Estructura tridimensional de inositol fosfoglicanos mediante rmn, mecánica y dinámica molecular

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES QUÍMICAS. CENTRO DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS “ISLA DE LA CARTUJA”. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE INOSITOL FOSFOGLICANOS MEDIANTE RMN, MECÁNICA Y DINÁMICA MOLECULAR. MEMORIA p esen ada pa a aspi a al g ado de Doc o en Ciencias Químicas po Jesús Angulo Ál a ez Se illa, 2002 MEMORIA p esen ada pa a aspi a al g ado de Doc o en Ciencias Químicas po José Luis Muñoz Ponce Se illa, 2015 D. PEDRO MANUEL NIETO MESA, Cien í ico Ti ula del C.S.I.C. CERTIFICA: Que el p esen e abajo i ulado: “ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE INOSITOL FOSFOGLICANOS MEDIANTE RMN, MECÁNICA Y DINÁMICA MOLECULAR” ha sido ealizado bajo mi di ección y aseso amien o, en el G upo de Ca bohid a os, en el Ins i u o de In es igaciones Químicas, del Cen o de In es igaciones Cien í icas Isla de La Ca uja (Se illa) du an e los años académicos 1999-2000, 2000-2001, 2001-2002 y 2002-2003, cons i uyendo la Memo ia que p esen a el Lcdo. José Luis Muñoz Ponce pa a aspi a al G ado de Doc o en Ciencias Químicas. Se illa, 28 de Sep iemb e de 2015 Di ec o Tesis: Doc o ando: Fdo.: Ped o M. Nie o Mesa Fdo. José Luis Muñoz Ponce Es a esis doc o al se ha lle ado a cabo g acias a la ayuda de las becas p edoc o ales, que se enume an a con inuación: Beca p edoc o al del g upo Rademache G oup Limi ed (Oc ub e1999-Diciemb e2000). Beca pa a o mación y especialización en líneas de in es igación de in e és pa a el sec o indus ial del CSIC (Ene o 2001-Diciemb e 2001). Beca pa a o mación y especialización en líneas de in es igación de in e és pa a el sec o indus ial del CSIC- I3P del CSIC (Feb e o 2002-Ene o 2003). Beca Ins i u o “Reina So ía” de la Fundación RENAL (Feb e o 2003-Junio 2003). "La ciencia se compone de e o es, que a su ez son los pasos hacia la e dad". Julio Ve ne. “No c eo que haya o a cualidad an esencial pa a el éxi o de cualquie ipo que la pe se e ancia. Supe a a casi odo, incluso a la na u aleza”. John D. Rocke elle . El ac ual abajo que p esen o, se ha ealizado en el Ins i u o de In es igaciones Químicas del Consejo Supe io de In es igaciones Químicas, bajo la di ección del In es igado Cien í ico, el D . Ped o Manuel Nie o Mesa. Han sido muchos años de u ela, di ección, apoyo y palab as de comp ensión en los malos momen os y ag adezco de odo co azón que no haya pe dido la espe anza y la cons ancia, pa a que es e p oyec o conjun o pueda ce a se con la consecución de mi esis doc o al. Sé que ha luchado con a odo y odos, y que a eces los p oyec os ienen un eco ido más co o del que que íamos, po eso e doy las g acias y po los buenos momen os y ho as de RMN donde he podido ap ende con uno de los g andes de es e país. No me gus a ía ol ida a la gen e que ocupa on un oci o de mi ida y a las que quie o exp esa mi p o undo y since o ag adecimien o: Sin la ayuda de la inanciación que ecibí du an e los años que ealicé la pa e expe imen al de la esis, no hubie a podido exis i , al menos imp esa con mi nomb e. Po eso y en p ime luga , ag adece al P o eso Manuel Ma ín Lomas, po busca me y encon a me en aquel labo a o io del CSIC en Mad id en 1999 cuando inalizaba mi Tesis de Licencia u a y o ece me la posibilidad de i a un g upo especialis a donde ealiza la esis. Es oy o gulloso de habe compa ido g upo con una de las pe sonas más p olí e as de es e país, e e encia de in es igado es. A las becas dis u adas y a las ins i uciones públicas y p i adas que posibili a on es a esis: Beca p edoc o al del g upo Rademache G oup Limi ed (Oc ub e1999-Diciemb e2000). Beca pa a o mación y especialización en líneas de in es igación de in e és pa a el sec o indus ial del CSIC (Ene o 2001-Diciemb e 2001). Beca pa a o mación y especialización en líneas de in es igación de in e és pa a el sec o indus ial del CSIC- I3P del CSIC (Feb e o 2002-Ene o 2003).Beca Ins i u o “Reina So ía” de la Fundación RENAL (Feb e o 2003-Junio 2003). A los u o es que con amabilidad acep a on la u ela en la p esen e esis doc o al del P og ama Es udios A anzados en Química; en p ime luga al D . José Fuen es Mo a has a la echa de su jubilación y en el úl imo año y con cie a p emu a el D . José Luis Jiménez Blanco, P o eso Ti ula Uni e sidad en Uni e sidad de Se illa. A los en onces Doc o es y hoy en día pila es en di e sas amas de in es igación y con ca gos ins i ucionales bien di e en es: Soledad Penedés, Julio Delgado, Luz Cadenas, F ancisco Pin o, Ja ie Rojo, E a A ce, Rica do Pé ez. A los que ue on compañe os du an e la ealización de mi esis con los que an as a en u as, dichas y desdichas compa í: Á ica, Rica do, Oli, Paco, Niels, Ja ie Lopez, Julia, Sa a, Juan An onio, Jesús, C is ina, Belén, Félix, S ephan, Flo ence, Mª José, Ma celo, Me cedes, Te e, Lize h, Na alia, José Luis de Paz, Ra ael Ojeda, Sil ia. Mención especial con mucho ca iño pa a mis “chicos de los espines o ien ados con el campo”, con los que pasé muchas ho as de mi ida, deba iendo, discu iendo, ampliando conocimien os, ealizándome como doc o ando y ap endiendo: D . F anck Che alie y D . Jesús Angulo Ál a ez. A mi amilia, po el ca iño. A mis pad es adop i os, nunca la palab a sueg os u o un signi icado an g ande y p óximo, g acias po ues a paciencia, apoyo in ini o y demos ación de a ec o día a día, en los buenos y sob e odo en los malos momen os, y sabéis que ambién exis ie on en una esis an la ga. Os debo mucho y nunca pod é pagá oslo. A mi amo , Pa icia Mo a, un apoyo básico sin el que no hubie a podido esis i . Su con ianza y palab as de ánimo, su aleg ía y posi i idad, su amo sin condiciones, hicie on de mi mejo pe sona e in es igado . El mo o de mi ida. Te quie o. Cuando inicié la p esen e esis no en aban ni en mis pensamien os y hoy en día son ealidad de mi ida e indispensables, mis dos hijos: Is ael y Cecilia, quienes con segu idad se abu i án en la de ensa de mi esis, pe o que el día de mañana ag adece án a buen segu o habe podido asis i . Son mi sang e y ca ne, y a ellos les pe enece odo lo que engo y soy; una pa e de es a esis a po oso os. También dedica al aún non na o, aún iene iempo pa a que podamos explica le que apo ó su pad e a la ciencia. INDICE PREFACIO 1.-INTRODUCCION 1.1.- INOSITOL DISTRIBUCCIÓN, ACTIVIDAD Y SIGNIFICANCIA BIOLÓGICA. Pag 5-6. 1.2.- MECANISMO DE ACCIÓN DE LA INSULINA. Pag 7-11. 1.2.1.-La cascada de os o ilación. Pag 7-8. 1.2.2.-La hipó esis del segundo mensaje o. Pag 8-10. 1.2.3.-Inosi ol os oglicanos como segundos mensaje os: IPGs ipo A y ipo P. Pag 10-11. 1.3.- ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE CARBOHIDRATOS. Pag 11-26. 1.3.1.- Ca ac e is icas es uc u ales de ca bohid a os. Pag 12-14. 1.3.2.- RMN de ca bohid a os. Pag 14-19. 1.3.3.- Modelado molecula de ca bohid a os: mé odos de campos de ue zas. Pag 19-26. 1.4.- OBJETIVOS DE LA TESIS DOCTORAL. Pag 26-27. 1.5.-BIBLIOGRAFIA. Pag 28-32. 2.- ESTUDIOS DE PSEUDODISACÁRIDOS MIMÉTICOS DE IPG. 2.1.- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS. Pag 35-38. 2.2.- METODOLOGÍA Pag 38-42. 2.2.1.- Resonancia Magné ica Nuclea . Pag 38-39. 2.2.2.- Cálculos eó icos de campos de ue zas. Pag 40-42. 2.3.- RESULTADOS Y DISCUSION. Pag 42-75. 2.3.1.- Mo i o es uc u al glucosamina  (1→6) mio-inosi ol. Pag 43-48. 2.3.2.- Mo i o es uc u al glucosamina  (1-6) mio-inosi ol. Pag 48-51. INDICE 2.3.3.- Mo i o es uc u al glucosamina  (1-6) qui o-inosi ol. Pag 52-56. 2.3.4.- Mo i o es uc u al glucosamina  (1-6) qui o-inosi ol. Pag 57-59. 2.3.5.- Mo i o es uc u al hexosamina 16) Pini ol Pag 60-66. 2.3.6.- Mo i o es uc u al hexosamina (16) pini ol. Pag 66-70. 2.3.7.- Modelado Molecula de los g upos Hid oxime ilo. Pag 71-75. 2.4.- CONCLUSIONES. Pag 75-78. 2.5.- BIBLIOGRAFIA. Pag 79-83. 3.- ESTUDIOS ESTRUCTURALES DE POTENCIALES INHIBIDORES DE PKA. 3.1.- DISEÑO RACIONAL DE NUEVOS IPGs. Pag 86-89. 3.2.- METODOLOGÍA Pag 89-91. 3.2.1.- Resonancia Magné ica Nuclea . Pag 89 3.2.2.- Cálculos Teó icos. Pag 89-91 3.3.- RESULTADOS Y DISCUSION. Pag 91-120. 3.3.1.- Pseudodisacá idos os a o. Pag 91-97 3.3.2.- Pseudo isacá idos no os a ados. Pag 97-105 3.3.4.- Pseudo isacá ido di- os a o. Pag 105-116 3.4.- ESTUDIO DE PROTONES HIDROXÍLICOS POR RMN. Pag 120-126. 3.5.- CONCLUSIONES Pag 126-128. 3.6.- BIBLIOGRAFIA. Pag 129-133. 4.- PARTE EXPERIMENTAL 4.1.- RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR. Pag 136-140. 4.2.- CALCULOS TEÓRICOS DE CAMPOS DE FUERZAS. Pag 141-144. APENDICE 1.- Es udio compa a i o de las pa ame izaciones pa a ca bohid a os del campo de ue zas AMBER. Pag 145-146. APENDICE 2.- Valo aciones ácido-base. Pag 147-148. CAPITULO 1 INTRODUCCION. 8│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce Figu a 3. Mecanismo de acción de la insulina. Pa alelamen e, se p oduce la ansducción de la señal que p oduce los e ec os me abólicos a a és una u a di e en e que es á aún menos de inida. Las p o eínas IRSs in e accionan con la enzima os a idilinosi ol 3 quinasa (PI-3K) que a su ez ac i a el anspo e de glucosa al in e io de la célula, po el anspo ado GLUT4. 17 Pa a ello, la PI-3K p oduce la os o ilación de un os a idilinosi ol de memb ana que po e ec o de una os olipasa C (PLC), inc emen a los ni eles de los os a idilinosi oles PI-(3)P, PI-(3,4)-P2 y PI-(3,4,5)-P3. 18 Es os os a idilinosi oles ac i an la p o eína quinasa B (PKB) que es á apa en emen e implicada an o en la es imulación del anspo e de glucosa al in e io de la célula, como en la ac i ación de la glucógeno sin asa (GS). 19 Sin emba go, la u a y mecanismos que igen la es imulación de la sín esis de glucógeno y la lipogénesis pe manecen aún desconocidos. 1.2.2.-LA HIPÓTESIS DEL SEGUNDO MENSAJERO. El concep o de mediado pa a la acción de la insulina ue in oducido po La ne en 1972, 20 que, apoyado en e idencias bioquímicas, p opuso que la in e acción de la insulina con su ecep o da ía luga a la p oducción in acelula de una molécula capaz de p opaga la acción de la misma. RECEPTOR INSULINA GLUCOSA RAS Dominio unión insulina Dominio ansmemb ana Dominio unión ATP Dominio i osina/quinasa ATP ADP P P PI SOS GAP P62 SOS G b2 Shc P P SOS G b2 IRS-1,2,3,4 COMPLEJO RAS PI-3-K Ra -1-quinasa MAP-quinasa-quinasa MAP-quinasa pp90-S6-quinasa PDK1 PKB GSK3 GS PLC IP3+ DAG PI-(3,4)-P2 PI-(3,4,5)-P3 ? GLUT4 PPG1 ? EFECTOS METABÓLICOS EFECTOS MITOGÉNICOS RECEPTOR INSULINA GLUCOSA RAS Dominio unión insulina Dominio ansmemb ana Dominio unión ATP Dominio i osina/quinasa ATP ADP P P PI SOS GAP P62 SOS G b2 Shc P P SOS G b2 IRS-1,2,3,4 COMPLEJO RAS PI-3-K Ra -1-quinasa MAP-quinasa-quinasa MAP-quinasa pp90-S6-quinasa PDK1 PKB GSK3 GS PLC IP3+ DAG PI-(3,4)-P2 PI-(3,4,5)-P3 ? GLUT4 PPG1 ? EFECTOS METABÓLICOS EFECTOS MITOGÉNICOS Capí ulo 1: In oducción 9│ Debido a su escasez, no se ha podido aisla y de e mina la es uc u a exac a de es os mediado es, y sólo ha sido posible p opone unas es uc u as pa ciales que ienen en común el posee un esiduo de inosi ol. La simili ud en e es as es uc u as y los GPIs de anclaje han hecho conside a a los GPI de anclaje como posibles p ecu so es ( ía la acción de os olipasas (GPI-PLC y/o GPI-PLD) de es os mediado es. Es a línea ha sido obje o de nume osos abajos de in es igación ecogidos en un g an núme o de e isiones 21 . La e minología que desc ibe las ca ac e ís icas químicas de los compues os elacionados con es os mediado es es: p GPI, p o eína unida a glicosil os a idil inosi ol y GPI, glicosil os a idil inosi ol, como lípidos in ac os a los cuales es á unida la p o eína anclada o no espec i amen e. IPGp , p o eína unida a inosi ol os oglicano e IPG, inosi ol os oglicano como moléculas solubles en agua de i adas de p GPI y GPI espec i amen e. La hipó esis de los segundos mensaje os consis e básicamen e en que la insulina, as in e acciona con su ecep o , p oduce la ac i ación de una os olipasa (C o D), la cual hid oliza una molécula de GPI libe ando al medio ex acelula un IPG (con o sin os a o espec i amen e), que es capaz de in oduci se al in e io de la célula y, median e la modulación de enzimas cla es, eje ce los e ec os de la ho mona (Figu a 4). La exis encia de un mecanismo de es e ipo no excluye la exis encia simul ánea de o os más ampliamen e admi idos, a los que se ha hecho e e encia en el apa ado an e io . Figu a 4. Hipó esis del segundo mensaje o pa a la acción de la insulina. 10│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce La hipó esis de los segundos mensaje os, explica ía los e ec os de la adminis ación exogénea de IPGs. Es os cons i ui ían una amilia de compues os di e en emen e glicosidados y os o ilados, de alguna mane a análoga a la amilia de los inosi ol os a os (IP, IP2 y IP3) 22 . P esen a un a ac i o indudable en el po encial a amien o de aquellas en e medades elacionadas con la esis encia a la insulina, debido a la posibilidad de accede a sus ancias que mime izan sus e ec os. Sin emba go, el que aun no se conozca la es uc u a exac a de los IPGs libe ados y que no se hayan es ablecido los mecanismos de su inco po ación a la célula son sus p incipales pun os débiles. 1.2.3.-INOSITOLFOSFOGLICANOS COMO SEGUNDOS MENSAJEROS: IPGs TIPO A y TIPO P. Las in es igaciones ealizadas po La ne , 23 Ma o 24 y Rademache , 25 pe mi en clasi ica los IPGs en dos g upos en unción de su es uc u a básica y sus ac i idades biológicas. Los IPG de ipo P es a ían compues os po qui o-inosi ol y galac osamina y se ían capaces de ac i a a la PDHP en e o as os op o ein os a asas elacionadas con el me abolismo de la glucosa y eguladas po al insulina. 26 , 27 Los IPG de ipo A, además de inhibi la PKA, son capaces de es imula la lipogénesis, ac i a la ace ilcoenzima A ca boxilasa y modi ica las ac i idades de la adenila o ciclasa y os odies e asa de AMP cíclico y es a ían cons i uidos po mio-inosi ol, glucosamina, galac osa y os a o. Los IPG ipo A y los GPIs de anclaje ienen una al a simili ud es uc u al lo que ha inducido a p opone que es os IPGs p o ienen de la hid ólisis de GPIs de anclaje median e la acción secuencial de una p o easa y una os olipasa. 28 Po el con a io la es uc u a pa cial de los IPGs ipo P, al p esen a un anillo de qui o-inosi ol y galac osamina, implica ía a un GPI o p GPI p ecu so di e en e. 29 Debido a las di icul ades inhe en es al aislamien o y de e minación es uc u al de es os segundos mensaje os una es a egia al e na i a pa a p o undiza en su ca ac e ización es el es udio de los enzimas cla e de es a u a de ansducción, que en es e caso se ian la PKA y la PDH os a asa. La PKA es la más simple de las p o eínas quinasas y la más comple amen e ca ac e izada 30 . El haloenzima inac i a PKA consis e en 2 subunidades egulado as y 2 ca alí icas que se disocian en espues a de ni eles ele ados de cAMP in acelula . Una desc ipción idimensional de es a subunidad ca alí ica es ob enida cuando la p ime a es uc u a c is alina de una p o eína quinasa ue esuel a como un complejo PKA-inhibido y con Mg+2 y ATP. 31 El conocimien o de allado de las in e acciones en e PKA y los inhibido es sin é icos de ipo IPG o ma án una de las bases en el diseño de á macos basados en la es uc u a de IPGs ( éase capi ulo 3). Capí ulo 1: In oducción 11│ La PDH os a asa, po o a pa e no ha sido c is alizada. Sin emba go clonando su subunidad ca alí ica 32 ha demos ado un 22% de aminoácidos idén icos con la "glycogen syn hase phospha ase” ( os a asa 2C). La es uc u a c is alina de la os a asa 2C ha sido de e minada y su cen o ca alí ico es conside ado como un modelo es uc u al pa a la secuencia ela i a a los dominios de la PDH os a asa. El es udio de las in e acciones especí icas incluyendo la ac i ación de la os a asa 2C po moléculas sin é icas de ipo IPGs, pod ía cons i ui o a de la bases pa a el diseño de á macos de ipo IPG. O as enzimas que pod ían se conside adas como dianas u obje i os con enien es en es as elaciones es uc u a-ac i idad elacionados con los IPGs, incluyen la uc osa 1,6- bis os a asa (FBP) que ep esen a un á maco diana al amen e a ac i o pa a la diabe es de ipo II y cuya es uc u a ha sido esuel a po ayos X 33 . 1.3.- ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE CARBOHIDRATOS. Los ca bohid a os pa icipan ac i amen e en unciones biológicas muy di e sas: ene gé icas (glucosa), es uc u ales (celulosa), inmunológicas y econocimien o celula (an ígenos oligosaca ídicos), cons i uyen el esquele o de los ácidos nucleicos ( ibosa) y es án implicados en p ocesos in ecciosos. G an pa e de es os enómenos es án undamen ados en p ocesos de econocimien o molecula en los que la es uc u a idimensional y disposición espacial de g upos uncionales y á omos juega un papel esencial como ansmiso de in o mación. En es e sen ido es necesa io des aca que los ca bohid a os, po su es uc u a y composición, p opo cionan a la na u aleza una amplia a iedad de códigos, muy supe io po unidad cons i u i a a o os biopolíme os como ácidos nucleicos o p o eínas. Con inuando es a línea de a gumen os se comp ende ácilmen e la ele ancia de los es udios es uc u ales en ca bohid a os. Aunque exis en más mé odos de análisis con o macional de ca bohid a os, sin duda los más pode osos son la espec oscopia de RMN y la c is alog a ía de ayos X, ambas en combinación con écnicas de modelado molecula . 34 La g an di icul ad que p esen a la c is alización de es os compues os ha es ingido la aplicación de los mé odos de di acción de ayos X, al menos en elación a o as biomoléculas. Po el con a io, el es udio de con o mación adop ada en disolución, es abo dada a menudo empleando las écnicas de esonancia magné ica nuclea (RMN). 35 12│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 1.3.1.- CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES DE CARBOHIDRATOS. Los es uc u a idimensional de los ca bohid a os se puede desc ibi , además de po las ca ac e ís icas de i adas de su composición como la con igu ación de los cen os qui ales p opia de cada esiduo, po cie os pa áme os con o macionales especí icos. Pa a la desc ipción de los monóme os que cons i uyen los oligosacá idos es necesa io de e mina la con o mación del ciclo de 6 miemb os que o igina ( o mas de pi anosa). En la mayo ía de los casos las pi anosas p esen an un compo amien o monocon o macional obse ando una de las dos posibles o mas de silla (habi ualmen e la 1C4), aunque es posible encon a excepcionalmen e o as o mas. También es posible encon a anillos de 5 miemb os como la ibosa a pesa de que no sean e modinámicamen e es ables. La desc ipción de la es uc u a de los monosacá idos se comple a ía con la de inición la o ien ación de los g upos exocíclicos. Es os, mayo i a iamen e g upos hid oxilos secunda ios, se p esen an en disposiciones al e nadas siendo más es ables aquellas que gene en edes de enlaces de hid ogeno cíclicos, lo que co esponde a si uaciones clockwise (c) y an iclowise ( ). O HO HO O OH R O HO HO O OH R O HO HO O OH OH R HO g gg g HHH HS HR OH O6 H5 H4 O4 RH HS HR HS HR RH HO OH HS HR O6 H5 H4 O4 HR HO HS O6 H5 H4 O4  Figu a 5. De inición de las es con o maciones al e nadas pa a el g upo hid oxime ilo en D- hexapi anosas. Un caso especial es la con o mación del g upo hid oxime ilo en hexapi anosas de inida po los o áme os del enlace C5-C6 (denominado  O5-C5-C6-O6). El g upo hid oxilo se puede dispone en 3 o ien aciones al e nadas, denominadas gauche-gauche (gg), gauche- ans (g ) y ans-gauche ( g) ( igu a 5). La dis ibución de las poblaciones de es os o áme os depende de una compleja combinación de e ec os, siendo el ac o de e minan e la o ien ación ela i a del sus i uyen e en la posición 4. Una amplia ecopilación de da os expe imen ales indica, que pa a azuca es de la se ie D, las poblaciones ela i as de los o áme os gg:g : g pa a con igu aciones ipo gluco y galac o se encuen an en o no a 60:40:0 y Capí ulo 1: In oducción 13│ 20:60:20, espec i amen e. Sin emba go, es os equilib ios se en modi icados po e ec os de sol a ación. No obs an e el ac o más in luyen e en la con o mación de ca bohid a os es la geome ía del enlace glicosídico, ya que es a de ine la o ien ación ela i a de dos unidades monosaca ídicas consecu i as. Es a geome ía iene de inida po la o ación de dos enlaces: el glicosídico C1-O1, ca ac e izada po la o sión  (H1’-C1’-O1’-Cx) y el aglicónico O1-Cx, de inida po la o sión  (C1’-O1’-Cx-Hx). La es uc u a idimensional de es os compues os depende undamen almen e de la o ación al ededo de es os enlaces, denominados enlaces de o sión glicosídicos. O HO HO OH O OH O OH OH OH HO   1' 1 Figu a 6. Rep esen ación de la es uc u a de un disacá ido. Las ue zas que in e ienen en la es abilización de las con o maciones de los ca bohid a os en disolución, al igual que pa a o as moléculas, son: los enlaces de hid ógeno, las in e acciones es é icas, las ue zas de an de Waals y elec os á icas jun o con o os ac o es, como la sol a ación. 