Genomica in Sanità Pubblica: integrazione tra dati molecolari e sorveglianza epidemiologica per la prevenzione e il controllo delle infezioni sostenute da batteri patogeni multi-resistenti

UNIVERSITÁ DEGLI STUDI DEL MOLISE
DIPARTIMENTO DI MEDICINA E DI SCIENZE DELLA SALUTE
“VINCENZO TIBERIO”
Do o a o di Rice ca in
“Medicina T aslazionale e Clinica”
Ciclo XXXII
TESI DI DOTTORATO
Genomica in Sani à Pubblica:
in eg azione a da i molecola i e so eglianza epidemiologica
pe la p e enzione e il con ollo delle in ezioni sos enu e da
ba e i
pa ogeni mul i- esis en i
Tu o Coo dina o e
Chia .mo P o . Gianca lo Ripabelli Chia .mo P o . Ma co Sa chiapone
Do o anda
Domiziana Di Tella
SSD: MED 42
AA 2018/2019
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
ABSTRACT
L’an ibio ico- esis enza (AMR) è un p oblema di uso a li ello globale. T a i pa ogeni che mos ano
spicca a mul i- esis enza (MDR) sono ile an i Klebsiella pneumoniae e Acine obac e baumannii
esponsabili di in ezioni co ela e all’assis enza e Salmonella en e ica non i oidea di quelle a
asmissione alimen a e.
Obie i o p incipale del la o o è s a o quello di desc i e e le ca a e is iche epidemiologiche di AMR
ela i e a ali pa ogeni ca a e izzando, con di e si app occi molecola i, ceppi di K. pneumoniae e A.
baumannii isola i nell’ambi o del sis ema di so eglianza ‘Ale o ganisms’ p esso il P esidio
Ospedalie o (PO)‘A. Ca da elli’ di Campobasso (Regione Molise) e ceppi di S.en e ica non i oidea
accol i nelle a i i à di ispezione del Public Heal h England, Regno Uni o.
Sono s a i analizza i 26 ceppi di K. pneumoniae e 24 di A. baumannii pe alu a e, median e
an ibiog amma, il p o ilo di esis enza ( esis o ipo) a di e si an ibio ici e, median e PCR, la
p e alenza di de e minan i di AMR (KPC, GES, VIM, IMP, NDM, OXA-48, CTX-M, TEM, SHV;
GIM, AmpC, OXA-23/24/51/58 solo in A.baumannii, come adeB/J/G/S/M, soxR e c aA codi ican i
pe sis emi di e lusso. Nei ceppi di K. pneumoniae colis ina- esis en i è s a a e e ua a la ice ca di
a ian i mc (1-8) e di mu azioni in mg B median e sequenziamen o. La ipizzazione molecola e è
s a a condo a median e Pulsed ield gel elec opho esis (PFGE), con XbaI pe K. pneumoniae e
ApaI/AscI pe A. baumannii, e Mul ilocus sequence yping (MLST), usando ispe i amen e i
p o ocolli Pas eu e Ox o d. Sono s a i analizza i i da i o enu i median e Whole genome
sequencing(WGS) ela i i a 74.958 campioni di di e sa o igine (alimen i, mangimi, acqua, ambien e)
accol i nel pe iodo 2013-18 pe de e mina e la p e alenza di S. en e ica non i oidea e dei se o a e
di geni di AMR nei soli ceppi p o enien i da Regno Uni o, Tailandia e B asile.
Nei ceppi MDR di K. pneumoniae, è s a a con e ma a la p esenza di KPC a li ello endemico e
l’ele a a di usione di VIM, TEM e SHV, implica i nella esis enza ai ca bapenemi, men e la
esis enza alla colis ina (70%) è s a a a ibui a alla sola p esenza di mu azioni pun i o mi e inse zioni
di sequenza (IS5like, ISKpn14) in mg B. PFGE e MLST hanno iden i ica o ispe i amen e un clus e
epidemico e i ica osi nel epa o di e apia in ensi a del PO e una maggio e p e alenza del sequence
ype (ST) 512 segui o da ST101, in linea con da i nazionali.
In u i i ceppi MDR di A. baumannii, è s a a osse a a la p esenza di OXA-23 e OXA-51, in linea
con mol i s udi i aliani e nel 30% anche VIM, ipicamen e iscon a a in K. pneumoniae. I geni
codi ican i pe le pompe di e lusso sono s a i indi idua i in u i i ceppi, anne abeM e c aA isul a i
assen i. La PFGE ha agg uppa o i ceppi in clus e , men e ST1720 è isul a o il clone p e alen e,
sebbene non iscon a o in al i s udi i aliani.
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La p e alenza di S. en e ica non i oidea è s a a pa i all’1,3% e più ele a a in campioni di pollo e
oglie di be el. S. Heidelbe g è isul a o il se o a maggio men e coin ol o nella di usione di geni di
AMR, in acco do con e idenze in le e a u a. L’analisi di de e minan i di AMR ha igua da o 384
ceppi includendo quelli da B asile, Tailandia e Regno Uni o. Gli isola i da B asile hanno mos a o
un’ele a a MDR (a più di 3 classi di an ibio ici), do u a alla p esenza di aac(6')-Iy (100%), pa C
(97,2%), e (A)-1 (94,6%), sul-2 (94,2%) e CMY-2 (75%), associa i ispe i amen e alla esis enza
e so aminoglicosidi, luo ochinoloni, e acicline, sul ame ossazolo e β-la amici. Anche i ceppi
p o enien i da Tailandia hanno mos a o li elli ele a i di AMR p esen ando sop a u o pa C (59%)
e aac(6')-Iy (56%). Negli isola i da Regno Uni o è s a o iscon a o il li ello di AMR più basso e pa C
(70%) e aac(6')-Iy (68,8%) sono s a i p e alen i. La di e en e p e alenza di geni di esis enza è
plausibilmen e associa a a di e se s a egie pe con as a e il enomeno dell’AMR nel Regno Uni o e
in Tailandia, men e sono anco a assen i in B asile.
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a
INDICE
1. P emessa
1
2. In oduzione
3
2.1. L’an ibio ico- esis enza
3
2.2. L’app occio ‘One Heal h’
7
2.2.1. Uso di an imic obici nell’uomo, in animali e nelle pian e
7
2.2.2. Impa o dell’an ibio ico- esis enza
9
2.3. La s ewa dship an imic obica
11
2.4. Le In ezioni Co ela e all’Assis enza (ICA)
14
2.5. I mic o ganismi ‘ESKAPE’
16
2.5.1. Klebsiella pneumoniae
17
2.5.2. Acine obac e baumannii
19
2.5.3. Meccanismi di esis enza nei pa ogeni ‘ESKAPE’
20
2.5.3.1. I be a-la amici
22
2.5.3.2. I ca bapenemi
24
2.5.3.3. Meccanismi di esis enza
26
2.5.3.3.1. β-la amasi
28
2.5.3.3.2. β-la amasi a spe o es eso (ESBL)
28
2.5.3.3.3. AmpC β-la amasi
29
2.5.3.3.4. Ca bapenemasi
31
2.5.3.3.5. Pompe di e lusso
36
2.5.3.4. La colis ina
39
2.5.3.4.1. Resis enza alla colis ina
40
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
b
2.6. Alimen i e an ibio ico- esis enza
43
2.6.1. Salmonella en e ica non i oidea
44
2.7. Genomica in Sani à Pubblica
46
2.7.1. La geno ipizzazione degli isola i ba e ici
47
2.7.1.1. Pulsed Field Gel Elec opho esis (PFGE)
47
2.7.1.2. Mul iLocus Sequence Typing (MLST)
50
2.7.1.3. Whole Genome Sequencing (WGS)
51
3. Obie i i
52
4. Ma e iali e me odi
55
4.1. La esis enza agli an ibio ici nel con es o ospedalie o
55
4.1.1. Isolamen o e selezione di ceppi di K. pneumoniae e A. baumannii
55
4.1.2. Tes di susce ibili à agli an ibio ici
58
4.1.3. Es azione del DNA
60
4.1.4. Rice ca di geni implica i nella esis enza ai ca bapenemi
61
4.1.5. Ca a e izzazione molecola e della esis enza alla colis ina
in K. pneumoniae
65
4.1.6. P o ocolli di PFGE
68
4.1.7. P o ocolli di MLST
69
4.2. S. en e ica non i oidea a asmissione alimen a e
e an ibio ico- esis enza
71
4.2.1. Analisi di un da abase ela i o a campioni di di e sa o igine
pe alu a e la p e alenza di Salmonella spp.
72
4.2.2. Analisi dei campioni isul a i posi i i pe S. en e ica non i oidea
75
4.2.3. Analisi dei de e minan i di esis enza o enu i median e WGS in ceppi
di S. en e ica non i oidea p o enien i da e a ee geog a iche
76
5. Risul a i
77
5.1. K. pneumoniae
77
5.1.1. P o ili di an ibio ico- esis enza
77

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c
5.1.2. P e alenza dei geni di esis enza
79
5.1.3. P e alenza delle a ian i mc coin ol e nella esis enza alla colis ina e
analisi del gene mg B
80
5.1.4. Ca a e izzazione molecola e median e PFGE e MLST
85
5.2. A. baumannii
87
5.2.1. P o ili di an ibio ico- esis enza
87
5.2.2. P e alenza dei geni di esis enza
89
5.2.3. Ca a e izzazione molecola e median e PFGE e MLST
90
5.3. S. en e ica non i oidea
96
5.3.1. Analisi di campioni di di e sa o igine
96
5.3.2. Analisi dei campioni posi i i pe S. en e ica non i oidea
98
5.3.3. P e alenza dei de e minan i di esis enza alu a i median e WGS
106
6. Discussione
114
6.1. Resis enza agli an ibio ici ed epidemiologia molecola e
di K. pneumoniae
114
6.2. Resis enza agli an ibio ici ed epidemiologia molecola e
di A. baumannii
122
6.3. De e minan i di esis enza agli an ibio ici in S. en e ica
non i oidea in campioni di di e sa ma ice
130
7. Conclusioni
139
8. Bibliog a ia
147
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1
1. P emessa
L’an ibio ico- esis enza (AMR) app esen a un’alla man e p io i à di Sani à Pubblica, sia pe le
impo an i implicazioni cliniche (aumen o della mo bili à, le ali à, du a a della mala ia, s iluppo di
complicanze, epidemie), sia pe le conseguenze economiche che ne de i ano in ambi o sani a io.
L’eme genza e la di usione di ba e i mul i esis en i agli an ibio ici limi a d as icamen e le opzioni
e apeu iche. In I alia, la si uazione è p eoccupan e, sop a u o a causa di ba e i G am-nega i i, come
Klebsiella pneumoniae e Acine obac e baumannii, equen emen e isola i nel se ing ospedalie o e,
in pa icola e, nei epa i di e apia in ensi a, che mos ano esis enza anche agli an ibio ici di ul ima
linea come i ca bapenemi, ino a po a e alla iconside azione e al iu ilizzo di an ibio ici di ecchia
gene azione, come la colis ina.
L’an ibio ico- esis enza, essendo un enomeno globale, che igua da u e le componen i della i a,
in e essa anche gli alimen i e i pa ogeni a asmissione alimen a e come Salmonella en e ica, le cui
a ian i non i oidee sono la p incipale causa di in ezioni gas oen e iche nei Paesi indus ializza i.
Tali in ezioni, pe lopiù au o-limi an i, al ol a necessi ano di un a amen o an ibio ico, che può
a e e opzioni limi a e a causa di ceppi esis en i. L’eme genza della esis enza in ba e i zoono ici
come Salmonella non i oidea non dipende da un e a o uso di an ibio ici nell’uomo a scopi
e apeu ici, ma p incipalmen e da un eccessi o uso, spesso in dosi sub- e apeu iche, in ambi o
zoo ecnico. Quindi, l’an ibio ico- esis enza è un enomeno che igua da l’in e a bios e a, quindi,
l’uomo, gli animali, le pian e e l’ambien e e può esse e con as a o solo con un app occio olis ico al
p oblema e con una isione di insieme denomina a ‘One Heal h’.
Pe a e on e a ques o p oblema semp e più eme gen e, in I alia, il Minis e o della Salu e ha emana o
il Piano Nazionale di Con as o all’An ibio ico-Resis enza (PNCAR) 2017-2020, che so olinea il
uolo impo an e della so eglianza epidemiologica e i cui e e i po anno esse e alu a i nel empo.
In ale con es o, si colloca il p esen e la o o di esi, che, g azie all’u ilizzo di ecniche di genomica,
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2
con ibuisce alla accol a e analisi di da i epidemiologici sul ema dell’an ibio ico- esis enza, anche
in con on o alle s a is iche nazionali e in e nazionali. In de aglio, il la o o ha igua da o lo s udio di
K. pneumoniae e A. baumannii isola i nel se ing ospedalie o nella Regione Molise e di Salmonella
en e ica non i oidea isola i a segui o dei con olli igienico-sani a i e e ua i nel Regno Uni o e
p o enien i da di e se ma ici (alimen i, ambien e, acqua) e da di e se egioni geog a iche del
mondo.
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3
2. In oduzione
2.1. L’an ibio ico- esis enza
Dal 1928, anno in cui Alexande Fleming scop ì la penicillina, gli agen i an imic obici hanno
i oluziona o la medicina mode na e sono di en a i essenziali nel ga an i e la salu e dell’uomo e degli
animali. A causa della lo o es ema e icacia e acili à di acquis o, l’u ilizzo che è s a o pu oppo
eccessi o e spesso e a o. Lo s esso Fleming, du an e la ce imonia in cui gli enne consegna o il
p emio Nobel, nel 1945, a e ì il mondo scien i ico della possibile inso genza della esis enza se la
penicillina osse s a a u ilizza a in manie a inapp op ia a, non necessa ia e sop a u o a basso
dosaggio (Nhung NT e al., 2017). Ciò non ha a da o ad accade e, an o che nel XXI secolo il
enomeno dell’an ibio ico- esis enza è di en a o un g a e p oblema di salu e pubblica a li ello
globale (P es inaci F e al., 2015; Thanne S e al., 2016; Naylo N e al., 2018; Flo ez-Cuad ado D
e al., 2018,), che ha de e mina o una p o onda c isi nell’e icacia dei a amen i e apeu ici, anche
di in ezioni ba e iche semplici (McEwen S, Collignon PJ, 2018). Le p oiezioni dell'impa o
dell’AMR pe l’anno 2050 p e edono uno scena io ca as o ico. Le in ezioni sos enu e da pa ogeni
esis en i agli an ibio ici sa anno, in a i, la p ima causa di mo e, de e minando 10 milioni di decessi
ogni anno, più di quelle causa e dal canc o oggi che ammon ano a 8,2 milioni (O'Neill J, 2016). Mol i
agen i in e i i po ebbe o esse e scon i i con successo u ilizzando una delle classi di an ibio ici
disponibili, ma hanno aggiun o li elli ele a i di esis enza, i ualmen e a u e le classi esis en i
(McEwen S, Collignon PJ, 2018).
L'uso eccessi o di an ibio ici in mol eplici se o i (umano, e e ina io, ag icolo e zoo ecnico) sono la
p ima causa di ale p oblema, ma anche quello inapp op ia o, in e mini di scel a inadegua a, dosaggio
inada o e sca sa ade enza alle linee guida pe il a amen o (McEwen S, Collignon PJ, 2018;
P es inaci F e al., 2015), insieme a nume osi a o i biologici (e oluzione ba e ica), compo amen ali
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della esis enza an imic obica in cui sono s a i ipo a i i da i asmessi da e i di so eglianza
nazionali e in e nazionali (Wo ld Heal h O ganiza ion, 2014) ed u ilizza i pe o ien a e sia le scel e
e apeu iche, sia pe comp ende e le endenze dell’AMR, pe iden i ica e le a ee p io i a ie pe gli
in e en i e pe e e ua e il moni o aggio dell'impa o degli in e en i sul con enimen o. La mancanza
di un'adegua a so eglianza in mol e pa i del mondo lascia g andi lacune nella conoscenza
complessi a della dis ibuzione e della po a a di ques o enomeno.

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11
2.3. La s ewa dship an imic obica
Gli an ibio ici sono a maci unici che p esen ano un impa o 'ecologico' no e ole, in cui la
p esc izione a un singolo pazien e può in luenza e lo s a o di colonizzazione/in ezione di mol i al i
(Meniche i F e al., 2018). Poiché le p oiezioni igua do l’AMR, pa zialmen e causa a da un
eccessi o uso degli an ibio ici, non sono o imis iche, la p esc izione di an ibio ici do ebbe basa si
su un p ocesso azionale, alu ando le in o mazioni epidemiologiche, mic obiologiche, cliniche e
a macologiche disponibili. In I alia, la si uazione è pa icola men e di icile, poiché la esis enza ai
ca bapenemi da pa e di En e obac e iaceae e ba e i G am-nega i i non e men an i ha aggiun o
alo i ipe -endemici (Rappo i ISTISAN 17-18).
Il e mine ‘an imic obial s ewa dship’ si incon a in di e si ica i con es i, dai p og ammi di ges ione
an imic obica negli ospedali e nella comuni à, in ambi o e e ina io, nell’app occio ‘One Heal h’ e
nel quad o di amminis azione globale dell'OMS (Dya O e al., 2017). Il p imo a icolo in cui si a
i e imen o all ‘an imic obial s ewa dship’ è s a o pubblica o negli S a i Uni i nel 1996 da John E.
McGowan J e Dale N. Ge ding, i quali hanno pos o l’accen o sul conce o che gli an imic obici sono
una p eziosa iso sa non inno abile; il e mine p e ede a la p esc izione app op ia a degli
an imic obici, e i andone un uso inu ile, anche se in quel pe iodo l’obie i o esclusi o e a il
con enimen o dei cos i (Dya O e al., 2017).
Mol o spesso il e mine si concen a solo sulle p esc izioni mediche, ma s a ia ia assumendo il
conce o di s a egia, o e o una se ie di azioni coe en i che p omuo ono l'uso esponsabile degli
an ibio ici. Le azioni speci iche a iano a seconda dello s akeholde , ma condi idono mol i pun i in
comune a di e si li elli all'in e no di un sis ema sani a io, nonché a salu e umana e animale.
Secondo il PNCAR 2017-2020 pe con as a e e icacemen e il enomeno dell’AMR sono necessa i
in e en i sui di e si se o i in e essa i dal enomeno, in g ado di p omuo e e l’in e azione e il
coo dinamen o e icace delle azioni ai di e si li elli (nazionale, egionale, locale). Il con as o
all’AMR, u a ia, necessi a di una conoscenza accu a a del p oblema, pe cui sono necessa i
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s umen i a i a alu a e l’andamen o del enomeno e di e en uali misu e di con ollo. Pe an o, la
so eglianza dell’AMR app esen a un pun o chia e di u e le s a egie accomanda e pe comba e la
(EU, WHO, FAO, OIE). Le a i i à di so eglianza sono di pa icola e impo anza a inché il
p oblema sia iconosciu o e a on a o nei di e si ambi i, pe la p og ammazione degli in e en i e la
lo o alu azione; pe il moni o aggio del enomeno; pe l’iden i icazione di e en i ina esi pe icolosi
pe la salu e pubblica, quali cambiamen i nei pa e n di AMR (eme genza e di usione di nuo e
esis enze) e ocolai epidemici; pe a ua e misu e di con enimen o empes i e e pe alu a e
l’e icacia degli in e en i di con ollo e s ewa dship messi in a o (PNCAR 2017-20).
Il p og amma di ‘an imic obial s ewa dship’ in I alia do ebbe esse e indi izza i e so mol eplici
azioni p io i a ie (Meniche i F e al., 2018), quali:
 o ene e una cope u a immuni a ia, median e s a egie accinali, adegua a che a ebbe un impa o
posi i o sull'uso di an imic obici e, di conseguenza, sulla esis enza an imic obica;
 e e ua e una p o ilassi an ibio ica app op ia a, che può idu e il ischio di in ezione in pazien i
so opos i a p ocedu e chi u giche, e i ando un uso indisc imina o che aumen a la p essione
sele i a e p omuo e la compa sa di ceppi di AMR (Sinha B e al., 2014);
 idu e il ischio di in ezioni co ela e all’assis enza (ICA), a a e so s a egie mi a e al con ollo
delle in ezioni sop a u o nelle popolazioni sensibili, sia negli ospedali pe acu i, sia nelle s u u e
di lungodegenza;
 e i a e l’uso non necessa io di an ibio ici negli animali e nell'ag icol u a, che cause ebbe lo s iluppo
di ba e i esis en i agli an ibio ici e la selezione di geni di esis enza che possono esse e as e i i
alle pe sone a a e so la con aminazione ambien ale (Ma shall BM, Le y SB, 2011);
 usa e bioma ca o i pe moni o a e il deco so clinico e la ispos a agli an ibio ici e guida e la e apia
(Da id N e al., 2017);
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13
 o ene e diagnosi mic obiologiche p ecoci, a inché le ospedalizzazioni e il consumo di an ibio ici
siano mino i, con ispa mio economico e iduzione della p essione sele i a (Buehle SS e al.,
2016);
 idu e l’u ilizzo di an ibio ici ad ampio spe o di azione, in a o e di quelli a spe o is e o,
pe me endo una iduzione della p essione sele i a e una iduzione dei cos i;
 e i a e dosaggi di a amen i an ibio ici e a i oppu e oppo lunghi;
 in es i e in suppo o amminis a i o e iso se umane.
Un esempio in e essan e di con enimen o di un ocolaio epidemico da K. pneumoniae p odu o e di
ca bapenemasi (KPC) si è e i ica o in Is aele, g azie all’applicazione di misu e di isolamen o e
posizionamen o dei pazien i in uni à au onome do a e di in e mie i dedica i e isolamen o obbliga o io
dei po a o i no i a li ello ospedalie o (Schwabe e MJ al., 2011).
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2.4. Le In ezioni Co ela e all’Assis enza (ICA)
La scope a della penicillina da pa e di Alexande Fleming, segui a dalla con inua scope a e dall’uso
di nuo i an ibio ici nei decenni successi i, ha ape o alla cosidde a 'an ibio ic e a', nella quale la
ges ione delle mala ie associa e a ba e i pa ogeni e a conside a a un o io successo e le in ezioni
non app esen a ano una minaccia pe l'uomo o gli animali (D’Accol i M e al., 2019). Da quel
momen o, l’imp op io ed eccessi o uso degli an ibio ici ha c ea o una p essione sele i a
selezionando ceppi esis en i, in g ado di sop a i e e ai a amen i e apeu ici. La esis enza agli
an imic obici è pa icola men e pe icolosa nei sogge i ospedalizza i, poiché du an e il ico e o il 5-
15% dei pazien i acquisisce le cosidde e ICA, che sono pe lopiù sos enu e da mic o ganismi
mul i esis en i (MDR) (Caini S e al., 2013; Co nejo-Juá ez P e al., 2015), sensibili solo a una o due
classi an imic obiche (Ex ensi ely D ug Resis an - XDR) (Basak S e al., 2016) o sensibili solo a
uno o due po enziali a maci a i i o esis en i a u i gli agen i an iba e ici disponibili (Pan D ug
Resis an - PDR) (Pon ikis K e al., 2014), endendo mol o di icile o impossibile il successo
e apeu ico (Di Tella D e al., 2019). Secondo l’ECDC, in Eu opa, ci ca 3 milioni di pazien i
con aggono almeno una ICA negli ospedali pe acu i ogni anno e 37.000 pazien i muoiono come
conseguenza di e a dell’in ezione (Eu opean Cen e o Disease P e en ion and Con ol 2013;
B usa e o S e al., 2015; Cassini A e al., 2016). Di ecen e, nell'UE, sono s a i acce a i 426.277 casi
di ICA da mic o ganismi esis en i agli an imic obici ogni anno (Cassini A e al., 2019). In I alia,
l'incidenza dell'ICA è del 5-10%, con in ezioni causa e da mic o ganismi MDR semp e più comuni e
con un asso di mo ali à del 20-30% (Messineo A, Ma sella LT, 2015).
Esis e un’impo an e di e enza nelle dinamiche di asmissione a mic o ganismi che causano
mala ie in e i e classiche e mic o ganismi esis en i a più a maci. Di e samen e dalle mala ie
in e i e classiche (mo billo, ube colosi, mala ia), le ICA causa e da ba e i esis en i agli an ibio ici
non p esen ano un pe iodo di incubazione de ini o, né p e edono ie di asmissione na u ali (d ople
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ae o-dispe se, pe con a o con goccioline, pe ia ecale-o ale). Ques o pe ché l’ospedale e le nuo e
p ocedu e cliniche (ad esempio, uso di endoscopi, espi a o i e ca e e i) app esen ano on i di
in ezione e modali à di asmissione che non sono s a e anco a desc i e. Pe ques o, impian i e
disposi i i medici su cui si o mano bio ilm, in e en i medici in asi i e un mic oambien e in
e oluzione sono impo an i a o i di ischio (F ied ich A, 2019). Sulla base di nume ose osse azioni,
l'ambien e ospedalie o s olge un uolo impo an e nella asmissione dell'ICA, in quan o app esen a
un se ba oio di agen i pa ogeni, che possono esse e acilmen e di usi da pazien i, isi a o i e
pe sonale ospedalie o (D’Accol i M e al., 2019). In a i, i mic o ganismi hanno la capaci à di
sop a i e e pe lunghi pe iodi di empo sulle supe ici (K ame A e al., 2006), da do e possono
esse e acilmen e asmessi ai pazien i ami e con a o di e o o indi e o (O e J e al., 2013). Appa e
e iden e la co elazione di e a a la con aminazione di supe ici e l’inso genza di ICA, poiché il
ischio di acquisi e un pa ogeno aumen a quando un pazien e iene ico e a o in una s anza
p eceden emen e occupa a da pazien i colonizza i o in e i da quello speci ico agen e in e i o
(D’Accol i M e al., 2019). S aphylococcus au eus, En e oba e i a cui Esche ichia coli e K.
pneumoniae, A. baumannii e Pseudomonas ae uginosa sono solo alcuni dei pa ogeni più comuni
co ela i all'inso genza di ICA, anche associa i all'AMR, che possono pe sis e e a lungo nell'ambien e
ospedalie o (G undmann H e al., 2017; D’Accol i M e al., 2019). In pa icola e, gli En e oba e i
che p oducono be a-la amasi a spe o es eso e ca bapenemasi sono in cos an e aumen o nel se ing
ospedalie o e le in ezioni da essi causa e sono spesso associa e ad una ele a a mo ali à (Palacios-
Baena ZR e al., 2017; Ripabelli G e al., 2018; Di Tella D e al., 2019). In a i, gli En e oba e i
esis en i ai ca bapenemi sono s a i inclusi nella lis a dei pa ogeni p io i a i a li ello globale e sono
s a i classi ica i come una p io i à 'c i ica' (WHO, 2017).

