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Repositorio Institucional de Documentos

Abstract

La enfermedad de Fabry (EF) es una patología lisosomal ligada al cromosoma X, debida al acúmulo de lípidos complejos (globotriaosilceramida principalmente) por un déficit de la enzima α-galactosidasa A (α-Gal A). La incidencia varía en los estudios de hipertrofia de ventrículo izquierdo (HVI). El objetivo es analizar la incidencia de la EF en pacientes con HVI de origen desconocido y realizar el estudio molecular y epidemiológico de las variantes genéticas identificadas. Se llevó a cabo un estudio multicéntrico seguido de una valoración transversal de las historias clínicas. Se determinó la α-Gal A en muestra de gota de sangre seca. Todas las mujeres, y los varones cuya α-Gal A normalizada≤70%, se les analizó el gen GLA mediante electroforesis capilar. Los pacientes en los que se identificaron variantes genéticas fueron más ampliamente estudiados. Se estudiaron 367 sujetos. El patrón de HVI más común fue el concéntrico (42%). Se secuenciaron todas las mujeres y el 26,9% de los varones, identificándose variantes en ambos géneros (11,4% mujeres; 4,9% varones): NP_000160.1:p.Ser126Gly relacionada con actividad residual, el alelo de pseudo-deficiencia NP_000160.1:p.Asp313Tyr y 3 variantes de significado incierto (VSI). 49 pacientes mostraron variantes en el promotor y/o intrones. Tras el análisis in silico de las 3 VSI, la variante NM_000169.2:c.192C>T se consideró como potencialmente patogénica, aun así, se realizó caracterización funcional de las 3 VSI mediante determinación de actividad enzimática en plasma y extracto leucocitario, estudio de grandes reordenamientos génicos, estudio de EMSA, estudio de transcritos alternativos mediante electroforesis y cuantificación de marcadores biológicos subrogados en plasma y orina. Los resultados obtenidos de estos estudios no permitieron confirmar la patogenicidad de ninguna de las 3 VSI, incluso de NM_000169.2:c.192C>T a pesar de los resultados obtenidos in silico. Se realizó un estudio de segregación haplotípica para el resto de variantes identificadas en el estudio genético, estableciendo como mayoritarios 3 haplotipos compuestos por variantes en regiones no codificantes (haplotipo complejo intrónico, HCI). Previa a la caracterización funcional de los HCI se realizó un estudio de asociación estadística de todos los marcadores genéticos que formaban parte de los HCI vs la actividad α-Gal A en gota de sangre seca; una vez se realizó este estudio, se procedió a caracterizar funcionalmente los HCI mediante determinación de actividad enzimática en plasma y extracto leucocitario, estudio de grandes reordenamientos génicos, secuenciación de regiones no codificantes del gen GLA, estudio de EMSA, estudio de transcritos alternativos mediante electroforesis, estudio de la expresión génica, cuantificación de marcadores biológicos subrogados en plasma y orina y cuantificación del acúmulo intracelular de sustratos mediante técnicas de inmunohistoquímica. Los resultados obtenidos de estos estudios indicaron que tan solo el HCI tipo I mostró una reducción significativa de la actividad α-Gal A en gota de sangre seca. Se identificaron nuevos marcadores genéticos en regiones intrónicas profundas tanto en HCI tipo I como tipo III. No se observó niveles elevados de biomarcadores en plasma y orina. No se identificaron reordenamientos patogénicos en el gen GLA. La actividad enzimática de α-Gal A en extracto leucocitario se encontraba significativamente reducida en los pacientes con HCI tipo I, observándose también en ellos una reducción de la expresión del gen GLA y un acúmulo intracelular de manera difusa de globotriaosilceramida a partir de los estudios realizados en cultivo primario de fibroblastos. La incidencia de la EF en nuestro estudio fue nula, sin embargo, se identificaron 3 VSI y varios HCI. El HCI tipo I mostró una reducción significativa de la actividad enzimática, regulación a la baja de la expresión del gen GLA y acúmulo intracelular de sustrato.<br /> <br /> Cebolla Sanz, Jorge Javier; Gervas Arruga, Javier; Pocovi Mieras, Miguel

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Repositorio Institucional de Documentos

Publisher: Universidad de Zaragoza, Prensas de la Universidad
Year: 2019
Source: https://zaguan.unizar.es/record/99372/files/TESIS-2021-052.pdf
2021
52
Jo ge Ja ie Cebolla Sanz
Es udio Epidemiológico y uncional
de a ian es en el gen GLA, en
pacien es con mioca diopa ía
hipe ó ica de en ículo izquie do
de o igen desconocido
Depa amen o
Di ec o /es
Bioquímica y Biología Molecula y Celula
Ge as A uga, Ja ie
Poco i Mie as, Miguel
© Uni e sidad de Za agoza
Se icio de Publicaciones
ISSN 2254-7606
Jo ge Ja ie Cebolla Sanz
ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO Y FUNCIONAL DE
VARIANTES EN EL GEN GLA, EN PACIENTES CON
MIOCARDIOPATÍA HIPERTRÓFICA DE
VENTRÍCULO IZQUIERDO DE ORIGEN
DESCONOCIDO
Di ec o /es
Bioquímica y Biología Molecula y Celula
Ge as A uga, Ja ie
Poco i Mie as, Miguel
Tesis Doc o al
Au o
2019
Reposi o io de la Uni e sidad de Za agoza – Zaguan h p://zaguan.uniza .es
UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
TESIS DOCTORAL
ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO Y FUNCIONAL DE VARIANTES EN EL
GEN GLA, EN PACIENTES CON MIOCARDIOPATÍA HIPERTRÓFICA
DE VENTRÍCULO IZQUIERDO DE ORIGEN DESCONOCIDO.
JORGE JAVIER CEBOLLA SANZ
2019

D. MIGUEL POCOVÍ MIERAS, Doc o en Ciencias Químicas, ca ed á ico del Depa amen o de
Bioquímica, Biología Molecula y Celula de la Uni e sidad de Za agoza, y
D. JAVIER GERVÁS ARRUGA, Doc o en Bioquímica y Biología Molecula ,
Di ec o es de es a Tesis Doc o al,
CERTIFICAN:
Que la memo ia de Tesis Doc o al i ulada: “Es udio epidemiológico y uncional de las a ian es
en el gen GLA, en pacien es con mioca diopa ía hipe ó ica de en ículo izquie do de o igen
desconocido”, p esen ada po D. Jo ge Ja ie Cebolla Sanz, ha sido ealizada en el Depa amen o
de Bioquímica, Biología Molecula y Celula de la Uni e sidad de Za agoza bajo su di ección, y
que eúne los equisi os pa a se p esen adas po su au o pa a op a al G ado de Doc o po la
Uni e sidad de Za agoza.
Za agoza, 30 de sep iemb e de 2019
D. Miguel Poco í Mie as D. Ja ie Ge ás A uga
“En las cenizas del acaso es á la sabidu ía”
Ama al (Canción: Robin Hood, Álbum: Hacia lo sal aje, 2011)
Tú e es mi α y mi Ω
A.C.G. + E.G.A

ÍNDICES
I
ÍNDICE PÁGINAS
Índice de Páginas
1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1
1.1 ANTECEDENTES HISTÓRICOS ................................................................................................. 2
1.2 PREVALENCIA .................................................................................................................... 3
1.2.1 C ibado neona al ....................................................................................................... 4
1.2.2 Poblaciónes de iesgo. ............................................................................................... 4
1.3 PATOGENIA ....................................................................................................................... 6
1.3.1 Sus a os acumulados ............................................................................................... 6
1.3.2 Fisiopa ología gene al ............................................................................................... 7
1.4 ESTRUCTURA DE LA Α-GALACTOSIDASA A HUMANA .................................................................. 8
1.5 GENÉTICA MOLECULAR ..................................................................................................... 10
1.5.1 Pa ón de he encia .................................................................................................. 11
1.5.2 Espec o mu acional ................................................................................................ 11
1.5.3 Co elación geno ipo- eno ipo ................................................................................ 14
1.5.4 La EF en las muje es. Bases gené icas y molecula es. ............................................. 14
1.6 SIGNOS Y SÍNTOMAS DE LA EF ............................................................................................ 16
1.6.1 Sín omas p ecoces de la EF ..................................................................................... 17
1.6.2 Mani es aciones enales ......................................................................................... 19
1.6.3 Mani es aciones ca díacas ...................................................................................... 20
1.6.4 Mani es ación ce eb o ascula ............................................................................... 21
1.6.5 O as mani es aciones ............................................................................................. 22
1.7 DIAGNÓSTICO ................................................................................................................. 22
1.7.1 Bioma cado es ........................................................................................................ 23
1.7.2 Diagnós ico enzimá ico ........................................................................................... 24

II
ÍNDICE PÁGINAS
1.7.3 Análisis mu acional .................................................................................................. 26
1.7.4 O os mé odos. ....................................................................................................... 27
1.8 TRATAMIENTO ................................................................................................................. 27
1.8.1 Te apia enzimá ica sus i u i a ................................................................................ 28
1.8.2 Te apia con chape onas molecula es...................................................................... 29
1.8.3 Nue as ap oximaciones e apéu icas ..................................................................... 31
2 HIPÓTESIS .................................................................................................................. 35
3 OBJETIVOS ................................................................................................................. 35
4 MATERIALES Y METODOLOGÍA ................................................................................... 39
4.1 PACIENTES Y CONTROLES ................................................................................................... 39
4.2 DISEÑO DEL ESTUDIO ........................................................................................................ 41
4.3 ESTUDIO ECOCARDIOGRÁFICO ............................................................................................ 41
4.4 EXTRACCIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE PARA LOS ESTUDIOS A REALIZAR EN DBS ........................ 42
4.5 EXTRACCIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE PARA LOS ESTUDIOS A REALIZAR EN PLASMA, CONCENTRADO
DE LEUCOCITOS, DNA Y RNA ........................................................................................................... 43
4.6 OBTENCIÓN DE MUESTRA DE ORINA PARA ESTUDIO DE MARCADORES EF ................................... 44
4.7 OBTENCIÓN DE UN CONCENTRADO DE LEUCOCITOS A PARTIR DE SANGRE PERIFÉRICA ................... 44
4.8 AISLAMIENTO DEL DNA GENÓMICO .................................................................................... 45
4.8.1 P oceden e de mues as de DBS ............................................................................. 45
4.8.2 P oceden e de mues as de sang e enosa ............................................................ 46
4.9 AISLAMIENTO DEL RNA TOTAL ........................................................................................... 47
4.10 ANÁLISIS DE CONCENTRACIÓN, PUREZA Y PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS AISLADOS (DNA
GENÓMICO Y RNA TOTAL) ............................................................................................................. 48
4.10.1 Concen ación y pu eza del DNA genómico aislado de sang e enosa .............. 48
4.10.2 Pu i icación del DNA genómico aislado de sang e enosa.................................. 48
4.10.3 Concen ación y pu eza del RNA o al: ............................................................... 49
III
ÍNDICE PÁGINAS
4.10.4 Pu i icación del RNA o al ................................................................................... 49
4.10.5 De e minación de la in eg idad del RNA o al .................................................... 49
4.11 DETERMINACIÓN DE MARCADORES BIOLÓGICOS SUBROGADOS A LA EF ..................................... 50
4.11.1 De e minación de la concen ación de Gb3 en o ina .......................................... 50
4.11.2 De e minación de la concen ación de Liso-Gb3 en plasma ............................... 51
4.12 MEDIDA DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA Α-GALACTOSIDASA A ................................................ 53
4.12.1 Medida de la ac i idad enzimá ica en mues as de go a de sang e seca ........... 53
4.12.2 Medida de la ac i idad enzimá ica en mues as de plasma K2EDTA .................. 54
4.12.3 Medida de la ac i idad enzimá ica en concen ado de leucoci os ..................... 54
4.13 ANÁLISIS MOLECULAR DEL GEN GLA. SECUENCIACIÓN CAPILAR. ............................................... 55
4.13.1 Ampli icación median e PCR de las egiones codi ican es del gen GLA .............. 57
4.13.2 Ampli icación median e PCR de las egiones no codi ican es del gen GLA ........ 59
4.13.3 Pu i icación del p oduc o de PCR ........................................................................ 60
4.13.4 Reacción de secuenciación de Sange , elec o o esis capila y análisis de
secuencias ........................................................................................................................... 61
4.14 ANÁLISIS MOLECULAR DEL GEN GLA. ESTUDIOS DE REORDENAMIENTOS. ................................... 62
4.15 ESTUDIOS BIOINFORMÁTICOS DE LAS VARIANTES GENÉTICAS IDENTIFICADAS ............................... 64
4.16 ANÁLISIS DE VARIANTES EN REGIÓN REGULADORA 5’-UTR ...................................................... 65
4.17 ANÁLISIS DE VARIANTES EN REGIÓN NO CODIFICANTE (INTRONES) ............................................ 66
4.17.1 Sín esis de cDNA o al ......................................................................................... 66
4.17.2 Ampli icación del cDNA del gen GLA ................................................................... 68
4.17.3 Ca ac e ización elec o o é ica del cDNA especí ico del gen GLA ...................... 69
4.17.4 Análisis molecula del cDNA del gen GLA. Secuenciación capila . ...................... 70
4.18 GENOTIPADO POBLACIONAL DE LAS VARIANTES EN REGIÓN REGULADORA Y NO CODIFICANTE. ....... 71
4.19 ESTUDIOS CUANTITATIVOS DE LA EXPRESIÓN DEL GEN GLA ..................................................... 72
4.19.1 De e minación de la e iciencia ciné ica de la eacción de qPCR ......................... 74
IV
ÍNDICE PÁGINAS
4.19.2 No malización de los da os de exp esión génica de e minados median e qPCR75
4.19.3 Cuan i icación ela i a de la exp esión génica .................................................... 76
4.20 DETERMINACIÓN DEL ACÚMULO INTRACELULAR DE SUSTRATO ................................................. 76
4.20.1 Modelo in i o de acúmulo lisosomal ................................................................ 76
4.20.2 Cuan i icación del acúmulo de galac oes ingolípidos en los pacien es .............. 77
4.21 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Y EPIDEMIOLÓGICO ............................................................................ 77
4.21.1 Análisis es adís ico gene al ................................................................................. 77
4.21.2 Es udio epidemiológico y de la seg egación ....................................................... 78
5 RESULTADOS .............................................................................................................. 81
5.1 DESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA DE ESTUDIO ........................................................................... 81
5.2 ACTIVIDAD DE Α-GAL A EN DBS Y ESTUDIO MOLECULAR DEL GEN GLA ..................................... 83
5.3 ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO DE LAS VARIANTES IDENTIFICADAS EN EL GRUPO DE SECUENCIACIÓN ... 88
5.4 ESTUDIO DE CARACTERIZACIÓN DE NM_000169.2:C.-34C>T; NM_000169.2:C.192C>T;
NM:000169.2:C.640-25A>G ..................................................................................................... 90
5.4.1 Es udio Bioin o má ico ............................................................................................ 90
5.4.2 Es udio en gel de e a do. “Elec opho e ic Mobili y Shi Assay” ......................... 91
5.4.3 Análisis enzimá ico en mues a de plasma y leucoci os de los pacien es 1,2 y 3 ... 92
5.4.4 De e minación de Gb3 en o ina y Liso-Gb3 en plasma de los pacien es 1, 2 y 3. .... 93
5.4.5 Ca ac e ización elec o o é ica en gel de poliac ilamida al 6% del pacien e 2 ...... 94
5.4.6 Iden i icación de ansc i os al e na i os median e secuenciación del cDNA
comple o del gen GLA en los pacien es 1, 2 y 3 .................................................................. 95
5.4.7 Pe il de eo denamien os en el gen GLA de los pacien es 1, 2 y 3 ........................ 95
5.5 ESTUDIO DE CARACTERIZACIÓN DE VARIANTES QUE FORMAN HAPLOTIPOS COMPLEJOS ................ 97
5.5.1 Análisis enzimá ico en mues a de plasma y leucoci os de los pacien es con
haplo ipos complejos .......................................................................................................... 97
5.5.2 De e minación de Gb3 en o ina y Liso-Gb3 en plasma de los pacien es con haplo ipos
complejos ............................................................................................................................ 98
V
ÍNDICE PÁGINAS
5.5.3 Ca ac e ización elec o o é ica en gel de poliac ilamida al 6% de los pacien es con
haplo ipos complejos .......................................................................................................... 98
5.5.4 Iden i icación de ansc i os al e na i os median e secuenciación del cDNA
comple o del gen GLA en los pacien es con haplo ipos complejos .................................... 99
5.5.5 Pe il de eo denamien os en el gen GLA de los pacien es con haplo ipos complejos
99
5.5.6 Análisis de la exp esión génica de los pacien es median e qPCR ......................... 100
5.5.7 Iden i icación de nue as a ian es en la egión 5’-UTR y en los in ones del gen GLA
en pacien es con haplo ipos complejos. ........................................................................... 102
5.6 CUANTIFICACIÓN DEL ACÚMULO DE SUSTRATO EN CULTIVOS CELULARES DE PACIENTES CON HCI I 106
5.6.1 Con i mación de la alidez del modelo in i o de acúmulo lisosomal ................. 106
5.6.2 De e minación del acúmulo lisosomal de galac olípidos en las células de los
pacien es con HCI I ............................................................................................................ 107
6 DISCUSIÓN ............................................................................................................... 111
7 CONCLUSIONES ........................................................................................................ 119
8 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 123
ANEXO A: PUBLICACIONES REALIZADAS DURANTE LA TESIS EN LA ENFERMEDAD DE FABRY . A
ANEXO B: PUBLICACIONES REALIZADAS DURANTE LA TESIS EN OTRAS ENFERMEDADES DE
DEPÓSITO LISOSOMAL ........................................................................................................ B
XII
ÍNDICE TABLAS
Índice de Ecuaciones
Ecuación 4.1. Cálculo de pu eza de los ácidos nucleicos. ........................................................... 48
Ecuación 4.2. Cálculo de la e iciencia ciné ica de la eacción de qPCR. ...................................... 75
Ecuación 4.3. Algo i mo empleado en la no malización de los da os de exp esión génica
de e minados po qPCR. ............................................................................................................. 76
Ecuación 4.4.Algo i mo empleado en el cálculo de la exp esión del gen GLA median e qPCR. . 76

XIII
ACRÓNIMOS
Ac ónimos
α-Gal A Al a galac osidasa A
λ Longi ud de onda
4-MU 4-me ilumbeli e ona
4-MU-Gal 4-me ilumbeli e il-α-D-galac opi anósido
A Ampe io
Abs Abso bancia
ACMG Ame ican College o Medical Gene ics
AEM Agencia Eu opea del Medicamen o
AF Ácido Fó mico
APS Pe sul a o amónico
B -E B omu o de e idio
cDNA DNA complemen a io
CR Cuan i icación ela i a de la exp esión génica
C Ciclo Umb al
DBS Go a de sang e seca
ddH2O Agua ul apu a lib e de DNAasas/RNAasas
DE Des iación es ánda
dNTP deoxi-nucleó ido- i- os a o
DGJ 1-deoxigalac onoji imicina
dH2O Agua desionizada es é il
ddNTP di-deoxi-nucleó idos- i- os a o
DMEM Dubelco’s Modi ied Eagle’s Medium
DNA Ácido desoxi ibonucleico
XIV
ACRÓNIMOS
DNAp DNA polime asa
E E iciencia de la eacción de qPCR
EDTA Ácido e ilendiamino e aacé ico
EE Es ánda ex e no
EF En e medad de Fab y
EG En e medad de Gauche
EI Es ánda in e no
EM Espec ome ía de masas
EMSA Elec opho e ic Mobili y Shi Assay
ER Re ículo endoplásmico
ERAD Deg adación asociada al e ículo endoplásmico
ERC En e medad enal c ónica
E OH E anol
EVI Espeso del sep o en icula y/o pa ed en icula izquie da pos e io
ExM Algo i mo de expec ación-maximización
FOS Fab y Ou come Su ey
FRET T ans e encia de ene gía de esonancia de esonancia de Fö s e
g Fue za de la g a edad
Gb3 Globo iaosilce amida
GCS Glucosilce amida sin asa
GFR Tasa de il ado glome ula
H2O Agua
HCI Haplo ipo complejo in ónico
HCl Ácido Clo híd ico
HSF Human Splicing Finde
XV
ACRÓNIMOS
HTA Hipe ensión a e ial
HVI Hipe o ia en icula izquie da
IVS In ón
kb Kilobase
m Masa
MeOH Me anol
MHVI Mioca diopa ía hipe ó ica de en ículo izquie do
Mg2Cl Clo u o de magnesio
MIM Mendelian Inhe i ance in Man
MLPA Mul iplex Liga ion-dependen P obe Ampli ica ion
mRNA RNA mensaje o
Ø Diáme o
PAGE Elec o o esis en gel de poliac ilamida
pb Pa es de bases
PCR Reacción en cadena de la polime asa
PM Masa molecula
qPCR Reacción en cadena de la polime asa cuan i a i a
R2 Coe icien e de de e minación
RFLP Polimo ismo de longi ud de agmen os de es icción
RNA Ácido ibonucleico
pm Re oluciones po minu o
RT-PCR PCR de e o ansc ipción
SD Sonda De echa
SFB Sue o Fe al Bo ino
SI Sonda Izquie da
XVI
ACRÓNIMOS
SNC Sis ema ne ioso cen al
SNP Polimo ismo de un solo nucleó ido
SSPNN Splice Si e P edic ion by Neu al Ne wo k
TAE T is-Ace a o-EDTA
TBE T is-Bo o-EDTA
TCM T iclo ome ano
TE T is-Clo híd ico-EDTA
TEMED N,N,N,N’- e ame ilendiamina
TES Te apia enzimá ica sus i u i a
TNFα Fac o de nec osis umo al al a
TRS Te apia de educción de sus a o
UI Unidades in e nacionales
UTR Región genómica no aducida
UV Ul a- iole a
V Vol io
Volumen
VUS Va ian e de signi icado incie o
W Va io
XVII
ENLACES
Enlaces
A an i Pola Lipids h ps://a an ilipids.com/
ClinVa h ps://www.ncbi.nlm.nih.go /clin a /
dbSNP h ps://www.ncbi.nlm.nih.go /snp/
Google h ps://www.google.es/
HGMD h ps://www.hgmd.c .ac.uk
HGSV h ps://www. a nomen.hg s.o g
HSF h p://www.umd.be/HSF3/
LOVD h ps://www.lo d.nl/3.0/
Lysosomal s o age esea ch h p://www.lysosomals o age esea ch.ca/
Ma Inspec o h p://www.genoma ix.de/ma inspec o .h ml
Ma eya h ps://www.ma eya.com
MRC-Holland h ps://www.m c-holland.com
Mu a ionTas e h p://www.mu a ion as e .o g/
Na ional Fab y Disease Founda ion h ps://www. ab ydisease.o g/
NCBI h ps://www.ncbi.nlm.nih.go
PROMO h p://alggen.lsi.upc.es
P o ein Da a Bank h ps://www. csb.o g/
Res ic ionMappe h p://www. es ic ionmappe .o g/
SSPNN h ps://www. ui ly.o g/seq_ ools/splice.h ml
TaqMan h ps://www. he mo ishe .com/ aqman
Uni e sidad de Na a a h ps://www.una .edu/

