T abajo Fin de Mas e
Es udio de la oxicidad ambien al e in i o
de los ma e iales g a énicos
Au o
Juan José Calleje o Ma ín
Di ec o
D . José Luis Pinilla Iba z
Codi ec o a
D a. E a Mª Gal ez Bue ba
Ponen e
D . Julián Pa do Jimeno
Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a
Depa amen o de Bioquímica y Biología Molecula y Celula
2020
RESUMEN
Los ma e iales g a énicos son conocidos desde el descub imien o en 1985 de los
ule enos, y pos e io men e, en 2004 del g a eno. El descub imien o de es e úl imo supuso oda
una e olución en muchas de las á eas de in es igación debida a las excelen es p opiedades que
p esen aban es os ma e iales (ele ada conduc i idad é mica y eléc ica, al o módulo de Young,
e c.). Den o de los ma e iales g a énicos, des acan los pun os cuán icos de g a eno “GQDs” (po
sus siglas en inglés: g aphene quan um do s), que se ca ac e izan po ene un amaño
nanomé ico de en e 3-20 nm y po posee , además de las ca ac e ís icas p opias de los
ma e iales g a énicos, o oluminiscencia. La capacidad de se o oluminiscen es ha pe mi ido
que sean empleados en mul i ud de aplicaciones, en e las que des aca su uso en aplicaciones
biomédicas. Sin emba go, su u ilización a ni el biomédico se ha is o limi ada debido a que
apenas exis en es udios que analicen con p o undidad la oxicidad que p esen an es os
nanoma e iales.
En el abajo p esen ado se abo dó el es udio de la oxicidad ambien a in i o e in i o
de los GQDs, y más conc e amen e, de los pun os cuán icos de óxido de g a eno “GOQDs” (po
sus siglas en inglés: g aphene oxide quan um do s). Es os nanoma e iales se di e encian de los
GQDs debido a que p esen an g upos oxigenados en su supe icie (p o enien es del mé odo de
ex oliación u ilizado en su sín esis), que modi ican su o oluminiscencia. Los GOQDs se
sin e iza on a pa i de nano ib as de ca bono (CNF) de ipo ishbone, median e un p oceso de
oxidación/ex oliación. Pa a pode comp oba la co ec a ealización de la sín esis, el ma e ial
se ca ac e izó median e dis in as écnicas de análisis (SEM, Análisis elemen al, XPS y TEM). Una
ez ca ac e izado, se analizó la oxicidad que p oducían los GOQDs en Caeno habdi is elegans
(C. elegans), nema odos empleados como modelo de ensayo in i o, siendo some idos a una
exposición aguda (5 días) y c ónica (25 días). Po o o lado, se es udió el e ec o óxico de los
GOQDs en a ias líneas celula es de ó ganos del sis ema diges i o (hepá ica (Hep G2) e in es inal
(Caco-2)) y neu onal (neu oblas oma (SH-SY5Y)), du an e un pe iodo de exposición de 3 y 5 días.
A ni el neu onal, ambién se analizó la oxicidad p oducida po la p esencia de los GOQDs en las
células neu onales di e enciadas después de una exposición de 5 días. Po úl imo, se es udió la
oxicidad inmunológica p oducida po los GOQDs en mac ó agos, después de una exposición de
5 días.
G acias a los esul ados ob enidos se pudo comp oba que la oxicidad, an o a ni el in
i o como in i o, que p esen an es os nanoma e iales depende de la concen ación empleada
y del pe iodo de exposición.
ÍNDICE GENERAL
1 In oducción y obje i os ...................................................................................... 1
1.1 In oducción a los ma e iales g a énicos ................................................................. 1
1.2 Ma e iales g a énicos. ............................................................................................ 2
1.3 Pun os cuán icos de g a eno. .................................................................................. 4
1.3.1 Aplicación en el ámbi o biomédico ........................................................................................ 5
1.3.2 Toxicidad ................................................................................................................................ 7
1.4 Obje i o ................................................................................................................. 8
2 Pa e Expe imen al ............................................................................................. 9
2.1 Sín esis de los GOQDs ............................................................................................. 9
2.2 Técnicas de ca ac e ización. .................................................................................. 10
2.2.1 Mic oscopía elec ónica de ansmisión .............................................................................. 10
2.2.2 Di acción de ayos X ............................................................................................................ 10
2.2.3 Espec oscopia de o oelec ones emi idos po ayos X ...................................................... 11
2.2.4 Análisis Elemen al. ................................................................................................................ 11
2.3 Ma e iales y mé odos. .......................................................................................... 11
2.3.1 Caeno habdi is elegans ........................................................................................................ 11
2.3.2 Cul i os celula es .................................................................................................................. 12
2.3.3 Mac ó agos ........................................................................................................................... 13
2.3.4 Es udio de la oxicidad ambien al in i o ............................................................................. 13
2.3.5 Es udio de la oxicidad in i o. ............................................................................................ 14
2.3.6 Es udio de la oxicidad inmunológica ................................................................................... 16
3 Resul ados ........................................................................................................ 17
3.1 Ca ac e ización de los GOQDs ............................................................................... 17
3.2 Es udio de la oxicidad ambien al in i o .............................................................. 21
3.3 Es udio de la oxicidad in i o. ............................................................................. 23
3.4 Es udio de la oxicidad inmunológica .................................................................... 28
4 Conclusiones ..................................................................................................... 30
5 Bibliog a ía ....................................................................................................... 31

ÍNDICE DE FÍGURAS
Figu a 1: Fo mas y dimensiones ca ac e ís icas de los aló opos del ca bono basados en g a eno
(ma e iales g a énicos) [3]. ........................................................................................................... 2
Figu a 2: Esquema de la ob ención del g a eno median e los mé odos op-down y bo om-up [3]
...................................................................................................................................................... 3
Figu a 3: Uso de los GQDs pa a la ehicula ización de á macos en el a amien o del cánce [18]
...................................................................................................................................................... 7
Figu a 4: Esquema del p oceso de sín esis lle ado a cabo pa a la ob ención de los GOQDs ..... 10
Figu a 5: Caeno habdi is elegans (C. elegans) ............................................................................ 11
Figu a 6: Esquema de la placa de 96 pocillos empleada du an e el expe imen o de oxicidad in
i o ............................................................................................................................................. 16
Figu a 7: Di ac og ama de ayos X de la mues a de las nano ib as de CNF y GOQDs .............. 17
Figu a 8: Po cen aje de los elemen os que componen las nano ib as CNF y los GOQDs. ......... 19
Figu a 9: Región C1s decon olucionada de los espec os XPS de los GOQDs. ............................ 20
Figu a 10: Imágenes TEM de los GOQDs. .................................................................................... 21
Figu a 11: E olución de la asa de supe i encia en C.elegans debida a la exposición aguda con
GOQDs ........................................................................................................................................ 22
Figu a 12: E olución de la asa de supe i encia en C.elegans debida a la exposición c ónica con
GOQDs ........................................................................................................................................ 23
Figu a 13: Es udio de la iabilidad celula de las células Hep G2 an e la p esencia de dis in as
concen aciones de GOQDs a 3 y 5 días ..................................................................................... 24
Figu a 14: Es udio de la iabilidad celula de las células Caco-2 an e la p esencia de dis in as
concen aciones de GOQDs a 3 y 5 días ..................................................................................... 25
Figu a 15: Es udio de la iabilidad celula de las células SH- SY5Y an e la exposición de dis in as
concen aciones de GOQDs a 3 y 5 días ..................................................................................... 26
Figu a 16: Compa ación de la iabilidad celula de las células SH-SY5Y con las células neu onales
an e la p esencia de dis in as concen aciones de GOQDs a 5 días. .......................................... 27
Figu a 17:Análisis de la p esencia de endo oxinas en la mues a de GOQDs. ............................ 28
Figu a 18: Es udio de la iabilidad celula de los mac ó agos an e la p esencia de dis in as
concen aciones de GOQDs a 5 días ........................................................................................... 29
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Núme o de células empleadas en los expe imen os de oxicidad in i o dependiendo
de la línea celula y del iempo del expe imen o ........................................................................ 15
Tabla 2: Pa áme os es uc u ales de e minados po XRD del pico (002) en las CNF y GOQDs. 18
Tabla 3: Componen es del análisis supe icial XPS de las acciones basadas en GOQDs. ......... 20
LISTADO DE ABREVIATURAS
Ab e ia u a
Signi icado
GQD
Pun os cuán icos de g a eno
GOQD
Pun os cuán icos de óxido de g a eno
CNT
Nano ubos de ca bono
BLG
Bicapa de g a eno
FLG
G a eno de pocas capas
MLG
G a eno mul icapa
CNF
Nano ib as de Ca bono
GO
Óxido de g a eno
FLGO
Óxido de g a eno de pocas capas
GONF
Nano ubos de ca bono oxidado
GNR
Nanocin as de g a eno
hNSC
Células mad e neu onales humanas
XRD
Di acción de ayos X
XPS
Espec oscopia de o oelec ones emi idos po
ayos X
TEM
Mic oscopía elec ónica de ansmisión
C.elegans
Caeno habdi is elegans
NGM
Aga nema ode g ow h media
DMEM
Medio de Dulbecco's eagle modi icado
SFB
Sue o e al bo ino
ROS
Especies eac i as de oxígeno
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In oducción y obje i os
1.1
In oducción a los ma e iales g a énicos
El ca bono es uno de los elemen os más abundan es de la na u aleza y cons i uye un
pila básico pa a la química o gánica y la exis encia de la ida. Su descub imien o se emon a a
la an igüedad, siendo uno de los p ime os elemen os conocidos. Se a a de un no me al
e a alen e, po lo que p esen a cua o elec ones capaces de o ma enlaces químicos
co alen es. La ele ancia de es e elemen o eside en la capacidad que iene de o ma dis in as
es uc u as molecula es, conocidas como aló opos de ca bono, median e la combinación en e
los á omos de ca bono y el ipo de hib idación que p esen an sus o bi ales (sp1, sp2 y sp3). Cada
aló opo de ca bono iene una es uc u a molecula di e en e al es o, la cual les con ie e
p opiedades ísicas, mo ológicas y químicas signi ica i amen e di e en es, siendo muy
in e esan es pa a di e sos campos de in es igación como la bio ecnología o la ene gía [1].
