INSTITUTO DE INVESTIGACIONES
QUÍMICAS.
CENTRO DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
“ISLA DE LA CARTUJA”.
DEPARTAMENTO DE
QUÍMICA ORGÁNICA
UNIVERSIDAD DE SEVILLA
ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE INOSITOL
FOSFOGLICANOS MEDIANTE RMN, MECÁNICA Y
DINÁMICA MOLECULAR.
MEMORIA p esen ada pa a aspi a al g ado de Doc o en Ciencias Químicas po
Jesús Angulo Ál a ez
Se illa, 2002
MEMORIA p esen ada pa a aspi a al g ado de Doc o en Ciencias Químicas po
José Luis Muñoz Ponce
Se illa, 2015
D. PEDRO MANUEL NIETO MESA, Cien í ico Ti ula del C.S.I.C.
CERTIFICA:
Que el p esen e abajo i ulado: “ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE
INOSITOL FOSFOGLICANOS MEDIANTE RMN, MECÁNICA Y DINÁMICA
MOLECULAR” ha sido ealizado bajo mi di ección y aseso amien o, en el G upo de
Ca bohid a os, en el Ins i u o de In es igaciones Químicas, del Cen o de
In es igaciones Cien í icas Isla de La Ca uja (Se illa) du an e los años académicos
1999-2000, 2000-2001, 2001-2002 y 2002-2003, cons i uyendo la Memo ia que
p esen a el Lcdo. José Luis Muñoz Ponce pa a aspi a al G ado de Doc o en Ciencias
Químicas.
Se illa, 28 de Sep iemb e de 2015
Di ec o Tesis: Doc o ando:
Fdo.: Ped o M. Nie o Mesa Fdo. José Luis Muñoz Ponce
Es a esis doc o al se ha lle ado a cabo g acias a la ayuda de las becas
p edoc o ales, que se enume an a con inuación:
Beca p edoc o al del g upo Rademache G oup Limi ed
(Oc ub e1999-Diciemb e2000).
Beca pa a o mación y especialización en líneas de
in es igación de in e és pa a el sec o indus ial del CSIC
(Ene o 2001-Diciemb e 2001).
Beca pa a o mación y especialización en líneas de
in es igación de in e és pa a el sec o indus ial del CSIC-
I3P del CSIC (Feb e o 2002-Ene o 2003).
Beca Ins i u o “Reina So ía” de la Fundación RENAL
(Feb e o 2003-Junio 2003).
"La ciencia se compone de e o es, que a su ez son los pasos hacia
la e dad".
Julio Ve ne.
“No c eo que haya o a cualidad an esencial pa a el éxi o de
cualquie ipo que la pe se e ancia. Supe a a casi odo, incluso a la
na u aleza”.
John D. Rocke elle .
El ac ual abajo que p esen o, se ha ealizado en el Ins i u o de In es igaciones Químicas del
Consejo Supe io de In es igaciones Químicas, bajo la di ección del In es igado Cien í ico, el
D . Ped o Manuel Nie o Mesa. Han sido muchos años de u ela, di ección, apoyo y palab as de
comp ensión en los malos momen os y ag adezco de odo co azón que no haya pe dido la
espe anza y la cons ancia, pa a que es e p oyec o conjun o pueda ce a se con la consecución
de mi esis doc o al. Sé que ha luchado con a odo y odos, y que a eces los p oyec os ienen
un eco ido más co o del que que íamos, po eso e doy las g acias y po los buenos
momen os y ho as de RMN donde he podido ap ende con uno de los g andes de es e país.
No me gus a ía ol ida a la gen e que ocupa on un oci o de mi ida y a las que quie o
exp esa mi p o undo y since o ag adecimien o:
Sin la ayuda de la inanciación que ecibí du an e los años que ealicé la pa e expe imen al de
la esis, no hubie a podido exis i , al menos imp esa con mi nomb e. Po eso y en p ime luga ,
ag adece al P o eso Manuel Ma ín Lomas, po busca me y encon a me en aquel labo a o io
del CSIC en Mad id en 1999 cuando inalizaba mi Tesis de Licencia u a y o ece me la
posibilidad de i a un g upo especialis a donde ealiza la esis. Es oy o gulloso de habe
compa ido g upo con una de las pe sonas más p olí e as de es e país, e e encia de
in es igado es.
A las becas dis u adas y a las ins i uciones públicas y p i adas que posibili a on es a esis:
Beca p edoc o al del g upo Rademache G oup Limi ed (Oc ub e1999-Diciemb e2000).
Beca pa a o mación y especialización en líneas de in es igación de in e és pa a el
sec o indus ial del CSIC (Ene o 2001-Diciemb e 2001). Beca pa a o mación y
especialización en líneas de in es igación de in e és pa a el sec o indus ial del CSIC-
I3P del CSIC (Feb e o 2002-Ene o 2003).Beca Ins i u o “Reina So ía” de la Fundación
RENAL (Feb e o 2003-Junio 2003).
A los u o es que con amabilidad acep a on la u ela en la p esen e esis doc o al
del P og ama Es udios A anzados en Química; en p ime luga al D . José
Fuen es Mo a has a la echa de su jubilación y en el úl imo año y con cie a
p emu a el D . José Luis Jiménez Blanco, P o eso Ti ula Uni e sidad en
Uni e sidad de Se illa.
A los en onces Doc o es y hoy en día pila es en di e sas amas de in es igación
y con ca gos ins i ucionales bien di e en es: Soledad Penedés, Julio Delgado,
Luz Cadenas, F ancisco Pin o, Ja ie Rojo, E a A ce, Rica do Pé ez.
A los que ue on compañe os du an e la ealización de mi esis con los que an as
a en u as, dichas y desdichas compa í: Á ica, Rica do, Oli, Paco, Niels, Ja ie
Lopez, Julia, Sa a, Juan An onio, Jesús, C is ina, Belén, Félix, S ephan,
Flo ence, Mª José, Ma celo, Me cedes, Te e, Lize h, Na alia, José Luis de Paz,
Ra ael Ojeda, Sil ia.

Mención especial con mucho ca iño pa a mis “chicos de los espines o ien ados
con el campo”, con los que pasé muchas ho as de mi ida, deba iendo,
discu iendo, ampliando conocimien os, ealizándome como doc o ando y
ap endiendo: D . F anck Che alie y D . Jesús Angulo Ál a ez.
A mi amilia, po el ca iño.
A mis pad es adop i os, nunca la palab a sueg os u o un signi icado an g ande
y p óximo, g acias po ues a paciencia, apoyo in ini o y demos ación de
a ec o día a día, en los buenos y sob e odo en los malos momen os, y sabéis que
ambién exis ie on en una esis an la ga. Os debo mucho y nunca pod é
pagá oslo.
A mi amo , Pa icia Mo a, un apoyo básico sin el que no hubie a podido esis i .
Su con ianza y palab as de ánimo, su aleg ía y posi i idad, su amo sin
condiciones, hicie on de mi mejo pe sona e in es igado . El mo o de mi ida.
Te quie o.
Cuando inicié la p esen e esis no en aban ni en mis pensamien os y hoy en día
son ealidad de mi ida e indispensables, mis dos hijos: Is ael y Cecilia, quienes
con segu idad se abu i án en la de ensa de mi esis, pe o que el día de mañana
ag adece án a buen segu o habe podido asis i . Son mi sang e y ca ne, y a ellos
les pe enece odo lo que engo y soy; una pa e de es a esis a po oso os.
También dedica al aún non na o, aún iene iempo pa a que podamos explica le
que apo ó su pad e a la ciencia.
INDICE
PREFACIO
1.-INTRODUCCION
1.1.- INOSITOL DISTRIBUCCIÓN, ACTIVIDAD Y SIGNIFICANCIA
BIOLÓGICA. Pag 5-6.
1.2.- MECANISMO DE ACCIÓN DE LA INSULINA. Pag 7-11.
1.2.1.-La cascada de os o ilación. Pag 7-8.
1.2.2.-La hipó esis del segundo mensaje o. Pag 8-10.
1.2.3.-Inosi ol os oglicanos como segundos mensaje os: IPGs ipo A y
ipo P. Pag 10-11.
1.3.- ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE CARBOHIDRATOS.
Pag 11-26.
1.3.1.- Ca ac e is icas es uc u ales de ca bohid a os.
Pag 12-14.
1.3.2.- RMN de ca bohid a os. Pag 14-19.
1.3.3.- Modelado molecula de ca bohid a os: mé odos de campos de
ue zas. Pag 19-26.
1.4.- OBJETIVOS DE LA TESIS DOCTORAL. Pag 26-27.
1.5.-BIBLIOGRAFIA. Pag 28-32.
2.- ESTUDIOS DE PSEUDODISACÁRIDOS MIMÉTICOS DE IPG.
2.1.- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS. Pag 35-38.
2.2.- METODOLOGÍA Pag 38-42.
2.2.1.- Resonancia Magné ica Nuclea . Pag 38-39.
2.2.2.- Cálculos eó icos de campos de ue zas.
Pag 40-42.
2.3.- RESULTADOS Y DISCUSION. Pag 42-75.
2.3.1.- Mo i o es uc u al glucosamina  (1→6) mio-inosi ol.
Pag 43-48.
2.3.2.- Mo i o es uc u al glucosamina  (1-6) mio-inosi ol.
Pag 48-51.
INDICE
2.3.3.- Mo i o es uc u al glucosamina  (1-6) qui o-inosi ol.
Pag 52-56.
2.3.4.- Mo i o es uc u al glucosamina  (1-6) qui o-inosi ol.
Pag 57-59.
2.3.5.- Mo i o es uc u al hexosamina 16) Pini ol
Pag 60-66.
2.3.6.- Mo i o es uc u al hexosamina (16) pini ol.
Pag 66-70.
2.3.7.- Modelado Molecula de los g upos Hid oxime ilo.
Pag 71-75.
2.4.- CONCLUSIONES. Pag 75-78.
2.5.- BIBLIOGRAFIA. Pag 79-83.
3.- ESTUDIOS ESTRUCTURALES DE POTENCIALES INHIBIDORES DE PKA.
3.1.- DISEÑO RACIONAL DE NUEVOS IPGs. Pag 86-89.
3.2.- METODOLOGÍA Pag 89-91.
3.2.1.- Resonancia Magné ica Nuclea . Pag 89
3.2.2.- Cálculos Teó icos. Pag 89-91
3.3.- RESULTADOS Y DISCUSION. Pag 91-120.
3.3.1.- Pseudodisacá idos os a o. Pag 91-97
3.3.2.- Pseudo isacá idos no os a ados. Pag 97-105
3.3.4.- Pseudo isacá ido di- os a o. Pag 105-116
3.4.- ESTUDIO DE PROTONES HIDROXÍLICOS POR RMN.
Pag 120-126.
3.5.- CONCLUSIONES Pag 126-128.
3.6.- BIBLIOGRAFIA. Pag 129-133.
4.- PARTE EXPERIMENTAL
4.1.- RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR. Pag 136-140.
4.2.- CALCULOS TEÓRICOS DE CAMPOS DE FUERZAS.
Pag 141-144.
APENDICE 1.- Es udio compa a i o de las pa ame izaciones pa a ca bohid a os del
campo de ue zas AMBER. Pag 145-146.
APENDICE 2.- Valo aciones ácido-base. Pag 147-148.
CAPITULO 1
INTRODUCCION.
8│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
Figu a 3. Mecanismo de acción de la insulina.
Pa alelamen e, se p oduce la ansducción de la señal que p oduce los e ec os
me abólicos a a és una u a di e en e que es á aún menos de inida. Las p o eínas IRSs
in e accionan con la enzima os a idilinosi ol 3 quinasa (PI-3K) que a su ez ac i a el
anspo e de glucosa al in e io de la célula, po el anspo ado GLUT4.
17
Pa a ello, la PI-3K
p oduce la os o ilación de un os a idilinosi ol de memb ana que po e ec o de una os olipasa
C (PLC), inc emen a los ni eles de los os a idilinosi oles PI-(3)P, PI-(3,4)-P2 y PI-(3,4,5)-P3.
18
Es os os a idilinosi oles ac i an la p o eína quinasa B (PKB) que es á apa en emen e
implicada an o en la es imulación del anspo e de glucosa al in e io de la célula, como en la
ac i ación de la glucógeno sin asa (GS).
19
Sin emba go, la u a y mecanismos que igen la
es imulación de la sín esis de glucógeno y la lipogénesis pe manecen aún desconocidos.
1.2.2.-LA HIPÓTESIS DEL SEGUNDO MENSAJERO.
El concep o de mediado pa a la acción de la insulina ue in oducido po La ne en
1972,
20
que, apoyado en e idencias bioquímicas, p opuso que la in e acción de la insulina con
su ecep o da ía luga a la p oducción in acelula de una molécula capaz de p opaga la
acción de la misma.
RECEPTOR INSULINA
GLUCOSA
RAS
Dominio
unión insulina
Dominio
ansmemb ana
Dominio
unión ATP
Dominio
i osina/quinasa
ATP
ADP
P
P
PI
SOS GAP P62
SOS
G b2
Shc
P
P
SOS
G b2
IRS-1,2,3,4
COMPLEJO RAS
PI-3-K
Ra -1-quinasa
MAP-quinasa-quinasa
MAP-quinasa
pp90-S6-quinasa
PDK1
PKB
GSK3
GS
PLC
IP3+ DAG
PI-(3,4)-P2
PI-(3,4,5)-P3
?
GLUT4
PPG1 ?
EFECTOS METABÓLICOS EFECTOS MITOGÉNICOS
RECEPTOR INSULINA
GLUCOSA
RAS
Dominio
unión insulina
Dominio
ansmemb ana
Dominio
unión ATP
Dominio
i osina/quinasa
ATP
ADP
P
P
PI
SOS GAP P62
SOS
G b2
Shc
P
P
SOS
G b2
IRS-1,2,3,4
COMPLEJO RAS
PI-3-K
Ra -1-quinasa
MAP-quinasa-quinasa
MAP-quinasa
pp90-S6-quinasa
PDK1
PKB
GSK3
GS
PLC
IP3+ DAG
PI-(3,4)-P2
PI-(3,4,5)-P3
?
GLUT4
PPG1 ?
EFECTOS METABÓLICOS EFECTOS MITOGÉNICOS

Capí ulo 1: In oducción
9│
Debido a su escasez, no se ha podido aisla y de e mina la es uc u a exac a de es os
mediado es, y sólo ha sido posible p opone unas es uc u as pa ciales que ienen en común el
posee un esiduo de inosi ol. La simili ud en e es as es uc u as y los GPIs de anclaje han
hecho conside a a los GPI de anclaje como posibles p ecu so es ( ía la acción de os olipasas
(GPI-PLC y/o GPI-PLD) de es os mediado es. Es a línea ha sido obje o de nume osos abajos
de in es igación ecogidos en un g an núme o de e isiones
21
. La e minología que desc ibe las
ca ac e ís icas químicas de los compues os elacionados con es os mediado es es: p GPI,
p o eína unida a glicosil os a idil inosi ol y GPI, glicosil os a idil inosi ol, como lípidos
in ac os a los cuales es á unida la p o eína anclada o no espec i amen e. IPGp , p o eína unida
a inosi ol os oglicano e IPG, inosi ol os oglicano como moléculas solubles en agua de i adas
de p GPI y GPI espec i amen e.
La hipó esis de los segundos mensaje os consis e básicamen e en que la insulina, as
in e acciona con su ecep o , p oduce la ac i ación de una os olipasa (C o D), la cual
hid oliza una molécula de GPI libe ando al medio ex acelula un IPG (con o sin os a o
espec i amen e), que es capaz de in oduci se al in e io de la célula y, median e la
modulación de enzimas cla es, eje ce los e ec os de la ho mona (Figu a 4). La exis encia de
un mecanismo de es e ipo no excluye la exis encia simul ánea de o os más ampliamen e
admi idos, a los que se ha hecho e e encia en el apa ado an e io .
Figu a 4. Hipó esis del segundo mensaje o pa a la acción de la insulina.
10│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
La hipó esis de los segundos mensaje os, explica ía los e ec os de la adminis ación
exogénea de IPGs. Es os cons i ui ían una amilia de compues os di e en emen e glicosidados
y os o ilados, de alguna mane a análoga a la amilia de los inosi ol os a os (IP, IP2 y IP3)
22
.
P esen a un a ac i o indudable en el po encial a amien o de aquellas en e medades
elacionadas con la esis encia a la insulina, debido a la posibilidad de accede a sus ancias que
mime izan sus e ec os. Sin emba go, el que aun no se conozca la es uc u a exac a de los IPGs
libe ados y que no se hayan es ablecido los mecanismos de su inco po ación a la célula son sus
p incipales pun os débiles.
1.2.3.-INOSITOLFOSFOGLICANOS COMO SEGUNDOS MENSAJEROS:
IPGs TIPO A y TIPO P.
Las in es igaciones ealizadas po La ne ,
23
Ma o
24
y Rademache ,
25
pe mi en
clasi ica los IPGs en dos g upos en unción de su es uc u a básica y sus ac i idades
biológicas. Los IPG de ipo P es a ían compues os po qui o-inosi ol y galac osamina y se ían
capaces de ac i a a la PDHP en e o as os op o ein os a asas elacionadas con el
me abolismo de la glucosa y eguladas po al insulina.
26
,
27
Los IPG de ipo A, además de
inhibi la PKA, son capaces de es imula la lipogénesis, ac i a la ace ilcoenzima A ca boxilasa
y modi ica las ac i idades de la adenila o ciclasa y os odies e asa de AMP cíclico y es a ían
cons i uidos po mio-inosi ol, glucosamina, galac osa y os a o. Los IPG ipo A y los GPIs de
anclaje ienen una al a simili ud es uc u al lo que ha inducido a p opone que es os IPGs
p o ienen de la hid ólisis de GPIs de anclaje median e la acción secuencial de una p o easa y
una os olipasa.
28
Po el con a io la es uc u a pa cial de los IPGs ipo P, al p esen a un anillo
de qui o-inosi ol y galac osamina, implica ía a un GPI o p GPI p ecu so di e en e.
29
Debido a las di icul ades inhe en es al aislamien o y de e minación es uc u al de
es os segundos mensaje os una es a egia al e na i a pa a p o undiza en su ca ac e ización es
el es udio de los enzimas cla e de es a u a de ansducción, que en es e caso se ian la PKA y la
PDH os a asa.
La PKA es la más simple de las p o eínas quinasas y la más comple amen e
ca ac e izada
30
. El haloenzima inac i a PKA consis e en 2 subunidades egulado as y 2
ca alí icas que se disocian en espues a de ni eles ele ados de cAMP in acelula . Una
desc ipción idimensional de es a subunidad ca alí ica es ob enida cuando la p ime a
es uc u a c is alina de una p o eína quinasa ue esuel a como un complejo PKA-inhibido y
con Mg+2 y ATP.
31
El conocimien o de allado de las in e acciones en e PKA y los inhibido es
sin é icos de ipo IPG o ma án una de las bases en el diseño de á macos basados en la
es uc u a de IPGs ( éase capi ulo 3).
Capí ulo 1: In oducción
11│
La PDH os a asa, po o a pa e no ha sido c is alizada. Sin emba go clonando su
subunidad ca alí ica
32
ha demos ado un 22% de aminoácidos idén icos con la "glycogen
syn hase phospha ase” ( os a asa 2C). La es uc u a c is alina de la os a asa 2C ha sido
de e minada y su cen o ca alí ico es conside ado como un modelo es uc u al pa a la secuencia
ela i a a los dominios de la PDH os a asa.
El es udio de las in e acciones especí icas incluyendo la ac i ación de la os a asa 2C
po moléculas sin é icas de ipo IPGs, pod ía cons i ui o a de la bases pa a el diseño de
á macos de ipo IPG.
O as enzimas que pod ían se conside adas como dianas u obje i os con enien es en
es as elaciones es uc u a-ac i idad elacionados con los IPGs, incluyen la uc osa 1,6-
bis os a asa (FBP) que ep esen a un á maco diana al amen e a ac i o pa a la diabe es de ipo
II y cuya es uc u a ha sido esuel a po ayos X
33
.
1.3.- ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE CARBOHIDRATOS.
Los ca bohid a os pa icipan ac i amen e en unciones biológicas muy di e sas:
ene gé icas (glucosa), es uc u ales (celulosa), inmunológicas y econocimien o celula
(an ígenos oligosaca ídicos), cons i uyen el esquele o de los ácidos nucleicos ( ibosa) y es án
implicados en p ocesos in ecciosos. G an pa e de es os enómenos es án undamen ados en
p ocesos de econocimien o molecula en los que la es uc u a idimensional y disposición
espacial de g upos uncionales y á omos juega un papel esencial como ansmiso de
in o mación. En es e sen ido es necesa io des aca que los ca bohid a os, po su es uc u a y
composición, p opo cionan a la na u aleza una amplia a iedad de códigos, muy supe io po
unidad cons i u i a a o os biopolíme os como ácidos nucleicos o p o eínas. Con inuando es a
línea de a gumen os se comp ende ácilmen e la ele ancia de los es udios es uc u ales en
ca bohid a os.
Aunque exis en más mé odos de análisis con o macional de ca bohid a os, sin duda
los más pode osos son la espec oscopia de RMN y la c is alog a ía de ayos X, ambas en
combinación con écnicas de modelado molecula .
34
La g an di icul ad que p esen a la
c is alización de es os compues os ha es ingido la aplicación de los mé odos de di acción de
ayos X, al menos en elación a o as biomoléculas. Po el con a io, el es udio de
con o mación adop ada en disolución, es abo dada a menudo empleando las écnicas de
esonancia magné ica nuclea (RMN).
35
12│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
1.3.1.- CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES DE CARBOHIDRATOS.
Los es uc u a idimensional de los ca bohid a os se puede desc ibi , además de po
las ca ac e ís icas de i adas de su composición como la con igu ación de los cen os qui ales
p opia de cada esiduo, po cie os pa áme os con o macionales especí icos.
Pa a la desc ipción de los monóme os que cons i uyen los oligosacá idos es necesa io
de e mina la con o mación del ciclo de 6 miemb os que o igina ( o mas de pi anosa). En la
mayo ía de los casos las pi anosas p esen an un compo amien o monocon o macional
obse ando una de las dos posibles o mas de silla (habi ualmen e la 1C4), aunque es posible
encon a excepcionalmen e o as o mas. También es posible encon a anillos de 5 miemb os
como la ibosa a pesa de que no sean e modinámicamen e es ables.
La desc ipción de la es uc u a de los monosacá idos se comple a ía con la de inición
la o ien ación de los g upos exocíclicos. Es os, mayo i a iamen e g upos hid oxilos
secunda ios, se p esen an en disposiciones al e nadas siendo más es ables aquellas que gene en
edes de enlaces de hid ogeno cíclicos, lo que co esponde a si uaciones clockwise (c) y
an iclowise ( ).
O
HO
HO
O
OH
R
O
HO
HO
O
OH
R
O
HO
HO
O
OH
OH
R
HO
g
gg g
HHH
HS
HR
OH
O6
H5
H4
O4
RH HS
HR
HS HR
RH
HO
OH
HS
HR
O6
H5
H4
O4
HR
HO
HS
O6
H5
H4
O4

Figu a 5. De inición de las es con o maciones al e nadas pa a el g upo hid oxime ilo en D-
hexapi anosas.
Un caso especial es la con o mación del g upo hid oxime ilo en hexapi anosas
de inida po los o áme os del enlace C5-C6 (denominado  O5-C5-C6-O6). El g upo
hid oxilo se puede dispone en 3 o ien aciones al e nadas, denominadas gauche-gauche (gg),
gauche- ans (g ) y ans-gauche ( g) ( igu a 5). La dis ibución de las poblaciones de es os
o áme os depende de una compleja combinación de e ec os, siendo el ac o de e minan e la
o ien ación ela i a del sus i uyen e en la posición 4. Una amplia ecopilación de da os
expe imen ales indica, que pa a azuca es de la se ie D, las poblaciones ela i as de los
o áme os gg:g : g pa a con igu aciones ipo gluco y galac o se encuen an en o no a 60:40:0 y
Capí ulo 1: In oducción
13│
20:60:20, espec i amen e. Sin emba go, es os equilib ios se en modi icados po e ec os de
sol a ación.
No obs an e el ac o más in luyen e en la con o mación de ca bohid a os es la
geome ía del enlace glicosídico, ya que es a de ine la o ien ación ela i a de dos unidades
monosaca ídicas consecu i as. Es a geome ía iene de inida po la o ación de dos enlaces: el
glicosídico C1-O1, ca ac e izada po la o sión  (H1’-C1’-O1’-Cx) y el aglicónico O1-Cx,
de inida po la o sión  (C1’-O1’-Cx-Hx). La es uc u a idimensional de es os compues os
depende undamen almen e de la o ación al ededo de es os enlaces, denominados enlaces de
o sión glicosídicos.
O
HO
HO OH O
OH
O
OH
OH
OH
HO


1' 1
Figu a 6. Rep esen ación de la es uc u a de un disacá ido.
Las ue zas que in e ienen en la es abilización de las con o maciones de los
ca bohid a os en disolución, al igual que pa a o as moléculas, son: los enlaces de hid ógeno,
las in e acciones es é icas, las ue zas de an de Waals y elec os á icas jun o con o os
ac o es, como la sol a ación.
36
Sin emba go, exis en dos impo an es e ec os peculia es de los
ca bohid a os y que se deben ene en cuen a en los ca bohid a os y que son los denominados
e ec os anomé ico y exo-anomé ico.
37
El e ec o anomé ico, p opues o po Lemieux
38
, se e ie e
a la p e e encia que mues a cualquie sus i uyen e elec onega i o en el ca bono 1 de un anillo
de pi anosa po una con igu ación axial, en con a de lo que cab ía espe a conside ando
c i e ios exclusi amen e es é icos. De la misma na u aleza, el e ec o exo-anomé ico se
mani ies a como una p e e encia del enlace exocíclico O1-R po adop a una o ien ación
gauche espec o al enlace C1-O5 ( igu a 7).
O
OOO
O
O
R
O
OR
E ec o exo-anomé ico
E ec o endo-anomé ico
Dipolos eléc icos
Figu a 7. Rep esen ación de los e ec os endo- y exo-anomé ico.