36 Sin emba go, exis en dos impo an es e ec os peculia es de los ca bohid a os y que se deben ene en cuen a en los ca bohid a os y que son los denominados e ec os anomé ico y exo-anomé ico. 37 El e ec o anomé ico, p opues o po Lemieux 38 , se e ie e a la p e e encia que mues a cualquie sus i uyen e elec onega i o en el ca bono 1 de un anillo de pi anosa po una con igu ación axial, en con a de lo que cab ía espe a conside ando c i e ios exclusi amen e es é icos. De la misma na u aleza, el e ec o exo-anomé ico se mani ies a como una p e e encia del enlace exocíclico O1-R po adop a una o ien ación gauche espec o al enlace C1-O5 ( igu a 7). O OOO O O R O OR E ec o exo-anomé ico E ec o endo-anomé ico Dipolos eléc icos Figu a 7. Rep esen ación de los e ec os endo- y exo-anomé ico. 14│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce Pa a jus i ica es os e ec os se han p opues o dos explicaciones al e na i as. Una de ellas conside a a las in e acciones elec os á icas en e los dipolos asociados a los enlaces C-O, p incipales esponsables de es os e ec os: p edominancia del isóme o axial en e al ecua o ial (e ec o anomé ico) y del con ó me o gauche (e ec o exoanomé ico). O a explicación, basada en la eo ía de o bi ales molecula es on e as, a ibuye la es abilización anomé ica a un enómeno de hipe conjugación n, sólo posible en disposiciones an i-pe iplana en e el pa soli a io sob e el oxígeno y el o bi al ipo  ( igu a 8). Es a in e acción supone la ans e encia elec ónica pa cial en e el o bi al n que aloja el pa soli a io de elec ones sob e el á omo de oxígeno y el o bi al an ienlazan e  del enlace C-O adyacen e, como consecuencia del solapamien o a o able en e dichos o bi ales ( igu a 8). Figu a 8. Rep esen ación esquemá ica del o igen elec ónico de los e ec os endo- y exo- anomé ico. Du an e años la con o e sia en e ambas explicaciones no ha podido se cla amen e esuel a. Sin emba go, es udios ecien es 39 han demos ado que es e ipo de in e acciones o bi álicas son más ecuen es y gene ales de lo que se pensaba. Así, se ha podido demos a que la mayo es abilidad de las con o maciones al e nadas del e ano, espec o de las eclipsadas, no esul a, como adicionalmen e ha sido acep ado, de las epulsiones es é icas po el solapamien o de los o bi ales de enlace C-H que iene luga en és as úl imas, sino que es una consecuencia de las in e acciones hipe conjuga i as que se o iginan, en el caso de las con o maciones al e nadas, en e los o bi ales ocupados de baja ene gía C-H y los o bi ales acíos, de mayo ene gía, C-H39, 40 1.3.2.- RMN DE CARBOHIDRATOS. A pesa de su ela i a sencillez, los espec os de RMN de los oligosacá idos p esen an una ele ada complejidad debida a la poca dispe sión que p esen an los p o ones de los anillos. O OO O O O O ROR C5 H1 O C2 C5 O H1 C2 1 2 3 45 1 2 3 451 2 3 45 1 2 3 45 C1 O5 C1 O5 R O5 H1 C2 C1 O R O5 H1 C2 C1 O E ec o endo-anomé ico E ec o exo-anomé ico ** ** ** ** Capí ulo 1: In oducción 15│ Así, la mayo pa e de las señales apa ecen en un ango que oscila en e 4,5 y 3,5 ppm dando luga a ecuen es solapamien os y si uaciones de acoplamien o ue e. A o unadamen e las señales de los p o ones anomé icos apa ecen en el ango de 4,4-5,5 ppm cons i uyendo un buen pun o de pa ida pa a el análisis es uc u al ya que, además, sus alo es de desplazamien o químico an o de 1H como de 13C y de acoplamien o escala pe mi en de e mina la con igu ación anomé ica con ela i a acilidad. 41 , 42 , 43 Pa a aquellas señales localizadas ue a de la egión de mayo solapamien o, Vliegen ha e al. 44 in oduje on la denominación de “g upo- in o mado -es uc u al” (s uc u al- epo e -g oup), o “huella dac ila ”, ya que los desplazamien os químicos de dichas señales dependen ue emen e de la es uc u a del ca bohid a o. Median e es a ap oximación es posible iden i ica azúca es indi iduales, de esiduos, mo i os es uc u ales o azúca es especí icos y composiciones de enlaces glicosídicos po compa ación con bases de da os adecuadas. 45 , 46 , 47 Los mé odos de asignación se basan ecuen emen e en la de e minación de sis ema de spín de cada esiduo median e la combinación de expe imen os de acoplamien o escala homonuclea es como DQF-COSY y TOCSY. En es e pun o ya se hab á ob enido in o mación, al menos pa cial de la con igu ación de los esiduos. Pa a comple a la asignación es necesa io es ablece la conec i idad en e de e minados sis emas de espines. Pa a es a ase gene almen e se emplean expe imen os NOESY capaces de es ablece conec i idades a a és del espacio en e los dis in os esiduos. Sin emba go en el con ex o del análisis de oligosacá idos, se han p opues o o os mé odos basados en acoplamien os escala es a la go alcance 1H-13C o en el e ec o de la glicosilación sob e el desplazamien o químico del ca bono más p óximo. Los desplazamien os químicos de 13C se ob ienen ácilmen e median e los expe imen os HSQC ó HMQC, que además se bene ician de una mayo dispe sión espec al que simpli ica su análisis. Es a mejo a de la dispe sión se puede emplea en combinación con ans e encias homonuclea es pa a sol en a las di icul ades asociadas solapamien os g a es. Así, en combinación con ans e encias TOCSY los expe imen os 2D HSQC-TOCSY 48 , HMQC-TOCSY, 49 han sido ampliamen e u ilizados. Simila men e, los espec os 2D HMQC- NOESY 50 y HSQC-NOESY p opo cionan conec i idades en e la unión glicosídica y pueden se ú iles en casos con solapamien o se e os. Debido a sus ca ac e ís icas espec ales: iempos de elajación ela i amen e la gos y un núme o mode ado de señales algunas de las cuales apa ecen ípicamen e ue a de la zona de solapamien o los análogos monodimensionales de los expe imen os bidimensionales son especialmen e ú iles en ca bohid a os. 51 En es e sen ido es con enien e des aca las en ajas de la implemen ación de esquemas de selec i os median e g adien es de campo magné ico como 16│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce dp gse (Double Pulse Field G adien Spin Echo) 52 que p opo ciona una >g an sensibilidad y limpieza en los espec os sin implica un excesi o aumen o de la complejidad expe imen al. Elucidación es uc u al po RMN: Al menos, son es los pa áme os espec ales que con ienen in o mación es uc u al y son u ilizados en el análisis con o macional de oligosacá idos 53 : el desplazamien o químico, que aunque es muy sensible a la es uc u a del en o no esul a di ícil de in e p e a cuan i a i amen e; 54 las cons an es de acoplamien o ecinales, que se elacionan con ángulos de o sión, median e ecuaciones de ipo Ka plus; 55 y el E ec o Nuclea O e hause 56 que pe mi e ex ae dis ancias in e p o ónicas expe imen ales. Recien emen e, se ha explo ado con éxi o la aplicación de cons an es dipola es esiduales en medios pa cialmen e o ien ados en es udios es uc u ales de oligosacá idos. 57 Cons an es de acoplamien o escala es: Las cons an es de acoplamien o homonuclea es ca ac e izan la disposición ela i a axial ó ecua o ial de los sus i uyen es en un esiduo de pi anosa o u anosa de mane a que es posible de e mina su con igu ación y con o mación. Desde una óp ica es uc u al, conocida la con igu ación del monosacá ido, los alo es de 3JH-H, deben pe mi i de e mina la con o mación o con o maciones p e e en es del anillo de cinco o seis miemb os del esiduo. O o elemen o es uc u al pa a el que son cla e es os acoplamien os es la e aluación de la disposición del g upo hid oxime ilo en e las posibles con o maciones al e nadas (gg/g / g) median e las cons an es 3JH5-H6p oR y 3JH5-H6p oS. Po úl imo, las cons an es de acoplamien o 1H- 13C pueden u iliza se pa a de e mina los ángulos de o sión glicosídicos, en pa icula en e el p o ón anomé ico y el ca bono aglicónico. Sin emba go, la di icul ad que implica su ob ención, p ác icamen e limi ada a mues as iso ópicamen e ma cadas, es inge su u ilización. E ec o Nuclea O e hause (NOE): El E ec o O e hause Nuclea (NOE) es el cambio en la in ensidad ne a de una señal de un de e minado núcleo como consecuencia de una pe u bación de la esonancia de o o núcleo que se encuen a p óximo en el espacio a és e p ime o. Su o igen es á en la edis ibución de poblaciones p oducida como consecuencia de la elajación c uzada dipolo- dipolo en e es os dos núcleos. 58 La impo ancia del NOE en análisis es uc u al y con o macional eside en su dependencia de la dis ancia en e los á omos, y po lo an o, en la in o mación sob e la es uc u a idimensional de las biomoléculas que los con ienen. Al a a se de un enómeno de elajación iene una compleja dependencia del mo imien o molecula lo que di icul a la ex acción di ec a de dis ancias in e p o ónicas. Pa a emplea la in o mación implíci a en el NOE en la de e minación de es uc u as idimensionales, se pueden emplea a ias ap oximaciones. La más sencilla es el análisis Capí ulo 1: In oducción 17│ cuali a i o, pa a el que se asume que la obse ación de NOE implica una dis ancia meno de una dada (3-3,5 A en oligosacá idos), en el que po con on ación del pa ón de NOEs obse ado con posibles es uc u as candida as pe mi e e alua la bondad del modelo empleado pa a el p onós ico de esas es uc u as. La o a posibilidad consis e en ealiza un análisis cuan i a i o de las cons an es de elocidad de elajación c uzada longi udinal  ijNOE, con el in de de i a las dis ancias in e nuclea es co espondien es. 59 Debido a la p opia na u aleza de los oligosacá idos, con escasos NOEs es uc u almen e ele an es, conside able lexibilidad y amaño mode ado, la in o mación expe imen al suele se insu icien e como pa a de ini po sí misma la es uc u a. Po ello se ecu e habi ualmen e a la ob ención de dis ancias expe imen ales muy p ecisas y a combina el análisis con cálculos eó icos. Acoplamien o dipola esidual. La necesidad de mejo a la p ecisión de las es uc u as calculadas po RMN en disolución ha es imulado la búsqueda de nue as es icciones geomé icas, especialmen e a la go alcance. En e es as es necesa io des aca a las cons an es de acoplamien o dipola es esiduales (RDC) que se obse an cuando las moléculas es án pa cialmen e o denadas espec o al campo magné ico de o ma que la magni ud de es e acoplamien o e leja la o ien ación de los núcleos acoplados espec o del campo. Aunque o iginalmen e el mé odo se desa olló pa a p o eínas ha sido ambién aplicado ambién a ca bohid a os: P es ega d e al. 60 Tjand a  Bax 61 . De e minación Expe imen al de Dis ancias in e p o ónicas a pa i del NOE Las in ensidades de un espec o 2D NOESY pa a un iempo de mezcla m (pe iodo de e olución del NOE) es án ep esen adas po la ma iz V( m) según: (0))·· exp(-)( mm VRV  donde R es la ma iz de elajación cons i uida po los elemen os:   i ji ijijijii JJJQ ,1 , ,2,1,0 )(6)(3)(·      )()(6· ,0,2  ijijij JJQ  24│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce puede encon a se es posibles con o maciones al e nadas, se ía necesa io gene a 3N con o maciones di e en es pa a cada pun o del espacio (,), siendo N el núme o de g upos exocíclicos. Es a es a egia exhaus i a esul a á en un iempo compu acional excesi o, siendo aconsejable educi és e conside ando únicamen e las o ien aciones a p io i más es ables como las gg, g , g del g upo hid oxime ilo o las disposiciones clockwise o an iclockwise que maximizan el núme o de enlaces de hid ógeno. Búsqueda con o macional no sis emá icos: mé odos Mon eCa lo. En e los mé odos no sis emá icos, el más ampliamen e u ilizado es el mé odo de Me ópolis Mon e Ca lo (MMC). 65 Esencialmen e consis e en gene a con igu aciones del sis ema de o ma alea o ia, median e la a iación de aquellos g ados de libe ad que se conside en más ele an es pa a la molécula obje o de es udio, y pos e io men e aplica c i e ios ene gé icos pa a acep a o echaza una de e minada con igu ación nue a. Si es e p ocedimien o es aplicado du an e un núme o es adís icamen e signi ica i o de e apas, se gene a un colec i o en el que cada con o mación se epe i á según su ac o de p obabilidad de Bol zmann. Simulaciones de ipo MMC pe mi en la ob ención de p opiedades molecula es p omediadas en colec i o (espacio con igu acional), pe o, si que emos ob ene p opiedades dinámicas del sis ema (espacio de ases) debe emos ecu i a o as écnicas de simulación es adís icas, ales como la dinámica molecula . Dinámica Molecula New oniana (DM): Es e es un mé odo de e minis a, que consis e, básicamen e, en calcula la e olución en in e alos de iempo  de las posiciones y momen os de odas las pa ículas del sis ema conside ado, conociendo an o los alo es iniciales de ellos como la o alidad de las ue zas del sis ema de pa ículas. Pa a ello se aplican las leyes de la dinámica de New on empleando las ue zas que se de e minan a pa i de las unciones ma emá icas que de inen el campo de ue zas. i i im F d d  i i F d dV  El esul ado inal es un conjun o de pun os que desc iben una ayec o ia de e minada sob e el espacio de ase. Los iempos de simulación empleados es án en el o den de decenas de pisosegundos (ps) a a ios nanosegundos (ns), dependiendo del amaño del sis ema es udiado. Exis en di e en es algo i mos pa a lle a a cabo el p oceso de in eg ación de las ecuaciones new onianas en inc emen os ini os de iempo  , siendo los más u ilizados el de Ve le 66 y el de “leap og”. Es os mé odos, además, suelen inco po a algo i mos pa a acoplamien os a Capí ulo 1: In oducción 25│ “baños é micos” o “pis ones” pa a lle a a cabo simulaciones a empe a u a (NTV) o a p esión (NTP) cons an e, espec i amen e. En dinámica molecula , a pa i de las ayec o ias ob enidas, se pueden calcula los p omedios e modinámicos de cualquie p opiedad molecula , A, como p omedios empo ales (hipó esis e gódica): Dinámicas Molecula es de Lange in ó Es ocás icas: En con as e con las dinámicas molecula es New onianas (DM), es án basadas en las ecuaciones de Lange in del mo imien o, ca ac e izándose po que inco po an explíci amen e el con ol de empe a u a y los e ec os amo iguan es del disol en e en la simulación. Es a ap oximación gene a conjun os igu osamen e canónicos (NVT). Los e ec os amo iguan es se conside an imponiendo una ue za iccional al el mo imien o del solu o a a és del disol en e. (F iccional). La empe a u a del sis ema es con olada incluyendo colisiones alea o ias con el disol en e, R( ), en la ecuación básica. Así, la ecuación del mo imien o pa a una pa ícula i puede se esc i a aho a como: En muchas simulaciones de sis emas solu o-disol en e, sob e odo en las egiones lejanas de la molécula de solu o. En e las écnicas que inco po an los e ec os del disol en e sin eque imien o de moléculas de disol en e explíci as, se encuen an las de “po encial de campo p omedio” (PMF) y los modelos de “dinámicas es ocás icas” (SD). Una de las p incipales en ajas de los mé odos es ocás icos es el aho o de iempo compu acional, en e a simulaciones con disol en e explíci o. Po ello son ú iles en aquellos sis emas en los que el p incipal aspec o de a ención es el compo amien o del solu o mien as que el disol en e es de poco in e és. Es e aho o posibili a ealiza simulaciones mucho más la gas. Po ejemplo, Widmalm y Pas o 67 lle a on a cabo dinámicas molecula es y es ocás icas de 1 ns, de una molécula de e ilenglicol en disolución acuosa con el solu o y 259 moléculas de agua. Las simulaciones de dinámica molecula a da on 300 ho as mien as que las dinámicas es ocás icas sólo lle a on 24 minu os. La educción en la du ación de las simulaciones de SD Ecuación de Lange in )(R )( ξ)}({F )( 2 2 d dx x d xd mi i ii i i    M i N i N i pA M A 1 ),( 1 26│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce no solamen e se debe al meno núme o de moléculas p esen es sino ambién al hecho de que pueden se usados iempos de in eg ación mayo es. 1.4.- OBJETIVOS DE LA TESIS DOCTORAL. El pun o débil de la hipó esis del segundo mensaje o es el que a pesa de los es ue zos ealizados aun no se han aislado y ca ac e izado adecuadamen e desde el pun o de is a químico es os segundos mensaje os o IPGs. Nues o labo a o io, den o de una ap oximación encuad ada den o de la química biológica, p e ende con ibui a la elucidación de es as es uc u as. Pa a ello, la in es igación básica ealizada, ha es ado o ien ada a es ablece una química que uncione e icazmen e pa a p epa a pos e io men e lib e ías de compues os de las que pudie an esul a moléculas ac i as. Conc e amen e, los esul ados de los abajos elacionados con el diseño, la sín esis y la ac i idad biológica de IPGs de ipo A, P y GPIs han sido ecogidos en las Tesis doc o ales de Ma ía Flo es, Ja ie López P ados, Julia Bonilla Ca mona, F ancisco Al onso Pé ez y Niels Reicha d . Pa alelamen e, se han e ec uado es udios es uc u ales de los compues os sin e izados con el in de con ibui , conjun amen e con las medidas de ac i idad biológica, a de ini y delimi a los eque imien os es uc u ales de los IPGs. Los esul ados de los es udios es uc u ales se ecogen en es a Tesis, y pa cialmen e en las de Juan Félix Espinosa y F anck Che alie . El p incipal obje i o de la p esen e esis doc o al, ha sido la ealización de un es udio es uc u al de una se ie de compues os sin é icos, po enciales ( igu a 9), mediado es de IPGs de ipo A y P, a a és de espec oscopia de RMN y de cálculos eó icos de campo de ue zas. El abajo ealizado se p esen a en es a Memo ia como se indica a con inuación: En el capí ulo 2 se p esen an los es udios de pseudodisacá idos que con ienen como cicli ol: qui o-inosi ol, mio-inosi ol y de O-me il-qui o-inosi ol. Es os p oduc os ue on diseñados a pa i de la in o mación agmen ada de la es uc u a de los compues os na u ales combinada con los posibles mecanismos p opues os pa a su gene ación de acue do con es a hipó esis. A pa i de los esul ados ob enidos sob e los compues os an e io es y basadas en unos es udios de docking sob e el si io de unión del ATP en la subunidad ca alí ica de la quinasa dependien e de AMP cíclico, ealizados en nues o labo a o io po el D . Félix Cue as, se es ablecie on unas nue as p emisas pa a el diseño acional de po enciales IPGs. Los es udios ealizados sob e los compues os sin e izados bajo es e nue o modelo se p esen an en el capí ulo 3. A des aca el es udio en disolución ealizado 68 sob e un pen asacá ido ( igu a 9) que cons i uye la es uc u a lineal conse ada de los GPIs de anclaje. Capí ulo 1: In oducción 27│ HO HO HO OH O HO O OH NH3 HO OH HO HO HO O O HO O OH NH3 HO O PO O HO HO HO OH O HO O OH NH3 HO OP OOH O HO HO HO OH O HO O OH NH3 HO OH HO HO HO OH O HO O OH NH3 HO OP O OH O O HO O OH NH3OH HO O O HO OH PO -O O HO O OH NH3 OH HO O O HO OH PO -O O HO O OH NH3 OH HO OH HO OH HO OHO O OH NH3OHHO OH HO OHHO + + + + + - + 9 10 - - + + + 13 12 11 15 14 78 O HO HO OH O HO O OH NH3 HO OH 16 + O HO HO OH O HO O OH NH3 HO OH 18 + H3C CH3O HO HO OH O HO O OH NH3 OH 17 + H3C OH O HO HO OH O HO O OH NH3 OH 19 + CH3 OH HO3PO O HO O NH3 OH HO HO OH OH HO HO O HO O NH3 HO3PO HO HO OH OH HO HO O HO3PO O NH3 OH HO HO OH OH HO 25 26 27 O HO HO HO O O HO O NH3 OH HO HO OH OH HO O HO HO HO O OH O HO O NH2 OH HO HO OH OH HO O HO O OH O HO O NH2 OH HO HO OH OH HO HO OH 20 21 22 OPOH OO O HO O O HO O NH3 OH HO HO OH OH HO HO OH 23 O HO O O HO O NH3HO HO OH OH HO HO OH 24 OPOH OOOPOH OO OPOH OO Figu a 9. Es uc u a de los compues os 7-27 modelos de IPGs que se es udia án en la p esen e esis doc o al. 28│ Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 1.5.