En la na u aleza, el ca bono elemen al se puede encon a como dos aló opos, el
diaman e y el g a i o, que consis en en ala gadas edes o madas po la combinación de los
á omos de ca bono con los o bi ales sp3 y sp2, espec i amen e. Ambos aló opos mues an
p opiedades ísicas únicas como du eza, ele ada conduc i idad é mica y eléc ica. Debido a
dichas p opiedades, es os ma e iales han sido ampliamen e es udiados, siendo los únicos
aló opos de ca bono conocidos du an e mucho iempo. Es a si uación cambió con el
descub imien o de los ule enos en 1985 [2] y años más a de del g a eno en 2004 [3].
Respec o al aló opo de g a eno, se o ma po la combinación de los á omos de ca bono
median e hib idación sp2 y cons i uye un componen e básico es uc u al pa a el es o de
es uc u as g a énicas (Figu a 1). Dichas es uc u as se denominan ma e iales g a énicos, los
cuales incluyen o mas 2D, que se conocen como ma e iales de g a eno, así como o mas 0, 1 y
3D cuyas es uc u as se o man a pa i de las “capas de g a eno”. Así, en el ule eno (0D), la
capa de g a eno se en uel e o mando una es e a, en los nano ubos de ca bono (CNT, po sus
siglas en inglés) (1D) se en olla o mando cilind os y en el g a i o (3D) se apila una capa sob e
o a de o ma pa alela.
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examina sus e ec os sob e la p oli e ación y la ac i idad me abólica de las hNSC, sin encon a
cambios sus anciales en la iabilidad celula , la p oli e ación, la ac i idad me abólica y el
po encial de las células mad e. Respec o a la oxicidad biológica, oda ía no exis en es udios que
hayan p o undizado ace ca de la oxicidad ambien al de los GQDs.
Todos los es udios mencionados an e io men e han se ido pa a es ablece las bases
ace ca de la oxicidad de los nanoma e iales GQDs. Sin emba go, es os es udios esul an escasos
si se iene en cuan a la can idad de ac o es que pueden in lui an o en la biocompa ibilidad
como en la oxicidad de los nanoma e iales. En e odos es os ac o es des acan el ipo de
sín esis, los g upos uncionales, el amaño, la conduc i idad, la na u aleza de las modi icaciones
químicas y ambién la línea celula y las moléculas del á maco. Es po ello que el p esen e
abajo se cen ó en el es udio de la oxicidad in i o e in i o p oducida po los GQDs, y más
conc e amen e, po los GOQDs. Es e nanoma e ial es muy simila a los GQDs pe o p esen a una
mejo o oluminiscencia ob enida g acias a la implemen ación de g upos oxigenados en su
supe icie, haciéndolos idóneos pa a aplicaciones biomédicas. A pesa de es a mejo ía, apenas
exis en in es igado es que hayan analizado la oxicidad in i o e in i o de es e ipo de
nanoma e ial. Po lo que son necesa ios es e ipo de es udios pa a pode iden i ica de mane a
cla a el mecanismo de oxicidad que lle an a cabo.
1.4
Obje i o
El obje i o p incipal de es e abajo es analiza la oxicidad in i o e in i o de los
ma e iales g a énicos GOQDs, pa a e alua su iabilidad en aplicaciones biomédicas.
Pa a es e obje i o gene al se han p opues o los siguien es obje i os in e medios:
1) Sín esis de los GOQDs pa iendo de nano ib as de ca bono (CNF, po sus siglas en
inglés) median e el p oceso de oxidación/ex oliación ( es a egia op-down).
2) Ca ac e ización del nanoma e ial sin e izado median e di e en es écnicas
analí icas: XRD, Análisis elemen al, XPS y TEM.
3) Es udio de la oxicidad ambien al in i o median e el empleo de Caeno habdi is
elegans (C.elegans).
4) Es udio de la oxicidad in i o en dis in as líneas celula es de ó ganos del sis ema
diges i o (hepá icas e in es inales) y neu onal (neu oblas oma y neu onales).
5) Es udio de la oxicidad inmunológica empleando mac ó agos.

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Pa e Expe imen al
Todos los eac i os u ilizados pa a el p oceso de sín esis apa ecen desc i os en el ANEXO I.
2.1
Sín esis de los GOQDs
Los GOQDs se sin e iza on a pa i de nano ib as de ca bono (CNF, po sus siglas en
inglés) de ipo ishbone median e oxidación química po el mé odo de Humme ´s modi icado
[27] y pos e io se les ealizó una ex olia on ul asónica. Es e p o ocolo de sín esis ue
p e iamen e desa ollado en el G upo de Con e sión de Combus ibles (ICB-CSIC) [28]. En la
sín esis, se pa ió de 3 g de CNF que se mezcla on con 3 g de NaNO3 (99.0%) y 138 ml de H2SO4
(96%) bajo agi ación y en baño de hielo. Después se añadió 26 g de KMnO4 poco a poco y bajo
agi ación igo osa. Du an e es a e apa la empe a u a se man u o po debajo de los 20 °C. T as
añadi odo el pe mangana o, se man u o la disolución en eposo du an e 30 min. Una ez
anscu ido ese iempo, la solución esul an e se dejó bajo agi ación a 30±5 °C du an e 2h y a
empe a u a ambien e du an e oda la noche. Finalizada la oxidación, se ob u o una mezcla
pas osa de colo ma ón. Después se añadie on muy len amen e 240 ml de agua desionizada
(mili-Q) e i ando supe a los 70 °C en la solución, debido a que la eacción con el ácido sul ú ico
es exo é mica. T anscu ida 1h de agi ación, se adiciona on o os 600 ml de agua desionizada
(mili-Q). T as la dilución, el exceso de iones pe mangana o se consumió añadiendo go a a go a
26 ml de H2O2 (33%), uno po cada g amo de KMnO4 añadido en la oxidación. El ma e ial
esul an e de la oxidación, de colo neg o, se ex olió median e sonicación du an e 4h y se
cen i ugó (Beckman Coul e , Alleg a X-22R) a 9500 pm y 4°C du an e 40 min. T as es e p oceso
se ob u o una suspensión de ma e iales de óxido de g a eno o mada po CNF oxidadas (GONF,
po sus siglas en inglés), óxidos de g a eno de pocas capas (FLGO, po sus siglas en inglés) y
GOQDs, cuya dis ibución depende del endimien o del p oceso de oxidación/ex oliación. El
p ecipi ado se la ó a ias eces con una disolución diluída de HCl (10%). Las di e en es
acciones se sepa a on median e una secuencia de cen i ugaciones di e enciales deg esi as.
Pa a ello el p ecipi ado se edispe só en agua desionizada (mili-Q) y se some ió a a ios ciclos
de cen i ugación de 60 min en e apas de elocidades descenden es (14800, 9500, 7000 y 4500
pm) usando en cada una el p ecipi ado edispe sado en agua de la e apa an e io y sepa ando
el sob enadan e ob enido en cada una de ellas en o den de amaños de pa ícula dec ecien e
(Figu a 4). T as la cen i ugación, la acción de GOQD ob enida p esen ó una concen ación en
o no a 0,1-0,6 mg ml-1.
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2.2
Técnicas de ca ac e ización.
El undamen o eó ico de las écnicas de ca ac e ización empleadas se encuen a desc i o en el
Anexo II.
2.2.1
Mic oscopía elec ónica de ansmisión
Median e mic oscopía elec ónica de ansmisión (TEM) se puede conoce la mo ología
y el amaño p omedio de los GOQDs sin e izados. Pa a la ealización del análisis ue necesa io
p epa a p e iamen e la mues a po dispe sión en agua median e ul asonidos. Las imágenes
de TEM se ob u ie on en el mic oscopio Tecnai F30 (FEI company) ope ado en modos TEM y
STEM, con una acele ación del ol aje de 300 kV. El ins umen o es aba equipado con un emiso
de campo y len es Supe Twin® que pe mi e una esolución máxima de 1.5 Å.
2.2.2
Di acción de ayos X
La di acción de ayos X (XRD) pe mi e conoce la es uc u a c is alina p esen e en los
GODQs. El pa ón de di acción se adquie e con un di ac ome o B uke (Modelo D8 Ad ance,
Se ies 2) con un modo de escaneo po e apas ( ango de ángulo 2Ɵ=5o-80o, amaño de paso
=0,05o, iempo de con eo=4s/paso), usando como uen e de ayos X un ánodo de cob e (λ=1,54
Å) y un monoc omado secunda io de g a i o, ope ado a 40,0 kV y 30,0 mA.
