Repositorio Institucional de Documentos

2021 52 Jorge Javier Cebolla Sanz Estudio Epidemiológico y funcional de variantes en el gen GLA, en pacientes con miocardiopatía hipertrófica de ventrículo izquierdo de origen desconocido Departamento Director/es Bioquímica y Biología Molecular y Celular Gervas Arruga, Javier Pocovi Mieras, Miguel © Universidad de Zaragoza Servicio de Publicaciones ISSN 2254-7606 Jorge Javier Cebolla Sanz ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO Y FUNCIONAL DE VARIANTES EN EL GEN GLA, EN PACIENTES CON MIOCARDIOPATÍA HIPERTRÓFICA DE VENTRÍCULO IZQUIERDO DE ORIGEN DESCONOCIDO Director/es Bioquímica y Biología Molecular y Celular Gervas Arruga, Javier Pocovi Mieras, Miguel Tesis Doctoral Autor 2019 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR TESIS DOCTORAL ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO Y FUNCIONAL DE VARIANTES EN EL GEN GLA, EN PACIENTES CON MIOCARDIOPATÍA HIPERTRÓFICA DE VENTRÍCULO IZQUIERDO DE ORIGEN DESCONOCIDO. JORGE JAVIER CEBOLLA SANZ 2019 D. MIGUEL POCOVÍ MIERAS, Doctor en Ciencias Químicas, catedrático del Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Celular de la Universidad de Zaragoza, y D. JAVIER GERVÁS ARRUGA, Doctor en Bioquímica y Biología Molecular, Directores de esta Tesis Doctoral, CERTIFICAN: Que la memoria de Tesis Doctoral titulada: “Estudio epidemiológico y funcional de las variantes en el gen GLA, en pacientes con miocardiopatía hipertrófica de ventrículo izquierdo de origen desconocido”, presentada por D. Jorge Javier Cebolla Sanz, ha sido realizada en el Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Celular de la Universidad de Zaragoza bajo su dirección, y que reúne los requisitos para ser presentadas por su autor para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza. Zaragoza, 30 de septiembre de 2019 D. Miguel Pocoví Mieras D. Javier Gervás Arruga “En las cenizas del fracaso está la sabiduría” Amaral (Canción: Robin Hood, Álbum: Hacia lo salvaje, 2011) Tú eres mi α y mi Ω A.C.G. + E.G.A ÍNDICES I ÍNDICE PÁGINAS Índice de Páginas 1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1 1.1 ANTECEDENTES HISTÓRICOS ................................................................................................. 2 1.2 PREVALENCIA .................................................................................................................... 3 1.2.1 Cribado neonatal ....................................................................................................... 4 1.2.2 Poblaciónes de riesgo. ............................................................................................... 4 1.3 PATOGENIA ....................................................................................................................... 6 1.3.1 Sustratos acumulados ............................................................................................... 6 1.3.2 Fisiopatología general ............................................................................................... 7 1.4 ESTRUCTURA DE LA Α-GALACTOSIDASA A HUMANA .................................................................. 8 1.5 GENÉTICA MOLECULAR ..................................................................................................... 10 1.5.1 Patrón de herencia .................................................................................................. 11 1.5.2 Espectro mutacional ................................................................................................ 11 1.5.3 Correlación genotipo-fenotipo ................................................................................ 14 1.5.4 La EF en las mujeres. Bases genéticas y moleculares. ............................................. 14 1.6 SIGNOS Y SÍNTOMAS DE LA EF ............................................................................................ 16 1.6.1 Síntomas precoces de la EF ..................................................................................... 17 1.6.2 Manifestaciones renales ......................................................................................... 19 1.6.3 Manifestaciones cardíacas ...................................................................................... 20 1.6.4 Manifestación cerebrovascular ............................................................................... 21 1.6.5 Otras manifestaciones ............................................................................................. 22 1.7 DIAGNÓSTICO ................................................................................................................. 22 1.7.1 Biomarcadores ........................................................................................................ 23 1.7.2 Diagnóstico enzimático ........................................................................................... 24 II ÍNDICE PÁGINAS 1.7.3 Análisis mutacional .................................................................................................. 26 1.7.4 Otros métodos. ....................................................................................................... 27 1.8 TRATAMIENTO ................................................................................................................. 27 1.8.1 Terapia enzimática sustitutiva ................................................................................ 28 1.8.2 Terapia con chaperonas moleculares...................................................................... 29 1.8.3 Nuevas aproximaciones terapéuticas ..................................................................... 31 2 HIPÓTESIS .................................................................................................................. 35 3 OBJETIVOS ................................................................................................................. 35 4 MATERIALES Y METODOLOGÍA ................................................................................... 39 4.1 PACIENTES Y CONTROLES ................................................................................................... 39 4.2 DISEÑO DEL ESTUDIO ........................................................................................................ 41 4.3 ESTUDIO ECOCARDIOGRÁFICO ............................................................................................ 41 4.4 EXTRACCIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE PARA LOS ESTUDIOS A REALIZAR EN DBS ........................ 42 4.5 EXTRACCIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE PARA LOS ESTUDIOS A REALIZAR EN PLASMA, CONCENTRADO DE LEUCOCITOS, DNA Y RNA ........................................................................................................... 43 4.6 OBTENCIÓN DE MUESTRA DE ORINA PARA ESTUDIO DE MARCADORES EF ................................... 44 4.7 OBTENCIÓN DE UN CONCENTRADO DE LEUCOCITOS A PARTIR DE SANGRE PERIFÉRICA ................... 44 4.8 AISLAMIENTO DEL DNA GENÓMICO .................................................................................... 45 4.8.1 Procedente de muestras de DBS ............................................................................. 45 4.8.2 Procedente de muestras de sangre venosa ............................................................ 46 4.9 AISLAMIENTO DEL RNA TOTAL ........................................................................................... 47 4.10 ANÁLISIS DE CONCENTRACIÓN, PUREZA Y PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS AISLADOS (DNA GENÓMICO Y RNA TOTAL) ............................................................................................................. 48 4.10.1 Concentración y pureza del DNA genómico aislado de sangre venosa .............. 48 4.10.2 Purificación del DNA genómico aislado de sangre venosa.................................. 48 4.10.3 Concentración y pureza del RNA total: ............................................................... 49 III ÍNDICE PÁGINAS 4.10.4 Purificación del RNA total ................................................................................... 49 4.10.5 Determinación de la integridad del RNA total .................................................... 49 4.11 DETERMINACIÓN DE MARCADORES BIOLÓGICOS SUBROGADOS A LA EF ..................................... 50 4.11.1 Determinación de la concentración de Gb3 en orina .......................................... 50 4.11.2 Determinación de la concentración de Liso-Gb3 en plasma ............................... 51 4.12 MEDIDA DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA Α-GALACTOSIDASA A ................................................ 53 4.12.1 Medida de la actividad enzimática en muestras de gota de sangre seca ........... 53 4.12.2 Medida de la actividad enzimática en muestras de plasma K2EDTA .................. 54 4.12.3 Medida de la actividad enzimática en concentrado de leucocitos ..................... 54 4.13 ANÁLISIS MOLECULAR DEL GEN GLA. SECUENCIACIÓN CAPILAR. ............................................... 55 4.13.1 Amplificación mediante PCR de las regiones codificantes del gen GLA .............. 57 4.13.2 Amplificación mediante PCR de las regiones no codificantes del gen GLA ........ 59 4.13.3 Purificación del producto de PCR ........................................................................ 60 4.13.4 Reacción de secuenciación de Sanger, electroforesis capilar y análisis de secuencias ........................................................................................................................... 61 4.14 ANÁLISIS MOLECULAR DEL GEN GLA. ESTUDIOS DE REORDENAMIENTOS. ................................... 62 4.15 ESTUDIOS BIOINFORMÁTICOS DE LAS VARIANTES GENÉTICAS IDENTIFICADAS ............................... 64 4.16 ANÁLISIS DE VARIANTES EN REGIÓN REGULADORA 5’-UTR ...................................................... 65 4.17 ANÁLISIS DE VARIANTES EN REGIÓN NO CODIFICANTE (INTRONES) ............................................ 66 4.17.1 Síntesis de cDNA total ......................................................................................... 66 4.17.2 Amplificación del cDNA del gen GLA ................................................................... 68 4.17.3 Caracterización electroforética del cDNA específico del gen GLA ...................... 69 4.17.4 Análisis molecular del cDNA del gen GLA. Secuenciación capilar. ...................... 70 4.18 GENOTIPADO POBLACIONAL DE LAS VARIANTES EN REGIÓN REGULADORA Y NO CODIFICANTE. ....... 71 4.19 ESTUDIOS CUANTITATIVOS DE LA EXPRESIÓN DEL GEN GLA ..................................................... 72 4.19.1 Determinación de la eficiencia cinética de la reacción de qPCR ......................... 74 IV ÍNDICE PÁGINAS 4.19.2 Normalización de los datos de expresión génica determinados mediante qPCR75 4.19.3 Cuantificación relativa de la expresión génica .................................................... 76 4.20 DETERMINACIÓN DEL ACÚMULO INTRACELULAR DE SUSTRATO ................................................. 76 4.20.1 Modelo in vitro de acúmulo lisosomal ................................................................ 76 4.20.2 Cuantificación del acúmulo de galactoesfingolípidos en los pacientes .............. 77 4.21 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Y EPIDEMIOLÓGICO ............................................................................ 77 4.21.1 Análisis estadístico general ................................................................................. 77 4.21.2 Estudio epidemiológico y de la segregación ....................................................... 78 5 RESULTADOS .............................................................................................................. 81 5.1 DESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA DE ESTUDIO ........................................................................... 81 5.2 ACTIVIDAD DE Α-GAL A EN DBS Y ESTUDIO MOLECULAR DEL GEN GLA ..................................... 83 5.3 ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO DE LAS VARIANTES IDENTIFICADAS EN EL GRUPO DE SECUENCIACIÓN ... 88 5.4 ESTUDIO DE CARACTERIZACIÓN DE NM_000169.2:C.-34C>T; NM_000169.2:C.192C>T; NM:000169.2:C.640-25A>G ..................................................................................................... 90 5.4.1 Estudio Bioinformático ............................................................................................ 90 5.4.2 Estudio en gel de retardo. “Electrophoretic Mobility Shift Assay” ......................... 91 5.4.3 Análisis enzimático en muestra de plasma y leucocitos de los pacientes 1,2 y 3 ... 92 5.4.4 Determinación de Gb3 en orina y Liso-Gb3 en plasma de los pacientes 1, 2 y 3. .... 93 5.4.5 Caracterización electroforética en gel de poliacrilamida al 6% del paciente 2 ...... 94 5.4.6 Identificación de transcritos alternativos mediante secuenciación del cDNA completo del gen GLA en los pacientes 1, 2 y 3 .................................................................. 95 5.4.7 Perfil de reordenamientos en el gen GLA de los pacientes 1, 2 y 3 ........................ 95 5.5 ESTUDIO DE CARACTERIZACIÓN DE VARIANTES QUE FORMAN HAPLOTIPOS COMPLEJOS ................ 97 5.5.1 Análisis enzimático en muestra de plasma y leucocitos de los pacientes con haplotipos complejos .......................................................................................................... 97 5.5.2 Determinación de Gb3 en orina y Liso-Gb3 en plasma de los pacientes con haplotipos complejos ............................................................................................................................ 98 V ÍNDICE PÁGINAS 5.5.3 Caracterización electroforética en gel de poliacrilamida al 6% de los pacientes con haplotipos complejos .......................................................................................................... 98 5.5.4 Identificación de transcritos alternativos mediante secuenciación del cDNA completo del gen GLA en los pacientes con haplotipos complejos .................................... 99 5.5.5 Perfil de reordenamientos en el gen GLA de los pacientes con haplotipos complejos 99 5.5.6 Análisis de la expresión génica de los pacientes mediante qPCR ......................... 100 5.5.7 Identificación de nuevas variantes en la región 5’-UTR y en los intrones del gen GLA en pacientes con haplotipos complejos. ........................................................................... 102 5.6 CUANTIFICACIÓN DEL ACÚMULO DE SUSTRATO EN CULTIVOS CELULARES DE PACIENTES CON HCI I 106 5.6.1 Confirmación de la validez del modelo in vitro de acúmulo lisosomal ................. 106 5.6.2 Determinación del acúmulo lisosomal de galactolípidos en las células de los pacientes con HCI I ............................................................................................................ 107 6 DISCUSIÓN ............................................................................................................... 111 7 CONCLUSIONES ........................................................................................................ 119 8 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 123 ANEXO A: PUBLICACIONES REALIZADAS DURANTE LA TESIS EN LA ENFERMEDAD DE FABRY . A ANEXO B: PUBLICACIONES REALIZADAS DURANTE LA TESIS EN OTRAS ENFERMEDADES DE DEPÓSITO LISOSOMAL ........................................................................................................ B XII ÍNDICE TABLAS Índice de Ecuaciones Ecuación 4.1. Cálculo de pureza de los ácidos nucleicos. ........................................................... 48 Ecuación 4.2. Cálculo de la eficiencia cinética de la reacción de qPCR. ...................................... 75 Ecuación 4.3. Algoritmo empleado en la normalización de los datos de expresión génica determinados por qPCR. ............................................................................................................. 76 Ecuación 4.4.Algoritmo empleado en el cálculo de la expresión del gen GLA mediante qPCR. . 