14│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
Pa a jus i ica es os e ec os se han p opues o dos explicaciones al e na i as. Una de
ellas conside a a las in e acciones elec os á icas en e los dipolos asociados a los enlaces C-O,
p incipales esponsables de es os e ec os: p edominancia del isóme o axial en e al ecua o ial
(e ec o anomé ico) y del con ó me o gauche (e ec o exoanomé ico). O a explicación, basada
en la eo ía de o bi ales molecula es on e as, a ibuye la es abilización anomé ica a un
enómeno de hipe conjugación n, sólo posible en disposiciones an i-pe iplana en e el
pa soli a io sob e el oxígeno y el o bi al ipo  ( igu a 8). Es a in e acción supone la
ans e encia elec ónica pa cial en e el o bi al n que aloja el pa soli a io de elec ones sob e
el á omo de oxígeno y el o bi al an ienlazan e  del enlace C-O adyacen e, como consecuencia
del solapamien o a o able en e dichos o bi ales ( igu a 8).
Figu a 8. Rep esen ación esquemá ica del o igen elec ónico de los e ec os endo- y exo-
anomé ico.
Du an e años la con o e sia en e ambas explicaciones no ha podido se cla amen e
esuel a. Sin emba go, es udios ecien es
39
han demos ado que es e ipo de in e acciones
o bi álicas son más ecuen es y gene ales de lo que se pensaba. Así, se ha podido demos a
que la mayo es abilidad de las con o maciones al e nadas del e ano, espec o de las
eclipsadas, no esul a, como adicionalmen e ha sido acep ado, de las epulsiones es é icas po
el solapamien o de los o bi ales de enlace C-H que iene luga en és as úl imas, sino que es una
consecuencia de las in e acciones hipe conjuga i as que se o iginan, en el caso de las
con o maciones al e nadas, en e los o bi ales ocupados de baja ene gía C-H y los o bi ales
acíos, de mayo ene gía, C-H39,
40
1.3.2.- RMN DE CARBOHIDRATOS.
A pesa de su ela i a sencillez, los espec os de RMN de los oligosacá idos p esen an
una ele ada complejidad debida a la poca dispe sión que p esen an los p o ones de los anillos.
O
OO
O
O
O
O
ROR
C5
H1
O
C2
C5
O
H1
C2
1
2
3
45
1
2
3
451
2
3
45
1
2
3
45
C1 O5 C1 O5
R
O5
H1
C2
C1 O
R
O5
H1
C2
C1 O
E ec o endo-anomé ico E ec o exo-anomé ico
**
**
**
**
Capí ulo 1: In oducción
15│
Así, la mayo pa e de las señales apa ecen en un ango que oscila en e 4,5 y 3,5 ppm dando
luga a ecuen es solapamien os y si uaciones de acoplamien o ue e. A o unadamen e las
señales de los p o ones anomé icos apa ecen en el ango de 4,4-5,5 ppm cons i uyendo un buen
pun o de pa ida pa a el análisis es uc u al ya que, además, sus alo es de desplazamien o
químico an o de 1H como de 13C y de acoplamien o escala pe mi en de e mina la
con igu ación anomé ica con ela i a acilidad.
41
,
42
,
43
Pa a aquellas señales localizadas ue a de
la egión de mayo solapamien o, Vliegen ha e al.
44
in oduje on la denominación de “g upo-
in o mado -es uc u al” (s uc u al- epo e -g oup), o “huella dac ila ”, ya que los
desplazamien os químicos de dichas señales dependen ue emen e de la es uc u a del
ca bohid a o. Median e es a ap oximación es posible iden i ica azúca es indi iduales, de
esiduos, mo i os es uc u ales o azúca es especí icos y composiciones de enlaces glicosídicos
po compa ación con bases de da os adecuadas.
45
,
46
,
47
Los mé odos de asignación se basan ecuen emen e en la de e minación de sis ema de
spín de cada esiduo median e la combinación de expe imen os de acoplamien o escala
homonuclea es como DQF-COSY y TOCSY. En es e pun o ya se hab á ob enido in o mación,
al menos pa cial de la con igu ación de los esiduos. Pa a comple a la asignación es necesa io
es ablece la conec i idad en e de e minados sis emas de espines. Pa a es a ase gene almen e
se emplean expe imen os NOESY capaces de es ablece conec i idades a a és del espacio
en e los dis in os esiduos. Sin emba go en el con ex o del análisis de oligosacá idos, se han
p opues o o os mé odos basados en acoplamien os escala es a la go alcance 1H-13C o en el
e ec o de la glicosilación sob e el desplazamien o químico del ca bono más p óximo.
Los desplazamien os químicos de 13C se ob ienen ácilmen e median e los
expe imen os HSQC ó HMQC, que además se bene ician de una mayo dispe sión espec al
que simpli ica su análisis. Es a mejo a de la dispe sión se puede emplea en combinación con
ans e encias homonuclea es pa a sol en a las di icul ades asociadas solapamien os g a es.
Así, en combinación con ans e encias TOCSY los expe imen os 2D HSQC-TOCSY
48
,
HMQC-TOCSY,
49
han sido ampliamen e u ilizados. Simila men e, los espec os 2D HMQC-
NOESY
50
y HSQC-NOESY p opo cionan conec i idades en e la unión glicosídica y pueden
se ú iles en casos con solapamien o se e os.
Debido a sus ca ac e ís icas espec ales: iempos de elajación ela i amen e la gos y
un núme o mode ado de señales algunas de las cuales apa ecen ípicamen e ue a de la zona de
solapamien o los análogos monodimensionales de los expe imen os bidimensionales son
especialmen e ú iles en ca bohid a os.
51
En es e sen ido es con enien e des aca las en ajas de
la implemen ación de esquemas de selec i os median e g adien es de campo magné ico como
16│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
dp gse (Double Pulse Field G adien Spin Echo)
52
que p opo ciona una >g an sensibilidad y
limpieza en los espec os sin implica un excesi o aumen o de la complejidad expe imen al.
Elucidación es uc u al po RMN:
Al menos, son es los pa áme os espec ales que con ienen in o mación es uc u al y
son u ilizados en el análisis con o macional de oligosacá idos
53
: el desplazamien o químico,
que aunque es muy sensible a la es uc u a del en o no esul a di ícil de in e p e a
cuan i a i amen e;
54
las cons an es de acoplamien o ecinales, que se elacionan con ángulos
de o sión, median e ecuaciones de ipo Ka plus;
55
y el E ec o Nuclea O e hause
56
que
pe mi e ex ae dis ancias in e p o ónicas expe imen ales. Recien emen e, se ha explo ado con
éxi o la aplicación de cons an es dipola es esiduales en medios pa cialmen e o ien ados en
es udios es uc u ales de oligosacá idos.
57
Cons an es de acoplamien o escala es:
Las cons an es de acoplamien o homonuclea es ca ac e izan la disposición ela i a
axial ó ecua o ial de los sus i uyen es en un esiduo de pi anosa o u anosa de mane a que es
posible de e mina su con igu ación y con o mación. Desde una óp ica es uc u al, conocida la
con igu ación del monosacá ido, los alo es de 3JH-H, deben pe mi i de e mina la
con o mación o con o maciones p e e en es del anillo de cinco o seis miemb os del esiduo.
O o elemen o es uc u al pa a el que son cla e es os acoplamien os es la e aluación de la
disposición del g upo hid oxime ilo en e las posibles con o maciones al e nadas (gg/g / g)
median e las cons an es 3JH5-H6p oR y 3JH5-H6p oS. Po úl imo, las cons an es de acoplamien o 1H-
13C pueden u iliza se pa a de e mina los ángulos de o sión glicosídicos, en pa icula en e el
p o ón anomé ico y el ca bono aglicónico. Sin emba go, la di icul ad que implica su ob ención,
p ác icamen e limi ada a mues as iso ópicamen e ma cadas, es inge su u ilización.
E ec o Nuclea O e hause (NOE):
El E ec o O e hause Nuclea (NOE) es el cambio en la in ensidad ne a de una señal
de un de e minado núcleo como consecuencia de una pe u bación de la esonancia de o o
núcleo que se encuen a p óximo en el espacio a és e p ime o. Su o igen es á en la
edis ibución de poblaciones p oducida como consecuencia de la elajación c uzada dipolo-
dipolo en e es os dos núcleos.
58
La impo ancia del NOE en análisis es uc u al y
con o macional eside en su dependencia de la dis ancia en e los á omos, y po lo an o, en la
in o mación sob e la es uc u a idimensional de las biomoléculas que los con ienen.
Al a a se de un enómeno de elajación iene una compleja dependencia del
mo imien o molecula lo que di icul a la ex acción di ec a de dis ancias in e p o ónicas. Pa a
emplea la in o mación implíci a en el NOE en la de e minación de es uc u as
idimensionales, se pueden emplea a ias ap oximaciones. La más sencilla es el análisis
Capí ulo 1: In oducción
17│
cuali a i o, pa a el que se asume que la obse ación de NOE implica una dis ancia meno de
una dada (3-3,5 A en oligosacá idos), en el que po con on ación del pa ón de NOEs
obse ado con posibles es uc u as candida as pe mi e e alua la bondad del modelo empleado
pa a el p onós ico de esas es uc u as. La o a posibilidad consis e en ealiza un análisis
cuan i a i o de las cons an es de elocidad de elajación c uzada longi udinal

ijNOE, con el in
de de i a las dis ancias in e nuclea es co espondien es.
59
Debido a la p opia na u aleza de los oligosacá idos, con escasos NOEs
es uc u almen e ele an es, conside able lexibilidad y amaño mode ado, la in o mación
expe imen al suele se insu icien e como pa a de ini po sí misma la es uc u a. Po ello se
ecu e habi ualmen e a la ob ención de dis ancias expe imen ales muy p ecisas y a combina el
análisis con cálculos eó icos.
Acoplamien o dipola esidual.
La necesidad de mejo a la p ecisión de las es uc u as calculadas po RMN en
disolución ha es imulado la búsqueda de nue as es icciones geomé icas, especialmen e a
la go alcance. En e es as es necesa io des aca a las cons an es de acoplamien o dipola es
esiduales (RDC) que se obse an cuando las moléculas es án pa cialmen e o denadas espec o
al campo magné ico de o ma que la magni ud de es e acoplamien o e leja la o ien ación de
los núcleos acoplados espec o del campo. Aunque o iginalmen e el mé odo se desa olló pa a
p o eínas ha sido ambién aplicado ambién a ca bohid a os: P es ega d e al.
60
Tjand a  Bax
61
.
De e minación Expe imen al de Dis ancias in e p o ónicas a pa i del NOE
Las in ensidades de un espec o 2D NOESY pa a un iempo de mezcla m (pe iodo de
e olución del NOE) es án ep esen adas po la ma iz V( m) según:
(0))·· exp(-)( mm VRV 
donde R es la ma iz de elajación cons i uida po los elemen os:
 
i
ji
ijijijii JJJQ ,1
,
,2,1,0 )(6)(3)(·

 
 
)()(6· ,0,2

ijijij JJQ 
24│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
puede encon a se es posibles con o maciones al e nadas, se ía necesa io gene a 3N
con o maciones di e en es pa a cada pun o del espacio (,), siendo N el núme o de g upos
exocíclicos. Es a es a egia exhaus i a esul a á en un iempo compu acional excesi o, siendo
aconsejable educi és e conside ando únicamen e las o ien aciones a p io i más es ables como
las gg, g , g del g upo hid oxime ilo o las disposiciones clockwise o an iclockwise que
maximizan el núme o de enlaces de hid ógeno.
Búsqueda con o macional no sis emá icos: mé odos Mon eCa lo.
En e los mé odos no sis emá icos, el más ampliamen e u ilizado es el mé odo de
Me ópolis Mon e Ca lo (MMC).
65
Esencialmen e consis e en gene a con igu aciones del
sis ema de o ma alea o ia, median e la a iación de aquellos g ados de libe ad que se
conside en más ele an es pa a la molécula obje o de es udio, y pos e io men e aplica c i e ios
ene gé icos pa a acep a o echaza una de e minada con igu ación nue a. Si es e
p ocedimien o es aplicado du an e un núme o es adís icamen e signi ica i o de e apas, se
gene a un colec i o en el que cada con o mación se epe i á según su ac o de p obabilidad de
Bol zmann. Simulaciones de ipo MMC pe mi en la ob ención de p opiedades molecula es
p omediadas en colec i o (espacio con igu acional), pe o, si que emos ob ene p opiedades
dinámicas del sis ema (espacio de ases) debe emos ecu i a o as écnicas de simulación
es adís icas, ales como la dinámica molecula .
Dinámica Molecula New oniana (DM):
Es e es un mé odo de e minis a, que consis e, básicamen e, en calcula la e olución en
in e alos de iempo  de las posiciones y momen os de odas las pa ículas del sis ema
conside ado, conociendo an o los alo es iniciales de ellos como la o alidad de las ue zas del
sis ema de pa ículas. Pa a ello se aplican las leyes de la dinámica de New on empleando las
ue zas que se de e minan a pa i de las unciones ma emá icas que de inen el campo de
ue zas.
i
i
im
F
d
d 
i
i
F
d
dV 
El esul ado inal es un conjun o de pun os que desc iben una ayec o ia de e minada
sob e el espacio de ase. Los iempos de simulación empleados es án en el o den de decenas de
pisosegundos (ps) a a ios nanosegundos (ns), dependiendo del amaño del sis ema es udiado.
Exis en di e en es algo i mos pa a lle a a cabo el p oceso de in eg ación de las ecuaciones
new onianas en inc emen os ini os de iempo  , siendo los más u ilizados el de Ve le
66
y el
de “leap og”. Es os mé odos, además, suelen inco po a algo i mos pa a acoplamien os a

Capí ulo 1: In oducción
25│
“baños é micos” o “pis ones” pa a lle a a cabo simulaciones a empe a u a (NTV) o a p esión
(NTP) cons an e, espec i amen e.
En dinámica molecula , a pa i de las ayec o ias ob enidas, se pueden calcula los
p omedios e modinámicos de cualquie p opiedad molecula , A, como p omedios empo ales
(hipó esis e gódica):
Dinámicas Molecula es de Lange in ó Es ocás icas:
En con as e con las dinámicas molecula es New onianas (DM), es án basadas en las
ecuaciones de Lange in del mo imien o, ca ac e izándose po que inco po an explíci amen e el
con ol de empe a u a y los e ec os amo iguan es del disol en e en la simulación. Es a
ap oximación gene a conjun os igu osamen e canónicos (NVT). Los e ec os amo iguan es se
conside an imponiendo una ue za iccional al el mo imien o del solu o a a és del
disol en e. (F iccional). La empe a u a del sis ema es con olada incluyendo colisiones alea o ias
con el disol en e, R( ), en la ecuación básica. Así, la ecuación del mo imien o pa a una
pa ícula i puede se esc i a aho a como:
En muchas simulaciones de sis emas solu o-disol en e, sob e odo en las egiones
lejanas de la molécula de solu o. En e las écnicas que inco po an los e ec os del disol en e sin
eque imien o de moléculas de disol en e explíci as, se encuen an las de “po encial de campo
p omedio” (PMF) y los modelos de “dinámicas es ocás icas” (SD).
Una de las p incipales en ajas de los mé odos es ocás icos es el aho o de iempo
compu acional, en e a simulaciones con disol en e explíci o. Po ello son ú iles en aquellos
sis emas en los que el p incipal aspec o de a ención es el compo amien o del solu o mien as
que el disol en e es de poco in e és. Es e aho o posibili a ealiza simulaciones mucho más
la gas. Po ejemplo, Widmalm y Pas o
67
lle a on a cabo dinámicas molecula es y es ocás icas
de 1 ns, de una molécula de e ilenglicol en disolución acuosa con el solu o y 259 moléculas de
agua. Las simulaciones de dinámica molecula a da on 300 ho as mien as que las dinámicas
es ocás icas sólo lle a on 24 minu os. La educción en la du ación de las simulaciones de SD
Ecuación de Lange in
)(R
)(
ξ)}({F
)(
2
2
d
dx
x
d
xd
mi
i
ii
i
i



M
i
N
i
N
i pA
M
A
1
),(
1
26│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
no solamen e se debe al meno núme o de moléculas p esen es sino ambién al hecho de que
pueden se usados iempos de in eg ación mayo es.
1.4.- OBJETIVOS DE LA TESIS DOCTORAL.
El pun o débil de la hipó esis del segundo mensaje o es el que a pesa de los es ue zos
ealizados aun no se han aislado y ca ac e izado adecuadamen e desde el pun o de is a
químico es os segundos mensaje os o IPGs. Nues o labo a o io, den o de una ap oximación
encuad ada den o de la química biológica, p e ende con ibui a la elucidación de es as
es uc u as. Pa a ello, la in es igación básica ealizada, ha es ado o ien ada a es ablece una
química que uncione e icazmen e pa a p epa a pos e io men e lib e ías de compues os de las
que pudie an esul a moléculas ac i as. Conc e amen e, los esul ados de los abajos
elacionados con el diseño, la sín esis y la ac i idad biológica de IPGs de ipo A, P y GPIs han
sido ecogidos en las Tesis doc o ales de Ma ía Flo es, Ja ie López P ados, Julia Bonilla
Ca mona, F ancisco Al onso Pé ez y Niels Reicha d . Pa alelamen e, se han e ec uado es udios
es uc u ales de los compues os sin e izados con el in de con ibui , conjun amen e con las
medidas de ac i idad biológica, a de ini y delimi a los eque imien os es uc u ales de los
IPGs. Los esul ados de los es udios es uc u ales se ecogen en es a Tesis, y pa cialmen e en
las de Juan Félix Espinosa y F anck Che alie .
El p incipal obje i o de la p esen e esis doc o al, ha sido la ealización de un es udio
es uc u al de una se ie de compues os sin é icos, po enciales ( igu a 9), mediado es de IPGs de
ipo A y P, a a és de espec oscopia de RMN y de cálculos eó icos de campo de ue zas.
El abajo ealizado se p esen a en es a Memo ia como se indica a con inuación:
En el capí ulo 2 se p esen an los es udios de pseudodisacá idos que con ienen como
cicli ol: qui o-inosi ol, mio-inosi ol y de O-me il-qui o-inosi ol. Es os p oduc os ue on
diseñados a pa i de la in o mación agmen ada de la es uc u a de los compues os na u ales
combinada con los posibles mecanismos p opues os pa a su gene ación de acue do con es a
hipó esis.
A pa i de los esul ados ob enidos sob e los compues os an e io es y basadas en unos
es udios de docking sob e el si io de unión del ATP en la subunidad ca alí ica de la quinasa
dependien e de AMP cíclico, ealizados en nues o labo a o io po el D . Félix Cue as, se
es ablecie on unas nue as p emisas pa a el diseño acional de po enciales IPGs. Los es udios
ealizados sob e los compues os sin e izados bajo es e nue o modelo se p esen an en el
capí ulo 3.
A des aca el es udio en disolución ealizado
68
sob e un pen asacá ido ( igu a 9) que
cons i uye la es uc u a lineal conse ada de los GPIs de anclaje.
Capí ulo 1: In oducción
27│
HO
HO
HO
OH
O
HO O
OH
NH3
HO
OH
HO
HO
HO
O
O
HO O
OH
NH3
HO
O
PO
O
HO
HO
HO
OH
O
HO O
OH
NH3
HO
OP
OOH
O
HO
HO
HO
OH
O
HO O
OH
NH3
HO
OH
HO
HO
HO
OH
O
HO O
OH
NH3
HO
OP
O OH
O
O
HO O
OH
NH3OH
HO
O
O
HO
OH
PO
-O
O
HO O
OH
NH3
OH
HO
O
O
HO
OH
PO
-O
O
HO O
OH
NH3
OH
HO OH
HO OH
HO
OHO O
OH
NH3OHHO OH
HO OHHO
+
+
+
+
+
-
+
9 10
-
-
+
+
+
13
12
11 15
14
78
O
HO
HO
OH
O
HO O
OH
NH3
HO
OH
16
+
O
HO
HO OH
O
HO O
OH
NH3
HO
OH
18
+
H3C
CH3O
HO
HO
OH
O
HO O
OH
NH3
OH
17
+
H3C
OH
O
HO
HO OH
O
HO O
OH
NH3
OH
19
+
CH3
OH
HO3PO
O
HO O
NH3
OH
HO
HO OH
OH
HO HO
O
HO O
NH3
HO3PO
HO
HO OH
OH
HO
HO
O
HO3PO O
NH3
OH
HO
HO OH
OH
HO
25 26 27
O
HO
HO
HO
O
O
HO O
NH3
OH
HO
HO OH
OH
HO
O
HO
HO
HO
O
OH O
HO O
NH2
OH
HO
HO OH
OH
HO
O
HO O
OH O
HO O
NH2
OH
HO
HO OH
OH
HO
HO
OH
20 21 22
OPOH
OO
O
HO O
O
HO O
NH3
OH
HO
HO OH
OH
HO
HO
OH
23
O
HO O
O
HO O
NH3HO
HO OH
OH
HO
HO
OH
24
OPOH
OOOPOH
OO
OPOH
OO
Figu a 9. Es uc u a de los compues os 7-27 modelos de IPGs que se es udia án en la p esen e
esis doc o al.
28│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
1.5.-BIBLIOGRAFIA.
a) Repo s issued by iupac-iub commission on biochemical nomencla u e. Pu e Appl Chem.
1974, 40, (3), 277-331. b) Repo o iupac commission on nomencla u e o o ganic-chemis y
and iupac-iub commission on biochemical nomencla u e. Pu e Appl Chem. 1974, 37, (1-2),
283-297.
2 Pos e nak, S. Comp . Rend. Acad. Sci. 1919, 169, 138_140. b). Pos e nak, Th. Chemis y o
he Cycli ols_The Cycli ols 1965, He mann, Pa is. c) Billing on, D.C. The Inosi ol Phospha es,
VCH Ve lagsgesellscha , Weinheim, 1993.
3 a) Fe guson, M.A.J.; Williams, A.F. Annu Re Biochem. 1988, 57, 285-320 b) Fe guson,
M.A.J. Cu . Opin. S uc . Biol. 1991, 1, 522-529. c) Mccon ille, M.J.; Fe guson, M.A.J.
Biochem J. 1993, 294, 305-324 d) Fe guson, M.A.J.; Homans, S. W.; Dwek, R.A.;
Rademache , T.W. Science. 1988, 239, 4841, 753-759.
4 Ikezawa, H. Biological & Pha maceu ical Bulle in. 2002, 25, (4), 409-417.
5 a) Schneide , P.; Fe guson, M.A.J.; McCon ille, M.J.; Mehle , A.; Homans, S.W.; Bo die ,
C.J. Biol. Chem. 1990, 265, 16955-16964. b) Field, M.C.; Menon, A.K.; C oss G.A.M. EMBO
J. 1991, 10, 2731-2739. c) Deeg, M.A.; Humph ey, D.R.; Yang, S.H.; Fe guson, T.R.;
Reinhold, V.N.; Rosenbe y, T.L. J. Biol. Chem. 1992, 267, 18573-18580. d) Haynes, P.A.;
Gooeley, A.A.; Fe guson, M.A.J.; Redmon, J.W.; William, K.L. Eu . J. Biochem. 1993, 216,
729-737. e) Redman, C.A.; Thoms-Oa es, J.E.; Oga a, S.; Ikeha a, Y.; Fe guson, M.A.J.
Biochem. J. 1994, 302, 861-865. ) B ewis, I.A.; Fe guson, M.A.J.; Mehle , A.; Tu ne , A.J.;
Hoope , N.M.J. Biol. Chem. 1995, 270, 22946-22956. g) Mukasa, R.; Umeda, M.; Endo, T.;
Kubala, A.; Inouek, A. A ch. Biochem. Biophys. 1995, 318, 182-190. h) Azzouz, N.; S iepen,
B.; Ge old, P.; Capde ille, Y.; Schwa z, R.T. EMBO J. 1995, 14, 4422-4433. i) T eumann, A.;
Li ely, M.R.; Schneide , P.; Fe guson, M.A.J. J. Biol. Chem. 1995, 270, 6088-6099. j) Ge old,
P.; Bo is, S.; Rei e , B.; Geye , R.; Reinwald, E.; Risse, H.J.; Schwa z, R.T. J. Mol. Biol.
1996, 261, 181-194.
6 a) Be idge, M.J. Biochemis y. 1984, 220, 345-360. b) Nishizuka, Y. Science. 1992, 258,
607-614. c) Be idge, M.J. Na u e 1993, 361, 315-325. d) B uzik, K.S.; Tsai, M.D. Bioo g.
Med. Chem. 1994, 2, 49-72. d) Williams, R.L. Biochim. Biophys. Ac a 1999, 1441, 255-267. e)
Be idge, M. J. Na u e. 1993, 361, (6410), 315-325. ) B uzik, K. S.; Hakeem, A. A.; Tsai, M.
D. Biochemis y 1994, 33, (27), 8367-8374. g) Williams, R.L. Bba-Mol. Cell. Biol. L. 1999,
1441, (2-3), 255-267.
7 a) Kuppe, A.; E ans, L.M.; McMillen, D.A.; G i i h, I.H. J. Bac e iol. 1989, 171, 6077-
6083. b) Mo is, J.C.; Lei, P.S.; Shen, T.Y.; Mensawilmo , K. J. Biol CHem. 1995, 270, (6),
2517-2524.
8 Nicola, N. Guidebook o Ci okines and hei Recep o s (Nicola N., ed.). Ox o d Uni e si y
P ess, Ox o d. 1994, 1-7.
9 Ro h, R.A.; Cassell, D.J. Science. 1983, 219, 4582, 299-301.
Capí ulo 1: In oducción
29│
10 Jacobs, S.; Cua ecasas, P. Endoc . Re . 1981, 2, (3), 251-263.
11 a) F a ali, A.L.; T eadway, J.L.; Pessin, J.E. J. Biol. Chem. 1992, 267, 27, 19521-19528.
12 Rosen, O.M. Diabe es. 1989, 38, 12, 1508-1511.
13 a) Sun, X.J.; Ro henbe g, P.; Kahn, C.R.; Backe , J.M.; A aki, E.; Wilden, P.A.; Cahill,
D.A.; Golds ein, B.J.; Whi e, M.F. Na u e. 1991, 352, 6330, 73-77. b) Sun, X.; Wang, L.M.;
Zhang, Y.; Yenush, L.; Mye s, M.G.J .; Glasheen, E.; Lane, W.S.; Pie ce, J.M.; Whi e, M.F.
Na u e. 1995, 377, 173-177. c) La an, B.E.; Lane, W.S.; Lienha d, G.E. J. Biol. Chem. 1997,
272, 11439-11443. d) La an, B.E.; Fan in, V.R.; Chang, E.T.; William, S.L.; Kelle , S.R.;
Lienha d, G.E. J. Biol. Chem. 1997, 272, 21403-21407.
14 Pelicci, G.; Lan ancone, L.; G ignani, F.; McGlade, J.; Ca allo, F.; Fo ni, G.; Nicole i, I.;
G ignani, F.; Pawson, T.; Pelicci, P.G. Cell. 1992, 70, (1), 93-104.
15 a) Wa e s, S.B.; Pessin, J.E. T ends Cell Biol. 1996, 6, 1, 1-4. b) Sal iel, A.R.; Pessin, J.E.
T ends Cell Biol. 2002, 12, (2), 65-71.
16 Chea man, B.; Kahn, C.R. Endoc . Re . 1995, 16, 117-142.
17 Shepe d, P.; Na e, B.; O´Rahilly, S. J. Mol. Endoc . 1996, 17, 175-184.
18 S ål o s, P. Bioessays. 1997, 19, 327-335.
19 Cale a, M.R.; Ma ínez, C.; Liu, H.; Am , K.E.J.; Bi nbaum, M.J.; Pilch, P.F. J. Biol. Chem.
1998, 273, 7201-7204.
20 La ne , J. Diabe es. 1972, 21 (2 Suppl.), 428-438.
21 a) Fe guson, M.A.J. Biochem. Soc. T ans. 1992, 20, 243-256. b) Gaul on, G.N.; P a , J.C.
Semin. Immunol. 1994, 6, 97-104. c) Kunja a, K.; Ca o, H.N.; McLean, P.; Rademache , T.W.
Biopolyme s & Biop oduc s (S ali J.,ed.). 1995, 301-305. d) Va ela-Nie o, I.; León, Y.; Ca o,
H.N. Comp. Biochem. Physiol B. Biochem. Mol. Biol. 1996, 115, 223-241. e) Field, M.C.
Glycobiology. 1997, 7, 161-168. ) Jones, D.R.; Á ila, M.A.; Sanz, C.; Va ela-Nie o, I.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997, 233, 432-437. g) S ål o s, P. Bioessays. 1997, 19,
327-335. h) Jones, D.R.; Va ela-Nie o, I. In . J. Biochem. Cell. Biol. 1998, 30, 313-326. i)
F ick, W.; Baue , A.; Baue , J.; Wied, S.; Mülle , G. Biochemis y. 1998, 37, 13421-13436. j)
Jones, D.R.; Va ela-Nie o, I. Mol. Med. 1999, 5, 505-514. k) La ne , J.; Huang, L.C. Diabe es
Re . 1999, 7, 217. l) Campbell, A.S. Glycoscience (F ase -Reid B.; Ta su a, K.; Thiem, J., ed.).
2001, 2, 1695-1777. m) Ikezawa, H. Biol. Pha m. Bull. 2002, 25, (4), 409-417.
22 a) Be idge, M.J. Biochemis y. 1984, 220, 345-360. b) Nishizuka, Y. Science. 1992, 258,
607-614. c) Be idge, M.J. Na u e. 1993, 361, 315-325. d) B uzik, K.S.; Tsai, M.D. Bioo .
Med. Chem. 1994, 2, 49-72.

