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T abajo Fin de Mas e Es udio de la oxicidad ambien al e in i o de los ma e iales g a énicos Au o Juan José Calleje o Ma ín Di ec o D . José Luis Pinilla Iba z Codi ec o a D a. E a Mª Gal ez Bue ba Ponen e D . Julián Pa do Jimeno Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a Depa amen o de Bioquímica y Biología Molecula y Celula 2020 RESUMEN Los ma e iales g a énicos son conocidos desde el descub imien o en 1985 de los ule enos, y pos e io men e, en 2004 del g a eno. El descub imien o de es e úl imo supuso oda una e olución en muchas de las á eas de in es igación debida a las excelen es p opiedades que p esen aban es os ma e iales (ele ada conduc i idad é mica y eléc ica, al o módulo de Young, e c.). Den o de los ma e iales g a énicos, des acan los pun os cuán icos de g a eno “GQDs” (po sus siglas en inglés: g aphene quan um do s), que se ca ac e izan po ene un amaño nanomé ico de en e 3-20 nm y po posee , además de las ca ac e ís icas p opias de los ma e iales g a énicos, o oluminiscencia. La capacidad de se o oluminiscen es ha pe mi ido que sean empleados en mul i ud de aplicaciones, en e las que des aca su uso en aplicaciones biomédicas. Sin emba go, su u ilización a ni el biomédico se ha is o limi ada debido a que apenas exis en es udios que analicen con p o undidad la oxicidad que p esen an es os nanoma e iales. En el abajo p esen ado se abo dó el es udio de la oxicidad ambien a in i o e in i o de los GQDs, y más conc e amen e, de los pun os cuán icos de óxido de g a eno “GOQDs” (po sus siglas en inglés: g aphene oxide quan um do s). Es os nanoma e iales se di e encian de los GQDs debido a que p esen an g upos oxigenados en su supe icie (p o enien es del mé odo de ex oliación u ilizado en su sín esis), que modi ican su o oluminiscencia. Los GOQDs se sin e iza on a pa i de nano ib as de ca bono (CNF) de ipo ishbone, median e un p oceso de oxidación/ex oliación. Pa a pode comp oba la co ec a ealización de la sín esis, el ma e ial se ca ac e izó median e dis in as écnicas de análisis (SEM, Análisis elemen al, XPS y TEM). Una ez ca ac e izado, se analizó la oxicidad que p oducían los GOQDs en Caeno habdi is elegans (C. elegans), nema odos empleados como modelo de ensayo in i o, siendo some idos a una exposición aguda (5 días) y c ónica (25 días). Po o o lado, se es udió el e ec o óxico de los GOQDs en a ias líneas celula es de ó ganos del sis ema diges i o (hepá ica (Hep G2) e in es inal (Caco-2)) y neu onal (neu oblas oma (SH-SY5Y)), du an e un pe iodo de exposición de 3 y 5 días. A ni el neu onal, ambién se analizó la oxicidad p oducida po la p esencia de los GOQDs en las células neu onales di e enciadas después de una exposición de 5 días. Po úl imo, se es udió la oxicidad inmunológica p oducida po los GOQDs en mac ó agos, después de una exposición de 5 días. G acias a los esul ados ob enidos se pudo comp oba que la oxicidad, an o a ni el in i o como in i o, que p esen an es os nanoma e iales depende de la concen ación empleada y del pe iodo de exposición. ÍNDICE GENERAL 1 In oducción y obje i os ...................................................................................... 1 1.1 In oducción a los ma e iales g a énicos ................................................................. 1 1.2 Ma e iales g a énicos. ............................................................................................ 2 1.3 Pun os cuán icos de g a eno. .................................................................................. 4 1.3.1 Aplicación en el ámbi o biomédico ........................................................................................ 5 1.3.2 Toxicidad ................................................................................................................................ 7 1.4 Obje i o ................................................................................................................. 8 2 Pa e Expe imen al ............................................................................................. 9 2.1 Sín esis de los GOQDs ............................................................................................. 9 2.2 Técnicas de ca ac e ización. .................................................................................. 10 2.2.1 Mic oscopía elec ónica de ansmisión .............................................................................. 10 2.2.2 Di acción de ayos X ............................................................................................................ 10 2.2.3 Espec oscopia de o oelec ones emi idos po ayos X ...................................................... 11 2.2.4 Análisis Elemen al. ................................................................................................................ 11 2.3 Ma e iales y mé odos. .......................................................................................... 11 2.3.1 Caeno habdi is elegans ........................................................................................................ 11 2.3.2 Cul i os celula es .................................................................................................................. 12 2.3.3 Mac ó agos ........................................................................................................................... 13 2.3.4 Es udio de la oxicidad ambien al in i o ............................................................................. 13 2.3.5 Es udio de la oxicidad in i o. ............................................................................................ 14 2.3.6 Es udio de la oxicidad inmunológica ................................................................................... 16 3 Resul ados ........................................................................................................ 17 3.1 Ca ac e ización de los GOQDs ............................................................................... 17 3.2 Es udio de la oxicidad ambien al in i o .............................................................. 21 3.3 Es udio de la oxicidad in i o. ............................................................................. 23 3.4 Es udio de la oxicidad inmunológica .................................................................... 28 4 Conclusiones ..................................................................................................... 30 5 Bibliog a ía ....................................................................................................... 31 ÍNDICE DE FÍGURAS Figu a 1: Fo mas y dimensiones ca ac e ís icas de los aló opos del ca bono basados en g a eno (ma e iales g a énicos) [3]. ........................................................................................................... 2 Figu a 2: Esquema de la ob ención del g a eno median e los mé odos op-down y bo om-up [3] ...................................................................................................................................................... 3 Figu a 3: Uso de los GQDs pa a la ehicula ización de á macos en el a amien o del cánce [18] ...................................................................................................................................................... 7 Figu a 4: Esquema del p oceso de sín esis lle ado a cabo pa a la ob ención de los GOQDs ..... 10 Figu a 5: Caeno habdi is elegans (C. elegans) ............................................................................ 