La ado
4500 pm
FLGO
Oxidación
Ex oliación
CNF
Suspensión
de GO
9500 pm
GOQD
14800 pm
7000 pm
GONF
Residuo
Figu a 4: Esquema del p oceso de sín esis lle ado a cabo pa a la ob ención de los GOQDs
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2.2.3
Espec oscopia de o oelec ones emi idos po ayos X
La espec oscopia de o oelec ones emi idos po ayos X (XPS) pe mi e de e mina con
p ecisión la composición a ómica más supe icial de los GODQs. El análisis se ealizó median e
un sis ema Omic on ESCAPlus, equipado con un analizado de ene gía de elec ones
hemis é ico, con un ánodo no monoc oma izado de Mg (λ=1253,6 eV) como uen e de adiación,
ope ado a 15 mA y 15 kV, a acío (˂5x10-9 o ).
2.2.4
Análisis Elemen al.
El análisis elemen al es una écnica de ca ac e ización que pe mi e de e mina de
mane a cuan i a i a y cuali a i a el con enido o al de ca bono, hid ógeno, ni ógeno y azu e
p esen e en los GODQs. Es a écnica analí ica se u ilizó pa a con i ma la composición de los
ma e iales analizados. Se empleó un analizado The mo Flash 1112 pa a la de e minación de
dichos elemen os en un ango en e el 0,05% y 99,95%, que cumple las no mas EN es ablecidas.
2.3
Ma e iales y mé odos.
2.3.1
Caeno habdi is elegans
Caeno habdi is elegans (C. elegans) son unos nema odos que habi an en el suelo y que se
alimen an de poblaciones úngicas y bac e ianas (Figu a 5). La capacidad de c ia cien os de
gusanos en una sola placa de Pe i, su anspa encia, su ciclo de ida ápido (3 días), su ida ú il
co a (3 semanas) y, su c ecimien o ácil y económico han hecho de es e gusano un modelo ideal
pa a abaja en el labo a o io. Además, los a ances en gené ica y biología molecula han
pe mi ido la iden i icación de odas las células de C.elegans y su genoma comple o, lo que ha
demos ado una al a conse ación de los mecanismos biológicos en e el gusano y los
e eb ados, siendo idóneos como modelos in i o.
Figu a 5: Caeno habdi is elegans (C. elegans)
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La cepa de C.elegans que se u ilizó du an e los expe imen os de oxicidad ambien al
p esen aba la mu ación glp-4. Es a mu ación p oduce que los gusanos sean incapaces de gene a
p ogenie cuando son cul i ados a 25 0C. Es e hecho pe mi ió ealiza los expe imen os de
supe i encia sin que apa ecie an anomalías en el ecuen o de los gusanos. Todas la cepas de
C.elegans p o inie on del Cen o de Gené ica Caeno gabdi is (Uni e sidad de Minneso a).
La p esencia de gusanos en di e en es e apas de desa ollo den o de los cul i os impide la
ob ención de esul ados e aces de los es udios de oxicidad. Po ello, ue necesa io some e los
a un p oceso de sinc onización con el obje i o de ob ene una población de gusanos que se
encon a á en la misma ase o e apa i al. El p oceso de sinc onización consis ió en ma a la as
y gusanos adul os, debili ando la cu ícula de los C. elegans a a és de una solución de lejía y
sosa caus ica, lo que pe mi ió libe a los hue os del in e io de los gusanos que se encon aban
en pe iodo de ges ación. Es os hue os esis ían condiciones más du as que los gusanos, po lo
que se ob u ie on hue os iables a a és del uso de una solución de lejía y sosa a una
concen ación adecuada. Un ac o impo an e ue e i ica en un es e eomic oscopio la
p esencia en los cul i os de gusanos en ges ación pa a pode selecciona el mejo día pa a
ealiza la sinc onización, y pa a así ob ene el máximo núme o de hue os. O os pa áme os,
como la elación en e la can idad o al de gusanos y la can idad de hid óxido de sodio p esen e
en la solución, el iempo de con ac o en e los gusanos, y la solución de lejía y sosa, la
empe a u a y la ai eación de los hue os ambién a ec a on al endimien o de ob ención de los
hue os.
El cul i o de C.elegans y el p oceso de sinc onización apa ece desc i o de mane a de allada
en el Anexo III (Apa ado 3.1).
2.3.2
Cul i os celula es
Pa a el análisis de la oxicidad in i o se u iliza on las siguien es líneas celula es umo ales:
1. SH-SY5Y: Línea celula de neu oblas oma
2. Hep G2: Línea celula de ca cinoma hepa ocelula .
3. Caco-2: Línea celula de adenoca cinoma colo ec al.
Las líneas celula es que se u iliza on en los expe imen os ue on adhe en es y su
manipulación se ealizó en condiciones de es e ilidad en campana de lujo lamina (Tels a ). La
línea celula SH-SY5Y se eligió debido a la escasos es udios exis en es sob e como a ec a la
p esencia de nanopa ículas de g a eno en el ejido neu onal. También se u iliza on células
neu onales, ob enidas median e la di e enciación de las SH-SY5Y u ilizando ácido e inoico. Po
o o lado, las líneas Hep G2 y Caco-2 se selecciona on debido a que ambas o man pa e del
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ejido de ó ganos del sis ema diges i o, po lo que pe mi i ían analiza la a ección que p oducen
las nanopa iculas cuando son in oducidas po ía gas oin es inal.
El man enimien o de es os cul i os, el p oceso de congelación y descongelación de los
mismos, y la de e minación de la densidad celula apa ecen explicados en p o undidad en el
Anexo III (Apa ado 3.2).
2.3.3
Mac ó agos
Los mac ó agos o man pa e de las células que cons i uyen el sis ema inmune, po lo
que analiza como a ec an los GOQDs a es as células da in o mación de cómo el sis ema inmune
eacciona an e la p esencia en el o ganismo de las nanopa iculas de g a eno. Pa a la ob ención
de los mac ó agos, se pa ió de una capa leucoci a ia o “bu y coa ” p oceden e del Banco de
Sang e y Tejidos de A agón. Es a capa ue some ida a un p oceso de cen i ugación en g adien e
de Ficoll con el obje i o de ex ae las células mononuclea es de sang e pe i é ica (PBMCs). Una
ez ex aídas se di e encia on a mac ó agos median e el p oceso que apa ece desc i o en el
Anexo III (Apa ado 3.3).
2.3.4
Es udio de la oxicidad ambien al in i o
La oxicidad ambien al in i o p oducida po los GOQDs en C.elegans se analizó as una
exposición aguda (5 días) y c ónica (25 días). Los gusanos, ya some idos al p oceso de
sinc onización, se ecogie on de la placa de aga nema ode g ow h media (NGM) de 60 mm,
donde se encon aban cul i ados, median e el la ado con 6 ml de ampón M9 (Na2HOP4, 6g;
NaCl, 5g; KH2PO4, 3g; H2O des ilada, 1l y 1 ml de MgSO4 1M). La suspensión de gusanos se
ans i ió a un Falcon de 15 ml. Pa a inc emen a el núme o de gusanos ob enidos, se ealizó
o o la ado de la placa de aga NGM con 4 ml de ampón M9. Una ez ealizado ese segundo
la ado, la suspensión se cen i ugó a 1200 pm du an e 5 minu os. El sob enadan e esul an e
se desechó educiendo el olumen has a los 2 ml. Los gusanos se esuspendie on median e
o eo manual y a con inuación, se ex ajo una alícuo a de 20 µl pa a cuan i ica el núme o de
gusanos p esen es en la suspensión. El ecuen o de los gusanos se ealizó empleando un
es e eomic oscopio, siendo necesa io in oduci la alícuo a en un pocillo de una placa de 96.
Una ez ealizado, se ex apola on los esul ados con el obje i o de conoce el nume o o al de
gusanos p esen es en los 2 ml.

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Pa a la ealización del es udio, se añadie on 30 gusanos a cada placa de aga NGM de
35mm, necesi ando un o al de 120 gusanos, debido a que en cada expe imen o se analiza on
dos si uaciones (p esencia de GOQDs y con ol) po duplicado. El es o de gusanos se ol ie on
a cul i a en una placa de aga de 60 mm, pa a pode se u ilizados en u u os expe imen os. A
con inuación, se adiciona on a dos de las placas 40 µl de GOQDs a una concen ación de 37
µg/ml, jun o con 200 µl de E. Coli OP50 que se empleó como uen e de alimen o pa a los
gusanos. Las o as dos placas de aga ue on el con ol, po lo que se les añadió solamen e 200
µl de E. Coli OP50. En el caso de los es udios de oxicidad c ónica, la adición a cada placa de E.
Coli y GOQDs se ealizó de o ma pe iódica cada 5 días mien as que en los es udios de oxicidad
aguda, sólo se ealizó el día 1. La e aluación del núme o de gusanos en cada placa se lle ó a
cabo de mane a dia ia, du an e el pe iodo que du ó el es udio, con la ayuda de un
es e eomic oscopio
Los esul ados apa ecen expues os como asa de supe i encia espec o al iempo de
exposición empleado.
