung 6, worüber durch nicht-lineare Regression mit dem Programm Grafit 3.0 bzw. Grafit 5.0 der Schmelzpunkt (TM) des thermischen Übergangs und die van’t Hoff-Enthalpie HD ermittelt wurden. y (T) =                                                                   T T T T R C TTR TH T T T T R C TTR TH TmyTmy MM p M M MM p M M U 0 UN 0 N ln1 11 )( exp1 ln1 11 )( exp)( Gl. 6 y(T): Messgröße, hier gemessene Elliptizität (in Grad); yN, yU: physikalische Eigenschaft des nativen (N) bzw. denaturierten (U) Proteins, wobei y0 jeweils die auf T = 0 K extrapolierten Werte angibt; mN, mU: Steigungen der Grundlinien des nativen und des denaturierten Proteins; TM: Temperatur am Mittelpunkt des Übergangs (in K);  H: van’t Hoff-Enthalpie der Entfaltung bei TM (in J mol-1);  Cp: Änderung der molaren Wärmekapazität bei Entfaltung des Proteins bei konstantem Druck (in J mol-1 K-1); T: Temperatur (in K); R: allgemeine Gaskonstante (in J mol-1 K-1) Zur Auswertung der Entfaltungsübergänge wurde für die G3P*-Varianten eine konstante Änderung der Wärmekapazität Cp von 10000 J mol-1 K-1 für N2 und 1000 J mol-1 K-1 für N1 angenommen.121 Für die isolierten N2-Domänen wurden Cp-Werte von 8000 J mol-1 K-1 und für TolAC ein Wert von 6000 J mol-1 K-1 verwendet.79; 121 Über die aus der Auswertung erhaltenen Werte für den Übergangsmittelpunkt TM und die van’t Hoff-Enthalpie HD kann die konformationelle Stabilität des Proteins in Abhängigkeit der Temperatur berechnet werden (Gleichung 4). 2.11.1.3 Auswertung der Entfaltungsübergänge nach einem Dreizustandsmodell Für die thermische Entfaltung des G3P* bei 230 nm ergaben sich biphasische Übergänge. Während der Denaturierung wird demnach ein Intermediat gebildet (Gleichung 7). Die Auswertung dieser thermischen Übergänge erfolgte daher gemäß dem Dreizustandsmodell137, wobei die beiden Gleichgewichtskonstanten der Entfaltung K1 und K2 berücksichtigt werden mussten (Gleichung 8). NIU Gl. 7 K1 =   N I ; K2 =    I U Gl. 8 K1: Gleichgewichtskonstante des Übergangs von N nach I; K2: Gleichgewichtskonstante des Übergangs von I nach U; N: natives Protein; I: Intermediat; U: entfaltetes Protein Die Gesamtproteinmenge (P) berechnet sich aus der Summe der Konzentrationen an nativem Protein [N], Intermediat [I] und denaturiertem Protein [U] (Gleichung 9). Durch Kombination der Gleichungen 8 und 9 ergibt sich nach Umformung Gleichung 10, über die die Konzentration an denaturiertem Protein in Abhängigkeit der Gesamtkonzentration berechnet werden kann. [P] = [N] + [I] + [U] Gl. 9 [U] =   1 P 121 21   KKK KK Gl. 10 Materialien und Methoden 33 Aus der Summe der Anteile des denaturierten Proteins (XU) und des Intermediats (XI) ergibt sich der apparente Anteil des denaturierten Proteins yapp (Gleichung 11). Der Parameter z entspricht dabei der optischen Ähnlichkeit des Intermediats mit dem entfalteten Zustand. yapp = [XU] + z  [XI]; [XU] =    P U; [XI] =    P U 2K Gl. 11 Die Kombination der Gleichungen 8-11 ergibt Gleichung 12, welche die über die Messgröße y(T) beobachtete Entfaltung in Abhängigkeit von der Temperatur beschreibt. Die Berechnung der Schmelztemperaturen für die beiden Domänen N1 und N2, sowie deren van`t Hoff Enthalpien aus den thermischen Übergängen des G3P* bei 230 nm, erfolgte anhand von Gleichung 12 wiederum durch nicht-lineare Regression unter Verwendung der Programme Grafit 3.0 und Grafit 5.0. y(T) =     TmyTmyK K K Tmy N 0 NU 0 N2 1 2 N 0 N)z( 1 1 1   Gl. 12 K1 =                              T T T T R C T T TR H1,M1,M 1,p 1,M 1ln1 1 exp K2 =                              T T T T R C T T TR H2,M2,M 2,p 2,M 2ln1 1 exp y(T): Messgröße, gemessene Elliptizität (in Grad); yN, yU: Signal des gefalteten (N) und entfalteten (U) Proteins; 0 U 0 N,yy : Werte für yN und yU auf T = 0 K extrapoliert; mN, mU: Steigungen der Grundlinien des nativen und des denaturierten Proteins; TM,1,TM,2: Temperatur am Mittelpunkt des Übergangs der 1. Domäne (TM,1) bzw. des Übergangs der 2. Domäne (TM,2) (in K); ∆H1, ∆H2: van´t Hoff Enthalpie der Entfaltung bei TM,1 bzw. TM,2 (in J mol-1); ∆Cp,1, ∆Cp,2: Differenz der molaren Wärmekapazitäten des denaturierten und nativen Proteins der bei TM,1 bzw. TM,2 entfaltenden Domäne (in J mol-1 K-1); z: optische Ähnlichkeit des Intermediats mit dem entfalteten Zustand; T: Temperatur (in K); R: allgemeine Gaskonstante (in J mol-1 K-1) Zur Auswertung der Entfaltungsübergänge wurde für die G3P*-Varianten eine konstante Änderung der Wärmekapazität Cp von 10000 J mol-1 K-1 für N2 und 1000 J mol-1 K-1 für N1 angenommen. Die optische Ähnlichkeit wurde auf 0,2 festgelegt.79; 121 Über die aus dem Angleich ermittelten Werte für HD und die Schmelzpunkte konnte für jede der Domänen des G3P* nach Gleichung 4 die freie Enthalpie berechnet werden. 2.11.1.4 Auswertung der thermisch-induzierten Entfaltungsübergänge der G1-Proteine Da die G1-Proteine in einem einphasigen Übergang entfalten, wurden der Verlauf ihrer thermischen Entfaltung ebenfalls nach dem einfachen Zweizustandsmodell NU aus 2.11.1.2 ausgewertet. Bei weiteren Untersuchungen stellte sich jedoch heraus, dass einige der Varianten eine deutlich erhöhte Tendenz zur Dimerisierung haben. Die Dissoziationskonstante der hyperstabilen Variante G1-M2 befindet sich im Bereich von 30 nM, weshalb der Großteil der Moleküle bereits bei einer Proteinkonzentration von 1 µM als Dimer vorliegt. Die Entfaltung des Proteins ist folglich an die Dissoziation des Dimers gekoppelt. Im einfachen Fall entfaltet das Dimer direkt in den denaturierten, Materialien und Methoden 34 jedoch monomeren Zustand (Gleichung 13). Die Gleichgewichtskonstante KU dieser Entfaltungsreaktion ergibt sich nach dem Massenwirkungsgesetz aus dem Quotienten des Quadrates der Konzentration an denaturiertem Protein und der Konzentration des Dimers (Gleichung 14). N2U Gl. 13 KU =    U 2 2 2 1 2 N U f fC Ut   Gl. 14 KU: Gleichgewichtskonstante der Entfaltung (in µM); [N2]: Konzentration an nativem Dimer (in µM); [U]: Konzentration an entfaltetem Protein (in µM); Ct: Gesamtkonzentration an monomerem Protein (in µM); : Anteil des entfalteten Proteins Unter der Annahme von Gleichung 13 ist KU direkt proportional zur Gesamtkonzentration an monomerem Protein und lässt sich aus dem Anteil an entfaltetem Protein  ermitteln (Gleichung 14).138 Dieser wiederum ergibt sich in Abhängigkeit der Temperatur aus der Messgröße des thermischen Übergangs (yobs) und den entsprechenden Signalen des gefalteten (N) und entfalteten (U) Proteins (Gleichung 15). )()( )()( )( TyTy TyTy Tf UN obsN U   Gl. 15 : Anteil des entfalteten Proteins; yobs: Messgröße bei Vorliegen einer Mischung von N2 und U; yN, yU: Signal des gefalteten (N) und entfalteten (U) Proteins, T: Temperatur (in K) Durch erneute Analyse der thermischen Übergänge von 1, 4 bzw. 10 µM G1-M2 wurde der Anteil an entfaltetem Protein und damit anhand von Gleichung 14 die jeweilige Gleichgewichtskonstante in Abhängigkeit von der Temperatur berechnet. Durch die Auftragung des natürlichen Logarithmus von KU gegen das Inverse der Temperatur (van`t Hoff-Auftragung) konnte nach Gleichung 16 durch lineare Regression der Werte im Übergangsbereich die apparente Enthalpie der Entfaltung des Dimers HvH(app) für die verschiedenen Konzentrationen an G1-M2 berechnet werden. R H T KvHU )app( ) 1 ( ln     Gl. 16 KU: Gleichgewichtskonstante der Entfaltung (µM); HvH(app): apparente Enthalpie der Entfaltung des Dimers (in J mol-1); T: Temperatur (in K); R: allgemeine Gaskonstante (in J mol-1 K-1) Die Abhängigkeit der Schmelztemperatur von der Konzentration des G1-M2 ist zwar vorhanden, jedoch verhältnismäßig gering. In erster Näherung sind damit sowohl die Enthalpie der Entfaltung des Dimers, HvH(Dimer), als auch die Entropie SvH(Dimer) unabhängig von der Temperatur. Unter dieser Voraussetzung ergibt sich nach Gleichung 17 die an die Dissoziation des Dimers gekoppelte Enthalpie der Entfaltung außerdem aus der Steigung der Auftragung von 1/TM gegen den natürlichen Logarithmus der Konzentration an Monomeren (Ct).138 )Dimer( )Dimer( ln )Dimer( 1 vH vH t vHM H S C H R T     Gl. 17 Materialien und Methoden 35 2.11.1.5 Kalorimetrische Messungen (DSC) Zur Bestimmung der thermischen Stabilität und des Oligomerisierungsgrades von WT-G1 und der hyperstabilen Variante G1-M2 bei höheren Konzentrationen wurden die Proteine zunächst in 0,1 M Na-Cacodylatpuffer, pH 7,0, 1,5 M GdmCl über Nacht dialysiert. Nach der Kalibrierung des VP-DSC Mikrokalorimeters (Zellvolumen 0,532 ml) mit dem jeweiligen Dialysepuffer wurden die zuvor entgasten Proteinproben mit Konzentrationen zwischen 62 und 140 µM gemessen. Die Heizrate während der Temperaturläufe betrug 90 °C h-1. Nach Korrektur der Daten um den Pufferwert, Umrechnung in die molare Wärmekapazität und Korrektur der Basislinien wurden die molaren Wärmekapazitäten der Varianten mit den Gleichungen 18 und 19 unter der Annahme eines NichtZweizustandsmodells ausgewertet. Der Wert für Cp wurde dabei auf null festgesetzt. Die Analyse wurde mit dem Programm Origin 5.0 durchgeführt. ... ))(1( )( )( 22 ,,        RTTK HHTK TC A vHAcalAA p Gl. 18        )1(exp)( , M vHA AT T RT H TK Gl. 19 Cp(T): molare Wärmekapazität (kJ mol-1 K-1); T: Temperatur (in K); TM: Temperatur am Übergangsmittelpunkt von Domäne A (in K); HA,vH: van’t Hoff Enthalpie der Entfaltung von Domäne A; HA,cal: kalorimetrische Enthalpie der Entfaltung von Domäne A; R: allgemeine Gaskonstante (in J mol-1 K-1) 2.11.2 Denaturierungsmittel-induzierte Entfaltungsübergänge 2.11.2.1 Messung Denaturierungsmittel-induzierter Entfaltungsübergänge Die Stabilität der Proteine gegenüber GdmCl bzw. Harnstoff wurde anhand der Änderung des Fluoreszenzsignals der Proteinlösung bei einer definierten Wellenlänge nach Anregung bei 280 oder 295 nm an einem Jasco-Fluoreszenzspektrophotometer FP-6500 untersucht. Die genaue Denaturierungsmittelkonzentration wurde nach refraktometrischer Bestimmung der Brechungsindices der einzelnen Proben ermittelt. Die jeweilige Konzentration ergibt sich dabei aus der Differenz der Brechungsindices des Puffers in Gegenwart und Abwesenheit von GdmCl bzw. Harnstoff (Gleichungen 20 und 21).139 [GdmCl] = 57,147  ∆n + 38,68  (∆n)2 - 91,6  (∆n)3 Gl. 20 [Harnstoff] = 117,66  ∆n + 29,753  (∆n)2 + 185,56  (∆n)3 Gl. 21 [GdmCl]: GdmCl-Konzentration (in M); [Harnstoff]: Harnstoff-Konzentration (in M); ∆n: Differenz der Brechungsindices der Lösungen mit und ohne Denaturierungsmittel Die Entfaltung sowohl der Varianten der isolierten N1-Domäne, als auch von N1 im fd G3P* durch GdmCl bei 25 °C wurde anhand der Änderung der Trp-Fluoreszenz der Proteine bei 360 nm nach Anregung bei 295 nm verfolgt. Der Übergang der N2-Domäne wurde selektiv über die Änderung der Tyr-Fluoreszenz bei 310 nm (Anregung 280 nm) detektiert. Die Stabilität der isolierten IF1-N1Varianten gegenüber GdmCl wurde bei 325 nm (Anregung 280 nm) analysiert. Die Messungen mit 1 µM Protein erfolgten nach Inkubation der Proben für mindestens 1 h bei 25 °C. Für den GdmCl- Materialien und Methoden 42 2U 2N N2 k RF k EF k on k off 2.12.2.2 Doppelmischexperimente zur Analyse der Kinetik der Dimerisierung Die Assoziation der Monomere des G1-M2-Proteins findet nicht während der konformationellen Faltung der Monomere statt, sondern erfolgt in einer nachgelagerten Reaktion, die lediglich im Übergangsbereich von 4 bis 6 M GdmCl durch die daran gekoppelte Faltung der monomeren Spezies spektroskopisch sichtbar ist. Die Geschwindigkeit der Assoziationsreaktion unter nativen Bedingungen wurde analog zu Kapitel 2.12.1.4 über einen Zweischritt-Entfaltungstest ermittelt. Die entsprechenden Doppelmischexperimente in 0,1 M Na-Cacodylatpuffer, pH 7,0 bei 25 °C wurden wiederum an einem DX.17MV Sequential stopped-flow-Spektrofluorimeter (Applied Photophysics) durchgeführt. In 7,4 M GdmCl denaturiertes Protein (11 µM bzw. 66 µM) wurde durch elffache Verdünnung für variable Zeitspannen in 2, 3 bzw. 3,5 M GdmCl rückgefaltet. Durch weitere sechsfache Verdünnung in 7,0 M GdmCl konnte die schnelle Entfaltungsreaktion der monomeren Spezies des G1-M2 anhand der Fluoreszenzänderung oberhalb von 320 nm nach Anregung bei 280 nm detektiert werden. Die Kurvenverläufe wurden, wie unter 2.12.3 beschrieben, anhand des Angleiches exponentieller Funktionen ausgewertet und die erhaltenen Amplituden gegen die Rückfaltungsdauer aufgetragen. Der Angleich an die Daten erfolgte unter der Annahme, dass die Faltung des Monomers und die Einstellung des Monomer-Dimer-Gleichgewichtes sequenzielle Reaktionen sind (Gleichung 30): Gl. 30 N: gefaltetes Monomer; N2: dimere Spezies; U: entfaltetes Protein; kEF, kRF: Geschwindigkeitskonstanten der Entbzw. Rückfaltung (in s-1); kon, koff: mikroskopischen Raten der Assoziation und Dissoziation (in µM-1s-1 bzw. s-1) Auf Grundlage dieses Modells ergeben sich für die Änderung der Konzentrationen der drei Spezies U, N und N2 die folgenden Differenzialgleichungen (Gleichung 31-33). ]N[]U[ ]U[    EFRF kk t Gl. 31 ]N[2]N[2]N[]U[ ]N[ 2 2   offonEFRF kkkk t Gl. 32 ]N[]N[ ]N[ 2 2 2   offon kk t Gl. 33 [N]: Konzentration an gefaltetem Monomer (in µM); [N2]: Konzentration der dimeren Spezies (in µM); [U]: Konzentration an entfaltetem Protein (in µM); kEF, kRF: Geschwindigkeitskonstanten der Entbzw. Rückfaltung (in s-1); kon, koff: mikroskopischen Raten der Assoziation und Dissoziation (in µM-1s-1 bzw. s-1) Die Auswertung der Verläufe unter Verwendung der Gleichungen 31-33 und der Proteinkonzentrationen während der Rückfaltung (1 bzw. 6 µM) erfolgte durch nicht-linearen least squares Angleich des postulierten theoretischen Modells (Gleichung 30) mit dem Programm DynaFit. Zur Verringerung der Anzahl an Variablen wurden die Informationen über die Geschwindigkeitskonstanten kEF und kRF, die dem Verlauf des Rückfaltungsastes der monomeren Spezies entnommen worden waren, konstant gesetzt. Im betrachteten Denaturierungsmittelbereich von 2-3,5 M GdmCl geht monomeres G1-M2 zudem vollständig in den nativen Zustand über. Aus der Materialien und Methoden 43 Bestimmung der Dissoziationskonstanten des Dimers (KD) in Übergangsbereich (2.12.2.3) ging hervor, dass bei 1 µM der hyperstabilen Variante das Gleichgewicht deutlich auf der Seite des Dimers liegt. Aus diesem Grund wurde die Dissoziationskonstante koff bei den Angleichen an die Amplitudenverläufe bei 2, 3 bzw. 3,5 M GdmCl vernachlässigt. Bei der erneuten Analyse der Rückfaltungskinetiken im Übergangsbereich (2.12.2.3) zur Bestimmung des KD-Wertes wurde koff jedoch als freier Parameter in die Analyse einbezogen. 2.12.2.3 Bestimmung der Dissoziationskonstante des G1-M2-Dimers Die Analyse der Faltungskinetiken hat gezeigt, dass die langsamere der beiden Rückfaltungsphasen im Übergangsbereich zwischen 4 und 6 M GdmCl die durch die Assoziation der Moleküle limitierte Faltung der Monomere widerspiegelt. Die entsprechenden Kurvenverläufe von 1 µM G1-M2 wurden daher unter der Annahme des sequenziellen Modells in Gleichung 30 noch einmal neu ausgewertet (2.12.2.2), um die mikroskopischen Raten der Assoziation und Dissoziation, kon und koff, bei der entsprechenden GdmCl-Konzentration zu ermitteln. Aus dem Quotient von koff und kon lässt sich die Dissoziationskonstante KD des Dimers berechnen (Gleichung 34). on off Dk k K Gl. 34 KD: Dissoziationskonstante (in µM); kon, koff: mikroskopische Raten der Assoziation und Dissoziation (in µM-1s-1 bzw. s-1) Neben der Auswertung der Kinetiken wurde die Dissoziationskonstante zu Vergleichszwecken zusätzlich über die Analyse der Gleichgewichtsübergänge von G1-M2 bei verschiedenen Proteinkonzentrationen ermittelt. Da sich die monomere Spezies und das Dimer in ihren Fluoreszenzeigenschaften nicht unterscheiden, zeigen die Gleichgewichtsübergänge mit 0,25, 1 bzw. 10 µM Protein einen einphasigen Verlauf. Die Gleichgewichtsentfaltung kann folglich nach dem Modell in Gleichung 30 über die apparente Gesamtgleichgewichtskonstante Kapp beschrieben werden (Gleichung 35). ]N[2]N[ ]U[ 2   app K Gl. 35 Kapp: apparente Gesamtgleichgewichtskonstante; [N]: Konzentration an gefaltetem Monomer (in µM); [N2]: Konzentration der dimeren Spezies (in µM); [U]: Konzentration an entfaltetem Protein (in µM) Die Konzentration an denaturiertem Protein [U] ist proportional zur Gleichgewichtskonstante KU der Entfaltung und ergibt sich daher durch Umstellung der Gleichung 36a. Die Konzentration des Dimers [N2] lässt sich über die Dissoziationskonstante ermitteln (Gleichung 36b). ]N[ ]U[  U K Gl. 36a D K 2 2 ]N[ ][N  Gl. 36b Materialien und Methoden 44 Die Kombination der Gleichungen 35, 36a und 36b resultiert in Gleichung 37, die die drei Gleichgewichtskonstanten in Bezug zur Konzentration des gefalteten Monomers setzt. Im Folgenden wird dieser Ausdruck durch die Variable a substituiert. a K K Kapp U D          1 2 1]N[ Gl. 37 Die Konzentrationen an nativem Protein [N] ergibt sich aus Gleichung 38 über die Gesamtproteinkonzentration [N0] und der Konzentration des Dimers [N2] bzw. des denaturierten Proteins [U] (Gleichung 38). ]N[2]U[]N[]N[ 20  Gl. 38 Aus den Gleichungen 36-38 resultiert Gleichung 39, über welche die Dissoziationskonstante des Dimers in Abhängigkeit von der apparenten Gesamtgleichgewichtskonstante und der Gleichgewichtskonstante der Entfaltung des Monomers berechnet werden kann. 2 0 2)1( ][N aKa K U D  Gl. 39 Die Kapp-Werte wurden als Funktion der GdmCl-Konzentration aus der Zweizustandsanalyse (Vgl. Gleichung 6) der Gleichgewichtsübergänge von 0,25, 1 bzw. 10 µM G1-M2 ermittelt. Die Gleichgewichtskonstante der Entfaltung (KU) bei verschiedenen GdmCl-Konzentrationen wurde aus dem Quotienten der entsprechenden Geschwindigkeitskonstanten der Entbzw. Rückfaltung der monomeren Spezies, kEF und kRF, erhalten (Gleichung 28). 2.13 Charakterisierung der Interaktion der N1-Domäne des G3P* mit TolAC-AEDANS 2.13.1 Messung von Fluoreszenzspektren Die Fluoreszenzemissionsspektren von je 1 µM der Bindungspartner TolAC-AEDANS und isolierter N1-Domäne bzw. WT fd G3P* sowie der entsprechenden Mischungen wurden in temperierbaren Quarzküvetten (Schichtdicke 1 cm) an einem Jasco FP-6500 Spektrofluorimeter bei 25 °C in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 gemessen. Die Aufnahme der Emissionsspektren im Bereich von 300 bis 550 nm nach Anregung bei 280 nm erfolgte mit einer Geschwindigkeit von 120 nm min-1 und einer Dämpfung von 0,5 s. Die Bandbreite der Anregungswellenlänge betrug 3 nm, die der Emissionswellenlänge 5 nm. Die Spektren wurden jeweils um die Fluoreszenz des Puffers korrigiert. 2.13.2 Kinetik der Bindung der N1-Domäne des G3P* an TolAC-AEDANS Die Bindung des Akzeptors TolAC-AEDANS an die isolierte N1-Domäne bzw. an N1 in den verschiedenen G3P*-Varianten wurde nach schneller Mischung an einem DX.17MV Sequential stopped-flow-Spektrofluorimeter (Applied Photophysics) verfolgt. Die Assoziationsreaktion des jeweiligen Bindungspartners (Konzentrationsbereich: 0 - 16 µM) mit 0,2 µM TolAC-AEDANS wurde durch 1:1 Mischung in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 und gegebenenfalls 0,1 M GdmCl bei 25 °C initiiert. Als Messsignal der Assoziation der Proteine diente die Änderung der integralen Fluoreszenz oberhalb Materialien und Methoden 45 von 460 nm, wobei Streuund Fluoreszenzlicht durch eine mit p-Nitroanilin-Lösung (2 mg ml-1 in Ethanol) gefüllte Küvette (Schichtdicke 5 mm) vor dem Photomultiplier absorbiert wurde. Die Anregung erfolgte bei 280 nm mit einer Bandbreite von 10 nm. Es wurden jeweils mindestens sechs Einzelmessungen durchgeführt, gemittelt und der resultierende Verlauf nach Kapitel 2.12.3 durch Angleich einer monoexponentiellen Funktion ausgewertet. Die darüber erhaltenen apparenten Raten und Amplituden wurden gegen die Donorkonzentration aufgetragen. Durch lineare Regression des Verlaufes der Raten ergibt sich aus dem Ordinatenabschnitt die mikroskopische Rate der Dissoziation (koff) und aus der Steigung der Gerade die mikroskopische Rate der Assoziation (kon). Nach Gleichung 34 wurde die Dissoziationskonstante KD aus dem Quotienten von koff und kon berechnet. Um den KD-Wert aus dem Verlauf der Amplituden zu ermitteln, wurde dieser analog zu einer Gleichgewichtstitration analysiert (Gleichung 43). Der Interaktion von N1 mit TolAC-AEDANS erfolgt nach dem nachstehenden Reaktionsschema: N1 + TolAC*N1·TolAC* Die Dissoziationskonstante KD berechnet sich nach Gleichung 40 zu: KD =      *TolACN1 *TolACN1   = on off k k Gl.40 KD: Dissoziationskonstante (in µM); [N1]: Konzentration an freiem N1 (in µM), [TolAC*]: Konzentration an freiem TolAC-AEDANS (in µM); [N1TolAC*]: Konzentration des N1-TolAC-AEDANS-Komplexes (in µM); kon: Geschwindigkeitskonstante der Assoziation (in µM-1 s-1); koff: Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation (in s-1) Die Konzentrationen an ungebundener N1-Domäne [N1] bzw. freiem TolAC-AEDANS [TolAC*] ergeben sich unter Berücksichtigung der Massenerhaltung zu [N1] = [N1]0 - [N1TolAC*] und [TolAC*] = [TolAC*]0 - [N1TolAC*] (mit [N1]0 und [TolAC*]0 als den Gesamtkonzentrationen an N1 bzw. TolAC-AEDANS). Durch Einsetzen dieser Gleichungen in Gleichung 40 ergibt sich die Konzentration des N1-TolAC-AEDANS-Komplexes (Gleichung 41). [N1TolAC*] =   2 *TolACN1 D00 K  00 D00 ]TolAC*[]N1[ 4 2 )]TolAC*[]N1([   K Gl. 41 Die Assoziationsreaktion wird über die Änderung der Fluoreszenz der kovalent an TolAC gebundenen AEDANS-Einheit verfolgt. Die gemessene Fluoreszenz ist dabei abhängig von den Konzentrationen an freiem und gebundenem TolAC-AEDANS (Gleichung 42). F = F0 + F 0 ]TolAC*[ ]TolAC*N1[  Gl. 42 F: gemessene Fluoreszenz; F0: Fluoreszenz des freien TolAC-AEDANS; F: maximale Fluoreszenzänderung bei vollständiger Bindung; [N1TolAC*]: Konzentration des N1-TolAC-AEDANS-Komplexes (in µM); [TolAC*]: Konzentration an freiem TolAC-AEDANS (in µM) Die Kombination der Gleichungen 41 und 42 resultiert in Gleichung 43, die die Abhängigkeit der gemessenen Fluoreszenz von den Gesamtkonzentrationen der Bindungspartner und dem KD-Wert des Komplexes aus N1 und TolAC-AEDANS wiedergibt. Durch Angleich dieser Gleichung an den Verlauf der Fluoreszenzamplitude in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration ergibt sich die Dissoziationskonstante KD. Materialien und Methoden 46 F = F0 + 0 [TolAC*] ΔF (   2 *TolACN1 D 00 K - 00 D00 ]TolAC*[]N1[ 4 2 )]TolAC*[]N1([   K) Gl. 43 Um die Affinität der aktiven Zustände des WT fd G3P* und der stabilisierten Variante fd G3P* IIHY zu bestimmen, wurden diese als langlebige Faltungsintermediate populiert. Dazu wurden die in 5,0 M GdmCl denaturierten Proteine 25fach in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 verdünnt und die Rückfaltung über einen Zeitraum von 450 s ermöglich. Anschließend wurden die Ansätze bis zur Messung auf Eis gestellt, um die durch die Isomerisierung von Pro213 limitierte Einnahme des gedockten Zustandes zu verlangsamen. Vor der Messung wurden die Proteine für 2 min in den Vorschubspritzen der vortemperierten Messapparatur bei 25 °C inkubiert. Die Aufnahme und Analyse der Assoziationskinetiken nach 1:1 Mischung mit 0,4 µM TolAC-AEDANS in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 erfolgte analog zu den nativen Proteinen. 2.13.3 Rückfaltung des G3P* in Gegenwart von TolAC-AEDANS Die Rückfaltung verschiedener G3P*-Varianten und der isolierten N1-Domäne bei 25 °C wurde zusätzlich in Gegenwart von TolAC-AEDANS untersucht, das im nicht assoziierten Zustand des G3P* mit dessen N1-Domäne interagieren kann. In GdmCl entfaltetes G3P* wurde durch zehnbzw. elffache Verdünnung (Endkonzentration: 1 µM) in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 und zusätzlich 1 µM TolAC-AEDANS in Rückfaltungsbedingungen überführt. Dadurch kann die schnell faltende N1-Domäne mit TolAC-AEDANS interagieren. Die Verdrängung von TolAC durch die Rückfaltung des G3P* wurde anhand der Änderung der Fluoreszenz bei 490 nm nach Anregung bei 280 nm in Quarzküvetten (Schichtdicke 1 cm) an einem Jasco FP-6500 Spektrofluorimeter verfolgt. Die Bandbreite der Anregungswellenlänge betrug 3 nm, die der Emissionswellenlänge 5 nm. Die Kinetiken wurden um die Fluoreszenz des Puffers korrigiert und durch Angleich exponentieller Funktionen (2.12.3) ausgewertet. Ergebnisse und Diskussion 47 3 Ergebnisse und Diskussion 3.1 Die Faltung des Gen-3-Proteins des filamentösen Phagen fd Eine wichtige Voraussetzung, um den Wirkungsmechanismus und damit die Funktion eines Proteins aufklären zu können, ist die Kenntnis über dessen Stabilität und Faltungsmechanismus. Letzterer ist jedoch gerade für die in der Zelle überwiegend vorkommenden Mehrdomänenproteine deutlich komplizierter als für kleine Eindomänenproteine, welche meist nach einem einfachen Zweizustandsmodell innerhalb weniger Sekunden falten.56; 144-148 Grund dafür sind unter anderem Wechselwirkungen zwischen den Domänen, die, wie im Fall der beiden N-terminalen Domänen (N1 und N2) des Gen-3-Proteins (G3P) des filamentösen fd Phagen, zu ihrer Stabilisierung und gleichzeitig zur Inaktivierung des Proteins führen können.96; 97; 122; 149 Die Interaktion der genannten Domänen N1 und N2 des G3P, die für die Infektion von E. coli Zellen durch den fd Phagen essentiell sind, wird zum großen Teil über die Gelenkregion der N2-Domäne vermittelt (Abbildung 3.1.1).59; 62; 96 Eine wichtige Rolle spielt dabei Prolinrest 213 in dieser Gelenkregion, das im geschlossenen Zustand in cisKonformation vorliegt und dadurch die Faltung der Gelenkregion und die Assoziation der Domänen ermöglicht.120 Barbara Eckert konnte zudem zeigen, dass die aufgrund der benachbarten Reste Gln212 und Pro214 sehr langsame Isomerisierung der Gln212-Pro213Peptidbindung die Infektiosität des Phagen fd reguliert.96 Abbildung 3.1.1: Tertiärstruktur des N1N2-Fragments von WT fd G3P*. Die Reste Pro161, Gln212, Pro213 und Pro214 sowie die Positionen der stabilisierenden Substitutionen in fd G3P* IIHY sind als Stäbchen-Modelle gezeigt. Die N1-Domäne ist in rot, der globuläre Teil von N2 in blau und die Gelenkregion in grün dargestellt. Die Abbildung wurde anhand der PDB-Struktur 2G3P60 mit dem Programm Pymol123 erstellt. Der Faltungsmechanismus des Fragments, das die beiden N-terminalen Domänen umfasst, wurde, wie bereits erwähnt, von Andreas Martin anhand der stark stabilisierten Variante fd G3P* IIHY untersucht (Abbildung 3.1.2a), um teilgefaltete und damit weniger stabile Intermediate besser analysieren zu können.120; 122 Dieses Protein enthält neben den Austauschen T13I und Q129H mit T101I und D209Y auch zwei Substitutionen in der Gelenkregion (Abbildung 3.1.1), welche zusammen mit Q129H die Stabilität der labileren N2-Domäne deutlich erhöhen.121 Thr13 Pro161 Pro213 Asp209Thr101 Gln129 Pro214 Gln212 Ergebnisse und Diskussion 48 Es hat sich jedoch gezeigt, dass dieser Substitutionshintergrund die Auswirkungen destabilisierender AS-Austausche auf die Stabilität und den Faltungsmechanismus des jeweiligen G3P* stark beeinflusst. Während zum Beispiel die Entfaltung der beiden Nterminalen Domänen im fd G3P* IIHY trotz des Austausches der beiden zu Pro213 benachbarten AS zu Alanin noch immer gekoppelt ist126, bewirken die gleichen Substitutionen im WT fd G3P*, dass die Domänen fast vollständig unabhängig voneinander vorliegen (Johanna Koch, unveröffentlichte Daten). Um folglich Aussagen über den Effekt von AS-Austauschen auf die Faltungseigenschaften der beiden N-terminalen Domänen des WT fd G3P* treffen zu können, muss auch der Faltungsmechanismus des natürlich vorkommenden G3P* bekannt sein. Entsprechende Untersuchungen wurden bereits von Roman Jakob unter anderem im Rahmen seiner Diplomarbeit begonnen. Er konnte zeigen, dass analog zu fd G3P* IIHY die Entfaltung beider Domänen ausgehend von nativem WT fd G3P* kinetisch gekoppelt und, wie die Einnahme des gedockten Zustandes, durch die notwendige Isomerisierung von Pro213 deutlich verlangsamt ist (;●;●, Abbildung 3.1.2a).150 Die Entfaltung der N1-Domäne aus dem nicht assoziierten Zustand sowie deren Rückfaltung laufen dagegen wiederum im gleichen schnellen Zeitbereich ab wie die der N1-Domäne der stabilisierten Variante. Abbildung 3.1.2: Auftragung der Entund Rückfaltungsraten von WT fd G3P*, fd G3P* IIHY und isolierter N2. a) Aufgetragen sind die apparenten Entfaltungs- (gefüllte Symbole) und Rückfaltungsraten  (offene Symbole) von WT fd G3P* (schwarze Symbole) bzw. fd G3P* IIHY (graue Symbole) in Abhängigkeit von der GdmClKonzentration bei 25 °C. Die Reaktionen der N1-Domäne wurden anhand der Trp-Fluoreszenz nach Anregung bei 295 nm verfolgt. Nach Anregung bei 280 nm wurden die Faltungsraten der N2-Domäne in Handmischexperimenten über die Messung der Fluoreszenz bei 310 nm und nach stopped-flow-Mischung anhand der Fluoreszenzänderung oberhalb von 340 nm erhalten. Gezeigt sind die Rückfaltung (;) der N1Domäne und deren Entfaltung aus dem nicht assoziierten Zustand (;) erhalten durch Doppelmischexperimente, die gekoppelte Entfaltung von N1 und N2 ausgehend von nativem Protein (;●;●), sowie die Rückfaltung der N2-Domäne (; und ;). Die Entfaltungsraten der N2-Domäne im ungedockten Zustand (;) wurden über Doppelmischexperimente ermittelt. Die gezeigten Daten wurden der Diplomarbeit von Roman Jakob150 und Referenz 151 entnommen. b) Entfaltungs- (offene Symbole) und Rückfaltungskinetiken (ausgefüllte Symbole) der isolierten N2-Domäne Q129H in Abhängigkeit von der Harnstoff-Konzentration bei 15 °C. Gezeigt sind die konformationelle Rückfaltung der cisbzw. trans-Spezies der N2 (;), deren Entfaltung (●) und die durch die Isomerisierung von Pro161 limitierten Entund Rückfaltungsraten (;). Die Daten wurden der Doktorarbeit von Roman Jakob94 entnommen, wobei die entsprechende Abbildung modifiziert wurde. Alle Messungen sind in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit 0,5 bzw. 1 µM Protein durchgeführt worden. 