XX
INTRODUCCIÓN
6
Tabla 1.3. P incipales es udios de búsqueda de pacien es en población meno de 60 años e ic us ecu en e.
Es udio
P e alencia*
Obse aciones y limi aciones del es udio
Rol s e al. 2005
1 / 26
Va ones y muje es; es udio enzimá ico plasma + molecula
Dubuc e al. 2013
1 / 14
Géne o no especi icado; es udio molecula + bioma cado es DBS
Shi e al. 2014
1 / 20 -1 / 30
Me a-análisis alo ando 9 es udios y n=8.302
Romani e al. 2015
1 / 36
Va ones es udio enzimá ico + molecula ; Muje es es udio molecula
Fazekas e al. 2015
1 / 111
Va ones y muje es; es udio enzimá ico + molecula DBS
Be sano e al. 2016
1 / 33
Va ones es udio enzimá ico + molecula ; Muje es es udio molecula
Reisin e al. 2018
1 / 311
Va ones es udio enzimá ico + molecula ; Muje es es udio molecula
Lee e al. 2019
1 / 500
Va ones y muje es; es udio molecula
DBS=Go a de sang e seca.
1.3 Pa ogenia
1.3.1 Sus a os acumulados
La causa undamen al de la EF es el acúmulo sis émico de lípidos neu os pe enecien es a la
amilia de los es ingolípidos ( igu a 1.3) 6. Es os lípidos de i an de la es ingosina, un
aminoalcohol de cadena ali á ica ( igu a 1.3 H). A su ez, la es ingosina, se halla unida a un ácido
g aso de cadena la ga median e un enlace amida dando luga a la ce amida ( igu a 1.3 G). Unida
al g upo hid oxilo 1 de la ce amida median e enlace O-glucosídico encon amos un oligosacá ido
de di e en e composición y amaño ( abla 1.4), o mando los glucoes ingolípidos ( igu a 1.3 A-
B-C-E-F).
Tabla 1.4.P incipales oligosacá idos que con o man los glucoes ingolípidos.
Familia
Es udio
Oligosacá ido*
Gangliósidos
GM1
Gal+NAC-Gal+NANA+Glu+Ce
GM2
NAC-Gal+NANA+Glu+Ce
GM3
NANA+Glu+Ce
Globósidos
Globo e aosilce amida (Gb
4
)
NAC-Gal+Gal+Gal+Glu+Ce
Globo iaosilce amida (Gb
3
)
Gal+Gal+Glu+Ce
Lac osilce amida (Gb
2
)
Gal+Glu+Ce
Galabiosilce amida (Ga
2
)
Gal+Gal+Ce
Ce eb ósidos
Glucosilce amida (Gb
1
)
Glu+Ce
Galac osilce amida (Ga
2
)
Gal+Ce
*Gal=Galac osa; Glu=Glucosa; NAC-Gal=N-Ace il Galac osamina; NANA=Ácido N-Ace il Neu oamínico;
Ce =Ce amida.

7
INTRODUCCIÓN
En la EF, el glucoes ingolípido que se acumula en mayo p opo ción es la Gb3 ( igu a 1.3 B). Es e
glucolípido es llamado ambién an ígeno pk de los g upos sanguíneos p 53 y CD77 ac uando como
ecep o de la oxina Shiga (Shigella dysen e iae) o semejan e a Shiga ambién llamada
e o oxina (Esche ichia coli) 54,55. O as subs ancias acumuladas son: la globo iaosiles ingosina
(liso-Gb3, igu a 1.3 D), de i ado deacilado de la Gb3 gene ado po la acción ca alí ica de la
ce amidasa ácida 56 y la galabiosilce amida (Ga2, ( igu a 1.3 E), p esen e mayo i a iamen e en
iñón 57.
Figu a 1.3. Glucoes ingolípidos. (A) Globo e aosilce amida o Gb4; (B) Globo iaosilce amida o Gb3; (C)
Globo iaosiles ingosina o Liso-Gb3; (D) Lac osilce amida o Gb2; (E) Galabiosilce amida o Ga2; (F) Glucosilce amida
o Gb1; (G) Ce amida; (H) Es ingosina; Fuen e: imagen adap ada de www.ma eya.com y www.a an ilipids.com.
1.3.2 Fisiopa ología gene al
La p incipal al e ación isiopa ológica en la EF es la dis unción ascula , pa icipando de la
pa ogenia de és a los siguien es ac o es 58:
1. Acúmulo de Gb3: El o igen del acúmulo de Gb3 bien es debido a la sín esis endógena, bien a
la au o agoci osis de las memb anas celula es. En el segundo caso, cabe des aca que los
glucoes ingolípidos son moléculas que se encuen an en las memb anas plasmá icas de la
mayo ía de las células de odos los ejidos en el o ganismo. Debido a la ele ada asa de
ecambio de los hema íes, es es a uen e de glucolípidos la que más con ibuye al desa ollo
de la EF. Excep o en las pe sonas con g upos sanguíneos pk y p, el p incipal
8
glucoes ingolípido de la memb ana del hema íe es la globo e aosilce amida (Gb4, igu a 1.3
A). Cuando las células ojas se uel en senescen es son e i adas del o ganismo po los
mac ó agos. Todos los componen es de la memb ana de las células agoci adas son
deg adados enzimá icamen e en el lisosoma. Po medio de la ca álisis enzimá ica de la
Hexosaminidasa B, las moléculas de Gb4 son hid olizadas o mando Gb3. En los pacien es
con la EF, pues o que la ac i idad de la α-Gal A es á educida o es nula, se acumulan
can idades pa ológicas de Gb3 en odos los ejidos del o ganismo. La impo ancia de la
uen e cons an e de glucoes ingolípidos p oceden e del es oma de los hema íes
senescen es ue con i mada po expe imen os con el modelo en a ón de EF. En es e a ón
se p oduce un acúmulo signi ica i o de Gb3 en los ó ganos 59.
2. Al e ación es uc u al de los asos: La pa ed ascula se encuen a al e ada ya que exis e
un eng osamien o de la ín ima y media de la capa muscula de la pa ed a e ial, siendo es a
hipe plasia la que p ecede a la dis unción endo elial en el de eni de los acon ecimien os
que lle an a la asculopa ía 60,61.
3. Ac i ación endo elial y es ado p o ombó ico: es e enómeno se pone de mani ies o al
es imula se en leucoci os ci culan es la sín esis y libe ación de moléculas pa a la adhesión
al endo elio ascula , debido a la p esencia de glucoes ingolípidos; a su ez, una mayo
in e acción de los leucoci os con el endo elio es imula en los p ime os una mayo sín esis
de moléculas p oin lama o ias como in e leucinas o ac o de nec osis umo al al a (TNFα)
62. O o ac o a ene en cuen a en la ac i ación endo elial y del es ado p o ombó ico, es
el exceso de p oducción de especies eac i as de oxígeno y la educción de la ac i idad del
óxido ní ico, p opiciando la egulación a alza de la exp esión de moléculas de adhesión en
el endo elio ascula 63. Se ha cons a ado que en los pacien es EF exis e una meno
exp esión de ac o es ombolí icos que p opician el es ado p o ombó ico edades
p ecoces.
1.4 Es uc u a de la α-galac osidasa A humana
La es uc u a de la α-Gal A humana ue de e minada median e c is alog a ía de ayos X en el
año 2004 64 y se encuen a indizada en el eposi o io público “P o ein Da a Bank” del Ins i u o
Nacional de la Salud de EE. UU con el núme o de acceso 1R46 ( e enlaces).
La enzima comp ende 429 aminoácidos y se es uc u a como un homodíme o, en el que cada
monóme o lo o man dos dominios: el dominio 1 o N- e minal es un ba il (β/α) y el dominio 2
o C- e minal es un sándwich β que con iene 8 heb as β an ipa alelas ( igu a 1.4). El dominio N-
9
INTRODUCCIÓN
e minal es á comp endido en e los esiduos 32 al 328 y el dominio an ipa alelo C- e minal
en e los esiduos 329 al 421. El dominio N- e minal con iene el cen o ac i o de la enzima el
cual es á colocado al inal del dominio C- e minal en las heb as β (β1-β7) al lado del cen o del
ba il β.
Figu a 1.4. Vis a 3D de uno de los monóme os de la α-Gal A humana. Fuen e: P o ein Da a Bank, imagen adap ada
de Ga man SC y Ga boczi DN 2004.
En la supe icie de la molécula se encuen an es mo i os N-glicosilados unidos a los esiduos
de ácido aspá ico N139, N192 y N215. El cen o ac i o de la molécula ( igu a 1.5) es á o mado
po las cadenas la e ales de los esiduos W47, D92, D93, Y134, C142, K168, D170, C172, E203,
L206, Y207, R227, D231, D266 y M267. Los esiduos C142 y C172 o man un puen e disul u o.
Los dos cen os ac i os en el díme o es án sepa ados a una dis ancia ap oximada de 50 Å 65.
Figu a 1.5. Cen o ac i o de la enzima. En azul es án ep esen adas las in e acciones de an de Waals y en ojo los
puen es de hid ógeno con el ligando de α-galac osa. Fuen e: imagen adap ada de Guce A y Ga man SC 2010.
10
La α-Gal A, usa un mecanismo de eacción de doble desplazamien o ( igu a 1.6), donde se
p oducen dos a aques nucleó ilos consecu i os en el ca bono anomé ico del sus a o,
ompiendo el enlace glucosídico con la e ención global del ca bono anomé ico del p oduc o.
En la α-Gal A, el ca alizado nucleó ilo es el esiduo D170 y la ca álisis ácido/base es á p oducida
po el esiduo D23 166.
Figu a 1.6. Mecanismo de eacción. Fuen e: imagen adap ada de Guce A 2010.
1.5 Gené ica Molecula
El gen GLA codi ica la hid olasa ácida lisosomal α-Gal A (EC.3.2.1.22) y es á localizado en el b azo
la go del c omosoma X (Xq22.1). Es á compues o po una egión p omo o a, sie e exones (el
amaño oscila en e 92 y291 pa es de bases [pb]) y po seis zonas in ónicas (Figu a 1.7.). La
egión codi ican e comp ende 1.292 pb. Como peculia idades de es e gen, es que es uno de los
que más elemen os Alu con iene en el genoma y que ca ece de zona 3’ no aducida o “UTR”;
es a úl ima peculia idad hace que la señal de poliadenilación se si úe en la egión codi ican e 67.
Figu a 1.7. Rep esen ación g á ica del gen GLA. Zonas in ónicas en e de. El amaño de exones e in ones no se
encuen a a escala.
11
INTRODUCCIÓN
1.5.1 Pa ón de he encia
La localización del gen GLA supone que el modelo de he encia se encuen e ligado al c omosoma
X. Los a ones po ado es hemizigo os de las a ian es causales de la en e medad, an a
ansmi i las a ian es al 100% de sus hijas y a ningún a ón en la siguien e gene ación; en el
caso de las muje es he e ozigo as, la an a ansmi i al 50% de sus descendien es sin impo a
el géne o de és os ( igu a 1.8).
Figu a 1.8. Modelo de he encia ligado al c omosoma X. Fuen e: imagen adap ada de www.google.com.
T adicionalmen e se ha conside ado que la he encia de es a en e medad e a de ipo ligada al X
ecesi a. Las de iniciones es ánda de he encia ligada al X dominan e o ecesi a no ienen en
cuen a la di e en e exp esi idad de las pa ologías en muje es ni ampoco los mecanismos que
p o ocan esa exp esión di e encial, po lo que se p opone la discon inuación de esas
de iniciones y an solo desc ibi se las pa ologías como he encia ligada al X 68.
1.5.2 Espec o mu acional
Se han desc i o 967 a ian es en el gen GLA (MIM*300644) en sep iemb e de 2019, odas ellas
ecogidas en la base de da os de a ian es en genes humanos del Ins i u o de Gené ica Médica
de Ca di (HGMD, e enlaces) 69. A endiendo a la dis ibución de las mu aciones p esen ada en
la igu a 1.9, ap oximadamen e, el 75% de las a ian es indizadas son a iaciones pun uales
(cambio de aminoácido, gene ación de codón de pa ada p ema u o, de ayus e o polimo ismos)
y el 25 % es an e co esponden a pequeños eo denamien os (deleciones y duplicaciones).

12
Figu a 1.9. Diag ama de sec o es de la dis ibución de las mu aciones del gen GLA, indizadas en la base de da os
HGMD, según la na u aleza de las mismas.
No exis en cla os pun os calien es o “ho spo s” que concen en la mayo ía de mu aciones
pun uales, aunque es ecuen e encon a las en los exones 5 y 6 siendo menos habi uales en el
exón 4. Tampoco exis en mu aciones ecu en es en gene al o pa a las dis in as poblaciones [a
excepción de la asiá ica donde la mu ación in ónica NM_000169.2:c.639+919G>A p esen a una
g an p e alencia como imos en el apa ado 1.2.1 23], ya que la mayo ía de las mu aciones son
p i a i as o exclusi as de cada amilia. Es e hecho es ecuen e en en e medades de baja
p e alencia y obliga a es udia la o alidad del gen cuando se sospecha la en e medad; el 5-10%
de los casos de diagnos icados de la EF es debido a mu aciones que han su gido de no o 70,71
Debido a la auge de los es udios de secuenciación masi a, Las úl imas ecomendaciones de la
“Ame ican College o Medical Gene ics” (ACMG) a an de es anda iza las ecomendaciones a
la ho a de in e p e a a ian es gené icas e indican que és as deben clasi ica se a endiendo a
c i e ios es uc u ales, poblacionales, in silico e c. 72. Es a asociación ca ego iza las a ian es de
la siguien e mane a:
• Pa ogénica: a ian e que causa la en e medad a alada po e idencia obus a gené ica
y expe imen al, incluyendo análisis de coseg egación amilia consis en e y es udios
uncionales.
• P obablemen e pa ogénica: a ian e con e idencias no de ini i as, la e idencia se basa
en su simili ud con a ian es pa ogénicas conocidas, coseg egación con amilia es o
poblaciones con en e medad y la e idencia uncional.
• Signi icado incie o (VUS): a ian e que no eúne los c i e ios de las an e io es o cuando
hay con adicciones en cuan o a su signi icado pa ológico o benigno.
13
INTRODUCCIÓN
• P obablemen e benignas: a ian e con e idencia que apoya que no causa en e medad
(pe o no concluyen e).
• Benigna: a ian e con e idencia concluyen e de que no causa la en e medad,
ípicamen e de e minada (no exclusi amen e) po su p esencia en la población gene al
(sana) con una p e alencia que excede la sospechada pa a la en e medad.
A la is a de es a clasi icación, encon amos a ian es gené icas de ec adas solas o en conjun o,
en pacien es con sin oma ología de la EF en la EF que po lo an o deben se conside adas VUS
y gene an amplio deba e sob e su implicación pa ogénica 73–83. O o g upo muy impo an e de
a ian es ( e igu a 1.10) 84, lo cons i uyen algunas a ian es como NM_000169.2:c.-30A>G 85,86,
NM_000169.2:c.196G>C (p.Glu66Gln) 87,88 NM_000169.2: c.937G>T (p.Asp313Ty ) 89–91 en las
que los di e en es g upos de in es igación no uni ican su c i e io espec o al ca ác e pa ogénico
o benigno de las mismas y que p esen an una ele ada p e alencia en la población. Po úl imo,
den o del g upo de las a ian es pa ogénicas y p obablemen e pa ogénicas, cab ía esal a
aquellas en las que es án causando la en e medad po al e ación del pa ón de ayus e isiológico
del ácido ibonucleico mensaje o (mRNA) inmadu o; den o de és as, hay algunas a ian es que
causan la EF po el mecanismo an e io al cambio de aminoácido en el polipép ido 92 o as sin
emba go son a ian es in ónicas alejadas de la zona dado a o acep o a que ambién des egulan
el mecanismo de ayus e 93,94.
Figu a 1.10. Rep esen ación iangula de las a ian es gené icas iden i icadas en el eno ipo clásico, a dío,
a ian es de signi icado incie o e incluso polimo ismos en la EF. Fuen e: imagen adap ada de O iz e al. 2018.
14
1.5.3 Co elación geno ipo- eno ipo
En la EF es di ícil es ablece una co elación en e el geno ipo iden i icado con el eno ipo debido
a la al a p opo ción de mu aciones p i adas 95, la a iabilidad clínica de la EF, la ele ada
a iabilidad eno ípica in a amilia , la in luencia de o os ac o es no gené icos 96 y la simila
p esen ación clínica espec o a o as en idades más p e alen es
Teniendo en cuen a las conside aciones an e io es, es necesa io a i ma que la na u aleza de las
mu aciones y su localización en la es uc u a p o eica ana a condiciona la ac i idad enzimá ica
esidual y en consonancia la exp esión eno ípica. Así pues, se asocia un eno ipo “clásico” a
mu aciones que a ec an al cen o ac i o y/o a la es abilidad con o macional de la enzima,
mien as que se asocia un eno ipo “a ípico o a dío” a mu aciones alejadas del cen o ac i o de
la enzima o bien que des egulen la exp esión de és a. En es e úl imo, la ac i idad esidual
enzimá ica juega un papel impo an e en el e aso en la apa ición de los sín omas de la EF. Con
el conocimien o ac ual sob e la his o ia na u al de la en e medad, se ha p opues o que esul a ía
más ap opiado desc ibi la EF como una en e medad con amplio espec o de eno ipos clínicos
he e ogéneos y p og esi os.96
Un condicionan e impo an e en la exp esión del eno ipo, además de la ac i idad esidual de la
enzima, se ía la p esencia de ac o es modi icado es gené icos y ambien ales. En e los p ime os
se iden i ican a ian es en genes codi ican es pa a moléculas p oin lama o ias o de la cascada
de la coagulación como el gen de la in e leucina 6, el gen de la enzima óxido ní ico sin asa
endo elial, el gen del Fac o V de Leiden o del ecep o de la i amina D. En e los segundos son
impo an es ac o es aquellos elacionados con el iesgo ascula (hipe ensión a e ial,
coles e olemia, abaquismo e c.) 97.
1.5.4 La EF en las muje es. Bases gené icas y molecula es.
En la EF el é mino po ado no es el más adecuado, ya que las muje es pueden no desa olla
sin oma ología o bien la pueden p esen a la a iando desde eno ipos clásicos a a ípicos como
lo ha ían los a ones con la sal edad que la edad de p esen ación de los sín omas de la
en e medad es á lige amen e e asado unos diez años espec o de los a ones 36,98–101.
El hecho de que las muje es no sean me as po ado as y p esen en una amplia a iabilidad
eno ípica pod ía se explicado po los mecanismos epigené icos de compensación de dosis
génica du an e la ase emb iona ia, en los que se inac i a de o ma alea o ia el c omosoma X
15
INTRODUCCIÓN
pa e no o ma e no, enómeno conocido con el nomb e de “Lyonización” po se descubie o
po la D a. Ma y F. Lyon en el año 1962 102. Pos e io men e, odas las células descendien es
man end án el pa ón de inac i ación adqui ido en la ase de blas ocis o de modo que las
muje es p esen an una si uación de mosaicismo somá ico espec o las ca ac e ís icas gené icas
seg egadas en dicho c omosoma.
Un ejemplo isual (Figu a 1.11.) de es e enómeno es la exp esión del colo na anja en la capa
de las hemb as elinas. El colo na anja en es a especie es á codi icado po el locus O-o localizado
en el c omosoma X; una hemb a he e ozigo a pa a ese locus (Oo) exp esa á un eno ipo mosaico
en su capa, con zonas na anjas y no na anjas. Una sal edad a es e pa ón, es el colo blanco ya
que és e se p oduce po al a de exp esión de los locus que con olan la colo ación de la capa.
Debido a la condición quimé ica de las células somá icas de las muje es, cabe des aca en e
o as implicaciones a ni el eno ípico, que ap oximadamen e una e ce a pa e de la muje es
po ado es de una a ian e gené ica pa ogénica y que desa olla on signos y sín omas de la EF,
no p esen aban ac i idad enzimá ica educida 103
Figu a 1.11.Exp esión eno ípica del mosaicismo ge minal del locus O-o en la capa de las ga as ca ey. Fuen e:
imagen adap ada de www.google.com
La epigené ica es un mecanismo de egulación del DNA in oluc ado en la exp esión de los genes
du an e el desa ollo celula . Es e mecanismo no modi ica la secuencia nucleo ídica del DNA
22
1.6.5 O as mani es aciones
Los as o nos audi i os y es ibula es son ecuen es en EF, esul ando en una a iedad de
sín omas como la pé dida audi i a, inni us y é igo 70. Se ha desc i o una mayo incidencia de
hipoacusia y so de a súbi a en pacien es con eno ipo clásico de EF 128. Se ha encon ado una
co elación en e la a ec ación neu opá ica y el daño ascula con la pé dida audi i a en a ones
en los que la ac i idad esidual de la α-Gal A enía un e ec o p o ec o en e a la pé dida audi i a
129.O a obse ación impo an e es la pé dida es ibula p og esi a en el 80% de los a ones y
en el 77% de las muje es cuando se ha e aluado median e la p ueba de po enciales e ocados
130.
Las opacidades co neales ( isibles median e mic oscopio de lámpa a de hendidu a) son los
sín omas ocula es más iniciales y ecuen es. Ocu en en la mayo ía de a ones hemizigo os. Se
obse a ambién una o uosidad en los asos e inianos y conjun i ales. Con ecuencia
apa ecen ambién ca a a as subcapsula es llamadas “Ca a a as de Fab y” y ep esen an un
sín oma ocula pa ognomónico en la EF “có nea e icilla a” ( igu a 1.14) 70.
La a ec ación espi a o ia es ecuen e en ambos sexos mani es ándose como disnea con el
eje cicio, os c ónica y uidos espi a o ios. Es ecuen e encon a obs ucción en los b onquios.
En los casos g a es, la in il ación de Gb3 en la ba e a al éolo capila y la pé dida de la
elas icidad pulmona debido a la in il ación in e s icial, se ma e ializa en una educción de la
capacidad y o os índices espi omé icos 131.
1.7 Diagnós ico
La edad de diagnós ico p omedio en la EF pa a a ones se encuen a en 25,7 ± 15,3 años
mien as que pa a muje es es de 31,3 ± 17,4 años, con un e aso p omedio desde la apa ición
de los sín omas has a el diagnós ico de ap oximadamen e 12 años pa a ambos sexos 132. Una
ez que se iene una sospecha de EF, el diagnós ico de ini i o en a ones debe ealiza se con el
análisis de la ac i idad de la α-Gal A en una mues a de sang e, el cual puede se lle ado a cabo
en mues as de células blancas, plasma/sue o 128 o en go a de sang e seca133. La de iciencia
enzimá ica puede se demos ada en cul i o de ib oblas os, o ina y o os ejidos 128. La
con i mación del diagnós ico es lle ada a cabo po la de ección de la mu ación causal en el gen
GLA. Las muje es he e ocigo as no se pueden diagnos ica de o ma idedigna median e el
análisis de ac i idad enzimá ica en leucoci os y plasma, debido a la inac i ación alea o ia del