2.3.5
Es udio de la oxicidad in i o.
Las líneas celula es, que se encuen an adhe idas a la supe icie de los ascos de cul i o
de 25 cm2 (TPP), se despega on de la supe icie median e la incubación con ipsina a 37 oC
du an e 5 min. Finalizado es e pe iodo, con el in de inac i a la ipsina se añadie on 5 ml de
medio de cul i o Dulbecco's Eagle modi icado DMEM (Gibco) suplemen ado con 10% ( / ) de
sue o e al bo ino (SFB, Sigma), L-glu amina 2mM (Pan Bio ech GmbH) y an ibió ico (penicilina
100 U/ml y es ep omicina 100 µg/ml, Sigma). A con inuación, las células se ans i ie on a un
Falcon de 15 ml y se cen i uga on a 1500 pm. La cen i ugación se ealizó con el obje i o de
elimina la ipsina p esen e. El sob enadan e ob enido se desechó y se ol ie on a añadi o os
5 ml de medio esco. Fue impo an e e i a que las células se encon asen aglome adas unas
con o as, pa a ello, se pipe eó a ias eces la suspensión con enida en el Falcon. Una ez
pipe eada, se omó una alícuo a de 50 µl con el obje i o de calcula la densidad celula de cada
línea empleada.
El es udio de oxicidad in i o se ealizó empleando una placa de 96 pocillos donde se
cul i a on las dis in as líneas celula es (Figu a 6) . En cada caso, se u iliza on un nume o o al de
32 pocillos (4 columnas x 8 ilas). A cada pocillo se añadie on 200 µl de medio que con enía un
núme o de e minado de células. Es e núme o dependía de la línea celula u ilizada y de la
du ación del expe imen o (3 o 5 días), debido a que se p e endía que en el momen o del
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ecuen o exis ie a el mismo núme o de células. An es de adiciona los GOQDs, las células debían
es a comple amen e adhe idas a la supe icie del ondo del pocillo. Pa a ello, se deja on
incubando du an e 2 ho as en un incubado e mos a izado a 37 oC, en ai e sa u ado de
humedad y con un 5% de CO2. Finalizado es e pe iodo, se saca on del incubado y se adiciona on
los GODQs a odas las ilas menos a la p ime a que ue el con ol. En cada ila se enían di e en es
concen aciones de GOQDs, inc emen ándose con o me se descendía, siendo cada columna un
expe imen o independien e. La concen ación de GOQDs en la segunda ila ue de 0,05 µg/ml,
aumen ando (2:1) a medida que se descendía has a los 3,7 µg/ml en la úl ima ila. Pa a
consegui lo, se añadie on a cada ila 20 µl de una suspensión, p e iamen e p epa ada, que
con enía una concen ación de GOQDs diez eces supe io a la necesa ia. Es e alo se debe a
que en los pocillos ya había 200 µl de medio, po lo que al adiciona los GOQDs se diluye on
1:10. Una ez añadidos, se dejó la placa en un incubado e mos a izado a 37 oC. El iempo que
pe maneció allí dependió del expe imen o, pudiendo se de 3 o 5 días. T anscu ido el pe iodo
de incubación, se adiciona on 10 µl de una disolución de B omu o de 3-(4,5-dime il iazol-2-ilo)-
2,5-di enil e azolio (MTT) a una concen ación de 5x103 µg/ml a odos los pocillos menos a los
de la úl ima columna que ac uó como blanco. El ensayo se basó en la educción me abólica del
MTT po la enzima mi ocond ial succina o-deshid ogenasa en o mazan (compues o colo eado
de colo iole a), pe mi iendo de e mina la uncionalidad mi ocond ial de las células a adas.
Po lo an o la can idad de células i as ue p opo cional a la can idad de o mazan p oducido.
T as la adicción, se dejó la placa incubando una ho a y a con inuación, se cen i ugó a 1200 pm
du an e 15 min.
Tabla 1: Núme o de células empleadas en los expe imen os de oxicidad in i o dependiendo de la línea
celula y del iempo del expe imen o
3 días
5 días
SH-SY5Y
10.0000
5.000
Neu onal
-
5.000
Hep G2
7.500
4.500
Caco-2
5.000
2.500
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La cuan i icación celula se ealizó median e espec o o ome ía (Anexo III, Apa ado
3.4) a una longi ud de onda de 570 nm. Pa a la elección de la longi ud de onda ue necesa io
ealiza un es udio p e io con el obje i o de que no in e i ie a con el alo de abso bancia
p oducido po los p opios GOQDs (Anexo III, Apa ado 3.5). La medición de abso bancia se
ealizó median e un espec o o óme o. Es e alo dependió de la can idad de MTT acumulado
en las células i as, de al o ma que, a mayo concen ación celula mayo in ensidad del colo
iole a y, po lo an o, mayo alo de abso bancia (Anexo III, Apa ado 3.6).
Los esul ados ob enidos se exponen como po cen aje de iabilidad celula espec o de
la concen ación de GOQDs empleada.
2.3.6
Es udio de la oxicidad inmunológica
El p o ocolo lle ado a cabo pa a la ealización de los ensayos de oxicidad inmunológica
ue el mismo que el desc i o en el apa ado an e io . En es e caso, an es de comenza , ue
necesa io conoce si había p esencia de endo oxinas en los GOQDs. Es e ipo de componen e
ac úa es imulando el sis ema inmune y gene ando un po en e e ec o óxico, po lo que podía
da luga a esul ados e óneos du an e el análisis de la oxicidad de los GOQDs. La de ección de
la p esencia de endo oxinas se ealizó empleando el ki ToxinSenso Endo oxin De ec ion Sys em
de la casa come cial GenSc ip y el p o ocolo que se lle ó a cabo apa ece desc i o de mane a
de allada en el Anexo III (Apa ado 3.7) . Respec o al ensayo de oxicidad, se analizó únicamen e
la oxicidad de los GOQDs en los mac ó agos du an e un pe iodo de exposición de 5 días,
empleando un núme o o al de 10.000 mac ó agos en cada pocillo.
Figu a 6: Esquema de la placa de 96 pocillos empleada du an e el expe imen o de oxicidad in i o
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3
Resul ados
3.1
Ca ac e ización de los GOQDs
Los di ac og amas del análisis XRD de la es uc u a de las nano ib as CNF de pa ida
jun o con del ma e ial esul an e del p oceso de oxidación/ex oliación apa ecen desc i o en la
Figu a 7. Las nano ib as CNF p esen a on una señal muy p onunciada en o no a 26,4°, jun o
con o as mino i a ias a 42,5°, 44,3°, 53,9° y 78°, odas ellas co espondien es a las es uc u a
del g a i o hexagonal. Es a señal dominan e co esponde al pico del plano de g a i o (002), el
cual endió a desapa ece en los GOQDs como consecuencia de la oxidación casi comple a del
g a i o p esen e en las nano ib as CNF. A pa i de la o ma y la posición de es e pico ue posible
de e mina el amaño del c is al (Lc), la dis ancia en e los planos g a énicos (d) y el núme o de
capas (n), empleando di e en es ecuaciones empí icas (Tabla 2). De es e modo, las nano ib as
CNF p esen a on una es uc u a apilada, con c is ales de g a i o con un núme o medio de capas
en o no a 19 y una dis ancia en e es as capas de 0,33 nm. T as su oxidación se pudo obse a
una expansión en esa dis ancia in e plana (0,362nm), que aumen ó debido a la in e calación
de g upos oxigenados, y es o se e lejó en un desplazamien o hacia la izquie da del pico 002.
Además, el núme o de capas de los GOQDs ue mucho más bajo (3,7), ya que el ma e ial se había
ex oliado. Po úl imo, el amaño de c is al disminuyó po que la ex oliación los ue ompiendo.
Figu a 7: Di ac og ama de ayos X de la mues a de las nano ib as de CNF y GOQDs
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a iación que p oducen en los ligandos de los que dependen los ecep o es a yl hyd oca bon
(AhR) y p egnane X (PXR) [37]. Es a a iación comienza a p oduci se con o me se a
inc emen ando la concen ación de nanoma e ial (< 1 mg/L) y se ha inculado con el
desencadenamien o de mecanismos celula es que conducen a un cie o ni el de au o agia con
la consiguien e disminución de los ni eles de los ecep o es an e io men e nomb ados y su
uncionalidad. La p esencia de ele adas concen aciones de GOQDs no sólo se ha elacionado
con la apa ición de au o agia celula , sino que además es as condiciones se han inculado con
la apa ición de es és mecánico u oxida i o, lo que a ec a ía a la célula gene ando especies
eac i as de oxígeno (ROS, po sus siglas en inglés) y pe dida de luidez celula . Los ROS son un
ipo de especie química, químicamen e eac i a, que se o ma como un subp oduc o na u al del
me abolismo del oxígeno [38]. En condiciones no males, acili an la ac i ación de los ac o es de
ansc ipción y p omue en la di e enciación celula pe o si se encuen en al amen e
concen ados, son capaces de induci apop osis y nec osis [37].
