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Implicación de los micrornas en la obtención de células productoras de insulina a partir de células troncales pluripotentes

López Beas, Emilio Javier · 2017

Abstract

La diabetes mellitus (DM) es un desorden metabólico que aparece cuando el páncreas no produce insulina suficiente o cuando el organismo no utiliza eficazmente la insulina dando lugar a la incapacidad para mantener la normoglucemia, desencadenando una situación de hiperglucemia crónica que produce daños a corto y largo plazo en muchos órganos y sistemas del organismo. Un aspecto central en el desarrollo de la DM es la reducción en el número de células beta pancreáticas que son las encargadas de producir insulina. Las limitaciones del tratamiento actual de la DM han estimulado la búsqueda de terapias que permitan restaurar la masa beta perdida para conseguir alcanzar la normoglucemia. La diferenciación de las células pluripotenciales hacia células productoras de insulina permitiría disponer de una fuente inagotable de células para una terapia alternativa de la DM. Sin embargo, los métodos disponibles hasta el momento presentan varios inconvenientes como son un bajo rendimiento, una difícil reproducibilidad y baja eficacia con la generación de células con un fenotipo inmaduro. Por lo tanto, será fundamental conseguir un aumento en la eficacia y eficiencia del proceso de diferenciación de células pluripotenciales hacia células productoras de insulina totalmente maduras. Nuestro grupo fue pionero en demostrar que las células troncales embrionarias (CTEs) murinas pueden diferenciarse in vitro hacia células productoras de insulina y revertir in vivo la glucemia en modelos murinos diabéticos, estudios posteriores han demostrado que los protocolos de diferenciación in vitro pueden ser optimizados mediante el uso de diversos factores de crecimiento para aumentar la eficacia y eficiencia, consiguiendo células beta pancreáticas maduras funcionales en cantidad suficiente para una posible terapia celular. Sin embargo, las etapas de maduración son susceptibles de mejoras y además los factores necesarios para el proceso de diferenciación son extremadamente caros, esto ha suscitado un gran interés por la investigación de los microRNAs (miRNAs) como factores clave de la diferenciación que podrían sustituirlos en los protocolos, al tiempo que proporcionan un proceso más fácilmente inducible hacia la diferenciación. La propuesta en este trabajo de investigación gira en torno a una mejora de la eficacia y eficiencia del proceso de diferenciación de las células pluripotenciales hacia células productoras de insulina, mediante un mecanismo regulador innovador ejercido por pequeñas moléculas de RNAs no codificantes como son los miRNAs, de forma que podrán constituir herramientas moleculares útiles en la manipulación de las CTEs. Los miRNAs están probablemente implicados en la mayoría de los procesos biológicos, incluyendo el desarrollo, transducción de señales, diferenciación de tejidos y desarrollo de enfermedades. En mamíferos constituyen una clase de moléculas reguladores de la expresión génica en diversos tipos celulares que pueden expresarse específicamente en diferentes tejidos. La expresión común similar de miRNAs en células troncales pluripotentes de roedores y humanos sugiere un importante papel funcional en el control de la auto‐renovación y diferenciación de estas células. En nuestro trabajo, identificamos el perfil de expresión específico de miRNAs en las células troncales pluripotentes (Familia miR‐302) y durante el proceso de diferenciación para obtener células productoras de insulina (miR‐7, ‐375, ‐373, 15a/b, ‐16, ‐148a y ‐29b), así como aquellos miRNAs con una expresión preferente en los islotes pancreáticos, entre los que destacan el miR‐7 y miR‐375, que varios trabajos sitúan como dos de los miRNAs más abundantes en páncreas, necesarios para un correcto desarrollo pancreático. Los resultados obtenidos revelan que el miR‐7 posee un importante papel en la obtención de células productoras de insulina a partir de células troncales, mejorando la sensibilidad de las células obtenidas a la liberación de insulina dependiente de los estímulos de glucosa. En conclusión, la generación de células productoras de insulina mediante miRNAs específicos en ausencia de factores de crecimiento resulta por el momento una meta lejana de alcanzar. Sin embargo, la mejora en los procesos de maduración para obtener células completamente funcionales mediante la combinación de factores de crecimiento y miRNAs es prometedora, aunque constituye un enfoque que se enfrenta a múltiples desafíos. Los próximos años revelaran el potencial real de los miRNAs como nuevas herramientas para la prevención y el tratamiento de la DM, revolucionando muchos de los actuales modelos en ciencias biomédicas.

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Implicación de los micrornas en la obtención de células productoras de insulina a partir de células troncales pluripotentes

Author: López Beas, Emilio Javier
Year: 2017
Source: https://idus.us.es/bitstreams/2fc97ba9-1ec3-4a1c-8655-19d76fada01b/download
Di igida po :
D . Abdelk im Hmadcha
D . Be na So ia Escoms
IMPLICACIÓN DE LOS MICRORNAS EN LA
OBTENCIÓN DE CÉLULAS PRODUCTORAS DE
INSULINA A PARTIR DE CÉLULAS TRONCALES
PLURIPOTENTES
CABIMER
Memo ia del abajo de in es igación p esen ada po
D. Emilio Ja ie López Beas pa a op a al g ado de Doc o .
Se illa, 2017
D . Be na So ia Escoms, Di ec o del Depa amen o de Células T oncales del Cen o
Andaluz de Biología Molecula y Medicina Regene a i a (CABIMER) y D . Abdelk im
Hmadcha, In es igado del Cen o Andaluz de Biología Molecula y Medicina
Regene a i a (CABIMER),
CERTIFICAN QUE:
El abajo de in es igación p esen ado po D. Emilio Ja ie López Beas i ulado
“Implicación de los mic oRNAs en la ob ención de células p oduc o as de insulina a
pa i de células oncales plu ipo en es” ha sido ealizado bajo su supe isión y
di ección en el Depa amen o de Células T oncales de CABIMER, y eúne los equisi os
de o iginalidad y calidad cien í ica necesa ios pa a se de endido an e un ibunal con el
in de op a al g ado de Doc o po la Uni e sidad de Se illa.
Y pa a que así cons e y a e ec os opo unos, i man el p esen e in o me en Se illa a 21
de Julio de 2016.
VºBº de los di ec o es del abajo.
D . Be na So ia Escoms
D . Abdelk im Hmadcha
Es e abajo ha sido ealizado en el Depa amen o de Regene ación y Te apia
Celula del Cen o Andaluz de Biología Molecula y Medicina Regene a i a
(CABIMER) y con la ayuda de un con a o pa a la o mación de Pe sonal
In es igado de la Fundación P og eso y Salud (FPS).
Du an e el pe iodo del con a o de o mación se han publicado los siguien es abajos:
ARTÍCULOS PUBLICADOS
López-Beas, J.; So ia, B.; Hmadcha, A. Mic oRNAs modula e di e en ia ion o human emb yonic
s em cells in o insulin-p oducing β-like cells and con ibu e o ma u a ion. Manusc i o en
p epa ación
Pezzolla, D.; López-Beas, J.; Lachaud, CC.; Domínguez-Rod íguez, A.; Smani, T.; Hmadcha, A.;
So ia, B. 2015. Res e a ol amelio a es he ma u a ion p ocess o β-cell-like cells ob ained om
an op imized di e en ia ion p o ocol o human emb yonic s em cells. PLoS One. 10:e0119904.
Lachaud, CC.; Lopez-Beas, J.; So ia, B.; Hmadcha, A. Cell Dea h & Disease. 2014. EGF-induced
adipose issue meso helial cells unde go unc ional ascula smoo h muscle di e en ia ion. Cell
Dea h Dis. 5:e1304.
CAPÍTULOS DE LIBRO
So ia, B.; Pezzolla, D.; López, J.; Rojas, A.; Hmadcha, A. 2013. P inciples o Tissue Enginee ing.
Gene a ion o Panc ea ic Isle s om S em Cells. 41:837-47.
CONGRESOS
Reunión Anual del Cen o de In es igación Biomédica en Red de Diabe es y En e medades
Me abólicas (CIBERDEM). Ba celona, España. 2017. Comunicación o al. “Gene a ing an
Ad anced The apy Medicinal P oduc (CAB-001) using he CABIMER Di e en ia ion P o ocol”
López-Beas, J.; Vakilian, M.; Capilla-González, V.; Aguile a, Y.; Escacena, N.; Tejedo, JR.; Bedoya,
FJ.; Ma ín, F.; So ia, B.; Hmadcha, A.
Reunión anual del Cen o de In es igación Biomédica en Red de Diabe es y En e medades
Me abólicas (CIBERDEM). Ba celona, España. 2016. Pós e : "In- i o di e en ia ion o insulin-
p oducing cells om human emb yonic s em cells: The cabime p o ocol". Hmadcha, A.; López-
Beas, J.; Pezzolla, D.; Salgue o-A anda, C.; Tejedo, J.; Bedoya, FJ.; Ma in, F.; So ia, B.
Reunión anual de la Red de Te apia celula (Te Cel). Se illa, España. 2016. Pós e : “P oducing
ma u e insulin-p oducing cells om human plu ipo en s em cells as a cell-based medicinal
p oduc ”. Pascual, S.; Vakilian, M.; López-Beas, J.; Mellado, N.; Aguile a, Y.; Escacena, N.;
Jiménez, V.; Gál ez, M.; So ia, B.; Hmadcha, A.
In e na ional Socie y o S em Cell Resea ch (ISSCR): Annual In e na ional Mee ing. Es ocolmo,
Suecia. 2015. Pós e : “mic oRNAs modula e di e en ia ion in mouse and human emb yonic
s em cells in o insulin-p oducing cells and con ibu e o ma u a ion". López-Beas, J.; Lachaud,
CC.; Aguile a, Y.; Mellado, N.; Hmadcha, A.; So ia, B.

Reunión anual de la Red de Te apia celula (Te Cel). Se illa, España. 2015. Pós e : “Mic oRNAs
modula e di e en ia ion in human emb yonic s em cells in o insulin p oducing β-like cells and
con ibu e o ma u a ion”. López-Beas, J.; Lachaud, CC.; Aguile a, Y.; Mellado, N.; Hmadcha, A.;
So ia, B.
Reunión anual del G upo de T abajo de Islo es Panc eá icos de la Sociedad Española de
Diabe es (SED). Mad id, España. 2014. Comunicación o al: "Los mic oRNAs modulan la
di e enciación de las células oncales emb iona ias hacia células p oduc o as de insulina".
López-Beas, J.; So ia, B.; Hmadcha, A.
The Eu opean Summe School on S em Cells & Regene a i e Medicine. Hyd a, G ecia. 2014.
Pós e : "mic oRNAs modula e di e en ia ion in mouse and human emb yonic s em cells in o
insulin-p oducing cells and con ibu es o ma u a ion". López-Beas, J.; Pezzolla, D.; Aguile a, Y.;
Mellado, N.; Hmadcha, A.; So ia, B.
"No engo ningún alen o en especial, sólo soy apasionadamen e cu ioso".
Albe Eins ein
A mi amilia y mis dos es ellas del cielo,
que siemp e iluminan mi camino,
Teodo a y Manuel.
Ag adecimien os
Es a esis doc o al no hubie a sido posible sin el impulso de odas aquellas pe sonas que
me han ayudado pe sonalmen e en el desa ollo de un abajo de es a índole,
comenzando po sus di ec o es, los doc o es Abdelk im Hmadcha y Be na So ia,
quienes con ia on en mí y me die on la opo unidad de ealiza uno de los e os más
impo an es de mi ida en el Depa amen o de Regene ación y Te apia Celula del
CABIMER. Ag adece a Ka im su dedicación y es ímulo, además de sus siemp e
ace ados consejos y de man ene siemp e abie a la pue a pa a ayuda en odo lo
posible y al doc o Ta ik Smani, u o del p og ama de doc o ado, po su inculación e
in e és.
A odos los in eg an es del g upo, po su paciencia, sob e odo en los inicios cuando
necesi é su es echa colabo ación pa a amplia mis conocimien os y ap i udes en el
labo a o io y pode ale me po mi mismo. Nu ia y Yolanda, po ues a undamen al
labo en es e g upo y la ines imable ayuda que nos p opo cionáis, siemp e dispues as a
colabo a con nues o abajo. Mis dos compañe as de a igas du an e mucho iempo, a
un lado Daniela que ue ma cando el camino pa a que odo me ue a un poco más ácil
y que nos aleg aba los días con su mano especial en la epos e ía y ese i amisú que
nunca ol ida emos y al o o Na alia, dispues a siemp e a colabo a en odo lo que es é
en su mano y que desp ende un halo de cons ancia y es ue zo que con agia a quien la
odea. Ch is ian po compa i su amplio conocimien o conmigo que me ha hecho
ap ende y mejo a con ace adas suge encias, y con esos “ingenios” que nos hacen la
ida un poco más ácil en el labo a o io. Las úl imas y g andes inco po aciones al g upo
con Vi ian que ha ansmi ido op imismo y posi i idad desde su llegada, y que con su
expe iencia me ha ayudado mucho en la ec a inal del abajo pa a culmina lo de la
mejo o ma posible, Sand a que aunque po menos iempo del que nos hab ía gus ado,
CONTENIDO
i
3.1. BIOÉTICA Y EXPERIMENTACIÓN ANIMAL 75
3.1.1. OBTENCIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS A PARTIR DE TEJIDOS DE ORIGEN MURINO 75
3.2. CULTIVO CELULAR 76
3.2.1. LÍNEAS CELULARES CULTIVADAS Y CONDICIONES DE CULTIVO 76
3.2.2. PROTOCOLO DE DIFERENCIACIÓN CELULAR 78
3.3. ANÁLISIS FUNCIONAL DE LOS MIRNAS 81
3.3.1. OBTENCIÓN DE LOS MIRNAS: POOL DE MIRNAS Y MIRNAS SINTÉTICOS 81
3.3.2. TRANSFECCIÓN DE LOS MIRNAS 82
3.4. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 84
3.4.1. EXTRACCIÓN DEL RNA 84
3.4.2. RETROTRANSCRIPCIÓN O TRANSCRIPCIÓN INVERSA 85
3.4.3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA CON TRANSCRIPTASA INVERSA (RT-
PCR) 86
3.4.4. PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL (QPCR) 89
3.4.5. MICROARRAY DE EXPRESIÓN GÉNICA DE MIRNAS 92
3.4.6. HIBRIDACIÓN IN SITU (ISH) DE MIRNAS 94
3.4.7. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS 95
3.4.8. ELECTROFORESIS EN SDS-PAGE 96
3.4.9. TRANSFERENCIA E INMUNODETECCIÓN DE LAS PROTEÍNAS: WESTERN BLOT (WB) 96
3.4.10. INMUNOFLUORESCENCIA (IF) 98
3.4.11. ENSAYO POR INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (ELISA) 99
3.4.12. FOSFATASA ALCALINA 99
3.5. MICROSCOPÍA 100
3.6. ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO 100
3.6.1. ANÁLISIS PREDICTIVO DE DIANAS DE MIRNAS 101
3.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 103
4. RESULTADOS 105
4.1. CARACTERIZACIÓN DE LÍNEAS CELULARES PLURIPOTENTES 107
4.2. EL PÁNCREAS Y LAS PEQUEÑAS MOLÉCULAS DE NCRNA 110
4.2.1. LAS PEQUEÑAS MOLÉCULAS DE NCRNA EN LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CTES 110
4.2.2. EXPRESIÓN DE LOS MIRNAS CARACTERÍSTICOS DEL PÁNCREAS 117
4.3. ANÁLISIS DE MIRNAS EN LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CTES 120
4.3.1. DIFERENCIACIÓN DE LAS CTES HACIA CÉLULAS PRODUCTORAS DE INSULINA 120
4.3.2. PERFIL DE EXPRESIÓN DE LOS MIRNAS EN LAS CTES 126
4.3.3. LOS MIRNAS Y LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CTES 131
4.3.4. LOS MIRNAS Y LOS ISLOTES PANCREÁTICOS 134