23
INTRODUCCIÓN
c omosoma X, ya que pueden ene ni eles de ac i idad no males 128. El análisis mu acional es
imp escindible pa a con i ma el diagnós ico de los pacien es he e ocigo os 134. La de ección y
cuan i icación de los p oduc os de acúmulo, Gb3 en plasma 135y o ina 136; liso-Gb3 en plasma 137y
Ga2 en o ina 57, pueden se de g an ayuda como p ueba que e idencia el diagnós ico y como
ma cado de seguimien o de la en e medad. El desa ollo de la TES 138,139 en a izó la impo ancia
del diagnós ico emp ano pa a la EF. Los mé odos de c ibado basados en el análisis de la
ac i idad enzimá ica en go a de sang e seca 133 y de acúmulo de sus a o en o ina ecogida en
papel de il o 140; han sido diseñados pa a ealiza el c ibado masi o y en poblaciones con al o
iesgo de EF.
1.7.1 Bioma cado es
Los bioma cado es se de inen como anali os que indican la p esencia de un p oceso biológico,
el cual se encuen a en es echa elación con las mani es aciones clínicas y el esul ado de una
pa ología pa icula . Un bioma cado idealmen e, debe ía p o ee indi ec amen e de la
in o mación de la ca ga de en e medad a la ho a del diagnós ico y seguimien o de la p og esión
de la en e medad, así como de la medida de la co ección e apéu ica de és a 141. Los
bioma cado es pueden se simples me aboli os o bien moléculas complejas.
1. Gb3: Du an e mucho iempo, el acúmulo p ima io de Gb3 ha sido conside ado el
bioma cado de e e encia de la EF 1. Los ni eles ano malmen e ele ados de es e glucolípido
no solo ocu en en el in e io celula si no que se puede encon a a ele adas
concen aciones en plasma u o ina como se ha cons a ado en a ones a ec os de la EF, sin
emba go pueden encon ase ni eles lige amen e ele ados en o ina y ni eles no males en
plasma de muje es po ado as sin omá icas de la EF 1,142,143. La u ilidad de los ni eles
u ina ios en la moni o ización de la p og esión de la en e medad no son e ec i os, como lo
demues an di e en es es udios en los que además hay una al a de co elación en e ni eles
u ina ios y sin oma ología 143. Po o o lado, los ni eles plasmá icos no mues an mejo es
alo es p edic i os pa a las mani es aciones de la en e medad 143. Las écnicas habi uales
pa a medi es e me aboli o an o en o ina como en plasma son c oma og a ía líquida de al a
e icacia (CL) acoplada a un sis ema de moni o ización múl iple de espec ome ía de masas
(EM) 144,145
2. Liso-Gb3: se cons a an unos ni eles ele ados en plasma en pacien es de la EF 137. A di e encia
de la Gb3 p esen a cie o alo diagnós ico ya que los ni eles de Liso-Gb3 se encuen an
mucho más ele ados y pe mi en di e encia en e los suje os con o mas clásicas, de las
24
a ípicas incluso de las incie as de la en e medad esul a inc emen ado 146. O a di e encia
impo an e espec o de la Gb3 es que los ni eles de Liso-Gb3 co elacionan con la g a edad
de los sín omas de la EF y se obse a un cla o descenso de sus ni eles bajo la TES 147,148. En
a ones a ados con la TES, se p oduce un descenso de los ni eles de Liso-Gb3 de mane a
ápida (3-6 meses pos -inicio TES) pa a con inua con ni eles ele ados espec o a la
población con ol 148,149. Sin emba go, encon amos una se ie limi aciones en el uso de la
Liso-Gb3 como bioma cado de la EF: se desconoce la implicación de las a iaciones de la
concen ación del anali o en la clínica 148,150; los ni eles pueden e se modi icados po una
se ie de a iables (edad, géne o, ipo de mu ación e c.) 146; la p esencia de an icue pos
an ienzima exógena p o ocan que se modi ique la espues a de és a a la Liso- Gb3 148.
3. O os: se han publicado abajos en los que se es udió el compo amien o de moléculas
p oin lama o ias como mielope oxidasas, me alop o einasas, p o eína C eac i a e incluso
la ac i idad qui o iosidasa 151–153 , conside ada uno de los p incipales bioma cado es en la
EG 154. O as muchas moléculas se han desc i o como po enciales bioma cado es de la EF
asociados a eno ipos ca díacos (Cis a ina C y domino amino e minal del pép ido
na iu é ico a ial) 155 y se con inúan los es ue zos pa a iden i ica nue os bioma cado es
con ap oximaciones p o eómicas 156.
1.7.2 Diagnós ico enzimá ico
La ac i idad de la α-Gal A habi ualmen e se mide en mues as de sue o/plasma, en leucoci os y
DBS, median e el uso del sus a o luo ogénico sin é ico, 4-me ilumbeli e il-α-D-
galac opi anósido a un pH de 4,6 1,133,134. En la igu a 1.17 se ilus a esquemá icamen e la
eacción in i o de la medida de la ac i idad enzimá ica u ilizando el sus a o luo ogénico
mencionado an e io men e.
Figu a 1.17. Esquema de la eacción in i o de la α-Gal A.
25
INTRODUCCIÓN
Pa a inhibi a la α-N-ace il galac osaminidasa (llamada ambién α-Gal B) se añade a la eacción
N-ace ilgalac osamina 157. Es a enzima es la esponsable de más del 20% de la ac i idad o al de
la α-Gal A en el plasma y en e el 5-10% en leucoci os usando el sus a o sin é ico. O os ac o es
que a ec an a la ac i idad son: el pH, la empe a u a, los inhibido es endógenos, an icoagulan es
y con aminación po e i oci os. Todos esos ac o es se han enido en cuen a a la ho a de
desa olla el p o ocolo es ánda y es ablece los angos de e e encia. La hemoglobina libe ada
po los e i oci os puede bloquea la luo escencia emi ida po el sus a o sin é ico. Las mues as
lipémicas p esen an o o p oblema po encial ya que los lípidos en suspensión pueden in e e i
con los eac i os de la eacción y a ec a las medidas de luo escencia. En el caso de medidas en
leucoci os, la hemólisis en el p oceso de ob ención ambién puede se un p oblema bloqueando
la luo escencia emi ida po el sus a o.
Los pacien es a ones con eno ipo clásico, gene almen e, p esen an una ac i idad en
plasma/sue o y leucoci os, baja o inde ec able. El diagnós ico debe con i ma se po análisis
mu acional. Los ni eles de sus a o en plasma u o ina es án ele ados en la mayo ía de los
pacien es y pueden u iliza se como sopo e pa a el diagnós ico. Algunos pacien es con eno ipo
clásico mode ado ienen ni eles esiduales bajos de ac i idad enzimá ica. En pacien es con las
o mas a ípicas de la en e medad, que no mues an eno ipos clásicos, con sín omas a díos, se
suelen encon a ni eles de ac i idad esidual al os 1,16,134 incluyendo las a ian es ca diacas 44 y
enales 87. Los pacien es a ones con una p esen ación clínica a ípica y ac i idad esidual al a,
deben se in es igados a a és de una ca ac e ización de la ac i idad esidual, secuenciación
comple a del gen GLA y medida de los p oduc os de acúmulo en o ina o plasma an es de
es ablece un diagnós ico de ini i o. La ac i idad en muje es a ec adas a ía desde los ni eles
bajos encon ados en a ones a ec ados has a ni eles den o de la no malidad. Un 30% de las
muje es po ado as iene ac i idad enzimá ica no mal 1. Una ac i idad no mal no iene po qué
con adeci una sospecha clínica en muje es. Aunque muchos he e ocigo os ienen una
ac i idad baja en plasma/sue o y leucoci os o os no se pueden de ec a po mé odos
enzimá icos. La iden i icación de los po ado es es á basada en la de ección de las mu aciones
causan es de en e medad en el gen GLA. Se asume que los ni eles de ac i idad de la α-Gal A en
los leucoci os de los he e ocigo os e lejan el pa ón de inac i ación del c omosoma X en las
células de la mues a. La inac i ación del c omosoma X, se p opone como mayo ac o
de e minan e del desa ollo de la en e medad en he e ocigo os. Se encon a on di e encias
signi ica i as en e los alo es de la pun uación de g a edad de la en e medad y la inac i ación
26
del c omosoma X 158 y se ha obse ado que en he e ocigo os en edad a anzada, a eces se
encuen an alo es de ac i idad al os den o del ango de los he e ocigo os.
1.7.3 Análisis mu acional
Pa a iden i ica las di e en es mu aciones en el gen GLA se pueden u iliza di e en es écnicas
dependiendo de la na u aleza de la mu ación 1,134. El 90% de las mu aciones (mu aciones
pun uales, pequeños eo denamien os) pueden se de ec ados ampli icando median e la
eacción de PCR, los exones, incluyendo las egiones que lo lanquean, seguido de la de ección
de los cambios en la secuencia po di e en es mé odos. El mé odo más p eciso es la
secuenciación. La mejo mane a de iden i ica a ian es(nue as y conocidas) y las pequeñas
inse ciones y deleciones es secuencia oda la zona codi ican e y las egiones que lo lanquean
en ambas di ecciones 159. O o mé odo pa a de ec a mu aciones de una o ma ápida y sencilla,
es el basado en la disociación de empe a u a de dos heb as y el análisis de las cu as de usión
160. Es e mé odo ha sido u ilizado en el c ibado mu acional en una población con sín omas de EF
74. Los mé odos de secuenciación masi a, en los que el gen GLA se in eg a en paneles de genes
ag upados po eno ipo o en exomas clínicos, son una ealidad en el análisis mu acional 161,162.
Los g andes eo denamien os, que o man pa e del 4-5% del o al de las mu aciones, pueden
se de ec ados median e la écnica “Sou he n blo ” u ilizando el DNA codi ican e del gen GLA
como sonda 163. Es di ícil de ec a deleciones en uno o a ios exones especialmen e en muje es
he e ocigo as. Esas mu aciones pueden se de ec adas median e la écnica “Mul iplex Liga ion-
dependen P obe Ampli ica ion” 164. Si la mu ación no se encuen a en la egión codi ican e del
gen o lanqueando a esas egiones y no es un g an eo denamien o, debe se alo ada la
posibilidad de que exis a una mu ación de ayus e (ap oximadamen e 5% de las mu aciones
conocidas) y debe se ca ac e izada median e el análisis del DNA codi ican e 93 o median e la
PCR cuan i a i a (qPCR) 94 pa a analiza la molécula de RNA. Es impo an e es udia la exp esión
del ayus e al e na i o de la α-Gal A ya que el ánsc i o, en condiciones no males, es á
exp esado en e el 1 y el 10% en ejidos. Un desbalance en el ayus e al e na i o en e el
ánsc i o isiológico y el al e na i o puede esul a en un dé ici enzimá ico. Se ha suge ido que
la qPCR debe ía es a incluida en el análisis gené ico de u ina en EF 93.
Schi mann e al. ealiza on un algo i mo pa a ayuda a e alua las VUS ( igu a 1.18) y llega on
a la conclusión que demos a el acúmulo de sus a o en el ejido implicado o en la piel, si no
ue a posible biopsia el ó gano diana, es la al e na i a necesa ia 165.
27
INTRODUCCIÓN
Figu a 1.18. Algo i mo pa a la in e p e ación de las VUS en la EF. Fuen e: Imagen adap ad de Schi mann e al. 2016
1.7.4 O os mé odos.
La obse ación de biopsias median e mic oscopia óp ica no suele se una g an con ibución al
diagnós ico. Cuando la mic oscopia elec ónica no es accesible, las secciones eñidas con azul
de oluidina o ic ómico de Mason acili an el diagnós ico. Debido al ele ado núme o de alsos
posi i os y al se un p oceso in asi o no suele se un p ocedimien o u ilizado en el diagnós ico.
Los es udios de la ul aes uc u a median e mic oscopia elec ónica del endomioca dio y las
biopsias de iñón pueden mos a acúmulo lisosomal en los ca diomioci os o di e en es ipos
celula es enales. La apa iencia de las ul aes uc u as de las inclusiones se p esen a como capas
en espi al que al e nan ma e ial denso y cla o (cue pos de ceb a o igu as de mielina).
La biopsia de piel obse ada po mic oscopia elec ónica puede u iliza se como apoyo al
diagnós ico pe o es de di ícil in e p e ación 166. Como hemos is o en el apa ado 1.7.3, la
ealización de una biopsia di igida al ó gano a ec ado o bien a la piel si no uese posible la
p ime a al e na i a, puede ayuda nos a la in e p e ación de un VUS 167.
1.8 T a amien o
En los úl imos años se han lle ado a cabo muchos a ances en el a amien o de las
en e medades lisosomales. An es del año 1990, no exis ía un a amien o especí ico pa a es as
en e medades y únicamen e se podían o ece a amien os palia i os pa a las mo bilidades
asociadas a la en e medad. La si uación cambió adicalmen e desde que apa eció la p ime a

28
enzima sus i u i a ob enida de placen as humanas pa a el a amien o de la en e medad de
Gauche 168, que ue la p ime a en dispone de un a amien o e icaz pa a comba i los sín omas
de la en e medad. Pos e io men e y po ecnología ecombinan e se han ob enido o as
enzimas sus i u i as aplicables a o as en e medades lisosomales. P ime amen e, en Es ados
Unidos y más a de en Eu opa, la egulación pa a los á macos hué anos, ha p opiciado que la
indus ia a macéu ica desa olle p oduc os pa a las pa ologías poco p e alen es a a és de un
p og ama de bene icios como o o ga les la exclusi idad en el me cado po un pe iodo de 10
años. Ac ualmen e, nue as ap oximaciones e apéu icas han sido ap obadas como las
chape onas a macológicas o se encuen an en ase de desa ollo como la e apia de educción
de sus a o o la e apia génica.
1.8.1 Te apia enzimá ica sus i u i a
En el año 2001 se in odujo po p ime a ez el uso de la enzima humana α-Gal A como TES. En
Eu opa, ac ualmen e, se come cializan dos enzimas: la algasidasa al a (Replagal®; Takeda;
Camb idge, MA, USA), p oducida median e la ecnología de ac i ación génica a pa i de líneas
celula es de ib osa coma humano (dosis: 0,2 mg/kg cada dos semanas) 169 y la algasidasa be a
(Fab azyme®; Genzyme-Sano I, Camb idge, MA, USA) p oducida a pa i del cDNA de la α-Gal A
en líneas celula es de o a io de háms e chino (dosis: 1 mg/kg cada dos semanas) 170. Aunque
los dos p oduc os ienen la misma secuencia de aminoácidos, las dos enzimas ecombinan es
di ie en en la can idad de esiduos de manosa-6- os a o y en la p opo ción de ácido siálico en
elación a la galac osa. Es o in luye en la in e acción de la p o eína con los ecep o es de
asialoglicop o eínas, mayo i a iamen e localizados en los hepa oci os y los ecep o es de
manosa-6- os a o dis ibuidos po a ios ejidos a ec ando a la biodisponibilidad 171. O o
ámbi o de di e enciación de ambos p oduc os es el pe il de segu idad, ya que po la na u aleza
de los mo i os de glicosilación de ambos moléculas, agalsidasa al a p esen a meno po cen aje
de e en os ad e sos elacionados con la inmunogenicidad 169,170
A di e encia de o as en e medades lisosomales como la en e medad de Gauche (EG) en la que
el acúmulo de ma e ial en el lisosoma es á mayo i a iamen e es ingido a la línea celula
monoci o-mac ó ago, en la EF es án comp ome idos un núme o mayo de ejidos. Po ese
mo i o la accesibilidad de la enzima es meno que en la EG. Aunque el p oceso pa ológico en el
ejido endo elial juega un papel muy impo an e, no puede explica po comple o el cuad o
clínico en la EF, únicamen e con el acúmulo de Gb3 en es e ejido. Se han ealizado a ios
es udios clínicos compa ando los pa áme os bioquímicos p e- y pos a amien o en mues as
29
INTRODUCCIÓN
de plasma y ejidos. La TES apo a bene icios sob e ó ganos como el co azón, iñón y o os
ejidos como el endo elial 172. La a iedad y g a edad de los sín omas en la EF es muy g ande y
no exis en buenos bioma cado es pa a su seguimien o 137,146. La TES iene a ias limi aciones: la
p ime a es que la enzima ecombinan e, como ocu e en o as en e medades de depósi o, no
puede a a esa la ba e a hema oence álica, con lo cual no llega a se dis ibuida al sis ema
ne ioso cen al. Pueden p oduci se eacciones de hipe sensibilidad a la adminis ación de la
enzima in a enosa. Los an icue pos gene ados a la la ga pueden dec ece la e icacia de la
e apia bloqueando la enzima 173. La e apia no iene e icacia sob e ó ganos que han sido
a ec ados de o ma i e e sible como la a ec ación enal en es adio III, sin emba go pe mi e la
es abilización de la ib osis y e i a su e olución 174. Muchas de las limi aciones de la TES
posiblemen e es én elacionadas con el momen o en el que se empieza a adminis a el
á maco, po eso un diagnós ico emp ano es impo an e pa a el éxi o e apéu ico.
1.8.2 Te apia con chape onas molecula es
En la EF un g an núme o de mu aciones son pun uales gene ando una p o eína ines able,
aunque ca alí icamen e uncional 64. La o ma pu i icada de la enzima mu an e es
ca alí icamen e compa able a la p o eína no mu ada 16, sin emba go no es capaz de alcanza el
lisosoma po un p oblema con o macional, haciendo que se al e e el á ico in acelula . Los
es udios del á ico in acelula y deg adación de las enzimas mu adas indican que és as quedan
e enidas en el e ículo endoplasmá ico (RE) y son deg adadas po el mecanismo p og amado
asociado al RE (ERAD) 16. Es e es el undamen o pa a el uso de pequeñas moléculas, las
chape onas, que es abilizan las con o maciones in e medias de la p o eína y así educi la
deg adación p ema u a median e ERAD 16. Los inhibido es enzimá icos que p o ienen de la
amilia de los iminoazúca es pueden ac ua ambién como chape onas a macológicas ac i as,
inc emen ando la ac i idad esidual enzimá ica y es abilizándola 175
Los iminoazúca es mime izan a los monosacá idos, debido al cambio de un á omo de ni ógeno
en luga del á omo de oxígeno p esen e en la es uc u a cíclica de los monosacá idos y pueden
ac ua como po en es inhibido es de las glucosidasas. Debido a que los iminoazúca es ienen
una al a a inidad po el cen o ac i o de la enzima diana, és os pueden ac ua como chape ona
especí ica de si io ac i o es abilizando las o mas de plegamien o in e medias 176.
Ac ualmen e en Eu opa, se come cializa una única chape ona molecula pa a la EF denominada
1-deoxigalac onoji imicina (DGJ) o migalas a (Gala old®; Amicus The apeu ics; C anbu y, NJ,
USA). Se a a de la p ime a e apia o al pa a la EF, se dis ibuye bajo la o mulación química de
30
hid oclo u o (150 mg/48h) y es á indicada pa a el a amien o de la EF en pacien es mayo es de
16 años y que p esen en una mu ación “suscep ible” 17. El é mino “suscep ibilidad” hace
e e encia al aumen o de la ac i idad de la α-Gal A mu an e en p esencia de migalas a ,
ob eniendo en modelo celula in i o un inc emen o ela i o mayo o igual al 3% o un
inc emen o absolu o mayo o igual a 1,20 177. La e icacia y segu idad del p oduc o se ha es ado
en a ios ensayos clínicos ob eniéndose esul ados de man enimien o de la unción enal,
disminución de la HVI, educción y man enimien o de ni eles plasmá icos de Liso-Gb3 e c. 149,178.
Respec o a las bondades de una e apia o al, segu a y e icaz pa a la EF. Pueden apa ece una
se ie de incon enien es en es a e apia como una posible al a de adhe encia pe sé al
a amien o o al en pacien es c ónicos 179, la limi ación al acceso del a amien o ya que poco
más del 30% de las mu aciones desc i as en la EF se ían suscep ibles 17, a iabilidad in e -
labo a o io en cuan o a los ensayos de suscep ibilidad 180.
Figu a 1.19. Mecanismo p opues o pa a las chape onas especí icas del cen o ac i o. A) Mecanismo pa a la enzima
no mu ada, B) mecanismo pa a la enzima mu ada. Imagen adap ada de Lysosomal s o age esea ch ( e enlace)
31
INTRODUCCIÓN
1.8.3 Nue as ap oximaciones e apéu icas
1. Te apia de educción o inhibición de sus a o: La inhibición de la sín esis de sus a o es una
al e na i a e apéu ica pa a las en e medades de acúmulo lisosomal. Es a ap oximación
e apéu ica en la EF lle a a la educción de la sín esis de Gb3 a a és del descenso de la
deposición de ce amida. La glucosilce amida sin asa es una de las dianas po enciales pa a
es a ap oximación e apéu ica. Su inhibición conduce a una educción en la sín esis de la
glucosilce amida, p ecu so de glucoes ingolípidos neu os y gangliósidos. La N-
bu ildeoxinoji imicina (miglus a , Za esca®; Johnson and Johnson) ha sido p obada con éxi o
en el a amien o de la EG 181, sin emba go el á maco p oduce e ec os secunda ios
e e sibles como la dia ea y emblo . En la EF ac ualmen e se es á desa ollando un nue o
inhibido de la glucosilce amida sin asa, llamado Luce as a que se a a de un iminoazúca
simila a miglus a que se ensaya en pacien es de la EF a ados p e iamen e con la TES
182,183.
2. Te apia enzimá ica sus i u i a pegilada: es e ipo de a amien o sigue los p incipios is os
en el apa ado 1.8.1, en los que se p oduce una enzima ecombinan e a pa i del cDNA de
la α-Gal A en líneas celula es ege ales pa a pos e io men e uni co alen emen e sus
subunidades median e in e calado de moléculas de polie ilenglicol, de es a o ma se a a
de inc emen a la ida ú il de la molécula en el plasma sin pe juicio del pe il de segu idad y
pudiendo espacia las dosis sin a ec a se la e icacia del a amien o. Se es án desa ollando
es ensayos clínicos en ase II habiéndose publicado esul ado posi i os en cuan o a unción
enal po Schi mann e al 184.
3. Te apia combinada: es a ap oximación p e ende combina el uso de la chape ona
a macológica DGJ o migalas a con la TES, pa a consegui ala ga la ida ú il de és a sin
pe judica a la e icacia. Los esul ados en animales de labo a o io ue on posi i os
consiguiendo inc emen a en 2,5 eces la ida ú il de la enzima exógena en el plasma,
además de consegui una educción ap oximada del 30% del acúmulo isula de Gb3 185.
Basado en esos esul ados, se es á desa ollando un ensayo clínico en ase II en el que se
es á p obando di e en es dosis de chape ona y enzima y po el momen o Wa nock e al. ha
comunicado un aumen o de la ida media de la enzima en plasma en e 1,2 y 5,1 eces,
esul ado que ambién cons a a en p opo ciones simila es en piel y células de la se ie blanca
de pacien es con la EF 186.
4. Te apia génica: ac ualmen e se es á lle ando a cabo un ensayo de e apia génica en EF, que
consis e en la inse ción del gen GLA co egido en el genoma celula median e un ec o
36
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
22C>T 73–83. Po úl imo, un caso muy ep esen a i o de la complejidad en el consenso sob e
la pa ogenicidad de cie as a ian es gené icas, lo cons i uyen algunas como
NM_000169.2:c.-30G>A 85,86 o NM_000169.2: c.937G>T (p.Asp313Ty ) 89,90.
Desde el pun o de is o epidemiológico, se desconoce la p e alencia eal de la EF, debido a
la complejidad diagnós ica de la en e medad y a la a iabilidad en cuan o a c i e ios de
c ibado, po lo que no se cuen a con un alo iable de p e alencia en población gene al y
menos si cabe en población a ec a de la EF cuyos sín omas se es ingen a un único ó gano o
sis ema, como po ejemplo la MHVI 33,34,37,45.
A la luz de los p eceden es an e io es, plan eamos los siguien es obje i os:
1. Conoce la incidencia de la EF en pacien es (muje es y a ones) diagnos icados de MHVI
de o igen desconocido.
2. Valo a la capacidad de c ibado en la EF, de un mé odo de análisis enzimá ico y gené ico
basado en go a de sang e seca sob e papel de il o.
3. Ca ac e iza uncionalmen e las a ian es gené icas nue as que se iden i iquen en el
gen GLA en indi iduos con signos y sín omas de la EF.
4. Realiza un análisis epidemiológico de la elación de las a ian es gené icas iden i icadas
en es e es udio con di e sos pa áme os clínico-analí icos de la población, y su
seg egación en o ma de haplo ipos.
5. P o undiza en el es udio molecula y uncional de los indi iduos con signos y sín omas
compa ibles con la EF, en los que se haya iden i icado las a ian es gené icas.