76 XIII ACRÓNIMOS Acrónimos α-Gal A Alfa galactosidasa A λ Longitud de onda 4-MU 4-metilumbeliferona 4-MU-Gal 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranósido A Amperio Abs Absorbancia ACMG American College of Medical Genetics AEM Agencia Europea del Medicamento AF Ácido Fórmico APS Persulfato amónico Br-Et Bromuro de etidio cDNA DNA complementario CR Cuantificación relativa de la expresión génica Ct Ciclo Umbral DBS Gota de sangre seca ddH2O Agua ultrapura libre de DNAasas/RNAasas DE Desviación estándar dNTP deoxi-nucleótido-tri-fosfato DGJ 1-deoxigalactonojirimicina dH2O Agua desionizada estéril ddNTP di-deoxi-nucleótidos-tri-fosfato DMEM Dubelco’s Modified Eagle’s Medium DNA Ácido desoxirribonucleico XIV ACRÓNIMOS DNAp DNA polimerasa E Eficiencia de la reacción de qPCR EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EE Estándar externo EF Enfermedad de Fabry EG Enfermedad de Gaucher EI Estándar interno EM Espectrometría de masas EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay ER Retículo endoplásmico ERAD Degradación asociada al retículo endoplásmico ERC Enfermedad renal crónica EtOH Etanol EVI Espesor del septo ventricular y/o pared ventricular izquierda posterior ExM Algoritmo de expectación-maximización FOS Fabry Outcome Survey FRET Transferencia de energía de resonancia de resonancia de Förster g Fuerza de la gravedad Gb3 Globotriaosilceramida GCS Glucosilceramida sintasa GFR Tasa de filtrado glomerular H2O Agua HCI Haplotipo complejo intrónico HCl Ácido Clorhídrico HSF Human Splicing Finder XV ACRÓNIMOS HTA Hipertensión arterial HVI Hipertrofia ventricular izquierda IVS Intrón kb Kilobase m Masa MeOH Metanol MHVI Miocardiopatía hipertrófica de ventrículo izquierdo Mg2Cl Cloruro de magnesio MIM Mendelian Inheritance in Man MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification mRNA RNA mensajero Ø Diámetro PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida pb Pares de bases PCR Reacción en cadena de la polimerasa PM Masa molecular qPCR Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa R2 Coeficiente de determinación RFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción RNA Ácido ribonucleico rpm Revoluciones por minuto RT-PCR PCR de retrotranscripción SD Sonda Derecha SFB Suero Fetal Bovino SI Sonda Izquierda XVI ACRÓNIMOS SNC Sistema nervioso central SNP Polimorfismo de un solo nucleótido SSPNN Splice Site Prediction by Neural Network TAE Tris-Acetato-EDTA TBE Tris-Boro-EDTA TCM Triclorometano TE Tris-Clorhídrico-EDTA TEMED N,N,N,N’-tetrametilendiamina TES Terapia enzimática sustitutiva TNFα Factor de necrosis tumoral alfa TRS Terapia de reducción de sustrato UI Unidades internacionales UTR Región genómica no traducida UV Ultra-violeta V Voltio v Volumen VUS Variante de significado incierto W Vatio XVII ENLACES Enlaces Avanti Polar Lipids https://avantilipids.com/ ClinVar https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ dbSNP https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/ Google https://www.google.es/ HGMD https://www.hgmd.cf.ac.uk HGSV https://www.varnomen.hgvs.org HSF http://www.umd.be/HSF3/ LOVD https://www.lovd.nl/3.0/ Lysosomal storage research http://www.lysosomalstorageresearch.ca/ MatInspector http://www.genomatix.de/matinspector.html Matreya https://www.matreya.com MRC-Holland https://www.mrc-holland.com MutationTaster http://www.mutationtaster.org/ National Fabry Disease Foundation https://www.fabrydisease.org/ NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov PROMO http://alggen.lsi.upc.es Protein Data Bank https://www.rcsb.org/ RestrictionMapper http://www.restrictionmapper.org/ SSPNN https://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html TaqMan https://www.thermofisher.com/taqman Universidad de Navarra https://www.unav.edu/ XX INTRODUCCIÓN 6 Tabla 1.3. Principales estudios de búsqueda de pacientes en población menor de 60 años e ictus recurrente. Estudio Prevalencia* Observaciones y limitaciones del estudio Rolfs et al. 2005 1 / 26 Varones y mujeres; estudio enzimático plasma + molecular Dubuc et al. 2013 1 / 14 Género no especificado; estudio molecular + biomarcadores DBS Shi et al. 2014 1 / 20 -1 / 30 Meta-análisis valorando 9 estudios y n=8.302 Romani et al. 2015 1 / 36 Varones estudio enzimático + molecular; Mujeres estudio molecular Fazekas et al. 2015 1 / 111 Varones y mujeres; estudio enzimático + molecular DBS Bersano et al. 2016 1 / 33 Varones estudio enzimático + molecular; Mujeres estudio molecular Reisin et al. 2018 1 / 311 Varones estudio enzimático + molecular; Mujeres estudio molecular Lee et al. 2019 1 / 500 Varones y mujeres; estudio molecular DBS=Gota de sangre seca. 1.3 Patogenia 1.3.1 Sustratos acumulados La causa fundamental de la EF es el acúmulo sistémico de lípidos neutros pertenecientes a la familia de los esfingolípidos (figura 1.3) 6. Estos lípidos derivan de la esfingosina, un aminoalcohol de cadena alifática (figura 1.3 H). A su vez, la esfingosina, se halla unida a un ácido graso de cadena larga mediante un enlace amida dando lugar a la ceramida (figura 1.3 G). Unida al grupo hidroxilo 1 de la ceramida mediante enlace O-glucosídico encontramos un oligosacárido de diferente composición y tamaño (tabla 1.4), formando los glucoesfingolípidos (figura 1.3 AB-C-E-F). Tabla 1.4.Principales oligosacáridos que conforman los glucoesfingolípidos. Familia Estudio Oligosacárido* Gangliósidos GM1 Gal+NAC-Gal+NANA+Glu+Cer GM2 NAC-Gal+NANA+Glu+Cer GM3 NANA+Glu+Cer Globósidos Globotetraosilceramida (Gb 4 ) NAC-Gal+Gal+Gal+Glu+Cer Globotriaosilceramida (Gb 3 ) Gal+Gal+Glu+Cer Lactosilceramida (Gb 2 ) Gal+Glu+Cer Galabiosilceramida (Ga 2 ) Gal+Gal+Cer Cerebrósidos Glucosilceramida (Gb 1 ) Glu+Cer Galactosilceramida (Ga 2 ) Gal+Cer *Gal=Galactosa; Glu=Glucosa; NAC-Gal=N-Acetil Galactosamina; NANA=Ácido N-Acetil Neuroamínico; Cer=Ceramida. 7 INTRODUCCIÓN En la EF, el glucoesfingolípido que se acumula en mayor proporción es la Gb3 (figura 1.3 B). Este glucolípido es llamado también antígeno pk de los grupos sanguíneos p 53 y CD77 actuando como receptor de la toxina Shiga (Shigella dysenteriae) o semejante a Shiga también llamada verotoxina (Escherichia coli) 54,55. Otras substancias acumuladas son: la globotriaosilesfingosina (liso-Gb3, figura 1.3 D), derivado deacilado de la Gb3 generado por la acción catalítica de la ceramidasa ácida 56 y la galabiosilceramida (Ga2, (figura 1.3 E), presente mayoritariamente en riñón 57. Figura 1.3. Glucoesfingolípidos. (A) Globotetraosilceramida o Gb4; (B) Globotriaosilceramida o Gb3; (C) Globotriaosilesfingosina o Liso-Gb3; (D) Lactosilceramida o Gb2; (E) Galabiosilceramida o Ga2; (F) Glucosilceramida o Gb1; (G) Ceramida; (H) Esfingosina; Fuente: imagen adaptada de www.matreya.com y www.avantilipids.com. 1.3.2 Fisiopatología general La principal alteración fisiopatológica en la EF es la disfunción vascular, participando de la patogenia de ésta los siguientes factores 58: 1. Acúmulo de Gb3: El origen del acúmulo de Gb3 bien es debido a la síntesis endógena, bien a la autofagocitosis de las membranas celulares. En el segundo caso, cabe destacar que los glucoesfingolípidos son moléculas que se encuentran en las membranas plasmáticas de la mayoría de las células de todos los tejidos en el organismo. Debido a la elevada tasa de recambio de los hematíes, es esta fuente de glucolípidos la que más contribuye al desarrollo de la EF. Excepto en las personas con grupos sanguíneos pk y p, el principal 8 glucoesfingolípido de la membrana del hematíe es la globotetraosilceramida (Gb4, figura 1.3 A). Cuando las células rojas se vuelven senescentes son retiradas del organismo por los macrófagos. Todos los componentes de la membrana de las células fagocitadas son degradados enzimáticamente en el lisosoma. Por medio de la catálisis enzimática de la Hexosaminidasa B, las moléculas de Gb4 son hidrolizadas formando Gb3. En los pacientes con la EF, puesto que la actividad de la α-Gal A está reducida o es nula, se acumulan cantidades patológicas de Gb3 en todos los tejidos del organismo. La importancia de la fuente constante de glucoesfingolípidos procedente del estroma de los hematíes senescentes fue confirmada por experimentos con el modelo en ratón de EF. En este ratón se produce un acúmulo significativo de Gb3 en los órganos 59. 2. Alteración estructural de los vasos: La pared vascular se encuentra alterada ya que existe un engrosamiento de la íntima y media de la capa muscular de la pared arterial, siendo esta hiperplasia la que precede a la disfunción endotelial en el devenir de los acontecimientos que llevan a la vasculopatía 60,61. 3. Activación endotelial y estado protrombótico: este fenómeno se pone de manifiesto al estimularse en leucocitos circulantes la síntesis y liberación de moléculas para la adhesión al endotelio vascular, debido a la presencia de glucoesfingolípidos; a su vez, una mayor interacción de los leucocitos con el endotelio estimula en los primeros una mayor síntesis de moléculas proinflamatorias como interleucinas o factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) 62. Otro factor a tener en cuenta en la activación endotelial y del estado protrombótico, es el exceso de producción de especies reactivas de oxígeno y la reducción de la actividad del óxido nítrico, propiciando la regulación a alza de la expresión de moléculas de adhesión en el endotelio vascular 63. Se ha constatado que en los pacientes EF existe una menor expresión de factores trombolíticos que propician el estado protrombótico edades precoces. 1.4 Estructura de la α-galactosidasa A humana La estructura de la α-Gal A humana fue determinada mediante cristalografía de rayos X en el año 2004 64 y se encuentra indizada en el repositorio público “Protein Data Bank” del Instituto Nacional de la Salud de EE. UU con el número de acceso 1R46 (ver enlaces). La enzima comprende 429 aminoácidos y se estructura como un homodímero, en el que cada monómero lo forman dos dominios: el dominio 1 o N-terminal es un barril (β/α) y el dominio 2 o C-terminal es un sándwich β que contiene 8 hebras β antiparalelas (figura 1.4). El dominio N- 9 INTRODUCCIÓN terminal está comprendido entre los residuos 32 al 328 y el dominio antiparalelo C-terminal entre los residuos 329 al 421. El dominio N-terminal contiene el centro activo de la enzima el cual está colocado al final del dominio C-terminal en las hebras β (β1-β7) al lado del centro del barril β. Figura 1.4. Vista 3D de uno de los monómeros de la α-Gal A humana. Fuente: Protein Data Bank, imagen adaptada de Garman SC y Garboczi DN 2004. En la superficie de la molécula se encuentran tres motivos N-glicosilados unidos a los residuos de ácido aspártico N139, N192 y N215. El centro activo de la molécula (figura 1.5) está formado por las cadenas laterales de los residuos W47, D92, D93, Y134, C142, K168, D170, C172, E203, L206, Y207, R227, D231, D266 y M267. Los residuos C142 y C172 forman un puente disulfuro. Los dos centros activos en el dímero están separados a una distancia aproximada de 50 Å 65. Figura 1.5. Centro activo de la enzima. En azul están representadas las interacciones de van der Waals y en rojo los puentes de hidrógeno con el ligando de α-galactosa. Fuente: imagen adaptada de Guce A y Garman SC 2010. 10 La α-Gal A, usa un mecanismo de reacción de doble desplazamiento (figura 1.6), donde se producen dos ataques nucleófilos consecutivos en el carbono anomérico del sustrato, rompiendo el enlace glucosídico con la retención global del carbono anomérico del producto. En la α-Gal A, el catalizador nucleófilo es el residuo D170 y la catálisis ácido/base está producida por el residuo D23 166. Figura 1.6. Mecanismo de reacción. Fuente: imagen adaptada de Guce A 2010. 1.5 Genética Molecular El gen GLA codifica la hidrolasa ácida lisosomal α-Gal A (EC.3.2.1.22) y está localizado en el brazo largo del cromosoma X (Xq22.1). Está compuesto por una región promotora, siete exones (el tamaño oscila entre 92 y291 pares de bases [pb]) y por seis zonas intrónicas (Figura 1.7.). La región codificante comprende 1.292 pb. Como peculiaridades de este gen, es que es uno de los que más elementos Alu contiene en el genoma y que carece de zona 3’ no traducida o “UTR”; esta última peculiaridad hace que la señal de poliadenilación se sitúe en la región codificante 67. Figura 1.7. Representación gráfica del gen GLA. Zonas intrónicas en verde. El tamaño de exones e intrones no se encuentra a escala. 11 INTRODUCCIÓN 1.5.1 Patrón de herencia La localización del gen GLA supone que el modelo de herencia se encuentre ligado al cromosoma X. Los varones portadores hemizigotos de las variantes causales de la enfermedad, van a transmitir las variantes al 100% de sus hijas y a ningún varón en la siguiente generación; en el caso de las mujeres heterozigotas, la van a transmitir al 50% de sus descendientes sin importar el género de éstos (figura 1.8). Figura 1.8. Modelo de herencia ligado al cromosoma X. Fuente: imagen adaptada de www.google.com. Tradicionalmente se ha considerado que la herencia de esta enfermedad era de tipo ligada al X recesiva. Las definiciones estándar de herencia ligada al X dominante o recesiva no tienen en cuenta la diferente expresividad de las patologías en mujeres ni tampoco los mecanismos que provocan esa expresión diferencial, por lo que se propone la discontinuación de esas definiciones y tan solo describirse las patologías como herencia ligada al X 68. 1.5.2 Espectro mutacional Se han descrito 967 variantes en el gen GLA (MIM*300644) en septiembre de 2019, todas ellas recogidas en la base de datos de variantes en genes humanos del Instituto de Genética Médica de Cardiff (HGMD, ver enlaces) 69. Atendiendo a la distribución de las mutaciones presentada en la figura 1.9, aproximadamente, el 75% de las variantes indizadas son variaciones puntuales (cambio de aminoácido, generación de codón de parada prematuro, de ayuste o polimorfismos) y el 25 % restante corresponden a pequeños reordenamientos (deleciones y duplicaciones). 12 Figura 1.9. Diagrama de sectores de la distribución de las mutaciones del gen GLA, indizadas en la base de datos HGMD, según la naturaleza de las mismas. No existen claros puntos calientes o “hot spots” que concentren la mayoría de mutaciones puntuales, aunque es frecuente encontrarlas en los exones 5 y 6 siendo menos habituales en el exón 4. Tampoco existen mutaciones recurrentes en general o para las distintas poblaciones [a excepción de la asiática donde la mutación intrónica NM_000169.2:c.639+919G>A presenta una gran prevalencia como vimos en el apartado 1.2.1 23], ya que la mayoría de las mutaciones son privativas o exclusivas de cada familia. Este hecho es frecuente en enfermedades de baja prevalencia y obliga a estudiar la totalidad del gen cuando se sospecha la enfermedad; el 5-10% de los casos de diagnosticados de la EF es debido a mutaciones que han surgido de novo 70,71 Debido a la auge de los estudios de secuenciación masiva, Las últimas recomendaciones de la “American College of Medical Genetics” (ACMG) tratan de estandarizar las recomendaciones a la hora de interpretar variantes genéticas e indican que éstas deben clasificarse atendiendo a criterios estructurales, poblacionales, in silico etc. 72. Esta asociación categoriza las variantes de la siguiente manera: • Patogénica: variante que causa la enfermedad avalada por evidencia robusta genética y experimental, incluyendo análisis de cosegregación familiar consistente y estudios funcionales. • Probablemente patogénica: variante con evidencias no definitivas, la evidencia se basa en su similitud con variantes patogénicas conocidas, cosegregación con familiares o poblaciones con enfermedad y la evidencia funcional. • Significado incierto (VUS): variante que no reúne los criterios de las anteriores o cuando hay contradicciones en cuanto a su significado patológico o benigno. 13 INTRODUCCIÓN • Probablemente benignas: variante con evidencia que apoya que no causa enfermedad (pero no concluyente). • Benigna: variante con evidencia concluyente de que no causa la enfermedad, típicamente determinada (no exclusivamente) por su presencia en la población general (sana) con una prevalencia que excede la sospechada para la enfermedad. A la vista de esta clasificación, encontramos variantes genéticas detectadas solas o en conjunto, en pacientes con sintomatología de la EF en la EF que por lo tanto deben ser consideradas VUS y generan amplio debate sobre su implicación patogénica 73–83. Otro grupo muy importante de variantes (ver figura 1.10) 84, lo constituyen algunas variantes como NM_000169.2:c.-30A>G 85,86, NM_000169.2:c.196G>C (p.Glu66Gln) 87,88 NM_000169.2: c.937G>T (p.Asp313Tyr) 89–91 en las que los diferentes grupos de investigación no unifican su criterio respecto al carácter patogénico o benigno de las mismas y que presentan una elevada prevalencia en la población. Por último, dentro del grupo de las variantes patogénicas y probablemente patogénicas, cabría resaltar aquellas en las que están causando la enfermedad por alteración del patrón de ayuste fisiológico del ácido ribonucleico mensajero (mRNA) inmaduro; dentro de éstas, hay algunas variantes que causan la EF por el mecanismo anterior al cambio de aminoácido en el polipéptido 92 otras sin embargo son variantes intrónicas alejadas de la zona dadora o aceptora que también desregulan el mecanismo de ayuste 93,94. Figura 1.10. Representación triangular de las variantes genéticas identificadas en el fenotipo clásico, tardío, variantes de significado incierto e incluso polimorfismos en la EF. Fuente: imagen adaptada de Ortiz et al. 2018. 14 1.5.3 Correlación genotipo-fenotipo En la EF es difícil establecer una correlación entre el genotipo identificado con el fenotipo debido a la alta proporción de mutaciones privadas 95, la variabilidad clínica de la EF, la elevada variabilidad fenotípica intrafamiliar, la influencia de otros factores no genéticos 96 y la similar presentación clínica respecto a otras entidades más prevalentes Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, es necesario afirmar que la naturaleza de las mutaciones y su localización en la estructura proteica vana a condicionar la actividad enzimática residual y en consonancia la expresión fenotípica. Así pues, se asocia un fenotipo “clásico” a mutaciones que afectan al centro activo y/o a la estabilidad conformacional de la enzima, mientras que se asocia un fenotipo “atípico o tardío” a mutaciones alejadas del centro activo de la enzima o bien que desregulen la expresión de ésta. En este último, la actividad residual enzimática juega un papel importante en el retraso en la aparición de los síntomas de la EF. Con el conocimiento actual sobre la historia natural de la enfermedad, se ha propuesto que resultaría más apropiado describir la EF como una enfermedad con amplio espectro de fenotipos clínicos heterogéneos y progresivos.96 Un condicionante importante en la expresión del fenotipo, además de la actividad residual de la enzima, sería la presencia de factores modificadores genéticos y ambientales. Entre los primeros se identifican variantes en genes codificantes para moléculas proinflamatorias o de la cascada de la coagulación como el gen de la interleucina 6, el gen de la enzima óxido nítrico sintasa endotelial, el gen del Factor V de Leiden o del receptor de la vitamina D. Entre los segundos son importantes factores aquellos relacionados con el riesgo vascular (hipertensión arterial, colesterolemia, tabaquismo etc.) 97. 