-BIBLIOGRAFIA. a) Repo s issued by iupac-iub commission on biochemical nomencla u e. Pu e Appl Chem. 1974, 40, (3), 277-331. b) Repo o iupac commission on nomencla u e o o ganic-chemis y and iupac-iub commission on biochemical nomencla u e. Pu e Appl Chem. 1974, 37, (1-2), 283-297. 2 Pos e nak, S. Comp . Rend. Acad. Sci. 1919, 169, 138_140. b). Pos e nak, Th. Chemis y o he Cycli ols_The Cycli ols 1965, He mann, Pa is. c) Billing on, D.C. The Inosi ol Phospha es, VCH Ve lagsgesellscha , Weinheim, 1993. 3 a) Fe guson, M.A.J.; Williams, A.F. Annu Re Biochem. 1988, 57, 285-320 b) Fe guson, M.A.J. Cu . Opin. S uc . Biol. 1991, 1, 522-529. c) Mccon ille, M.J.; Fe guson, M.A.J. Biochem J. 1993, 294, 305-324 d) Fe guson, M.A.J.; Homans, S. W.; Dwek, R.A.; Rademache , T.W. Science. 1988, 239, 4841, 753-759. 4 Ikezawa, H. 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Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 40│ 2.2.2.- CALCULOS TEÓRICOS DE CAMPOS DE FUERZAS. Los análisis con o macionales eó icos de los compues os 7-19, se ealiza on median e cálculos de campos de ue za empleando écnicas de mecánica y dinámica molecula . Es os compues os, además de un esquele o de ipo ca bohid a o, con ienen g upos ca gados, lo supone una di icul ad añadida a es e ipo de análisis. Es as es icciones limi aban la elección del campo de ue zas ya que és e debe ía modela adecuadamen e ca ac e ís icas p opias de los ca bohid a os, 34 al mismo iempo que debe ían es a adecuadamen e pa ame izados los g upos os a o y amonio. Po lo an o, de los campos de ue za accesibles en nues o g upo en el momen o de la ealización de es a ésis: MM2* (modi icación MM2 de 1987),35 MM3* (modi icación MM3 de 1991),36-39 AMBER* (modi icación AMBER de 1984 y 1986),40-43 OPLSA* (modi icación OPLS/A de 1991)44-46 y po úl imo MMFF implemen ados en Mac omodel ( e siones 5.5 y 6.0);47-53 MM2, MM3, MMFF9447-53, AMBER36, 42 y TRIPOS54 incluidos o iginalmen e en Sybyl, y o os adap ados po Imbe y e al. ,55 pa a el análisis con o macional de ca bohid a os, pocos e an alidos en nues o caso. Únicamen e AMBER* p esen aba simul áneamen e pa áme os especí icos de al a calidad pa a ca bohid a os y és e es os ó icos. Po o o lado, el campo de ue zas AMBER (incluyendo pa áme os de Homans) en su adap ación a Insigh II/DISCOVER 94.0, se había empleado p e iamen e en el es udio de las es uc u as 1-32 aunque no es aba disponible en nues o g upo. Dados es os an eceden es se decidió u iliza MACROMODEL con el campo de ue zas AMBER*. Es a implemen ación pe mi ía op a en e dos epa ame izaciones especí icas pa a ca bohid a os: la de Homans de 199056 y la más mode na de S ill e al.40, 57. La p ime a ue gene ada ampliando los pa áme os de Ha e al.58 exis en es pa a monosacá idos, basándose en cálculos ab ini io del dime oxime ano59. La segunda es mucho más mode na (1996), ha sido desa ollada de no o a pa i de cálculos de o bi ales molecula es ab ini io sob e modelos de pi anosas,40, 60, 61 y op imizada pa a el modelo con ínuo de disol en e GB/SA62, 63. En gene al se empleó la e sión de S ill debido a que ue la más p ecisa en un es udio compa a i o p e io (Apéndice 1) p obablemen e po de i a de mé odos de cálculo más so is icados. En cie os casos en los que se conside ó in e esan e, se con as a on los esul ados de es a pa ame ización con la de Homans. Los cálculos de mecánica molecula consis ie on en el es udio sis emá ico del espacio con o macional usando mapas adiabá icos de ipo Ramachand an del enlace glicosídico o median e simulaciones de dinámica molecula examinando esencialmen e el mismo elemen o. Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG 41│ Mapas Adiabá icos Al se el enlace glicosídico el p incipal pun o de lexibilidad de los ca bohid a os y asumiendo que los esiduos que o man pa e de un de e minado enlace glicosídico son ígidos, se puede supone que la geome ía global de los con ó me os de baja ene gía, depende a p incipalmen e de las o aciones en o no a los enlaces glicosídicos (). Po ello, pa a explo a el espacio con o macional accesible de los disacá idos obje o de nues o es udio 7-19, se ealizado una búsqueda sis emá ica al ededo de es os enlaces.64-66 Se han gene ado el colec i o de con ó me os ep esen a i os de odo el espacio con o macional () median e la a iación sis emá ica de dichas o siones, en pequeños inc emen os  sob e el in e alo o al de 360º (mapas ígidos). Pos e io men e, se ob u ie on los mapas elajados po minimización de la ene gía de odos los g ados de libe ad excep o en las o siones di ec o as (). Es os desc iben más ampliamen e la supe icie de ene gía po encial accesible, disminuyendo las ba e as en e mínimos ela i os, y localizando mínimos de ene gía meno es que la/s es uc u a/s de pa ida. Sin emba go, a pesa de la mayo e icacia en la localización de las egiones de mínima ene gía, los mapas no conside an el p oblema de “mínimos múl iples” ( e capi ulo 1), y pa a un pun o dado () del espacio con o macional desc i o po el mapa elajado es posible que se puedan p oduci aún, con o maciones de meno ene gía po o ación de los g upos exocíclicos. Po es o se han cons uido los co espondien es mapas adiabá icos, median e una a iación sis emá ica de odas las posibles combinaciones de o ien aciones de odos los g upos exocíclicos p esen es en los compues os analizados. Si asumimos que cada g upo exocíclico puede encon a se mayo i a iamen e en cada una de las 3 con o maciones “al e nadas”, hab ía que gene a 3N con o maciones di e en es pa a cada pun o del espacio (), siendo N el núme o de g upos exocíclicos. En gene al, se han conside ado los o áme os (gg, g , y g) del g upo hid oxime ilo de la hexosamina y ambién posibles o ien aciones de los g upos os a o y me ilo. En nues o caso, pa a educi el cos e compu acional, se han conside ado solo las disposiciones de los g upos hid oxilos secunda ios que den luga a un mayo núme o de enlaces de hid ógeno, y pa a ello, los OH- secunda ios se o ien an bien en sen ido de las manecillas del eloj (sen ido clockwise) o bien en sen ido con a io (an iclockwise). Se ha empleado es e ipo de ap oximación, po que al a a se de ca bohid a os de un amaño y lexibilidad limi ados, el iempo compu acional no es excesi o y en es e ipo de ap oximaciones cons i uye una de las o mas más e icaces de educi el cos e compu acional, man eniendo la segu idad de que se explo a an las con igu aciones del sis ema de mayo sen ido ísico-químico. Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 42│ Dinámicas Molecula es (DM). Como complemen o al análisis sis emá ico empleando mapas adiabá icos (,), se ealiza on en los casos de los compues os 18-21 simulaciones de dinámica molecula . Es a al e na i a, al pe mi i la ob ención de in o mación adicional ace ca de la dinámica y lexibilidad de los compues os es udiados, esul aba a ac i a en las es uc u as es udiadas en es a esis doc o al. En p ime luga se ealiza on simulaciones de dinámica molecula clásica, NVT in acuo,67, 68 de los compues os 18-21, empleando como es uc u as de pa ida aquellas de mínima ene gía encon adas median e búsqueda sis emá ica. Pe o, sin duda como se desc ibe más adelan e, los mejo es esul ados se ob u ie on empleando dinámicas es ocás icas o de Lange in.69, 70 2.3.- RESULTADOS. El es udio con o macional de los disacá idos 7-19 en disolución se ha lle ado a cabo3 median e una combinación de mé odos expe imen ales de RMN y de cálculos eó icos de campos de ue zas (mecánica y dinámica molecula ). Ambas écnicas han sido comple amen e independien es en su adquisición. Es deci , en la ealización de los cálculos no se han empleado es icciones de i adas de los da os expe imen ales. Du an e el análisis de los esul ados, las desc ipciones eó icas se han empleado pa a in e p e a los esul ados expe imen ales, y ecíp ocamen e, los da os de RMN han sido u ilizados pa a alida los esul ados eó icos. Pa a la p esen ación y discusión de los esul ados que sigue, se han ag upado los pseudodisacá idos 7-19 de acue do con ‘mo i os es uc u ales’ ca ac e ís icos, basándose en la es e eoquímica del enlace glicosídico y en el isóme o de inosi ol que lo compone. Así, la aplicación es os c i e ios p oduce seis mo i os es uc u ales: mo i o es uc u al compues os D-glucosamina  (1→6) D-mio-inosi ol D-glucosamina  (1→6) D-mio-inosi ol D-glucosamina  (1→6) D-qui o-inosi ol D-glucosamina  (1→6) D-qui o-inosi ol D-hexosamina  (1→6) D-pini ol D-hexosamina  (1→6) D-pini ol 9 y 10 11 y 12 13, 14 y 15 16 y 17 18 y 19 20 y 21 Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG 43│ 2.3.1.- Mo i o es uc u al glucosamina  (1→6) mio-inosi ol. O HO O OH NH3 OH HO O O HO OH PO -O O HO O OH NH3 OH HO OH HO OH HO + + 9 10 La asignación comple a de los espec os 1H-RMN y 13C-RMN, de los disacá idos 9 y 10, se mues a en la abla 1. Tabla 1. Desplazamien os químicos de 1H (  (ppm)) y 13C (  (ppm)) y cons an es de acoplamien o 3JH-H (Hz), en D2O, de los compues os 9 y 10 a 25ºC y a 500 MHz. 9 10 9 10  [1H] 3JH-H  [1H] 3JH-H  [13C]  [13C] Glucosamina H-1 5,16 3,67 5,63 3,76 C-1 100,3 95,5 H-2 2,72 3,70/10,25 3,33 3,67/10,66 C-2 55,5 54,6 H-3 3,54 9,70 4,01 9,14/10,69 C-3 74,0 69,8 H-4 3,37 9,62 3,43 10,14/9,22 C-4 70,0 70,3 H-5 3,95 9,55 4,24 2,68/5,75 C-5 72,8 72,3 H-6 3,73 - 3,74 12,51/2,32 C-6 60,7 61,0 H-6’ 3,73 - 3,95 12,55/5,70 Cicli ol H-1 3,67 2,60/9,74 3,56 3,04/9,92 C-1 71,9 70,9 H-2 3,94 2,75/2,80 4,34 2,74/2,74 C-2 72,8 71,4 H-3 3,45 2,80/10,05 4,09 8,72/2,68 C-3 71,3 73,6 H-4 3,57 - 3,99 9,83/9,67 C-4 72,5 76,8 H-5 3,29 9,11 3,55 9,47/9,47 C-5 73,3 75,3 H-6 3,63 8,80 3,68 9,82/9,58 C-6 80,9 72,9 Los alo es en las cons an es de acoplamien o, indican que el anillo de pi anosa de ambos compues os se encuen a en con o mación de silla canónica 4C1. Po el con a io, pa a el anillo de cicli ol del compues o 10 indican una dis o sión p oducida po el anillo de cinco miemb os usionado del os a o cíclico. Las supe icies adiabá icas de los enlaces glicosídicos de 9 y 10 ue on cons uidas a pa i de los co espondien es mapas elajados (36 y 12 espec i amen e), siguiendo la me odología desc i a en el apa ado 2.2. Es os jun o con los mapas de población y la supe posición de las egiones de p oximidad in e p o ónica p edichos pa a los compues os 9 y 10 se mues an en las igu as 2.2 y 2.3. Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 44│ Figu a 2.2. Mapa de ene gía adiába ico (izda) calculado pa a el compues o 9 y supe posición de los NOEs p edichos en el mapa de dis ibución de p obabilidad con o macional (de echa). Los ni eles de con o nos se mues an cada 5KJ mol-1 pa a la ene gía, las dis ancias in e p o ónicas a 2,5 y 3 Å y los de p obabilidad a 10, 5.5 y 1%. Figu a 2.3. Mapa de ene gía adiába ico (izda) calculado pa a el compues o 10 y supe posición de los NOEs p edichos en el mapa de dis ibución de p obabilidad con o macional (de echa). Los ni eles de con o nos se mues an cada 5KJ mol-1 pa a la ene gía, las dis ancias in e p o ónicas a 2,5 y 3 Å y los de p obabilidad a 10, 5.5 y 1%. En ambos casos las supe icies adiabá icas p edicen dos mínimos locales, uno absolu o si uado en la zona cen al del mapa adiabá ico, de ipo syn-, y o o de meno ene gía en la zona an i-±180º)Ambos es án de acue do con la o ien ación p edicha po el e ec o exo-anomé ico. Los mapas de dis ancias in e p o ónicas in e io es a 3Å indican que mien as que el mínimo syn-se encon a ía ca ac e izado po el NOE exclusi o H1’-H6; el mínimo an i-po su pa e lo se ía po los NOEs H1’-H5 y H1’-H1. En los expe imen os NOESY y ROESY egis ados pa a 9 y 10, se ap ecian simul aneamen e los NOEs H1’-H6 y H1’-H5, indicando la coexis encia de ambos mínimos en disolución. El NOE H1’-H1, se pudo obse a en el caso del compues o 10, pe o no en el de 9 debido a solapamien o de señales. La mayo in ensidad del NOE H1’-H6 espec o a H1’-H1 y Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG 45│ H1’-H5 pa a 10 indican una mayo población del mínimo syn-. En el caso de 9 la di e encia de desplazamien o químico en e las señales co espondien es a H1 y H6 es compa able a la cons an e de acoplamien o en e ambos lo que complicó es e análisis. Con el in de de e mina cuali a i amen e cual de los dos NOEs exclusi os e a mayo i a io, se ealizó un expe imen o HMQC-NOESY. Median e es e expe imen o (Figu a 2.4) se pudo sepa a los picos de c uce po su ecuencia de ca bono de e minando sin dudas, la mayo in ensidad del NOE H1’-H6 con espec o a H1’-H1. De es a mane a, al menos cuali a i amen e se puede es ablece que los compues os 9 y 10, p esen an es uc u as muy simila es y sus es uc u as idimensionales, es a ían desc i as po un con ó me o mayo i a io de ipo syn- en ápido in e cambio con un con ó me o an i- mino i a io. Figu a 2.4. Secciones del espec o 2D-HMQC-NOESY ( iempo de mezcla 400 ms) a 500 MHz, 298 K, pa a 9. Pa a cuan i ica las dis ancias in e p o ónicas cla e se ealiza on se ies de expe imen os 1D-NOESY y 1D-ROESY a dis in os iempos de mezcla. Los alo es de las cons an es de elocidad de elajación c uzada y de las dis ancias de i adas de és as se ecogen H-1’ C-6 C-1 H-1’ C-6 C-1 Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 46│ en la abla 2. En el caso de 9 no ue posible el cálculo p eciso de odas las dis ancias in e p o ónicas debido al solapamien o espec al. Las dis ancias expe imen ales se compa a on con las es imadas a pa i de los cálculos de mecánica molecula ( abla 2) con el in de comp oba la calidad de es os. Es as dis ancias eó icas se calcula on como el p omedio < -6> de las dis ancias de odos los con ó me os empleados pa a la cons ucción de los co espondien es mapas adiabá icos ponde adas en la p obabilidad de cada con ó me o ( éase pa e expe imen al). Tan o en el caso de 9 como de 10, se obse a una lige a des iación sis emá ica de las dis ancias eó icas espec o a las expe imen ales. Es a disc epancia iene su o igen en una subes imación de la población del mínimo an i- que p oduce una sob ees ima las dis ancias ca ac e ís icas de la es uc u a syn, H1’-H1 y H1’-H5. Es os esul ados no mejo a on en nues as manos a pesa de epe i los cálculos empleando o os campos de ue za u o os a amien os elec os á icos. Tabla 2. Cons an es de elocidad de elajación c uzada  y dis ancias in e p o ónicas expe imen ales calculadas pa a 9 y 10 en D2O y a 25º C. NOESY ROESY Teó ica Pa eja de P o ones  s-1 d (Å)  s-1 d (Å) d (Å) 9 H1’-H2’ 0,081 0,093 H1’-H6 + H1’-H1 0,112 0,058 H1’-H5 0,014 3,41 0,009 3,23 3,72 10 H1’-H2’ 0,074 0,078 H1’-H5 0,018 3,00 0,076 2,38 4,51 H1’-H6 0,077 2,35 0,189 2,05 2,28 H1’-H1 0,011 3,24 0,010 3,35 3,86 Es a des iación en la es imación de las poblaciones ela i as de los dos con ó me os es á en apa en e con adicción con abajos p e ios sob e 1 y 2 en los que se p edice una población ap eciable del mínimo an i-  en 1.2 Es a di e gencia puede se a ibuida al empleo de o a o ma del campo de ue zas AMBER según su implemen ación en DISCOVER33. Además debido a que en los dos es udios se emplea on écnicas de di e en e sensibilidad (2D- NOESY o 1D-NOESY) pa a la ob ención los da os expe imen ales, no es posible alo a si es a apa en e disc epancia en los esul ados eó icos e leja o no una ealidad demos able. El es udio del P o . Jiménez-Ba be o, a ibuye un papel con o macional cla e a la in e acción elec os á ica de los g upos amonio y os a o.2 Es os g upos se encuen an p óximos en el espacio en el mínimo syn- en el compues o 2 es abilizándolo espec o a la posibilidad ipo an i- que no ue de ec ado. Po el con a io, en el caso de 1 el os a o cíclico no es capaz de p oduci es a es abilización y se obse an las dos con o maciones syn y an i- en equilib io. Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG 47│ En nues o caso, el compo amien o de 9, que ca ece de g upo os a o y po an o no puede es ablece in e acciones con el g upo amonio, es simila a 10, lo que con i ma ía es a explicación. Po o o lado, se pod ía espe a que en el caso de 10 la con igu ación opues a del cicli ol pudie a da luga a una es abilización elec os á ica de la o ma an i. Sin emba go, el es udio de los modelos molecula es co espondien es a los dos mínimos calculados pa a es a se ie e ela, que la dis ancia en e los g upos ca gados no es la adecuada pa a ello. El es ablecimien o de in e acciones elec os á icas implica ía una impo an e des iación de los alo es Φ/Ψ del mínimo. El que no se ap ecie una g an modi icación de las p opo ciones de las dos especies, end ía a señala que es a in e acción elec os á ica no es capaz po si sola, de di igi la con o mación al ededo del enlace glicosídico. Se ían los e ec os es e eoelec ónicos ca ac e ís icos de ca bohid a os (e ec o gauche y exo-anomé ico) los p incipales esponsables de su geome ía, que la in e acción elec os á ica modula ía en un cie o g ado. El solapamien o impide la cuan i icación del NOE exclusi o de la con o mación syn en el caso de 7. Po ello, pa a compa a las poblaciones ela i as de 9 y 10 es necesa io analiza las p opo ciones del NOE exclusi o del con o me o mino i a io H1’-H5 en e ambos compues os. Pa a ello se ha empleado el cocien e con una dis ancia ija, H1’-H2’ / H1’-H5, ( abla 3) que indica que la p opo ción de la con o mación mino i a ia es mayo pa a el compues o con os a o cíclico Tabla 3. P opo ción de NOE pa a 9 y 10, ob enidas a pa i de los da os de  NOE p oceden es de la abla 4. 9 10 H1’-H2’ / H1’-H5 5,8 4,0 Figu a 2.5. Es uc u as de mínima ene gía pa a 9 (supe io ) y 10 (in e io ), en sus con o maciones syn-  (izda) y an i-  (de echa). Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 48│ El análisis de las es uc u as de mínima ene gía de los dos con o me os syn- y an i-  en e 9 y 10 (Figu a 2.5), sugie e la p esencia de in e acciones es abilizan es en 10 debidas al g upo os a o cíclico. Po un lado, el g upo os a o de 10 pod ía pe mi i es ablece se un enlace de hid ógeno en e uno de sus oxígenos y el g upo hid oxilo en posición 6 del esiduo de glucosamina que es abiliza ía la es uc u a syn- espec o a 9. Po o o lado la in e acción elec os á ica amonio os a o lo ha ia pa a la es uc u a an i-. El p edomino de la segunda in e acción explica ía el aumen o de la población del mínimo an i- en 10 con espec o a 9. 2.3.2.