MATERIALES Y METODOLOGÍA
39
MATERIALES Y METODOLOGÍA
4 Ma e iales y Me odología
4.1 Pacien es y con oles
Se eclu a on pacien es, independien emen e del géne o: pacien es diagnos icados de MHVI
idiopá ica que se encon aban en el momen o de la inclusión en seguimien o clínico en las
consul as de ca diología de los hospi ales pa icipan es ( eclu amien o e ospec i o); pacien es
e aluados en la p ác ica clínica habi ual en dichas consul as ( eclu amien o p ospec i o). En la
abla 4.1 se ecogen los c i e ios de inclusión y exclusión pa a los pacien es.
Tabla 4.1. C i e ios de inclusión y exclusión de los pacien es.
CRITERIOS DE INCLUSIÓN
Va ones o muje es.
Mayo ía de edad en el momen o del eclu amien o (≥18 años).
Pacien es con MHVI de o igen desconocido (espeso del sep o en icula y/o pa ed en icula izquie da pos e io
(EVI)>14mm).
Pacien es no elacionados en e sí (1 pacien e po amilia).
Fi ma del consen imien o in o mado de pa icipación en el es udio.
OPCIONAL (NO EXCLUYENTE):
Pacien es con es enosis aó ica lige a (g adien e medio<20 mm de Hg o á ea al ula aó ica>1,5 cm2).
Pacien es HTA lige a (p esión sis ólica<160 mm de Hg y/o dias ólica<95 mm de Hg).
CRITERIOS DE EXCLUSIÓN
Pacien es con MHVI secunda ia a causa o gánica.
Pacien es con MHVI debido a causa gené ica conocida.
Pacien es con MHVI de o igen idiopá ico cuyo pa ón de he encia gené ica no uese ligado al c omosoma X.
Pacien es con es enosis aó ica mode ada o g a e (g adien e medio≥20 mm de Hg o á ea al ula aó ica≤1,5 cm2).
Pacien es con HTA mode ada o g a e (p esión sis ólica≥160 mm de Hg y/o dias ólica≥95 mm de Hg).
Pacien es con coa ación aó ica.
El pe íodo es imado pa a el eclu amien o de los pacien es ue de nue e meses desde la
inclusión del p ime pacien e o bien has a alcanza el núme o de 600 pacien es en e los 8
cen os pa icipan es ( abla 4.2).

40
MATERIALES Y METODOLOGÍA
Tabla 4.2. Cen os pa icipan es en el es udio.
CENTRO PROVINCIA
Hospi al Gene al Uni e si a io de Alican e Alican e
Hospi al Uni e si a io Pue a de Hie o Mad id
Hospi al Clínico Uni e si a io de San iago de Compos ela A Co uña
Facul ad de Medicina de la Uni e sidad de Mu cia Mu cia
Hospi al Uni e si a io Vi gen de la A ixaca Mu cia
Hospi al Uni e si a i Son Llà ze Palma de Mallo ca
Hospi al Gene al Uni e si a io de Elche Alican e
Hospi al Uni e si a io de Donos ia Guipúzcoa
Con el in de no maliza las posibles a iables p eanalí icas elacionadas con la oma de la
mues a de DBS, se solici ó a cada uno de los cen os an e io es, que apo asen un mínimo de
20 mues as de indi iduos de ambos géne os sin pa ología ca díaca conocida ni his o ia amilia
de la misma, con el in de pode ajus a unos angos de e e encia pa a cada cen o pa a odas
las de e minaciones que se uesen a ealiza en DBS.
Pa a el es o de de e minaciones en mues as di e en es al DBS, se u iliza on los exceden es del
diagnós ico de indi iduos a ones y muje es, a los que se les desca ó median e mé odo
enzimá ico y/o gené ico la compa ibilidad con la EF, p oceden es de la colección de mues as de
En e medades Lisosomales ges ionadas po el Biobanco del Sis ema de Salud de A agón.
Todos los pacien es y con oles ue on in o mados e balmen e y po esc i o, de los obje i os y
me odología a segui en es e es udio, acep ando de mane a olun a ia su pa icipación en el
mismo y i mando el co espondien e consen imien o in o mado.
Es e es udio ue ap obado el 30 de ma zo de 2011 po el Comi é de é ica de in es igación clínica
de la Comunidad Valenciana de la Agència Valenciana de Salu (Alican e) y ca ego izado el 20 de
ene o de 2011 como “es udio obse acional no posau o ización (No-EPA)” po la Subdi ección
gene al de medicamen os de uso humano de la Agencia española de medicamen os y p oduc os
sani a ios. La in es igación ue lle ada a cabo según los p incipios de la Decla ación de Helsinki
de la p omulgada po la Asociación Médica Mundial en su 18º asamblea gene al del año 1964
41
MATERIALES Y METODOLOGÍA
en Helsinki (Finlandia), y enmendada po es a misma asociación en la 64º asamblea gene al del
año 2013 celeb ada en Fo aleza (B asil) 187.
4.2 Diseño del es udio
El es udio cons ó de 3 ases como se mues a en la igu a 4.1: una p ime a ase de inclusión de
pacien es siguiendo los c i e ios de inclusión/exclusión ( e abla 4.1) y oma de mues a en DBS;
una segunda ase que a ec a a la o alidad de los pacien es que componen la mues a y que
consis e en c ibado enzimá ico en DBS y/o secuenciación de las egiones 5’-UTR y codi ican es
del gen GLA; una e ce a ase de ca ac e ización de aquellos pacien es en los que se hayan
iden i icado a ian es po encialmen e causales de la EF.
Figu a 4.1.Diag ama del lujo del es udio.
4.3 Es udio ecoca diog á ico
Pa a sa is ace el c i e io de inclusión ela i o al espeso del sep o en icula y/o pa ed
en icula izquie da pos e io (EVI, e abla 4.1), es a de e minación se podía ob ene de
cualquie ecoca diog ama que se le hubie a ealizado al pacien e con una an igüedad máxima
de 6 meses al momen o de la inclusión en el es udio ( e ospec i o). En caso de no ene ninguna
de e minación an e io , se debía ealiza una ecoca diog a ía p e ia a la inclusión que
pe mi ie a con i ma la exis encia de c i e ios de HVI (p ospec i a). Además del espeso sep al
y/o pa ed en icula se egis ó el pa ón de dis ibución de la HVI.
Los es udios ecoca diog á icos se lle a on a cabo po los médicos especialis as de cada una de
las consul as ex e nas de ca diología de los ocho cen os pa icipan es ( e abla 4.2), siguiendo
las ecomendaciones de la Sociedad ame icana de ecoca diog a ía 188.
42
MATERIALES Y METODOLOGÍA
4.4 Ex acción de mues as de sang e pa a los es udios a ealiza en DBS
Las mues as de sang e des inadas a los es udios de c ibado enzimá ico y análisis molecula del
gen GLA sob e mues a de DBS, se ecogie on en las consul as ex e nas de ca diología de los
cen os pa icipan es ( abla 4.2).
La sang e se ob u o po dos p ocedimien os di e en es, siguiendo las ecomendaciones emi idas
po nues o labo a o io, eligiendo uno u o o según c i e io de cada cen o: En el p ime
p ocedimien o la sang e se ob u o median e lebo omía de la ena cubi al, u ilizando una
palomilla de ex acción de sang e con ac i ación au omá ica y po a ubos p emon ado (BD
Vacu aine ® Push Bu on, Bec on Dickinson™ o simila ) pa a ecoge un olumen a iable de
sang e enosa en ubos de acío que con enían el an icoagulan e sal dipo ásica del ácido
e ilendiamino e aacé ico (K2EDTA) a concen ación de 1,8 mg/mL (BD Vacu aine ®, Bec on
Dickinson™ o simila ). Una ez ob enida la sang e, se homogeneizó el con enido del ubo
median e in e sión sua e y se oma on 35 μL del homogeneizado, deposi ándose de o ma
con inua en cada una de las á eas delimi adas de las a je as de papel de il o Wha man nº 903
(Wha man™, GE Heal hca e™). En el segundo p ocedimien o la sang e se ob u o median e
punción de la ena digi al palma del dedo índice, deposi ándose una sola go a de sang e en
cada una de las á eas delimi adas de las a je as de papel de il o Wha man nº 903. ( e igu a
4.2)
Figu a 4.2. Ta je a de papel de il o u ilizada en el es udio de c ibado.
T as deposi a la sang e, se codi icó anonimizándose la iden idad del pacien e y se p ocedió al
pos e io secado du an e un mínimo de cua o ho as a empe a u a y humedad ela i a
ambien e. Finalizado el secado, las a je as se conse a on den o de una bolsa de plás ico de
43
MATERIALES Y METODOLOGÍA
cie e he mé ico (eliminando el ai e esidual) jun o con un ma e ial hig oscópico, a empe a u a
de e ige ación (+4 ºC) du an e un pe íodo máximo de es días has a el momen o del en ío al
labo a o io median e se icio de mensaje ía, siguiendo las ecomendaciones p e iamen e
publicadas 189,190.
4.5 Ex acción de mues as de sang e pa a los es udios a ealiza en plasma,
concen ado de leucoci os, DNA y RNA
Las mues as de sang e des inadas a los es udios uncionales sob e mues a de plasma,
concen ado de leucoci os, DNA y RNA, se ecogie on en las consul as ex e nas de ca diología
de los cen os pa icipan es mencionados ( abla 4.2)., siguiendo las ecomendaciones emi idas
po nues o labo a o io.
La sang e pa a los es udios del plasma, concen ado leucoci a io y DNA se ob u o median e
lebo omía de la ena cubi al, u ilizando una palomilla de ex acción de sang e con ac i ación
au omá ica y po a ubos p emon ado (BD Vacu aine ® Push Bu on, Bec on Dickinson™ o
simila ) pa a ecoge 10 mL de sang e enosa en ubo de acío con an icoagulan e K2EDTA (BD
Vacu aine ®, Bec on Dickinson™ o simila ); una ez ob enida la sang e, se homogeneizó el
con enido del ubo median e in e sión. Adicionalmen e, pa a lle a a cabo es udios sob e el
RNA se solici a on 5 mL de sang e enosa ecogida en 2 ubos (2,5 mL/ ubo) PAXgene® Blood
RNA ube (P eAnaly ix™, Bec on Dickinson™/Quiagen™) que con enían un eac i o químico que
pe mi e la es abilización del RNA o al (me odología de ex acción según ecomendación del
ab ican e).
Las mues as de sang e se codi ica on con el mismo código que se le asignó a la mues a de DBS
y se en ia on el mismo día de la ex acción, median e se icio de mensaje ía, man eniéndolas a
empe a u a de e ige ación (+4 ºC) has a la ecepción en el labo a o io 24h pos -ex acción.
Se sepa ó el plasma de las células sanguíneas, de las mues as de sang e con K2EDTA, median e
cen i ugación a 2.000xg du an e 10 minu os a empe a u a ambien e en una cen í uga
Alleg a® X-15R (Beckman Coul e ™). La ase supe io (plasma) se alicuo ó con enien emen e en
mic o ubos de 1,5 mL (Daslab) p e iamen e codi icados. El olumen de plasma aislado ue
econs i uido añadiendo el mismo olumen de una solución de sue o salino NaCl 0,9% (p/ )
(PM=58,4 g/mol; Sigma-Ald ich®) es é il pa a e i a al e a la concen ación de elemen os
celula es. De es e econs i uido, se sepa ó un olumen de 3 mL que se congeló a -20ºC pa a
50
MATERIALES Y METODOLOGÍA
Pa a alo a el uso en ensayos molecula es del RNA o al aislado y/o pu i icado, se acep ó como
c i e io de idoneidad la obse ación de una banda de amaño 1,9 kb (RNA ibosomal 18S) y o a
banda de amaño 5 kb (RNA ibosomal 28S).
4.11 De e minación de ma cado es biológicos sub ogados a la EF
En es e es udio como ma cado es biológicos analizamos en mues a de o ina y plasma K2EDTA
conse ada a -80ºC, la concen ación de la Gb3 ( e apa ado 4.5.) y la concen ación de la Liso-
Gb3 ( e apa ado 4.4.) espec i amen e. Ambos me aboli os ue on en iados median e
anspo e especial en nie e ca bónica y analizados en sendos labo a o io de e e encia: La Gb3
ue analizada po el D . Kai B uns en el Ins i u o de Química Clínica y Labo a o io de Medicina
del Cen o de Médico de la Uni e sidad Johannes Gu enbe g de Mainz (Alemania) y la Liso-Gb3
ue analizada po los doc o es José Ma ía He nández Pé ez y Lou des Flu iá Cams en la Unidad
de P o eómica y Me abolómica del Hospi al Uni e si a i Ge mans T ias i Pujol de Badalona,
Ba celona (España).
4.11.1 De e minación de la concen ación de Gb3 en o ina
La cuan i icación de la Gb3 se ealizó de acue do a la me odología p e iamen e publicada po
K ugë e al. 2010 191. B e emen e, se oma on 200 µL de o ina descongelada ( e apa ado 4.5.)
y se le añadie on 1.200 µL de una mezcla 2:1 de TCM:me anol (MeOH) ( / ) y 20 µL de una
solución de es ánda in e no (EI) de concen ación 0,5 mg/L de Gb3 modi icada co alen emen e
(N-hep adecanoil-Gb3, e igu a 4.3) (Ma eya LLC) en una mezcla 2:1 de TCM:MeOH ( / ) como
disol en e. La mezcla an e io se sonicó du an e 5 minu os, se homogeneizó median e ó ice y
se cen i ugó 2.800xg du an e 10 minu os. Finalizado es e pe íodo, se secó el sob enadan e
median e el uso de una cen í uga de acío y se esuspendió el p ecipi ado con 1.000 µL de TCM
pa a se sonicado de nue o, homogeneizado y cen i ugado a 13.000xg du an e 10 minu os. La
Gb3 se sepa ó del p oduc o an e io median e ex acción en ase sólida, u ilizando como ase
es aciona ia pe las de sílica (100 mg/mL) al amen e e en i as pa a compues o apola es
equilib adas con MeOH y TCM; una ez el p oduc o in e accionó con la ase es aciona ia se la ó
con MeOH y e il-ace a o y se eluyó el me aboli o con una mezcla 8:2 de ace ona:MeOH ( / ). El
elua o se secó con una cen í uga de acío y se esuspendió el p ecipi ado con 100 µL de MeOH
pa a se sonicado de nue o, homogeneizado y cen i ugado a 13.000xg du an e 10 minu os. El
sob enadan e ob enido ue ans e ido a iales de c is al y es aba lis o pa a se analizado po
CL.