CONTENIDO
4.4. LOS MIRNAS Y LA OBTENCIÓN DE CÉLULAS PRODUCTORAS DE INSULINA A PARTIR DE
CTES 142
4.4.1. SELECCIÓN DE LOS MIRNAS PANCREÁTICOS CANDIDATOS 142
4.4.2. MECANISMOS DE INDUCCIÓN Y SUPRESIÓN DE LOS MIRNAS PANCREÁTICOS EN
LAS CTES 146
4.4.3. EFECTO DE LA INDUCCIÓN DE LOS MIRNAS PANCREÁTICOS 149
5. DISCUSIÓN 161
5.1. POTENCIAL REGULADOR DEL POOL DE PEQUEÑAS MOLÉCULAS DE NCRNA
PANCREÁTICAS EN LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CTES MURINAS 164
5.2. LOS MIRNAS PANCREÁTICOS 171
5.3. IMPLICACIÓN DE LOS MIRNAS EN LAS CÉLULAS BETA PANCREÁTICAS 175
5.4. LOS MIRNAS Y LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CTES: IMPLICACIÓN EN LA OBTENCIÓN DE
CÉLULAS PRODUCTORAS DE INSULINA 179
5.5. UTILIDAD DE LOS MIRNAS EN LA DIFERENCIACIÓN PANCREÁTICA DE LAS CTES 189
6. CONCLUSIONES 201
7. BIBLIOGRAFÍA 205
ii
RESUMEN
La diabe es melli us es un deso den me abólico que apa ece cuando el pánc eas no
p oduce insulina su icien e o cuando el o ganismo no u iliza e icazmen e la insulina
dando luga a la incapacidad pa a man ene la no moglucemia, desencadenando una
si uación de hipe glucemia c ónica que p oduce daños a co o y la go plazo en muchos
ó ganos y sis emas del o ganismo. Un aspec o cen al en el desa ollo de la diabe es es
la educción en el núme o de células be a panc eá icas que son las enca gadas de
p oduci insulina. Las limi aciones del a amien o ac ual de la diabe es han es imulado
la búsqueda de e apias que pe mi an es au a la masa celula be a pe dida pa a
consegui alcanza la no moglucemia. La di e enciación de las células oncales
plu ipo en es hacia células p oduc o as de insulina pe mi i ía dispone de una uen e
inago able de células pa a una e apia al e na i a. Sin emba go, los mé odos disponibles
has a el momen o p esen an a ios incon enien es como son un bajo endimien o, una
di ícil ep oducibilidad y baja e icacia con la gene ación de células con un eno ipo
inmadu o. Nues o g upo ue pione o en demos a que las células oncales
emb iona ias (CTEs) mu inas pueden di e encia se in i o hacia células p oduc o as de
insulina y e e i in i o la glucemia en modelos mu inos diabé icos, es udios
pos e io es han demos ado que los p o ocolos de di e enciación in i o pueden se
op imizados median e el uso de di e sos ac o es de c ecimien o pa a aumen a la
e icacia y e iciencia, consiguiendo células be a panc eá icas madu as uncionales en
can idad su icien e pa a una posible e apia celula . Sin emba go, las e apas de
madu ación son suscep ibles de mejo as y además los ac o es necesa ios pa a el
p oceso de di e enciación son ex emadamen e ca os, es o ha susci ado un g an in e és
po la in es igación de los mic oRNAs (miRNAs) como ac o es cla e en la di e enciación
que pod ían sus i ui los.
iii
La p opues a en es e abajo de in es igación gi a en o no a una mejo a de la e icacia y
e iciencia del p oceso de di e enciación de las células oncales plu ipo en es hacia
células p oduc o as de insulina, median e un mecanismo egulado inno ado eje cido
po pequeñas moléculas de RNAs no codi ican es como son los miRNAs, de o ma que
pod án cons i ui he amien as molecula es ú iles en la manipulación de las CTEs. En
nues o abajo, iden i icamos el pe il de exp esión especí ico de miRNAs en las células
oncales plu ipo en es (Familia miR-302) y du an e el p oceso de di e enciación pa a
ob ene células p oduc o as de insulina (miR-7, -375, -373, -15a/b, -16, -148a y -29b), así
como aquellos miRNAs con una exp esión p e e en e en los islo es panc eá icos, en e
los que des acan miR-7 y -375, que a ios abajos si úan como dos de los miRNAs más
abundan es en pánc eas, necesa ios pa a un co ec o desa ollo panc eá ico. Los
esul ados ob enidos e elan que miR-7 posee un impo an e papel en la ob ención de
células p oduc o as de insulina a pa i de células oncales, mejo ando la sensibilidad
de las células ob enidas a la libe ación de insulina dependien e de los es ímulos de
glucosa.
En conclusión, la gene ación de células p oduc o as de insulina median e miRNAs
especí icos en ausencia de ac o es de c ecimien o esul a po el momen o una me a
lejana de alcanza . Sin emba go, la mejo a en los p ocesos de madu ación pa a ob ene
células comple amen e uncionales median e la combinación de ac o es de c ecimien o
y miRNAs es p ome edo a, aunque cons i uye un en oque que se en en a a múl iples
desa íos. Los p óximos años e ela an el po encial eal de los miRNAs como nue as
he amien as pa a la p e ención y el a amien o de la diabe es, e olucionando
muchos de los ac uales modelos en ciencias biomédicas.
ABREVIATURAS

ABREVIATURAS
xi
Ab
An ibody (An icue po)
ABCA1
ATP binding casse e sub amily A membe 1 (Miemb o 1 de la sub amilia A de case es de
union a ATP)
ACTB
Ac in, be a (Be a ac ina)
Ac 2a
Ac i in ecep o ype-2A (Recep o de Ac i ina ipo 2A)
ADA
Ame ican diabe es associa ion (Asociación ame icana de diabe es)
ADP
Adenosine diphospha e (Adenosín di os a o)
Ago
P o eína a gonau a
Ago2
p o eína a gonau a-2
AKT
Se ine/ h eonine kinase 1 (Se ina/ eonina quinasa 1)
AMY2A5
Amylase 2a5 (Amilasa)
ANOVA
Analysis o a iance (Análisis de a iación)
AP
Alkaline phospha ase (Fos a asa alcalina)
APC
Adenoma ous polyposis coli
ATP
Adenosine iphospha e (Adenosín i os a o)
AU
A bi a y uni s (Unidades a bi a ias)
BCL2
B cell leukemia/lymphoma 2 (Lin oma de células B 2)
bFGF
Basic ib oblas g ow h ac o (Fac o de c ecimien o ib oblás ico básico)
BHLHE22
Basic helix-loop-helix amily, membe e22 (Miemb o e22 de la amilia hélice-bucle-hélice
básica)
BMP
Bone mo phogenic p o ein (P o eína mo ogénica ósea)
BMP2
Bone mo phogenic p o ein-2 (P o eína mo ogénica ósea-2)
BMP4
Bone mo phogenic p o ein-4 (P o eína mo ogénica ósea-4)
BSA
Bo ine se um albumin (Albúmina sé ica bo ina)
CALB1
Calbindin 1 (Calbindina 1)
Cap-5'
Cape uza 5'
CAV2
Ca eolin 2 (Ca eolina 2)
CCDC18
Coiled-coil domain con aining 18
CDKs
Cyclin-dependen kinases (Quinasas dependien es de ciclinas)
cDNA
DNA complemen a io
CIBERDEM
Cen o de in es igación biomédica en ed de diabe es y en e medades me abólicas
CIE-10
Clasi icación in e nacional de en e medades
c-MYC
A ian Myelocy oma osis Vi al Oncogene Homolog (Homólogo del oncogen i al A ian
Myelocy oma osis)
CRYBB2
C ys allin be a B2 (C is alina be a B2)
C
Cycle h eshold (Ciclo umb al)
CTAs
Células oncales adul as
CTEs
Células oncales emb iona ias
CTNNB
Ca enin, be a (Be a ca enina)
CTRB1
Chymo ypsinogen B1 (Quimio ipsinógeno B1)
DD-CTEs
Di e enciacion di igida de células oncales emb iona ias
DGCR8
DiGeo ge synd ome c i ical egion gene 8 (Región c í ica del gen 8 del sínd ome
DiGeo ge)
DMEM
Dulbecco's modi ied eagle médium (Medio Eagle modi icado de Dulbecco)
DMEM/F12
Dulbecco's modi ied eagle medium: Nu ien mix u e F-12 (Medio Eagle modi icado de
Dulbecco: Mezcla de nu ien es F-12)
DMG
Diabe es melli us ges acional
DMID
Diabe es melli us insulindependien e
ABREVIATURAS
xii
DMNID
Diabe es melli us no insulindependien e
DNA
Deoxy ibonucleic acid (Ácido desoxi ibonucleico)
DNAJC3
DnaJ hea shock p o ein amily (Hsp40) membe C3
(Miemb o C3 de la amilia de p o eínas de DNA de choque é mico)
DSH
Dishe elled
EBs
Emb yoid bodies (Cue pos emb iona ios)
EDC
1-E hyl-3-[3-dime hylaminop opyl]ca bodiimide hyd ochlo ide
(1-e il-3-(3-dime ilaminop opil) hid oclo u o de ca bodiimida)
EDG
Endo helial di e en ia ion gene (Gen de di e enciación endo elial)
ESCC
Emb yonic s em cell-cicle (Ciclo celula de células oncales)
EVP
En e medad ascula pe i é ica
FBS
Fe al bo ine se um (Sue o e al bo ino)
FDA
Food and d ug adminis a ion (Agencia de alimen os y medicamen os)
FED
Fede ación española de diabe es
FGF
Fib oblas g ow h ac o (Fac o de c ecimien o ib oblás ico)
FID
Fede ación in e nacional de diabe es
FLK1
Fe al Li e Kinase 1 (Quinasa 1 de hígado e al)
FOXA2
Fo khead box A2
FRZ
F izzled
GCG
Glucagon
GCNT2
Glucosaminyl (N-ace yl) ans e ase 2, I-b anching enzyme
GDFs
G ow h di e en ia ion ac o s (Fac o es de c ecimien o y di e enciación)
GFF
Glass ibe il e (Fil o de ib a de id io)
GLUT2
Solu e ca ie amily 2 membe 2 (Miemb o 2 de la amilia de anspo ado es de solu o)
GSC
Goosecoid
GSIS
Glucose-s imula ed insulin sec e ion (Sec eción de insulina es imulada po glucosa)
GSK3β
Glycogen syn hase kinase 3 be a (Glucógeno sin asa quinasa-3 be a)
HbA1c
Hemoglobina glicosilada
HGF
Hepa ocy e g ow h ac o (Fac o de c ecimien o de hepa oci os)
hiPSC
Human induced plu ipo en s em cells (Células oncales plu ipo en es inducidas
humanas)
HLA
Human Leukocy e An igen (An ígenos leucoci a ios humanos)
HMG
High-Mobili y G oup (G upo de al a mo ilidad)
HNF1β
HNF1 homeobox B
HNF4α
Hepa ocy e nuclea ac o 4 alpha (Fac o de hepa oci o nuclea 4 al a)
h bFGF
Recombinan human basic ib oblas g ow h ac o (Fac o de c ecimien o ib oblás ico
básico humano ecombinan e)
IAPP
Isle amyloid polypep ide (Polipép ido amieloide de los islo es)
ICAs
Isle cell an ibodies (An icue pos An iislo es Panc eá icos)
IF
Inmuno luo escencia
IFG
Impai ed as ing glycemia (Glicemia al e ada en ayunas)
IGF1R
Insulin-Like G ow h Fac o 1 Recep o (Recep o del ac o de c ecimien o simila a la
insulin ipo 1)
IGT
Impai ed glucose ole ance (In ole ancia a la glucosa)
IND
In e na ional nomencla u e o diseases (Nomencla u a in e nacional de en e medades)
INS
Insulina
INS-I
Insulina-I
INSIG1
Insulin induced gene 1 (Gen 1 inducido po insulina)
ABREVIATURAS
xiii
IRS2
Insulin ecep o subs a e 2 (Recep o de sus a o de insulina 2)
ISH
In si u hyb idiza ion (Hib idación in si u)
ISL1
ISL LIM homeobox 1
ITS
Insulina-T ans e ina-Selenio
JAZF1
JAZF zinc inge 1
LEF
Lymphoid enhance -binding ac o (Fac o po enciado lin oide)
LIF
Leukemia inhibi o y ac o (Fac o inhibi o io de leucemia)
lncRNA
Long non-coding RNA (RNA la go no codi ican e)
MAFA
MAF bZIP ansc ip ion ac o A (Fac o de ansc ipción A MAF bZIP)
MAP4K4
Mi ogen-ac i a ed p o ein kinase 4 (P o eína quinasa ac i ada po mi ógenos ipo 4)
MCI
Masa Celula In e na
MCL1
Myeloid cell leukemia 1 (Célula de leucemia mieloide ipo 1)
MCT1
Solu e ca ie amily 16 membe 1 (Miemb o 1 de la amilia 16 de anspo ado es de
monoca boxila o)
MEC
Ma iz ex acelula
miRISC
miRNA-induced silencing complex (Complejo de silenciamien o inducido po miRNA)
miRNAs
mic oRNAs
MIST1
Basic helix-loop-helix amily, membe a15 (Miemb o a15 de la amilia hélice-bucle-hélice
básica)
M-MLV RT
Moloney mu ine leukemia Vi us e e se ansc ip ase (T ansc ip asa in e sa del i us de
la leucemia mu ina Moloney)
MODY
Ma u i y-onse diabe es o he young (Diabe es del adul o de inicio en la ju en ud)
mRNA
Ácido ibonucleico mensaje o
mTOR
Mammalian a ge o apamycin (Diana de apamicina en mamí e o)
MTPN
Myo ophin (Mio o ina)
NB
Técnica de No he n Blo ing
ncRNA
Non-codgin RNA (RNA no codi ican e)
NDDG
Na ional Diabe es Da a G oup (G upo nacional de da os de diabe es)
NEUROD1
Neu ogenic Di e en ia ion Fac o (Fac o de di e enciación neu ogénico)
NEUROG3
Neu ogenin 3 (Neu ogenina 3)
NFκβ
Nuclea ac o kappa-B (Fac o nuclea kappa-B)
NKX2.2
NK2 homeobox 2
NKX6.1
NK6 homeobox 1
OC-2
One cu homeobox 2
OCT4
Oc ame -binding ansc ip ion ac o 4 (Fac o de ansc ipción-4 de unión a oc áme o)
OMS
O ganización mundial de la salud
ORF
Open eading ame (Ma co de lec u a abie o)
PAK6
p21 (RAC1) ac i a ed kinase 6 (Quinada ac i ada po p21 ipo 6)
PAX4
Pai ed box 4 (Caja empa ejada de genes-4)
PAX6
Pai ed box 6 (Caja empa ejada de genes-6)
pb
Pa es de bases
PBS
Phospha e bu e ed saline (Tampón os a o salino)
PCR
Polyme ase chain eac ion (Reacción en Cadena de la Polime asa)
PDFG
Pla ele -de i ed g ow h ac o (Fac o de c ecimien o de i ado de plaque as)
PDK1
Py u a e dehyd ogenase kinase-1 (Quinasa dependien e de os oinosi ol-1)
PDX1
Panc ea ic and duodenal homeobox 1 (Fac o homebox ipo 1 panc eá ico y duodenal)
PGCs
P imo dial ge m cells (Células ge minales p imo diales)
PI3K
Phospha idylinosi ol 3-kinase (Fos oinosi ol 3-quinasa)
INTRODUCCIÓN
4
complicaciones simila es a la go plazo (cegue a, allo enal, ampu ación del pie
diabé ico, e c.) (So di e al., 2008). Las limi aciones del a amien o ac ual de la
diabe es han es imulado la búsqueda de e apias que pe mi an es au a la masa celula
be a pe dida pa a consegui alcanza la no moglucemia. El asplan e alógenico de
islo es panc eá icos p oceden es de donan es cadá e po el p o ocolo de Edmon on
(Shapi o e al., 2006) ha demos ado que la e apia celula unciona, de o ma que el
asplan e de células p oduc o as de insulina a pacien es diabé icos no maliza la
glucemia en e 1 y 5 años. Sin emba go, es e a amien o iene unas limi aciones como
son la ca encia de su icien es donan es y la necesidad de inmunosup esión (Su he land
e al., 2001; Shapi o e al., 2006).
La di e enciación de las células plu ipo en es hacia células p oduc o as de insulina
pe mi i ía dispone de una uen e inago able de células. Po lo an o, se á undamen al
consegui un aumen o en la e icacia y e iciencia del p oceso de di e enciación de células
plu ipo en es hacia células p oduc o as de insulina, jun o con la mejo a del p oceso y su
uso en modelos animales. Las células oncales emb iona ias (CTEs) mu inas pueden
di e encia se hacia células p oduc o as de insulina (León-Quin o e al., 2004; So ia e al.,
2000). Es udios pos e io es han demos ado que el p o ocolo de di e enciación in i o
puede op imiza se (Vaca e al., 2006) e incluso aplica se a células oncales
emb iona ias humanas (D’Amou e al., 2005, 2006; Rezania e al., 2014; Pagliuca e al.,
2014; Pezzolla e al., 2015). Sin emba go, los mé odos disponibles has a el momen o
p esen an a ios incon enien es como son un bajo endimien o, una di ícil
ep oducibilidad y baja e icacia con la gene ación de células con un eno ipo inmadu o.
Los p ocedimien os desc i os con las CTEs ienen una e icacia y una e iciencia bajas, es
un p ocedimien o poco e icaz po que el eno ipo al que se llega no es el de una célula
be a panc eá ica madu a y es poco e icien e po que el endimien o en é minos de
biomasa es bajo.