30│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
23 La ne , J.; Huang, L.C.; Schwa z, C.F.; Oswald, A.S.; Shen, T.Y.; Kin e , M.; Tang, G.Z.;
Zelle , K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988, 151, 1416-1426.
24 Ma o, J.M.; Kelly, K.L.; Able , A.; Ja e , L. J. Biol. Chem. 1987, 262, 2131-2137.
25 a) Rademache , T.W.; Ca o, H.N.; Kunja a, S.; Wang, D.Y.; G eenbaun, A.L.; McLean, P.
B az. J. Med. Biol. Res. 1994, 27, 327-341. b) Ca o, H.N.; Kunja a, S.; Rademache , T.W.;
León, Y.; Jones, D.R.; Á ila, M.A.; Va ela-Nie o, I. Biochem. Mol. Med. 1997, 61, 214-228.
26 a) Jones, D.R.; Va ela-Nie o, I. Mol. Med. 1999, 5, 505-514. b) Kunja a, S.; Wang, D.Y.;
G eenbaun, A.L.; McLean, P.; Ku z, A.; Rademache , T.W. Mol. Gen. Me abol. 1999, 68,
488-502.
27 a) La ne , J.; Huang, L.C.; Tang, G.; Suzuky, S.; Schwa z, C.F.W.; Rome o, G.; Roulidis,
X.; Zelle , K.; Shen, T.W.; Oswald, A.S.; Lu e ell, L. Cold Sp ing Ha bo Symp. 1988, 53,
965-971. b) Rome o, G. Cell. Biol. In . Rep. 1991, 15, 827-852. c) Rome o, G.; La ne , J. Ad .
Pha macol. 1993, 24, 21-50. d) Rademache , T.W.; Ca o, H.N.; Kunja a, S.; Wang, D.Y.;
G eenbaum, A.L.; McLean, P. B az. J. Med. Biol. 1994, 27, 327-341. e) Va ela-Nie o, I.; León,
Y.; Ca o, H.N. Comp. Biochem. Physiol. B. 1996, 115, 223-241.
28 a) Rome o, G.; Lu ell, L.; Rogol, A.; Zelle , K.; Hewle , E.; La ne , J. Science. 1988, 240,
509-511. b) Mülle , G.; Wield, S.; C ecelius, A.; Kessle , A.; Eckel, J. Endoc inology. 1997,
138, 3459-3475.
29 La ne , J.; P ice, J.D.; Heima k, D.; Smi h, L.; Rule, G.; Picca iello, T.; Fon eles, M.C.;
Pon es, C.; Vale, D.; Huang, L. J. Med. Chem. 2003, 46, 3283-3291.
30 Taylo , S.S.; Buechle , J.A.; Yonemo o, W. Ann. Re . Biochem. 1990, 59, 971-1005.
31 a) Knigh on, D.R.; Zheng, J.H.; Ten, Eyck L.F.; Xuong, N.H.; Taylo , S.S.; Sowadski, J.M.
Science. 1991, 253, 407-414. b) Knigh on, D.R., Zheng, J.H.; Ten Eyck, L.F.; Xuong, N.H.;
Taylo , S.S.; Sowadski, J.M. Science, 1991, 253, 414-420.
32 Lawson, J.E.; Niu, X.D.; B owning, K.S.; Le, T ong H.; Yan, J.; Reed, L.J. Biochemis y.
1993, 32, 8987-8993.
33 Ke, H.M.; Zhang, Y.P.; Lipscomb, W.N. P oc. Na l. Acad. Sci. USA. 1990, 87, 5243-5247.
34 on de Lie h, C-W.; Kóza, T.; Hull, W.E. J. Mol. S uc . Theochem. 1997, 395-396, 225-
244.
35 a) Jiménez-Ba be o, J.; Noble, O.; P e e , C.; Pé ez, S. New. J. Chem. 1988, 12, 941. b)
F ench, A.D. Biopolyme s. 1988, 27, 1519. c) Ha, S.N.; Madsen, L.J.; B ady J.W.
Biopolyme s. 1988, 27, 1927. d) T an, V.; Buleon, A.; Imbe y, A. Biopolyme s. 1989, 28, 679.
e) Imbe y, A.; T an, V.; Pé ez, S. J. Compu . Chem. 1989, 11, 205. ) Jiménez-Ba be o, J.;
Roupe, C.B.; Rochas, C.; Pé ez, S. J. Biol. Mac omol. 1989, 11, 265. g) Jimenez-Ba be o, J.;
Pe e s, T. NMR Spec oscopy o Glycoconjuga es, VCH. Weinheim, 2003.
Capí ulo 1: In oducción
31│
36 F ench, A.D.; B ady, J.W. ACS Symp. Se . 1990, 430.
37 a) Wol e, S.; Whangbo, M.-H.; Mi chell, D.J. Ca bohyd . Res. 1979, 69, 1. b) Tha che ,
G.R.J. The Anome ic E ec and Associa ed S e eoelec onic E ec s, A.C.S. Washing on. 1993.
38 a) Lemieux, R.U.; Bock, K.; Delbae e, L.T.J.; Ko o, S.; Rao, V.S. Can. J. Chem. 1980, 58,
631. b) P aly, J.P.; Lemieux, R.U. Can. J. Chem. 1987, 65, 213. c) Tho gensen, H.; Lemieux,
R.U.; Bock, K.; Maye , B. Can. J. Chem. 1982, 60, 44.
39 Poph is ic, V. Goodman, L. Na u e. 2001, 411, 565-568.
40 Sch eine , P.R. Angew. Chem. In . Ed. 2002, 41, 3579-3581.
41 Jansson, P.E.; Kenne, L.; Wildmalm, G. Ca bohyd . Res. 1987, 168, 67-77.
42 Lemieux, R.U.; Kullnig, R.K.; Be ns ein, H.J.; Schneide , W.G. J. Am. Chem. Soc. 1958, 80,
6098-6105.
43 Bock, K.; Pede sen, C. J. Chem. Soc. Pe kin T ans. 1974, 2, 293-297.
44 Vliegen ha , J.F.G.; Do land, L.; an Halbeek, H. Ad . Ca bohyd . Chem. Biochem. 1983,
41, 209-374.
45 an Kuik, J.A.; Vliegen ha , J.F.G. T ends Glycosci. Glyco echnol. 1991, 3, 229-230.
46 an Kuik, J.A.; Hå d, K.; Vliegen ha , J.F.G. Ca bohyd . Res. 1992, 235, 53-68.
47 Boube , S.; Bock, K; Smi h, D.; Da ill, A.; Albe sheim, P. T ends Biochem. Sci. 1989, 14,
475-477.
48 No wood, T.J.; Boyd, J.; He i age, J.E.; So e, N.; Campbell, L.D. J. Magn. Reson. 1990, 87,
488-501. b) Kö e , E.; H uby, V.J.; Uh in, D.J. J. Magn. Reson. 1997, 129, 125-129. c) de
Bee , T.; an Zuylen, C.W.E.M.; Ha d, K.; Boelens, R.; Kap ein, R.; Kame ling, J.P.;
Vliegen ha , J.F.G. FEBS Le . 1984, 348, 1-6.
49 a) Le ne , L.; Bax, A. J. Magn. Reson. 1986, 69, 375-380. b) Ca anagh, J.; Palme , A.G.;
W igh , P.E.; Rance, M. J. Magn. Reson. 1991, 91, 429-436.
50 de Vaa d, P.; Boelens, R.; Vuis e , G.W.; Vliegen ha , J.F.G. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112,
3232-3234.
51 a) B iche , H.R.; Mülle , C.; Bigle , P. J. Magn. Reson. 1990, 89, 146-152. b) Sabesan, S.;
Duus, J.Ø.; Fukunaga, T.; Bock, K.; Lud igsen, S. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 3236-3246. c)
Sco , K.; Keele , J.; Van, Q.N.; Shaka, A.J. J. Magn. Reson. 1997, 125, 302-324.
52 S o , K.; Keele , J. Magn. Reson. Chem. 1996, 34, (7), 554-558..
32│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
53 a) Bush, C.A.; Cagas, P. Ad . Biophys. Chem. Vol 2. JAI P ess 1991. b) Poppe, L.; Von de
Lie h, C.W.; Dab owski, J. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 7762. c) Sca dale, J.N.; P es ega d,
J.H.; Yu, R.K. Biochemis y. 1990, 29, 9843. d) Bock, K. Pu e. App. Chem. 1983, 55, 605.
54 Dios, A.C.; Pea son, J.G.; Old ield, E. Science. 1993, 55, 1491.
55 a) Ka plus, M. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2870. b) T a oska, I.; H ico ini, M.; Pe ako a,
E. Ca bohyd . Res. 1989, 189, 359. c) T a oska, I.; Ta a el, F.R. J. Biomol. NMR. 1992, 2,
421. d) Haasnoo , C.A.G.; de Leeuw, F.A.A.M.; Al ona, C. Te ahed on. 1980, 36, 2783.
56 Neuhaus, D.; Williamson, M.P. The Nuclea O e hause E ec in S uc u al and
Con o ma ional Analysis. VCH Publishe , New Yo k, 1989.
57 Canales, A.; Jiménez-Ba be o, J.; Ma ín-Pas o , M. Magn. Reson. Chem. 2012, 50, (1), 80-
85.
58 Macu a, S. E ns , R.R. Mol. Phys. 1980, 41, 95-117.
59 E ns , R.R.; Bodenhausen, G. Wokaun, A. P inciples o Nm in one and wo dimensions.
Cla endon P ess, Ox o d. 1987.
60 Aubin, Y.; P es ega d, J. H. Biochemis y. 1993, 32, 3422-28.
61 Tjand a, N.; Bax, A. Science. 1997, 278, 1111-14.
62 Bock, K. Pu e. Appl.Chem. 1983, 55, 605.
63 a) Asensio, J. L.; Jiménez-Ba be o, J. Biopolyme s. 1995, 35, 55. b) Homans, S.W.
Biochemis y. 1990, 29, 9110. c) Acquo ,i D.; Can u, L.; Ragg, E.; Sonnino, S. Eu . J.
Biochem. 1994, 225, 271.
64 Edinge , S.R.; Co is, C.; Shenkin, P.S.; F iesne , R.A. J. Phys. Chem B. 1997, 101, 1190-
1197.
65 Me opolis, N.; Rosenblu h, A.W. Rosenblu h, M.N.; Telle , A.H.; Telle , E. J. Chem. Phys.
1953, 21, 1087-1092.
66 a) Ve le , L. Phys. Re . 1967, 159, 98. b) Ha ey, S.C.; McCammon, J.A. Dynamics o
P o eins and Nucleic Acids, Camb idge Uni e si y P ess, Camb idge, 1987.
67 Widmalm, G.; Pas o , R.W. J. Chem. Soc. Fa aday. T ansac ions. 1992, 88, 1747-1754
68 Ma ín-Lomas, M.; Khia , N.; Ga cía, S.; Koessle , J-L.; Nie o, P.M.; Rademache , T.W.
Chem. Eu . J. 2000, 6, (19), 3608-3621.
CAPITULO 2
ESTUDIOS DE
PSEUDODISACÁRIDOS
MIMÉTICOS DE IPG.
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
40│
2.2.2.- CALCULOS TEÓRICOS DE CAMPOS DE FUERZAS.
Los análisis con o macionales eó icos de los compues os 7-19, se ealiza on median e
cálculos de campos de ue za empleando écnicas de mecánica y dinámica molecula . Es os
compues os, además de un esquele o de ipo ca bohid a o, con ienen g upos ca gados, lo
supone una di icul ad añadida a es e ipo de análisis. Es as es icciones limi aban la elección
del campo de ue zas ya que és e debe ía modela adecuadamen e ca ac e ís icas p opias de los
ca bohid a os, 34 al mismo iempo que debe ían es a adecuadamen e pa ame izados los g upos
os a o y amonio.
Po lo an o, de los campos de ue za accesibles en nues o g upo en el momen o de la
ealización de es a ésis: MM2* (modi icación MM2 de 1987),35 MM3* (modi icación MM3
de 1991),36-39 AMBER* (modi icación AMBER de 1984 y 1986),40-43 OPLSA* (modi icación
OPLS/A de 1991)44-46 y po úl imo MMFF implemen ados en Mac omodel ( e siones 5.5 y
6.0);47-53 MM2, MM3, MMFF9447-53, AMBER36, 42 y TRIPOS54 incluidos o iginalmen e en
Sybyl, y o os adap ados po Imbe y e al. ,55 pa a el análisis con o macional de ca bohid a os,
pocos e an alidos en nues o caso. Únicamen e AMBER* p esen aba simul áneamen e
pa áme os especí icos de al a calidad pa a ca bohid a os y és e es os ó icos. Po o o lado, el
campo de ue zas AMBER (incluyendo pa áme os de Homans) en su adap ación a Insigh
II/DISCOVER 94.0, se había empleado p e iamen e en el es udio de las es uc u as 1-32
aunque no es aba disponible en nues o g upo.
Dados es os an eceden es se decidió u iliza MACROMODEL con el campo de
ue zas AMBER*. Es a implemen ación pe mi ía op a en e dos epa ame izaciones
especí icas pa a ca bohid a os: la de Homans de 199056 y la más mode na de S ill e al.40, 57. La
p ime a ue gene ada ampliando los pa áme os de Ha e al.58 exis en es pa a monosacá idos,
basándose en cálculos ab ini io del dime oxime ano59. La segunda es mucho más mode na
(1996), ha sido desa ollada de no o a pa i de cálculos de o bi ales molecula es ab ini io
sob e modelos de pi anosas,40, 60, 61 y op imizada pa a el modelo con ínuo de disol en e
GB/SA62, 63. En gene al se empleó la e sión de S ill debido a que ue la más p ecisa en un
es udio compa a i o p e io (Apéndice 1) p obablemen e po de i a de mé odos de cálculo
más so is icados. En cie os casos en los que se conside ó in e esan e, se con as a on los
esul ados de es a pa ame ización con la de Homans.
Los cálculos de mecánica molecula consis ie on en el es udio sis emá ico del espacio
con o macional usando mapas adiabá icos de ipo Ramachand an del enlace glicosídico o
median e simulaciones de dinámica molecula examinando esencialmen e el mismo elemen o.

Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
41│
Mapas Adiabá icos
Al se el enlace glicosídico el p incipal pun o de lexibilidad de los ca bohid a os y
asumiendo que los esiduos que o man pa e de un de e minado enlace glicosídico son ígidos,
se puede supone que la geome ía global de los con ó me os de baja ene gía, depende a
p incipalmen e de las o aciones en o no a los enlaces glicosídicos (). Po ello, pa a
explo a el espacio con o macional accesible de los disacá idos obje o de nues o es udio 7-19,
se ealizado una búsqueda sis emá ica al ededo de es os enlaces.64-66 Se han gene ado el
colec i o de con ó me os ep esen a i os de odo el espacio con o macional () median e la
a iación sis emá ica de dichas o siones, en pequeños inc emen os  sob e el in e alo o al
de 360º (mapas ígidos). Pos e io men e, se ob u ie on los mapas elajados po minimización
de la ene gía de odos los g ados de libe ad excep o en las o siones di ec o as (). Es os
desc iben más ampliamen e la supe icie de ene gía po encial accesible, disminuyendo las
ba e as en e mínimos ela i os, y localizando mínimos de ene gía meno es que la/s
es uc u a/s de pa ida. Sin emba go, a pesa de la mayo e icacia en la localización de las
egiones de mínima ene gía, los mapas no conside an el p oblema de “mínimos múl iples” ( e
capi ulo 1), y pa a un pun o dado () del espacio con o macional desc i o po el mapa
elajado es posible que se puedan p oduci aún, con o maciones de meno ene gía po o ación
de los g upos exocíclicos. Po es o se han cons uido los co espondien es mapas adiabá icos,
median e una a iación sis emá ica de odas las posibles combinaciones de o ien aciones de
odos los g upos exocíclicos p esen es en los compues os analizados. Si asumimos que cada
g upo exocíclico puede encon a se mayo i a iamen e en cada una de las 3 con o maciones
“al e nadas”, hab ía que gene a 3N con o maciones di e en es pa a cada pun o del espacio
(), siendo N el núme o de g upos exocíclicos. En gene al, se han conside ado los
o áme os (gg, g , y g) del g upo hid oxime ilo de la hexosamina y ambién posibles
o ien aciones de los g upos os a o y me ilo.
En nues o caso, pa a educi el cos e compu acional, se han conside ado solo las
disposiciones de los g upos hid oxilos secunda ios que den luga a un mayo núme o de
enlaces de hid ógeno, y pa a ello, los OH- secunda ios se o ien an bien en sen ido de las
manecillas del eloj (sen ido clockwise) o bien en sen ido con a io (an iclockwise). Se ha
empleado es e ipo de ap oximación, po que al a a se de ca bohid a os de un amaño y
lexibilidad limi ados, el iempo compu acional no es excesi o y en es e ipo de
ap oximaciones cons i uye una de las o mas más e icaces de educi el cos e compu acional,
man eniendo la segu idad de que se explo a an las con igu aciones del sis ema de mayo
sen ido ísico-químico.
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
42│
Dinámicas Molecula es (DM).
Como complemen o al análisis sis emá ico empleando mapas adiabá icos (,), se
ealiza on en los casos de los compues os 18-21 simulaciones de dinámica molecula . Es a
al e na i a, al pe mi i la ob ención de in o mación adicional ace ca de la dinámica y
lexibilidad de los compues os es udiados, esul aba a ac i a en las es uc u as es udiadas en
es a esis doc o al. En p ime luga se ealiza on simulaciones de dinámica molecula clásica,
NVT in acuo,67, 68 de los compues os 18-21, empleando como es uc u as de pa ida aquellas
de mínima ene gía encon adas median e búsqueda sis emá ica. Pe o, sin duda como se
desc ibe más adelan e, los mejo es esul ados se ob u ie on empleando dinámicas es ocás icas
o de Lange in.69, 70
2.3.- RESULTADOS.
El es udio con o macional de los disacá idos 7-19 en disolución se ha lle ado a cabo3
median e una combinación de mé odos expe imen ales de RMN y de cálculos eó icos de
campos de ue zas (mecánica y dinámica molecula ). Ambas écnicas han sido comple amen e
independien es en su adquisición. Es deci , en la ealización de los cálculos no se han
empleado es icciones de i adas de los da os expe imen ales. Du an e el análisis de los
esul ados, las desc ipciones eó icas se han empleado pa a in e p e a los esul ados
expe imen ales, y ecíp ocamen e, los da os de RMN han sido u ilizados pa a alida los
esul ados eó icos.
Pa a la p esen ación y discusión de los esul ados que sigue, se han ag upado los
pseudodisacá idos 7-19 de acue do con ‘mo i os es uc u ales’ ca ac e ís icos, basándose en la
es e eoquímica del enlace glicosídico y en el isóme o de inosi ol que lo compone. Así, la
aplicación es os c i e ios p oduce seis mo i os es uc u ales:
mo i o es uc u al
compues os
D-glucosamina  (1→6) D-mio-inosi ol
D-glucosamina  (1→6) D-mio-inosi ol
D-glucosamina  (1→6) D-qui o-inosi ol
D-glucosamina  (1→6) D-qui o-inosi ol
D-hexosamina  (1→6) D-pini ol
D-hexosamina  (1→6) D-pini ol
9 y 10
11 y 12
13, 14 y 15
16 y 17
18 y 19
20 y 21
Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
43│
2.3.1.- Mo i o es uc u al glucosamina  (1→6) mio-inosi ol.
O
HO
O
OH
NH3
OH
HO
O
O
HO
OH
PO
-O
O
HO
O
OH
NH3
OH
HO OH
HO OH
HO +
+
9 10
La asignación comple a de los espec os 1H-RMN y 13C-RMN, de los disacá idos 9 y
10, se mues a en la abla 1.
Tabla 1. Desplazamien os químicos de 1H (

(ppm)) y 13C (

(ppm)) y cons an es de acoplamien o 3JH-H (Hz), en D2O,
de los compues os 9 y 10 a 25ºC y a 500 MHz.
9
10
9
10

[1H]
3JH-H

[1H]
3JH-H

[13C]

[13C]
Glucosamina
H-1
5,16
3,67
5,63
3,76
C-1
100,3
95,5
H-2
2,72
3,70/10,25
3,33
3,67/10,66
C-2
55,5
54,6
H-3
3,54
9,70
4,01
9,14/10,69
C-3
74,0
69,8
H-4
3,37
9,62
3,43
10,14/9,22
C-4
70,0
70,3
H-5
3,95
9,55
4,24
2,68/5,75
C-5
72,8
72,3
H-6
3,73
-
3,74
12,51/2,32
C-6
60,7
61,0
H-6’
3,73
-
3,95
12,55/5,70
Cicli ol
H-1
3,67
2,60/9,74
3,56
3,04/9,92
C-1
71,9
70,9
H-2
3,94
2,75/2,80
4,34
2,74/2,74
C-2
72,8
71,4
H-3
3,45
2,80/10,05
4,09
8,72/2,68
C-3
71,3
73,6
H-4
3,57
-
3,99
9,83/9,67
C-4
72,5
76,8
H-5
3,29
9,11
3,55
9,47/9,47
C-5
73,3
75,3
H-6
3,63
8,80
3,68
9,82/9,58
C-6
80,9
72,9
Los alo es en las cons an es de acoplamien o, indican que el anillo de pi anosa de
ambos compues os se encuen a en con o mación de silla canónica 4C1. Po el con a io, pa a el
anillo de cicli ol del compues o 10 indican una dis o sión p oducida po el anillo de cinco
miemb os usionado del os a o cíclico.
Las supe icies adiabá icas de los enlaces glicosídicos de 9 y 10 ue on cons uidas a
pa i de los co espondien es mapas elajados (36 y 12 espec i amen e), siguiendo la
me odología desc i a en el apa ado 2.2. Es os jun o con los mapas de población y la
supe posición de las egiones de p oximidad in e p o ónica p edichos pa a los compues os 9 y
10 se mues an en las igu as 2.2 y 2.3.
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
44│
Figu a 2.2. Mapa de ene gía adiába ico (izda) calculado pa a el compues o 9 y supe posición de
los NOEs p edichos en el mapa de dis ibución de p obabilidad con o macional (de echa). Los ni eles de
con o nos se mues an cada 5KJ mol-1 pa a la ene gía, las dis ancias in e p o ónicas a 2,5 y 3 Å y los de
p obabilidad a 10, 5.5 y 1%.
Figu a 2.3. Mapa de ene gía adiába ico (izda) calculado pa a el compues o 10 y supe posición
de los NOEs p edichos en el mapa de dis ibución de p obabilidad con o macional (de echa). Los ni eles
de con o nos se mues an cada 5KJ mol-1 pa a la ene gía, las dis ancias in e p o ónicas a 2,5 y 3 Å y los
de p obabilidad a 10, 5.5 y 1%.
En ambos casos las supe icies adiabá icas p edicen dos mínimos locales, uno
absolu o si uado en la zona cen al del mapa adiabá ico, de ipo syn-, y o o de meno ene gía
en la zona an i-±180º)Ambos es án de acue do con la o ien ación p edicha po el e ec o
exo-anomé ico. Los mapas de dis ancias in e p o ónicas in e io es a 3Å indican que mien as
que el mínimo syn-se encon a ía ca ac e izado po el NOE exclusi o H1’-H6; el mínimo
an i-po su pa e lo se ía po los NOEs H1’-H5 y H1’-H1.
En los expe imen os NOESY y ROESY egis ados pa a 9 y 10, se ap ecian
simul aneamen e los NOEs H1’-H6 y H1’-H5, indicando la coexis encia de ambos mínimos en
disolución. El NOE H1’-H1, se pudo obse a en el caso del compues o 10, pe o no en el de 9
debido a solapamien o de señales. La mayo in ensidad del NOE H1’-H6 espec o a H1’-H1 y
Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
45│
H1’-H5 pa a 10 indican una mayo población del mínimo syn-. En el caso de 9 la di e encia
de desplazamien o químico en e las señales co espondien es a H1 y H6 es compa able a la
cons an e de acoplamien o en e ambos lo que complicó es e análisis. Con el in de de e mina
cuali a i amen e cual de los dos NOEs exclusi os e a mayo i a io, se ealizó un expe imen o
HMQC-NOESY. Median e es e expe imen o (Figu a 2.4) se pudo sepa a los picos de c uce
po su ecuencia de ca bono de e minando sin dudas, la mayo in ensidad del NOE H1’-H6
con espec o a H1’-H1. De es a mane a, al menos cuali a i amen e se puede es ablece que los
compues os 9 y 10, p esen an es uc u as muy simila es y sus es uc u as idimensionales,
es a ían desc i as po un con ó me o mayo i a io de ipo syn- en ápido in e cambio con un
con ó me o an i- mino i a io.
Figu a 2.4. Secciones del espec o 2D-HMQC-NOESY ( iempo de mezcla 400 ms) a 500 MHz,
298 K, pa a 9.
Pa a cuan i ica las dis ancias in e p o ónicas cla e se ealiza on se ies de
expe imen os 1D-NOESY y 1D-ROESY a dis in os iempos de mezcla. Los alo es de las
cons an es de elocidad de elajación c uzada y de las dis ancias de i adas de és as se ecogen
H-1’
C-6
C-1
H-1’
C-6
C-1

Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
46│
en la abla 2. En el caso de 9 no ue posible el cálculo p eciso de odas las dis ancias
in e p o ónicas debido al solapamien o espec al. Las dis ancias expe imen ales se compa a on
con las es imadas a pa i de los cálculos de mecánica molecula ( abla 2) con el in de
comp oba la calidad de es os. Es as dis ancias eó icas se calcula on como el p omedio < -6>
de las dis ancias de odos los con ó me os empleados pa a la cons ucción de los
co espondien es mapas adiabá icos ponde adas en la p obabilidad de cada con ó me o ( éase
pa e expe imen al). Tan o en el caso de 9 como de 10, se obse a una lige a des iación
sis emá ica de las dis ancias eó icas espec o a las expe imen ales. Es a disc epancia iene su
o igen en una subes imación de la población del mínimo an i- que p oduce una sob ees ima
las dis ancias ca ac e ís icas de la es uc u a syn, H1’-H1 y H1’-H5. Es os esul ados no
mejo a on en nues as manos a pesa de epe i los cálculos empleando o os campos de ue za
u o os a amien os elec os á icos.
Tabla 2. Cons an es de elocidad de elajación c uzada  y dis ancias in e p o ónicas expe imen ales calculadas
pa a 9 y 10 en D2O y a 25º C.
NOESY
ROESY
Teó ica
Pa eja de P o ones
 s-1
d (Å)
 s-1
d (Å)
d (Å)
9
H1’-H2’
0,081
0,093
H1’-H6 + H1’-H1
0,112
0,058
H1’-H5
0,014
3,41
0,009
3,23
3,72
10
H1’-H2’
0,074
0,078
H1’-H5
0,018
3,00
0,076
2,38
4,51
H1’-H6
0,077
2,35
0,189
2,05
2,28
H1’-H1
0,011
3,24
0,010
3,35
3,86
Es a des iación en la es imación de las poblaciones ela i as de los dos con ó me os
es á en apa en e con adicción con abajos p e ios sob e 1 y 2 en los que se p edice una
población ap eciable del mínimo an i-

en 1.2 Es a di e gencia puede se a ibuida al empleo
de o a o ma del campo de ue zas AMBER según su implemen ación en DISCOVER33.
Además debido a que en los dos es udios se emplea on écnicas de di e en e sensibilidad (2D-
NOESY o 1D-NOESY) pa a la ob ención los da os expe imen ales, no es posible alo a si
es a apa en e disc epancia en los esul ados eó icos e leja o no una ealidad demos able.
El es udio del P o . Jiménez-Ba be o, a ibuye un papel con o macional cla e a la
in e acción elec os á ica de los g upos amonio y os a o.2 Es os g upos se encuen an
p óximos en el espacio en el mínimo syn- en el compues o 2 es abilizándolo espec o a la
posibilidad ipo an i- que no ue de ec ado. Po el con a io, en el caso de 1 el os a o cíclico
no es capaz de p oduci es a es abilización y se obse an las dos con o maciones syn y an i-
en equilib io.
Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
47│
En nues o caso, el compo amien o de 9, que ca ece de g upo os a o y po an o no
puede es ablece in e acciones con el g upo amonio, es simila a 10, lo que con i ma ía es a
explicación. Po o o lado, se pod ía espe a que en el caso de 10 la con igu ación opues a del
cicli ol pudie a da luga a una es abilización elec os á ica de la o ma an i. Sin emba go, el
es udio de los modelos molecula es co espondien es a los dos mínimos calculados pa a es a
se ie e ela, que la dis ancia en e los g upos ca gados no es la adecuada pa a ello. El
es ablecimien o de in e acciones elec os á icas implica ía una impo an e des iación de los
alo es Φ/Ψ del mínimo. El que no se ap ecie una g an modi icación de las p opo ciones de las
dos especies, end ía a señala que es a in e acción elec os á ica no es capaz po si sola, de
di igi la con o mación al ededo del enlace glicosídico. Se ían los e ec os es e eoelec ónicos
ca ac e ís icos de ca bohid a os (e ec o gauche y exo-anomé ico) los p incipales esponsables
de su geome ía, que la in e acción elec os á ica modula ía en un cie o g ado.
El solapamien o impide la cuan i icación del NOE exclusi o de la con o mación syn
en el caso de 7. Po ello, pa a compa a las poblaciones ela i as de 9 y 10 es necesa io analiza
las p opo ciones del NOE exclusi o del con o me o mino i a io H1’-H5 en e ambos
compues os. Pa a ello se ha empleado el cocien e con una dis ancia ija, H1’-H2’ / H1’-H5,
( abla 3) que indica que la p opo ción de la con o mación mino i a ia es mayo pa a el
compues o con os a o cíclico
Tabla 3. P opo ción de NOE pa a 9 y 10, ob enidas a pa i de los da os de

NOE p oceden es de la abla 4.
9
10
H1’-H2’ / H1’-H5
5,8
4,0
Figu a 2.5. Es uc u as de mínima ene gía pa a 9 (supe io ) y 10 (in e io ), en sus
con o maciones syn-

(izda) y an i-

(de echa).
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
48│
El análisis de las es uc u as de mínima ene gía de los dos con o me os syn- y an i-
 en e 9 y 10 (Figu a 2.5), sugie e la p esencia de in e acciones es abilizan es en 10 debidas
al g upo os a o cíclico. Po un lado, el g upo os a o de 10 pod ía pe mi i es ablece se un
enlace de hid ógeno en e uno de sus oxígenos y el g upo hid oxilo en posición 6 del esiduo
de glucosamina que es abiliza ía la es uc u a syn- espec o a 9. Po o o lado la in e acción
elec os á ica amonio os a o lo ha ia pa a la es uc u a an i-. El p edomino de la segunda
in e acción explica ía el aumen o de la población del mínimo an i- en 10 con espec o a 9.
2.3.2.- Mo i o es uc u al glucosamina  (1-6) mio-inosi ol.
O
HO O
OH
NH3OH
HO
O
O
HO
OH
PO
O
OHO O
OH
NH3OHHO OH
HO OHHO
++
11 12
-
Los espec os de RMN han sido asignados como se ha indicado en el apa ado
an e io . Sus espec os, an o de 1H como de 13C son ca ac e ís icos de un enlace glicosídico 
con desplazamien os a campo al o de las señales y acoplamien os JH1-H2 ~ 8Hz.
Tabla 4. Desplazamien os químicos de 1H (

(ppm)) y 13C (

(ppm)) y cons an es de acoplamien o 3JH-H (Hz), en
D2O, de los compues os 11 y 12 a 25ºC y a 500 MHz.
11
12
11
12
 (1H)
3JH-H
 (1H)
3JH-H
 (13C)
 (13C)
Glucosamina
H-1
4,63
8,3
4,91
8,4
C-1
106,1
100,6
H-2
2,67
8,9
2,96
10,3/10,3
C-2
58,9
56,4
H-3
3,92
9,1
3,61
8,9/9,1
C-3
77,9
43,2
H-4
3,36
9,9
3,44
9,6/9,9
C-4
71,7
69,8
H-5
3,45
2,2/6,0/11,7
3,51
2,9/2,2
C-5
78,4
76,5
H6a/H6b
3,89
2,0 12,3
3,73
5,5/5,4
C-6
62,8
60,7
3,70
6,1/12,3
3,90
12,5/12,5
Cicli ol
H-1
3,59
2,8/9,9
3,75
5,3
C-1
71,9
69,8
H-2
4,05
2,8
4,17
4,2/4,7
C-2
74,1
77,3
H-3
3,50
2,8
4,56
8,3/8,3
C-3
73,2
79,4
H-4
3,62
9,6
4,06
10,3/9,2
C-4
74,6
82,3
H-5
3,44
9,4
3,40
9,9/9,9
C-5
76,1
70,5
H-6
3,79
9,6
3,68
9,7
C-6
84,6
71,7
En es e caso pa a el cálculo de los co espondien es mapas adiabá icos y de
dis ibución de poblaciones (Figu a 2.6) se conside a on un o al de 12 mapas elajados en el
Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
49│
caso de 11 y 36 pa a 12, lo cual supuso un o al de 7200 y 2400 con ó me os es udiados
espec i amen e.
Tal y como cabe espe a pa a es uc u as con enlaces glicosídicos de ipo , se
obse an es mínimos locales en los mapas elajados, los ya conocidos syn-, an i-, y
apa ece el denominado mínimo an i- alo es deenº). En e es as, como cabía espe a
la con o mación syn- es la ene gé icamen e a o ecida. Los NOE exclusi os que
ca ac e iza ían es os mínimos son el H1’-H6 acompañado po con ac os débiles H1’-H1 pa a el
syn-; H1’-H1 y H1’-H5 pa a la o ien ación an i-, mien as que H2’-H6 se ía el NOE
exclusi o pa a la con o mación an i-.
Figu a 2.6. Mapas de ene gía adiabá icos calculados pa a el compues o 11 (supe io de echa) y
12 (in e io de echa) y supe posición de los NOEs p edichos en los mapas de dis ibución de
p obabilidad con o macional (supe io izda pa a 11 e in e io izda pa a 12). Los ni eles de con o nos se
mues an cada 5KJ mol-1 pa a la ene gía, las dis ancias in e p o ónicas a 2,5 y 3 Å y los de p obabilidad
a 10, 5.5 y 1% pa a ambos compues os.
El espec o NOESY de 11 mos ó picos de c uce in ensos en e H1’-H6 y débiles pa a
H1’-H1 (Figu a 2.7) indicando el p edominio de es uc u as de ipo syn-.
Desa o unadamen e el con ac o exclusi o de la con o mación an i-Ψ (H1’-H5), no puede se
cuan i icado di ec amen e debido al solapamien o con el NOE in a- esiduo H1’-H5’. Dado que
an o H3’ como H5’ se encuen an a una dis ancia equi alen e de H1’ y expe imen an simila es
mo imien os in e nos la compa ación en e las in ensidades de los picos H1’-H3’ y la suma de
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
56│
Figu a 2.11. Es uc u as minimizadas pa a el mo i o es uc u al

(1-6) qui o-inosi ol,
submínimo A1(a iba) pa a el compues o 13 (izquie da) y 14 (de echa) y submínimo A2 (abajo) pa a los
compues os 15 (izquie da) y 14 (de echa).
Figu a 2.12. Red de enlaces de hid ógeno que mues a el compues o 14 únicamen e a a és del
submínimo de ipo A1.

Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
57│
2.3.4.- Mo i o es uc u al glucosamina  (1-6) qui o-inosi ol.
HO
HO
HO
OH
O
HO O
OH
NH3
HO
OP
OOH
O
HO
HO
HO
OH
O
HO
O
OH
NH3
HO
OH
+
-
+
17
16
Los compues os 16 y 17, son los ep esen an es del pa ón es uc u al  (1→6)
qui o-inosi ol. Los espec os de 1H-RMN de ambos ue on asignados ( abla 8), aunque en es e
caso la escasa can idad de ma e ial disponible impidió el egis o y asignación de los espec os
de 13C. Como se obse ó pa a los de i ados  (1→6) qui o-inosi ol, las cons an es de
acoplamien o indican que los anillos de los esiduos de glucosamina y cicli ol ienen un
compo amien o monocon o macional.
Tabla 8. Desplazamien os químicos de 1H (

(ppm)) y 13C (

(ppm)) y cons an es de acoplamien o 3JH-H (Hz), en D2O,
de los compues os 16 y 17 a 25ºC y a 500 MHz.
16
17
 (1H)
3JH-H
 (1H)
3JH-H
Glucosamina
H-1
4,57
8,2
4,66
8,2
H-2
2,71
9,9
2,77
8,7/10,3
H-3
3,41
9,5
3,45
9,4
H-4
3,37
9,3
3,36
9,4
H-5
3,47
2,3/9,3
3,47
2,2/ 5,5/9,9
H6a/H6b
3,74
2,3/12,3/5,6
3,90
2,2/12,7/5,7
3,92
10,7
3,71
10,4
Cicli ol
H-1
4,26
3,6
4,58
3,0/4,2/8,5
H-2
3,77
3,2/9,5
3,68
2,6/9,8
H-3
3,57
9,4
3,62
8,8
H-4
3,62
9,5
3,54
9,4
H-5
3,84
3,3/ 9,7
3,93
10,0
H-6
4,06
3,7
4,19
3,8
Las supe icies de ene gía y mapas de p obabilidad globales de los de i ados de -
qui o-inosi ol 16 y 17 calculadas siguiendo el mismo p o ocolo empleado con es o de
compues os p esen an un único mínimo syn- a  56±5, 17 (Figu a 2.13). Es a p edicción
se encuen a de acue do con el e ec o exo-anomé ico pa a una disposición  pa a la unión
glicosídica. En es os mapas se ap ecia cla amen e que aunque la posición del mínimo global es
muy simila en ambos casos, la egión accesible del de i ado con os a o 17 es á mucho más
es ingida que pa a 16. Al igual que en el caso de los anóme os  de la se ie qui o en los
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
58│
mapas / se ap ecia una conside able disminución de la lexibilidad con espec o a análogos
en la se ie mio-inosi ol.
Figu a 2.13. Mapas de ene gía adiabá icos calculados pa a el compues o 16 (supe io de echa)
y 17 (in e io de echa) y supe posición de los NOEs p edichos en los mapas de dis ibución de
p obabilidad con o macional (supe io izda pa a 16 e in e io izda pa a 17). Los ni eles de con o nos se
mues an cada 5KJ mol-1 pa a la ene gía, las dis ancias in e p o ónicas a 2,5 y 3 Å y los de p obabilidad
a 10, 5.5 y 1% pa a ambos compues os.
Expe imen almen e se de ec an dos NOEs glicosídicos in ensos: H1’-H6 y H1’-H1,
es e úl imo con meno in ensidad. De acue do con los mapas de dis ancias in e p o ónicas 
(Figu a 2.13) es os co esponden a los NOEs exclusi os de la única con o mación p edicha po
los cálculos. No se encuen a, incluso a iempos de mezcla la gos, ninguna e idencia de o os
NOEs in e glicosídicos como H1’-H4 ó H1’-H2, que se ían ep esen a i os de una hipo é ica
si uación an i-. Los esul ados expe imen ales con i man cuali a i amen e las p edicciones
eó icas, de iniendo el enlace glicosídico de 16 y 17 como un único mínimo de ipo syn-
A pa i de las cons an es de elajación c uzada ( abla 9) se calcula on las dis ancias
expe imen ales pa a 17. Desa o unadamen e es o no ue posible pa a 16 debido a la ausencia
de un alo iable pa a la cons an e NOE de una dis ancia de e e encia po que H1’-H3’ y
H1’-H5’ es án solapadas y H1’-H2’, con aminado po acoplamien o escala . Tampoco se puede
conside a como e e encia el p omedio de dis ancias H1’-H3’ y H1’-H5’, pues o que debido a
Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
59│
un acoplamien o escala ue e de H3’ con H4’ se p oduce una pé dida de NOE de H3’ a H4’
po es a ía indi ec a. A pesa de no pode dispone de dis ancias expe imen ales iables la
simili ud de los alo es de NOE pa a H1’-H6 y H1’-H1, en e los compues os 16 y 17 pe mi e
supone un g an pa ecido de su es uc u a en disolución. Pa a 17 al igual que ocu ió con el
mo i o β mio- se obse a una buena conco dancia en e los esul ados expe imen ales y la
p edicción, que es mejo en el caso de las dis ancias calculadas sob e el espacio Φ,Ψ comple o
que sob e las es uc u as elajadas. Es a obse ación es indica i a de la lexibilidad del enlace
glicosídico den o de es e mínimo como p edice el mapa adiabá ico (Figu a 2.13). En es e
compues o apa ece ambién un pico de c uce H1’-H4’ o iginado po ue e acoplamien o en e
H3’-H4’.
Tabla 9. Cons an es de elocidad de elajación c uzada  , y dis ancias in e p o ónicas expe imen ales pa a 16 y 17
calculadas en D2O y a 25ºC. Las dis ancias eó icas es án calculadas sob e de mapas adiabá icos.
Exp.
Teó ica
Teó ica< >
Pa P o ones
 [s.1]
d [Å]
d [Å]
d [Å]
16
H1’-H3’ + H1’-H5’
( e e encia solapada)
0,117
H1’-H4’
0,060
H1’-H6
0,156
2,30
2,30
H1’-H1
0,029
3,77
3,43
H1’-H2’
0,023
H1’-H3’ ( e e encia)
0,121
17
H1’-H5’ ( e e encia)
0,134
H1’-H6
0,121
2,49
2,36
2,28
H1’-H1
0,023
3,29
3,87
3,47
Figu a 2.14. Es uc u as de mínima ene gía pa a los compues os 16 (izda) y 17 (de echa).
Cuando se compa a on las es uc u as elajadas de 16 y 17, ep esen adas en la igu a
2.14, se pudo ap ecia un enlace de hid ógeno es abilizan e en e p o ón del os a o y el
oxígeno del anillo de pi anosa O-5 Glc, en 17. Es a in e acción in e - esíduo, ausen e en 16,
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
60│
pod ía explica la meno dispe sión del mínimo syn- pa a 17 que e lejan los cálculos
eó icos.
2.3.5.- Mo i o es uc u al hexosamina (16) Pini ol
HO HO OH
O
HO O
OH
NH3
HO
OMe
+
18
OH HO HO OH
O
HO O
OH
NH3
OH
OMe
+
OH
19
Las azones po las que se diseña on y sin e iza on los compues os 18 a 21, se alejan
en cie o modo de la busqueda sis emá ica en la que se basa on los modelos de IPGs de ipo A
y de ipo P. Como consecuencia de es e cambio apa ecie on dos nue os componen es, los
esiduos de pini ol y de galac osamina. Aunque ambos implican nue as ca ac e ís icas
es uc u ales a la ho a de la in e acción con po enciales ecep o es, no debe ian supone una
g an al e ación de la geome ía del enlace glicosídico, pues o que las di e encias con inosi ol y
glucosamina es án alejadas de él. Po ello, es especialmen e in e esan e de e mina si es os
cambios no al e an en esencia la geome ía del esquele o común con espec o a los de i ados
de qui o-inosi ol 13 a 17. De se así, median e la compa ación de las ac i idades biológicas, se
pod ía deduci la impo ancia ela i a de los g upos en posición 4 de la hexosamina y del
pini ol en su unción como IPGs. Coincidiendo con es a modi icación, ambién se decidió
amplia los cálculos eó icos incluyendo simulaciones de dinámica molecula pa a
complemen a los mapas adiabá icos ya que es as conside an más adecuadamen e la
lexibilidad de los pseudodisacá idos.
Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
61│
Empleando la me odología habi ual ue posible ealiza asignación inambigua de los
compues os 18 y 19 ( abla 10). Los anillos de pi anosa y pini ol adop a on la espe ada
con o mación 4C1 como indican los alo es de las cons an es de acoplamien o.
Tabla 10. Desplazamien os químicos de 1H (

(ppm)) y 13C (

(ppm)) y cons an es de acoplamien o 3JH-H (Hz), en
D2O, de los compues os 18 y 19 a 25ºC y a 500 MHz.
18
19
 (1H)
3JH-H
 (1H)
3JH-H
Hexosamina
H-1
5,07
3,5
5,31
3,85
H-2
2,97
-
3,54
11,2
H-3
3,70
9,4
4,11
3,3
H-4
3,43
10,4
4,02
2,0
H-5
3,99
4,2
4,26
6,5
H6a/H6b
3,77
2,7
3,74
2,5
3,77
-
3,74
-
Cicli ol
H-1
4,12
3,5
4,16
3,4
H-2
3,74
10,1
3,74
10,0
H-3
3,31
9,4
3,34
9,3
H-4
3,65
10,4
3,68
10,5
H-5
3,85
3,7
3,89
3,5
H-6
4,02
3,8
4,11
3,8
El análisis con o macional de 18 y 19 median e las supe icies de ene gía adiabá icas
de los ángulos de o sión glicosídicos empleando AMBER* y el modelo GB/SA p edice, pa a
ambos compues os, un único mínimo del ipo sin- con población de ec able (Figu as 2.15).

Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
62│
Figu a 2.15. Mapa de ene gía adiába ico (de echa) y mapa de dis ibución de p obabilidad
(izquie da), calculados pa a 18 (a iba) y pa a 19 (abajo).
El compo amien o de ambos compues os es simila al de los de i ados de qui o-
inosi ol con enlaces α 13-15; se dis inguen dos subminimos locales en los mapas adiabá icos de
18 y 19. Po lo an o pa ece que, como cabia espe a , la inclusión del g upo me oxilo en el
anillo de inosi ol no a ec a ap eciablemen e a la disposición adop ada po los enlaces
glicosídicos. La semejanza en e los mapas de 18 y 19 ambién indicó que la es e eoquímica de
la posición 4 de la hexosamina no al e a el compo aminen o del enlace glicosídico, conclusión
que po las mismas azones ambién e a p esumible.
Los po enciales NOE exclusi os deducidos de los mapas de dis ancias in e p o ónicos
son simila es a los de los compues os análogos 13-15: H1’-H6 pa a la con o mación syn-, y
H1’-H5, pa a la an i-. El NOE H1’-H1 in e sec a con ambas egiones y po lo an o no se
puede emplea con ca ác e de diagnos ico. Expe imen almen e se obse a on pa a 18 y 19 los
NOEs en e H1’-H6 y H1’-H1, mien as que en ningún caso se pudo de ec a la p esencia del
NOE H1’-H5. Po lo an o, cuali a i amen e se puede conclui que los compues os con el
mo i o hexosamina  (1-6) pini ol se p esen an en disolución como un único ipo de
con o mación del ipo syn-.
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180

-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180

-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180

-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180

Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
63│
Simulaciones de dinámica molecula
A lo la go de los es udios an e io es se habia obse ado que al conside a odo el
espacio Φ/Ψ pa a la es imación de dis ancias eo icas, el ajus e con los da os expe imen ales
mejo aba. Es a obse ación indica que es os compues os poseen una lexibilidad ap eciable,
incluso aquellos conside ados como semi igidos, al y como co esponde a su na u aleza
glucídica. Po es a azón se decidió amplia el es udio eó ico incluyendo simulaciones de
dinámica molecula pa a mejo a la desc ipción de la lexibilidad. En el momen o de comenza
es e es udio no había an eceden es en el empleo en simulaciones de dinámica molecula de la
modi icación de Sende owi z e al. al campo de ue zas AMBER, que había sido seleccionada
po sus mejo es esul ados en las simulaciones de mecánica molecula . Po es a azón se
decició ealiza o o es udio compa a i o de sus esul ados en simulaciones de dinámica
molecula con la al e na i a clásica de Homans.
En p ime luga se ealiza on dinámicas molecula es de 2 ns de los compues os 18-21
pa iendo de es uc u as gene adas median e minimización exhaus i a de los mínimos
absolu os de e minados a pa i de los mapas adibá icos y empleando condiciones ípicas:
acoplamien o a baño é mico de 0,1 ps, =80 y el algo i mo SHAKE71. Los esul ados no
ue on en absolu o sa is ac o ios. Se obse ó un ue e amo iguamien o de las oscilaciones de
los ángulos de o sión  al a anza la simulación (Figu a 2.16).
Figu a 2.16. Valo es del angulo de o sión

y ene gía o al du an e simulaciones de dinámica
molecula de 2ns con ε=80 y a 25ºC del 18.
0 500 1000 1500 2000
-180
-120
-60
0
60
120
180
 (ps)