51
MATERIALES Y METODOLOGÍA
Se gene a on los calib ado es de la Gb3 a pa i de conjun os de o inas ecolec adas du an e 24
ho as de indi iduos no a ec os de la EF. Es os conjun os de o inas se p ocesa on de la misma
mane a que las mues as de los pacien es. El p ecipi ado ob enido median e secado a acío se
esuspendió con una solución de la Gb3 de po cino (es ánda ex e no, EE) de concen ación
conocida en la mezcla 2:1 de TCM:MeOH ( / ) como disol en e. Los calib ado es ob enidos
aba caban el ango (0,0-7,2) mg/L.
Se p ocedió con la EM: la agmen ación y cuan i icación del me aboli o se ealizó en modo
elec oesp ay con un ins umen o iple-cuad upolo (TSQ Quan um Disco e y, The moFishe
Scien i ic).
La concen ación de la Gb3 en las mues as de o ina de los pacien es se no malizó con la
concen ación de la c ea inina de las mismas y el esul ado se exp esó como mg de Gb3 po
mmol de c ea inina. El alo de e e encia del labo a o io ue meno de 0,03 mg Gb3/mmol
c ea inina pa a ambos géne os
Figu a 4.3. Isóme os con o macionales empleados como es ánda ex e no (A) e in e no (B) en el p oceso de
c oma og a ía líquida-espec ome ía de masas pa a la cuan i icación de la Gb3 en mues a de o ina. Fuen e:
imagen adap ada de www.ma eya.com.
4.11.2 De e minación de la concen ación de Liso-Gb3 en plasma
La cuan i icación de la Liso-Gb3 se ealizó, con lige as modi icaciones sob e el mé odo publicado
po Bou in e al. 2012 192. B e emen e, las alícuo as de plasma K2EDTA ( e apa ado 4.4.) se
descongela on a +4ºC y se homogeneiza on median e agi ación con ó ice y sonicación. Como
paso p e io al aislamien o del me aboli o en la mues a de plasma, ue necesa io acondiciona
el ca ucho de ex acción en ase sólida (Oasis®MCX, Wa e s Co p.) median e la adición
secuencial de 1.200 µL de MeOH y 1.200 µL HCl 1,0 mol/L en H2O de g ado ap o pa a CL como
disol en e. Una ez acondicionado el ca ucho, se ca ga on con una mezcla de 200 µL de plasma
sonicado, 500 µL de una solución de EI de concen ación 4,0 nmol/L de 1-β-D-glucosiles ingosina
de o igen ege al ( e igu a 4.4, Ma eya LLC) en MeOH como disol en e y 100 µL de una
52
MATERIALES Y METODOLOGÍA
dilución de HCl 1,0 mol/L en H2O de g ado ap o pa a CL como disol en e. T as inaliza la ca ga
de la mezcla an e io , se p ocedió al la ado secuencial del ca ucho con una solución al 2,0% de
ácido ó mico (AF; m/ ) en H2O de g ado ap o pa a CL y con o a solución al 0,2% de AF (m/ ) en
MeOH. Los me aboli os e enidos ue on eluidos median e la adición al ca ucho de 4,0 mL de
una solución al 5,0% de amoniaco ( / ) en MeOH. El elua o se ecogió en ubos de c is al y se
secó con una cen í uga de acío; el p ecipi ado ob enido se esuspendió con una mezcla
50:28,8:0,2 de ace oni ilo:AF:H2O de g ado CL ( / ) y se ans i ió a iales de c is al ap os pa a
la CL.
Los calib ado es de la Liso-Gb3; se gene a on median e conjun os de plasmas K2EDTA de
indi iduos no a ec os de la EF a los que se les deplecionó la Liso-Gb3 endógena median e
a amien o de los mismos con ca bón dex ano du an e 12 ho as a +4ºC; una ez se eliminó el
me aboli o endógeno se p ocesa on de la misma mane a que las mues as de plasma de los
pacien es. El p ecipi ado ob enido median e secado a acío se esuspendió con una solución de
la Liso-Gb3 (EE) de concen ación conocida en la mezcla 50:28,8:0,2 de ace oni ilo:AF:H2O de
g ado CL ( / ) como disol en e. Los calib ado es ob enidos aba caban el ango (0,0-400,0)
nmol/L.
La agmen ación y cuan i icación del me aboli o asociada al p oceso de EM, se ealizó en modo
elec oesp ay posi i o con un ins umen o iple-cuad upolo (Agilen 6410 T iple Quad upole
LC/MS, Agilen Technologies).
La concen ación de la Liso-Gb3 en las mues as de plasma K2EDTA de los pacien es se exp esó
como nmol Liso-Gb3 po li o de plasma. El alo de e e encia del labo a o io ue meno de 1,0
nmol Liso-Gb3/L pa a ambos géne os.
Figu a 4.4. Isóme os con o macionales empleados como es ánda ex e no (A) e in e no (B) en el p oceso de
c oma og a ía líquida-espec ome ía de masas pa a la cuan i icación de la Liso-Gb3 en mues a de plasma K2EDTA.
Fuen e: imagen adap ada de www.ma eya.com.
53
MATERIALES Y METODOLOGÍA
4.12 Medida de la ac i idad de la enzima α-galac osidasa A
4.12.1 Medida de la ac i idad enzimá ica en mues as de go a de sang e seca
El ensayo de la ac i idad de la α-Gal A en DBS se ealizó po iplicado y ue lle ado a cabo según
el mé odo desc i o po Chamoles e al 2001 193. B e emen e, median e un oquel se ob u o un
disco de 3 mm Ø de la mues a de DBS, se deposi ó en un mic o ubo de 1,5 mL
con enien emen e codi icado y se incubó a empe a u a ambien e con una solución de 0,25 M
de N-Ace il-D-galac osamina p epa ada en dH2O (Sigma-Ald ich®, S . Louis, MO, EE. UU.), como
inhibido de especí ico de la enzima α-galac osidasa B. A es e p oduc o se le añadió una solución
de 5 mM del sus a o luo ogénico 4-me ilumbeli e il-α-D-galac opi anósido (4-MU-Gal) (Sigma-
Ald ich®, S . Louis, MO, EE. UU.) p epa ado en ampón 0,07 M ci a o / 0,15 M os a o (Pan eac)
a pH=4,6. Las mues as se incuba on a 37ºC du an e 20 ho as en un baño e mos á ico seco con
agi ación de 550 pm (The momixe ®, Eppendo ™). Finalizado es e pe íodo, se pa ó la eacción
median e ampón alcalino 0,1 M de e ilendiamina diluida en dH2O a pH=11,4 (Sigma-Ald ich®).
El p oduc o luo escen e 4-me ilumbeli e eona (4-MU) ob enido se midió con una cube a de
cua zo de 10,0 x 4,0 mm de paso óp ico (Hellma®) en un luo íme o Pe kinElme LS-45
(Pe kinElme ®), empleando λexci ación=366 nm y λemisión=445 nm.
Las medidas de luo escencia se in e pola on en una ec a de calib ado cons uida con
calib ado es de di e en e concen ación de 4-MU, aba cando el ango (0,00-0,50) nmol ( igu a
4.5).
Figu a 4.5. Rec a de calib ado de la 4-me ilumbeli e ona pa a los ensayos de ac i idad enzimá ica en DBS.
El esul ado se exp esó como mic omoles de sus a o p ocesado po ho a y po “spo ” y se
no malizó ela i izándolo espec o al alo medio de un conjun o de con oles del mismo géne o
ob enidos en el mismo cen o que el p obando.
54
MATERIALES Y METODOLOGÍA
4.12.2 Medida de la ac i idad enzimá ica en mues as de plasma K2EDTA
El ensayo de la ac i idad de la α-Gal A en plasma K2EDTA se ealizó po iplicado y ue lle ado a
cabo según el mé odo modi icado desc i o po Mayes e al 1981 194. B e emen e, se añadie on
a mic o ubos de 1,5 mL el plasma diluido con dH2O y una mezcla en p opo ción 1:1 de solución
8,75 mM del sus a o 4-MU-Gal en dH2O y ampón 0,2 M ci a o / 0,4 M os a o ( / ) a pH=4,6.
Las mues as se incuba on a 37ºC du an e 2 ho as en e mos a o de bloque seco (Selec a P®).
Finalizado es e pe íodo, se pa ó la eacción median e ampón alcalino 0,2 M de glicina/hid óxido
de sodio (NaOH) en dH2O a pH=11,0 (Sigma-Ald ich®). La 4-MU se midió con una cube a de
cua zo de 10,0 x 10,0 mm de paso óp ico ( e apa ado 4.12.1).
Las medidas de luo escencia se in e pola on en una ec a de calib ado cons uida con
calib ado es de 4-MU, aba cando el ango (0,0-2,0) nmol. El esul ado se exp esó como
nanomoles de sus a o p ocesado po ho a y po mL de plasma K2EDTA.
4.12.3 Medida de la ac i idad enzimá ica en concen ado de leucoci os
El ensayo de la ac i idad de la α-Gal A en mues a de concen ado de leucoci os se ealizó po
iplicado y ue lle ado a cabo según el mé odo modi icado desc i o po Mayes e al 1981 194.
B e emen e, los concen ados de leucoci os ob enidos según el apa ado 4.7, ue on lisados
median e esuspensión en ampón de au ocola o sódico al 1% (m/ ) (Sigma-Ald ich®) y
sonicación (B. B aun Labsonic®U, B. B aun Bio ech. In e na ional) de acue do con el esquema
indicado en la igu a 4.6; a con inuación, se cen i uga on a 2.000xg. du an e 10 minu os a +4ºC
y el sob enadan e ob enido se ans i ió a un nue o mic o ubo de 1,5 mL inme so en baño de
hielo. La concen ación de p o eína o al p esen e en el ex ac o celula se cuan i icó median e
espec o o ome ía de abso ción UV con el espec o o óme o NanoD op™ 2000C a λ=280 nm
y se diluye on a concen ación de abajo 0,0013 mg p o eína/µL u ilizando au ocola o sódico
al 1% como diluyen e.
55
MATERIALES Y METODOLOGÍA
Figu a 4.6. Esquema del p oceso de lisado del concen ado de leucoci os. El colo ojo indica aplicación de pulso de
ul asonido y el colo azul no aplicación del pulso.
Una ez se ob u o el ex ac o leucoci a io a la concen ación de ensayo, se añadie on a
mic o ubos de 1,5 mL una mezcla en p opo ción equi olumé ica de es e ex ac o, solución 14,0
mM del sus a o 4-MU-Gal en dH2O, solución 0,4 M de N-Ace il-D-galac osamina p epa ada en
dH2O y ampón 0,4 M ci a o / 0,8 M os a o ( / ) a pH=4,6. Las mues as se incuba on a 37ºC
du an e 1 ho a en e mos a o de bloque seco. Finalizado es e pe íodo, se pa ó la eacción
median e ampón alcalino 0,3 M de glicina/NaOH en dH2O a pH=10,6. La 4-MU se midió con una
cube a de cua zo de 10,0 x 10,0 mm de paso óp ico ( e apa ado 4.12.1).
Las medidas de luo escencia se in e pola on en una ec a de calib ado cons uida con
calib ado es de 4-MU, aba cando el ango (0,0-3,0) nmol. El esul ado se exp esó como
nanomoles de sus a o p ocesado po ho a y po mg de p o eína o al celula .
4.13 Análisis molecula del gen GLA. Secuenciación capila .
Pa a ealiza el análisis de la secuencia nucleo ídica del gen GLA, se ealiza on ampli icaciones
especí icas de dicho gen median e PCR y pos e io aplicación de écnicas de secuenciación de
p ime a gene ación (mé odo Sange o de los di-deoxi-nucleó idos- i- os a o [ddNTPs].
Pa a ello diseñamos pa ejas de cebado es especí icos median e el p og ama Oligo .7
(Molecula Biology Insigh s Inc., CO, EE. UU.) que cub iesen odas las egiones codi ican es (la
egión 5’-UTR y exones, abla 4.3) así como las egiones no codi ican es (p omo o del gen y
odos los in ones, abla 4.4). Pa a el diseño de los cebado es, omamos como e e encia la
secuencia genómica de dicho gen (NG_007119.1), deposi ada en el eposi o io público del
cen o nacional de in o mación bio ecnológica de Es ados Unidos (NCBI, e enlaces).

56
MATERIALES Y METODOLOGÍA
Tabla 4.3. Cebado es especí icos pa a la ampli icación de las egiones codi ican es del gen GLA.
CEBADOR
5’ - SECUENCIA - 3’
Ta (ºC)
AMPLICÓN (pb)
5’-UTR
CCCACACACCAACCTCTAACGATAC
54,0 424
GGTGACCGGACAGCATAAAT
Exón 1
TAGGGCGGGTCAATATCAAG
54,0 596
TCACACAGAGAAAGTTTAGG
Exón 2
GTGAAATCCCAAGGTGCCTA
54,0 345
GCCATGAGGGCTGTTTCTAA
Exón 3
CCCCAATACCTGGTGAAGTAA
54,0 407
TTTCCAGTATTGTGACAGGGTATTT
Exón 4
GGAAGCTGAGACAGAAGAGT
54,0 494
AGACACAAGGATGACTTTCC
Exón 5
GTAAACTCAAGAGAAGGCTACA
54,0 430
AAAGTTACCTAGATGACCCATA
Exón 6
AGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAG
54,0 349
GGGAAGCAACTGCGATGGTATAAGA
Exón 7
CCAAACTAACAGGGCCACTT
57,5 434
ATGAGCCACCTAGCCTTGAG
Ta=Tempe a u a de anillamien o o hib idación; UTR=Región no aducida (“Un asla ed egion”).
57
MATERIALES Y METODOLOGÍA
Tabla 4.4. Cebado es especí icos pa a la ampli icación de las egiones no codi ican es del gen GLA.
CEBADOR
5’ - SECUENCIA - 3’
Ta (ºC)
AMPLICÓN (pb)
P omo o
AACCCGTCCCATTTAATTCC
59,0 862
CTCGCTATAGCCGTTTGAGG
In ón 1 ag. A
CCCTTTGCTTTTCCATGTGT
59,0 825
TTGCTCTGTAAGCGCAGTTG
In ón 1 ag. B
GGAAGGTTGACATGGAGGAA
59,0 809
TTGCCATTAGCCAAACATGA
In ón 1 ag. C
CCAGAAATAATCATGGTTTAAATGTT
59,0 960
GTATTATCTTCAGGTAGGAAAGGACTT
In ón 1 ag. D
AATACAGTGGTTCTTCCTATGTGTTGG
59,0 845
GGTTTTGCATTTTGGCTAGGCTA
In ón 1 ag. E
TTTGTAATGTTGTGCCAAGTTCC
54,0 871
ACCTCCCATTTATTAGGCACCTT
In ón 2 ag. A
TACAGAAGCTTGTTTAGAAACAGC
59,0 870
AAGGTTATATGGAAATACATGCAC
In ón 2 ag. B
ATGTTTTGTAATAGCTCTTGAGGC
59,0 634
AATCTGCTCATTGGCTATAAATCT
In ón 2 ag. C
CTTGTAATCCGCCCACCTT
59,0 767
CCCTAGCTTCAGTCCTTTGCT
In ón 3
CCAGAGATTTAGCCACAAAGG
59,0 822
GAATTTCCAGCTGGGGCTAT
In ón 4 ag. A
CCCAGGTTCCAACCACTTCTC
59,0 826
CCCTGCCCTCATGAAACTTA
In ón 4 ag. B
AGCCCTCTGTCCATTCATTCT
59,0 916
TAATTGGGCTGTGAAAACAGA
Exón 5 + In ón 5
AAGGCTACAAGTGCCTCCTTT
57,5 521
GGGCCATCTGAGTTACTTGC
Exón 6 + In ón 6
CTCCTTGTTCAAGACCCTGCGGTAG
57,5 785
GGGAAGCAACTGCGATGGTATAAGA
4.13.1 Ampli icación median e PCR de las egiones codi ican es del gen GLA
Las ampli icaciones median e PCR se lle a on a cabo en mic o ubos de 0,2 mL (4 i ude® L d, UK)
inco po ando en es e el DNA aislado ( e apa ado 4.8) y odos los eac i os necesa ios: enzima
58
MATERIALES Y METODOLOGÍA
polime asa del DNA e moes able “Taq”, ampón de eacción de la misma, clo u o de magnesio
(Mg2Cl), deoxi-nucleó idos- i- os a o (dNTPs), cebado es especí icos ( abla 4.3) y ddH2O. Las
p opo ciones de cada uno de los eac i os empleados pa a la eacción de PCR, ue on di e en e
bien si el DNA de pa ida se aisló a pa i de DBS ( e 4.8.1, abla 4.5) bien si ue aislado de sang e
EDTA líquida ( e 4.8.2, abla 4.6).
Tabla 4.5. Es equeome ía pa a la ampli icación de las egiones codi ican es del gen GLA a pa i de DNA de DBS.
REACTIVO
CANTIDAD (µL)
CONCENTRACIÓN FINAL
ddH
2
O lib e DNAasa/RNAasa
11,45
Tampón 10x, Bioline®
2,00
1x
dNTPs (2mM), In i ogen®
2,00
200,000 µM
Mg
2
Cl (50mM), Bioline®
0,60
1,500 mM
Cebado Di ec o (10 µM)
0,40
200,000 nM
Cebado Re e so (10 µM)
0,40
200,000 nM
BIOTAQ™ DNA polime asa 5 UI/µL, Bioline®
0,15
0,038 UI/µL
DNA genómico de DBS
3,00
Volumen inal de eacción=20 µL/amplicón
Tabla 4.6. Es equeome ía pa a la ampli icación de las egiones codi ican es del gen GLA a pa i de DNA de sang e
EDTA líquida.
REACTIVO
CANTIDAD (µL)
CONCENTRACIÓN FINAL
ddH
2
O lib e DNAasa/RNAasa
6,20
Tampón 10x, Bioline®
1,00
1x
dNTPs (2mM), In i ogen®
1,00
200,00 µM
Mg
2
Cl (50mM), Bioline®
0,30
1,50 mM
Cebado Di ec o (10 µM)
0,20
200,00 nM
Cebado Re e so (10 µM)
0,20
200,00 nM
BIOTAQ™ DNA polime asa 5 UI/µL, Bioline®
0,10
0,05 UI/µL
DNA genómico de sang e EDTA líquida (50 ng/µL)
1,00
5,00 ng/µL
Volumen inal de eacción=10 µL/amplicón
La eacción se lle ó a cabo en un e mociclado GeneAmp® PCR Sys em 9700 según el p og ama
é mico indicado en la abla 4.7. El p oduc o de la eacción (amplicón) se comp obó median e
elec o o esis en gel de aga osa al 2% (m/ ) con inción de B -E u ilizando como ampón TAE
1X (30 minu os 90V). El esul ado se documen ó con el equipo desc i o en el apa ado 4.9. Los
amplicones se conse a on bien a +4 ºC pa a pe íodos de conse ación meno es a 3 días bien a
-20ºC pa a pe íodos de conse ación supe io es.
59
MATERIALES Y METODOLOGÍA
Tabla 4.7. P og amas é micos empleados pa a la ampli icación de las egiones codi ican es del gen GLA.
PROGRAMA
REGIONES
PROGRAMA TÉRMICO
GLA CDS 1 Res o
Desna u alización inicial: 94ºC 2’
Ciclo: 45 x (94ºC 30’’ 54,0ºC 30’’ 72ºC 30’’)
Elongación inal: 72 ºC 7’
Conse ación: 4ªC ∞
GLA CDS 2 Exón 7
Desna u alización inicial: 94ºC 2’
Ciclo: 40 x (94ºC 30’’ 57,5ºC 30’’ 72ºC 30’’)
Elongación inal: 72 ºC 7’
Conse ación: 4ªC ∞
No a: se emplea on los mismos p og amas é micos indis in amen e del o igen del DNA aislado.
4.13.2 Ampli icación median e PCR de las egiones no codi ican es del gen GLA
La ampli icación de las egiones no codi ican es del gen GLA se ealizó exclusi amen e a pa i
de mues as de DNA aislado de sang e EDTA líquida (apa ado 4.8.2) de mane a idén ica a lo
desc i o en el apa ado 4.13.1, u ilizándose los cebado es indicados en la abla 4.4. Hubo
modi icaciones en cuan o a la es equeome ía de la eacción ( abla 4.8) y el p og ama é mico
( abla 4.9).
Tabla 4.8. Es equeome ía pa a la ampli icación de las egiones no codi ican es del gen GLA.
REACTIVO
CANTIDAD (µL)
CONCENTRACIÓN FINAL
ddH
2
O lib e DNAasa/RNAasa
5,80
Tampón 10x, Bioline®
1,00
1x
dNTPs (2mM), In i ogen®
1,00
200,00 µM
Mg
2
Cl (50mM), Bioline®
0,30
1,50 mM
Cebado Di ec o (10 µM)
0,40
400,00 nM
Cebado Re e so (10 µM)
0,40
400,00 nM
BIOTAQ™ DNA polime asa 5 UI/µL, Bioline®
0,10
0,05 UI
DNA genómico de sang e EDTA líquida (50 ng/µL)
1,00
5,00 ng/µL
Volumen inal de eacción=10 µL/amplicón
66
MATERIALES Y METODOLOGÍA
la señal en el gel de cada una de las condiciones de compe i i idad y se calculó la a iación en la
a inidad ep esen ando la ec a que elaciona los alo es in e sos de las in ensidades de cada
condición s el exceso de “sonda ía”. La elación de la pendien e de la ec a y la a inidad ela i a
de cada alelo po el ex ac o nuclea es in e samen e p opo cional.
4.17 Análisis de a ian es en egión no codi ican e (in ones)
Pa a comp oba que cie as a ian es en egión no codi ican e (in ones) iden i icadas en el
análisis molecula del gen GLA (apa ado 4.13), pudie an al e a el no mal mecanismo no mal
de ayus e del p e-RNA mensaje o (mRNA), se es udió la molécula complemen a ia (cDNA) del
mRNA del gen GLA.
4.17.1 Sín esis de cDNA o al
Pa a la sín esis de cDNA median e e o ansc ipción del mRNA a pa i del RNA o al aislado en
el apa ado 4.9, se omó 1 μg de RNA o al en un olumen inal de 20 μL. Se u ilizó la ba e ía de
eac i os P imeSc ip ™ 1s s and cDNA Syn hesis Ki (Taka a Bio INC.), siguiendo las
ins ucciones del ab ican e. E n un p ime paso se lle ó a cabo la hib idación de OligodT a las
colas de poli-Adenilación del ex emo 3’ de odas las moléculas mRNA p esen e en el RNA o al
aislado; pa a es e paso se adicionó a 1 μg de RNA o al, una mezcla de eacción que con iene
po cada mues a: 1 μL de cebado OligodT 50 μM, 1 μL de la mezcla de dNTPs (10 mM de cada
dNTP) y can idad su icien e de ddH2O pa a olumen inal de 10 μL. Se incubó en un
e mociclado GeneAmp® PCR Sys em 9700 a 65ºC du an e 10 minu os y después se man u o a
+4ºC. En un segundo luga se lle ó a cabo una eacción de PCR de e o ansc ipción (RT-PCR),
en la que po cada molécula de mRNA que haya hib idado la cola OligodT, se gene a á una
molécula de cDNA ( elación 1:1). Al p oduc o de hib idación OligodT-mRNA se le añadió una
mezcla de RT-PCR que con enía po cada mues a: 5 μL de ampón P imeSc ip 5x, 0,5 μL de
inhibido de RNAasas (40 UI/μL), 1 μL de P imeSc ip e o ansc ip asa (200UI/μL) y can idad
su icien e de ddH2O pa a 10 μL de olumen inal de eacción. Se incubó en un e mociclado
GeneAmp® PCR Sys em 9700 a 42 ºC 60minu os, seguido de 95ºC 5 minu os y después se
man u o a 4ºC. El p oduc o de RT-PCR se conse ó, bien a +4 ºC pa a pe íodos de conse ación
meno es a 3 días bien a -20ºC pa a pe íodos de conse ación supe io es.
La comp obación de la co ec a sín esis de cDNA se ealizó median e ampli icación de un
agmen o del gen cons i u i o β-Ac ina (ACTB, MIM*102630), u ilizando como molde la
molécula de cDNA sin e izada a pa i del mRNA o al.