1.5.4 La EF en las mujeres. Bases genéticas y moleculares. En la EF el término portador no es el más adecuado, ya que las mujeres pueden no desarrollar sintomatología o bien la pueden presentarla variando desde fenotipos clásicos a atípicos como lo harían los varones con la salvedad que la edad de presentación de los síntomas de la enfermedad está ligeramente retrasado unos diez años respecto de los varones 36,98–101. El hecho de que las mujeres no sean meras portadoras y presenten una amplia variabilidad fenotípica podría ser explicado por los mecanismos epigenéticos de compensación de dosis génica durante la fase embrionaria, en los que se inactiva de forma aleatoria el cromosoma X 15 INTRODUCCIÓN paterno o materno, fenómeno conocido con el nombre de “Lyonización” por ser descubierto por la Dra. Mary F. Lyon en el año 1962 102. Posteriormente, todas las células descendientes mantendrán el patrón de inactivación adquirido en la fase de blastocisto de modo que las mujeres presentan una situación de mosaicismo somático respecto las características genéticas segregadas en dicho cromosoma. Un ejemplo visual (Figura 1.11.) de este fenómeno es la expresión del color naranja en la capa de las hembras felinas. El color naranja en esta especie está codificado por el locus O-o localizado en el cromosoma X; una hembra heterozigota para ese locus (Oo) expresará un fenotipo mosaico en su capa, con zonas naranjas y no naranjas. Una salvedad a este patrón, es el color blanco ya que éste se produce por falta de expresión de los locus que controlan la coloración de la capa. Debido a la condición quimérica de las células somáticas de las mujeres, cabe destacar entre otras implicaciones a nivel fenotípico, que aproximadamente una tercera parte de la mujeres portadores de una variante genética patogénica y que desarrollaron signos y síntomas de la EF, no presentaban actividad enzimática reducida 103 Figura 1.11.Expresión fenotípica del mosaicismo germinal del locus O-o en la capa de las gatas carey. Fuente: imagen adaptada de www.google.com La epigenética es un mecanismo de regulación del DNA involucrado en la expresión de los genes durante el desarrollo celular. Este mecanismo no modifica la secuencia nucleotídica del DNA 22 1.6.5 Otras manifestaciones Los trastornos auditivos y vestibulares son frecuentes en EF, resultando en una variedad de síntomas como la pérdida auditiva, tinnitus y vértigo 70. Se ha descrito una mayor incidencia de hipoacusia y sordera súbita en pacientes con fenotipo clásico de EF 128. Se ha encontrado una correlación entre la afectación neuropática y el daño vascular con la pérdida auditiva en varones en los que la actividad residual de la α-Gal A tenía un efecto protector frente a la pérdida auditiva 129.Otra observación importante es la pérdida vestibular progresiva en el 80% de los varones y en el 77% de las mujeres cuando se ha evaluado mediante la prueba de potenciales evocados 130. Las opacidades corneales (visibles mediante microscopio de lámpara de hendidura) son los síntomas oculares más iniciales y frecuentes. Ocurren en la mayoría de varones hemizigotos. Se observa también una tortuosidad en los vasos retinianos y conjuntivales. Con frecuencia aparecen también cataratas subcapsulares llamadas “Cataratas de Fabry” y representan un síntoma ocular patognomónico en la EF “córnea verticillata” (figura 1.14) 70. La afectación respiratoria es frecuente en ambos sexos manifestándose como disnea con el ejercicio, tos crónica y ruidos respiratorios. Es frecuente encontrar obstrucción en los bronquios. En los casos graves, la infiltración de Gb3 en la barrera alvéolo capilar y la pérdida de la elasticidad pulmonar debido a la infiltración intersticial, se materializa en una reducción de la capacidad y otros índices espirométricos 131. 1.7 Diagnóstico La edad de diagnóstico promedio en la EF para varones se encuentra en 25,7 ± 15,3 años mientras que para mujeres es de 31,3 ± 17,4 años, con un retraso promedio desde la aparición de los síntomas hasta el diagnóstico de aproximadamente 12 años para ambos sexos 132. Una vez que se tiene una sospecha de EF, el diagnóstico definitivo en varones debe realizarse con el análisis de la actividad de la α-Gal A en una muestra de sangre, el cual puede ser llevado a cabo en muestras de células blancas, plasma/suero 128 o en gota de sangre seca133. La deficiencia enzimática puede ser demostrada en cultivo de fibroblastos, orina y otros tejidos 128. La confirmación del diagnóstico es llevada a cabo por la detección de la mutación causal en el gen GLA. Las mujeres heterocigotas no se pueden diagnosticar de forma fidedigna mediante el análisis de actividad enzimática en leucocitos y plasma, debido a la inactivación aleatoria del 23 INTRODUCCIÓN cromosoma X, ya que pueden tener niveles de actividad normales 128. El análisis mutacional es imprescindible para confirmar el diagnóstico de los pacientes heterocigotos 134. La detección y cuantificación de los productos de acúmulo, Gb3 en plasma 135y orina 136; liso-Gb3 en plasma 137y Ga2 en orina 57, pueden ser de gran ayuda como prueba que evidencia el diagnóstico y como marcador de seguimiento de la enfermedad. El desarrollo de la TES 138,139 enfatizó la importancia del diagnóstico temprano para la EF. Los métodos de cribado basados en el análisis de la actividad enzimática en gota de sangre seca 133 y de acúmulo de sustrato en orina recogida en papel de filtro 140; han sido diseñados para realizar el cribado masivo y en poblaciones con alto riesgo de EF. 1.7.1 Biomarcadores Los biomarcadores se definen como analitos que indican la presencia de un proceso biológico, el cual se encuentra en estrecha relación con las manifestaciones clínicas y el resultado de una patología particular. Un biomarcador idealmente, debería proveer indirectamente de la información de la carga de enfermedad a la hora del diagnóstico y seguimiento de la progresión de la enfermedad, así como de la medida de la corrección terapéutica de ésta 141. Los biomarcadores pueden ser simples metabolitos o bien moléculas complejas. 1. Gb3: Durante mucho tiempo, el acúmulo primario de Gb3 ha sido considerado el biomarcador de referencia de la EF 1. Los niveles anormalmente elevados de este glucolípido no solo ocurren en el interior celular si no que se puede encontrar a elevadas concentraciones en plasma u orina como se ha constatado en varones afectos de la EF, sin embargo pueden encontrase niveles ligeramente elevados en orina y niveles normales en plasma de mujeres portadoras sintomáticas de la EF 1,142,143. La utilidad de los niveles urinarios en la monitorización de la progresión de la enfermedad no son efectivos, como lo demuestran diferentes estudios en los que además hay una falta de correlación entre niveles urinarios y sintomatología 143. Por otro lado, los niveles plasmáticos no muestran mejores valores predictivos para las manifestaciones de la enfermedad 143. Las técnicas habituales para medir este metabolito tanto en orina como en plasma son cromatografía líquida de alta eficacia (CL) acoplada a un sistema de monitorización múltiple de espectrometría de masas (EM) 144,145 2. Liso-Gb3: se constatan unos niveles elevados en plasma en pacientes de la EF 137. A diferencia de la Gb3 presenta cierto valor diagnóstico ya que los niveles de Liso-Gb3 se encuentran mucho más elevados y permiten diferenciar entre los sujetos con formas clásicas, de las 24 atípicas incluso de las inciertas de la enfermedad resulta incrementado 146. Otra diferencia importante respecto de la Gb3 es que los niveles de Liso-Gb3 correlacionan con la gravedad de los síntomas de la EF y se observa un claro descenso de sus niveles bajo la TES 147,148. En varones tratados con la TES, se produce un descenso de los niveles de Liso-Gb3 de manera rápida (3-6 meses post-inicio TES) para continuar con niveles elevados respecto a la población control 148,149. Sin embargo, encontramos una serie limitaciones en el uso de la Liso-Gb3 como biomarcador de la EF: se desconoce la implicación de las variaciones de la concentración del analito en la clínica 148,150; los niveles pueden verse modificados por una serie de variables (edad, género, tipo de mutación etc.) 146; la presencia de anticuerpos antienzima exógena provocan que se modifique la respuesta de ésta a la LisoGb3 148. 3. Otros: se han publicado trabajos en los que se estudió el comportamiento de moléculas proinflamatorias como mieloperoxidasas, metaloproteinasas, proteína C reactiva e incluso la actividad quitotriosidasa 151–153 , considerada uno de los principales biomarcadores en la EG 154. Otras muchas moléculas se han descrito como potenciales biomarcadores de la EF asociados a fenotipos cardíacos (Cistatina C y domino amino terminal del péptido natriurético atrial) 155 y se continúan los esfuerzos para identificar nuevos biomarcadores con aproximaciones proteómicas 156. 1.7.2 Diagnóstico enzimático La actividad de la α-Gal A habitualmente se mide en muestras de suero/plasma, en leucocitos y DBS, mediante el uso del sustrato fluorogénico sintético, 4-metilumbeliferil-α-Dgalactopiranósido a un pH de 4,6 1,133,134. En la figura 1.17 se ilustra esquemáticamente la reacción in vitro de la medida de la actividad enzimática utilizando el sustrato fluorogénico mencionado anteriormente. Figura 1.17. Esquema de la reacción in vitro de la α-Gal A. 25 INTRODUCCIÓN Para inhibir a la α-N-acetil galactosaminidasa (llamada también α-Gal B) se añade a la reacción N-acetilgalactosamina 157. Esta enzima es la responsable de más del 20% de la actividad total de la α-Gal A en el plasma y entre el 5-10% en leucocitos usando el sustrato sintético. Otros factores que afectan a la actividad son: el pH, la temperatura, los inhibidores endógenos, anticoagulantes y contaminación por eritrocitos. Todos esos factores se han tenido en cuenta a la hora de desarrollar el protocolo estándar y establecer los rangos de referencia. La hemoglobina liberada por los eritrocitos puede bloquear la fluorescencia emitida por el sustrato sintético. Las muestras lipémicas presentan otro problema potencial ya que los lípidos en suspensión pueden interferir con los reactivos de la reacción y afectar las medidas de fluorescencia. En el caso de medidas en leucocitos, la hemólisis en el proceso de obtención también puede ser un problema bloqueando la fluorescencia emitida por el sustrato. Los pacientes varones con fenotipo clásico, generalmente, presentan una actividad en plasma/suero y leucocitos, baja o indetectable. El diagnóstico debe confirmarse por análisis mutacional. Los niveles de sustrato en plasma u orina están elevados en la mayoría de los pacientes y pueden utilizarse como soporte para el diagnóstico. Algunos pacientes con fenotipo clásico moderado tienen niveles residuales bajos de actividad enzimática. En pacientes con las formas atípicas de la enfermedad, que no muestran fenotipos clásicos, con síntomas tardíos, se suelen encontrar niveles de actividad residual altos 1,16,134 incluyendo las variantes cardiacas 44 y renales 87. Los pacientes varones con una presentación clínica atípica y actividad residual alta, deben ser investigados a través de una caracterización de la actividad residual, secuenciación completa del gen GLA y medida de los productos de acúmulo en orina o plasma antes de establecer un diagnóstico definitivo. La actividad en mujeres afectadas varía desde los niveles bajos encontrados en varones afectados hasta niveles dentro de la normalidad. Un 30% de las mujeres portadoras tiene actividad enzimática normal 1. Una actividad normal no tiene por qué contradecir una sospecha clínica en mujeres. Aunque muchos heterocigotos tienen una actividad baja en plasma/suero y leucocitos otros no se pueden detectar por métodos enzimáticos. La identificación de los portadores está basada en la detección de las mutaciones causantes de enfermedad en el gen GLA. Se asume que los niveles de actividad de la α-Gal A en los leucocitos de los heterocigotos reflejan el patrón de inactivación del cromosoma X en las células de la muestra. La inactivación del cromosoma X, se propone como mayor factor determinante del desarrollo de la enfermedad en heterocigotos. Se encontraron diferencias significativas entre los valores de la puntuación de gravedad de la enfermedad y la inactivación 26 del cromosoma X 158 y se ha observado que en heterocigotos en edad avanzada, a veces se encuentran valores de actividad altos dentro del rango de los heterocigotos. 1.7.3 Análisis mutacional Para identificar las diferentes mutaciones en el gen GLA se pueden utilizar diferentes técnicas dependiendo de la naturaleza de la mutación 1,134. El 90% de las mutaciones (mutaciones puntuales, pequeños reordenamientos) pueden ser detectados amplificando mediante la reacción de PCR, los exones, incluyendo las regiones que lo flanquean, seguido de la detección de los cambios en la secuencia por diferentes métodos. El método más preciso es la secuenciación. La mejor manera de identificar variantes(nuevas y conocidas) y las pequeñas inserciones y deleciones es secuenciar toda la zona codificante y las regiones que lo flanquean en ambas direcciones 159. Otro método para detectar mutaciones de una forma rápida y sencilla, es el basado en la disociación de temperatura de dos hebras y el análisis de las curvas de fusión 160. Este método ha sido utilizado en el cribado mutacional en una población con síntomas de EF 74. Los métodos de secuenciación masiva, en los que el gen GLA se integra en paneles de genes agrupados por fenotipo o en exomas clínicos, son una realidad en el análisis mutacional 161,162. Los grandes reordenamientos, que forman parte del 4-5% del total de las mutaciones, pueden ser detectados mediante la técnica “Southern blot” utilizando el DNA codificante del gen GLA como sonda 163. Es difícil detectar deleciones en uno o varios exones especialmente en mujeres heterocigotas. Esas mutaciones pueden ser detectadas mediante la técnica “Multiplex Ligationdependent Probe Amplification” 164. Si la mutación no se encuentra en la región codificante del gen o flanqueando a esas regiones y no es un gran reordenamiento, debe ser valorada la posibilidad de que exista una mutación de ayuste (aproximadamente 5% de las mutaciones conocidas) y debe ser caracterizada mediante el análisis del DNA codificante 93 o mediante la PCR cuantitativa (qPCR) 94 para analizar la molécula de RNA. Es importante estudiar la expresión del ayuste alternativo de la α-Gal A ya que el tránscrito, en condiciones normales, está expresado entre el 1 y el 10% en tejidos. Un desbalance en el ayuste alternativo entre el tránscrito fisiológico y el alternativo puede resultar en un déficit enzimático. Se ha sugerido que la qPCR debería estar incluida en el análisis genético de rutina en EF 93. Schiffmann et al. realizaron un algoritmo para ayudar a evaluar las VUS (figura 1.18) y llegaron a la conclusión que demostrar el acúmulo de sustrato en el tejido implicado o en la piel, si no fuera posible biopsiar el órgano diana, es la alternativa necesaria 165. 27 INTRODUCCIÓN Figura 1.18. Algoritmo para la interpretación de las VUS en la EF. Fuente: Imagen adaptad de Schiffmann et al. 2016 1.7.4 Otros métodos. La observación de biopsias mediante microscopia óptica no suele ser una gran contribución al diagnóstico. Cuando la microscopia electrónica no es accesible, las secciones teñidas con azul de toluidina o tricrómico de Mason facilitan el diagnóstico. Debido al elevado número de falsos positivos y al ser un proceso invasivo no suele ser un procedimiento utilizado en el diagnóstico. Los estudios de la ultraestructura mediante microscopia electrónica del endomiocardio y las biopsias de riñón pueden mostrar acúmulo lisosomal en los cardiomiocitos o diferentes tipos celulares renales. La apariencia de las ultraestructuras de las inclusiones se presenta como capas en espiral que alternan material denso y claro (cuerpos de cebra o figuras de mielina). La biopsia de piel observada por microscopia electrónica puede utilizarse como apoyo al diagnóstico pero es de difícil interpretación 166. Como hemos visto en el apartado 1.7.3, la realización de una biopsia dirigida al órgano afectado o bien a la piel si no fuese posible la primera alternativa, puede ayudarnos a la interpretación de un VUS 167. 1.8 Tratamiento En los últimos años se han llevado a cabo muchos avances en el tratamiento de las enfermedades lisosomales. Antes del año 1990, no existía un tratamiento específico para estas enfermedades y únicamente se podían ofrecer tratamientos paliativos para las morbilidades asociadas a la enfermedad. La situación cambió radicalmente desde que apareció la primera 28 enzima sustitutiva obtenida de placentas humanas para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher 168, que fue la primera en disponer de un tratamiento eficaz para combatir los síntomas de la enfermedad. Posteriormente y por tecnología recombinante se han obtenido otras enzimas sustitutivas aplicables a otras enfermedades lisosomales. Primeramente, en Estados Unidos y más tarde en Europa, la regulación para los fármacos huérfanos, ha propiciado que la industria farmacéutica desarrolle productos para las patologías poco prevalentes a través de un programa de beneficios como otorgarles la exclusividad en el mercado por un periodo de 10 años. Actualmente, nuevas aproximaciones terapéuticas han sido aprobadas como las chaperonas farmacológicas o se encuentran en fase de desarrollo como la terapia de reducción de sustrato o la terapia génica. 