11 Figu a 6: Esquema de la placa de 96 pocillos empleada du an e el expe imen o de oxicidad in i o ............................................................................................................................................. 16 Figu a 7: Di ac og ama de ayos X de la mues a de las nano ib as de CNF y GOQDs .............. 17 Figu a 8: Po cen aje de los elemen os que componen las nano ib as CNF y los GOQDs. ......... 19 Figu a 9: Región C1s decon olucionada de los espec os XPS de los GOQDs. ............................ 20 Figu a 10: Imágenes TEM de los GOQDs. .................................................................................... 21 Figu a 11: E olución de la asa de supe i encia en C.elegans debida a la exposición aguda con GOQDs ........................................................................................................................................ 22 Figu a 12: E olución de la asa de supe i encia en C.elegans debida a la exposición c ónica con GOQDs ........................................................................................................................................ 23 Figu a 13: Es udio de la iabilidad celula de las células Hep G2 an e la p esencia de dis in as concen aciones de GOQDs a 3 y 5 días ..................................................................................... 24 Figu a 14: Es udio de la iabilidad celula de las células Caco-2 an e la p esencia de dis in as concen aciones de GOQDs a 3 y 5 días ..................................................................................... 25 Figu a 15: Es udio de la iabilidad celula de las células SH- SY5Y an e la exposición de dis in as concen aciones de GOQDs a 3 y 5 días ..................................................................................... 26 Figu a 16: Compa ación de la iabilidad celula de las células SH-SY5Y con las células neu onales an e la p esencia de dis in as concen aciones de GOQDs a 5 días. .......................................... 27 Figu a 17:Análisis de la p esencia de endo oxinas en la mues a de GOQDs. ............................ 28 Figu a 18: Es udio de la iabilidad celula de los mac ó agos an e la p esencia de dis in as concen aciones de GOQDs a 5 días ........................................................................................... 29 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1: Núme o de células empleadas en los expe imen os de oxicidad in i o dependiendo de la línea celula y del iempo del expe imen o ........................................................................ 15 Tabla 2: Pa áme os es uc u ales de e minados po XRD del pico (002) en las CNF y GOQDs. 18 Tabla 3: Componen es del análisis supe icial XPS de las acciones basadas en GOQDs. ......... 20 LISTADO DE ABREVIATURAS Ab e ia u a Signi icado GQD Pun os cuán icos de g a eno GOQD Pun os cuán icos de óxido de g a eno CNT Nano ubos de ca bono BLG Bicapa de g a eno FLG G a eno de pocas capas MLG G a eno mul icapa CNF Nano ib as de Ca bono GO Óxido de g a eno FLGO Óxido de g a eno de pocas capas GONF Nano ubos de ca bono oxidado GNR Nanocin as de g a eno hNSC Células mad e neu onales humanas XRD Di acción de ayos X XPS Espec oscopia de o oelec ones emi idos po ayos X TEM Mic oscopía elec ónica de ansmisión C.elegans Caeno habdi is elegans NGM Aga nema ode g ow h media DMEM Medio de Dulbecco's eagle modi icado SFB Sue o e al bo ino ROS Especies eac i as de oxígeno Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 1 1 In oducción y obje i os 1.1 In oducción a los ma e iales g a énicos El ca bono es uno de los elemen os más abundan es de la na u aleza y cons i uye un pila básico pa a la química o gánica y la exis encia de la ida. Su descub imien o se emon a a la an igüedad, siendo uno de los p ime os elemen os conocidos. Se a a de un no me al e a alen e, po lo que p esen a cua o elec ones capaces de o ma enlaces químicos co alen es. La ele ancia de es e elemen o eside en la capacidad que iene de o ma dis in as es uc u as molecula es, conocidas como aló opos de ca bono, median e la combinación en e los á omos de ca bono y el ipo de hib idación que p esen an sus o bi ales (sp1, sp2 y sp3). Cada aló opo de ca bono iene una es uc u a molecula di e en e al es o, la cual les con ie e p opiedades ísicas, mo ológicas y químicas signi ica i amen e di e en es, siendo muy in e esan es pa a di e sos campos de in es igación como la bio ecnología o la ene gía [1]. En la na u aleza, el ca bono elemen al se puede encon a como dos aló opos, el diaman e y el g a i o, que consis en en ala gadas edes o madas po la combinación de los á omos de ca bono con los o bi ales sp3 y sp2, espec i amen e. Ambos aló opos mues an p opiedades ísicas únicas como du eza, ele ada conduc i idad é mica y eléc ica. Debido a dichas p opiedades, es os ma e iales han sido ampliamen e es udiados, siendo los únicos aló opos de ca bono conocidos du an e mucho iempo. Es a si uación cambió con el descub imien o de los ule enos en 1985 [2] y años más a de del g a eno en 2004 [3]. Respec o al aló opo de g a eno, se o ma po la combinación de los á omos de ca bono median e hib idación sp2 y cons i uye un componen e básico es uc u al pa a el es o de es uc u as g a énicas (Figu a 1). Dichas es uc u as se denominan ma e iales g a énicos, los cuales incluyen o mas 2D, que se conocen como ma e iales de g a eno, así como o mas 0, 1 y 3D cuyas es uc u as se o man a pa i de las “capas de g a eno”. Así, en el ule eno (0D), la capa de g a eno se en uel e o mando una es e a, en los nano ubos de ca bono (CNT, po sus siglas en inglés) (1D) se en olla o mando cilind os y en el g a i o (3D) se apila una capa sob e o a de o ma pa alela. Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 8 examina sus e ec os sob e la p oli e ación y la ac i idad me abólica de las hNSC, sin encon a cambios sus anciales en la iabilidad celula , la p oli e ación, la ac i idad me abólica y el po encial de las células mad e. Respec o a la oxicidad biológica, oda ía no exis en es udios que hayan p o undizado ace ca de la oxicidad ambien al de los GQDs. Todos los es udios mencionados an e io men e han se ido pa a es ablece las bases ace ca de la oxicidad de los nanoma e iales GQDs. Sin emba go, es os es udios esul an escasos si se iene en cuan a la can idad de ac o es que pueden in lui an o en la biocompa ibilidad como en la oxicidad de los nanoma e iales. En e odos es os ac o es des acan el ipo de sín esis, los g upos uncionales, el amaño, la conduc i idad, la na u aleza de las modi icaciones químicas y ambién la línea celula y las moléculas del á maco. Es po ello que el p esen e abajo se cen ó en el es udio de la oxicidad in i o e in i o p oducida po los GQDs, y más conc e amen e, po los GOQDs. Es e nanoma e ial es muy simila a los GQDs pe o p esen a una mejo o oluminiscencia ob enida g acias a la implemen ación de g upos oxigenados en su supe icie, haciéndolos idóneos pa a aplicaciones biomédicas. A pesa de es a mejo ía, apenas exis en in es igado es que hayan analizado la oxicidad in i o e in i o de es e ipo de nanoma e ial. Po lo que son necesa ios es e ipo de es udios pa a pode iden i ica de mane a cla a el mecanismo de oxicidad que lle an a cabo. 1.4 Obje i o El obje i o p incipal de es e abajo es analiza la oxicidad in i o e in i o de los ma e iales g a énicos GOQDs, pa a e alua su iabilidad en aplicaciones biomédicas. Pa a es e obje i o gene al se han p opues o los siguien es obje i os in e medios: 1) Sín esis de los GOQDs pa iendo de nano ib as de ca bono (CNF, po sus siglas en inglés) median e el p oceso de oxidación/ex oliación ( es a egia op-down). 