0500 1000 1500 2000
400
410
420
430
440
450
460
470
ETOTAL
(KE+PE)
 (ps)
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
64│
Se pensó que o bien el acoplamien o al baño é mico e a excesi o o que la es uc u a
de pa ida no e a es able. Sin emba go, ni la cuidadosa minimización de la geome ía inicial, ni
la elajación del acoplamien o al baño é mico (desde 0,1 has a 5 ps), e i a on el e ec o
amo iguan e, aunque lo disminuye on. Tampoco se consiguie on simulaciones acep ables ni
incluyendo p o ocolos de equilib ación con e apas de calen amien o p og esi o (desde 0ºC
has a 25ºC), ni a iando las cons an e dielec ica del medio (desde 1 a 80) 56, 72 pa a modula
el peso de las in e acciones elec os á icas. Con el in mejo a el con ol sob e el balance
ene gé ico se emplea on dinámicas es ocás icas o de Lange in (SD). Es as incluyen la
egulación de la ene gía ciné ica en las ecuaciones básicas de la simulación po lo que
p opo cionan, en e o as inno aciones, una mejo a en el compo amien o de la empe a u a
du an e la ayec o ia. Las ines abilidades e impe ecciones obse ados an e io men e se
e i a on comple amen e al emplea la dinámicas es ocas icas al y como se implemen an en el
p og ama Mac omodel.
T as es ablece las condiciones óp imas de simulación se p ocedió a calcula las
ayec o ias du an e 5 ns de los de i ados 18-19 conside ando dos a amien os elec os á icos
(=80, GB/SA) y dos pa ame izaciones (Sende owi z e al/ Homans) di e en es. Los esul ados
de las simulaciones (Figu a 2.17), indica on la p esencia de un único mínimo de ipo syn-, en
la zona cen al del mapa (, ) no obse ándose in e con e siones hacia egiones de ipo an i-
. Es os esul ados, p esen an un acue do cuali a i o con los mapas adiabá icos calculados
median e MM (Figu a 2.15). Dados los e o es obse ados en las dinámicas new onianas se
u o especial p ecaución en comp oba que en las nue as condiciones el sis ema e a simulado
de o ma ealis a. Pa a ello, se epi ie on las simulaciones pa iendo de es uc u as con
di e en es o ien aciones del g upo hid oxílo p ima io (gg, g y g) o me ilo en posición 3 del
esiduo de inosi ol. En odos los casos se comp obó que as un pe iodo de equilib ación los
esul ados e an independien es de la es uc u a de pa ida. Las ayec o ias de los ángulos
o sionales  y  ue on simila es, independien emen e de la pa ame ización empleada y de si
el ca bohid a o en posición no educ o a, e a glucosamina o galac osamina. Los alo es (, )
p omedio ob enidos as 5 ns de simulación ue on (-41º, -21º) y (-45º, -26º) pa a 18 y (-42º, -
21º) y (-45º, 26º) pa a 19, empleando espec i amen e los pa áme os de Homans y S ille.
Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
65│
Figu a 2.17. Mapas de la dis ibución de los ángulos de o sión glicosídicos du an e
simulaciones de 5ns median e dinámica es ocás ica, de los compues os 18 (a iba) y 19 (abajo)
empleando las pa ame izaciones de Sende owi z e al (izda) y Homans (de echa), jun o con la
supe posición de los NOEs exclusi os pa a la con o mación syn-

(H1’-H6 y H1’-H1).
Las dis ancias in e p o ónicas expe imen ales se calcula on a pa i de las elocidades
de elajación c uzada ob enidas a su ez del análisis de la elocidad de c ecimien o de los
NOEs. En la abla 11 se compa an es as dis ancias con las eó icas calculadas a pa i de las
es uc u as elajadas de mecánica molecula (MM) o de los p omedios a lo la go de las
simulaciones de dinámica molecula (MD).
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
1'6
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
1'1


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
1'6
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
1'1


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
1'6
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
1'1


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
1'6
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180
1'1


Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
72│
mecanocuan icos, semiempí icos o ab ini io, ampoco ep oduce adecuadamen e los esul ados
expe imen ales. Du an e la ealización de la p esen e esis doc o al R.Woods demos ó,
empleando pa áme os de campo de ue zas de i ados de da os mecanocuan icos36 e
incluyendo las in e acciones explíci as con el disol en e, que simulaciones de dinámica
molecula , ep oducen co ec amen e la es abilidad ela i a de los o áme os.77
El incon enien e de la ap oximación de Woods es que necesi a de simulaciones
ex ao dina iamen e la gas (50 ns, pa a compues os sencillos) po lo que no se deben desca a
ap oximaciones menos p ecisas pe o más ápidas. En el momen o de comenza es os abajos
no se habia desc i o la iabilidad de la pa ame ización de Sende owi z en es e aspec o, po lo
que se decidió e alua sus cualidades en el caso de los compues os 18-21.
Figu a 2.22. Mapas del pe il o acional

, pa a los compues os 18-21, con los pa áme os de
Sende owi z (izda) y Homans (de echa) y con a amien o elec os á ico de

=80.
Pa a ello, en p ime luga se calculó la a iación de la ene gía con el angulo died o 
pa a los compues os 18-21 empleando los campos de ue zas de Sende owi z e al. y Homans
(Figu a 2.22). Es os pe iles ene gé icos co esponden con las poblaciones a 298 K e lejadas
en la abla 14.
060 120 180 240 300 360
0
6
12
18
24
30

E(kJ/Mol)
Compues o 17
Compues o 16
Compues o 18
Compues o 19
060 120 180 240 300 360
0
6
12
18
24
30

Compues o 17
Compues o 16
Compues o 18
Compues o 19
E(kJ/Mol)

Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
73│
Tabla 14. Dis ibución de poblaciones de o áme os de los compues os 18-21 du an e dinámicas es ocás icas de 5
ns, ealizadas con idén ica es uc u a de pa ida empleando di e en es pa ame izaciones
Ro áme o




Homans
Sende .
Homans
Sende .
Homans
Sende .
Homans
Sende .
g 60º  60
12
88
6
81
13
92
11
89
g 300º  60
54
9
56
14
50
6
39
7
gg 180º  60
34
3
38
6
37
2
50
4
Como cabia espe a po el ni el de la ap oximación eó ica empleada, ninguna de las
dos pa ame izaciones ue capaz de ep oduci la di e encia en el pe il ene gé ico de es a
o sión ni pa a con igu aciones gluco ni galac o. Los pa áme os de Homans ue on los que
p opo ciona on un mejo ajus e con el compo amien o espe ado pa a es os compues os. Ello
se debe a que, aunque es os son los pa áme os más an iguos, se pa ame iza on di ec amen e a
los da os expe imen ales po lo que con ienen implíci amen e los e ec os de sol a ación. Po
o o lado los pa áme os de Sende owi z es án basados en cálculos ab ini io po lo que se ía
necesa io inclui el e ec o del disol en e en los calculos pa a conside a odos los ac o es que
in e ienen en la es abilidad de los o áme os.
Con el obje o de e alua el e ec o de la aplicación de modelos sencillos de disol en e
implíci o se ealiza on simulaciones de dinámica molecula es ocas ica pa a los compues os
18-21, pa iendo de los con ó me os más es ables y empleando ambos campos de ue zas, y en
el caso de los pa áme os de Sende owi z dos a amien os al e na i os, =80 y GB/SA, éase
abla 15.
Tabla 15. P opo ción de o áme os de los compues os con mo i o es uc u al GlcNH2 (1→6) D-qui o-inosi ol, 18 y
19, analizados de las simulaciones de 5ns de dinámicas es ocás icas, con di e en es condiciones; en neg i a la
con o mación inicial del hid oxime ilo de las hexosaminas.
% gg
% g
% g
18
Sende .  = 80. gg
9
14
77
Sende .  = 80. g
2
8
90
Sende . GB/SA. gg
8
20
72
Homans  = 80. gg
36
53
11
Homans  = 80. g
22
71
7
19
Sende .  = 80. g
0
19
82
Sende .  = 80. g
0
2
98
Sende . GB/SA. gg
0
21
79
Homans  = 80. g
13
76
11
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
74│
Del análisis de los compues os con esiduos de glucosamina, (18 y 19) des aca la
p eponde ancia de los o áme os g sob e los o os, cuando se u iliza la pa ame ización de
Sende owi z e al. y de mane a independien e al a amien o elec os á ico escogido (=80 ó
GB/SA). Las simulaciones de Homans ue on ealizadas únicamen e sob e las es uc u as de
mínima ene gía p edichas median e los cálculos p e ios de MM y e leja on siemp e un mayo
peso de los o áme os g . En los compues os con esiduo de galac osamina 20 y 21, se obse a
una endencia simila a la de los análogos de glucosamina: p edominancia de los o áme os g
pa a pa ame izaciones de Sende owi z y de los g si se u iliza Homans.
Tabla 16. P opo ción de o áme os de los compues os con mo i o es uc u al GalNH2 (1→6) D-qui o-
inosi ol, 20 y 21, analizados de las simulaciones de 5ns de dinámicas es ocás icas, con di e en es condiciones; en
neg i a la con o mación inicial del hid oxime ilo de las hexosaminas; en el caso de 21 se desc iben los ángulos  del
g upo me oxilo de pa ida.
% gg
% g
% g
20
Sende .  = 80. gg
11
5
84
Sende .  = 80. g
0
4
96
Sende . GB/SA. gg
3
13
84
 = 80. gg
23
56
21
21
Sende .  = 80. gg +60º
14
12
74
Sende .  = 80. gg -60º
13
6
81
Sende .  = 80. gg 180º
13
6
82
Sende .  = 80. g -60º
0
2
98
Sende .  = 80. g +60º
0
3
97
Sende .  = 80. g 180º
0
5
95
Sende .  = 80. g +60º
5
7
88
Sende .  = 80. g -60º
24
5
71
Sende .  = 80. g 180º
5
3
92
Sende . GB/SA. g
0
3
97
Homans  = 80. gg
20
67
13
La p esencia del o áme o g en galac opi anósidos a eces es explicada como
p o enien e de los e ec os del disol en e13a ó in e acciones 1,3-diaxiales14 ( epulsión es é ica y
elec ónica en e O4 y O6 deses abiliza ía el o áme o gg). Una in e acción equi alen e en
glucopi anósidos ha sido u ilizada pa a explica la pequeña población que ep esen a los
o áme os g.78
Como hemos is o a lo la go del p esen e es udio, los pa áme os de Homans son los
que mejo se ajus an a los da os expe imen ales, aunque la modi icación de Sende owi z es é
pa ame izada en p incipio a un mayo ni el eó ico. Es e esul ado e leja la impo ancia del
disol en e en la con o mación de los ca bohid a os ya que los pa áme os de Homans, de po
su na u aleza, conside an implíci amen e los e ec os del disol en e. Po an o, la ealización de
Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
75│
u u as simulaciones con es os compues os debe ía inclui moléculas de agua explíci a que a
buen segu o mejo a án los esul ados. El compo amien o dinámico de los compues os 18-21,
espec o al ángulo o sional  y con pa ame ización de Homans queda debidamen e e lejado
en la igu a 24. A lo la go de la ayec o ia se obse an luc uaciones en e los o áme os .
Figu a 2.23. Mapas de ayec o ias y dis ibución de poblaciones en % del ángulo

a lo la go
de las simulaciones de SD con pa áme os de Homans y ε=80, pa a los compues os 18 (a iba izda), 20
(a iba de echa), 19 (abajo izda) y 21 (abajo de echa).
2.4.- DISCUSIÓN.
En es e capí ulo se desc ibe el es udio es uc u al en disolución de los compues os
disaca ídicos 9-21, median e la combinación de da os expe imen ales de RMN y cálculos
eó icos basados en campos de ue za ealizados sin es icciones expe imen ales explíci as. En
gene al el acue do en e ambos mé odos es bueno. Lo que pe mi e, compa aciones cuali a i as,
co espondiendo los NOEs exclusi os obse ados con la p edicción del cálculo. Es a
co elación es ambién sa is ac o ia cuan i a i amen e pa a los compues os poco lexibles, en
los que el mé odo pe mi e de ec a di e encias en de alles su iles como el desplazamien o de la
geome ía del mínimo en la se ie 13-17. Sin emba go, en el caso de los compues os más
lexibles la e aluación de la di e encia de ene gía en e mínimos ela i os no es an adecuada y
se sob ees ima sis emá icamen e la población del con ó me o syn-, sin que a iaciones en el
campo de ue zas o condicciones de cálculo empleadas den una solución o almen e
sa is ac o ia. En cualquie caso, la disc epancia sólo a ec a a la ene gía ela i a en e ambas
0 1000 2000 3000 4000 5000
-180
-120
-60
0
60
120
180
0 1000 2000 3000 4000 5000
-150
-100
-50
0
50
100
150
0 1000 2000 3000 4000 5000
-180
-120
-60
0
60
120
180
0 1000 2000 3000 4000 5000
-180
-120
-60
0
60
120
180
 (ps)
 (ps)
% poblacion




 (ps)
-180 -120 -60 0 60 120 180
0
20
40
60
 (ps) 


% poblacion

-180 -120 -60 0 60 120 180
0
20
40
60
% poblacion
-180 -120 -60 0 60 120 180
0
20
40
60
% poblacion
-180 -120 -60 0 60 120 180
0
20
40
60
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
76│
o mas y no a las geome ías p edichas. Po lo an o combinado con da os expe imen ales,
pe mi e ealiza análisis compa a i os en e compues os que engan es uc u as simila es.
También, se ha ealizado pa alelamen e un análisis de las dos pa ame izaciones del
campo de ue zas AMBER* disponibles pa a ca bohid a os en MACROMODEL: Homans y
Sende owi z-Pa ish–S ill. En nues as manos, y pa a es os compues os, hemos ap eciado que la
segunda, más mode na, mejo a el balance de ene gía en e las con o maciones syn- y an i-Ψ.
Po el con a io, en cuan o a la dis ibución de o áme os de los g upos hid oxime ilo la
pa ame ización Homans coincide mejo con los da os expe imen ales. Es a disc epancia iene
su o igen en la in luencia de los e ec os de sol a ación, no conside ados a es e ni el de cálculo.
Po ello, el campo de ue zas más an iguo es, pa adójicamen e, el que mejo es esul ado
p opo ciona pues o que ue ajus ado di ec amen e a da os expe imen ales.
En cuan o a las es uc u as de es os pseudodisacá idos, el es udio compa a i o de los
compues os 9-21 pe mi e es ablece algunas conclusiones gene ales. En p ime luga , es
posible dis ingui dos ipos básicos de compo amien o con o macional bien di e enciados a lo
la go de la se ie: unos compues os exis en como un único con ó me o syn-Ψ, dis ibuido
al ededo de un mínimo más o menos amplio, mien as que o os p esen an una mayo
lexibilidad y se encuen an en un equilib io en e dos con ó me os, uno syn-Ψ, mayo i a io, y
o o an i- mino i a io. El ipo de cicli ol pa ece se de e minan e en la apa ición de uno u
o o compo amien o. Así los de i ados de mio-inosi ol (9-12) son lexibles y p esen an dos
es uc u as (syn-an i-, expe imen almen e obse ables a a és de con ac os NOE
exclusi os. Tan o los compues os con qui o-inosi ol como pini ol (3-me il-qui o-inosi ol)
(13-21) mues an el compo amien o opues o y se encuen an como un único con ó me o syn-
Ψ. Es impo an e des aca que es a di isión de compo amien os no pa ece e se al e ada ni
po la es e eoquímica  o β, del ca bono anomé ico, o D- o L- del cicli ol, ni po la p esencia de
sus i uyen es, ca gados o no. Po ello, pa ece lógico a ibui mayo i a iamen e la causa de al
compo amien o a la es e eoquímica axial o ecua o ial del enlace glicosídico espec o al
cicli ol.
En segundo luga , den o de cada ipo gene al de compo amien o, algunos de alles
es uc u ales conc e os pa ecen pode se modulados po la p esencia y disposición de los
sus i uyen es ca gados, como se habia hipo e izado en el plan eamien o de es a memo ia. Po
ejemplo, la p esencia y es uc u a del g upo os a o en 13-15 es capaz de desplaza la posición
del mínimo absolu o, den o de la misma es uc u a gene al. Tambien, como en el caso de 9 y
10 o 11 y 12, puede a ia las p opo ciones de los mínimos syn- y an i-Ψ. Sin emba go, no se
han encon ado en ningun caso un e ec o an acusado como el desc i o pa a 2, en el que no se
obse a la con o mación an i po que la in e acción os a o-amonio es abiliza la o ma opues a.
Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
77│
Es o se debe p obablemen e a que la opología del enlace glicosídico no pe mi e que
en el caso de los compues os es udiados en es e capí ulo el acceso a la geome ía en la que la
in e acción amonio- os a o sea óp ima.
Po úl imo, se deduce de la compa ación en e compues os con di e encias
es uc u ales lejanas al enlace glicosídico (glucosamina en e a galac osamina, o qui o-inosi ol
en e a pini ol) que es as no pa ecen a ec a ap eciablemen e a la es uc u a idimensional de
es os disacá idos.
Figu a 2.24. Supe posición de los esquele os co espondien es a es uc u as de minima ene gia
de las con igu aciones glucosamina (1-6) mio-inosi ol (izquie da)

( ojo) y β (azul) y glucosamina

(1-
6) inosi ol (de echa) mio- ( ojo) y chi o- ( e de).
Desde el pun o de is a del es udio de las bases es uc u ales del mecanismo de
ac i ación de la insulina ia IPGs es des acable la can idad de di e en es geome ias ela i as
de los dos anillos que pueden se gene adas po pequeñas a iaciones es e eoquímicas de sus
componen es (Figu a 2.24). En es e con ex o, si se conside a es e disacá ido como el esquele o
sob e el que se si uan los g upos ca gados, supues os pun os de unión, da luga a una muy
amplia dispe sión de geome ías (Figu a 2.25). Po o o lado, el es udio desc i o en es e
capí ulo, desc ibe la a iabilidad de es uc u as y compo amien os dinámicos que
p opo cionan los di e en es mo i os químicos conside ados con po encial ac i idad. Es a
colección de es uc u as ue esencial pa a ealiza los es udios de docking con PKA, ealizados
en nues o g upo de in es igación, que di ie on luga a nue os diseños de po enciales
insulinomimé icos (Véase Capí ulo 3).

Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
78│
Figu a 2.25. Supe posición de las es uc u as de mínima ene gía de los compues os 10, 12, 14,
16 y 17 que con ienen algun g upo os a o. La supe posición se ha ealizado sob e los á omos pesados
del anillo de glucosamina. La igu a mues a la dispe sión de disposiciones ela i as amonio – os a o
o iginadas po cambios en la es e eoquímica del esquele o.
Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
79│
2.4.- BIBLIOGRAFIA.
1 Fe guson, M.A.J.; Homans, S.W.; Dwek, R.A.; Rademache , T.W. Science. 1988, 239,
(4841), 753-759.
2 Die ich, H.; Espinosa, J.F.; Chia a, J.L.; Jimenez-Ba be o, J.; Leon, Y.; Va ela-Nie o, I.;
Ma o, J.M.; Cano, F.H.; Foces-Foces, C.; Ma in-Lomas, M. Chem-Eu . J. 1999, 5, (1), 320-
336.
3 Ma in-Lomas, M.; Nie o, P.M.; Khia , N.; Ga cia, S.; Flo es-Mosque a, M.; Poi o , E.;
Angulo, J.; Munoz, J.L. Te ahed on-Asymme . 2000, 11, (1), 37-51.
4 Che alie , F.; Lopez-P ados, J.; Pe ez, S.; Ma in-Lomas, M.; Nie o, P.M. Eu . J. O g. Chem.
2005, (16), 3489-3498.
5 Che alie , F.; Lopez-P ados, J.; G o es, P.; Pe ez, S.; Ma in-Lomas, M.; Nie o, P.M.
Glycobiology. 2006, 16, (10), 969-980.
6 Lopez-P ados, J.; Ma in-Lomas, M. J. Ca bohyd. chem. 2005, 24, (4-6), 393-414
7 Lopez-P ados, J.; Cue as, F.; Reicha d , N.C.; de Paz, J. L.; Mo ales, E.Q.; Ma in-Lomas,
M. O ganic & Biomolecula Chemis y. 2005, 3, (5), 764-786.
8 Cid, M.B.; Al onso, F.; Ma in-Lomas, M. Synle . 2005, 13, 2052-2056.
9 Cid, M.B.; Al onso, F.; Ma in-Lomas, M. Chem-Eu . J. 2005, 11, (3), 928-938.
10 Cid, M.B.; Al onso, F.; Ma in-Lomas, M. Ca bohyd. Res. 2004, 339, (13), 2303-2307.
11 Reicha d , N.C.; Ma in-Lomas, M. Angew. Chem. In . Edi . 2003, 42, (38), 4674-4677.
12 Cid, M.B.; Bonilla, J.B.; Al onso, F.; Ma in-Lomas, M. Eu . J. O g. Chem. 2003, 18, 3505-
3514.
13 Cid, M.B.; Al onso, F.; Ma in-Lomas, M. Synle . 2003, 9, 1370-1372.
14 Cid, M.B.; Bonilla, J.B.; Duma cay, S.; Al onso, F.; Ma in-Lomas, M. Eu . J. O g. Chem.
2002, 5, 881-888.
15 Bonilla, J.B.; Munoz-Ponce, J.L.; Nie o, P.M.; Cid, M.B.; Khia , N.; Ma in-Lomas, M. Eu .
J. O g. Chem. 2002, 5, 889-898.
16 Ma in-Lomas, M.; Khia , N.; Ga cia, S.; Koessle , J.L.; Nie o, P.M.; Rademache , T.W.
Chem-Eu . J. 2000, 6, (19), 3608-3621.
17 Ma in-Lomas, M.; Flo es-Mosque a, M.; Khia , N. Eu . J. O g. Chem. 2000, 8, 1539-1545.
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
80│
18 Ma in-Lomas, M.; Flo es-Mosque a, M.; Chia a, J.L. Eu . J. O g. Chem. 2000, 8, 1547-
1562.
19 Khia , N.; Ma in-Lomas, M. Ca bohyd a e Mimics. Concep s and Me hods. 1998, 433-462.
20 Zapa a, A.; Leon, Y.; Ma o, J.M.; Va ela-Nie a, I.; Penades, S.; Ma in-Lomas, M.
Ca bohyd. Res. 1994, 264, (1), 21-31.
21 Al onso, F. Sín esis De Inosi ol os oglicanos. Es udio Del E ec o De Los Sus i uyen es En
Acep o es De i ados De Chi o-Inosi ol En La Reac i idad, Es e eoselec i idad Y
Regioselec i idad De Las Reacciones De Glicosilación. Uni e sidad de Se illa, Se illa, 2003.
22 Lopez-P ados, J. Inosi ol os oglicanos: Sín esis, Es uc u a y Ac i idad Biológica
Uni e sidad de Se illa, Se illa, 2005.
23 Flo es-Mosque a, M. Uni e sidad Au ónoma de Mad id, Mad id, 2002.
24 Bonilla, J.B. Segundos Mensaje os Po enciales De La Acción De La Insulina: Sín esis,
Es uc u a y Es udios Biológicos De Glicosil Qui o-Inosi oles y Glicosil Fos a idilinosi oles
Uni e sidad de Se illa, Se illa, 2004.
25 Ma o, J.M.; Kelly, K.L.; Able , A.; Ja e , L.; Co key, B.E.; Cashel, J.A.; Zop , D. Biochem.
Bioph. Res. Co. 1987, 146, (2), 764-770.
26 Da is, A.L.; Laue, E.D.; Keele , J.; Moskau, D.; Lohman, J. J. Magn. Reson. 1991, 94, (3),
637-644.
27 Bax ,A.; Da is, D.G. J. Magn. Reson. 1985, 65, (2), 355-360.
28 Wagne , R.; Be ge , S. J. Magn. Reson. Se . A. 1996, 123, (1), 119-121.
29 Bo hne by, A.A.; S ephens, R.L.; Lee, J.M.; Wa en, C.D.; Jeanloz, R.W. J. Am. Chem. Soc.
1984, 106, (3), 811-813.
30 Willke , W.; Leib i z, D.; Ke ssebaum, R.; Be mel, W. Magn. Reson. Chem. 1993, 31, (3),
287-292.
31 Schleuche , J.; Schwendinge , M.; Sa le , M.; Schmid , P.; Schedle zky, O.; Glase , S.J.;
So ensen, O.W.; G iesinge , C. J. Biomol. Nm . 1994, 4, (2), 301-306.
32 Neuhaus, D.; Williamson, M., The Nuclea O e hause E ec in S uc u al and
Con o ma ional Analysis. VCH Publishe s (UK) L d.: Camb idge, 1989.
33 S o , K.; Keele , J.; Van, Q.N.; Shaka, A.J. J. Magn. Reson. 1997, 125, (2), 302-324.
34 Pe ez, S.; Imbe y ,A.; Engelsen, S.B.; G uza, J.; Mazeau, K.; Jimenez-Ba be o, J.; Po eda,
A.; Espinosa, J.F.; an Eyck, B.P.; Johnson, G.; F ench, A.D.; Louise, M.; Kouwijze , C.E.;
Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG
81│
G oo enuis, P.D.J.; Be na di, A.; Raimondi, L.; Sende owi z, H.; Du ie , V.; Ve go en, G.;
Rasmussen, K. Ca bohyd. Res. 1998, 314, (3-4), 141-155.
35 Allinge , N.L. J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, (25), 8127-8134.
36 Woods, R.J.; Dwek, R.A.; Edge, C.J.; F ase eid, B. J. Phys. Chem-Us. 1995, 99, (11), 3832-
3846.
37 Allinge , N.L.; Yuh, Y.H.; Lii, J.H. J. Am. Chem. Soc.1989, 111, (23), 8551-8566.
38 Lii, J.H.; Allinge , N.L. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, (23), 8576-8582.
39 Lii, J.H.; Allinge , N.L. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, (23), 8566-8575.
40 Sende owi z, H.; Pa ish, C.; S ill, W.C. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, (8), 2078-2086.
41 McDonald, D.Q.; S ill, W.C. Te ahed on. Le . 1992, 33, (50), 7743-7746.
42 Weine , P.K.; Kollman, P.A. J. Compu . Chem. 1981, 2, (3), 287-303.
43 Wang, J.M.; Wol , R.M.; Caldwell, J.W.; Kollman, P.A.; Case, D.A. J. Compu . Chem.
2004, 25, (9), 1157-1174.
44 Pa a, M.; Ka unen, M. J. Compu . Chem. 2004, 25, (5), 678-689.
45 Kaminski, G.A.; F iesne , R.A.; Ti ado-Ri es, J.; Jo gensen, W.L. J. Phys. Chem. B. 2001,
105, (28), 6474-6487.
46 Jo gensen, W.L.; Ti ado i es, J. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, (6), 1657-1666.
47 Halg en, T.A. J. Compu . Chem. 1996, 17, (5-6), 616-641.
48 Halg en, T.A. J. Compu . Chem. 1996, 17, (5-6), 520-552.
49 Halg en, T.A. J. Compu . Chem. 1999, 20, (7), 720-729.
50 Halg en, T.A.; Nachba , R.B. J. Compu . Chem. 1996, 17, (5-6), 587-615.
51 Halg en, T.A. J. Compu . Chem. 1999, 20, (7), 730-748.
52 Halg en, T.A. J. Compu . Chem. 1996, 17, (5-6), 490-519.
53 Halg en, T.A. J. Compu . Chem. 1996, 17, (5-6), 553-586.
54 Cla k, M.; C ame , R.D.; Vanopdenbosch, N. J. Compu . Chem. 1989, 10, (8), 982-1012.
55 Imbe y, A.; Ha dman, K.D.; Ca e , J.P.; Pe ez, S. Glycobiology. 1991, 1, (6), 631-642.
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
88│
O
HO
HO
HO
O
OH
O
HO
O
NH3
OH
HO HO
OH
OH
HO
OPOH
OO
23 24
25 26
27
O
HO
O
OH
O
HO
O
NH3
OH
HO HO
OH
OH
HO
OH
O
HO
HO
HO
OO
HO
O
NH3
OH
HO HO
OH
OH
HO
OPOH
OO
O
HO
OO
HO
O
NH3
OH
HO HO
OH
OH
HO
OH
OH
OH
OPOH
OO
O
HO
OO
HO
O
NH3
HO HO
OH
OH
HO
OH
OH
OPOH
O
O
O
HO
O
NH3
HO3PO
HO OH
OH
OH
HO
20 21 22
HO O
HO
O
NH3
OPO3H
HO OH
OH
OH
HO
OH
O
HO3PO
O
NH3
HO OH
OH
OH
HO
OH
OH
Figu a 3.3. Es uc u as de los disacá idos y isacá idos es udiados en es e capí ulo.
Es as conclusiones se aplica on en el diseño de una nue a se ie de pseudodi- y
isacá idos, 20, 21, 22, 25, 26 y 27, que con ienen g upos os a o; ambién se sin e iza on
p oduc os análogos sin g upos os a o 23 y 24, po mo i os de compa ación ( igu a 3.3).24,29,30
En es e capí ulo de desc ibe el es udio es uc u al en disolución de es os compues os
median e RMN y dinámica molecula . El obje o de es e es udio es undamen almen e

Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
89│
comp oba que las es uc u as de es os compues os concue dan con las p edichas po y pa a el
es udio de docking. Simul aneamen e ambién se p opone analiza la posible in luencia sob e la
es uc u a idimensional del GPI de la p esencia de g upos O- os a o en o os esiduos
dis in os del inosi ol.
3.2.- METODOLOGÍA
3.2.1.- Resonancia Magné ica Nuclea .
Los pseudodisaca idos y pseudo isaca idos 20-27 han sido es udiados en disolución
median e espec oscopía de RMN. En p ime luga , la asignación inambigua de sus
espec os de 1H y 13C, se ealizó empleando écnicas habi uales pa a
oligosacá idos.31-36 Se usa on esencialmen e los siguien es ipos de expe imen os
DQF-COSY,37 TOCSY,38 NOESY39 y HSQC40. Pos e io men e se ex aje on
es icciones expe imen ales basadas en cons an es de acoplamien o ( o siones) o de
dis ancia calculadas a pa i de la elocidad de elajación c uzada (NOE). Debido a
que los mé odos son comunes, se emi e al capí ulo 2 pa a una desc ipción más
exhaus i a de es as écnicas. En es e capí ulo ambien se explo ó la obse ación de
los p o ones hid oxílicos como po encial uen e de nue as es icciones
expe imen ales ( éase apa ado 3.4).
3.2.2.- Cálculos Teó icos.
La me odología empleada inicialmen e en los es udios de modelado molecula en es e
capí ulo ue en gene al simila a la desc i a en el capí ulo an e io . En p ime luga , se
es udia on las supe icies de ene gía de los enlaces glicosídicos median e mé odos sis emá icos,
calculando los mapas ígidos, elajados y adiabá icos.41 En el caso de los isacá idos, se
asumió que no había in e acciones signi ica i as a la go alcance y que, po lo an o, las
p opiedades con o macionales de una unión dada son independien es de que o me pa e de di-
o i-sacá idos. Po ello, eniendo en cuen a los mapas elabo ados en el capí ulo 2 sólo ue
necesa io conside a es disacá idos independien es: Gal-(1→6)-GlcN-1-OMe, Man-
(1→6)-GlcN-1-OMe y GlcN-(1→6)-mio-inosi ol ( igu a 3.4). De acue do con la
e aluación de los campos de ue za ealizada en el capí ulo an e io se empleó AMBER*42
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
90│
incluyendo la pa ame ización de S ille,43 y aplicando el mé odo GB/SA44 como modelo
con inuo de disol en e.
Figu a 3.4. Disacá idos modelos de las uniones glicosídicas de los isacá idos 23-27
empleados en los cálculos de MM.
El es udio con o macional se comple ó median e simulaciones de dinámica molecula
en las condiciones op imizadas pa a los compues os 7-19 desc i as en capí ulo 2. En es e caso,
se decidió aplica sis emá icamen e es a me odología a odos los compues os ya que debe ia
p opo ciona una desc ipcion mas ealis a que la busqueda sis emá ica complemen ando sus
conclusiones. De acue do con las condicciones de simulacion op imizadas en el capí ulo
an e io pa a los de i ados de pini ol 16-19, se emplea on dinámicas molecula es de
Lange in45 pa iendo de las es uc u as de mínima ene gía in e idas de los es udios
sis emá icos de mecánica molecula . Po úl imo, en un in en o po a anza en la comp ensión
de las p opiedades dinámicas de las es uc u as se han e aluado simulaciones de dinámica
molecula empleando modelos de disol en e explíci o.46
Modelización molecula con inclusión de agua explíci a.
Es e p ocedimien o se basa en la conside ación explíci a de moléculas del disol en e
en las simulaciones, de o ma que sol a en a dicho solu o, pe mi iendo calcula las
in e acciones solu o-disol en e de mane a más adecuada.
Sin emba go iene el incon enien e de gene a asime ías en las in e ases “solu o-
acío” que deben se a adas adecuadamen e. Ello se esuel e de o ma sencilla median e la
aplicación de condiciones de on e a pe iódicas (PBC; Pe iodic Bounda y Condi ions)47.
Las simulaciones se lle a on a cabo a 298 K, con una cons an e de acoplamien o al baño
é mico de 0.2 ps, una cons an e dieléc ica de 1, y aplicando una dis ancia de uncado pa a las
in e acciones de no-enlace de 9 Å. Con el obje o de ealiza las simulaciones con el mayo
igo posible, se calcula on las ca gas a omicas pun uales especi icas pa a las es uc u as
Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
91│
simuladas48 y se cuidó el p oceso de sol a ación y equilib ación empleando p o ocolos
su icien emen e con as ados.49
3.3.- RESULTADOS.
3.3.1.- PSEUDODISACÁRIDOS FOSFATO.
Es udio po RMN de los disacá idos 20-22 ( e igu a 3.3).
Los compues os 20-22 han sido asignados ( abla 3.1) median e las écnicas de RMN
desc i as en el apa ado de me odología.
Tabla 3.1. Desplazamien os químicos de 1H (

(ppm)) y 13C (

(ppm)) en D2O, de los compues os 20, 21 y 22 a 25ºC
y a 500 MHz, a alo es de pH de 6.3 pa a 22, 5.5 pa a 21 y 5.6 pa a 20.
20
21
22
20
21
22
 (1H)
 (1H)
 (1H)
 (13C)
 (13C)
 (13C)
Glucosamina
H-1
5,39
5,40
5,39
C-1
96,6
96,2
96,5
H-2
3,40
3,37
3,36
C-2
54,3
54,3
54,4
H-3
4,36
4,07
3,90
C-3
73,1
69,2
69,4
H-4
3,64
3,98
3,63
C-4
68,9
72,7
68,8
H-5
4,07
4,10
4,14
C-5
71,6
71,3
71,4
H6a/H6b
3,82
3,88
4,11
C-6
59,8
59,8
63,1
3,77
3,73
3,98
mio-inosi ol
H-1
3,73
3,71
3,70
C-1
71,6
71,6
71,6
H-2
3,98
3,99
3,99
C-2
72,4
72,4
72,4
H-3
3,50
3,49
3,49
C-3
70,9
70,9
70,9
H-4
3,60
3,61
3,62
C-4
72,6
72,5
72,6
H-5
3,40
3,36
3,35
C-5
72,5
72,6
72,6
H-6
3,69
3,69
3,70
C-6
80,5
80,4
80,6
En el caso de es os compues os (20-22), y a di e encia de lo obse ado pa a los
pseudodisacá idos es udiados en el capí ulo 2, los nue os p oduc os p esen a on espec os 1D-
1H con señales muy anchas en un amplio ango de pH. Es o di icul ó la es imación di ec a de
las cons an es de acoplamien o 3JH-H y hubo que ecu i pa a su medida a los expe imen os
2D-DQF-COSY. Los alo es de las cons an es de acoplamien o 3JH,H, con i ma on que, como
e a p e isible, ambos esiduos se encon aban en una con o mación de ipo silla en los es
compues os, conc e amen e del ipo 4C1 pa a el anillo de glucosamina.
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
92│
Pa a el análisis cuali a i o de los da os de RMN pa a los disaca idos 20-22 se empleó
el mismo mapa de dis ancias que el calculado pa a los compues os 9-10 (capí ulo 2) que
con ienen el mismo esquele o básico. Ello, implica asumi que la p esencia del g upo os a o en
posiciones alejadas del enlace glicosídico no debe ía p oduci g andes modi icaciones en la
es uc u a de los compues os. La alidez de es a suposición quedó con i mada po las
simulaciones de dinámica molecula ealizadas pos e io men e. Po lo an o, y al y como se
encon ó pa a los compues os 7 y 8, la p esencia de las con o maciones de ipo syn- queda ía
de e minada po la obse ación del NOE H1’-H6, mien as que las disposiciones ipo an i-,
lo se ían po los NOEs H1’-H5 y H1’-H1. De nue o, es e úl imo con ac o NOE (H1’-H1) no es
exclusi o de la con o mación an i, pues o que solapa pa cialmen e con la egión cen al,
asignada a la con o mación syn ( e igu as 2.9 y 2.10).
En los expe imen os NOESY de los compues os 20-21 ( igu a 3.5), se obse ó un
ue e NOE en e H1’-H6, ca ac e ís ico de disposiciones de ipo syn-. Po o a pa e,
ambién se ap eció un NOE débil en e H1’-H5, en es e caso, exclusi o de la con o mación
an i- Po úl imo, el NOE en e H1’-H1, sólo pudo de ec a se de mane a inambigua pa a 20 y
21, mien as que en el caso de 22 el solapamien o H1 y H6 no pe mi ió una ca ac e ización
indiscu ible. La p esencia simul ánea de NOEs exclusi os de con o maciones di e en es (H1’-
H6 y H1’-H5), es incompa ible con la o mulación de un compo amien o
monocon o macional, lo que implica la exis encia de un equilib io con o macional. La mayo
in ensidad ela i a del NOE exclusi o de la con o mación syn (H1’-H6) espec o a los
ca ac e ís icos de la disposición an i (H1’-H5) indica la o ma syn es la mas poblada en dicho
equilib io. Es e compo amien o no di ie e cuali a i amen e del p esen ado po los compues os
7 y 8 que poseen el mismo esquele o básico GlcN--mio-inosi ol.
Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
93│
Figu a 3.5. NOEs ele an es de la egión anomé ica de expe imen os NOESY pa a 20 (supe io ),
21 (cen al) y 22 (in e io ), a 500 MHz y 298K, en D2O y egis ados con un iempo de mezcla de 500 ms.

Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
94│
El análisis cuan i a i o de las dis ancias in e p o ónicas expe imen ales pa ece e leja
lige as di e encias con el disacá ido básico 7 ( abla 3.2). La meno dis ancia calculada en e
H1’-H5 pa a el caso de 7 y 22, en e a 20 y 21, indica ía una mayo p opo ción de la
con o mación an i en el equilib io con o macional pa a los p ime os.
Tabla 3.2. Dis ancias in e p o ónicas expe imen ales de e minadas a pa i de NOE pa a los compues os 7, 20, 21
y 22.
Compues o
Dis ancias In e p o ónicas
Dis ancias Expe imen ales
20
H1’-H6
2,3
H1’-H1
3,0
H1’-H5
3,8
21
H1’-H6
2,3
H1’-H1
2,9
H1’-H5
3,7
22
H1’-H6
Solap.
H1’-H1
Solap.
H1’-H5
3,3
7
H1’-H6
Solap.
H1’-H1
Solap.
H1’-H5
3,41
Es udio Teó ico de los pseudodisacá idos os a o 20-22.
Los es udios eó icos de los pseudodisacá idos os a o 20-22, se ealiza on empleando
simulaciones de dinámica molecula de Lange in (dinámicas es ocás icas) y el mé odo GB/SA
pa a la simulación del disol en e. Es as condiciones ue on las más adecuadas pa a es uc u as
simila es como se ha desc i o en el capí ulo 2. En es e es udio ambién se incluyo el compues o
7 con ines compa a i os. Como pun o de pa ida de es as simulaciones se eligie on las
es uc u as elajadas co espondien es a con ó me os de ipo syn- y an i-, cons uidas a
pa i de los esul ados de los mapas adiabá icos p e iamen e calculados pa a el compues o 7.
Los esul ados ob enidos pa a 7 ( igu a 3.6), no consiguie on ep oduci
sa is ac o iamen e los esul ados expe imen ales ya que no se obse a on isi as a egiones
an i- du an e la dinámica y és as ue on demos adas expe imen almen e po la obse ación
del NOE H1’-H5 (cap. 2). Es e esul ado ue independien e de la geome ía de la es uc u a de
pa ida, y se ep odujo an o pa iendo de mínimos syn ó an i, demos ando que en es as
condiciones de simulación, el mínimo an i- no e a es able. Es a anomalía es análoga a la
in a alo ación del mínimo an i- obse ada en el análisis de las supe icies adiabá icas de
ene gía ealizado en el capí ulo 2.
Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
95│
Figu a 3.6. T ayec o ias del ángulo

1 y alo es ins an áneos de

,

du an e las dinámicas
es ocás icas (50ns) pa a el compues o 7 pa iendo desde el mínimo syn-

.
En el caso de los compues os 20-22, el compo amien o du an e las simulaciones ue
di e en e, obse ándose ansiciones espo ádicas hacia egiones an i- an o pa iendo desde
es uc u as ipo syn- ( igu a 3.7) como desde an i-(da os no mos ados). Po lo an o,
al menos cuali a i amen e, las simulaciones de los de i ados sus i uidos ue on capaces de
ep oduci el equilib io con o macional de e minado expe imen almen e. En es e sen ido es
in e esan e des aca que es e compo amien o depende cuali a i amen e de la posición del
g upo os a o en el esiduo glucosamina ( igu a 3.7 y abla 3.3)).
Figu a 3.7. Simulaciones de dinámicas es ocás icas (50ns) pa a el compues o 20 (izda), 21
(cen o) y 22 (de echa), con el campo de ue zas AMBER*, pa ame ización de Sende owi z e al. y
mé odo elec os á ico GB/SA, pa iendo desde el mínimo syn-

. En la pa e in e io se mues a las
in e con e siones del ángulo

a lo la go de la simulación.
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


0 10000 20000 30000 40000 50000
-180
-120
-60
0
60
120
180

 (ps)
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


05000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000
-180
-120
-60
0
60
120
180

 (ps)
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


04000 8000 12000 16000 20000 24000 28000 32000 36000 40000
-180
-120
-60
0
60
120
180

 (ps)
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000
-180
-120
-60
0
60
120
180

 (ps)
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
96│
Tabla 3.3. P opo ción de con ó me os de ipo syn- / an i-, ob enidos de las simulaciones de SD (50 ns), pa a los
compues os 20-22.
Compues o
SD
% syn-

% an i-

20
SD syn-

98,4
1,6
SD an i-

99,1
0,9
21
SD syn-

99,1
0,9
SD an i-

99,7
0,3
22
SD syn-

91,7
8,3
SD an i-

97,3
2,7
El es udio eó ico con inuó con un análisis cuan i a i o de las dis ancias
in e p o ónicas signi ica i as calculadas a lo la go de las simulaciones y su compa ación con
las de i adas de los da os de RMN. En la abla 3.4 se mues an las dis ancias in e p o ónicas
eó icas y expe imen ales pa a los compues os 7, 20-21.
Tabla 3.4. P omedios en < -6> y en < -3>2 de las dis ancias in e p o ónicas signi ica i as calculadas a pa i de las
simulaciones de SD, y compa ación con las expe imen ales pa a los compues os 20-22, y 7.
Compues o
Dis ancias
In e p o ónicas
Exp.
SD syn-

< -6> / < -3>2
20
H1’-H6
2,3
2,28/2,30
H1’-H1
3,0
>4
H1’-H5
3,8
3,81/ 3,86
21
H1’-H6
2,3
2,27 / 2,29
H1’-H1
2,9
3,86 / 3,92
H1’-H5
3,7
4,10 / 4,31
22
H1’-H6
Solap.
2,33 /2,37
H1’-H1
Solap.
3,80 /3,88
H1’-H5
3,3
3,41 /3,84
7
H1’-H6
Solap.
2,28/2,31
H1’-H1
Solap.
>4
H1’-H5
3,41
3,81/3,86
En gene al, el acue do en e las dis ancias expe imen ales y los p omedios du an e las
ayec o ias de las dinámicas molecula es son buenos pa a la dis ancia p omedio más co a
(H1’-H6). Que es la que ca ac e iza al mínimo más poblado, syn-. En las dis ancias
co espondien es a los NOEs exclusi os de los con ó me os an i- (H1’-H5), se obse a una
subes imación de los alo es eó icos que co esponde a la in a alo ación de la con ibución
de es as es uc u as ya comen ada. Po lo an o a ibuíble a los campos de ue za usados. La
Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
97│
di e encias en las poblaciones del con o me o mino i a io obse adas en las simulaciones de
los compues os 7, 20-22, y e lejada en las dis ancias in e p o ónicas calculadas, no pa ecen
conco da con los da os expe imen ales, que son simila es ( abla 3.4). Sin emba go, en el caso
del compues o 22 y sus i uido en posición 6, pa a el que se p edice una mayo población an i-
 se obse ó una dis ancia expe imen al H1’-H5 mas co a. Desa o unadamen e el es o de las
dis ancias in e glicosídicas no pudo se es imado y no es posible oma es a obse ación como
una conclusión de ini i a.
En cualquie caso, e independien emen e de la alo ación de la analogía con los da os
expe imen ales, es in e esan e la obse ación de di e encias en la e aluación de los
con o me os en unción del pa ón de sus i ución de compues os con el mismo esquele o
básico. Mien as que pa a los compues os 7-10 no ha sido posible ep oduci la exis encia de
las o mas an i obse adas, en el caso de los análogos os o ilados en el esiduo de
glucosamina (20-22) es as es uc u as son es ables du an e las simulaciones de dinámica
molecula . Es as conside aciones pa ecen indica que la dis ibución de ca gas en la es uc u a
global esul a de e minan e en la e aluación del peso ela i o del mínimo an i en es e ipo de
es uc u as desde el pun o de is a de la pa ame ización del campo de ue za AMBER*, Es e
aspec o debe á se es udiado más exhaus i amen e con el in de mejo a el compo amien o de
es e campo de ue zas.
3.3.2.- PSEUDOTRISACÁRIDOS NO FOSFATADOS.
Los es udios es uc u ales de los pseudo isacá idos 23 y 24 ienen el in e és adicional
de pe mi i de e mina la posible in luencia de la elongación de la cadena saca ídica en las
p opiedades con o macionales de la es uc u a glucosamina-mio-inosi ol. Si es a in luencia no
ue a impo an e se ía posible ex ende las conclusiones ob enidas en el capí ulo an e io ace ca
del compo amien o de disacá idos hexosamina-inosi ol a o as es uc u as más complejas que
con engan es e mo i o, como los GPIs de anclaje.
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
104│
0 10000 20000 30000 40000 50000
-180
-120
-60
0
60
120
180
 (ps)

0 10000 20000 30000 40000 50000
-180
-120
-60
0
60
120
180
 (ps)

-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


Figu a 3.13. T ayec o ias del ángulo glicosídico

du an e las simulaciones de SD de 23, con

=80 (izquie da) y GB/SA (de echa).
Figu a 3.14. Mapas de dis ibución de alo es

du an e dinámicas es ocás icas de 90 ns
pa a 24 en la con o mación de pa ida an i-

, con el modelo sol a ación GB/SA.
Las dis ancias in e glicosidicas calculadas a lo la go de las simulaciones e lejan una
g an semejanza en e 23 y 24 pa a un mismo ipo de a amien o elec os á ico
independien emen e de la es uc u a de pa ida empleada. Se obse a on disc epancias en e los
esul ados expe imen ales y las simulaciones con espec o a las dis ancias ca ac e is icas de los
con o me os mino i a ios debidas a la subes imación de la población de es os minimos. Po el
con a io en las dis ancias exclusi as de los con ó me os ipo syn- el acue do con los
esul ados expe imen ales es mejo .

Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
105│
Tabla 3.7. Dis ancias in e p o ónicas expe imen ales y eó icas pa a 23 y 24.
Pa de P o ones
Exp.
SD =80
< -6>
SD GB/SA
< -6> syn-
SD GB/SA
< -6> an i-
23
H1’-H6
2,1*
2,34
2,29
2,29
H1’-H5
3,1
3,78
3,82
3,80
H1’’-H3’
3,1
3,22
3,41
3,34
H1’’-H5’
3,2
3,97
3,77
3,62
H1’’-H4’
2,7
2,53
2,38
2,39
24
H1’-H6
2,1*
2,34
2,29
2,30
H1’-H5
3,2
4,37
3,82
3,75
H1’’-H3’
3,3
3,20
3,63
3,73
H1’’-H5’
3,8
3,83
4,11
4,40
H1’’-H4’
2,5
2,50
2,30
2,29
* Solapado en los espec os de RMN H1’-H6 con H1’-H1.
De es e es udio se puede conclui que el empleo de la me odología GB/SA pe mi e
ep oduci cuali a i amen e el compo amien o dinámico de es os compues os en cuan o a la
es abilidad de las o mas an i-. Sin emba go la población es os con o me os es subes imada
sis emá icamen e, hecho que queda e lejado en los análisis cuan i a i os de dis ancias.
3.3.3.- PSEUDOTRISACÁRIDOS MONO-FOSFATO.
Es udios po RMN de los isacá idos 25 y 26. (Ve igu a 3.3).
En es e caso, al igual que ocu ió con los pseudodisacá idos 20-22 además de los
cambios lógicos en el desplazamien o químico en unción del pH, se ap ecian ensanchamien os
acusados de las señales de g upos ce canos a los cen os ionizables a alo es p óximos al pKa
pa a 25 y 26 ( igu a 3.15). Es e compo amien o di ie e del de aquellos oligosacá idos en los
que el g upo os a o se encon aba en el anillo de inosi ol, pa a los que las señales se
desplazaban sin ensanchamien os an acusados. Es a obse ación simplemen e e leja
di e en es ciné icas de los equilib ios ácido-base. En cualquie caso, y desde un pun o de is a
p ác ico, es e e ec o di icul ó la ealización de los expe imen os al limi a el ango de pH de
abajo pa a esol e el solapamien o de señales cla e. La asignación de los compues os 25 y
26 a pH p óximo a 7.0 se ealizó po la me odología 2D habi ual y se mues a en la abla 3.8.
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
106│
Figu a 3.15. Espec os de RMN 1D 1H del compues o 22 en D2O y 25ºC, ealizados en unción
del pH.
Tabla 3.8. Desplazamien os químicos δ (ppm) de 1H y 13C y alo es de las cons an es de acoplamien o 3JH-H (Hz),
pa a los isacá idos 22 y 23 en D2O, a 500 MHz y 298K.
25
26
25
26

(1H)
3JH-H

(1H)
3JH-H

(13C)

(13C)
Hexosa (Man ó Gal)
H-1
5,17
2,0
5,39
3,9
C-1
101,2
98,4
H-2
3,94
-
3,85
3,8/ 10,4
C-2
70,4
57,0
H-3
3,71
-
3,85
3,3/ 10,5
C-3
70,4
71,9
H-4
3,66
-
4,04
-
C-4
66,3
78,2
H-5
3,72
5,5 / 7,0
4,15
-
C-5
73,0
72,5
H6a/H6b
4,01
-
3,94
-
C-6
64,2
62,3
3,94
3,94
Glucosamina
H-1
5,33
3,5
5,40
3,4
C-1
96,4
100,8
H-2
3,28
3,5/10,5
3,34
3,7/ 10,3
C-2
54,7
70,8
H-3
4,03
9,5/ 10,5
4,26
10,4/11,2
C-3
69,9
66,2
H-4
3,70
9,5
3,78
9,8 /10,2
C-4
76,1
73,0
H-5
4,10
3,0/ 10,0
4,24
3,1/10,2
C-5
70,9
71,3
H6a/H6b
3,78
12,5/ 2,5
3,90
-
C-6
60,1
71,5
3,73
12,5/ 3,5
3,84
-
mio-inosi ol
H-1
3,63
-
3,84
C-1
71,8
74,0
H-2
3,91
2,5
3,99
2,5
C-2
72,6
74,8
H-3
3,41
3,0/ 10,0
3,49
2,8/ 10,0
C-3
71,0
73,4
H-4
3,53
9,5
3,61
9,8
C-4
72,8
75,0
H-5
3,27
9,5
3,37
C-5
72,8
75,0
H-6
3,62
-
3,83
C-6
80,6
82,7
Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
107│
Los expe imen os NOESY ( igu as 3.16 y 3.17), indican que el compo amien o
con o macional de los compues os 25 y 26 puede desc ibi se en é minos gene ales como un
equilib io en e con o maciones syn-/an i- con p edominio de las o mas syn-
pa a los dos enlaces glicosídicos. En el caso de la unión GlcN-(1→6)-mio-inosi ol se ap ecia
in ensamen e el NOE exclusi o del mínimo syn-, H1’-H6, mien as que los que ca ac e izan
las o mas an i- H1’-H1 (lige amen e solapado con H1’-H6) y H1’-H5, son de meno
in ensidad. En el caso del compues o 25 el NOE H1’-H5, no se pudo de ec a inequi ocamen e
debido a que apa ece solapado con el co espondien e a H1’-H2’. No obs an e la o ma
compleja del pico de c uce H1’-H2 que sugie e una con ibución de H1’-H5 y el pico H1’-H1
se puede conside a un a gumen o a a o de la de ección de la o ma an i- La geome ía de
la segunda unión glicosídica en e la hexosa co espondien e y la glucosamina queda de inida
en ambos compues os po los NOE ca ac e ís icos de las o mas syn- (H1’’-H4’) con mayo
in ensidad que los p opios de las o mas an i (H1’’-H3’ jun o a H1’’-H5’).
Figu a 3.16. NOEs signi ica i os de 25 a 500 MHz, pH 6,8 y 500 ms de iempo de mezcla; 2D-
NOESY (de echa) y 1D-dp gse-NOESY (izquie da).
H1+H6 mioIns
H5 mioIns+H2 GlcN
H6 GlcN
H2 Man
H5 GlcN
H3 GlcN
H4 GlcN
H1Man
H1GlcN
H5 mioIns +
H2 GlcN
H4 GlcN
H2 Man
H5GlcN
H3GlcN
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
108│
Figu a 3.17. NOEs signi ica i os de 26 a 500MHz, pH 9,2 y 500 ms de iempo de mezcla; 2D-
NOESY (de echa) y 1D-dp gse-NOESY (izquie da).
Los expe imen os NOESY empleados pa a el cálculo de las dis ancias in e p o ónicas
de 26, se ealiza on a un pH de 9,2; di e en e del de los expe imen os de asignación pa a e i a
el solapamien o de señales cla e. Es e hecho debe se conside ado en el análisis de los
esul ados pues o que indica la o ma ácido-base p edominan e es la amino y que es di e en e
al amonio sob e la que se han ealizado odos los es udios an e io es.
Cálculos eó icos de los isacá idos 25 y 26.
OPOH
OO
25 26
O
HO
HO
HO
OO
HO
O
NH3
OH
HO HO
OH
OH
HO
OPOH
OO
O
HO
OO
HO
O
NH3
OH
HO HO
OH
OH
HO
OH
OH
Asumiendo el compo amien o monocon o macional de los monosacá idos
ca ac e izado expe imen almen e un análisis con o macional sis emá ico debe ía conside a a
Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
109│
los dos enlaces glicosidicos: hexosa-glucosamina y glucosamina-inosi ol y a los g upos
exocíclicos, especialmen e al es e os ó ico en la posición 6 del esíduo del e minal no
educ o . Al igual que se hizo pa a los isacá idos 23 y 24, no se conside a on ele an es los
po enciales e ec os de la go alcance, de mane a que se asumió que las supe icies de ene gía en
unción de los ángulos de o sión e an equi alen es en el isacá ido o en el disacá ido. Po lo
an o, se analiza on las supe icies de ene gía adiabá icas en unción de los ángulos de o sión
pa a 4-O-me il-glucosamina-(1→6)-mio-inosi ol (p e iamen e calculado), 6-O-
os a idilmanosa-(1→4)-1-O-me il-glucosamina y 6-O- os a idilgalac osa-(1→4)- 1-O-
me il-glucosamina.
Los mapas adiabá icos pa a los enlaces manosa-glucosamina y galac osa-glucosamina
( igu as 3.18 y 3.19) se calcula on conside ando los es o áme os posibles de los g upos
hid oxime ilo y un único con o me o pa a el g upo os a o
1
empleando AMBER* con la
modi icación de Sende owi z e al y el mé odo de sol a ación GB/SA.
Figu a 3.18. Mapas de ene gía adiabá ico (izda) y de dis ibución de p obabilidad (de echa)
pa a el disacá ido 6- os a o-D-manopi anosil-