Figu a 13: Es udio de la iabilidad celula de las células Hep G2 an e la p esencia de dis in as concen aciones de
GOQDs a 3 y 5 días
0
0,05
0,10
0,23
0,46
0,90
1,80
3,70
0
25
50
75
100 5 días
3 días
Concen ación (mg/l)
Viabilidad Celula (%)

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En el caso de las células Caco-2, la iabilidad celula apenas se modi icó a medida que
se aumen ó la concen ación de GOQDs, si uándose siemp e en o no al 80% (Figu a 14). Es e
hecho ocu ió an o en los expe imen os ealizados du an e 3 días como en los ealizados
du an e 5 días, e lejando una g an esis encia de es e ipo de células a la p esencia de los
GOQDs. O os au o es analiza on la capacidad que end ían los pun os cuán icos de CdSe/ZnS
de a a esa la memb ana celula de las células Caco-2 [38], obse ando que a bajas
concen aciones (< 5 mg/l), es os nanoma e iales no se de ec an ni en la memb ana celula ni
in acelula men e después de es días de exposición. Sin emba go, con o me se abaja con
concen aciones más ele adas (>5 mg/l), la memb ana celula comienza a deg ada se
pe mi iendo el paso de pequeñas can idades de nanoma e ial al in e io de la célula. Es as
can idades se ían capaces de p oduci dis in as al e aciones en el in e io de la célula como es
la gene ación de ROS, lo que a ec a ía a las unciones celula es e incluso a al e a el ADN,
disminuyendo así la iabilidad celula . Es e enómeno obse ado usando pun os cuán icos de
CdSe/ZnS pod ía ocu i ambién en es e es udio, explicando así los esul ados ob enidos.
Figu a 14: Es udio de la iabilidad celula de las células Caco-2 an e la p esencia de dis in as concen aciones de
GOQDs a 3 y 5 días
0
0,05
0,10
0,23
0,46
0,90
1,80
3,70
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100
3 días
5 días
Concen ación (mg/l)
Viabilidad Celula (%)
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En la Figu a 15, se mues a el es udio de la oxicidad in i o debida a la p esencia de
dis in as concen aciones de GOQDs en las células de neu oblas oma (SH-SY5Y), ealizado
du an e 3 y 5 días. En él, se obse ó que la iabilidad celula disminuyó con o me se ue
inc emen ando la concen ación de GOQDs. También se ap ecia on di e encias en e los
expe imen os ealizados du an e 3 y 5 días, ob eniendo una meno iabilidad celula en los
ealizados du an e 5 días. Es os esul ados e lejan la in luencia de la concen ación de los
GOQDs y del pe iodo de exposición en la iabilidad de las células SH-SY5Y. La pe dida de la
iabilidad celula de las células neu onales (SH-SY5Y) en p esencia de los GOQDs se ha a ibuido
al aumen o de la asa de apop osis, del Ca+2 in acelula y a la libe ación de ROS [39]. Respec o
al al o ni el de Ca+2 in acelula , es e se enca ga ía de es imula la libe ación de
neu o ansmiso es como el ácido glu ámico, po enciando así la exci abilidad de la espues a
ne iosa y pos sináp ica. Los neu o ansmiso es supe luos gene ados se ían capaces de
acumula se poco a poco en la hendidu a sináp ica, in luyendo nega i amen e en el c ecimien o
y desa ollo neu onal. También hay que des aca que se ha comp obado que el empleo de
GOQDs ecubie os de un ma e ial an ioxidan e (NAC) log a educi de mane a d ás ica es as
al e aciones [40], e lejando así la impo ancia del es és oxida i o en la neu o oxicidad de es os
nanoma e iales.
Figu a 15: Es udio de la iabilidad celula de las células SH- SY5Y an e la exposición de dis in as concen aciones de
GOQDs a 3 y 5 días
0
0,05
0,10
0,23
0,46
0,90
1,80
3,70
0
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3 días
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Concen ación (mg/l)
Viabilidad Celula (%)
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A con inuación, se mues an los esul ados de oxicidad ob enidos en las células de
neu oblas oma (SH-SY5Y) jun o con los ob enidos en las células neu onales a los 5 días de
exposición con GOQDs (Figu a 16). A pa i del análisis de los esul ados, se ap eció una meno
iabilidad celula en las células neu onales, e lejando una mayo sensibilidad a la oxicidad de
los GOQDs po pa e de las células di e enciadas (neu onales) espec o a las no di e enciadas
(SH-SY5Y). Es e hecho ocu ió en odas las concen aciones de GOQDs excep o a 3,7 mg/l. La
anomalía en es e esul ado pudo es a elacionada con un e o en la medición, ya que, al
abaja a al concen ación, el medio se encon aba bas an e sa u ado de GOQDs, lo que pudo
da luga a alo es e óneos de abso bancia. Pa a pode comp ende es a di e encia, o os
au o es analiza on la ac i idad celula de ambas células en p esencia de es e ipo de
nanoma e ial du an e 48 ho as [41], obse ando que la ac i idad celula de las células
di e enciadas se educe has a el 60% debida a la exposición, mien as que la de las células no
di e enciadas se man iene en un 90%.
Figu a 16: Compa ación de la iabilidad celula de las células SH-SY5Y con las células neu onales an e la p esencia de
dis in as concen aciones de GOQDs a 5 días.
0
0,05
0,10
0,23
0,46
0,90
1,80
3,70
0
25
50
75
100 Neu o
SH-SY5Y
Concen ación (mg/l)
Viabilidad Celula (%)
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3.4
Es udio de la oxicidad inmunológica
En p ime luga , se mues an los esul ados ob enidos del análisis de la p esencia de
endo oxinas en las nanoma e iales GOQDs (Figu a 17). Jun o con el alo ob enido de los
GOQDs, apa ece la ec a de calib ado, elabo ada de al o ma que se cub e odo el ango de
concen aciones de endo oxinas. In e polando el esul ado ob enido en la ec a de calib ado, se
pudo conoce si la mues a p esen a una baja o al a concen ación de endo oxinas. En es e caso,
la concen ación de endo oxinas de ec ada en los GOQDs se encon ó muy p óxima al meno
alo de la ec a de calib ado, po lo que se concluyó que la p esencia de endo oxinas en la
mues a de GOQDs e a mínima.
Figu a 17:Análisis de la p esencia de endo oxinas en la mues a de GOQDs.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10 Rec a de Calib ado
GOQDs
Abso bancia
Concen ación endo oxinas
(EU/ml)
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Una ez que se conoció que no había p esencia de endo oxinas en el nanoma e ial, se
analizó la oxicidad p oducida en los mac ó agos debida a la exposición con GOQDs du an e 5
días (Figu a 18). En dicho análisis, se obse ó que la iabilidad celula disminuyó con o me se
inc emen ó la concen ación de GOQDs, has a alcanza un alo mínimo de 25% a la
concen ación más al a de GOQDs (3,7 mg/l). Es os esul ados si ie on pa a e leja que los
GOQDs gene an inmuno oxicidad y que es á inmuno oxicidad depende de la concen ación de
GOQDs. Desde el pun o de is a del sis ema inmune, di e sas in es igaciones comp oba on que
la capacidad de ensi a de los mac ó agos se e educida después de su exposición con GQDs, ya
que se de ec o que su p esencia daba luga a una disminución signi ica i a en la can idad de
ci ocinas in lama o ias, po lo que el a amien o con es e ipo de nanoma e iales inc emen a ía
la suscep ibilidad de los mac ó agos an e es ímulos pos e io es [42]. De mane a más especi ica,
se elacionó su p esencia con la ac i ación del ecep o del sis ema inmuni a io inna o TLR y la
pos e io es imulación de la u a MAPK o NF-kB, inculadas a la modulación de la exp esión de
dis in os genes, lo que gene a ía genes p oin lama o ios y simul áneamen e, desencadenando
una espues a inmune [43].
Figu a 18: Es udio de la iabilidad celula de los mac ó agos an e la p esencia de dis in as concen aciones de
GOQDs a 5 días
0
0,05
0,10
0,23
0,46
0,90
1,80
3,70
0
20
40
60
80
100
Concen ación (mg/l)
Viabilidad Celula (%)

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4
Conclusiones
El abajo de in es igación desa ollado a lo la go del p esen e T abajo de Fin de Mas e
se cen ó en el es udio de la oxicidad ambien al in i o e in i o p oducida po los ma e iales
g a énicos, GOQDs. Los es udios de oxicidad ealizados pe mi ie on e alua la iabilidad de
es os nanoma e iales g a énicos en aplicaciones biomédicas. Todos los GOQDs empleados
ue on p e iamen e sin e izados y ca ac e izados en el labo a o io. Las p incipales conclusiones
de es e abajo se des acan a con inuación:
o Los GOQDs ob enidos a pa i de CNF median e el p oceso de oxidación/ex oliación
esul a on es a co ec amen e sin e izados. La es a egia op-down seguida consigue un
endimien o en peso de GOQDs (20-25%) supe io al del es o de es a egias op-down
desc i as (10%).
o A ni el de oxicidad ambien al in i o, la exposición aguda (5 días) a una concen ación
de GOQDs de 37 mg/l en C.elegans no in luye ni en la le alidad ni en el desa ollo de los
gusanos. Sin emba go, la exposición c ónica (25 días) a al concen ación de GOQDs si
que ocasiona impo an es daños, llegando a ob ene una asa de supe i encia del 25%
al cabo de los 25 días.
o La oxicidad p oducida po los GOQDs en las dis in as líneas celula es (Hep G2, Caco-2,
SH-SY5Y) depende an o del pe iodo de exposición como de la concen ación de los
GOQDs, ob eniendo una mayo oxicidad a medida que se aumen an dichos pa áme os.
o La línea celula Caco-2 p esen a una mayo esis encia a la oxicidad p oducida po los
GOQDs, en compa ación con el es o de líneas celula es. Es a mayo esis encia se
elaciona con la meno capacidad que end ían los GOQDs de a a esa la memb ana
celula de las células Caco-2.
o La compa ación de los esul ados de oxicidad ob enidos en e las líneas di e enciadas
(neu onales) y no di e enciadas (SH-SY5Y) e idencia una mayo sensibilidad a la oxicidad
p oducida po los GOQDs po pa e de las células di e enciadas.
o El análisis de la oxicidad inmunológica e ela que la p esencia de los GOQDs en
mac ó agos p oduce inmuno oxicidad y que es a inmuno oxicidad depende de la
concen ación de GOQDs empleada.
Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020
Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza)
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5
Bibliog a ía
[1] And eas Hi sch “The e a o ca bon allo opes”, Na u e Ma e ials, 9 (2010).
[2] H. W. K o o, J. R. Hea h, S. C. O’B ien, R. F. Cu l, “C60: Buckmins e ulle ene”, Na u e 318,
162-163 (1985).
[3] No oselo , K.S., Geim, A.K., Mo ozo , S.V., e al. “Elec ic Field E ec in A omically Thin
Ca bon Films” Science 306, 666 (2004).
[4] J. Slonczewski, P. Weiss, “Band s uc u e o g aphi e”, Phys. Re . 109 (2), 272 (1958) .
[5] L. Landau, “Theo ie de phasenumwandlungen II”, Phys. Z. Sowje union 11 26–35 (1937).
[6] L.D. Landau, E. Li shi z, “S a is ical physics, pa I”, Cou se Theo . Phys. 5 468 (1980).
[7] K. No oselo , A.K. Geim, S. Mo ozo , D. Jiang, M. Ka snelson, I. G igo ie a, S. Dubonos,
A. Fi so , “Two-dimensional gas o massless Di ac e mions in g aphene”, Na u e 438,
197–200 (2005).
[8] Kim, K., Zhao, Y., Jang, H. e al. “La ge-scale pa e n g ow h o g aphene ilms o
s e chable anspa en elec odes”. Na u e 457, 706–710 (2009).
[9] Balandin, A.A., Ghosh, S., Bao, W., Calizo, I., Teweldeb han, D., Miao, F. and Lau, C.N.
“Supe io The mal Conduc i i y o Single-Laye G aphene”. Nano Le e s 8, 902-907
(2008).
[10] Lee C, Wei X, Kysa JW, Hone J. “Measu emen o he elas ic p ope ies and in insic
s eng h o monolaye g aphene”, Science 321, 385-388 (2008).
[11] Ja iwala, D., Sangwan, V. K., Lauhon, L. J., Ma ks, T. J., & He sam, M. C. “Ca bon
nanoma e ials o elec onics, op oelec onics, pho o ol aics, and sensing”. Chemical
Socie y Re iews 42, 2824-2860 (2013).
[12] E e aghi, E., Ghobadian, B., Rashidi, A., Naja i, G., Khosh aghaza, M.H., Pou hashem, S.,
2017. “P epa a ion and in es iga ion o he hea ans e p ope ies o a no el nano-
luid based on g aphene quan um do s”. Ene gy Con e s. Manag. 153, 215–223 (2017).
[13] Lee, J.S., Youn, Y.H., Kwon, I.K., Ko, N.R., 2018. “Recen ad ances in quan um do s o
biomedical applica ions”. J. Pha m. In es ig., 1–6 (2018).
[14] L. A. Ponoma enko, F. Schedin, M. I. Ka snelson, R. Yang, E. W. Hill, K. S. No oselo and
A. K. Geim, “Chao ic Di ac Billia d in G aphene Quan um Do s,” Science 320, 356-358
(2008).
[15] Li X, Rui M, Song J, Shen Z, Zeng H. “Unde s anding and manipula ing luminescence in
ca bon nanodo s” Ad Func Ma e . 25, 4929-47 (2015).
Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020
Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza)
Página 32
[16] Jang M-H, Ha HD, Lee E-S, Liu F, Kim Y-H, Seo TS, e al. “Unique p ope ies o g aphene
quan um do s and hei applica ions in pho onic/elec onic de ices” Small. 11, 3773-81
(2015).
[17] S. Bení ez-Ma ínez, M. Valcá cel/T ends “G aphene quan um do s in analy ical science”
Analy ical Chemis y 72, 93–113 (2015).
[18] T.K. Henna and K. P amod “G aphene quan um do s ede ine nanobiomedicine”
Ma e ials Science & Enginee ing 110, 110651 (2020).
[19] F. Chen e al. “G aphene quan um do s in biomedical applica ions: Recen ad ances and
u u e challenges” F on ie s in Labo a o y Medicine 1, 192–199 (2017).
[20] Lalwani G, D'Aga i M, Khan AM, Si ha aman B. “Toxicology o g aphene-based
nanoma e ials”. Ad D ug Deli Re .105(P B), 109-144 (2016).
[21] Jing, Y., Zhu, Y., Yang, X., Shen, J., Li, C., “Ul asound- igge ed sma d ug elease om
mul i unc ional co e- shell capsules one-s ep ab ica ed by coaxial elec osp ay me hod”.
Langmui 27 (3), 1175–1180 (2010).
[22] Chen, M.L., He, Y.J., Chen, X.W., Wang, J.H., 2013. “Quan um-do -conjuga ed g aphene
as a p obe o simul aneous cance - a ge ed luo escen imaging, acking, and
moni o ing d ug deli e y”. Bioconjuga e Chemis y 24 (3), 387–397 (2013).
[23] Qiu, J., Li, D., Mou, X., Li, J., Guo, W., e al. “E ec s o g aphene quan um do s on he
sel - enewal and di e en ia ion o mesenchymal s em cells”. Ad . Heal hc. Ma e 5 (6),
702–710 (2016).
[24] Chong, Y., Ma, Y., Shen, H., e al., “The in i o and in i o oxici y o g aphene quan um
do s. Bioma e ials” 35 (19), 5041–5048 (2014).
[25] Wang, T., Zhu, S., Jiang, X., 2015. “Toxici y mechanism o g aphene oxide and ni ogen-
doped g aphene quan um do s in RBCs e ealed by su ace-enhanced in a ed
abso p ion spec oscopy”. Toxicology Resea ch 2015 (4), 885–894 (2015).
[26] Shang, W., Zhang, X., Zhang, M., e al. “The up ake mechanism and biocompa ibili y o
g aphene quan um do s wi h human neu al s em cells”. Nanoscale 6 (11), 5799–5806
(2014).
[27] William S., Humme s J ., Richa d E., “P epa a ion o G aphi ic Oxide”, Jou nal o he
Ame ican Chemical Socie y 80 (6), 1339 (1958).
[28] To es, D., Pinilla, J.L., Gál ez, E.M., Suel es, I. “G aphene quan um do s om ishbone
ca bon nano ibe s”. RSC Ad ances. 2016. 6 (54), 48504-48514 (2016).
Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020
Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza)
Página 33
[29] Juan Peng, Wei Gao, Bipin Kuma Gup a, Zheng Liu, Rebeca Rome o-Abu o, Liehui Ge,
Li Song, “G aphene Quan um Do s De i ed om Ca bon Fibe s” Nano Le e s 12 (2), 844-
849 (2012).
[30] Yang, P., Zhou, L., Zhang, S., Wan, N., “Facile syn hesis and pho oluminescence
mechanism o g aphene quan um do s”. J. Appl. Phys. 116, 244306 (2014).
[31] B. Ka imi, B. Ramezanzadeh “A compa a i e s udy on he e ec s o ul a hin luminescen
g aphene oxide quan um do (GOQD) and g aphene oxide (GO) nanoshee s on he
in e acial in e ac ions and mechanical p ope ies o an epoxy composi e” Jou nal o
Colloid and In e ace Science 493 62–76 (2017).
[32] Chun ang Zhang, Kai ang Wei, Wenhai Zhang, Yunxiang Bai, Yuping Sun, and Jin Gu
“G aphene Oxide Quan um Do s Inco po a ed in o a Thin Film Nanocomposi e
Memb ane wi h High Flux and An i ouling P ope ies o Low-P essu e Nano il a ion”
ACS Applied Ma e ials & In e aces 9 (12), 11082-11094 (2017).
[33] Chong, Yu Ma, Yu ei Shen, He Tu, Xiaolong Zhou, Xuan Xu, Jiaying Dai, Jianwu Fan,
Saijun Zhang, Zhijun “The in i o and in i o oxici y o g aphene quan um do s”.
Bioma e ials. 35 (2014).
[34] Liu P, Shao H, Kong Y, Wang D. “E ec o g aphene oxide exposu e on in es inal Wn
signaling in nema ode Caeno habdi is elegans”. J En i on Sci (China). 2020;88:200-208.
(2019).
[35] So i ios I. Sinisa, Kons an inos I. Gou goulianisb, Ch issi Ha zoglou “Mechanisms o
enginee ed nanopa icle induced neu o oxici y in T Caeno habdi is elegans”
En i onmen al Toxicology and Pha macology 67 29–34 (2019).