INTRODUCCIÓN
5
1.2. Diabe es Melli us
El e mino diabe es desc ibe un as o no me abólico de e iología múl iple
ca ac e izado po hipe glucemia c ónica con al e aciones del me abolismo de
ca bohid a os, g asas y p o eínas como consecuencia de de ec os en la sec eción de
insulina, la acción de la insulina o ambos. Los e ec os de la diabe es incluyen daños a
la go plazo que p oducen la dis unción e insu iciencia de a ios ó ganos y puede
p esen a se con sín omas ca ac e ís icos como sed, poliu ia, dis o sión de la isión y
pé dida de peso, pudiendo desa olla en sus o mas más se e as, ce oacidosis o un
es ado hipe osmola no ce ónico y da luga a es upo , coma y en ausencia de
a amien o e icaz, la mue e. A menudo los sín omas no son g a es o pueden es a
ausen es y po consiguien e el g ado de hipe glucemia su icien e pa a ocasiona
cambios pa ológicos y uncionales puede es a p esen e du an e un la go iempo an es
de ealiza se el diagnós ico. Los e ec os a la go plazo de la diabe es, incluyen el
desa ollo p og esi o de complicaciones especi icas mic o ascula es (lesiones de los
asos sanguíneos pequeños) y mac o ascula es (lesiones de asos sanguíneos más
g andes). Va ios p ocesos pa ogénicos es án implicados en el desa ollo de diabe es,
es o incluye p ocesos los cuales des uyen las células be a panc eá icas del pánc eas
con la consiguien e insu iciencia de insulina. Las anomalías en ca bohid a os, g asas y el
me abolismo de p o eínas se deben a la acción de icien e de la insulina en los ejidos
diana esul an e po la disminución en la sensibilidad y/o al a de insulina.
1.2.1. Clasi icación de la diabe es
La p ime a clasi icación ampliamen e acep ada de la diabe es ue publicado po la
O ganización Mundial de la Salud (OMS) en 1979 (Na ional Diabe es Da a G oup, 1979).
El Comi é de Expe os p opuso en onces como clases p incipales de diabe es la Diabe es
melli us insulindependien e (DMID) y Diabe es melli us no insulindependien e (DMNID),
que se ía modi icada pos e io men e en 1985 (WHO S udy G oup, 1985) como ipo 1 y
ipo 2, espec i amen e. O os ipos como la in ole ancia a la glucosa (IGT) o la diabe es
INTRODUCCIÓN
6
melli us ges acional (DMG) ue on e lejados en la pos e io Nomencla u a
In e nacional de En e medades (IND) en 1991 y en la décima e isión de la Clasi icación
In e nacional de En e medades (CIE-10) en 1992. En 1997 (Expe Commi ee on he
Diagnosis and Classi ica ion o Diabe es Melli us, 2003), los c i e ios de clasi icación y
diagnós ico de la diabe es elabo ados po el G upo Nacional de Da os de Diabe es
(NDDG) y ecomendados po la OMS, han sido e isados po el Comi é de Expe os pa a
el diagnós ico y clasi icación de la diabe es de la Asociación Ame icana de Diabe es
(ADA), con el obje i o de plan ea una nue a clasi icación, dejando de lado el c i e io
e apéu ico y eniendo en cuen a la e iología de la en e medad.
La clasi icación p e ia ag upaba bajo el é mino diabe es, aquellas al e aciones que
di ie en en su pa ogénesis, e olución na u al, espues a e apéu ica y p e ención. A
es o se ag egan dis in os ac o es gené icos y del medio ambien e que conducen a
o mas de diabe es que pa ecen eno ípicamen e simila es pe o que pueden ene
e iologías dis in as. Se incluyen 4 ca ego ías y un g upo adicional de indi iduos que
ienen glucemias ano males con al o iesgo de desa olla diabe es (Expe Commi ee
on he Diagnosis and Classi ica ion o Diabe es Melli us, 2003), de o ma que los
p incipales ipos de diabe es se án los siguien es:
 Diabe es Melli us Tipo 1:
La diabe es ipo 1 ( ambién llamada insulinodependien e, ju enil o de inicio en la
in ancia), se ca ac e iza po una des ucción de las células be a panc eá icas,
de iciencia absolu a de insulina, endencia a la ce oacidosis y equie e la
adminis ación dia ia de insulina. Se desconoce aún la causa de la diabe es ipo 1
y no se puede cu a con el conocimien o ac ual. Se pueden dis ingui 2 sub-
g upos:
o Au oinmune: Es a o ma de diabe es, p e iamen e conocida po los é minos
diabe es dependien e de insulina, diabe es ipo 1 o diabe es ju enil, esul a
de una des ucción au oinmune de las células be a panc eá icas (A kinson y
INTRODUCCIÓN
7
Macla en, 1994), p o ocando que la sec eción de insulina e mine siendo
mínima o nula; se p esen a en gene al du an e la p ime a in ancia y la
adolescencia, aunque su apa ición puede ocu i a cualquie edad. La
p edisposición gené ica es múl iple y además se elaciona con ac o es
ambien ales aún no o almen e de inidos.
o Idiopá ica: Se e ie e a las o mas de e iología desconocida de mínima
p e alencia. Algunos de es os pacien es ienen insulinopenia pe manen e y
son p opensos a la ce oacidosis, pe o no hay e idencia de au oinmunidad. La
p e alencia de es e ipo de pacien e es muy baja, siendo la mayo ía de o igen
a icano o asiá ico. Es a o ma de diabe es iene una impo an e ca ga
he edi a ia y ca ece de e idencia inmunológica pa a la au oinmunidad de las
células be a panc eá icas (Bane ji y Lebo i z, 1989).
 Diabe es Melli us Tipo 2:
La diabe es ipo 2 ( ambién llamada no dependien e de la insulina o diabe es del
adul o), es un é mino que se u iliza pa a las pe sonas que ienen esis encia a la
insulina y po lo gene al ienen una ela i a de iciencia en la sín esis de insulina
(Rea en e al., 1976; Ole sky e al., 1982; DeF onzo e al., 1979; Tu ne e al.,
1979), ep esen ando ap oximadamen e un 90-95% de odos los pacien es
diabé icos (Ame ican Diabe es Associa ion, 2015). Al menos inicialmen e y con
ecuencia du an e oda su ida, es os pacien es no necesi an a amien o con
insulina pa a sob e i i . P obablemen e hay nume osas causas de es a o ma de
diabe es y es p obable que la p opo ción de pacien es en es a ca ego ía
disminuya en el u u o con la iden i icación de los p ocesos pa ogénicos
especí icos y de ec os gené icos causan es.
Aunque no se conocen las causas especí icas de la diabe es ipo 2, la des ucción
au oinmune de las células be a panc eá icas no se p oduce. La mayo ía de los
pacien es son obesos, po lo que la obesidad en sí p o oca un cie o g ado de
esis encia a la insulina (Kol e man e al., 1981; Boga dus e al., 1985) o bien
INTRODUCCIÓN
8
p esen an una acumulación de g asa co po al en la egión abdominal sin llega a
se obesos (Kissebah y Pei is, 1989; Bu kiewicz e al., 1995; Bane ji e al., 1994;
Umpie ez e al., 1995). Es a o ma de diabe es cu sa con ecuencia sin
diagnos ica du an e muchos años debido a que la hipe glucemia se desa olla
g adualmen e, no p esen ando la su icien e g a edad en e apas an e io es como
pa a que el pacien e obse e cualquie a de los sín omas clásicos de la diabe es
(Ha is; Zimme , 1992; Fujimo o e al., 1987). Sin emba go, es os pacien es ienen
un mayo iesgo de desa olla complicaciones mac o ascula es y
mic o ascula es (Fujimo o e al., 1987; Moss e al., 1994; Kuusis o e al., 1994;
Ande sson y S ä dsudd, 1995; Uusi upa e al., 1993). La sec eción de insulina es
de ec uosa en es os pacien es e insu icien e pa a compensa la esis encia a la
insulina. Es a puede mejo a con la educción del peso y/o a amien o
a macológico de la hipe glucemia, pe o a a ez pod á es au a se la no malidad
(Sca le e al.; Fi h e al., 1986; Simonson e al., 1984; Hen y e al., 1986; Wing
e al., 1994).
El iesgo de desa olla es e ipo de diabe es aumen a con la edad, la obesidad y
la al a de ac i idad ísica (Zimme , 1992); además con ecuencia se asocia con
una ue e p edisposición gené ica, incluso en mayo magni ud que la o ma
au oinmune de la diabe es ipo 1 (Newman e al., 1987; Ba ne e al., 1981). Sin
emba go, la gené ica de es a o ma de diabe es es compleja y no es á de inida
o almen e.
 Diabe es Melli us Ges acional (DMG):
Du an e muchos años, la DMG se de inió como cualquie g ado de in ole ancia a
la glucosa con el inicio o p ime econocimien o du an e el emba azo (Expe
Commi ee on he Diagnosis and Classi ica ion o Diabe es Melli us, 2003),
independien emen e de si la condición puede habe p ecedido al emba azo o
comenzado de o ma concomi an e con es e (Me zge , 1991). Es a de inición
acili ó una es a egia uni o me pa a la de ección y clasi icación de DMG, pe o se
INTRODUCCIÓN
9
io limi ada po la imp ecisión. Po ello, las muje es con diabe es en el p ime
imes e se án clasi icados como diabe es ipo 2, mien as que se conside a
DMG aquella diagnos icada en el segundo o e ce imes e del emba azo que
no es cla amen e diabe es mani ies a. En cualquie caso, unas 6 semanas o más
después de que e mine el emba azo, la diabe es de la muje debe se
eclasi icada de modo que pod ía diagnos ica se una glicemia al e ada en ayunas
(IFG) o in ole ancia a la glucosa (IGT), las cuales no deben se is as como
en idades clínicas, pe o cons i uyen ac o es de iesgo pa a el desa ollo de la
diabe es. En la mayo ía de los casos de DMG, la egulación de la glucosa ol e á a
la no malidad después del pa o.
 O os ipos Especí icos:
Según la ADA, en un pequeño po cen aje de los casos la diabe es puede ocu i
en pe sonas con cie os desó denes o condiciones, como son los siguien es:
o Al e aciones gené icas: Va ias o mas de diabe es es án asociados con
de ec os monogené icos en la unción de las células be a panc eá icas
(Vaxillai e y F oguel, 2008). Es as o mas de diabe es se ca ac e izan
ecuen emen e po la apa ición de hipe glucemia en una edad emp ana y
se ca ac e izan po la sec eción de insulina al e ada e incluyen la diabe es
melli us neona al o diabe es monogénica de la p ime a in ancia, la diabe es
del adul o de inicio ju enil (MODY), sínd omes asociados con esis encia
ex ema a la insulina y o os sínd omes poco ecuen es en los que la
diabe es es una más de una pléyade de mani es aciones, como el sínd ome
de Wolco -Rallison o el sínd ome de Wol am (Vaxillai e e al., 2009; U ano,
2016).
o Endoc inopa ías: Va ias ho monas (ho mona del c ecimien o, co isol,
glucagón o epine ina) an agonizan con la acción de la insulina. Las
can idades excesi as de es as ho monas (ac omegalia, sínd ome de Cushing,
glucagonoma o eoc omoci oma), pueden causa diabe es (Jad esic e al.,