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2.5. I mic o ganismi ‘ESKAPE’
Il e mine 'ESKAPE' è un ac onimo u ilizza o pe iden i ica e sei ba e i pa ogeni che p esen ano
spicca a i ulenza ed ele a a esis enza agli an ibio ici, includendo En e ococcus aecium, S. au eus,
K. pneumoniae, A. baumannii, P. ae uginosa e En e obac e spp. (Rice LB, 2008). I pa ogeni
ESKAPE sono esponsabili della maggio pa e delle in ezioni nosocomiali, sono in g ado di s uggi e
(“escape”) all'azione biocida degli agen i an imic obici (Rice LB, 2008; Na idinia M, 2016) e sono
associa i ad un al o ischio di mo ali à, con conseguen e aumen o dei cos i sani a i (Founou RC e
al., 2017). L'OMS ha ecen emen e inse i o i pa ogeni ESKAPE nell'elenco dei 12 ba e i con o i
quali è necessa io lo s iluppo di nuo i an ibio ici (Tacconelli E e al., 2018) e di ques i, in pa icola e
A. baumannii, esis en e ai ca bapenemi, e K. pneumoniae esis en e ai ca bapenemi e ai be a-
la amici a spe o es eso, sono inse i i nell'elenco dei pa ogeni con p io i à c i ica. I meccanismi di
esis enza ca a e is ici dei mic o ganismi ‘ESKAPE’ sono agg uppa i in e ca ego ie: i)
ina i azione del a maco comunemen e ca alizza a da un enzima; ii) modi icazione del si o be saglio
a cui l'an ibio ico può lega si; iii) iduzione dell’accumulo di a maco a causa della ido a
pe meabili à o aumen o dell’es usione median e pompe di e lusso (San aji S, Ind awa ana N,
2016). Tali pa ogeni sono anche in g ado di o ma e bio ilm che impediscono isicamen e alle cellule
del sis ema immuni a io dell'ospi e e agli an ibio ici di esplica e la p op ia a i i à. I bio ilm, inol e,
p o eggono le cellule do mien i specializza e, chiama e cellule pe sis en i, che sono olle an i agli
an ibio ici che causano in ezioni ecalci an i e di icili da a a e (Mulani M e al., 2019).
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2.5.1. Klebsiella pneumoniae
K. pneumoniae è la specie del gene e Klebsiella spp. più ile an e dal pun o di is a clinico (Pi ou
JDD e al., 2015). È un pa ogeno oppo unis a che, in sogge i immunocomp omessi, può causa e una
as a gamma di in ezioni, a cui polmoni e, in ezione del a o u ina io, ba e iemia e meningi e,
sop a u o in indi idui che so ono di diabe e o neoplasie (Paczosa MK, Mecsas J, 2016).
K. pneumoniae ha una capsula di polisacca idi che è impo an e pe la sua pa ogenesi e la capaci à di
e i a e la agoci osi (Co és e al., 2002). Lo s udio di p e alenza pun uale delle ICA e dell’uso di
an imic obici negli ospedali pe acu i (Poin P e alence Su ey), e e ua o nel 2011-2012
dall’ECDC, ha iden i ica o K. pneumoniae quale esponsabile del 6,8% delle ICA, app esen ando la
seconda specie nelle En e obac e iaceae dopo E. coli maggio men e isola a nel se ing ospedalie o
(ECDC, 2013). Men e nel 2005, in u i i Paesi eu opei non è s a o segnala o alcun isolamen o di K.
pneumoniae esis en e ai ca bapenemi, du an e un pe iodo di 10 anni (2005-2015), è eme sa
un’ele a a p e alenza di ceppi esis en i, aggiungendo assi del 40-60% (Na on-Venezia S e al.,
2017). Nello s udio Top TEn Mic o ganisms (TOTEM), K. pneumoniae esis en e ai ca bapenemi è
s a o classi ica o a i più c i ici agen i pa ogeni esis en e agli an ibio ici che è causa di in ezioni
nosocomiali, sop a u o nei epa i di e apia in ensi a (Rello J e al., 2019). In a i, è s a o ipo a o
che su 5331 casi di ba e iemia causa i da En e obac e iaceae esis en i ai ca bapenemi, il 96,8% è
a ibuibile a K. pneumoniae (Sabba ucci M e al., 2018). A li ello EU/EEA, nel 2017, il 34% degli
isola i di K. pneumoniae no i ica i all’Eu opean An imic obial Resis ance Su eillance Ne wo k
(EARS-Ne ) mos a a esis enza almeno ad un g uppo di an ibio ici so o so eglianza, inclusi i
ca bapenemi (ECDC, 2018). La p oduzione di ca bapenemasi, in pa icola e di KPC, app esen a il
meccanismo p e alen e di esis enza ai ca bapenemi in K. pneumoniae (Gi menia C e al., 2016;
Sabba ucci M e al., 2018), segui o dalla p oduzione delle ca bapenemasi GES, NDM, IMP, VIM e
OXA (Munoz-P ice LS e al., 2013). L’isolamen o di ceppi di K. pneumoniae posi i i a blaKPC ha
aggiun o dei li elli endemici in I alia; in a i, ci ca il 90% di ceppi di K. pneumoniae esis en i ai
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ca bapenemi sono p odu o i di KPC, segui i da blaVIM (9,2%) e blaOXA-48 (1,3%) (Giani T e al., 2015;
Ripabelli G e al., 2018; Di Tella D e al., 2019).
In K. pneumoniae, sono spesso p esen i anche i geni codi ican i pe le be a-la amasi a spe o es eso
(ESBL), coin ol i nella esis enza alle oximino-ce alospo ine e in g ado di id olizza e i be a-la amici
(Ghasemi Y e al., 2013). Du an e il pe iodo 1990-2000, K. pneumoniae è di en a o il mic o ganismo
con p oduzione di ESBL maggio men e coin ol o negli e en i epidemici nel con es o ospedalie o,
sop a u o pe la p oduzione di blaTEM e blaSHV (Calbo E, Ga au J, 2015). L’aumen o della p e alenza
dei ba e i G am-nega i i mul i esis en i (MDR) ha causa o la iconside azione della colis ina,
sop a u o pe il a amen o delle in ezioni sos enu e da K. pneumoniae (Rello J e al., 2019).
Tu a ia, negli ul imi anni, anche la esis enza alla colis ina è signi ica i amen e eme sa in ceppi di
K. pneumoniae esis en i ai ca bapenemi e con li elli piu os o al i, che si a es ano in o no al 36%
(Canna elli A e al., 2014; Ja a i Z e al., 2019). Ques o ipo di esis enza è do u a a modi icazioni
s u u ali del lipopolisacca ide (LPS) ba e ico, che app esen a il a ge della colis ina. Uno dei
meccanismi di esis enza più equen emen e ipo a i in K. pneumoniae è app esen a o
dall’ina i azione del gene mg B, coin ol o nella down- egolazione del sis ema Pm (Canna elli A e
al., 2013; Poi el L e al., 2015). Al i meccanismi di esis enza, che coin olgono semp e l’LPS, sono
codi ica i dai geni mc che s olgono un uolo c uciale nella esis enza alla colis ina media a da
plasmidi ( a ian i mc -1,2,3,4,5,6,7,8) (Ca a oli A e al., 2016; Ba bie i NL e al., 2017; Xa ie B e
al., 2016; Yin W e al., 2017; Bo owiak M e al., 2017; Wang X e al., 2018; Yang YQ e al., 2018).
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2.5.2. Acine obac e baumannii
I ba e i del gene e Acine obac e spp. appa engono alla amiglia delle Mo axellaceae. Essi
comp endono coccobacilli G am-nega i i, ca alasi posi i i, ossidasi nega i i e non e men an i. Tali
mic o ganismi sono immobili, ma alcuni ceppi mos ano una mo ili à associa a alla p esenza di
imb ie. Sono mic o ganismi ae obi s e i, che possono u ilizza e una g ande a ie à di subs a i come
on e di ca bonio e c escono acilmen e sui più comuni e eni di isolamen o ad una empe a u a di
c esci a o imale di 33-37°C (Kuo S e al., 2006). Come u i i ba e i G am-nega i i, Acine obac e
spp. è ca a e izza o dalla p esenza di una ipica memb ana es e na, cos i ui a da un doppio s a o
os olipidico, alla quale si o ano anco a i i lipopolisacca idi e di e se p o eine di memb ana, a cui
le po ine che, o mando canali id o ili, consen ono il passaggio e l’asso bimen o di piccole molecole,
comp esi gli an ibio ici. I ba e i del gene e Acine obac e spp. sono ubiqui a i in na u a e possono
esse e iscon a i nel suolo, nell’acqua ed in una ampia a ie à di alimen i, sop a u o in ambien e sia
umido. Ques i ceppi di o igine ambien ale spesso p esen ano meccanismi di esis enza agli an ibio ici,
a cui p oduzione di ca bapenemasi e ESBL (Al A ouni A e al., 2016). Sono, inol e, pa e della
lo a ba e ica umana, colonizzano la cu e e le mucose del a o espi a o io, in es inale e
geni ou ina io e engono comunemen e isola i in ambien e ospedalie o (Aoi e H e al., 2012). Mol e
specie del gene e Acine obac e spp. sono pa ogene oppo unis e. T a ques e, A. baumannii è senza
dubbio la specie più impo an e, che è passa o dall’esse e i enu o un ba e io con un basso li ello di
pa ogenici à a app esen a e uno dei pa ogeni nosocomiali più impo an i associa o a casi di ICA in
u o il mondo, sop a u o nei epa i di e apia in ensi a (Lee C e al., 2017; Mohd Sazlly LS e al.,
2019). I p imi casi di in ezione sos enu i da A. baumanni sono eme si negli anni 60-70’ in pa allelo
con l’u ilizzo di cu e più in ensi e (Wong D e al., 2016). Nei decenni successi i, u a ia, il c escen e
u ilizzo della en ilazione meccanica, del ca e e e enoso cen ale e u ina io e della e apia an ibio ica
ha causa o un aumen o della equenza e della g a i à delle in ezioni da Acine obac e (Spellbe g B
e al., 2014; Wong D e al., 2016). La p e alenza di ceppi MDR di A. baumannii in pazien i a e i da
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2.5.3.3. Meccanismi di esis enza
Mol i ba e i G am-nega i i non- e men an i (Pseudomonas spp., Acine obac e spp.), memb i
delle En e obac e iaceae (Klebsiella spp., Esche ichia coli, En e obac e spp.) e ba e i G am-
posi i i (S ep ococcus spp., S aphylococcus spp., En e ococcus spp.) s anno acquisendo esis enza
alla maggio pa e dei ca bapenemi clinicamen e disponibili. I p incipali meccanismi alla base di
ale esis enza comp endono la p oduzione di β-la amasi, la so a-esp essione di pompe di
e lusso, l’acquisizione di mu azioni che al e ano l’esp essione e/o la unzione delle po ine e delle
PBP. La combinazione di ali meccanismi può de e mina e ele a i li elli di esis enza in alcune
specie ba e iche, come in K. pneumoniae.
T a i meccanismi non associa i alla p oduzione di ca bapenemasi, un uolo ile an e è s ol o dalla
la ido a p oduzione di po ine. La memb ana es e na dei ba e i G am-nega i i o ma una ba ie a
id o oba che p o egge la cellula da agen i es e ni, quali me alli pesan i e de e gen i. Essa con iene
p o eine speci iche, chiama e po ine, che o mano canali id o ilici i quali consen ono
l'asso bimen o sele i o di nu ien i essenziali e al i compos i, comp esi gli an ibio ici. Nelle
En e obac e iaceae, le po ine p incipalmen e coin ol e nell’ing esso degli an ibio ici
appa engono alle amiglie OmpF o OmpC (Pagès J e al., 2008). E en uali a iazioni nel nume o
o nell'a i i à delle s esse po ebbe o a e e e e i a a o e della esis enza agli an ibio ici. La
mu azione di un “ga ekeeping loop” o canale cen ale delle po ine, una pe di a di esp essione o un
cambiamen o nel ipo di po ine p esen i nella memb ana es e na, può diminui e la sensibili à agli
an ibio ici. Inol e, la lo o sin esi può esse e egola a in ispos a a compos i an imic obici o
a oma ici, a a e so a ie eazioni a casca a, che coin olgono gli ope oni ma e sox, con una
conseguen e diminuzione del nume o di po ine nella memb ana es e na (Nikaido H, 2003).
Negli En e oba e i, la esis enza ai ca bapenemi è s a a osse a a in segui o all’ipe -esp essione di
un gene c omosomico ampC codi ican e pe una ce alospo inasi in inseca e all’esibizione di
modi iche nelle po ine OmpC o OmpF (Doumi h M e al., 2009). Ques o meccanismo di esis enza

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ai ca bapenemi è s a o osse a o anche in al i En e oba e i che non esp imono ale
ce alospo inasi, come in E. coli, K. pneumoniae e Salmonella spp. In al caso, la esis enza
co isponde alla combinazione dell’esp essione di AmpC plasmidiche insieme ad una diminui a
pe meabili à della memb ana cellula e (Shin S e al., 2012). I geni ampC po a i da plasmidi sono
spesso associa i ad al i geni codi ican i pe la esis enza ad al i an ibio ici (ad esempio,
aminoglicosidi, e acicline, sul amidici) come conseguenza della co-localizzazione dei geni sugli
s essi plasmidi (Ma inez-Ma inez L, 2008). Isola i che non p oducono ca bapenemasi ma che
mos ano esis enza ai ca bapenemi sono gene almen e meno esis en i agli an ibio ici di al e
amiglie. La esis enza media a da AmpC non è as e ibile, a di e enza dei geni codi ican i pe la
maggio pa e delle ca bapenemasi. Pe ale mo i o, gli isola i ca bapenemi- esis en i che non
p oducono ca bapenemasi des ano mino i p eoccupazioni ispe o a quelli p odu o i di
ca bapenemasi in ambi o clinico (No dmann P e al., 2012).
La esis enza ai β-la amici iene esplica a a a e so e p incipali meccanismi. Il meccanismo più
comune è la p oduzione di enzimi che deg adano o modi icano l’an ibio ico p ima che possa
aggiunge e il si o di des inazione. In ques o caso, la amiglia di β-la amasi deg ada gli an ibio ici
ap endo l’anello β-la amico e p oducendo un de i a o ina i o. Ques i enzimi sono ampiamen e
di usi a i ba e i G am-posi i i e G am-nega i i. Una ol a p odo e, le β-la amasi sono sec e e
nello spazio pe iplasma ico nei G am-nega i i, lega e alla memb ana ci oplasma ica, o esc e e nei
G am-posi i i. Il secondo meccanismo è app esen a o dall’al e azione del si o be saglio
dell’an ibio ico, o e o delle anspep idasi, che isul ano a e e una mino e a ini à pe
l’an ibio ico. Il meccanismo inale è ca a e izza o dalla iduzione o dal blocco dell'accesso
dell'an ibio ico al ci oplasma median e al e azione della pe meabili à della memb ana o
dall’e lusso o za o (Wilke M e al., 2005).
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2.5.3.3.1. β-la amasi
Le β-la amasi app esen ano il p incipale meccanismo di di esa da pa e dei ba e i G am-nega i i
con o di e se classi di agen i an imic obici. Due sono gli schemi di classi icazione delle β-
la amasi. La classi icazione s u u ale Amble p opos a nel 1980 (Amble RP, 1980) si basa su
analogie della sequenza amminoacidica, classi icando le β-la amasi in 4 g uppi, da A a D. Gli
enzimi dei g uppi A, C e D sono se ina-enzimi, men e quelli del g uppo B sono me allo-enzimi.
Anche se un app occio s u u ale è il modo più semplice pe classi ica e ques o insieme e e ogeneo
di enzimi, la classi icazione unzionale p opos a da Bush nel 1989 (Bush K e al., 1995) e amplia a
nel 1995, o e l’oppo uni à di me e e in elazione ques i enzimi in base al lo o uolo clinico,
o e o o nendo in o mazioni sulla lo o esis enza sele i a alle di e se classi di an ibio ici β-
la amici. Lo schema aggio na o di Bush comp ende:
 G uppo 1 (classe C) - ce alospo inasi;
 G uppo 2 (classi A e D) - β-la amasi inibi o i esis en i, β-la amasi a spe o es eso
(ESBL) e ca bapenemasi a se ina;
 G uppo 3 (classe B): me allo-β-la amasi.
2.5.3.3.2. β-la amasi a spe o es eso (ESBL)
Sebbene non i sia una p ecisa ed uni oca de inizione, le ESBL engono comunemen e de ini e
come enzimi po a i da plasmidi che con e iscono esis enza a penicilline, ce alospo ine di p ima,
seconda e e za gene azione, monoba amici (ma non a ca bapenemi e ce amicine) e che sono
no malmen e inibi i dagli inibi o i delle β-la amasi, come l’acido cla ulanico (Pa e son DL e al.,
2005). Tali enzimi de i ano dal g uppo 2b (classi icazione Bush) delle β-la amasi (TEM-1, TEM-
2 e SHV-1) e appa engono al g uppo 2be do e la “e” s a ad indica e un es eso spe o d’azione.
TEM-1 è la β-la amasi media a da plasmidi più comune nei bacilli en e ici G am-nega i i (E.
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coli), men e SHV-1 è p incipalmen e p odo o da ceppi di K. pneumoniae. TEM-2 è il memb o
meno comune del g uppo delle β-la amasi e mani es a ca a e is iche biochimiche iden iche a
TEM-1 (Pa e son DL e al., 2005). Le ESBL che de i ano da TEM-1, TEM-2 o SHV-1 di e iscono
dai lo o p ogeni o i pe uno o pochi amminoacidi e ciò compo a un cambiamen o nell’a i i à
id oli ica dell’enzima, il cui spe o d’azione isul a esse e anco più es eso dell’enzima p ogeni o e
(Pa e son DL e al., 2005).
La p ima β-la amasi media a da plasmidi, TEM-1, u desc i a nel 1965 ed isola a dal pazien e
chiama o Temonei a (da cui il nome) ad A ene; da allo a, si è di usa in u o il mondo ed è p odo a
da nume ose specie della amiglia delle En e obac e iaceae.
Nei p imi anni 80’, in ispos a alla c escen e p e alenza e di usione delle β-la amasi, u ono
in odo e le ce alospo ine di e za gene azione nella p a ica clinica. Tu a ia, è eme sa
apidamen e anche la esis enza a ques e molecole e la p ima e idenza di un enzima SHV-2 in
g ado di id olizza e ques i an ibio ici è s a a pubblica a nel 1983 in Ge mania (Pa e son DL e al.,
2005).
Un al o g ande g uppo di enzimi ESBL è app esen a o da CTX-M, che comp ende più di 40
memb i, ampiamen e di usi in u o il mondo. En e oba e i p odu o i di enzimi CTX-M sono
s a i isola i p incipalmen e in ambi o comuni a io, come esponsabili di in ezioni del a o u ina io
(Rawa D, Nai D, 2010).
2.5.3.3.3. AmpC β-la amasi
Nella classi icazione s u u ale Amble delle β-la amasi (Amble RP, 1980), gli enzimi AmpC
appa engono alla classe C, men e nello schema di classi icazione unzionale di Bush sono
assegna i al g uppo 1 (Bush K e al., 1995). Ques i enzimi possono esse e c omosomici o codi ica i
da plasmidi. Le β-la amasi AmpC con e iscono esis enza alle oximino-ce alospo ine
(ce o axime, ce azidime, ce iaxone), alle ce alospo ine del g uppo 7-α me ossi (ce oxi ina o
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ce o e an) e non sono in luenza i dagli inibi o i delle β-la amasi (acido cla ulanico, sulbac am,
azobac am). Inol e, ACT-1, DHA-1, CMY-2, CMY-10 esibiscono un’a i i à ca ali ica pe
imipenem (Jeon JH e al., 2015). Le AmpC β-la amasi media e da plasmidi, come quelle esp esse
in K. pneumoniae (CMY-1, CMY-2, CMY-8, CMY-12, MOX-1, MOX-2, FOX-1, FOX-5, LAT-
1, LAT-2, LAT-2b, ACT-1, MIR-1, ACC-1, ACT-3, DHA-2 e DHA-3), di e iscono da quelle
c omosomiche in quan o non sono inducibili e sono ipicamen e associa e ad AMR. Le opzioni di
a amen o pe le in ezioni causa e da o ganismi che esp imono AmpC sono limi a e (Gup a V e
al., 2012). Tali β-la amasi sono s a e osse a e equen emen e in ceppi di K. pneumoniae, ma
anche in al e specie, come Klebsiella oxy oca, Salmonella spp. e P o eus mi abilis. La dis ibuzione
globale di ali enzimi è mol o ampia: A ica (Alge ia, Tunisia), Asia (India, Giappone, Pakis an,
Co ea del Sud), Eu opa (F ancia, Ge mania, G ecia, I alia, S ezia, Regno Uni o), Medio O ien e
(A abia Saudi a) e Ame ica (S a i Uni i, A gen ina, Gua emala)
I geni bla sono p esen i su plasmidi di e en i, ma spesso coesis ono sullo s esso plasmide. Ad
esempio, il gene codi ican e pe la β-la amasi ACT-1, i o a o in isola i clinici, può esse e
co ela o con TEM-10 o TEM-26 oppu e con SHV-1 o TEM-1. Mol i geni di esis enza, inclusi
quelli appa enen i alle classi Amble A, B e D sono colloca i in casse e geniche con un elemen o
di 59 basi a alle che unge da si o di icombinazione, di e samen e dai geni AmpC, che sono pa e
di un in eg one e non sono inco po a i in una casse a genica. Al i geni blaAmpC sono adiacen i
ad una comune sequenza di inse zione (ISCR1) coin ol a nella mobili azione genica, ipica degli
in eg oni di classe 1 (Jacoby G, 2009). In mol i En e oba e i, la p oduzione di AmpC è inducibile
ami e un sis ema che coin olge i geni ampD, ampG e ampR (Philippon A e al., 2002).
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2.5.3.3.4. Ca bapenemasi
Le ca bapenemasi app esen ano la amiglia di β-la amasi più e sa ile, con uno spe o d’azione
mol o più ampio ispe o ad al i enzimi id oli ici la amici. Alcuni ice ca o i hanno p e e i o la
nomencla u a “enzimi di id olisi dei ca bapenemi” in ece che ca bapenemasi, in quan o i
ca bapenemi sono solo una piccola pa e del lo o ampio spe o di subs a i (Queenan AM, Bush
K, 2007). Ol e a id olizza e β-la amici e ce alospo ine di seconda e e za gene azione, come le
ESBL, iescono ad ina i a e anche i ca bapenemi. Le ca bapenemasi di maggio e in e esse
epidemiologico e clinico pe il lo o p o ilo ca ali ico sono comp ese nei g uppi A, B e D
(No dmann P, Poi el L 2014).
Le ca bapenemasi possono esse e codi ica e sia da geni (bla) a localizzazione c omosomiale, sia
da geni as e ibili. Ques i ul imi possono “muo e si” a i mic o ganismi pe lopiù a a e so
plasmidi e meno equen emen e con il suppo o di al i elemen i de i asposoni.
La esis enza do u a alle ca bapenemasi acquisi e è s a a e idenzia a in ceppi pa ogeni G am-
nega i i a pa i e dagli inizi degli anni ’90. Gli isolamen i di bacilli MDR p odu o i di
ca bapenemasi e esponsabili di ou b eak in ambi o nosocomiale sono imas i limi a i ino alla
me à del 2000, allo ché l’aumen o della p e alenza, insieme alla compa sa di nuo e a ian i
enzima iche, ha aggiun o dimensioni epidemiologiche p eoccupan i in u o il mondo.
Le ca bapenemasi, inol e, p esen ano a i i à id oli iche a iabili; enzimi come le me allo-β-
La amasi (MβL) e Klebsiella pneumoniae ca bapenemasi (KPC) id olizzano più e icien emen e
i ca bapenemi ispe o a Oxacillin-hyd olysing ca bapenemases (OXA). Tu a ia, di soli o
l’ele a a esis enza ai ca bapenemi di ceppi di K. pneumoniae p odu o i di ca bapanemasi è
associa a ad al e azioni della pe meabili à della memb ana cellula e, indipenden emen e dal ipo
di ca bapenemasi. Al con a io, ceppi di K. pneumoniae p odu o i di u i i ipi di ca bapenemasi
p esen ano bassi alo i di concen azione minima iniben e (Minimal Inhibi o y Concen a ion -
MIC) pe i ca bapenemi (No dmann P, Poi el L, 2014). Le ca bapenemasi sono classi ica e in

Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
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di e se classi:
 Classe A: ca bapenemasi a se ina
T a i p incipali ipi di ca bapenemasi di classe A ed impo an i da un pun o di is a clinico, KPC
id olizza una as a gamma di β-la amici, a cui penicilline, ce alospo ine, ca bapenemi e
monoba amici (az eonam), a a e so un meccanismo id oli ico che coin olge un si o a i o
con enen e una se ina in posizione 70. L’a i i à id oli ica è inibi a in i o da acido cla ulanico e
azobac am. (No dmann P e al., 2012).
Il p imo p odu o e di KPC (KPC-2 in K. pneumoniae) u iden i ica o nel 1996 in No d Ca olina
(Yigi H e al., 2001). Nel 1997, è s a o isola o in alcuni ospedali di New Yo k Ci y (B ad o d PA
e al., 2004) e da allo a ha con inua o a di onde si. Mic o ganismi p odu o i di enzimi KPC sono
s a i segnala i negli S a i Uni i (Ki chel B e al., 2009), ma con maggio e p e alenza nella pa e
o ien ale ispe o a quella occiden ale e me idionale. La p esenza di ceppi di K. pneumoniae
p odu o i di KPC è conside a a endemica nelle egioni del Medio O ien e, in Flo ida e Po o Rico
e sono di usi in u o il mondo. Il p imo Paese ol e gli S a i Uni i, che ha egis a o un ocolaio a
li ello locale è s a o Is aele (Sam a Z e al., 2007). Un o e aumen o del nume o di isola i
p odu o i di KPC in K. pneumoniae è s a o egis a o negli ospedali di Tel A i a il 2005 e il
2006, isul a i anche gene icamen e co ela i ai ceppi ci colan i negli ospedali s a uni ensi (Na on-
Venezia S e al., 2009). Al i Paesi che hanno egis a o in ezioni sos enu e da ale mic o ganismo
sono s a e la G ecia e l’I alia. Nei appo i ISTISAN 17/18 è s a o ipo a o che il 95,1% e il 77,5%
ispe i amen e di 1681 isola i di K.pneumoniae e di 17 isola i di E. coli è p odu o e di KPC,
classi icando l’I alia come un Paese ipe -endemico pe ques a ca bapenemasi.
Le ca bapenemasi KPC e GES sono codi ica e da plasmidi e pe ale mo i o hanno il maggio e
po enziale di di usione e asmissione. Inol e, sebbene gli enzimi KPC siano p e alen emen e
p odo i da ceppi di K. pneumoniae, sono s a i segnala i anche in al e specie, come En e obac e
e Salmonella spp. ed E. coli. (Ripabelli G e al., 2019). Le ca bapenemasi di ipo KPC id olizzano
β-la amici di u e le classi, con l'id olisi più e icien e osse a a pe ni oce in, ce alo ina,
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ce alo idina, benzilpenicillina, ampicillina e pipe acillina. Imipenem, me openem, ce o axime e
az eonam sono id olizza i 10 ol e meno e icien emen e ispe o alle penicilline e ce alospo ine.
Inol e, l’id olisi osse a a pe ce oxi ina e ce azidime isul a debole, ma in ogni caso p esen e,
con e mando che KPC ha un ampio spe o di azione nei con on i di di e si an ibio ici β-la amici.
Il a amen o delle in ezioni causa e da ques i o ganismi è es emamen e di icile a causa della
lo o mul i esis enza, de e minando al i assi di mo ali à (Ripabelli G e al., 2019).
I geni blaKPC sono po a i da plasmidi e le sequenze adiacen i ad essi mos ano una limi a a
di e si à, sugge endo la de i azione da una singola on e. Tali geni sono con enu i nel asposone
Tn4401 (T asposone Tn3), colloca i a sequenze ipe u e ed in e i e di ci ca 39 bp e delimi a i da
si i di duplicazione di ci ca 5 bp. Tale s u u a indica che è a enu o un p ocesso di asposizione
eplica i a ( ipico dei asposoni del ipo Tn3), che pe me e la di usione di sequenze KPC a
di e se uni à gene iche, po ando a dis in i plasmidi codi ican i pe KPC (Tzou elekis LS e al.,
2012). Ad oggi, sono s a e desc i e più di 20 di e en i a ian i KPC, ma KPC-2 e KPC- 3
imangono le a ian i più comunemen e iden i ica e (Wal he -Rasmussen J, Hoiby N, 2007; Pi ou
JDD e al., 2015).
Un al o ipo di β-la amasi è app esen a o dalla ca bapenemasi Guiana Ex ended Spec um (GES),
inizialmen e conside a o un enzima della amiglia ESBL, pe ché GES-1 non possede a a i i à
ca bapenemasica, ma successi amen e u ono iden i ica e alcune a ian i che la possede ano
sebbene debole. Ques i enzimi di e iscono pe la sos i uzione di due amminoacidi e possiedono i
mo i i ca a e is ici del si o a i o degli enzimi di classe A, con esidui di Cis eina nelle posizioni
69 e 238, iscon a i nella amiglia KPC. I geni codi ican i pe enzimi GES sono si ua i in in eg oni
su plasmidi. Sono s a e desc i e almeno 9 a ian i di GES e GES-2, GES-4, GES-5 e GES-6 hanno
sos i uzioni di Aspa agina o Se ina in posizione 170, associa e all’id olisi dell’imipenem (Lee SH,
Jeong SH, 2005; Vou li S e al., 2004).
 Classe B: Me allo-β-la amasi
Le Me allo-β-la amasi (MβL) cos i uiscono una classe di enzimi (classe B) che, nonos an e la lo o
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di e si à nella sequenza amminoacidica, condi idono e p op ie à unzionali, o e o la capaci à
di id olizza e i ca bapenemi, la esis enza agli inibi o i e la sensibili à ad agen i chelan i, come
EDTA. Ques ’ul ima p op ie à è do u a al meccanismo di id olisi, in cui ca ioni bi alen i,
gene almen e ioni zinco (Zn2+), sono essenziali pe l’a acco nucleo ilo all’anello la amico. Lo
spe o di subs a i di ali enzimi è abbas anza ampio: ol e ai ca bapenemi, id olizzano
ce alospo ine e penicilline, ma non sono in g ado di id olizza e az eonam, pe la bassa a ini à con
cui le MβL legano i monoba amici. Ciononos an e, i sono a iazioni signi ica i e in e mini di
e icienza id oli ica, anche a enzimi dello s esso ipo. Le p ime MβL iden i ica e e analizza e
e ano c omosomali p esen i in ba e i oppo unis i di o igine ambien ale. I geni codi ican i pe
MβL non sono acilmen e as e ibili. Le p incipali p op ie à dis in i e includono la p esenza dello
ione zinco pe una e icien e id olisi del β-la ame e l’assen e susce ibili à all’inibizione da pa e
di acido cla ulanico e azobac am. L’analisi ilogene ica ha sugge i o l’esis enza di e discenden i
MβLs: β1 e β3. Il so og uppo β1 comp ende gli enzimi del ipo Ve ona In eg on-encoded Me allo-
β-lac amase (VIM), Imipenem- esis an Pseudomonas (IMP), Ge man Imipenemase (GIM) e New
Delhi Me allo β-la amasi (NDM). Di ques i, VIM, IMP e NDM sono s a i iscon a i in K.
pneumoniae. Le a ian i blaVIM e blaIMP iden i ica e in K. pneumoniae sono p esen i come “casse e
geniche” inco po a e in egioni a iabili degli In eg oni di classe 1, i quali se associa i con plasmidi
o asposoni acili ano il as e imen o a ba e i. Al con a io, i geni blaNDM non sono associa i a
in eg oni. Ceppi di K. pneumoniae p odu o i di VIM sono s a i iden i ica i pe la p ima ol a a
il 2001 e il 2003 nel Sud Eu opa, in segui o anche in No d Eu opa (Ge mania, F ancia,
Scandina ia) e negli S a i Uni i, sop a u o da pazien i colonizza i e as e i i da a ee ad al a
p e alenza. Inol e, casi spo adici sono s a i egis a i in Tunisia, Co ea del Sud, Venezuela, men e
solo in G ecia sono s a i egis a i e en i epidemici (Queenan AM, Bush K, 2007).
Il p imo ceppo p odu o e di IMP è s a o desc i o nel 1990, p incipalmen e in Giappone, ma anche
in Taiwan e Singapo e. Ceppi di K. pneumoniae p odu o i di IMP-4 hanno anche causa o epidemie
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in se ing ospedalie i in Cina e Aus alia (Queenan AM, Bush K, 2007).
Pe quan o igua da gli enzimi della amiglia NDM, MβL di più ecen e scope a, il p incipale
se ba oio di e en i epidemici è s a o il subcon inen e indiano, do e è s a a documen a a
ipe u amen e un’ele a a equenza di isolamen o in s u u e di assis enza ed anche una as a
di usione in di e en i nicchie ambien ali. Il p imo ceppo di K. pneumoniae p odu o e di NDM u
iden i ica o in un pazien e indiano e esiden e in S ezia nel 2008, ico e a o pe una in ezione a New
Delhi p ima di a i o no in S ezia (Yong D e al., 2009). La ecen e di usione di ceppi p odu o i
di NDM in Eu opa Occiden ale, Ame ica del No d, Aus alia e in Es emo O ien e è s a a a ibui a
a pazien i p o enien i sop a u o da India, Pakis an e Bangladesh (No dmann P e al., 2011).
Recen emen e, in I alia sono s a i isola i ceppi di K. pneumoniae p odu o i di NDM, a Ca ania
(Gona F e al 2019) e in Toscana ed hanno causa o un e en o epidemico (ECDC, Rapid Risk
Assessmen 2019).
Dalla p ima desc izione di NDM-1 sono s a e indi idua e più di 10 a ian i di ques o enzima, di
cui la maggio pa e ha a u o o igine in Asia (No dmann P, Poi el L, 2014; Pi ou JDD e al., 2015).
La maggio pa e dei mic o ganismi p odu o i di NDM-1 codi ica anche pe al i meccanismi di
esis enza, a i quali: β-la amasi AmpC media e da plasmidi (sop a u o CMY), ESBL (sop a u o
CTX-M-15), ca bapenemasi (VIM e KPC), 16S RNA me il as e asi, de e minan i di esis enza
ai chinoloni media i da plasmidi, es e asi modi ican i i mac olidi e enzimi modi ican i i ampicina.
Di conseguenza, En e oba e i che p oducono enzimi di ipo NDM es ano più susce ibili ad agen i
come colis ina, os omicina e igeciclina (No dmann P, Poi el L, 2014; Pi ou JDD e al., 2015).
 Classe D: Oxa-β-la amasi
Le β-la amasi di classe D, anche de e OXA (“Oxacillinasi, o e o id olizzan i Oxacillina”)
hanno, nel complesso, un’a i i à ca bapenemasica debole e non sono inibi i da acido cla ulanico
ed EDTA, ma da NaCl. Sebbene la maggio pa e delle a ian i di β-la amasi di classe D
id olizzan i i ca bapenemi siano s a i indi idua i in Acine obac e spp., OXA-48 è s a o o a o
solo nelle En e obac e iaceae, sop a u o in ceppi di K. pneumoniae di o igine nosocomiale e in
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l’iden i icazione di ceppi mc -1 posi i i negli alimen i impo a i, nei iumi u bani e in iaggia o i
e idenziano il po enziale di mc -1 di con inua e a di onde si (No dmann P e al., 2016). In modo
alla man e, mc -1 è s a o iden i ica o in di e si ba e i MDR, a cui En e obac e iaceae p odu o i di
ESBL e ca bapenemasi (No dman P e al 2016). Dopo mc -1, sono s a e iden i ica e nume ose al e
a ian i del gene (mc -2,3,4,5,6,7,8) (Ca a oli A e al 2016; Xa ie Be al 2016; Ba bie i NL e al
2017; Yin We al 2017; Bo owiak M e al 2017; Wang X e al 2018; Yang e al 2018).

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2.6. Alimen i e an ibio ico- esis enza
Le mala ie di o igine alimen a e sono un'impo an e causa di mo bili à e mo ali à in u o il mondo,
ma è di icile de ini e il ca ico sani a io ed economico do u o ad alimen i mic obiologicamen e non
sicu i (WHO, 2015). Gli agen i pa ogeni possono con amina e il cibo in qualsiasi pun o lungo la
ca ena alimen a e: p esso l'azienda ag icola, l'impian o di as o mazione, du an e il aspo o, nei
pun i di endi a, nel se izio di is o azione o in ambi o domes ico (Chapman B, Gun e C, 2018).
Quasi una pe sona su 10 nel mondo si ammala ogni anno a causa del consumo di alimen i con amina i;
la gas oen e i e è il sin omo più comune di mala ia, con 550 milioni di casi e 230.000 mo i ogni
anno nel mondo (Wo ld Heal h O ganiza ion 2019). Nei bambini di e à in e io e ai cinque anni, è
s a o associa o il 40% del bu den o ale da mala ie a asmissione alimen a e e al ol a p esen ano
sequele po enzialmen e pe manen i. Campylobac e jejuni e C. coli e Salmonella en e ica sono le
cause più comuni di dia ea ba e ica a li ello globale e sono esponsabili ispe i amen e di ci ca 96
e 80 milioni di in ezioni ogni anno (WHO, 2015).
La p esenza di agen i pa ogeni MDR negli alimen i di o igine animale come la e, ca ne e pollame è
no e olmen e aumen a a negli ul imi anni (Muloi D e al., 2018). La lo o capaci à di e ol e si pe
acquisi e nuo e ca a e is iche, in pa icola e, la esis enza a più a maci, è di enu o un p oblema
mondiale. Con la di usione negli alimen i di o igine animale a causa dell'abuso di a maci
an imic obici negli alle amen i, alcuni ba e i MDR esponsabili di zoonosi sono in g ado, oggi, di
aggiunge e il a o in es inale umano eicolando u i i geni di AMR (Muloi D e al., 2018; Pé ez-
Rod íguez F, Me canoglu Taban B, 2019).
Le in ezioni sos enu e da ba e i al amen e esis en i non si limi ano più alle sole ICA acquisi e nel
se ing ospedalie o, do e la asmissione di agen i pa ogeni a iene p incipalmen e da pe sona
in e a/colonizza a ad al e pe sone. Oggi, a a e so gli alimen i di o igine animale con amina i, i
pa ogeni MDR si di ondono, non solo ai g uppi ad al o ischio, come pazien i immunodep essi o
ulne abili, ma a u a la popolazione (Pé ez-Rod íguez F, Me canoglu Taban B, 2019).
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2.6.1. Salmonella en e ica non i oidea
Salmonella p o iene dalla amiglia delle En e obac e iacaeae, è un pa ogeno clinicamen e
impo an e sia pe gli animali sia pe l’uomo poiché la sua nicchia ecologica p incipale è il a o
in es inale di en ambi (Galanis E e al., 2006). In acco do con la classi icazione di Tindall (Tindall
BJ e al., 2005), ad oggi, sono conosciu e due specie, o e o Salmonella bongo i e S. en e ica.
Ques ’ul ima è compos a da sei so ospecie e una di ques e, S. en e ica subsp. en e ica, comp ende
ci ca 2000 se o a su ci ca 2600 di u o il gene e Salmonella. Alcuni di ques i sono pa ogeni s e i
pe l’uomo (Salmonella Typhi) e al i in ece igua dano solo gli animali (Salmonella Abo uso is).
Mol i se o a di Salmonella causano zoonosi e sono pa ogeni sia pe l’uomo, sia pe gli animali
(LeLiè e V e al., 2019).
Le salmonellosi nell'uomo e negli animali possono esse e ampiamen e classi ica e in due g uppi,
ebb e en e ica ( i o) e salmonellosi non i oidea (NTS) (Lang idge e al., 2008) con di e se
mani es azioni, quali ebb e en e ica, gas oen e i e, ba e iemia, in ezione ex a-in es inale e s a o di
po a o e sano (Lang idge e al., 2008). La maggio pa e dei se o a p o oca in iammazione
localizza a au o-limi an e dell’ileo e minale e del colon, no a come gas oen e i e, che in alcuni casi
necessi a di un a amen o an imic obico (Gal-Mo O, 2019). Ques i se o a di Salmonella non
i oidea sono anche iconosciu i come 'gene alis i' pe la lo o capaci à di colonizza e e in e a e
di e se specie animali che ungono da ise a ambien ale (Gal-Mo O, 2019). Secondo i Cen e s o
Disease Con ol and P e en ion (CDC) è s a o s ima o che Salmonella non i oidea sia esponsabile
di 1,2 milioni di in ezioni, 23.000 ico e i e 450 decessi ogni anno solo negli S a i Uni i (Scallan E
e al., 2011; CDC, 2013). Negli ul imi dieci anni, in Eu opa, annualmen e, sono s a i egis a i a
87.000 e 135.000 casi di salmonellosi nell’uomo (EFSA ECDC, 2014; Busani L e al., 2018). Nel
pe iodo 2008-2012, è s a a osse a a una iduzione s a is icamen e signi ica i a dei casi con e ma i
di salmonellosi umana ( iduzione del 35%); u a ia, nel pe iodo 2012-2016, il nume o di casi non è
ul e io men e diminui o. Nel 2016, nell'UE, 9.061 casi umani sono s a i associa i a 1.067 ocolai di
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salmonellosi di o igine alimen a e, che hanno po a o al ico e o del 40% delle pe sone a e e e al
decesso di 128 sogge i (0,25%) (Busani L e al., 2018). Salmonella spp. può esse e asmessa
all'uomo a a e so la ca ena alimen a e. Uo a e p odo i a base di uo a sono un'impo an e on e di
ocolai di salmonellosi di o igine alimen a e con un asso di 0,06 su 100.000 abi an i, segui i da
pollame e ca ne di maiale (0,03 ocolai di o igine alimen a e su 100.000) e o maggio (0,01 ocolai
di o igine alimen a e su 100.000) (EFSA & ECDC, 2017). Salmonella è semp e più maggio men e
iscon a a nei bo ini da la e di u o il mondo (Chlebicz A, Slizewska K, 2018).
Una maggio e p e alenza di Salmonella non i oidea con p o ilo di AMR è s a a osse a a a il 2005-
2015 (C ump JA e al., 2015), in pa icola e con p o ilo MDR, mos ando esis enza a e o più classi
an imic obiche (Figuei edo R e al., 2019). Inol e, in alcuni Paesi eu opei, sono s a i iden i ica i ceppi
eme gen i MDR di S. en e ica che p esen ano de e minan i di esis enza ai me alli pesan i (Mou ao J
e al., 2015). Isola i clinici di Salmonella mos ano ele a i assi di esis enza a sul amidici, e acicline
e ampicillina. Nell'UE, la p oduzione di ESBL negli isola i di Salmonella di o igine umana è s a a
iden i ica a con una equenza pa i a 0,5%, app esen a i con ol e 10 di e si se o a (EFSA &
ECDC, 2017). Pe quan o igua da i da i di mul i esis enza nell'UE, i assi più ele a i sono s a i
egis a i in S. Typhimu ium mono asica, che è a ualmen e il e zo se o a più equen e in Eu opa
nel causa e in ezione nell’uomo, con 5.770 casi nel 2015, ol e ad esse e il secondo più comune nei
suini e il p imo in e mini di mul i esis enza (EFSA, 2017a; Flo ez-Cuad ado D e al., 2018). Mol i
se o a di Salmonella, a cui Agona, Ana um, De by, Heidelbe g, In an is, Ken ucky, Muenchen,
Newpo , Schwa zeng und e Typhimu ium sono comunemen e ile a i negli animali e nei p odo i
alimen a i e sono associa i a in ezioni nell'uomo da ceppi esis en i (Po nsuka om S e al., 2018).
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2.7. Genomica in Sani à Pubblica
Le a i i à di Sani à Pubblica in ambi o di mala ie in e i e possono esse e classi ica e come indagini
epidemiologiche, so eglianza o ien a a al con ollo delle mala ie in e i e e so eglianza o ien a a
alla de inizione di s a egie da a ua e pe e i a ne l’inso genza (S uelens MJ, B isse S, 2013).
L'obie i o p incipale di un'indagine epidemiologica è quello di iden i ica e le possibili on i di
in ezione e di a ua e misu e di con ollo e icaci e app op ia e pe limi a e e/o elimina e il ischio di
un’ul e io e di usione (Van Goe hem N e al., 2019). Le indagini sulle epidemie soli amen e engono
in ap ese dopo un imp o iso aumen o del nume o di casi di in ezione, men e la so eglianza è la
accol a, l'analisi e la e isione sis ema ica di da i pe la piani icazione, l'implemen azione e la
alu azione dei p og ammi di Sani à Pubblica (Van Goe hem N e al., 2019).
Negli ul imi decenni, gli epidemiologi hanno a o passi da gigan e nel accia e la di usione delle
in ezioni all'in e no e a le s u u e sani a ie in eg ando s udi di epidemiologia classica con di e en i
me odiche di ipizzazione molecola e. T a ques i, alcuni app occi alu ano la s u u a (Pulsed Field
Gel Elec opho esis - PFGE) o la sequenza (Mul ilocus Sequence Typing - MLST) del ma e iale
gene ico di un mic o ganismo, al ine di de e mina e le elazioni a gli isola i e alu a e se essi sono
plausibilmen e collega i nella asmissione dell’in ezione.
Recen emen e, il sequenziamen o dell'in e o genoma (Whole Genome Sequencing - WGS) ha
miglio a o l'epidemiologia molecola e, o nendo uno s umen o unico pe u i che supe a
i ualmen e u i i limi i dei me odi p eceden i, come la di icol à di in e p e azione dei da i, la
de e minazione piu os o a bi a ia dei cu -o , l’u ilizzo di una ecnica a di e se scale di g andezza,
come accade u ilizzando l’MLST, che ha un o imo po e e isolu i o a li ello globale o egionale, ma
è di icilmen e applicabile pe la de e minazione di elazioni clonali all’in e no di un unico ospedale.
La PFGE, in ece, possiede un ele a o po e e disc iminan e an o da ende e di icile il con on o a
pa ogeni p o enien i da egioni geog a iche di e en i (Hawken SE, Sni kin ES. 2019).
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La capaci à di analizza e e con on a e in e i genomi di pa ogeni con una maggio e eloci à, a cos i
mino i e con un’ampia p ecisione signi ica che la genomica s a pe esse e applica a anche nella
mic obiologia clinica di ou ine e nella ice ca pe le indagini sui ocolai epidemici. Le in o mazioni
igua dan i i mic o ganismi pa ogeni o enu e median e ecniche di genomica possono esse e
u ilizza e nella p a ica clinica sia pe iden i ica e la causa dell'in ezione, sia pe alu a e la sensibili à
agli an ibio ici dei pa ogeni, il che ha pe messo di indi idua e, in empi b e i, i a amen i miglio i
pe un ipo di in ezione, in oducendo ques e ecniche come ondamen ali pe la medicina
pe sonalizza a (Johnson SB, Pa ke M, 2019).
È s a o dimos a o che il WGS o nisce una isoluzione su icien e a chia i e i meccanismi di
asmissione come l'o igine, i empi, la asmissione e la di usione della mala ia, men e al empo
s esso p oduce da i che acili ano il moni o aggio dei pa ogeni a li ello globale (Hawken SE, Sni kin
ES, 2019; Ladne JT e al., 2019). G azie a ques i me odi sa à possibile p e ede e le pandemie e
l’e oluzione dei pa ogeni, in modo da on eggia e le eme genze con maggio e consape olezza
(Ladne JT e al., 2019).
Le indagini bene iciano così di una maggio e isoluzione dei da i qual è quella o e a da WGS pe
l'acce amen o dei casi, pe me endo di associa e i casi alle possibili on i di in ezione, de inendo i
clus e di asmissione e o nendo un apido eedback sugli a ibu i eno ipici chia e ( esis o ipo:
p o ilo eno ipico di esis enza agli an ibio ici) dei pa ogeni coin ol i. L'applicazione del WGS è,
in ine pa icola men e u ile pe alu a e l'impa o dei p og ammi di p e enzione e con ollo, come
campagne di accinazione e ges ione nell’u ilizzo degli an ibio ici (Van Goe hem N e al., 2019).
Poiché il WGS è di en a o il me odo di ipizzazione mic obica di i e imen o nello s udio di ou b eak
è semp e più applica o alla so eglianza nazionale delle mala ie in e i e nei Paesi UE/SEE. Inol e,
l’ECDC, nel 2015, du an e una consul azione con un eam di espe i di ogni se o e disciplina e, ha
esp esso un pa e e su ale ecnica e o mula o una s a egia di u ilizzo
(h ps://www.ecdc.eu opa.eu/si es/de aul / iles/documen s/ amewo k- o -genomic-
su eillance.pd ). G azie ad una miglio e alu azione delle dinamiche di asmissione delle mala ie

Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
48
e della esis enza ai a maci, e à miglio a a l'accu a ezza e l'e icacia della so eglianza sulle
mala ie in e i e, delle indagini sulle epidemie e della de inizione delle poli iche di p e enzione.
2.7.1. La geno ipizzazione degli isola i ba e ici
La ipizzazione ba e ica iene u ilizza a pe disc imina e i ceppi ba e ici ed è essenziale nelle
indagini epidemiologiche, nella so eglianza e negli s udi ilogene ici. I p imi espe imen i di
ipizzazione sono s a i condo i a a e so es biochimici i cui isul a i e ano basa i sul eno ipo
ba e ico, come la esis enza agli an ibio ici, la susce ibili à nei con on i dei agi ( ipizzazione
agica) e la p esenza di an igeni di supe icie (sie o ipizzazione) (Foxman B e al., 2005). Con
l'a en o della biologia molecola e, i me odi di ipizzazione basa i sull’analisi del DNA sono s a i
semp e più u ilizza i poiché i isul a i di ques i p o ocolli sono ip oducibili a causa della na u a s abile
degli acidi nucleici, ol e ad esse e più apidi e meno labo iosi (Riley LW, 2018).
2.7.1.1. Pulsed Field Gel Elec opho esis (PFGE)
La PFGE o ele o o esi su gel in campo pulsa o è una me odologia di ipizzazione molecola e
s iluppa a da Schwa z e Can o nel 1984 ed è conside a a un app occio molecola e di e za
gene azione pe la ipizzazione ba e ica (Goe ing RV, 2010). Essa consen e di sepa a e miscele di
molecole di DNA g andi di 20 kb ino a 5 Mb su gel di aga osio, iducendo il di a io a la isoluzione
dell'ele o o esi con enzionale (0,1-30 kb) e i me odi ci ogene ici (>5 Mb). Tu e le analisi
molecola i dalla p ima alla e za gene azione ichiedono l'uso dell'ele o o esi su gel di aga osio pe
sepa a e i ammen i di DNA plasmidico o genomico dopo la es izione enzima ica (Lopez-Cano as
L e al., 2019). L'iden i icazione di clus e epidemici si basa sull’analisi di p o ili cos i ui i da a ie
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
49
bande di DNA. Come inno azione ispe o ad un app occio di p ima e seconda gene azione, è
p esen e il mo imen o e la sepa azione dei ammen i del genoma che, ol e a dipende e dalle
dimensioni molecola i di ciascun ammen o limi a o, nella PFGE si basa anche sul io ien amen o
pe iodico pulsa o dei campi ele o o e ici (Goe ing RV, 2010). Poiché i genomi ba e ici hanno una
dimensione di 2-4 Mbp, l'ele o o esi pulsa a consen e una più chia a sepa azione dei ammen i di
DNA di a ie dimensioni (da kb a Mb), con una conseguen e maggio e isoluzione nella ipizzazione
(Neoh H e al., 2019). La PFGE pe me e l’analisi di un inge p in ing, che app esen a i
cambiamen i/mu azioni nei si i di iconoscimen o dell'endonucleasi (che po a alla pe di a o
all’acquisizione di si i di es izione). Pe an o, ali in o mazioni possono esse e u ilizza e pe indagini
di co elazione gene ica a li ello di ceppo. Sono s a e p opos e linee guida pe l'in e p e azione dei
modelli di es izione gene a i da PFGE, de ini i come c i e i di Teno e (Teno e e al.,1995). I ceppi
sono conside a i gene icamen e 'indis inguibili' se i p o ili di PFGE mos ano lo s esso nume o e
dimensione dei ammen i di DNA. Sono conside a i 's e amen e co ela i' se i p o ili di PFGE
di e iscono da un ceppo di i e imen o da cambiamen i coe en i con un singolo e en o gene ico
(di e enza di 2 o 3 bande). Se i pa e n PFGE di e iscono pe 4 ino a 6 bande, si i iene che abbiano
subi o due e en i gene ici indipenden i e quindi siano 'possibilmen e co ela i'. Se i ceppi hanno
di e enze di banda >6 ispe o a un modello di i e imen o, essi sono conside a i 'di e si' e
gene icamen e non co ela i (Riley LW e al., 2018). Nonos an e il suo ampio u ilizzo, la PFGE è un
me odo labo ioso a causa della p epa azione del campione, del lungo pe iodo di empo di co sa e
della dipendenza dalla col u a ba e ica, in quan o il p o ocollo p e ede l’u ilizzo di in e e colonie,
p eceden emen e col i a e, da so opo e a a amen o con bu e e p o einasi e successi amen e a
diges ione enzima ica (Quainoo S e al., 2017). La PFGE può esse e u ilizza a pe la ipizzazione
molecola e di qualsiasi o ganismo ba e ico col i abile senza una conoscenza p elimina e delle
sequenze di DNA ed è più disc iminan e ispe o ad al i es basa i sull'ele o o esi (Riley LW e al.,
2018).
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
50
2.7.1.2. Mul iLocus Sequence Typing (MLST)
La me odica MLST, p opos a nel 1998, è basa a sul sequenziamen o genico pe iden i ica e le
elazioni clonali a di e si ba e i. Ques a ecnica si pone l’obie i o di ipizza e i mic o ganismi
escludendo dall’analisi i de e minan i genici che possono esse e acquisi i da un ba e io median e
as o mazione o as e imen o o izzon ale. Quindi, p e ede l’analisi di geni conse a i denomina i
‘housekeeping’ eu ilizza come uni à di con on o gli alleli, piu os o che le sequenze di nucleo idi.
Ogni cambiamen o allelico iene con eggia o come un singolo e en o gene ico, indipenden emen e
dal nume o di polimo ismi nucleo idici coin ol i (Maiden M e al., 2013). Nella maggio pa e degli
schemi u ilizza i di MLST, engono indicizza i se e 'loci MLST'. Viene assegna o un nume o di
allele uni oco pe ciascun locus con una sequenza uni oca. La combinazione degli alleli pe ciascuno
dei loci ca a e izzano il p o ilo allelico (ad esempio, 2-3-4-3-8-4-6), gene ando quindi un Sequence
Type (ST), anch’esso de ini o e ca a e izza o da un nume o disponibile da un ampio da abase (ad
esempio, ST11). ST e sequenze alleliche sono co ela e ai ispe i i p o ili nei da abase di MLST
(PubMLST da abase collec ion) e ciascun ST iassume le in o mazioni di migliaia di coppie di basi
di DNA. Il da o ela i o all’assegnazione dell’ST può esse e, quindi, u ilizza o come un codice a ba e
pe di e enzia e gli isola i e pe s abili e elazioni e olu i e ami e s umen i di analisi speci ici
(Maiden M e al., 2013). Sebbene un ST app esen i solo una piccola pe cen uale delle pa i
'conse a e' del genoma analizza o, la g ande a ie à in e mini di ST di e si in mol e specie ba e iche
dimos a l'impo anza come mezzo di con on o dei da i. Ciononos an e, ques a ecnica non è in g ado
di mos a e elazioni in e -specie; di conseguenza, anche nello s esso gene e ba e ico è necessa io
u ilizza e di e si schemi di MLST; allo s esso empo, non è su icien emen e disc iminan e pe
dis ingue e singoli cloni appa enen i alla s essa lineage (Jolley KA e al., 2012).
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
51
2.7.1.3. Whole Genome Sequencing (WGS)
WGS è anche de ini o il sequenziamen o dell’in e o genoma. Ciò è eso possibile g azie alle nuo e
ecniche di ‘Nex Gene a ion Sequencing’ (NGS), che pe me ono di o ene e un g an nume o di da i
in b e e empo e a cos i ela i amen e bassi (Ha is S e al., 2013; Deu enbe g R e al., 2017).
L’applicazione del WGS è ampia e può spazia e dal sequenziamen o del genoma umano, o ando
spazio nella medicina pe sonalizza a, ino al sequenziamen o di mic oo ganismi, pe comp ende ne
ilogenesi, modali à di asmissione, p o ili di esis enza e appa enenza ad e en i epidemici. Il
sequenziamen o dell'in e o genoma può esse e u ilizza o nella ou ine di la o o di labo a o io nel caso
in cui sia ichies a la ipizzazione di agen i pa ogeni median e un me odo con il più al o po e e
disc iminan e, ad esempio nelle indagini di ocolai epidemici in ambi o ospedalie o (Zhou K e al.,
2016). Il WGS di genomi ba e ici può esse e usa o anche pe i ela e la p esenza di geni di AMR o
geni associa i a i ulenza e pa ogenici à, che al ol a non engono esp essi in i o, ma sol an o in
i o (Quainoo S e al., 2017), nonché pe iden i ica e nuo i meccanismi di pa ogenici à e esis enza
(Fe dous M e al., 2016). Inol e, il sequenziamen o di nuo a gene azione consen e di e e ua e anche
s udi di me agenomica ami e l'iden i icazione col u a-indipenden e degli agen i pa ogeni in
campioni complessi, comp esi campioni clinici, ambien ali e alimen a i, consen endo anche
l'iden i icazione di axa esigen i e di icili da col i a e (Saba AJ e al., 2017).
In di e si Paesi, come S a i Uni i, Danima ca, Regno Uni o, Ge mania e Paesi Bassi, la
geno ipizzazione di ba e i pa ogeni basa a sull’uso di WGS è già in ase di spe imen azione pe
l'implemen azione come s umen o di ou ine pe il moni o aggio e il ile amen o di ceppi MDR
(Peco a N e al., 2015), nonché pe l’iden i icazione empes i a di ocolai epidemici (Joensen K e
al., 2015; Ey e DW e al., 2015). La ipizzazione basa a su WGS di agen i pa ogeni include elemen i
gene ici mobili e o nisce una isoluzione senza p eceden i nel disc imina e anche linee gene iche
al amen e co ela i e po ebbe e i a e l'uso di p o ocolli uni oci pe una sola specie.
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
58
4.1.2 Tes di susce ibili à agli an ibio ici
La alu azione della susce ibili à agli an ibio ici è s a a e e ua a in collabo azione con i Labo a o i
di mic obiologia del P esidio Ospedalie o “A. Ca da elli” usando BD Phoenix™ Au oma ed
Mic obiology Sys em (Bec on Dickinson Diagnos ic Sys ems, Spa ks, Uni ed S a es), che ha
pe messo di alu a e la concen azione minima iniben e (Minimal Inhibi o y Concen a ion, MIC) di
ciascun an ibio ico. Gli an ibio ici es a i pe K. pneumoniae e A. baumannii sono indica i nella
(Tabella 3).
Inol e, nei ceppi di K. pneumoniae, pe la de e minazione della MIC pe la colis ina in K. pneumoniae
è s a o usa o il me odo della mic odiluizione. I isul a i sono s a i in e p e a i seguendo le linee guida
dell’Eu opean Commi ee on An imic obial Suscep ibili y Tes ing (EUCAST, Eu opean commi ee
on an imic obial suscep ibili y es ing, 2019).
È da so olinea e che non u i i ceppi sono s a i es a i pe lo s esso panel di an ibio ici; pe an o, la
susce ibili à ad essi è s a a esp essa in pe cen uale in elazione al nume o dei ceppi pe i quali ne è
s a a alu a a la suce ibili à e so un an ibio ico.

Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
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Tabella 3: An ibio ici es a i pe la de e minazione della MIC
ANTIBIOTICO
Nume o di ceppi es a i
di K. pneumoniae
Nume o di ceppi es a i
di A. baumannii
Imipenem
26/26
24/24
Me openem
26/26
24/24
E apenem
26/26
0/24
Az eonam
0/26
24/24
Ampicillina
26/26
20/24
Amoxicillina-cla ulana o
26/26
24/24
Pipe acillina
26/26
15/24
Pipe acillina- azobac am
26/26
24/24
Ce azidime
26/26
0/24
Ce azolina
0/26
13/24
Ce oxi ina
0/26
18/24
Ce u oxime
26/26
0/24
Ce o axime
26/26
23/24
Amikacina
26/26
24/24
Gen amicina
26/26
24/24
Cip o loxacina
26/26
24/24
Le o loxacina
26/26
24/24
Fos omicina
26/26
0/24
Clo am enicolo
26/26
14/24
T ime op im
0/26
24/24
T ime op im-sul ame ossazolo
26/26
0/24
Tigeciclina
26/26
0/24
Tob amicina
26/26
0/24
Colis ina
26/26
23/24
Te aciclina
0/26
15/24
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
60
4.1.3 Es azione del DNA
Il DNA è s a o es a o u ilizzando Maxwell® 16 Cell DNA Pu i ica ion (P omega, Milan, I aly)
median eil ki di pu i icazione Cell Pu i ica ion Ca #AS1010. Il me odo pe me e l’es azione
simul anea di 16 campioni in soli 40 minu i, s u ando le capaci à della silice di adso bi e il
ma e iale gene ico.
Il p o ocollo di es azione ha p e is o di e se asi:
 lisi del campione;
 legame degli acidi nucleici a pa icelle di silice magne izza a;
 sepa azione delle pa icelle lega e da al i componen i cellula i;
 eluizione degli acidi nucleici da u ilizza e pe successi e analisi.
Fase di lisi cellula e
La sospensione ba e ica è s a a so opos a a lisi p ima dell’es azione. È s a o, quindi, e e ua o il
p elie o di un’ansa a di pa ina mic obica da pias e di T yp on Soy Aga (TSA), p eceden emen e
incuba e o e nigh , in segui o isospesa in 300 µl di soluzione, con enen e 260 µl di Bu e di lisi
L6 (Tiociana o Guanidina + TRIS HCl pH 6.4 0,1M, EDTA 0,2M pH 8, T i on) e 40 µl di
P o einasi K (20 mg/ml) (IBI Shel on Scien i ic, Milano). Successi amen e, la sospensione è s a a
incuba a a 65°C pe 10 minu i. Pe la lisi comple a della memb ana es e na, la sospensione è s a a
iscalda a a 100°C pe 10 minu i e cen i uga a a 12.000 pm pe 1 minu o.
Fase di es azione degli acidi nucleici
Il p o ocollo di es azione in base al Maxwell 16® Ins umen Techinical Manual p e ede di
posiziona e le ca ucce disponibili pe l’es azione, una pe ciascun ceppo, su un ack nume a o,
pe poi imuo e e il sigillan e ed esegui e le seguen i ope azioni:
 as e i e la sospensione o enu a dalla ase di lisi (ci ca 300 µl) nel pozze o #1 della
ca uccia, con assegna o da un codice iden i ica i o;
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
61
 posiziona e un pis one (“plunge ”) nel pozze o #7 di ciascuna ca uccia;
 accende e lo s umen o e usa e il cu so e “Run” pe e e ua e una co sa di pu i icazione e
seleziona e il me odo e il ipo di campione da cui es a e il DNA (Cell in ques o caso);
 ap i e lo spo ello dello s umen o e p eme e “Run/S op” pe es ende e la pia a o ma
e so l’es e no, al ine di posiziona e co e amen e le ca ucce, ciascuna con enen e un
pis one;
 in ogni pos azione, nume a a da 1 a 16, p edispo e un ubo di eluizione, con enen e 300
µl del Bu e di eluizione, incluso nel ki ;
 p eme e “Run/S op” pe pe me e e alla pia a o ma di i a si e so l’in e no e chiude e
lo spo ello pe pe me e e l’inizio del p ocesso di es azione.
Quando la pu i icazione è s a a comple a a, il moni o LCD mos a un messaggio pe indica e
che il p ocesso è e mina o e quindi:
 p eme e “Run/S op” pe po a e in a an i la pia a o ma dello s umen o;
 imuo e e i ubi di eluizione dalla pia a o ma dello s umen o e posiziona li nel ack
magne ico, che pe me e di a p ecipi a e le pa icelle sul ondo del ubo;
 as e i e i campioni da ciascun ubo di eluizione in ubi s e ili;
 imuo e e le ca ucce ed i pis oni ed elimina li.
4.1.4. Rice ca di geni implica i nella esis enza ai ca bapenemi
Nei ceppi di K. pneumoniae, è s a a e e ua a la ice ca dei p incipali geni coin ol i nella esis enza
ai ca bapenemi, quali blaKPC, blaGES, blaIMP, blaVIM, blaOXA-48 e blaNDM-1 median e saggi di PCR
u ilizzando p ime speci ici (Tabella 4), come p eceden emen e ipo a o (Dallenne C e al., 2010;
No dmann P e al., 2011). L’ampli icazione è s a a e e ua a in eazioni dal olume inale di 25 μl
u ilizzando 2 μl di DNA, 1X Mas e Mix (P omega Co po a ion) e p ime s (Eu o ins Genomics, s l,
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
62
Ebe sbe g, Ge many) u ilizza i alla concen azione di 1 µM. I geni a ge sono s a i ampli ica i usando
le seguen i condizioni: 94°C pe 2 min; 35 cicli: 94°C pe 1 min, 45°C (blaIMP)/52°C (blaKPC)/54°C
(blaGES)/56°C (blaVIM/OXA-48)/60°C (blaNDM-1) pe 40 sec, 72°C pe 1 min; 72°C pe 5 min. I p odo i
di PCR sono s a i sepa a i median e ele o o esi su gel di aga osio (alla concen azione di 1-1,5%
m/ , TAE bu e 1X a 100 V pe 1 h), includendo il ladde di DNA (P omega) da 100 bp. In ogni
eazione è s a o incluso un con ollo nega i o e un con ollo posi i o.
È s a a, inol e, alu a a la p esenza dei geni blaSHV, blaTEM e blaCTX-M codi ican i pe le ESBL
median e saggi di mul iplex-PCR, usando oligonucleo idi speci ici (Tabella 4), come ipo a o
p eceden emen e (Ghasemi Y e al., 2013). I p odo i di PCR sono s a i isualizza i dopo ele o o esi
su gel di aga osio (concen azione 1-1,5% m/ , TAE bu e 1X a 100 V pe 1 h), includendo in ogni
eazione ladde di DNA di 100 bp (P omega), un con ollo posi i o e un con ollo nega i o.
Nei ceppi di A. baumannii, la p esenza di geni codi ican i pe le p incipali ca bapenemasi (blaSHV,
blaKPC, blaGES, blaIMP, blaVIM, blaNDM-1, blaGIM, blaAmpC, blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 e blaOXA-58)
(Tabella 5) e di quelli codi ican i pe le pompe di e lusso coin ol e nei meccanismi di esis enza
e so nume osi an ibio ici (adeB, adeG e adeJ, abeS, c aA, abeM, soxR) è s a a alu a a median e
saggi di PCR (Tabella 6). Le eazioni sono s a e e e ua e in un olume inale di 25 µl con enen e 2
µl di DNA, 1X Mas e Mix (The mo Fishe PCR Mas e Mix 2X), p ime s (Tabelle 5-6) u ilizza i ad
una concen azione a iabile (0,5 µM pe blaVIM e blaNDM-1, 2 µM pe abeM e abeS, 1 µM pe u i
gli al i geni) e acqua pe po a e a olume.
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
63
Tabella 4: P ime u ilizza i pe la ice ca di geni codi ican i pe le ca bapenemasi e le ESBL nei ceppi
di K. pneumoniae
Gene
a ge
Sequenza (5’-3’) dei p ime
Peso
molecola e
Ri e imen i
bibliog a ici
Ca bapenemasi
classe A
blaKPC
F: CATTCAAGGGCTTTCTTGCTGC
R: ACGACGGCATAGTCATTTGC
538 bp
Dallenne C e al., 2010
blaGES
F: AGTCGGCTAGACCGGAAAG
R: TTTGTCCGTGCTCAGGAT
399 bp
Dallenne C e al., 2010
Ca bapenemasi
classe B
blaVIM
F: GATGGTGTTTGGTCGCATA
R: CGAATGCGCAGCACCAG
390 bp
Dallenne C e al., 2010
blaIMP
F: TTGACACTCCATTTACDG
R: GATYGAGAATTAAGCCACYCT
139 bp
Dallenne C e al., 2010
blaNDM-1
F: GGGCAGTCGCTTCCAACGGT
R: GTAGTGCTCAGTGTCGGCAT
475 bp
Shenoy KA e al., 2014
Ca bapenemasi
classe D
blaOXA-48
F: GCTTGATCGCCCTCGATT
R: GATTTGCTCCGTGGCCGAAA
281 bp
Chaudha y M, Anu ag
P, 2014
ESBL
blaTEM
F: TCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGA
R: ACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT
445 bp
Ghasemi Y e al., 2013
blaCTX-M
F: ATGTGCAGYACCAGTAARGTKATGGC
R: TGGGTRAARTARGTSACCAGAAYCAGCGG
593 bp
Ghasemi Y e al., 2013
blaSHV
F: TCTCCCTGTTAGCCACCCTG
R: CCACTGCAGCAGCTGC(A/C)GTT
973 bp
Ghasemi Y e al., 2013
Dopo l’ampli icazione, è s a a e e ua a l’ele o o esi su gel di aga osio (concen azione 1,5%-2,5%
in base al peso molecola e del p odo o di PCR) in Bu e TAE 1X (Bio-Rad), impos ando 100 V e
400 mA pe 80 minu i. Pe ogni co sa ele o o e ica, è s a o incluso un ladde di 100 bp (The mo
Fishe GeneRule DNA Ladde 100 bp), anne pe il gene abeS pe il quale è s a o u ilizza o il ma ke
di 20 bp (The mo Fishe GeneRule DNA Ladde 20 bp).

Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
64
Tabella 5: P ime u ilizza i pe la ice ca di geni codi ican i pe le ca bapenemasi, β-la amasi e
ESBL in A. baumannii
Gene
Sequenza (5'- 3') dei p ime
Peso
molecola e
Ri e imen i bibliog a ici
ESBL
blaSHV
F: CGCCTGTGTATTATCTCCCT
293 bp
Bali EB e al., 2010
R: CGAGTAGTCCACCAGATCCT
Ca bapenemasi
blaKPC (1-5)
F: CATTCAAGGGCTTTCTTGCTGC
538 bp
Dallenne C e al., 2010
classe A
R: ACGACGGCATAGTCATTTGC
blaGES (1-9, 11)
F: AGTCGGCTAGACCGGAAAG
399 bp
Dallenne C e al., 2010
R: TTTGTCCGTGCTCAGGAT
Ca bapenemasi
blaIMP (9,16,18, 22 e 25)
F: TTGACACTCCATTTACDG
139 bp
Dallenne C e al., 2010
classe B
R: GATYGAGAATTAAGCCACYCT
blaVIM (1-2)
F: GATGGTGTTTGGTCGCATA
390 bp
Dallenne C e al., 2010
R: CGAATGCGCAGCACCAG
blaNDM-1
F: GGGCAGTCGCTTCCAACGGT
475 bp
Shenoy KA e al., 2014
R: GTAGTGCTCAGTGTCGGCAT
blaGIM
F: TCGACACACCTTGGTCTGAA
477 bp
Sa a i M e al., 2015
R: AACTTCCAACTTTGCCATGC
β-la amasi
blaAmpC
F: CGACAGCAGGTGGAT
510 bp
Zhang T e al., 2017
R: GGTTAAGGTTGGCATG
Ca bapenemasi
blaOXA-23
F: GATCGGATTGGAGAACCAGA
501 bp
Qi C e al., 2007
classe D
R: ATTCTGACCGCATTTCCAT
blaOXA-24
F: GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA
246 bp
Qi C e al., 2007
R: AGTTGAGCGAAAAGGGGATT
blaOXA-51
F: TAATGCTTTGATCGGCCTTG
353 bp
Shamsizadeh Z e al., 2017
R: TGGATTGCACTTCATCTTGG
blaOXA-58
F: AAGTATTGGGGCTTGTGCTG
599 bp
Shamsizadeh Z e al., 2017
R: CCCCTCTGCGCTCTACATAC
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
65
Tabella 6: P ime u ilizza i pe la ice ca di geni codi ican i pe le pompe di e lusso in A. baumannii
Famiglia
Gene
Sequenze (5'- 3') dei p ime
Peso molecola e
Ri e imen i bibligo a ici
RND
adeB
F: CTTGCATTTACGTGTGGTGT
168 bp
Coyne S e al., 2010
R: GCTTTTCTACTGCACCCAAA
adeG
F: GCGTTGCTGTGACAGATGTT
104 bp
Nowak J e al., 2015
R: TTGTGCACGGACCTGATAAA
adeJ
F: GGTCATTAATATCTTTGGC
221 bp
Fe nandez-Cuenca S e al., 2015
R: GGTACGAATACCGCTGTCA
SMR
abeS
F: TTTGGTCAGGCGCAGGTATT
86 bp
Li H e al., 2017
R: ACCAATGCAGGCAGCTAAGT
MFS
c aA
F: TTCATTGCTTGCGCCTTT
125 bp
Rumbo C e al., 2013
R: CCAGTGCCATGAAACATAATCA
MATE
abeM
F: AGGGACGTATTATGGCGAAA
165 bp
Rumbo C e al., 2013
R: CTGCTGTGCTTAGACCAATTTTT
soxR
F: ATGGATATTGGTGAAGTCG
405 bp
Li H e al., 2017
R: TTAAAGTTTTGTTGGCTGAT
4.1.5. Ca a e izzazione molecola e della esis enza alla colis ina in K. pneumoniae
Nei ceppi di K. pneumoniae esis en i alla colis ina (col-R) è s a a e e ua a, median e saggi di PCR,
la ice ca di geni codi ica i da plasmidi: mc -1(Ba bie i NL e al., 2017), mc -2 (Xa ie B e al., 2016),
mc -3 (Yin W e al., 2017), mc -4 (Ca a oli A e al., 2017), mc -5 (Bo owiak M e al., 2017), mc -6
(Wang X e al., 2018), mc -7(Yang YQ e al., 2018), mc -7.1(Yang YQ e al., 2018) e mc -8 (Wang
X e al., 2018). Le eazioni sono s a e e e ua e in un olume inale di 25 μl con 2 μl di DNA, 1X
Mas e Mix (P omega Co po a ion) e p ime s alla concen azione di 1 µM. Gli ampliconi sono s a i
sepa a i median e ele o o esi su gel di aga osio (concen azione 1-1,5% m/ , TAE bu e 1X a 100
V pe 1 h), usando un ladde di DNA (P omega) da 100 bp. In ogni eazione è s a o incluso un
con ollo nega i o e un con ollo posi i o (Tabella 7).
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
66
L’analisi del gene c omosomale mg B è s a a e e ua a u ilizzando la coppia di p ime mg B_Ex _F
e mg B_Ex _R pe l’ampli icazione del gene a ge e di alcune egioni iancheggian i il gene
(o enendo un amplicone di 253 bp), come ipo a o (Canna elli A e al., 2014). L’ampl icazione è
s a a e e ua a in un olume inale di 50 μl usando 5 μl di DNA empla e, 1X Mas e Mix (P omega
Co po a ion) e p ime s alla concen azione di 1 µM (Tabella 7).
In ogni eazione, sono s a i inclusi i con olli nega i i, app esen a i da ceppi sensibili alla colis ina
(col-S). I p odo i di PCR sono s a i inizialmen e analizza i median e isualizzazione in ele o o esi
su gel di aga osio (1,5% m/ concen azione, 1X TAE bu e a 100 V o 1 h) u ilizzando un ma ke
da 100 bp DNA (P omega). La p esenza di ampliconi con un peso molecola e supe io e all’a eso
(253 bp) ha sugge i o la p esenza di una Sequenza di Inse zione (IS) nel gene. Quindi, gli ampliconi
ela i i ai ceppi col-R sono s a i so opos i a sequenziamen o di Sange (Eu o ins Genomics, s l,
Ebe sbe g, Ge many), includendo anche ceppi col-S come con ollo. Le sequenze sono s a e
analizza e median e Basic Local Alignmen Sea ch Tool (BLAST; blas .ncbi.nlm.nih.go /Blas .cgi)
e p ocessa e con BioEdi 7.0.5., al ine di alu a e la p esenza di mu azioni pun i o mi all’in e no
del gene.
Pe adu e le sequenze di DNA o enu e è s a o u ilizza o EMBOSS T anseq
(h ps://www.ebi.ac.uk/Tools/s /emboss). Le sequenze p o eiche o enu e sono s a e so opos e a
successi e analisi median e P o ein Va ia ion E ec Analyze (PROVEAN) che, g azie ad un
algo i mo s udia o sulla unzionali à p o eica, pe me e di de e mina e l’impa o delle mu azioni sulla
p o eina s essa a a e so il calcolo di uno sco e o ‘pun eggio’ pe ogni mu azione segnala a (Choi e
al., 2012). Gli sco e di PROVEAN sono calcola i in base a sequenze omologhe accol e in un
da abase. Pe o imizza e la capaci à p edi i a di PROVEAN, è s a o scel o un alo e di cu -o dello
sco e pa i a 2,5 pe consen i e una miglio e sepa azione a le mu azioni dele e ie e quelle neu ali.
La a iazione dello sco e di allineamen o è s a a conside a a come misu a della a iazione di
somiglianza causa a dalla mu azione, pe me endo di de e mina e la unzionali à delle p o eine dopo
a e accumula o una o più mu azioni.
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
67
Tabella 7: P ime usa i pe la ice ca di geni associa i alla esis enza alla colis ina in K. pneumoniae
Gene
Sequenza (5’-3’) dei p ime
Peso molecola e
Ri e imen i bibliog a ici
mc -1
F: CGGTCAGTCCGTTTGTTC
R: CTTGGTCGGTCTGTAGGG
1626 bp
Ba bie i NL e al., 2017
mc -2
F: TGGTACAGCCCCTTTATT
R: GCTTGAGATTGGGTTATGA
16117 bp
Xa ie B e al., 2016
mc -3
F: TTGGCACTGTATTTTGCATTT
R: TTAACGAAATTGGCTGGAACA
542 bp
Yin W e al 2017
mc -4
F: ATTGGGATAGTCGCCTTTTT
R: TTACAGCCAGAATCATTATCA
1820 bp
Ca a oli A e al., 2017
mc -5
F: ATGCGGT TGTCTGCATTTATC
R: TCATTGTGGTTGTCCTTTTCTG
1644 bp
Bo owiak M e al., 2017
mc -6
F: GTCCGGTCAATCCCTATCTGT
R: ATCACGGGATTGACATAGCTAC
556 bp
Wang X e al., 2018
mc -7
F: TGCTCAAGCCCTTCTTTTCGT
R: TTCATCTGCGCCACCTCGT
892 bp
Yang YQ e al., 2018
mc -7.1
F: AGGGGATAAACCGACCCTGA
R: TGATCTCGATGTTGGGCACC
355 bp
Yang YQ e al., 2018
mc -8
F: AACCGCCAGAGCACAGAATT
R: TTCCCCCAGCGATTCTCCAT
667 bp
Wang X e al., 2018
mg B
F: TTAAGAAGGCCGTGCTATCC
R: AAGGCGTTCATTCTACCACC
253 bp
Canna elli A e al., 2014
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
74
I campioni di alimen i di o igine non animale pe il consumo umano sono s a i suddi isi in:
- ca ego ia “Ve du a”, includendo la u a da sola o in combinazione con al a u a, u e le e du e
da sole o in combinazione con al e e du e, c ude o co e; in essa sono s a e incluse anche u a e
e du a in sca ola, e ige a a e congela a, u a sci oppa a e e du e in salamoia, unghi, semi e
oglie;
- ca ego ia “Al o ipo di cibo”, includendo una mino anza di alimen i di e si, come g asso di o igine
ege ale.
I campioni classi ica i come 'mangimi' hanno igua da o qualsiasi sos anza o p odo o, comp esi gli
addi i i, as o ma i, pa zialmen e as o ma i o non as o ma i, des ina i ad esse e u ilizza i pe
l'alimen azione o ale degli animali a no ma del Regolamen o (CE) n. 178/2002 (a . 2). Gli 'alimen i
pe animali domes ici' sono ma e iali di o igine ege ale o animale des ina i al consumo da pa e degli
animali domes ici, inclusi i p odo i denomina i “dog chews” u ilizza i pe la pulizia dei den i degli
s essi.
I campioni ‘ambien ali’ sono s a i suddi isi in:
- ca ego ia “panno” usa o pe la a e e asciuga e e o a o in un ambien e di p oduzione alimen a e
du an e il moni o aggio mic obiologico;
- ca ego ia “ ampone” come campioni de i a i da es di igiene nell'indus ia della is o azione e
alimen a e o in un is o an e pe e i ica e la con aminazione c ocia a e es a e che le supe ici e gli
s umen i siano adegua amen e puli i;
- ca ego ia “al o campione” meno nume osi o meno speci ici.
In ine, i campioni di 'acqua' sono s a i campiona i da ambien i di p oduzione alimen a e come la ello
e aniche.

Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
75
4.2.2. Analisi dei campioni isul a i posi i i pe S. en e ica non i oidea
Sono s a i es apola i i da i ela i i a campioni con amina i da Salmonella non i oidea (n=982),
includendo anche le in o mazioni ela i e ai se o a e i da i di WGS. Il da abase o enu o da
STARLIMS è s a o combina o con un al o o enu o da MOLIS (so wa e pe la accol a dei da i di
labo a o io u ilizza o da GBRU). I da i ela i i ad un isola o sono s a i au oma icamen e abbina i
u ilizzando un nume o uni oco di iden i icazione (ID). La co ispondenza è s a a o enu a anche
manualmen e laddo e è s a o necessa io, u ilizzando i documen i ca acei di ogni campione. Dopo
a e e e ua o una sempli icazione del da abase, è s a a e e ua a un’analisi dei da i del nume a o e
median e l’u ilizzo di abelle pi o Excel (Mic oso O ice) ocalizzando l’a enzione su p o enienza,
o igine e se o a . Gli isola i di Salmonella p o enien i dai labo a o i di FW&E e ice u i da GBRU
nel 2013 sono s a i ipizza i median e sie o ipizzazione con enzionale e ca ego izza i in se o a
(G imon PAD, Weill X, 2007), seguendo le linee guida WHO Collabo a ing Cen e o Re e ence
and Resea ch on Salmonella ‘An igenic o mulae o he Salmonella se o a s’ (G imon PAD, Weill
X, 2007). A pa i e dal 2014, la sie o ipizzazione con enzionale è s a a a ianca a ad analisi di WGS,
che è di en a a la ecnica di elezione pe u i gli isola i (Ash on P e al., 2016). L’es azione del DNA
pe l’analisi di WGS è s a a e e ua a p esso i labo a o i di GBRU del PHE, u ilizzando un p o ocollo
modi ica o di Qiasymphony DSP DNA midi ki (Qiagen, Hilden, Ge mania). La concen azione del
DNA es a o è s a a de e mina a a a e so il sis ema GloMax (P omega; Ash on P e al., 2015). Il
sequenziamen o del DNA è s a o e e ua o p esso l’uni à di Genome Sequencing and De elopmen
Uni del PHE usando un p o ocollo s anda d 2x101 basi con lo s umen o HiSeq 2500 (Illumina, San
Diego, CA, USA) in modali à eloce. U ilizzando T immoma ic (Ash on P e al., 2015), i ammen i
delle le u e del DNA sono s a i aglia i e i aglia i e la quali à è s a a o enu a ino a aggiunge e un
pun eggio PHRED in e io e a 30. Le sequenze in e io i a 50 bp sono s a e elimina e. Quindi, la
sequenza de in i a o enu a è s a a con on a a con al e p eceden emen e a chi ia e, u ilizzando la
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
76
pipeline Kme ID del PHE (h ps://gi hub.com/phe-bioin o ma ics/kme id), al ine di iden i ica e il
se o a di Salmonella (Ash on P e al., 2015).
4.2.3. Analisi dei de e minan i di esis enza o enu i median e WGS in ceppi
di S. en e ica non i oidea p o enien i da e a ee geog a iche
T a i campioni isul a i posi i i a S. en e ica non i oidea, è s a a e e ua a un’analisi ela i a a 384
campioni, p o enien i da Regno Uni o (n=77), Thailandia (n=66) e B asile (n=241). Tali campioni
sono s a i seleziona i pe Paese di o igine, includendo quelli da cui il Regno Uni o impo a la maggio
pa e degli alimen i con amina i da S. en e ica, pe e e ua e il con on o dei da i di AMR e e ua o
median e l’u ilizzo di abelle pi o Excel (Mic oso O ice). Pe l’iden i icazione dei de e minan i di
an ibio ico- esis enza nei ceppi è s a o impiega o l’algo i mo “Gene inde ” che, u ilizzando Bow ie
2, ha mappa o la le u a della sequenza o enu a median e WGS con sequenze di i e imen o e ha
pe messo di gene a e un ile con Sam ools (Langmead, Salzbe g, 2012). Il ma ch delle sequenze è
s a o de ini o posi i o dopo a e soddis a o di e si c i e i: cope u a della sequenza del 100%;
a iazione bese-call >85%; iden i à nucleo idica >90% (Neue S e al., 2018). Il da abase di
i e imen o igua dan e Salmonella non i oidea con iene geni e mu azioni che codi icano pe
esis enza a β-la ami, chinoloni, aminoglicosidi, sul amidici, e acicline, ime hop im e enicoli
(Day M e al., 2018).
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
77
5. Risul a i
5.1. K. pneumoniae
5.1.1. P o ili di an ibio ico- esis enza
I isul a i ela i i alle concen azioni minime di iniben i di an ibio ico sono s a i in ep e a i seguendo
le linee guida EUCAST (Tabella 10).
I 26 ceppi di K. pneumoniae hanno mos a o 21 di e si p o ili di esis enza ( esis o ipi) e
ca a e is iche di mul i esis enza e so i ca bapenemi: u i i ceppi sono, in a i, isul a i esis en i a
e apenem, 22 (84%) a me openem e 20 (77%) a imipenem. Ven i isola i sono s a i ca a e izza i
come esis en i a u i i ca bapenemi es a i. Inol e, 19 (73%) ceppi sono isul a i esis en i alla
colis ina (col-R). Nessun isola o ha mos a o susce ibili à e so ampicillina, amoxicillina-
cla ulana o, ce azidime, cip o loxacina, ce o axime, ce u oxime, le o loxacina, pipe acillina e
pipe acillina- azobac am. Inol e, l’81% (n=21) ha p esen a o esis enza e so ob amicina, 16 (62%)
a ime op im, 16 (61,5%) nei con on i di amikacina, 8 (31%) a igeciclina, 5 a gen amicina e 2 e so
os omicina.
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
78
Tabella 10: Valo i di b eakpoin s secondo EUCAST u ilizza i pe l’in e p e azione
dell’an ibiog amma nei ceppi di K. pneumoniae
MIC b eakpoin s
(mg/L)
Penicilline
S ≤
R >
Ampicillina
8
8
Amoxicillina-Cla ulana o
8
8
Pipe acillina
8
16
Pipe acillina-Tazobac am
8
16
Ce alospo ine
S ≤
R >
Ce o axime
1
2
Ce azidime
1
4
Ce u oxime
8
8
Ca bapenemi
S ≤
R >
E apenem
0,5
0,5
Imipenem
2
4
Me openem
2
8
Fluo ochinoloni
S ≤
R >
Cip o loxacina
0,25
0.5
Le o loxacina
0,5
1
Aminoglicosidi
S ≤
R >
Amikacina
8
16
Gen amicina
2
4
Tob amicina
2
4
Te acicline
S ≤
R >
Tigeciclina
0,5
0,5
Agen i mis i
S ≤
R >
Clo am enicolo
8
8
Colis ina
2
2
Fos omicina
32
32
T ime op im
2
4
T ime op im-sul ame ossazolo
2
4
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
79
5.1.2. P e alenza dei geni di esis enza
Il gene blaKPC è s a o iscon a o in u i i ceppi di K. pneumoniae e il 69,2% (n=18) è isul a o posi i o
a blaVIM. Nella g an pa e dei ceppi è s a a, inol e, osse a a la p esenza di ESBL. In a i, i geni
blaSHV e blaTEM sono s a i ampli ica i ispe i amen e nel 96,2% (n=25) e nell’88,4% (n=23) dei ceppi,
men e l’84,6% (n=22) li ha p esen a a i en ambi. Il gene blaCTX-M è s a o ile a o solo in due ceppi.
Nessun isola o ba e ico ha mos a o la p esenza di blaGES, blaNDM-1 o blaOXA-48 (Figu a 1).
Figu a 1: Resis o ipo e geno ipo di esis enza nei 26 ceppi di K. pneumoniae
Colis ina
Fos omicina
Gen amicina
Tigeciclina
T im-sul ame ossazolo
Amikacina
Tob amicina
Imipenem
Me openem
E apenem
Ampicillina
Amox-cla
Ce azidime
Cip o loxacina
Ce o axime
Ce u oxime
Le o loxacina
Pipe acillina
Pipe acillina-Tazobac am
blaCTX
blaTEM
blaSHV
blaVIM
blaKPC
KP 3
-
+
+
+
+
KP 4
-
+
+
+
+
KP 5
-
+
+
+
+
KP 6
-
+
+
+
+
KP 7
-
+
+
+
+
KP 8
-
+
+
+
+
KP 9
-
+
+
+
+
KP 10
+
+
+
+
+
KP 11
-
+
+
+
+
KP 12
-
+
+
+
+
KP 14
-
+
+
+
+
KP 18
-
+
+
+
+
KP 19
-
+
+
+
+
KP 25
-
+
+
+
+
KP 27
-
-
+
+
+
KP 28
-
+
+
-
+
KP 29
-
+
+
+
+
KP 31
-
+
-
-
+
KP 32
+
+
+
+
+
KP 34
-
+
+
-
+
KP 36
-
+
+
-
+
KP 39
-
+
+
-
+
KP 40
-
-
+
-
+
KP 41
-
+
+
-
+
KP 42
-
-
+
-
+
KP 43
-
+
+
-
+
p o ili di esis enza
susce ibile
in e medio
esis en e
CEPPO
7,6%
88,4%
96,2%
69,2%
100,0%

Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
80
5.1.3. P e alenza delle a ian i mc coin ol e nella esis enza alla colis ina
e analisi del gene mg B
Nessuno dei 19 ceppi col-R ha mos a o la p esenza delle a ian i plasmidiche mc -1,2,3,4,5,6,7,8.
La esis enza alla colis ina è s a a successi amen e indaga a median e l’analisi del gene c omosomale
mg B. Una p ima alu azione è s a a e e ua a median e ele o o esi su gel di aga osio, conside ando
il peso molecola e di i e imen o di 253 bp (Canna elli A e al., 2014). I p odo i di PCR sono s a i,
quindi, sequenzia i sia pe iden i ica e e en uali sequenze di inse zione (IS) p esen i nel gene, sia pe
alu a e la p esenza di mu azioni coin ol e nell’acquisizione di esis enza pe disa i azione della
p o eina.
Ampliconi con un peso molecola e supe io e a quello a eso sono s a i osse a i in 6 (31,6%) ceppi
col-R e il sequenziamen o ha
con e ma o la p esenza di un
asposone.
In pa icola e, il asposone più
equen emen e iden i ica o è
isul a o appa enen e alla amiglia
IS5-like (1056 bp), p esen e in 5/19
(26%) ceppi. Il asposone ISKpn14
è s a o iden i ica o solo nel ceppo
KP11 (Figu a 2).
Nei 12 ceppi col-R con un amplicone a eso di 253 bp (Figu a 2) sono s a e iden i ica e mu azioni
pun i o mi nel gene mg B, p e ia analisi delle sequenze in con on o con un ceppo wild- ype di
i e imen o (Canna elli A e al., 2014) e a due ceppi con eno ipo di sensibili à e so la colis ina. In
de aglio, i ceppi KP9 e KP10 (10,5%) hanno ipo a o la p esenza di una delezione (∆g19) con
conseguen e mu azione ameshi nel gene e p ema u a e minazione della p o eina Mg B.
26,3%
5,3%
63,2%
5,3%
IS5-like
ISKpn14
mu azioni pun i o mi
nessuna mu azione
Figu a 2: Tipi di mu azione iden i ica e nel gene mg B
nei ceppi col-R di K. pneumoniae
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
81
Nel 42,1% (n=8; KP5, KP31, KP34, KP36, KP40, KP41 e KP43) dei ceppi e a p esen e la mu azione
missenso 95g che dopo la aduzione è s a a app esen a a dalla sos i uzione V32G; la mu azione
missenso c62a ado a come T21N è s a a osse a a in un solo ceppo (KP28), come la mu azione
missenso g60a ado a in W20S op p esen e in KP31. In un solo ceppo (KP6) non è s a o possibile
indi idua e mu azioni all’in e no del gene. Le sequenze p o eiche, p e ia iden i icazione del eading
ame, sono s a e allinea e con BioEdi , insieme con e sequenze di i e imen o pe indi idua e le
e en uali mu azioni p esen i (Figu e 3 e 4). Le sequenze o enu e, sia quelle wild- ype di mg B nei
ceppi KP25 e KP42 (Accession numbe s: MN389772 e MN389773, ispe i amen e), sia quelle dei
ceppi col-R che non hanno p esen a o IS (KP5, KP6, KP7, KP9, KP10, KP28, KP31, KP34, KP36,
KP39, KP40, KP41 e KP43) sono s a e deposi a e sulla pia a o ma BankI /GenBank (Accession
numbe s: MN389775, MN389774, MN389776, MN389777, MN3897,78, MN389779, MN389780,
MN389781, MN389782, MN389783, MN389784, MN389785 e MN389786, ispe i amen e).
Successi amen e, le mu azioni indi idua e sono s a e analizza e con PROVEAN e i isul a i sono
ipo a i in Tabella 11.
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
82
Figu a 3: Allineamen o delle sequenze di mg B nei ceppi di K. pneumoniae esis en i alla colis ina
in con on o con le sequenze di ceppi wild- ype
No e: le sequenze di ceppi wild- ype (WT) sono e idenzia e in blu, men e le mu azioni indi idua e in osso.
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
83
Figu a 4: Allineamen o delle sequenze p o eiche o enu e pe Mg B nei ceppi di K. pneumoniae
esis en i alla colis ina in con on o con ceppi wild- ype
No e: le sequenze p o eiche di Mg B nei ceppi wild- ype (WT) sono e idenzia e in g igio scu o, men e le
mu azioni in osso.
WT (Canna elli 2014)
KP25 (WT)
KP42 (WT)
KP6
KP5
KP7
KP34
KP36
KP39
KP40
KP41
KP43
KP28
KP31
KP9
KP10
1V V V V V V V V V V V V V V V V
2K K K K K K K K K K K K K K K K
3K K K K K K K K K K K K K K K K
4L L L L L L L L L L L L L L L L
5R R R R R R R R R R R R R R R R
6W W W W W W W W W W W W W W W W
7W W W W W W W W W W W W W W F F
8L L L L L L L L L L L L L L Y Y
9L L L L L L L L L L L L LL s op s op
10 IIIIIIIIIIIIII
11 V V V V V V V V V V V V V V
12 IIIIIIIIIIIIII
13 IIIIIIIIIIIIII
14 A A A A A A A A A A A A A A
15 G G G G G G G G G G G G G G
16 C C C C C C C C C C C C C C
17 L L L L L L L L L L L L L L
18 L L L L L L L L L L L L L L
19 L L L L L L L L L L L L L L
20 WWWWWWWWWWWWW s op
21 T T T T T T T T T T T T N
22 QQQQQQQQQQQQQ
23 MMMMMMMMMMMMM
24 L L L L L L L L L L L L L
25 NNNNNNNNNNNNN
26 V V V V V V V V V V V V V
27 MMMMMMMMMMMMM
28 C C C C C C C C C C C C C
29 DDDDDDDDDDDDD
30 QQQQQQQQQQQQQ
31 DDDDDDDDDDDDD
32 V V V V GGGGGGGGV
33 QQQQQQQQQQQQQ
34 F F F F F F F F F F F F F
35 F F F F F F F F F F F F F
36 S S S S S S S S S S S S S
37 G G G G G G G G G G G G G
38 IIIIIIIIIIIII
39 C C C C C C C C C C C C C
40 T T T T T T T T T T T T T
41 IIIIIIIIIIIII
42 NNNNNNNNNNNNN
43 KKKKKKKKKKKKK
44 F F F F F F F F F F F F F
45 IIIIIIIIIIIII
46 P P P P P P P P P P P P P
47 WWWWWWWWWWWWW
48 s op s op s op s op s op s op s op s op s op s op s op s op s op
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
90
5.2.3. Ca a e izzazione molecola e median e PFGE e MLST
I 24 ceppi di A. baumannii sono s a i ipizza i median e PFGE u ilizzando sepa a amen e gli enzimi
di es izione ApaI e AscI, al ine di iden i ica e le e en uali elazioni clonali u ili a s abili e po enziali
co elazioni epidemiologiche.
Impos ando il cu -o di simila i à al 90%, median e la combinazione dei p o ili o enu i con en ambi
gli enzimi, i 24 ceppi di A. baumanni sono s a i agg uppa i in qua o clus e (I-IV), analogamen e a
quan o o enu o a a e so il solo enzima ApaI (Figu a7).
Il clus e I, è s a o il agg uppamen o più g ande, includendo 10 (41,7%) ceppi, segui o dal clus e III
con o o isola i (33,3%) e dal clus e IV con cinque (20,8%) isola i. Il clus e I ha agg uppa o solo
un ceppo, isola o nel epa o di ne ologia. I ceppi AC11, AC12, AC7 e AC8 hanno mos a o p o ili
iden ici a di lo o, così come AC14, AC16, AC19, AC20 e AC22. L’analisi del dend og amma
gene a o con ApaI, ad un li ello di simila i à del 95% ha e idenzia o 7 pulso ipi (PT), di cui il più
equen e è s a o PT4 associa o ai 6 ceppi del clus e III; PT1, PT2 e PT7 sono s a i associa i a cinque
ceppi. In pa icola e, PT1 è isul a o associa o ai p imi cinque ceppi del clus e I; PT2 ai successi i
cinque dello s esso clus e e PT7 agli isola i del clus e V. Solo i pulso ipi PT3, PT5 e PT6 sono s a i
associa i ad un solo ceppo: PT3 ad un ceppo del clus e II, men e PT5 e PT6 sono s a i associa i
ciascuno ad un ceppo del clus e III (Figu a 7). Inol e, qua o ceppi (AC11, AC12, AC7 e AC8) con
PT1 u i hanno p esen a o i geni blaVIM, blaOXA-23, blaOXA-51, blaAmpC, adeB, adeJ, adeG e abeS.

Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
91
Figu a 7: Dend og amma o enu o median e PFGE con ApaI nei ceppi di A. baumannii
PULSOTIPO CLUSTER
AC 11 1 I
AC 12 1 I
AC 7 1 I
AC 8 1 I
AC 15 1 I
AC 14 2 I
AC 16 2 I
AC 19 2 I
AC 20 2 I
AC 22 2 I
AC 3 3 II
AC 33 4III
AC 38 4III
AC 25 4III
AC 29 4III
AC 28 4III
AC 30 4III
AC 27 5III
AC 39 6III
AC 1 7 IV
AC 2 7 IV
AC 4 7 IV
AC 5 7 IV
AC 6 7 IV
PFGE ApaI – ApaI/AscI
CEPPO
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92
L’analisi del dend og amma o enu o median e la diges ione con l’endonucleasi AscI, al cu -o di
simila i à del 90%, ha i ela o se e clus e (I-VII) (Figu a 8). Il clus e VI è s a o p e alen e
agg uppando ben undici ceppi (45,8%) isola i a luglio e no emb e 2010, segui o dal clus e IV che
ha incluso cinque ceppi (20,8%) isola i a o ob e e no emb e 2010. Nel clus e I sono s a i
agg uppa i e ceppi (12,5%) isola i nel mese di giugno 2010, AC4, AC5 ed AC6, iden ici a lo o.
Nel clus e III, in ece, sono s a i inclusi i ceppi AC1 e AC2 (8,3%) iden ici a lo o, isola i ad ap ile
e maggio 2010. Il clus e II, V e VII hanno incluso solo un isola o, ispe i amen e AC3 p o enien e
dal epa o di ne ologia, AC30 e AC39.
In ques o caso, l’analisi del dend og amma con AscI ad un li ello di simila i à del 95% ha e idenzia o
11 pulso ipi, dei quali PT7 è s a o il più equen e associa o a cinque ceppi. Tale pulso ipo è s a o
segui o da PT4 associa o a qua o ceppi e da PT1 e PT9, ciascuno associa o a e ceppi. Gli al i
pulso ipi (PT2, 5, 6, 8 e 11), ad eccezione di PT3 e PT10 co isponden i a due ceppi, sono s a i
associa i ad un singolo ceppo. L’Indice di Simpson calcola o pe la PFGE è isul a o pa i all’84% e
al 91% ispe i amen e pe ApaI e AscI, so olineando un ele a o po e e disc iminan e.
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
93
Figu a 8: Dend og amma o enu o median e PFGE con AscI nei ceppi di A.baumannii
PULSOTIPO CLUSTER
AC 4 1 I
AC 5 1 I
AC 6 1 I
AC 3 2 II
AC 1 3 III
AC 2 3 III
AC 27 4IV
AC 28 4IV
AC 29 4IV
AC 33 4IV
AC 25 5IV
AC 30 6 V
AC 14 7VI
AC 16 7VI
AC 20 7VI
AC 22 7VI
AC 38 7VI
AC 19 8VI
AC 11 9VI
AC 12 9VI
AC 15 VI
AC 710 VI
AC 810 VI
AC 39 11 VII
CEPPO
Dice (Op :1.00%) (Tol 1.00%-1.00%) (H>0.0%) [0.0%-100.0%]
PFGE AscI
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94
L’analisi dei 24 ceppi di A. baumannii median e MLST ha pe messo di e idenzia e e ST. Di ques i,
ST1720 è s a o p e alen e (n=13; 54,2%), segui o da ST218 (n=8; 33,3%) e da ST513 (n=2; 8,3%).
Pe un ceppo, AB20, non è s a o possibile assegna e un ST a causa di una combinazione allelica non
ipo a a nel da abase e, quindi, anco a non deposi a a. I e ST iden i ica i sono isul a i al amen e
co ela i a lo o app esen ando ciascuno la a ian e monoallelica dell’al o. In de aglio, u ilizzando
come i e imen o ST1720, che è isul a o p e alen e, sono s a e osse a e a ian i monoalleliche pe
il gene ecA sia pe ST218 che pe ST513, in ece, nel caso del ST non de ini o, la a ian e
monoallelica è s a a iscon a a pe il gene poD (Tabella 13). Il po e e disc iminan e della me odica
MLST è isul a o pa i al 61,2% (Figu a 9).
Tabella 13: Va ian i alleliche e ST nei ceppi di A. baumannii secondo lo schema MLST-Ox o d
Geni e a ian i alleliche
gl A
gy B
gdhB
ecA
cpn60
gpi
poD
ST
N (P e alenza)
1
3
3
102
2
102
3
1720
13 (54,2%)
1
3
3
2
2
102
3
218
8 (33,3%)
1
3
3
62
2
102
3
513
2 (8,3%)
1
3
3
102
2
102
159
non de ini o
1 (4,2%)
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95
Figu a 9: Tipizzazione molecola e dei 24 ceppi di A. baumannii median e PFGE (dend og amma
combina o ApaI-AscI) e MLST secondo lo schema Ox o d
PULSOTIPO CLUSTER
AC 11 1 I
1 3 3 2 2 102 3218
AC 12 1 I
1 3 3 102 2102 31720
AC 7 1 I
1 3 3 102 2102 31720
AC 8 1 I
1 3 3 2 2 102 3218
AC 15 1 I
1 3 3 2 2 102 3218
AC 14 2 I
1 3 3 102 2102 31720
AC 16 2 I
1 3 3 102 2102 31720
AC 19 2 I
1 3 3 2 2 102 3218
AC 20 2 I
1 3 3 102 2102 159 NON DEFINITO
AC 22 2 I
1 3 3 2 2 102 3218
AC 3 3 II
1 3 3 102 2102 31720
AC 33 4III
1 3 3 62 2102 3513
AC 38 4III
1 3 3 2 2 102 3218
AC 25 4III
1 3 3 102 2102 31720
AC 29 4III
1 3 3 102 2102 31720
AC 28 4III
1 3 3 102 2102 31720
AC 30 4III
1 3 3 102 2102 31720
AC 27 5III
1 3 3 2 2 102 3218
AC 39 6III
1 3 3 62 2102 3513
AC 1 7 IV
1 3 3 102 2102 31720
AC 2 7 IV
1 3 3 102 2102 31720
AC 4 7 IV
1 3 3 2 2 102 3218
AC 5 7 IV
1 3 3 102 2102 31720
AC 6 7 IV
1 3 3 102 2102 31720
PFGE ApaI – ApaI/AscI
CEPPO
gl A
ST
gy B
gdhB
ecA
cpn60
gpi
poD

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96
5.3. S. en e ica non i oidea
5.3.1. Analisi di campioni di di e sa o gine
Un o ale di 74.958 campioni sono s a i so opos i a es mic obiologici pe alu a e la p esenza di
Salmonella spp. La maggio pa e (n=30.537; 44,8%) è s a a analizza a p esso la sede dei Labo a o i
del FW&E di Colindale, Lond a, men e al i sono s a i esamina i nei Labo a o i di Yo k (n=18.470;
24,6%), Po on (n=13.183; 17,6%), Bi mingham (n=8.873; 11,8%) e P es on (n=3.936; 5,2%).
Il 90,7% (n=68.027) dei campioni e a app esen a o da p odo i alimen a i, l’8,1% (n=6.052) da on i
ambien ali, l’1,1% (n=828) da mangimi e solo una minima pa e (n=51; 0,07%) da acqua.
L’analisi dei campioni da ma ici alimen a i ha i ela o che la maggio pa e e a di o igine animale
(n=30.964; 45,5%), segui o da o igine non-animale o ege ale (n=16.268; 23,9%) e p odo i compos i
(n=20.795; 30,6%). I campioni di mangime e ano p e alen emen e di o igine animale (n=827/828;
99,9%). I campioni ambien ali sono s a i suddi isi in e ca ego ie: swab o amponi (n=5.617; 92,8%),
“panni” (n=403; 6,7%) e campioni di al a o igine (n=32; 0,5%).
Successi amen e, alimen i di o igine animale sono s a i suddi isi in alimen i “ eady o ea ” (RTE)
(n= 22.698; 73,3%) e non-RTE (n=8.265; 26,7%). Gli alimen i di o igine ege ale sono s a i pe lopiù
di ipo RTE (n=16.053; 98,7%). La o ali à dei p odo i alimen a i compos i (n=20.795) è s a a
classi ica a come RTE (Figu a 10). Du an e il pe iodo conside a o, pa i a cinque anni (2013-2018),
la accol a delle a ie ipologie di campione è imas a cos an e, a a eccezione pe i campioni di
acqua che non sono s a i mai p ele a i nel 2018 (Figu a 11).
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
97
Figu a 10: Classi icazione dei 74.958 campioni accol i nell’ambi o dei con olli igienico-sani a i
nel Regno Uni o nel pe iodo 2013-2018
Figu a 11: Raccol a delle a ie ipologie di campione du an e il pe iodo 2013-2018
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
98
5.3.2. Analisi dei campioni posi i i pe S. en e ica non i oidea
Il nume o di campioni posi i i pe Salmonella non i oidea è s a o di n=982, pa i all’1,3 % del o ale.
L’82% (n=809) e a app esen a o da campioni di cibo, il 15,4% (n=151) da quelli ambien ali, l’1,7%
(n=17) da mangime e 5 da acqua (Figu a 12).
Figu a 12: Desc izione dei 982 campioni isul a i posi i i pe S. en e ica non i oidea
classi ica i pe ipologia di ma ice
Il nume o di ceppi di S. en e ica non i oidea isola i è isul a o a iabile nell’a co empo ale agos o
2013-agos o 2018, egis ando un picco nel 2017 (Figu a13).
Sono s a i egis a i in media 162 campioni di cibo posi i i pe Salmonella pe anno, l’1,2% dei
campioni di o igine alimen a e analizza i, segui i da campioni ambien ali con una media di 30 pe
anno, o e o il 2,5% dei campioni ambien ali o ali. Pe quan o igua da i campioni di alimen i pe
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
99
animali, sono s a i in media 3 pe anno, il 2% del o ale. In ine, è s a o indi idua o un campione di
acqua pe anno, app esen ando il 9,8% dei campioni o ali di acqua.
Figu a 13: Isolamen o di ceppi di S. en e ica non i oidea nel pe iodo agos o 2013-agos o 2018
T a i campioni da alimen i isul a i posi i i pe S. en e ica non i oidea, il 49,9% (n=404) è s a o di
o igine animale, il 45,4% (n=367) di o igine non animale e il 4,7% (n=38) è s a o app esen a o da
p odo i compos i (Figu a 14). La maggio pa e dei campioni ambien ali è s a a app esen a a da
swab (n=139), segui i da panni (n=11; 7,28%) e il i (n=1; 0,7%) (Figu a 15).
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106
5.3.3 P e alenza dei de e minan i di esis enza alu a i median e WGS
L’analisi dei da i di an ibio ico- esis enza ha igua da o un so oinsieme (n=384) di ceppi di S.
en e ica non i oidea. In de aglio, sono s a i seleziona i pe l’analisi solo i campioni p o enien i
da Regno Uni o (n=77), Tailandia (n=61) e B asile (n=240). I da i e ano, in a i, più omogenei
in e mini di comple ezza ed anche più app esen a i i di egioni geog a iche mol o di e se e
lon ane a lo o. L’analisi è s a a incen a a sulla p o enienza dei di e en i se o a s e dei
de e minan i di esis enza. Dei 384 campioni seleziona i, uno solo è s a o isola o nel 2013 ed
e a p o enien e dal Regno Uni o, men e l'80% (n=16/20) dei campioni del 2014 p o eni a
dalla Tailandia, come pe il 2015 (n=14/19, 73%). Il 76% (n=38/50) dei campioni ela i i al
2016 e a p o enien e dal Regno Uni o ed il 14% (n=7/50) dalla Tailandia. Nel 2017 è s a o
egis a o un picco di accol a di campioni posi i i a S. en e ica non i oidea. I campioni
o igina i dal B asile sono isul a i p e alen i (n=147/203, 72,4%) nel 2017, segui i dal 15,3%
(n=31/203) dal Regno Uni o e dal 12,3% (n=25/203) dalla Tailandia. Nel 2018, il 94,5%
(n=86/91) dei campioni e a p o enien e dal B asile (Figu a 19).
Figu a 19: O igine e dis ibuzione dei 384 campioni conside a i nel pe iodo 2013-2018

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107
Tu i i campioni di swab (n=38) e di panno (n=1) e ano p o enien i dal Regno Uni o, come u i
gli alimen i compos i RTE o di o igine animale ed i campioni di pesce non RTE. Dal B asile
e ano p o enien i p incipalmen e alimen i di o igine animale non RTE (n=236/229, 81,1%),
men e il 77,8% (n=7/9) degli alimen i pe animali domes ici e il 69,2% (n=9/13) di p odo i di
o igine non animale RTE dalla Tailandia.
S. Heidelbe g è s a o il se o a p e alen e nei campioni del B asile (n=201/241, 83%), segui o
da S. Minneso a (n=24/241, 10%) ed al i se o a s mino i, come S. Agona, S. Sain paul, S.
In an is, S. En e i idis, S. Gi e e S. Schwa zeng und. Il se o a più equen e nei campioni dalla
Tailandia è s a o S. En e i idis (n=14/66, 21,2%), segui o da S. Albany (n=8/66, 12,2%) e S.
Agona (n=6/66, 9,1%) e se o a s mino i. S. Agona è s a o il se o a maggio men e iden i ica o
nei campioni del Regno Uni o (n=22/77, 28,6%), segui o da S. B ande up (n=21/77, 27,3%), S.
Bo is-mo bi icans (n=19/77, 24,7 %) e al i se o a s mino i.
A a e so il WGS dei 384 campioni seleziona i, è s a o analizza o il p o ilo gene ico pe
s abili e la p e alenza di de e minan i implica i nella esis enza e so 12 classi di an ibio ici
conside a i (aminoglicosidi, chinoloni, mac olidi, β-la amici, ime op im, os omicina,
e acicline, sul amidici, am enicoli, in amicina, ca bapenemi, acido usidico). Nessun ceppo
ha mos a o i geni codi ican i pe la esis enza a in amicina, acido usidico e ca bapenemi, ma
il 61,2% (n=235) ha p esen a o una o più β-la amasi (CMY-2, CMY-18, CMY-54, CTX-M-2,
CTX-M-8, CTX-M-55, CTX-M-65, TEM-1, TEM-117-p*, TEM-135, TEM-191-p*, blaBIL-
1[u], CARB-2, CTX-M-55, ACT-24[ ]). Quasi u i i ceppi (n=380/384, 99%) sono isul a i
posi i i pe i geni associa i alla esis enza agli aminoglicosidi (aac(6')-Iy, aac(3)-Via, aadA-12,
aadA-1, aac(6')-Iaa, aac(3)-IId, aadA-2, aph(6)-Id, aph(4)Ia, s B, s A, aadA-1b, aadD, aadA-
8b, aadA-17, aadA-13*). Inol e, nell'89,8% (n=345/380) è s a a osse a a la p esenza di geni
di esis enza nei con on i dei chinoloni (pa C, gy A, qn B-19, qn S-1), men e il 65,1%
(n=250/384) ed il 59,1% (n=227/384) hanno mos a o i de e minan i implica i ispe i amen e
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
108
nella esis enza alla e aciclina ( e (A), e (A)-1, e (D), e (G), e (J)) e al sul ame ossazolo
(sul-1, sul-2, sul-3). Il 9,6% (n=37/384) è isul a o posi i o ai de e minan i di esis enza pe i
mac olidi (lnu-(A), sa 2A, mph-(B)); il 5,2% (n=20/384) e l’1,5% (n=6/384) a quelli associa i
ispe i amen e alla esis enza a ime op im (d A-1, d A-14, d A-8, d A-12) e al
clo am enicolo ( loR, ca A-2, cml-1*, FOSa[V]). Solo un ceppo (0,2%) ha p esen a o il gene
osA codi ican e pe la esis enza alla os omicina.
Pe quan o igua da i p o ili di esis enza, e ceppi (due dal B asile; uno dalla Tailandia) hanno
mos a o esis enza a 8 classi di an ibio ici, includendo aminoglicosidi, chinoloni, mac olidi, β-
la amici, ime op im, e acicline, sul amidici e am enicoli; 4 ceppi sono isul a i esis en i a
7 classi di an ibio ici (25% da B asile e 75% da Tailandia) e 8 ceppi p esen a ano esis enza a
6 classi di an ibio ici. Il 34,4% (n=132/384) e a esis en e a 5 classi. A qua o classi sono
isul a i esis en i 105 ceppi (27,3%). Il 23,1% (n=80/384) e a esis en e a e classi e il 6,5%
(n=25/384) e il 7% (n=27/384) ispe i amen e a due e una classe di an ibio ici.
Figu a 20: Nume o di classi di an ibio ici e so le quali è s a a osse a a la esis enza
nei ceppi di S. en e ica non i oidea in base alla p o enienza
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
109
Sono s a i de ini i MDR i ceppi che p esen ano esis enza a più di e classi di an ibio ici, che
sono s a i l'86,5% (n=332/384). Di ques i, il 13,8% (n= 46/332) e a p o enien e dal Regno
Uni o e dalla Tailandia e il 72,3% (n=240/332) dal B asile. Il 99% dei ceppi dal B asile è
isul a o MDR, men e il 70% e il 60% ispe i amen e di quelli p o enien i da Tailandia e dal
Regno Uni o (Figu e 21-22).
Figu a 21: P e alenza di ceppi MDR pe Paese di p o enienza
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
110
Figu a 22: Nume o di ceppi che hanno p esen a o un p o ilo MDR ca ego izza i pe classi di
an ibio ici e se o a
1 2 3 4 5 6 7 8 o ale
B asile 1 26 82 122 532
240
S. Agona 5
S. En e i idis 1
S. Gi e 1
S. Heidelbe g 16 78 98 432
S. In an is 2 1
S. Minneso a 4 20
S. Sain paul 4
S. Schwa zeng und 1
S. Unnamed 1
Tailandia 8 12 18 15 9031
66
S. Agona 1 5
S. Albany 5 2 1
S. Binza 1
S. Bleadon 1
S. B aende up 3
S. En e i idis 6 3 5
S. Gi e 1
S. Hou en 1
S. H i ing oss 1 1
S. Idikan 1
S. Kedougou 5
S. Ken ucky 1
S. Mbandaka 1
S. Minneso a 1
S. Moun -pleasan 1
S. Ohio 2
S. Poona 2
S. Rama -gan 1
S. Rissen 2
S. Sen enbe g 2 1
S. S anley 1
S. Typhimu ium 1 1 2
S. Vi chow 1
S. Wel e eden 1 2
Regno Uni o 18 13 36 262
77
S. Agona 10 12
S. Ana um 1
S. Bo is-mo bi icans 17 2
S. B aende up 1 19 1
S. En e i idis 1
S. Gold-coas 1
S. Hada 1
S. In an is 1 1
S. Ja a 1
S. La ochelle 1
S. Li ings one 1
S. Newpo 1
S. Typhimu ium 1
S. Typhimu ium - monophasic 3 1
p o ilo - Mul i D ug Resis an
Nume o classi an ibio iche
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
111
Tu i i campioni p o enien i dal
B asile con amina i da S. en e ica
non i oidea sono isul a i posi i i alla
β-la amasi CMY-2 e aac(6')-ly
implica o nella esis enza agli
aminoglicosidi. Quasi il o ale dei
ceppi ha, inol e, p esen a o i geni
pa C (n=235/240; 97,9%) e gy A
(n=203/240; 85,6%), en ambi
coin ol i nella esis enza ai
chinoloni; sul-2 (n=226/240; 94,2%)
associa o alla esis enza al
sul ame ossazolo e e (a)-1
(n=227/240; 94,6%), de e minan e di
esis enza alla e aciclina (Figu a
23).
Figu a 23: P e alenza dei de e minan i di esis enza
negli isola i da campioni p o enien i dal
B asile

Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
112
T a i 66 ceppi isola i da campioni
p o enien i dalla Tailandia, quasi
u i sono isul a i ai de e minan i
associa i alla esis enza e so
aminoglicosidi (n=64/66, 97%). In
pa icola e, i de e minan i di
esis enza sono s a i aac(6')ly e
aac(6')laa, ispe i amen e osse a i
nel 56,1% (n=37/66) e 40,9%
(n=27/66) degli isola i. Il 42,2% è,
inol e, isul a o posi i o alle β-
la amasi, con e de e minan i
maggio men e coin ol i, quali TEM-
1 (n=7/66; 10,6%), TEM-117p*
(n=9/66; 13,6%) e TEM-135
(n=8/66;12,1%). L'81,8% (n=54/66)
p esen a a i de e minan i di
esis enza ai chinoloni mos ando le
a ian i geniche di pa C e gy A,
ispe i amen e nel 59,1% (n=39/66)
e nel 31,8% (n= 21/66) degli isola i
(Figu a 24).
Figu a 24: P e alenza dei de e minan i di esis enza
negli isola i da campioni p o enien i dalla
Tailandia
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
113
Dei 77 isola i da campioni
p o enien i dal Regno Uni o, il
68,8% (n=53/77) e il 37,7%
(n=29/77) sono isul a i posi i i
ispe i amen e pe aac(6')ly e pe
aac(6')Iaa, che con e iscono
esis enza agli aminoglicosidi. Il
9,1% (n=7/77) ha mos a o i
de e minan i implica i sia nella
eisis enza e so i β-la amici, pe
la p esenza del de e minan e
ACT-24, sia e so il
sul ame ossazolo con sul-2. Il
70,1% (n=54/77) ha mos a o,
inol e, a ian i di pa C associa o
alla esis enza ai chinoloni. Solo
un ceppo ha p esen a o il gene
osA codi ican e pe la esis enza
alla os omicina (Figu a 25).
Figu a 25: P e alenza dei de e minan i di esis enza
negli isola i da campioni p o enien i dal
Regno Uni o
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
114
6. Discussione
La apida di usione della esis enza agli an ibio ici in ba e i che causano in ezioni nell’uomo
è ad oggi un p oblema di dimensioni globali. A pa i e dal 2050, sono s ima i 10 milioni di
decessi ogni anno a causa di in ezioni sos enu e da ba e i MDR, mol e di più di quelle do u e
al canc o (8,2 milioni) (O’Neill J e al., 2016). Con l’eme genza di pa ogeni mul i esis en i è
semp e più e iden e la necessi à di implemen a e s a egie apide e sensibili pe
l’iden i icazione p ecoce ed il con ollo della di usione. In ques o scena io, l’u ilizzo di me odi
di ipizzazione molecola e app esen a un alido app occio pe de ini e la s u u a di una
popolazione ba e ica; pe accia e le on i di in ezione e de ini e i meccanismi di asmissione;
pe aumen a e le conoscenze igua do l’epidemiologia di ali in ezioni, in e mini di p e alenza,
incidenza e pe sis enza, e pe implemen a e in e en i azionali pe il con ollo e la ges ione di
e en uali ocolai in ambi o ospedalie o e/o in comuni à (Donna umma F e al., 2011).
6.1. Resis enza agli an ibio ici ed epidemiologia molecola e
di K. pneumoniae
Una pa e di ques o la o o di esi desc i e i isul a i o enu i dalla ca a e izzazione
biomolecola e di ceppi di K. pneumoniae isola i nel pe iodo 2014-2017 nell’ambi o del sis ema
di so eglianza degli “Ale o ganisms” implemen a o p esso il P esidio Ospedalie o “A.
Ca da elli” di Campobasso, Regione Molise. I isul a i dello s udio hanno e idenzia o come
ques o ba e io G am-nega i o sia maggio men e isola o da pazien i di e à a anza a e dal epa o
di e apia in ensi a, do e le p ocedu e e l’u ilizzo di de ices in asi i giocano un uolo c uciale
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
115
nell’inso genza di ali in ezioni (Giani T e al., 2015; C is ina ML e al., 2016; Codjoe FS e al.,
2018).
Lo s udio ha igua da o 24 ceppi di K. pneumoniae, nei quali sono s a i indi idua i 21 p o ili di
esis enza, so olineando l’ele a a di e si à eno ipica in a-specie. Tu i gli isola i hanno
p esen a o, inol e, un p o ilo MDR, con una ele a a p e alenza di esis enza e so i
ca bapenemi (76,9%) e la colis ina (73%), anche se è impo an e so olinea e, anco a una ol a,
che i mic o ganismi sono s a i isola i e segnala i nell’ambi o di un sis ema di so eglianza pe
‘Ale o ganisms’.
Sebbene sia da segnala e un’ele a a susce ibili à dei ceppi alla os omicina (92%), an ibio ico
ecen emen e p eso in conside azione pe il a amen o di in ezioni sos enu e da pa ogeni XDR,
des a p eoccupazione il a o che anche e so ques o an ibio ico s ia eme gendo una esis enza
media a dal gene osA, il quale può esse e as e i o median e plasmidi a i ba e i delle
En e obac e iaceae (Klon z EH e al., 2017).
Ceppi di K. pneumoniae p odu o i di ca bapenemasi si sono di usi apidamen e in ambi o
ospedalie o in u o il mondo, inclusa l’I alia, do e sono in con inuo aumen o, passando da una
p e alenza del 2% nel 2009 al 19% nel 2012, ino a aggiunge e il 34,3 % nel 2013 (Eu opean
Cen e o Disease P e en ion, 2010, 2014; Sis o A e al., 2012).
La colis ina negli ul imi anni è s a a p esa nuo amen e in conside azione come scel a
e apeu ica pe indi idua e a maci al e na i i ai ca bapenemi, sebbene ecen i s udi abbiano
ipo a o un’eme gen e esis enza anche ad essa, sia a li ello mondiale, sia a li ello nazionale
(Monaco M e al., 2014). La compa sa e la di usione di ques a nuo a esis enza, aggiun i a a
quella nei con on i dei ca bapenemi, ende il p oblema degli En e oba e i p odu o i di
ca bapenemasi anco a più alla man e pe la salu e pubblica. Il a amen o con colis ina e,
sop a u o, la du a a dello s esso, sono a i p incipali a o i di ischio pe l’aumen o della
p e alenza di ceppi esis en i. Alcuni ba e i G am-nega i i mul i esis en i sono conside a i
in insecamen e non-susce ibili alla colis ina, come P o eus, P o idencia e Mo ganella
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
122
6.2. Resis enza agli an ibio ici ed epidemiologia molecola e
di A. baumannii
Il p esen e la o o di esi ha igua da o anche la ca a e izzazione bio-molecola e di 24 ceppi di
A. baumannii isola i da pazien i ico e a i p esso il P esidio Ospedalie o “A. Ca da elli” di
Campobasso. A. baumannii p esen a una esis enza in inseca a mol i an ibio ici e ciò lo
classi ica come un ba e io eme gen e nel causa e in ezioni nosocomiali (Ga nacho-Mon e o J,
Timsi J, 2018), sop a u o nel epa o di e apia in ensi a (Mohd Sazlly LS e al., 2019).
Ques o mic o ganismo è ca a e izza o da una ele a a pe sis enza nell'ambien e che consen e di
di onde si apidamen e, nonchè da una s ao dina ia capaci à di s iluppa e esis enza a di e si
an ibio ici (Ga nacho-Mon e o J, Timsi , J, 2018). Il apido aumen o della esis enza in A.
baumannii negli ul imi decenni ha messo in e idenza la no e ole plas ici à genomica di ques o
ba e io, che può de e mina e una di icile ges ione dei casi di in ezioni (Da Sil a GJ e al.,
2016). La di usione di ceppi p odu o i di ca bapenemasi ha de e mina o un signi ica i o
inc emen o della esis enza, in pa icola e ai ca bapenemi, so olineando che l’an ibio ico-
esis enza è un enomeno semp e più eme gen e e di dimensioni p eoccupan i. Ul e io i
meccanismi di esis enza, sebbene meno equen i, sono app esen a i dalla so a-esp essione
di geni codi ican i pe la β-la amasi, come AmpC, dalla ido a pe meabili à della memb ana
es e na e dalla so a-esp essione delle pompe di e lusso, che app esen a una ase inziale pe
lo s iluppo di un eno ipo MDR (Piddock L e al., 2006). Ad oggi, la colis ina app esen a
l'unico an ibio ico nei con on i con on i del quale i li elli di sensibili à imangono ele a i;
u a ia, il suo impiego è limi a o pe p oblema iche di ossici à e, al con empo, anche pe il
ecen e inc emen o di ceppi ad essa esis en i (Cai Y e al., 2012; Agodi A e al., 2015).
L’isolamen o di ceppi MDR di A. baumannii in u o il mondo so olinea la necessi à e
l’impo anza di implemen a e s a egie pe una apida iden i icazione ed un e icace con ollo

Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
123
della lo o di usione. In ques o con es o, i me odi di ipizzazione molecola e o niscono un
alido suppo o, non solo pe l’indi iduazione di ceppi esponsabili di ocolai in ambi o
nosocomiale, ma anche pe s abili e e en uali p o ocolli e apeu ici ed implemen a e la
so eglianza epidemiologica (Samma co ML e al., 2014; Di Tella D e al., 2019). Ol e il 90%
dei ceppi analizza i in ques o s udio sono s a i isola i da pazien i con in ezioni del a o
espi a o io, segui e da quelle del a o u ina io, coe en emen e con al i s udi che ipo ano
un’ele a a equenza di isolamen o in ali in ezioni (Viehman JA e al., 2014; Zhao S e al.,
2015; P incipe L e al., 2014). La p e alenza di ceppi MDR di A. baumannii in pazien i con
polmoni e acquisi a in ambi o ospedalie o si colloca in un ange comp eso a il 40% ed il 95%
(Almomani B e al., 2015; Nowak J e al., 2017; Ziółkowski G e al., 2018). Tali pa ologie
app esen ano una causa impo an e di mo ali à e mo bili à, sop a u o se sos enu e da A.
baumannii e P. ae uginosa.
La o ali à dei ceppi esamina i di A. baumannii isola i nell’ambi o della so eglianza di ‘Ale
o ganisms’ è isul a a esis en e ai ca bapenemi es a i (imipenem e me openem), in acco do
con al i s udi i aliani che e idenziano anche la esis enza a nume osi al i an ibio ici
(penicilline, ce alospo ine, luo ochinoloni, amminoglicosidi) (B igan e G e al., 2012; De o i
M e al., 2014; Caio C e al., 2018).
Le successi e analisi molecola i hanno pe messo di de ini e che la esis enza ai ca bapenemi
in u i i ceppi di A. baumannii è p incipalmen e do u a alla p esenza del gene blaOXA-23, in
acco do con al i s udi condo i a li ello nazionale (B igan e G e al., 2012; Agodi A e al.,
2015), sebbene siano s a i ile an i ul e io i meccanismi, a ibuibili al gene blaOXA-51,
anch’esso iscon a o in u i ceppi. La p e alenza di blaOXA-23 e a ampiamen e a esa dal
momen o che i ocolai do u i a ceppi di A. baumannii esis en i ai ca bapenemi desc i i negli
ul imi anni in I alia sono s a i pe lopiù ca a e izza i dalla p oduzione di ale ca bapenemasi
(Mammina C e al., 2011; B igan e G e al., 2012; P incipe L e al., 2014; Pe illi M e al., 2015).
Nell’ul imo decennio, la p e alenza del gene blaOXA-23 è, in a i, aumen a a epen inamen e,
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
124
po ando ad una d as ica iduzione della p e alenza di blaOXA-58 (D’A ezzo S e al., 2011;
B igan e G e al., 2012), p edominan e ino al 2008 nel e i o io nazionale (Di Popolo A e al.,
2011). Di a o, il gene blaOXA-58 non è s a o iscon a o in nessuno dei 24 ceppi analizza i nello
s udio.
T a le ca bapenemasi di classe D è s a a, anche, indaga a la p esenza del gene blaOXA-24 isul a o
assen e in u i i ceppi, in acco do con i da i epidemiologici disponibili, che e idenziano
un’ele a a p e alenza in Spagna, B asile, Belgio, F ancia, Ame ica La ina, Po ogallo, USA ed
Asia, ma non in I alia (Peleg A e al., 2008; E ans B, Amyes S, 2014). Gli enzimi OXA, che
app esen ano le β-la amasi maggio men e p esen i in ale ba e io, con e iscono esis enza non
solo ai ca bapenemi, ma anche a penicilline e ce alospo ine. AmpC è no malmen e esp essa a
bassi li elli e non è inducibile; il uolo nella esis enza ai ca bapenemi è p incipalmen e lega o
alla p esenza della sequenza di inse zione ISAba1, che si o a a mon e del gene blaAmpC, che
o nisce un p omo o e pe l'ipe -p oduzione di geni codi ican i pe ali β-la amasi (Peleg Ae
al., 2008; Pagano M e al., 2016).
T a i mol eplici de e minan i di esis enza esamina i, anche AmpC, β-la amasi di classe C, è
s a a iscon a a in u i i ceppi, con e mando il suo no e ole con ibu o nei meccanismi di
esis enza alle oximino-ce alospo ine (ce azidime e ce o axime). Ciò è s a o ul e io men e
a alo a o dall’assenza di SHV (ESBL), anch’essa implica a nella esis enza a ali an ibio ici
(Sa a i M e al., 2015). Le AmpC sono anche a ini alle penicilline e esis en i all’azione degli
inibi o i delle β-la amasi (acido cla ulanico, sulbac am e azobac am) (Rod íguez-Ma ínez JM
e al., 2010). In a i, u i i ceppi indaga i sono anche isul a i esis en i agli an ibio ici della
classe delle penicilline (ampicillina, amoxicillina-cla ulona o, pipe acillina, pipe acillina-
azobac am) e delle ce alospo ine (ce ozidime, ce o axime, ce azolina, ce oxi ina, ce epime).
Un ul e io e meccanismo di esis enza iden i ica o nei ceppi analizza i è s a o app esen a o
dalla p esenza del gene blaVIM, iscon a o nel 33,3% degli isola i. Ciò sugge isce il possibile
inc emen o della p oduzione delle MβL, ino a iscon a e spo adicamen e in ques o ba e io
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
125
(Zhao S e al., 2015). Tu i i ceppi blaVIM-posi i i hanno p esen a o un p o ilo di esis enza
simile, ad eccezione di due isola i (AC3 e AC39). In u i i casi, gli isola i sono isul a i esis en i
ai ca bapenemi, sugge endo il con ibu o della p oduzione di ale ca bapenemasi come un
ul e io e meccanismo di esis enza. Di a o, la simul anea p esenza di geni codi ican i pe le
MβL è s a a segnala a in di e se pa i del mondo (Peleg A e al., 2008; Amudhan SM e al.,
2011). In I alia, è s a a già documen a a la p esenza di ceppi di A. baumannii blaVIM-posi i i.
Nel 2011, è s a a ipo a a pe la p ima ol a un ou b eak di casi di ulce a da decubi o causa e
da A. baumannii p odu o i di MβL e i ica esi in una uni à di e apia in ensi a di un ospedale
di Pale mo e in un caso è s a a iscon a a la p esenza di un ceppo p odu o e di VIM-4
(Mammina C e al., 2011). Anche se a li ello nazionale la p esenza di ques a ca bapenemasi in
A. baumannii non iene ipo a a equen emen e, la p esenza di blaVIM in ques o
mic o ganismo è s a a segnala a in nume ose al e pa i del mondo, come I an (Da oodi S e
al., 2015), India (Amudhan MS e al., 2012), A abia Saudi a (Al-Sul an A e al., 2015), Co ea
(Lee K e al., 2003) e in di e si Paesi eu opei (Polonia, G ecia, Ge mania) (Toleman M e al.,
2004; Tsak is A e al., 2006; W oblewska M e al., 2007). Inol e, la p e alenza di ale MβL in
69 ceppi di A. baumanni si è a es a a al 14,5% secondo uno s udio condo o in Tu chia (Asgin
N e al., 2019).
Nel p esen e la o o di esi, è s a a anche alu a a la p esenza di al e ca bapenemasi di classe
B, quali IMP, GIM e NDM, ma non sono s a e iscon a e. L’assenza di ali ca bapenemasi è in
acco do con di e si s udi che ipo ano VIM come la MβL più equen emen e iscon a a in
ceppi di A. baumannii (Amudhan SM e al, 2011; Mammina C e al., 2011; Zhao S e al. 2015),
sebbene la sua p oduzione, insieme a quella di IMP, sia maggio men e osse a a in P.
ae uginosa (Ghamgosha M e al., 2015). I isul a i dello s udio, inol e, conco dano con i da i
epidemiologici disponibili a li ello globale, che ipo ano la ci colazione di ceppi di A.
baumanni p odu o i della ca bapenemasi GIM in Ge mania (Queenan AM e al., 2007), Egi o
(Alkasaby NM e al., 2017) e A abia Saudi a (Sa a i M e al., 2015) e di NDM in B asile
Tesi di Do o a o | Domiziana Di Tella
126
(Pillone o M e al., 2014), Cina (Chen Y e al. 2011), Egi o (Kaase M e al., 2011) ed India
(Ka hikeyan K e al., 2010). Ciononos an e, ceppi di A. baumannii p odu o i di NDM sono
s a i anche segnala i in F ancia e G ecia negli ul imi anni (Decousse JW e al. 2013; Voulga i
E e al. 2016).
Sebbene le MβL siano iden i ica e con mino e equenza in A. baumannii ispe o alle
ca bapenemasi OXA, la lo o a i i à id oli ica nei con on i dei ca bapenemi è
signi ica i amen e più ele a a, essendo in g ado di id olizza e u i gli an ibio ici β-la amici,
ad eccezione dei monoba ami (az eonam) (Amudhan SM e al., 2011).
Nei ceppi esamina i sono isul a e assen i anche le ca bapenemasi KPC e GES appa enen i alla
classe A, in acco do con i da i disponibili in I alia (No dmann P e al., 2009; A nold RS e al.,
2011; Ripabelli G. e al., 2018). In a i, le β-la amasi di ipo KPC si o ano p e alen emen e
e, a li elli endemici, in ceppi di K. pneumoniae (No dmann P e al., 2009; A nold RS e al.,
2011; Ripabelli G e al., 2018) e in alcune specie di En e obac e (Hossain A e al., 2004; B a u
S e al., 2005; Queenan AM e al., 2007). Gli unici casi di ceppi di A. baumannii p odu o i di
KPC sono s a i iscon a i a Po o Rico (Ma inez T e al., 2016; Alkasaby NM e al., 2017).
Le ca bapenemasi GES, sebbene a e, sono s a e iden i ica e in u o il mondo, inclusa l’Eu opa
e, a a eccezione pe qualche ocolaio di dimensioni limi a e, sono s a e associa e
equen emen e a isolamen i spo adici o occasionali (Queenan AM e al., 2007).
T a gli obie i i del la o o di esi, i e a anche la alu azione della p e alenza di geni codi ican i
pe le p incipali pompe di e lusso in A. baumannii, sebbene la de e minazione dei ispe i i
li elli di esp essione a ebbe o ni o un quad o più chia o sul lo o coin olgimen o nei
meccanismi di esis enza agli an ibio ici (Coyne S e al., 2010; Rosen eld N e al., 2012). La
esis enza media a dalle pompe di e lusso, in pa icola e della amiglia ‘Resis ance Nodula ion
Di ision’ (RND) ampiamen e dis ibui e in A. baumannii, con ibuisce signi ica i amen e a
idu e la susce ibili à a più an ibio ici quando sono so a-esp esse (Coyne S e al., 2010). I
geni appa enen i a ale amiglia, quali adeB, adeG e adeJ, sono s a i iscon a i in u i i ceppi
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esamina i, con e mando l’ampia dis ibuzione in ale ba e io e sugge endo una po enziale
associazione con la esis enza agli an ibio ici (Lin MF, Lan CY, 2014). Anche il egola o e
nega i o dell’esp essione delle pompe di e lusso, soxR, è s a o iscon a o in u i i ceppi, ma
dal momen o che è s a a alu a a la solo p esenza è di icile alu a ne l’e e o sui geni egola i
da esso. È s a o ipo a o che soxR è in g ado di egola e di e amen e codi ican i pe le pompe
di e lusso. In a i, la lo o esp essione, in pa icola e di adeG e adeJ appa enen i alla amiglia
RND è isul a a signi ica i amen e diminui a in p esenza di una so a-esp essione di soxR (Li
H e al., 2017).
Rigua do i geni codi ican i pe le al e pompe di e lusso, solo abeS, appa enen e alla amiglia
‘Small Mul id ug Resis ance’ (SMR), è s a o iscon a o in u i i ceppi esamina i, men e i geni
abeM ( amiglia ‘Mul id ug and oxic compound ex usion’ - MATE) e c aA ( amiglia Majo
Facili ies Supe amily - MFS) sono isul a i semp e assen i, sugge endo un impa o poco
signi ica i o di ali sis emi nella esis enza con e i a a clo am enicolo, imipenem e
luo ochinoloni. Al con a io, è impo an e so olinea e il uolo di abeS nella esis enza e so
alcuni an ibio ici in A. baumannii, a cui amikacina, clo am enicolo e cip o loxacina, come
dimos a o in un al o s udio (S ini asan VB e al., 2009). Pe an o, la combinazione dei geni
di esis enza e delle pompe di e lusso può app esen a e una s a egia di successo pe ques o
mic o ganismo nella sop a i enza e nell’ada amen o nell’ambien e ospedalie o (Jia W e al.,
2015).
L’analisi median e PFGE, u ilizzando i due enzimi di es izione ApaI e AscI, ha indica o la
p esenza di dis in i clus e e pulso ipi. Di a o, il p incipale obie i o della geno ipizzazione è
quello di de e mina e se gli isola i siano co ela i e, quindi, appa enen i ad un ocolaio
epidemico (Samma co ML e al., 2014), poiché è no o che all’in e no di popolazioni ba e iche
della s essa specie esis e un’ampia a ie à gene ica cos i ui a da una o più so opopolazioni
gene icamen e uni o mi, denomina e ‘cloni’, che p o engono dallo s esso ceppo (Singh A e
al., 2006; Samma co ML e al., 2014). P op io pe la sua capaci à disc iminan e, ad oggi, la

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PFGE isul a esse e uno dei me odi di scel a pe la ipizzazione molecola e dei ba e i,
disc iminando i ceppi in base alla lo o “imp on a digi ale” ( inge p in ) gene a a dalla
diges ione del genoma con un enzima di es izione, che iconosce speci iche sequenze di DNA
(Fon ana C e al., 2013).
L’analisi del dend og amma o enu o a a e so la diges ione con ApaI ha e idenzia o una più
ele a a simila i à a i ceppi ispe o a quello o enu o con AscI, gene ando in a i 4 clus e e 7
pulso ipi in con on o a 7 clus e e 11 pulso ipi ispe i amen e, indicando un po e e
disc iminan e della me odica più ele a o con l’impiego di AscI e sugge endo il suo u ilizzo pe
i con on i in e -labo a o io (Chang KM e al., 2013).
Sebbene con l’enzima AscI sia s a a e idenzia a una maggio e capaci à disc iminan e, la
combinazione dei ammen i o enu i dalla diges ione con en ambi gli enzimi ha gene a o un
dend og amma so apponibile a quello o enu o con ApaI. L’analisi combina a con i due enzimi
ha consen i o di osse a e una maggio e p e alenza di un pulso ipo (PT4), sugge endo la
ci colazione nell’ambien e ospedalie o di ceppi al amen e co ela i a lo o, come ipo a o in
al i s udi (Da Sil a GJ e al., 2016; Nowak P e al., 2016). Ciò è sos enu o dal a o che u i i
ceppi ca a e izza i dallo s esso pulso ipo hanno anche mos a o lo s esso p o ilo di esis enza
pe u i gli an ibio ici, comp esi i due ca bapenemi. Inol e, ali ceppi sono isul a i anche
sensibili alla colis ina, con e mando l’ele a a susce ibili à di ceppi MDR di A. baumannii e so
ques o an ibio ico (Mezza es a ML e al., 2008; Mammina C e al., 2011). Tu a ia, con
l’aumen a o ico so alla colis ina pe il a amen o delle ICA causa e da A. baumannii, si i iene
al amen e p obabile che anche la esis enza a ale an ibio ico possa aumen a e d as icamen e,
limi ando ul e io men e le opzioni e apeu iche (Qu eshi ZA e al., 2015).
Lo schema Ox o d u ilizza o pe la ipizzazione di A. baumanii median e MLST (Ba ual S e
al., 2005) ha e idenzia o e ST ci colan i all’in e no del P esidio Ospedalie o, con la maggio e
p e alenza di ST1720, segui o da ST218 e ST513 e un ST non de ini o. I e ST de ini i
app esen ano ognuno la a ian e monoallelica degli al i, di e endo pe il solo allele del gene
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ecA. Il nuo o ST, in ece, è la a ian e monoallelica di ST1720 pe il gene poD. I ceppi
iden i ica i e s a i ica i in base al ST non sono isul a i al e an o dis inguibili con la PFGE,
che li ha agg uppa i negli s essi clus e o pulso ipi nonos an e la a iazione allelica. Ques o
può conside a si plausibile, in quan o gli enzimi di es izione u ilizza i nella ecnica della
PFGE iconoscono si i di aglio che e iden emen e non hanno coin ol o i geni housekeeping,
pu isul ando a ia i con l’MLST. In ogni caso, u i i ceppi in s udio sono isul a i al amen e
co ela i.
Allo s a o a uale, anco a pochi sono gli s udi disponibili a li ello eu opeo e nazionale igua do
i cloni maggio men e ci colan i. Pe A. baumannii, i an aggi di una classi icazione ami e
MLST sono s a i in qualche modo ido i dalla coesis enza di due schemi, en ambi ampiamen e
u ilizza i (Gaia sa S e al., 2019). Gli schemi comp endono le specie A. baumannii e
Acine obac e non-baumannii. Il p imo schema è s a o indica o come schema di Ox o d
(Ba ual S e al., 2005), men e successi amen e è s a o in odo o un ul e io e app occio,
conosciu o come schema Pas eu (Diancou L e al., 2010). I due schemi sono isul a i esse e
complemen a i, ma il sis ema MLST-Ox o d ha dimos a o di possede e un po e e
disc iminan e più ele a o ispe o allo schema Pas eu (Tomaschek F e al., 2016) e pe ali
mo i azioni, è s a o u ilizza o pe ques o s udio.
Da i ecen i ela i i alla si uazione epidemiologica in I alia, hanno e idenzia o median e lo
schema MLST-Ox o d la sola ci colazione di ST415 in 13 ceppi di A. baumannii isola i in un
ou b eak ospedalie o in e apia in ensi a (Vendi i C e al., 2019). In un al o s udio (Lo enzin
G e al., 2019), sebbene condo o con l’al o schema (Pas eu ), in ceppi isola i in un ospedale
del no d I alia è s a a, in ece, ipo a a la ci colazione di di e en i ST, quali ST2, ST19, ST195,
ST577 e ST632. I da i o enu i sono s a i con on a i anche con al i s udi condo i in Egi o e
India, che hanno u ilizza o lo schema Ox o d, in cui comunque sono s a i iden i ica i ST
di e en i ispe o a quelli osse a i nel p esen e la o o (Vijayakuma S e al., 2018; Al-Hassan
L e al., 2019).
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6.3. De e minan i di esis enza agli an ibio ici in S. en e ica non i oidea
in campioni di di e sa ma ice
Salmonella è l’agen e ba e ico più comunemen e isola o in caso di in ezioni asmesse da
alimen i. Le in ezioni da Salmonella spp. possono e i ica si nell’uomo e negli animali
domes ici, da co ile e sel a ici, comp esi i e ili domes ici (iguane e a a ughe d’acqua). I
p incipali se ba oi sono app esen a i p op io dagli animali e dai lo o de i a i (ca ne, uo a e
la e consuma i c udi o non pas o izza i) e dall’ambien e (acque non po abili) (Epicen o.iss.i .).
In I alia, il nume o dei casi di Salmonella spp. isola i da casi umani nel 2018, o ni i dalla e e
di so eglianza En e -Ne , è s a o di 3656, e idenziando un lie e inc emen o ispe o agli anni
p eceden i (EFSA e ECDC, 2018). Nel 2018, gli S a i Memb i dell'UE hanno segnala o 5146
ocolai epidemici di o igine alimen a e mis a che hanno colpi o 48365 pe sone; ispe o al 2017,
è s a o iscon a o un legge o aumen o nel nume o di pe sone coin ol e (+2897), nelle
ospedalizzazioni (4588 ico e a i, +1%) e nei decessi (40 decessi, +21%). Il 13% dei ocolai si
è e i ica o in ambi o amilia e e Salmonella è s a o il p incipale agen e causale anche nel 2018,
esponsabile di 1 ocolaio su 3 (Epicen o.iss.i .).
Slo acchia, Spagna e Polonia hanno egis a o il 67% dei 1581 ocolai o ali do u i a
Salmonella. Come negli anni p eceden i, la maggio pa e dei ocolai sono s a i causa i dal
se o a S. En e i idis, che sono aumen a i del 36,3% ispe o al 2017 (Eu opean Food Sa e y
Au ho i y, 2019). Gli e en i epidemici causa i da Salmonella e S. En e i idis nel 2018 sono s a i
p incipalmen e associa i a uo a e p odo i a base di uo a, come negli anni p eceden i (Eu opean
Food Sa e y Au ho i y, 2019).
Una pa e di ques o la o o di esi ha igua da o lo s udio di ceppi di S. en e ica non i oidea
isola a da campioni di a ia ma ice (alimen i-, ambien i e acqua), p esso il Public Heal h
England (PHE), sezione Food Wa e and Eni i onmen al e Gas oin es inal Bac e ia Re e ence
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Uni di Colindale, Lond a. In pa icola e, l’analisi ha igua da o un da ase di 74.958 campioni
di di e sa o igine, includendo alimen i, mangimi, campioni ambien ali e acqua, p ele a i
nell’ambi o della so eglianza igienico-sani a ia e e ua a nel Regno Uni o. È s a a
successi amen e iden i ica a la ca ego ia maggio men e coin ol a nella con aminazione da
pa e di Salmonella. I isul a i sono s a i in e essan i, poiché i campioni maggio men e coin ol i,
in e mini di p e alenza in ogni ma ice, sono isul a i quelli ambien ali e isola i da acqua (2,5%
e 9,8% ispe i amen e). I campionamen i hanno igua da o swab su supe ici depu a e alla
p epa azione di alimen i o che po ebbe o esse e coin ol e in con aminazioni c ocia e du an e
la p epa azione degli s essi, come maniglie, ubine i, po e, oppu e campioni di panni usa i pe
la pulizia o l’asciuga u a delle mani. I campioni di acqua, come i campioni ambien ali, sono
s a i p ele a i sop a u o da cucine di is o an i, in aniche oppu e nei la andini do e e ano s a i
pos i molluschi e u i di ma e. È necessa io so olinea e che ques i campionamen i non sono
s a i casuali, in quan o a enu i a segui o di segnalazioni di ou b eak co ela i al consumo di
alimen i nei is o an i. Ciò sicu amen e può a e de e mina o una so as ima dei casi posi i i
sul o ale.
Inol e, il 2% dei campioni di mangime pe animali, sop a u o den al-s ick pe cani, è isul a o
posi i o. La p e alenza di Salmonella non i oidea in campioni di pe - ood è isul a a piu os o
al a. La sicu ezza alimen a e e mic obiologica degli alimen i pe animali, sop a u o quelli
domes ici, è impo an e pe la salu e e la sicu ezza nell’ambien e domes ico, poiché ceppi di
Salmonella possono di onde si nell’ambien e a a e so alimen i pe animali, che spesso non
engono manipola i in manie a sicu a, implicando un ele a o ischio di con aminazione
c ocia a e, quindi, un ele a o ischio pe la salu e umana. Pe an o, è necessa io implemen a e
gli s udi epidemiologici a igua do, al ine di alu a e le s a egie pe aumen a e la
consape olezza del ischio da pa e dei p op ie a i di animali domes ici (Finley R e al., 2006).
T a i 982/74.598 campioni posi i i a Salmonella, l’85% è isul a o p o enien e da ma ici
alimen a i des ina e al consumo umano, dei quali il 46% appa enen i alla ca ego ia di ipo RTE.
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85%, ispe i amen e), men e in ceppi p o enien i da Tailandia è s a a osse a a una
p e alenza del 59% in pa C e del 31% in gy A. Nei ceppi dal Regno Uni o, le a ian i di pa C
sono s a e iscon a e nel 70% e solo nel 12% in gy A. In acco do con da i di le e a u a, la
esis enza ai chinoloni è mol o di usa nei ceppi di Salmonella spp. isola i da alimen i in B asile
(P ibul B e al., 2017). Tali an ibio ici sono comunemen e usa i pe il a amen o della
salmonellosi da ceppi MDR in medicina umana e e e ina ia pe la lo o a i i à an imic obica
ad ampio spe o, ma l'aumen o della esis enza cos i uisce un’ul e io e di icol à nel con ollo
di ali in ezioni (P ibul B e al., 2017). I geni sul-2, associa o alla esis enza al sul ame ossazolo,
e e A, coin ol o nella esis enza alla e aciclina, sono isul a i i de e minan i di esis enza
p e alen i ( ispe i amen e 94,2% e 94,6%) nei ceppi di Salmonella, specialmen e in quelli
p o enien i dal B asile. Al con a io, i ceppi p o enien i dalla Tailandia hanno mos a o una
bassa p e alenza di ques i geni, come quelli dal Regno Uni o. I geni sul-2 e e A sono ipo a i
a i de e minan i di esis enza p e alen i nelle ispe i e classi an ibio iche (sul amidici e
e acicline) anche in un ecen e s udio (Neue S e al., 2018), essendo isul a i p esen i in
490/927 (sul2) e in 843/927 ( e A) ceppi es a i, ispe i amen e. L’ele a a p e alenza di ques i
de e minan i nei ceppi p o enin i dal B asile ispe o a quelli da Tailandia e Regno Uni o
so olinea l’assenza di poli iche di s ewa dship an imic obica in ques a Nazione del Sud
Ame ica, che può app esen a e una impo an e concausa della selezione e di usione di
esis enze ba e iche. L’ele a a esis enza dei ceppi di Salmonella isola i da campioni di pollo,
impo a i nel Regno Uni o dal B asile, ispe o agli al i coin ol i nello s udio, so olineano la
dimensione del p oblema. Il B asile è il e zo maggio e p odu o e di ca ne di pollo dopo S a i
Uni i e Cina) ed è il maggio e espo a o e di ques o p odo o (U.S. In e na ional T ade
Commission, 2012). Le poli iche sani a ie e le scel e ope a e in ale Paese do ebbe o esse e
maggio men e o ien a e a de ini e no am i e e p ocedu e necessa ie pe mi iga e il p oblema
dell’AMR, supe ando l’inadegua ezza e al ol a l’assenza di leggi nazionali e di linee guida
sull’adegua o u ilizzo di an ibio ici.