2) Ca ac e ización del nanoma e ial sin e izado median e di e en es écnicas analí icas: XRD, Análisis elemen al, XPS y TEM. 3) Es udio de la oxicidad ambien al in i o median e el empleo de Caeno habdi is elegans (C.elegans). 4) Es udio de la oxicidad in i o en dis in as líneas celula es de ó ganos del sis ema diges i o (hepá icas e in es inales) y neu onal (neu oblas oma y neu onales). 5) Es udio de la oxicidad inmunológica empleando mac ó agos. Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 9 2 Pa e Expe imen al Todos los eac i os u ilizados pa a el p oceso de sín esis apa ecen desc i os en el ANEXO I. 2.1 Sín esis de los GOQDs Los GOQDs se sin e iza on a pa i de nano ib as de ca bono (CNF, po sus siglas en inglés) de ipo ishbone median e oxidación química po el mé odo de Humme ´s modi icado [27] y pos e io se les ealizó una ex olia on ul asónica. Es e p o ocolo de sín esis ue p e iamen e desa ollado en el G upo de Con e sión de Combus ibles (ICB-CSIC) [28]. En la sín esis, se pa ió de 3 g de CNF que se mezcla on con 3 g de NaNO3 (99.0%) y 138 ml de H2SO4 (96%) bajo agi ación y en baño de hielo. Después se añadió 26 g de KMnO4 poco a poco y bajo agi ación igo osa. Du an e es a e apa la empe a u a se man u o po debajo de los 20 °C. T as añadi odo el pe mangana o, se man u o la disolución en eposo du an e 30 min. Una ez anscu ido ese iempo, la solución esul an e se dejó bajo agi ación a 30±5 °C du an e 2h y a empe a u a ambien e du an e oda la noche. Finalizada la oxidación, se ob u o una mezcla pas osa de colo ma ón. Después se añadie on muy len amen e 240 ml de agua desionizada (mili-Q) e i ando supe a los 70 °C en la solución, debido a que la eacción con el ácido sul ú ico es exo é mica. T anscu ida 1h de agi ación, se adiciona on o os 600 ml de agua desionizada (mili-Q). T as la dilución, el exceso de iones pe mangana o se consumió añadiendo go a a go a 26 ml de H2O2 (33%), uno po cada g amo de KMnO4 añadido en la oxidación. El ma e ial esul an e de la oxidación, de colo neg o, se ex olió median e sonicación du an e 4h y se cen i ugó (Beckman Coul e , Alleg a X-22R) a 9500 pm y 4°C du an e 40 min. T as es e p oceso se ob u o una suspensión de ma e iales de óxido de g a eno o mada po CNF oxidadas (GONF, po sus siglas en inglés), óxidos de g a eno de pocas capas (FLGO, po sus siglas en inglés) y GOQDs, cuya dis ibución depende del endimien o del p oceso de oxidación/ex oliación. El p ecipi ado se la ó a ias eces con una disolución diluída de HCl (10%). Las di e en es acciones se sepa a on median e una secuencia de cen i ugaciones di e enciales deg esi as. Pa a ello el p ecipi ado se edispe só en agua desionizada (mili-Q) y se some ió a a ios ciclos de cen i ugación de 60 min en e apas de elocidades descenden es (14800, 9500, 7000 y 4500 pm) usando en cada una el p ecipi ado edispe sado en agua de la e apa an e io y sepa ando el sob enadan e ob enido en cada una de ellas en o den de amaños de pa ícula dec ecien e (Figu a 4). T as la cen i ugación, la acción de GOQD ob enida p esen ó una concen ación en o no a 0,1-0,6 mg ml-1. Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 10 2.2 Técnicas de ca ac e ización. El undamen o eó ico de las écnicas de ca ac e ización empleadas se encuen a desc i o en el Anexo II. 2.2.1 Mic oscopía elec ónica de ansmisión Median e mic oscopía elec ónica de ansmisión (TEM) se puede conoce la mo ología y el amaño p omedio de los GOQDs sin e izados. Pa a la ealización del análisis ue necesa io p epa a p e iamen e la mues a po dispe sión en agua median e ul asonidos. Las imágenes de TEM se ob u ie on en el mic oscopio Tecnai F30 (FEI company) ope ado en modos TEM y STEM, con una acele ación del ol aje de 300 kV. El ins umen o es aba equipado con un emiso de campo y len es Supe Twin® que pe mi e una esolución máxima de 1.5 Å. 2.2.2 Di acción de ayos X La di acción de ayos X (XRD) pe mi e conoce la es uc u a c is alina p esen e en los GODQs. El pa ón de di acción se adquie e con un di ac ome o B uke (Modelo D8 Ad ance, Se ies 2) con un modo de escaneo po e apas ( ango de ángulo 2Ɵ=5o-80o, amaño de paso =0,05o, iempo de con eo=4s/paso), usando como uen e de ayos X un ánodo de cob e (λ=1,54 Å) y un monoc omado secunda io de g a i o, ope ado a 40,0 kV y 30,0 mA. La ado 4500 pm FLGO Oxidación Ex oliación CNF Suspensión de GO 9500 pm GOQD 14800 pm 7000 pm GONF Residuo Figu a 4: Esquema del p oceso de sín esis lle ado a cabo pa a la ob ención de los GOQDs Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 11 2.2.3 Espec oscopia de o oelec ones emi idos po ayos X La espec oscopia de o oelec ones emi idos po ayos X (XPS) pe mi e de e mina con p ecisión la composición a ómica más supe icial de los GODQs. El análisis se ealizó median e un sis ema Omic on ESCAPlus, equipado con un analizado de ene gía de elec ones hemis é ico, con un ánodo no monoc oma izado de Mg (λ=1253,6 eV) como uen e de adiación, ope ado a 15 mA y 15 kV, a acío (˂5x10-9 o ). 2.2.4 Análisis Elemen al. El análisis elemen al es una écnica de ca ac e ización que pe mi e de e mina de mane a cuan i a i a y cuali a i a el con enido o al de ca bono, hid ógeno, ni ógeno y azu e p esen e en los GODQs. Es a écnica analí ica se u ilizó pa a con i ma la composición de los ma e iales analizados. Se empleó un analizado The mo Flash 1112 pa a la de e minación de dichos elemen os en un ango en e el 0,05% y 99,95%, que cumple las no mas EN es ablecidas. 2.3 Ma e iales y mé odos. 2.3.1 Caeno habdi is elegans Caeno habdi is elegans (C. elegans) son unos nema odos que habi an en el suelo y que se alimen an de poblaciones úngicas y bac e ianas (Figu a 5). La capacidad de c ia cien os de gusanos en una sola placa de Pe i, su anspa encia, su ciclo de ida ápido (3 días), su ida ú il co a (3 semanas) y, su c ecimien o ácil y económico han hecho de es e gusano un modelo ideal pa a abaja en el labo a o io. Además, los a ances en gené ica y biología molecula han pe mi ido la iden i icación de odas las células de C.elegans y su genoma comple o, lo que ha demos ado una al a conse ación de los mecanismos biológicos en e el gusano y los e eb ados, siendo idóneos como modelos in i o. Figu a 5: Caeno habdi is elegans (C. elegans) Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 12 La cepa de C.elegans que se u ilizó du an e los expe imen os de oxicidad ambien al p esen aba la mu ación glp-4. Es a mu ación p oduce que los gusanos sean incapaces de gene a p ogenie cuando son cul i ados a 25 0C. Es e hecho pe mi ió ealiza los expe imen os de supe i encia sin que apa ecie an anomalías en el ecuen o de los gusanos. Todas la cepas de C.elegans p o inie on del Cen o de Gené ica Caeno gabdi is (Uni e sidad de Minneso a). La p esencia de gusanos en di e en es e apas de desa ollo den o de los cul i os impide la ob ención de esul ados e aces de los es udios de oxicidad. Po ello, ue necesa io some e los a un p oceso de sinc onización con el obje i o de ob ene una población de gusanos que se encon a á en la misma ase o e apa i al. El p oceso de sinc onización consis ió en ma a la as y gusanos adul os, debili ando la cu ícula de los C. elegans a a és de una solución de lejía y sosa caus ica, lo que pe mi ió libe a los hue os del in e io de los gusanos que se encon aban en pe iodo de ges ación. Es os hue os esis ían condiciones más du as que los gusanos, po lo que se ob u ie on hue os iables a a és del uso de una solución de lejía y sosa a una concen ación adecuada. Un ac o impo an e ue e i ica en un es e eomic oscopio la p esencia en los cul i os de gusanos en ges ación pa a pode selecciona el mejo día pa a ealiza la sinc onización, y pa a así ob ene el máximo núme o de hue os. O os pa áme os, como la elación en e la can idad o al de gusanos y la can idad de hid óxido de sodio p esen e en la solución, el iempo de con ac o en e los gusanos, y la solución de lejía y sosa, la empe a u a y la ai eación de los hue os ambién a ec a on al endimien o de ob ención de los hue os. El cul i o de C.elegans y el p oceso de sinc onización apa ece desc i o de mane a de allada en el Anexo III (Apa ado 3.1). 