1.8.1 Terapia enzimática sustitutiva En el año 2001 se introdujo por primera vez el uso de la enzima humana α-Gal A como TES. En Europa, actualmente, se comercializan dos enzimas: la algasidasa alfa (Replagal®; Takeda; Cambridge, MA, USA), producida mediante la tecnología de activación génica a partir de líneas celulares de fibrosarcoma humano (dosis: 0,2 mg/kg cada dos semanas) 169 y la algasidasa beta (Fabrazyme®; Genzyme-SanofI, Cambridge, MA, USA) producida a partir del cDNA de la α-Gal A en líneas celulares de ovario de hámster chino (dosis: 1 mg/kg cada dos semanas) 170. Aunque los dos productos tienen la misma secuencia de aminoácidos, las dos enzimas recombinantes difieren en la cantidad de residuos de manosa-6-fosfato y en la proporción de ácido siálico en relación a la galactosa. Esto influye en la interacción de la proteína con los receptores de asialoglicoproteínas, mayoritariamente localizados en los hepatocitos y los receptores de manosa-6-fosfato distribuidos por varios tejidos afectando a la biodisponibilidad 171. Otro ámbito de diferenciación de ambos productos es el perfil de seguridad, ya que por la naturaleza de los motivos de glicosilación de ambos moléculas, agalsidasa alfa presenta menor porcentaje de eventos adversos relacionados con la inmunogenicidad 169,170 A diferencia de otras enfermedades lisosomales como la enfermedad de Gaucher (EG) en la que el acúmulo de material en el lisosoma está mayoritariamente restringido a la línea celular monocito-macrófago, en la EF están comprometidos un número mayor de tejidos. Por ese motivo la accesibilidad de la enzima es menor que en la EG. Aunque el proceso patológico en el tejido endotelial juega un papel muy importante, no puede explicar por completo el cuadro clínico en la EF, únicamente con el acúmulo de Gb3 en este tejido. Se han realizado varios estudios clínicos comparando los parámetros bioquímicos prey postratamiento en muestras 29 INTRODUCCIÓN de plasma y tejidos. La TES aporta beneficios sobre órganos como el corazón, riñón y otros tejidos como el endotelial 172. La variedad y gravedad de los síntomas en la EF es muy grande y no existen buenos biomarcadores para su seguimiento 137,146. La TES tiene varias limitaciones: la primera es que la enzima recombinante, como ocurre en otras enfermedades de depósito, no puede atravesar la barrera hematoencefálica, con lo cual no llega a ser distribuida al sistema nervioso central. Pueden producirse reacciones de hipersensibilidad a la administración de la enzima intravenosa. Los anticuerpos generados a la larga pueden decrecer la eficacia de la terapia bloqueando la enzima 173. La terapia no tiene eficacia sobre órganos que han sido afectados de forma irreversible como la afectación renal en estadio III, sin embargo permite la estabilización de la fibrosis y evita su evolución 174. Muchas de las limitaciones de la TES posiblemente estén relacionadas con el momento en el que se empieza a administrar el fármaco, por eso un diagnóstico temprano es importante para el éxito terapéutico. 1.8.2 Terapia con chaperonas moleculares En la EF un gran número de mutaciones son puntuales generando una proteína inestable, aunque catalíticamente funcional 64. La forma purificada de la enzima mutante es catalíticamente comparable a la proteína no mutada 16, sin embargo no es capaz de alcanzar el lisosoma por un problema conformacional, haciendo que se altere el tráfico intracelular. Los estudios del tráfico intracelular y degradación de las enzimas mutadas indican que éstas quedan retenidas en el retículo endoplasmático (RE) y son degradadas por el mecanismo programado asociado al RE (ERAD) 16. Este es el fundamento para el uso de pequeñas moléculas, las chaperonas, que estabilizan las conformaciones intermedias de la proteína y así reducir la degradación prematura mediante ERAD 16. Los inhibidores enzimáticos que provienen de la familia de los iminoazúcares pueden actuar también como chaperonas farmacológicas activas, incrementando la actividad residual enzimática y estabilizándola 175f Los iminoazúcares mimetizan a los monosacáridos, debido al cambio de un átomo de nitrógeno en lugar del átomo de oxígeno presente en la estructura cíclica de los monosacáridos y pueden actuar como potentes inhibidores de las glucosidasas. Debido a que los iminoazúcares tienen una alta afinidad por el centro activo de la enzima diana, éstos pueden actuar como chaperona específica de sitio activo estabilizando las formas de plegamiento intermedias 176. Actualmente en Europa, se comercializa una única chaperona molecular para la EF denominada 1-deoxigalactonojirimicina (DGJ) o migalastat (Galafold®; Amicus Therapeutics; Cranbury, NJ, USA). Se trata de la primera terapia oral para la EF, se distribuye bajo la formulación química de 30 hidrocloruro (150 mg/48h) y está indicada para el tratamiento de la EF en pacientes mayores de 16 años y que presenten una mutación “susceptible” 17. El término “susceptibilidad” hace referencia al aumento de la actividad de la α-Gal A mutante en presencia de migalastat, obteniendo en modelo celular in vitro un incremento relativo mayor o igual al 3% o un incremento absoluto mayor o igual a 1,20 177. La eficacia y seguridad del producto se ha testado en varios ensayos clínicos obteniéndose resultados de mantenimiento de la función renal, disminución de la HVI, reducción y mantenimiento de niveles plasmáticos de Liso-Gb3 etc. 149,178. Respecto a las bondades de una terapia oral, segura y eficaz para la EF. Pueden aparecer una serie de inconvenientes en esta terapia como una posible falta de adherencia persé al tratamiento oral en pacientes crónicos 179, la limitación al acceso del tratamiento ya que poco más del 30% de las mutaciones descritas en la EF serían susceptibles 17, variabilidad interlaboratorio en cuanto a los ensayos de susceptibilidad 180. Figura 1.19. Mecanismo propuesto para las chaperonas específicas del centro activo. A) Mecanismo para la enzima no mutada, B) mecanismo para la enzima mutada. Imagen adaptada de Lysosomal storage research (ver enlace) 31 INTRODUCCIÓN 1.8.3 Nuevas aproximaciones terapéuticas 1. Terapia de reducción o inhibición de sustrato: La inhibición de la síntesis de sustrato es una alternativa terapéutica para las enfermedades de acúmulo lisosomal. Esta aproximación terapéutica en la EF lleva a la reducción de la síntesis de Gb3 a través del descenso de la deposición de ceramida. La glucosilceramida sintasa es una de las dianas potenciales para esta aproximación terapéutica. Su inhibición conduce a una reducción en la síntesis de la glucosilceramida, precursor de glucoesfingolípidos neutros y gangliósidos. La Nbutildeoxinojirimicina (miglustat, Zavesca®; Johnson and Johnson) ha sido probada con éxito en el tratamiento de la EG 181, sin embargo el fármaco produce efectos secundarios reversibles como la diarrea y temblor. En la EF actualmente se está desarrollando un nuevo inhibidor de la glucosilceramida sintasa, llamado Lucerastat que se trata de un iminoazúcar similar a miglustat que se ensaya en pacientes de la EF tratados previamente con la TES 182,183. 2. Terapia enzimática sustitutiva pegilada: este tipo de tratamiento sigue los principios vistos en el apartado 1.8.1, en los que se produce una enzima recombinante a partir del cDNA de la α-Gal A en líneas celulares vegetales para posteriormente unir covalentemente sus subunidades mediante intercalado de moléculas de polietilenglicol, de esta forma se trata de incrementar la vida útil de la molécula en el plasma sin perjuicio del perfil de seguridad y pudiendo espaciar las dosis sin afectarse la eficacia del tratamiento. Se están desarrollando tres ensayos clínicos en fase II habiéndose publicado resultado positivos en cuanto a función renal por Schiffmann et al 184. 3. Terapia combinada: esta aproximación pretende combinar el uso de la chaperona farmacológica DGJ o migalastat con la TES, para conseguir alargar la vida útil de ésta sin perjudicar a la eficacia. Los resultados en animales de laboratorio fueron positivos consiguiendo incrementar en 2,5 veces la vida útil de la enzima exógena en el plasma, además de conseguir una reducción aproximada del 30% del acúmulo tisular de Gb3 185. Basado en esos resultados, se está desarrollando un ensayo clínico en fase II en el que se está probando diferentes dosis de chaperona y enzima y por el momento Warnock et al. ha comunicado un aumento de la vida media de la enzima en plasma entre 1,2 y 5,1 veces, resultado que también constata en proporciones similares en piel y células de la serie blanca de pacientes con la EF 186. 4. Terapia génica: actualmente se está llevando a cabo un ensayo de terapia génica en EF, que consiste en la inserción del gen GLA corregido en el genoma celular mediante un vector 36 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 22C>T 73–83. Por último, un caso muy representativo de la complejidad en el consenso sobre la patogenicidad de ciertas variantes genéticas, lo constituyen algunas como NM_000169.2:c.-30G>A 85,86 o NM_000169.2: c.937G>T (p.Asp313Tyr) 89,90. Desde el punto de visto epidemiológico, se desconoce la prevalencia real de la EF, debido a la complejidad diagnóstica de la enfermedad y a la variabilidad en cuanto a criterios de cribado, por lo que no se cuenta con un valor fiable de prevalencia en población general y menos si cabe en población afecta de la EF cuyos síntomas se restringen a un único órgano o sistema, como por ejemplo la MHVI 33,34,37,45. A la luz de los precedentes anteriores, planteamos los siguientes objetivos: 1. Conocer la incidencia de la EF en pacientes (mujeres y varones) diagnosticados de MHVI de origen desconocido. 2. Valorar la capacidad de cribado en la EF, de un método de análisis enzimático y genético basado en gota de sangre seca sobre papel de filtro. 3. Caracterizar funcionalmente las variantes genéticas nuevas que se identifiquen en el gen GLA en individuos con signos y síntomas de la EF. 4. Realizar un análisis epidemiológico de la relación de las variantes genéticas identificadas en este estudio con diversos parámetros clínico-analíticos de la población, y su segregación en forma de haplotipos. 5. Profundizar en el estudio molecular y funcional de los individuos con signos y síntomas compatibles con la EF, en los que se haya identificado las variantes genéticas. MATERIALES Y METODOLOGÍA 39 MATERIALES Y METODOLOGÍA 4 Materiales y Metodología 4.1 Pacientes y controles Se reclutaron pacientes, independientemente del género: pacientes diagnosticados de MHVI idiopática que se encontraban en el momento de la inclusión en seguimiento clínico en las consultas de cardiología de los hospitales participantes (reclutamiento retrospectivo); pacientes evaluados en la práctica clínica habitual en dichas consultas (reclutamiento prospectivo). En la tabla 4.1 se recogen los criterios de inclusión y exclusión para los pacientes. Tabla 4.1. Criterios de inclusión y exclusión de los pacientes. CRITERIOS DE INCLUSIÓN Varones o mujeres. Mayoría de edad en el momento del reclutamiento (≥18 años). Pacientes con MHVI de origen desconocido (espesor del septo ventricular y/o pared ventricular izquierda posterior (EVI)>14mm). Pacientes no relacionados entre sí (1 paciente por familia). Firma del consentimiento informado de participación en el estudio. OPCIONAL (NO EXCLUYENTE): Pacientes con estenosis aórtica ligera (gradiente medio<20 mm de Hg o área valvular aórtica>1,5 cm2). Pacientes HTA ligera (presión sistólica<160 mm de Hg y/o diastólica<95 mm de Hg). CRITERIOS DE EXCLUSIÓN Pacientes con MHVI secundaria a causa orgánica. Pacientes con MHVI debido a causa genética conocida. Pacientes con MHVI de origen idiopático cuyo patrón de herencia genética no fuese ligado al cromosoma X. Pacientes con estenosis aórtica moderada o grave (gradiente medio≥20 mm de Hg o área valvular aórtica≤1,5 cm2). Pacientes con HTA moderada o grave (presión sistólica≥160 mm de Hg y/o diastólica≥95 mm de Hg). Pacientes con coartación aórtica. El período estimado para el reclutamiento de los pacientes fue de nueve meses desde la inclusión del primer paciente o bien hasta alcanzar el número de 600 pacientes entre los 8 centros participantes (tabla 4.2). 40 MATERIALES Y METODOLOGÍA Tabla 4.2. Centros participantes en el estudio. CENTRO PROVINCIA Hospital General Universitario de Alicante Alicante Hospital Universitario Puerta de Hierro Madrid Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela A Coruña Facultad de Medicina de la Universidad de Murcia Murcia Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca Murcia Hospital Universitari Son Llàtzer Palma de Mallorca Hospital General Universitario de Elche Alicante Hospital Universitario de Donostia Guipúzcoa Con el fin de normalizar las posibles variables preanalíticas relacionadas con la toma de la muestra de DBS, se solicitó a cada uno de los centros anteriores, que aportasen un mínimo de 20 muestras de individuos de ambos géneros sin patología cardíaca conocida ni historia familiar de la misma, con el fin de poder ajustar unos rangos de referencia para cada centro para todas las determinaciones que se fuesen a realizar en DBS. Para el resto de determinaciones en muestras diferentes al DBS, se utilizaron los excedentes del diagnóstico de individuos varones y mujeres, a los que se les descartó mediante método enzimático y/o genético la compatibilidad con la EF, procedentes de la colección de muestras de Enfermedades Lisosomales gestionadas por el Biobanco del Sistema de Salud de Aragón. Todos los pacientes y controles fueron informados verbalmente y por escrito, de los objetivos y metodología a seguir en este estudio, aceptando de manera voluntaria su participación en el mismo y firmando el correspondiente consentimiento informado. Este estudio fue aprobado el 30 de marzo de 2011 por el Comité de ética de investigación clínica de la Comunidad Valenciana de la Agència Valenciana de Salut (Alicante) y categorizado el 20 de enero de 2011 como “estudio observacional no posautorización (No-EPA)” por la Subdirección general de medicamentos de uso humano de la Agencia española de medicamentos y productos sanitarios. La investigación fue llevada a cabo según los principios de la Declaración de Helsinki de la promulgada por la Asociación Médica Mundial en su 18º asamblea general del año 1964 41 MATERIALES Y METODOLOGÍA en Helsinki (Finlandia), y enmendada por esta misma asociación en la 64º asamblea general del año 2013 celebrada en Fortaleza (Brasil) 187. 4.2 Diseño del estudio El estudio constó de 3 fases como se muestra en la figura 4.1: una primera fase de inclusión de pacientes siguiendo los criterios de inclusión/exclusión (ver tabla 4.1) y toma de muestra en DBS; una segunda fase que afecta a la totalidad de los pacientes que componen la muestra y que consiste en cribado enzimático en DBS y/o secuenciación de las regiones 5’-UTR y codificantes del gen GLA; una tercera fase de caracterización de aquellos pacientes en los que se hayan identificado variantes potencialmente causales de la EF. Figura 4.1.Diagrama del flujo del estudio. 4.3 Estudio ecocardiográfico Para satisfacer el criterio de inclusión relativo al espesor del septo ventricular y/o pared ventricular izquierda posterior (EVI, ver tabla 4.1), esta determinación se podía obtener de cualquier ecocardiograma que se le hubiera realizado al paciente con una antigüedad máxima de 6 meses al momento de la inclusión en el estudio (retrospectivo). En caso de no tener ninguna determinación anterior, se debía realizar una ecocardiografía previa a la inclusión que permitiera confirmar la existencia de criterios de HVI (prospectiva). Además del espesor septal y/o pared ventricular se registró el patrón de distribución de la HVI. Los estudios ecocardiográficos se llevaron a cabo por los médicos especialistas de cada una de las consultas externas de cardiología de los ocho centros participantes (ver tabla 4.2), siguiendo las recomendaciones de la Sociedad americana de ecocardiografía 188. 42 MATERIALES Y METODOLOGÍA 4.4 Extracción de muestras de sangre para los estudios a realizar en DBS Las muestras de sangre destinadas a los estudios de cribado enzimático y análisis molecular del gen GLA sobre muestra de DBS, se recogieron en las consultas externas de cardiología de los centros participantes (tabla 4.2). La sangre se obtuvo por dos procedimientos diferentes, siguiendo las recomendaciones emitidas por nuestro laboratorio, eligiendo uno u otro según criterio de cada centro: En el primer procedimiento la sangre se obtuvo mediante flebotomía de la vena cubital, utilizando una palomilla de extracción de sangre con activación automática y portatubos premontado (BD Vacutainer® Push Button, Becton Dickinson™ o similar) para recoger un volumen variable de sangre venosa en tubos de vacío que contenían el anticoagulante sal dipotásica del ácido etilendiaminotetraacético (K2EDTA) a concentración de 1,8 mg/mL (BD Vacutainer®, Becton Dickinson™ o similar). Una vez obtenida la sangre, se homogeneizó el contenido del tubo mediante inversión suave y se tomaron 35 μL del homogeneizado, depositándose de forma continua en cada una de las áreas delimitadas de las tarjetas de papel de filtro Whatman nº 903 (Whatman™, GE Healthcare™). En el segundo procedimiento la sangre se obtuvo mediante punción de la vena digital palmar del dedo índice, depositándose una sola gota de sangre en cada una de las áreas delimitadas de las tarjetas de papel de filtro Whatman nº 903. (ver figura 4.2) Figura 4.2. Tarjeta de papel de filtro utilizada en el estudio de cribado. Tras depositar la sangre, se codificó anonimizándose la identidad del paciente y se procedió al posterior secado durante un mínimo de cuatro horas a temperatura y humedad relativa ambiente. Finalizado el secado, las tarjetas se conservaron dentro de una bolsa de plástico de 43 MATERIALES Y METODOLOGÍA cierre hermético (eliminando el aire residual) junto con un material higroscópico, a temperatura de refrigeración (+4 ºC) durante un período máximo de tres días hasta el momento del envío al laboratorio mediante servicio de mensajería, siguiendo las recomendaciones previamente publicadas 189,190. 4.5 Extracción de muestras de sangre para los estudios a realizar en plasma, concentrado de leucocitos, DNA y RNA Las muestras de sangre destinadas a los estudios funcionales sobre muestra de plasma, concentrado de leucocitos, DNA y RNA, se recogieron en las consultas externas de cardiología de los centros participantes mencionados (tabla 4.2)., siguiendo las recomendaciones emitidas por nuestro laboratorio. La sangre para los estudios del plasma, concentrado leucocitario y DNA se obtuvo mediante flebotomía de la vena cubital, utilizando una palomilla de extracción de sangre con activación automática y portatubos premontado (BD Vacutainer® Push Button, Becton Dickinson™ o similar) para recoger 10 mL de sangre venosa en tubo de vacío con anticoagulante K2EDTA (BD Vacutainer®, Becton Dickinson™ o similar); una vez obtenida la sangre, se homogeneizó el contenido del tubo mediante inversión. Adicionalmente, para llevar a cabo estudios sobre el RNA se solicitaron 5 mL de sangre venosa recogida en 2 tubos (2,5 mL/tubo) PAXgene® Blood RNA tube (PreAnalytix™, Becton Dickinson™/Quiagen™) que contenían un reactivo químico que permite la estabilización del RNA total (metodología de extracción según recomendación del fabricante). Las muestras de sangre se codificaron con el mismo código que se le asignó a la muestra de DBS y se enviaron el mismo día de la extracción, mediante servicio de mensajería, manteniéndolas a temperatura de refrigeración (+4 ºC) hasta la recepción en el laboratorio 24h post-extracción. Se separó el plasma de las células sanguíneas, de las muestras de sangre con K2EDTA, mediante centrifugación a 2.000xg durante 10 minutos a temperatura ambiente en una centrífuga Allegra® X-15R (Beckman Coulter™). La fase superior (plasma) se alicuotó convenientemente en microtubos de 1,5 mL (Daslab) previamente codificados. El volumen de plasma aislado fue reconstituido añadiendo el mismo volumen de una solución de suero salino NaCl 0,9% (p/v) (PM=58,4 g/mol; Sigma-Aldrich®) estéril para evitar alterar la concentración de elementos celulares. De este reconstituido, se separó un volumen de 3 mL que se congeló a -20ºC para 50 MATERIALES Y METODOLOGÍA Para valorar el uso en ensayos moleculares del RNA total aislado y/o purificado, se aceptó como criterio de idoneidad la observación de una banda de tamaño 1,9 kb (RNA ribosomal 18S) y otra banda de tamaño 5 kb (RNA ribosomal 28S). 