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7. Conclusioni
L'eme genza di un nume o semp e più c escen e di ba e i pa ogeni esis en i agli an ibio ici
cos i uisce una minaccia alla man e pe la salu e pubblica, in pa icola e pe i g uppi più
ulne abili della popolazione, come pe sone immunodep esse, anziani e bambini (Alsan M e
al., 2018). Ciò ende l’an ibio ico- esis enza un p oblema p io i a io di sani à pubblica a li ello
mondiale. Le sue implicazioni non sono solo di ca a e e sani a io (aumen o della mo bili à,
le ali à, du a a della mala ia, s iluppo di complicanze, epidemie), ma anche di ca a e e
economico poiché in luisce sui cos i pe l’impiego di a maci e p ocedu e più cos ose e pe il
p olungamen o dei empi di degenza. La esis enza ai a maci è de e mina a dalla p esenza di
geni codi ican i pe enzimi o p o eine coin ol i nel me abolismo degli an ibio ici. Si passa dalla
p esenza enzimi che deg adano l’an ibio ico a geni che codi icano pe pompe di e lusso che
espellono il a maco dal compa o in acellula e del ba e io, impedendo il aggiungimen o
delle concen azioni u ili all’a i i à della molecola, pe ini e a modi icazione dei si i a ge
dell’an ibio ico s esso.
Il c escen e u ilizzo della genomica ha condo o alla e isione della de inizione di
mic o ganismi e a iconside a e le capaci à di un ba e io median e lo s udio del me abolismo,
della isiologia, dell’ecologia e delle elazioni ospi e-pa ogeno e, quindi, a iesamina e l'insieme
di me odi e app occi u ili a con as a e le in ezioni (Na u e Re iews Gene ics, 2019). Le
ecniche molecola i, che p e edono l’analisi del genoma, in b e e empo, pe me e ebbe o di
e e ua e una so a di “an ibiog amma molecola e”. G azie al lo o impiego, è possibile in un
gio no, i ualmen e senza alcuna necessi à di col i azione ba e ica, o ene e un p o ilo di
esis enza gene ica, che può esse e la base pe la decisione di una e apia mi a a e apida. Ques e
ecniche, inol e, o nendo da i ogge i amen e accu a i e con on abili a li ello mondiale,
consen ono di implemen a e la so eglianza dei ceppi ba e ici più i ulen i e esis en i e di
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implemen a e le s a egie speci iche pe con ene e e con as a e il enomeno (Na u e Re iews
Gene ics, 2019).
In ques o la o o di esi, sono s a i u ilizza i a i app occi genomici allo scopo di alu a e le
dimensioni dell’an ibio ico- esis enza e i suoi de e minan i, analizzando ceppi di K.
pneumoniae e A. baumannii implica i nell’inso genza di in ezioni co ela e all’assis enza e
ceppi di Salmonella en e ica non i oidea, agen e eziologico della maggio pa e di mala ie a
asmissione alimen a e. In pa icola e, pe l’analisi di ceppi MDR di K. pneumoniae e A.
baumannii isola i nel se ing ospedalie o della Regione Molise, sono s a e impiega e di e se
me odiche, quali PFGE, usa a pe la ipizzazione molecola e degli isola i e la alu azione delle
elazioni clonali esis en i a essi; MLST ai ini di un’ul e io e geno ipizzazione e di un
con on o sui cloni ci colan i con i da i disponibili a li ello nazionale e in e nazionale; PCR, al
ine di de e mina e la p e alenza di de e minan i genici alla base dell’an ibio ico- esis enza; il
sequenziamen o con me odo Sange pe l’iden i icazione di mu azioni all’in e no di geni
coin ol i nell’acquisizione di esis enza an ibio ica (genomica di ecchia gene azione). Nello
s udio di ceppi di S. en e ica non i oidea isola i da di e se ma ici sono s a i analizza i da i
o enu i median e WGS, ecnica che p e ede il sequenziamen o dell’in e o genoma ba e ico da
cui è possibile es apola e ogni in o mazione, includendo l’appa enenza a complessi clonali e
la p esenza di de e minan i di esis enza acquisi a da plasmidi oppu e do u a all’inso genza di
mu azioni in geni coin ol i in ali meccanismi (genomica di nuo a gene azione).
L’u ilizzo di me odiche molecola i è, quindi, necessa ia non solo pe con e ma e i da i o enu i
median e me odi eno ipici adizionali (an ibiog amma, sie o ipizzazione, p o e biochimiche,
ecc.), ma è anche essenziale pe de ini e il enomeno in modo esaus i o e pe o ni e una isione
più ampia della di usione e dell’e oluzione ami e la de e minazione dei p o ili gene ici
associa i alla esis enza agli an ibio ici.
Il p esen e la o o di esi ha igua da o lo s udio della esis enza ai ca bapenemi e alla colis ina
negli isola i clinici di K. pneumoniae e di A. baumannii della Regione Molise. I isul a i sono
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di no e ole u ili à pe una miglio e comp ensione dell’epidemiologia delle in ezioni ospedalie e
sos enu e da ali mic o ganismi a li ello locale e possono esse e ce amen e alidi pe il
con on o con i da i disponibili a li ello nazionale e in e nazionale, comple andone il quad o
epidemiologico.
Lo s udio di K. pneumoniae esis en e ai ca bapenemi ha pe messo di con e ma e che le
in ezioni/colonizzazioni sos enu e da ques o mic o ganismo sono, come a eso, più
comunemen e ile a e nei pazien i in e apia in ensi a, a causa delle lo o condizioni c i iche e
delle p ocedu e in asi e, e che l'enzima KPC, nel con es o esamina o, è la ca bapenemasi
p edominan e, segui a da VIM. Il la o o s ol o ha pe messo di iscon a e un li ello più ele a o
di esis enza alla colis ina nei ceppi di K. pneumoniae ispe o a quello osse a o in al i s udi
condo i in I alia, sebbene p o enien i dal sis ema di so egliaza degli ‘Ale o ganisms’. G azie
all’ampli icazione e al successi o sequenziamen o del gene mg B, implica o nel man enimen o
della susce ibili à alla colis ina, è s a o possibile associa e la esis enza a ale an ibio ico
all'acquisizione di Sequenze di Inse zione o all'accumulo di mu azioni dele e ie in esso,
escludendo comple amen e la p esenza delle a ian i plasmidiche di ipo mc . Ul e io i indagini
sono comunque necessa ie pe chia i e l'in e o uolo del sis ema di segnalazione Pm nei ceppi
esis en i alla colis ina, sop a u o in elazione ad un ceppo che, pu isul ando esis en e ad
ess, non ha mos a o mu azioni nel gene a ge . La ipizzazione molecola e di ceppi median e
PFGE ha pe messo di iden i ica e clus e sia pe K. pneumoniae, sia pe A. baumannii. Tale
me odica, o mai ela i amen e economica ispe o ad al e ecniche molecola i, isul a
comunque labo iosa poiché ichiede di e si gio ni pe una sua co e a esecuzione. La me odica
MLST, sebbene non abbia pe messo di disc imina e i clus e di e samen e e idenzia i ami e
la PFGE, ha o ni o una desc izione accu a a dei cloni ci colan i nel con es o ospedalie o
egionale, consen endo di con on a li con i da i nazionali e in e nazionali. È s a o, in a i,
possibile associa e la p esenza della ca bapenemasi KPC, di cui sono s a i con e ma i i li elli
endemici, all’ele a a p e alenza del clone ST512, a ian e monoallelica di ST258, che è il
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p imo clone associa o alla di usione della ca bapenemasi KPC a li ello globale. Inol e, è s a o
possibile iden i ica e una ansizione in K. pneumoniae e so un aumen o della ci colazione di
ST101, anch’esso oggi conside a o pa icola men e i ulen o e esponsabile della di usione di
KPC. Le in ezioni sos enu e da ceppi di K. pneumoniae esis en i ai ca bapenemi, in pa icola e
quando p oducono KPC, sono ampiamen e dis ibui e e i a amen i an imic obici do ebbe o
esse e alu a i c i icamen e, de e minando anche il p o ilo molecola e del ceppo in ques ione
(Ripabelli G e al., 2018). Alla luce della mancanza di nuo i agen i an imic obici pe il
a amen o delle in ezioni co ela e all’assis enza di icili da a a e, l'a uazione di adegua e
s a egie di p e enzione e un'adegua a disponibili à di pe sonale o ma o è essenziale pe
con olla e la di usione di MDR K. pneumoniae (Ripabelli G e al., 2019).
Anche la ca a e izzazione bio-molecola e di ceppi di A. baumannii isola i nel medesimo
P esidio Ospedalie o o nisce pe la p ima ol a da i igua dan i la si uazione epidemiologica
nella Regione Molise. Lo s udio di ques i isola i ha consen i o di a ibui e al gene blaOXA-23 la
esis enza ai ca bapenemi e, pa allelamen e, ha anche con e ma o la d as ica iduzione di
blaOXA-58, in acco do con i da i i aliani. Inol e, la esis enza e so le oximino-ce alospo ine è
s a a associa a all’enzima AmpC e a alo a a dall’assenza delle ESBL. La ice ca dei
de e minan i gene ici di esis enza median e saggi speci ici di PCR ha pe messo di e idenzia e
l’eme genza della ca bapenemasi VIM, e idenzia a solo a amen e in A. baumannii, il cui
aumen o anche nel con es o i aliano po ebbe esse e do u a ad un aumen o dei iaggi
in e nazionali e in e con inen ali, da a la maggio e p e alenza nei Paesi dell’Es Eu opa e
dell’Asia.
L'uso di WGS, che a a e so il sequenziamen o dell’in e o genoma di un ba e io in sos anza
include i isul a i o enibili a a e so u e le ecniche di ampli icazione e sequenziamen o come
PCR e MLST, ha consen i o di analizza e apidamen e i da i ela i i a quasi 75.000 ceppi di S.
en e ica non i oidea a ini epidemiologici. Inol e, è un me odo s anda d, i cui da i o enu i
possono esse e con on a i in u o il mondo basandosi sul isul a o ogge i o della sequenza di
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DNA. Tale ecnica ha mos a o un’o ima applicabili à anche pe lo s udio e la ile azione di
nuo i meccanismi di an ibio ico- esis enza. Pe an o, WGS do ebbe esse e implemen a o su
la ga scala nello s udio dell'AMR. Dal sequenziamen o del genoma ba e ico comple o alla
me agenomica, o e un ampio se di s umen i in g ado di iden i ica e e ca a e izza e
apidamen e i ceppi mic obici, o nendo in o mazioni ad al a isoluzione sul genoma e
pe me endo una comp ensione accu a a dei meccanismi gene ici esponsabili della esis enza
ai a maci (Hend iksen RS e al. 2019). La genomica dei mic o ganismi è alla base delle scienze
omiche e include la asc i omica, me agenomica, me a asc i omica, ga an endo il
supe amen o degli app occi iduzionis ici al ine ul imo di desc i e e il co edo comple o dei
geni di un o ganismo e l’analisi della biodi e si à (Hasin Y e al., 2017). Inol e, o nisce
suppo o agli s udi di as e imen o genico la e ale (an ibio ico- esis enza, me abolismo degli
xenobio ici) e nella icos uzione di ie me aboliche e della comp ensione della biologia dei
sis emi.
Il la o o di esi ha pe messo di a alo a e che il WGS è un me odo e icace pe lo sc eening di
un g an nume o di isola i e dei de e minan i di esis enza, poiché i da i isul ano accu a i e meno
sogge i a e o i, quindi, pa icola men e u ili al con on o ispe o ai da i o enu i con me odi
adizionali (Tang S e al., 2019). Il u u o u ilizzo del WGS pe la de e minazione dei p o ili
di esis enza ichiede ul e io i s udi, poiché il esis o ipo app esen a un ca a e e eno ipico
do u o all’in e azione a il geno ipo e l’ambien e, sa à necessa io s abili e il uolo di di e si
de e minan i genici di esis enza an ibio ica, p esi sia singola men e, sia in associazione, nella
de e minazione della MIC ad ogni an ibio ico (Nai S e al., 2016). La gene azione, quasi in
empo eale, di da i molecola i su mol i ceppi con empo aneamen e gene a una iso sa
signi ica i a e una base di pa enza pe la ice ca e lo s iluppo di nuo e ecniche e s a egie.
Nel de aglio, è s a o possibile alu a e in un empo ela i amen e b e e quali de e minan i di
esis enza agli an ibio ici, e lo o a ian i, osse o maggio men e di usi nel con es o
in e nazionale. La β-la amasi più di usa è isul a a CMY-2 sop a u o in isola i p o enien i

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dal B asile, isul a a assen e negli isola i da Tailandia e Regno Uni o e che hanno p esen a o,
in ece, TEM-1. Il gene aac(6’)Iy, codi ican i pe aminoglicoside-ace il ans e asi è isul a o
p e alen e sia nei ceppi da B asile, sia in quelli da Tailandia e Regno Uni o. Mu azioni nei geni
c omosomici pa C e gy A, che mediano la esis enza ai luo ochinoloni ca a e is ici della quasi
oo ali à dei ceppi dal B asile sono isul a e mediamen e p esen i in quelli p o enien i da
Tailandia e dal Regno Uni o. sul-2, e e A anch’essi p e alen i nei ceppi p o enien i dal B asile,
hanno mos a o una bassa p e alenza negli al i Paesi in s udio.
È da segnala e che sono necessa ie linee guida e p ocedu e ope a i e pe accoglie e e in eg a e
i da i di WGS con al e ecniche u ilizza e nelle indagini epidemiologiche, al ine di ga an i e
le s a egie più app op ia e pe la u ela della salu e pubblica. In linea di p incipio, la sequenza
genomica di un mic o ganismo con iene u e le in o mazioni o enibili usando me odi di
ecchia gene azione (PFGE, PCR, sequenziamen o di Sange , MLST), ma WGS ha il
po enziale di sos i ui e mol e delle p ocedu e ad al a in ensi à di la o o anco a u ilizza e
(Gilch is C e al., 2015). Nello s udio, i da i molecola i sull’an ibio ico- esis enza in ceppi di
Salmonella non i oidea hanno e idenzia o ca a e is iche impo an i del enomeno a li ello
globale. I ceppi p o enien i dal Regno Uni o hanno mos a o un li ello di esis enza più basso,
sia in e mini di p e alenza dei ceppi MDR, sia di p e alenza dei de e minan i genici associa i
ad essa. Gli isola i hanno mos a o, in a i, bassa esis enza ai β-la amici, alle e acicline e ai
sul amidici, nonché a mac olidi, am enicoli e ime op im, ma è s a a signi ica i a la p e alenza
dei geni coin ol i nella esis enza ad aminoglicosidi e chinoloni; inol e, un ceppo ha p esen a o
il de e minan e di esis enza pe la os omicina. I ceppi p o enien i dalla Tailandia hanno
p esen a o un li ello di esis enza in e medio, con ele a a esis enza pe chinoloni e
aminoglicosidi, bassi li elli di esis enza e so β-la amici, mac olidi, ime op im, sul amidici
e e acicline, ma sono s a i gli unici ceppi a p esen a e, anche se in basse pe cen uali, i
de e minan i di esis enza pe am enicoli. Inol e, ali ceppi hanno mos a o un’ampia gamma
di de e minan i genici in e mini di nume o di a ian i e di classi an ibio iche in e essa e. I ceppi
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p o enien i dal B asile hanno p esen a o li elli di mul i esis enza ele a i, app esen ando ci ca
il 75% dei ceppi MDR in s udio. La quasi o ali à dei ceppi ha mos a o de e minan i di
esis enza e so β-la amici, aminoglicosidi, chinoloni, e acicline e sul amidici e bassi/nulli
li elli di esis enza a mac olidi, am enicoli e ime opim. Dai da i di WGS, è s a o e iden e
che il Regno Uni o, come l’Eu opa, a ua s a egie con eni i e pe il con as o del enomeno
dell’AMR, sop a u o pe quan o igua da la s ewa dship an imic obica, con la messa al bando
degli an ibio ici u ilizza i come p omo o i della c esci a e linee guida pe l’u ilizzo consape ole
nel compa o animale di ali molecole, al ine di u ela ne l’e icacia nell’uomo. La Tailandia
s a ce cando una s a egia di con ollo del enomeno indi izza a e so la u ela di quelle classi
di an ibio ici pe cui anco a non è eme sa una esis enza ele a a. Il B asile, da a l’assenza di
sis emi di so eglianza, nonché di linee guida e no me sull’a gomen o, non s a anco a
pa ecipando a i amen e alla lo a a ques o enomeno, causando g a i conseguenze anche in
al i Paesi del mondo in cui espo a i p op i p odo i e con essi mic o ganismi e de e minan i
genici. È, dunque, necessa io sensibilizza e i go e ni a li ello mondiale igua do il p oblema
della esis enza agli an imic obici, in modo che possano a ua e s a egie e impo e egole più
s ingen i nell’u ilizzo di ques e p eziose molecole. Nonos an e i assi di AMR aggiungano
li elli mol o ele a i, l’Eu opa p esen a una legislazione p ecisa e s ingen e in e mini di u ilizzo
di an ibio ici a li ello sani a io, sop a u o nella p a ica dell’alle amen o con la messa al bando
del lo o u ilizzo a dosi sub- e apeu iche come p omo o i della c esci a, al con a io di al i Paesi.
Vi è, dunque, l’es ema necessi à di un piano globale di azione e lo a all’AMR.
In conclusione, l'applicazione di analisi molecola i pe il ile amen o apido e accu a o dei
de e minan i di esis enza e di mu azioni gene iche che con e iscono esis enza è c uciale pe
idu e e con olla e il ca ico di in ezioni da ba e i MDR e pe guida e nella scel a della e apia
più e icace, nonché pe comp ende e l’epidemiologia e le dinamiche di di usione
nell'ambien e ospedalie o.
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La ipizzazione molecola e dei mic o ganismi pa ogeni assume, quindi, un uolo cen ale nella
so eglianza e nello s udio dell’epidemiologia delle mala ie in e i e, mos ando un ele a o
po e e disc iminan e e consen endo la desc izione di si uazioni complesse u ili ad indi idua e
le s a egie d’in e en o più e icaci. Nonos an e l’e oluzione ecnologica e i an aggi di un
app occio molecola e, l’applicazione di ou ine non è anco a a enu a p obabilmen e a causa
dei cos i, che ia ia sono in d as ica diminuzione, ma anche alla complessi à di analisi che
ichiede ope a o i al amen e o ma i. Cionodimeno, in ques a ase di sos anziale ansizione,
l’indi iduazioni di Cen i di i e imen o po ebbe ga an i e l’applicazioni di ques e nuo e
me odiche già da subi o nella p a ica clinica e nella de inizione di idonee poli iche di Sani à
Pubblica.
Pe an o, alla luce dei isul a i o enu i nel la o o di esi, nel se ing ospedalie o è necessa io
miglio a e la s ewa dship an imic obica, iducendo e limi ando l’u ilizzo di an ibio ici al ine
di u ela e l’e icacia delle poche molecole e so le quali anco a non si è assis i o ad una pe di a
sos anziale di susce ibili à, come la os omicina. Tali s a egie and ebbe o applica e a li ello
globale, in quan o la di usione di mic o ganismi esis en i e dei geni associa i ad essa in e essa
u i i compa i di i a.
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