2.3.2 Cul i os celula es Pa a el análisis de la oxicidad in i o se u iliza on las siguien es líneas celula es umo ales: 1. SH-SY5Y: Línea celula de neu oblas oma 2. Hep G2: Línea celula de ca cinoma hepa ocelula . 3. Caco-2: Línea celula de adenoca cinoma colo ec al. Las líneas celula es que se u iliza on en los expe imen os ue on adhe en es y su manipulación se ealizó en condiciones de es e ilidad en campana de lujo lamina (Tels a ). La línea celula SH-SY5Y se eligió debido a la escasos es udios exis en es sob e como a ec a la p esencia de nanopa ículas de g a eno en el ejido neu onal. También se u iliza on células neu onales, ob enidas median e la di e enciación de las SH-SY5Y u ilizando ácido e inoico. Po o o lado, las líneas Hep G2 y Caco-2 se selecciona on debido a que ambas o man pa e del Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 13 ejido de ó ganos del sis ema diges i o, po lo que pe mi i ían analiza la a ección que p oducen las nanopa iculas cuando son in oducidas po ía gas oin es inal. El man enimien o de es os cul i os, el p oceso de congelación y descongelación de los mismos, y la de e minación de la densidad celula apa ecen explicados en p o undidad en el Anexo III (Apa ado 3.2). 2.3.3 Mac ó agos Los mac ó agos o man pa e de las células que cons i uyen el sis ema inmune, po lo que analiza como a ec an los GOQDs a es as células da in o mación de cómo el sis ema inmune eacciona an e la p esencia en el o ganismo de las nanopa iculas de g a eno. Pa a la ob ención de los mac ó agos, se pa ió de una capa leucoci a ia o “bu y coa ” p oceden e del Banco de Sang e y Tejidos de A agón. Es a capa ue some ida a un p oceso de cen i ugación en g adien e de Ficoll con el obje i o de ex ae las células mononuclea es de sang e pe i é ica (PBMCs). Una ez ex aídas se di e encia on a mac ó agos median e el p oceso que apa ece desc i o en el Anexo III (Apa ado 3.3). 2.3.4 Es udio de la oxicidad ambien al in i o La oxicidad ambien al in i o p oducida po los GOQDs en C.elegans se analizó as una exposición aguda (5 días) y c ónica (25 días). Los gusanos, ya some idos al p oceso de sinc onización, se ecogie on de la placa de aga nema ode g ow h media (NGM) de 60 mm, donde se encon aban cul i ados, median e el la ado con 6 ml de ampón M9 (Na2HOP4, 6g; NaCl, 5g; KH2PO4, 3g; H2O des ilada, 1l y 1 ml de MgSO4 1M). La suspensión de gusanos se ans i ió a un Falcon de 15 ml. Pa a inc emen a el núme o de gusanos ob enidos, se ealizó o o la ado de la placa de aga NGM con 4 ml de ampón M9. Una ez ealizado ese segundo la ado, la suspensión se cen i ugó a 1200 pm du an e 5 minu os. El sob enadan e esul an e se desechó educiendo el olumen has a los 2 ml. Los gusanos se esuspendie on median e o eo manual y a con inuación, se ex ajo una alícuo a de 20 µl pa a cuan i ica el núme o de gusanos p esen es en la suspensión. El ecuen o de los gusanos se ealizó empleando un es e eomic oscopio, siendo necesa io in oduci la alícuo a en un pocillo de una placa de 96. Una ez ealizado, se ex apola on los esul ados con el obje i o de conoce el nume o o al de gusanos p esen es en los 2 ml. Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 14 Pa a la ealización del es udio, se añadie on 30 gusanos a cada placa de aga NGM de 35mm, necesi ando un o al de 120 gusanos, debido a que en cada expe imen o se analiza on dos si uaciones (p esencia de GOQDs y con ol) po duplicado. El es o de gusanos se ol ie on a cul i a en una placa de aga de 60 mm, pa a pode se u ilizados en u u os expe imen os. A con inuación, se adiciona on a dos de las placas 40 µl de GOQDs a una concen ación de 37 µg/ml, jun o con 200 µl de E. Coli OP50 que se empleó como uen e de alimen o pa a los gusanos. Las o as dos placas de aga ue on el con ol, po lo que se les añadió solamen e 200 µl de E. Coli OP50. En el caso de los es udios de oxicidad c ónica, la adición a cada placa de E. Coli y GOQDs se ealizó de o ma pe iódica cada 5 días mien as que en los es udios de oxicidad aguda, sólo se ealizó el día 1. La e aluación del núme o de gusanos en cada placa se lle ó a cabo de mane a dia ia, du an e el pe iodo que du ó el es udio, con la ayuda de un es e eomic oscopio Los esul ados apa ecen expues os como asa de supe i encia espec o al iempo de exposición empleado. 2.3.5 Es udio de la oxicidad in i o. Las líneas celula es, que se encuen an adhe idas a la supe icie de los ascos de cul i o de 25 cm2 (TPP), se despega on de la supe icie median e la incubación con ipsina a 37 oC du an e 5 min. Finalizado es e pe iodo, con el in de inac i a la ipsina se añadie on 5 ml de medio de cul i o Dulbecco's Eagle modi icado DMEM (Gibco) suplemen ado con 10% ( / ) de sue o e al bo ino (SFB, Sigma), L-glu amina 2mM (Pan Bio ech GmbH) y an ibió ico (penicilina 100 U/ml y es ep omicina 100 µg/ml, Sigma). A con inuación, las células se ans i ie on a un Falcon de 15 ml y se cen i uga on a 1500 pm. La cen i ugación se ealizó con el obje i o de elimina la ipsina p esen e. El sob enadan e ob enido se desechó y se ol ie on a añadi o os 5 ml de medio esco. Fue impo an e e i a que las células se encon asen aglome adas unas con o as, pa a ello, se pipe eó a ias eces la suspensión con enida en el Falcon. Una ez pipe eada, se omó una alícuo a de 50 µl con el obje i o de calcula la densidad celula de cada línea empleada. El es udio de oxicidad in i o se ealizó empleando una placa de 96 pocillos donde se cul i a on las dis in as líneas celula es (Figu a 6) . En cada caso, se u iliza on un nume o o al de 32 pocillos (4 columnas x 8 ilas). A cada pocillo se añadie on 200 µl de medio que con enía un núme o de e minado de células. Es e núme o dependía de la línea celula u ilizada y de la du ación del expe imen o (3 o 5 días), debido a que se p e endía que en el momen o del Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 15 ecuen o exis ie a el mismo núme o de células. An es de adiciona los GOQDs, las células debían es a comple amen e adhe idas a la supe icie del ondo del pocillo. Pa a ello, se deja on incubando du an e 2 ho as en un incubado e mos a izado a 37 oC, en ai e sa u ado de humedad y con un 5% de CO2. Finalizado es e pe iodo, se saca on del incubado y se adiciona on los GODQs a odas las ilas menos a la p ime a que ue el con ol. En cada ila se enían di e en es concen aciones de GOQDs, inc emen ándose con o me se descendía, siendo cada columna un expe imen o independien e. La concen ación de GOQDs en la segunda ila ue de 0,05 µg/ml, aumen ando (2:1) a medida que se descendía has a los 3,7 µg/ml en la úl ima ila. Pa a consegui lo, se añadie on a cada ila 20 µl de una suspensión, p e iamen e p epa ada, que con enía una concen ación de GOQDs diez eces supe io a la necesa ia. Es e alo se debe a que en los pocillos ya había 200 µl de medio, po lo que al adiciona los GOQDs se diluye on 1:10. Una ez añadidos, se dejó la placa en un incubado e mos a izado a 37 oC. El iempo que pe maneció allí dependió del expe imen o, pudiendo se de 3 o 5 días. T anscu ido el pe iodo de incubación, se adiciona on 10 µl de una disolución de B omu o de 3-(4,5-dime il iazol-2-ilo)- 2,5-di enil e azolio (MTT) a una concen