INTRODUCCIÓN
10
1982; S ens öm e al., 1988). Es o ocu e gene almen e en indi iduos con
de ec os p eexis en es en la sec eción de insulina y la hipe glucemia se
esuel e no malmen e cuando se e i a el exceso de la ho mona.
o En e medades panc eá icas: Cualquie p oceso adqui ido que daña de o ma
di usa al pánc eas puede causa diabe es como pueden se la panc ea i is,
auma, in ección, panc ea ec omía y el ca cinoma de pánc eas (Ce sosimo
e al., 1991; La sen e al., 1987).
o Diabe es inducida po d ogas o químicos: Muchos medicamen os pueden
a ec a la sec eción de insulina. Es os medicamen os no pueden causa la
diabe es po sí mismos, pe o pueden p ecipi a la apa ición de diabe es en
pe sonas con esis encia a la insulina (Pandi e al., 1993; O’By ne y Feely,
1990; Izzedine e al., 2005).
o In ecciones: Cie os i us se han asociado con la des ucción de células be a
panc eá icas. La diabe es se p oduce en pacien es con ubéola congéni a
(Fo es e al., 1971), aunque la mayo ía de es os pacien es ienen an ígenos
leucoci a ios humanos (HLA) y ma cado es inmunológicos ca ac e ís icos de
la diabe es ipo 1. Además, las in ecciones ocasionadas po o os i us como
son ci omegalo i us, adeno i us, Coxsackie B y mixo i us han sido implicados
en la inducción en cie os casos de la en e medad (King e al., 1983;
Ka jalainen e al., 1988; Pak e al., 1988) .
1.2.2. P e alencia y diagnós ico
Los c i e ios diagnós icos pa a la diabe es se han modi icado a pa i de los p e iamen e
ecomendados po el Comi é de Expe os del NDDG (Expe Commi ee on he Diagnosis
and Classi ica ion o Diabe es Melli us, 2003) o el g upo de es udio de la OMS (WHO
S udy G oup, 1985). Las mismas p uebas se u ilizan an o pa a la p edicción como el
diagnós ico de la diabe es y puede se iden i icada en cualquie luga a lo la go del
espec o de escena ios clínicos posibles, ya sea en indi iduos apa en emen e en bajo
INTRODUCCIÓN
11
iesgo, en pacien es sin omá icos y en indi iduos de al o iesgo con sospechas de
diabe es. Las mismas p uebas ambién pueden de ec a indi iduos con p ediabe es, un
as o no en que el ni el de la glucosa en la sang e es mayo de lo no mal pe o no lo
su icien emen e al o como pa a diagnos ica diabe es, pe o signi ica que se encuen a
en iesgo de desa olla la. Exis en a ios mé odos pa a diagnos ica la diabe es y cada
uno debe se con i mado pos e io men e po cualquie a de los mé odos dados, los
cuales es án esumidos en la siguien e Tabla 1:
P ueba
Desc ipción
Diabe es
P ediabe es
Hemoglobina glucosilada
(A1C)
P omedio de glucosa en la sang e
du an e los úl imos 2-3 meses
≥ 6,5 %.
5,7%–6,4 %.
Glucosa plasmá ica ayunas
(PGA)
Ni el glucosa en sang e en ayuno
≥ 126mg/dl
100–125 mg/dl
Tole ancia glucosa o al
(PTOG)
Ni el glucosa en sang e an es y
después de la inges a de una
solución glucosada (75 g )
≥ 200 mg/dl
140–199 mg/dl
P ueba Alea o ia glucosa o al
Análisis de sang e en cualquie
momen o del día
≥ 200 mg/dl
TABLA 1. C i e ios de diagnós ico y p edicción de la diabe es.
En 2014 la OMS in o ma que la ca ga de mo bilidad de la diabe es es á aumen ando en
odo el mundo y en pa icula en los países en desa ollo. Las causas son complejas,
pe o en g an pa e es án elacionadas con el ápido aumen o del sob epeso, la obesidad
y la inac i idad ísica. La FID ha dado a conoce , du an e la celeb ación del Cong eso
Mundial de la Diabe es en Vancou e , los da os de su A las de la Diabe es sép ima
edición (2015), que cons i uye la uen e ac edi ada de in o mación sob e la p e alencia
global y egional de la diabe es, así como del gas o y la mo alidad asociados. En es e se
egis a que en el mundo hay más de 415 millones de pe sonas con diabe es y pa a
2040 se p e é que es a ci a aumen e a 642 millones, además se calcula que las mue es
po diabe es aumen a án más de un 50% en los p óximos 10 años al y como se e leja
en la Figu a 1. Ac ualmen e, la diabe es se ha con e ido en una de las causas
INTRODUCCIÓN
12
p incipales de en e medad y mue e p ema u a en la mayo ía de los países, sob e odo
debido al aumen o del iesgo de en e medades ca dio ascula es (50%-80% de las
mue es de pacien es diabé icos se deben a causas ca dio ascula es) y se p e é que la
diabe es se con ie a en el año 2030 en la sép ima causa mundial de mue e. Además,
la diabe es es una causa impo an e de cegue a, ampu ación e insu iciencia enal.
FIGURA 1. Rep esen ación de la dis ibución geog á ica de pe sonas a ec adas po diabe es, indicando el núme o
de pe sonas con diabe es a ni el mundial po egión en 2015 y la es imación en 2040. Imagen modi icada del
A las de Diabe es de la FID. Sép ima edición, 2015.
El es udio [email p o ec ed] ealizado desde el CIBERDEM del Ins i u o de Salud Ca los III
(Minis e io de Ciencia e Inno ación) en colabo ación con la SED y la FED (So igue e al.,
2012), si uó la p e alencia de la diabe es en España en o no al 13,8% de la población,
un po cen aje lige amen e supe io a los es udios ealizados an e io men e en España.
La diabe es se ha con e ido en uno de los p oblemas sani a ios más g a es de nues o
INTRODUCCIÓN
13
iempo, los esul ados del es udio ambién con i man la asociación en e diabe es,
obesidad e hipe ensión a e ial y la impo ancia de la ac i idad ísica como mé odo de
p e ención.
1.2.3. T a amien o de la diabe es
La e a de la insulino e apia o e apia insulínica de la diabe es se inició en 1922, cuando
los p o eso es F ede ick G an Ban ing, Cha les He be Bes , Jon James Richa d
Macleod y Jame Be am Collip, abajando en la uni e sidad de To on o, ue on
capaces de aisla y pu i ica la insulina (Rosen eld, 2002; Maclean, 1926), lo cual
p opo cionó a la ciencia médica uno de los más impo an es medios de p olonga la ida
humana y cons i uyó un hi o en la his o ia del a amien o de la a al en e medad. Po
p ime a ez en la his o ia, el a amien o impidió la ce oacidosis y mue e pe mi iendo a
los pacien es con diabe es i i du an e décadas con la en e medad. La capacidad de
es a e apia de p e eni la mue e y p opo ciona una ida casi no mal a los pacien es
pa ecía milag osa y los muchos p oblemas asociadas al a amien o insulínico e an
p e e ibles a la al e na i a de una mue e segu a. Sin emba go, el conocimien o de es as
complicaciones ajo consigo la necesidad de una e apia más so is icada.
Desde en onces, las p epa aciones de insulina y las es a egias e apéu icas han ido
desa ollándose inicialmen e a expensas del o igen de la insulina y pos e io men e con
la inco po ación de sus ancias que modi icaban su abso ción. Ya en la década de los 90
su gie on en onces los análogos de la insulina, con una especial capacidad de cambio en
su a macociné ica. Más adelan e se in oduje on nue as o mas de libe ación a la
insulina inyec able con je inguilla o pluma, como son las bombas de in usión con inua y
la insulina inhalada, odo es o apoyado po nue os sis emas de moni o ización de la
glucosa. En la úl ima década, el asplan e de islo es panc eá icos y la e apia celula con
la ob ención de células p oduc o as de insulina a pa i de células oncales
plu ipo en es aumen an las expec a i as, en la Tabla 2 se esumen los p incipales
INTRODUCCIÓN
20
FIGURA 2. Una sección ans e sal del pánc eas mues a los islo es de Lange hans, que es la unidad uncional del
pánc eas endoc ino, cons i uido po di e en es g upos celula es como son las células be a panc eá icas,
sin e izan y sec e an insulina; células al a, sec e an glucagón, que aumen a la concen ación de azúca en la
sang e; células del a, sec e an la ho mona inhibido a del c ecimien o soma os a ina, que inhibe la sec eción de
la insulina y el glucagón; células epsilon, sec e an g elina y células PP, sec e an el polipép ido panc eá ico, el
cual in luye en la sec eción de enzimas in es inales y gás icas, inhibe los mo imien os en el in es ino y ac úa
como neu o ansmiso .
1.3.1. Desa ollo endodé mico: O igen del pánc eas
Una de las p ime as decisiones en el des ino celula ealizada du an e la emb iogénesis
de e eb ados es la sepa ación de las 3 capas ge minales clásicas: ec ode mo,
mesode mo y endode mo. El endode mo, el cual p ime o o ma la pa e ex e na del

INTRODUCCIÓN
21
emb ión pa a más a de in e naliza se, da á luga al sis ema espi a o io y diges i o, y
sus ó ganos asociados, como son el hígado, pánc eas, pulmones, in es ino o es ómago.
Al endode mo emb iona io se le a ibuyen 2 unciones p incipales; la p ime a unción es
induci la o mación de a ios ó ganos mesodé micos como son el co azón, los asos
sanguíneos e incluso la capa ge mina i a mesodé mica; la segunda unción del
endode mo emb iona io es cons ui el e es imien o de 2 ubos en el in e io del
cue po de los e eb ados, uno de ellos se o ma como una e aginación del ubo
diges i o que inalmen e se bi u ca, o iginando los pulmones y el o o que se ex iende a
lo la go de la longi ud co po al o igina el ubo diges i o y o ma á a pa i de sus
esbozos el hígado, esícula bilia , pánc eas y ó ganos acceso ios que se desa ollan
inmedia amen e caudal al es ómago.
El pánc eas se desa olla a pa i de la usión de los p imo dios do sal y en al
endodé micos p oceden es de la pa e caudal del in es ino an e io , los cuales se
ap oximan al c ece y inalmen e se usionan du an e la o ación del es ómago e
in es ino. El b o e endodé mico do sal o ma á la mayo pa e del pánc eas (cabeza,
cue po y cola) y el b o e en al desa olla á la apó isis uncinada y pa e duodenal de la
cabeza del pánc eas (Mas suma a y England, 1996).
La o mación del pánc eas puede se la o a ca a de la o mación del hígado, de o ma
que mien as las células del co azón p omue en y la no oco da impide la o mación del
hígado, la no oco da puede p omo e ac i amen e la o mación del pánc eas y el
co azón bloquea la. Du an e la o mación del endode mo se ha pos ulado la hipó esis
de que la exp esión de PDX1 le o o ga a una egión pa icula del ubo diges i o la
capacidad pa a llega a se pánc eas o hígado (Song e al., 1999) como se obse a en la
Figu a 3A. Po an o, un g upo de condiciones como son la p esencia de no oco da y
ausencia de co azón, lle a a la o mación de pánc eas (Kim e al., 1997). La no oco da
ac i a el desa ollo del pánc eas al ep imi la exp esión de la ía de señalización Sonic
hedgehog (Shh) en el endode mo (Heb ok e al., 1998), el cual es exp esado en odo el
INTRODUCCIÓN
22
endode mo del ubo diges i o, excep o en la egión que o ma á el pánc eas. La
no oco da en es a egión del emb ión sec e a ac i ina y el ac o de c ecimien o
ib oblás ico básico (bFGF), que son capaces de egula la exp esión de la ía de
señalización Shh en el endode mo. El desa ollo panc eá ico es iniciado en aquellas
localizaciones donde el endode mo del in es ino an e io con ac a al endo elio de los
asos sanguíneos p incipales. Po an o, la asociación de ejidos panc eá icos con asos
sanguíneos es c í ica en la o mación de células endoc inas y exoc inas del pánc eas
como obse amos en la siguien e Figu a 3B.
FIGURA 3. A) Se obse a el inicio del desa ollo panc eá ico como dos e aginaciones, do sal y
en al, o mándose sob e la u u a egión duodenal del in es ino p imi i o. El PDX1 ( e de) es
exp esado do sal y en almen e, mien as que su exp esión es baja en el ubo p imi i o del
in es ino, que se ex iende has a el es ómago pos e io . Las células p oduc o as de glucagón ( ojo)
comienzan a o ma se en la aíz do sal, células simila es du an e las siguien es ho as ambién
empiezan a di e encia se en la aíz en al. La di e enciación endoc ina en las egiones adyacen es
(es ómago e in es ino) no se inicia has a ap oximadamen e 5 días más a de (Madsen e al., 2001).
B) Islo es panc eá icos ( ojo) y asos sanguíneos ( e de), que mues an como la e ascula ización
induce una ue e p oli e ación de células de los islo es panc eá icos (Joana Almaça e al., 2014).
Ba a de escala =97,63 µm.
1.3.2. Pa ones de exp esión génica que egulan el
desa ollo del pánc eas
Los ac o es de ansc ipción cons i uyen una clase de p o eínas capaces de egula la
exp esión de nume osos genes, pa a ejecu a un de e minado p og ama celula .
INTRODUCCIÓN
23
Múl iples ac o es de ansc ipción in e ienen en el desa ollo panc eá ico y
cons i uyen una compleja e in incada ed egulado a que han sido esumidos en la
Figu a 4A. Una ez se ha es ablecido el endode mo, a ios ac o es de ansc ipción son
esenciales pa a el es ablecimien o y p oli e ación de las células p ogeni o as
panc eá icas que incluye a ios genes ipo HNF como son HNF1β (TCF2), HNF1α (TCF1),
HNF4, HNF6 (OC-2) o HNF3β (FOXA2) (Bo e al., 2004; G apin-Bo on e al., 2001;
Jacquemin e al., 2003; Haumai e e al., 2005; Du o e al., 1998; Poll e al., 2006; Yang
e al., 2016), es e úl imo es un gen egulado cla e en el desa ollo endodé mico y
pa icipa en la exp esión génica especí ica en pulmón, hígado y pánc eas adul os (Gao
e al., 2008; Lee e al., 2002). Es os ac o es pa ece que coope an con un egulado cla e
del desa ollo panc eá ico como es PDX1, eque ido pa a la o mación del pánc eas, su
exp esión comienza en células epi eliales de la egión do sal y en al panc eá ica,
p esen ando una cla a he e ogeneidad de o ma que educe su exp esión g adualmen e
con la di e enciación exoc ina y es á implicado en a ios aspec os de la unción de
células be a panc eá icas adul as (Jennings e al., 2013; She wood e al., 2009; Fuji ani
e al., 2006; O ield e al., 1996). Du an e el desa ollo panc eá ico PDX1 p o oca la
o mación del esbozo desde el epi elio del ubo diges i o; ep ime la exp esión de genes
que son ca ac e ís icos de o as egiones del ubo diges i o (Teo e al., 2015); man iene
la ep esión de la ía de señalización Shh; inicia aunque no comple a la di e enciación
celula de los islo es panc eá icos y es necesa io pa a la exp esión de la insulina (G apin-
Bo on e al., 2001). En los emb iones humanos, la obus a de ección de PDX1 ue
acompañada inicialmen e po una débil exp esión de SOX9 en el endode mo
panc eá ico, necesa io pa a el man enimien o de poblaciones p ogeni o as
mul ipo en es (Pan y W igh , 2011; Cano e al., 2014; Jennings e al., 2013), que
ambién exp esan SOX17 necesa io pa a la o mación del endode mo (Spence e al.,
2009) y ac o es Ga a (GATA4 y GATA6) eque idos al menos pa cialmen e pa a una
ap opiada exp esión de PDX1 (Ca asco e al., 2012; Cano e al., 2014).
INTRODUCCIÓN
24
La de e minación panc eá ica no es un es ado pe manen e, end á luga una
especi icación de compa imen os más especializados del endode mo donde las células
adquie en su des ino e minal especializado con el iempo y su especialización implica
una mayo pa icipación de egulado es in ínsecos de la célula. Las p ime as células
endoc inas que apa ecen en el pánc eas son las células be a, seguidas del es o de ipos
celula es de los islo es panc eá icos (Pipe e al., 2004; Ly le e al., 2008; Riedel e al.,
2012; Jennings e al., 2013). Coinciden e con la pé dida de SOX9, el comp omiso
endoc ino en las células epi eliales panc eá icas se inicia con la exp esión de NEUROG3
(G adwohl e al., 2000; Ly le e al., 2008; Jennings e al., 2013), que p ecede a la
inducción de los ac o es de ansc ipción ISL1, NEUROD1, MAFA/B, NKX2.2, NKX6.1 y
PAX6 implicados en la madu ación celula endoc ina (Jeon e al., 2009). Con el uso de un
sis ema inducible C e-Lox pa a ma ca las células de la p ogenie que exp esan NEUROG3
o PDX1 (Gu e al., 2002), se demos ó que las células que es án exp esando NEUROG3
son especí icamen e p ogeni o as de células de los islo es panc eá icos, mien as que
las células que es án exp esando PDX1 dan o igen a los 3 ipos de ejido panc eá ico
(exoc ino, endoc ino y células duc ales). Los ac o es de ansc ipción NKX6.1 y NKX2.2
cons i uyen ma cado es emp anos del epi elio panc eá ico. En los islo es panc eá icos
madu os, la exp esión de NKX6.1 es á es ingida a las células be a panc eá icas (Jensen
e al., 1996), donde se ha suge ido que ac úa como un ep eso ansc ipcional del
glucagón (Gau hie e al., 2007; Schisle e al., 2005), mien as que NKX2.2 es un
ma cado de células al a, be a y F o PP (Sussel e al., 1998). El ac o ISL1 pa ece se
necesa io pa a el desa ollo de pánc eas en humanos y a ones (Du e al., 2009; May).
En odos los ipos de células endoc inas de los islo es panc eá icos adul os se encuen a
la exp esión de NEUROD1 (Jeon e al., 2009; Jennings e al., 2013) y esul a esencial pa a
la madu ación de células be a panc eá icas (Gu e al., 2010). O o ac o como PAX6
comienza a exp esa se du an e el desa ollo panc eá ico y se man end á en las células
de islo es panc eá icos adul os (Ly le e al., 2008) y pa ece in e eni en la
di e enciación y asignación de células endoc inas (Sande e al., 1997; Ahlq is e al.,
INTRODUCCIÓN
25
2012). Po úl imo, MAFA iene una exp esión ela i amen e a día en el desa ollo (Dai
e al., 2012), asociándose como un ma cado de madu ación c ucial pa a la espues a de
células be a panc eá icas a la glucosa a a és de la egulación de INS y GLUT2 (Hang y
S ein, 2011).
FIGURA 4. A) esquema de los ac o es de ansc ipción que de inen los di e en es ipos celula es y
es adios de di e enciación du an e el desa ollo panc eá ico. B) Imágenes de luo escencia
ep esen a i as de las p incipales células endoc inas (células-β, células-α, células-δ y células-F o PP)
de los islo es panc eá icos, con los núcleos iden i icados con DAPI.
Las ases de desa ollo panc eá ico incluye la de e minación de los dominios
panc eá icos en el in es ino an e io en al y do sal, la o mación de los conduc os y el
c ecimien o, seguido po la di e enciación de los linajes panc eá icos, donde la
combinación de un conjun o de ac o es es de e minan e en la especi icación del ejido
y los di e en es ipos celula es (Figu a 4B), y no la simple acción de un egulado más e