[36] Kim M, Eom HJ, Choi I, Hong J, Choi J. “G aphene oxide-induced neu o oxici y on
neu o ansmi e s, AFD neu ons and locomo i e beha io in Caeno habdi is elegans”
Neu o oxicology.77:30-39 (2020).
[37] Zena a, Ond ej V zalo a, Ane a Bachleda, Pe Janecko a, Jana Panacek, Ales K i ek,
Libo V zal, Radim. “The e ec o g aphene oxide on signalling o xenobio ic ecep o s
in ol ed in bio ans o ma ion”. Chemosphe e 253. 126753 (2020).
[38] Peuschel, H., Ruckelshausen, T., Kie e , S. e al. “Pene a ion o CdSe/ZnS quan um do s
in o di e en ia ed s undi e en ia ed Caco-2 cells”. J Nanobio echnol 14, 70 (2016).
[39] Ren, Chaoxiu Zhou, Qixing. “G aphene Oxide Quan um Do s Reduce Oxida i e S ess and
Inhibi Neu o oxici y In Vi o and In Vi o h ough Ca alase-Like Ac i i y and Me abolic
Regula ion”. Ad anced Science. 5. 1700595 (2018).
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2.2
Di acción de ayos X
La écnica de la di acción de ayos X (XRD) consis e en hace incidi un haz de ayos X
sob e el sólido suje o a es udio. La in e acción en e el ec o eléc ico de la adiación X y los
elec ones de la ma e ia que a a iesa dan luga a una dispe sión (Figu a A2). Al p oduci se la
dispe sión ienen luga in e e encias ( an o cons uc i as como des uc i as) en e los ayos
dispe sados, ya que las dis ancias en e los cen os de dispe sión son del mismo o den de
magni ud que la longi ud de onda de la adiación [2]. El esul ado de odo es o es la di acción,
que da luga a un pa ón de in ensidades que puede in e p e a se según la ubicación de los
á omos en el c is al, po medio de la ley de B agg:
n*λ = 2 d sen θ [Ec. A1]
Dónde:
λ: longi ud de onda de los ayos X.
n: o den de la di acción
θ: ángulo en e los ayos inciden es y los planos de dispe sión
d: dis ancia in e plana del c is al
Figu a A2: P oceso de di acción de ayos X (XRD) [2]

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2.3
Espec oscopia de o oelec ones emi idos po ayos X
La écnica de espec oscopía o oelec ónica de ayos-X (XPS) consis e básicamen e en
la exci ación median e un haz de ayos-X de los ni eles más in e nos de los á omos, p o ocando
la emisión de o oelec ones que nos p opo cionan in o mación sob e la ene gía de cada ni el
y, po an o, sob e la na u aleza de cada á omo emiso (Figu a A3). Pues o que la ene gía del
haz es h , si el o oelec ón sale con una ene gía ciné ica EK, la di e encia en e ambas nos da la
ene gía de ligadu a (EL) del á omo en pa icula , ca ac e ís ica de cada elemen o. Todo se
esume a medi la elocidad de los elec ones emi idos median e el espec óme o. Pa a ello es
necesa io abaja en condiciones de Ul a Al o Vacío UHV (ul a high acuum). Es o se consigue
median e el uso de bombas u bo-molecula es y bombas iónicas apoyadas con acíos p e ios
ob enidos po bombas o a o ias de acei e [3].
Figu a A3:Espec oscopia de o oelec ones emi idos po ayos X [3]
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2.4
Análisis Elemen al.
La écnica del análisis químico elemen al pe mi e de e mina el con enido o al de
ca bono, hid ógeno, ni ógeno y azu e (C, H, N y S) p esen e en mues as o gánicas e
ino gánicas, an o sólidas como líquidas, que no posean calcio ni ós o o. Es os análisis pe mi en
la de e minación del con enido de es os elemen os en las mues as es udiadas, lo que es
esencial pa a la de e minación de la composición química de los ma e iales. El análisis elemen al
de C, H, N y S se basa en la ola ilización de una mues a po combus ión o al en a mós e a de
oxígeno pu o, libe ándose los elemen os a medi en o ma de CO2, H2O, NOx y SOx,
espec i amen e. Un p oceso pos e io de educción ans o ma los NOx y SOx en N2 y SO2,
espec i amen e. Todos los gases así o mados (CO2, H2O, N2 y SO2) son analizados
cuan i a i amen e en un de ec o (Figu a A4). Equipamien o Los análisis se lle an a cabo en un
analizado elemen al. La mues a se oxida po comple o y de mane a ins an ánea
ans o mando odos los compues os p esen es en p oduc os de combus ión. Los gases de
combus ión esul an es son en iados a un ubo de educción median e un caudal de 250
cm3/min de gas po ado (He) y pos e io men e son sepa ados selec i amen e en columnas
especí icas. Finalmen e, los gases son deso bidos é micamen e e in oducidos de o ma
sepa ada a un de ec o de conduc i idad é mica que p opo ciona una señal p opo cional a la
concen ación de cada uno de los componen es indi iduales de la mues a.
Figu a A4: De ec o empleado pa a el análisis elemen al
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3
Anexo III: Ma e iales y mé odos
3.1
Cul i o y sinc onización C.elegans
Los gusanos C. elegans se cul i a on en placas de aga NGM con kanamicina 50 µg/ml y
es ep omicina 100 µg/ml. Se u ilizó E. Coli OP50 como uen e de alimen o y se gua da on en
una es u a a 20 0C . La sinc onización comenzó con el la ado de es placas de aga NGM de
100 mm con 6 ml del ampón M9 (Na2HOP4, 6g; NaCl, 5g; KH2PO4, 3g; H2O des ilada, 1l y 1 ml de
MgSO4 1M), cada una. La suspensión de gusanos en ampón M9 ob enida se ans i ió a ubos
Falcon de 15 ml. Se pueden usa 4 ml más de M9 con el obje i o de despega los hue os de las
placas de aga NGM. La suspensión se cen i ugó a 650 pm du an e 2 minu os y el sob enadan e
se desechó has a que quedan 2 ml en el ubo Falcon de 15 ml. A con inuación, se añadió la
solución de lejía que con iene NaOH y NaClO a los gusanos pa a alcanza un olumen inal de 4
ml y las concen aciones inales de NaOH y NaClO de 0,25% y 1%, espec i amen e. La solución
de NaClO debe p epa a se dia iamen e debido a la pé dida de e ec i idad. Los gusanos con la
disolución de lejía se agi a on en ó ex du an e 10 segundos y se omó una alícuo a pa a
e i ica si se había conseguido elimina los gusanos i os empleando un mic oscopio de
disección. Si se man ienen los gusanos i os o la cu ícula de la mayo ía de los gusanos no se ha
o o se pod ía ol e a u iliza el ó ex, ealizando o eos de 10 segundos has a un iempo
máximo de con ac o de 6 minu os. También es posible que se necesi e una mayo concen ación
de NaOH pa a pode ompe la cu ícula si la suspensión con iene demasiados gusanos. Obse a
los gusanos de mane a egula en un mic oscopio de disección p opo ciona la mejo in o mación
pa a sabe cuándo se debe de ene el p oceso. Una ez ob enidas las condiciones necesa ias,
el ubo Falcon de 15 ml se llenó con ampón M9 y se cen i uga 2 minu os a 650 pm y se epi ió
es e p oceso de la ado dos eces con el obje i o de elimina el máximo con enido de la solución
de lejía. El sob enadan e del la ado con M9 se desechó has a que solo quedan 0,5 ml en el ubo.
El sedimen o de hue os se esuspendió y se colocó en una placa de aga NGM sin E. Coli OP50
pa a pe mi i que los hue os eclosionen y educi así las di e encias de desa ollo en las nue as
la as debido a la di e en e edad de los hue os. T anscu idas 24h se añadió E. Coli OP50 a la
placa de aga NGM y se gua dó en una es u a a 25 0C.
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3.2
Cul i os celula es
3.2.1
Man enimien o de los cul i os celula es
El cul i o u ina io de las dis in as líneas celula es se ealizó u ilizando ascos de cul i o de
25 cm2 (TPP) con apón con il o, en un olumen ap oximado de 5ml, las células se semb a on
con una densidad inicial de 4*104 células/ml. Una ez alcanzadas las densidades de sa u ación a
es as condiciones, se es ablecie on sub-cul i os de i ados de los iniciales. Pa a ello, las células
se despega on median e incubación con ipsina/EDTA a 37 oC du an e 5 minu os. Una ez
anscu ido es e pe iodo, con el in de inac i a la ipsina se añadie on 5 ml de medio esco
con sue o, y las células se ans i ie on a ubos de ondo cónico pa a de e mina así el núme o
de células y su iabilidad. El olumen ob enido se cen i ugó du an e 5 min a 1200 pm en una
cen i uga Beckman and Coul e (Ro o SX4750A), se eliminó el sob enadan e y las células se
esemb a on en medio esco o bien, se u iliza on pa a lle a a cabo los di e en es
expe imen os.
3.2.2
Congelación y descongelación de las líneas celula es
Pa a el p oceso de congelación se oma on 107 células que as se cen i ugadas (1200 pm x 5
min) y elimina el sob enadan e, se esuspendie on en 1 ml de medio DMEM comple o con 10%
de dime ilsul óxido (DMSO) y se ans asa on a un c io ubo de congelación es é il. Es os iales
se congela on a menos 800C has a su u ilización.