- Mo i o es uc u al glucosamina  (1-6) mio-inosi ol. O HO O OH NH3OH HO O O HO OH PO O OHO O OH NH3OHHO OH HO OHHO ++ 11 12 - Los espec os de RMN han sido asignados como se ha indicado en el apa ado an e io . Sus espec os, an o de 1H como de 13C son ca ac e ís icos de un enlace glicosídico  con desplazamien os a campo al o de las señales y acoplamien os JH1-H2 ~ 8Hz. Tabla 4. Desplazamien os químicos de 1H (  (ppm)) y 13C (  (ppm)) y cons an es de acoplamien o 3JH-H (Hz), en D2O, de los compues os 11 y 12 a 25ºC y a 500 MHz. 11 12 11 12  (1H) 3JH-H  (1H) 3JH-H  (13C)  (13C) Glucosamina H-1 4,63 8,3 4,91 8,4 C-1 106,1 100,6 H-2 2,67 8,9 2,96 10,3/10,3 C-2 58,9 56,4 H-3 3,92 9,1 3,61 8,9/9,1 C-3 77,9 43,2 H-4 3,36 9,9 3,44 9,6/9,9 C-4 71,7 69,8 H-5 3,45 2,2/6,0/11,7 3,51 2,9/2,2 C-5 78,4 76,5 H6a/H6b 3,89 2,0 12,3 3,73 5,5/5,4 C-6 62,8 60,7 3,70 6,1/12,3 3,90 12,5/12,5 Cicli ol H-1 3,59 2,8/9,9 3,75 5,3 C-1 71,9 69,8 H-2 4,05 2,8 4,17 4,2/4,7 C-2 74,1 77,3 H-3 3,50 2,8 4,56 8,3/8,3 C-3 73,2 79,4 H-4 3,62 9,6 4,06 10,3/9,2 C-4 74,6 82,3 H-5 3,44 9,4 3,40 9,9/9,9 C-5 76,1 70,5 H-6 3,79 9,6 3,68 9,7 C-6 84,6 71,7 En es e caso pa a el cálculo de los co espondien es mapas adiabá icos y de dis ibución de poblaciones (Figu a 2.6) se conside a on un o al de 12 mapas elajados en el Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG 49│ caso de 11 y 36 pa a 12, lo cual supuso un o al de 7200 y 2400 con ó me os es udiados espec i amen e. Tal y como cabe espe a pa a es uc u as con enlaces glicosídicos de ipo , se obse an es mínimos locales en los mapas elajados, los ya conocidos syn-, an i-, y apa ece el denominado mínimo an i- alo es deenº). En e es as, como cabía espe a la con o mación syn- es la ene gé icamen e a o ecida. Los NOE exclusi os que ca ac e iza ían es os mínimos son el H1’-H6 acompañado po con ac os débiles H1’-H1 pa a el syn-; H1’-H1 y H1’-H5 pa a la o ien ación an i-, mien as que H2’-H6 se ía el NOE exclusi o pa a la con o mación an i-. Figu a 2.6. Mapas de ene gía adiabá icos calculados pa a el compues o 11 (supe io de echa) y 12 (in e io de echa) y supe posición de los NOEs p edichos en los mapas de dis ibución de p obabilidad con o macional (supe io izda pa a 11 e in e io izda pa a 12). Los ni eles de con o nos se mues an cada 5KJ mol-1 pa a la ene gía, las dis ancias in e p o ónicas a 2,5 y 3 Å y los de p obabilidad a 10, 5.5 y 1% pa a ambos compues os. El espec o NOESY de 11 mos ó picos de c uce in ensos en e H1’-H6 y débiles pa a H1’-H1 (Figu a 2.7) indicando el p edominio de es uc u as de ipo syn-. Desa o unadamen e el con ac o exclusi o de la con o mación an i-Ψ (H1’-H5), no puede se cuan i icado di ec amen e debido al solapamien o con el NOE in a- esiduo H1’-H5’. Dado que an o H3’ como H5’ se encuen an a una dis ancia equi alen e de H1’ y expe imen an simila es mo imien os in e nos la compa ación en e las in ensidades de los picos H1’-H3’ y la suma de Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 56│ Figu a 2.11. Es uc u as minimizadas pa a el mo i o es uc u al  (1-6) qui o-inosi ol, submínimo A1(a iba) pa a el compues o 13 (izquie da) y 14 (de echa) y submínimo A2 (abajo) pa a los compues os 15 (izquie da) y 14 (de echa). Figu a 2.12. Red de enlaces de hid ógeno que mues a el compues o 14 únicamen e a a és del submínimo de ipo A1. Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG 57│ 2.3.4.- Mo i o es uc u al glucosamina  (1-6) qui o-inosi ol. HO HO HO OH O HO O OH NH3 HO OP OOH O HO HO HO OH O HO O OH NH3 HO OH + - + 17 16 Los compues os 16 y 17, son los ep esen an es del pa ón es uc u al  (1→6) qui o-inosi ol. Los espec os de 1H-RMN de ambos ue on asignados ( abla 8), aunque en es e caso la escasa can idad de ma e ial disponible impidió el egis o y asignación de los espec os de 13C. Como se obse ó pa a los de i ados  (1→6) qui o-inosi ol, las cons an es de acoplamien o indican que los anillos de los esiduos de glucosamina y cicli ol ienen un compo amien o monocon o macional. Tabla 8. Desplazamien os químicos de 1H (  (ppm)) y 13C (  (ppm)) y cons an es de acoplamien o 3JH-H (Hz), en D2O, de los compues os 16 y 17 a 25ºC y a 500 MHz. 16 17  (1H) 3JH-H  (1H) 3JH-H Glucosamina H-1 4,57 8,2 4,66 8,2 H-2 2,71 9,9 2,77 8,7/10,3 H-3 3,41 9,5 3,45 9,4 H-4 3,37 9,3 3,36 9,4 H-5 3,47 2,3/9,3 3,47 2,2/ 5,5/9,9 H6a/H6b 3,74 2,3/12,3/5,6 3,90 2,2/12,7/5,7 3,92 10,7 3,71 10,4 Cicli ol H-1 4,26 3,6 4,58 3,0/4,2/8,5 H-2 3,77 3,2/9,5 3,68 2,6/9,8 H-3 3,57 9,4 3,62 8,8 H-4 3,62 9,5 3,54 9,4 H-5 3,84 3,3/ 9,7 3,93 10,0 H-6 4,06 3,7 4,19 3,8 Las supe icies de ene gía y mapas de p obabilidad globales de los de i ados de - qui o-inosi ol 16 y 17 calculadas siguiendo el mismo p o ocolo empleado con es o de compues os p esen an un único mínimo syn- a  56±5, 17 (Figu a 2.13). Es a p edicción se encuen a de acue do con el e ec o exo-anomé ico pa a una disposición  pa a la unión glicosídica. En es os mapas se ap ecia cla amen e que aunque la posición del mínimo global es muy simila en ambos casos, la egión accesible del de i ado con os a o 17 es á mucho más es ingida que pa a 16. Al igual que en el caso de los anóme os  de la se ie qui o en los Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 58│ mapas / se ap ecia una conside able disminución de la lexibilidad con espec o a análogos en la se ie mio-inosi ol. Figu a 2.13. Mapas de ene gía adiabá icos calculados pa a el compues o 16 (supe io de echa) y 17 (in e io de echa) y supe posición de los NOEs p edichos en los mapas de dis ibución de p obabilidad con o macional (supe io izda pa a 16 e in e io izda pa a 17). Los ni eles de con o nos se mues an cada 5KJ mol-1 pa a la ene gía, las dis ancias in e p o ónicas a 2,5 y 3 Å y los de p obabilidad a 10, 5.5 y 1% pa a ambos compues os. Expe imen almen e se de ec an dos NOEs glicosídicos in ensos: H1’-H6 y H1’-H1, es e úl imo con meno in ensidad. De acue do con los mapas de dis ancias in e p o ónicas  (Figu a 2.13) es os co esponden a los NOEs exclusi os de la única con o mación p edicha po los cálculos. No se encuen a, incluso a iempos de mezcla la gos, ninguna e idencia de o os NOEs in e glicosídicos como H1’-H4 ó H1’-H2, que se ían ep esen a i os de una hipo é ica si uación an i-. Los esul ados expe imen ales con i man cuali a i amen e las p edicciones eó icas, de iniendo el enlace glicosídico de 16 y 17 como un único mínimo de ipo syn- A pa i de las cons an es de elajación c uzada ( abla 9) se calcula on las dis ancias expe imen ales pa a 17. Desa o unadamen e es o no ue posible pa a 16 debido a la ausencia de un alo iable pa a la cons an e NOE de una dis ancia de e e encia po que H1’-H3’ y H1’-H5’ es án solapadas y H1’-H2’, con aminado po acoplamien o escala . Tampoco se puede conside a como e e encia el p omedio de dis ancias H1’-H3’ y H1’-H5’, pues o que debido a Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG 59│ un acoplamien o escala ue e de H3’ con H4’ se p oduce una pé dida de NOE de H3’ a H4’ po es a ía indi ec a. A pesa de no pode dispone de dis ancias expe imen ales iables la simili ud de los alo es de NOE pa a H1’-H6 y H1’-H1, en e los compues os 16 y 17 pe mi e supone un g an pa ecido de su es uc u a en disolución. Pa a 17 al igual que ocu ió con el mo i o β mio- se obse a una buena conco dancia en e los esul ados expe imen ales y la p edicción, que es mejo en el caso de las dis ancias calculadas sob e el espacio Φ,Ψ comple o que sob e las es uc u as elajadas. Es a obse ación es indica i a de la lexibilidad del enlace glicosídico den o de es e mínimo como p edice el mapa adiabá ico (Figu a 2.13). En es e compues o apa ece ambién un pico de c uce H1’-H4’ o iginado po ue e acoplamien o en e H3’-H4’. Tabla 9. Cons an es de elocidad de elajación c uzada  , y dis ancias in e p o ónicas expe imen ales pa a 16 y 17 calculadas en D2O y a 25ºC. Las dis ancias eó icas es án calculadas sob e de mapas adiabá icos. Exp. Teó ica Teó ica< > Pa P o ones  [s.1] d [Å] d [Å] d [Å] 16 H1’-H3’ + H1’-H5’ ( e e encia solapada) 0,117 H1’-H4’ 0,060 H1’-H6 0,156 2,30 2,30 H1’-H1 0,029 3,77 3,43 H1’-H2’ 0,023 H1’-H3’ ( e e encia) 0,121 17 H1’-H5’ ( e e encia) 0,134 H1’-H6 0,121 2,49 2,36 2,28 H1’-H1 0,023 3,29 3,87 3,47 Figu a 2.14. Es uc u as de mínima ene gía pa a los compues os 16 (izda) y 17 (de echa). Cuando se compa a on las es uc u as elajadas de 16 y 17, ep esen adas en la igu a 2.14, se pudo ap ecia un enlace de hid ógeno es abilizan e en e p o ón del os a o y el oxígeno del anillo de pi anosa O-5 Glc, en 17. Es a in e acción in e - esíduo, ausen e en 16, Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 60│ pod ía explica la meno dispe sión del mínimo syn- pa a 17 que e lejan los cálculos eó icos. 2.3.5.- Mo i o es uc u al hexosamina (16) Pini ol HO HO OH O HO O OH NH3 HO OMe + 18 OH HO HO OH O HO O OH NH3 OH OMe + OH 19 Las azones po las que se diseña on y sin e iza on los compues os 18 a 21, se alejan en cie o modo de la busqueda sis emá ica en la que se basa on los modelos de IPGs de ipo A y de ipo P. Como consecuencia de es e cambio apa ecie on dos nue os componen es, los esiduos de pini ol y de galac osamina. Aunque ambos implican nue as ca ac e ís icas es uc u ales a la ho a de la in e acción con po enciales ecep o es, no debe ian supone una g an al e ación de la geome ía del enlace glicosídico, pues o que las di e encias con inosi ol y glucosamina es án alejadas de él. Po ello, es especialmen e in e esan e de e mina si es os cambios no al e an en esencia la geome ía del esquele o común con espec o a los de i ados de qui o-inosi ol 13 a 17. De se así, median e la compa ación de las ac i idades biológicas, se pod ía deduci la impo ancia ela i a de los g upos en posición 4 de la hexosamina y del pini ol en su unción como IPGs. Coincidiendo con es a modi icación, ambién se decidió amplia los cálculos eó icos incluyendo simulaciones de dinámica molecula pa a complemen a los mapas adiabá icos ya que es as conside an más adecuadamen e la lexibilidad de los pseudodisacá idos. Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG 61│ Empleando la me odología habi ual ue posible ealiza asignación inambigua de los compues os 18 y 19 ( abla 10). Los anillos de pi anosa y pini ol adop a on la espe ada con o mación 4C1 como indican los alo es de las cons an es de acoplamien o. Tabla 10. Desplazamien os químicos de 1H (  (ppm)) y 13C (  (ppm)) y cons an es de acoplamien o 3JH-H (Hz), en D2O, de los compues os 18 y 19 a 25ºC y a 500 MHz. 18 19  (1H) 3JH-H  (1H) 3JH-H Hexosamina H-1 5,07 3,5 5,31 3,85 H-2 2,97 - 3,54 11,2 H-3 3,70 9,4 4,11 3,3 H-4 3,43 10,4 4,02 2,0 H-5 3,99 4,2 4,26 6,5 H6a/H6b 3,77 2,7 3,74 2,5 3,77 - 3,74 - Cicli ol H-1 4,12 3,5 4,16 3,4 H-2 3,74 10,1 3,74 10,0 H-3 3,31 9,4 3,34 9,3 H-4 3,65 10,4 3,68 10,5 H-5 3,85 3,7 3,89 3,5 H-6 4,02 3,8 4,11 3,8 El análisis con o macional de 18 y 19 median e las supe icies de ene gía adiabá icas de los ángulos de o sión glicosídicos empleando AMBER* y el modelo GB/SA p edice, pa a ambos compues os, un único mínimo del ipo sin- con población de ec able (Figu as 2.15). Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 62│ Figu a 2.15. Mapa de ene gía adiába ico (de echa) y mapa de dis ibución de p obabilidad (izquie da), calculados pa a 18 (a iba) y pa a 19 (abajo). El compo amien o de ambos compues os es simila al de los de i ados de qui o- inosi ol con enlaces α 13-15; se dis inguen dos subminimos locales en los mapas adiabá icos de 18 y 19. Po lo an o pa ece que, como cabia espe a , la inclusión del g upo me oxilo en el anillo de inosi ol no a ec a ap eciablemen e a la disposición adop ada po los enlaces glicosídicos. La semejanza en e los mapas de 18 y 19 ambién indicó que la es e eoquímica de la posición 4 de la hexosamina no al e a el compo aminen o del enlace glicosídico, conclusión que po las mismas azones ambién e a p esumible. Los po enciales NOE exclusi os deducidos de los mapas de dis ancias in e p o ónicos son simila es a los de los compues os análogos 13-15: H1’-H6 pa a la con o mación syn-, y H1’-H5, pa a la an i-. El NOE H1’-H1 in e sec a con ambas egiones y po lo an o no se puede emplea con ca ác e de diagnos ico. Expe imen almen e se obse a on pa a 18 y 19 los NOEs en e H1’-H6 y H1’-H1, mien as que en ningún caso se pudo de ec a la p esencia del NOE H1’-H5. Po lo an o, cuali a i amen e se puede conclui que los compues os con el mo i o hexosamina  (1-6) pini ol se p esen an en disolución como un único ipo de con o mación del ipo syn-. -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180  -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180  -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180  -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180  Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG 63│ Simulaciones de dinámica molecula A lo la go de los es udios an e io es se habia obse ado que al conside a odo el espacio Φ/Ψ pa a la es imación de dis ancias eo icas, el ajus e con los da os expe imen ales mejo aba. Es a obse ación indica que es os compues os poseen una lexibilidad ap eciable, incluso aquellos conside ados como semi igidos, al y como co esponde a su na u aleza glucídica. Po es a azón se decidió amplia el es udio eó ico incluyendo simulaciones de dinámica molecula pa a mejo a la desc ipción de la lexibilidad. En el momen o de comenza es e es udio no había an eceden es en el empleo en simulaciones de dinámica molecula de la modi icación de Sende owi z e al. al campo de ue zas AMBER, que había sido seleccionada po sus mejo es esul ados en las simulaciones de mecánica molecula . Po es a azón se decició ealiza o o es udio compa a i o de sus esul ados en simulaciones de dinámica molecula con la al e na i a clásica de Homans. En p ime luga se ealiza on dinámicas molecula es de 2 ns de los compues os 18-21 pa iendo de es uc u as gene adas median e minimización exhaus i a de los mínimos absolu os de e minados a pa i de los mapas adibá icos y empleando condiciones ípicas: acoplamien o a baño é mico de 0,1 ps, =80 y el algo i mo SHAKE71. Los esul ados no ue on en absolu o sa is ac o ios. Se obse ó un ue e amo iguamien o de las oscilaciones de los ángulos de o sión  al a anza la simulación (Figu a 2.16). Figu a 2.16. Valo es del angulo de o sión  y ene gía o al du an e simulaciones de dinámica molecula de 2ns con ε=80 y a 25ºC del 18. 0 500 1000 1500 2000 -180 -120 -60 0 60 120 180  (ps)  0500 1000 1500 2000 400 410 420 430 440 450 460 470 ETOTAL (KE+PE)  (ps) Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 64│ Se pensó que o bien el acoplamien o al baño é mico e a excesi o o que la es uc u a de pa ida no e a es able. Sin emba go, ni la cuidadosa minimización de la geome ía inicial, ni la elajación del acoplamien o al baño é mico (desde 0,1 has a 5 ps), e i a on el e ec o amo iguan e, aunque lo disminuye on. Tampoco se consiguie on simulaciones acep ables ni incluyendo p o ocolos de equilib ación con e apas de calen amien o p og esi o (desde 0ºC has a 25ºC), ni a iando las cons an e dielec ica del medio (desde 1 a 80) 56, 72 pa a modula el peso de las in e acciones elec os á icas. Con el in mejo a el con ol sob e el balance ene gé ico se emplea on dinámicas es ocás icas o de Lange in (SD). Es as incluyen la egulación de la ene gía ciné ica en las ecuaciones básicas de la simulación po lo que p opo cionan, en e o as inno aciones, una mejo a en el compo amien o de la empe a u a du an e la ayec o ia. Las ines abilidades e impe ecciones obse ados an e io men e se e i a on comple amen e al emplea la dinámicas es ocas icas al y como se implemen an en el p og ama Mac omodel. T as es ablece las condiciones óp imas de simulación se p ocedió a calcula las ayec o ias du an e 5 ns de los de i ados 18-19 conside ando dos a amien os elec os á icos (=80, GB/SA) y dos pa ame izaciones (Sende owi z e al/ Homans) di e en es. Los esul ados de las simulaciones (Figu a 2.17), indica on la p esencia de un único mínimo de ipo syn-, en la zona cen al del mapa (, ) no obse ándose in e con e siones hacia egiones de ipo an i- . Es os esul ados, p esen an un acue do cuali a i o con los mapas adiabá icos calculados median e MM (Figu a 2.15). Dados los e o es obse ados en las dinámicas new onianas se u o especial p ecaución en comp oba que en las nue as condiciones el sis ema e a simulado de o ma ealis a. Pa a ello, se epi ie on las simulaciones pa iendo de es uc u as con di e en es o ien aciones del g upo hid oxílo p ima io (gg, g y g) o me ilo en posición 3 del esiduo de inosi ol. En odos los casos se comp obó que as un pe iodo de equilib ación los esul ados e an independien es de la es uc u a de pa ida. Las ayec o ias de los ángulos o sionales  y  ue on simila es, independien emen e de la pa ame ización empleada y de si el ca bohid a o en posición no educ o a, e a glucosamina o galac osamina. Los alo es (, ) p omedio ob enidos as 5 ns de simulación ue on (-41º, -21º) y (-45º, -26º) pa a 18 y (-42º, - 21º) y (-45º, 26º) pa a 19, empleando espec i amen e los pa áme os de Homans y S ille. Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG 65│ Figu a 2.17. Mapas de la dis ibución de los ángulos de o sión glicosídicos du an e simulaciones de 5ns median e dinámica es ocás ica, de los compues os 18 (a iba) y 19 (abajo) empleando las pa ame izaciones de Sende owi z e al (izda) y Homans (de echa), jun o con la supe posición de los NOEs exclusi os pa a la con o mación syn-  (H1’-H6 y H1’-H1). Las dis ancias in e p o ónicas expe imen ales se calcula on a pa i de las elocidades de elajación c uzada ob enidas a su ez del análisis de la elocidad de c ecimien o de los NOEs. En la abla 11 se compa an es as dis ancias con las eó icas calculadas a pa i de las es uc u as elajadas de mecánica molecula (MM) o de los p omedios a lo la go de las simulaciones de dinámica molecula (MD). -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'6 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'1   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'6 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'1   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'6 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'1   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'6 -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180 1'1   Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 72│ mecanocuan icos, semiempí icos o ab ini io, ampoco ep oduce adecuadamen e los esul ados expe imen ales. Du an e la ealización de la p esen e esis doc o al R.Woods demos ó, empleando pa áme os de campo de ue zas de i ados de da os mecanocuan icos36 e incluyendo las in e acciones explíci as con el disol en e, que simulaciones de dinámica molecula , ep oducen co ec amen e la es abilidad ela i a de los o áme os.77 El incon enien e de la ap oximación de Woods es que necesi a de simulaciones ex ao dina iamen e la gas (50 ns, pa a compues os sencillos) po lo que no se deben desca a ap oximaciones menos p ecisas pe o más ápidas. En el momen o de comenza es os abajos no se habia desc i o la iabilidad de la pa ame ización de Sende owi z en es e aspec o, po lo que se decidió e alua sus cualidades en el caso de los compues os 18-21. Figu a 2.22. Mapas del pe il o acional  , pa a los compues os 18-21, con los pa áme os de Sende owi z (izda) y Homans (de echa) y con a amien o elec os á ico de  =80. Pa a ello, en p ime luga se calculó la a iación de la ene gía con el angulo died o  pa a los compues os 18-21 empleando los campos de ue zas de Sende owi z e al. y Homans (Figu a 2.22). Es os pe iles ene gé icos co esponden con las poblaciones a 298 K e lejadas en la abla 14. 