INTRODUCCIÓN
26
al amen e especí ico. La iden i icación de odos es os ac o es y de e mina los iempos
adecuados de exp esión, es cla e pa a un mejo conocimien o del desa ollo
panc eá ico que nos pe mi i á mejo a los p ocesos de ob ención de células be a
panc eá icas e apéu icas que puedan se asplan adas en pacien es diabé icos.
1.4. Células oncales
1.4.1. ¿Qué es una célula oncal?
La biología de las células oncales es una de las á eas más impo an es en la
in es igación biomédica ac ual. El p ime concep o de e apia celula y medicina
egene a i a su ge ya en 1959, cuando el P o eso E. Donnall Thomas ealiza el p ime
asplan e de médula ósea con éxi o y es p emiado con el P emio Nobel de Fisiología y
Medicina. En aquellos años, nadie hablaba de células oncales y el P o eso E. Donnall
Thomas solamen e explicaba que enía que habe algún ipo celula esponsable de la
egene ación hema opoyé ica en los pacien es a ec ados con leucemia que ecibían
dicho asplan e de médula ósea (Thomas e al., 1959). Además, la emb iología y
zoología ya había demos ado con an e io idad, si bien en especies in e io es como la
salamand a o el ajolo e, la exis encia de una egene ación isula .
Según la de inición apo ada po Weissman en 2002 (Weissman, 2002) podemos de ini
a las células oncales como aquellas células que ienen la capacidad, no sólo de pode
cul i ase y ep oduci se a sí mismas, sino ambién de gene a células adul as de
di e en e p ogenie, es deci de di e en es ejidos. Las células oncales se de inen de
mane a pu amen e uncional como unidades biológicas capaces de au o- eno a se de
o ma p olongada y de gene a di e enciación a múl iples es i pes celula es (Weissman,
2000). Po an o, una célula oncal es aquella capaz de ealiza di isiones asimé icas, a
di e encia del es o de las células de un o ganismo que lo hacen exclusi amen e de
o ma simé ica (au o eno ación). El pode ealiza di isiones asimé icas, pe mi e
man ene un núme o más o menos cons an e de es as poblaciones de células oncales
INTRODUCCIÓN
27
du an e oda la ida del o ganismo e i gene ando o as células “hijas” que son las
esponsables de cons ui y man ene las es uc u as uncionales (Knoblich, 2008).
Además, una célula oncal debe posee una capacidad de mul iplicación al a y po encial
pa a gene a a ios linajes celula es (plu ipo encia), la plas icidad o po encialidad de las
células oncales es una ca ac e ís ica que indica la a iedad de ipos celula es que
pueden gene a . Pa ece cada ez más cla o que al e aciones de es e mecanismo básico
de au o eno ación se encuen an implicadas an o en enómenos genuinamen e
isiológicos como en el en ejecimien o, cánce y en muy di e sas pa ologías humanas.
FIGURA 5. P opiedades p incipales de las células oncales (au o eno ación y plu ipo encia),
ep esen ando la capacidad de las células pa a lle a a cabo un ipo de di isión asimé ica, que
pe mi e la ansición hacia dis in os ipos de células especializadas en un ejido conc e o, mien as
que se man iene la población de células oncales al o igina se ambién una célula idén ica a la
p ogeni o a.
1.4.2. Clasi icación de las células oncales
Exis en 2 g andes o mas de clasi ica las células oncales, en unción de su
po encialidad o de su o igen como se ep esen a en la Figu a 6. La clasi icación más
común de las células oncales se undamen a en la po encialidad que ienen pa a
o igina células de di e en es es i pes, lo cual es á elacionado con el g ado de
di e enciación de las células oncales. Po an o, a g andes asgos y de mane a ela i a
podemos de ini di e en es ipos de células oncales en base a su descenden e
capacidad de egene ación:
INTRODUCCIÓN
28
 Células oncales o ipo en es: células capaces de c ece y o ma un
o ganismo comple o. La célula oncal o ipo en e po excelencia es el cigo o,
o mado as la ecundación de un ó ulo po un espe ma ozoide.
 Células oncales plu ipo en es: células capaces de o ma odas las células
de los ejidos emb iona ios, aunque no son capaces de o igina un indi iduo
comple o. En las p ime as e apas del desa ollo emb iona io se o ma el
blas oci o, o mado po una g an ca idad in e io y 2 ipos celula es como son
la capa ex e na que da á luga la placen a y las en ol u as emb iona ias
( o oblas o) y la masa celula in e na (MCI) que o ma á odos los ejidos del
o ganismo. Las células de la MCI del blas ocis o son células plu ipo en es, es
deci que no pueden o ma un o ganismo comple o, pe o puede o ma
cualquie ipo de célula p o enien e de las 3 capas emb iona ias (endode mo,
mesode mo y ec ode mo), así como del linaje ge minal y/o saco i elino.
 Células oncales mul ipo en es: células más di e enciadas que sólo pueden
da ipos celula es de su p opia capa o linaje emb iona io de o igen. Una ez
desa olladas se au o- enue an du an e oda la ida del indi iduo, a
di e encia de las células oncales o ipo en es y plu ipo en es, que solo se
encuen an du an e la e apa emb iona ia.
 Células oncales unipo en es o especí icas de ejido: células que su en una
es icción en la exp esión de su genoma, desa ollando un mayo g ado de
di e enciación y p oducen ipos celula es ca ac e ís icos del ejido en el cual
se encuen an.
Desde un pun o de is a on ogénico, las células oncales pueden ob ene se de
di e en es ejidos, en e los que podemos des aca los siguien es:
 Células oncales emb iona ias (CTEs): Las CTEs sólo exis en en las p ime as ases
del desa ollo emb iona io y son capaces de p oduci cualquie ipo de célula en
el cue po. Bajo las condiciones adecuadas, es as células conse an la capacidad
INTRODUCCIÓN
29
de di idi se y hace copias de sí mismas inde inidamen e. Los cien í icos es án
empezando a comp ende cómo hace que es as células se con ie an en
cualquie a de los más de 200 ipos de células del cue po humano. Con o me
a anza el desa ollo emb iona io se o man di e en es poblaciones de células
oncales con po encialidad pa a gene a ejidos cada ez más es ingida y que
en la edad adul a se encuen an en "nichos" en algunos ejidos del o ganismo.
 Células oncales adul as (CTAs): Las CTAs, no son exclusi as del emb ión en
desa ollo, sino que es án p esen es ambién en el ejido adul o, donde son
impo an es en la homeos asis del o ganismo. Las CTAs son más limi adas y
especializadas que las CTEs, ya que pueden da o igen solo a las células p opias
de cada ejido u ó gano (células oncales unipo enciales) o se capaces de
o igina unos pocos ipos celula es (células oncales mul ipo enciales). Las
células oncales adul as ambién ienen una capacidad más limi ada pa a
eemplaza se que las células oncales emb iona ias.
FIGURA 6. Rep esen ación esquemá ica de los ipos de células oncales, que en unción del o igen
p esen a án una po encialidad con di e en e limi ación.
Las CTEs y CTAs p esen an sus en ajas y des en ajas con espec o a su po encial
aplicación en la e apia celula . Una de las p incipales di e encias en e ambas es su
INTRODUCCIÓN
36
de los p e-miRNAs. Cada miRNA en el genoma humano es capaz de silencia un
conjun o de genes diana, exis iendo en e ellos genes impo an es pa a el
desa ollo y la di e enciación (Kedde y Agami, 2008), de o ma que LIN28 puede
e e i el e ec o di e enciado de los miRNAs, egulando la ansición en e un
es ado plu ipo en e y el comp omiso a un linaje celula de e minado (Tsialikas y
Rome -Seibe , 2015).
1.5.2. Con oles ex ínsecos
A di e encia de las CTEs mu inas, un ac o ex ínseco como es el LIF no es su icien e
pa a man ene la plu ipo encia en las CTEs humanas, donde la señalización FGF y el
balance en e TGF-β (Fac o de c ecimien o ans o man e be a), ac i ina y señalización
BMP (P o eínas mo ogénicas ósea) son esenciales pa a la au o eno ación de las CTEs
humanas.
La supe amilia de ligandos TGF-β, la cual con iene unos 40 ligandos en el genoma
humano, juega el mayo papel en el man enimien o de la au o eno ación de las CTEs
humanas. A a és de la ía de señalización TGF-β/Ac i ina/Nodal, la cual implica la
ac i ación de la p o eína SMAD2/3 a a és de ecep o es Tipo I ALK4/5/7 (Quinasa
simila al ecep o de ac i ina 4/5/7). La ac i ación de la ama TGF-β/Ac i ina/Nodal a
a és de SMAD2/3 es á asociada con la plu ipo encia y es eque ida pa a el
man enimien o del es ado no di e enciado en las CTEs humanas.
En con as e a la señalización TGF-β/Ac i ina/Nodal, la cual p omue e el man enimien o
de las CTEs humanas plu ipo en es, la ía de señalización BMP es incapaz de sopo a la
au o eno ación y es á asociada con la di e enciación hacia o oblas o o endode mo
ex aemb iona io. En las CTEs humanas, la p o eína mo ogénica ósea 4 (BMP4) induce
la di e enciación hacia mesode mo y ec ode mo, mien as que la p o eína mo ogénica
ósea 2 (BMP2) p omue e la di e enciación hacia endode mo ex aemb iona io. La
ep esión de la señalización BMP en las CTEs humanas median e los ac o es nogina y