76543210 10 2 10 1 10 0 10 -1 10 -2 10 -3 [Ha r nstoff] (M)  (s -1 ) a) b) [GdmCl] (M) 0123456  (s -1 ) -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 1 1 10 2 10 3 10 Ergebnisse und Diskussion 49 Die monophasische Entfaltung der N2-Domäne ausgehend von nicht assoziiertem WT fd G3P* ist aufgrund fehlender günstiger Wechselwirkungen zwischen den Domänen ebenfalls deutlich beschleunigt (, Abbildung 3.1.2a). Während der Rückfaltung der N2Domäne wurden dagegen zwei Phasen detektiert, wobei die schnellere der beiden ( = 37 s in 0,5 M GdmCl; , Abbildung 3.1.2a) analog zu fd G3P* IIHY der konformationellen Faltung des globulären Teils von N2, die zweite der losen Domänenassoziation zugeordnet wurde (, Abbildung 3.1.2a; = 195 s in 0,5 M GdmCl).150 Während seiner Doktorarbeit konnte R. Jakob jedoch durch die eingehende Analyse des Faltungsmechanismus von isolierter N2 im Denaturierungsmittel Harnstoff zeigen, dass die Rückfaltung dieser Domäne nicht in zwei sondern drei Phasen abläuft, wobei der in der N2Domäne des nativen G3P* ebenfalls in cis-Konformation vorkommende Prolinrest 161 eine wichtige Rolle spielt (Abbildung 3.1.1).151 In einer schnellen Reaktion faltet dabei zunächst die geringe Population denaturierter N2 mit cis-Pro161 ( = 33 ms in 1 M Harnstoff), danach erfolgt die 30fach langsamere Faltung der Spezies mit Pro161 in trans-Konformation (;, Abbildung 3.1.2b). Im letzten Schritt kommt es zur transcis-Isomerisierung des ProlinRestes, wodurch N2 stabilisiert wird (, Abbildung 3.1.2b). Die Entfaltungsraten der beiden nativen Formen  und  sind dagegen gleich und folgen daher dem gleichen Chevronast (●, Abbildung 3.1.2b). Zur besseren Zuordnung der isomeren Spezies der Prolinreste 161 und 213 gilt im Folgenden die Festlegung, dass Konformere, die sich auf Pro161 beziehen, über hochgestellte Bezeichnungen gekennzeichnet werden, diejenigen von Pro213 sind entsprechend tiefgestellt (/Pro Pro). Durch den Vergleich der Rückfaltungskinetiken der isolierten N2-Domäne mit denen der N2-Domäne im WT fd G3P* in Harnstoff konnte abgeleitet werden, dass die Faltung dieser Domäne im N1N2-Fragment ebenfalls in diesen drei Phasen abläuft. Die Strukturierung des globulären Teils von N2 erfolgt damit nicht nur unabhängig von N1 und der eventuell gleichzeitig stattfindenden Faltung der Gelenkregion, sondern ist vor allem auch schneller, als aus den Daten der Rückfaltung in GdmCl zunächst geschlussfolgert worden war.94 3.1.1 Die Faltung des globulären Teils der N2-Domäne erfolgt in der Totzeit der manuellen Mischung Die Analyse der Faltung der N2-Domäne im durch Harnstoff entfalteten WT fd G3P* fand in Gegenwart von nativer N1 statt, da diese sehr stabil ist und in Harnstoff nur zu einem geringen Teil entfaltet wird. Einige der in dieser Arbeit untersuchten Substitutionen sind jedoch in der N1-Domäne lokalisiert, weshalb zur Analyse der Faltung beider Domänen dieser Varianten wieder auf das stärkere Denaturierungsmittel GdmCl zurückgegriffen werden musste. Um die Effekte der Austausche auf die Faltung des WT fd G3P* evaluieren zu können, wurde zunächst untersucht, inwieweit sich der oben beschriebene Faltungsmechanismus von N2 in Gegenwart von Harnstoff und bei 15 °C auf die Faltung der isolierten Form und des Gesamtproteins in GdmCl bei 25 °C übertragen lässt. Im Folgenden werden in Ergebnisse und Diskussion 50 den Auftragungen die bereits bekannten Chevrondaten in grau dargestellt. Farblich hervorgehoben werden jeweils die entsprechend diskutierten Daten. Die isolierte N2-Domäne besitzt nur eine sehr geringe Stabilität (TM = 34,6 °C), weshalb der Verlauf der Rückfaltungsraten nicht gut aufgelöst werden konnte (, Abbildung 3.1.3). Die nach stopped-flow-Mischung aufgenommenen Kinetiken zeigen jedoch, dass die Faltung von N2 schnell abläuft ( = 0,42 s in 0,2 M GdmCl). Oberhalb von 0,3 M GdmCl kann die gebildete Spezies aufgrund ihrer geringen Stabilität nicht mehr falten. Stattdessen sind Faltungsreaktionen mit noch schnelleren Raten detektierbar (, Abbildung 3.1.3). Abbildung 3.1.3: Chevron-Auftragung der Faltungsund Entfaltungsraten von WT fd G3P*. Aufgetragen sind die apparenten Entfaltungs- (gefüllte Symbole) und Rückfaltungsraten (offene Symbole) von WT fd G3P* (graue Symbole) aus Abbildung 3.1.2 und isolierter N2 (schwarze Symbole) in Abhängigkeit von der GdmCl-Konzentration bei 25 °C. Die Raten der Rückfaltung der N2-Domäne ausgehend von vollständig entfaltetem WT fd G3P* () bzw. in 2 M GdmCl teilweise denaturiertem Protein () wurden nach Doppelbzw. Einzelmischexperimenten erhalten, die Entfaltungsraten von N2 aus dem nicht assoziierten Zustand über Doppelmischexperimente nach Rückfaltung für 0,5 s () bzw. 150 s () in 0,5 M GdmCl. Die Entund Rückfaltungsraten der isolierten N2-Domäne (;;) wurden anhand von Einzelmischexperimenten erhalten. Gezeigt sind außerdem die Rückfaltung () der N1-Domäne des WT fd G3P* und deren Entfaltung aus dem nicht assoziierten Zustand () erhalten durch Doppelmischexperimente, die gekoppelte Entfaltung von N1 und N2 ausgehend von nativem Protein (;●), sowie die Rückfaltung der N2-Domäne (;). Die Entfaltungsraten der N2-Domäne im ungedockten Zustand nach 20 s Rückfaltungsdauer () wurden ebenfalls über Doppelmischexperimente ermittelt. Einige der Daten wurden, wie in Abbildung 3.1.2 beschrieben, der Diplomarbeit von Roman Jakob150 entnommen. Nach stopped-flow-Mischung wurden die Faltungsraten der N2Domäne anhand der Änderung der Fluoreszenz oberhalb von 320 nm (Anregung bei 280 nm) erhalten. Die Messungen wurden in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit 0,5 bzw. 1 µM Protein durchgeführt. Nach dem von Roman Jakob aufgestellten Modell ist aufgrund des geringen -Anteils während der Rückfaltung der N2-Domäne fast ausschließlich die Faltung der -Spezies beobachtbar, die erst durch die langsame Isomerisierung des Pro161 in die stabilere cis-Form umgewandelt wird.151 Die während der langsameren Faltungsreaktion gebildete instabile Spezies entspricht demnach isolierter N2 mit trans-Pro161 (). Im gefalteten Zustand ist der Anteil an  deutlich gegenüber  erhöht, wodurch die Amplitude der Entfaltungskinetiken ausgehend von gefalteter N2 durch die Reaktion von    dominiert wird. [GdmCl] (M) 0123456  (s -1 ) -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 1 1 10 2 10 3 10 Ergebnisse und Diskussion 51 Der niedrige TM-Wert der isolierten N2-Domäne ließ vermuten, dass N2 im nicht assoziierten WT fd G3P* gegenüber GdmCl ebenfalls nur eine marginale Stabilität besitzt. Im nativen, gedockten WT fd G3P* ist die N2-Domäne dagegen durch die Interaktion mit N1 stark stabilisiert. Der Übergangsmittelpunkt ihres Gleichgewichtsüberganges liegt bei 1,4 M GdmCl, der der N1-Domäne bei 2,6 M GdmCl.121 Aufgrund der Limitierung durch die maximal mögliche Verdünnung während der stopped-flow-Mischung wurde die Faltung der N2-Domäne zunächst ausgehend von (in 2 M GdmCl) teilweise entfaltetem G3P* untersucht. Unter diesen Bedingungen ist die labilere N2 bereits entfaltet, N1 befindet sich dagegen noch fast vollständig im nativen Zustand. Gemäß der erhaltenen Rückfaltungsreaktionen läuft die Faltung des globulären Teils der N2-Domäne im teilgefalteten WT fd G3P* deutlich schneller ab als aufgrund früherer Daten150 angenommen. Die Zeitkonstante ist von 37 s auf 2,8 s in 0,5 M GdmCl verringert (, Abbildung 3.1.3). Um auch die Rückfaltung der N2-Domäne ausgehend von vollständig denaturiertem WT fd G3P* untersuchen zu können, wurden zusätzlich Doppelmischexperimente durchgeführt. Durch elffache Verdünnung des entfalteten Proteins von 5,5 M nach 0,5 M GdmCl für 0,55 s wurde zunächst die Faltung der N1-Domäne ermöglicht ( = 83 ms). Die Rückfaltung der N2-Domäne wurde nach einem weiteren Sprung in GdmClKonzentrationen von 0,1 bis 0,5 M verfolgt. Die Raten der resultierenden monophasischen Kinetiken (, Abbildung 3.1.3) sind dabei identisch mit denen der Rückfaltung ausgehend von in 2 M GdmCl teilweise gefaltetem G3P*. Im Vergleich zu isolierter N2 ist die Rückfaltung jeweils geringfügig verlangsamt. Eine Aussage darüber, ob die Rückfaltungsgeschwindigkeit der N2-Domäne durch die Anwesenheit der gefalteten N1-Domäne, mit der sie über die Gelenkregion verknüpft ist, beeinflusst wird, kann jedoch nicht getroffen werden, da dazu die Informationen über die isolierte N2-Domäne fehlen. Die Entfaltung der N2-Domäne aus dem nicht assoziierten Zustand kann ebenfalls anhand von Doppelmischexperimenten untersucht werden. Bereits nach kurzer Rückfaltungsdauer von 0,5 s in 0,5 M GdmCl und erneutem Sprung diesmal in Entfaltungsbedingungen ergeben sich Entfaltungskinetiken, deren Zeitkonstanten (0,125 s in 1,6 M GdmCl) im Bereich der von Roman Jakob nach einer Rückfaltungszeit von 20 s gemessenen Raten liegen (;, Abbildung 3.1.3).150 Auch nach Verlängerung der Rückfaltungsdauer auf 150 s in 0,5 M GdmCl entfaltet oberhalb von 1,2 M GdmCl zumindest ein Teil der N2-Moleküle des WT fd G3P* mit der gleichen Geschwindigkeit (, Abbildung 3.1.3). Dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass die beiden N2-Spezies ( und ) gleich schnell entfalten.151 Unterhalb von 1,2 M GdmCl deutet sich nach längerer Rückfaltung ein Abknicken des Entfaltungsastes an. Das ist ein Hinweis darauf, dass hier im Gegensatz zur Entfaltung nach kurzer Rückfaltung wieder die Denaturierung der stabileren -Spezies das Fluoreszenzsignal dominiert. Die transcis-Isomerisierung des Prolin161 findet demnach vermutlich in diesem Zeitfenster statt. Ergebnisse und Diskussion 58 Abbildung 3.1.6. Analyse der Entfaltung der N2-Domäne ausgehend von nicht assoziiertem WT fd G3P*. a) Entfaltungskinetik von 1 µM der N2-Domäne im WT fd G3P* in 1,4 M GdmCl nach Rückfaltung des vollständig entfalteten Proteins für 300 s in 0,5 M GdmCl. Die schwarze durchgezogene Linie stellt den Angleich einer triexponentiellen Funktion an die Daten mit Zeitkonstanten von = 13,2 s, 2 = 102 s und 3 = 1667 s dar. b) Auftragung der Amplituden der schnellen () und intermediären Entfaltungsphase (●) und des Betrages der Amplitude der langsamsten Rückfaltungsreaktion () der N2-Domäne im WT fd G3P* als Funktion der GdmCl-Konzentration nach Rückfaltung des entfalteten Proteins für 300 s in 0,5 M GdmCl und erneutem Sprung in Entfaltungsbedingungen. Die in a) und b) gezeigten Daten wurde bei 310 nm nach Anregung bei 280 nm erhalten. c) Aufgetragen sind die apparenten Entfaltungs- (gefüllte Symbole) und Rückfaltungsraten (offene Symbole) von WT fd G3P* in Abhängigkeit von der GdmCl-Konzentration. Die Raten der schnellen () und intermediären Entfaltungsreaktion (●) sowie der langsamen Rückfaltungsphase () des WT fd G3P* aus dem nicht assoziierten Zustand wurden, wie in a) beschrieben, über Doppelmischexperimente bestimmt. Aufgetragen sind zudem die über Einzelsprünge nach manueller Mischung erhaltenen Entfaltungs- (●;●) und Rückfaltungsraten (;) ausgehend von vollständig nativem bzw. entfaltetem Protein sowie die Raten der langsamen () und intermediären Rückfaltungsphase () der N2-Domäne aus dem entfalteten Zustand mit cis-Pro213. Gezeigt sind außerdem die Raten der Rückfaltung der N2-Domäne ausgehend von entfaltetem WT fd G3P* (), die Entfaltungsraten von N2 aus dem nicht assoziierten Zustand nach Rückfaltung für 150 s () bzw. 20 s () in 0,5 M GdmCl, die Rückfaltung der N1-Domäne des WT fd G3P* () und deren Entfaltung aus dem ungedockten Zustand () erhalten durch Doppelmischexperimente, die gekoppelte Entfaltung von N1 und N2 ausgehend von nativem Protein (, verfolgt nach stopped-flow-Mischung). Zu Vergleichszwecken aufgetragen sind zusätzlich die Entund Rückfaltungsraten der isolierten N2-Domäne (;;). Wie in Abbildung 3.1.2 beschrieben, wurde ein Teil der Daten der Diplomarbeit von Roman Jakob entnommen.150 Alle Messungen wurden in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit 0,5 bzw. 1 µM Protein bei 25 °C durchgeführt. a) b) c) t (s) 060120180240 relative Fluoreszenz 150 155 160 165 170 2000 4000 6000 [GdmCl] (M) 0123456  (s -1 ) -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 1 1 10 2 10 3 10 [GdmCl] (M) 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 relative Fluoreszenz 0 10 20 30 Ergebnisse und Diskussion 59 Nach 300 s Rückfaltungsdauer ist sowohl die N1als auch die N2-Domäne gefaltet. Die Gelenkregion ist dagegen noch nicht strukturiert, da Pro213 noch weitgehend in transKonformation vorliegt. Während der Entfaltung dieses Intermediates sind drei Phasen detektierbar, wobei die schnelle ( = 13,3 s) und die mittlere ( = 102 s) ein abfallendes Signal zeigen, die langsame ( = 1667 s; jeweils in 1,4 M GdmCl) dagegen mit einem Anstieg der Fluoreszenz verbunden ist (Abbildung 3.1.6a). Grund für letzteren ist, wie auch schon in den Rückfaltungsexperimenten beobachtet, die Kopplung der Faltung von N2 an die Isomerisierung von Pro213 und die Einnahme des gedockten Zustandes. Oberhalb von 1,5 M GdmCl ist diese Rückfaltungsreaktion nicht mehr detektierbar, da das Gleichgewicht zu stark auf der Seite der Entfaltung liegt (, Abbildung 3.1.6b,c). Die intermediäre Phase folgt in ihren Raten der konformationellen Entfaltung ausgehend von nativem Protein. Ihre Amplitude ist jedoch im Vergleich zu den Daten aus den Einzelmischexperimenten deutlich verringert (●, Abbildung 3.1.6b,c). Das Auftreten dieser Reaktion deutet an, dass im entfalteten Zustand analog zu Pro161 auch Pro213 sowohl in transals auch cis-Konformation vorkommt, wobei das Gleichgewicht auf der Seite der -Spezies liegt. Bei geringen GdmCl-Konzentrationen wird die größte Signaländerung durch die zusätzliche schnelle Phase verursacht (, Abbildung 3.1.6). Der Verlauf ihrer Raten geht in den Chevronast der schnellen Rückfaltungsreaktion über (, Abbildung 3.1.6b). Dies deutet an, dass hier analog zum Faltungsmechanismus der isolierten N2-Domäne in Harnstoff die durch die cistrans-Isomerisierung von Pro161 limitierte Entfaltung der -Spezies beobachtet wird. 3.1.4 Die Substitution des Pro161 gegen Alanin hat keine Auswirkung auf den gedockten Zustand Nach den gezeigten Ergebnissen kann für WT fd G3P* keine der konformationellen Faltung der einzelnen Domänen nachgelagerte lose Assoziationsreaktion beobachtet werden. Die N2Domäne wird stattdessen sowohl während der konformationellen Faltung als auch im nicht assoziierten Zustand durch die Isomerisierung von Pro161 in die cis-Konformation stabilisiert, bevor der gedockte Zustand, limitiert durch die transcis-Isomerisierung von Pro213, eingenommen wird. Durch diese abschließende Kopplung der beiden Domänen wird die Stabilität von N2 im nativen G3P* deutlich erhöht. Die Substitution des Pro161 durch Alanin, das ausschließlich in trans-Konformation vorliegt, sollte sich demnach lediglich auf die Rückfaltung, jedoch kaum auf die Stabilität des Wildtyp-G3P* im Gleichgewicht bzw. dessen Entfaltung aus dem nativen Zustand auswirken. Die Stabilität der entsprechenden Variante fd G3P* P161A wurde durch thermischinduzierte Entfaltung untersucht, wobei die Änderung des CD-Signals bei 230 nm als Sonde diente.121 Genau wie zuvor für WT fd G3P* und die Variante fd G3P* P213G beobachtet, entfaltet fd G3P* P161A bei dieser Wellenlänge in einem zweiphasigen Übergang. Während der ersten Phase kommt es zur Entfaltung der labileren N2-Domäne, die gleichzeitig auch die Ergebnisse und Diskussion 60 Dissoziation der Domänen und die Entfaltung der Gelenkregion widerspiegelt. Der zweite Übergang kann der Denaturierung der stabileren N1-Domäne zugeordnet werden (Abbildung 3.1.7). Die nach Angleich gemäß eines Dreizustandsmodells erhaltenen thermodynamischen Parameter sind in Tabelle 3.1.1 aufgelistet. Abbildung 3.1.7: Thermisch-induzierte Entfaltung von WT fd G3P* und den beiden substituierten Varianten. Auftragung der relativen Änderung des CD-Signals bei a) 230 nm und b) 210 nm von WT fd G3P* (●), fd G3P* P213G (○) und fd G3P* P161A () in Abhängigkeit von der Temperatur. Die durchgezogenen Linien Stellen den Angleich an die Daten gemäß eines a) Dreizustandsbzw. b) Zweizustandsmodells dar. Die Übergänge von 4 µM Protein (1 µM bei 210 nm) wurden in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit einer Schichtdicke von 1 cm, einer Heizrate von 60 °C h-1 und einer Dämpfung von 8 s gemessen. Die aus der Datenanalyse erhaltenen thermodynamischen Parameter sind in Tabelle 3.1.1 aufgelistet. Tabelle 3.1.1: Stabilitätsdaten aus der thermisch-induzierter Entfaltung von WT fd G3P* und den Varianten fd G3P* P161A bzw. fd G3P* P213G Domänendissoziation und Entfaltung der N2-Domäne Entfaltung der N1-Domäne Variante TM (°C) H (kJ mol-1) G45°C (kJ mol-1) TM (°C) H (kJ mol-1) G60°C (kJ mol-1) WT fd G3P* 48,5 591 6,2 60,2 230 0,1 48,0 612 5,6 - - - fd G3P* P161A 47,1 636 4,1 60,5 211 0,3 46,6 560 2,7 - - - fd G3P* P213G 44,9 279 -0,1 60,2 225 0,1 37,8 442 -11,0 - - - isolierte N2-Domäne 34,6 304 -11,7 - - - Angegeben sind für die G3P*-Varianten fd G3P* P161A, fd G3P* P213G und WT fd G3P* sowie die isolierte N2-Domäne die Schmelztemperaturen TM, die Enthalpie der jeweiligen Entfaltungsreaktion am TM (H) und die freien Enthalpien der Entfaltung G45°C und G60°C bei 45 °C bzw. 60 °C. Die Stabilitätsdaten der beiden Domänen im G3P* wurden nach Auswertung des biphasischen Entfaltungsübergangs, der anhand des CDSignals bei 230 nm gemessen wurde, gemäß eines Dreizustandsmodells erhalten (Abbildung 3.1.7a). Der erste Übergang spiegelt die Entfaltung der N2-Domäne sowie die Dissoziation der Domänen wider, der zweite Übergang die Denaturierung der N1-Domäne. Darunter jeweils aufgelistet sind die Stabilitätsdaten von N2 im jeweiligen G3P*, welche, wie die der isolierten N2-Domäne, über die Änderung des CD-Signals bei 210 nm ermittelt wurden (Abbildung 3.1.7b). Die entsprechenden thermischen Übergänge wurden gemäß eines Zweizustandsmodells ausgewertet. Für die Analyse wurde eine konstante Änderung der Wärmekapazität Cp von 10000 J mol-1 K-1 für N2 bzw. für N1 1000 J mol-1 K-1 angenommen. Für die isolierte N2-Domäne wurde ein Wert von 8000 J mol-1 K-1 verwendet. Die Daten für WT fd G3P* wurden der Arbeit 121 entnommen; die Werte für fd G3P* P213G bei 230 nm der Referenz 79. Die Daten zu isolierter N2-Domäne sind eine persönliche Mitteilung von Roman Jakob. Die Messungen wurden unter den in Abbildung 3.1.7 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. 10080604020 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 T (°C) relative Signaländerung 6050403020 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 T (°C) relative Signaländerung a) b) Ergebnisse und Diskussion 61 Im Gegensatz zu Variante fd G3P* P213G, in der der Austausch des Pro213 zu einer Abnahme des TM-Wertes der N2-Domäne um ca. 3 °C führt, ist die Stabilität von N2 in fd G3P* P161A erwartungsgemäß nur geringfügig gegenüber WT fd G3P* verringert. Die ähnlich hohe Enthalpie deutet darauf hin, dass in diesem Protein die stabilisierende Assoziation zwischen den Domänen noch besteht. Die Kooperativität der Entfaltung von N2 in der Variante mit Glycin an Position 213 ist dagegen deutlich kleiner, was zumindest auf eine Schwächung der Wechselwirkungen schließen lässt. Die Stabilität der N1-Domäne ist durch die Substitution im globulären Teil von N2 bzw. in der Gelenkregion, die zusammen mit N2 entfaltet, nicht beeinflusst. Die durch die Denaturierung der N2-Domäne verursachte Signaländerung bei 230 nm ist sehr gering. Wenn die Übergänge der beiden Domänen nur schwach voneinander getrennt und zudem die Enthalpien der Übergänge klein sind, wird die Bestimmung des Übergangsmittelpunktes der N2-Domäne sehr ungenau. Aus diesem Grund wurde die Entfaltung der labileren -Faltblattdominierten N2-Domäne zusätzlich selektiv über die Änderung des CD-Signals bei 210 nm verfolgt (Abbildung 3.1.7b, Tabelle 3.1.1). Dabei zeigte sich, dass zwar für WT fd G3P* bzw. fd G3P* P161A die Stabilitätsdaten mit den zuvor bei 230 nm erhaltenen Werten gut übereinstimmen, der Übergangsmittelpunkt der Variante mit P213G-Substitution ist jedoch um 7 °C verringert. Damit ist die N2-Domäne des fd G3P* P213G nur geringfügig stabiler als die isolierte N2-Domäne (TM = 34,6 °C, Tabelle 3.1.1). Die gleichzeitig deutlich erhöhte Enthalpie zeigt allerdings an, dass im nativen fd G3P* P213G zwischen den Domänen trotz der verringerten Stabilität Wechselwirkungen vorhanden sind, die vermutlich auch über die strukturierte Gelenkregion vermittelt werden (Tabelle 3.1.1). Da die Faltungskinetiken in Abhängigkeit von der GdmCl-Konzentration analysiert werden, wurde zu Vergleichszwecken zusätzlich die Stabilität der Proteine gegenüber diesem Denaturierungsmittel untersucht (Abbildung 3.1.8). Hier diente die Änderung der Fluoreszenz bei 310 nm nach Anregung bei 280 nm als spezifische Sonde der Entfaltung der N2-Domäne, an die wiederum die Entfaltung der Gelenkregion und die Dissoziation der Domänen gekoppelt sind. Die Denaturierung der N1-Domäne wurde anhand der Zunahme der Fluoreszenz der drei enthaltenen Tryptophanreste bei 360 nm verfolgt. Die N2-Domäne besitzt ebenfalls ein Tryptophan, weshalb diese Sonde nicht vollständig selektiv für N1 ist. Die durch Trp181 in N2 verursachte schwache Signaländerung ist vermutlich der Grund dafür, dass das Fluoreszenzsignal vor allem des nativen fd G3P* P161A in diesem Bereich nicht linear verläuft (Abbildung 3.1.8a). Die nach Angleich an die Daten unter Festlegung der Basislinie erhaltenen thermodynamischen Parameter der N1-Domäne der Variante sind im Vergleich zu WT fd G3P* leicht verringert, was jedoch wahrscheinlich auf die ungenauere Auswertung zurückzuführen ist (Tabelle 3.1.2). Wie auch schon bei der thermisch-induzierten Entfaltung beobachtet, ist der Übergangsmittelpunkt der N1-Domäne durch die Substitution P213G ebenfalls nicht beeinflusst. Ergebnisse und Diskussion 62 Abbildung 3.1.8: GdmCl-induzierte Entfaltung der P161Abzw. P213G-substituierten G3P*-Variante. Aufgetragen ist die relative Fluoreszenzänderung von WT fd G3P* (●), fd G3P* P213G (○) bzw. fd G3P* P161A () als Funktion der GdmCl-Konzentration bei (a) 360 nm nach Anregung bei 295 nm zur Detektion der Entfaltung der N1-Domäne anhand der Trp-Fluoreszenz und bei (b) 310 nm nach Anregung bei 280 nm zur Beobachtung der N2-Domäne anhand der Tyr-Fluoreszenz. Die durchgezogenen Linien stellen Kurvenangleiche an die Messwerte unter Annahme eines Zweizustandsmodells dar. Die Daten für WT fd G3P wurden der Arbeit 121 entnommen. Die Übergänge wurden bei 25 °C mit 0,5 µM WT fd G3P bzw. 1 µM fd G3P P213G und fd G3P P161A in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 bei einer Schichtdicke von 1cm gemessen. Die aus der Datenanalyse erhaltenen thermodynamischen Parameter sind in Tabelle 3.1.2 aufgelistet. Tabelle 3.1.2: Stabilitätsdaten von WT fd G3P* bzw. den Varianten fd G3P* P161A und fd G3P* P213G aus GdmCl-induzierter Entfaltung Domänendissoziation und Entfaltung der N2-Domäne Entfaltung der N1-Domäne Variante [GdmCl]m (M) m (kJ mol-1 M-1) G25 °C (kJ mol-1) [GdmCl]m (M) m (kJ mol-1 M-1) G25 °C (kJ mol-1) WT fd G3P* 1,4 18,8 26,6 2,6 8,6 22,2 fd G3P* P161A 1,1 19,7 22,1 2,4 6,7 15,9 fd G3P* P213G 0,7 18,7 12,3 2,6 6,5 16,5 Angegeben sind die Übergangsmittelpunkte [GdmCl]m, die Kooperativitätsparameter m sowie die auf 0 M GdmCl extrapolierten freien Enthalpien der Entfaltung (G) bei 25 °C. Der Übergang der N2-Domäne wurde nach Anregung bei 280 nm anhand der Fluoreszenz bei 310 nm gemessen, der der N1-Domäne bei 360 nm nach Anregung bei 295 nm verfolgt. Für beide Domänen erfolgte die Analyse der Daten nach einem Zweizustandsmodell. Die Daten für WT fd G3P* wurden der Arbeit 121 entnommen. Die Messungen wurden unter den in Abbildung 3.1.8 