060 120 180 240 300 360 0 6 12 18 24 30  E(kJ/Mol) Compues o 17 Compues o 16 Compues o 18 Compues o 19 060 120 180 240 300 360 0 6 12 18 24 30  Compues o 17 Compues o 16 Compues o 18 Compues o 19 E(kJ/Mol) Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG 73│ Tabla 14. Dis ibución de poblaciones de o áme os de los compues os 18-21 du an e dinámicas es ocás icas de 5 ns, ealizadas con idén ica es uc u a de pa ida empleando di e en es pa ame izaciones Ro áme o     Homans Sende . Homans Sende . Homans Sende . Homans Sende . g 60º  60 12 88 6 81 13 92 11 89 g 300º  60 54 9 56 14 50 6 39 7 gg 180º  60 34 3 38 6 37 2 50 4 Como cabia espe a po el ni el de la ap oximación eó ica empleada, ninguna de las dos pa ame izaciones ue capaz de ep oduci la di e encia en el pe il ene gé ico de es a o sión ni pa a con igu aciones gluco ni galac o. Los pa áme os de Homans ue on los que p opo ciona on un mejo ajus e con el compo amien o espe ado pa a es os compues os. Ello se debe a que, aunque es os son los pa áme os más an iguos, se pa ame iza on di ec amen e a los da os expe imen ales po lo que con ienen implíci amen e los e ec os de sol a ación. Po o o lado los pa áme os de Sende owi z es án basados en cálculos ab ini io po lo que se ía necesa io inclui el e ec o del disol en e en los calculos pa a conside a odos los ac o es que in e ienen en la es abilidad de los o áme os. Con el obje o de e alua el e ec o de la aplicación de modelos sencillos de disol en e implíci o se ealiza on simulaciones de dinámica molecula es ocas ica pa a los compues os 18-21, pa iendo de los con ó me os más es ables y empleando ambos campos de ue zas, y en el caso de los pa áme os de Sende owi z dos a amien os al e na i os, =80 y GB/SA, éase abla 15. Tabla 15. P opo ción de o áme os de los compues os con mo i o es uc u al GlcNH2 (1→6) D-qui o-inosi ol, 18 y 19, analizados de las simulaciones de 5ns de dinámicas es ocás icas, con di e en es condiciones; en neg i a la con o mación inicial del hid oxime ilo de las hexosaminas. % gg % g % g 18 Sende .  = 80. gg 9 14 77 Sende .  = 80. g 2 8 90 Sende . GB/SA. gg 8 20 72 Homans  = 80. gg 36 53 11 Homans  = 80. g 22 71 7 19 Sende .  = 80. g 0 19 82 Sende .  = 80. g 0 2 98 Sende . GB/SA. gg 0 21 79 Homans  = 80. g 13 76 11 Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 74│ Del análisis de los compues os con esiduos de glucosamina, (18 y 19) des aca la p eponde ancia de los o áme os g sob e los o os, cuando se u iliza la pa ame ización de Sende owi z e al. y de mane a independien e al a amien o elec os á ico escogido (=80 ó GB/SA). Las simulaciones de Homans ue on ealizadas únicamen e sob e las es uc u as de mínima ene gía p edichas median e los cálculos p e ios de MM y e leja on siemp e un mayo peso de los o áme os g . En los compues os con esiduo de galac osamina 20 y 21, se obse a una endencia simila a la de los análogos de glucosamina: p edominancia de los o áme os g pa a pa ame izaciones de Sende owi z y de los g si se u iliza Homans. Tabla 16. P opo ción de o áme os de los compues os con mo i o es uc u al GalNH2 (1→6) D-qui o- inosi ol, 20 y 21, analizados de las simulaciones de 5ns de dinámicas es ocás icas, con di e en es condiciones; en neg i a la con o mación inicial del hid oxime ilo de las hexosaminas; en el caso de 21 se desc iben los ángulos  del g upo me oxilo de pa ida. % gg % g % g 20 Sende .  = 80. gg 11 5 84 Sende .  = 80. g 0 4 96 Sende . GB/SA. gg 3 13 84  = 80. gg 23 56 21 21 Sende .  = 80. gg +60º 14 12 74 Sende .  = 80. gg -60º 13 6 81 Sende .  = 80. gg 180º 13 6 82 Sende .  = 80. g -60º 0 2 98 Sende .  = 80. g +60º 0 3 97 Sende .  = 80. g 180º 0 5 95 Sende .  = 80. g +60º 5 7 88 Sende .  = 80. g -60º 24 5 71 Sende .  = 80. g 180º 5 3 92 Sende . GB/SA. g 0 3 97 Homans  = 80. gg 20 67 13 La p esencia del o áme o g en galac opi anósidos a eces es explicada como p o enien e de los e ec os del disol en e13a ó in e acciones 1,3-diaxiales14 ( epulsión es é ica y elec ónica en e O4 y O6 deses abiliza ía el o áme o gg). Una in e acción equi alen e en glucopi anósidos ha sido u ilizada pa a explica la pequeña población que ep esen a los o áme os g.78 Como hemos is o a lo la go del p esen e es udio, los pa áme os de Homans son los que mejo se ajus an a los da os expe imen ales, aunque la modi icación de Sende owi z es é pa ame izada en p incipio a un mayo ni el eó ico. Es e esul ado e leja la impo ancia del disol en e en la con o mación de los ca bohid a os ya que los pa áme os de Homans, de po su na u aleza, conside an implíci amen e los e ec os del disol en e. Po an o, la ealización de Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG 75│ u u as simulaciones con es os compues os debe ía inclui moléculas de agua explíci a que a buen segu o mejo a án los esul ados. El compo amien o dinámico de los compues os 18-21, espec o al ángulo o sional  y con pa ame ización de Homans queda debidamen e e lejado en la igu a 24. A lo la go de la ayec o ia se obse an luc uaciones en e los o áme os . Figu a 2.23. Mapas de ayec o ias y dis ibución de poblaciones en % del ángulo  a lo la go de las simulaciones de SD con pa áme os de Homans y ε=80, pa a los compues os 18 (a iba izda), 20 (a iba de echa), 19 (abajo izda) y 21 (abajo de echa). 2.4.- DISCUSIÓN. En es e capí ulo se desc ibe el es udio es uc u al en disolución de los compues os disaca ídicos 9-21, median e la combinación de da os expe imen ales de RMN y cálculos eó icos basados en campos de ue za ealizados sin es icciones expe imen ales explíci as. En gene al el acue do en e ambos mé odos es bueno. Lo que pe mi e, compa aciones cuali a i as, co espondiendo los NOEs exclusi os obse ados con la p edicción del cálculo. Es a co elación es ambién sa is ac o ia cuan i a i amen e pa a los compues os poco lexibles, en los que el mé odo pe mi e de ec a di e encias en de alles su iles como el desplazamien o de la geome ía del mínimo en la se ie 13-17. Sin emba go, en el caso de los compues os más lexibles la e aluación de la di e encia de ene gía en e mínimos ela i os no es an adecuada y se sob ees ima sis emá icamen e la población del con ó me o syn-, sin que a iaciones en el campo de ue zas o condicciones de cálculo empleadas den una solución o almen e sa is ac o ia. En cualquie caso, la disc epancia sólo a ec a a la ene gía ela i a en e ambas 0 1000 2000 3000 4000 5000 -180 -120 -60 0 60 120 180 0 1000 2000 3000 4000 5000 -150 -100 -50 0 50 100 150 0 1000 2000 3000 4000 5000 -180 -120 -60 0 60 120 180 0 1000 2000 3000 4000 5000 -180 -120 -60 0 60 120 180  (ps)  (ps) % poblacion      (ps) -180 -120 -60 0 60 120 180 0 20 40 60  (ps)    % poblacion  -180 -120 -60 0 60 120 180 0 20 40 60 % poblacion -180 -120 -60 0 60 120 180 0 20 40 60 % poblacion -180 -120 -60 0 60 120 180 0 20 40 60 Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 76│ o mas y no a las geome ías p edichas. Po lo an o combinado con da os expe imen ales, pe mi e ealiza análisis compa a i os en e compues os que engan es uc u as simila es. También, se ha ealizado pa alelamen e un análisis de las dos pa ame izaciones del campo de ue zas AMBER* disponibles pa a ca bohid a os en MACROMODEL: Homans y Sende owi z-Pa ish–S ill. En nues as manos, y pa a es os compues os, hemos ap eciado que la segunda, más mode na, mejo a el balance de ene gía en e las con o maciones syn- y an i-Ψ. Po el con a io, en cuan o a la dis ibución de o áme os de los g upos hid oxime ilo la pa ame ización Homans coincide mejo con los da os expe imen ales. Es a disc epancia iene su o igen en la in luencia de los e ec os de sol a ación, no conside ados a es e ni el de cálculo. Po ello, el campo de ue zas más an iguo es, pa adójicamen e, el que mejo es esul ado p opo ciona pues o que ue ajus ado di ec amen e a da os expe imen ales. En cuan o a las es uc u as de es os pseudodisacá idos, el es udio compa a i o de los compues os 9-21 pe mi e es ablece algunas conclusiones gene ales. En p ime luga , es posible dis ingui dos ipos básicos de compo amien o con o macional bien di e enciados a lo la go de la se ie: unos compues os exis en como un único con ó me o syn-Ψ, dis ibuido al ededo de un mínimo más o menos amplio, mien as que o os p esen an una mayo lexibilidad y se encuen an en un equilib io en e dos con ó me os, uno syn-Ψ, mayo i a io, y o o an i- mino i a io. El ipo de cicli ol pa ece se de e minan e en la apa ición de uno u o o compo amien o. Así los de i ados de mio-inosi ol (9-12) son lexibles y p esen an dos es uc u as (syn-an i-, expe imen almen e obse ables a a és de con ac os NOE exclusi os. Tan o los compues os con qui o-inosi ol como pini ol (3-me il-qui o-inosi ol) (13-21) mues an el compo amien o opues o y se encuen an como un único con ó me o syn- Ψ. Es impo an e des aca que es a di isión de compo amien os no pa ece e se al e ada ni po la es e eoquímica  o β, del ca bono anomé ico, o D- o L- del cicli ol, ni po la p esencia de sus i uyen es, ca gados o no. Po ello, pa ece lógico a ibui mayo i a iamen e la causa de al compo amien o a la es e eoquímica axial o ecua o ial del enlace glicosídico espec o al cicli ol. En segundo luga , den o de cada ipo gene al de compo amien o, algunos de alles es uc u ales conc e os pa ecen pode se modulados po la p esencia y disposición de los sus i uyen es ca gados, como se habia hipo e izado en el plan eamien o de es a memo ia. Po ejemplo, la p esencia y es uc u a del g upo os a o en 13-15 es capaz de desplaza la posición del mínimo absolu o, den o de la misma es uc u a gene al. Tambien, como en el caso de 9 y 10 o 11 y 12, puede a ia las p opo ciones de los mínimos syn- y an i-Ψ. Sin emba go, no se han encon ado en ningun caso un e ec o an acusado como el desc i o pa a 2, en el que no se obse a la con o mación an i po que la in e acción os a o-amonio es abiliza la o ma opues a. Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG 77│ Es o se debe p obablemen e a que la opología del enlace glicosídico no pe mi e que en el caso de los compues os es udiados en es e capí ulo el acceso a la geome ía en la que la in e acción amonio- os a o sea óp ima. Po úl imo, se deduce de la compa ación en e compues os con di e encias es uc u ales lejanas al enlace glicosídico (glucosamina en e a galac osamina, o qui o-inosi ol en e a pini ol) que es as no pa ecen a ec a ap eciablemen e a la es uc u a idimensional de es os disacá idos. Figu a 2.24. Supe posición de los esquele os co espondien es a es uc u as de minima ene gia de las con igu aciones glucosamina (1-6) mio-inosi ol (izquie da)  ( ojo) y β (azul) y glucosamina  (1- 6) inosi ol (de echa) mio- ( ojo) y chi o- ( e de). Desde el pun o de is a del es udio de las bases es uc u ales del mecanismo de ac i ación de la insulina ia IPGs es des acable la can idad de di e en es geome ias ela i as de los dos anillos que pueden se gene adas po pequeñas a iaciones es e eoquímicas de sus componen es (Figu a 2.24). En es e con ex o, si se conside a es e disacá ido como el esquele o sob e el que se si uan los g upos ca gados, supues os pun os de unión, da luga a una muy amplia dispe sión de geome ías (Figu a 2.25). Po o o lado, el es udio desc i o en es e capí ulo, desc ibe la a iabilidad de es uc u as y compo amien os dinámicos que p opo cionan los di e en es mo i os químicos conside ados con po encial ac i idad. Es a colección de es uc u as ue esencial pa a ealiza los es udios de docking con PKA, ealizados en nues o g upo de in es igación, que di ie on luga a nue os diseños de po enciales insulinomimé icos (Véase Capí ulo 3). Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 78│ Figu a 2.25. Supe posición de las es uc u as de mínima ene gía de los compues os 10, 12, 14, 16 y 17 que con ienen algun g upo os a o. La supe posición se ha ealizado sob e los á omos pesados del anillo de glucosamina. La igu a mues a la dispe sión de disposiciones ela i as amonio – os a o o iginadas po cambios en la es e eoquímica del esquele o. Capí ulo 2: Es udios de Pseudodisacá idos mimé icos de IPG 79│ 2.4.- BIBLIOGRAFIA. 1 Fe guson, M.A.J.; Homans, S.W.; Dwek, R.A.; Rademache , T.W. Science. 1988, 239, (4841), 753-759. 2 Die ich, H.; Espinosa, J.F.; Chia a, J.L.; Jimenez-Ba be o, J.; Leon, Y.; Va ela-Nie o, I.; Ma o, J.M.; Cano, F.H.; Foces-Foces, C.; Ma in-Lomas, M. Chem-Eu . 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Chem. 1989, 10, (8), 982-1012. 55 Imbe y, A.; Ha dman, K.D.; Ca e , J.P.; Pe ez, S. Glycobiology. 1991, 1, (6), 631-642. Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 88│ O HO HO HO O OH O HO O NH3 OH HO HO OH OH HO OPOH OO 23 24 25 26 27 O HO O OH O HO O NH3 OH HO HO OH OH HO OH O HO HO HO OO HO O NH3 OH HO HO OH OH HO OPOH OO O HO OO HO O NH3 OH HO HO OH OH HO OH OH OH OPOH OO O HO OO HO O NH3 HO HO OH OH HO OH OH OPOH O O O HO O NH3 HO3PO HO OH OH OH HO 20 21 22 HO O HO O NH3 OPO3H HO OH OH OH HO OH O HO3PO O NH3 HO OH OH OH HO OH OH Figu a 3.3. Es uc u as de los disacá idos y isacá idos es udiados en es e capí ulo. Es as conclusiones se aplica on en el diseño de una nue a se ie de pseudodi- y isacá idos, 20, 21, 22, 25, 26 y 27, que con ienen g upos os a o; ambién se sin e iza on p oduc os análogos sin g upos os a o 23 y 24, po mo i os de compa ación ( igu a 3.3).24,29,30 En es e capí ulo de desc ibe el es udio es uc u al en disolución de es os compues os median e RMN y dinámica molecula . El obje o de es e es udio es undamen almen e Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 89│ comp oba que las es uc u as de es os compues os concue dan con las p edichas po y pa a el es udio de docking. Simul aneamen e ambién se p opone analiza la posible in luencia sob e la es uc u a idimensional del GPI de la p esencia de g upos O- os a o en o os esiduos dis in os del inosi ol. 3.2.- METODOLOGÍA 3.2.1.- Resonancia Magné ica Nuclea . Los pseudodisaca idos y pseudo isaca idos 20-27 han sido es udiados en disolución median e espec oscopía de RMN. En p ime luga , la asignación inambigua de sus espec os de 1H y 13C, se ealizó empleando écnicas habi uales pa a oligosacá idos.31-36 Se usa on esencialmen e los siguien es ipos de expe imen os DQF-COSY,37 TOCSY,38 NOESY39 y HSQC40. Pos e io men e se ex aje on es icciones expe imen ales basadas en cons an es de acoplamien o ( o siones) o de dis ancia calculadas a pa i de la elocidad de elajación c uzada (NOE). Debido a que los mé odos son comunes, se emi e al capí ulo 2 pa a una desc ipción más exhaus i a de es as écnicas. En es e capí ulo ambien se explo ó la obse ación de los p o ones hid oxílicos como po encial uen e de nue as es icciones expe imen ales ( éase apa ado 3.4). 3.2.2.- Cálculos Teó icos. La me odología empleada inicialmen e en los es udios de modelado molecula en es e capí ulo ue en gene al simila a la desc i a en el capí ulo an e io . En p ime luga , se es udia on las supe icies de ene gía de los enlaces glicosídicos median e mé odos sis emá icos, calculando los mapas ígidos, elajados y adiabá icos.41 En el caso de los isacá idos, se asumió que no había in e acciones signi ica i as a la go alcance y que, po lo an o, las p opiedades con o macionales de una unión dada son independien es de que o me pa e de di- o i-sacá idos. Po ello, eniendo en cuen a los mapas elabo ados en el capí ulo 2 sólo ue necesa io conside a es disacá idos independien es: Gal-(1→6)-GlcN-1-OMe, Man- (1→6)-GlcN-1-OMe y GlcN-(1→6)-mio-inosi ol ( igu a 3.4). De acue do con la e aluación de los campos de ue za ealizada en el capí ulo an e io se empleó AMBER*42 Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 90│ incluyendo la pa ame ización de S ille,43 y aplicando el mé odo GB/SA44 como modelo con inuo de disol en e. Figu a 3.4. Disacá idos modelos de las uniones glicosídicas de los isacá idos 23-27 empleados en los cálculos de MM. El es udio con o macional se comple ó median e simulaciones de dinámica molecula en las condiciones op imizadas pa a los compues os 7-19 desc i as en capí ulo 2. En es e caso, se decidió aplica sis emá icamen e es a me odología a odos los compues os ya que debe ia p opo ciona una desc ipcion mas ealis a que la busqueda sis emá ica complemen ando sus conclusiones. De acue do con las condicciones de simulacion op imizadas en el capí ulo an e io pa a los de i ados de pini ol 16-19, se emplea on dinámicas molecula es de Lange in45 pa iendo de las es uc u as de mínima ene gía in e idas de los es udios sis emá icos de mecánica molecula . Po úl imo, en un in en o po a anza en la comp ensión de las p opiedades dinámicas de las es uc u as se han e aluado simulaciones de dinámica molecula empleando modelos de disol en e explíci o.46 Modelización molecula con inclusión de agua explíci a. Es e p ocedimien o se basa en la conside ación explíci a de moléculas del disol en e en las simulaciones, de o ma que sol a en a dicho solu o, pe mi iendo calcula las in e acciones solu o-disol en e de mane a más adecuada. Sin emba go iene el incon enien e de gene a asime ías en las in e ases “solu o- acío” que deben se a adas adecuadamen e. Ello se esuel e de o ma sencilla median e la aplicación de condiciones de on e a pe iódicas (PBC; Pe iodic Bounda y Condi ions)47. Las simulaciones se lle a on a cabo a 298 K, con una cons an e de acoplamien o al baño é mico de 0.2 ps, una cons an e dieléc ica de 1, y aplicando una dis ancia de uncado pa a las in e acciones de no-enlace de 9 Å. Con el obje o de ealiza las simulaciones con el mayo igo posible, se calcula on las ca gas a omicas pun uales especi icas pa a las es uc u as Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 91│ simuladas48 y se cuidó el p oceso de sol a ación y equilib ación empleando p o ocolos su icien emen e con as ados.49 3.3.- RESULTADOS. 3.3.1.- PSEUDODISACÁRIDOS FOSFATO. Es udio po RMN de los disacá idos 20-22 ( e igu a 3.3). Los compues os 20-22 han sido asignados ( abla 3.1) median e las écnicas de RMN desc i as en el apa ado de me odología. Tabla 3.1. Desplazamien os químicos de 1H (  (ppm)) y 13C (  (ppm)) en D2O, de los compues os 20, 21 y 22 a 25ºC y a 500 MHz, a alo es de pH de 6.3 pa a 22, 5.5 pa a 21 y 5.6 pa a 20. 20 21 22 20 21 22  (1H)  (1H)  (1H)  (13C)  (13C)  (13C) Glucosamina H-1 5,39 5,40 5,39 C-1 96,6 96,2 96,5 H-2 3,40 3,37 3,36 C-2 54,3 54,3 54,4 H-3 4,36 4,07 3,90 C-3 73,1 69,2 69,4 H-4 3,64 3,98 3,63 C-4 68,9 72,7 68,8 H-5 4,07 4,10 4,14 C-5 71,6 71,3 71,4 H6a/H6b 3,82 3,88 4,11 C-6 59,8 59,8 63,1 3,77 3,73 3,98 mio-inosi ol H-1 3,73 3,71 3,70 C-1 71,6 71,6 71,6 H-2 3,98 3,99 3,99 C-2 72,4 72,4 72,4 H-3 3,50 3,49 3,49 C-3 70,9 70,9 70,9 H-4 3,60 3,61 3,62 C-4 72,6 72,5 72,6 H-5 3,40 3,36 3,35 C-5 72,5 72,6 72,6 H-6 3,69 3,69 3,70 C-6 80,5 80,4 80,6 En el caso de es os compues os (20-22), y a di e encia de lo obse ado pa a los pseudodisacá idos es udiados en el capí ulo 2, los nue os p oduc os p esen a on espec os 1D- 1H con señales muy anchas en un amplio ango de pH. Es o di icul ó la es imación di ec a de las cons an es de acoplamien o 3JH-H y hubo que ecu i pa a su medida a los expe imen os 2D-DQF-COSY. Los alo es de las cons an es de acoplamien o 3JH,H, con i ma on que, como e a p e isible, ambos esiduos se encon aban en una con o mación de ipo silla en los es compues os, conc e amen e del ipo 4C1 pa a el anillo de glucosamina. Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 92│ Pa a el análisis cuali a i o de los da os de RMN pa a los disaca idos 20-22 se empleó el mismo mapa de dis ancias que el calculado pa a los compues os 9-10 (capí ulo 2) que con ienen el mismo esquele o básico. Ello, implica asumi que la p esencia del g upo os a o en posiciones alejadas del enlace glicosídico no debe ía p oduci g andes modi icaciones en la es uc u a de los compues os. La alidez de es a suposición quedó con i mada po las simulaciones de dinámica molecula ealizadas pos e io men e. Po lo an o, y al y como se encon ó pa a los compues os 7 y 8, la p esencia de las con o maciones de ipo syn- queda ía de e minada po la obse ación del NOE H1’-H6, mien as que las disposiciones ipo an i-, lo se ían po los NOEs H1’-H5 y H1’-H1. De nue o, es e úl imo con ac o NOE (H1’-H1) no es exclusi o de la con o mación an i, pues o que solapa pa cialmen e con la egión cen al, asignada a la con o mación syn ( e igu as 2.9 y 2.10). En los expe imen os NOESY de los compues os 20-21 ( igu a 3.5), se obse ó un ue e NOE en e H1’-H6, ca ac e ís ico de disposiciones de ipo syn-. Po o a pa e, ambién se ap eció un NOE débil en e H1’-H5, en es e caso, exclusi o de la con o mación an i- Po úl imo, el NOE en e H1’-H1, sólo pudo de ec a se de mane a inambigua pa a 20 y 21, mien as que en el caso de 22 el solapamien o H1 y H6 no pe mi ió una ca ac e ización indiscu ible. La p esencia simul ánea de NOEs exclusi os de con o maciones di e en es (H1’- H6 y H1’-H5), es incompa ible con la o mulación de un compo amien o monocon o macional, lo que implica la exis encia de un equilib io con o macional. La mayo in ensidad ela i a del NOE exclusi o de la con o mación syn (H1’-H6) espec o a los ca ac e ís icos de la disposición an i (H1’-H5) indica la o ma syn es la mas poblada en dicho equilib io. Es e compo amien o no di ie e cuali a i amen e del p esen ado po los compues os 7 y 8 que poseen el mismo esquele o básico GlcN--mio-inosi ol. Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 93│ Figu a 3.5. NOEs ele an es de la egión anomé ica de expe imen os NOESY pa a 20 (supe io ), 21 (cen al) y 22 (in e io ), a 500 MHz y 298K, en D2O y egis ados con un iempo de mezcla de 500 ms. Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 94│ El análisis cuan i a i o de las dis ancias in e p o ónicas expe imen ales pa ece e leja lige as di e encias con el disacá ido básico 7 ( abla 3.2). La meno dis ancia calculada en e H1’-H5 pa a el caso de 7 y 22, en e a 20 y 21, indica ía una mayo p opo ción de la con o mación an i en el equilib io con o macional pa a los p ime os. Tabla 3.2. Dis ancias in e p o ónicas expe imen ales de e minadas a pa i de NOE pa a los compues os 7, 20, 21 y 22. Compues o Dis ancias In e p o ónicas Dis ancias Expe imen ales 20 H1’-H6 2,3 H1’-H1 3,0 H1’-H5 3,8 21 H1’-H6 2,3 H1’-H1 2,9 H1’-H5 3,7 22 H1’-H6 Solap. H1’-H1 Solap. H1’-H5 3,3 7 H1’-H6 Solap. H1’-H1 Solap. H1’-H5 3,41 Es udio Teó ico de los pseudodisacá idos os a o 20-22. Los es udios eó icos de los pseudodisacá idos os a o 20-22, se ealiza on empleando simulaciones de dinámica molecula de Lange in (dinámicas es ocás icas) y el mé odo GB/SA pa a la simulación del disol en e. Es as condiciones ue on las más adecuadas pa a es uc u as simila es como se ha desc i o en el capí ulo 2. En es e es udio ambién se incluyo el compues o 7 con ines compa a i os. Como pun o de pa ida de es as simulaciones se eligie on las es uc u as elajadas co espondien es a con ó me os de ipo syn- y an i-, cons uidas a pa i de los esul ados de los mapas adiabá icos p e iamen e calculados pa a el compues o 7. Los esul ados ob enidos pa a 7 ( igu a 3.6), no consiguie on ep oduci sa is ac o iamen e los esul ados expe imen ales ya que no se obse a on isi as a egiones an i- du an e la dinámica y és as ue on demos adas expe imen almen e po la obse ación del NOE H1’-H5 (cap. 2). Es e esul ado ue independien e de la geome ía de la es uc u a de pa ida, y se ep odujo an o pa iendo de mínimos syn ó an i, demos ando que en es as condiciones de simulación, el mínimo an i- no e a es able. Es a anomalía es análoga a la in a alo ación del mínimo an i- obse ada en el análisis de las supe icies adiabá icas de ene gía ealizado en el capí ulo 2. Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 95│ Figu a 3.6. T ayec o ias del ángulo  1 y alo es ins an áneos de  ,  du an e las dinámicas es ocás icas (50ns) pa a el compues o 7 pa iendo desde el mínimo syn-  . En el caso de los compues os 20-22, el compo amien o du an e las simulaciones ue di e en e, obse ándose ansiciones espo ádicas hacia egiones an i- an o pa iendo desde es uc u as ipo syn- ( igu a 3.7) como desde an i-(da os no mos ados). Po lo an o, al menos cuali a i amen e, las simulaciones de los de i ados sus i uidos ue on capaces de ep oduci el equilib io con o macional de e minado expe imen almen e. En es e sen ido es in e esan e des aca que es e compo amien o depende cuali a i amen e de la posición del g upo os a o en el esiduo glucosamina ( igu a 3.7 y abla 3.3)). Figu a 3.7. Simulaciones de dinámicas es ocás icas (50ns) pa a el compues o 20 (izda), 21 (cen o) y 22 (de echa), con el campo de ue zas AMBER*, pa ame ización de Sende owi z e al. y mé odo elec os á ico GB/SA, pa iendo desde el mínimo syn-  . En la pa e in e io se mues a las in e con e siones del ángulo  a lo la go de la simulación. -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   0 10000 20000 30000 40000 50000 -180 -120 -60 0 60 120 180   (ps) -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   05000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 -180 -120 -60 0 60 120 180   (ps) -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   04000 8000 12000 16000 20000 24000 28000 32000 36000 40000 -180 -120 -60 0 60 120 180   (ps) 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 -180 -120 -60 0 60 120 180   (ps) -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 96│ Tabla 3.3. P opo ción de con ó me os de ipo syn- / an i-, ob enidos de las simulaciones de SD (50 ns), pa a los compues os 20-22. Compues o SD % syn-  % an i-  20 SD syn-  98,4 1,6 SD an i-  99,1 0,9 21 SD syn-  99,1 0,9 SD an i-  99,7 0,3 22 SD syn-  91,7 8,3 SD an i-  97,3 2,7 El es udio eó ico con inuó con un análisis cuan i a i o de las dis ancias in e p o ónicas signi ica i as calculadas a lo la go de las simulaciones y su compa ación con las de i adas de los da os de RMN. En la abla 3.4 se mues an las dis ancias in e p o ónicas eó icas y expe imen ales pa a los compues os 7, 20-21. Tabla 3.4. P omedios en < -6> y en < -3>2 de las dis ancias in e p o ónicas signi ica i as calculadas a pa i de las simulaciones de SD, y compa ación con las expe imen ales pa a los compues os 20-22, y 7. Compues o Dis ancias In e p o ónicas Exp. SD syn-  < -6> / < -3>2 20 H1’-H6 2,3 2,28/2,30 H1’-H1 3,0 >4 H1’-H5 3,8 3,81/ 3,86 21 H1’-H6 2,3 2,27 / 2,29 H1’-H1 2,9 3,86 / 3,92 H1’-H5 3,7 4,10 / 4,31 22 H1’-H6 Solap. 2,33 /2,37 H1’-H1 Solap. 3,80 /3,88 H1’-H5 3,3 3,41 /3,84 7 H1’-H6 Solap. 2,28/2,31 H1’-H1 Solap. >4 H1’-H5 3,41 3,81/3,86 En gene al, el acue do en e las dis ancias expe imen ales y los p omedios du an e las ayec o ias de las dinámicas molecula es son buenos pa a la dis ancia p omedio más co a (H1’-H6). Que es la que ca ac e iza al mínimo más poblado, syn-. En las dis ancias co espondien es a los NOEs exclusi os de los con ó me os an i- (H1’-H5), se obse a una subes imación de los alo es eó icos que co esponde a la in a alo ación de la con ibución de es as es uc u as ya comen ada. Po lo an o a ibuíble a los campos de ue za usados. La Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 97│ di e encias en las poblaciones del con o me o mino i a io obse adas en las simulaciones de los compues os 7, 20-22, y e lejada en las dis ancias in e p o ónicas calculadas, no pa ecen conco da con los da os expe imen ales, que son simila es ( abla 3.4). Sin emba go, en el caso del compues o 22 y sus i uido en posición 6, pa a el que se p edice una mayo población an i-  se obse ó una dis ancia expe imen al H1’-H5 mas co a. Desa o unadamen e el es o de las dis ancias in e glicosídicas no pudo se es imado y no es posible oma es a obse ación como una conclusión de ini i a. En cualquie caso, e independien emen e de la alo ación de la analogía con los da os expe imen ales, es in e esan e la obse ación de di e encias en la e aluación de los con o me os en unción del pa ón de sus i ución de compues os con el mismo esquele o básico. Mien as que pa a los compues os 7-10 no ha sido posible ep oduci la exis encia de las o mas an i obse adas, en el caso de los análogos os o ilados en el esiduo de glucosamina (20-22) es as es uc u as son es ables du an e las simulaciones de dinámica molecula . Es as conside aciones pa ecen indica que la dis ibución de ca gas en la es uc u a global esul a de e minan e en la e aluación del peso ela i o del mínimo an i en es e ipo de es uc u as desde el pun o de is a de la pa ame ización del campo de ue za AMBER*, Es e aspec o debe á se es udiado más exhaus i amen e con el in de mejo a el compo amien o de es e campo de ue zas. 3.3.2.- PSEUDOTRISACÁRIDOS NO FOSFATADOS. Los es udios es uc u ales de los pseudo isacá idos 23 y 24 ienen el in e és adicional de pe mi i de e mina la posible in luencia de la elongación de la cadena saca ídica en las p opiedades con o macionales de la es uc u a glucosamina-mio-inosi ol. Si es a in luencia no ue a impo an e se ía posible ex ende las conclusiones ob enidas en el capí ulo an e io ace ca del compo amien o de disacá idos hexosamina-inosi ol a o as es uc u as más complejas que con engan es e mo i o, como los GPIs de anclaje. Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 104│ 0 10000 20000 30000 40000 50000 -180 -120 -60 0 60 120 180  (ps)  0 10000 20000 30000 40000 50000 -180 -120 -60 0 60 120 180  (ps)  -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   Figu a 3.13. T ayec o ias del ángulo glicosídico  du an e las simulaciones de SD de 23, con  =80 (izquie da) y GB/SA (de echa). Figu a 3.14. Mapas de dis ibución de alo es  du an e dinámicas es ocás icas de 90 ns pa a 24 en la con o mación de pa ida an i-  , con el modelo sol a ación GB/SA. Las dis ancias in e glicosidicas calculadas a lo la go de las simulaciones e lejan una g an semejanza en e 23 y 24 pa a un mismo ipo de a amien o elec os á ico independien emen e de la es uc u a de pa ida empleada. Se obse a on disc epancias en e los esul ados expe imen ales y las simulaciones con espec o a las dis ancias ca ac e is icas de los con o me os mino i a ios debidas a la subes imación de la población de es os minimos. Po el con a io en las dis ancias exclusi as de los con ó me os ipo syn- el acue do con los esul ados expe imen ales es mejo . Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 105│ Tabla 3.7. Dis ancias in e p o ónicas expe imen ales y eó icas pa a 23 y 24. Pa de P o ones Exp. SD =80 < -6> SD GB/SA < -6> syn- SD GB/SA < -6> an i- 23 H1’-H6 2,1* 2,34 2,29 2,29 H1’-H5 3,1 3,78 3,82 3,80 H1’’-H3’ 3,1 3,22 3,41 3,34 H1’’-H5’ 3,2 3,97 3,77 3,62 H1’’-H4’ 2,7 2,53 2,38 2,39 24 H1’-H6 2,1* 2,34 2,29 2,30 H1’-H5 3,2 4,37 3,82 3,75 H1’’-H3’ 3,3 3,20 3,63 3,73 H1’’-H5’ 3,8 3,83 4,11 4,40 H1’’-H4’ 2,5 2,50 2,30 2,29 * Solapado en los espec os de RMN H1’-H6 con H1’-H1. De es e es udio se puede conclui que el empleo de la me odología GB/SA pe mi e ep oduci cuali a i amen e el compo amien o dinámico de es os compues os en cuan o a la es abilidad de las o mas an i-. Sin emba go la población es os con o me os es subes imada sis emá icamen e, hecho que queda e lejado en los análisis cuan i a i os de dis ancias. 3.3.3.- PSEUDOTRISACÁRIDOS MONO-FOSFATO. Es udios po RMN de los isacá idos 25 y 26. (Ve igu a 3.3). En es e caso, al igual que ocu ió con los pseudodisacá idos 20-22 además de los cambios lógicos en el desplazamien o químico en unción del pH, se ap ecian ensanchamien os acusados de las señales de g upos ce canos a los cen os ionizables a alo es p óximos al pKa pa a 25 y 26 ( igu a 3.15). Es e compo amien o di ie e del de aquellos oligosacá idos en los que el g upo os a o se encon aba en el anillo de inosi ol, pa a los que las señales se desplazaban sin ensanchamien os an acusados. Es a obse ación simplemen e e leja di e en es ciné icas de los equilib ios ácido-base. En cualquie caso, y desde un pun o de is a p ác ico, es e e ec o di icul ó la ealización de los expe imen os al limi a el ango de pH de abajo pa a esol e el solapamien o de señales cla e. La asignación de los compues os 25 y 26 a pH p óximo a 7.0 se ealizó po la me odología 2D habi ual y se mues a en la abla 3.8. Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 106│ Figu a 3.15. Espec os de RMN 1D 1H del compues o 22 en D2O y 25ºC, ealizados en unción del pH. Tabla 3.8. Desplazamien os químicos δ (ppm) de 1H y 13C y alo es de las cons an es de acoplamien o 3JH-H (Hz), pa a los isacá idos 22 y 23 en D2O, a 500 MHz y 298K. 25 26 25 26  (1H) 3JH-H  (1H) 3JH-H  (13C)  (13C) Hexosa (Man ó Gal) H-1 5,17 2,0 5,39 3,9 C-1 101,2 98,4 H-2 3,94 - 3,85 3,8/ 10,4 C-2 70,4 57,0 H-3 3,71 - 3,85 3,3/ 10,5 C-3 70,4 71,9 H-4 3,66 - 4,04 - C-4 66,3 78,2 H-5 3,72 5,5 / 7,0 4,15 - C-5 73,0 72,5 H6a/H6b 4,01 - 3,94 - C-6 64,2 62,3 3,94 3,94 Glucosamina H-1 5,33 3,5 5,40 3,4 C-1 96,4 100,8 H-2 3,28 3,5/10,5 3,34 3,7/ 10,3 C-2 54,7 70,8 H-3 4,03 9,5/ 10,5 4,26 10,4/11,2 C-3 69,9 66,2 H-4 3,70 9,5 3,78 9,8 /10,2 C-4 76,1 73,0 H-5 4,10 3,0/ 10,0 4,24 3,1/10,2 C-5 70,9 71,3 H6a/H6b 3,78 12,5/ 2,5 3,90 - C-6 60,1 71,5 3,73 12,5/ 3,5 3,84 - mio-inosi ol H-1 3,63 - 3,84 C-1 71,8 74,0 H-2 3,91 2,5 3,99 2,5 C-2 72,6 74,8 H-3 3,41 3,0/ 10,0 3,49 2,8/ 10,0 C-3 71,0 73,4 H-4 3,53 9,5 3,61 9,8 C-4 72,8 75,0 H-5 3,27 9,5 3,37 C-5 72,8 75,0 H-6 3,62 - 3,83 C-6 80,6 82,7 Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 107│ Los expe imen os NOESY ( igu as 3.16 y 3.17), indican que el compo amien o con o macional de los compues os 25 y 26 puede desc ibi se en é minos gene ales como un equilib io en e con o maciones syn-/an i- con p edominio de las o mas syn- pa a los dos enlaces glicosídicos. En el caso de la unión GlcN-(1→6)-mio-inosi ol se ap ecia in ensamen e el NOE exclusi o del mínimo syn-, H1’-H6, mien as que los que ca ac e izan las o mas an i- H1’-H1 (lige amen e solapado con H1’-H6) y H1’-H5, son de meno in ensidad. En el caso del compues o 25 el NOE H1’-H5, no se pudo de ec a inequi ocamen e debido a que apa ece solapado con el co espondien e a H1’-H2’. No obs an e la o ma compleja del pico de c uce H1’-H2 que sugie e una con ibución de H1’-H5 y el pico H1’-H1 se puede conside a un a gumen o a a o de la de ección de la o ma an i- La geome ía de la segunda unión glicosídica en e la hexosa co espondien e y la glucosamina queda de inida en ambos compues os po los NOE ca ac e ís icos de las o mas syn- (H1’’-H4’) con mayo in ensidad que los p opios de las o mas an i (H1’’-H3’ jun o a H1’’-H5’). Figu a 3.16. NOEs signi ica i os de 25 a 500 MHz, pH 6,8 y 500 ms de iempo de mezcla; 2D- NOESY (de echa) y 1D-dp gse-NOESY (izquie da). H1+H6 mioIns H5 mioIns+H2 GlcN H6 GlcN H2 Man H5 GlcN H3 GlcN H4 GlcN H1Man H1GlcN H5 mioIns + H2 GlcN H4 GlcN H2 Man H5GlcN H3GlcN Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 108│ Figu a 3.17. NOEs signi ica i os de 26 a 500MHz, pH 9,2 y 500 ms de iempo de mezcla; 2D- NOESY (de echa) y 1D-dp gse-NOESY (izquie da). Los expe imen os NOESY empleados pa a el cálculo de las dis ancias in e p o ónicas de 26, se ealiza on a un pH de 9,2; di e en e del de los expe imen os de asignación pa a e i a el solapamien o de señales cla e. Es e hecho debe se conside ado en el análisis de los esul ados pues o que indica la o ma ácido-base p edominan e es la amino y que es di e en e al amonio sob e la que se han ealizado odos los es udios an e io es. Cálculos eó icos de los isacá idos 25 y 26. OPOH OO 25 26 O HO HO HO OO HO O NH3 OH HO HO OH OH HO OPOH OO O HO OO HO O NH3 OH HO HO OH OH HO OH OH Asumiendo el compo amien o monocon o macional de los monosacá idos ca ac e izado expe imen almen e un análisis con o macional sis emá ico debe ía conside a a Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 109│ los dos enlaces glicosidicos: hexosa-glucosamina y glucosamina-inosi ol y a los g upos exocíclicos, especialmen e al es e os ó ico en la posición 6 del esíduo del e minal no educ o . Al igual que se hizo pa a los isacá idos 23 y 24, no se conside a on ele an es los po enciales e ec os de la go alcance, de mane a que se asumió que las supe icies de ene gía en unción de los ángulos de o sión e an equi alen es en el isacá ido o en el disacá ido. Po lo an o, se analiza on las supe icies de ene gía adiabá icas en unción de los ángulos de o sión pa a 4-O-me il-glucosamina-(1→6)-mio-inosi ol (p e iamen e calculado), 6-O- os a idilmanosa-(1→4)-1-O-me il-glucosamina y 6-O- os a idilgalac osa-(1→4)- 1-O- me il-glucosamina. Los mapas adiabá icos pa a los enlaces manosa-glucosamina y galac osa-glucosamina ( igu as 3.18 y 3.19) se calcula on conside ando los es o áme os posibles de los g upos hid oxime ilo y un único con o me o pa a el g upo os a o 1 empleando AMBER* con la modi icación de Sende owi z e al y el mé odo de sol a ación GB/SA. Figu a 3.18. Mapas de ene gía adiabá ico (izda) y de dis ibución de p obabilidad (de echa) pa a el disacá ido 6- os a o-D-manopi anosil-  (1→4)-[2-amino-2-desoxi]-D-glucopi anósido. 1 Con el in de op imiza el núme o de es uc u as a conside a en el cálculo de los mapas adiabá icos, se ealizó un análisis p é io de la es uc u a hid oxime il os a o en manosa y galac osa pa a desca a aquellos o áme os no p obables. Los esul ados de es e análisis indica on que mien as que son p obables odos los con o me os gg, g y g el ángulo  1 p esen a un único o áme o es able a 60º. -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 110│ Figu a 3.19. Mapas de ene gía adiabá ico (izda) y de dis ibución de p obabilidad (de echa) pa a el disacá ido 6- os a o-D-galac opi anosil-  (1→4)-[2-amino-2-desoxi]-D-glucopi anósido. Los mapas adiabá icos calculados ue on semejan es pa a los dos ipos de enlace. En ambos casos se obse a un mínimo absolu o de ipo syn- a alo es pa a la unión Man-(1→4)-GlcN, compues o 25, igu a 3.18) y a  -36.0,  -18.0 pa a Gal- (1→4)-GlcN, compues o 26, igu a 3.19) jun o con un mínimo ela i o ipo an i- a  -50,  160 y a  -36.0,  180.0 pa a 25 y 26 espec i amen e. Ambos ipos de con o me os ue on de ec ados expe imen almen e po la obse ación de sus co espondien es NOE exclusi os ( igu a 3.16 y 3.17), éase apa ado de RMN, po lo que cuan i a i amene se puede conclui que al igual que 23 y 24 ambién la segunda unión glicosídica p esen a un compo amien o ap eciablemen e lexible consis en e con un equilib io en e una disposición syn, mayo i a ia, y o a an i, mino i a ia. Pa a el análisis de la o a unión disaca ídica, GlcN-(1→6)-mio-inosi ol, se emplea on los mapas adiabá icos ob enidos pa a los compues os 7, 23 y 24. Los da os expe imen ales de RMN con i man cuali a i amen e es as p edicciones obse andose un pa ón de NOEs exclusi os p opio de la p esencia simul ánea de dos con o maciones syn y an i siendo mayo i a ia la p ime a, como en los compues os análogos 7, 23 y 24. El es udio es uc u al de 25 y 26 ue ampliado con el análisis de su compo aminen o dinámico median e simulaciones de dinámica molecula es ocás ica (SD). Es os cálculos se ealiza on de mane a simila a la de los o os isacá idos ya es udiados, 23 y 24, empleando los pa áme os especí icos de Sende owi z e al pa a AMBER* y an o =80 como GB/SA pa a conside a los e ec os del disol en e. Se p epa a on dos es uc u as de pa ida cons uidas a pa i de los mapas adiabá icos, con el obje o de comp oba si en las condiciones de simulación -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 111│ el sis ema alcanzaba el equilib io. Los esul ados ( igu as 3.20 y 3.21), ob enidos pa a las SD indican, en gene al, un acue do azonable con los esul ados expe imen ales y las supe icies ene gé icas calculadas.