4.11 Determinación de marcadores biológicos subrogados a la EF En este estudio como marcadores biológicos analizamos en muestra de orina y plasma K2EDTA conservada a -80ºC, la concentración de la Gb3 (ver apartado 4.5.) y la concentración de la LisoGb3 (ver apartado 4.4.) respectivamente. Ambos metabolitos fueron enviados mediante transporte especial en nieve carbónica y analizados en sendos laboratorio de referencia: La Gb3 fue analizada por el Dr. Kai Bruns en el Instituto de Química Clínica y Laboratorio de Medicina del Centro de Médico de la Universidad Johannes Gutenberg de Mainz (Alemania) y la Liso-Gb3 fue analizada por los doctores José María Hernández Pérez y Lourdes Fluviá Cams en la Unidad de Proteómica y Metabolómica del Hospital Universitari Germans Trias i Pujol de Badalona, Barcelona (España). 4.11.1 Determinación de la concentración de Gb3 en orina La cuantificación de la Gb3 se realizó de acuerdo a la metodología previamente publicada por Krugër et al. 2010 191. Brevemente, se tomaron 200 µL de orina descongelada (ver apartado 4.5.) y se le añadieron 1.200 µL de una mezcla 2:1 de TCM:metanol (MeOH) (v/v) y 20 µL de una solución de estándar interno (EI) de concentración 0,5 mg/L de Gb3 modificada covalentemente (N-heptadecanoil-Gb3, ver figura 4.3) (Matreya LLC) en una mezcla 2:1 de TCM:MeOH (v/v) como disolvente. La mezcla anterior se sonicó durante 5 minutos, se homogeneizó mediante vórtice y se centrifugó 2.800xg durante 10 minutos. Finalizado este período, se secó el sobrenadante mediante el uso de una centrífuga de vacío y se resuspendió el precipitado con 1.000 µL de TCM para ser sonicado de nuevo, homogeneizado y centrifugado a 13.000xg durante 10 minutos. La Gb3 se separó del producto anterior mediante extracción en fase sólida, utilizando como fase estacionaria perlas de sílica (100 mg/mL) altamente retentivas para compuesto apolares equilibradas con MeOH y TCM; una vez el producto interaccionó con la fase estacionaria se lavó con MeOH y etil-acetato y se eluyó el metabolito con una mezcla 8:2 de acetona:MeOH (v/v). El eluato se secó con una centrífuga de vacío y se resuspendió el precipitado con 100 µL de MeOH para ser sonicado de nuevo, homogeneizado y centrifugado a 13.000xg durante 10 minutos. El sobrenadante obtenido fue transferido a viales de cristal y estaba listo para ser analizado por CL. 51 MATERIALES Y METODOLOGÍA Se generaron los calibradores de la Gb3 a partir de conjuntos de orinas recolectadas durante 24 horas de individuos no afectos de la EF. Estos conjuntos de orinas se procesaron de la misma manera que las muestras de los pacientes. El precipitado obtenido mediante secado a vacío se resuspendió con una solución de la Gb3 de porcino (estándar externo, EE) de concentración conocida en la mezcla 2:1 de TCM:MeOH (v/v) como disolvente. Los calibradores obtenidos abarcaban el rango (0,0-7,2) mg/L. Se procedió con la EM: la fragmentación y cuantificación del metabolito se realizó en modo electroespray con un instrumento triple-cuadrupolo (TSQ Quantum Discovery, ThermoFisher Scientific). La concentración de la Gb3 en las muestras de orina de los pacientes se normalizó con la concentración de la creatinina de las mismas y el resultado se expresó como mg de Gb3 por mmol de creatinina. El valor de referencia del laboratorio fue menor de 0,03 mg Gb3/mmol creatinina para ambos géneros Figura 4.3. Isómeros conformacionales empleados como estándar externo (A) e interno (B) en el proceso de cromatografía líquida-espectrometría de masas para la cuantificación de la Gb3 en muestra de orina. Fuente: imagen adaptada de www.matreya.com. 4.11.2 Determinación de la concentración de Liso-Gb3 en plasma La cuantificación de la Liso-Gb3 se realizó, con ligeras modificaciones sobre el método publicado por Boutin et al. 2012 192. Brevemente, las alícuotas de plasma K2EDTA (ver apartado 4.4.) se descongelaron a +4ºC y se homogeneizaron mediante agitación con vórtice y sonicación. Como paso previo al aislamiento del metabolito en la muestra de plasma, fue necesario acondicionar el cartucho de extracción en fase sólida (Oasis®MCX, Waters Corp.) mediante la adición secuencial de 1.200 µL de MeOH y 1.200 µL HCl 1,0 mol/L en H2O de grado apto para CL como disolvente. Una vez acondicionado el cartucho, se cargaron con una mezcla de 200 µL de plasma sonicado, 500 µL de una solución de EI de concentración 4,0 nmol/L de 1-β-D-glucosilesfingosina de origen vegetal (ver figura 4.4, Matreya LLC) en MeOH como disolvente y 100 µL de una 52 MATERIALES Y METODOLOGÍA dilución de HCl 1,0 mol/L en H2O de grado apto para CL como disolvente. Tras finalizar la carga de la mezcla anterior, se procedió al lavado secuencial del cartucho con una solución al 2,0% de ácido fórmico (AF; m/v) en H2O de grado apto para CL y con otra solución al 0,2% de AF (m/v) en MeOH. Los metabolitos retenidos fueron eluidos mediante la adición al cartucho de 4,0 mL de una solución al 5,0% de amoniaco (v/v) en MeOH. El eluato se recogió en tubos de cristal y se secó con una centrífuga de vacío; el precipitado obtenido se resuspendió con una mezcla 50:28,8:0,2 de acetonitrilo:AF:H2O de grado CL (v/v) y se transfirió a viales de cristal aptos para la CL. Los calibradores de la Liso-Gb3; se generaron mediante conjuntos de plasmas K2EDTA de individuos no afectos de la EF a los que se les deplecionó la Liso-Gb3 endógena mediante tratamiento de los mismos con carbón dextrano durante 12 horas a +4ºC; una vez se eliminó el metabolito endógeno se procesaron de la misma manera que las muestras de plasma de los pacientes. El precipitado obtenido mediante secado a vacío se resuspendió con una solución de la Liso-Gb3 (EE) de concentración conocida en la mezcla 50:28,8:0,2 de acetonitrilo:AF:H2O de grado CL (v/v) como disolvente. Los calibradores obtenidos abarcaban el rango (0,0-400,0) nmol/L. La fragmentación y cuantificación del metabolito asociada al proceso de EM, se realizó en modo electroespray positivo con un instrumento triple-cuadrupolo (Agilent 6410 Triple Quadrupole LC/MS, Agilent Technologies). La concentración de la Liso-Gb3 en las muestras de plasma K2EDTA de los pacientes se expresó como nmol Liso-Gb3 por litro de plasma. El valor de referencia del laboratorio fue menor de 1,0 nmol Liso-Gb3/L para ambos géneros. Figura 4.4. Isómeros conformacionales empleados como estándar externo (A) e interno (B) en el proceso de cromatografía líquida-espectrometría de masas para la cuantificación de la Liso-Gb3 en muestra de plasma K2EDTA. Fuente: imagen adaptada de www.matreya.com. 53 MATERIALES Y METODOLOGÍA 4.12 Medida de la actividad de la enzima α-galactosidasa A 4.12.1 Medida de la actividad enzimática en muestras de gota de sangre seca El ensayo de la actividad de la α-Gal A en DBS se realizó por triplicado y fue llevado a cabo según el método descrito por Chamoles et al 2001 193. Brevemente, mediante un troquel se obtuvo un disco de 3 mm Ø de la muestra de DBS, se depositó en un microtubo de 1,5 mL convenientemente codificado y se incubó a temperatura ambiente con una solución de 0,25 M de N-Acetil-D-galactosamina preparada en dH2O (Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, EE. UU.), como inhibidor de específico de la enzima α-galactosidasa B. A este producto se le añadió una solución de 5 mM del sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranósido (4-MU-Gal) (SigmaAldrich®, St. Louis, MO, EE. UU.) preparado en tampón 0,07 M citrato / 0,15 M fosfato (Panreac) a pH=4,6. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 20 horas en un baño termostático seco con agitación de 550 rpm (Thermomixer®, Eppendorf™). Finalizado este período, se paró la reacción mediante tampón alcalino 0,1 M de etilendiamina diluida en dH2O a pH=11,4 (Sigma-Aldrich®). El producto fluorescente 4-metilumbelifereona (4-MU) obtenido se midió con una cubeta de cuarzo de 10,0 x 4,0 mm de paso óptico (Hellma®) en un fluorímetro PerkinElmer LS-45 (PerkinElmer®), empleando λexcitación=366 nm y λemisión=445 nm. Las medidas de fluorescencia se interpolaron en una recta de calibrado construida con calibradores de diferente concentración de 4-MU, abarcando el rango (0,00-0,50) nmol (figura 4.5). Figura 4.5. Recta de calibrado de la 4-metilumbeliferona para los ensayos de actividad enzimática en DBS. El resultado se expresó como micromoles de sustrato procesado por hora y por “spot” y se normalizó relativizándolo respecto al valor medio de un conjunto de controles del mismo género obtenidos en el mismo centro que el probando. 54 MATERIALES Y METODOLOGÍA 4.12.2 Medida de la actividad enzimática en muestras de plasma K2EDTA El ensayo de la actividad de la α-Gal A en plasma K2EDTA se realizó por triplicado y fue llevado a cabo según el método modificado descrito por Mayes et al 1981 194. Brevemente, se añadieron a microtubos de 1,5 mL el plasma diluido con dH2O y una mezcla en proporción 1:1 de solución 8,75 mM del sustrato 4-MU-Gal en dH2O y tampón 0,2 M citrato / 0,4 M fosfato (v/v) a pH=4,6. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 2 horas en termostato de bloque seco (Selecta P®). Finalizado este período, se paró la reacción mediante tampón alcalino 0,2 M de glicina/hidróxido de sodio (NaOH) en dH2O a pH=11,0 (Sigma-Aldrich®). La 4-MU se midió con una cubeta de cuarzo de 10,0 x 10,0 mm de paso óptico (ver apartado 4.12.1). Las medidas de fluorescencia se interpolaron en una recta de calibrado construida con calibradores de 4-MU, abarcando el rango (0,0-2,0) nmol. El resultado se expresó como nanomoles de sustrato procesado por hora y por mL de plasma K2EDTA. 4.12.3 Medida de la actividad enzimática en concentrado de leucocitos El ensayo de la actividad de la α-Gal A en muestra de concentrado de leucocitos se realizó por triplicado y fue llevado a cabo según el método modificado descrito por Mayes et al 1981 194. Brevemente, los concentrados de leucocitos obtenidos según el apartado 4.7, fueron lisados mediante resuspensión en tampón de taurocolato sódico al 1% (m/v) (Sigma-Aldrich®) y sonicación (B. Braun Labsonic®U, B. Braun Biotech. International) de acuerdo con el esquema indicado en la figura 4.6; a continuación, se centrifugaron a 2.000xg. durante 10 minutos a +4ºC y el sobrenadante obtenido se transfirió a un nuevo microtubo de 1,5 mL inmerso en baño de hielo. La concentración de proteína total presente en el extracto celular se cuantificó mediante espectrofotometría de absorción UV con el espectrofotómetro NanoDrop™ 2000C a λ=280 nm y se diluyeron a concentración de trabajo 0,0013 mg proteína/µL utilizando taurocolato sódico al 1% como diluyente. 55 MATERIALES Y METODOLOGÍA Figura 4.6. Esquema del proceso de lisado del concentrado de leucocitos. El color rojo indica aplicación de pulso de ultrasonido y el color azul no aplicación del pulso. Una vez se obtuvo el extracto leucocitario a la concentración de ensayo, se añadieron a microtubos de 1,5 mL una mezcla en proporción equivolumétrica de este extracto, solución 14,0 mM del sustrato 4-MU-Gal en dH2O, solución 0,4 M de N-Acetil-D-galactosamina preparada en dH2O y tampón 0,4 M citrato / 0,8 M fosfato (v/v) a pH=4,6. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 1 hora en termostato de bloque seco. Finalizado este período, se paró la reacción mediante tampón alcalino 0,3 M de glicina/NaOH en dH2O a pH=10,6. La 4-MU se midió con una cubeta de cuarzo de 10,0 x 10,0 mm de paso óptico (ver apartado 4.12.1). Las medidas de fluorescencia se interpolaron en una recta de calibrado construida con calibradores de 4-MU, abarcando el rango (0,0-3,0) nmol. El resultado se expresó como nanomoles de sustrato procesado por hora y por mg de proteína total celular. 4.13 Análisis molecular del gen GLA. Secuenciación capilar. Para realizar el análisis de la secuencia nucleotídica del gen GLA, se realizaron amplificaciones específicas de dicho gen mediante PCR y posterior aplicación de técnicas de secuenciación de primera generación (método Sanger o de los di-deoxi-nucleótidos-tri-fosfato [ddNTPs]. Para ello diseñamos parejas de cebadores específicos mediante el programa Oligo v.7 (Molecular Biology Insights Inc., CO, EE. UU.) que cubriesen todas las regiones codificantes (la región 5’-UTR y exones, tabla 4.3) así como las regiones no codificantes (promotor del gen y todos los intrones, tabla 4.4). Para el diseño de los cebadores, tomamos como referencia la secuencia genómica de dicho gen (NG_007119.1), depositada en el repositorio público del centro nacional de información biotecnológica de Estados Unidos (NCBI, ver enlaces). 56 MATERIALES Y METODOLOGÍA Tabla 4.3. Cebadores específicos para la amplificación de las regiones codificantes del gen GLA. CEBADOR 5’ - SECUENCIA - 3’ Ta (ºC) AMPLICÓN (pb) 5’-UTR CCCACACACCAACCTCTAACGATAC 54,0 424 GGTGACCGGACAGCATAAAT Exón 1 TAGGGCGGGTCAATATCAAG 54,0 596 TCACACAGAGAAAGTTTAGG Exón 2 GTGAAATCCCAAGGTGCCTA 54,0 345 GCCATGAGGGCTGTTTCTAA Exón 3 CCCCAATACCTGGTGAAGTAA 54,0 407 TTTCCAGTATTGTGACAGGGTATTT Exón 4 GGAAGCTGAGACAGAAGAGT 54,0 494 AGACACAAGGATGACTTTCC Exón 5 GTAAACTCAAGAGAAGGCTACA 54,0 430 AAAGTTACCTAGATGACCCATA Exón 6 AGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAG 54,0 349 GGGAAGCAACTGCGATGGTATAAGA Exón 7 CCAAACTAACAGGGCCACTT 57,5 434 ATGAGCCACCTAGCCTTGAG Ta=Temperatura de anillamiento o hibridación; UTR=Región no traducida (“Untraslated region”). 57 MATERIALES Y METODOLOGÍA Tabla 4.4. Cebadores específicos para la amplificación de las regiones no codificantes del gen GLA. CEBADOR 5’ - SECUENCIA - 3’ Ta (ºC) AMPLICÓN (pb) Promotor AACCCGTCCCATTTAATTCC 59,0 862 CTCGCTATAGCCGTTTGAGG Intrón 1 frag. A CCCTTTGCTTTTCCATGTGT 59,0 825 TTGCTCTGTAAGCGCAGTTG Intrón 1 frag. B GGAAGGTTGACATGGAGGAA 59,0 809 TTGCCATTAGCCAAACATGA Intrón 1 frag. C CCAGAAATAATCATGGTTTAAATGTT 59,0 960 GTATTATCTTCAGGTAGGAAAGGACTT Intrón 1 frag. D AATACAGTGGTTCTTCCTATGTGTTGG 59,0 845 GGTTTTGCATTTTGGCTAGGCTA Intrón 1 frag. E TTTGTAATGTTGTGCCAAGTTCC 54,0 871 ACCTCCCATTTATTAGGCACCTT Intrón 2 frag. A TACAGAAGCTTGTTTAGAAACAGC 59,0 870 AAGGTTATATGGAAATACATGCAC Intrón 2 frag. B ATGTTTTGTAATAGCTCTTGAGGC 59,0 634 AATCTGCTCATTGGCTATAAATCT Intrón 2 frag. C CTTGTAATCCGCCCACCTT 59,0 767 CCCTAGCTTCAGTCCTTTGCT Intrón 3 CCAGAGATTTAGCCACAAAGG 59,0 822 GAATTTCCAGCTGGGGCTAT Intrón 4 frag. A CCCAGGTTCCAACCACTTCTC 59,0 826 CCCTGCCCTCATGAAACTTA Intrón 4 frag. B AGCCCTCTGTCCATTCATTCT 59,0 916 TAATTGGGCTGTGAAAACAGA Exón 5 + Intrón 5 AAGGCTACAAGTGCCTCCTTT 57,5 521 GGGCCATCTGAGTTACTTGC Exón 6 + Intrón 6 CTCCTTGTTCAAGACCCTGCGGTAG 57,5 785 GGGAAGCAACTGCGATGGTATAAGA 4.13.1 Amplificación mediante PCR de las regiones codificantes del gen GLA Las amplificaciones mediante PCR se llevaron a cabo en microtubos de 0,2 mL (4titude® Ltd, UK) incorporando en este el DNA aislado (ver apartado 4.8) y todos los reactivos necesarios: enzima 58 MATERIALES Y METODOLOGÍA polimerasa del DNA termoestable “Taq”, tampón de reacción de la misma, cloruro de magnesio (Mg2Cl), deoxi-nucleótidos-tri-fosfato (dNTPs), cebadores específicos (tabla 4.3) y ddH2O. Las proporciones de cada uno de los reactivos empleados para la reacción de PCR, fueron diferente bien si el DNA de partida se aisló a partir de DBS (ver 4.8.1, tabla 4.5) bien si fue aislado de sangre EDTA líquida (ver 4.8.2, tabla 4.6). Tabla 4.5. Estequeometría para la amplificación de las regiones codificantes del gen GLA a partir de DNA de DBS. REACTIVO CANTIDAD (µL) CONCENTRACIÓN FINAL ddH 2 O libre DNAasa/RNAasa 11,45 Tampón 10x, Bioline® 2,00 1x dNTPs (2mM), Invitrogen® 2,00 200,000 µM Mg 2 Cl (50mM), Bioline® 0,60 1,500 mM Cebador Directo (10 µM) 0,40 200,000 nM Cebador Reverso (10 µM) 0,40 200,000 nM BIOTAQ™ DNA polimerasa 5 UI/µL, Bioline® 0,15 0,038 UI/µL DNA genómico de DBS 3,00 Volumen final de reacción=20 µL/amplicón Tabla 4.6. Estequeometría para la amplificación de las regiones codificantes del gen GLA a partir de DNA de sangre EDTA líquida. REACTIVO CANTIDAD (µL) CONCENTRACIÓN FINAL ddH 2 O libre DNAasa/RNAasa 6,20 Tampón 10x, Bioline® 1,00 1x dNTPs (2mM), Invitrogen® 1,00 200,00 µM Mg 2 Cl (50mM), Bioline® 0,30 1,50 mM Cebador Directo (10 µM) 0,20 200,00 nM Cebador Reverso (10 µM) 0,20 200,00 nM BIOTAQ™ DNA polimerasa 5 UI/µL, Bioline® 0,10 0,05 UI/µL DNA genómico de sangre EDTA líquida (50 ng/µL) 1,00 5,00 ng/µL Volumen final de reacción=10 µL/amplicón La reacción se llevó a cabo en un termociclador GeneAmp® PCR System 9700 según el programa térmico indicado en la tabla 4.7. El producto de la reacción (amplicón) se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% (m/v) con tinción de Br-Et utilizando como tampón TAE 1X (30 minutos 90V). El resultado se documentó con el equipo descrito en el apartado 4.9. Los amplicones se conservaron bien a +4 ºC para períodos de conservación menores a 3 días bien a -20ºC para períodos de conservación superiores. 59 MATERIALES Y METODOLOGÍA Tabla 4.7. Programas térmicos empleados para la amplificación de las regiones codificantes del gen GLA. PROGRAMA REGIONES PROGRAMA TÉRMICO GLA CDS 1 Resto Desnaturalización inicial: 94ºC 2’ Ciclo: 45 x (94ºC 30’’ 54,0ºC 30’’ 72ºC 30’’) Elongación final: 72 ºC 7’ Conservación: 4ªC ∞ GLA CDS 2 Exón 7 Desnaturalización inicial: 94ºC 2’ Ciclo: 40 x (94ºC 30’’ 57,5ºC 30’’ 72ºC 30’’) Elongación final: 72 ºC 7’ Conservación: 4ªC ∞ Nota: se emplearon los mismos programas térmicos indistintamente del origen del DNA aislado. 