INTRODUCCIÓN
37
bFGF apoya la au o eno ación a la go plazo. El bFGF es conocido como el mejo ac o
p omo o de la au o eno ación en las CTEs humanas, median e la ac i ación de la u a
PI3K/Ak . Una ez ac i ada se p omue e la p oli e ación, supe i encia, c ecimien o y
mo ilidad celula y es á implicada ambién en la umo ogenicidad. Además, la ac i ación
de PI3K/Ak dependien e del bFGF es eque ida pa a la e icien e exp esión de p o eínas
de la ma iz ex acelula (MEC) (Xiao e al., 2006; Conley e al., 2007; Wang e al., 2005;
Xu e al., 2005).
Las p o eínas WNTs cons i uidas po un g upo de p o eínas que o man pa e del g upo
de moléculas de señalización pa a p ocesos biológicos y del desa ollo, desempeñan un
impo an e papel en el con ol del man enimien o de las CTEs. La ía de señalización
WNT es conocida po es a implicada en la egulación de la p oli e ación de las células
oncales. Los componen es de la ía de señalización WNT es án p esen es en las CTEs,
aunque los ni eles de los di e en es ecep o es a ia an en e poblaciones de células no
di e enciadas y di e enciadas. Es a ía se c ee que es capaz de es imula an o la
p oli e ación de las CTEs humanas como la di e enciación (Xiao e al., 2006; Miyabayashi
e al., 2007; Da idson e al., 2007).
Un liso os olípido bioac i o, la Es ingosina-1- os a o (S1P) ambién man iene la
au o eno ación de las CTEs humanas. La S1P ha sido implicada en di e sos p ocesos
biológicos, que incluyen c ecimien o celula , di e enciación, mig ación y apop osis en
muchos ipos celula es dis in os. Debido a que la p e ención de la apop osis es un
mecanismo de au o eno ación común, S1P po encialmen e ayuda al p oceso de
au o eno ación en las CTEs humanas. El ac o de c ecimien o de i ado de plaque as
(PDFG) ha sido implicado ambién en la p e ención de la apop osis. La combinación del
PDFG ex acelula y S1P man iene la au o eno ación de las CTEs humanas (Chase y
Fi po, 2007; Inniss y Moo e, 2006).
INTRODUCCIÓN
38
1.6. Di e enciación de las CTEs hacia células p oduc o as de
insulina
Las CTEs exhiben como acabamos de expone , una se ie de ías de señalización
implicadas en la au o eno ación y plu ipo encia que son in e dependien es y mues an
una se ie de mecanismos elacionados. Desci a es as ías es esencial pa a la
gene ación de me odologías mejo adas pa a el man enimien o y la p oli e ación de las
CTEs plu ipo en es in i o, que jun o con la comp ensión de los ac o es exógenos y
endógenos que con olan la au o eno ación y la di e enciación, acili a á el uso de
es as células en e apias basadas en células y pe mi i á la comp ensión de los p ocesos
emp anos del desa ollo. Di e sos ac o es es án in oluc ados an o en el
man enimien o del es ado no di e enciado como en la di e enciación de las células
oncales, incluyendo la es uc u a celula , ac o es de c ecimien o, in e acciones
celula es, el es ado nu icional, la igidez y composición de la ma iz, la ensión
mecánica, la adhesión célula-ma iz y el mic oambien e o nicho celula (anoxia, hipoxia
y no moxia; empe a u a; humedad) como se obse a en la Figu a 8.
FIGURA 8. Las CTEs aisladas de la MCI del blas ocis o pueden man ene se en es ado no di e enciado o
di e encia se in i o en di e sos ipos celula es especí icos, median e el con ol eje cido po a ios ac o es
in ínsecos ansc ipcionales y ac o es ex ínsecos.
INTRODUCCIÓN
39
1.6.1. Di e enciación espon ánea
Las células oncales esiden den o de mic oambien es especializados que cons i uyen
el nicho celula , el cual modula la p oli e ación y di e enciación, la p e alencia simé ica
en e a la di isión asimé ica y las p o ege del es és isiológico. Du an e el desa ollo
emb iona io, un complejo conjun o de señales egula es os p ocesos isiológicos en las
células oncales plu ipo en es, di igiéndolas hacia un comp omiso con de e minados
eno ipos celula es. Es as señales cons i uyen una ed egulado a ansc ipcional muy
con olada que man iene las células con capacidad de au o eno ación y plu ipo encia,
de cuyo equilib io depende la posibilidad de di e encia se hacia ipos celula es
especializados. Así, mien as las CTEs p oli e an en cul i o bajo las condiciones
ap opiadas se man end án en es ado no di e enciado, pe o cuando se pe mi e la salida
de es e es ado las células ienden a ag upa se o mando cue pos emb iona ios (EBs),
que co esponden a es uc u as idimensionales muy semejan es a los emb iones en
los p ime os es adios de desa ollo y se desencadena una modi icación de la ed
egulado a que inicia un p oceso de di e enciación espon áneo y pueden cons i ui
di e sos ipos celula es. Aunque la di e enciación espon ánea es una buena indicación
de que el cul i o de las CTEs es adecuado, se a a de un p oceso no di igido y po an o
una ine icien e es a egia pa a p oduci cul i os celula es especí icos con ines
e apéu icos, de modo que una de las p incipales di icul ades de la e apia celula adica
en el con ol de su di e enciación hacia las células o ejidos deseados.
1.6.2. Di e enciación di igida
En los úl imos años, han sido iden i icados un g an núme o de ac o es de c ecimien o
que en unción de su ac i idad biológica son capaces de di e encia las CTEs
selec i amen e hacia linajes mesodé mico, endodé mico o ec odé mico (Schuldine
e al., 2000), concluyendo que ales moléculas pueden desempeña papeles impo an es
du an e la emb iogénesis y se pueden u iliza pa a di igi o apoya la di e enciación de
células oncales plu ipo en es. Dilucida y ecapi ula odos es os bio ac o es es
INTRODUCCIÓN
40
esencial pa a con ola la di e enciación de las células oncales y di igi de o ma iable
la di e enciación de las CTEs hacia ipos celula es especí icos, o eciendo la posibilidad
de una uen e eno able de células y ejidos de eemplazo pa a un posible a amien o
de en e medades, incluyendo po ejemplo la diabe es, degene ación macula , a i is o
ca diopa ías.
En la ob ención de células p oduc o as de insulina se pueden dis ingui las siguien es
e apas undamen ales: especi icación, di e enciación y madu ación. Las CTEs se
di e encian en células p oduc o as de insulina a a és de las siguien es e apas: la
especi icación del endode mo de ini i o y ejido panc eá ico a pa i del ubo p imi i o
del in es ino y del in es ino an e io del pánc eas; la di e enciación de p ogeni o es
panc eá icos y el desa ollo de las células p oduc o as de insulina madu as
ca ac e izadas po la exp esión de de e minados ac o es de ansc ipción. Las ías de
ansducción de señales implicadas en la ob ención de células p oduc o as de insulina a
pa i de las CTEs han sido ampliamen e es udiadas en las úl imas décadas. Una
comp ensión comple a del desa ollo panc eá ico iene de e minada po el
conocimien o de odas las señales ex acelula es en las di e en es e apas y ambién po
los mecanismos molecula es undamen ales de cada molécula y ac o que ac i an una
espec i a señal pa a da luga a la di e enciación de las CTEs. La a ención se ha
cen ado en g an medida en la iden i icación de las edes undamen ales de moléculas y
ías de señalización en el desa ollo de las células p oduc o as de insulina.
Los p o ocolos de di e enciación u ilizados has a la echa p e enden simula los e en os
que ienen luga du an e el desa ollo del pánc eas y la di e enciación de los islo es
panc eá icos. Es o equie e un amplio conocimien o de las ías de señalización
implicadas, pa a la inclusión de moléculas de señalización en el medio de cul i o que
simulen a los ac o es de c ecimien o sec e ados. Ac ualmen e, se han iden i icado
a ias moléculas que ac úan como señales ex acelula es pa a el co ec o desa ollo del
linaje de panc eá ico, en el que la p ime a e apa del endode mo de ini i o ecibe
INTRODUCCIÓN
41
señales de los ejidos adyacen es. Al inicio del desa ollo panc eá ico, las señales de la
supe amilia TGF-β de ac i inas juegan un papel p imo dial. La p esencia de ac i ina y la
al a señalización nodal en es a e apa son sup imidas po una egulación nega i a de la
ía de señalización PI3K pa a ac i a la plu ipo encia de las CTEs (McLean e al., 2007).
La ía de señalización PI3k ac i ada u iliza os a idilinosi ol mono-, bi- o i- os a o pa a
ac i a a la p o eína quinasa B (PKB o AKT) y la GSK3β. La inhibición de PI3K y AKT, jun o
con una al a señalización nodal inducen la di e enciación de las CTEs hacia el
endode mo de ini i o (Ho i e al., 2002; Vallie e al., 2009; Chen e al., 2006). La
ac i ina A ha demos ado desempeña un papel undamen al en la mig ación de los
islo es panc eá icos y la egulación de la di e enciación celula endoc ina y exoc ina
du an e la o mación inicial del pánc eas (Mo iya e al., 2000; Maldonado e al.; Kim
e al., 2000; Shiozaki e al., 1999; Zhang e al., 2002; Fu ukawa e al., 1995). La ía de
señalización Wn es o a ía impo an e en el desa ollo panc eá ico, p incipalmen e en
la pola idad celula , la mig ación y la p oli e ación. Si es a ía p omue e la
au o eno ación o la di e enciación de las células oncales du an e la di e enciación y
o ganogénesis es obje o de con o e sia. Ap oximadamen e se han iden i icado 20
moléculas di e en es de la amilia Wn , en e ellas algunas in e accionan con el ecep o
F izzled (FRZ) y ac i an una p o eína llamada DVL pa a bloquea a la GSK3β, la cual
os o ila a la CTNNB. Po an o, la CTNNB de os o ilada se acumula en el ci oplasma
o mando un complejo con el ac o TCF7L2 en el núcleo (Liu y Habene , 2010). Es e
complejo es impo an e pa a el desa ollo del pánc eas y la sec eción de insulina. La ía
de señalización Wn es más impo an e du an e las e apas iniciales que en las e apas
a días de la di e enciación de las CTEs. Se ha is o que OCT4 ep ime la ía de
señalización Wn du an e el p oceso de au o eno ación y la señalización de CTNNB ue
obse ada solo con OCT4 bloqueado. Po consiguien e, se llegó a la conclusión de que la
ía de señalización Wn unciona p incipalmen e en la di e enciación, pe o no en la
au o eno ación de las CTEs y además, se ha obse ado que la ac i ación de la
señalización Wn /CTNNB, median e la adición de Wn 3a puede es imula la

INTRODUCCIÓN
42
p oli e ación de las CTEs (Da idson e al., 2012). En conjun o es as obse aciones, han
desembocado en a ios es udios que sugie en la combinación de Wn 3a y ac i ina A
pa a p omo e la di e enciación de las CTEs hacía el endode mo de ini i o (K oon e al.,
2008; Johannesson e al., 2009; M opou e al., 2010; D’Amou e al., 2006). O a u a
des acada en el desa ollo panc eá ico es la ía de señalización BMP, que ac úa como un
inhibido en las e apas emp anas del desa ollo del endode mo, mien as que se
equie e en la úl ima pa e de la o mación de células p ogeni o as de panc eá icas (Cai
e al., 2010; Zhang e al., 2009; Vallie e al., 2009), es a ía de señalización es
con olada po la p o eína nogina (Jiang e al., 2007a; K oon e al., 2008). Po o o lado,
la inhibición de la ía de señalización Shh en las células humanas y mu inas p omue e la
o mación del linaje panc eá ico (Kawaguchi e al., 2002; Kim y Mel on, 1998; Heb ok e
al., 2000; Lau y Heb ok, 2010). En las p ime as e apas, du an e la o mación del
mesendode mo y el endode mo de ini i o, la ac i ina A y el bFGF se usan pa a inhibi la
ía de señalización Shh (Jiang e al., 2007a; D’Amou e al., 2006). Así como, el bFGF y la
ciclopamina se u ilizan pos e io men e en la expansión de p ogeni o es panc eá icos
(D’Amou e al., 2006).
1.6.3. P o ocolos de di e enciación
Los p ime os es udios pa a la ob ención de células p oduc o as de insulina a pa i de
las CTEs mu inas (Shi oi e al., 2002; So ia e al., 2001, 2000) y humanas (Assady e al.,
2001; Lumelsky e al., 2001), indica on que se pueden ob ene in i o a pa i de células
plu ipo en es espon áneamen e di e enciadas. Es a di e enciación espon ánea enía un
endimien o muy bajo, insu icien e pa a una aplicación clínica. Du an e la úl ima década
muchos g upos han con ibuido a gene a p o ocolos de di e enciación que simulan
desa ollo del pánc eas (Van Hoo e al., 2009). A pa i de los es udios iniciales sob e la
o mación del endode mo de ini i o, a ios p o ocolos han sido publicados pa a la
gene ación de células p oduc o as de insulina, simulando el amplio conocimien o
adqui ido en el desa ollo panc eá ico en Xenopus y oedo es (Van Hoo e al., 2009;
INTRODUCCIÓN
43
Rezania e al., 2012; Chen e al., 2009; K oon e al., 2008; D’Amou e al., 2006). Se
ob u ie on g andes poblaciones de células que exp esan ac o es de ansc ipción
p esen es en endode mo panc eá ico, incluyendo PDX1 y NEUROG3. Sin emba go, un
g an po cen aje de las células e an poli-ho monales, al exp esa simul áneamen e
soma os a ina, glucagón y/o insulina (B uin e al., 2014). La exp esión de múl iples
ma cado es ho monales den o de una sola célula y la mala espues a a la glucosa en
cuan o a la libe ación de insulina, sugi ió que los p o ocolos equie en nue as mejo as.
En base al p o ocolo de di e enciación de D’Amou e al., una compañía de
bio ecnología en San Diego (ViaCy e), in e ino de o ma impo an e en el desa ollo de
p o ocolos pa a gene a células p oduc o as de insulina a pa i de células oncales con
espues a a es ímulos de glucosa, median e el asplan e de células p ogeni o as
panc eá icas encapsuladas en a ones donde pos e io men e madu an has a
con e i se en células be a panc eá icas uncionales in i o capaces de p o ege con a
la hipe glucemia inducida po es ep ozo ocina (STZ) (K oon e al., 2008). En un abajo
más ecien e, las células p ogeni o as panc eá icas se di e encia on en células
p oduc o as de insulina con un al o po cen aje (≈80%) de células endoc inas, de las
cuales la mi ad exp esa on insulina (Agulnick e al., 2015). Recien emen e, se han
publicado o os p o ocolos mejo ados pa a la gene ación de células p oduc o as de
insulina sensibles a glucosa (Pagliuca e al., 2014; Russ e al., 2015; Pezzolla e al., 2015;
Rezania e al., 2014). En odos ellos, las células se cul i an en suspensión pa a simula
mejo las condiciones del c ecimien o in i o y la di e enciación. Exis e una conside able
a iación en e los p o ocolos pa a la o mación del endode mo de ini i o y
p ogeni o es panc eá icos, aunque las condiciones de cul i o pa a conduci las células a
pa i de p ecu so es panc eá icos endoc inos a células p oduc o as de insulina
inmadu as y inalmen e a madu a son muy simila es.
Sin emba go, exis e una se ie de e os que deben se supe ados an es de llega a una
e apia basada en células p oduc o as de insulina pa a el a amien o de la diabe es.
Uno de los p incipales p oblemas a supe a es la madu ación comple a de las células
INTRODUCCIÓN
44
p oduc o as de insulina in i o, ya que las células di e enciadas sec e an gene almen e
muy bajo ni el de insulina, exp esan a ias ho monas y mues an una espues a
insu icien e a la es imulación de glucosa. O o e o es la supe i encia a la go plazo de
los implan es de células p oduc o as de insulina, ya que el asplan e de células ex a-
panc eá icamen e pod ían su i una dedi e enciación o incluso cambia a o os ipos
celula es. Además, las CTEs mu inas y humanas son di e en es en muchos aspec os, de
o ma que aslada la in es igación de animales a humanos equie e ex ema las
p ecauciones. Si bien has a el momen o exis en ue es e idencias que con i man que
las células p oduc o as de insulina gene adas pueden educi la hipe glucemia en
oedo es, la capacidad de es as células pa a el a amien o de los pacien es diabé icos
no ha sido comp obada y la gene ación de células a g an escala pa a la aplicación clínica
cons i uye o o obs áculo, aunque los ecien es a ances hacen indica que la me a es á
cada ez más p óxima. Po o a pa e, pe sis e la incógni a de cuál pod ía se la eacción
del sis ema inmune del huésped en e a las células p oduc o as de insulina ob enidas,
ya que simila a la si uación del asplan e de islo es panc eá icos, las células oncales
asplan adas ambién en en an el p oblema del echazo inmunológico, de modo que
el e o pa a una e apia basada en células con éxi o en el a amien o de la diabe es no
es sólo la ob ención de células p oduc o as de insulina uncionales, sino ambién el
bloqueo de la espues a au oinmune. Po ello, muchos de los es ue zos de la
in es igación ac ual se basan en écnicas que mejo en el implan e de las células
asplan adas y e i a cualquie ipo de echazo po el sis ema inmunológico. En es e
sen ido, una de las es a egias pe seguidas ha consis ido en u iliza una g an a iedad
de moléculas inmunosup eso as, ya sea aisladas o combinadas, pa a p o ege a las
células ob enidas de las CTEs del echazo inmunológico, como pod ía se la combinación
del CTLA4-Ig, un á maco ap obado po la Agencia de alimen os y medicamen os
no eame icana (FDA), pa a el a amien o de la a i is euma oide que sup ime las
células T esponsables del echazo inmune y una p o eína llamada PD-L1 que se sabe
que es impo an e pa a la inducción de la ole ancia inmune en umo es, que ha
INTRODUCCIÓN
45
pe mi ido sob e i i a las células alogénicas en a ones humanizados, los cuales se
ca ac e izan po exp esa un sis ema inmunológico equi alen e al humano, sin p o oca
el echazo inmune (Rong e al., 2014). O a es a egia ecien e que se ha pe seguido
ac i amen e como un medio de a on a el a aque au oinmune, consis e en la
encapsulación celula . En es e caso, se lle a a cabo la p o ección de las células
encapsuladas del sis ema inmuni a io al iempo que se pe mi e una oxigenación
adecuada, el ánsi o de nu ien es y glucosa, y el anspo e de insulina a a és de la
ba e a. Aunque no se ha desc i o una exi osa y ep oducible encapsulación de islo es
panc eá icos humanos que du e más de unas pocas semanas en pacien es con diabe es
ipo 1, ViaCy e de iende que las células p oduc o as de insulina ob enidas a pa i de
células oncales pueden unciona in i o en sus disposi i os de mac o-encapsulación
pa en ados (Agulnick e al., 2015). Po an o, a pesa de que se a a de e os
impo an es, hay muchas azones pa a c ee que la e apia de eemplazo de células
be a panc eá icas puede con e i se en una ealidad clínica pa a el a amien o de
pacien es con diabe es.
1.7. Regulación epigené ica de las CTEs
El p incipal ol de la epigené ica es la egulación de genes, es e p oceso es cla e en
di e en es p ocesos celula es como pueden se :
• La modulación indi idual de genes y su ac i idad;
• El desa ollo y di e enciación de ipos celula es median e g upos de genes que
son uncionales en cada ipo celula especí ico.
• La plas icidad me abólica celula , que le pe mi e adap a se a los cambios
exógenos.
Comp ende odos los mecanismos molecula es gobe nan es que con olan las CTEs es
de inmenso in e és biológico. Como se ha comen ado con an e io idad, abajos p e ios
han iden i icado una ed ansc ipcional di igida po ac o es de ansc ipción ales
INTRODUCCIÓN
52
codi icaba pa a un RNA egulado de unos 22 nucleó idos, no se ía desc i o has a 7 años
después. El le -7 ac uaba p omo iendo el desa ollo de la la a a día hacia la o ma
adul a, así como lin-4 ac uaba en el desa ollo emp ano en la ansición del p ime
es adio la a io al segundo (Reinha e al., 2000; Slack e al., 2000). A aíz del
descub imien o del le -7, se ue on descub iendo homólogos en o os genomas como el
humano o el de o os animales bila e ales cons i uyendo una g an amilia, además de
o os muchos miRNAs que desde el año 2002 es án siendo egis ados en la base de
da os Sange miRBase (h p://www.mi base.o g/), la cual ep esen a un a chi o en línea
de secuencias de miRNAs y según el úl imo ecuen o en la e sión 21 de junio de 2014
hay más de 35.828 miRNAs madu os egis ados en 223 especies, que incluye más de
2.588 miRNAs iden i icados en humanos.
1.9.1. Biogénesis de los miRNAs
Los genes que codi ican los miRNAs pueden a ia su localización ampliamen e en el
genoma, localizándose p incipalmen e den o de los in ones de genes que pueden
codi ica pa a p o eínas, pe o ambién pueden encon a se en egiones in e génicas o
exónicas (Rod iguez, 2004; Zeng, 2006). En el p ime caso, la exp esión de los miRNAs
puede i co elacionada con la egulación ansc ipcional de su gen huésped y de es a
mane a explica ía una especi icidad isula debida a la exp esión de di e en es g upos
de genes (Lin e al., 2006; Ba el, 2004). En el segundo caso, la exp esión de los miRNAs
iene egulada de o ma independien e a a és de sus p opios elemen os egulado es
(Zeng, 2006). También se ha obse ado que los miRNAs pueden es a de i ados de
secuencias epe i i as del DNA (Smalheise y To ik, 2005).
Los miRNAs madu os son moléculas de unos 20-30 nucleó idos de longi ud, con un
g upo os a o en el ex emo 5’ y un g upo hid oxilo en el ex emo 3’. Los miRNAs
madu os se gene an a a és de múl iples e apas de p ocesamien o de escisiones
secuenciales endonucleolí icas que se inician en el núcleo de la célula y culminan en el