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Die N2-Domänen der beiden Substitutionsvarianten sind wieder im Vergleich zum Wildtyp-G3P* destabilisiert, insbesondere nach Austausch von Pro213 durch Glycin. Die Substitution P161A in der N2-Domäne wirkt sich weniger stark destabilisierend aus. Die unverändert hohen m-Werte der Entfaltung der N2-Domäne zeigen jedoch an, dass diese in beiden Varianten an die Entfaltung der Gelenkregion und die Domänenöffnung gekoppelt ist (Tabelle 3.1.2). Im Folgenden wurde untersucht, inwieweit sich die P161A-Substitution in der N2-Domäne auf den Faltungsmechanismus des G3P* auswirkt. Dazu wurden zunächst die Rückfaltung von N1 und des globulären Teils der N2-Domäne dieser Variante nach schneller Mischung analysiert. Die Raten beider Reaktionen stimmen mit denen des WT fd G3P* 32,521,510,50 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 [GdmCl] (M) relative Signaländerung a) b) 543210 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 [GdmCl] (M) relative Signaländerung Ergebnisse und Diskussion 63 überein (;, Abbildung 3.1.9). Auch in dieser Variante falten demnach beide Domänen unabhängig voneinander in schnellen Reaktionen. Die Faltungsraten von N2 mit P161A folgen dabei in ihrem Verlauf denen der N2-Domäne mit trans-Pro161 im geöffneten Zustand des G3P*. Oberhalb von 0,5 M GdmCl ist jedoch keine zusätzliche Phase detektierbar, die der Faltung der N2-Spezies mit cis-Pro161 im WT fd G3P* entspricht. Abbildung 3.1.9. Chevronauftragung der Faltungsund Entfaltungsraten der Variante fd G3P* P161A. Aufgetragen sind die apparenten Entfaltungs- (gefüllte Symbole) und Rückfaltungsraten (offene Symbole) von WT fd G3P* (graue Symbole) bzw. fd G3P* P161A (farbige Symbole) in Abhängigkeit von der GdmClKonzentration. Die langsamen Entfaltungs- (●;●;●;●) und Rückfaltungsraten (;;;;) der N2-Domäne des jeweiligen G3P* nach manueller Mischung wurden anhand der Änderung der Tyrosinfluoreszenz bei 310 nm nach Anregung bei 280 nm gemessen. Gezeigt sind außerdem die schnelle Rückfaltung der N1-Domänen (;), die anhand der Trp-Fluoreszenz oberhalb von 340 nm nach Anregung bei 295 nm verfolgt wurde. Die konformationelle Faltung der jeweiligen -Spezies (;) ausgehend von entfaltetem Protein sowie die gekoppelte Entfaltung von N1 und N2 aus dem nativen Zustand (;) nach stopped-flow-Mischung wurden anhand der Fluoreszenz oberhalb von 320 nm nach Anregung bei 280 nm gemessen. Die Rückfaltung von N2 (;) und der N1-Domäne () ausgehend von denaturiertem Protein mit cis-Pro213 wurde nach Entfaltung für 1,5 s in 3,5 M GdmCl und erneutem Sprung in native Bedingungen über die gleiche Sonde detektiert. Zu Vergleichszwecken aufgetragen sind außerdem die Entfaltungsraten der N2-Domäne nach 20 bzw. 150 s Rückfaltungsdauer in 0,5 M GdmCl (;), die Entfaltungsraten der N1-Domäne () im ungedockten WT fd G3P* sowie die Entund Rückfaltungsraten der isolierten N2-Domäne (;). Einige der Daten des WT fd G3P* wurden, wie in Abbildung 3.1.2 beschrieben, der Diplomarbeit von Roman Jakob entnommen.150 Alle Messungen wurden in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit 1 µM Protein bei 25 °C durchgeführt. Auch nach Austausch von Pro161 gegen Alanin erfolgt die langsame, nach manueller Mischung detektierte Rückfaltung im mehreren Phasen (;;, Abbildung 3.1.10). Bei niedrigen GdmCl-Konzentrationen ist lediglich eine Reaktion (,  = 19,2 s in 0,25 M GdmCl) mit einer geringen Amplitude detektierbar (Abbildung 3.1.10a), da die konformationelle Faltung der N2-Domäne zum großen Teil bereits in der Totzeit der manuellen Mischung abläuft (Abbildung 3.1.9). Diese Faltungsphase war auch für die isolierte N2-Domäne mit der P161A-Substitution beobachtet worden. Es wurde vermutet, dass sie die durch die cistrans-Isomerisierung der zusätzlich in N2 enthaltenen Prolinreste limitierte Faltung der N2-Domäne reflektiert. Diese Reaktion wird im WT fd G3P* durch die Isomerisierung des Pro161 überdeckt, die im gleichen Zeitbereich abläuft.151 [GdmCl] (M) 0123456  (s -1 ) -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 1 1 10 2 10 3 10 Ergebnisse und Diskussion 64 Oberhalb von 0,5 M GdmCl kann nur noch ein kleiner Teil der N2-Domäne vor der Assoziation mit N1 in die native Form übergehen. Die Faltung wird vielmehr durch die langsame transcis-Isomerisierung des Pro213 bestimmt, wodurch der assoziierte Zustand eingenommen und die N2-Domäne ausreichend stabilisiert wird (Abbildung 3.1.10c,b). Diese langsame Reaktion zeigt demnach auch die größte Amplitude (, Abbildung 3.1.10d). Zusätzlich ist eine intermediäre Phase mit einer Zeitkonstante von etwa 100 s detektierbar, deren geringe Amplitude jedoch interessanterweise in die entgegengesetzte Richtung zeigt (, Abbildung 3.1.10b-d). Die genaue Ursache der Signaländerung ist nicht bekannt. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass sie lediglich durch Bleicheffekte verursacht wird, da die Probe während der ersten 240 s permanenter Lichteinstrahlung ausgesetzt war. Abbildung 3.1.10. Rückfaltungskinetiken von fd G3P* P161A in Abhängigkeit der GdmCl-Konzentration. Gezeigt sind die Faltungsreaktionen von 1 µM entfaltetem fd G3P* P161A nach Verdünnung in a) 0,25 M, b) 0,55 M bzw. c) 0,7 M GdmCl. Die schwarzen durchgezogenen Linien stellen Angleiche an die Daten mit mono-, bibzw. triexponentiellen Gleichungen da. Die daraus erhaltenen Zeitkonstanten ergeben sich zu a) = 19,2 s, b)  = 29 s,  = 94 s und  = 2564 s, c)  = 127 s und  = 3300 s. d) Auftragung der Amplituden der schnelleren (●) und langsamsten Entfaltungsphase (●) sowie der schnellen (), intermediären () und langsamsten () Rückfaltungsreaktionen der N2-Domäne im fd G3P* P161A als Funktion der GdmClKonzentration. Die Daten wurden nach manueller Mischung bei 310 nm anhand der Tyr-Fluoreszenz (Anregung 280 nm) in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 bei 25 °C gemessen. Wie bereits vermutet wird die Entfaltung des Proteins durch die Alanin-Substitution nicht verändert. Die Zeitkonstanten der monophasischen Entfaltungskinetiken von nativem t (s) 0 20406080100 relative Fluoreszenz 210 212 214 216 t (s) 0 50 100 150 200 relative Fluoreszenz 195 200 205 210 2500 5000 7500 a) b) d)c) t (s) 0 50 100 150 200 relative Fluoreszenz 190 195 200 205 210 3000 6000 9000 [GdmCl] (M) 0,5 1 1,5 2 relative Fluoreszenz 0 10 20 30 40 50 Ergebnisse und Diskussion 65 fd G3P* P161A bei hohen GdmCl-Konzentrationen entsprechen denen des WT fd G3P* (, Abbildung 3.1.9). Im Bereich von 1 bis 2 M GdmCl erfolgt die Entfaltung der N2Domäne in einem zweiphasigen Prozess (●;●, Abbildung 3.1.9, Abbildung 3.1.10). Dem Ratenbzw. Amplitudenverlauf nach kann die schnelle Reaktion der konformationellen Entfaltung der N2-Domäne aus dem assoziierten Zustand (●), die langsamere (●) der Isomerisierung des Pro213 zugeordnet werden. Dass durch den AS-Austausch die Stabilität der N2-Domäne im Vergleich zu N2 im Wildtyp-Protein leicht verringert ist, zeigt sich in der geringfügigen Verschiebung des Chevronastes zu niedrigeren GdmCl-Konzentrationen (●;●, Abbildung 3.1.9). Die Rückfaltung der N2-Domäne in den gedockten Zustand wurde wiederum über Doppelmischexperimente ermittelt, indem natives fd G3P* P161A zunächst kurz für 1,5 s in 3,5 M GdmCl zur Population der -Spezies entfaltet wurde. Wie bereits ausgeführt, ist dieser Entfaltungspuls ausreichend, um das Protein konformationell zu entfalten, allerdings behält Pro213 in der Gelenkregion weitgehend seine cis-Konformation, so dass sich bei der Rückfaltung unmittelbar der geschlossene Zustand ausbilden kann. Im Gegensatz zu WT fd G3P* sind während der Rückfaltung lediglich zwei Phasen detektierbar, wobei die schnellere der beiden die Faltung der N1-Domäne widerspiegelt (, Abbildung 3.1.9). Die langsame Phase (, Abbildung 3.1.9) reflektiert die Faltung der N2-Domäne. Ihre Rate entspricht der Rate der Bildung der  -Spezies in WT fd G3P* (, Abbildung 3.1.9). Die Analyse des entsprechenden Chevrons zeigt, dass die N2-Domäne bei der Faltung in die gedockte Form wiederum deutlich stabiler ist als bei Rückfaltung von vollständig denaturiertem G3P* in den nicht assoziierten Zustand. Bei niedrigen GdmCl-Konzentrationen stimmen die jeweiligen Faltungsraten jedoch wieder gut überein ((  ) = 2,7 s; (  ) = 2,1 s, jeweils in 0,5 M GdmCl, Abbildung 3.1.9, ;). Der Ablauf der Faltung der N2-Domäne wird demnach auch in fd G3P* P161A nicht durch die Konformation des Pro213 beeinflusst. Die deutliche Stabilisierung der N2-Domäne in Gegenwart von cisPro213 wird vielmehr über die dann mögliche Assoziation mit der gefalteten N1-Domäne erreicht. Das Fehlen der Rückfaltungsphase mit einer Zeitkonstante von 0,134 s (in 0,64 M GdmCl), die im Ausgangsprotein die Bildung der  -Form reflektiert (, Abbildung 3.1.5), bestätigt, dass die Faltung von fd G3P* P161A im Wesentlichen der Faltung der Form des WT fd G3P mit trans-Pro161 folgt. 3.1.5 Durch den Austausch des Pro213 gegen Glycin liegt das WT fd G3P* teilweise in nicht assoziierter Form vor Anders als die P161A-Substitution hat der Austausch von Pro213 gegen Glycin einen deutlich negativen Einfluss auf die Stabilität der N2-Domäne des WT fd G3P, was sich auch in der Rückfaltungskinetik der Variante fd G3P* P213G widerspiegelt. Während der Faltung ausgehend von vollständig denaturiertem fd G3P* P213G sind drei Reaktionen spektroskopisch sichtbar (Abbildung 3.1.11). Die Verläufe der Faltungsraten der N1-Domäne Ergebnisse und Diskussion 66 (, Abbildung 3.1.11) und des globulären Teils der N2-Domäne mit Pro161 in transKonformation (, Abbildung 3.1.11) stimmen dabei mit den entsprechenden Raten überein, die für das Wildtyp-Protein erhalten worden waren. Die Stabilität des globulären Teils der N2-Domäne im nicht assoziierten Zustand ist also trotz des Austausches in der Gelenkregion unverändert. Nach manueller Mischung konnte dagegen nur eine Faltungsreaktion detektiert werden, deren Rate der Isomerisierung von Pro161 in seine cis-Konformation entspricht (, Abbildung 3.1.11). Die langsamste Reaktion, die der Bildung der assoziierten Form beim WT fd G3P entspricht, konnte bei fd G3P* P213G nicht nachgewiesen werden. Abbildung 3.1.11. Chevronauftragung der Faltungsund Entfaltungsraten des fd G3P* P213G. Auftragung der apparenten Entfaltungs- (gefüllte Symbole) und Rückfaltungsraten (offene Symbole) von WT fd G3P* (graue Symbole) bzw. fd G3P* P213G (farbige Symbole) in Abhängigkeit von der GdmClKonzentration. Die Entfaltungs- (●;;●;●) und Rückfaltungsraten (;;) der N2-Domäne des jeweiligen G3P* nach manueller Mischung wurden anhand der Änderung der Tyrosinfluoreszenz bei 310 nm nach Anregung bei 280 nm gemessen. Gezeigt sind außerdem die schnelle Rückfaltung der N1-Domänen (;), die anhand der Trp-Fluoreszenz oberhalb von 340 nm nach Anregung bei 295 nm verfolgt wurde. Die konformationelle Faltung der jeweiligen -Spezies (;) ausgehend von entfaltetem Protein sowie die Entfaltung von N1 und N2 aus dem nativen Zustand (;;) wurden nach stopped-flow-Mischung anhand der Änderung der Fluoreszenz oberhalb von 320 nm (Anregung 280 nm; bzw. N1: Anregung bei 295 nm, Emission oberhalb von 340 nm) beobachtet. Die Entfaltung der -Spezies aus dem nicht assoziierten Zustand () konnte bereits in Einzelsprungexperimenten nach schneller Mischung anhand der gleichen Sonde detektiert werden. Im WT fd G3P* sind diese Raten dagegen erst nach Rückfaltung für 20 bzw. 150 s in 0,5 M GdmCl und erneuter Überführung in Entfaltungsbedingungen beobachtbar (;). Zu Vergleichszwecken aufgetragen sind außerdem die Entfaltungsraten der N1-Domäne () im ungedockten WT fd G3P* sowie die Entund Rückfaltungsraten der isolierten N2-Domäne (;). Einige der Daten des WT fd G3P* wurden, wie in Abbildung 3.1.3 beschrieben, der Diplomarbeit von Roman Jakob entnommen.150 Die Messungen wurden in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit 0,5 bzw. 1 µM Protein bei 25 °C durchgeführt. Der Verlauf der Rückfaltung deutet darauf hin, dass durch den Austausch des Pro213 gegen Glycin die Einnahme des gedockten Zustandes und damit die Stabilisierung der N2Domäne verhindert werden und deshalb ein großer Teil der Proteine in geöffneter Form vorliegt. Tatsächlich ergeben sich bei der Entfaltung ausgehend von nativem Protein im Bereich von 1 bis 2 M GdmCl drei Phasen (●;;, Abbildung 3.1.11). Die Raten der schnellsten Entfaltungsreaktion, die nach stopped-Flow-Mischung detektiert wurde, stimmen [GdmCl] (M) 0123456  (s -1 ) -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 1 1 10 2 10 3 10 Ergebnisse und Diskussion 67 mit denen der Denaturierung von nicht assoziierter -Spezies im WT fd G3P* überein (;, Abbildung 3.1.11), die in letzterem Fall jedoch erst über Doppelmischexperimente zugänglich ist. Im Gegensatz zum Wildtyp-Protein ist folglich die Entfaltung zumindest eines Teils der Moleküle des fd G3P* P213G tatsächlich nicht durch die Dissoziation der Domänen limitiert. Die intermediäre Phase (, Abbildung 3.1.11), die nach manueller Mischung erhalten wurde, entspricht mit einer Zeitkonstante von  = 29 s (in 1,1 M GdmCl) der durch die cistrans-Isomerisierung von Pro161 limitierten Denaturierung von N2 im WT fd G3P* (  = 27 s in 1,1 M GdmCl). Die Raten der langsamen Entfaltungsreaktion der N2-Domäne (;●, Abbildung 3.1.11) gehen dem Verlauf nach in den Entfaltungsast von N1 ausgehend von nativem Protein über (, Abbildung 3.1.11). Oberhalb von 3,5 M GdmCl stimmen die über beide Sonden erhaltenen Entfaltungskinetiken überein. Die Zeitkonstante dieser Reaktion (  = 25 ms in 3,7 M GdmCl) ist dabei zehnmal geringer als im WT fd G3P* (  = 230 ms in 3,7 M GdmCl) und entspricht damit der Zeitkonstante der Entfaltung der isolierten N1-Domäne. Dies bedeutet zum einen, dass trotz des Fehlens von Pro213 ein Teil der Population einen Zustand einnehmen kann, in dem durch die Assoziation der beiden Domänen die Entfaltung von N1 an die der N2-Domäne gekoppelt ist. Zum anderen weist die erhöhte Entfaltungsgeschwindigkeit der Domänen darauf hin, dass ihre Kopplung in diesem Zustand und damit die Stabilisierung von N2 deutlich schwächer ist als im Wildtyp-Protein. Tatsächlich ist der Entfaltungsast dieser assoziierten Spezies zu niedrigeren GdmClKonzentrationen verschoben. Dabei liegen die unterhalb von 1,6 M GdmCl nach manueller Mischung erhaltenen Raten der Entfaltung von N2 aus dieser assoziierten Form (●, Abbildung 3.1.11) im Zeitbereich der Raten der konformationellen Entfaltung der -Form von WT fd G3P* (●, Abbildung 3.1.11). Die Variante fd G3P* P213G liegt folglich als Mischung aus geschlossener und offener Form vor. Dies erklärt auch die von Barbara Eckert beobachtete hohe Infektiosität des entsprechenden Phagen gegenüber pilusfreien E. coli HB2156 Zellen, bei deren Infektion die Zugänglichkeit der N1-Domäne für ihren Rezeptor, die C-terminale Domäne des Membranproteins TolA, von entscheidender Bedeutung ist.96 Im Vergleich zum Ausgangsphagen ist der Phage mit P213G-Substitution hundertfach infektiöser, was auf die durch die Domänendissoziation deutlich bessere Exposition der Bindungsfläche auf der N1Domäne zurückgeführt werden kann. 3.1.6 Die Geschwindigkeit der Assoziation der Domänen im fd G3P* P213G ist gegenüber der transcis-Isomerisierung von Pro213 deutlich beschleunigt Die Assemblierung von N1 und N2 im fd G3P* P213G ist spektroskopisch nicht sichtbar. Um Informationen über die Geschwindigkeit der Bildung des assoziierten Zustandes zu erhalten, wurde daher ein Zweischritt-Entfaltungstest für native Moleküle durchgeführt.142; 143 Dazu wurde entfaltetes fd G3P* P213G analog zu den bereits beschriebenen Ergebnisse und Diskussion 74 Für die stabilisierte Variante fd G3P* IIHY P213G konnte keine Beschleunigung der Assoziationsreaktion durch die Prolylisomerase Cyclophilin 18 beobachtet werden.120 Von Cyclophilin 18 ist jedoch bekannt, dass es die Isomerisierung von Pro213 beschleunigen kann und generell eine geringe Spezifität gegenüber der AS von und nach dem Prolinrest besitzt.160 Die Ursache für den Unterschied in der Katalysierbarkeit der beiden P213G-Varianten ist nicht bekannt, ein möglicher Grund kann jedoch die Zugänglichkeit der betroffenen Peptidbindung in der Gelenkregion sein. Während im lose-assoziierten Zustand der stabilisierten Variante die Gelenkregion bereits teilweise gefaltet vorliegt62, ist sie im langlebigen Faltungsintermediat von WT fd G3P* unstrukturiert (siehe auch Kapitel 3.2.2). Dies ist wahrscheinlich auch die Ursache für die unterschiedlich starke Beschleunigung der beiden Rückfaltungsphasen in fd G3P* P213G, denn Pro161 in Schleife 3 der N2-Domäne ist sehr stark lösungsmittelexponiert und damit gut zugänglich für Prolylisomerasen. 3.1.8 Die Rückfaltung der N2-Domäne in der stabilisierten Variante fd G3P* IIHY erfolgt unmittelbar in den lose-assoziierten Zustand Nach den vorhandenen Daten ergeben sich signifikante Unterschiede in den Faltungsmechanismen des Wildtyp-Proteins und der stabilisierten Variante fd G3P* IIHY. Die Entfaltung des nativen WT fd G3P* erfolgt in zwei spektroskopisch sichtbaren Schritten, wobei die konformationelle Entfaltung der N2-Domäne deutlich schneller ist als die cistrans-Isomerisierung von Pro213. Für die stabilisierte G3P*-Variante ist lediglich eine Entfaltungsphase detektierbar, deren Rate im Übergangsbereich der N2-Domäne der der langsamen Prolylisomerisierungsreaktion von Pro213 entspricht (●, Abbildung 3.1.16).122 Der Entfaltungsast der Variante fd G3P* IIHY P213G ist zwar zu niedrigeren GdmClKonzentrationen verschoben, jedoch sind im Gegensatz zu fd G3P* P213G neben der Entfaltung aus dem assoziierten Zustand keine weiteren Reaktionen detektierbar (●, Abbildung 3.1.16).120 Das bedeutet, dass fd G3P* IIHY im nativen Zustand trotz des Fehlens von Pro213 vollständig in der geschlossenen Konformation vorliegt. Während der Rückfaltung der stabilisierten G3P*-Variante bei niedrigen GdmClKonzentrationen sind drei Phasen beobachtbar (;;, Abbildung 3.1.16), bevor der native Zustand in einer spektroskopisch unsichtbaren Reaktion durch die Isomerisierung von Pro213 ( = 6200 s in 0,5 M GdmCl) erreicht wird. Die Strukturierung der N1-Domäne ist dabei wieder innerhalb weniger Millisekunden abgeschlossen. Die N2-Domäne faltet dagegen mit deutlicher Verzögerung in zwei sequenziellen Schritten. Die schnellere der beiden Phasen mit einer Zeitkonstante von 7 s spiegelt dabei die konformationelle Faltung ihres globulären Teils wider. Der zweite Schritt ( = 42 s in 0,5 M GdmCl) wurde hier jedoch nicht der Isomerisierung von Pro161, sondern der losen Assoziation der beiden gefalteten Domänen zugeordnet (, Abbildung 3.1.16).122 Durch Doppelmischexperimente ließ sich analog zum WT fd G3P* die Entfaltungsgeschwindigkeit von N2 aus diesem lose assoziierten Zustand bestimmen (, Abbildung 3.1.16).122 Sie ist zwar deutlich schneller als die Entfaltung der Domäne aus dem gedockten Zustand, jedoch gleichzeitig erheblich langsamer als die Ergebnisse und Diskussion 75 Denaturierung der entsprechenden isolierten N2-Domäne (, Abbildung 3.1.16). Dies zeigt an, dass N2 durch die verstärkte Interaktion mit der N1-Domäne deutlich gegenüber der nicht assoziierten Form stabilisiert ist. Abbildung 3.1.16. Faltungsund Entfaltungsraten der Varianten fd G3P* IIHY und fd G3P* IIHY P213G. Aufgetragen sind die apparenten Entfaltungs- (gefüllte Symbole) und Rückfaltungsraten (offene Symbole) von fd G3P* IIHY (graue Symbole) bzw. fd G3P* IIHY P213G (blaue Symbole) in Abhängigkeit von der GdmClKonzentration. Bis auf die Raten der isolierten N2 wurden alle Daten den Publikationen 120 und 122 entnommen. Die Entfaltungs- (●;●) und Rückfaltungsraten (;;;) von N2 des jeweiligen G3P* nach manueller Mischung wurden anhand der Änderung der Tyrosinfluoreszenz bei 310 nm nach Anregung bei 280 nm gemessen. Gezeigt ist außerdem die schnelle Rückfaltung der N1-Domäne des fd G3P* IIHY () sowie deren Entfaltung aus dem ungedockten Zustand (), die über Doppelmischexperimente ermittelt wurde. Die Entfaltung der N2-Domäne des fd G3P* IIHY aus dem lose-assoziierten Zustand wurde nach Rückfaltung über einen Zeitraum von 180 s in 0,5 M GdmCl und erneutem Sprung in Entfaltungsbedingungen () nach manueller Mischung ermittelt. Die konformationelle Faltung von N2 ergab sich über die Rückfaltung für 0,5 s in 0,5 GdmCl und weitere Verdünnung in niedrigen GdmCl-Konzentrationen () nach schneller Mischung. Die Bildung von nativem fd G3P* IIHY und damit die Rate der Domänenassoziation wurde wie Referenz 122 beschrieben anhand eines Zweischritt-Entfaltungstests für native Moleküle ermittelt (). Zu Vergleichszwecken aufgetragen sind außerdem die Entund Rückfaltungsraten der isolierten N2-Domäne Q129H (;). Dass die Rückfaltung und vor allem die Einnahme des lose-assoziierten Zustandes des stabilisierten G3P* tatsächlich nicht mehr von der Änderung der Konformation des Pro161 abhängig ist, ergibt sich auch aus den Rückfaltungsexperimenten der drei Varianten fd G3P* IIHY, fd G3P* IIHY P213G und fd G3P* IIHY P161A in Gegenwart von TolACAEDANS (Abbildung 3.1.17). Der Angleich an die Daten ist zwar aufgrund fehlender Informationen über den Reaktionsverlauf zu Beginn der Messung stark fehlerbehaftet, aber dennoch zeigt sich, dass nach manueller Mischung die erste detektierbare Rückfaltungsphase auch des fd G3P* IIHY P161A über 80 % der Gesamtamplitude besitzt. Die Zeitkonstanten dieser Reaktion im fd G3P* IIHY bzw. fd G3P* IIHY P213G entsprechen mit 27 bzw. 25 s nicht nur denen der jeweiligen langsamen Rückfaltungsreaktionen (Abbildung 3.1.16), sondern befinden sich genau wie die Zeitkonstante von fd G3P* IIHY P161A ( = 24 s) im Zeitbereich der Isomerisierung von Peptidylprolylbindungen.106 Die nachgelagerte Reaktion spiegelt die Einnahme des gedockten Zustandes wider, die durch den Austausch von Pro213 gegen Glycin deutlich beschleunigt wird. Die Zeitkonstante von 168 s entspricht dabei relativ [GdmCl] (M) 0123456  (s-1) -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 1 1 10 2 10 Ergebnisse und Diskussion 76 gut der Zeitkonstante der Domänenassoziation, die mit Hilfe eines ZweischrittEntfaltungstestes für native Moleküle bestimmt worden war ( = 240 s).120 Abbildung 3.1.17: Freisetzung von TolAC-AEDANS durch Faltung der stabilisierten G3P*-Varianten. Gezeigt sind die normierten Kinetiken der Verdrängung von TolAC-AEDANS während der Rückfaltung von fd G3P* IIHY (grün), fd G3P* IIHY P161A (rot) bzw. fd G3P* IIHY P213G (blau). Die Reaktionen wurden nach elffacher Verdünnung des jeweiligen denaturierten Proteins (11 µM in 5,5 M GdmCl) in Gegenwart von 1 µM TolAC-AEDANS anhand der AEDANS-Fluoreszenz bei 490 nm nach Anregung bei 280 nm verfolgt. Die schwarzen Linien stellen den Angleich biexponentieller Funktionen an die Daten mit folgenden Zeitkonstanten da: 1(IIHY) = 27 s, 2(IIHY) = 1357 s; 1(P161A) = 24 s, 2(P161A) = 1263 s und 1(P213G) = 25 s, 2(P213G) = 168 s. Die Messungen wurden bei 25 °C in 0,1 M KP-Puffer, 0,5 M GdmCl, pH 7,0 mit einer Schichtdicke von 1 cm durchgeführt. Es stellte sich daher die Frage, inwieweit sich die Isomerisierung des Pro161 in der stabilisierten Variante auf den Faltungsmechanismus und die Stabilität auswirkt. Der Übergangsmittelpunkt des thermischen Überganges der N2-Domäne ist ähnlich wie im WT fd G3P* durch die Alaninsubstitution an Position 161 nur geringfügig von 61,4 auf 59,6 °C verringert, während die Stabilität der N1-Domäne 65,7 °C unverändert ist.79 Dies deckt sich auch mit den Daten aus der GdmCl-induzierten Entfaltung (Tabelle 3.1.4). Während sich durch den Austausch des Pro213 gegen Glycin eine deutliche Verschiebung des Übergangsmittelpunktes der N2-Domäne zu niedrigeren Denaturierungsmittelkonzentrationen ergibt79, ist die N2-Domäne in fd G3P* IIHY P161A nur leicht gegenüber fd G3P* IIHY destabilisiert. Tabelle 3.1.4: Stabilitätsdaten von fd G3P* IIHY und der Varianten fd G3P* IIHY P161A und fd G3P* IIHY P213G aus GdmCl-induzierter Entfaltung Domänendissoziation und Entfaltung der N2-Domäne Entfaltung der N1-Domäne Variante [GdmCl]m (M) m (kJ mol-1 M-1)  G25 °C (kJ mol-1) [GdmCl]m (M) m (kJ mol-1 M-1) G25 °C (kJ mol-1) fd G3P* IIHY 2,5 15,9 39,3 3,2 8,9 28,6 fd G3P* IIHY P161A 2,3 16,9 38,8 3,3 8,1 26,7 fd G3P* IIHY P213G 1,7 19,8 34,3 3,2 8,1 26,3 Angegeben sind die Übergangsmittelpunkte [GdmCl]m, die Kooperativitätsparameter m sowie die auf 0 M GdmCl extrapolierten freien Enthalpien der Entfaltung G bei 25 °C. Der Übergang der N2-Domäne wurde nach Anregung bei 280 nm anhand der Fluoreszenz bei 310 nm gemessen, der der N1-Domäne bei 360 nm nach Anregung bei 295 nm verfolgt. Für beide Domänen erfolgte die Analyse der Daten nach einem Zweizustandsmodell. Die Messungen wurden bei 25 °C in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit einer Schichtdicke von 1 cm durchgeführt. Die Daten für fd G3P* IIHY und fd G3P* IIHY P213G wurden der Arbeit 79 entnommen. t (s) 0 100 200 300 relative Fluoreszenz 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 5000 10000 Ergebnisse und Diskussion 77 Erwartungsgemäß stimmen daher die Entfaltungsraten der N2-Domäne ausgehend von nativem fd G3P* IIHY P161A (●, Abbildung 3.1.18a) mit denen von fd G3P* IIHY überein (●, Abbildung 3.1.18a). Die schnelle Rückfaltung der N1-Domäne ist ebenfalls identisch mit der von fd G3P* IIHY (;, Abbildung 3.1.18a). Abbildung 3.1.18: Der Faltungsmechanismus des fd G3P* IIHY P161A. a) Aufgetragen sind die apparenten Entfaltungs- (gefüllte Symbole) und Rückfaltungsraten (offene Symbole) von fd G3P* IIHY (graue Symbole) bzw. fd G3P* IIHY P161A (farbige Symbole) in Abhängigkeit von der GdmCl-Konzentration. Die Entfaltungs- (●;●) und Rückfaltungsraten (;;;) von N2 des jeweiligen G3P* nach manueller Mischung gemessen. Die schnelle Rückfaltung der N2-Domäne ausgehend von vollständig entfaltetem fd G3P* IIHY P161A wurde zusätzlich an einer stopped-flow-Apparatur untersucht (). Gezeigt ist außerdem die Rückfaltung der N1-Domänen (;) sowie deren Entfaltung aus dem ungedockten Zustand des fd G3P* IIHY (), die über Doppelmischexperimente ermittelt wurde. Die konformationelle Faltung von N2 des fd G3P* IIHY wurde nach Rückfaltung für 0,5 s in 0,5 M GdmCl durch Verdünnung in niedrige GdmClKonzentrationen () gemessen. Die Entfaltung der N2-Domäne aus dem nicht assoziierten Zustand von fd G3P* IIHY ergab sich durch einen zweiten Sprung in Entfaltungsbedingungen (). Die Entfaltung der N2Domäne aus dem lose-assoziierten Zustand wurde nach einer Rückfaltungsdauer von 180 s in 0,5 M GdmCl und erneutem Sprung in Entfaltungsbedingungen über manuelle Mischung erhalten (;). Die Rate der Domänenassoziation von fd G3P* IIHY wurde, wie in Referenz 122 beschrieben, anhand eines ZweischrittEntfaltungstests