4.13.2 Amplificación mediante PCR de las regiones no codificantes del gen GLA La amplificación de las regiones no codificantes del gen GLA se realizó exclusivamente a partir de muestras de DNA aislado de sangre EDTA líquida (apartado 4.8.2) de manera idéntica a lo descrito en el apartado 4.13.1, utilizándose los cebadores indicados en la tabla 4.4. Hubo modificaciones en cuanto a la estequeometría de la reacción (tabla 4.8) y el programa térmico (tabla 4.9). Tabla 4.8. Estequeometría para la amplificación de las regiones no codificantes del gen GLA. REACTIVO CANTIDAD (µL) CONCENTRACIÓN FINAL ddH 2 O libre DNAasa/RNAasa 5,80 Tampón 10x, Bioline® 1,00 1x dNTPs (2mM), Invitrogen® 1,00 200,00 µM Mg 2 Cl (50mM), Bioline® 0,30 1,50 mM Cebador Directo (10 µM) 0,40 400,00 nM Cebador Reverso (10 µM) 0,40 400,00 nM BIOTAQ™ DNA polimerasa 5 UI/µL, Bioline® 0,10 0,05 UI DNA genómico de sangre EDTA líquida (50 ng/µL) 1,00 5,00 ng/µL Volumen final de reacción=10 µL/amplicón 66 MATERIALES Y METODOLOGÍA la señal en el gel de cada una de las condiciones de competitividad y se calculó la variación en la afinidad representando la recta que relaciona los valores inversos de las intensidades de cada condición vs el exceso de “sonda fría”. La relación de la pendiente de la recta y la afinidad relativa de cada alelo por el extracto nuclear es inversamente proporcional. 4.17 Análisis de variantes en región no codificante (intrones) Para comprobar que ciertas variantes en región no codificante (intrones) identificadas en el análisis molecular del gen GLA (apartado 4.13), pudieran alterar el normal mecanismo normal de ayuste del pre-RNA mensajero (mRNA), se estudió la molécula complementaria (cDNA) del mRNA del gen GLA. 4.17.1 Síntesis de cDNA total Para la síntesis de cDNA mediante retrotranscripción del mRNA a partir del RNA total aislado en el apartado 4.9, se tomó 1 μg de RNA total en un volumen final de 20 μL. Se utilizó la batería de reactivos PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara Bio INC.), siguiendo las instrucciones del fabricante. E n un primer paso se llevó a cabo la hibridación de OligodT a las colas de poli-Adenilación del extremo 3’ de todas las moléculas mRNA presente en el RNA total aislado; para este paso se adicionó a 1 μg de RNA total, una mezcla de reacción que contiene por cada muestra: 1 μL de cebador OligodT 50 μM, 1 μL de la mezcla de dNTPs (10 mM de cada dNTP) y cantidad suficiente de ddH2O para volumen final de 10 μL. Se incubó en un termociclador GeneAmp® PCR System 9700 a 65ºC durante 10 minutos y después se mantuvo a +4ºC. En un segundo lugar se llevó a cabo una reacción de PCR de retrotranscripción (RT-PCR), en la que por cada molécula de mRNA que haya hibridado la cola OligodT, se generará una molécula de cDNA (relación 1:1). Al producto de hibridación OligodT-mRNA se le añadió una mezcla de RT-PCR que contenía por cada muestra: 5 μL de tampón PrimeScript 5x, 0,5 μL de inhibidor de RNAasas (40 UI/μL), 1 μL de PrimeScript retrotranscriptasa (200UI/μL) y cantidad suficiente de ddH2O para 10 μL de volumen final de reacción. Se incubó en un termociclador GeneAmp® PCR System 9700 a 42 ºC 60minutos, seguido de 95ºC 5 minutos y después se mantuvo a 4ºC. El producto de RT-PCR se conservó, bien a +4 ºC para períodos de conservación menores a 3 días bien a -20ºC para períodos de conservación superiores. La comprobación de la correcta síntesis de cDNA se realizó mediante amplificación de un fragmento del gen constitutivo β-Actina (ACTB, MIM*102630), utilizando como molde la molécula de cDNA sintetizada a partir del mRNA total. 67 MATERIALES Y METODOLOGÍA Para el diseño de los cebadores, tomamos como referencia la secuencia del transcrito de mRNA maduro del gen ACBT (NM_001101.5, NCBI) y se empleó el programa Oligo v.7 (tabla 4.12). Tabla 4.12. Cebadores específicos para la amplificación de una región del cDNA complementario al mRNA del gen ACTB. CEBADOR 5’ - SECUENCIA - 3’ Ta (ºC) AMPLICÓN (pb) Exón 4 – Exón 6 ACACTGTGCCCATCTACGAGG 60,0 621 AGTATGACGAGTCCGGCCCCT La reacción de PCR se llevó a cabo en microtubos de 0,2 mL y las proporciones de cada uno de los reactivos empleados para la reacción se muestran en la tabla 4.13. Tabla 4.13.Estequeometría para la amplificación de una región del cDNA complementario al mRNA del gen ACTB. REACTIVO CANTIDAD (µL) CONCENTRACIÓN FINAL ddH 2 O libre DNAasa/RNAasa 6,24 Tampón 10x, Bioline® 1,00 1x dNTPs (2mM), Invitrogen® 1,00 200,00 µM Mg 2 Cl (50mM), Bioline® 0,30 1,50 mM Cebador Directo (10 µM) 0,20 200,00 nM Cebador Reverso (10 µM) 0,20 200,00 nM BIOTAQ™ DNA polimerasa 5 UI/µL, Bioline® 0,06 0,03 UI/µL cDNA molde 1,00 Volumen final de reacción=10 µL La reacción se llevó a cabo en un termociclador GeneAmp® PCR System 9700 según el programa térmico indicado en la tabla 4.14. El producto de la amplificación se conservó a +4ºC hasta que se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% (m/v) con tinción de Br-Et utilizando como tampón TAE 1X (30 minutos 90V). El resultado se documentó con el equipo descrito en el apartado 4.9. 68 MATERIALES Y METODOLOGÍA Tabla 4.14. Programa térmico empleado para la amplificación de una región del cDNA complementario al mRNA del gen ACTB. PROGRAMA REGIÓN PROGRAMA TÉRMICO ACTB cDNA Exón 4 – Exón 6 Desnaturalización inicial: 94ºC 2’ Ciclo: 32 x (94ºC 30’’ 60,0ºC 30’’ 72ºC 30’’) Elongación final: 72 ºC 7’ Conservación: 4ªC ∞ 4.17.2 Amplificación del cDNA del gen GLA Para poder estudiar el efecto de las variantes intrónicas sobre el hipotético ayuste alternativo, fue necesario obtener una cantidad razonable de cDNA específico de gen GLA, para ello se realizó una amplificación del cDNA de éste como fase preparativa para usos posteriores. Los cebadores fueron diseñados de tal manera que abarcase la mayor extensión posible de la molécula de mRNA (1418 pb). Se utilizó como referencia la secuencia del transcrito de mRNA maduro del gen GLA (NM_000169.2, NCBI) y se empleó el programa Oligo v.7 (tabla 4.15). Tabla 4.15. Cebadores específicos para la amplificación del cDNA complementario al mRNA del gen GLA. CEBADOR 5’ - SECUENCIA - 3’ Ta (ºC) AMPLICÓN (pb) Exón 1 – Exón 7 TGCAGCTGAGGAACCCAGAACTACA 59,0 1.114 TACCATCGCAGTTGCTTCCCT La reacción de PCR se llevó a cabo en microtubos de 0,2 mL y las proporciones de cada uno de los reactivos empleados para la reacción se muestran en la tabla 4.16. 69 MATERIALES Y METODOLOGÍA Tabla 4.16. Estequeometría para la amplificación del cDNA complementario al mRNA del gen GLA. REACTIVO CANTIDAD (µL) CONCENTRACIÓN FINAL ddH 2 O libre DNAasa/RNAasa 34,65 Tampón 10x, Bioline® 5,00 1x dNTPs (2mM), Invitrogen® 5,00 200,000 µM Mg 2 Cl (50mM), Bioline® 1,50 1,500 mM Cebador Directo (10 µM) 1,00 200,000 nM Cebador Reverso (10 µM) 1,00 200,000 nM BIOTAQ™ DNA polimerasa 5 UI/µL, Bioline® 0,85 0,085 UI/µL cDNA molde 1,00 Volumen final de reacción=50 µL La reacción se llevó a cabo en un termociclador GeneAmp® PCR System 9700 según el programa térmico indicado en la tabla 4.17. El amplicón resultante se conservó a +4ºC hasta que se caracterizó mediante geles PAGE no desnaturalizantes; el excedente del amplicón utilizado en esta técnica se conservó a -20ºC para usos posteriores. Tabla 4.17. Programa térmico empleado para la amplificación del cDNA complementario al mRNA del gen GLA. PROGRAMA REGIÓN PROGRAMA TÉRMICO GLA cDNA Exón 1 – Exón 7 Desnaturalización inicial: 94ºC 2’ Ciclo: 32 x (94ºC 30’’ 59,0ºC 30’’ 72ºC 30’’) Elongación final: 72 ºC 7’ Conservación: 4ªC ∞ 4.17.3 Caracterización electroforética del cDNA específico del gen GLA Una vez obtuvimos una cantidad suficiente de cDNA específico del mRNA del gen GLA (apartado 4.17.2), para identificar los posibles transcritos generados de diversos tamaños como resultado del ayuste del pre-mRNA se eligió la técnica de PAGE no desnaturalizante. Para preparar los geles de 55 mL de volumen al 6,0% se añadieron los siguientes reactivos, sin dejar de homogeneizarse y en campana extractora: 34,5 mL de dH2O, 14,6 mL de una mezcla de acrilamida/bisacrilamida 30,0% en proporción 37,5:1,0 (Bio-Rad), 5,5 mL de TBE 10x (Tris-Borato 0,89 M + EDTA 0,50 M pH=8,0) (Carlo Erba), 0,3 mL de persulfato amónico (APS) 10,0% (m/v) (Bio-Rad) disuelto en dH2O y 0,03 mL de N,N,N,N’-tetrametilendiamina (TEMED) 0,1 % (v/v) (BioRad) diluido en dH2O. Una vez polimerizado el gel se sumergió en una célula de electroforesis 70 MATERIALES Y METODOLOGÍA vertical Protean® II xi Cell (Bio-Rad) con TBE 1x como tampón de electroforesis. Se cargó en cada uno de los pocillos una mezcla de 15 µL del producto de cDNA específico de gen GLA (apartado 4.17.2) y 5 µL de tampón de carga (Xylene Cyanol) y se sometió al proceso de electroforesis (3 horas a 46 mA). Finalizado el proceso de electroforesis se sumergió el gel en una mezcla de 500 mL de tampón TBE 1x diluido en dH2O + 1 mL de solución de Br-Et y se dejó teñir durante 20 minutos con agitación por balanceo. El resultado se documentó con el equipo descrito en el apartado 4.9 y se comparó el patrón de bandas de los sujetos con variantes intrónicas vs el patrón de bandas de individuos control. 4.17.4 Análisis molecular del cDNA del gen GLA. Secuenciación capilar. Para tratar de definir la variación en la secuencia nucleotídica del mRNA del gen GLA, como consecuencia de un hipotético ayuste alternativo del pre-mRNA, procedimos a secuenciar el cDNA específico del gen GLA obtenido en el apartado 4.17.2. Se optó por un diseño de PCR anidada del cDNA del gen GLA, dividiendo este en dos fragmentos solapantes. Los cebadores fueron diseñados utilizando como referencia la secuencia del transcrito de mRNA maduro del gen GLA (NM_000169.2, NCBI) con el programa Oligo v.7 (tabla 4.18). Tabla 4.18. Cebadores específicos para la amplificación anidada del cDNA complementario al mRNA del gen GLA. CEBADOR 5’ - SECUENCIA - 3’ Ta (ºC) AMPLICÓN (pb) Exón 1 – Exón 4 TGCAGCTGAGGAACCCAGAACTACA 55,0 616 GTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCT Exón 3 – Exón 7 GAAGCTAGGGATTTATGCAGATGT 55,0 637 TACCATCGCAGTTGCTTCCCT La reacción de PCR se llevó a cabo en microtubos de 0,2 mL y las proporciones de cada uno de los reactivos empleados para la reacción se muestran en la tabla 4.19. 71 MATERIALES Y METODOLOGÍA Tabla 4.19. Estequeometría para la amplificación anidada del cDNA complementario al mRNA del gen GLA. REACTIVO CANTIDAD (µL) CONCENTRACIÓN FINAL ddH 2 O libre DNAasa/RNAasa 5,94 Tampón 10x, Bioline® 1,00 1x dNTPs (2mM), Invitrogen® 1,00 200,00 µM Mg 2 Cl (50mM), Bioline® 0,60 3,00 mM Cebador Directo (10 µM) 0,20 200,00 nM Cebador Reverso (10 µM) 0,20 200,00 nM BIOTAQ™ DNA polimerasa 5 UI/µL, Bioline® 0,06 0,03 UI/µL cDNA molde diluido 1/1.000 con ddH 2 O 1,00 Volumen final de reacción=10 µL La reacción se llevó a cabo en un termociclador GeneAmp® PCR System 9700 según el programa térmico indicado en la tabla 4.20. El amplicón resultante se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa (apartado 4.13.1) y el restante se conservó a +4ºC hasta que se procedió con la purificación y secuenciación capilar según los protocolos descritos en los apartados 4.13.3 y 4.13.4. Tabla 4.20. Programa térmico empleado para la amplificación anidada del cDNA complementario al mRNA del gen GLA. PROGRAMA REGIÓN PROGRAMA TÉRMICO GLA cDNA Anidado Exón 1 – Exón 7 Desnaturalización inicial: 94ºC 2’ Ciclo: 32 x (94ºC 30’’ 55,0ºC 30’’ 72ºC 30’’) Elongación final: 72 ºC 7’ Conservación: 4ªC ∞ 4.18 Genotipado poblacional de las variantes en región reguladora y región no codificante. Para conocer la frecuencia en población control, de los alelos identificados en las zonas no codificantes del gen GLA (ver 4.13), se optó por la técnica de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción o “RFLP”. En primer lugar, se analizaron in silico los amplicones que contenían las variantes diferentes del alelo salvaje, con la herramienta RestrictionMapper v.3 (ver enlaces) para evidenciar diferencias en cuanto a patrones de restricción entre la secuencia que contenía el alelo salvaje vs alelo 72 MATERIALES Y METODOLOGÍA mutado. Posteriormente se procedió a amplificar las regiones de interés mediante PCR (ver 4.13.1 y 4.13.2), corte según el protocolo de cada enzima de restricción y revelado del patrón de restricción mediante electroforesis. Esto último se realizó utilizando gel de agarosa al 1/2/3% (m/v) o gel de agarosa de alta resolución NuSieve™GTG™ (Lonza) al 3% (m/v), dependiendo de la diferencia de tamaño entre los fragmentos generados, con tinción de Br-Et utilizando como tampón TAE 1X (30/60/90 minutos 90V). El resultado se documentó con el equipo descrito en el apartado 4.9. 4.19 Estudios cuantitativos de la expresión del gen GLA Para determinar el nivel de expresión del gen GLA, utilizamos procedimientos de amplificación específica por PCR y cuantificación en tiempo real mediante detección de fluorescencia (qPCR). La diferente química empleada en el diseño de las sondas se muestra en la figura 4.8. Para nuestros experimentos se decidió emplear sondas de hidrólisis (figura 4.8.A), éstas son complementarias al cDNA, aportando especificidad a la reacción y la cuantificación del molde se realiza combinando la actividad exonucleasa 5’->3’ de la DNAp termoestable y del principio de transferencia de energía de resonancia (“Förster resonance energy transfer”, FRET). Se emplearon mezclas comerciales de cebadores y sondas de hidrólisis o TaqMan® (Applied Biosystems®, ThermoFisher Scientific) marcadas con diferentes fluorocromos para poder preformar reacciones múltiples en el mismo pocillo (tabla 4.21) Tabla 4.21. Premezcla de sondas de hidrólisis y cebadores (TaqMan®) empleadas para el estudio de expresión del gen GLA y del gen de control endógeno GAPDH. GEN (NCBI)1 UNIÓN cDNA FLUORÓFORO/SUPRESOR2 REFERENCIA3 Ta (ºC) AMPLICÓN (pb) GLA (NM_000169.2) Ex 2 – Ex 3 FAM™ / MGB Hs00609238_m1 60,0 80 GAPDH (NM_002046.3) Ex 3 VIC® / MGB Hs99999905_m1 60,0 122 1Secuencia de referencia recogida en NCBI (ver enlaces). 2 Premezcla de cebadores y sondas según Applied Biosystems® (ver enlaces). 73 MATERIALES Y METODOLOGÍA Figura 4.8. Representación esquemática de las diferentes aproximaciones químicas empleadas en el estudio cuantitativo de la expresión génica mediante qPCR. (A) Sondas de hidrólisis o sondas TaqMan™; compuesta por una secuencia de DNA complementaria a la región diana, una molécula fluorescente (F) en 5’ y una molécula supresora o “quencher” (S) en 3’; en la fase de síntesis catalizada por la DNAp, se produce hidrólisis de la sonda, liberación de F y FRET. (B) Sondas de hidrólisis con doble molécula supresora o sondas ZEN™; presenta una composición similar a (A) en el que se incluye una molécula supresora extra (S2) situada a 9-10 pb de F en 5’; presenta como ventaja respecto a (A) la reducción del ruido de fondo en las etapas iniciales de la reacción. (C) Balizas moleculares o Molecular Beacons™; compuesta por una secuencia de DNA complementaria a la región diana, una molécula fluorescente (F) en 5’ y una supresora (S) en 3’; la sonda antes de la hibridación permanece en forma de horquilla lo que hace que F y S se sitúen próximos en el espacio; en el momento de la hibridación con el DNA complementario de la región diana, la sonda se linealiza haciendo que F y S se distancien lo suficiente como para producirse fluorescencia. (D) Sondas Eclipse; presenta en el extremo 3’ de la sonda una molécula fluorescente (F) y en el extremo 5’ de la misma una molécula supresora (S) y una molécula de unión al surco menor del DNA (“Minor Groove Binder”, MGB); la sonda antes de la hibridación permanece empaquetada en forma de bovina permitiendo que F y S estén próximos espacialmente; el mecanismo de hibridación con el DNA complementario a la región diana y generación de fluorescencia, es muy similar al descrito en (C) pero se encuentra asistido por la interacción no covalente de las bases nitrogenadas del surco menor del DNA con la molécula MGB. (E) Sondas de hibridación dual; compuesta por dos secuencias de DNA complementarias a la región diana y adyacentes entre sí, además de una molécula fluorescente diferente en cada sonda (F1 en 5’ de sonda 1 y F2 en 3’ de sonda 2); a diferencia de las sondas basadas en hidrólisis, la hibridación adyacente de ambas sondas permite que uno de los fluoróforos emita energía al propiciarse el fenómeno FRET por la proximidad espacial de ambos fluoróforos. (F) Sondas escorpión o Scorpions®; presentan una composición muy similar a (C) uniéndosele a S de manera covalente un cebador (Ce) de PCR; Ce hibrida con el DNA complementario de la región diana y comienza la síntesis de la cadena complementaria, una vez esto ocurre la horquilla se linealiza durante la fase de desnaturalización posterior, propiciando la hibridación de ésta con el DNA complementario sintetizado; esta situación favorece el fenómeno FRET al aumentar la distancia espacial entre S y F. (G) Cebador de PCR fluorogénico después de la extensión o Cebadores de PCR LUX®; presenta una composición similar a (F) salvo que carece de molécula supresora ya que el efecto de ésta es suplido por la interacción de F con la estructura secundaria en forma de horquilla del DNA complementario de la sonda; una vez que Ce hibrida con el DNA complementario de la región diana y comienza la síntesis del DNA complementario, F es capaz de generar fluorescencia debido al cambio conformacional de la molécula de DNA. (H) Cebador de PCR Qzyme™; el diseño de este tipo de sondas es más complejo ya que por una parte se compone una secuencia antisentido para un DNA con acción catalítica o deoxiribozima y por otra parte de una sonda de hidrólisis similar a la descrita en (A) que funciona como sustrato del deoxiribozima; el deoxiribozima inactivo hibrida parcialmente con la secuencia de DNA complementaria a la región diana y mediante una reacción de PCR se genera el deoxiribozima sentido activo; a continuación se le suministra el sustrato específico que no es ni más ni menos que la sonda de hidrólisis que contiene F y S; mediante la acción deoxiribozima sobre la sonda, se libera F y se produce FRET. 74 MATERIALES Y METODOLOGÍA Las reacciones de qPCR se llevaron a cabo utilizando plásticos ópticamente compatibles: placas de 96 pocillos de fondo cónico y volumen de 0,2 mL, selladas con láminas de plástico (Applied Biosystems®); de cada reacción se realizaron réplicas técnicas (triplicados). En cada pocillo se incorporó el cDNA sintetizado (ver apartado 4.17.1) y todos los reactivos necesarios: la mezcla maestra, la mezcla de cebadores y sondas específicas (tabla 4.20) y ddH2O. Las proporciones de cada uno de los reactivos empleados para la reacción de qPCR se recogen tabla 4.22. Tabla 4.22. Estequeometría para el estudio de expresión del gen GLA y el gen de control endógeno GAPDH. REACTIVO CANTIDAD (µL) CONCENTRACIÓN FINAL Mezcla maestra 2x, Applied Biosystems® 10,0 1x ddH 2 O libre DNAasa/RNAasa 6,0 Premezcla cebadores+sondas GLA-FAM 20x Applied Biosystems® 1,0 1x Premezcla cebadores+sondas GAPDH-VIC 20x Applied Biosystems® 1,0 1x cDNA molde 10 ng/µL 2,00 1 ng/µL Volumen final de reacción=20 µL La reacción se llevó a cabo en un equipo de PCR a tiempo real StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems®) según el programa térmico indicado en la tabla 4.23. Los datos de ciclo umbral (Ct, ciclo de PCR en el que la fluorescencia recogida es estadísticamente significativa respecto a la línea base o ruido de fondo) y desviación estándar (DE) de las réplicas técnicas, fueron recogidos mediante el programa StepOnePlus™ Software v2.3 (Applied Biosystems®). Tabla 4.23. Programa térmico empleado para el estudio de expresión del gen GLA y el gen de control endógeno GAPDH. PROGRAMA PROGRAMA TÉRMICO GLA/GAPDH qPCR Desnaturalización inicial: 95ºC 10’ Ciclo: 40 x (96ºC 15’’ 60,0ºC 1’ ) Conservación: 4ªC ∞ = Adquisición de fluorescencia. 