ación de 5x103 µg/ml a odos los pocillos menos a los de la úl ima columna que ac uó como blanco. El ensayo se basó en la educción me abólica del MTT po la enzima mi ocond ial succina o-deshid ogenasa en o mazan (compues o colo eado de colo iole a), pe mi iendo de e mina la uncionalidad mi ocond ial de las células a adas. Po lo an o la can idad de células i as ue p opo cional a la can idad de o mazan p oducido. T as la adicción, se dejó la placa incubando una ho a y a con inuación, se cen i ugó a 1200 pm du an e 15 min. Tabla 1: Núme o de células empleadas en los expe imen os de oxicidad in i o dependiendo de la línea celula y del iempo del expe imen o 3 días 5 días SH-SY5Y 10.0000 5.000 Neu onal - 5.000 Hep G2 7.500 4.500 Caco-2 5.000 2.500 Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 16 La cuan i icación celula se ealizó median e espec o o ome ía (Anexo III, Apa ado 3.4) a una longi ud de onda de 570 nm. Pa a la elección de la longi ud de onda ue necesa io ealiza un es udio p e io con el obje i o de que no in e i ie a con el alo de abso bancia p oducido po los p opios GOQDs (Anexo III, Apa ado 3.5). La medición de abso bancia se ealizó median e un espec o o óme o. Es e alo dependió de la can idad de MTT acumulado en las células i as, de al o ma que, a mayo concen ación celula mayo in ensidad del colo iole a y, po lo an o, mayo alo de abso bancia (Anexo III, Apa ado 3.6). Los esul ados ob enidos se exponen como po cen aje de iabilidad celula espec o de la concen ación de GOQDs empleada. 2.3.6 Es udio de la oxicidad inmunológica El p o ocolo lle ado a cabo pa a la ealización de los ensayos de oxicidad inmunológica ue el mismo que el desc i o en el apa ado an e io . En es e caso, an es de comenza , ue necesa io conoce si había p esencia de endo oxinas en los GOQDs. Es e ipo de componen e ac úa es imulando el sis ema inmune y gene ando un po en e e ec o óxico, po lo que podía da luga a esul ados e óneos du an e el análisis de la oxicidad de los GOQDs. La de ección de la p esencia de endo oxinas se ealizó empleando el ki ToxinSenso Endo oxin De ec ion Sys em de la casa come cial GenSc ip y el p o ocolo que se lle ó a cabo apa ece desc i o de mane a de allada en el Anexo III (Apa ado 3.7) . Respec o al ensayo de oxicidad, se analizó únicamen e la oxicidad de los GOQDs en los mac ó agos du an e un pe iodo de exposición de 5 días, empleando un núme o o al de 10.000 mac ó agos en cada pocillo. Figu a 6: Esquema de la placa de 96 pocillos empleada du an e el expe imen o de oxicidad in i o Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 17 3 Resul ados 3.1 Ca ac e ización de los GOQDs Los di ac og amas del análisis XRD de la es uc u a de las nano ib as CNF de pa ida jun o con del ma e ial esul an e del p oceso de oxidación/ex oliación apa ecen desc i o en la Figu a 7. Las nano ib as CNF p esen a on una señal muy p onunciada en o no a 26,4°, jun o con o as mino i a ias a 42,5°, 44,3°, 53,9° y 78°, odas ellas co espondien es a las es uc u a del g a i o hexagonal. Es a señal dominan e co esponde al pico del plano de g a i o (002), el cual endió a desapa ece en los GOQDs como consecuencia de la oxidación casi comple a del g a i o p esen e en las nano ib as CNF. A pa i de la o ma y la posición de es e pico ue posible de e mina el amaño del c is al (Lc), la dis ancia en e los planos g a énicos (d) y el núme o de capas (n), empleando di e en es ecuaciones empí icas (Tabla 2). De es e modo, las nano ib as CNF p esen a on una es uc u a apilada, con c is ales de g a i o con un núme o medio de capas en o no a 19 y una dis ancia en e es as capas de 0,33 nm. T as su oxidación se pudo obse a una expansión en esa dis ancia in e plana (0,362nm), que aumen ó debido a la in e calación de g upos oxigenados, y es o se e lejó en un desplazamien o hacia la izquie da del pico 002. Además, el núme o de capas de los GOQDs ue mucho más bajo (3,7), ya que el ma e ial se había ex oliado. Po úl imo, el amaño de c is al disminuyó po que la ex oliación los ue ompiendo. Figu a 7: Di ac og ama de ayos X de la mues a de las nano ib as de CNF y GOQDs Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 24 a iación que p oducen en los ligandos de los que dependen los ecep o es a yl hyd oca bon (AhR) y p egnane X (PXR) [37]. Es a a iación comienza a p oduci se con o me se a inc emen ando la concen ación de nanoma e ial (< 1 mg/L) y se ha inculado con el desencadenamien o de mecanismos celula es que conducen a un cie o ni el de au o agia con la consiguien e disminución de los ni eles de los ecep o es an e io men e nomb ados y su uncionalidad. La p esencia de ele adas concen aciones de GOQDs no sólo se ha elacionado con la apa ición de au o agia celula , sino que además es as condiciones se han inculado con la apa ición de es és mecánico u oxida i o, lo que a ec a ía a la célula gene ando especies eac i as de oxígeno (ROS, po sus siglas en inglés) y pe dida de luidez celula . Los ROS son un ipo de especie química, químicamen e eac i a, que se o ma como un subp oduc o na u al del me abolismo del oxígeno [38]. En condiciones no males, acili an la ac i ación de los ac o es de ansc ipción y p omue en la di e enciación celula pe o si se encuen en al amen e concen ados, son capaces de induci apop osis y nec osis [37]. Figu a 13: Es udio de la iabilidad celula de las células Hep G2 an e la p esencia de dis in as concen aciones de GOQDs a 3 y 5 días 0 0,05 0,10 0,23 0,46 0,90 1,80 3,70 0 25 50 75 100 5 días 3 días Concen ación (mg/l) Viabilidad Celula (%) Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 25 En el caso de las células Caco-2, la iabilidad celula apenas se modi icó a medida que se aumen ó la concen ación de GOQDs, si uándose siemp e en o no al 80% (Figu a 14). Es e hecho ocu ió an o en los expe imen os ealizados du an e 3 días como en los ealizados du an e 5 días, e lejando una g an esis encia de es e ipo de células a la p esencia de los GOQDs. O os au o es analiza on la capacidad que end ían los pun os cuán icos de CdSe/ZnS de a a esa la memb ana celula de las células Caco-2 [38], obse ando que a bajas concen aciones (< 5 mg/l), es os nanoma e iales no se de ec an ni en la memb ana celula ni in acelula men e después de es días de exposición. Sin emba go, con o me se abaja con concen aciones más ele adas (>5 mg/l), la memb ana celula comienza a deg ada se pe mi iendo el paso de pequeñas can idades de nanoma e ial al in e io de la célula. Es as can idades se ían capaces de p oduci dis in as al e aciones en el in e io de la célula como es la gene ación de ROS, lo que a ec a ía a las unciones celula es e incluso a al e a el ADN, disminuyendo así la iabilidad celula . Es e enómeno obse ado usando pun os cuán icos de CdSe/ZnS pod ía ocu i ambién en es e es udio, explicando así los esul ados ob enidos. Figu a 14: Es udio de la iabilidad celula de las células Caco-2 an e la p esencia de dis in as concen aciones de GOQDs a 3 y 5 días 0 0,05 0,10 0,23 0,46 0,90 1,80 3,70 0 25 50 75 100 3 días 5 días Concen ación (mg/l) Viabilidad Celula (%) Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 26 En la Figu a 15, se mues a el es udio de la oxicidad in i o debida a la p esencia de dis in as concen aciones de GOQDs en las células de neu oblas oma (SH-SY5Y), ealizado du an e 3 y 5 días. En él, se obse ó que la iabilidad celula disminuyó con o me se ue inc emen ando la concen ación de GOQDs. También se ap ecia on di e encias en e los expe imen os ealizados du an e 3 y 5 días, ob eniendo una meno iabilidad celula en los ealizados du an e 5 días. Es os esul ados e lejan la in luencia de la concen ación de los