67
MATERIALES Y METODOLOGÍA
Pa a el diseño de los cebado es, omamos como e e encia la secuencia del ansc i o de mRNA
madu o del gen ACBT (NM_001101.5, NCBI) y se empleó el p og ama Oligo .7 ( abla 4.12).
Tabla 4.12. Cebado es especí icos pa a la ampli icación de una egión del cDNA complemen a io al mRNA del gen
ACTB.
CEBADOR 5’ - SECUENCIA - 3’ Ta (ºC) AMPLICÓN (pb)
Exón 4 – Exón 6
ACACTGTGCCCATCTACGAGG
60,0 621
AGTATGACGAGTCCGGCCCCT
La eacción de PCR se lle ó a cabo en mic o ubos de 0,2 mL y las p opo ciones de cada uno de
los eac i os empleados pa a la eacción se mues an en la abla 4.13.
Tabla 4.13.Es equeome ía pa a la ampli icación de una egión del cDNA complemen a io al mRNA del gen ACTB.
REACTIVO
CANTIDAD (µL)
CONCENTRACIÓN FINAL
ddH
2
O lib e DNAasa/RNAasa
6,24
Tampón 10x, Bioline®
1,00
1x
dNTPs (2mM), In i ogen®
1,00
200,00 µM
Mg
2
Cl (50mM), Bioline®
0,30
1,50 mM
Cebado Di ec o (10 µM)
0,20
200,00 nM
Cebado Re e so (10 µM)
0,20
200,00 nM
BIOTAQ™ DNA polime asa 5 UI/µL, Bioline®
0,06
0,03 UI/µL
cDNA molde
1,00
Volumen inal de eacción=10 µL
La eacción se lle ó a cabo en un e mociclado GeneAmp® PCR Sys em 9700 según el p og ama
é mico indicado en la abla 4.14. El p oduc o de la ampli icación se conse ó a +4ºC has a que
se comp obó median e elec o o esis en gel de aga osa al 2% (m/ ) con inción de B -E
u ilizando como ampón TAE 1X (30 minu os 90V). El esul ado se documen ó con el equipo
desc i o en el apa ado 4.9.
68
MATERIALES Y METODOLOGÍA
Tabla 4.14. P og ama é mico empleado pa a la ampli icación de una egión del cDNA complemen a io al mRNA
del gen ACTB.
PROGRAMA
REGIÓN
PROGRAMA TÉRMICO
ACTB cDNA Exón 4 – Exón 6
Desna u alización inicial: 94ºC 2’
Ciclo: 32 x (94ºC 30’’ 60,0ºC 30’’ 72ºC 30’’)
Elongación inal: 72 ºC 7’
Conse ación: 4ªC ∞
4.17.2 Ampli icación del cDNA del gen GLA
Pa a pode es udia el e ec o de las a ian es in ónicas sob e el hipo é ico ayus e al e na i o,
ue necesa io ob ene una can idad azonable de cDNA especí ico de gen GLA, pa a ello se
ealizó una ampli icación del cDNA de és e como ase p epa a i a pa a usos pos e io es.
Los cebado es ue on diseñados de al mane a que aba case la mayo ex ensión posible de la
molécula de mRNA (1418 pb). Se u ilizó como e e encia la secuencia del ansc i o de mRNA
madu o del gen GLA (NM_000169.2, NCBI) y se empleó el p og ama Oligo .7 ( abla 4.15).
Tabla 4.15. Cebado es especí icos pa a la ampli icación del cDNA complemen a io al mRNA del gen GLA.
CEBADOR 5’ - SECUENCIA - 3’ Ta (ºC) AMPLICÓN (pb)
Exón 1 – Exón 7
TGCAGCTGAGGAACCCAGAACTACA
59,0 1.114
TACCATCGCAGTTGCTTCCCT
La eacción de PCR se lle ó a cabo en mic o ubos de 0,2 mL y las p opo ciones de cada uno de
los eac i os empleados pa a la eacción se mues an en la abla 4.16.
69
MATERIALES Y METODOLOGÍA
Tabla 4.16. Es equeome ía pa a la ampli icación del cDNA complemen a io al mRNA del gen GLA.
REACTIVO
CANTIDAD (µL)
CONCENTRACIÓN FINAL
ddH
2
O lib e DNAasa/RNAasa
34,65
Tampón 10x, Bioline®
5,00
1x
dNTPs (2mM), In i ogen®
5,00
200,000 µM
Mg
2
Cl (50mM), Bioline®
1,50
1,500 mM
Cebado Di ec o (10 µM)
1,00
200,000 nM
Cebado Re e so (10 µM)
1,00
200,000 nM
BIOTAQ™ DNA polime asa 5 UI/µL, Bioline®
0,85
0,085 UI/µL
cDNA molde
1,00
Volumen inal de eacción=50 µL
La eacción se lle ó a cabo en un e mociclado GeneAmp® PCR Sys em 9700 según el p og ama
é mico indicado en la abla 4.17. El amplicón esul an e se conse ó a +4ºC has a que se
ca ac e izó median e geles PAGE no desna u alizan es; el exceden e del amplicón u ilizado en
es a écnica se conse ó a -20ºC pa a usos pos e io es.
Tabla 4.17. P og ama é mico empleado pa a la ampli icación del cDNA complemen a io al mRNA del gen GLA.
PROGRAMA
REGIÓN
PROGRAMA TÉRMICO
GLA cDNA Exón 1 – Exón 7
Desna u alización inicial: 94ºC 2’
Ciclo: 32 x (94ºC 30’’ 59,0ºC 30’’ 72ºC 30’’)
Elongación inal: 72 ºC 7’
Conse ación: 4ªC ∞
4.17.3 Ca ac e ización elec o o é ica del cDNA especí ico del gen GLA
Una ez ob u imos una can idad su icien e de cDNA especí ico del mRNA del gen GLA (apa ado
4.17.2), pa a iden i ica los posibles ansc i os gene ados de di e sos amaños como esul ado
del ayus e del p e-mRNA se eligió la écnica de PAGE no desna u alizan e. Pa a p epa a los
geles de 55 mL de olumen al 6,0% se añadie on los siguien es eac i os, sin deja de
homogeneiza se y en campana ex ac o a: 34,5 mL de dH2O, 14,6 mL de una mezcla de
ac ilamida/bisac ilamida 30,0% en p opo ción 37,5:1,0 (Bio-Rad), 5,5 mL de TBE 10x (T is-Bo a o
0,89 M + EDTA 0,50 M pH=8,0) (Ca lo E ba), 0,3 mL de pe sul a o amónico (APS) 10,0% (m/ )
(Bio-Rad) disuel o en dH2O y 0,03 mL de N,N,N,N’- e ame ilendiamina (TEMED) 0,1 % ( / ) (Bio-
Rad) diluido en dH2O. Una ez polime izado el gel se sume gió en una célula de elec o o esis
70
MATERIALES Y METODOLOGÍA
e ical P o ean® II xi Cell (Bio-Rad) con TBE 1x como ampón de elec o o esis. Se ca gó en cada
uno de los pocillos una mezcla de 15 µL del p oduc o de cDNA especí ico de gen GLA (apa ado
4.17.2) y 5 µL de ampón de ca ga (Xylene Cyanol) y se some ió al p oceso de elec o o esis (3
ho as a 46 mA). Finalizado el p oceso de elec o o esis se sume gió el gel en una mezcla de 500
mL de ampón TBE 1x diluido en dH2O + 1 mL de solución de B -E y se dejó eñi du an e 20
minu os con agi ación po balanceo. El esul ado se documen ó con el equipo desc i o en el
apa ado 4.9 y se compa ó el pa ón de bandas de los suje os con a ian es in ónicas s el
pa ón de bandas de indi iduos con ol.
4.17.4 Análisis molecula del cDNA del gen GLA. Secuenciación capila .
Pa a a a de de ini la a iación en la secuencia nucleo ídica del mRNA del gen GLA, como
consecuencia de un hipo é ico ayus e al e na i o del p e-mRNA, p ocedimos a secuencia el
cDNA especí ico del gen GLA ob enido en el apa ado 4.17.2.
Se op ó po un diseño de PCR anidada del cDNA del gen GLA, di idiendo es e en dos agmen os
solapan es. Los cebado es ue on diseñados u ilizando como e e encia la secuencia del
ansc i o de mRNA madu o del gen GLA (NM_000169.2, NCBI) con el p og ama Oligo .7 ( abla
4.18).
Tabla 4.18. Cebado es especí icos pa a la ampli icación anidada del cDNA complemen a io al mRNA del gen GLA.
CEBADOR 5’ - SECUENCIA - 3’ Ta (ºC) AMPLICÓN (pb)
Exón 1 – Exón 4
TGCAGCTGAGGAACCCAGAACTACA
55,0 616
GTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCT
Exón 3 – Exón 7
GAAGCTAGGGATTTATGCAGATGT
55,0 637
TACCATCGCAGTTGCTTCCCT
La eacción de PCR se lle ó a cabo en mic o ubos de 0,2 mL y las p opo ciones de cada uno de
los eac i os empleados pa a la eacción se mues an en la abla 4.19.
71
MATERIALES Y METODOLOGÍA
Tabla 4.19. Es equeome ía pa a la ampli icación anidada del cDNA complemen a io al mRNA del gen GLA.
REACTIVO
CANTIDAD (µL)
CONCENTRACIÓN FINAL
ddH
2
O lib e DNAasa/RNAasa
5,94
Tampón 10x, Bioline®
1,00
1x
dNTPs (2mM), In i ogen®
1,00
200,00 µM
Mg
2
Cl (50mM), Bioline®
0,60
3,00 mM
Cebado Di ec o (10 µM)
0,20
200,00 nM
Cebado Re e so (10 µM)
0,20
200,00 nM
BIOTAQ™ DNA polime asa 5 UI/µL, Bioline®
0,06
0,03 UI/µL
cDNA molde diluido 1/1.000 con ddH
2
O
1,00
Volumen inal de eacción=10 µL
La eacción se lle ó a cabo en un e mociclado GeneAmp® PCR Sys em 9700 según el p og ama
é mico indicado en la abla 4.20. El amplicón esul an e se comp obó median e elec o o esis
en gel de aga osa (apa ado 4.13.1) y el es an e se conse ó a +4ºC has a que se p ocedió con
la pu i icación y secuenciación capila según los p o ocolos desc i os en los apa ados 4.13.3 y
4.13.4.
Tabla 4.20. P og ama é mico empleado pa a la ampli icación anidada del cDNA complemen a io al mRNA del gen
GLA.
PROGRAMA
REGIÓN
PROGRAMA TÉRMICO
GLA cDNA Anidado Exón 1 – Exón 7
Desna u alización inicial: 94ºC 2’
Ciclo: 32 x (94ºC 30’’ 55,0ºC 30’’ 72ºC 30’’)
Elongación inal: 72 ºC 7’
Conse ación: 4ªC ∞
4.18 Geno ipado poblacional de las a ian es en egión egulado a y egión
no codi ican e.
Pa a conoce la ecuencia en población con ol, de los alelos iden i icados en las zonas no
codi ican es del gen GLA ( e 4.13), se op ó po la écnica de polimo ismos de longi ud de
agmen os de es icción o “RFLP”.
En p ime luga , se analiza on in silico los amplicones que con enían las a ian es di e en es del
alelo sal aje, con la he amien a Res ic ionMappe .3 ( e enlaces) pa a e idencia di e encias
en cuan o a pa ones de es icción en e la secuencia que con enía el alelo sal aje s alelo

72
MATERIALES Y METODOLOGÍA
mu ado. Pos e io men e se p ocedió a ampli ica las egiones de in e és median e PCR ( e
4.13.1 y 4.13.2), co e según el p o ocolo de cada enzima de es icción y e elado del pa ón
de es icción median e elec o o esis. Es o úl imo se ealizó u ilizando gel de aga osa al 1/2/3%
(m/ ) o gel de aga osa de al a esolución NuSie e™GTG™ (Lonza) al 3% (m/ ), dependiendo de
la di e encia de amaño en e los agmen os gene ados, con inción de B -E u ilizando como
ampón TAE 1X (30/60/90 minu os 90V). El esul ado se documen ó con el equipo desc i o en el
apa ado 4.9.
4.19 Es udios cuan i a i os de la exp esión del gen GLA
Pa a de e mina el ni el de exp esión del gen GLA, u ilizamos p ocedimien os de ampli icación
especí ica po PCR y cuan i icación en iempo eal median e de ección de luo escencia (qPCR).
La di e en e química empleada en el diseño de las sondas se mues a en la igu a 4.8.
Pa a nues os expe imen os se decidió emplea sondas de hid ólisis ( igu a 4.8.A), és as son
complemen a ias al cDNA, apo ando especi icidad a la eacción y la cuan i icación del molde se
ealiza combinando la ac i idad exonucleasa 5’->3’ de la DNAp e moes able y del p incipio de
ans e encia de ene gía de esonancia (“Fö s e esonance ene gy ans e ”, FRET).
Se emplea on mezclas come ciales de cebado es y sondas de hid ólisis o TaqMan® (Applied
Biosys ems®, The moFishe Scien i ic) ma cadas con di e en es luo oc omos pa a pode
p e o ma eacciones múl iples en el mismo pocillo ( abla 4.21)
Tabla 4.21. P emezcla de sondas de hid ólisis y cebado es (TaqMan®) empleadas pa a el es udio de exp esión del
gen GLA y del gen de con ol endógeno GAPDH.
GEN (NCBI)1 UNIÓN cDNA FLUORÓFORO/SUPRESOR2 REFERENCIA3 Ta (ºC) AMPLICÓN (pb)
GLA
(NM_000169.2) Ex 2 – Ex 3 FAM™ / MGB Hs00609238_m1 60,0 80
GAPDH
(NM_002046.3) Ex 3 VIC® / MGB Hs99999905_m1 60,0 122
1Secuencia de e e encia ecogida en NCBI ( e enlaces).
2
P emezcla de cebado es y sondas según Applied Biosys ems® ( e enlaces).
73
MATERIALES Y METODOLOGÍA
Figu a 4.8. Rep esen ación esquemá ica de las di e en es ap oximaciones químicas empleadas en el es udio
cuan i a i o de la exp esión génica median e qPCR.
(A) Sondas de hid ólisis o sondas TaqMan™; compues a po una secuencia de DNA complemen a ia a la egión diana,
una molécula luo escen e (F) en 5’ y una molécula sup eso a o “quenche ” (S) en 3’; en la ase de sín esis ca alizada po
la DNAp, se p oduce hid ólisis de la sonda, libe ación de F y FRET. (B) Sondas de hid ólisis con doble molécula sup eso a
o sondas ZEN™; p esen a una composición simila a (A) en el que se incluye una molécula sup eso a ex a (S2) si uada a
9-10 pb de F en 5’; p esen a como en aja espec o a (A) la educción del uido de ondo en las e apas iniciales de la
eacción. (C) Balizas molecula es o Molecula Beacons™; compues a po una secuencia de DNA complemen a ia a la
egión diana, una molécula luo escen e (F) en 5’ y una sup eso a (S) en 3’; la sonda an es de la hib idación pe manece
en o ma de ho quilla lo que hace que F y S se si úen p óximos en el espacio; en el momen o de la hib idación con el
DNA complemen a io de la egión diana, la sonda se linealiza haciendo que F y S se dis ancien lo su icien e como pa a
p oduci se luo escencia. (D) Sondas Eclipse; p esen a en el ex emo 3’ de la sonda una molécula luo escen e (F) y en
el ex emo 5’ de la misma una molécula sup eso a (S) y una molécula de unión al su co meno del DNA (“Mino G oo e
Binde ”, MGB); la sonda an es de la hib idación pe manece empaque ada en o ma de bo ina pe mi iendo que F y S
es én p óximos espacialmen e; el mecanismo de hib idación con el DNA complemen a io a la egión diana y gene ación
de luo escencia, es muy simila al desc i o en (C) pe o se encuen a asis ido po la in e acción no co alen e de las bases
ni ogenadas del su co meno del DNA con la molécula MGB. (E) Sondas de hib idación dual; compues a po dos
secuencias de DNA complemen a ias a la egión diana y adyacen es en e sí, además de una molécula luo escen e
di e en e en cada sonda (F1 en 5’ de sonda 1 y F2 en 3’ de sonda 2); a di e encia de las sondas basadas en hid ólisis, la
hib idación adyacen e de ambas sondas pe mi e que uno de los luo ó o os emi a ene gía al p opicia se el enómeno
FRET po la p oximidad espacial de ambos luo ó o os. (F) Sondas esco pión o Sco pions®; p esen an una composición
muy simila a (C) uniéndosele a S de mane a co alen e un cebado (Ce) de PCR; Ce hib ida con el DNA complemen a io
de la egión diana y comienza la sín esis de la cadena complemen a ia, una ez es o ocu e la ho quilla se linealiza
du an e la ase de desna u alización pos e io , p opiciando la hib idación de és a con el DNA complemen a io
sin e izado; es a si uación a o ece el enómeno FRET al aumen a la dis ancia espacial en e S y F. (G) Cebado de PCR
luo ogénico después de la ex ensión o Cebado es de PCR LUX®; p esen a una composición simila a (F) sal o que ca ece
de molécula sup eso a ya que el e ec o de és a es suplido po la in e acción de F con la es uc u a secunda ia en o ma
de ho quilla del DNA complemen a io de la sonda; una ez que Ce hib ida con el DNA complemen a io de la egión diana
y comienza la sín esis del DNA complemen a io, F es capaz de gene a luo escencia debido al cambio con o macional
de la molécula de DNA. (H) Cebado de PCR Qzyme™; el diseño de es e ipo de sondas es más complejo ya que po una
pa e se compone una secuencia an isen ido pa a un DNA con acción ca alí ica o deoxi ibozima y po o a pa e de una
sonda de hid ólisis simila a la desc i a en (A) que unciona como sus a o del deoxi ibozima; el deoxi ibozima inac i o
hib ida pa cialmen e con la secuencia de DNA complemen a ia a la egión diana y median e una eacción de PCR se
gene a el deoxi ibozima sen ido ac i o; a con inuación se le suminis a el sus a o especí ico que no es ni más ni menos
que la sonda de hid ólisis que con iene F y S; median e la acción deoxi ibozima sob e la sonda, se libe a F y se p oduce
FRET.
74
MATERIALES Y METODOLOGÍA
Las eacciones de qPCR se lle a on a cabo u ilizando plás icos óp icamen e compa ibles: placas
de 96 pocillos de ondo cónico y olumen de 0,2 mL, selladas con láminas de plás ico (Applied
Biosys ems®); de cada eacción se ealiza on éplicas écnicas ( iplicados). En cada pocillo se
inco po ó el cDNA sin e izado ( e apa ado 4.17.1) y odos los eac i os necesa ios: la mezcla
maes a, la mezcla de cebado es y sondas especí icas ( abla 4.20) y ddH2O. Las p opo ciones de
cada uno de los eac i os empleados pa a la eacción de qPCR se ecogen abla 4.22.
Tabla 4.22. Es equeome ía pa a el es udio de exp esión del gen GLA y el gen de con ol endógeno GAPDH.
REACTIVO
CANTIDAD (µL)
CONCENTRACIÓN FINAL
Mezcla maes a 2x, Applied Biosys ems®
10,0
1x
ddH
2
O lib e DNAasa/RNAasa
6,0
P emezcla cebado es+sondas GLA-FAM 20x Applied Biosys ems®
1,0
1x
P emezcla cebado es+sondas GAPDH-VIC 20x Applied Biosys ems®
1,0
1x
cDNA molde 10 ng/µL
2,00
1 ng/µL
Volumen inal de eacción=20 µL
La eacción se lle ó a cabo en un equipo de PCR a iempo eal S epOnePlus™ Real-Time PCR
Sys em (Applied Biosys ems®) según el p og ama é mico indicado en la abla 4.23. Los da os de
ciclo umb al (C , ciclo de PCR en el que la luo escencia ecogida es es adís icamen e signi ica i a
espec o a la línea base o uido de ondo) y des iación es ánda (DE) de las éplicas écnicas,
ue on ecogidos median e el p og ama S epOnePlus™ So wa e 2.3 (Applied Biosys ems®).
Tabla 4.23. P og ama é mico empleado pa a el es udio de exp esión del gen GLA y el gen de con ol endógeno
GAPDH.
PROGRAMA
PROGRAMA TÉRMICO
GLA/GAPDH qPCR
Desna u alización inicial: 95ºC 10’
Ciclo: 40 x (96ºC 15’’ 60,0ºC 1’ )
Conse ación: 4ªC ∞
= Adquisición de luo escencia.
4.19.1 De e minación de la e iciencia ciné ica de la eacción de qPCR
De acue do con las ecomendaciones p opues as 204, se de e minó la e iciencia ciné ica de la
eacción múl iple de exp esión del gen diana (GLA) y del gen de con ol endógeno, ealizando
pa a cada gen una cu a de calib ado independien e. Pa a ello, se pa ió de una mezcla de cDNA
de di e en es indi iduos sanos (p opo ción de a ones y muje es 1:1) a 50 ng/µL (can idad inal
en la eacción=100 ng) y se ealiza on diluciones se iadas 1/10 has a ob ene un ango dinámico
75
MATERIALES Y METODOLOGÍA
100-0,01 ng de cDNA. Se p e o mó la eacción de cada pun o de la cu a po iplicado siguiendo
las condiciones desc i as en las ablas 4.21 y 4.22. Se ep esen ó el log10 de la can idad de cDNA
molde en cada dilución s C medio ob enido de las éplicas écnicas de dicha dilución; se ealizó
un ajus e de los pun os a una línea ec a y se ob u o la ecuación de la misma, así como el
coe icien e de de e minación (R2). La e iciencia de la eacción se de e minó de acue do a la
ecuación 4.2.
Ecuación 4.2. Cálculo de la e iciencia ciné ica de la eacción de qPCR.
E=10-1/pendien e ec a
E=E iciencia ciné ica de la eacción de qPCR.
Se acep ó como c i e io de idoneidad cuando la ec a ob enida ue lineal (R2>0,980), la
a iabilidad de las éplicas e a baja (DE<1,60) y el esul ado de la ecuación 4.2 se encon aba en
el ango (1,6-2,1).
Se calculó la e iciencia ciné ica pa a cada gen den o de la eacción múl iple y pos e io men e,
analizamos que las e iciencias de ambos genes ue an simila es y no p esen asen g andes
disco dancias; pa a ello se ep esen ó el log10 de la can idad de cDNA molde en cada dilución s
(C GLA - C Gen Con ol endógeno).
Se acep ó como c i e io de idoneidad cuando la pendien e de la ec a ob enida ue meno que
0,1.
4.19.2 No malización de los da os de exp esión génica de e minados median e
qPCR
Pa a con ola la a iabilidad an o analí ica como p eanalí ica, seguimos las ecomendaciones
p opues as 204 y los da os de exp esión del gen GLA se no maliza on espec o a la exp esión de
un gen de con ol endógeno o cons i ucional que se conside ó es able en sang e pe i é ica; en
es e caso se eligió el gen codi ican e pa a la enzima glice aldehído-3- os a o deshid ogenasa
(GAPDH; MIM*138400).
La no malización se ealizó según lo indicado en la ecuación 4.3.