4.19.1 Determinación de la eficiencia cinética de la reacción de qPCR De acuerdo con las recomendaciones propuestas 204, se determinó la eficiencia cinética de la reacción múltiple de expresión del gen diana (GLA) y del gen de control endógeno, realizando para cada gen una curva de calibrado independiente. Para ello, se partió de una mezcla de cDNA de diferentes individuos sanos (proporción de varones y mujeres 1:1) a 50 ng/µL (cantidad final en la reacción=100 ng) y se realizaron diluciones seriadas 1/10 hasta obtener un rango dinámico 75 MATERIALES Y METODOLOGÍA 100-0,01 ng de cDNA. Se preformó la reacción de cada punto de la curva por triplicado siguiendo las condiciones descritas en las tablas 4.21 y 4.22. Se representó el log10 de la cantidad de cDNA molde en cada dilución vs Ct medio obtenido de las réplicas técnicas de dicha dilución; se realizó un ajuste de los puntos a una línea recta y se obtuvo la ecuación de la misma, así como el coeficiente de determinación (R2). La eficiencia de la reacción se determinó de acuerdo a la ecuación 4.2. Ecuación 4.2. Cálculo de la eficiencia cinética de la reacción de qPCR. E=10-1/pendiente recta E=Eficiencia cinética de la reacción de qPCR. Se aceptó como criterio de idoneidad cuando la recta obtenida fue lineal (R2>0,980), la variabilidad de las réplicas era baja (DE<1,60) y el resultado de la ecuación 4.2 se encontraba en el rango (1,6-2,1). Se calculó la eficiencia cinética para cada gen dentro de la reacción múltiple y posteriormente, analizamos que las eficiencias de ambos genes fueran similares y no presentasen grandes discordancias; para ello se representó el log10 de la cantidad de cDNA molde en cada dilución vs (Ct GLA - Ct Gen Control endógeno). Se aceptó como criterio de idoneidad cuando la pendiente de la recta obtenida fue menor que 0,1. 4.19.2 Normalización de los datos de expresión génica determinados mediante qPCR Para controlar la variabilidad tanto analítica como preanalítica, seguimos las recomendaciones propuestas 204 y los datos de expresión del gen GLA se normalizaron respecto a la expresión de un gen de control endógeno o constitucional que se consideró estable en sangre periférica; en este caso se eligió el gen codificante para la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; MIM*138400). La normalización se realizó según lo indicado en la ecuación 4.3. 81 RESULTADOS 5 Resultados 5.1 Descripción de la muestra de estudio El reclutamiento de los pacientes, según los criterios indicados en la tabla 4.1, comenzó entre julio de 2011 y febrero de 2012 (según centros) y finalizó en mayo del mismo año. Se reclutaron un total de 367 pacientes con MHVI de origen desconocido, constituyendo la muestra (tabla 5.1). Tabla 5.1. Características demográficas y de exploración ecocardiográfica de la población de estudio VARIABLE RESULTADO EN LA MUESTRA Edad (años) n(n perdidos) 367(0) Mediana(P25-P75) 63,0(50,0-73,0) Edad Mujeres n(%) 118(32,2) Mediana(P25-P75) 68,0(57,0-76,0) Edad Varones n(%) 249(67,8) Mediana(P25-P75) 61,0(48,0-70,0) IMC (kg m-2) n(n perdidos) 364(3) Mediana(P25-P75) 27,4(24,8-30,8) Creatinina sangre (mg/dL) n(n perdidos) 359(8) Mediana(P25-p75) 0,9(0,8-1,1) EVI (mm) n(n perdidos) 366(1) Mediana(P25-p75) 18,0(16,0-22,0) Geometría HVI n(n perdidos) 236(101) Septal n(%) 58(24,6) Concéntrica n(%) 135(57,2) Apical n(%) 43(18,2) EVI=Espesor del septo ventricular y/o pared ventricular izquierda posterior; IMC=Índice de masa corporal; HVI=Hipertrofia de ventrículo izquierdo; P25-P75=Percentil 25-Percentil 75. Este grupo estuvo compuesto por 249 varones (67,8%) y 118 mujeres (32,2%), siendo los primeros más jóvenes que los segundos (p<0,001). No se encontraron más diferencias significativas al estratificar por género en dicho grupo de pacientes. Se observó que los 82 RESULTADOS pacientes, independientemente de su género, presentaban sobrepeso, un EVI de 18,0(16,022,0) mm y que el patrón geométrico más frecuente en la HVI fue el concéntrico (57,2%). Analizando las características de las submuestras estratificadas por centro reclutador (tabla 5.2), observamos que no hay diferencias significativas entre los diferentes centros al valorar edad, IMC y EVI entre los centros. Tabla 5.2. Características demográficas y de exploración ecocardiográfica de la población de estudio, estratificada por centro reclutador. CENTRO MUJERES* VARONES* TOTAL* H. G.U. de Alicante Edad (años) 68,0(62,0-79,2) ‡ 61,0(44,8-71,4) 63,5(45,8-71,4) IMC (kg m-2) 28,5(25,8-36,4) 27,6(25,6-31,2) 27,9(26,1-31,2) EVI (mm) 18,0(17,0-19,0) 19,0(25,0-22,4) 18,0(15,8-20,8) n 22 54 76 H. U. Puerta de Hierro Edad (años) 57,5(43,8-74,3) 56,5(45,0-68,2) 56,0(42,5-67,0) IMC (Kg/m2) 25,0(23,2-30,5) 27,1(25,3-29,4) # 27,5(24,4-30,1) EVI (mm) 20,0(15,8-23,0) 21,4(18,8-27,0) 20,0(16,8-26,0) n 26 45 71 H. C. U. de Santiago de Compostela Edad (años) 57 65 - IMC (Kg/m2) ND 24,5 - EVI (mm) ND 17,0 - n 1 1 2 Universidad de Murcia Edad (años) 66,5(60,0-76,8) ‡ 63,5(51,8-74,0) 67,0(58,5-74,8) IMC (Kg/m2) 29,4(24,9-32,4) 27,2(25,1-30,0) 27,4(24,2-31,2) EVI (mm) 18,0(16,0-24,0) 19,5(16,0-23,4) 18,0(16,0-22,0) n 31 60 91 H. U. Virgen de la Arrixaca Edad (años) 68,0(55,0-73,2) 55,0(45,0-68,3) 62,0(49,5-70,4) 83 RESULTADOS IMC (Kg/m2) 26,6(24,2-29,0) 27,4(24,8-31,7) 27,9(25,3-31,6) EVI (mm) 18,0(15,0-20,0) 16,0(15,0-22,6) 18,5(15,0-21,0) n 11 25 36 H. Son Llàtzer Edad (años) 67,0(63,0-74,6)‡ 62,0(47,5-69,6) 62,5(47,8-73,0) IMC (Kg/m2) 26,0(23,2-30,9) 28,4(26,0-30,9) 28,3(24,5-31,1) EVI (mm) 19,0(16,8-22,0) 19,0(17,0-21,0) 20,0(16,0-22,0) n 15 27 42 H. U. G. de Elche Edad (años) 69,5(59,3-78,3) 67,0(38,0-71,8) 67,0(52,3-72,7) IMC (Kg/m2) 29,2(27,2-31,7) 25,6(24,5-31,2) 27,7(24,5-31,0) EVI (mm) 18,0(15,8-20,0) 20,0(16,8-24,0) 19,0(16,3-20,0) n 6 14 20 H. U. de Donostia Edad (años) 76,0(72,0-83,2) 67,0(50,0-78,0) 74,0(50,0-80,0) IMC (Kg/m2) 25,4(23,8-29,3) 26,2(24,2-29,0) 25,9(24,0-29,1) EVI (mm) 16,5(15,0-19,4) 17,0(15,0-19,1) 16,5(15,0-19,4) n 12 24 36 *Edad, IMC y EVI expresados como mediana(Percentil 25-Percentil75) p grado de significación estadística para la prueba de U de Mann-Whitney. ‡p<0,05 #p<0,01‡ 5.2 Actividad de α-Gal A en DBS y estudio molecular del gen GLA Se analizó la actividad α-Gal A en DBS en todos los individuos de la muestra independientemente de su género según el protocolo descrito en el apartado 4.12.1, y resultó que la actividad mediana en la muestra fue de 5,90(4,35-7,92) µmol/spot/h. Cuando se estratificó por género, los varones presentaron una activad enzimática significativamente menor (p=0,014) que las mujeres [5,51(4,12-8,51) vs 7,28(4,83-8,70). El resultado global de la segunda fase del estudio, o fase de pacientes, se muestra en la figura 5.1. 84 RESULTADOS Figura 5.1. Esquema de las fases y resultados del estudio. De acuerdo con el diseño del estudio (figura 4.1), los varones cuya actividad de α-Gal A en DBS fue ≤70% se les secuenció las regiones 5’-UTR y codificantes del gen GLA; en el caso de las mujeres, independientemente de su actividad enzimática, fueron sometidas a la misma estrategia de secuenciación (Grupo de secuenciación). Se amplificó la región 5’-UTR y los exones del gen GLA de acuerdo al diseño y el protocolo del apartado 4.13.1. Una vez se obtuvieron los amplicones de las regiones anteriores, se llevó a cabo el proceso de secuenciación del gen según el procedimiento indicado en los apartados 4.13.3 y 4.13.4. El resultado de este proceso fue que en 118 mujeres (32,2%) y 67 varones (18,2%) se secuenciaron las regiones indicadas, obteniéndose los resultados indicados en la tabla 5.4. No se identificó ninguna variante patogénica o probablemente patogénica para la EF en el grupo de secuenciación. Se identificaron variantes genéticas diferentes de sus alelos silvestres en 60 pacientes, incluso algunas de las variantes cosegregaban en el mismo paciente. Ciertas variantes en región no codificante (5’-UTR e intrones) tienden a segregar en forma haplotípica, denominándose haplotipos complejos intrónicos (HCI) (tabla 5.3). 85 RESULTADOS Tabla 5.3. Variantes genéticas en el gen GLA identificadas en el Grupo de secuenciación NM_000169.21 SNP2 GRch38.p123 SILVESTRE/MUTADO n c.-125T>G rs185255090 101408028 A/C 1 c.-34C>T NUEVO 101407947 G/A 1 c.-30G>A rs3027584 100662921 C/T 4 c.192C>T NUEVO 101407712 G/A 1 c.194+17A>G rs2071226 101407693 T/C 1 c.640-25A>G NUEVO 101398972 T/C 1 c.937G>T rs28935490 101398432 C/A 2 HCI-I4 c.-10C>T rs2071225 101407913 G/A 14 c.370-81_370-77delCAGCC rs5903184 101401886 GGCTG/- c.640-16A>G rs2071397 101398962 T/C c.1000-22C>T rs2071228 101398121 G/A HCI-II5 c.370-81_370-77delCAGCC rs5903184 101401886 GGCTG/- 19 c.640-16A>G rs2071397 101398962 T/C c.1000-22C>T rs2071228 101398121 G/A HCI-III c.-12G>A rs3027585 101407915 C/T 14 c.548-125C>G rs2071396 101400882 G/C c.639+68A>G rs3027589 101400882 T/C c.1000-22C>T rs2071228 101398121 G/A HCI-I + HCI-III 1 HCI-II + HCI-III 1 HCI=Haplotipo complejo intrónico; SNP=Variaciones de un nucleótido (dbSNP, ver enlace). 1Secuencia de referencia (ver enlace NCBI) 2Identificador de SNP (ver enlace dbSNP) 3Posición respecto a la versión del genoma de referencia (ver enlace NCBI) 4HCI-I incluye combinaciones con NM_000169.2:376A>G (n=1), NM_000169.2:c.937G>T (n=1), NM_000169.2:c.945C>T (n=1). 5 HIC-II incluye combinaciones con NM_000169.2:c.937G>T (n=1). 86 RESULTADOS Tras buscar las variantes de la tabla 5.3 en las bases de datos HGMD, ClinVar, LOVD y dbSNP obtuvimos el siguiente análisis: 1. NM_000169.2:c.-125T>G -> ClinVar clasifica esta variante como probablemente benigna, además en HGMD y LOVD no se encuentran publicaciones relacionadas con esta variante. En nuestra población, se identificó en una mujer en heterozigosidad (0,3%). 2. NM_000169.2:c.-34C>T -> No se encuentran entradas en ClinVar, HGMD ni LOVD para esta variante. En nuestra población, se identificó en una mujer en heterozigosidad (0,3%). 3. NM_000169.2:c.-30G>A -> ClinVar recoge 1 estudio en el que se interpreta como probablemente benigna y 2 estudios como benigna. HGMD y LOVD recogen varias publicaciones en las que se categoriza como benigna. En nuestra población, se identificó en 4 mujeres en heterozigosidad (1,1%). 4. NM_000169.2:c.-12G>A -> ClinVar recoge 5 estudios en el que se interpreta como probablemente benigna y 2 estudios como benigna. Ni HGMD ni LOVD recogen publicaciones respecto a esta variante. En nuestra población, se identificó en 16 sujetos (4,3%). 5. NM_000169.2:c.-10C>T -> ClinVar recoge 10 estudios en el que se interpreta como probablemente benigna y 2 estudios como benigna. HGMD y LOVD recogen publicaciones respecto a esta variante en los que se observa una reducción de la actividad enzimática. En nuestra población, se identificó en 14 sujetos (3,8%). 6. NM_000169.2:c.192C>T (NP_0001601:p.Ile64=) -> No se encuentran entradas en ClinVar, HGMD ni LOVD para esta variante. En nuestra población, se identificó en una mujer en heterozigosidad (0,3%). 7. NM_000169.2:c.194+17A>G -> ClinVar recoge 2 estudios en el que se interpreta como benigna. Ni HGMD ni LOVD recogen publicaciones respecto a esta variante. En nuestra población, se identificó en una mujer en heterozigosidad (0,3%). 8. NM_000169.2:c. c.370-81_370-77delCAGCC -> -> ClinVar recoge 1 estudio en el que se interpreta como benigna. Ni HGMD ni LOVD recogen publicaciones respecto a esta variante. En nuestra población, se identificó en 35 sujetos (9,5%). 9. NM_000169.2:c.376A>G (NP_000160.1:p.Ser126Gly) -> existe conflicto respecto a la interpretación de esta variante ya que ClinVar recoge 5 estudios en los que se interpreta como probablemente benigna y 2 estudios como VUS. HGMD y LOVD recogen varias 87 RESULTADOS publicaciones en las que se categoriza como benigna. En nuestra población, se identificó en un varón cosegregando con HCI-I (0,3%). 10. NM_000169.2:c.548-125C>G -> No se recoge información en ninguna base de datos consultada. En nuestra población, se identificó en 17 sujetos (4,6%). 11. NM_000169.2:c.639+68A>G -> No se recoge información en ninguna base de datos consultada. En nuestra población, se identificó en 17 sujetos (4,6%). 12. NM_000169.2:c.640-16A>G -> No se recoge información en ninguna base de datos consultada. En nuestra población, se identificó en 35 sujetos (9,5%). 13. NM_000169.2:c.640-25A>G -> No se recoge información en ninguna base de datos consultada. En nuestra población, se identificó en 1 sujeto (0,3%). 14. NM_000169.2:c.937G>T (NP_000160.1p.Asp313Tyr) -> existe conflicto respecto a la interpretación de esta variante ya que ClinVar recoge 2 estudios en los que se interpreta como benigna, 10 estudios como probablemente patogénica y 2 estudios como VUS. HGMD y LOVD recogen varias publicaciones en las que se categoriza como benigna o polimorfismo de pseudo-deficiencia. En nuestra población, se identificó en 4 mujeres en heterozigosidad o cosegregando con HCI-I y II (1,1%). 15. NM_000169.2:c.945C>T (NP_000160.1p.Asp315=) -> existe conflicto respecto a la interpretación de esta variante ya que ClinVar recoge 1 estudio en el que se interpreta como benigna, 4 estudios como probablemente patogénica y 1 estudio como VUS. En HGMD y LOVD no se encuentran publicaciones asociadas a esta variante recoge varias publicaciones en las que se categoriza como benigna o polimorfismo de pseudodeficiencia. En nuestra población, se identificó en 4 mujeres en heterozigosidad o cosegregando con HCI-I y II (1,1%). 16. NM_000169.2:c.1000-22C>T -> ClinVar recoge 3 estudios en el que se interpreta como benigna. Ni HGMD ni LOVD recogen publicaciones respecto a esta variante. En nuestra población, se identificó en 35 sujetos (9,5%). Aquellas variantes identificadas de novo en esta fase del estudio que se pueden considerar VUS (Paciente 1 NM_000169.2:c.-34C>T, Paciente 2 NM_000169.2:c.192C>T y Paciente 3 NM_000169.2:c.640-25A>C) continuaron la fase de caracterización del estudio. Debido a la elevada frecuencia en nuestra muestra las variantes que conforman los diferentes HCI (NM_000169.2:c.-12G>A, NM_000169.2:c.-10C>T, NM_000169.2:c. c.370-81_370-77delCAGCC, NM_000169.2:c.548-125C>G, NM_000169.2:c.639+68A>G, NM_000169.2:c.640-16A>G y NM_000169.2:c.1000-22G>A), continuamos el estudio de éstas en la la fase de caracterización. 88 RESULTADOS 5.3 Estudio epidemiológico de las variantes identificadas en el Grupo de secuenciación Se realizó un estudio de ligamiento de los 17 marcadores o variantes genéticas (tabla 5.3) en el Grupo de secuenciación de la fase de pacientes del estudio (figura 5.1) para darnos idea de la independencia de la segregación y de la evolución de esos caracteres en nuestra muestra. Se observó una elevada tendencia a la cosegregación de diversas variantes como se aprecia en la figura 5.2, donde un mayor desequilibrio entre dos marcadores hace que el color vire del azul al rojo. Figura 5.2. Gráfico de desequilibrio de ligamiento de los 17 marcadores identificados en el Grupo de secuenciación. Analizando la figura observamos que el grado de ligamiento entre algunos marcadores, que componen el HCI-I, II y III, fue elevado (tabla 5.4). 89 RESULTADOS Tabla 5.4. Resultado del análisis de desequilibrio de ligamiento en el Grupo de secuenciación MARCADORES/VARIANTE GENÉTICAS D’ R2 NM_000169.2:c.-30G>A (rs3027584) vs NM_000169.2:c.548-125C>G (rs2071396) 1,000 0,955 NM_000169.2:c.-30G>A (rs3027584) vs NM_000169.2:c.639+68A>G (rs3027589) 0,955 0,913 NM_000169.2:c.370-81_370-77delCAGCC (rs5903184) vs NM_000169.2:c.640-16A>G (rs2071397) 1,000 0,902 NM_000169.2:c.370-81_370-77delCAGCC (rs5903184) vs NM_000169.2:c.1000-22G>A (rs2071228) 1,000 0,728 NM_000169.2:c.548-125C>G (rs2071396) vs NM_000169.2:c.639+68A>G (rs3027589) 1,000 1,000 D’=medida de la heredabilidad de dos marcadores genéticos; R2=nivel de redundancia estadística entre dos marcadores Para conocer el nivel de asociación de las 17 variantes genéticas identificadas, planteamos un modelo de regresión en el que analizó como variable dependiente la actividad α-Gal A en DBS, como variables independientes el conteo de los alelos para cada marcador genético, y se intentó realizar un ajuste utilizando como covariables el género, el IMC, el EVI y la presencia/ausencia de HTA. El estudio de asociación para las 17 variantes identificadas, indicó que existía una asociación estadísticamente significativa de la actividad α-Gal A en DBS con 4 de las 17 variantes identificadas, bajo el modelo de herencia recesiva, para los genotipos hemizigoto y homozigoto mutado (tabla 5.5). Las 4 variantes forman parte de los HCI-I y II. Tabla 5.5. Resultados del test de correlación/tendencia para la actividad de α-Gal A en DBS y los genotipos de los alelos identificados en el Grupo de secuenciación, bajo el modelo de herencia recesiva. MARCADOR/VARIANTE GENÉTICA ALELO1 COEF. β P2 p AJUSTADA3 NM_000169.2:c.