- Los dos enlaces glicosídicos oscilan p incipalmen e al ededo de mínimos de ipo syn. Los esul ados con e gen independien emen e de la es uc u a de pa ida, syn-2 o an i-2, lo que indica que la du ación de la simulación es su icien e como pa a alcanza el es ado es aciona io. Al emplea el mé odo GB/SA se mejo a el compo amien o de las simulaciones al aumen a las ansiciones hacia egiones an i especialmen e en el caso del enlace glicosídico GlcN-(1→6)-mio-inosi ol. En cualquie caso, como se discu i á mas adelan e la población de es as es uc u as en el equilib io es a in a alo ada. Figu a 3.20. Dis ibución de los angulos de o sión  1,  1,  2 y  2 de 25 du an e dinámicas es ocás icas (60ns), pa iendo de una con o mación syn-  con  =80 (supe io ) y GB/SA (cen o) y de una con o mación an i-  2, GB/SA (in e io ). -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 112│ Figu a 3.21. Dis ibución de los angulos de o sión  1,  1,  2 y  2 de 26 du an e dinámicas es ocás icas (60ns), pa iendo de una con o mación syn-  2  con  =80 (supe io ) y GB/SA (cen o) y de una con o mación an i-  2 y GB/SA (in e io ). El análisis cuan i a i o de las simulaciones empleando las dis ancias in e p o ónicas expe imen ales p esen a en es e caso la di icul ad de la escasez de es iciones de dis ancia debido a los p oblemas encon ados en la ob ención de los da os expe imen ales. Es e p oblema es especialmen e acusado en el caso del isacá ido 25 pa a en que no se puede desc ibi cuan i a i amen e el enlace glucosamina inosi ol. En líneas gene ales, las dis ancias co espondien es a los NOEs exclusi os de las con o maciones mayo i a ias son más co as que pa a los con o me os an i. -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   -180 -120 -60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180   Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 113│ Tabla 3.9. Dis ancias in e p o ónicas eó icas calculadas como p omedios < -6> pa a 25, a pa i de simulaciones de SD, y compa adas con las expe imen ales. Las comillas se e ie en a los esiduos de manosa ó galac osa (‘‘); glucosamina (‘); mio-inosi ol (sin comillas). 25 Exp. RMN SD =80 < -6> SD GB/SA < -6> syn- SD GB/SA < -6> an i- H1’-H6* - 2,34 2,29 2,29 H1’-H5 no 4,35 4,14 4,05 H1’’-H3’ 3,5 3,09 3,07 3,37 H1’’-H5’ 3,4 3,63 3,27 3,97 H1’’-H4’ 2,3 2,54 2,46 2,41 Tabla 3.10. Dis ancias in e p o ónicas eó icas calculadas como p omedios < -6> pa a 26, a pa i de simulaciones de SD, y compa adas con las expe imen ales. Las comillas se e ie en a los esiduos de manosa ó galac osa (‘‘); glucosamina (‘); mio-inosi ol (sin comillas). 26 Exp. RMN SD =80 < -6> SD GB/SA < -6> syn- SD GB/SA < -6> an i- H1’-H6* 2,2 2,35 2,28 2,29 H1’-H5 3,9 4,38 4,18 3,95 H1’’-H3’ - 3,35 3,50 3,37 H1’’-H5’ 3,2 3,65 3,65 2,96 H1’’-H4’ 2,4 2,47 2,32 2,36 * Solapamien o de H1 y H6 de mio-inosi ol. Los esul ados e lejan un acue do azonable en e las dis ancias expe imen ales y las simulaciones pa iendo de es uc u as syn-que es mejo al emplea condicciones GB/SA pa a simula el e ec o del disol en e. En el caso de las uniones GlcN - myoIns se ap ecia en el único caso cuan i icado, compues o 26, una in a alo ación de la población de las o mas an i mino i a ias. Dinámicas Molecula es en agua explíci a. Con el p opósi o de in en a mejo a la desc ipción de las o mas mino i a ias an i-, se decidió ele a el ni el de eo ia de las simulaciones de dinámica molecula con la inclusión de agua explíci a en es os sis emas. El p incipal mo i o de es a decisión ue la sensibilidad demos ada po es os compues os a cambios en los modelos de sol a ación empleados, ya que el empleo explíci o de moléculas de agua supond ía una e aluación más comple a de las in e acciones elec os á icas y enlaces de hid ógeno en e el solu o y el disol en e. En p ime luga ue necesa io e alua las ca gas pun uales pa a es os compues os. Se siguie on los p ocedimien os habi uales,50 y se empleó el mé odo RESP (Res ained Elec oS a ic Po encial i ).24 Pa a ello, p ime o se ealizó el cálculo median e mecánica Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 120│ En es e caso el análisis de las ayec o ias de SD pa iendo de mínimos ipo syn- o an i-  mues an un ap eciable ni el de con e sión con o macional en ambos (Figu a 3.27). La población de las o mas an i ue supe io al 5% pa a ambos enlaces cualquie a que uese la es uc u a de pa ida. Las dis ancias in e p o ónicas eó icas ( abla 2.13), calculadas como p omedio en < 6> a lo la go de dinámicas es ocás icas e lejan un buen acue do con las expe imen ales. Tabla 3.12. Dis ancias in e p o ónicas eó icas calculadas como p omedios < > pa a 27, a pa i de simulaciones de SD, y compa adas con las expe imen ales. Las comillas se e ie en a los esiduos de manosa ó galac osa (‘‘); glucosamina (‘); mio-inosi ol (sin comillas). * Solapamien o de H1 y H6 de mio-inosi ol. Des aca de los da os calculados a pa i de las simulaciones de SD el excelen e ajus e pa a las dis ancias co espondien es a la unión Gal-(1→4)-GlcN, incluso pa a aquellas que ca ac e izan al mínimo an i-. Desa o unadamen e no se pudo calcula expe imen almen e la dis ancia H1’-H5 pa a la unión GlcN-(1→6)-mio-inosi ol, pa a pode ealiza una compa ación simila . 3.4.- ESTUDIO DE PROTONES HIDROXÍLICOS POR RMN. Un ac o de e minan e de la p ecisión con la que es posible de ini es uc u as idimensionales basadas en RMN es el núme o de es icciones expe imen ales signi ica i as accesibles.53 Es a es la p incipal causa de la di e encia en la de inición de es uc u as ob enidas median e RMN pa a p o einas, con un g an núme o de NOEs, en e a las de ca bohid a os, peo de inidas. En el caso de ca bohid a os, debido a su p opia na u aleza, sólo es posible obse a un núme o limi ado de NOEs es uc u almen e ele an es en disoluciones de 2H2O. Como consecuencia de es e incon enien e, la p ecisión y esolución con la que es posible ealiza la de e minación es uc u al de ca bohid a os ha sido menos sa is ac o ia que en el caso de o as biomoleculas. Es e hecho ha es imulado la búsqueda de me odos al e na i os de ob ención de es icciones complemen a ias al NOE, como son las cons an es de acoplamien o escala o dipola esidual.54 O a es a egia se ha basado en amplia el conjun o de es icciones de i adas de NOEs a los p o ones hid oxílicos pa a ob ene más es icciones signi ica i as. 27 Exp. SD < -6> syn- SD < -6> an i- H1’-H6* 2,2* 2,35 2,30 H1’-H5 Solap. 3,83 3,77 H1’-H1 3,7 3,30 3,92 H1’’-H3’ 3,4 3,33 3,13 H1’’-H5’ 3,1 3,31 3,08 H1’’-H4’ 2,5 2,39 2,43 Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 121│ Así la es udio de los p o ones hid oxílicos ha sido empleado pa a ob ene in o mación es uc u al en é minos de es e eoquímica55, dis ancias in e p o ónicas56,57, enlaces de hid ógeno58, e c. Requisi os pa a la obse ación de los hid oxilos en agua: El p ime equisi o es ob iamen e ealiza los expe imen os en H2O pa a e i a el in e cambio de los p o ones lábiles con los deu e ones del disol en e habi ualmen e empleado. En es as condiciones es necesa io obse a las señales del solu o (~1mM) en p esencia de las de H2O (~50M). Es a elación sob epasa el ango dinámico de los ADCs empleados en RMN, lo que implica usa algun ipo de sup esión de señal del disol en e pa a obse a las del solu o, como po ejemplo, p esa u ación59, Jump-Re u n60, NOHOSS61, 1-1 Echo62, Spin-Lock63 o empleando g adien es de campo, wa e ga e64 o exci a ion sculp ing65. Po o o lado, el esquema empleado pa a elimina la señal debe se más ápido que la elocidad de in e cambio en e los p o ones lábiles y el disol en e pa a e i a des ui las señales de in e és. Es e es el incon enien e de la p esa u ación, que es el mé odo más común pa a sup imi la señal del disol en e. Du an e el p oceso de sa u ación los p o ones lábiles se in e cambian con los del disol en e magné icamen e inac i os, p oduciendo la pe dida de las señales de in e és. El módulo Wa e ga e (Wa e Sup esion by G adien Tailo ed Exci a ion), u iliza una combinación de pulsos de adio ecuencia selec i os y pulsos de g adien es pa a consegui una sup esión de agua del ango necesa io (104-105) y es su icien emen e ápido como pa a pe mi i la obse ación de señales con elocidades de in e cambio ela i amen e al as. Además, es sencillo de adap a a la mayo ia de expe imen os de RMN. Es as ca ac e ís icas le han con e ido en la écnica de elección pa a la sup esión de disol en es cuando se desea obse a señales de p o ones in e cambiables con el agua.66 Los p o ones hid oxílicos ienen elocidades in ínsecas de in e cambio con el agua mucho mayo es que o os p o ones in e cambiables, como los p o ones de amida de las p o einas. Po ello la obse ación de las señales de los g upos hid oxilo de ca bohid a os es mucho más di ícil. Su éxi o depende en g an medida de la disminución de la ciné ica del in e cambio en la mues a. Pa a ello se disminuye la empe a u a lo máximo posible, incluso empleando mezclas c ioscópicas como H2O / Ace ona o Me anol 9:1 que congela en e -10 a - 15º C67 o DMSOd6: H2O 1:3 ( / ) que congela a – 62º C68 o mé odos de agua supe en iada.69 Como el mecanismo de in e cambio p esen a un mecanismo de ca álisis acido-base gene al, ambien es de i al impo ancia el ajus e del pH de la mues a en o no a la neu alidad con el in de minimiza es e in e cambio.70 Finalmen e, es igualmen e impo an e limi a la p esencia de azas ionicas que de la misma mane a ac uan como ca alizado es del p oceso.71 Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 122│ Resul ado con los pseudooligosacá idos 25 y 26. Con el in de op imiza las condicciones expe imen ales, p epa ación de la mues a, op imización de las secuencias de pulsos, e c, se eligió como compues o modelo la saca osa que ha sido ecuen e obje o de es e ipo de es udios . Figu a 3.28. Espec os de RMN pa a una mues a de saca osa en H2O/(CD3)2CO, en p opo ción 85% / 15%, 20mM ealizado a -7ºC y pH 6.75; en la pa e supe io se mues a el espec o de TOCSY, a  m de 40ms, en la in e io el espec o 1D 1H ambos con módulo WATERGATE. Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 123│ Los expe imen os se ealiza on con una mues a de saca osa y u ilizando condiciones es ablecidas po es udios p eceden es:pH p óximo a la neu alidad (6,75), empe a u as po debajo de -7ºC empleando una mezcla agua y ace ona y el módulo de sup esión de agua ipo Wa e ga e, con el en de pulsos 3-9-19. Los esul ados ue on buenos pudiendo ealiza expe imen os bidimensionales (TOCSY y NOESY) y ue posible ealiza una comple a asignación de las esonancias de los hid oxilos ( igu a 3.28). También se pudo es ablece que la in luencia de la concen ación es ap eciable aunque no ascenden al ealizando los expe imen os a concen aciones en e 2 y 20mM. A con inuación ealizamos los expe imen os pa a de ec a los hid oxilos de los isacá idos 25 y 26. Después de a ios ensayos se de e mino que en nues o caso, la mezcla de disol en es op ima ué agua / ace ona 85:15, lo que pe mi ió alcanza empe a u as de -17ºC pa a una concen ación de azúca del o den de 10mM. En p ime luga , se ealizo una e aluación de allada de la in luencia del pH en las señales de los hid oxilos (Figu a 3.29). Tal y como se espe aba, los pH p óximos a la neu alidad, son los más ap opiados pa a la obse ación de es as señales, siendo los op imos: 7,17 pa a 25 y de 7,12 pa a 26. A alo es po debajo de pH 5,0 y po encima de 8,0 se obse a un ensanchamien o no able de las señales, como consecuencia de la acele ación de p ocesos de in e cambio químico. O o de los ac o es que in luye en el aspec o de los espec os, conc e amen e en la o ma de los p o ones lábiles in e cambiables, es la empe a u a. Po un lado su disminución a o ece la obse ación de las señales al disminui la elocidad del in e cambio químico con el agua, po o o su in luencia en la mo ilidad del solu o y iscosidad del disol en e a empe a u as p óximas a la congelación p oduce un ensanchamien o gene alizado de las señales. Aunque se había desc i o la u ilización de esinas de in e cambio iónico72,71e pa a elimina posibles azas de las impu ezas iónicas que ca alizan el in e cambio, en nues o caso debido a la p esencia de g upos ca gados os a o y amino en los pseudo isaca idos 25 y 26 es o no ue posible. Po ello, se e ec uó la pu i icación p e ia empleando c oma og a ía en ase e e sa. Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 124│ Figu a 3.29. Espec os de RMN pa a una mues a de 25 (izda) en H2O/(CD3)2CO, en p opo ción 85%:15%, ealizado a -7ºC y 500 MHz y a iando el pH pa a obse a el ango óp imo de obse ación de las señales de hid oxilo (desapan alladas) y de 26 (d cha)con a iaciones de la empe a u a desde 273K (in e io ) has a 262 K(supe io ) pa a un pH óp imo ijo de 7,12. Finalmen e, las condiciones op imas encon adas pa a la de p epa ación de las mues as ue on: el empleo de agua y ace ona (85:15) como disol en e, a pH de 7,17 pa a 22 y de 7,12 pa a 23 y una empe a u a en e 0ºC has a –15ºC. La asignación de las señales de los p o ones hid oxílicos se ealizó median e expe imen os TOCSY ealizados a di e en es iempos de mezcla (15-60 ms) y expe imen os NOESY y ROESY odos ellos empleando el módulo wa e ga e ( igu a 3.30). Se pudie on de ec a e iden i ica las señales co espondien es al esiduo del cicli ol (mio-inosi ol), no iden i icándose las co epondien es a los o os anillos de pi anosa ( e igu a 3.31). La señal más desapan allada y es echa del espec o se co esponde con los p o ones del g upo amino, en posición 2 de los esiduos de glucosa. Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 125│ Figu a 3.30. Espec os TOCSY con módulo WATERGATE a  m de 40 ms pa a una mues a de 26 en H2O/ (CD3)2CO, a -11ºC y 500MHz y ealizados a pH óp imo de 7,17. Figu a 3.31. Ampliación de los espec os TOCSY con módulo WATERGATE a  m de 15 ms (cen o) y 40 ms (abajo) pa a una mues a de 25 (izda) y 26 (de echa) en H2O/ (CD3)2CO, a -11ºC y 500MHz y ealizados a sus pH óp imos. El diag ama supe io de echo mues a una ampliación del 2D- NOESY pa a 26 con WATERGATE a 300 ms. En cualquie caso y a pesa de habe conseguido obse a y asigna las señales de algunos hid oxilos, no se pudo ex ae in o mación es uc u alemen e ele an e como cons an es de acoplamien o o NOEs in e glicosidicos. En nues as manos y pa a es os compues os no ue posible educi su icien emen e las elocidades de in e cambio con el disol en e y las señales obse adas e an aun demasiado anchas como pa a pode medi las Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 126│ cons an es de acoplamien o. El mismo in e cambio quimico domina los expe imen os NOESY y ROESY de o ma al que no pe mi e ob ene picos NOE de alo es uc u al debido a que las ans e encias secuenciales gene an un al o núme o de pe mu aciones. Una posible explicación pa a la di e encia de compo amien o de 25 y 26 con la saca osa empleando el mismo sis ema, equipo y labo a o io, pod ia esidi en la in luencia de los g upos ionizados p esen es en los pseudo isaca idos como au oca alizado es de los p ocesos de in e cambio con el disol en e. Como consecuencia de los es os esul ados se decidió no con inua el es udio con el es o de los compues os. 3.5.- DISCUSIÓN Se ha lle ado a cabo el es udio es uc u al en disolución de las es uc u as pseudodisaca ídicas 20-22, y pseudo isaca ídicas 23-27, median e la combinación de RMN y mé odos de cálculo eó icos: MM y dinámicas molecula es es ocás icas. Los es udios se han ealizado con el campo de ue zas AMBER* y pa ame izaciones de Sende owi z-Pa ish–S ill, de mane a simila a la p esen ada en el capí ulo 2 de es a esis doc o al. Respec o a los compues os 20-22, ca ac e izados po posee g upos os a o en los anillos de GlcN, se ha comp obado expe imen almen e (a a és de NOEs exclusi os) que exis en en disolución como un equilib io en e dos con ó me os: uno mayo i a io syn-, y o o mino i a io del ipo an i-. Con el obje o de pode ealiza un es udio compa a i o del e ec o de la sus i ución del g upo os a o, en las simulaciones eó icas se ealizó la compa ación con el compues o base 7 (que no posee g upo os a o). Las ayec o ias de las dinámicas es ocás icas (SD) de los compues os 20-22, isi a on las egiones an i-mien as es o no sucedió pa a 7. La compa ación en e las dis ancias p omedio a lo la go de las ayec o ias y las expe imen ales, ue on buenos pa a la dis ancia que ca ac e iza al mínimo más poblado syn-, mien as que las co espondien es a la con ibución de con ó me os an i-, ue on en gene al, sob ees imadas en odos los casos. El es udio de los pseudo isacá idos 23-27 equi ió analiza sepa adamen e las dos uniones glicosídicas, a sabe , Hexosa-(1→4)-GlcN y GlcN-(1→6)-mio-inosi ol. Con espec o al enlace GlcN-(1→6)-mio-inosi ol pa a 23, 24, 25, 26 y 27, la obse ación simul ánea de NOE exclusi os de las con o maciones syn-yan i-, incompa ibles en e sí, indicó que pa a es e enlace debe exis i un equilib io con o macional en e ambas si uaciones. La mayo in ensidad de los mínimos syn-, en e a los an i-nos señala la meno dis ancia de los p ime os. Respec o al o o enlace glicosídico, hexosa-(1→4)-GlcN, ocu e algo Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 127│ simila ; odos los compues os p esen an un equilib io con o macional en e un mínimo an i- mino i a io y o o syn- mayo i a io. Los mapas de ene gía adiabá icos y mapas de dis ibución de p obabilidad con o macional calculados concue dan acep ablemen e con las dis ancias expe imen ales pa a la unión Hexosa-(1→4)-GlcN de los compues os 23-27. Así se p edicen los mínimos syn- y los an i- que an es habían sido de ec ados expe imen almen e po RMN, alidando es a me odología empleada. Respec o a la unión GlcN-(1→6)-mio-inosi ol, que ya había sido analizada en el capí ulo 2, el modelo empleado no p edice los mínimos an i-. La me odología de dinámicas es ocás icas ue empleada a con inuación con dos a amien os del disol en e implíci o di e en es: =80 y GB/SA, con el obje o de comp oba cuál ep oducía con mayo iabilidad los da os expe imen ales hallados median e los expe imen os de RMN. De mane a gene al se puede deci que el empleo de SD mejo ó los ajus es en e las dis ancias expe imen ales y las eó icas calculadas como p omedio de las es uc u as en las simulaciones, con espec o a las simulaciones de MM. En ambas uniones glicosídicas, las dis ancias ela i as a con o maciones syn-, ue on mejo ep oducidas po las simulaciones, especialmen e al emplea el mé odo de GB/SA. Po o o lado, las dis ancias an i-  ue on sis emá icamen e sob ees imadas independien emen e de las condiciones u ilizadas. Es des acable el caso del compues o 27, en donde el ajus e expe imen ado en las dis ancias que ca ac e izaban los dos mínimos con o macionales syn-/ an i-, en e los expe imen os de RMN y las simulaciones de SD, ue casi pe ec o pa a ambas uniones glicosídicas. Con los obje i os p opues os en el apa ado 3.3.4 del p esen e capí ulo, se ealiza on expe imen os con H2O como disol en e, a bajas empe a u as y u ilizando los mé odos ac uales pa a sup esión de disol en es median e écnicas de RMN (secuencias de wa e ga e), en los compues os 25 y 26. A pesa del eno me es ue zo empleado pa a la de ección de los OH- de es os compues os en H2O, apenas algunos hid oxilos de los esiduos de mio-inosi ol pudie on se cla amen e de ec ados, mien as que aquéllos de los esiduos de hexosa y de glucosamina pe manecie on ocul os. Pues o que empleando como modelo saca osa pudimos de ec a sa is ac o iamen e los hid oxilos u ilizando las mismas condiciones que con 25 y 26 (campo magné ico, empe a u a, e c.) se puede conclui que la na u aleza in ínseca de es os po enciales mediado es de IPGs (más conc e amen e, la p esencia de los g upos os a o y amonio) es la que impide la plena obse ación de los hid oxilos en H2O. También se ha e aluado el uso de disol en e explíci o en los es udios de modelado molecula empleando el compues o 25 como modelo. El cálculo de ca gas a ómicas álidas Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 128│ pa a es e compues o 25 y ex apolables a los demás, hizo que se empeza a po el esiduo de cicli ol (mio- y qui o-inosi ol común en odas los compues os), an o en sus e siones lib e como me ilados en posición 6. Nos hemos concen ado en los mé odos de ca gas basadas en el po encial elec os á ico (RESP) y nues o c i e io de calidad cla e ue el cálculo de las ene gías de in e acción elec os á ica o al de las simulaciones. T as el cálculo especí ico de las ca gas basadas en el po encial elec os á ico, las di icul ades en es as simulaciones empeza on con la equilib ación del sis ema, as inclui el solu o 25 en la caja ec angula de agua (TIP3P), donde se p oducían con inuos e o es debidos al eescalado de las elocidades a ómicas. T as supe a es os p oblemas, la dinámica p oduc i a (10 ns en ap oximadamen e 6 meses de simulación) ampoco mejo ó la desc ipción del equilib io obse ado expe imen almen e en e los mínimos syn- y an i-. Po es o y a al a de da os que in ie an es a opinión, no pa ece demasiado adecuado emplea es a me odología en el es udio de pseudooligosacá idos mediado es de IPGs, dado la ele ada exigencia eque ida en cos e compu acional y los esul ados ob enidos. Capí ulo 3: Es udio de IPGs po enciales inhibido es de la cPKA 129│ 3.6.