81
RESULTADOS
5 Resul ados
5.1 Desc ipción de la mues a de es udio
El eclu amien o de los pacien es, según los c i e ios indicados en la abla 4.1, comenzó en e
julio de 2011 y eb e o de 2012 (según cen os) y inalizó en mayo del mismo año. Se eclu a on
un o al de 367 pacien es con MHVI de o igen desconocido, cons i uyendo la mues a ( abla
5.1).
Tabla 5.1. Ca ac e ís icas demog á icas y de explo ación ecoca diog á ica de la población de es udio
VARIABLE RESULTADO EN LA MUESTRA
Edad (años)
n(n pe didos) 367(0)
Mediana(P25-P75) 63,0(50,0-73,0)
Edad Muje es
n(%) 118(32,2)
Mediana(P25-P75) 68,0(57,0-76,0)
Edad Va ones
n(%) 249(67,8)
Mediana(P25-P75) 61,0(48,0-70,0)
IMC (kg m-2)
n(n pe didos) 364(3)
Mediana(P25-P75) 27,4(24,8-30,8)
C ea inina sang e (mg/dL)
n(n pe didos) 359(8)
Mediana(P25-p75) 0,9(0,8-1,1)
EVI (mm)
n(n pe didos) 366(1)
Mediana(P25-p75) 18,0(16,0-22,0)
Geome ía HVI n(n pe didos) 236(101)
Sep al n(%) 58(24,6)
Concén ica n(%) 135(57,2)
Apical n(%) 43(18,2)
EVI=Espeso del sep o en icula y/o pa ed en icula izquie da pos e io ; IMC=Índice de masa co po al;
HVI=Hipe o ia de en ículo izquie do; P25-P75=Pe cen il 25-Pe cen il 75.
Es e g upo es u o compues o po 249 a ones (67,8%) y 118 muje es (32,2%), siendo los
p ime os más jó enes que los segundos (p<0,001). No se encon a on más di e encias
signi ica i as al es a i ica po géne o en dicho g upo de pacien es. Se obse ó que los
82
RESULTADOS
pacien es, independien emen e de su géne o, p esen aban sob epeso, un EVI de 18,0(16,0-
22,0) mm y que el pa ón geomé ico más ecuen e en la HVI ue el concén ico (57,2%).
Analizando las ca ac e ís icas de las submues as es a i icadas po cen o eclu ado ( abla 5.2),
obse amos que no hay di e encias signi ica i as en e los di e en es cen os al alo a edad,
IMC y EVI en e los cen os.
Tabla 5.2. Ca ac e ís icas demog á icas y de explo ación ecoca diog á ica de la población de es udio, es a i icada
po cen o eclu ado .
CENTRO MUJERES* VARONES* TOTAL*
H. G.U. de Alican e
Edad (años) 68,0(62,0-79,2) ‡ 61,0(44,8-71,4) 63,5(45,8-71,4)
IMC (kg m-2) 28,5(25,8-36,4) 27,6(25,6-31,2) 27,9(26,1-31,2)
EVI (mm) 18,0(17,0-19,0) 19,0(25,0-22,4) 18,0(15,8-20,8)
n 22 54 76
H. U. Pue a de Hie o
Edad (años) 57,5(43,8-74,3) 56,5(45,0-68,2) 56,0(42,5-67,0)
IMC (Kg/m2) 25,0(23,2-30,5) 27,1(25,3-29,4) # 27,5(24,4-30,1)
EVI (mm) 20,0(15,8-23,0) 21,4(18,8-27,0) 20,0(16,8-26,0)
n 26 45 71
H. C. U. de San iago de Compos ela
Edad (años) 57 65 -
IMC (Kg/m2) ND 24,5 -
EVI (mm) ND 17,0 -
n 1 1 2
Uni e sidad de Mu cia
Edad (años) 66,5(60,0-76,8) ‡ 63,5(51,8-74,0) 67,0(58,5-74,8)
IMC (Kg/m2) 29,4(24,9-32,4) 27,2(25,1-30,0) 27,4(24,2-31,2)
EVI (mm) 18,0(16,0-24,0) 19,5(16,0-23,4) 18,0(16,0-22,0)
n 31 60 91
H. U. Vi gen de la A ixaca
Edad (años) 68,0(55,0-73,2) 55,0(45,0-68,3) 62,0(49,5-70,4)
83
RESULTADOS
IMC (Kg/m2) 26,6(24,2-29,0) 27,4(24,8-31,7) 27,9(25,3-31,6)
EVI (mm) 18,0(15,0-20,0) 16,0(15,0-22,6) 18,5(15,0-21,0)
n 11 25 36
H. Son Llà ze
Edad (años) 67,0(63,0-74,6)‡ 62,0(47,5-69,6) 62,5(47,8-73,0)
IMC (Kg/m2) 26,0(23,2-30,9) 28,4(26,0-30,9) 28,3(24,5-31,1)
EVI (mm) 19,0(16,8-22,0) 19,0(17,0-21,0) 20,0(16,0-22,0)
n 15 27 42
H. U. G. de Elche
Edad (años) 69,5(59,3-78,3) 67,0(38,0-71,8) 67,0(52,3-72,7)
IMC (Kg/m2) 29,2(27,2-31,7) 25,6(24,5-31,2) 27,7(24,5-31,0)
EVI (mm) 18,0(15,8-20,0) 20,0(16,8-24,0) 19,0(16,3-20,0)
n 6 14 20
H. U. de Donos ia
Edad (años) 76,0(72,0-83,2) 67,0(50,0-78,0) 74,0(50,0-80,0)
IMC (Kg/m2) 25,4(23,8-29,3) 26,2(24,2-29,0) 25,9(24,0-29,1)
EVI (mm) 16,5(15,0-19,4) 17,0(15,0-19,1) 16,5(15,0-19,4)
n 12 24 36
*Edad, IMC y EVI exp esados como mediana(Pe cen il 25-Pe cen il75)
p g ado de signi icación es adís ica pa a la p ueba de U de Mann-Whi ney. ‡p<0,05 #p<0,01‡
5.2 Ac i idad de α-Gal A en DBS y es udio molecula del gen GLA
Se analizó la ac i idad α-Gal A en DBS en odos los indi iduos de la mues a independien emen e
de su géne o según el p o ocolo desc i o en el apa ado 4.12.1, y esul ó que la ac i idad
mediana en la mues a ue de 5,90(4,35-7,92) µmol/spo /h. Cuando se es a i icó po géne o,
los a ones p esen a on una ac i ad enzimá ica signi ica i amen e meno (p=0,014) que las
muje es [5,51(4,12-8,51) s 7,28(4,83-8,70).
El esul ado global de la segunda ase del es udio, o ase de pacien es, se mues a en la igu a
5.1.
84
RESULTADOS
Figu a 5.1. Esquema de las ases y esul ados del es udio.
De acue do con el diseño del es udio ( igu a 4.1), los a ones cuya ac i idad de α-Gal A en DBS
ue ≤70% se les secuenció las egiones 5’-UTR y codi ican es del gen GLA; en el caso de las
muje es, independien emen e de su ac i idad enzimá ica, ue on some idas a la misma
es a egia de secuenciación (G upo de secuenciación).
Se ampli icó la egión 5’-UTR y los exones del gen GLA de acue do al diseño y el p o ocolo del
apa ado 4.13.1. Una ez se ob u ie on los amplicones de las egiones an e io es, se lle ó a cabo
el p oceso de secuenciación del gen según el p ocedimien o indicado en los apa ados 4.13.3 y
4.13.4. El esul ado de es e p oceso ue que en 118 muje es (32,2%) y 67 a ones (18,2%) se
secuencia on las egiones indicadas, ob eniéndose los esul ados indicados en la abla 5.4.
No se iden i icó ninguna a ian e pa ogénica o p obablemen e pa ogénica pa a la EF en el g upo
de secuenciación. Se iden i ica on a ian es gené icas di e en es de sus alelos sil es es en 60
pacien es, incluso algunas de las a ian es coseg egaban en el mismo pacien e. Cie as a ian es
en egión no codi ican e (5’-UTR e in ones) ienden a seg ega en o ma haplo ípica,
denominándose haplo ipos complejos in ónicos (HCI) ( abla 5.3).
85
RESULTADOS
Tabla 5.3. Va ian es gené icas en el gen GLA iden i icadas en el G upo de secuenciación
NM_000169.21
SNP2
GRch38.p123
SILVESTRE/MUTADO
n
c.-125T>G
s185255090
101408028
A/C
1
c.-34C>T
NUEVO
101407947
G/A
1
c.-30G>A
s3027584
100662921
C/T
4
c.192C>T
NUEVO
101407712
G/A
1
c.194+17A>G
s2071226
101407693
T/C
1
c.640-25A>G
NUEVO
101398972
T/C
1
c.937G>T
s28935490
101398432
C/A
2
HCI-I4
c.-10C>T
s2071225
101407913
G/A
14
c.370-81_370-77delCAGCC
s5903184
101401886
GGCTG/-
c.640-16A>G
s2071397
101398962
T/C
c.1000-22C>T
s2071228
101398121
G/A
HCI-II5
c.370-81_370-77delCAGCC
s5903184
101401886
GGCTG/-
19
c.640-16A>G
s2071397
101398962
T/C
c.1000-22C>T
s2071228
101398121
G/A
HCI-III
c.-12G>A
s3027585
101407915
C/T
14
c.548-125C>G
s2071396
101400882
G/C
c.639+68A>G
s3027589
101400882
T/C
c.1000-22C>T
s2071228
101398121
G/A
HCI-I + HCI-III
1
HCI-II + HCI-III
1
HCI=Haplo ipo complejo in ónico; SNP=Va iaciones de un nucleó ido (dbSNP, e enlace).
1Secuencia de e e encia ( e enlace NCBI)
2Iden i icado de SNP ( e enlace dbSNP)
3Posición espec o a la e sión del genoma de e e encia ( e enlace NCBI)
4HCI-I incluye combinaciones con NM_000169.2:376A>G (n=1), NM_000169.2:c.937G>T (n=1), NM_000169.2:c.945C>T (n=1).
5
HIC-II incluye combinaciones con NM_000169.2:c.937G>T (n=1).

86
RESULTADOS
T as busca las a ian es de la abla 5.3 en las bases de da os HGMD, ClinVa , LOVD y dbSNP
ob u imos el siguien e análisis:
1. NM_000169.2:c.-125T>G -> ClinVa clasi ica es a a ian e como p obablemen e
benigna, además en HGMD y LOVD no se encuen an publicaciones elacionadas con
es a a ian e. En nues a población, se iden i icó en una muje en he e ozigosidad
(0,3%).
2. NM_000169.2:c.-34C>T -> No se encuen an en adas en ClinVa , HGMD ni LOVD pa a
es a a ian e. En nues a población, se iden i icó en una muje en he e ozigosidad
(0,3%).
3. NM_000169.2:c.-30G>A -> ClinVa ecoge 1 es udio en el que se in e p e a como
p obablemen e benigna y 2 es udios como benigna. HGMD y LOVD ecogen a ias
publicaciones en las que se ca ego iza como benigna. En nues a población, se iden i icó
en 4 muje es en he e ozigosidad (1,1%).
4. NM_000169.2:c.-12G>A -> ClinVa ecoge 5 es udios en el que se in e p e a como
p obablemen e benigna y 2 es udios como benigna. Ni HGMD ni LOVD ecogen
publicaciones espec o a es a a ian e. En nues a población, se iden i icó en 16 suje os
(4,3%).
5. NM_000169.2:c.-10C>T -> ClinVa ecoge 10 es udios en el que se in e p e a como
p obablemen e benigna y 2 es udios como benigna. HGMD y LOVD ecogen
publicaciones espec o a es a a ian e en los que se obse a una educción de la
ac i idad enzimá ica. En nues a población, se iden i icó en 14 suje os (3,8%).
6. NM_000169.2:c.192C>T (NP_0001601:p.Ile64=) -> No se encuen an en adas en
ClinVa , HGMD ni LOVD pa a es a a ian e. En nues a población, se iden i icó en una
muje en he e ozigosidad (0,3%).
7. NM_000169.2:c.194+17A>G -> ClinVa ecoge 2 es udios en el que se in e p e a como
benigna. Ni HGMD ni LOVD ecogen publicaciones espec o a es a a ian e. En nues a
población, se iden i icó en una muje en he e ozigosidad (0,3%).
8. NM_000169.2:c. c.370-81_370-77delCAGCC -> -> ClinVa ecoge 1 es udio en el que se
in e p e a como benigna. Ni HGMD ni LOVD ecogen publicaciones espec o a es a
a ian e. En nues a población, se iden i icó en 35 suje os (9,5%).
9. NM_000169.2:c.376A>G (NP_000160.1:p.Se 126Gly) -> exis e con lic o espec o a la
in e p e ación de es a a ian e ya que ClinVa ecoge 5 es udios en los que se in e p e a
como p obablemen e benigna y 2 es udios como VUS. HGMD y LOVD ecogen a ias
87
RESULTADOS
publicaciones en las que se ca ego iza como benigna. En nues a población, se iden i icó
en un a ón coseg egando con HCI-I (0,3%).
10. NM_000169.2:c.548-125C>G -> No se ecoge in o mación en ninguna base de da os
consul ada. En nues a población, se iden i icó en 17 suje os (4,6%).
11. NM_000169.2:c.639+68A>G -> No se ecoge in o mación en ninguna base de da os
consul ada. En nues a población, se iden i icó en 17 suje os (4,6%).
12. NM_000169.2:c.640-16A>G -> No se ecoge in o mación en ninguna base de da os
consul ada. En nues a población, se iden i icó en 35 suje os (9,5%).
13. NM_000169.2:c.640-25A>G -> No se ecoge in o mación en ninguna base de da os
consul ada. En nues a población, se iden i icó en 1 suje o (0,3%).
14. NM_000169.2:c.937G>T (NP_000160.1p.Asp313Ty ) -> exis e con lic o espec o a la
in e p e ación de es a a ian e ya que ClinVa ecoge 2 es udios en los que se in e p e a
como benigna, 10 es udios como p obablemen e pa ogénica y 2 es udios como VUS.
HGMD y LOVD ecogen a ias publicaciones en las que se ca ego iza como benigna o
polimo ismo de pseudo-de iciencia. En nues a población, se iden i icó en 4 muje es en
he e ozigosidad o coseg egando con HCI-I y II (1,1%).
15. NM_000169.2:c.945C>T (NP_000160.1p.Asp315=) -> exis e con lic o espec o a la
in e p e ación de es a a ian e ya que ClinVa ecoge 1 es udio en el que se in e p e a
como benigna, 4 es udios como p obablemen e pa ogénica y 1 es udio como VUS. En
HGMD y LOVD no se encuen an publicaciones asociadas a es a a ian e ecoge a ias
publicaciones en las que se ca ego iza como benigna o polimo ismo de pseudo-
de iciencia. En nues a población, se iden i icó en 4 muje es en he e ozigosidad o
coseg egando con HCI-I y II (1,1%).
16. NM_000169.2:c.1000-22C>T -> ClinVa ecoge 3 es udios en el que se in e p e a como
benigna. Ni HGMD ni LOVD ecogen publicaciones espec o a es a a ian e. En nues a
población, se iden i icó en 35 suje os (9,5%).
Aquellas a ian es iden i icadas de no o en es a ase del es udio que se pueden conside a VUS
(Pacien e 1 NM_000169.2:c.-34C>T, Pacien e 2 NM_000169.2:c.192C>T y Pacien e 3
NM_000169.2:c.640-25A>C) con inua on la ase de ca ac e ización del es udio. Debido a la
ele ada ecuencia en nues a mues a las a ian es que con o man los di e en es HCI
(NM_000169.2:c.-12G>A, NM_000169.2:c.-10C>T, NM_000169.2:c. c.370-81_370-77delCAGCC,
NM_000169.2:c.548-125C>G, NM_000169.2:c.639+68A>G, NM_000169.2:c.640-16A>G y
NM_000169.2:c.1000-22G>A), con inuamos el es udio de és as en la la ase de ca ac e ización.
88
RESULTADOS
5.3 Es udio epidemiológico de las a ian es iden i icadas en el G upo de
secuenciación
Se ealizó un es udio de ligamien o de los 17 ma cado es o a ian es gené icas ( abla 5.3) en el
G upo de secuenciación de la ase de pacien es del es udio ( igu a 5.1) pa a da nos idea de la
independencia de la seg egación y de la e olución de esos ca ac e es en nues a mues a. Se
obse ó una ele ada endencia a la coseg egación de di e sas a ian es como se ap ecia en la
igu a 5.2, donde un mayo desequilib io en e dos ma cado es hace que el colo i e del azul al
ojo.
Figu a 5.2. G á ico de desequilib io de ligamien o de los 17 ma cado es iden i icados en el G upo de secuenciación.
Analizando la igu a obse amos que el g ado de ligamien o en e algunos ma cado es, que
componen el HCI-I, II y III, ue ele ado ( abla 5.4).
89
RESULTADOS
Tabla 5.4. Resul ado del análisis de desequilib io de ligamien o en el G upo de secuenciación
MARCADORES/VARIANTE GENÉTICAS
D’
R2
NM_000169.2:c.-30G>A ( s3027584) s NM_000169.2:c.548-125C>G ( s2071396)
1,000
0,955
NM_000169.2:c.-30G>A ( s3027584) s NM_000169.2:c.639+68A>G ( s3027589)
0,955
0,913
NM_000169.2:c.370-81_370-77delCAGCC ( s5903184) s NM_000169.2:c.640-16A>G ( s2071397)
1,000
0,902
NM_000169.2:c.370-81_370-77delCAGCC ( s5903184) s NM_000169.2:c.1000-22G>A ( s2071228)
1,000
0,728
NM_000169.2:c.548-125C>G ( s2071396) s NM_000169.2:c.639+68A>G ( s3027589)
1,000
1,000
D’=medida de la he edabilidad de dos ma cado es gené icos; R2=ni el de edundancia es adís ica en e dos ma cado es
Pa a conoce el ni el de asociación de las 17 a ian es gené icas iden i icadas, plan eamos un
modelo de eg esión en el que analizó como a iable dependien e la ac i idad α-Gal A en DBS,
como a iables independien es el con eo de los alelos pa a cada ma cado gené ico, y se in en ó
ealiza un ajus e u ilizando como co a iables el géne o, el IMC, el EVI y la p esencia/ausencia
de HTA. El es udio de asociación pa a las 17 a ian es iden i icadas, indicó que exis ía una
asociación es adís icamen e signi ica i a de la ac i idad α-Gal A en DBS con 4 de las 17 a ian es
iden i icadas, bajo el modelo de he encia ecesi a, pa a los geno ipos hemizigo o y homozigo o
mu ado ( abla 5.5). Las 4 a ian es o man pa e de los HCI-I y II.
Tabla 5.5. Resul ados del es de co elación/ endencia pa a la ac i idad de α-Gal A en DBS y los geno ipos de los
alelos iden i icados en el G upo de secuenciación, bajo el modelo de he encia ecesi a.
MARCADOR/VARIANTE GENÉTICA
ALELO1
COEF. β
P2
p AJUSTADA3
NM_000169.2:c.-10C>T ( s2071225)
T
-0,5857
0,00005
0,0005
NM_000169.2:c.370-81_370-77delCAGCC ( s5903184)
del
-0,3767
0,00246
0,0222
NM_000169.2:c.640-16A>G ( s2071397)
G
-0,4328
0,00117
0,0106
NM_000169.2:c.1000-22G>A ( s2071228)
T
-0,2882
0,00249
0,0224
Va iable dependien e del modelo: L(α-Gal A); Co a iables ajus adas: géne o, IMC, EVI, HTA.
1Alelo mino i a io
2p g ado de signi icación es adís ica pa a el es de co elación endencia
3p ajus ada median e co ección pos hoc de Bon e oni
El análisis de seg egación haplo ípica de las 4 a ian e pa icipan es del HCI-I y II, indicó 16
haplo ipos posibles. Cua o de esos haplo ipos es aban p esen es con una ecuencia del 96,6%
en nues a mues a. El haplo ipo que comp ende las a ian es NM_000169.2:c.-10C>T
( s2071225), NM_000169.2:c. c.370-81_370-77delCAGCC ( s5903184), NM_000169.2:c.640-
16A>G ( s2071397) y NM_000169.2:c.1000-22G>A ( s2071228), y se co esponde con HCI-I,
p esen aba una ecuencia de 7,41%, mien as que el que comp ende las a ian es
NM_000169.2:c. c.370-81_370-77delCAGCC ( s5903184), NM_000169.2:c.640-16A>G
96
RESULTADOS
Figu a 5.6. His og amas del núme o de copias de las egiones codi ican es del gen GLA en los pacien es 1, 2 y 3. En
el eje de abscisas se ep esen an odas las sondas que cub en an o los exones del gen GLA, así como los genes
con ol cons i u i os. En el eje de o denadas se ep esen a la dosis ela i a no malizada de cada una de las sondas
del eje de abscisas. Las ba as ho izon ales se encuen an ubicadas en los pun os de co e de la deleción (0,75) y la
duplicación (1,25).