GOQDs y del pe iodo de exposición en la iabilidad de las células SH-SY5Y. La pe dida de la iabilidad celula de las células neu onales (SH-SY5Y) en p esencia de los GOQDs se ha a ibuido al aumen o de la asa de apop osis, del Ca+2 in acelula y a la libe ación de ROS [39]. Respec o al al o ni el de Ca+2 in acelula , es e se enca ga ía de es imula la libe ación de neu o ansmiso es como el ácido glu ámico, po enciando así la exci abilidad de la espues a ne iosa y pos sináp ica. Los neu o ansmiso es supe luos gene ados se ían capaces de acumula se poco a poco en la hendidu a sináp ica, in luyendo nega i amen e en el c ecimien o y desa ollo neu onal. También hay que des aca que se ha comp obado que el empleo de GOQDs ecubie os de un ma e ial an ioxidan e (NAC) log a educi de mane a d ás ica es as al e aciones [40], e lejando así la impo ancia del es és oxida i o en la neu o oxicidad de es os nanoma e iales. Figu a 15: Es udio de la iabilidad celula de las células SH- SY5Y an e la exposición de dis in as concen aciones de GOQDs a 3 y 5 días 0 0,05 0,10 0,23 0,46 0,90 1,80 3,70 0 25 50 75 100 3 días 5 días Concen ación (mg/l) Viabilidad Celula (%) Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 27 A con inuación, se mues an los esul ados de oxicidad ob enidos en las células de neu oblas oma (SH-SY5Y) jun o con los ob enidos en las células neu onales a los 5 días de exposición con GOQDs (Figu a 16). A pa i del análisis de los esul ados, se ap eció una meno iabilidad celula en las células neu onales, e lejando una mayo sensibilidad a la oxicidad de los GOQDs po pa e de las células di e enciadas (neu onales) espec o a las no di e enciadas (SH-SY5Y). Es e hecho ocu ió en odas las concen aciones de GOQDs excep o a 3,7 mg/l. La anomalía en es e esul ado pudo es a elacionada con un e o en la medición, ya que, al abaja a al concen ación, el medio se encon aba bas an e sa u ado de GOQDs, lo que pudo da luga a alo es e óneos de abso bancia. Pa a pode comp ende es a di e encia, o os au o es analiza on la ac i idad celula de ambas células en p esencia de es e ipo de nanoma e ial du an e 48 ho as [41], obse ando que la ac i idad celula de las células di e enciadas se educe has a el 60% debida a la exposición, mien as que la de las células no di e enciadas se man iene en un 90%. Figu a 16: Compa ación de la iabilidad celula de las células SH-SY5Y con las células neu onales an e la p esencia de dis in as concen aciones de GOQDs a 5 días. 0 0,05 0,10 0,23 0,46 0,90 1,80 3,70 0 25 50 75 100 Neu o SH-SY5Y Concen ación (mg/l) Viabilidad Celula (%) Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 28 3.4 Es udio de la oxicidad inmunológica En p ime luga , se mues an los esul ados ob enidos del análisis de la p esencia de endo oxinas en las nanoma e iales GOQDs (Figu a 17). Jun o con el alo ob enido de los GOQDs, apa ece la ec a de calib ado, elabo ada de al o ma que se cub e odo el ango de concen aciones de endo oxinas. In e polando el esul ado ob enido en la ec a de calib ado, se pudo conoce si la mues a p esen a una baja o al a concen ación de endo oxinas. En es e caso, la concen ación de endo oxinas de ec ada en los GOQDs se encon ó muy p óxima al meno alo de la ec a de calib ado, po lo que se concluyó que la p esencia de endo oxinas en la mues a de GOQDs e a mínima. Figu a 17:Análisis de la p esencia de endo oxinas en la mues a de GOQDs. 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 Rec a de Calib ado GOQDs Abso bancia Concen ación endo oxinas (EU/ml) Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 29 Una ez que se conoció que no había p esencia de endo oxinas en el nanoma e ial, se analizó la oxicidad p oducida en los mac ó agos debida a la exposición con GOQDs du an e 5 días (Figu a 18). En dicho análisis, se obse ó que la iabilidad celula disminuyó con o me se inc emen ó la concen ación de GOQDs, has a alcanza un alo mínimo de 25% a la concen ación más al a de GOQDs (3,7 mg/l). Es os esul ados si ie on pa a e leja que los GOQDs gene an inmuno oxicidad y que es á inmuno oxicidad depende de la concen ación de GOQDs. Desde el pun o de is a del sis ema inmune, di e sas in es igaciones comp oba on que la capacidad de ensi a de los mac ó agos se e educida después de su exposición con GQDs, ya que se de ec o que su p esencia daba luga a una disminución signi ica i a en la can idad de ci ocinas in lama o ias, po lo que el a amien o con es e ipo de nanoma e iales inc emen a ía la suscep ibilidad de los mac ó agos an e es ímulos pos e io es [42]. De mane a más especi ica, se elacionó su p esencia con la ac i ación del ecep o del sis ema inmuni a io inna o TLR y la pos e io es imulación de la u a MAPK o NF-kB, inculadas a la modulación de la exp esión de dis in os genes, lo que gene a ía genes p oin lama o ios y simul áneamen e, desencadenando una espues a inmune [43]. Figu a 18: Es udio de la iabilidad celula de los mac ó agos an e la p esencia de dis in as concen aciones de GOQDs a 5 días 0 0,05 0,10 0,23 0,46 0,90 1,80 3,70 0 20 40 60 80 100 Concen ación (mg/l) Viabilidad Celula (%) Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 30 4 Conclusiones El abajo de in es igación desa ollado a lo la go del p esen e T abajo de Fin de Mas e se cen ó en el es udio de la oxicidad ambien al in i o e in i o p oducida po los ma e iales g a énicos, GOQDs. Los es udios de oxicidad ealizados pe mi ie on e alua la iabilidad de es os nanoma e iales g a énicos en aplicaciones biomédicas. Todos los GOQDs empleados ue on p e iamen e sin e izados y ca ac e izados en el labo a o io. Las p incipales conclusiones de es e abajo se des acan a con inuación: o Los GOQDs ob enidos a pa i de CNF median e el p oceso de oxidación/ex oliación esul a on es a co ec amen e sin e izados. La es a egia op-down seguida consigue un endimien o en peso de GOQDs (20-25%) supe io al del es o de es a egias op-down desc i as (10%). o A ni el de oxicidad ambien al in i o, la exposición aguda (5 días) a una concen ación de GOQDs de 37 mg/l en C.elegans no in luye ni en la le alidad ni en el desa ollo de los gusanos. Sin emba go, la exposición c ónica (25 días) a al concen ación de GOQDs si que ocasiona impo an es daños, llegando a ob ene una asa de supe i encia del 25% al cabo de los 25 días. o La oxicidad p oducida po los GOQDs en las dis in as líneas celula es (Hep G2, Caco-2, SH-SY5Y) depende an o del pe iodo de exposición como de la concen ación de los GOQDs, ob eniendo una mayo oxicidad a medida que se aumen an dichos pa áme os. o La línea celula Caco-2 p esen a una mayo esis encia a la oxicidad p oducida po los GOQDs, en compa ación con el es o de líneas celula es. Es a mayo esis encia se elaciona con la meno capacidad que end ían los GOQDs de a a esa la memb ana celula de las células Caco-2. o La compa ación de los esul ados de oxicidad ob enidos en e las líneas di e enciadas (neu onales) y no di e enciadas (SH-SY5Y) e idencia una mayo sensibilidad a la oxicidad p oducida po los GOQDs po pa e de las células di e enciadas. o El análisis de la oxicidad inmunológica e ela que la p esencia de los GOQDs en mac ó agos p oduce inmuno oxicidad y que es a inmuno oxicidad depende de la concen ación de GOQDs empleada. Juan José Calleje o Ma ín Memo ia 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 31 5 Bibliog a ía [1] And eas Hi sch “The e a o ca bon allo opes”, Na u e Ma e ials, 9 (2010). [2] H. W. K o o, J. R. Hea h, S. C. O’B ien, R. F. Cu l, “C60: Buckmins e ulle ene”, Na u e 318, 162-163 (1985). 