für native Moleküle ermittelt (). Zu Vergleichszwecken aufgetragen sind außerdem die Entund Rückfaltungsraten der isolierten N2-Domäne Q129H (;). Bis auf die Entfaltungsraten von N2 aus dem nicht assoziierten Zustand wurden die Daten von fd G3P* IIHY der Publikation 122 entnommen. Die Reaktionen der N1-Domäne wurden anhand der Trp-Fluoreszenz oberhalb von 340 nm nach Anregung bei 295 nm verfolgt, die der N2-Domäne oberhalb von 320 nm nach Anregung bei 280 nm. Die Faltungsraten der N2-Domäne nach manueller Mischung wurden über die Messung der Fluoreszenz bei 310 nm erhalten. b) Rückfaltungskinetik der N2-Domäne in 0,5 M GdmCl ausgehend von vollständig entfaltetem fd G3P* IIHY P161A. Die Reaktion wurde bei 310 nm (Anregung 280 nm) gemessen. Die rote Linie stellt den Angleich einer triexponentiellen Funktion an die Daten mit Zeitkonstanten von = 2,4 s, 2 = 24,7 s und 3 = 5640 s da. c) Auftragung der Fluoreszenzamplituden der Tyrosinfluoreszenz der schnellen (), intermediären () und langsamen Rückfaltung () der N2-Domäne in fd G3P* IIHY P161A als Funktion der GdmCl-Konzentration. Die Messungen wurden in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit 1 µM Protein bei 25 °C durchgeführt. b) c) [GdmCl] (M) 0,5 1 1,5 2 relative Fluoreszenz 5 10 15 20 25 t (s) 0 50 100 150 200 relative Fluoreszenz 115 120 125 130 135 140 7000 14000 a) [GdmCl] (M) 0123456  (s -1 ) -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 1 1 10 2 10 Ergebnisse und Diskussion 78 Während der Rückfaltung nach manueller Mischung sind drei Phasen detektierbar (;;, Abbildung 3.1.18). Mit einer Zeitkonstante von 5640 s (in 0,5 M GdmCl) spiegelt die langsame Phase die Faltung von N2 durch die Pro213-limitierte Einnahme des gedockten Zustandes wider (, Abbildung 3.1.18b). Im Gegensatz zu fd G3P* IIHY ist diese Reaktion jedoch auch bei niedrigen GdmCl-Konzentrationen beobachtbar, allerdings nur mit einer geringen Amplitude (, Abbildung 3.1.18c). Dies zeigt, dass hier ein kleiner Teil der - Spezies während der Faltung nicht die native Konformation einnehmen kann. Ab 1,5 M GdmCl ergibt sich eine deutliche Zunahme der Amplitude, da die N2-Domäne bei diesen Denaturierungskonzentrationen nur noch durch die Einnahme des gedockten Zustandes ausreichend stabilisiert wird (, Abbildung 3.1.18c). Auffällig ist zudem, dass die Raten über den gesamten untersuchten Bereich unabhängig von der GdmCl-Konzentration sind. Die scheinbare Beschleunigung der langsamen Rückfaltung von fd G3P* IIHY bei geringen GdmCl-Konzentrationen kann demnach zum Teil auf die Isomerisierung von Pro161 und die damit verbundene Bildung der stabileren cis-Spezies zurückgeführt werden. Während der Rückfaltung des fd G3P* IIHY P161A ist noch eine weitere GdmClunabhängige Phase beobachtbar, deren Zeitkonstante mit 24,7 s in 0,5 M GdmCl der schnellen Verdrängung von TolAC-AEDANS aus dem Komplex mit N1 während der Rückfaltung des Proteins entspricht ( = 24 s, Abbildung 3.1.17, ). Wie bereits erwähnt ist die Denaturierungsmittelunabhängigkeit ein Anzeichen dafür, dass die Geschwindigkeit der entsprechenden Reaktion durch Prolylisomerisierungen limitiert ist.106; 153 Um dies zu überprüfen wurde die Katalysierbarkeit der Phase durch die Prolylisomerase hFKBP12+IF untersucht (Abbildung 3.1.19). Abbildung 3.1.19: Katalyse der Rückfaltung von fd G3P* IIHY P161A durch den Faltungshelfer hFKBP12+IF. Gezeigt sind die Rückfaltungskinetiken von 1 µM entfaltetem fd G3P* IIHY P161A in 0,6 M GdmCl in Abwesenheit (blau) bzw. Anwesenheit von 50 nM (rot), 200 nM (grün), 300 nM (orange) bzw. 1 µM (schwarz) des Faltungshelfers hFKBP12+IF. Die durchgezogenen Linien stellen den Angleich von biexponentiellen Gleichungen an die Daten mit folgenden Zeitkonstanten dar: (ohne) = 8,0 s, (ohne) = 38,5 s; (50 nM) = 6,5 s, (50 nM) = 34,8 s; (200 nM) = 4,4 s, (200 nM) = 30,8 s; (300 nM) = 3,7 s, (300 nM) = 23,5 s; (1 µM) = 2,0 s, (1 µM) = 8,0 s. Die Reaktionen wurden bei 310 nm nach Anregung bei 280 nm in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 bei 25 °C gemessen. t (s) 0 50 100 150 200 relative Fluoreszenz 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Ergebnisse und Diskussion 79 Tatsächlich wird nicht nur die intermediäre Phase ( = 38,5 s) durch die Prolylisomerase beschleunigt sondern auch die etwas schnellere Reaktion ( = 8,0 s). Letztere spiegelt einen Teil der konformationellen Faltung der N2-Domäne wider, welche ebenfalls mehrere Prolinreste beinhaltet (, Abbildung 3.1.18). Da Pro161 durch Alanin ersetzt wurde, stellt sich die Frage, welche Proline die langsame Reaktion verursachen. Bereits während der Rückfaltung von fd G3P* P161A war bei niedrigen GdmCl-Konzentrationen eine Reaktion mit ähnlicher Zeitkonstante und vergleichbar geringer Amplitude beobachtet worden (Abbildung 3.1.18), welche der bereits erwähnten, nachgelagerten cistrans-Isomerisierung von Prolinresten in der N2-Domäne zugeordnet wurde. Im Gegensatz zur stabilisierten Variante wird dadurch die Bindungsfähigkeit von TolAC-AEDANS an N1 kaum beeinflusst (Abbildung 3.1.14), da in diesem Protein der lose-assoziierte Zustand nicht populiert wird. Möglicherweise ist für die Einnahme der lose-assoziierten Form in den stabilisierten G3P*-Varianten die Konformationsänderung von einem oder mehreren Prolinresten in der Gelenkregion notwendig. Dieser Bereich des G3P* enthält neben Pro213 sechs weitere Proline. Die Analyse der Kristallstrukturen des WT fd G3P* und der hyperstabilen Variante 0SS-G3P*-stab161, die neben weiteren Substitutionen auch die vier stabilisierenden Austausche enthält, zeigt, dass im gedockten Zustand des G3P* nur die Prolinreste 161 und 213 in cis-Konformation vorliegen. Aufgrund des partiellen Doppelbindungscharakters ist die Aktivierungsenergie für die Rotation um die Peptidbindung sehr hoch.162 Es ist daher sehr unwahrscheinlich, dass während der Bildung des lose-assoziierten Intermediates zunächst ein Prolinrest in die cis-Form isomerisiert, um bei der abschließenden Assoziationsreaktion erneut die Konformation zu wechseln. Denkbar ist jedoch, dass die intermediäre Phase die nachgelagerte Isomerisierung von Prolinresten in der Gelenkregion widerspiegelt, die im entfalteten Zustand teilweise auch in der nicht nativen cis-Form vorkommen.153 In diesem Fall ist jedoch, entgegen früherer Vermutungen122, die Einnahme des langlebigen Intermediates keine sequenziell auf die Faltung des globulären Teils der N2Domäne folgende Reaktion. Vielmehr geht bereits während der schnellen Rückfaltungsphase ein großer Teil der -Spezies durch die gleichzeitig stattfindende partielle Strukturierung der Gelenkregion direkt in den lose-assoziierten Zustand über. Bekräftigt wird diese Annahme durch den Verlauf der entsprechenden Faltungsraten im stabilisierten Hintergrund. Bei allen drei hier gezeigten Varianten geht der Rückfaltungsast in den Entfaltungsast der loseassoziierten Spezies über, der nach Rückfaltung für 180 s in 0,5 M GdmCl und erneutem Sprung in Entfaltungsbedingungen ermittelt wurde (Abbildung 3.1.17 bzw. 3.1.18). Im Vergleich zur isolierten N2-Domäne Q129H ist in den Proteinen dadurch nicht nur der Übergangsmittelpunkt von N2 um mehr als 1 M zu höheren GdmCl-Konzentrationen verschoben sondern auch die Entfaltung der Domäne fast tausendfach verlangsamt (Abbildung 3.1.18). Zwar ist die N2-Domäne im geöffneten WT fd G3P* ebenfalls leicht gegenüber der isolierten Domäne stabilisiert, der Unterschied fällt jedoch deutlich geringer aus (Abbildung 3.1.3). Ergebnisse und Diskussion 80 Um den Zeitverlauf der Bildung des lose-assoziierten Zustandes zu ermitteln, wurden analog zu fd G3P* P213G Doppelmischexperimente durchgeführt, indem zunächst durch Verdünnung von entfaltetem fd G3P* IIHY bzw. fd G3P* IIHY P161A die Rückfaltung in 0,5 M GdmCl initiiert wurde. Nach variablen Zeitspannen wurde durch einen weiteren Sprung in 2,45 M GdmCl die Entfaltung der Moleküle anhand der Fluoreszenzänderung oberhalb von 320 nm nach Anregung bei 280 nm an einer stopped-flow-Apparatur verfolgt. Für beide Proteine wurden biexponentielle Kinetiken mit Zeitkonstanten von (IIHY) = 0,18 s und (IIHY) = 1,1 s bzw. (P161A) = 0,25 s und (P161A) = 1 s erhalten, deren Amplituden in Abbildung 3.1.20 in Abhängigkeit von der Rückfaltungsdauer aufgetragen sind (;). Die schnellere der beiden Phasen spiegelt vermutlich die Entfaltung der N2-Domäne aus dem nicht assoziierten Intermediat wider. Die Zeitkonstanten der zweiten Entfaltungsreaktionen stimmen mit denen der jeweiligen N2-Domäne aus dem lose-assoziierten Zustand überein, die aus Doppelmischexperimenten nach einer Rückfaltungsdauer von 180 s erhalten wurden (;, Abbildung 3.1.18) Abbildung 3.1.20: Zeitverlauf der Rückfaltung von N2 im fd G3P* IIHY bzw. fd G3P* IIHY P161A. Aufgetragen sind die Amplituden der schnellen () und langsamen () Entfaltungsphase von a) fd G3P* IIHY und b) fd G3P* IIHY P161A in 2,45 M GdmCl nach stopped-flow-Mischung in Abhängigkeit der Rückfaltungsdauer in 0,5 M GdmCl. Die Reaktionen wurden anhand der Fluoreszenz oberhalb von 320 nm nach Anregung bei 280 nm mit 1 µM Protein in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 bei 25 °C verfolgt. In 5,5 M GdmCl denaturiertes G3P* wurde dazu durch elffache Verdünnung in 0,5 M GdmCl über verschiedene Zeiten rückgefaltet und danach in 2,45 M GdmCl erneut entfaltet. Die durchgezogenen Linien stellen den Angleich biexponentieller Funktionen an die Daten dar. Für die Verläufe der Amplituden ergeben sich Zeitkonstanten von (IIHY) = 2,8 s und (IIHY) = 3,9 s bzw. (P161A) = 1,3 s, (P161A) = 1,6 s. Die schnellere Phase hat zwar nur eine sehr geringe Amplitude (, Abbildung 3.1.20), sie zeigt jedoch an, dass, analog zum WT fd G3P*, auch in beiden stabilisierten Varianten im geringen Maße ein nicht assoziierter Zustand populiert wird. Zumindest für fd G3P* IIHY ergaben sich nach kurzer Rückfaltung in 0,5 M GdmCl und erneutem Sprung in Entfaltungsbedingungen die Raten des entsprechenden Entfaltungsastes (, Abbildung 3.1.18). Im fd G3P* IIHY P161A konnte dagegen dieser Verlauf aufgrund der geringen Signaländerung nicht aufgelöst werden. a) b) Rückfaltungsdauer (s) 0 5 10 15 20 25 Amplitude der Entfaltung 0 0,1 0,2 0,3 Rückfaltungsdauer (s) 0 5 10 15 20 25 Amplitude der Entfaltung 0 0,1 0,2 0,3 Ergebnisse und Diskussion 81 Der Verlauf der in Abbildung 3.1.20 gezeigten Amplituden macht deutlich, dass sowohl die nicht assoziierte als auch die lose-assoziierte Form mit etwa der gleichen Zeitkonstante gebildet wird. Die Zeitkonstanten liegen mit (IIHY) = 2,8 s und (IIHY) = 3,9 s bzw. (P161A) = 1,3 s, (P161A) = 1,6 s jeweils im Bereich der entsprechenden schnellen Rückfaltungsreaktionen der N2-Domänen von fd G3P* IIHY und fd G3P* IIHY P161A. Wie bereits in den Rückfaltungsexperimenten ausgehend von nativem Protein beobachtet, ist auch hier die Faltung von N2 in fd G3P* IIHY P161A leicht beschleunigt. Die Ursache der im Vergleich zum fd G3P* IIHY verringerten Signaländerung der schnell entfaltenden Form im Zweischritt-Entfaltungstest (Abbildung 3.1.20) liegt vermutlich am Fehlen der stabileren cisSpezies, die im Gegensatz zur trans-Form in 0,5 M GdmCl vollständig in den nativen Zustand übergeht. Die Raten und Amplituden der schnellen Entfaltungsphase von fd G3P* IIHY P161A sind daher sehr stark fehlerbehaftet und können lediglich als Anhaltpunkte betrachtet werden. Das Auftreten der nicht assoziierten Spezies deckt sich mit der Beobachtung, dass ein kleiner Teil der Moleküle des fd G3P* IIHY P161A in 0,5 M GdmCl erst durch die nachgelagerte Isomerisierung von Prolinresten in der Gelenkregion in den stabileren loseassoziierten Zustand übergehen und damit TolAC-AEDANS verdrängen kann. Die Stabilität der isolierten N2 Q129H zeigt dabei an, dass die Domäne unter diesen Bedingungen auch ohne zusätzliche günstige Wechselwirkungen mit N1 zumindest teilweise falten kann. Ob die lose-assoziierte Form in Verlauf des weiteren Faltungsvorganges vollständig eingenommen wird, konnte anhand des Doppelmischexperimentes nicht aufgelöst werden. Sowohl die auch bei geringen Denaturierungsmittelkonzentrationen detektierbare Pro213-limitierte Faltungsreaktion der P161A-substitutierten Variante als auch der Verlauf der langsamen Rückfaltung von fd G3P* IIHY lassen jedoch schlussfolgern, dass zumindest ein geringer Anteil der Population nicht als stabilisiertes Intermediat vorliegt. Ergebnisse und Diskussion 82 3.2 Aktivierung des fd Phagen G3P* durch Prolin-gekoppelte Entfaltung Die Rückfaltungsexperimente der verschiedenen G3P*-Varianten in Gegenwart von TolACAEDANS haben deutlich gemacht, dass die Wechselwirkung der N1-Domäne mit dem sekundären Rezeptor TolAC sehr stark vom Faltungszustand und damit von der Stabilität der N2-Domäne abhängt. Tatsächlich konnte bereits Barbara Eckert unter anderem anhand der Infektion von sowohl pilushaltigen als auch pilusfreien E. coli Zellen durch Phagen mit unterschiedlich stabilen G3P*-Varianten zeigen, dass die Faltung und Stabilität des Proteins auf die Funktion in vivo abgestimmt ist.79; 96; 97 Sie schlussfolgerte, dass stabilisierte Phagen gegenüber dem Wildtyp-Phagen im Nachteil sind, da in ihrem G3P* die Aktivierung durch Domänendissoziation und Entfaltung der Gelenkregion aufgrund der stabilisierenden Substitutionen erschwert ist. Die Ergebnisse des vorangegangenen Kapitels bekräftigen diese Vermutungen. Entgegen früherer Annahmen liegt das langlebige Intermediat von WT fd G3P* mit trans-Pro213 nämlich offen, und nicht wie die stabilisierte Variante bereits in lose-assoziierter Form vor, wodurch die Interaktionsfläche für TolAC auf der N1-Domäne des Wildtyp-Protein in diesem Zustand besser zugänglich ist. Im Vergleich zur offenen Form ist die Interaktionsfähigkeit der gedockten Form des G3P* gegenüber TolAC deutlich herabgesetzt. Im Folgenden sollte zunächst durch Bestimmung der Dissoziationskonstante (KD) quantifiziert werden, wie sich die verschiedenen Faltungszustände des G3P* in ihrer Affinität für die C-terminale Domäne von TolA unterscheiden und welchen Einfluss dabei die vier stabilisierenden Substitutionen des fd G3P* IIHY in der Gelenkregion bzw. in den beiden Domänen auf die Wechselwirkung zwischen dem G3P* und TolAC haben. 3.2.1 Die Population des aktiven Intermediates erhöht die Affinität der N1-Domäne des G3P* für TolAC Zur Ermittlung der KD-Werte der Komplexe aus TolAC und WT fd G3P*, fd G3P* IIHY, ihren Faltungsintermediaten sowie der jeweiligen isolierten N1-Domäne wurde das in Kapitel 3.1.7 beschriebene Energietransfersystem verwendet. Nach Anregung der Tyrosinbzw. Tryptophanreste des G3P* bei 280 nm diente die Änderung der Fluoreszenz der AEDANS-Gruppe als Sonde der Interaktion. Entsprechende Gleichgewichtstitrationen, bei denen die Konzentration des Donors variiert worden war, hatten bereits verdeutlicht, dass die isolierte N1-Domäne mit der stabilisierenden Substitution T13I eine sehr hohe Affinität zu TolAC-AEDANS hat (KD = 0,49 µM). Der zunächst für das native WT fd G3P* erhaltene Wert war mit 3,9 µM achtfach schlechter.79 Anhand einer Verdrängungstitration mit unmarkiertem TolAC zur Freisetzung von TolAC-AEDANS aus dem Komplex mit N1 konnte zudem nachgewiesen werden, dass die Modifikation mit dem Fluorophor AEDANS die Affinität von TolAC gegenüber der N1-Domäne nur geringfügig beeinflusst.79 In weiterführenden Experimenten stellte sich heraus, dass geringe Verunreinigungen mit freiem AEDANS das Fluoreszenzsignal stark beeinflussen (Daten nicht aufgeführt). Die Ergebnisse und Diskussion 83 Komplexbildung zwischen 0,2 µM TolAC-AEDANS und zunehmenden Donorkonzentrationen in Bereich von 0 bis 15 µM wurde deshalb nach stopped-flow-Mischung in ihrem Zeitverlauf analysiert. Wie bereits für die isolierte Domäne N1 T13I und die Deletionsvariante G3P* IIHY 6 gezeigt, ergeben sich dabei nach geeigneter Mischung der Bindungspartner für die Fluoreszenz oberhalb von 460 nm nach Anregung bei 280 nm Reaktionsverläufe pseudo-erster Ordnung.79; 80 Da die Bindung des TolAC-Proteins an die N1-Domäne von deren Zugänglichkeit und damit der spontanen Dissoziation der Domänen des G3P* abhängt, können bereits mit geringen Konzentrationen an isolierter und damit frei zugänglicher N1bzw. N1 T13IDomäne Assoziationskinetiken detektiert werden (Abbildung 3.2.1). Natives WT fd G3P* liegt dagegen fast ausschließlich im gedockten Zustand vor, weshalb deutlich höhere Proteinkonzentrationen benötigt werden, um die Bindung an TolAC-AEDANS verfolgen zu können (Abbildung 3.2.1b). In fd G3P* IIHY ist der TM-Wert der N2-Domäne, der gleichzeitig auch die Domänendissoziation und die Entfaltung der Gelenkregion reflektiert, deutlich von 48,0 auf 61,2 °C erhöht.121 Die Stabilisierung des assoziierten Zustandes führt dazu, dass selbst in Gegenwart von 15 µM fd G3P* IIHY keine Bindungskinetik beobachtbar ist (Abbildung 3.2.1b). Abbildung 3.2.1: Interaktion von TolAC-AEDANS mit der N1-Domäne verschiedenen G3P*-Varianten. Assoziationsreaktionen von 0,2 µM TolAC-AEDANS mit a) ansteigenden Konzentrationen (0; 0,2; 0,8; 1,5 bzw. 3 µM) an isolierter N1 T13I und b) 2,5; 7,5 µM bzw. 15 µM WT fd G3P* (schwarz) sowie 15 µM fd G3P* IIHY (rot). Die Bindung wurde jeweils nach Förster-Resonanz-Energie-Transfer von den in N1 enthaltenen TrpResten auf TolAC-AEDANS anhand der AEDANS-Fluoreszenz oberhalb von 460 nm nach Anregung bei 280 nm verfolgt. Die Messungen erfolgten bei 25 °C nach schneller Mischung an einer stopped-flow-Apparatur in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0, 0,1 M GdmCl. Durch Angleich monoexponentieller Funktionen an die Kinetiken lassen sich die jeweilige Amplitude und Rate in Abhängigkeit der Donorkonzentration bestimmen (Abbildung 3.2.2). Über den Verlauf der unter Bedingungen pseudo-erster Ordnung erhaltenen apparenten Raten kann nach linearer Regression die Dissoziationskonstante ermittelt werden. Der Achsenabschnitt der aus dem Verlauf der Raten resultierenden Gerade entspricht der mikroskopischen Rate der Dissoziation (koff), die Steigung der Assoziationsrate (kon). Der Quotient von koff und kon ergibt KD (Gleichung 34). Dieser kann zudem unabhängig davon aus a) b) t (s) 02468 relative Fluoreszenz 4 5 6 7 t (s) 00,511,52 relative Fluoreszenz 4 5 6 7 Ergebnisse und Diskussion 90 Die Schutzfaktoren der Reste im aktiven Zustand wurden anhand der Kompetition zwischen Faltung und H/D-Austausch ermittelt, indem entfaltetes WT fd G3P* zunächst in 1 M GdmCl und 100 % H2O für 5 min rückgefaltet wurde. Nach der Überführung in D2Ohaltigen Puffer wurde nach 10 Stunden ein 15N TROSY-HSQC-Spektrum aufgenommen. Als Referenz diente ein unter den gleichen Bedingungen gemessenes Spektrum des nativen G3P*. Über den Vergleich der Intensitäten der verbleibenden NH-Kreuzsignale wurden, wie in Referenz 62 beschrieben, die Schutzfaktoren berechnet (Abbildung 3.2.4b). In der vollständig gefalteten und damit gedockten Form bilden die Domänen eine kooperative Einheit, weshalb N1 und N2 vergleichbar hohe Schutzfaktoren aufweisen (Abbildung 3.2.4a). Im Gegensatz zur stabilisierten Variante fd G3P* IIHY62 sind jedoch die Werte für die am stärksten geschützten Amidprotonen um eine Größenordnung verringert, was einer Abnahme der freien Enthalpie um 5,7 kJ mol-1 entspricht. Zudem wird im WT fd G3P* die Gelenkregion durch die cis-Pro213 bedingte Interaktion der N-terminalen Domänen nicht so deutlich stabilisiert wie in fd G3P* IIHY. Der Stabilitätsunterschied der Reste im aktiven Intermediatszustand fällt noch deutlicher aus. Während in der stabilisierten Variante durch die lose Assoziation von N1 und N2 ein großer Teil der AS beider Domänen noch immer ähnlich gut geschützt ist, sind im Ausgangsprotein vor allem die Schutzfaktoren der Amidprotonen von N2 deutlich reduziert (Abbildung 3.2.4b). Die Werte für den globulären Teil sind dabei um Faktor zehn verringert, über die Schutzfaktoren der Reste der Gelenkregion liegen aufgrund der stark verringerten Stabilität keine Informationen vor.62 Ein ähnliches Ergebnis ergibt sich für WT fd G3P* in Gegenwart eines vierfachen Überschusses an TolAC (Abbildung 3.2.4c). Die Interaktion von N1 mit TolAC führt zur Dissoziation der Domänen und damit zur Population des geöffneten Zustandes, weshalb die AS der Gelenkregion wiederum vollkommen ungeschützt sind. Die Schutzfaktoren von N2 befinden sich mit Werten unter 100 ebenfalls im Bereich derer der nicht assoziierten Form. Einzig die Reste der N1-Domäne weisen zum Teil erhöhte Werte auf, was vermutlich indirekt bedingt wird durch die Wechselwirkung mit TolAC. 3.2.3 Sequenzvariationen um den Prolinschalter führen zur Dissoziation der N-terminalen Domänen Die Übereinstimmung der Schutzfaktoren des langlebigen Rückfaltungsintermediates von WT fd G3P* mit denen seiner nativen Form in Gegenwart von TolAC zeigt, dass durch die Bindung von TolAC die stark stabilisierende Domänenassemblierung aufgelöst werden kann. Die unterschiedlichen Affinitäten des WT fd G3P* und der stabilisierten Variante in diesem Zustand (Tabelle 3.2.1) weisen gleichzeitig darauf hin, dass unter anderem auch die Stabilität der Gelenkregion über die Interaktionsfähigkeit entscheidet. Um zu untersuchen, wie sich die Veränderung der Stabilität und des Faltungsmechanismus auf die Funktionalität des G3P auswirken, wurde die lokale Sequenz um Pro213 variiert (Abbildung 3.2.5). In der Variante fd G3P* APA wurden dazu von Johanna Koch die zu Pro213 benachbarten Reste Gln212 und Ergebnisse und Diskussion 91 Pro213 Thr13 Gln129 Thr101 Asp209 Pro214 Gln212 6 Pro214 gegen Alaninreste ausgetauscht. Die Variante fd G3P* AGA, die von Roman Jakob hergestellt wurde, enthält zusätzlich dazu die P213G-Substitution. Abbildung 3.2.5: Tertiärstruktur des N1N2-Fragments von WT fd G3P*. Die Reste der Schalterregion Gln212, Pro213 und Pro214 sowie die Positionen der stabilisierenden Substitutionen im fd G3P* IIHY sind als Stäbchen-Modelle gezeigt. Die N1-Domäne ist in rot, der globuläre Teil von N2 in dunkelblau und die Gelenkregion in grün dargestellt. Der in der Variante fd G3P* IIHY 6 deletierte Faltblattstrang der Gelenkregion ist in hellblau gezeigt. Die Abbildung wurde anhand der PDBStruktur 2G3P60 mit dem Programm Pymol123 erstellt. Der Austausch von Gln212 bzw. Pro214 gegen Alanin führt jeweils zu einer zweibzw. dreifachen Beschleunigung der Isomerisierungsreaktion an Pro213. Durch die Q212ASubstitution wird außerdem das im assoziierten Zustand gebildete Wasserstoffbrückennetzwerk zwischen der Gelenkregion und der N1-Domäne geschwächt, da die Seitengruppe des Gln212 gleich zwei Wasserstoffbrücken zu Gln52 in der N1-Domäne ausbildet, wenn Pro213 in cis-Konformation vorliegt.120 Die Kombination der beiden Substitutionen hat auf WT fd G3P* und fd G3P* IIHY sehr unterschiedliche Auswirkungen. Während in fd G3P* IIHY APA trotz der starken Destabilisierung von N2 beide Domänen weiterhin in gedockter Konformation vorliegen (Tabelle 3.2.2)126, entfaltet die N1-Domäne im fd G3P* APA unabhängig von N2 (Johanna Koch, persönliche Mitteilung). In letzterem Fall ist nicht nur der Übergangsmittelpunkt der labileren Domäne deutlich von 48,0 °C auf 36,8 °C verringert sondern auch die Enthalpie der Entfaltung. Mit 331 kJ mol-1 liegt H im Bereich der Enthalpie der isolierten N2-Domäne (304 kJ mol-1), was bestätigt, dass zwischen den N-terminalen Domänen des nativen fd G3P* APA kaum noch Interaktionen vorhanden sind. Eine vollständige Entkopplung der Domänen wie bei der Variante fd G3P* IIHY 6, in der durch die Deletion des in der Gelenkregion gelegenen sechsten -Faltblattstranges (Abbildung 3.2.5) die Stabilität der N2Domäne auf das Niveau von isolierter N2 Q129H herabgesetzt ist (Tabelle 3.2.2), liegt jedoch nicht vor.151 Gegenüber der isolierten N2-Domäne ist der TM-Wert der N2-Domäne des fd G3P* APA jedoch nur um 2 °C erhöht. Ergebnisse und Diskussion 92 Die zusätzliche Substitution des Pro213 durch Glycin in fd G3P* AGA wirkt sich im Vergleich dazu leicht stabilisierend aus, wobei auch die Enthalpie mit 470 kJ mol-1 deutlich erhöht ist. Der TM-Wert von fd G3P* AGA ähnelt mit 37,9 °C dem TM-Wert der Variante fd G3P* P213G (Tabelle 3.2.2), die teilweise in geöffneter Form vorkommt. Dies ist deshalb bemerkenswert, da durch die drei Substitutionen die gesamte Schaltersequenz entfernt ist. Die destabilisierenden Effekte der drei Austausche an den Positionen Gln212-Pro214 sind demnach nicht additiv. Die P213G-Substitution alleine führte zu einer deutlichen Verringerung der Stabilität, nicht nur im Wildtyp-Protein sondern auch in der stabilisierten Variante IIHY.79 Die Auswirkung der Substitution der zu Pro213 benachbarten Reste ist demnach enorm vom Kontext abhängig. Tabelle 3.2.2: Thermische Stabilitätsdaten von WT fd G3P* und verschiedenen G3P*-Varianten Domänendissoziation und Entfaltung der N2-Domäne Entfaltung der N1-Domäne Variante TM (°C) H (kJ mol-1) G55°C (kJ mol-1) TM (°C) H (kJ mol-1) G65°C (kJ mol-1) isolierte N1 - - - 62,3 234 -1,9 isolierte N1 T13I - - - 67,5 235 1,7 isolierte N2 34,6 304 -25,4 - - - isolierte N2 Q129H 38,8 344 -21,2 - - - WT fd G3P* 48,0 612 -14,1 60,2 230 -3,3 fd G3P* APA 36,8 331 -24,6 59,9 227 -3,5 fd G3P* AGA 37,9 470 -30,4 58,6 189 -3,7 fd G3P* P213G 37,8 442 -29,1 60,2 225 -3,3 fd G3P* IIHY 61,2 644 11,4 66,0 228 0,7 fd G3P* IIHY APA 53,5 453 -2,1 67,0 228 1,3 fd G3P* IIHY 6 36,7 285 -21,1 64,1 202 -0,5 Angegeben sind für die G3P*-Varianten bzw. isolierten Domänen die Schmelztemperaturen TM, die Enthalpien der jeweiligen Enfaltungsreaktion am TM (H) und die freien Enthalpien der Entfaltung G55°C und G65°C bei 55 °C bzw. 65 °C. Die Übergänge der N2-Domänen (isoliert oder im G3P*), welche über die Änderung des CDSignals bei 210 nm verfolgt wurden, wurden gemäß eines Zweizustandsmodells analysiert. Die Daten für die N1-Domänen in den G3P*-Varianten wurden nach Auswertung des biphasischen Entfaltungsübergangs, der anhand des CD-Signals bei 230 nm gemessen wurde, gemäß eines Dreizustandsmodells erhalten. Der erste Übergang spiegelt die Entfaltung der N2-Domäne sowie die Dissoziation der Domänen wider, der zweite Übergang die Denaturierung der N1-Domäne. Der Übergang der isolierten N1-Domänen wurde über die Änderung des CD-Signals bei 230 nm gemessen und gemäß eines Zweizustandsmodells ausgewertet. Zur Auswertung der Entfaltungsübergänge wurde für die G3P*-Varianten eine konstante Änderung der Wärmekapazität Cp von 10000 J mol-1 K-1 für N2 und für N1 1000 J mol-1 K-1 angenommen, für die isolierten N2-Domänen wurden Cp-Werte von 8000 J mol-1 K-1 und für die isolierten N1-Domänen 1000 J mol-1 K-1 verwendet. Die Daten für WT fd G3P*, isolierte N1 T13I und fd G3P* IIHY wurden der Referenz 121 entnommen. Die Stabilitätsparameter von fd G3P* IIHY 6 