97
RESULTADOS
5.5 Es udio de ca ac e ización de a ian es que seg egan en o ma de
haplo ipos complejos
De acue do con el esul ado de las a ian es gené icas iden i icadas en el G upo de
secuenciación ( abla 5.3) y con los esul ados del es udio epidemiológico ( abla 5.5 y abla 5.6),
a amos de ca ac e iza los indi iduos que p esen aban los haplo ipos complejos sin
coseg egación de ninguna a ian e clasi icada como VUS, po encialmen e benigna. A endiendo
a es e c i e io, en el g upo de pacien es con HCI I (n=14) excluimos a 3 de ellos al exis i
coseg egación con las a ian e NM_000169.2:c.376A>G, NM_000169.2:c.937G>T y
NM_000169.2:c.945C>T po lo que ca ac e izamos inalmen e n=11 pacien es con HCI I (6
a ones y 5 muje es); espec o al g upo de pacien es con HCI III (n=14) los ca ac e izamos a
odos (6 a ones y 8 muje es).
Los a ones con HCI I e an más jó enes [(61,5(47,5-75,3)] que las muje es [(66,0(59,3-72,8)],
obse ación que se eplica en los pacien es con HCI III 68,0(47,8-76,0) s 70,0(60,3-81,5).
5.5.1 Análisis enzimá ico en mues a de plasma y leucoci os de los pacien es
con haplo ipos complejos
EL análisis enzimá ico se ealizó en mues as de plasma K2EDTA y ex ac o leucoci a io según el
p o ocolo especi icado en el apa ado 4.12.2 y 4.12.3. Se u ilizó la misma población con ol que
la desc i a en el apa ado 5.4.3, pa a con as a los da os de ac i idad enzimá ica en plasma y
ex ac o leucoci a io de los pacien es con HCI I y III. El esul ado de es a de e minación indica
que exis e una educción signi ica i a en los a ones que p esen an el HCI I (p=0,030); es a
educción ue de un 15% de media espec o al alo mediano de la población con ol empa ejada
po géne o ( igu a 5.7)
Figu a 5.7. G á ico de la ac i idad de α-Gal A en plasma K2EDTA (A) y ex ac o leucoci a io (B) en la población con ol
s G upo HCI s G upo HCI III. mediana(Pe cen il25-Pe cen il75). ‡p<0,05
98
RESULTADOS
5.5.2 De e minación de Gb3 en o ina y Liso-Gb3 en plasma de los pacien es
con haplo ipos complejos
Los ni eles de bioma cado es elacionados con la EF se midie on en mues a de o ina y en
mues a de plasma de los 11 pacien es con HCI I y los 14 pacien es con HCI III; se in e p e a on
según los pun os de co e es ablecidos (apa ados 4.11.1 y 4.11.2). Todos los pacien es
independien emen e de su géne o y el haplo ipo que p esen an, mos a on ni eles de Gb3 en
o ina y Liso-Gb3 en plasma po debajo de los pun os de co e es ablecidos en los labo a o ios de
e e encia. En el caso de la concen ación de Gb3 en o ina en los pacien es con HCI III se
encon aba po debajo del lími e de de ección de la écnica ( abla 5.11). La compa ación de los
ni eles de cada bioma cado es a i icando po géne o y/o haplo ipo, no esul a on se
signi ica i as.
Tabla 5.11. Ni eles de Gb3 en o ina y de Liso-Gb3 medidas en el G upo HCI I y HCI III.
PACIENTE
Gb
3
ORINA1,*
Liso-Gb
3
PLASMA2*
Va ones
Muje es
Va ones
Muje es
HCI I
0,105(0,010-0,014)
0,020(0,011-0,030)
0,04(ND-0,27)
0,14(0,03-0,19)
HCI III
ND
ND
0,05(0,03-0,14)
0,07(ND-0,17)
1mg Gb
3
/mmol c ea inina; ango no mal <0,300 mg Gb
3
/mmol
2nmol Liso-Gb3/L; ango no mal <1,00 nmol Liso-Gb3/L
*mediana(Pe cen il 25-Pe cen il 75)
ND=No de ec able
5.5.3 Ca ac e ización elec o o é ica en gel de poliac ilamida al 6% de los
pacien es con haplo ipos complejos
La coseg egación de di e sas a ian es en egiones in ónicas pod ía des egula el ayus e
isiológico del mRNA y gene a ansc i os al e na i os con implicación pa ogénica. Median e
sepa ación elec o o é ica PAGE (apa ado 4.17.3), a pa i de la molécula de cDNA del gen GLA
(apa ado 4.17.1), se compa ó el pa ón de agmen os ob enidos de los pacien es con HCI con
el de las mues as de cDNA de indi iduos con ol de géne o masculino y emenino. No se
iden i ican agmen os de di e en e amaño que los isualizados en los con oles ( igu a 5.9).
99
RESULTADOS
Figu a 5.8. Elec o o esis PAGE 6% (m/ ) de la mues a de cDNA pacien es hemi y he e ozigo os pa a los HCI I y III.
Se incluye un con ol a ón (C XY) y un con ol muje (C XX). HCI=haplo ipo complejo in ónico; PM=ma cado
de pesos molecula es.
5.5.4 Iden i icación de ansc i os al e na i os median e secuenciación del
cDNA comple o del gen GLA en los pacien es con haplo ipos complejos
La secuenciación del cDNA de los pacien es con haplo ipos complejos, u ilizando la écnica de
PCR anidada desc i a en el apa ado 4.17.4, no pe mi ió iden i ica ansc i os al e na i os
debidos a ayus e al e na i o del mRNA.
5.5.5 Pe il de eo denamien os en el gen GLA de los pacien es con haplo ipos
complejos
El análisis de las 5 muje es con HCI I y de las 8 muje es con HCI III, median e écnica de MLPA
(apa ado 4.14), no iden i icó eo denamien os pa ogénicos en el gen GLA. En la igu a 5.9 se
ilus a el his og ama co espondien e, a la dosis ela i a de las sondas p esen es en la mezcla de
eacción, de una muje con HCI ipo I y o a con HC ipo III.
100
RESULTADOS
Figu a 5.9. His og amas del núme o de copias de las egiones codi ican es del gen GLA en los pacien es con
haplo ipos complejos. HCI=haplo ipo complejo in ónico
5.5.6 Análisis de la exp esión génica de los pacien es median e qPCR
Los haplo ipos complejos se componen de una se ie de a ian es gené icas, casi odas de ellas
en egiones in ónicas, pe o además cuen an cada uno de los haplo ipos con una a ian e en
egión 5’UTR. La seg egación del alelo mu ado en es as a ian es, pod ía modi ica la in e acción
de los elemen os ipo T ans y causa una des egulación de la exp esión del gen GLA. Pa a lle a
a cabo es e análisis se u iliza on sondas de hid ólisis o TaqMan pa a el gen diana, así como pa a
el gen cons i u i o GAPDH de acue do con el p o ocolo desc i o en 4.19. A pa i de una mues a
de cDNA con ol, ealizamos las ec as es ánda pa a calcula la e iciencia de las p emezclas de
los cebado es y sondas ( e apa ado 4.19.1). Las ec as pa a las dos sondas mos a on un
coe icien e de de e minación R2>0,99. Los alo es de las e iciencias pa a las sondas ue on:
EGLA=1,99 y EGAPDH=1,86.
Una ez u imos op imizadas las condiciones de eacción se lle ó a cabo una qPCR de las
mues as de los pacien es con haplo ipo complejo y 30 suje os con ol (15 a ones y 15
muje es), po iplicado y siguiendo el p o ocolo de allado en el apa ado 4.19. Se calculó la CR
101
RESULTADOS
de la exp esión de los dos ansc i os a pa i de los alo es de C egis ados pa a cada indi iduo;
compa ándolos con los con oles empa ejados po géne o.
Cuando analizamos odos los indi iduos que p esen an haplo ipos complejos,
independien emen e de su géne o, obse amos una cie a educción de la exp esión del gen en
la submues a de los HCI I que no ue es adís icamen e signi ica i a (p=0,089); po o o lado, la
submues a de los HCI III man ienen unos ni eles de exp esión p ác icamen e iguales a los de
los con oles ( igu a 5.10).
Figu a 5.10. Cuan i icación ela i a del gen GLA en los pacien es con haplo ipos complejos. No se es a i icó po
géne o a los pacien es. mediana(Pe cen il25-Pe cen il75).
Al ealiza la es a i icación de las submues as po géne o, cons a amos que el componen e
p incipal de la educción de la exp esión del gen GLA en pacien es con HCI I son los a ones
( igu a 5.11). La educción de la exp esión es signi ica i a en é minos es adís icos (p=0,038).
Figu a 5.11. Cuan i icación ela i a del gen GLA en los pacien es con haplo ipos complejos es a i icados po
géne o. HCI=haplo ipo complejo in ónico. mediana(Pe cen il25-Pe cen il75). ‡p<0,05

102
RESULTADOS
5.5.7 Iden i icación de nue as a ian es en la egión 5’-UTR y en los in ones
del gen GLA en pacien es con haplo ipos complejos.
La egión codi ican e del gen GLA apenas supone un 10% de la secuencia de és e. Pa a
comp oba la p esencia o ausencia de más a ian es en las egiones no codi ican es del gen, se
plan eó una ampli icación de és as u ilizando un diseño de cebado es que gene an agmen os
solapan es (“p ime walking”) según el p o ocolo indicado en el apa ado 4.13.2. Los amplicones
gene ados se secuencia on de acue do a los p ocedimien os desc i os en 4.13.3 y 4.13.4. Con
una cobe u a del 96%, se secuencia on odos los indi iduos con HCI I y III, iden i icándose en
odos ellos 8 nue os polimo ismos (1 asociado a HCI I y 7 asociados a HCI III) en egiones no
codi ican es bien en hemizigosidad bien en he e ozigosidad bien en homozigosidad. En la abla
5.12 se ecogen las a ian es que con o man el haplo ipo comple o pa a los pacien es con HCI I
y en la abla 5.13 se ecogen las que con o man el haplo ipo comple o pa a los pacien es con
HCI III.
Tabla 5.12. Va ian es gené icas que con o man el HCI I.
NM_00169.21
IVS
SNP2
GRch38.p123
SILVESTRE/MUTADO
c.-769G>C
5’-UTR
s3027580
101408672
C/G
c.10C>T
5’-UTR
s2071225
101407913
G/A
c.369+990C>A
2
s1023431
101402821
T/G
c.370-81_370-77delCAGCC
2
s5903184
101401886
GGCTG/-
c.640-16A>G
4
s2071397
101398962
T/C
c.1000-22C>T
6
s2071228
101398121
G/A
SNP=Va iaciones de un nucleó ido (dbSNP, e enlace); IVS=Región in ónica dónde se de ec a.
En ojo se indica las nue as a ian es in ónicas iden i icadas asociadas a es e haplo ipo.
1Secuencia de e e encia ( e enlace NCBI)
2Iden i icado de SNP ( e enlace dbSNP)
3
Posición espec o a la e sión del genoma de e e encia ( e enlace NCBI)
103
RESULTADOS
Tabla 5.13. Va ian es gené icas que con o man el HCI III.
NM_00169.21
IVS
SNP2
GRch38.p123
SILVESTRE/MUTADO
c.-12G>A
5’-UTR
s3027585
101407915
C/T
c.194+377C>T
1
s57788389
101407333
T/C
c.194+1287T>A
1
s3027587
101406423
A/T
c.195-1663G>A
1
s28452934
101405648
C/T
c.195-807G>T
1
s12394005
101404792
C/A
c.547+190C>T
3
s41311559
101401442
G/A
c.548-125C>G
3
s2071396
101400882
G/C
c.639+68A>G
4
s3027589
101400598
T/C
c.640-386G>A
4
s111232330
101399332
C/T
c.640-136T>C
4
s3027592
101399082
A/T
c.1000-22C>T
6
s2071228
101398121
G/A
SNP=Va iaciones de un nucleó ido (dbSNP, e enlace); IVS=Región in ónica dónde se de ec a.
En ojo se indica las nue as a ian es in ónicas iden i icadas asociadas a es e haplo ipo.
1Secuencia de e e encia ( e enlace NCBI)
2Iden i icado de SNP ( e enlace dbSNP)
3
Posición espec o a la e sión del genoma de e e encia ( e enlace NCBI)
Una ez que se iden i ica on nue as a ian es asociadas a los HCI I y III, se p ocedió a geno ipa
de las nue as a ian es asociadas a los HCI ( ablas 5.12 y 5.13) y las a ian es p e iamen e
asociadas a és os (apa ado 5.2) en una población con ol. A su ez, se geno ipó las nue as
a ian es asociadas a los HCI ( ablas 5.12 y 5.13) en la población del G upo de Secuenciación. La
población que se a oma como con ol son indi iduos sanos, compues o po 50 a ones y 50
muje es. El geno ipado se ealizó median e RFLP y la isualización median e elec o o esis en
gel de aga osa. Median e el uso del p og ama Res ic ion Mappe , se analizó la secuencia
esul an e de la ampli icación u ilizando el diseño de cebado es con emplado en los apa ados
4.13.1 y 4.13.2. Cuando no se pudiese encon a una enzima de es icción adecuada pa a que
co ase los amplicones an e io es, se plan eó un diseño de cebado es degene ados. Es os
cebado es p esen an como ca ac e ís icas que: se diseñan 5’ co ien e a iba del nucleó ido que
que emos geno ipa , p esen a una o a ias bases ni ogenadas di e en e a las que le
co esponde ía en la heb a molde ce ca de la secuencia 3’ del cebado di ec o o e e so e c. Al
in oduci es a/as base/s jun o el nucleó ido donde se localiza la a ian e, es a emos gene ando
un si io de es icción que an es no exis ía y así acili a que alguna enzima econozca esa
secuencia “ o zada” y la co e gene ando un pa ón de es icción al e na i o al ob enido con la
a ian e sil es e. La in o mación del diseño del geno ipado median e RFLPs se encuen a en la
abla 5.14.
104
RESULTADOS
Tabla 5.14. Resumen del p o ocolo de geno ipado de las a ian es asociadas a HCI I y III, median e écnica de RFLPs.
NM_00169.21
HCI
SNP2
CEBADORES3
ENZIMA4
POLÍMERO5
c.-769G>C
I
s3027580
P omo o
Hin I
Aga osa 3%
c.10C>T
I
s2071225
Exón 1
HphI
NuSie e™ 3%
c.369+990C>A
I
s1023431
In ón 2 ag. B
Mbo
Aga osa 1%
c.370-81_370-
77delCAGCC I s5903184 Exón 3 BsaJI NuSie e™ 3%
c.640-16A>G I s2071397
GATGTTAGTAGAAAGTAAACAGAAGAGTG
EcoRV NuSie e™ 3%
TTATACTTTTCCAGGAATCATCAAT
c.-12G>A
III
s3027585
Exón 1
MspI
Aga osa 1%
c.194+377C>T
III
s57788389
In ón 1 ag. A
MspI
NuSie e™ 3%
c.194+1287T>A
III
s3027587
In ón 1 ag. B
D aI
Aga osa 1%
c.195-1663G>A
III
s28452934
In ón 1 ag. C
AciI
NuSie e™ 3%
c.195-807G>T III s12394005
GGCCTCCCAAAATGCTGTTAT
DpnI NuSie e™ 3%
CATTTTGGCTAGGCTAGTCTTGAT
c.547+190C>T III s41311559
GCTTCCCTGGGAGTTTTGGAT
M aI NuSie e™ 3%
CACAATATTAGCTATGGTTAGGTATGCC
c.548-125C>G
III
s2071396
Exón 4
BsaJI
Aga osa 3%
c.639+68A>G
III
s3027589
Exón 4
S yI
Aga osa 3%
c.640-386G>A
III
s111232330
In ón 4 ag. B
HaeIII
Aga osa 3%
c.640-136T>C
III
s3027592
In ón 4 ag. B
PsiI
Aga osa 1%
c.1000-22C>T I/III s2071228
TAACCTTGAAGTCCATTCCATAGAAC
TseI NuSie e™ 3%
CCACTTATCACTAGTTGCTAAGCAG
HCI=haplo ipo complejo in ónico; SNP=Va iaciones de un nucleó ido (dbSNP, e enlace).
1Secuencia de e e encia ( e enlace NCBI)
2Iden i icado de SNP ( e enlace dbSNP)
3In o mación de la secuencia nucleo ídica disponible en las ablas 4.3 y 4.4. En el caso de cebado es degene ados, la
secuencia se especi ica en la celda en sen ido 5’ -> 3’ y el nucleó ido que disco da se indica en ojo.
4Enzima de es icción. P o ocolo é mico de co e según ab ican e (The moFishe Scien i ic o New England BioLabs®
lnc)
5
Políme o empleado pa a ealiza la ca ac e ización elec o o é ica del p oduc o de es icción
Se es udió una la población con ol (50 a ones y 50 muje es sanos) median e análisis de
es icción indicado en el p o ocolo de la abla 5.14. Se calculó la ecuencia alélica y geno ípica
pa a cada uno de ellos. En el caso de los a ones, al se hemizigo os y p esen a ma cado es
gené icos monomó icos, la ecuencia alélica coincide con la geno ípica. Los esul ados se
esumen en la abla 5.15.
105
RESULTADOS
Tabla 5.15. Resul ados de la es imación de la ecuencia alélica y geno ípica en nues a población con ol.
NM_00169.21
HCI
SNP2
FRECUENCIA ALÉLICA3
FRECUENCIA GENOTÍPICA4
c.-769G>C
I
s3027580
0,99 / 0,01
0,96 / 0,04 / 0,00
c.10C>T
I
s2071225
0,98 / 0,02
0,98 / 0,02 / 0,00
c.369+990C>A
I
s1023431
0,90 / 0,10
0,81 / 0,19 / 0,00
c.370-81_370-77delCAGCC
I
s5903184
0,96 / 0,04
0,98 / 0,02 / 0,00
c.640-16A>G
I
s2071397
0,93 / 0,07
0,81 / 0,19 / 0,00
c.-12G>A
III
s3027585
0,96 / 0,04
0,94 / 0,06 / 0,00
c.194+377C>T
III
s57788389
0,98 / 0,02
0,94 / 0,06 / 0,00
c.194+1287T>A
III
s3027587
0,98 / 0,02
0,94 / 0,06 / 0,00
c.195-1663G>A
III
s28452934
0,98 / 0,02
0,94 / 0,06 / 0,00
c.195-807G>T
III
s12394005
0,99 / 0,01
0,96 / 0,04 / 0,00
c.547+190C>T
III
s41311559
1,00 / 0,00
1,00 / 0,00 / 0,00
c.548-125C>G
III
s2071396
0,98 / 0,02
0,94 / 0,06 / 0,00
c.639+68A>G
III
s3027589
0,98 / 0,02
0,92 / 0,08 / 0,00
c.640-386G>A
III
s111232330
0,99 / 0,01
0,96 / 0,04 / 0,00
c.640-136T>C
III
s3027592
0,98 / 0,02
0,88 / 0,12 / 0,00
c.1000-22C>T
I/III
s2071228
0,88 / 0,12
0,75 / 0,25 / 0,00
HCI=haplo ipo complejo in ónico; SNP=Va iaciones de un nucleó ido (dbSNP, e enlace).
1Secuencia de e e encia ( e enlace NCBI)
2Iden i icado de SNP ( e enlace dbSNP)
3Alelo sil es e / Alelo mu ado. Valo ada en a ones y muje es.
4
Geno ipo homozigo o sil es e / Geno ipo he e ozigo o /Geno ipo homozigo o mu ado. Valo ada en muje es.
El es udio de desequilib io de ligamien o no mos ó di e encias signi ica i as en e las
ecuencias geno ípicas de la población con ol y las espe adas en una población en equilib io,
po an o, odos nues os ma cado es gené icos asociados a los HCI se encuen an en equilib io
en la población con ol.
Cuando con as amos las ecuencias alélicas de la población con ol s la población de nues o
es udio con HCI I y III, sin es a i ica po géne o, ob enemos que la ecuencia de muchos
ma cado es es signi ica i a en la los pacien es con HCI I y III ( abla 5.16) y po lo an o esos
ma cado es es án di e encialmen e ep esen ados en nues a población espec o a una
población con ol.