Po o o lado, pa a el p oceso de descongelación el c io ubo donde se encuen an las células se
dejó a empe a du an e 1 minu o en la campana de lujo lamina . Una ez anscu ido es e
pe iodo, la suspensión celula se as asa a un ubo alconTM p epa ado p e iamen e con 5 ml
de medio DMEM comple o. La suspensión se cen i ugó a 1200 pm du an e 5 minu os, se
eliminó el sob enadan e y el pelle se esuspendió en 5 ml de medio esco DMEM.
3.2.3
De e minación de la densidad celula
La de e minación de la densidad celula se ealizó median e la inción con Azul de T ipán
(Sigma), colo an e que es capaz de pene a en las células mue as que ienen memb ana
plasmá ica dañada iñéndolas de colo azul. Las células i as, que no pie den la in eg idad de la
memb ana plasmá ica, no se iñen.
El ecuen o se ealizó mezclando 50 µl de una de e minada suspensión celula y 50 µl de
Azul de T ipan, la mezcla se colocó sob e una cáma a de Neubaue y se ealizó el ecuen o celula
en un mic oscopio óp ico (Op ipho , Nikon).
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Ø La densidad celula se de e minó median e la siguien e o mula:
𝐷𝐶
#
𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
𝑚𝑙
+
=𝑁°/𝑑𝑒/𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑣𝑖𝑣𝑎𝑠∗𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟/𝑑𝑒/𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛∗10=
𝑁°/𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠/𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠
DC: Densidad celula
104: Ajus e al amaño de la cáma a
Fac o de dilución: 2 (mezcla 50µl + 50µl
3.3
Ob ención de mac ó agos
Los medios u ilizados pa a la ob ención de los mac ó agos ue on los siguien es:
Ø Medio Roswell Pa k Memo ial Ins i u e (RPMI) 1640 (Gibco) suplemen ado con 1% de
sue o humano AB inac i ado y il ado, L-glu amina 2mM y an ibió ico (penicilina 1000
U/ml y es ep omicina 100 µg/ml).
Ø Medio RPMI 1640 (Gibco) suplemen ado con 10% ( / ) de SFB descomplemen ado, 1%
de L-glu amina 2 mM y 1% de an ibió ico (penicilina 100 U/ml y es ep omicina 100
µg/ml): RPMI comple o.
El ac o de c ecimien o u ilizado en el p o ocolo:
Ø GM-CSF: Recombinan Human G anulocy e-Mac ophage Colony S imula ing Fac o .
Ac i idad biólogica: 0,02-0,1 ng/ml.
El sue o u ilizado en los expe imen os ealizados con células humanas se
descomplemen ó pa a e i a la lisis de las células po el sis ema del complemen o. Pa a ello,
se a ó du an e 30 minu os a 56 0C y anscu ido es e iempo se cen i ugo a 1000 pm
du an e 15 minu os. El sob enadan e ue ecogido en un ubo de ondo cónico y se congeló
has a su uso.
El p o ocolo de ob ención de mac ó agos se inició ealizando una cen i ugación en
g adien e de Ficoll pa iendo de una capa leucoci a ia o “bu y coa ” p oceden e del Banco
de Sang e y Tejidos de A agón. Se a a de una écnica de cen i ugación po g adien e de
densidad pa a sepa a células mononuclea es del es o de células sanguíneas (Figu a A5).

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Figu a A5: Imagen ilus a i a del esul ado inal que se ob iene a pa i de la écnica Ficoll-HyPaque, donde puede
obse a se la o mación de las di e en es capas celula es en unción de su densidad.
La sang e o al se diluyó en p opo ción 1:1 en ampón os a o salino PBS (NaCl, K2HPO4,
KH2PO4) se omó un olumen adecuado pa a una p opo ción 2:1 con el eac i o Ficoll-Hypaque
(GE Heal hca e) y la sang e diluida se deposi ó sua emen e sob e el Ficoll pa a man ene la
in e ase. Se cen i ugó sin eno du an e 20 min a 1000 pm y luego se ecolec ó la in e ase, es
deci , la capa de células mononuclea es de sang e pe i é ica (PBMCs).
Se hicie on 3 la ados con ampón PBS y se añadió medio RPMI comple o. Se omó una
alícuo a de la suspensión celula pa a de e mina la densidad y iabilidad celula median e
inción con Azul de T ipán, el pelle celula se esuspendió a una concen ación inal de 2,5*106
células/ml con medio RPMI+ sue o humano AB y se cul i a on las células en una placa de Pe i
du an e 2 ho as a 37 oC. Finalmen e, después de ealiza o a se ie de la ados con ampón PBS
a empe ado, se añadió medio RPMI comple o jun o con el ac o de c ecimien o GM-CSF
(In i ogen) a una concen ación de 0,1 ng/ml. El cul i o celula se man u o du an e 6 días pa a
comple a la di e enciación de los monoci os a mac ó agos (Figu a A6) en un incubado
e mos a izado (He aeus Cell) a 37 oC, en ai e sa u ado de humedad y con un 5% de CO2.
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Figu a A6: Imágenes del cul i o celula de mac ó agos ob enidos en el labo a o io
3.4
Espec o o ome ía
La espec o o ome ía es una écnica analí ica que pe mi e de e mina la concen ación de
un compues o en solución (Figu a A7). Se basa en que las moléculas abso ben las adiaciones
elec omagné icas y a su ez que la can idad de luz abso bida depende de o ma lineal de la
concen ación (Ley de Lambe -Bee ). El undamen o de la espec oscopía se debe a la
capacidad de las moléculas pa a abso be adiaciones, en e ellas las adiaciones den o del
espec o UV- isible. Las longi udes de onda de las adiaciones que una molécula puede abso be
y la e iciencia con la que se abso ben dependen de la es uc u a a ómica y de las condiciones
del medio (pH, empe a u a, ue za iónica, cons an e dieléc ica), po lo que dicha écnica
cons i uye un alioso ins umen o pa a la de e minación y ca ac e ización de biomoléculas.
Pa a hace es e ipo de medidas se emplea un espec o o óme o [4]. Aunque pueden a ia
en diseño, en especial con la inco po ación de o denado es pa a el análisis de da os, odos los
espec o o óme os cons an, según se indica en la igu a, de:
1. Una uen e de ene gía adian e: lámpa a de deu e io y ungs eno.
2. Un monoc omado pa a la selección de adiaciones de una de e minada longi ud de
onda: il os, p ismas, edes de di acción.
3. Un compa imen o donde se aloja un ecipien e anspa en e (cube as o ubos) que
con enga la mues a Pueden se de id io, cua zo o plás ico anspa en e. Pa a medi en
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UV se deben usa las de cua zo o sílice undido, po que el id io no ansmi e la adiación
UV.
4. Un de ec o de luz y un ampli icado con e ido de las señales luminosas en señales
eléc icas.
5. Un egis ado o sis ema de lec u a de da os.
Figu a A7: Esquema de un espec o o óme o [4]
3.4.1
Ley de Lambe -Bee
La Ley de Lambe -Bee exp esa la elación en e abso bancia de luz monoc omá ica ( de
longi ud de onda ija) y la concen ación de un c omó o o en solución:
𝐴=𝑙𝑜𝑔 𝑙
𝑙@=𝜀∗𝑐∗𝑙
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La abso bancia de una solución es di ec amen e p opo cional a su concen ación – a mayo
núme o de moléculas mayo in e acción de la luz con ellas-; ambién depende de la dis ancia
que eco e la luz po la solución a igual concen ación, cuan o mayo dis ancia eco e la luz
po la mues a más moléculas se encon a á-; y po úl imo, depende de e, una cons an e
p opo cionalidad -denominada coe icien e de ex inción- que es especí ica de cada c omó o o.
Como A es adimensional, las dimensiones de e dependen de las de c y l. La segunda magni ud (l)
se exp esa siemp e en cm mien as que la p ime a ( c ) se hace, siemp e que sea posible, en M,
con lo que las dimensiones de e esul an se M-1.cm-1. Es e coe icien e así exp esado, en
é minos de unidades de concen ación mola (o un submúl iplo ap opiado), se denomina
coe icien e de ex inción mola (εM).
La ley de Lambe -Bee se cumple pa a soluciones diluidas; pa a alo es de c al os, ε a ía
debido a enómenos de dispe sión de la luz, ag egación de moléculas, cambios del medio, e c.
3.5
De e minación de la longi ud de onda pa a el ensayo de oxicidad in i o
En la Figu a A8 se mues a el análisis de la abso bancia de dis in as concen aciones de
GOQDs a dis in as longi udes de onda. Pa a que no in e accione con los esul ados del ensayo
de oxicidad se necesi a emplea una longi ud de onda a la cual la abso bancia p oducida po los
p opios GOQDs sea mínima. En es e caso, la concen ación máxima empleada en los ensayos
de oxicidad es de 3,7 mg/l, po lo que a pa i de los 500 l ya se es a ía en un alo de
abso bancia p óximo al 0. Como se iene que elegi un alo conc e o, en es e caso, se ha
decidido abaja a una longi ud de onda de 570 l, debido a que el espec o o óme o ya se
encuen a con igu ado pa a ealiza la medición a esa longi ud de onda.