bzw. isolierter N1-Domäne wurden aus den Arbeiten 80 bzw. 152 erhalten. Die Werte für die Domänen des fd G3P* IIHY APA bzw. N1 der Variante fd G3P* P213G entstammen den Referenzen 126 und 79. Die Daten von isolierter N2 Q129H wurden der Referenz 151 entnommen, die Werte für die Varianten fd G3P* APA und fd G3P* AGA sind persönliche Mitteilungen von Johanna Koch bzw. Roman Jakob. Die Übergänge von 4 µM Protein (1 µM bei 210 nm) wurden in 0,1 M KPPuffer, pH 7,0 mit einer Schichtdicke von 1 cm, einer Heizrate von 60 °C h-1 und einer Dämpfung von 8 s gemessen. Die während der Rückfaltung der Variante fd G3P* P213G beobachtete Domänenassoziationsreaktion war der Isomerisierung von Prolinresten wie Pro214 in der Ergebnisse und Diskussion 93 Gelenkregion zugeschrieben worden. Ob trotz des Ersatzes dieses Restes eine entsprechende Assoziationsreaktion während der Strukturierung von fd G3P* AGA detektierbar ist, wurde anhand der Entund Rückfaltungskinetiken dieser Variante näher untersucht (Abbildung 3.2.6a). Die schnelle Rückfaltung von N1 und des globulären Teils von N2 sind durch den Austausch der Schaltersequenz nicht beeinflusst (;;, Abbildung 3.2.6a). Wie jedoch schon für die Variante fd G3P* P213G beobachtet, ist nach manueller Mischung die durch die Isomerisierung von Pro161 limitierte Entfaltung auch ausgehend von nativem Protein detektierbar (, Abbildung 3.2.6a). Die dieser Reaktion nachgelagerte Phase mit geringer Amplitude besitzt eine GdmCl-unabhängige Zeitkonstante im Bereich von 1000 s (●, Abbildung 3.2.6a). Ihre Raten gehen demnach bei höheren Denaturierungsmittelkonzentrationen nicht in den Entfaltungsast der N1-Domäne über (, Abbildung 3.2.6a). Die Entfaltung der N2-Domäne im fd G3P* AGA oberhalb von 1 M GdmCl ist vielmehr bereits nach schneller Mischung auflösbar, wobei der entsprechende Ast geringfügig zu höheren GdmCl-Konzentrationen verschoben ist (, Abbildung 3.2.6a). Dies deckt sich mit dem Befund, dass die Entfaltungsraten von N1 im fd G3P* AGA mit denen der isolierten N1Domäne übereinstimmen und N1 damit von N2 entkoppelt ist (, Abbildung 3.2.6a). Abbildung 3.2.6: Analyse der Faltungsund Entfaltungsraten des fd G3P* AGA und fd G3P* APA. Auftragung der apparenten Entfaltungs- (gefüllte Symbole) und Rückfaltungsraten (offene Symbole) von a) fd G3P* AGA bzw. b) fd G3P* APA (jeweils farbige Symbole) sowie jeweils der entsprechenden Raten des WT fd G3P* (graue Symbole) in Abhängigkeit von der GdmCl-Konzentration. Die Entfaltungs- (●;;●;●) und Rückfaltungsraten (;;;) der N2-Domäne des jeweiligen G3P* wurden nach manueller Mischung gemessen. Gezeigt sind außerdem die schnelle Rückfaltung der N1-Domänen (;), die konformationelle Faltung der jeweiligen -Spezies (;) ausgehend von entfaltetem Protein sowie die Entfaltung von N1 aus dem nativen Zustand (;) nach stopped-flow-Mischung. Die Entfaltung der -Spezies aus dem nicht assoziierten Zustand () konnte bereits in Einzelmischexperimenten nach schneller Mischung detektiert werden. Im WT fd G3P* sind diese Raten dagegen erst nach Rückfaltung für 20 bzw. 150 s in 0,5 M GdmCl und erneuter Überführung in Entfaltungsbedingungen beobachtbar (;). Zu Vergleichszwecken aufgetragen sind außerdem die Entfaltungsraten der N1-Domäne () im ungedockten WT fd G3P* sowie die Entund Rückfaltungsraten der isolierten N2-Domäne (;). Einige der Daten des WT fd G3P* wurden, wie in Abbildung 3.1.2 beschrieben, der Diplomarbeit von Roman Jakob150 entnommen. Die Reaktionen der N1-Domäne nach schneller Mischung wurden anhand der Trp-Fluoreszenz oberhalb von 340 nm nach Anregung bei 295 nm verfolgt, die der N2-Domäne oberhalb von 320 nm nach Anregung bei 280 nm. Die Faltungsraten der N2-Domäne nach manueller Mischung wurden über die Messung der Fluoreszenz bei 310 nm erhalten. Die Messungen wurden in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit 1 µM Protein bei 25 °C durchgeführt. a) b ) [GdmCl] (M) 012345  (s -1 ) -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 1 1 10 2 10 3 10 [GdmCl] (M) 012345  (s -1 ) -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 1 1 10 2 10 3 10 Ergebnisse und Diskussion 94 Durch die nach manueller Mischung zusätzlich detektierbare Faltungsreaktion von fd G3P* AGA wird N2 nur leicht stabilisiert. Im Gegensatz zu fd G3P* P213G liegt hier jedoch keine Mischung aus offener und stabilisierter, gedockter Spezies vor. Demnach beeinflusst Pro214 in Abwesenheit des ursprünglichen Schalters Pro213 tatsächlich die Faltung hin zum assoziierten Zustand. Durch die zusätzliche Substitution der Reste, die Pro213 flankieren, wird auch Pro214 entfernt. Dadurch erhöht sich die Flexibilität der Gelenkregion, und fd G3P* AGA kann eine gegenüber der offenen Spezies des WT fd G3P* stabilisierte Konformation einnehmen. Die Kombination der Substitutionen Q212A und P214A hat einen noch gravierenderen Effekt auf den Faltungsmechanismus des WT fd G3P*. Die während der Rückfaltung transient gebildete trans-Pro213-Spezies ist deutlich instabiler als die des fd G3P* AGA bzw. WT fd G3P* (, Abbildung 3.2.6b). Das bedeutet, dass während der Faltung günstige Interaktionen zu N1 bzw. Resten der Gelenkregion nicht ausgebildet werden können. Ursache ist vermutlich die Kombination aus beschleunigter Einnahme der cis-Konformation des Pro213 und dessen Starrheit, wodurch die für Umstrukturierungen wie im fd G3P* AGA während der frühen Faltungsphase notwendige Flexibilität nicht gegeben ist. Wie bei fd G3P* AGA sind im fd G3P* APA nach manueller Mischung wieder die Isomerisierungsreaktion von Pro161 und die nachgelagerte Rückfaltungsphase mit einer Zeitkonstante im Bereich von 1000 s detektierbar (;, Abbildung 3.2.6b). Beide führen zu einer Stabilisierung der N2-Domäne, allerdings nicht so stark wie bei der N2-Domäne im fd G3P* AGA. Die Entfaltungsraten von N2 stimmen vielmehr mit denen des cis-Konformers des Wildtyp-Proteins überein (, Abbildung 3.2.6b). Wie anhand der NMR-Experimente gezeigt, sind die Domänen in diesem Zustand fast vollständig unabhängig voneinander. Die molekulare Ursache für die langsame Rückfaltungsreaktion mit einer Zeitkonstante von 1000 s ist für beide Proteine nicht bekannt (, Abbildung 3.2.6). Möglicherweise sind Prolinreste in der Gelenkregion dafür verantwortlich. 3.2.4 Die Substitution der Schaltersequenz hat gravierende Auswirkungen auf die Interaktion mit TolAC-AEDANS Die Unterschiede in den Faltungsmechanismen von fd G3P* APA und fd G3P* AGA spiegeln sich auch in ihrer Rückfaltung in Gegenwart von TolAC-AEDANS wider (Abbildung 3.2.7). Da die Substitutionen in der Gelenkregion lokalisiert sind, ist ihr Einfluss auf die Stabilität von N1 sehr gering (Tabelle 3.2.2). Die Affinität der Proteine zu TolACAEDANS ist demzufolge auch hier abhängig von der Population an nicht assoziierten Molekülen, in denen die Interaktionsfläche auf N1 für TolAC exponiert ist. In vollständig gefaltetem fd G3P* APA sind zwischen den Domänen fast keine Interaktionen vorhanden. Während der Strukturierung dieser Variante kommt es daher lediglich zu einer geringfügigen Verdrängung von TolAC-AEDANS innerhalb der ersten 300 s (Abbildung 3.2.7). Weder die Strukturierung von N2 durch die Bildung der stabileren Spezies mit cis-Pro161 noch die Konformationsänderung während der nachgelagerten Ergebnisse und Diskussion 95 Faltungsreaktion führen demnach zu einer signifikanten Verdrängung von TolAC und damit der Abnahme des Fluoreszenzsignals der AEDANS-Gruppe. Abbildung 3.2.7: Freisetzung von TolAC-AEDANS bei der Faltung von fd G3P* AGA bzw. fd G3P* APA. Gezeigt sind die Kinetiken der Verdrängung von TolAC-AEDANS während der Rückfaltung von fd G3P* AGA (schwarz) und fd G3P* APA (blau). Die Reaktionen wurden nach elffacher Verdünnung des jeweiligen denaturierten Proteins (11 µM in 5,5 M GdmCl) in Gegenwart von 1 µM TolAC-AEDANS anhand der AEDANS-Fluoreszenz bei 490 nm nach Anregung bei 280 nm verfolgt. Die rote Linie stellt den Angleich biexponentieller Funktionen an die Daten des fd G3P* AGA mit Zeitkonstanten von 1 = 96 s und 2 = 1250 s dar. Die Messungen wurden bei 25 °C in 0,1 M KP-Puffer, 0,5 M GdmCl, pH 7,0 mit einer Schichtdicke von 1 cm durchgeführt. Die Freisetzung von TolAC-AEDANS aus dem Komplex mit N1 der Variante fd G3P* AGA erfolgt dagegen in zwei Phasen, wobei die erste Reaktion die Hauptamplitude besitzt (Abbildung 3.2.7). Die Zeitkonstante dieser schnellen Phase entspricht mit 96 s der Isomerisierungsreaktion von Pro161. Die nachgelagerte Signaländerung ist zwar deutlich geringer, sie bestätigt jedoch, dass die Moleküle des fd G3P* AGA in einen stärker assoziierten Zustand übergehen, wodurch TolAC-AEDANS verdrängt wird. Die Zeitkonstante der Reaktion liegt mit 1250 s (in 0,5 M GdmCl) im Bereich der Assoziationsreaktion von fd G3P* P213G (752 s; Kapitel 3.1.7, Tabelle 3.1.3). Dies weist darauf hin, dass in den P213G-substituierten Varianten nicht ausschließlich Pro214 für die Einnahme zumindest einer leicht assoziierten Form verantwortlich ist. Wie in Kapitel 3.1.7 angedeutet, können aus den Amplituden der Reaktionsverläufe keine direkten Rückschlüsse auf die Affinitäten der Varianten für TolAC gezogen werden, da zum Teil bereits durch die Strukturierung von N2 in der Totzeit des Experimentes die Bindung von TolAC-AEDANS an N1 beeinträchtigt wird. Aus diesem Grund wurden analog zum WT fd G3P* und fd G3P* IIHY über die Messung der Assoziationskinetiken die KD-Werte der im Bereich des Pro213 substituierten Proteine bestimmt (Tabelle 3.2.3). t (s) 0 100 200 relative Fluoreszenz 20 40 60 80 2500 5000 7500 Ergebnisse und Diskussion 96 Tabelle 3.2.3: Interaktion von TolAC-AEDANS mit den verschiedenen G3P*-Varianten. Variante kon (µM-1s-1) koff (s-1) koff/kon (µM) KD (µM) isolierte N1 0,86 ± 0,01 0,26 ± 0,03 0,30 0,31 ± 0,02 isolierte N1 T13I 1,21 ± 0,02 0,16 ± 0,03 0,13 0,19 ± 0,01 WT fd G3P* 0,003 ± 0,001 0,51 ± 0,01 171 22,1 ± 6,6 fd G3P* APA 0,65 ± 0,01 0,37± 0,01 0,57 0,44 ± 0,02 fd G3P* AGA 0,19 ± 0,01 0,31 ± 0,01 1,68 1,26 ± 0,05 fd G3P* IIHY APA n. d. n. d. n. d. 31 ± 21 WT fd G3P* - Intermediat 0,19 ± 0,01 0,29 ± 0,01 1,54 1,85 ± 0,12 fd G3P* IIHY - Intermediat 0,006 ± 0,001 0,28 ± 0,01 48 13,6 ± 1,8 fd G3P* IIHY keine Assoziationskinetiken detektierbar Angegeben ist jeweils der aus der Analyse der Amplituden nach Gleichung 43 erhaltene KD-Wert sowie die mikroskopischen Raten koff und kon aus der Auswertung der Auftragung der apparenten Assoziationsraten. Deren Quotient ergibt ebenfalls die Dissoziationskonstante des Komplexes aus dem jeweiligen G3P* und 0,2 µM TolAC-AEDANS. Die entsprechenden Assoziationskinetiken wurden nach Anregung bei 280 nm anhand der Änderung der AEDANS-Fluoreszenz oberhalb von 460 nm in stopped-flow-Mischexperimenten verfolgt. (n. d.: keine Auswertung möglich). Alle Messungen wurden bei 25 °C in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0, 0,1 M GdmCl durchgeführt. Beide Proteine, fd G3P* AGA und fd G3P* APA, besitzen relativ zu nativem WT fd G3P* eine deutlich höhere Affinität für TolAC-AEDANS, was hauptsächlich auf höhere Assoziationsraten zurückgeführt werden kann. Die Dissoziationskonstante der dreifachsubstituierten Variante fd G3P* AGA liegt dabei mit 1,68 µM im Bereich des KDWertes des lose assoziierten WT fd G3P* (1,85 µM). Relativ zur isolierten N1-Domäne ist die Bindungsfähigkeit der Variante nur sechsfach verringert. Demnach sind die zusätzlichen stabilisierenden Wechselwirkungen im fd G3P* AGA über den nicht assoziierten Zustand hinaus relativ schwach. Die Variante fd G3P* APA bindet noch besser an TolAC-AEDANS. Im Vergleich zur isolierten N1-Domäne ist die Dissoziationskonstante nur unwesentlich von 0,31 µM auf 0,44 µM erhöht (Tabelle 3.2.3), was noch einmal bestätigt, dass die Domänen in dieser Variante im Wesentlichen unabhängig voneinander vorliegen. Im fd G3P* IIHY führen die Substitutionen der beiden zu Pro213 benachbarten Reste dazu, dass im untersuchten Konzentrationsbereich zumindest Kinetiken der Assoziation von TolAC-AEDANS und fd G3P* IIHY APA detektiert werden können. Der aus den Amplituden ermittelte KD-Wert von 31 µM ist zwar sehr stark fehlerbehaftet, er bekräftigt jedoch, dass auch in dieser Variante die Stärke der Domänenassoziation durch die beiden Alanin-Substitutionen stark herabgesetzt wird. Im Gegensatz zum WT fd G3P* können die ebenfalls enthaltenen Substitutionen T101I und D209Y in der Gelenkregion die destabilisierende Wirkung der Austausche Q212A und P214A jedoch zumindest soweit kompensieren, dass der gedockte Zustand eingenommen wird. Ergebnisse und Diskussion 97 3.2.5 Durch den Austausch der zu Pro213 benachbarten Reste liegt der entsprechende Phage permanent in der geöffneten Form vor Die Modulation des Prolinschalters hat in vitro einen großen Einfluss auf die Stabilität und damit auch die Affinität des G3P* für TolAC. Über in vivo Experimente sollte im Folgenden untersucht werden, wie sich die Substitutionen um Pro213 auf die Infektiosität des fd Phagen auswirken. Im ersten Schritt der Infektion pilushaltiger (F+) E. coli Zellen interagiert die N2Domäne des G3P* mit der Spitze des F-Pilus, wodurch vermutlich der Pilus zurückgezogen wird und so der Phage an die Zelloberfläche gelangt.11; 69 Ob N2 während der folgenden Infektionsschritte am Pilus gebunden bleibt ist nicht bekannt. Die Wechselwirkung mit dem Pilus führt jedoch zur Isomerisierung von Pro213 in die trans-Konformation und die Dissoziation der Domänen, wodurch die Interaktionsfläche für TolAC auf der N1-Domäne exponiert wird.60; 72 Vereinfacht betrachtet spiegelt demnach die Infektiosität des fd Phagen gegenüber F+-Zellen die Affinität seines G3P* im aktiven Intermediatszustand gegenüber TolAC wider. Anhand von Infektionsstudien mit pilushaltigen E. coli Zellen konnte bereits gezeigt werden, dass Phagen mit stabilisierenden Substitutionen in der Gelenkregion des G3P einen leichten Nachteil gegenüber dem natürlichen fd Phagen haben.79 Ursache dafür sind vermutlich die zusätzlichen günstigen Interaktionen zwischen der Gelenkregion und N1, welche zur Ausbildung der lose-assoziierten Form führen, in der die Bindung von TolAC beeinträchtigt ist. Die in dieser Arbeit näher untersuchten Austausche der zu Pro213 benachbarten AS haben dagegen zum Teil eine drastische Verringerung der Domäneninteraktionen und damit Destabilisierung von N2 zur Folge. Ein entsprechend positiver Effekt auf die Funktionalität der Phagen mit aktiviertem G3P ist jedoch nicht beobachtbar. Relativ zum Phagen fd G3P IIHY ist die Infektiosität des Phagen fd G3P IIHY APA gegenüber F+-Zellen unverändert (Abbildung 3.2.8). Dass sich die Substitutionen Q212A und P214A selektiv nur auf das assoziierte G3P auswirken, ist unwahrscheinlich. Vielmehr geht unter anderem aus den Faltungskinetiken des fd G3P* IIHY APA126 sowie dessen Rückfaltung in Gegenwart von TolAC-AEDANS hervor, dass zwar der Intermediatszustand deutlich destabilisiert und damit N1 besser exponiert ist, dafür jedoch das Protein viel schneller seine native, gedockte Form einnimmt (Daten nicht gezeigt). Die Beschleunigung der Öffnungsund Schließreaktion des Pro213 führt vermutlich zur Störung der Interaktion zwischen N1 und TolAC. Interessanterweise hat auch der Phage fd G3P APA bei der Infektion von pilushaltigen Zellen keinen Vorteil gegenüber dem WT fd Phagen (Abbildung 3.2.8), obwohl sein G3P selbst in der nativen Form fast vollständig geöffnet vorliegt. Ein möglicher Grund für die verringerte Infektiosität dieser Variante und auch fd G3P IIHY 6 ist die geringe Stabilität ihrer N2-Domänen. Die Infektionsexperimente selbst wurden unter Bedingungen durchgeführt, bei denen N2 jeweils gefaltet vorlag. Die zur Isolierung der Phagen verwendeten Übernachtkulturen (ÜNK) wurden jedoch bei 37 °C inkubiert, was im Bereich Ergebnisse und Diskussion 98 des Übergangsmittelpunktes der N2-Domäne der Varianten liegt. Es ist daher nicht auszuschließen, dass aufgrund der Aggregation eines Teils der partiell entfalteten Proteine die Anzahl an infektiösen Phagenpartikeln verringert wurde. Abbildung 3.2.8: Infektion von pilusfreien bzw. pilushaltigen E. coli Zellen durch die fd Phagenvarianten. Aufgetragen sind die Infektiositäten verschiedener fd Phagen gegenüber a) F+ E. coli TG1 Zellen und b) FE. coli HB2156 Zellen in Gegenwart von 50 mM CaCl2 in a) relativ zu WT fd Phagen bzw. in b) relativ zu fd G3P N2 Phagen. Die koloniebildenden Einheiten (c.f.u.) der infizierten Zellen wurden nach Inkubation für 30 min bei 25 °C anhand von Verdünnungsreihen auf Chloramphenicol- (Cm-)haltigen dYT-Nährböden bestimmt. Für die Infektion von F+-Zellen ist die Anwesenheit der N2-Domäne essentiell, da durch deren Interaktion mit dem Pilus der geöffnete, aktive Zustand erzeugt wird. Pilusfreie FE. coli Zellen können in Gegenwart von 50 mM CaCl2 ebenfalls infiziert werden.124 Die Effizienz ist allerdings um mehr als drei Zehnerpotenzen herabgesetzt, da durch die fehlende Wechselwirkung mit dem Pilus keine Anreicherung der Phagen auf der Oberfläche stattfindet. Es wird vielmehr vermutet, dass die zusätzlich enthaltenen Calciumionen entweder durch Präzipitation der Phagen auf der Oberfläche oder über die Störung der Membranintegrität der Zelle und damit Verbesserung der Zugänglichkeit von TolAC die Infektiosität erhöhen. Die Gegenwart der N2-Domäne wirkt sich demnach hier hinderlich auf den Infektionsprozess aus, da sie durch die Wechselwirkung mit der N1-Domäne die Interaktionsfläche für TolAC blockiert. Die Phagenvarianten, deren G3P* aufgrund zusätzlicher Substitutionen entweder deutlich schwächer oder gar nicht in assoziierter Form vorliegt, haben demnach einen deutlichen Vorteil. Erwartungsgemäß zeigen der Deletionsphage fd G3P N2 und der Phage fd G3P* IIHY 6, in dessen G3P die beiden Domänen unabhängig voneinander agieren, die höchste Infektiosität (Abbildung 3.2.8b). Die Infektiosität des Phagen fd G3P APA ist dem gegenüber jedoch nur zweifach verringert. Dies deckt sich mit den aus den Bindungsexperimenten erhaltenen KD-Werten und zeigt gleichzeitig an, dass der Verlust an aktiven fd G3P APA Phagenpartikeln durch Aggregationsprozesse während der Inkubation der ÜNK bei 37 °C gering ist. a) b) relative Infektiosität (%) 0.1 1 10 100 fd G3P N2 WT fd Phage fd G3P IIHY fd G3P APA fd G3P IIHY APA fd G3P IIHY 6 relative Infektiosität (%) 0.1 1 10 100 fd G3P N2 WT fd Phage fd G3P IIHY fd G3P APA fd G3P IIHY APA fd G3P IIHY 6 Ergebnisse und Diskussion 99 Dass die Infektiosität von der spontanen Dissoziation der Domänen und damit auch der Stabilität der N2-Domäne abhängt, zeigt sich in den Werten der drei übrigen Varianten. Während analog zum in vitro Experiment die Anzahl an durch den Phagen fd G3P IIHY infizierten Zellen unterhalb der Detektionsgrenze liegt, führt die beschleunigende Modifikation des Prolinschalters zu einer sichtbaren Verbesserung der Infektiosität gegenüber F--Zellen. Sowohl der Übergangsmittelpunkt von N2 als auch der KD-Wert des fd G3P* IIHY APA sind nur leicht im Vergleich zu denen des WT fd G3P* erhöht, weshalb die Infektiositäten der entsprechenden Phagen sehr ähnlich sind. Gegenüber dem Phagen fd G3P N2 mit vollständig zugänglicher N1-Domäne ergibt sich allerdings noch immer ein hundertfacher Unterschied, der mit den Differenzen in den Dissoziationskonstanten gut übereinstimmt. Die über den Energietransfer zwischen den gereinigten Proteinen erhaltenen Bindungsaffinitäten reflektieren demnach sehr gut die Stärke der Wechselwirkung der N1Domäne des Phagen-G3P während der Infektion. Ergebnisse und Diskussion 106 Abbildung 3.3.4: Chevron-Auftragung der Rückund Entfaltungsraten der isolierten N1-Domänen. Gezeigt sind die apparenten Rückfaltungs- (offene Symbole) und Entfaltungsraten (geschlossene Symbole) von isolierter N1 (,), N1 T13I (,), N1 EGDS (,) und N1 T13I EGDS (,●) in Abhängigkeit von der GdmClKonzentration. Die durchgezogenen Linien repräsentieren den Angleich gemäß eines Zweizustandsmodells an die Datenpunkte. Die daraus erhaltenen thermodynamischen Parameter sind in Tabelle 3.3.3 aufgelistet. Die entsprechenden Kinetiken wurden nach stopped-flow-Mischung anhand der Änderung der Trp-Fluoreszenz oberhalb von 330 nm nach Anregung bei 295 nm mit 1 µM Protein verfolgt. Alle Messungen wurden in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 bei 25 °C durchgeführt. Die Daten für isolierte N1 T13I wurden der Referenz 122 entnommen, die der isolierten N1-Domäne der Arbeit 95. Tabelle 3.3.3: Parameter der Analyse der Faltungsreaktionen der isolierten N1-Domänen. Variante mRF (M-1) kRF (s-1) mEF (M-1) kEF (s-1) [GdmCl]m (M) m (kJ mol-1 M-1) G (kJ mol-1) Isolierte N1 -1,205 302 1,062 1,421 2,4 5,6 13,3 N1 EGDS -1,086 373 0,962 0,367 3,4 5,1 17,2 N1 T13I -1,017 281 1,02 0,357 3,3 5,0 16,5 N1 T13I EGDS -1,033 416 0,941 0,111 4,1 4,9 20,4 Aufgelistet sind die mikroskopischen Entfaltungs- (kEF) und Rückfaltungsraten (kRF) extrapoliert auf 0 M GdmCl sowie die entsprechenden kinetischen m-Werte nach Auswertung der in Abbildung 3.3.4 gezeigten Daten gemäß eines Zweizustandsmodells (Gleichung 28). Der Übergangsmittelpunkt [GdmCl]m, die freie Enthalpie der Entfaltung G sowie Kooperativität m wurden über die Gleichung 29 bzw. 30 berechnet. Die kinetischen Daten wurden wie in Abbildung 3.3.4 beschrieben gemessen. Die Daten für isolierte N1 T13I wurden der Referenz 122 entnommen, die der isolierten N1-Domäne der Arbeit 95. Die kinetischen m-Werte der Entund Rückfaltung sind im Gegensatz zu den Ratenkonstanten kaum verändert. Die darüber ermittelbaren Kooperativitätsparameter liegen daher alle im Bereich von ca. 5 kJ mol-1 M-1. Der m-Wert der isolierten N1 T13I ist damit deutlich geringer als der über den Gleichgewichtsübergang bestimmte Wert von 8,9 kJ mol-1 M-1. Ein vergleichbarer Unterschied in den Kooperativitäten ergibt sich auch für N1 T13I in fd G3P* IIHY (Tabelle 3.3.3). Bei dieser Variante wurde aufgrund des Abknickens des Rückfaltungsastes vermutet, dass während der Strukturierung in geringen GdmCl-Konzentrationen ein schnell faltendes N1-Intermediat populiert wird.122 Die ebenfalls gute Überstimmung der aus den kinetischen Parametern erhaltenen [GdmCl]m-Werte mit denen der Gleichgewichtsübergänge zeigt jedoch an, dass die Auswertung der kinetischen Daten anhand eines Zweizustandsmodells insgesamt gerechtfertigt ist. [GdmCl] (M) 0123456  (s-1) 1 10 2 10 3 10 Ergebnisse und Diskussion 107 3.3.2 Im fd G3P* EGDS sind die Wechselwirkungen zwischen den N-terminalen Domänen drastisch vermindert Die im Vergleich zu WT fd G3P* deutlich verringerte Stabilität der N2-Domäne der Variante fd G3P* EGDS lässt vermuten, dass hier der gedockte Zustand nicht mehr vollständig eingenommen werden kann. In diesem Fall sollte die Entfaltung der N1-Domäne ausgehend von nativem Protein deutlich beschleunigt sein, da hier die Denaturierung nicht durch die Domänenöffnung limitiert wird. Tatsächlich folgen die Entfaltungsraten von N1 in fd G3P* EGDS dem Verlauf der Entfaltung der isolierten N1 EGDS (;, Abbildung 3.3.5). Der sich aus den Entund Rückfaltungsraten der N1-Domäne des fd G3P* EGDS ergebende Übergangsmittelpunkt und der m-Wert stimmen dabei mit den Daten des Gleichgewichtsüberganges überein (Tabelle 10.1 im Anhang). Bei hohen GdmCl-Konzentrationen ergeben sich monoexponentielle Kinetiken, die der vollständig von N2 entkoppelten Entfaltung der N1-Domäne zugeordnet werden können. Zwischen 3 und 4,4 M GdmCl ist eine zusätzliche schnellere Phase mit entgegengesetzter Amplitude detektierbar, welche die Entfaltung der N2-Domäne widerspiegelt. Unterhalb von 2,8 M GdmCl wird die Signaländerung von der Denaturierung der N2-Domäne dominiert (Abbildung 3.3.5b). Die Raten folgen jedoch nicht dem Verlauf der Entfaltung von N2 im nicht assoziierten Zustand des WT fd G3P*. Der Chevronast ist vielmehr leicht zu höheren GdmCl-Konzentrationen verschoben (, Abbildung 3.3.5). Die N2-Domäne wird demnach über zusätzliche Wechselwirkungen leicht stabilisiert. Der Verlauf der Rückfaltung der -Spezies des fd G3P* EGDS kann nicht aufgelöst werden (, Abbildung 3.3.5). Die nach stopped-flow-Mischung gemessenen Kinetiken sind mit Zeitkonstanten von 0,67 s (in 0,2 M GdmCl) etwa dreifach gegenüber der Rückfaltung von N2 im WT fd G3P* (1,82 s in 0,2 M GdmCl) beschleunigt, wobei das Chevronminimum zu niedrigeren GdmCl-Konzentrationen verschoben ist (, Abbildung 3.3.5). Im Umkehrschluss bedeutet dies, dass im Wildtyp-Protein bereits während der Strukturierung von N2 zur Schleifenregion hin Interaktionen ausgebildet werden. Der Befund deckt sich auch mit den Ergebnissen der -Wert-Analyse der isolierten N2-Domäne von Roman Jakob und Maximilian von Delbrück.157; 166 Aus -Werten können anhand des Vergleiches der Faltungsmechanismen des Ausgangsproteins und einer substituierten Variante Rückschlüsse auf die energetischen Wechselwirkungen der ursprünglichen AS in den verschiedenen Zuständen gezogen werden.167; 168 Der mit Asp24 in der N1-Domäne interagierende Rest Gly153 von N2 befindet sich danach bereits im Übergangszustand in einer nativähnlichen Umgebung.157; 166 Er kann also im G3P* während der Faltung von N2 mit der schon gefalteten N1-Domäne Interaktionen eingehen, wodurch wiederum die Rückfaltung von N2 beeinflusst wird. Ergebnisse und Diskussion 108 Abbildung 3.3.5: Analyse der Faltungsund Entfaltungsraten des fd G3P* EGDS. a) Auftragung der apparenten Entfaltungs- (gefüllte Symbole) und Rückfaltungsraten (offene Symbole) von WT fd G3P* (graue Symbole) bzw. fd G3P* EGDS (farbige Symbole) in Abhängigkeit von der GdmClKonzentration. Die langsamen Entfaltungs- (●;;;●;●) und Rückfaltungsreaktionen (;;;) der N2Domäne des jeweiligen G3P* wurden nach manueller Mischung gemessen. Gezeigt sind außerdem die schnellen Rückfaltungsraten (;) der N1-Domänen sowie der isolierten N1 EGDS () nach stopped-flow-Mischung. Aufgetragen sind zusätzlich die Raten der konformationellen Faltung der jeweiligen -Spezies (;) ausgehend von entfaltetem Protein sowie die Entfaltung von N1 aus dem nativen Zustand (;;) nach stoppedflow-Mischung. Die Entfaltung von N2 aus dem nicht assoziierten Zustand () konnte bereits in Einzelmischexperimenten nach schneller Mischung detektiert werden. Im WT fd G3P* sind diese Raten dagegen erst nach Rückfaltung für 20 bzw. 150 s in 0,5 M GdmCl und erneuter Überführung in Entfaltungsbedingungen beobachtbar (;). Zu Vergleichszwecken aufgetragen sind außerdem die Entfaltungsraten der N1-Domäne () im ungedockten WT fd G3P* sowie die Entund Rückfaltungsraten der isolierten N2-Domäne (;). Einige der Daten des WT fd G3P* wurden der Diplomarbeit von Roman Jakob entnommen (siehe Abbildung 3.1.2).150 Die Kinetiken des fd G3P* EGDS wurden bis auf die mit den Symbolen ●; und  gekennzeichneten Daten von Anna Schneider gemessen, jedoch von mir noch einmal separat ausgewertet. Die Reaktionen der N1-Domäne nach schneller Mischung wurden anhand der Trp-Fluoreszenz oberhalb von 340 nm nach Anregung bei 295 nm verfolgt, die der N2-Domäne oberhalb von 320 nm nach Anregung bei 280 nm. Die Faltungsraten der N2Domäne nach manueller Mischung wurden über die Messung der Fluoreszenz bei 310 nm erhalten. b) Gezeigt sind die Entfaltungskinetiken von nativem fd G3P* EGDS nach schneller Mischung in 2,7 M GdmCl (blau) und 3,3 M GdmCl (schwarz, rechte Ordinate) mit Zeitkonstanten von  M GdmCl) = 43 ms bzw.  