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A1] Dónde: λ: longi ud de onda de los ayos X. n: o den de la di acción θ: ángulo en e los ayos inciden es y los planos de dispe sión d: dis ancia in e plana del c is al Figu a A2: P oceso de di acción de ayos X (XRD) [2] Juan José Calleje o Ma ín Anexos 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 4 2.3 Espec oscopia de o oelec ones emi idos po ayos X La écnica de espec oscopía o oelec ónica de ayos-X (XPS) consis e básicamen e en la exci ación median e un haz de ayos-X de los ni eles más in e nos de los á omos, p o ocando la emisión de o oelec ones que nos p opo cionan in o mación sob e la ene gía de cada ni el y, po an o, sob e la na u aleza de cada á omo emiso (Figu a A3). Pues o que la ene gía del haz es h , si el o oelec ón sale con una ene gía ciné ica EK, la di e encia en e ambas nos da la ene gía de ligadu a (EL) del á omo en pa icula , ca ac e ís ica de cada elemen o. Todo se esume a medi la elocidad de los elec ones emi idos median e el espec óme o. Pa a ello es necesa io abaja en condiciones de Ul a Al o Vacío UHV (ul a high acuum). Es o se consigue median e el uso de bombas u bo-molecula es y bombas iónicas apoyadas con acíos p e ios ob enidos po bombas o a o ias de acei e [3]. Figu a A3:Espec oscopia de o oelec ones emi idos po ayos X [3] Juan José Calleje o Ma ín Anexos 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 5 2.4 Análisis Elemen al. La écnica del análisis químico elemen al pe mi e de e mina el con enido o al de ca bono, hid ógeno, ni ógeno y azu e (C, H, N y S) p esen e en mues as o gánicas e ino gánicas, an o sólidas como líquidas, que no posean calcio ni ós o o. Es os análisis pe mi en la de e minación del con enido de es os elemen os en las mues as es udiadas, lo que es esencial pa a la de e minación de la composición química de los ma e iales. El análisis elemen al de C, H, N y S se basa en la ola ilización de una mues a po combus ión o al en a mós e a de oxígeno pu o, libe ándose los elemen os a medi en o ma de CO2, H2O, NOx y SOx, espec i amen e. Un p oceso pos e io de educción ans o ma los NOx y SOx en N2 y SO2, espec i amen e. Todos los gases así o mados (CO2, H2O, N2 y SO2) son analizados cuan i a i amen e en un de ec o (Figu a A4). Equipamien o Los análisis se lle an a cabo en un analizado elemen al. La mues a se oxida po comple o y de mane a ins an ánea ans o mando odos los compues os p esen es en p oduc os de combus ión. Los gases de combus ión esul an es son en iados a un ubo de educción median e un caudal de 250 cm3/min de gas po ado (He) y pos e io men e son sepa ados selec i amen e en columnas especí icas. Finalmen e, los gases son deso bidos é micamen e e in oducidos de o ma sepa ada a un de ec o de conduc i idad é mica que p opo ciona una señal p opo cional a la concen ación de cada uno de los componen es indi iduales de la mues a. Figu a A4: De ec o empleado pa a el análisis elemen al Juan José Calleje o Ma ín Anexos 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 6 3 Anexo III: Ma e iales y mé odos 3.1 Cul i o y sinc onización C.elegans Los gusanos C. elegans se cul i a on en placas de aga NGM con kanamicina 50 µg/ml y es ep omicina 100 µg/ml. Se u ilizó E. Coli OP50 como uen e de alimen o y se gua da on en una es u a a 20 0C . La sinc onización comenzó con el la ado de es placas de aga NGM de 100 mm con 6 ml del ampón M9 (Na2HOP4, 6g; NaCl, 5g; KH2PO4, 3g; H2O des ilada, 1l y 1 ml de MgSO4 1M), cada una. La suspensión de gusanos en ampón M9 ob enida se ans i ió a ubos Falcon de 15 ml. Se pueden usa 4 ml más de M9 con el obje i o de despega los hue os de las placas de aga NGM. La suspensión se cen i ugó a 650 pm du an e 2 minu os y el sob enadan e se desechó has a que quedan 2 ml en el ubo Falcon de 15 ml. A con inuación, se añadió la solución de lejía que con iene NaOH y NaClO a los gusanos pa a alcanza un olumen inal de 4 ml y las concen aciones inales de NaOH y NaClO de 0,25% y 1%, espec i amen e. La solución de NaClO debe p epa a se dia iamen e debido a la pé dida de e ec i idad. Los gusanos con la disolución de lejía se agi a on en ó ex du an e 10 segundos y se omó una alícuo a pa a e i ica si se había conseguido elimina los gusanos i os empleando un mic oscopio de disección. Si se man ienen los gusanos i os o la cu ícula de la mayo ía de los gusanos no se ha o o se pod ía ol e a u iliza el ó ex, ealizando o eos de 10 segundos has a un iempo máximo de con ac o de 6 minu os. También es posible que se necesi e una mayo concen ación de NaOH pa a pode ompe la cu ícula si la suspensión con iene demasiados gusanos. Obse a los gusanos de mane a egula en un mic oscopio de disección p opo ciona la mejo in o mación pa a sabe cuándo se debe de ene el p oceso. Una ez ob enidas las condiciones necesa ias, el ubo Falcon de 15 ml se llenó con ampón M9 y se cen i uga 2 minu os a 650 pm y se epi ió es e p oceso de la ado dos eces con el obje i o de elimina el máximo con enido de la solución de lejía. El sob enadan e del la ado con M9 se desechó has a que solo quedan 0,5 ml en el ubo. El sedimen o de hue os se esuspendió y se colocó en una placa de aga NGM sin E. Coli OP50 pa a pe mi i que los hue os eclosionen y educi así las di e encias de desa ollo en las nue as la as debido a la di e en e edad de los hue os. T anscu idas 24h se añadió E. Coli OP50 a la placa de aga NGM y se gua dó en una es u a a 25 0C. Juan José Calleje o Ma ín Anexos 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 7 3.2 Cul i os celula es 3.2.1 Man enimien o de los cul i os celula es El cul i o u ina io de las dis in as líneas celula es se ealizó u ilizando ascos de cul i o de 25 cm2 (TPP) con apón con il o, en un olumen ap oximado de 5ml, las células se semb a on con una densidad inicial de 4*104 células/ml. Una ez alcanzadas las densidades de sa u ación a es as condiciones, se es ablecie on sub-cul i os de i ados de los iniciales. Pa a ello, las células se despega on median e incubación con ipsina/EDTA a 37 oC du an e 5 minu os. Una ez anscu ido es e pe iodo, con el in de inac i a la ipsina se añadie on 5 ml de medio esco con sue o, y las células se ans i ie on a ubos de ondo cónico pa a de e mina así el núme o de células y su iabilidad. El olumen ob enido se cen i ugó du an e 5 min a 1200 pm en una cen i uga Beckman and Coul e (Ro o SX4750A), se eliminó el sob enadan e y las células se esemb a on en medio esco o bien, se u iliza on pa a lle a a cabo los di e en es expe imen os. 3.2.2 Congelación y descongelación de las líneas celula es Pa a el p oceso de congelación se oma on 107 células que as se cen i ugadas (1200 pm x 5 min) y elimina el sob enadan e, se esuspendie on en 1 ml de medio DMEM comple o con 10% de dime ilsul óxido (DMSO) y se ans asa on a un c io ubo de congelación es é il. Es os iales se congela on a menos 800C has a su u ilización. Po o o lado, pa a el p oceso de descongelación el c io ubo donde se encuen an las células se dejó a empe a du an e 1 minu o en la campana de lujo lamina . Una ez anscu ido es e pe iodo, la suspensión celula se as asa a un ubo alconTM p epa ado p e iamen e con 5 ml de medio DMEM comple o. La suspensión se cen i ugó a 1200 pm du an e 5 minu os, se eliminó el sob enadan e y el pelle se esuspendió en 5 ml de medio esco DMEM. 3.2.3 De e minación de la densidad celula La de e minación de la densidad celula se ealizó median e la inción con Azul de T ipán (Sigma), colo an e que es capaz de pene a en las células mue as que ienen memb ana plasmá ica dañada iñéndolas de colo azul. Las células i as, que no pie den la in eg idad de la memb ana plasmá ica, no se iñen. El ecuen o se ealizó mezclando 50 µl de una de e minada suspensión celula y 50 µl de Azul de T