-10C>T (rs2071225) T -0,5857 0,00005 0,0005 NM_000169.2:c.370-81_370-77delCAGCC (rs5903184) del -0,3767 0,00246 0,0222 NM_000169.2:c.640-16A>G (rs2071397) G -0,4328 0,00117 0,0106 NM_000169.2:c.1000-22G>A (rs2071228) T -0,2882 0,00249 0,0224 Variable dependiente del modelo: L(α-Gal A); Covariables ajustadas: género, IMC, EVI, HTA. 1Alelo minoritario 2p grado de significación estadística para el test de correlación tendencia 3p ajustada mediante corrección posthoc de Bonferroni El análisis de segregación haplotípica de las 4 variante participantes del HCI-I y II, indicó 16 haplotipos posibles. Cuatro de esos haplotipos estaban presentes con una frecuencia del 96,6% en nuestra muestra. El haplotipo que comprende las variantes NM_000169.2:c.-10C>T (rs2071225), NM_000169.2:c. c.370-81_370-77delCAGCC (rs5903184), NM_000169.2:c.64016A>G (rs2071397) y NM_000169.2:c.1000-22G>A (rs2071228), y se corresponde con HCI-I, presentaba una frecuencia de 7,41%, mientras que el que comprende las variantes NM_000169.2:c. c.370-81_370-77delCAGCC (rs5903184), NM_000169.2:c.640-16A>G 96 RESULTADOS Figura 5.6. Histogramas del número de copias de las regiones codificantes del gen GLA en los pacientes 1, 2 y 3. En el eje de abscisas se representan todas las sondas que cubren tanto los exones del gen GLA, así como los genes control constitutivos. En el eje de ordenadas se representa la dosis relativa normalizada de cada una de las sondas del eje de abscisas. Las barras horizontales se encuentran ubicadas en los puntos de corte de la deleción (0,75) y la duplicación (1,25). 97 RESULTADOS 5.5 Estudio de caracterización de variantes que segregan en forma de haplotipos complejos De acuerdo con el resultado de las variantes genéticas identificadas en el Grupo de secuenciación (tabla 5.3) y con los resultados del estudio epidemiológico (tabla 5.5 y tabla 5.6), tratamos de caracterizar los individuos que presentaban los haplotipos complejos sin cosegregación de ninguna variante clasificada como VUS, potencialmente benigna. Atendiendo a este criterio, en el grupo de pacientes con HCI I (n=14) excluimos a 3 de ellos al existir cosegregación con las variante NM_000169.2:c.376A>G, NM_000169.2:c.937G>T y NM_000169.2:c.945C>T por lo que caracterizamos finalmente n=11 pacientes con HCI I (6 varones y 5 mujeres); respecto al grupo de pacientes con HCI III (n=14) los caracterizamos a todos (6 varones y 8 mujeres). Los varones con HCI I eran más jóvenes [(61,5(47,5-75,3)] que las mujeres [(66,0(59,3-72,8)], observación que se replica en los pacientes con HCI III 68,0(47,8-76,0) vs 70,0(60,3-81,5). 5.5.1 Análisis enzimático en muestra de plasma y leucocitos de los pacientes con haplotipos complejos EL análisis enzimático se realizó en muestras de plasma K2EDTA y extracto leucocitario según el protocolo especificado en el apartado 4.12.2 y 4.12.3. Se utilizó la misma población control que la descrita en el apartado 5.4.3, para contrastar los datos de actividad enzimática en plasma y extracto leucocitario de los pacientes con HCI I y III. El resultado de esta determinación indica que existe una reducción significativa en los varones que presentan el HCI I (p=0,030); esta reducción fue de un 15% de media respecto al valor mediano de la población control emparejada por género (figura 5.7) Figura 5.7. Gráfico de la actividad de α-Gal A en plasma K2EDTA (A) y extracto leucocitario (B) en la población control vs Grupo HCI vs Grupo HCI III. mediana(Percentil25-Percentil75). ‡p<0,05 98 RESULTADOS 5.5.2 Determinación de Gb3 en orina y Liso-Gb3 en plasma de los pacientes con haplotipos complejos Los niveles de biomarcadores relacionados con la EF se midieron en muestra de orina y en muestra de plasma de los 11 pacientes con HCI I y los 14 pacientes con HCI III; se interpretaron según los puntos de corte establecidos (apartados 4.11.1 y 4.11.2). Todos los pacientes independientemente de su género y el haplotipo que presentan, mostraron niveles de Gb3 en orina y Liso-Gb3 en plasma por debajo de los puntos de corte establecidos en los laboratorios de referencia. En el caso de la concentración de Gb3 en orina en los pacientes con HCI III se encontraba por debajo del límite de detección de la técnica (tabla 5.11). La comparación de los niveles de cada biomarcador estratificando por género y/o haplotipo, no resultaron ser significativas. Tabla 5.11. Niveles de Gb3 en orina y de Liso-Gb3 medidas en el Grupo HCI I y HCI III. PACIENTE Gb 3 ORINA1,* Liso-Gb 3 PLASMA2* Varones Mujeres Varones Mujeres HCI I 0,105(0,010-0,014) 0,020(0,011-0,030) 0,04(ND-0,27) 0,14(0,03-0,19) HCI III ND ND 0,05(0,03-0,14) 0,07(ND-0,17) 1mg Gb 3 /mmol creatinina; rango normal <0,300 mg Gb 3 /mmol 2nmol Liso-Gb3/L; rango normal <1,00 nmol Liso-Gb3/L *mediana(Percentil 25-Percentil 75) ND=No detectable 5.5.3 Caracterización electroforética en gel de poliacrilamida al 6% de los pacientes con haplotipos complejos La cosegregación de diversas variantes en regiones intrónicas podría desregular el ayuste fisiológico del mRNA y generar transcritos alternativos con implicación patogénica. Mediante separación electroforética PAGE (apartado 4.17.3), a partir de la molécula de cDNA del gen GLA (apartado 4.17.1), se comparó el patrón de fragmentos obtenidos de los pacientes con HCI con el de las muestras de cDNA de individuos control de género masculino y femenino. No se identifican fragmentos de diferente tamaño que los visualizados en los controles (figura 5.9). 99 RESULTADOS Figura 5.8. Electroforesis PAGE 6% (m/v) de la muestra de cDNA pacientes hemi y heterozigotos para los HCI I y III. Se incluye un control varón (CtrXY) y un control mujer (CtrXX). HCI=haplotipo complejo intrónico; PM=marcador de pesos moleculares. 5.5.4 Identificación de transcritos alternativos mediante secuenciación del cDNA completo del gen GLA en los pacientes con haplotipos complejos La secuenciación del cDNA de los pacientes con haplotipos complejos, utilizando la técnica de PCR anidada descrita en el apartado 4.17.4, no permitió identificar transcritos alternativos debidos a ayuste alternativo del mRNA. 5.5.5 Perfil de reordenamientos en el gen GLA de los pacientes con haplotipos complejos El análisis de las 5 mujeres con HCI I y de las 8 mujeres con HCI III, mediante técnica de MLPA (apartado 4.14), no identificó reordenamientos patogénicos en el gen GLA. En la figura 5.9 se ilustra el histograma correspondiente, a la dosis relativa de las sondas presentes en la mezcla de reacción, de una mujer con HCI tipo I y otra con HC tipo III. 100 RESULTADOS Figura 5.9. Histogramas del número de copias de las regiones codificantes del gen GLA en los pacientes con haplotipos complejos. HCI=haplotipo complejo intrónico 5.5.6 Análisis de la expresión génica de los pacientes mediante qPCR Los haplotipos complejos se componen de una serie de variantes genéticas, casi todas de ellas en regiones intrónicas, pero además cuentan cada uno de los haplotipos con una variante en región 5’UTR. La segregación del alelo mutado en estas variantes, podría modificar la interacción de los elementos tipo Trans y causar una desregulación de la expresión del gen GLA. Para llevar a cabo este análisis se utilizaron sondas de hidrólisis o TaqMan para el gen diana, así como para el gen constitutivo GAPDH de acuerdo con el protocolo descrito en 4.19. A partir de una muestra de cDNA control, realizamos las rectas estándar para calcular la eficiencia de las premezclas de los cebadores y sondas (ver apartado 4.19.1). Las rectas para las dos sondas mostraron un coeficiente de determinación R2>0,99. Los valores de las eficiencias para las sondas fueron: EGLA=1,99 y EGAPDH=1,86. Una vez tuvimos optimizadas las condiciones de reacción se llevó a cabo una qPCR de las muestras de los pacientes con haplotipo complejo y 30 sujetos control (15 varones y 15 mujeres), por triplicado y siguiendo el protocolo detallado en el apartado 4.19. Se calculó la CR 101 RESULTADOS de la expresión de los dos transcritos a partir de los valores de Ct registrados para cada individuo; comparándolos con los controles emparejados por género. Cuando analizamos todos los individuos que presentan haplotipos complejos, independientemente de su género, observamos una cierta reducción de la expresión del gen en la submuestra de los HCI I que no fue estadísticamente significativa (p=0,089); por otro lado, la submuestra de los HCI III mantienen unos niveles de expresión prácticamente iguales a los de los controles (figura 5.10). Figura 5.10. Cuantificación relativa del gen GLA en los pacientes con haplotipos complejos. No se estratificó por género a los pacientes. mediana(Percentil25-Percentil75). Al realizar la estratificación de las submuestras por género, constatamos que el componente principal de la reducción de la expresión del gen GLA en pacientes con HCI I son los varones (figura 5.11). La reducción de la expresión es significativa en términos estadísticos (p=0,038). Figura 5.11. Cuantificación relativa del gen GLA en los pacientes con haplotipos complejos estratificados por género. HCI=haplotipo complejo intrónico. mediana(Percentil25-Percentil75). ‡p<0,05 102 RESULTADOS 5.5.7 Identificación de nuevas variantes en la región 5’-UTR y en los intrones del gen GLA en pacientes con haplotipos complejos. La región codificante del gen GLA apenas supone un 10% de la secuencia de éste. Para comprobar la presencia o ausencia de más variantes en las regiones no codificantes del gen, se planteó una amplificación de éstas utilizando un diseño de cebadores que generan fragmentos solapantes (“primer walking”) según el protocolo indicado en el apartado 4.13.2. Los amplicones generados se secuenciaron de acuerdo a los procedimientos descritos en 4.13.3 y 4.13.4. Con una cobertura del 96%, se secuenciaron todos los individuos con HCI I y III, identificándose en todos ellos 8 nuevos polimorfismos (1 asociado a HCI I y 7 asociados a HCI III) en regiones no codificantes bien en hemizigosidad bien en heterozigosidad bien en homozigosidad. En la tabla 5.12 se recogen las variantes que conforman el haplotipo completo para los pacientes con HCI I y en la tabla 5.13 se recogen las que conforman el haplotipo completo para los pacientes con HCI III. Tabla 5.12. Variantes genéticas que conforman el HCI I. NM_00169.21 IVS SNP2 GRch38.p123 SILVESTRE/MUTADO c.-769G>C 5’-UTR rs3027580 101408672 C/G c.10C>T 5’-UTR rs2071225 101407913 G/A c.369+990C>A 2 rs1023431 101402821 T/G c.370-81_370-77delCAGCC 2 rs5903184 101401886 GGCTG/- c.640-16A>G 4 rs2071397 101398962 T/C c.1000-22C>T 6 rs2071228 101398121 G/A SNP=Variaciones de un nucleótido (dbSNP, ver enlace); IVS=Región intrónica dónde se detecta. En rojo se indica las nuevas variantes intrónicas identificadas asociadas a este haplotipo. 1Secuencia de referencia (ver enlace NCBI) 2Identificador de SNP (ver enlace dbSNP) 3 Posición respecto a la versión del genoma de referencia (ver enlace NCBI) 103 RESULTADOS Tabla 5.13. Variantes genéticas que conforman el HCI III. NM_00169.21 IVS SNP2 GRch38.p123 SILVESTRE/MUTADO c.-12G>A 5’-UTR rs3027585 101407915 C/T c.194+377C>T 1 rs57788389 101407333 T/C c.194+1287T>A 1 rs3027587 101406423 A/T c.195-1663G>A 1 rs28452934 101405648 C/T c.195-807G>T 1 rs12394005 101404792 C/A c.547+190C>T 3 rs41311559 101401442 G/A c.548-125C>G 3 rs2071396 101400882 G/C c.639+68A>G 4 rs3027589 101400598 T/C c.640-386G>A 4 rs111232330 101399332 C/T c.640-136T>C 4 rs3027592 101399082 A/T c.1000-22C>T 6 rs2071228 101398121 G/A SNP=Variaciones de un nucleótido (dbSNP, ver enlace); IVS=Región intrónica dónde se detecta. En rojo se indica las nuevas variantes intrónicas identificadas asociadas a este haplotipo. 1Secuencia de referencia (ver enlace NCBI) 2Identificador de SNP (ver enlace dbSNP) 3 Posición respecto a la versión del genoma de referencia (ver enlace NCBI) Una vez que se identificaron nuevas variantes asociadas a los HCI I y III, se procedió a genotipar de las nuevas variantes asociadas a los HCI (tablas 5.12 y 5.13) y las variantes previamente asociadas a éstos (apartado 5.2) en una población control. A su vez, se genotipó las nuevas variantes asociadas a los HCI (tablas 5.12 y 5.13) en la población del Grupo de Secuenciación. La población que se va tomar como control son individuos sanos, compuesto por 50 varones y 50 mujeres. El genotipado se realizó mediante RFLP y la visualización mediante electroforesis en gel de agarosa. Mediante el uso del programa Restriction Mapper, se analizó la secuencia resultante de la amplificación utilizando el diseño de cebadores contemplado en los apartados 4.13.1 y 4.13.2. Cuando no se pudiese encontrar una enzima de restricción adecuada para que cortase los amplicones anteriores, se planteó un diseño de cebadores degenerados. Estos cebadores presentan como características que: se diseñan 5’ corriente arriba del nucleótido que queremos genotipar, presenta una o varias bases nitrogenadas diferente a las que le correspondería en la hebra molde cerca de la secuencia 3’ del cebador directo o reverso etc. Al introducir esta/as base/s junto el nucleótido donde se localiza la variante, estaremos generando un sitio de restricción que antes no existía y así facilitar que alguna enzima reconozca esa secuencia “forzada” y la corte generando un patrón de restricción alternativo al obtenido con la variante silvestre. La información del diseño del genotipado mediante RFLPs se encuentra en la tabla 5.14. 104 RESULTADOS Tabla 5.14. Resumen del protocolo de genotipado de las variantes asociadas a HCI I y III, mediante técnica de RFLPs. NM_00169.21 HCI SNP2 CEBADORES3 ENZIMA4 POLÍMERO5 c.-769G>C I rs3027580 Promotor HinfI Agarosa 3% c.10C>T I rs2071225 Exón 1 HphI NuSieve™ 3% c.369+990C>A I rs1023431 Intrón 2 frag. B Mbo Agarosa 1% c.370-81_37077delCAGCC I rs5903184 Exón 3 BsaJI NuSieve™ 3% c.640-16A>G I rs2071397 GATGTTAGTAGAAAGTAAACAGAAGAGTG EcoRV NuSieve™ 3% TTATACTTTTCCAGGAATCATCAAT c.-12G>A III rs3027585 Exón 1 MspI Agarosa 1% c.194+377C>T III rs57788389 Intrón 1 frag. A MspI NuSieve™ 3% c.194+1287T>A III rs3027587 Intrón 1 frag. B DraI Agarosa 1% c.195-1663G>A III rs28452934 Intrón 1 frag. C AciI NuSieve™ 3% c.195-807G>T III rs12394005 GGCCTCCCAAAATGCTGTTAT DpnI NuSieve™ 3% CATTTTGGCTAGGCTAGTCTTGAT c.547+190C>T III rs41311559 GCTTCCCTGGGAGTTTTGGAT MvaI NuSieve™ 3% CACAATATTAGCTATGGTTAGGTATGCC c.548-125C>G III rs2071396 Exón 4 BsaJI Agarosa 3% c.639+68A>G III rs3027589 Exón 4 StyI Agarosa 3% c.640-386G>A III rs111232330 Intrón 4 frag. B HaeIII Agarosa 3% c.640-136T>C III rs3027592 Intrón 4 frag. B PsiI Agarosa 1% c.1000-22C>T I/III rs2071228 TAACCTTGAAGTCCATTCCATAGAAC TseI NuSieve™ 3% CCACTTATCACTAGTTGCTAAGCAG HCI=haplotipo complejo intrónico; SNP=Variaciones de un nucleótido (dbSNP, ver enlace). 1Secuencia de referencia (ver enlace NCBI) 2Identificador de SNP (ver enlace dbSNP) 3Información de la secuencia nucleotídica disponible en las tablas 4.3 y 4.4. En el caso de cebadores degenerados, la secuencia se especifica en la celda en sentido 5’ -> 3’ y el nucleótido que discorda se indica en tojo. 4Enzima de restricción. Protocolo térmico de corte según fabricante (ThermoFisher Scientific o New England BioLabs® lnc) 5 Polímero empleado para realizar la caracterización electroforética del producto de restricción Se estudió una la población control (50 varones y 50 mujeres sanos) mediante análisis de restricción indicado en el protocolo de la tabla 5.14. Se calculó la frecuencia alélica y genotípica para cada uno de ellos. En el caso de los varones, al ser hemizigotos y presentar marcadores genéticos monomórficos, la frecuencia alélica coincide con la genotípica. Los resultados se resumen en la tabla 5.15. 105 RESULTADOS Tabla 5.15. Resultados de la estimación de la frecuencia alélica y genotípica en nuestra población control. NM_00169.21 HCI SNP2 FRECUENCIA ALÉLICA3 FRECUENCIA GENOTÍPICA4 c.-769G>C I rs3027580 0,99 / 0,01 0,96 / 0,04 / 0,00 c.10C>T I rs2071225 0,98 / 0,02 0,98 / 0,02 / 0,00 c.369+990C>A I rs1023431 0,90 / 0,10 0,81 / 0,19 / 0,00 c.370-81_370-77delCAGCC I rs5903184 0,96 / 0,04 0,98 / 0,02 / 0,00 c.640-16A>G I rs2071397 0,93 / 0,07 0,81 / 0,19 / 0,00 c.-12G>A III rs3027585 0,96 / 0,04 0,94 / 0,06 / 0,00 c.194+377C>T III rs57788389 0,98 / 0,02 0,94 / 0,06 / 0,00 c.194+1287T>A III rs3027587 0,98 / 0,02 0,94 / 0,06 / 0,00 c.195-1663G>A III rs28452934 0,98 / 0,02 0,94 / 0,06 / 0,00 c.195-807G>T III rs12394005 0,99 / 0,01 0,96 / 0,04 / 0,00 c.547+190C>T III rs41311559 1,00 / 0,00 1,00 / 0,00 / 0,00 c.548-125C>G III rs2071396 0,98 / 0,02 0,94 / 0,06 / 0,00 c.639+68A>G III rs3027589 0,98 / 0,02 0,92 / 0,08 / 0,00 c.640-386G>A III rs111232330 0,99 / 0,01 0,96 / 0,04 / 0,00 c.640-136T>C III rs3027592 0,98 / 0,02 0,88 / 0,12 / 0,00 c.1000-22C>T I/III rs2071228 0,88 / 0,12 0,75 / 0,25 / 0,00 HCI=haplotipo complejo intrónico; SNP=Variaciones de un nucleótido (dbSNP, ver enlace). 1Secuencia de referencia (ver enlace NCBI) 2Identificador de SNP (ver enlace dbSNP) 3Alelo silvestre / Alelo mutado. Valorada en varones y mujeres. 4 Genotipo homozigoto silvestre / Genotipo heterozigoto /Genotipo homozigoto mutado. Valorada en mujeres. El estudio de desequilibrio de ligamiento no mostró diferencias significativas entre las frecuencias genotípicas de la población control y las esperadas en una población en equilibrio, por tanto, todos nuestros marcadores genéticos asociados a los HCI se encuentran en equilibrio en la población control. Cuando contrastamos las frecuencias alélicas de la población control vs la población de nuestro estudio con HCI I y III, sin estratificar por género, obtenemos que la frecuencia de muchos marcadores es significativa en la los pacientes con HCI I y III (tabla 5.16) y por lo tanto esos marcadores están diferencialmente representados en nuestra población respecto a una población control.