M GdmCl) = 23 ms und  M GdmCl) = 50 ms. Die Reaktionen wurden oberhalb von 340 nm nach Anregung bei 280 nm gemessen. c) Auftragung der Fluoreszenzamplituden der schnellen () Rückfaltungsphase sowie der schnelleren () und langsamen Entfaltungsphase (●) der N2-Domäne im fd G3P* EGDS als Funktion der GdmCl-Konzentration. Die Daten wurden nach manueller Mischung anhand der Tyrosinfluoreszenz bei 310 nm nach Anregung bei 280 nm aufgenommen. Die Messungen wurden in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit 1 µM Protein bei 25 °C durchgeführt. [GdmCl] (M) 0123456  (s -1 ) -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 1 1 10 2 10 3 10 [GdmCl] (M) 00,511,52 relative Fluoreszenz 0 20 40 60 t (s) 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 relative Fluoreszenz 5,6 5,7 5,8 5,9 relative Fluoreszenz 5,8 5,9 6 6,1 6,2 a) b) c) Ergebnisse und Diskussion 109 Sowohl die Entfaltung der isolierten N2-Domäne als auch von N2 in nicht assoziiertem G3P* sind normalerweise unabhängig von der Konformation des Pro161 (Kapitel 3.1.1).151 Interessanterweise hat jedoch der Austausch der Schleifenregion einen Einfluss auf die Entfaltungsgeschwindigkeit der cisbzw. trans-Form der N2-Domäne. Der Entfaltungsast der -Spezies des fd G3P* EGDS, der sich nach Rückfaltung in 0,5 M GdmCl für 2 s und erneutem Sprung in Entfaltungsbedingungen ergibt (, Abbildung 3.3.6), ist im Vergleich zu dem der isolierten N2-Domäne ist zu höheren GdmCl-Konzentrationen verschoben (, Abbildung 3.3.6). Dies zeigt an, dass der globuläre Teil von N2 während der Faltung durch schwache Interaktionen z.B. durch den Zusammenhalt der Enden von N2 stabilisiert wird. Die Entfaltungsgeschwindigkeit der -Spezies ist allerdings geringfügig gegenüber der der stabileren N2-Domäne mit cis-Pro161 erhöht, die nach Rückfaltung in 0,5 M GdmCl für 600 s populiert wird. Die Entfaltungsraten der -Form liegen im Bereich derer von N2 des nicht assoziierten WT fd G3P* (;, Abbildung 3.3.6). Vermutlich haben die AS der unstrukturierten Gelenkregion einen ungünstigen Einfluss auf die Anordnung der Reste des globulären Teils von N2 mit trans-Pro161, der erst durch die nachgelagerte transcis-Isomerisierung von Pro161 und damit Stabilisierung von N2 kompensiert wird. Im WT fd G3P* wird diese ungünstige Anordnung durch die bereits im frühen Stadium der Faltung der labileren N2-Domäne ausgebildete Interaktion mit der Schleifenregion verhindert. Abbildung 3.3.6: Analyse der Faltungsund Entfaltungskinetiken der N2-Domäne fd G3P* EGDS. Auftragung der apparenten Entfaltungs- (gefüllte Symbole) und Rückfaltungsraten (offene Symbole) der N2Domäne von WT fd G3P* (graue Symbole) bzw. fd G3P* EGDS (farbige Symbole) nach schneller Mischung in Abhängigkeit von der GdmCl-Konzentration. Gezeigt ist der Verlauf der Rückfaltung ausgehend von entfaltetem Protein (;) sowie die Entfaltung von nativem fd G3P* EGDS (), die von Anna Schneider gemessen wurde (Daten persönliche Mitteilung). Die Entfaltungsraten aus dem nicht assoziierten Zustand wurden über Doppelmischexperimente erhalten. Entfaltetes Protein wurde für 2 () bzw. 600 s () in 0,5 M GdmCl rückgefaltet und danach durch erneuten Sprung in höhere Denaturierungsmittelkonzentrationen entfaltet. Im WT fd G3P* wurden entsprechende Raten nach Rückfaltung für 20 () bzw. 150 s () in 0,5 M GdmCl und erneuter Überführung in Entfaltungsbedingungen beobachtet. Zu Vergleichszwecken aufgetragen sind die Entund Rückfaltungsraten der isolierten N2-Domäne (;). Einige der Daten des WT fd G3P* wurden, wie in Abbildung 3.1.2 beschrieben, der Diplomarbeit von Roman Jakob entnommen.150 Die Reaktionen der N2Domäne nach schneller Mischung wurden anhand der Fluoreszenz oberhalb von 320 nm nach Anregung bei 280 nm verfolgt. Die Messungen wurden in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit 1 µM Protein bei 25 °C durchgeführt. [GdmCl] (M) 00,511,522,53  (s -1 ) -1 10 1 1 10 2 10 Ergebnisse und Diskussion 110 Die Entfaltung der substituierten Variante nach manueller Mischung folgt einem biexponentiellen Verlauf. Mit einer Zeitkonstante von 51 s entspricht dabei die schnellere der beiden Phasen der Isomerisierung von Pro161 in die trans-Konformation (, Abbildung 3.3.5a). Demnach liegt im nativen fd G3P* EGDS genau wie in fd G3P* P213G ein Teil der Moleküle im nicht assoziierten Zustand vor. Die Zeitkonstante der langsameren Reaktion verringert sich zwischen 0,6 und 1,6 M GdmCl von 1430 auf 196 s, bleibt oberhalb dieser Denaturierungsmittelkonzentration jedoch konstant (●, Abbildung 3.3.5a). Die Raten befinden sich ungefähr im Bereich der Isomerisierung des Pro213, ihr Verlauf ist jedoch zu niedrigeren GdmCl-Konzentrationen verschoben, was die deutliche Destabilisierung von N2 im assoziierten Zustand des fd G3P* EGDS reflektiert. Die Amplituden der beiden Phasen nehmen ebenfalls zu höheren GdmCl-Konzentrationen hin ab (●;, Abbildung 3.3.5c). Die mit der größten Signaländerung verbundene konformationelle Entfaltung aus dem offenen bzw. assoziierten Zustand findet, wie in den stopped-flowExperimenten gezeigt, bereits in der Totzeit der Handmischung statt. Die detektierten Entfaltungsreaktionen stellen folglich die daran gekoppelten langsameren Isomerisierungen von Pro161 bzw. Pro213 dar, welche bereits für WT fd G3P* beobachtet worden waren (Kapitel 3.1.2, Gleichung 44). Während der Rückfaltung ist nach manueller Mischung lediglich eine Phase detektierbar, deren Zeitkonstante mit 122 s (in 0,5 M GdmCl) der der transcis-Isomerisierung des Prolin161 entspricht (, Abbildung 3.3.5a). Tatsächlich lässt sich die Geschwindigkeit dieser Rückfaltungsreaktion durch den Faltungshelfer hFKBP12+IF beschleunigen (Daten nicht gezeigt). Eine nachgelagerte Reaktion, die der Einnahme des assoziierten Zustandes durch die transcis-Isomerisierung von Pro213 entspricht, ist dagegen spektroskopisch nicht sichtbar. Dies kann auf dessen geringe Stabilität im Vergleich zum WT fd G3P* zurückgeführt werden, denn anhand der Freisetzung von TolAC-AEDANS aus dem Komplex mit der N1-Domäne des fd G3P* EGDS während der Rückfaltung in 0,5 M GdmCl lässt sich die Zeitkonstante der Assoziationsreaktion bestimmen (Abbildung 3.3.7). Sie liegt, wie bereits vermutet, mit 3390 s etwa im Zeitbereich der langsamen Isomerisierungsreaktion des Pro213. Der Prolinschalter ist demnach noch intakt. Die Erhöhung der Interaktionen zwischen den Domänen und damit die Stabilisierung der N2-Domäne sind jedoch durch die Verkürzung der Schleifenregion deutlich behindert. Ob dadurch auch die Ausbildung des Wasserstoffbrückennetzwerkes zwischen der N1-Domäne und der Gelenkregion beeinflusst ist, kann an dieser Stelle nicht eindeutig geklärt werden. Während der Faltung von fd G3P* EGDS wird deutlich weniger TolAC-AEDANS verdrängt als bei der Rückfaltung des Wildtyp-Proteins bzw. fd G3P* P161A (Abbildung 3.3.7). Wie bereits anhand des Faltungsmechanismus der Variante mit substituierter Schleife 1 geschlussfolgert, liegt ein Großteil der Moleküle aufgrund der nur schwach ausgeprägten Domäneninteraktionen in geöffneter Form vor. Auffällig ist zudem, dass die Amplitude der ersten Phase der Freisetzung von TolAC-AEDANS während der Rückfaltung von fd G3P* EGDS wie in fd G3P* P161A deutlich geringer ist als die der Ergebnisse und Diskussion 111 zweiten Reaktion. Durch die Isomerisierung von Pro161, mit der in 0,5 M GdmCl hauptsächlich auch die Strukturierung des globulären Teils der N2-Domäne einhergeht, kann TolAC folglich nur zu einem sehr geringen Anteil verdrängt werden. Dies bestätigt noch einmal, dass die beiden Domänen im nicht assoziierten Zustand des fd G3P* EGDS fast vollständig unabhängig voneinander sind und die N2-Domäne im Gegensatz zu WT fd G3P* während ihrer Faltung nicht mit TolAC um die Wechselwirkung mit N1 kompetieren kann. Abbildung 3.3.7: Verdrängung von TolAC aus dem Komplex mit N1 durch Faltung des fd G3P* EGDS. Gezeigt sind die um den Pufferwert korrigierten Kinetiken der Freisetzung von TolAC-AEDANS während der Rückfaltung von WT fd G3P* (schwarz), fd G3P* P161A (rot) und fd G3P* EGDS (grün). Die Reaktionen wurden nach zehnfacher Verdünnung des jeweiligen denaturierten Proteins (10 µM in 5 M GdmCl) in Gegenwart von 1 µM TolAC-AEDANS anhand der AEDANS-Fluoreszenz bei 490 nm nach Anregung bei 280 nm verfolgt. Die schwarzen Linien stellen den Angleich biexponentieller Funktionen an die Daten mit folgenden Zeitkonstanten dar: 1(WT) = 82 s, 2(WT) = 5260 s; 1(P161A) = 60 s, 2(P161A) = 7190 s; 1(EGDS) = 122 s, 2(EGDS) = 3390 s. Die Messungen wurden bei 25 °C in 0,1 M KP-Puffer, 0,5 M GdmCl, pH 7,0 mit einer Schichtdicke von 1 cm durchgeführt. 3.3.3 Durch die Substitution der Schleifenregion wird das aktive Intermediat populiert Eine Aussage darüber, wie groß der Anteil an geöffneten fd G3P* EGDS Molekülen relativ zum Ausgangsprotein ist, kann nicht getroffen werden, da ein Vergleich der Gesamtamplituden aus den TolAC-Verdrängungsexperimenten der verschiedenen Varianten unzulässig ist. Die Interaktion zwischen N1 und TolAC wird hauptsächlich über Wasserstoffbrücken und Coulombwechselwirkungen vermittelt.81; 83 Unter anderem bildet auch die Seitenkette des Asp28 der ursprünglichen Schleifensequenz von fd-N1 (DDKTLD28) mit dem am C-Terminus von TolAC lokalisierten Lys212 eine Salzbrücke aus. Die Bindungsfähigkeit der N1-Domäne von fd G3P* EGDS ist daher vermutlich herabgesetzt. Um herauszufinden, wie groß der Effekt der Substitution auf die Affinität ist, wurden analog zu Kapitel 3.2.1 anhand der Assoziationskinetiken die Dissoziationskonstanten der Komplexe aus TolAC-AEDANS und den verschiedenen Varianten in Abwesenheit von GdmCl bestimmt. Neben den apparenten Raten der Reaktionen wurde wieder der Verlauf der Amplituden ausgewertet (Abbildung 3.3.8). Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 3.3.4 aufgelistet. t (s) 0 100 200 300 relative Fluoreszenz 0 20 40 60 10000 20000 30000 Ergebnisse und Diskussion 112 Wie erwartet führt der Austausch der Schleifenregion unabhängig vom zusätzlichen Substitutionshintergrund zu einer vierfachen Verringerung der Affinität der isolierten N1-Domäne. Interessanterweise sind Assoziation und Dissoziation gleichermaßen negativ beeinflusst. Das bedeutet, dass zwar bereits die vor allem auf elektrostatischer Anziehung basierende Bindung erschwert wird, gleichzeitig jedoch auch ungünstige Interaktionen den Komplex destabilisieren. Im Komplex von TolAC mit der N1-Domäne des Phagen IF1, nach deren Vorbild die Variante fd G3P* EGDS konstruiert worden war, wird ebenfalls eine Salzbrücke ausgehend von Lys212 des TolAC-Proteins gebildet. Der korrespondierende Wechselwirkungspartner der IF1-N1-Domäne ist jedoch nicht Asp28 in der Schleifenregion sondern Glu37, welches im übernächsten Faltblattstrang lokalisiert ist.91 In fd-N1 befindet sich an dieser Position Asn39 (Abbildung 3.3.1), das unter den Pufferbedingungen (pH 7,0) keine Salzsondern lediglich Wasserstoffbrücken zu Lys212 ausbilden kann. Der Verlust des ursprünglichen Interaktionspartners Asp28 kann demnach nicht vollständig kompensiert werden. Aus dem Vergleich der Dissoziationskonstanten von isolierter N1 EGDS und N1 T13I EGDS geht allerdings hervor, dass die Substitution T13I die Verringerung der Affinität durch die Veränderung der ersten Schleife teilweise ausgleicht (Tabelle 3.3.4). Im Hintergrund der stabilisierenden Substitution T13I wirken sich demnach der Austausch der Schleifenregion und der damit verbundene Verlust des für die Interaktion mit TolAC wichtigen Asp28 nur geringfügig auf die Affinität der N1-Domäne für TolAC aus. Abbildung 3.3.8: Bindung der G3P*-Varianten mit veränderter Schleife an den Rezeptor TolAC-AEDANS. Auftragung der normierten Fluoreszenzamplituden (a) bzw. apparenten Assoziationsraten (b) in Abhängigkeit von der Konzentration an isolierter N1 (), N1 T13I (), N1 EGDS (), N1 T13I EGDS (●), WT fd G3P* (●), fd G3P* EGDS () bzw. fd G3P* IIHY EGDS (). Sowohl die Raten als auch die Amplituden wurden aus dem Angleich monoexponentieller Gleichungen an die Assoziationskinetiken erhalten. Die in a) gezeigten Linien stellen einen Angleich an die Amplituden gemäß Gleichung 43 dar. Die mikroskopischen Raten der Dissoziation (koff) und Assoziation (kon) ergaben sich nach linearer Regression der in b) aufgetragenen Daten aus dem Schnittpunkt mit der y-Achse bzw. der Geradensteigung. Die Dissoziationskonstante KD wurde aus dem Quotienten der beiden mikroskopischen Raten berechnet (Gleichung 34). Die Assoziationskinetiken wurden nach Anregung bei 280 nm anhand der Änderung der AEDANS-Fluoreszenz oberhalb von 460 nm in stoppedflow-Mischexperimenten verfolgt. Alle Messungen wurden bei 25 °C in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 durchgeführt. Die erhaltenen KD-Werte und mikroskopische Raten sind in Tabelle 3.3.4 aufgelistet. [Protein] (µM) 0 4 8 121620 k app (s -1 ) 0 2 4 6 8 10 a) b) [Protein] (µM) 0 4 8 121620 relative Amplitude 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Ergebnisse und Diskussion 113 Tabelle 3.3.4: Parameter der Interaktion von TolAC-AEDANS mit den verschiedenen G3P*-Varianten. Variante kon (µM-1s-1) koff (s-1) koff/kon (µM) KD (µM) Isolierte N1 0,97 ± 0,01 0,25 ± 0,01 0,26 0,28 ± 0,02 Isolierte N1 EGDS 0,41 ± 0,01 0,53 ± 0,02 1,3 1,07 ± 0,05 Isolierte N1 T13I 1,24 ± 0,02 0,16 ± 0,04 0,13 0,15 ± 0,01 Isolierte N1 T13I EGDS 0,61 ± 0,01 0,4 ± 0,02 0,65 0,56 ± 0,02 WT fd G3P* n.d. n.d. n.d. 82 ± 30 fd G3P* EGDS 0,11 ± 0,01 0,6 ± 0,01 5,62 3,45 ± 0,16 fd G3P* APA 0,81 ± 0,01 0,36 ± 0,01 0,44 0,34 ± 0,01 fd G3P* G153D 0,26 ± 0,01 0,4 ± 0,02 1,51 1,08 ± 0,07 fd G3P* IIHY n.d. n.d. n.d. n.d. fd G3P* IIHY EGDS n.d. n.d. n.d. 107 ± 40 Angegeben ist der aus der Analyse der Amplituden erhaltene KD-Wert sowie die mikroskopischen Raten koff und kon aus der Auswertung der apparenten Assoziationsraten. Deren Quotient ergibt ebenfalls die Dissoziationskonstante des Komplexes aus dem jeweiligen G3P* und 0,2 µM TolAC-AEDANS. (n. d.: keine Auswertung möglich). Die Messungen erfolgten unter den in Abbildung 3.3.8 beschriebenen Bedingungen. Die Affinität von fd G3P* EGDS ist aufgrund des hohen Anteils an nicht assoziierter Spezies nicht nur deutlich gegenüber WT fd G3P* erhöht, sondern außerdem nur vierfach gegenüber der Affinität der korrespondierenden isolierten N1 EGDS verringert. Verantwortlich für diesen verbleibenden Unterschied ist die niedrigere Assoziationsrate des G3P* (Tabelle 3.3.4). Die TolAC-Bindungsdomäne der Variante ist demnach etwas schlechter zugänglich, was auf die Mischung aus geöffnetem und assoziiertem Zustand zurückgeführt werden kann. Unter der Annahme, dass im nicht assoziierten fd G3P* EGDS zwischen N1 und N2 kaum Wechselwirkungen bestehen und N1 in der geschlossenen Form des G3P* nicht an TolAC binden kann, lässt sich abschätzen, dass maximal 75 % des nativen Proteins im gedockten Zustand vorliegen. Der Austausch G153D in N2 hat nicht nur einen zur Substitution der Schleifenregion ähnlichen Effekt auf die Stabilität der N2-Domäne sondern auch auf die Dissoziationskonstante (Tabelle 3.3.4). Die Bindung von fd G3P* G153D an TolACAEDANS ist genau wie bei fd G3P* EGDS nur vierfach schlechter als die Wechselwirkung zwischen TolAC und der korrespondierenden isolierten N1-Domäne. Grund dafür ist ebenfalls die verlangsamte Assoziationsreaktion. Die Affinität der gegenüber fd G3P* EGDS leicht destabilisierten Variante fd G3P* APA ist auch ohne das Denaturierungsmittel GdmCl fast so hoch wie die Affinität der isolierten N1-Domäne (Tabelle 3.3.4). Im nativen Zustand sind hier Interaktionen zwischen den Domänen nur sehr schwach ausgeprägt, weshalb die N1und N2Domäne fast vollständig unabhängig voneinander vorliegen. In der Variante fd G3P* IIHY EGDS gehen durch die zusätzlichen stabilisierenden Substitutionen in der Gelenkregion fast alle Moleküle in den gedockten Zustand über. Der KD-Wert ist daher erwartungsgemäß sehr hoch. Die N2-Domäne des fd G3P* IIHY EGDS ist jedoch vermutlich aufgrund fehlender Interaktionen leicht destabilisiert, weshalb im Ergebnisse und Diskussion 114 Vergleich zu fd G3P* IIHY die Assoziation detektiert werden kann, auch wenn sie sehr schwach ist und nur eine geringe Amplitude zeigt. 3.3.4 Der fd Phage geht durch den Austausch der Schleifenregion und den damit verbundenen Verlust der Domäneninteraktionen in den aktiven Zustand über Die Affinität des jeweiligen G3P* in vivo wurde wiederum über die Infektiosität der entsprechenden Phagen gegenüber pilusfreien Zellen untersucht. Die Anzahl der durch den Phagen fd G3P IIHY EGDS infizierten FHB2156 E. coli Zellen liegt trotz der leicht verbesserten Bindungsfähigkeit unterhalb der Detektionsgrenze (Abbildung 3.3.9a). Die Infektiosität des Phagen fd G3P* EGDS ist dagegen um fast eine Zehnerpotenz gegenüber der des Wildtyp-Phagen erhöht, da die Infektion dieser F--Zellen von der Population an Phagen mit G3P im nicht assoziierten Zustand abhängt (Abbildung 3.3.9a). Wie in Kapitel 3.2.5 gezeigt, wird der FHB2156 E. coli Stamm in Gegenwart von 50 mM CaCl2 am effizientesten vom fd G3P N2 Phagen infiziert, dessen G3P* lediglich N1 und die C-terminale Domäne enthält, und daher die Bindungsstellen für TolAC permanent zugänglich sind. Die Infektiosität des fd G3P N2 Phagen mit N1 EGDS ist dabei leicht gegenüber dem Phagen mit der ursprünglichen N1-Domäne herabgesetzt (Abbildung 3.3.9a), was im Rahmen des Fehlers dem Unterschied der über die in vitro Experimente ermittelten Affinitäten der isolierten N1-Domänen für TolAC-AEDANS entspricht (Tabelle 3.3.4). Abbildung 3.3.9: Infektion von pilusfreien bzw. pilushaltigen E. coli Zellen durch fd Phagenvarianten. Aufgetragen sind die Infektiositäten verschiedener fd Phagen gegenüber a) FHB2156 E. coli Zellen in Gegenwart von 50 mM CaCl2 und b) E. coli XL1 Blue Zellen in a) relativ zu fd G3P N2 bzw. in b) relativ zu WT fd Phagen. Die koloniebildenden Einheiten (c.f.u.) der infizierten Zellen wurden nach Inkubation für 30 min bei 25 °C anhand von Verdünnungsreihen auf Cm-haltigen dYT-Nährböden bestimmt. Pilushaltige E. coli Zellen werden durch die beiden Phagenvarianten ohne N2-Domäne nicht infiziert (Abbildung 3.3.9b). Erst durch die Bindung von N2 an den Pilus gelangt der Phage an die Zelloberfläche, wobei die Interaktion gleichzeitig für die Dissoziation der relative Infektiosität (%) 0,1 1 10 100 fd G3P N2 WT fd Phage fd G3P IIHY fd G3P EGDS fd G3P IIHY EGDS fd G3P N2 EGDS relative Infektiosität (%) 0,1 1 10 100 fd G3P N2 WT fd Phage fd G3P IIHY fd G3P EGDS fd G3P IIHY EGDS fd G3P N2 EGDS a) b) Ergebnisse und Diskussion 115 Domänen sorgt. Dadurch wird die Bindungsstelle für TolAC auf der N1-Domäne exponiert, deren Affinität während der folgenden Infektionsschritte von entscheidender Bedeutung ist. Aus diesem Grund ist die Infektiosität der fd G3P EGDS Phagen im Vergleich zum WildtypPhagen vermindert. Der Unterschied ist mit Faktor zehn sehr groß und wie bei den Phagen fd G3P IIHY 6 und fd G3P APA (Kapitel 3.2.5) vermutlich durch die verringerte Stabilität der N2-Domäne bedingt. Die hier ebenfalls hohe Infektiosität gegenüber pilusfreien Zellen zeigt jedoch wiederum an, dass der Verlust an aktiven fd G3P EGDS Phagen verhältnismäßig gering ist. Der Phage fd G3P IIHY EGDS infiziert F+-Zellen fast so gut wie der WT fd Phage. Neben der deutlich höheren Stabilität von N2 wird hier die durch die Substitution der Schleife bedingte Verringerung der Affinität aufgrund der zusätzlichen Substitution T13I teilweise ausgeglichen. Die Infektiosität dieses Phagen ist jedoch auch leicht gegenüber der seines Ausgangsphagen fd G3P IIHY erhöht. Im geöffneten Zustand, der durch die Wechselwirkung mit dem Pilus populiert wird, ist demnach die Zugänglichkeit der TolAC-Interaktionsfläche der N1-Domäne im G3P IIHY EGDS deutlich besser als im G3P IIHY. Dies zeigt sich auch in den Rückfaltungsexperimenten mit den entsprechenden Proteinvarianten in Gegenwart von TolAC-AEDANS (Abbildung 3.3.10). Abbildung 3.3.10: Freisetzung von TolAC-AEDANS im Verlauf der Faltung stabilisierter G3P*-Varianten. Gezeigt sind die normierten Kinetiken der Verdrängung von TolAC-AEDANS während der Rückfaltung von fd G3P* IIHY (blau), fd G3P* IIHY P161A (rot), fd G3P* P161A (schwarz) bzw. fd G3P* IIHY EGDS (grün). Die Reaktionen wurden nach elffacher Verdünnung des jeweiligen denaturierten Proteins (11 µM in 5,5 M GdmCl) in Gegenwart von 1 µM TolAC-AEDANS anhand der AEDANS-Fluoreszenz bei 490 nm nach Anregung bei 280 nm verfolgt. Die schwarzen Linien stellen den Angleich biexponentieller Funktionen an die Daten mit folgenden Zeitkonstanten dar: 1(IIHY) = 27 s, 2(IIHY) = 1357 s; 1(IIHY P161A) = 24 s, 2(IIHY P161A) = 1263 s; 1(EGDS) = 99 s, 2(EGDS) = 5670 s und 1(P161A) = 60 s, 2(P161A) = 7190 s. Die Messungen wurden bei 25 °C in 0,1 M KP-Puffer, 0,5 M GdmCl, pH 7,0 mit einer Schichtdicke von 1 cm durchgeführt. In allen bisher untersuchten G3P* IIHY Varianten wird TolAC-AEDANS bereits während der Einnahme des lose-assoziierten Zustandes aus dem Komplex mit der N1-Domäne freigesetzt (Abbildung 3.3.10). Während der Faltung von fd G3P* IIHY EGDS ist dagegen, ähnlich wie im fd G3P* P161A, für die Verdrängung des Bindungspartners hauptsächlich die t (s) 0 100 200 relative Fluoreszenz 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 10000 20000 30000 Ergebnisse und Diskussion 122 Abbildung 3.4.1: Vergleich der Strukturen und Sequenzen der N1-Domänen des fd G3P* und IF1 G3P*. a) Überlagerung der Kristallstruktur der N1-Domäne des G3P des Phagen IF1 (grau) mit der N1-Domäne des WT fd G3P* (rot), deren Rückgratatome eine Abweichung von 0,623 Å zeigen. Die homologe Schleifenstruktur ist orange (fd-N1) bzw. hellblau (IF1-N1) eingefärbt. Als Stäbchen-Modelle dargestellt sind die im fd G3P* enthaltenen Reste Asp49 und Glu50 sowie die AS Asp48 und Asp46 der IF1-N1-Domäne. Die Abbildung wurde anhand der PDB-Strukturen 1G3P61 und 2X9B91 mit dem Programm Pymol123 erstellt. b) AS-Sequenzvergleich der N1-Domänen des fd G3P und IF1 G3P* sowie IF1-N1DDKTLD. Identische Reste sind in rot, ähnliche AS in blau dargestellt. Die Abbildung wurde mit dem Programm BioEdit165 erstellt. 