INTRODUCCIÓN
53
ci oplasma. Aunque se han desc i o algunos casos de ansc ipción po la RNA-
polime asa III (Bo che e al., 2006), en la mayo ía de los casos se án ansc i os po la
RNA-polime asa II que p oduce una la ga molécula p ecu so a de RNA que puede
excede a ias kilobases, conocida con el nomb e de miRNA p ima io (p i-miRNA) (Lee
e al., 2004; Cai e al., 2004). Es e o ma una es uc u a s em-loop (Lee e al., 2003) y
se á p ocesado en el núcleo po el complejo mic op ocesado , o mado po la RNasa III
conocida con el nomb e de D osha, que dime iza con la p o eína de la egión c í ica del
gen 8 del sínd ome DiGeo ge (DGCR8), ambién conocida como Pasha. D osha escinde
de o ma asimé ica ambas cadenas en los si ios ce canos a la base de la es uc u a
p ima ia en o ma de s em-loop, de o ma que el p oduc o esul an e es una molécula
de RNA p ecu so a de unos 70-120 nucleó idos denominada p e-miRNA (Denli e al.,
2004; Lee e al., 2003). Es e es expo ado al ci oplasma de o ma ac i a a a és del
complejo Expo ina-5, dependien e de Ran-GTP (Lund e al., 2004; Yi e al., 2003), en el
que la p o eína nuclea asociada a Ras (Ran) es un co ac o que une GTP du an e la
expo ación nuclea del RNA. En el ci oplasma, la molécula de GTP es hid olizada a GDP
y el p e-miRNA es libe ado del complejo expo ado . En el ci oplasma, los p e-miRNAs
son econocidos po el complejo de p ocesamien o de los p e-miRNAs o mado po
Dice , la p o eína de unión a RNA en espues a a ans-ac i ación (TRBP) y la p o eína
quinasa ac i ado a dependien e de RNA de cadena doble inducible po in e e ón
(PRKRA), dando luga a una molécula de doble cadena conocida como miRNA dúplex
(Lund e al., 2004; Yi e al., 2003; Hu ágne e al., 2001; G ishok e al., 2001). T as el
p ocesamien o, se sepa an las 2 heb as del miRNA dúplex, dependiendo de a ios
ac o es ales como la asime ía e modinámica de los dúplex y la es abilidad de
empa ejamien o de bases en el ex emo 5', de e minándose una heb a guía que se á
p e e en emen e in eg ada con una de las 4 p o eínas A gonau as (Ago) pa a o ma el
complejo de silenciamien o inducido po RNA (RISC) (Schwa z e al., 2003; Kh o o a
e al., 2003), el cual cons i uye la maquina ia ca alí ica esponsable de la deg adación
del mRNA diana y/o inhibición de la aducción, mien as que la o a heb a (heb a
INTRODUCCIÓN
54
pasaje a o miR*), po lo gene al se deg ada o en casos a os puede asocia se con
p o eínas Ago, pe mi iendo a ambas heb as se i como miRNAs uncionales (K ol e al.,
2010; Okamu a e al., 2009; Czech e al., 2009). Al RISC que lle a a cabo su acción
asociado con la heb a guía del miRNA, se le conoce como miRISC y cons i uye el enzima
ca alí ico que p ocesa el mRNA diana pa a bloquea su aducción. En la Figu a 10, se
e leja en de alle los p ocesos y ac o es implicados en la biogénesis de los miRNAs.
FIGURA 10. El p ocesamien o de los miRNAs clásico se inicia con la (1) ansc ipción del p i-miRNA
median e la RNA polime asa II. (2) A con inuación el ansc i o p ima io es escindido en un p e-
miRNA median e el complejo o mado po D osha y DCGR8 (Mic op ocesado ). (3) La siguien e e apa
implica la expo ación nuclea dependien e de RAN-GTP, median e la Expo ina-5. (4) Es a nue a
localización pe mi e a la RNasa Dice y TRBP escindi el p e-miRNA, dando luga a un duplex
impe ec o de ap oximadamen e 19-24 nucleó idos de longi ud, que se disocia á en una heb a guía y
o a pasaje a. (5) Finalmen e, la p o eína a gonau a-2 (Ago2), basándose en eglas e modinámicas
selecciona á la heb a guía del miRNA, (6) cons i uyéndose el miRISC que se enca ga de la egulación
del mRNA diana.
INTRODUCCIÓN
55
1.9.2. Mecanismos de acción de los miRNAs
Los miRNAs pueden egula nega i amen e la exp esión génica a a és de 2
mecanismos p incipales que son la deg adación del mRNA diana o la ep esión de la
aducción, la u ilización de un mecanismo u o o depende á del mRNA diana. Una ez
el miRNA se inco po e en el RISC, ac ua á un mecanismo u o o dependiendo del g ado
de complemen a iedad del miRNA con su diana. Si la complemen a iedad es ele ada o
o al se p oduci á la deg adación del mRNA (Bagga e al., 2005), mien as que si la
complemen a iedad no es o al o es insu icien e se p oduci á una inhibición de la
aducción. Uno de los p incipales pun os de discusión en es e campo gi a en o no al
g ado de complemen a iedad necesa io pa a el silenciamien o génico y a cuán os
miRISC son necesa ios pa a inhibi la aducción. Según los conocimien os disponibles
sob e los siRNAs, se c ee que se ían necesa ios al menos 11 pb pa a una ele ada
a inidad en el econocimien o del mRNA diana y la unión al miRISC, po debajo de es e
núme o la a inidad del miRISC po su diana se encuen a comp ome ida. Sin emba go,
Doench y Sha p (Doench y Sha p, 2004) desc ibie on que la habilidad de los miRNAs
pa a sup imi la aducción dependía eno memen e de la ene gía lib e de unión en e
los p ime os 8 nucleó idos del ex emo 5’-UTR del miRNA y mRNA diana. Según es o un
miRNA puede ac ua sob e muchas zonas 3’-UTR de un g an núme o de genes. Es udios
de exp esión de mic oa ays mos a on que los miRNAs pueden inhibi muchos mRNAs
dianas que con engan secuencias que sean complemen a ias a las posiciones 2-7 del
ex emo 5’-UTR de un miRNA, egión que se conoce como secuencia semilla (seed) (Lim
e al., 2005). La segunda cues ión pod ía esponde se conside ando la a inidad del
miRISC po su diana; las e idencias apun an a que se equie en a ias egiones de unión
a miRNAs pa a una in e acción miRNA-mRNA de al a a inidad que sup ima la aducción.
Es plausible pensa que un miRISC que econoce una unión impe ec a en e el miRNA y
el mRNA con sólo 7-9 nucleó idos, se uni ía a la diana con baja a inidad. Po lo que
múl iples copias de miRISC pod ían uni se a la diana pa a compensa la unión de baja
a inidad en e el miRISC y el mRNA (Lim e al., 2005; Pillai e al., 2005).
INTRODUCCIÓN
56
Cuando un miRNA guía hacia la deg adación de un mRNA, el co e se p oduce
p ecisamen e en el mismo si io en que lo p oducen los siRNAs en su acción, en e los
nucleó idos que odean al esiduo 10-11 del miRNA (Hu ágne y Zamo e, 2002).
Después de la deg adación del mRNA, el miRNA pe manece in ac o y puede guia hacia
el econocimien o y la des ucción de mRNAs adicionales. En gene al en es e
mecanismo de acción la complemen a iedad se puede da an o en egiones
codi ican es como en egiones 3’-UTR, mien as que cuando ac úa inhibiendo la
aducción suele uni se exclusi amen e a la egión 3’-UTR del mRNA. Exis en
excepciones como la que se ha obse ado con miR-122 que a ec a posi i amen e la
eplicación del i us de la Hepa i is C, po unión a la egión 5’-UTR no codi ican e
(Jopling e al., 2005), en es e caso el miRNA iene unción ac i ado a de la exp esión
génica, aunque no es á cla o si es un mecanismo único o si ep esen a un mecanismo de
acción oda ía desconocido de los miRNAs.
En el mecanismo de inhibición de la aducción, el p incipal e ec o es un miemb o de la
amilia de RNA helicasas (RCK/p54) y componen e del miRISC. Di e sos es udios
mues an que algunos componen es del miRISC colocalizan en los cue pos-P (pun os
ci oplasmá icos que con ienen complejos p o eicos) jun o con el mRNA ep imido
aduccionalmen e. Múl iples copias del miRISC que con ienen RCK/p54 pueden inicia
un e en o de oligome ización que secues a al mRNA y lo anspo a a los cue pos-P,
una ez allí el mRNA aduccionalmen e ep imido pod ía pe manece en es uc u as
oligomé icas pa a su almacenamien o o pod ía o ma un complejo con enzimas
decapping y p o eínas cap-binding que deg adan el mRNA. En esumen, el miRNA en el
miRISC indica la secuencia diana y RCK/p54 es la molécula e ec o a que anspo a el
mRNA hacia el almacenaje o p ocesamien o en los cue pos-P (Sen y Blau, 2005; Liu e
al., 2005; Valencia-Sanchez, 2006).
Po o o lado, algunos siRNAs pueden uni se al DNA y ealiza no sólo ep esión pos -
ansc ipcional sino ambién ep esión ansc ipcional, es o apun a a que los miRNAs
INTRODUCCIÓN
57
pod ían ambién ac ua de es a mane a. Además, los miRNAs pod ían es a
elacionados con la egulación de la es uc u a de la c oma ina. En es e sen ido, la
p edicción de genes diana de los miRNAs en e los cuales hay p o eínas modi icado as
de his onas, como son las his onas me il- ans e asas, p o eínas de unión a islas CpG e
his onas deace ilasas, apoya ía es a hipó esis (Lewis e al., 2005).
1.9.3. Los miRNAs y la au o eno ación de las CTEs
La decisión del es ado de au o eno ación o di e enciación es á egulada po un
complejo conjun o de ac o es, incluyendo ac o es de ansc ipción, modi icaciones de
la c oma ina, ías de señalización y ncRNAs. El p og ama molecula de las CTEs necesi a
se conse ado con el in de man ene el es ado de plu ipo encia no di e enciado,
mien as que es e p og ama se e á some ido a cambios de exp esión génica y la
in e ención de la epigené ica, cuando las células es án comp ome idas hacia un
p oceso de di e enciación que esul a en una ans o mación masi a del eno ipo
celula . Po su capacidad pa a egula de o ma simul ánea cien os de dianas, los
miRNAs ep esen an excelen es candida os pa a es a ápida y g an ans o mación. En
es e sen ido los miRNAs han demos ado se piezas cla e en la egulación del desa ollo
de las células oncales al juga un papel c í ico en la o mación y la de inición de la
plu ipo encia de células oncales, así como en su di e enciación (Yi y Fuchs, 2011).
La exp esión de los miRNAs se ha examinado ampliamen e en las CTEs mu inas y
humanas median e di e sas écnicas e elando que la exp esión global de los miRNAs es
más baja en las CTEs en compa ación a las mismas células di e enciadas. Sin emba go,
algunos miRNAs es án limi ados a las CTEs, mien as que o os se encuen an
ampliamen e exp esados, pe o disminuyen signi ica i amen e du an e la di e enciación.
Po an o, un núme o limi ado de los miRNAs se ansc iben en las CTEs y se exp esan
p e e en emen e en el es ado plu ipo en e, mien as que se án inmedia amen e
silenciados una ez que eciben señales de di e enciación (Houba iy e al., 2003). La