ipan, la mezcla se colocó sob e una cáma a de Neubaue y se ealizó el ecuen o celula en un mic oscopio óp ico (Op ipho , Nikon). Juan José Calleje o Ma ín Anexos 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 8 Ø La densidad celula se de e minó median e la siguien e o mula: 𝐷𝐶 # 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑚𝑙 + =𝑁°/𝑑𝑒/𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑣𝑖𝑣𝑎𝑠∗𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟/𝑑𝑒/𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛∗10= 𝑁°/𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠/𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠 DC: Densidad celula 104: Ajus e al amaño de la cáma a Fac o de dilución: 2 (mezcla 50µl + 50µl 3.3 Ob ención de mac ó agos Los medios u ilizados pa a la ob ención de los mac ó agos ue on los siguien es: Ø Medio Roswell Pa k Memo ial Ins i u e (RPMI) 1640 (Gibco) suplemen ado con 1% de sue o humano AB inac i ado y il ado, L-glu amina 2mM y an ibió ico (penicilina 1000 U/ml y es ep omicina 100 µg/ml). Ø Medio RPMI 1640 (Gibco) suplemen ado con 10% ( / ) de SFB descomplemen ado, 1% de L-glu amina 2 mM y 1% de an ibió ico (penicilina 100 U/ml y es ep omicina 100 µg/ml): RPMI comple o. El ac o de c ecimien o u ilizado en el p o ocolo: Ø GM-CSF: Recombinan Human G anulocy e-Mac ophage Colony S imula ing Fac o . Ac i idad biólogica: 0,02-0,1 ng/ml. El sue o u ilizado en los expe imen os ealizados con células humanas se descomplemen ó pa a e i a la lisis de las células po el sis ema del complemen o. Pa a ello, se a ó du an e 30 minu os a 56 0C y anscu ido es e iempo se cen i ugo a 1000 pm du an e 15 minu os. El sob enadan e ue ecogido en un ubo de ondo cónico y se congeló has a su uso. El p o ocolo de ob ención de mac ó agos se inició ealizando una cen i ugación en g adien e de Ficoll pa iendo de una capa leucoci a ia o “bu y coa ” p oceden e del Banco de Sang e y Tejidos de A agón. Se a a de una écnica de cen i ugación po g adien e de densidad pa a sepa a células mononuclea es del es o de células sanguíneas (Figu a A5). Juan José Calleje o Ma ín Anexos 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 9 Figu a A5: Imagen ilus a i a del esul ado inal que se ob iene a pa i de la écnica Ficoll-HyPaque, donde puede obse a se la o mación de las di e en es capas celula es en unción de su densidad. La sang e o al se diluyó en p opo ción 1:1 en ampón os a o salino PBS (NaCl, K2HPO4, KH2PO4) se omó un olumen adecuado pa a una p opo ción 2:1 con el eac i o Ficoll-Hypaque (GE Heal hca e) y la sang e diluida se deposi ó sua emen e sob e el Ficoll pa a man ene la in e ase. Se cen i ugó sin eno du an e 20 min a 1000 pm y luego se ecolec ó la in e ase, es deci , la capa de células mononuclea es de sang e pe i é ica (PBMCs). Se hicie on 3 la ados con ampón PBS y se añadió medio RPMI comple o. Se omó una alícuo a de la suspensión celula pa a de e mina la densidad y iabilidad celula median e inción con Azul de T ipán, el pelle celula se esuspendió a una concen ación inal de 2,5*106 células/ml con medio RPMI+ sue o humano AB y se cul i a on las células en una placa de Pe i du an e 2 ho as a 37 oC. Finalmen e, después de ealiza o a se ie de la ados con ampón PBS a empe ado, se añadió medio RPMI comple o jun o con el ac o de c ecimien o GM-CSF (In i ogen) a una concen ación de 0,1 ng/ml. El cul i o celula se man u o du an e 6 días pa a comple a la di e enciación de los monoci os a mac ó agos (Figu a A6) en un incubado e mos a izado (He aeus Cell) a 37 oC, en ai e sa u ado de humedad y con un 5% de CO2. Juan José Calleje o Ma ín Anexos 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 10 Figu a A6: Imágenes del cul i o celula de mac ó agos ob enidos en el labo a o io 3.4 Espec o o ome ía La espec o o ome ía es una écnica analí ica que pe mi e de e mina la concen ación de un compues o en solución (Figu a A7). Se basa en que las moléculas abso ben las adiaciones elec omagné icas y a su ez que la can idad de luz abso bida depende de o ma lineal de la concen ación (Ley de Lambe -Bee ). El undamen o de la espec oscopía se debe a la capacidad de las moléculas pa a abso be adiaciones, en e ellas las adiaciones den o del espec o UV- isible. Las longi udes de onda de las adiaciones que una molécula puede abso be y la e iciencia con la que se abso ben dependen de la es uc u a a ómica y de las condiciones del medio (pH, empe a u a, ue za iónica, cons an e dieléc ica), po lo que dicha écnica cons i uye un alioso ins umen o pa a la de e minación y ca ac e ización de biomoléculas. Pa a hace es e ipo de medidas se emplea un espec o o óme o [4]. Aunque pueden a ia en diseño, en especial con la inco po ación de o denado es pa a el análisis de da os, odos los espec o o óme os cons an, según se indica en la igu a, de: 1. Una uen e de ene gía adian e: lámpa a de deu e io y ungs eno. 2. Un monoc omado pa a la selección de adiaciones de una de e minada longi ud de onda: il os, p ismas, edes de di acción. 3. Un compa imen o donde se aloja un ecipien e anspa en e (cube as o ubos) que con enga la mues a Pueden se de id io, cua zo o plás ico anspa en e. Pa a medi en Juan José Calleje o Ma ín Anexos 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 11 UV se deben usa las de cua zo o sílice undido, po que el id io no ansmi e la adiación UV. 4. Un de ec o de luz y un ampli icado con e ido de las señales luminosas en señales eléc icas. 5. Un egis ado o sis ema de lec u a de da os. Figu a A7: Esquema de un espec o o óme o [4] 3.4.1 Ley de Lambe -Bee La Ley de Lambe -Bee exp esa la elación en e abso bancia de luz monoc omá ica ( de longi ud de onda ija) y la concen ación de un c omó o o en solución: 𝐴=𝑙𝑜𝑔 𝑙 𝑙@=𝜀∗𝑐∗𝑙 Juan José Calleje o Ma ín Anexos 01/09/2020 Escuela de Ingenie ía y A qui ec u a (Uni e sidad de Za agoza) Página 12 La abso bancia de una solución es di ec amen e p opo cional a su concen ación – a mayo núme o de moléculas mayo in e acción de la luz con ellas-; ambién depende de la dis ancia que eco e la luz po la solución a igual concen ación, cuan o mayo dis ancia eco e la luz po la mues a más moléculas se encon a á-; y po úl imo, depende de e, una cons an e p opo cionalidad -denominada coe icien e de ex inción- que es especí ica de cada c omó o o. Como A es adimensional, las dimensiones de e dependen de las de c y l. La segunda magni ud (l) se exp esa siemp e en cm mien as que la p ime a ( c ) se hace, siemp e que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de e esul an se M-1.cm-1. Es e coe icien e así exp esado, en é minos de unidades de concen ación mola (o un submúl iplo ap opiado), se denomina coe icien e de ex inción mola (εM). La ley de Lambe -Bee se cumple pa a soluciones diluidas; pa a alo es de c al os, ε a ía debido a enómenos de dispe sión de la luz, ag egación de moléculas, cambios del medio, e c. 3.5 De e minación de la longi ud de onda pa a el ensayo de oxicidad in i o En la Figu a A8 se mues a el análisis de la abso bancia de dis in as concen aciones de GOQDs a dis in as longi udes de onda. Pa a que no in e accione con los esul ados del ensayo de oxicidad se necesi a emplea una longi ud de onda a la cual la abso bancia p oducida po los p opios GOQDs sea mínima. En es e caso, la concen ación máxima empleada en los ensayos de oxicidad es de 3,7 mg/l, po lo que a pa i de los 500 l ya se es a ía en un alo de abso bancia p óximo al 0. Como se iene que elegi un alo conc e o, en es e caso, se ha decidido abaja a una longi ud de onda de 570 l, debido a que el espec o o óme o ya se encuen a con igu ado pa a ealiza la medición a esa longi ud de onda.