(1→4)-[2-amino-2-desoxi]-D-glucopi anósido.
1
Con el in de op imiza el núme o de es uc u as a conside a en el cálculo de los mapas adiabá icos, se ealizó un
análisis p é io de la es uc u a hid oxime il os a o en manosa y galac osa pa a desca a aquellos o áme os no
p obables. Los esul ados de es e análisis indica on que mien as que son p obables odos los con o me os gg, g y g
el ángulo

1 p esen a un único o áme o es able a 60º.
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180



Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
110│
Figu a 3.19. Mapas de ene gía adiabá ico (izda) y de dis ibución de p obabilidad (de echa)
pa a el disacá ido 6- os a o-D-galac opi anosil-

(1→4)-[2-amino-2-desoxi]-D-glucopi anósido.
Los mapas adiabá icos calculados ue on semejan es pa a los dos ipos de enlace. En
ambos casos se obse a un mínimo absolu o de ipo syn- a alo es pa a
la unión Man-(1→4)-GlcN, compues o 25, igu a 3.18) y a  -36.0,  -18.0 pa a Gal-
(1→4)-GlcN, compues o 26, igu a 3.19) jun o con un mínimo ela i o ipo an i- a  -50,
 160 y a  -36.0,  180.0 pa a 25 y 26 espec i amen e.
Ambos ipos de con o me os ue on de ec ados expe imen almen e po la obse ación
de sus co espondien es NOE exclusi os ( igu a 3.16 y 3.17), éase apa ado de RMN, po lo
que cuan i a i amene se puede conclui que al igual que 23 y 24 ambién la segunda unión
glicosídica p esen a un compo amien o ap eciablemen e lexible consis en e con un equilib io
en e una disposición syn, mayo i a ia, y o a an i, mino i a ia. Pa a el análisis de la o a unión
disaca ídica, GlcN-(1→6)-mio-inosi ol, se emplea on los mapas adiabá icos ob enidos pa a
los compues os 7, 23 y 24. Los da os expe imen ales de RMN con i man cuali a i amen e es as
p edicciones obse andose un pa ón de NOEs exclusi os p opio de la p esencia simul ánea de
dos con o maciones syn y an i siendo mayo i a ia la p ime a, como en los compues os
análogos 7, 23 y 24.
El es udio es uc u al de 25 y 26 ue ampliado con el análisis de su compo aminen o
dinámico median e simulaciones de dinámica molecula es ocás ica (SD). Es os cálculos se
ealiza on de mane a simila a la de los o os isacá idos ya es udiados, 23 y 24, empleando los
pa áme os especí icos de Sende owi z e al pa a AMBER* y an o =80 como GB/SA pa a
conside a los e ec os del disol en e. Se p epa a on dos es uc u as de pa ida cons uidas a
pa i de los mapas adiabá icos, con el obje o de comp oba si en las condiciones de simulación
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
111│
el sis ema alcanzaba el equilib io. Los esul ados ( igu as 3.20 y 3.21), ob enidos pa a las SD
indican, en gene al, un acue do azonable con los esul ados expe imen ales y las supe icies
ene gé icas calculadas.- Los dos enlaces glicosídicos oscilan p incipalmen e al ededo de
mínimos de ipo syn. Los esul ados con e gen independien emen e de la es uc u a de pa ida,
syn-2 o an i-2, lo que indica que la du ación de la simulación es su icien e como pa a
alcanza el es ado es aciona io. Al emplea el mé odo GB/SA se mejo a el compo amien o de
las simulaciones al aumen a las ansiciones hacia egiones an i especialmen e en el caso del
enlace glicosídico GlcN-(1→6)-mio-inosi ol. En cualquie caso, como se discu i á mas
adelan e la población de es as es uc u as en el equilib io es a in a alo ada.
Figu a 3.20. Dis ibución de los angulos de o sión

1,

1,

2 y

2 de 25 du an e dinámicas
es ocás icas (60ns), pa iendo de una con o mación syn-

con

=80 (supe io ) y GB/SA (cen o) y de
una con o mación an i-

2, GB/SA (in e io ).
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
112│
Figu a 3.21. Dis ibución de los angulos de o sión

1,

1,

2 y

2 de 26 du an e dinámicas
es ocás icas (60ns), pa iendo de una con o mación syn-

2

con

=80 (supe io ) y GB/SA (cen o) y de
una con o mación an i-

2 y GB/SA (in e io ).
El análisis cuan i a i o de las simulaciones empleando las dis ancias in e p o ónicas
expe imen ales p esen a en es e caso la di icul ad de la escasez de es iciones de dis ancia
debido a los p oblemas encon ados en la ob ención de los da os expe imen ales. Es e p oblema
es especialmen e acusado en el caso del isacá ido 25 pa a en que no se puede desc ibi
cuan i a i amen e el enlace glucosamina inosi ol. En líneas gene ales, las dis ancias
co espondien es a los NOEs exclusi os de las con o maciones mayo i a ias son más co as
que pa a los con o me os an i.
-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


-180 -120 -60 0 60 120 180
-180
-120
-60
0
60
120
180


Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
113│
Tabla 3.9. Dis ancias in e p o ónicas eó icas calculadas como p omedios < -6> pa a 25, a pa i de simulaciones de
SD, y compa adas con las expe imen ales. Las comillas se e ie en a los esiduos de manosa ó galac osa (‘‘);
glucosamina (‘); mio-inosi ol (sin comillas).
25
Exp. RMN
SD =80
< -6>
SD GB/SA
< -6> syn-
SD GB/SA
< -6> an i-
H1’-H6*
-
2,34
2,29
2,29
H1’-H5
no
4,35
4,14
4,05
H1’’-H3’
3,5
3,09
3,07
3,37
H1’’-H5’
3,4
3,63
3,27
3,97
H1’’-H4’
2,3
2,54
2,46
2,41
Tabla 3.10. Dis ancias in e p o ónicas eó icas calculadas como p omedios < -6> pa a 26, a pa i de simulaciones de
SD, y compa adas con las expe imen ales. Las comillas se e ie en a los esiduos de manosa ó galac osa (‘‘);
glucosamina (‘); mio-inosi ol (sin comillas).
26
Exp. RMN
SD =80
< -6>
SD GB/SA
< -6> syn-
SD GB/SA
< -6> an i-
H1’-H6*
2,2
2,35
2,28
2,29
H1’-H5
3,9
4,38
4,18
3,95
H1’’-H3’
-
3,35
3,50
3,37
H1’’-H5’
3,2
3,65
3,65
2,96
H1’’-H4’
2,4
2,47
2,32
2,36
* Solapamien o de H1 y H6 de mio-inosi ol.
Los esul ados e lejan un acue do azonable en e las dis ancias expe imen ales y las
simulaciones pa iendo de es uc u as syn-que es mejo al emplea condicciones GB/SA pa a
simula el e ec o del disol en e. En el caso de las uniones GlcN - myoIns se ap ecia en el único
caso cuan i icado, compues o 26, una in a alo ación de la población de las o mas an i
mino i a ias.
Dinámicas Molecula es en agua explíci a.
Con el p opósi o de in en a mejo a la desc ipción de las o mas mino i a ias an i-,
se decidió ele a el ni el de eo ia de las simulaciones de dinámica molecula con la inclusión
de agua explíci a en es os sis emas. El p incipal mo i o de es a decisión ue la sensibilidad
demos ada po es os compues os a cambios en los modelos de sol a ación empleados, ya que
el empleo explíci o de moléculas de agua supond ía una e aluación más comple a de las
in e acciones elec os á icas y enlaces de hid ógeno en e el solu o y el disol en e.
En p ime luga ue necesa io e alua las ca gas pun uales pa a es os compues os. Se
siguie on los p ocedimien os habi uales,50 y se empleó el mé odo RESP (Res ained
Elec oS a ic Po encial i ).24 Pa a ello, p ime o se ealizó el cálculo median e mecánica
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
120│
En es e caso el análisis de las ayec o ias de SD pa iendo de mínimos ipo syn- o
an i-

mues an un ap eciable ni el de con e sión con o macional en ambos (Figu a 3.27). La
población de las o mas an i ue supe io al 5% pa a ambos enlaces cualquie a que uese la
es uc u a de pa ida. Las dis ancias in e p o ónicas eó icas ( abla 2.13), calculadas como
p omedio en < 6> a lo la go de dinámicas es ocás icas e lejan un buen acue do con las
expe imen ales.
Tabla 3.12. Dis ancias in e p o ónicas eó icas calculadas como p omedios < > pa a 27, a pa i de simulaciones
de SD, y compa adas con las expe imen ales. Las comillas se e ie en a los esiduos de manosa ó galac osa (‘‘);
glucosamina (‘); mio-inosi ol (sin comillas).
* Solapamien o de H1 y H6 de mio-inosi ol.
Des aca de los da os calculados a pa i de las simulaciones de SD el excelen e ajus e
pa a las dis ancias co espondien es a la unión Gal-(1→4)-GlcN, incluso pa a aquellas que
ca ac e izan al mínimo an i-. Desa o unadamen e no se pudo calcula expe imen almen e la
dis ancia H1’-H5 pa a la unión GlcN-(1→6)-mio-inosi ol, pa a pode ealiza una
compa ación simila .
3.4.- ESTUDIO DE PROTONES HIDROXÍLICOS POR RMN.
Un ac o de e minan e de la p ecisión con la que es posible de ini es uc u as
idimensionales basadas en RMN es el núme o de es icciones expe imen ales signi ica i as
accesibles.53 Es a es la p incipal causa de la di e encia en la de inición de es uc u as ob enidas
median e RMN pa a p o einas, con un g an núme o de NOEs, en e a las de ca bohid a os,
peo de inidas. En el caso de ca bohid a os, debido a su p opia na u aleza, sólo es posible
obse a un núme o limi ado de NOEs es uc u almen e ele an es en disoluciones de 2H2O.
Como consecuencia de es e incon enien e, la p ecisión y esolución con la que es posible
ealiza la de e minación es uc u al de ca bohid a os ha sido menos sa is ac o ia que en el caso
de o as biomoleculas. Es e hecho ha es imulado la búsqueda de me odos al e na i os de
ob ención de es icciones complemen a ias al NOE, como son las cons an es de acoplamien o
escala o dipola esidual.54 O a es a egia se ha basado en amplia el conjun o de es icciones
de i adas de NOEs a los p o ones hid oxílicos pa a ob ene más es icciones signi ica i as.
27
Exp.
SD < -6> syn-
SD < -6> an i-
H1’-H6*
2,2*
2,35
2,30
H1’-H5
Solap.
3,83
3,77
H1’-H1
3,7
3,30
3,92
H1’’-H3’
3,4
3,33
3,13
H1’’-H5’
3,1
3,31
3,08
H1’’-H4’
2,5
2,39
2,43

Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
121│
Así la es udio de los p o ones hid oxílicos ha sido empleado pa a ob ene in o mación
es uc u al en é minos de es e eoquímica55, dis ancias in e p o ónicas56,57, enlaces de
hid ógeno58, e c.
Requisi os pa a la obse ación de los hid oxilos en agua:
El p ime equisi o es ob iamen e ealiza los expe imen os en H2O pa a e i a el
in e cambio de los p o ones lábiles con los deu e ones del disol en e habi ualmen e empleado.
En es as condiciones es necesa io obse a las señales del solu o (~1mM) en p esencia de las
de H2O (~50M). Es a elación sob epasa el ango dinámico de los ADCs empleados en RMN,
lo que implica usa algun ipo de sup esión de señal del disol en e pa a obse a las del solu o,
como po ejemplo, p esa u ación59, Jump-Re u n60, NOHOSS61, 1-1 Echo62, Spin-Lock63 o
empleando g adien es de campo, wa e ga e64 o exci a ion sculp ing65. Po o o lado, el esquema
empleado pa a elimina la señal debe se más ápido que la elocidad de in e cambio en e los
p o ones lábiles y el disol en e pa a e i a des ui las señales de in e és. Es e es el
incon enien e de la p esa u ación, que es el mé odo más común pa a sup imi la señal del
disol en e. Du an e el p oceso de sa u ación los p o ones lábiles se in e cambian con los del
disol en e magné icamen e inac i os, p oduciendo la pe dida de las señales de in e és. El
módulo Wa e ga e (Wa e Sup esion by G adien Tailo ed Exci a ion), u iliza una combinación
de pulsos de adio ecuencia selec i os y pulsos de g adien es pa a consegui una sup esión de
agua del ango necesa io (104-105) y es su icien emen e ápido como pa a pe mi i la
obse ación de señales con elocidades de in e cambio ela i amen e al as. Además, es
sencillo de adap a a la mayo ia de expe imen os de RMN. Es as ca ac e ís icas le han
con e ido en la écnica de elección pa a la sup esión de disol en es cuando se desea obse a
señales de p o ones in e cambiables con el agua.66
Los p o ones hid oxílicos ienen elocidades in ínsecas de in e cambio con el agua
mucho mayo es que o os p o ones in e cambiables, como los p o ones de amida de las
p o einas. Po ello la obse ación de las señales de los g upos hid oxilo de ca bohid a os es
mucho más di ícil. Su éxi o depende en g an medida de la disminución de la ciné ica del
in e cambio en la mues a. Pa a ello se disminuye la empe a u a lo máximo posible, incluso
empleando mezclas c ioscópicas como H2O / Ace ona o Me anol 9:1 que congela en e -10 a -
15º C67 o DMSOd6: H2O 1:3 ( / ) que congela a – 62º C68 o mé odos de agua supe en iada.69
Como el mecanismo de in e cambio p esen a un mecanismo de ca álisis acido-base gene al,
ambien es de i al impo ancia el ajus e del pH de la mues a en o no a la neu alidad con el
in de minimiza es e in e cambio.70 Finalmen e, es igualmen e impo an e limi a la p esencia
de azas ionicas que de la misma mane a ac uan como ca alizado es del p oceso.71
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
122│
Resul ado con los pseudooligosacá idos 25 y 26.
Con el in de op imiza las condicciones expe imen ales, p epa ación de la mues a,
op imización de las secuencias de pulsos, e c, se eligió como compues o modelo la saca osa
que ha sido ecuen e obje o de es e ipo de es udios .
Figu a 3.28. Espec os de RMN pa a una mues a de saca osa en H2O/(CD3)2CO, en p opo ción
85% / 15%, 20mM ealizado a -7ºC y pH 6.75; en la pa e supe io se mues a el espec o de TOCSY, a

m de 40ms, en la in e io el espec o 1D 1H ambos con módulo WATERGATE.
Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
123│
Los expe imen os se ealiza on con una mues a de saca osa y u ilizando condiciones
es ablecidas po es udios p eceden es:pH p óximo a la neu alidad (6,75), empe a u as po
debajo de -7ºC empleando una mezcla agua y ace ona y el módulo de sup esión de agua ipo
Wa e ga e, con el en de pulsos 3-9-19. Los esul ados ue on buenos pudiendo ealiza
expe imen os bidimensionales (TOCSY y NOESY) y ue posible ealiza una comple a
asignación de las esonancias de los hid oxilos ( igu a 3.28). También se pudo es ablece que la
in luencia de la concen ación es ap eciable aunque no ascenden al ealizando los
expe imen os a concen aciones en e 2 y 20mM.
A con inuación ealizamos los expe imen os pa a de ec a los hid oxilos de los
isacá idos 25 y 26. Después de a ios ensayos se de e mino que en nues o caso, la mezcla de
disol en es op ima ué agua / ace ona 85:15, lo que pe mi ió alcanza empe a u as de -17ºC
pa a una concen ación de azúca del o den de 10mM. En p ime luga , se ealizo una
e aluación de allada de la in luencia del pH en las señales de los hid oxilos (Figu a 3.29). Tal
y como se espe aba, los pH p óximos a la neu alidad, son los más ap opiados pa a la
obse ación de es as señales, siendo los op imos: 7,17 pa a 25 y de 7,12 pa a 26. A alo es po
debajo de pH 5,0 y po encima de 8,0 se obse a un ensanchamien o no able de las señales,
como consecuencia de la acele ación de p ocesos de in e cambio químico.
O o de los ac o es que in luye en el aspec o de los espec os, conc e amen e en la
o ma de los p o ones lábiles in e cambiables, es la empe a u a. Po un lado su disminución
a o ece la obse ación de las señales al disminui la elocidad del in e cambio químico con el
agua, po o o su in luencia en la mo ilidad del solu o y iscosidad del disol en e a
empe a u as p óximas a la congelación p oduce un ensanchamien o gene alizado de las
señales. Aunque se había desc i o la u ilización de esinas de in e cambio iónico72,71e pa a
elimina posibles azas de las impu ezas iónicas que ca alizan el in e cambio, en nues o caso
debido a la p esencia de g upos ca gados os a o y amino en los pseudo isaca idos 25 y 26
es o no ue posible. Po ello, se e ec uó la pu i icación p e ia empleando c oma og a ía en ase
e e sa.
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
124│
Figu a 3.29. Espec os de RMN pa a una mues a de 25 (izda) en H2O/(CD3)2CO, en p opo ción
85%:15%, ealizado a -7ºC y 500 MHz y a iando el pH pa a obse a el ango óp imo de obse ación
de las señales de hid oxilo (desapan alladas) y de 26 (d cha)con a iaciones de la empe a u a desde
273K (in e io ) has a 262 K(supe io ) pa a un pH óp imo ijo de 7,12.
Finalmen e, las condiciones op imas encon adas pa a la de p epa ación de las
mues as ue on: el empleo de agua y ace ona (85:15) como disol en e, a pH de 7,17 pa a 22 y
de 7,12 pa a 23 y una empe a u a en e 0ºC has a –15ºC.
La asignación de las señales de los p o ones hid oxílicos se ealizó median e
expe imen os TOCSY ealizados a di e en es iempos de mezcla (15-60 ms) y expe imen os
NOESY y ROESY odos ellos empleando el módulo wa e ga e ( igu a 3.30). Se pudie on
de ec a e iden i ica las señales co espondien es al esiduo del cicli ol (mio-inosi ol), no
iden i icándose las co epondien es a los o os anillos de pi anosa ( e igu a 3.31). La señal
más desapan allada y es echa del espec o se co esponde con los p o ones del g upo amino,
en posición 2 de los esiduos de glucosa.
Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
125│
Figu a 3.30. Espec os TOCSY con módulo WATERGATE a

m de 40 ms pa a una mues a de 26
en H2O/ (CD3)2CO, a -11ºC y 500MHz y ealizados a pH óp imo de 7,17.
Figu a 3.31. Ampliación de los espec os TOCSY con módulo WATERGATE a

m de 15 ms
(cen o) y 40 ms (abajo) pa a una mues a de 25 (izda) y 26 (de echa) en H2O/ (CD3)2CO, a -11ºC y
500MHz y ealizados a sus pH óp imos. El diag ama supe io de echo mues a una ampliación del 2D-
NOESY pa a 26 con WATERGATE a 300 ms.
En cualquie caso y a pesa de habe conseguido obse a y asigna las señales de
algunos hid oxilos, no se pudo ex ae in o mación es uc u alemen e ele an e como
cons an es de acoplamien o o NOEs in e glicosidicos. En nues as manos y pa a es os
compues os no ue posible educi su icien emen e las elocidades de in e cambio con el
disol en e y las señales obse adas e an aun demasiado anchas como pa a pode medi las

Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
126│
cons an es de acoplamien o. El mismo in e cambio quimico domina los expe imen os NOESY
y ROESY de o ma al que no pe mi e ob ene picos NOE de alo es uc u al debido a que las
ans e encias secuenciales gene an un al o núme o de pe mu aciones. Una posible explicación
pa a la di e encia de compo amien o de 25 y 26 con la saca osa empleando el mismo sis ema,
equipo y labo a o io, pod ia esidi en la in luencia de los g upos ionizados p esen es en los
pseudo isaca idos como au oca alizado es de los p ocesos de in e cambio con el disol en e.
Como consecuencia de los es os esul ados se decidió no con inua el es udio con el es o de
los compues os.
3.5.- DISCUSIÓN
Se ha lle ado a cabo el es udio es uc u al en disolución de las es uc u as
pseudodisaca ídicas 20-22, y pseudo isaca ídicas 23-27, median e la combinación de RMN y
mé odos de cálculo eó icos: MM y dinámicas molecula es es ocás icas. Los es udios se han
ealizado con el campo de ue zas AMBER* y pa ame izaciones de Sende owi z-Pa ish–S ill,
de mane a simila a la p esen ada en el capí ulo 2 de es a esis doc o al.
Respec o a los compues os 20-22, ca ac e izados po posee g upos os a o en los
anillos de GlcN, se ha comp obado expe imen almen e (a a és de NOEs exclusi os) que
exis en en disolución como un equilib io en e dos con ó me os: uno mayo i a io syn-, y o o
mino i a io del ipo an i-. Con el obje o de pode ealiza un es udio compa a i o del e ec o
de la sus i ución del g upo os a o, en las simulaciones eó icas se ealizó la compa ación con
el compues o base 7 (que no posee g upo os a o). Las ayec o ias de las dinámicas
es ocás icas (SD) de los compues os 20-22, isi a on las egiones an i-mien as es o no
sucedió pa a 7. La compa ación en e las dis ancias p omedio a lo la go de las ayec o ias y las
expe imen ales, ue on buenos pa a la dis ancia que ca ac e iza al mínimo más poblado syn-,
mien as que las co espondien es a la con ibución de con ó me os an i-, ue on en gene al,
sob ees imadas en odos los casos.
El es udio de los pseudo isacá idos 23-27 equi ió analiza sepa adamen e las dos
uniones glicosídicas, a sabe , Hexosa-(1→4)-GlcN y GlcN-(1→6)-mio-inosi ol. Con
espec o al enlace GlcN-(1→6)-mio-inosi ol pa a 23, 24, 25, 26 y 27, la obse ación
simul ánea de NOE exclusi os de las con o maciones syn-yan i-, incompa ibles en e sí,
indicó que pa a es e enlace debe exis i un equilib io con o macional en e ambas si uaciones.
La mayo in ensidad de los mínimos syn-, en e a los an i-nos señala la meno dis ancia
de los p ime os. Respec o al o o enlace glicosídico, hexosa-(1→4)-GlcN, ocu e algo
Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
127│
simila ; odos los compues os p esen an un equilib io con o macional en e un mínimo an i-
mino i a io y o o syn- mayo i a io.
Los mapas de ene gía adiabá icos y mapas de dis ibución de p obabilidad
con o macional calculados concue dan acep ablemen e con las dis ancias expe imen ales pa a
la unión Hexosa-(1→4)-GlcN de los compues os 23-27. Así se p edicen los mínimos syn- y
los an i- que an es habían sido de ec ados expe imen almen e po RMN, alidando es a
me odología empleada. Respec o a la unión GlcN-(1→6)-mio-inosi ol, que ya había sido
analizada en el capí ulo 2, el modelo empleado no p edice los mínimos an i-.
La me odología de dinámicas es ocás icas ue empleada a con inuación con dos
a amien os del disol en e implíci o di e en es: =80 y GB/SA, con el obje o de comp oba
cuál ep oducía con mayo iabilidad los da os expe imen ales hallados median e los
expe imen os de RMN. De mane a gene al se puede deci que el empleo de SD mejo ó los
ajus es en e las dis ancias expe imen ales y las eó icas calculadas como p omedio de las
es uc u as en las simulaciones, con espec o a las simulaciones de MM. En ambas uniones
glicosídicas, las dis ancias ela i as a con o maciones syn-, ue on mejo ep oducidas po las
simulaciones, especialmen e al emplea el mé odo de GB/SA. Po o o lado, las dis ancias an i-
 ue on sis emá icamen e sob ees imadas independien emen e de las condiciones u ilizadas.
Es des acable el caso del compues o 27, en donde el ajus e expe imen ado en las
dis ancias que ca ac e izaban los dos mínimos con o macionales syn-/ an i-, en e los
expe imen os de RMN y las simulaciones de SD, ue casi pe ec o pa a ambas uniones
glicosídicas.
Con los obje i os p opues os en el apa ado 3.3.4 del p esen e capí ulo, se ealiza on
expe imen os con H2O como disol en e, a bajas empe a u as y u ilizando los mé odos ac uales
pa a sup esión de disol en es median e écnicas de RMN (secuencias de wa e ga e), en los
compues os 25 y 26. A pesa del eno me es ue zo empleado pa a la de ección de los OH- de
es os compues os en H2O, apenas algunos hid oxilos de los esiduos de mio-inosi ol pudie on
se cla amen e de ec ados, mien as que aquéllos de los esiduos de hexosa y de glucosamina
pe manecie on ocul os. Pues o que empleando como modelo saca osa pudimos de ec a
sa is ac o iamen e los hid oxilos u ilizando las mismas condiciones que con 25 y 26 (campo
magné ico, empe a u a, e c.) se puede conclui que la na u aleza in ínseca de es os
po enciales mediado es de IPGs (más conc e amen e, la p esencia de los g upos os a o y
amonio) es la que impide la plena obse ación de los hid oxilos en H2O.
También se ha e aluado el uso de disol en e explíci o en los es udios de modelado
molecula empleando el compues o 25 como modelo. El cálculo de ca gas a ómicas álidas
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
128│
pa a es e compues o 25 y ex apolables a los demás, hizo que se empeza a po el esiduo de
cicli ol (mio- y qui o-inosi ol común en odas los compues os), an o en sus e siones lib e
como me ilados en posición 6. Nos hemos concen ado en los mé odos de ca gas basadas en el
po encial elec os á ico (RESP) y nues o c i e io de calidad cla e ue el cálculo de las ene gías
de in e acción elec os á ica o al de las simulaciones.
T as el cálculo especí ico de las ca gas basadas en el po encial elec os á ico, las
di icul ades en es as simulaciones empeza on con la equilib ación del sis ema, as
inclui el solu o 25 en la caja ec angula de agua (TIP3P), donde se p oducían
con inuos e o es debidos al eescalado de las elocidades a ómicas. T as supe a
es os p oblemas, la dinámica p oduc i a (10 ns en ap oximadamen e 6 meses de
simulación) ampoco mejo ó la desc ipción del equilib io obse ado
expe imen almen e en e los mínimos syn- y an i-. Po es o y a al a de da os que
in ie an es a opinión, no pa ece demasiado adecuado emplea es a me odología en
el es udio de pseudooligosacá idos mediado es de IPGs, dado la ele ada exigencia
eque ida en cos e compu acional y los esul ados ob enidos.
Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA
129│
3.6.- BIBLIOGRAFIA
1 Jones, D.R.; Va ela-Nie o, In e na ional Jou nal o Biochemis y & Cell Biology.
1998, 30, (3), 313-326.
2 Field, M. C. Glycobiology. 1997, 7, (2), 161-168.
3 S al o s, P. Bioessays. 1997, 19, (4), 327-335.
4 Cohen, P. Na u e Re iews D ug Disco e y. 2002, 1, (4), 309-315.
5 Knigh on, D.R.; Zheng, J.H.; Teneyck, L.F.; Ash o d, V.A.; Xuong, N.H.; Taylo ,
S.S.; Sowadski, J.M. Science 1991, 253, (5018), 407-414.
6 Knigh on, D.R.; Zheng, J.H.; Teneyck, L.F.; Xuong, N.H.; Taylo , S.S.; Sowadski,
J. M. Science 1991, 253, (5018), 414-420.
7 Zheng, J.H.; Knigh on, D.R.; Pa ello, J.; Taylo , S.S.; Sowadski, J.M. Me hods in
Enzymology 1991, 200, 508-521.
8 Knigh on, D.R.; Bell, S.M.; Zheng, J.H.; Teneyck, L.F.; Xuong, N.H.; Taylo , S.S.;
Sowadski, J.M. Ac a C ys allog aphica Sec ion D-Biological C ys allog aphy. 1993,
49, 357-361.
9 Zheng, J.H.; Knigh on, D.R.; Teneyck, L. F.; Ka lsson, R.; Xuong, N.H.; Taylo ,
S.S.; Sowadski, J.M. Biochemis y. 1993, 32, (9), 2154-2161.
10 Zheng, J.H.; Knigh on, D.R.; Xuong, N.H.; Taylo , S.S.; Sowadski, J.M.;
Teneyck, L.F. P o ein Science. 1993, 2, (10), 1559-1573.
11 Zheng, J.H.; T a ny, E.A.; Knigh on, D.R.; Xuong, N. .; Taylo , S.S.; Teneyck,
L.F.; Sowadski, J.M. Ac a C ys allog aphica Sec ion D-Biological C ys allog aphy.
1993, 49, 362-365.
12 Madhusudan; E.A.;T a ny, E.A.; Xuong, N.H.; Adams, J.A.; Teneyck, L.F.;
Taylo , S.S.; Sowadski, J.M. P o ein Science. 1994, 3, (2), 176-187.
13 Ka lsson, R.; Zheng, J.H.; Xuong, N.H.; Taylo , S.S.; Sowadski, J.M. Ac a
C ys allog aphica Sec ion D-Biological C ys allog aphy. 1993, 49, 381-388.
14 Gassel, M.; B ei enlechne , C.B.; Konig, N.; Hube , R.; Engh, R.A.; Bossemeye ,
D. Jou nal o Biological Chemis y. 2004, 279, (22), 23679-23690.
15 P ade, L.; Engh, R.A.; Gi od, A.; Kinzel, V.; Hube , R.; Bossemeye , D.
S uc u e. 1997, 5, (12), 1627-1637.
16 Engh, R.A.; Gi od, A.; Kinzel, V.; Hube , R.; Bossemeye , D. Jou nal o
Biological Chemis y. 1996, 271, (42), 26157-26164.
17 Bossemeye , D.; Engh, R.A.; Kinzel, V.; Pons ingl, H.; Hube , R. Embo Jou nal.
1993, 12, (3), 849-859.
18 Toledo, L.M.; Lydon, N.B.; Elbaum, D. Cu en Medicinal Chemis y. 1999, 6,
(9), 775-805.

Capí ulo 4: Pa e expe imen al
136│
4 PARTE EXPERIMENTAL
4.1.- RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR.
Los espec os de RMN se han egis ado en el espec óme o B uke
AVANCE 500 DPX del se icio de RMN del Cen o de In es igaciones Químicas
Isla de la Ca uja.
Los espec os han sido asignados u ilizando écnicas bidimensionales
con encionales, COSY,
2
TOCSY,
3
NOESY
4
, ROESY,
5
y HMQC
6
o HSQC
7
,
La concen ación de las mues as de oligosacá idos pa a RMN, es u o
siemp e en el en o no de 3-1 mM (disuel os en 600-500 L de disol en e). Las
mues as se lio iliza on al menos 3 eces con D2O, y pos e io men e se disol ie on
en D2O del 99.97 %D (eu iso- op). El alo de pH* se ajus ó en odos los casos
median e adición de pequeñas can idades de DCl o NaOH ( e e ecia). Todos los
espec os de RMN se egis a on en D2O a 25º C, sal o en casos conc e os en los que
se especi ique o a empe a u a, en espec óme os B uke AVANCE DRX-500
(sonda de de ección in e sa de 5mm doble 1H/Banda-ancha, con g adien es en Z), y
2
G iesinge , C.; Sø ensen, O.W.; E ns , R.R. J. Magn. Reson. 1987, 75, (3), 474-
492. b) Muelle , L. J. Magn. Reson. 1987, 72, (1), 191-196. c) Kim, Y.; P es ega d,
J.H. J. Magn. Reson. 1989, 84, (1), 9-13.
3
a) B aunschweile , L.; E ns , R.R.; J. Magn. Reson. 1983, 53, 521-528. b) Bax,
A.D. Da is, G.; J. Magn. Reson. 1985, 65, 355-360. c) Bax, A.; Me hods Enzymol.
1989, 176, 151-168
4
Jeene , J.; Meie , B.H.; Bachmann, P.; E ns , R.R.; J. Chem. Phys. 1979, 71, 4546-
4553.
5
a) Fa me , B. T.; Macu a, S.; B own, L. R. J. Magn. Reson. 1987, 72, 2, 347-352.
b) Bull. T.E. J. Magn. Reson. 1988, 80, (3), 470-481. c) Poppe, L.; an Halbeek. H.
J. Magn. Reson. 1992, 96, (1), 185-190.
6
a) Kessle , H.; Schmiede , P.; Ku z, M. J. Magn. Reson. 1989, 85, (2), 400-405. b)
C ouch, R.C.; McFadyen, R.B.; Daluge, S.M.; Ma in, G.E. Magn. Reson. Chem. 1990,
28, (9), 792-796.
7
a) Ma ion, D.; Wüe h ich, K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980, 95, 1. b)
Mülle , L. J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 4481-4484. c) Willke , W.; Leib i z, D.;
Ke ssebaum, R.; Be mel, W. J. Magn. Reson. 1993, 31, 287-292.
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
137│
B uke AVANCE DRX-400 (sonda di ec a 5mm QNP). Los desplazamien os
químicos se exp esan en pa es po millón (ppm) espec o a la ecuencia de
esonancia del DSS como e e encia p ima ia, aunque la calib ación de los
desplazamien os químicos se ealizó a pa i de la ecuencia base absolu a del
núcleo co espondien e y la elación de ecuencias, de acue do con el so wa e del
ab ican e.
Los expe imen os 2D DQF-COSY
8
, TOCSY, NOESY, ROESY y TROESY
9
se egis a on en el modo sensible a la ase con el mé odo TPPI (Time P opo ional
Phase Inc emen ) pa a la de ección en cuad a u a en F1. Los expe imen os HMQC se
lle a on a cabo en modo magni ud, y los expe imen os HSQC en el modo sensible a
la ase con de ección “eco-an ieco”. Pa a los espec os COSY, NOESY HMQC, y
HSQC, se u iliza on p og amas de pulsos con g adien es en Z pa a selección o
pu ga.
En los expe imen os DQF-COSY se u iliza on ípicamen e ma ices de da os
de 4 K x 1 K, pa a anchu as espec ales de 5000 Hz, y 16-32 acumulaciones po
inc emen o, dependiendo de la mues a. Se aplica on unciones sen2x desplazadas,
en ambas dimensiones, y se aplicó ze o- illing en F1 pa a aumen a la esolución
digi al expandiendo los da os a una ma iz de 8 K x 2 K. Es a impo an e expansión
de los da os con ie e mayo p ecisión en la ob ención de las cons an es 3JH,H po
descon olución ecu si a en el dominio de ecuencias de los picos de c uce. Pa a
al e ec o se hizo uso del p og ama DECO implemen ado en el p og ama de
p ocesado de RMN XWINNMR. Las cons an es de acoplamien o eó icas se
8
a) Rance, M.; Sø ensen, O.W.; Bodenhausen, G.; Wagne , G.; E ns , R.R.;
Wü h ich, K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983, 117, 479-485. b) Pian ini, U.;
Sø ensen, O.W.; E ns , R.R. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 6800-6801. c) Da is,
A.L.; Laue, E.D.; Keele , J.; Moskau, D.; Lohman, J. J. Magn. Reson. 1991, 94, 637-
644.
9
a) B üschweile , R.; G iesinge , C.; E ns , R.R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, (20),
8034-8035. b) B üschweile , R. S uc u al dynamics in biomolecules moni o ed by
nuclea magne ic esonance elaxa ion (Doc o al disse a ion, Diss. Na u wiss. ETH
Zü ich, N . 9466, 1991. c) Hwang, T.L., Shaka, A.J. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114,
(8), 3157-3159.
Capí ulo 4: Pa e expe imen al
138│
ob u ie on po aplicación de las ecuaciones ipo Ka plus modi icadas po Haasnoo
e al.
10
¡E o ! Ma cado no de inido. implemen adas en Mac omodel 6.0.
Las cons an es de acoplamien o in e p o ónicas ue on ob enidas po medida
di ec a del desdoblamien o cuando ue posible ó po descon olución de los picos en
an i ase en los expe imen os DQF-COSY (Double-Quan um Fil e ed Co ela ion
Spec oscopy).
11
Pa a los expe imen os TOCSY, se u iliza on gene almen e ma ices de da os
de 2 K x 256-300, y 32 acumulaciones po inc emen o, dependiendo de la mues a.
Se u ilizó la secuencia MLEV-17 con 60 ms como pe íodo de mezcla iso ópica. Pa a
mejo a la esolución se aplica on unciones sen2x desplazadas, y p edicción lineal
en la dimensión F1. Los expe imen os 2D-NOESY se egis a on a di e en es
iempos de mezcla 200 y 600 ms ( ípicamen e 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, y
600 ms) empleando ma ices de da os de 2K x 300, y ue on p ocesados aplicando
unciones sen2x desplazadas y ze o- illing du an e la ans o mación.
Los expe imen os de co elación 1H-13C a un enlace se lle a on a cabo
median e secuencias HMQC o HSQC. En odos los casos se adqui ió una ma iz de
da os de 1 K x 256 pa a esol e anchu as espec ales de 5000 Hz y 12600 Hz en F2
y F1, espec i amen e, ealizando 16 acumulaciones po inc emen o. Se aplica on
unciones sen2x con alo es de desplazamien o (SSB) de 2.2 (F2) y 3.5 (F1), se
comple ó con ce os has a una ma iz inal de 1K x 1K y se empleó p edicción lineal
en la dimensión F1.
Pa a la e olución de las cons an es de elocidad de elajación c uzada, NOE,
ROE, T-ROE, se emplea on siemp e que ue posible expe imen os 1D selec i os
basados en el doble eco de espín p opues o po Shaka (dp gse: double pulsed ield
10
Haasnoo , C.A.G.; de Leeuw, F.A.A.M.; Al ona, C. Te ahed on. 1980, 36, (19),
2783–2792. b) Haasnoo , C.A.G.; De Leeuw, F.A.A.M.; Al ona, C. Bull. Soc. Chim.
Belges, 1980, 89, 125–131.
11
a) Ca anagh, J.; Wal ho, J. P.; Keele , J. J. Magn. Reson. 1987, 74, (2), 386-393. b) Pons,
M.; Feliz, M.; Gi al , E. J. Magn. Reson. 1988, 78, (2), 314-320. c) De ome, A.E;
Williamson, M. P. J. Magn. Reson. 1990, 88, (1), 177-185.
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
139│
g adien s spin echo). En el caso de los expe imen os NOESY se empleó un esquema
en esencia simila al p opues o po Keele y Shaka que incluye g adien es bipola es
en el iempo de mezcla pa a disminui posibles in e e encias de mecanismos no
deseados.
Pa a e i ica la linealidad del c ecimien o en el ango de iempo de mezcla
conside ado, se ep esen a on las cu as del olumen no malizado pa a cada iempo
de mezcla (Vij/Vdiag) = en e al iempo de mezcla. Una ez comp obado, se
ob u ie on las cons an es de elocidad de elajación c uzada, , como la elocidad
inicial de c ecimien o del NOE, ROE o TROE calculada po ex apolación a iempo
de mezcla ce o de la elación lineal (Vij/[Vdiag· m]) s. m, donde Vij , Vdiag., y m, son
los olúmenes de los picos de c uce y diagonal, y el iempo de mezcla,
espec i amen e
12
.
Obse ación de p o ones lábiles.
La concen ación de las mues as empleadas ue simila a la de los es udios
en D2O, sal o en el caso de los expe imen os sob e saca osa en los que se a ió en e
2 y 20mM. También se e alua on ubos de RMN no con encionales de 1.5 mm que
pe mi ie on aumen a la concen ación has a 10 mM. Los ubos de RMN ue on
a ados p e iamen e con ampón os a o a pH neu o o con Clo u o de TMS pa a
e i a in e e encias de la supe icie del id io.
13
,
14
Se emplea on como disol en e
mezclas H2O/D2O (90:10), agua / DMSO y agua / ace ona en a ias p opo ciones,
siendo la op ima agua / ace ona 85:15 a empe a u as en e 5 y -17C. Los
expe imen os monodimensionales se egis a on empleando los mé odos wa e ga e,
o iginal o empleando los enes de pulsos 3-9-19, W3, W4 y W5,
15
o exci a ion
12
an Halbeek, H.; Poppe, L. Magn. Reson. Chem. 1992, 30, 74-86.
13
Sands öm, C.; Baumann, H.; Kenne, L. J. Chem. Soc. Pe kin T ans. 1998, 2, 809-
815.
14
Beki oglu, S.; Sands öm, C.; No be g, T.; Kenne, L. Ca bohyd . Res. 2000, 328,
409-418.
15
a) Pio o, M.; Saudek, V.; Sklena , V. J. Biomol. NMR. 1992, 2, 661. b) Sklena ,
V.; Pio o, M.; Leppik, R.; Saudek, V. J. Magn. Reson. A. 1993, 102, 241.

Capí ulo 4: Pa e expe imen al
140│
sculp ing
16
. Pa a los expe imen os bidimensionales TOCSY (15-60 ms de iempo de
mezcla), NOESY o ROESY se emplea on siemp e implemen aciones del wa e ga e
basadas en el en 3-9-19 sob e los p og amas de pulsos empleados an e io men e. El
es o de las condiciones expe imen ales: ipo de adquisición, opciones de
ans o mación e c. ue on, en esencia, simila es a las desc i as pa a los
expe imen os en D2O.
Finalmen e, las condiciones op imas encon adas pa a la de p epa ación de
las mues as ue on: el empleo de agua y ace ona (85:15) como disol en e, a pH de
7,17 pa a 22 y de 7,12 pa a 23 y una empe a u a en e 0ºC has a –15ºC. Aunque se
había desc i o la u ilización de esinas de in e cambio iónico pa a elimina posibles
azas de las impu ezas iónicas que ca alizan el in e cambio. En nues o caso, debido
a la p esencia de g upos ca gados os a o y amino en los pseudo isaca idos 25 y 26
se e ec uó la pu i icación p e ia empleando c oma og a ía en ase e e sa.
Valo aciones ácido-base.
Las mues as empleadas en los expe imen os de alo ación ue on las
mismas que se usa on en el es o de los expe imen os sal o que se empleó ace ona
(3-5 L) como e e encia in e na. El pH* se a ió añadiendo pequeñas can idades de
NaOD, o DCl, y se midió después de la medida empleando un pHme o sin
calib ación especial pa a co egi los e ec os iso ópicos del deu e io.
16
a) Hwang, T-L.; Shaka, A.J. J. Magn. Reson. 1995, 112, 275. b) Eme a om, C.;
Hwang, T.-L.; Mackin, G.; Shaka, A.J. J. Magn. Reson. 1995, 115, 137. c) Mackin,
G.; Shaka, A.J. J. Magn. Reson. 1996, 118, 247. d) Heikkinen, S.; Rahkamaa, E.;
Kilpeläinen, I. J. Magn. Reson. 1997, 127, 80-86. e) Heikkinen, S.; Rahkamaa, E.;
Kilpeläinen, I. J. Magn. Reson. 1998, 133, 183-189.
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
141│
4.2.- CÁLCULOS TEÓRICOS.
Los ángulos de o sión han sido de inidos como: =H1C1O1Cx, =
C1O1CxHx, y =H5C5C6O6.
Mapas adiabá icos.
En el cálculo de los mapas adiabá icos se empleó el p og ama
Mac omodel 6.0 empleando el campo de ue zas AMBER* con la adap ación de
la pa ame ización de Homans o con la pos e io de S ille empleando las ca gas
pun uales asignadas po el campo de ue zas e incluyendo los e ec os del
disol en e empleando una cons an e dieléc ica de 80 ó el modelo con inuo
GB/SA. Las es uc u as de pa ida se cons uye on, en una p ime a e apa,
manualmen e y minimiza on exhaus i amen e an es de comenza la p epa ación
de los mapas ígidos. En odas las minimizaciones se empleó el algo i mo de
g adien es conjugados de Pola -Ribie e has a cumpli el c i e io de con e gencia
(de i adas de mnd meno es de 0.001 hJ/Åmol) has a un máximo de 9999
i e aciones. Los mapas ígidos se cons uye on a iando los ángulos de o sión
es udiados cada 20º en las es uc u as de pa ida minimizadas. Pa a la gene ación
de es os mapas se conside a on los es posibles o áme os del g upo
hid oxime ilo: gg, g , g; los dos posibles sen idos de las disposiciones cíclicas
de los g upos hid oxilo secunda ios: “clockwise” o “an iclockwise”. Los mapas
elajados se cons uye on po minimización de los co espondien es mapas
ígidos, según las condiciones ci adas man eniendo cons an e los ángulos
o siones e aluadas. Y inalmen e, los mapas adiabá icos se cons uye on
empleando un p og ama desa ollado po Manuel Ma ín Pas o incluidos en
NOEPROM de acue do con la siguien e exp esión, que e alúa la p obabilidad en
el espacio:
 
 
 
 
 

 
 


ii
ii
RTE
RTE
P
,,,
,/exp
/exp
Capí ulo 4: Pa e expe imen al
142│
Las dis ancias in e p o ónicas sob e el espacio con o macional del mapa
adiabá ico se calcula on como el p omedio en < -6> pesado en la p obabilidad de
cada pun o según:
 
6/1
66 
 
klkl
kl P
Simulaciones "in acuo"
Pa a las dinámicas molecula es (new onianas o es ocás icas) se usó el
p og ama Mac omodel 6.0, y los mismos campos de ue zas y asignaciones de
ca gas que las empleadas en el cálculo de los mapas adiabá icos. Tan o pa a las
dinámicas con  = 80 como pa a aquellas con GB/SA el p o ocolo seguido ue el
mismo. En p ime luga , la es uc u a de pa ida elegida sob e los mapas
adiabá icos se some ió a una minimización ene gé ica en las condiciones
habi uales. Pos e io men e, as una ase de equilib ación con una asignación de
elocidades iniciales según una dis ibución de Maxwell-Bol zmann a 0K y
calen amien o p og esi o du an e 100-500 ps, se ealizó la e apa p oduc i a a
empe a u a cons an e de 300K usando un iempo de in eg ación de 1.0 s,
ac ualizando la lis a de pa es de no-enlace cada 25 e apas de in eg ación, con una
la dis ancia lími e pa a el uncado de es as in e acciones (cu o ) de 10 Å,
aplicando el algo i mo SHAKE pa a la es icción de los mo imien os de al a
ecuencia a los á omos de hid ógeno, y una cons an e de acoplamien o al baño
é mico según el algo i mo de Be endsen de 0.5 ps (dinámicas new onianas) o
una cons an e de icción de 2.5 ps (dinámicas es ocás icas). Las es uc u as
in e medias ue on gua dadas cada picosegundo. Las dis ancias p omedio
calculadas a lo la go de las simulaciones de dinámica molecula ue on
calculadas como < -6> según:
 
6/1
66 )/1( 
 
kl
kl n
Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce
143│
Simulaciones con disol en e explíci o
Pa a las simulaciones en p esencia de disol en e explíci o se empleó el
p og ama AMBER 6.0
17
empleando el campo de ue zas GLYCAM. Los dis in os
ipos de esiduos se cons uye on manualmen e y se incluye on en la lib e ía de
esiduos de AMBER con el módulo PREP, modi icando con enien emen e los ipos
de á omos pa a compa ibiliza los con las de iniciones del campo de ue zas
AMBER-GLYCAM. Se calcula on las ca gas pun uales pa a es os compues os
empleando GAUSSIAN 94
18
ó 98
19
, con el ni el de cálculo HF/6-31G* según el
mé odo RESP (Res ained Elec oS a ic Po encial i ).
20
Las es uc u as de pa ida se some ie on a una minimización "in acuo", pa a
elimina malos con ac os iniciales. Es a minimización consis ió en 200 e apas de
"descenso p onunciado" seguido po minimización con "g adien es conjugados"
17
Case, D.A.; Pea lman, D.A.; Caldwell, J.W.; Chea ham III, T.E.; Ross, W.S.;
Simme ling, C.L,; Kollman, P.A. AMBER 6. Uni e si y o Cali o nia, San F ancisco,
119. 1999.
18
F isch, M.J.; T ucks, G.W.; Schlegel, H.B.; Gill, P.M.W.; Johnson, B.G.; Robb,
M.A.; Cheeseman, J.R.; Kei h, T.; Pe e sson, G.A.; Mon gome y, J.A.;
Ragha acha i, K.; Al-Laham, M.A.; Zak zewski, V.G.; O iz, J.V.; Fo esman, J.B.;
Cioslowski, J.; S e ano , B.B.; Nanayakka a, A.; Challacombe, M.; Peng, C.Y.;
Ayala, P. Y.; Chen, W.; Wong, M.W.; And es, J.L.; Replogle, E.S.; Gompe s, R.;
Ma in, R.L.; Fox, D.J.; Binkley, J.S.; De ees, D.J.; Bake , J.; S ewa , J.P.; Head-
Go don, M.; Gonzalez, C.; Pople, J.A. Gaussian, Inc., Pi sbu gh PA, 1995.
19
F isch, M.J.; T ucks, G.W.; Schlegel, H.B.; Scuse ia, G.E.; Robb, M.A.;
Cheeseman, J.R.; Zak zewski, V.G.; Mon gome y J , J.A.; S a mann, R.E.; Bu an ,
J.C.; Dapp ich, S.; Millam, J.M.; Daniels, A.D.; Kudin, K.N.; S ain, M.C.; Fa kas,
O.; Tomasi, J.; Ba one, V.; Cossi, M.; Cammi, R.; Mennucci, B.; Pomelli, C.;
Adamo, C.; Cli o d, S.; Och e ski, J.; Pe e sson, G.A.; Ayala, P.Y.; Cui, Q.;
Mo okuma, K.; Sal ado , P.; Dannenbe g, J.J.; Malick, D.K.; Rabuck, A.D.;
Ragha acha i, K.; Fo esman, J.B.; Cioslowski, J.; O iz, J.V.; Baboul, A.G.;
S e ano , B.B.; Liu, G.; Liashenko, A.; Pisko z, P.; Koma omi, I.; Gompe s, R.;
Ma in, R.L.; Fox, D.J.; Kei h, T.; Al-Laham, M.A.; Peng, C.Y.; Nanayakka a, A.;
Gonzalez, C.; Challacombe, M.; Gill, P.M.W.; Johnson, B.; Chen, W.; Wong, M.W.;
And es, J.L.; Gonzalez, C.; Head-Go don, M.; Replogle, E.S.;. Pople. J.A. Gaussian,
Inc., Pi sbu gh, PA, 1998.
20
Bayly, C.I.; Cieplak, P.; Co nell, W.; Kollman, P.A. J. Phys. Chem-Us. 1993, 97,
(40), 10269-10280.