3.4.1 Durch den Einbau von IF1-N1 in die stabilisierte Variante fd G3P* IIHY werden beide Domänen destabilisiert Die resultierende Variante fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY und die korrespondierende isolierte N1-Domäne mit veränderter Schleifensequenz (IF1-N1DDKTLD) wurden zunächst hinsichtlich auf ihre Stabilität charakterisiert. Die thermische Entfaltung der isolierten N1-Domäne wurde dabei anhand des CD-Signals bei 222 nm gemessen. Im Vergleich zu natürlich vorkommender IF1-N1 ergab sich eine starke Destabilisierung durch die Veränderung der Schleife (Tabelle 3.4.1). Die Abnahme des TM-Wertes um über 10 °C fällt dabei noch deutlicher aus als die Stabilisierung von fd N1 durch die reziproke Substitution seiner langen Schleife durch die homologe Schleife EGDS aus IF1-N1 (TM = 8 °C, Kapitel 3.3.1). Wie bereits bei der Variante fd G3P* EGDS beobachtet, hat der Austausch der Region jedoch keinen Einfluss auf die Kooperativität des Überganges. Das bedeutet, dass die Destabilisierung nicht durch eine weniger kompakte Faltung verursacht wird. Zwar bleibt die Nettoladung der Schleife gleich, durch die Verlängerung wird jedoch an ihrem N-terminalen Ende ein zusätzlicher Aspartatrest eingefügt. Da sich analog zur N1-Domäne des Phagen fd mit den AS Asp46 und Asp48 zwei negativ geladene Reste in unmittelbarer Umgebung befinden (Abbildung 3.4.1b), wird die ungünstige negative Oberflächenladungsdichte in dieser Region zusätzlich vergrößert. Der destabilisierende Effekt auf die N1-Domäne in der Chimäre ist noch gravierender. Der Übergangsmittelpunkt der Domäne ist nochmals um mehr als 4 °C verringert (Tabelle 3.4.1). Der Stabilitätsunterschied zeigt an, dass sich die Verknüpfung mit N2 über die Gelenkregion 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.. N1 T13I fd G3P AETVESCLAKPHIENSFTNVWKDDKTLDRYANYEGCLWNATGVVVCTGDETQCYGTWVPIGLAIPEN N1 IF1 G3P ATTDAECLSKPAFDGTLSNVWKEGDS--RYANFENCIYELSGIGIGYDNDTSCNGHWTPVRAAD--- IF1-N1DDKTLD ATTDAECLSKPAFDGTLSNVWKDDKTLDRYANFENCIYELSGIGIGYDNDTSCNGHWTPVRAAD--- Glu50 Asp49 Asp46 Asp48 a) b) Ergebnisse und Diskussion 123 ungünstig auf N1 auswirkt. Auch im WT fd G3P* ist die N1-Domäne relativ zur isolierten N1-Domäne leicht destabilisiert, jedoch ist hier der Unterschied mit 2,1 °C nicht so stark ausgeprägt. Tabelle 3.4.1: Thermische Stabilitätsdaten von IF1-N1DDKTLD und der Chimäre fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY. Domänendissoziation und Entfaltung der N2-Domäne Entfaltung der N1-Domäne Variante TM (°C) H (kJ mol-1) G45°C (kJ mol-1) TM (°C) H (kJ mol-1) G55°C (kJ mol-1) Isolierte IF1-N1 - - - 67,2 232 8,1 Isolierte IF1-N1DDKTLD - - - 56,8 238 1,3 fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY 46,3 341 1,4 52,7 222 -1,6 isolierte N1 - - - 62,3 234 5,0 isolierte N1 T13I - - - 67,5 235 8,4 isolierte N2 Q129H 38,8 344 -7,4 - - - WT fd G3P* 48,0 612 5,6 60,2 230 3,5 fd G3P* T101I 56,2 626 19,4 62,7 262 5,9 fd G3P* IIHY 61,2 644 27,2 66,0 228 7,2 fd G3P* IIHY 6 36,7 285 -8,7 64,1 202 5,3 Angegeben sind für die Varianten die Schmelztemperaturen TM, die Enthalpien der jeweiligen Entfaltungsreaktion am TM (H) und die freien Enthalpien der Entfaltung G45°C und G55°C bei 45 °C bzw. 55 °C. Die Übergänge der N2-Domänen im G3P, welche über die Änderung des CD-Signals bei 210 nm verfolgt wurden, wurden gemäß eines Zweizustandsmodells analysiert. Die Daten für N1 im G3P* und der wurden nach Auswertung des biphasischen Entfaltungsübergangs, der anhand des CD-Signals bei 230 nm gemessen wurde, gemäß eines Dreizustandsmodells erhalten. Der erste Übergang spiegelt die Entfaltung der N2-Domäne sowie die Dissoziation der Domänen wider, der zweite Übergang die Denaturierung der N1-Domäne. Die thermischinduzierten Übergänge der isolierten N1-Domänen des Phagen IF1 wurden anhand der CD-Signaländerung bei 222 nm gemessen. Der Übergang der isolierten fd-N1-Domänen wurde über die Änderung des CD-Signals bei 230 nm gemessen und gemäß eines Zweizustandsmodells ausgewertet. Zur Auswertung der Entfaltungsübergänge wurde für die G3P*-Varianten eine konstante Änderung der Wärmekapazität Cp von 10000 J mol-1 K-1 für N2 und für N1 1000 J mol-1 K-1 angenommen, für die isolierten N2-Domänen wurden CpWerte von 8000 J mol-1 K-1 und für die isolierten N1-Domänen 1000 J mol-1 K-1 verwendet. Die Daten für WT fd G3P*, isolierte N1 T13I und fd G3P* IIHY wurden der Referenz 121 entnommen. Die Stabilitätsparameter von fd G3P* IIHY G153D bzw. isolierter N1-Domäne wurden aus den Arbeiten 150 bzw. 152 erhalten. Die Daten von isolierter N2 Q129H wurden der Referenz 151 entnommen. Die Daten der isolierten fdN1-Domäne bzw. isolierten IF1-N1-Domäne wurde den Arbeiten 152 und 91. Die Werte für die Domänen des fd G3P* T101I entstammen der Referenz 79, die Daten der Variante fd G3P* IIHY 6 wurden Referenz 80 entnommen. Die Übergänge von 4 µM Protein (1 µM bei 210 nm) wurden in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit einer Schichtdicke von 1 cm, einer Heizrate von 60 °C h-1 und einer Dämpfung von 8 s gemessen. Während der Denaturierung der N2-Domäne des Wildtyp-Proteins sind die Entfaltung der Gelenkregion und die Dissoziation der Domänen N1 und N2 miteinander gekoppelt. Die Stabilität von N2 ist dementsprechend ein Maß für die Stärke der Domänenassoziation. In der Variante fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY sind günstige Interaktionen zwischen den Domänen nur schwach ausgebildet. Zwar liegt der Übergangsmittelpunkt mit 46,3 °C deutlich über denen der isolierten N2 Q129H (38,8 °C) bzw. N2 aus der Deletionsvariante fd G3P* IIHY 6 (36,7 °C), die Enthalpie der Entfaltung befindet sich jedoch mit 341 kJ mol-1 im gleichen Bereich (Tabelle 3.4.1). Die relativ zu isolierter N2-Domäne erhöhte Stabilität der Chimäre ist folglich nicht auf die verstärkte Wechselwirkung zwischen den Domänen zurückzuführen. Im Gegensatz zu fd G3P* IIHY 6 ist in fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY mit dem Ergebnisse und Diskussion 124 6-Faltblattstrang auch der Austausch T101I enthalten. Im nativen G3P* führt diese in der Gelenkregion lokalisierte Substitution zu einer Erhöhung des TM-Wertes um mehr als 8 °C (Tabelle 3.4.1), wobei aufgrund des geringen Abstandes zur N1-Domäne von 4 Å vermutet wurde, dass hydrophobe Wechselwirkungen zu N1 dafür verantwortlich sind.121 Zwar wird in der Chimäre der gedockte Zustand nicht eingenommen, es ist jedoch möglich, dass durch Interaktionen der Reste der flankierenden Gelenkregion die Enden des globulären Teils von N2 zusammengehalten und die Domäne dadurch entropisch stabilisiert wird. Zusätzlich wurde wiederum die Stabilität gegenüber dem Denaturierungsmittel GdmCl untersucht. Dabei zeigte sich, dass in fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY die Änderung der Fluoreszenz sowohl nach Anregung bei 280 nm als auch 295 nm nicht selektiv für die Entfaltung der N2bzw. N1-Domäne ist, obwohl in dieser Variante die gleiche Anzahl an Fluorophoren enthalten ist wie im fd G3P* IIHY. Der Verlauf des Signals bei 310 nm nach Anregung bei 280 nm konnte nicht ausgewertet werden. Die Daten aus dem biphasischen Übergang bei 325 nm nach Anregung bei 295 nm (Abbildung 10.1 im Anhang) sind in Tabelle 3.4.2 aufgelistet. Aufgrund der geringen Stabilitätsunterschiede sind die beiden Phasen nicht sehr gut voneinander getrennt. Da zusätzlich N2 im Vergleich zur Ausgangsvariante deutlich destabilisiert und daher die Basislinie des nativen Proteins schlecht definiert ist, sind die erhaltenen Parameter stark fehlerbehaftet. Wie bereits bei der thermischen Entfaltung beobachtet, ist die N2-Domäne in der Chimäre trotzdem leicht gegenüber der isolierten N2-Domäne stabilisiert. Der [GdmCl]m-Wert von isolierter IF1-N1DDKTLD ist relativ zur isolierten IF1-N1-Domäne ebenfalls deutlich um 1,2 M GdmCl verringert (Tabelle 3.4.2). Der Übergangsmittelpunkt der N1-Domäne des fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY im Vergleich dazu wiederum geringfügig zu niedrigeren Denaturierungsmittelkonzentrationen verschoben, was sich mit den Ergebnissen der thermischen Entfaltung deckt. Tabelle 3.4.2: Stabilitätsdaten von IF1-N1DDKTLD und der Chimäre fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY aus GdmClinduzierter Entfaltung. Domänendissoziation und Entfaltung der N2-Domäne Entfaltung der N1-Domäne Variante [GdmCl]m (M) m (kJ mol-1 M-1)  G (kJ mol-1) [GdmCl]m (M) m (kJ mol-1 M-1) G (kJ mol-1) isolierte IF1-N1 - - - 3,6 7,8 29,0 isolierte IF1-N1DDKTLD - - - 2,4 6,5 15,0 fd G3P* IF1N1DDKTLDIHY 0,9 23,0 19,8 2,2 6,1 13,6 isolierte N2 Q129H 0,7 15,9 10,9 - - - fd G3P* IIHY 2,5 14,9 37,2 3,2 8,9 28,6 Angegeben sind die Übergangsmittelpunkte [GdmCl]m, die Kooperativitätsparameter m sowie die auf 0 M GdmCl extrapolierten freien Enthalpien der Entfaltung G bei 25 °C. Der Übergang von N2 im fd G3P* bzw. isolierter N2 Q129H wurde anhand der Fluoreszenz bei 310 nm bzw. 340 nm (Anregung 280 nm) gemessen, der der N1-Domäne im fd G3P* IIHY bei 360 nm (Anregung 295 nm) verfolgt. Der Verlauf der Entfaltung der isolierten N1-Domänen des Phagen IF1 wurde bei 325 nm (Anregung bei 280 nm) aufgenommen. Für beide Domänen erfolgte die Analyse der Daten nach einem Zweizustandsmodell. Die GdmCl-induzierte Entfaltung der Domänen der Chimäre wurde über die Fluoreszenz bei 325 nm (Anregung bei 295 nm) verfolgt. Der entsprechende Übergang wurde gemäß eines Dreizustandsmodells ausgewertet. Die Daten für die isolierte Ergebnisse und Diskussion 125 IF1-N1-Domäne wurde Referenz 91 und die Parameter für fd G3P* IIHY der Referenz 121 entnommen. Die Daten isolierter N2 Q129H sind eine persönliche Mitteilung von Roman Jakob. Um zu untersuchen, wie sich der Austausch der Schleife in IF1-N1 auf die Faltung des Proteins auswirkt, wurden die entsprechenden Entund Rückfaltungskinetiken gemessen (Abbildung 3.4.2). Aus dem Verlauf der entsprechenden Raten geht hervor, dass sich der Austausch der Schleifenregion auf beide Geschwindigkeitskonstanten kEF und kRF ungünstig auswirkt. Die Entfaltung von IF1-N1DDKTLD ist gegenüber IF1-N1 achtfach beschleunigt, die Rückfaltung dagegen 2,7fach verlangsamt. Demnach wird nicht nur der entfaltete Zustand stabilisiert sondern gleichzeitig auch die gefaltete Form destabilisiert. Zusammen mit den unveränderten Kooperativitäten (Tabelle 10.2 im Anhang) bestätigt dies, dass in der gefalteten IF1-N1-Domäne durch die Substitution der Schleifensequenz lokal ungünstige Wechselwirkungen ausgebildet werden. Abbildung 3.4.2: Chevron-Auftragung der Faltungsund Entfaltungsraten von IF1-N1 und IF1-N1DDKTLD. Gezeigt sind die apparenten Rückfaltungs- (offene Symbole) und Entfaltungsraten (geschlossene Symbole) von isolierter IF1-N1 (;) und IF1-N1DDKTLD (;●) in Abhängigkeit von der GdmCl-Konzentration. Die durchgezogenen Linien repräsentieren den Angleich an die Datenpunkte gemäß eines Zweizustandsmodells. Die daraus erhaltenen thermodynamischen Parameter sind im Anhang in Tabelle 10.2 aufgelistet. Die entsprechenden Kinetiken wurden nach stopped-flow-Mischung anhand der Änderung der Trp-Fluoreszenz oberhalb von 330 nm nach Anregung bei 295 nm mit 1 µM Protein verfolgt. Alle Messungen wurden in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 bei 25 °C durchgeführt. Daten der isolierten IF1-N1-Domäne wurden der Referenz 91 entnommen. 3.4.2 In der Chimäre fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY liegen die Domänen IF1-N1DDKTLD und N2 in nicht assoziierter Form vor Zur Analyse, wie stark die Wechselwirkungen durch den Austausch der modifizierten N1-Domäne verringert sind, wurde der Faltungsmechanismus der Variante fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY untersucht. Sowohl die Rückfaltungsals auch die Entfaltungsraten von N1 der Chimäre (;, Abbildung 3.4.3) sind identisch zu denen der korrespondierenden isolierten N1-Domäne (;, Abbildung 3.4.3, Tabelle 10.2 im Anhang). Im Gegensatz zur stabilisierten Ausgangsvariante fd G3P* IIHY ist demnach die Entfaltung von N1 deutlich beschleunigt. Die Rückfaltung der N2-Domäne der Chimäre in die - Form ist geringfügig gegenüber der der isolierten N2-Domäne verlangsamt (;, Abbildung 3.4.3). Die N2-Domäne wird folglich nur leicht durch das Zusammenhalten [GdmCl] (M) 0123456  (s-1) 1 1 10 2 10 3 10 Ergebnisse und Diskussion 126 der Enden stabilisiert und nicht wie im fd G3P* IIHY durch die Einnahme des loseassoziierten Zustandes (;, Abbildung 3.4.3). Die Interaktionen zwischen den Domänen während der Faltung sind folglich nur sehr schwach ausgeprägt. Abbildung 3.4.3: Analyse der Faltungsund Entfaltungsraten der Chimäre fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY. Auftragung der apparenten Entfaltungs- (gefüllte Symbole) und Rückfaltungsraten (offene Symbole) von fd G3P* IIHY (graue Symbole) und fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY (farbige Symbole) in Abhängigkeit von der GdmCl-Konzentration. Die langsamen Entfaltungs- () und Rückfaltungsraten () der N2-Domäne der Chimäre wurden nach manueller Mischung gemessen. Gezeigt sind außerdem die schnellen Rückund Entfaltungsraten der N1-Domäne in der Chimäre (;), die entsprechenden Raten der isolierten IF1-N1DDKTLD (;) und die konformationelle Faltung der jeweiligen -Spezies (;), ausgehend von entfaltetem Protein. Die Entfaltung der -Spezies aus dem nicht assoziierten Zustand () konnte bereits in Einzelmischexperimenten nach schneller Mischung detektiert werden. Die entsprechenden Raten wurden zusätzlich auch Anregung bei 295 nm anhand der Änderung der Fluoreszenz oberhalb von 340 nm erhalten (). Die Entfaltung der N2Domäne aus dem lose-assoziierten Zustand des fd G3P* IIHY wurde ausgehend von vollständig entfaltetem Protein nach Rückfaltung für 180 s () in 0,5 M GdmCl und Sprung in Entfaltungsbedingungen gemessen. Die Entfaltungs- (●) und Rückfaltungsraten () des fd G3P* IIHY nach manueller Mischung gemessen. Zu Vergleichszwecken aufgetragen sind außerdem die Entfaltungsraten der N1-Domäne im ungedockten fd G3P* IIHY (), deren Rückfaltung aus dem entfalteten Zustand () und die Entund Rückfaltungsraten der isolierten N2-Domäne Q129H (;).Die Reaktionen der N1-Domänen nach schneller Mischung wurden anhand der Trp-Fluoreszenz oberhalb von 340 nm nach Anregung bei 295 nm verfolgt, die der N2-Domänen oberhalb von 320 nm nach Anregung bei 280 nm. Die Faltungsraten der N2-Domänen nach manueller Mischung wurden über die Messung der Fluoreszenz bei 310 nm erhalten. Die Daten von fd G3P* IIHY wurden der Publikation 122 entnommen. Die Messungen wurden in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit 0,5 bzw. 1 µM Protein bei 25 °C durchgeführt. Nach manueller Mischung ist lediglich eine Rückfaltungsreaktion detektierbar, deren Rate unabhängig von der GdmCl-Konzentration ist (, Abbildung 3.4.3). Mit einer Zeitkonstante von 37 s (in 0,6 M GdmCl) liegt sie im Bereich der Isomerisierung von Pro161 (Abbildung 3.1.6, Kapitel 3.1.3). Während der Entfaltung kann nach manueller Mischung ebenfalls nur eine Reaktion detektiert werden, deren Zeitkonstante bei etwa 40 s liegt (, Abbildung 3.4.3). Dem Verlauf nach gehen die Raten der Phase in die langsame, von Pro161 limitierte Rückfaltungsreaktion über. Oberhalb von 2,0 M GdmCl verliert die Entfaltungsreaktion ihre Amplitude. Ab dieser GdmCl-Konzentration findet demnach die konformationelle Entfaltung der N2-Domäne vollständig in der Totzeit der manuellen Mischung statt. [GdmCl] (M) 0123456  (s-1) -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 1 1 10 2 10 3 10 Ergebnisse und Diskussion 127 Nach stopped-flow-Mischung ergeben sich unterhalb von 3,0 M GdmCl biexponentielle Kinetiken, deren schnelle Reaktion die Entfaltung der N1-Domäne widerspiegelt (, Abbildung 3.4.3). Der Verlauf der resultierenden Raten stimmt, wie schon erwähnt, mit dem der isolierten IF1-N1DDTKLD überein (, Abbildung 3.4.3). Die langsame Phase reflektiert die Entfaltung der N2-Domäne. Sie wird sowohl nach Anregung bei 280 nm als auch bei 295 nm beobachtet (;, Abbildung 3.4.3). Eine Kopplung zwischen den Domänen, die z.B. durch die Denaturierung der N1-Domäne verlangsamt wird, ist demnach nicht beobachtbar. Trotz der stabilisierenden Substitutionen T101I und D209Y in der Gelenkregion gehen die beiden Domänen der Chimäre während der Faltung weder in den gedockten noch in den loseassoziierten Zustand über. N1 und N2 liegen vielmehr in einer nicht assoziierten Form vor, die dem langlebigen Faltungsintermediat des Wildtyp-Proteins entspricht. Die Vermutung liegt daher nahe, dass sich IF1-N1DDKTLD in der Chimäre aufgrund lokaler Sequenzunterschiede nicht in der Weise anordnen kann wie die fd-N1-Domäne und dadurch die Einnahme der gedockten Form nicht möglich ist. In G3P des fd Phagen wird der assoziierte Zustand mit cis-Pro213 durch die Ausbildung eines Wasserstoffbrückennetzwerkes zwischen Resten der Gelenkregion und dem unteren Teil der N1-Domäne stark stabilisiert.62 Daran beteiligt ist, wie bereits erwähnt, unter anderem Gln52 in der N1-Domäne, das zu Gln212 zwei Wasserstoffbrücken ausbildet.120 In der Struktur der isolierten IF1-N1-Domäne befindet sich an dieser Position ein Serinrest, der folglich die Wechselwirkungen nicht im gleichen Maße aufrechterhalten kann. Desweiteren trägt Serinrest 16 zur Stabilisierung der assoziierten Form des fd G3P* bei. Der Rest bildet über sein Carbonylsauerstoffatom mit Val215 und seine Hydroxylgruppe mit Pro211 jeweils eine Wasserstoffbrücke aus. In IF1-N1 ist an der entsprechenden Position ein Threoninrest lokalisiert, der sich eventuell aufgrund der zusätzlichen Methylgruppe nicht optimal positionieren kann. Trotz der guten Übereinstimmung des Proteinrückgrates der Strukturen der beiden N1-Domänen gibt es demnach lokale Unterschiede, die vermutlich eine große Auswirkung auf die Stabilität des gedockten Zustandes haben. Dieser Effekt wird wahrscheinlich noch verstärkt durch die Anhäufung von Prolinresten in der Gelenkregion (Pro211, Pro213, Pro214, Pro96, Pro98), die die Flexibilität der Gelenkregion herabsetzen, weshalb alternative Interaktionspartner in der N1-Domäne weniger gut toleriert werden. Im Folgenden stellte sich die Frage, ob zumindest die Interaktion der verlängerten Schleife 1 der N1-Domäne der Chimäre zur Stabilisierung der N2-Domäne beiträgt. Anhand der Variante fd G3P* EGDS konnte gezeigt werden, dass die Interaktion mit der Schleifenregion wichtig ist für Stabilisierung des trans-Konformers von N2, das dadurch mit der gleichen Geschwindigkeit entfaltet wie die cis-Form (Kapitel 3.3.2). Um zu untersuchen, ob sich die Entfaltungsäste der cisund trans-Spezies der N2-Domäne der Chimäre unterscheiden, wurde die Entfaltung der Domäne mit trans-Pro161 nach kurzer Rückfaltung für 1 s in 0,35 M GdmCl verfolgt (, Abbildung 3.4.4). Ergebnisse und Diskussion 128 Abbildung 3.4.4: Faltungsund Entfaltungsraten des fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY nach schneller Mischung. Auftragung der apparenten Entfaltungs- (gefüllte Symbole) und Rückfaltungsraten (offene Symbole) der Domänen des fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY in Abhängigkeit von der GdmCl-Konzentration. Gezeigt sind die schnellen Rückund Entfaltungsraten der N1-Domäne in der Chimäre (;) und die konformationelle Faltung der -Spezies () ausgehend von entfaltetem Protein. Die Entfaltung der N2-Domäne aus dem nativen Zustand () wurde in Einzelmischexperimenten nach schneller Mischung detektiert. Die Denaturierung der -Form der Chimäre wurden nach Rückfaltung für 1 s in 0,35 M GdmCl und erneuter Überführung in Entfaltungsbedingungen beobachtet (). Zu Vergleichszwecken aufgetragen sind außerdem die Entund Rückfaltungsraten der isolierten N2-Domäne Q129H (;). Die Reaktionen der N1-Domäne nach schneller Mischung wurden anhand der Trp-Fluoreszenz oberhalb von 340 nm nach Anregung bei 295 nm verfolgt, die der N2-Domäne oberhalb von 320 nm nach Anregung bei 280 nm. Die Messungen wurden in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit 0,5 bzw. 1 µM Protein bei 25 °C durchgeführt. Tatsächlich ist die Geschwindigkeit der Entfaltung der -Form (, Abbildung 3.4.4) gegenüber dem Entfaltungsast der N2-Domäne ausgehend von nativem fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY leicht beschleunigt (, Abbildung 3.4.4). Dies zeigt, dass analog zur Variante fd G3P* EGDS während der Faltung des globulären Teils von N2 keine günstigen Wechselwirkungen zu der verlängerten Schleifenregion in der N1-Domäne ausgebildet werden. Der Austausch der Schleife und die Anwesenheit der Gelenkregion reichen demnach nicht aus, damit IF1-N1 und die N2-Domäne des fd G3P miteinander assoziieren können. 3.4.3 Durch die Gegenwart der N2-Domäne wird die Affinität der IF1-N1-Domäne in der Chimäre für TolAC-AEDANS nicht beeinflusst Durch die Substitution der N1-Domäne kann weder der gedockte noch der lose-assoziierte Zustand eingenommen werden. In diesem Fall sollte die Affinität der N1-Domäne der Chimäre relativ zur isolierten Form unverändert sein. Tatsächlich ist der KD-Wert von fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY mit 4,7 µM nur unwesentlich gegenüber IF1-N1DDKTLD (KD = 3,7 µM) erhöht (Tabelle 3.4.3). Der Unterschied fällt bei den über die Auftragung der Raten erhaltenen Dissoziationskonstanten größer aus (6,5 µM und 4,4 µM), was auf die geringfügig verringerte Assoziationsrate und damit vermutlich etwas schlechtere Zugänglichkeit von N1 in der Chimäre zurückgeführt werden kann. [GdmCl] (M) 01234  (s -1 ) -1 10 1 1 10 2 10 Ergebnisse und Diskussion 129 Der Komplex aus fd N1 bzw. IF1-N1 und TolAC wird unter anderem durch drei Salzbrücken stabilisiert. Zwei der drei wechselwirkenden Reste von TolAC, Arg158 und Asp210, besitzen mit Arg29 (fd-N1) bzw. Arg27 (IF1-N1) und Glu50 bzw. Asp48 homologe Interaktionspartner auf N1 (Abbildung 3.4.5). Die Salzbrücke ausgehend von Lys212 wird dagegen, wie bereits erwähnt, in IF1-N1 zu Glu37 ausgebildet, während in der N1-Domäne des fd Phagen mit Asp28 der letzte Rest der Schleifenregion an der Interaktion beteiligt ist.91 Tabelle 3.4.3: Parameter der Interaktion von TolAC-AEDANS mit verschiedenen IF1-G3P*-Varianten. Variante [NaCl] (M) kon (µM-1s-1) koff (s-1) koff/kon (µM) KD (µM) Isolierte IF1-N1 0 0,24 ± 0,01 1,06 ± 0,01 4,4 3,3 ± 0,1 1 0,22 ± 0,01 1,23 ± 0,02 5,6 4,5 ± 0,1 Isolierte IF1-N1 E37N 0 0,23 ± 0,01 1,91 ± 0,01 8,4 7,2 ± 0,7 Isolierte IF1-N1DDKTLD E37N 0 0,32 ± 0,01 1,96 ± 0,02 6,3 5,3 ± 0,2 Isolierte IF1-N1DDKTLD 0 0,4 ± 0,01 1,74 ± 0,01 4,4 3,7 ± 0,1 0,5 0,37 ± 0,01 1,71 ± 0,01 4,6 3,0 ± 0,3 1 0,39 ± 0,01 1,55 ± 0,01 4,0 3,6 ± 0,2 fd G3P* IF1-N1DDKTLD IHY 0 0,26 ± 0,01 1,68 ± 0,04 6,5 4,7 ± 0,2 0,5 0,15 ± 0,01 1,57 ± 0,01 10,5 7,7 ± 0,3 1 0,11 ± 0,01 1,44 ± 0,01 13,1 11,4 ± 0,2 Angegeben sind die aus der Analyse der Amplituden mittels Gleichung 43 erhaltenen KD-Werte sowie die mikroskopischen Raten koff und kon aus der Auswertung der apparenten Assoziationsraten. Deren Quotient ergibt ebenfalls die Dissoziationskonstante des Komplexes aus der jeweiligen N1-Domäne und 0,2 µM TolACAEDANS. Die Daten von IF1-N1 in Abwesenheit bzw. in 1 M NaCl wurden der Masterarbeit von Stefanie Hofmann entnommen.169 Die Messungen erfolgten in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 und den angegebenen Salzkonzentrationen bei 25 °C. Abbildung 3.4.5: Überlagerung der Strukturen der Komplexe aus IF1-N1 und TolAC bzw. fd-N1 und TolAC. Gezeigt sind die Strukturen von TolAC (grün) im Komplex mit fd-N1 (rot, PDB-Eintrag 1TOL81) und TolAC im Komplex mit IF1-N1 (violett bzw. grau; PDB-Eintrag 2X9A91). Als Stäbchen-Modelle dargestellt sind die in der fd-N1-Domäne enthaltenen Reste Asp28, Arg29 und Leu27, die Reste Arg27, Glu37 und Asp48 der IF1-N1Domäne sowie die Reste Arg158, Asp210 und Lys212 von TolAC. Die die Reste 23 bis 26 bzw. 28 umfassende homologe Schleifenstruktur ist in der linken Abbildung hellblau (IF1-N1) bzw. orange (fd G3P*) eingefärbt. Die Abbildung wurde mit dem Programm Pymol63 erstellt. Lys212 Glu37 Asp28 Asp210 Arg29/Arg27 Glu50/Asp48 Arg158 Ergebnisse und Diskussion 130 Durch die Substitution der Schleifensequenz enthält IF1-N1DDKTLD mit Asp28 neben Glu37 einen zusätzlichen potenziellen Interaktionspartner für Lys212 im TolAC, trotzdem ist die Affinität dieser Variante für TolAC im Vergleich zu IF1-N1 nicht verbessert (Tabelle 3.4.3). Unterschiede ergeben sich allerdings bei den Werten für kon und koff, die für IF1-N1DDKTLD jeweils leicht erhöht sind. Demnach wird der Komplex zwar schneller gebildet, ist jedoch gleichzeitig weniger stabil. Der Austausch des Glu37 gegen Glutamin in der isolierten IF1-N1 führt zu einer zweifachen Erhöhung des KD-Wertes, was hauptsächlich in der Beschleunigung der Dissoziation begründet liegt (Tabelle 3.4.3). Dieser Effekt kann jedoch zumindest teilweise durch die weitere Substitution der Schleifenregion kompensiert werden. Im Vergleich zu isolierter IF1-N1 E37N (KD = 7,2 µM) ist die Dissoziationskonstante der Variante IF1-N1DDTKLD E37N nur leicht auf 5,3 µM verringert (Tabelle 3.4.3). Glu37 hat folglich keinen großen Einfluss auf die Affinität der N1-Domäne für TolAC. Wie zusätzlich die Analyse der Bindungsaffinität einer TolAC-Variante, in der unter anderem Lys212 gegen Aspartat ausgetauscht wurde, gegenüber fd-N1 bzw. IF1-N1 gezeigt hat, scheint der Einfluss der einzelnen Salzbrücken auf die Stabilität des Komplexes relativ gering zu sein. In beiden Fällen waren die KD-Werte zwar erhöht, lagen jedoch jeweils in der gleichen Größenordnung (Daten nicht gezeigt). Grund dafür ist vermutlich das zusätzlich über Wasserstoffbrücken zusammengehaltene, intermolekulare -Faltblatt zwischen den Interaktionspartnern, welches durch hydrophobe Wechselwirkungen stabilisiert wird (Abbildung 3.4.5). Folglich hat auch die Erhöhung der Salzkonzentration bis auf 1 M NaCl kaum eine Auswirkung auf die Affinität der isolierten IF1-N1DDTKLD bzw. IF1-N1 für TolAC (Tabelle 3.4.3). Interessanterweise nimmt dagegen in 1 M NaCl die Dissoziationskonstante der Chimäre deutlich von 3,6 auf mehr als 11 µM zu, was ausschließlich an der deutlich schlechteren Assoziationsrate liegt (Tabelle 3.4.3). Möglicherweise ist die Bindungsfähigkeit herabgesetzt, da die Interaktionen zwischen den Domänen der Chimäre in 1 M Salz verbessert sind und das Protein dadurch stärker geschlossen vorliegt. In diesem Fall müsste sich die Verbesserung der Wechselwirkungen zwischen IF1-N1DDKTLD und N2 auch in ihrem TM-Wert und vor allem der Enthalpie bemerkbar machen. Tatsächlich ergibt sich mit steigender NaCl-Konzentration eine Zunahme des H-Wertes, allerdings ist diese Salzabhängigkeit auch für die isolierte N2 Q129H beobachtbar (Tabelle 3.4.4). Während in 1 M NaCl der Übergangsmittelpunkt dieses Proteins geringfügig zu höheren Werten verschoben ist, sind die TM-Werte beider Domänen im fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY sogar leicht verringert, was gegen eine stärkere Assemblierung der Domänen in diesem Konstrukt spricht. Ergebnisse und Diskussion 131 Tabelle 3.4.4: Thermische Stabilitätsdaten der isolierten N2-Domäne Q129H bzw. N1 und N2 in der Chimäre. Domänendissoziation und Entfal t ung der N2-Domäne Entfaltung der N1-Domäne Variante [NaCl] (M) TM (°C) H (kJ mol-1) G45°C (kJ mol-1) TM (°C) H (kJ mol-1) G55°C (kJ mol-1) isolierte N2 Q129H 0 38,8 344 -7,4 - - - 0,5 38,0 346 -8,7 - - - 1 39,6 392 -7,2 - - - fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY 0 46,3 341 1,4 52,7 222 -1,6 0,5 43,2 345 -2,0 51,0 193 -2,4 1 44,8 391 -0,2 50,5 192 -2,7 Angegeben sind für die beiden Proteine die Schmelztemperaturen TM, die Enthalpien der jeweiligen Entfaltungsreaktion am TM (H) und die freien Enthalpien der Entfaltung G45°C und G55°C bei 45 °C bzw. 55 °C. Die Übergänge der N2-Domänen, welche über die Änderung des CD-Signals bei 210 nm verfolgt wurden, wurden gemäß eines Zweizustandsmodells analysiert. Der Verlauf der Entfaltung der N1-Domäne wurde anhand der Änderung des CD-Signals bei 230 nm verfolgt und ebenfalls anhand eines Zweizustandsmodells analysiert. Zur Auswertung der Entfaltungsübergänge wurde für N2 in der Chimäre fd G3P* IF1-N1DDKTLDIHY eine konstante Änderung der Wärmekapazität Cp von 10000 J mol-1 K-1 für N2 und für N1 1000 J mol-1 K-1 angenommen, für die isolierte N2-Domäne Q129H wurde ein Cp-Wert von 8000 J mol-1 K-1 verwendet. Die Daten von isolierter N2 Q129H in Abwesenheit von NaCl wurden der Referenz 151 entnommen. Die Messungen erfolgten in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit einer Schichtdicke von 1 cm und einer Heizrate von 60 °C h-1. Da das Denaturierungsmittel GdmCl ein Salz ist, finden die Entund Rückfaltung von Proteinen in GdmCl immer unter Hochsalzbedingungen statt. Um zu überprüfen, ob die Ionenkonzentration einen Einfluss auf den Faltungsmechanismus der Chimäre hat, wurden daher deren Entund Rückfaltungskinetiken zusätzlich im unpolaren Denaturierungsmittel Harnstoff bei 15 °C untersucht. Unter diesen Bedingungen ergeben sich sowohl nach Anregung bei 280 als auch bei 295 nm monophasische Gleichgewichtsübergänge, die die Denaturierung der N2-Domäne reflektieren. Die N1-Domäne liegt trotz ihrer nur geringfügig höheren Stabilität permanent in gefalteter Form vor. Wie auch schon bei der Entfaltung durch GdmCl beobachtet, ist der Übergangsmittelpunkt der N2-Domäne des fd G3P* IF1N1DDKTLDIHY mit 4,1 M Harnstoff deutlich gegenüber isolierter N2-Domäne Q129H erhöht ([Harnstoff]m = 2,6 M; Tabelle 10.3 im Anhang). Die Kombination aus verringerter Messtemperatur und dem im Vergleich zu GdmCl schwächeren Denaturierungsmittel Harnstoff macht es möglich, die Faltungskinetiken der N2-Domäne selektiv zu messen und so sowohl den Chevron der cis-Pro161-Spezies als auch den der labileren trans-Form der N2-Domäne Q129H aufzulösen (Abbildung 3.4.6). Wie bereits erwähnt unterscheiden sich bei der isolierten N2-Domäne die beiden Konformere mit cisbzw. trans-Pro161 lediglich in ihrer Rückfaltungsgeschwindigkeit, ihre Entfaltungsraten folgen dagegen dem gleichen Chevronast. Ergebnisse und Diskussion 138 Die Stabilitäten der Deletionsvarianten sind jedoch ähnlich hoch, daher ist anzunehmen, dass der größere Teil die gedockte Konformation einnimmt. Abbildung 3.5.2: Chevron-Auftragung der Entfaltungsund Rückfaltungsraten der Deletionsvarianten. Aufgetragen sind die apparenten Entfaltungs- (gefüllte Symbole) und Rückfaltungsraten (offene Symbole) von a) fd G3P* GG und b) fd G3P* GSEG in Abhängigkeit von der GdmCl-Konzentration. In rot sind die Reaktionen der N1-Domäne dargestellt, welche oberhalb von 340 nm anhand der Trp-Fluoreszenz nach Anregung bei 295 nm gemessen wurden. Nach Anregung bei 280 nm wurden die Faltungsraten der N2-Domäne (blaue