- BIBLIOGRAFIA 1 Jones, D.R.; Va ela-Nie o, In e na ional Jou nal o Biochemis y & Cell Biology. 1998, 30, (3), 313-326. 2 Field, M. C. Glycobiology. 1997, 7, (2), 161-168. 3 S al o s, P. Bioessays. 1997, 19, (4), 327-335. 4 Cohen, P. Na u e Re iews D ug Disco e y. 2002, 1, (4), 309-315. 5 Knigh on, D.R.; Zheng, J.H.; Teneyck, L.F.; Ash o d, V.A.; Xuong, N.H.; Taylo , S.S.; Sowadski, J.M. Science 1991, 253, (5018), 407-414. 6 Knigh on, D.R.; Zheng, J.H.; Teneyck, L.F.; Xuong, N.H.; Taylo , S.S.; Sowadski, J. M. Science 1991, 253, (5018), 414-420. 7 Zheng, J.H.; Knigh on, D.R.; Pa ello, J.; Taylo , S.S.; Sowadski, J.M. Me hods in Enzymology 1991, 200, 508-521. 8 Knigh on, D.R.; Bell, S.M.; Zheng, J.H.; Teneyck, L.F.; Xuong, N.H.; Taylo , S.S.; Sowadski, J.M. Ac a C ys allog aphica Sec ion D-Biological C ys allog aphy. 1993, 49, 357-361. 9 Zheng, J.H.; Knigh on, D.R.; Teneyck, L. 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S uc u e. 1997, 5, (12), 1627-1637. 16 Engh, R.A.; Gi od, A.; Kinzel, V.; Hube , R.; Bossemeye , D. Jou nal o Biological Chemis y. 1996, 271, (42), 26157-26164. 17 Bossemeye , D.; Engh, R.A.; Kinzel, V.; Pons ingl, H.; Hube , R. Embo Jou nal. 1993, 12, (3), 849-859. 18 Toledo, L.M.; Lydon, N.B.; Elbaum, D. Cu en Medicinal Chemis y. 1999, 6, (9), 775-805. Capí ulo 4: Pa e expe imen al 136│ 4 PARTE EXPERIMENTAL 4.1.- RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR. Los espec os de RMN se han egis ado en el espec óme o B uke AVANCE 500 DPX del se icio de RMN del Cen o de In es igaciones Químicas Isla de la Ca uja. Los espec os han sido asignados u ilizando écnicas bidimensionales con encionales, COSY, 2 TOCSY, 3 NOESY 4 , ROESY, 5 y HMQC 6 o HSQC 7 , La concen ación de las mues as de oligosacá idos pa a RMN, es u o siemp e en el en o no de 3-1 mM (disuel os en 600-500 L de disol en e). Las mues as se lio iliza on al menos 3 eces con D2O, y pos e io men e se disol ie on en D2O del 99.97 %D (eu iso- op). El alo de pH* se ajus ó en odos los casos median e adición de pequeñas can idades de DCl o NaOH ( e e ecia). Todos los espec os de RMN se egis a on en D2O a 25º C, sal o en casos conc e os en los que se especi ique o a empe a u a, en espec óme os B uke AVANCE DRX-500 (sonda de de ección in e sa de 5mm doble 1H/Banda-ancha, con g adien es en Z), y 2 G iesinge , C.; Sø ensen, O.W.; E ns , R.R. J. Magn. Reson. 1987, 75, (3), 474- 492. b) Muelle , L. J. Magn. Reson. 1987, 72, (1), 191-196. c) Kim, Y.; P es ega d, J.H. J. Magn. Reson. 1989, 84, (1), 9-13. 3 a) B aunschweile , L.; E ns , R.R.; J. Magn. Reson. 1983, 53, 521-528. b) Bax, A.D. Da is, G.; J. Magn. Reson. 1985, 65, 355-360. c) Bax, A.; Me hods Enzymol. 1989, 176, 151-168 4 Jeene , J.; Meie , B.H.; Bachmann, P.; E ns , R.R.; J. Chem. Phys. 1979, 71, 4546- 4553. 5 a) Fa me , B. T.; Macu a, S.; B own, L. R. J. Magn. Reson. 1987, 72, 2, 347-352. b) Bull. T.E. J. Magn. Reson. 1988, 80, (3), 470-481. c) Poppe, L.; an Halbeek. H. J. Magn. Reson. 1992, 96, (1), 185-190. 6 a) Kessle , H.; Schmiede , P.; Ku z, M. J. Magn. Reson. 1989, 85, (2), 400-405. b) C ouch, R.C.; McFadyen, R.B.; Daluge, S.M.; Ma in, G.E. Magn. Reson. Chem. 1990, 28, (9), 792-796. 7 a) Ma ion, D.; Wüe h ich, K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980, 95, 1. b) Mülle , L. J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 4481-4484. c) Willke , W.; Leib i z, D.; Ke ssebaum, R.; Be mel, W. J. Magn. Reson. 1993, 31, 287-292. Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 137│ B uke AVANCE DRX-400 (sonda di ec a 5mm QNP). Los desplazamien os químicos se exp esan en pa es po millón (ppm) espec o a la ecuencia de esonancia del DSS como e e encia p ima ia, aunque la calib ación de los desplazamien os químicos se ealizó a pa i de la ecuencia base absolu a del núcleo co espondien e y la elación de ecuencias, de acue do con el so wa e del ab ican e. Los expe imen os 2D DQF-COSY 8 , TOCSY, NOESY, ROESY y TROESY 9 se egis a on en el modo sensible a la ase con el mé odo TPPI (Time P opo ional Phase Inc emen ) pa a la de ección en cuad a u a en F1. Los expe imen os HMQC se lle a on a cabo en modo magni ud, y los expe imen os HSQC en el modo sensible a la ase con de ección “eco-an ieco”. Pa a los espec os COSY, NOESY HMQC, y HSQC, se u iliza on p og amas de pulsos con g adien es en Z pa a selección o pu ga. En los expe imen os DQF-COSY se u iliza on ípicamen e ma ices de da os de 4 K x 1 K, pa a anchu as espec ales de 5000 Hz, y 16-32 acumulaciones po inc emen o, dependiendo de la mues a. Se aplica on unciones sen2x desplazadas, en ambas dimensiones, y se aplicó ze o- illing en F1 pa a aumen a la esolución digi al expandiendo los da os a una ma iz de 8 K x 2 K. Es a impo an e expansión de los da os con ie e mayo p ecisión en la ob ención de las cons an es 3JH,H po descon olución ecu si a en el dominio de ecuencias de los picos de c uce. Pa a al e ec o se hizo uso del p og ama DECO implemen ado en el p og ama de p ocesado de RMN XWINNMR. Las cons an es de acoplamien o eó icas se 8 a) Rance, M.; Sø ensen, O.W.; Bodenhausen, G.; Wagne , G.; E ns , R.R.; Wü h ich, K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983, 117, 479-485. b) Pian ini, U.; Sø ensen, O.W.; E ns , R.R. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 6800-6801. c) Da is, A.L.; Laue, E.D.; Keele , J.; Moskau, D.; Lohman, J. J. Magn. Reson. 1991, 94, 637- 644. 9 a) B üschweile , R.; G iesinge , C.; E ns , R.R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, (20), 8034-8035. b) B üschweile , R. S uc u al dynamics in biomolecules moni o ed by nuclea magne ic esonance elaxa ion (Doc o al disse a ion, Diss. Na u wiss. ETH Zü ich, N . 9466, 1991. c) Hwang, T.L., Shaka, A.J. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, (8), 3157-3159. Capí ulo 4: Pa e expe imen al 138│ ob u ie on po aplicación de las ecuaciones ipo Ka plus modi icadas po Haasnoo e al. 10 ¡E o ! Ma cado no de inido. implemen adas en Mac omodel 6.0. Las cons an es de acoplamien o in e p o ónicas ue on ob enidas po medida di ec a del desdoblamien o cuando ue posible ó po descon olución de los picos en an i ase en los expe imen os DQF-COSY (Double-Quan um Fil e ed Co ela ion Spec oscopy). 11 Pa a los expe imen os TOCSY, se u iliza on gene almen e ma ices de da os de 2 K x 256-300, y 32 acumulaciones po inc emen o, dependiendo de la mues a. Se u ilizó la secuencia MLEV-17 con 60 ms como pe íodo de mezcla iso ópica. Pa a mejo a la esolución se aplica on unciones sen2x desplazadas, y p edicción lineal en la dimensión F1. Los expe imen os 2D-NOESY se egis a on a di e en es iempos de mezcla 200 y 600 ms ( ípicamen e 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, y 600 ms) empleando ma ices de da os de 2K x 300, y ue on p ocesados aplicando unciones sen2x desplazadas y ze o- illing du an e la ans o mación. Los expe imen os de co elación 1H-13C a un enlace se lle a on a cabo median e secuencias HMQC o HSQC. En odos los casos se adqui ió una ma iz de da os de 1 K x 256 pa a esol e anchu as espec ales de 5000 Hz y 12600 Hz en F2 y F1, espec i amen e, ealizando 16 acumulaciones po inc emen o. Se aplica on unciones sen2x con alo es de desplazamien o (SSB) de 2.2 (F2) y 3.5 (F1), se comple ó con ce os has a una ma iz inal de 1K x 1K y se empleó p edicción lineal en la dimensión F1. Pa a la e olución de las cons an es de elocidad de elajación c uzada, NOE, ROE, T-ROE, se emplea on siemp e que ue posible expe imen os 1D selec i os basados en el doble eco de espín p opues o po Shaka (dp gse: double pulsed ield 10 Haasnoo , C.A.G.; de Leeuw, F.A.A.M.; Al ona, C. Te ahed on. 1980, 36, (19), 2783–2792. b) Haasnoo , C.A.G.; De Leeuw, F.A.A.M.; Al ona, C. Bull. Soc. Chim. Belges, 1980, 89, 125–131. 11 a) Ca anagh, J.; Wal ho, J. P.; Keele , J. J. Magn. Reson. 1987, 74, (2), 386-393. b) Pons, M.; Feliz, M.; Gi al , E. J. Magn. Reson. 1988, 78, (2), 314-320. c) De ome, A.E; Williamson, M. P. J. Magn. Reson. 1990, 88, (1), 177-185. Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 139│ g adien s spin echo). En el caso de los expe imen os NOESY se empleó un esquema en esencia simila al p opues o po Keele y Shaka que incluye g adien es bipola es en el iempo de mezcla pa a disminui posibles in e e encias de mecanismos no deseados. Pa a e i ica la linealidad del c ecimien o en el ango de iempo de mezcla conside ado, se ep esen a on las cu as del olumen no malizado pa a cada iempo de mezcla (Vij/Vdiag) = en e al iempo de mezcla. Una ez comp obado, se ob u ie on las cons an es de elocidad de elajación c uzada, , como la elocidad inicial de c ecimien o del NOE, ROE o TROE calculada po ex apolación a iempo de mezcla ce o de la elación lineal (Vij/[Vdiag· m]) s. m, donde Vij , Vdiag., y m, son los olúmenes de los picos de c uce y diagonal, y el iempo de mezcla, espec i amen e 12 . Obse ación de p o ones lábiles. La concen ación de las mues as empleadas ue simila a la de los es udios en D2O, sal o en el caso de los expe imen os sob e saca osa en los que se a ió en e 2 y 20mM. También se e alua on ubos de RMN no con encionales de 1.5 mm que pe mi ie on aumen a la concen ación has a 10 mM. Los ubos de RMN ue on a ados p e iamen e con ampón os a o a pH neu o o con Clo u o de TMS pa a e i a in e e encias de la supe icie del id io. 13 , 14 Se emplea on como disol en e mezclas H2O/D2O (90:10), agua / DMSO y agua / ace ona en a ias p opo ciones, siendo la op ima agua / ace ona 85:15 a empe a u as en e 5 y -17C. Los expe imen os monodimensionales se egis a on empleando los mé odos wa e ga e, o iginal o empleando los enes de pulsos 3-9-19, W3, W4 y W5, 15 o exci a ion 12 an Halbeek, H.; Poppe, L. Magn. Reson. Chem. 1992, 30, 74-86. 13 Sands öm, C.; Baumann, H.; Kenne, L. J. Chem. Soc. Pe kin T ans. 1998, 2, 809- 815. 14 Beki oglu, S.; Sands öm, C.; No be g, T.; Kenne, L. Ca bohyd . Res. 2000, 328, 409-418. 15 a) Pio o, M.; Saudek, V.; Sklena , V. J. Biomol. NMR. 1992, 2, 661. b) Sklena , V.; Pio o, M.; Leppik, R.; Saudek, V. J. Magn. Reson. A. 1993, 102, 241. Capí ulo 4: Pa e expe imen al 140│ sculp ing 16 . Pa a los expe imen os bidimensionales TOCSY (15-60 ms de iempo de mezcla), NOESY o ROESY se emplea on siemp e implemen aciones del wa e ga e basadas en el en 3-9-19 sob e los p og amas de pulsos empleados an e io men e. El es o de las condiciones expe imen ales: ipo de adquisición, opciones de ans o mación e c. ue on, en esencia, simila es a las desc i as pa a los expe imen os en D2O. Finalmen e, las condiciones op imas encon adas pa a la de p epa ación de las mues as ue on: el empleo de agua y ace ona (85:15) como disol en e, a pH de 7,17 pa a 22 y de 7,12 pa a 23 y una empe a u a en e 0ºC has a –15ºC. Aunque se había desc i o la u ilización de esinas de in e cambio iónico pa a elimina posibles azas de las impu ezas iónicas que ca alizan el in e cambio. En nues o caso, debido a la p esencia de g upos ca gados os a o y amino en los pseudo isaca idos 25 y 26 se e ec uó la pu i icación p e ia empleando c oma og a ía en ase e e sa. Valo aciones ácido-base. Las mues as empleadas en los expe imen os de alo ación ue on las mismas que se usa on en el es o de los expe imen os sal o que se empleó ace ona (3-5 L) como e e encia in e na. El pH* se a ió añadiendo pequeñas can idades de NaOD, o DCl, y se midió después de la medida empleando un pHme o sin calib ación especial pa a co egi los e ec os iso ópicos del deu e io. 16 a) Hwang, T-L.; Shaka, A.J. J. Magn. Reson. 1995, 112, 275. b) Eme a om, C.; Hwang, T.-L.; Mackin, G.; Shaka, A.J. J. Magn. Reson. 1995, 115, 137. c) Mackin, G.; Shaka, A.J. J. Magn. Reson. 1996, 118, 247. d) Heikkinen, S.; Rahkamaa, E.; Kilpeläinen, I. J. Magn. Reson. 1997, 127, 80-86. e) Heikkinen, S.; Rahkamaa, E.; Kilpeläinen, I. J. Magn. Reson. 1998, 133, 183-189. Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 141│ 4.2.- CÁLCULOS TEÓRICOS. Los ángulos de o sión han sido de inidos como: =H1C1O1Cx, = C1O1CxHx, y =H5C5C6O6. Mapas adiabá icos. En el cálculo de los mapas adiabá icos se empleó el p og ama Mac omodel 6.0 empleando el campo de ue zas AMBER* con la adap ación de la pa ame ización de Homans o con la pos e io de S ille empleando las ca gas pun uales asignadas po el campo de ue zas e incluyendo los e ec os del disol en e empleando una cons an e dieléc ica de 80 ó el modelo con inuo GB/SA. Las es uc u as de pa ida se cons uye on, en una p ime a e apa, manualmen e y minimiza on exhaus i amen e an es de comenza la p epa ación de los mapas ígidos. En odas las minimizaciones se empleó el algo i mo de g adien es conjugados de Pola -Ribie e has a cumpli el c i e io de con e gencia (de i adas de mnd meno es de 0.001 hJ/Åmol) has a un máximo de 9999 i e aciones. Los mapas ígidos se cons uye on a iando los ángulos de o sión es udiados cada 20º en las es uc u as de pa ida minimizadas. Pa a la gene ación de es os mapas se conside a on los es posibles o áme os del g upo hid oxime ilo: gg, g , g; los dos posibles sen idos de las disposiciones cíclicas de los g upos hid oxilo secunda ios: “clockwise” o “an iclockwise”. Los mapas elajados se cons uye on po minimización de los co espondien es mapas ígidos, según las condiciones ci adas man eniendo cons an e los ángulos o siones e aluadas. Y inalmen e, los mapas adiabá icos se cons uye on empleando un p og ama desa ollado po Manuel Ma ín Pas o incluidos en NOEPROM de acue do con la siguien e exp esión, que e alúa la p obabilidad en el espacio:                  ii ii RTE RTE P ,,, ,/exp /exp Capí ulo 4: Pa e expe imen al 142│ Las dis ancias in e p o ónicas sob e el espacio con o macional del mapa adiabá ico se calcula on como el p omedio en < -6> pesado en la p obabilidad de cada pun o según:   6/1 66    klkl kl P Simulaciones "in acuo" Pa a las dinámicas molecula es (new onianas o es ocás icas) se usó el p og ama Mac omodel 6.0, y los mismos campos de ue zas y asignaciones de ca gas que las empleadas en el cálculo de los mapas adiabá icos. Tan o pa a las dinámicas con  = 80 como pa a aquellas con GB/SA el p o ocolo seguido ue el mismo. En p ime luga , la es uc u a de pa ida elegida sob e los mapas adiabá icos se some ió a una minimización ene gé ica en las condiciones habi uales. Pos e io men e, as una ase de equilib ación con una asignación de elocidades iniciales según una dis ibución de Maxwell-Bol zmann a 0K y calen amien o p og esi o du an e 100-500 ps, se ealizó la e apa p oduc i a a empe a u a cons an e de 300K usando un iempo de in eg ación de 1.0 s, ac ualizando la lis a de pa es de no-enlace cada 25 e apas de in eg ación, con una la dis ancia lími e pa a el uncado de es as in e acciones (cu o ) de 10 Å, aplicando el algo i mo SHAKE pa a la es icción de los mo imien os de al a ecuencia a los á omos de hid ógeno, y una cons an e de acoplamien o al baño é mico según el algo i mo de Be endsen de 0.5 ps (dinámicas new onianas) o una cons an e de icción de 2.5 ps (dinámicas es ocás icas). Las es uc u as in e medias ue on gua dadas cada picosegundo. Las dis ancias p omedio calculadas a lo la go de las simulaciones de dinámica molecula ue on calculadas como < -6> según:   6/1 66 )/1(    kl kl n Tesis Doc o al José Luis Muñoz Ponce 143│ Simulaciones con disol en e explíci o Pa a las simulaciones en p esencia de disol en e explíci o se empleó el p og ama AMBER 6.0 17 empleando el campo de ue zas GLYCAM. Los dis in os ipos de esiduos se cons uye on manualmen e y se incluye on en la lib e ía de esiduos de AMBER con el módulo PREP, modi icando con enien emen e los ipos de á omos pa a compa ibiliza los con las de iniciones del campo de ue zas AMBER-GLYCAM. Se calcula on las ca gas pun uales pa a es os compues os empleando GAUSSIAN 94 18 ó 98 19 , con el ni el de cálculo HF/6-31G* según el mé odo RESP (Res ained Elec oS a ic Po encial i ). 20 Las es uc u as de pa ida se some ie on a una minimización "in acuo", pa a elimina malos con ac os iniciales. Es a minimización consis ió en 200 e apas de "descenso p onunciado" seguido po minimización con "g adien es conjugados" 17 Case, D.A.; Pea lman, D.A.; Caldwell, J.W.; Chea ham III, T.E.; Ross, W.S.; Simme ling, C.L,; Kollman, P.A. AMBER 6. Uni e si y o Cali o nia, San F ancisco, 119. 1999. 18 F isch, M.J.; T ucks, G.W.; Schlegel, H.B.; Gill, P.M.W.; Johnson, B.G.; Robb, M.A.; Cheeseman, J.R.; Kei h, T.; Pe e sson, G.A.; Mon gome y, J.A.; Ragha acha i, K.; Al-Laham, M.A.; Zak zewski, V.G.; O iz, J.V.; Fo esman, J.B.; Cioslowski, J.; S e ano , B.B.; Nanayakka a, A.; Challacombe, M.; Peng, C.Y.; Ayala, P. Y.; Chen, W.; Wong, M.W.; And es, J.L.; Replogle, E.S.; Gompe s, R.; Ma in, R.L.; Fox, D.J.; Binkley, J.S.; De ees, D.J.; Bake , J.; S ewa , J.P.; Head- Go don, M.; Gonzalez, C.; Pople, J.A. Gaussian, Inc., Pi sbu gh PA, 1995. 19 F isch, M.J.; T ucks, G.W.; Schlegel, H.B.; Scuse ia, G.E.; Robb, M.A.; Cheeseman, J.R.; Zak zewski, V.G.; Mon gome y J , J.A.; S a mann, R.E.; Bu an , J.C.; Dapp ich, S.; Millam, J.M.; Daniels, A.D.; Kudin, K.N.; S ain, M.C.; Fa kas, O.; Tomasi, J.; Ba one, V.; Cossi, M.; Cammi, R.; Mennucci, B.; Pomelli, C.; Adamo, C.; Cli o d, S.; Och e ski, J.; Pe e sson, G.A.; Ayala, P.Y.; Cui, Q.; Mo okuma, K.; Sal ado , P.; Dannenbe g, J.J.; Malick, D.K.; Rabuck, A.D.; Ragha acha i, K.; Fo esman, J.B.; Cioslowski, J.; O iz, J.V.; Baboul, A.G.; S e ano , B.B.; Liu, G.; Liashenko, A.; Pisko z, P.; Koma omi, I.; Gompe s, R.; Ma in, R.L.; Fox, D.J.; Kei h, T.; Al-Laham, M.A.; Peng, C.Y.; Nanayakka a, A.; Gonzalez, C.; Challacombe, M.; Gill, P.M.W.; Johnson, B.; Chen, W.; Wong, M.W.; And es, J.L.; Gonzalez, C.; Head-Go don, M.; Replogle, E.S.;. Pople. J.A. Gaussian, Inc., Pi sbu gh, PA, 1998. 20 Bayly, C.I.; Cieplak, P.; Co nell, W.; Kollman, P.A. J. Phys. 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