Symbole) in Handmischexperimenten über die Messung der Fluoreszenz bei 310 nm und nach schneller Mischung über die Verfolgung der Fluoreszenz oberhalb von 320 nm erhalten. Die Rückfaltung der N1-Domäne (), die Entfaltung des nativen Proteins oberhalb von 2,3 M GdmCl (;) und der N2-Domäne im nicht assoziierten Zustand () wurden nach schneller Mischung an einer stopped-flow-Apparatur gemessen. Die schnellere () und langsamste () Rückfaltungsreaktion von N2 und die zwei bzw. drei Entfaltungsreaktionen der N2-Domäne aus dem nativen Zustand (;●;●) wurden nach manueller Mischung aufgenommen. In grau sind jeweils zum Vergleich analogen die Daten des WT fd G3P* aufgetragen. Die entsprechenden Raten wurden der Abbildung 3.1.6 (Kapitel 3.1.3) entnommen. Gezeigt sind dabei die aus Doppelsprungexperimenten erhaltenen Raten der durch die Isomerisierung von Pro161 limitierten Entfaltung von N2 (), die Rückfaltung der ungedockten N2-Domäne () sowie die Entfaltung der N1-Domäne im nicht assoziierten Zustand (). Alle Messungen wurden bei 25 °C in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 mit 1 µM Protein durchgeführt. Im Gegensatz zur kurzen Deletionsvariante liegt natives fd G3P* GSEG wie die Ausgangsvariante fast ausschließlich im assoziierten Zustand vor. Die Entfaltungsund a) [GdmCl] (M) 0123456  (s -1 ) -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 1 1 10 2 10 3 10 [GdmCl] (M) 0123456  (s-1) -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 1 1 10 2 10 3 10 b) Ergebnisse und Diskussion 139 Rückfaltungsraten entsprechen denen von WT fd G3P* und es sind weder in den Handmischnoch in den stopped-flow-Mischexperimenten zusätzliche Phasen detektierbar (Abbildung 3.5.2b). Der einzige Unterschied ergibt sich für die Raten der Entfaltung aus dem gedockten Zustand oberhalb von 3 M GdmCl, die relativ zum WT fd G3P* geringfügig verlangsamt sind (;, Abbildung 3.5.2b). Die Abweichung tritt erst unter Denaturierungsbedingungen auf, bei denen die Entfaltung von der Denaturierung der N1Domäne abhängt. Die Rückfaltung der N1-Domäne ist wie in fd G3P* GG durch die Deletion des Linkers nicht beeinflusst. Trotz der Tatsache, dass sich die Länge der Linkerbereiche in den Deletionsvarianten um lediglich zwei AS unterscheidet, ist nur in fd G3P* GG der geöffnete Zustand signifikant populiert. Es ist daher unwahrscheinlich, dass der distale Glycin-Serin-reiche Linker im WT fd G3P* direkt an der Vermittlung von stabilisierenden Wechselwirkungen zwischen den beiden N-terminalen Domänen beteiligt ist, denn sonst wäre ein ähnlich destabilisierender Effekt auch für fd G3P* GSEG beobachtet worden. Der Faltungsmechanismus der Population an assoziierten Molekülen in der kurzen Deletionsvariante ist im Vergleich zu WT fd G3P* unverändert. Denkbar ist daher, dass die verknüpfende Linkersequenz in fd G3P* GG ausreicht, um den Abstand zwischen N1 und dem ersten Faltblatt der Gelenkregion im vollständig gefalteten Protein zu überbrücken. Damit jedoch der gedockte Zustand überhaupt eingenommen werden kann, sind neben der Isomerisierung von Pro213 zusätzlich strukturelle Umlagerungen der AS der Gelenkregion notwendig, die unter anderem zur Ausbildung der beiden -Faltblätter führen (Kapitel 3.2). Die zu starke Verkürzung des Linkerbereiches verhindert also vermutlich eine optimale Orientierung der Reste, wodurch die aufgrund der notwendigen Prolylisomerisierung ohnehin hohe Energiebarriere noch vergrößert und das Gleichgewicht leicht in Richtung der nicht assoziierten Spezies verschoben wird. 3.5.2 Die Affinität der N1-Domäne für TolAC ist unabhängig von der Länge des distalen Linkers des G3P* Die Stabilität und der Faltungsmechanismus des gedockten fd G3P* sind durch die Deletion des distalen Linkers nur geringfügig bzw. gar nicht beeinflusst. Es stellt sich daher die Frage, ob dieser Bereich eventuell eine Rolle für die Interaktion von N1 mit dem Rezeptor TolAC spielt. Denkbar ist, dass durch seine Länge und Flexibilität der Abstand der N1-Domäne zu N2 und der Gelenkregion vergrößert und somit die Bindungsfläche besser exponiert wird. Im nächsten Schritt sollte daher untersucht werden, wie sich die Verkürzung des ersten Linkerbereiches auf die Affinität des G3P* für TolAC auswirkt. Dazu wurden, wie in Kapitel 3.2.1 gezeigt, die Kinetiken der Bindung von TolAC-AEDANS an fd G3P* GG bzw. fd G3P* GSEG in Abhängigkeit von deren Konzentration gemessen. Anhand der Zunahme der Amplituden und der apparenten Raten (kapp) konnten die Dissoziationskonstanten bestimmt werden (Abbildung 3.5.3, Tabelle 3.5.3). Ergebnisse und Diskussion 140 Abbildung 3.5.3: Bindung der G3P*-Deletionsvarianten an den Rezeptor TolAC-AEDANS. a) Abhängigkeit der normierten Fluoreszenzamplituden aus den Assoziationskinetiken von der Konzentration an isolierter N1 (●), WT fd G3P* (●), fd G3P* GG (●) bzw. fd G3P* GSEG (●). Die Linien stellen den Angleich an die Daten gemäß Gleichung 43 dar. b) Auftragung der apparenten Assoziationsraten der Bindung von variierenden Konzentrationen isolierter N1 (●), WT fd G3P* (●), fd G3P* GG (●) bzw. fd G3P* GSEG (●) an 0,2 µM TolAC-AEDANS. Die Raten und Amplituden wurden aus dem Angleich monoexponentieller Funktionen an die Assoziationskinetiken erhalten. Durch lineare Regression (durchgezogene Linien) ergab sich aus dem Schnittpunkt mit der y-Achse die mikroskopische Rate der Dissoziation koff, aus der Steigung die mikroskopische Rate der Assoziation kon. Die Dissoziationskonstante KD wurde aus den Quotienten der beiden berechnet. Die Assoziationskinetiken wurden nach Anregung bei 280 nm anhand der Änderung der AEDANSFluoreszenz oberhalb von 460 nm in stopped-flow-Mischexperimenten verfolgt. Alle Messungen wurden bei 25 °C in 0,1 M KP-Puffer, pH 7,0 durchgeführt. Die erhaltenen KD-Werte und mikroskopischen Raten sind in Tabelle 3.5.3 aufgelistet. Tabelle 3.5.3: Bindungsparameter der Interaktion von TolAC-AEDANS mit den G3P*-Deletionsvarianten. Variante kon (µM-1s-1) ko ff (s-1)koff/kon (µM) KD (µM) Isolierte N1 0,97 ± 0,01 0,25 ± 0,01 0,26 0,28 ± 0,02 WT fd G3P* n.d. n.d. n.d. 82 ± 30 fd G3P* GG 0,014 ± 0,001 0,453 ± 0,002 32 13 ± 2 fd G3P* GSEG n.d. n.d. n.d. 59 ± 10 Angegeben ist der aus der Analyse der Amplituden erhaltene KD-Wert sowie die mikroskopischen Rate koff und kon aus der Auswertung der apparenten Assoziationsraten. Deren Quotient ergibt ebenfalls die Dissoziationskonstante des Komplexes aus dem jeweiligen G3P* und 0,2 µM TolAC-AEDANS. (n. d.: keine Auswertung möglich). Die Messungen erfolgten unter den in Abbildung 3.5.3 beschriebenen Bedingungen. Im nativen, gedockten Zustand des G3P ist die Bindungsstelle für TolAC größtenteils in der Interaktionsfläche zwischen N1 und N2 verborgen. Erst nach Dissoziation der beiden Domänen wird die Bindungsstelle zugänglich. Vollständig gefaltetes WT fd G3P* hat daher z.B. im Vergleich zu isolierter N1 eine sehr geringe Affinität gegenüber TolAC-AEDANS. Der aus der Auswertung der Amplituden erhaltene K D-Wert der längeren der beiden Deletionsvarianten, fd G3P* GSEG, ist mit 59 µM vergleichbar hoch. Eine verlässliche Auswertung der apparenten Raten war hier, wie auch schon beim WT fd G3P*, nicht möglich (Abbildung 3.5.3, Tabelle 3.5.3). Zwischen den beiden Varianten existieren also weder signifikante Unterschiede in der thermodynamischen Stabilität noch im Faltungsmechanismus und fd G3P* GSEG liegt wie das Wildtyp-Protein ebenfalls fast vollständig im gedockten a) [Protein] (µM) 0481216 k app (s -1 ) 0 1 2 3 4 5 6 b) [Protein] (µM) 0481216 relative Amplitude 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Ergebnisse und Diskussion 141 Zustand vor. In diesem hat die Verkürzung des distalen Linkers auf die Sequenz GSEG demnach keinen Effekt auf die Wechselwirkung mit TolAC. Die Affinität von fd G3P* GG gegenüber TolAC-AEDANS ist im Vergleich zur isolierten N1-Domäne vor allem aufgrund der deutlich geringeren Assoziationsrate noch immer sehr gering. Relativ zu WT fd G3P* bzw. fd G3P* GSEG ist jedoch der KD zumindest nach der Analyse des Amplitudenverlaufes signifikant verringert. Aus dem Quotienten der mikroskopischen Raten koff und kon ergibt sich ein höherer KD-Wert, der jedoch auch unter denen der anderen beiden G3P*-Varianten liegt. Verantwortlich dafür ist wahrscheinlich die im Vergleich zu den anderen Proteinen erhöhte Population an nicht assoziierten Molekülen, in denen die Interaktionsfläche auf N1 für TolAC-AEDANS besser zugänglich ist. Der Anteil an ungedocktem fd G3P* GG liegt danach bei maximal 10 %, wie der Vergleich mit der Dissoziationskonstante des langlebigen, nicht assoziierten Intermediates des WT fd G3P* zeigt (KD = 1,54 µM in zusätzlich 0,1 M GdmCl; Kapitel 3.2.1). Um die Bindungsfähigkeit der Deletionsvarianten im ungedockten Zustand zu untersuchen, wurde, wie unter Kapitel 3.1.7 beschrieben, ihre Rückfaltung in Gegenwart von TolACAEDANS anhand der Änderung der Akzeptorfluoreszenz detektiert. Bei allen drei Varianten erfolgt die Freisetzung von TolAC-AEDANS aus dem Komplex mit N1 über eine biexponentielle Reaktion, deren Raten die Faltung der N2-Domäne und die feste Domänenassoziation durch die Isomerisierung von Pro161 bzw. Pro213 in die cisKonformation widerspiegeln (Abbildung 3.5.4, Tabelle 3.5.4). Abbildung 3.5.4: Verdrängung von TolAC aus dem Komplex mit N1 durch Faltung des jeweiligen G3P*. Gezeigt sind die um den Pufferwert korrigierten Kinetiken der Freisetzung von TolAC-AEDANS bei der Rückfaltung von (●) WT fd G3P*, (●) fd G3P* GG bzw. (●) fd G3P* GSEG. Die Reaktionen wurde nach zehnfacher Verdünnung des jeweiligen denaturierten Proteins (10 µM in 5 M GdmCl) in Gegenwart von 1 µM TolAC-AEDANS anhand der AEDANS-Fluoreszenz bei 490 nm nach Anregung bei 280 nm verfolgt. Die Messungen wurden bei 25 °C in 0,1 M KP-Puffer, 0,5 M GdmCl, pH 7,0 mit einer Schichtdicke von 1 cm durchgeführt. Die schwarzen Linien stellen den Angleich biexponentieller Funktionen an die Daten da. Die daraus erhaltenen Raten und Amplituden sind in Tabelle 3.5.4 aufgelistet. t (s) 0100200 relative Fluoreszenz 0 20 40 60 7500 15000 22500 Ergebnisse und Diskussion 142 Tabelle 3.5.4: Raten und Amplituden der Freisetzung von TolAC-AEDANS aus dem Komplex mit N1 durch Faltung der verschiedenen G3P*-Deletionsvarianten. Variante A1 A2Ages  1(s1 )2 (s1 ) WT fd G3P* 23,9 37,4 61,3 82 5260 fd G3P* GSEG 25,6 28,9 54,5 78 5435 fd G3P* GG 18,9 27,7 46,5 84 4762 Aufgelistet sind die Raten und Amplituden aus dem Angleich biexponentieller Funktionen an die Kinetiken der TolAC-AEDANS-Verdrängung durch die Faltung der jeweiligen G3P*-Deletionsvariante. Die Messungen wurden unter den in Abbildung 3.5.6 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Die Zeitkonstanten der beiden Phasen stimmen jeweils überein, was wiederum bestätigt, dass die Linkerregion keinen Einfluss auf die Faltungskinetik des Wildtyp-G3P* hat. Die Anfangswerte der Deletionsvarianten sind jedoch im Vergleich zum WT fd G3P* leicht herabgesetzt. Das bedeutet, dass die Zugänglichkeit der Bindungsfläche auf der N1-Domäne im geöffneten Zustand dieser beiden Proteine schlechter ist. Hauptursache dafür ist vermutlich die verringerte Flexibilität der N1-Domäne im nicht assoziierten Zustand, welche bedingt wird durch die Verkürzung des Linkers. Abweichungen ergeben sich außerdem bei den Amplituden der Reaktionen. Erwartungsgemäß ist die Gesamtamplitude der TolACVerdrängung durch die Faltung von fd G3P* GG am kleinsten, da hier ein Teil der Moleküle nicht in die assoziierte Form übergeht. Der Fluoreszenzendwert dieser Verdrängungskinetik liegt dementsprechend deutlich über denen der anderen. 3.5.3 fd Phagen mit verkürztem distalem Linker haben bei der Propagation gegenüber dem Wildtyp-Phagen keinen Nachteil Der Vergleich der verkürzten Proteine mit WT fd G3P* zeigt, dass der distale Linker, wenn überhaupt, nur einen geringen Einfluss auf die Stabilität und Faltung des G3P* bzw. die Affinität der N1-Domäne gegenüber TolAC hat. Das legt die Vermutung nahe, dass dieser Bereich eventuell eine wichtige Funktion während eines der anderen Schritte der Phagenpropagation hat, denn das G3P ist unter anderem auch an der Fertigstellung der Assemblierung des Phagen beteiligt.15-17 Zur Überprüfung wurden im Gen-3 des Wildtyp-Phagen die entsprechenden Deletionen eingefügt und die DNA in E. coli Zellen eingebracht. Nach Inkubation der Zellen konnten aus deren Kulturmedium die entsprechenden Phagen fd G3P GG bzw. fd G3P GSEG isoliert werden. Die Assemblierung und Freisetzung der Phagenvarianten sind demnach durch die Verkürzung des ersten Serin-Glycin-reichen Linkers nicht beeinflusst. Die isolierten Phagen wurden zunächst für Infektionsexperimente mit pilusfreien E. coli HB2156 Zellen verwendet. Die Infektiosität der Phagen ist hier lediglich abhängig von der Population der Phagen mit geöffnetem G3P*, denn erst durch die Dissoziation der beiden N-terminalen Domänen wird die Bindungsstelle auf N1 für den Rezeptor TolAC zugänglich. Trotz der leicht erhöhten Affinität des fd G3P* GG gegenüber TolAC-AEDANS in vitro besitzt der entsprechende Phage relativ zu den fd WT Phagen und dem Phagen fd G3P* GSEG keine höhere Infektiosität gegenüber den F--Zellen (Daten nicht gezeigt). Der Ergebnisse und Diskussion 143 Anteil der Phagen mit nicht assoziiertem G3P ist demnach zumindest geringer als die Auflösungsgrenze des Infektionsexperimentes, das eine Genauigkeit von 10 % hat. Beim Vergleich der Infektiositäten der Phagenvarianten gegenüber pilushaltigen E. coli Zellen war ebenfalls kein Unterschied zum Wildtyp-Phagen detektierbar (Daten nicht gezeigt). Das bedeutet zum einen, dass auch für das Einbringen der ssDNA des Phagen in die Zelle nach der Interaktion von N1 mit TolAC die Länge des ersten Linkers nicht ausschlaggebend ist. Zum anderen findet sich kein Hinweis darauf, dass die von Nilsson et al. beobachtete Interaktion des Serin-Glycin-reichen Bereiches mit dem Pilus170 einen signifikanten Einfluss auf den Infektionsmechanismus hat. Die Genauigkeit des Vergleiches der Infektion verschiedener pilushaltiger E. coli Kulturen durch die Phagenvarianten ist jedoch verhältnismäßig gering, da die Konzentration an F-Pili stark von den Wachstumsbedingungen der Zellen abhängt. Wie bereits erwähnt war es bis zum jetzigen Zeitpunkt nicht möglich, die monomere Einheit des Pilus, das F-Pilin, in stabiler Form herzustellen. Ob es zwischen dem F-Pilus und dem distalen Linker zu Wechselwirkungen kommt, wodurch die Bindungsaffinität des G3P* gegenüber dem Pilus zusätzlich erhöht wird, konnte deshalb in vitro nicht untersucht werden. Sollte jedoch der Wildtyp-Phage durch die vermeintliche zweite Bindungsstelle bei der Interaktion mit dem Pilus einen Vorteil gegenüber den verkürzten Phagenvarianten haben, müsste er sich in einem entsprechenden Kompetitionsexperiment gegen diese Konkurrenz durchsetzen. Um dies zu untersuchen wurde eine E. coli TG1 Zellkultur mit gleichen Konzentrationen an fd WT Phagen und fd G3P GSEG bzw. fd G3P GG Phagen infiziert. Nach einer Runde bestehend aus Infektion, Phagenpropagation und -isolation wurden mit der erhaltenen Phagensuspension hintereinander drei weitere Zyklen durchgeführt, um eventuell vorhandene geringe Unterschiede in den Infektiositäten der Phagen zu amplifizieren. Nach jeder Infektionsrunde wurde von einer repräsentativen Anzahl an Zellen mittels PCR bestimmt, durch welche Phagenvariante sie infiziert worden waren. Dabei wurde ausgenutzt, dass die Gene des G3P der Deletionsphagen im Bereich des distalen Linkers deutlich kürzer sind als das ursprüngliche Gen-3. In Abbildung 3.5.5 sind die Ergebnisse der Kompetition zwischen dem fd WT Phagen und fd G3P GSEG bzw. fd G3P GG gezeigt. Auch nach vier Infektionszyklen war der Anteil der Phagen mit verkürztem G3P an der Gesamtmenge der koloniebildenden Einheiten (c.f.u.) unverändert, sie können sich also gegen den Wildtyp-Phagen behaupten. Die in den Kinetiken der TolAC-Verdrängung beobachtete, leicht verringerte Affinität von fd G3P* GSEG für TolAC im nicht assoziierten Zustand hat ebenfalls keine Auswirkung auf die Fitness des entsprechenden Phagen. Es ist allerdings nicht geklärt, ob das G3P der Phagen durch die Wechselwirkung von N2 mit dem Pilus lediglich in den nicht assoziierten Zustand übergeht oder N2 eventuell sogar vollständig entfaltet wird. In diesem Fall wäre die Bindungsstelle für TolAC auf der N1-Domäne aufgrund fehlender Interaktionen mit N2 auch im fd G3P* GSEG Phagen permanent zugänglich. Ergebnisse und Diskussion 144 Abbildung 3.5.5: Kompetition der Deletionsphagen mit dem Wildtyp-Phagen um die Infektion von F+-Zellen. Aufgetragen ist der jeweilige Anteil an a) Phagen fd G3P GSEG (grau) bzw. fd WT Phagen (schwarz) und b) Phagen fd G3P GG (grau) bzw. fd WT Phagen (schwarz) an der Gesamtmenge an c.f.u. nach jedem Infektionszyklus. Vor der ersten Infektionsrunde wurden die jeweiligen Phagensuspensionen im Verhältnis von 1:1 gemischt und damit bei 25 °C E. coli TG1 Zellen (m.o.i. (multiplicity of infection) > 1) infiziert. Nach jedem der vier aufeinanderfolgenden Zyklen bestehend aus Infektion, Phagenpropagation und deren Präparation wurde von mindestens 48 Zellen mittels PCR bestimmt, durch welche Phagen sie infiziert worden waren. Dass die von Nilsson et al.170 beschriebene Interaktion zwischen dem distalen Linker und dem Pilus ausreicht, damit ein Phage mit G3P, bestehend aus N1, erstem Serin-Glycinreichem Linker und C-terminaler Domäne, pilushaltige Zellen ähnlich gut infizieren kann wie der fd WT Phage, ist nach den erhaltenen Ergebnissen unwahrscheinlich. Der Wildtyp-Phage hat bei der gleichzeitigen Infektion von F+-Zellen keinen Vorteil gegenüber den Deletionsphagen, deren Affinitäten für den Pilus durch das Fehlen des Linkers signifikant verringert sein sollten. Die Wechselwirkung der N2-Domäne mit der Spitze des F-Pilus wird zudem hauptsächlich über deren hydrophobe Reste Trp181, Phe190 und Phe194 vermittelt.68 Ein Austausch dieser AS gegen Alanin-Reste im G3P führt dazu, dass die entsprechende Phagenvariante F+-Zellen nicht mehr infizieren kann.68; 97 Der in diesem Phagen ebenfalls enthaltene distale Linker kann folglich den Verlust der Wechselwirkung von N2 mit dem Pilus nicht kompensieren. Infektionszyklus 1234 relativer Anteil an c.f.u. (%) 0 20 40 60 80 100 a) b) Infektionszyklus 1234 relativer Anteil an c.f.u. (%) 0 20 40 60 80 100 Ergebnisse und Diskussion 145 3.6 Strukturelle und energetische Grundlagen der Dimerisierung des G1-Proteins Wie das Beispiel des G3P des fd Phagen zeigt, ist die natürliche Evolution so ausgerichtet, dass Proteine zum einen unter den herrschenden Bedingungen ihre native Struktur aufrechterhalten und zum anderen ihre biologische Funktion optimal erfüllen können.31; 32 Die geringe Stabilität, vor allem gegenüber thermischer Denaturierung beeinträchtigt jedoch die industrielle Anwendbarkeit vieler Proteine, weshalb unter anderem Selektionsverfahren zur gerichteten evolutiven Stabilisierung immer stärkere Bedeutung erlangen.35 Mit Hilfe des in dieser Arbeitsgruppe entwickelten Selektionssystems Proside konnten bereits das Kälteschockprotein CspB aus B. subtilis und die TEM-1 β-Lactamase aus E. coli erheblich stabilisiert werden.54; 172 Die Proside-Methode basiert auf der Kopplung der Infektiosität des fd Phagen an die Proteaseresistenz und damit Stabilität des zwischen der Cterminalen und den beiden N-terminalen Domänen des G3P eingebauten Gastproteins.48; 49 Die Stabilisierung der Immunoglobulinbindungsdomäne 1 des Proteins G aus Streptococcus (G1) erfolgte in mehreren Schritten. Zunächst wurde dessen Gen mittels error-prone PCR randomisiert und die erhaltenen Phagenbibliotheken durch ProsideSelektion gerichteter Evolution unterworfen. Dadurch konnten von Michael Wunderlich mit Glu15, Thr16, Thr18, Ala24 und Asn37 fünf Reste identifiziert werden, welche anscheinend ein hohes Stabilisierungspotential aufweisen (Abbildung 3.6.1).57 Abbildung 3.6.1: Tertiärstruktur des G1-Proteins aus Streptococcus sp. Die fünf Reste mit Stabilisierungspotential Glu15, Thr16, Thr18, Ala24 und Asn37 sowie Tyr33 sind als Stäbchen-Modelle dargestellt. Die Abbildung wurde mit dem Programm Pymol63 erstellt und basiert auf den Koordinaten der PDB-Datei 1PGA173. Durch Sättigungsmutagenese an diesen Positionen und anschließender Proside-Selektion ergaben sich unter anderem in jeder der selektierten Varianten an den Positionen 16 und 37 Leucin-Substitutionen, die das Protein deutlich stabilisieren. Die Kombination der besten, allesamt hydrophoben Austausche E15V, T16L, T18I und N37L erhöht den TM-Wert der resultierenden Variante G1-M2 gegenüber WT-G1 um 35 °C.57 Eine thermodynamische Analyse der einzelnen Austausche sowohl im WT-G1als auch G1-M2-Hintergrund zeigte, dass vor allem die Interaktion zwischen den Leucinresten an den Ala24 Thr18 Thr16 Glu15 Asn37 Tyr33  3    Ergebnisse und Diskussion 146 Positionen 16 und 37 einen sehr hohen Beitrag zur Stabilisierung des G1-M2-Proteins liefert, wobei dessen Enthalpie der Entfaltung signifikant erhöht ist. Eine direkte Wechselwirkung zwischen den Resten konnte jedoch aufgrund des großen Abstandes der beiden AS von über 10 Å ausgeschlossen werden. Vielmehr wurde vermutet, dass die Interaktion über die aromatische Seitenkette des Tyr33 vermittelt wird (Abbildung 3.6.1).128; 174 Im Rahmen des Vertiefungspraktikums und der anschließenden Diplomarbeit wurde von mir die Funktion des Tyr33 für die Stabilität von G1 anhand weiterer Proside-Selektionen mit an den Positionen 16, 33 und 37 bzw. 16, 18, 33 und 37 randomisierten G1Phagenbibliotheken untersucht. Daraus resultierten sechs Varianten, von denen zwei an Position 33 den ursprünglichen Tyrosinrest besitzen. Diese Varianten G1-16L,18I,Y33,37L und G1-16L,18I,Y33,D36A,37L enthielten außerdem an den Positionen 16, 18 und 37 die gleichen AS wie G1-M2. Ansonsten waren an den variierten Positionen fast ausschließlich aromatische und aliphatische Substitutionen zu finden (Tabelle 10.4 im Anhang).175 Alle Proteine wiesen deutlich erhöhte Enthalpien und TM-Werte auf, die zum Teil noch über denen des hyperstabilen G1-M2 lagen. Bei allen Varianten zeigte sich zudem, dass ihre Stabilität abhängig von der eingesetzten Proteinkonzentration ist. Im Bereich von 1 bis 10 µM ergab sich jeweils ein Anstieg des TM-Wertes zwischen 0,7 °C (G1-16F,33M,37L) und 3,9 °C (G1-16L,33L,37I, Tabelle 10.4 im Anhang), was die Vermutung nahelegte, dass die Proteine unterschiedlich stark zur Ausbildung von Oligomeren neigen. Bei früheren über Proside-Selektionen stabilisierten G1-Varianten und WT-G1 konnte dagegen in diesem Konzentrationsbereich keine Tendenz zur Oligomerisierung beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Bei der Entfaltung von Oligomeren müssen zunächst die intermolekularen Wechselwirkungen zwischen den Molekülen gelöst werden damit die Monomere entfalten können. Die thermischen Entfaltungskurven der Varianten konnten jedoch gemäß eines einfachen Zweizustandsmodells ausgewertet werden. Eine Signaländerung, verursacht durch die Dissoziation der Oligomere, war demnach nicht direkt beobachtbar. Wenn ein Dimer entfaltet, trägt neben den einzelnen stabilisierenden Substitutionen jedoch folglich auch die Vergrößerung der kooperativen Einheit zur Erhöhung der apparenten Gesamtenthalpie der Entfaltung ΔHvH(Monomer) bei. Die Kooperativitäten der Übergänge der Varianten sind vermutlich deshalb deutlich um bis zu 230 kJ mol-1 gegenüber der des WT-G1 erhöht, das als monomeres Protein tatsächlich in einem Zweizustandsübergang entfaltet.175 3.6.1 Die hohe Stabilität der Variante G1-M2 wird zum Teil bedingt durch die Ausbildung von Dimeren Der Übergangsmittelpunkt und die Enthalpie der kombinierten Variante G1-M2 liegen im Bereich der Werte, die für die selektierten Varianten erhalten worden waren. Aus diesem Grund wurde die thermische Entfaltung von G1-M2 ebenfalls im Konzentrationsbereich von Ergebnisse und Diskussion 147 1 bis 10 µM untersucht (Abbildung 3.6.2). Die erhaltenen thermisch-induzierten Entfaltungsübergänge waren wieder einphasig, so dass der Angleich an die Daten unter der Annahme eines Zweizustandsmodells erfolgte. Abbildung 3.6.2: Konzentrationsabhängigkeit der thermisch-induzierten Entfaltung von WT-G1 und G1-M2. a) Auftragung der relativen Änderung des CD-Signals bei 222,6 nm von 1 () und 10 µM (●) WT-G1 bzw. 1 (), 4 () und 10 µM () G1-M2 in Abhängigkeit von der Temperatur. Die durchgezogenen Linien stellen den Angleich an die Messwerte nach Auswertung unter der Annahme des Zweizustandsmodells NU dar. Die Übergänge wurden in 0,1 M Na-Cacodylatpuffer, pH 7,0 in Gegenwart von 1,5 M GdmCl mit einer Schichtdicke von 1 cm, einer Heizrate von 90 °C h-1 und einer Dämpfung von 8 s gemessen. Die aus der Datenanalyse erhaltenen thermodynamischen Parameter sind in Tabelle 3.6.1 aufgelistet. b) Abhängigkeit der Schmelztemperatur TM von der Konzentration Ct an monomerem G1-M2. Die aufgetragenen Übergangsmittelpunkte resultieren aus der Analyse der CD- () und DSC-Messungen (, Tabelle 3.6.1). Nach Gleichung 17 lässt sich durch lineare Regression aus der Steigung die Gesamtenthalpie der Entfaltung HvH(Dimer) ausgehend von vollständig dimerem G1-M2 zu 615 ± 17 kJ mol-1 berechnen. Im Gegensatz zu WT-G1 ist auch die Entfaltung von G1-M2 konzentrationsabhängig (Tabelle 3.6.1). Zwischen 1 und 10 µM steigt der Schmelzpunkt um 3,6 °C und die Enthalpie von 360 auf 391 kJ mol-1, was andeutet, dass die hyperstabile Variante im angegebenen Konzentrationsbereich ebenfalls eine Tendenz zur Oligomerisierung hat. Um eine Aussage über den Oligomerisierungsgrad treffen zu können, wurden die Stabilitäten von WT-G1 und G1-M2 bei hohen Konzentrationen mittels DSC (Differencial Scanning Calorimetry) analysiert. Neben dem TM-Wert werden hier Informationen über die van’t Hoff und kalorimetrische Enthalpie erhalten, aus deren Quotient sich der Zweizustandscharakter eines Entfaltungsüberganges abschätzen lässt.176 Der Übergangsmittelpunkt von WT-G1 ist bis zu einer Konzentration von 100 µM konstant und das Verhältnis HvH/Hcal nahe 1, was bestätigt, dass das Protein in Lösung als Monomer vorliegt und gemäß des Zweizustandsmodells NU entfaltet (Tabelle 3.6.1). Im Vergleich dazu sind die Schmelzpunkte von G1-M2 bei 62 bzw. 139 µM genau wie die HvH-Werte signifikant erhöht. Die kalorimetrische Enthalpie Hcal wird dagegen auf Grundlage der Monomerkonzentration berechnet. Da sich für G1-M2 ein Quotient HvH/Hcal von etwa 2 ergibt, liegt dieses bei den untersuchten Konzentrationen folglich als Dimer vor. 10080604020 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 T (°C) relative Signaländerung -8-9-10-11-12-13-14 2,82 2,8 2,78 2,76 2,74 2,72 ln C t 1/T M (1000/K)