INTRODUCCIÓN
58
mayo ía de es os miRNAs especí icos se puede ag upa en 4 g andes g upos. Uno de
ellos cons i uido po la amilia miR-290 (miR-291, -294 y -295) en a ones y su homólogo
en humanos la amilia miR-371/373 (miR-371, -372 y -373); o o po la amilia miR-
302/367 (miR-302a/b/c/d y -367) común en a ones y humanos; la amilia miR-17/92
(miR-17, -18a, -19a/b, -20a y -92); y la amilia C19MC que incluye 46 miRNAs codi icados
en el c omosoma 19 (S adle e al., 2010). La exp esión común de simila es miRNAs en
CTEs mu inas y humanas sugie e un impo an e papel uncional en la biología de las
células oncales. La mayo ía de es as amilias de miRNAs se ansc iben como
ansc i os policis ónicos, lo que sugie e que compa en egulado es comunes y el
mismo pa ón de exp esión. De hecho, los p omo o es de la mayo ía de es os miRNAs
pueden se ac i ados po OCT4, SOX2 y NANOG (Ma son e al., 2008). Además,
p esen an una secuencia semilla (seed) idén ica o muy simila (AAGUGCU o AAAGUGC),
po lo que pueden di igi se a un g upo común de mRNAs diana (S adle e al., 2010).
El hecho de que muchos miRNAs engan la misma secuencia semilla (seed) y que un solo
miRNA puede ac ua en múl iples dianas hacen di ícil es udia su unción de o ma
indi idual. La eliminación de odos los miRNAs se puede consegui median e la
sup esión de los genes que codi ican las enzimas implicadas en el p ocesamien o o
uncionamien o de los miRNAs, D osha, Dice o DGCR8, en e o os. La de iciencia de
Dice gene a mue e p ema u a en e apas emp anas del desa ollo de a ones
(Be ns ein e al., 2003), mien as que las CTEs mu inas mu an es en Dice son iables en
cul i o, pe o p esen an de ec os en la di e enciación (Kanellopoulou e al., 2005). La
pé dida de Dice ambién conduce a g a es de ec os de c ecimien o de las CTEs y
p olonga lige amen e las ases G1 y G0 del ciclo celula (Mu chison e al., 2005). De
o ma simila a la de iciencia de Dice , la inac i ación de DCGR8 da luga a a ones no
iables y las CTEs mu inas con de ec os en la p oli e ación y allos en la di e enciación
(Wang e al., 2008). Las de iciencias conjun as de D osha y Dice a enúan d ás icamen e
la di isión celula de las CTEs humanas e inducen de ec os en la di e enciación (Qi e al.,
INTRODUCCIÓN
59
2009). En conjun o es os da os ponen en e idencia que los miRNAs son c í icos pa a la
au o eno ación y di e enciación de las CTEs.
Una egulación es ic a de la di isión de células oncales es p imo dial pa a man ene la
capacidad de au o eno ación. Los de ec os obse ados en la p oli e ación de mu an es
Dice , D osha y DGCR8 sugie en que los miRNAs es án in oluc ados en la egulación de
su ciclo celula . Se sabe que las CTEs se ca ac e izan po un a ípico ciclo celula
acele ado, debido a una co a ansición de la ase G1 a la ase S en compa ación a las
células somá icas (Fluckige e al., 2006; Wang e al., 2008). Los pun os de con ol
egulan la p og esión a a és de las ases del ciclo celula y son egulados po la
ac i ación e inac i ación secuencial de las p o eínas quinasas dependien es de ciclinas
(CDKs). Con a iamen e a las células somá icas, las CTEs exp esan muy bajos ni eles de
inhibido es del ciclo celula (p21, p27 y p16), lo que hace que exhiban un a ípico ciclo
celula . Mucho de los de ec os en la p oli e ación inducidos po la de iciencia de las
enzimas Dice o D osha, pueden se con a es ados po miemb os de las amilias miR-
290 y -302, lo que e ela que se a a de miRNAs impo an es como egulado es del
ciclo celula (Wang e al., 2008; Sinkkonen e al., 2008). Po ello, a es os miRNAs se les
conoce como especí icos del ciclo celula de las CTEs (ESCC), dado que
p edominan emen e in e ienen en la egulación el ciclo celula (miRNAs p omo o es
del ciclo celula de las CTEs). Es e ipo de miRNAs compa en una secuencia semilla
(seed) común, lo que sugie e que egulan un conjun o común de genes. La búsqueda de
sus dianas e eló que uncionan median e la sup esión de a ios egulado es cla e
(p21, Rbl2 y Las 2) de pun os de es icción como la ía CiclinaE/CDK2, que egula la
ansición de las ases G1/S pe mi iendo así una ápida p oli e ación en las CTEs (Wang
e al., 2008, 2013b). In e esan emen e, la amilia miR-290 en a ones ha sido mos ada
como diana de Rbl2 y disminuye la exp esión de las DNA me il ans e asas (Wang e al.,
2008), de o ma simila ac úa su o ólogo en humanos la amilia miR-372 (Qi e al.,
2009). En conjun o, es os nume osos cambios molecula es inducidos sugie en que los
miRNAs ESCC ienen un impo an e e ec o p omo o del ciclo celula y p ese ado de la
INTRODUCCIÓN
60
capacidad p oli e a i a, lo que les con ie e en ac o es p incipales en el con ol de la
di isión de las CTEs.
El ci cui o egulado básico (OCT4-SOX2-NANOG), desempeña un papel cen al en el
man enimien o y adquisición de la plu ipo encia, aunque exis en o os ac o es que
pa icipan ambién en la ed egulado a de la plu ipo encia como LIN28, c-MYC, KLF4,
TCF3 o STAT3. Se puede di e encia un g upo de miRNAs ca ac e ís icos de las CTEs que
son capaces de p omo e la au o eno ación de las células oncales y a su ez inhiben
la di e enciación celula . Po ello, el impac o de los miRNAs sob e el ansc ip oma de
las CTEs ha sido analizado en p o undidad. Se ha descubie o que los miRNAs pa ecen
inc emen a la ac i idad de c-MYC a a és de múl iples u as indi ec as (Lin e al., 2009;
Ca w igh e al., 2005). Es e ac o p omue e la p oli e ación y es eque ido pa a la
au o eno ación de las CTEs y su inhibición p omue e la pe dida de la au o eno ación
(Singh y Dal on, 2009). Además, c-MYC conduce a la ansc ipción de nume osos
miRNAs que p omue en la au o eno ación como son miR-141, -200 y -429 (Lin e al.,
2009). In e esan emen e, los p omo o es de las amilias miR-290 y -302 son
di ec amen e egulados po los ac o es de plu ipo encia (OCT4, SOX2, NANOG y TCF3) y
a su ez los miRNAs man ienen la exp esión de los ac o es de plu ipo encia median e la
inhibición de silenciado es (Judson e al., 2009; Ma son e al., 2008). O os ac o es
asociados a la plu ipo encia son ambién indi ec amen e p omo idos po los miRNAs,
es os incluyen LIN28, TRIM71 y SALL4 (Mel on e al., 2010) o bien son los miRNAs los
que p omue en su exp esión como la amilia miR-17/92 que induce a LIN28 (Wa ande
e al., 2016). Po an o, pa ece cla o que se es ablecen ci cui os de e oalimen ación
en e los ac o es de ansc ipción y los miRNAs que ayuda a o alece el
man enimien o del es ado plu ipo en e de las CTEs.
INTRODUCCIÓN
61
1.9.4. Los miRNAs y la di e enciación celula de las CTEs
La ansición del es ado de au o eno ación de las CTEs a un es ado di e enciado es un
p oceso obus amen e egulado pa a un desa ollo no mal y la homeos asis de los
ejidos. Dado que los miRNAs se adap an pa a es abiliza el es ado de au o eno ación,
es án bien si uados pa a p omo e la ansición de la au o eno ación a la
di e enciación. Los miRNAs p o-di e enciación pueden se inducidos ápidamen e con el
inicio de los p ocesos de di e enciación de las CTEs a linajes especí icos y silencian la
au o eno ación ac uando di ec amen e sob e la ed cen al de ac o es de
plu ipo encia. Una segunda clase de miRNAs p o-di e enciación an siendo inducidos
du an e el anscu so de la di e enciación y en gene al sup ime p og amas génicos
asociados a las CTEs pe o no a los mismos ac o es de ansc ipción cen ales de
plu ipo encia (Tisco nia y Izpisúa Belmon e, 2010). Es as 2 clases de miRNAs de
di e enciación p obablemen e juegan dis in os oles en el p oceso de di e enciación, de
modo que la p ime a clase de miRNAs sup imen di ec amen e el es ado de
au o eno ación de las CTEs, mien as que la segunda clase de miRNAs
p edominan emen e es abilizan el es ado di e enciado, al igual que los miRNAs ESCC
es abilizan el es ado plu ipo encial de las CTEs (Ong e al., 2015).
Du an e la di e enciación de las CTEs humanas es sob eexp esado miR-145 (S adle
e al., 2010), es e inc emen o ep ime la exp esión de ac o es de plu ipo encia y acili a
la di e enciación, mien as que su disminución pe judica a la di e enciación e induce la
exp esión de OCT4, SOX2 y KLF4. Po an o, miR-145 con ola la di e enciación de las
CTEs median e la in e acción con los ac o es de plu ipo encia silenciando el p og ama
de au o eno ación (Xu e al., 2009). In e esan emen e, el p omo o de miR-145 es
inhibido po OCT4 es ableciéndose un ci cui o de e oalimen ación nega i o. En las
CTEs mu inas se ha demos ado que a ios miRNAs p omue en la di e enciación
median e in e acción con genes que codi ican ac o es de ansc ipción implicados en el
man enimien o de la iden idad de células oncales. Los miRNAs miR-200c, -203 y -183

2. OBJETIVOS
OBJETIVOS
71
Nues o g upo ue pione o en demos a que las CTEs mu inas pueden di e encia se in
i o hacia células p oduc o as de insulina y e e i in i o la glucemia en modelos
mu inos diabé icos, es udios pos e io es han demos ado que los p o ocolos de
di e enciación in i o pueden se op imizados pa a aumen a la e icacia y e iciencia,
consiguiendo células p oduc o as de insulina madu as uncionales en can idad
su icien e pa a una posible e apia celula . Du an e el desa ollo un complejo
en amado de señales induc o as y de ac o es de ansc ipción egulado es de e mina
de o ma combina o ia la adquisición de un eno ipo panc eá ico. Nues a hipó esis
consis ía en comp oba si es posible aumen a la e icacia y e iciencia del p oceso de
di e enciación de las células plu ipo en es hacia células p oduc o as de insulina,
median e un mecanismo egulado inno ado eje cido po pequeñas moléculas de
ncRNAs como son los miRNAs, de o ma que pod án cons i ui he amien as
molecula es ú iles en la manipulación de las CTEs.
El obje i o p incipal se cen a especialmen e en el aislamien o de miRNAs candida os e
in oluc ados en la di e enciación de células oncales plu ipo en es a células
p oduc o as de insulina, analizando el posible pa ón de exp esión común de miRNAs
du an e el desa ollo emb iona io panc eá ico y la di e enciación de las CTEs hacia
células p oduc o as de insulina e iden i ica especí icos miRNAs candida os que puedan
desempeña un papel egulado cla e en la di e enciación de las CTEs, así como analiza
el pa ón de exp esión de miRNAs en las células madu as de islo es panc eá icos adul os
y con es e p opósi o nos hemos plan eado los siguien es obje i os especí icos:
1. Es udia el posible e ec o de las pequeñas moléculas de ncRNAs en los p ocesos
de di e enciación in i o de las CTEs.
2. Analiza la exp esión global de los miRNAs du an e el p oceso de di e enciación
in i o de las CTEs hacia células humanas p oduc o as de insulina, median e
mic oa ays pa a la iden i icación de miRNAs especí icos implicados en el p oceso
de di e enciación.
OBJETIVOS
72
3. Analiza el pa ón de exp esión de los miRNAs en el ejido panc eá ico adul o e
iden i ica aquellos p e e en emen e exp esados en las células de islo es
panc eá icos adul os.
4. Es udia los pe iles de exp esión común a los miRNAs desc i os en la
o ganogénesis del pánc eas y la di e enciación de las CTEs hacia células
p oduc o as de insulina, de e minando los mecanismos compa idos en la
egulación mediada po es os miRNAs y comp oba si la egulación iene luga a
a és de las mismas p o eínas diana.
5. Es udia el e ec o de la inhibición o sob eexp esión de los miRNAs iden i icados
con una exp esión p e e en e an o en el p oceso de di e enciación panc eá ica
como en los islo es panc eá icos adul os. Analizando la implicación uncional de
los miRNAs alidados y seleccionados en la di e enciación in i o de las CTEs
hacia células p oduc o as de insulina y la implicación de es os miRNAs en la
inducción de cambios de exp esión de los ma cado es de di e enciación
panc eá ica.
3. MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES Y MÉTODOS
75
3.1. Bioé ica y expe imen ación animal
Se emplea on a ones adul os C57BL/6J como modelo de expe imen ación y ue on
alojados en la Unidad de Recu sos Biológicos del Cen o Andaluz de Biología Molecula y
Medicina Regene a i a (CABIMER). Los p o ocolos de manipulación de animales,
incluyendo eu anasia y sac i icio, se ealiza on bajo la guía de legislación de la
Comunidad Eu opea y ue on ap obados po el Comi é É ico de Expe imen ación Animal
del CABIMER (CEEA-CABIMER. 19/2010).
3.1.1. Ob ención de mues as biológicas a pa i de
ejidos de o igen mu ino
Los animales adul os de 3 meses se sac i ica on median e dislocación ce ical, pa a la
ob ención de los islo es panc eá icos. Una ez sac i icados se p ac ica una lapa o omía
media comple a, aba iendo la pa ed abdominal la e almen e median e 2 secciones
ho izon ales inmedia amen e po debajo de los ebo des cos ales in e io es. Se
mo iliza on el hígado y se ijó la pa ed cos al median e un papel de il o. Se
desplaza on los in es inos a pa i del yeyuno hacia la de echa del animal, de o ma que
queda on expues os el pánc eas, la esícula bilia y la po ción p oximal del conduc o
bilia común. Se mo ilizó el duodeno con el in de localiza la po ción dis al del conduc o
bilia común y se ligó el colédoco en su unión al duodeno, a unos 2 o 3 milíme os po
debajo de la esícula bilia , se in odujo en el conduc o bilia una aguja de pun a oma,
p e iamen e doblada en ángulo ec o; a con inuación, se pasó una ligadu a que ija la
aguja en su posición. Se inyec ó con una je inga 6 mL de solución de Hanks (Gibco,
14025092), suplemen ada con 0,08 mg/mL de colagenasa (SIGMA, C9263). De es e
modo, se log a una buena dis ensión del ejido panc eá ico que acili a su ex acción,
además de pe mi i un buen acceso de la colagenasa a odo el pánc eas. Se ex ajo el
pánc eas de la ca idad abdominal po disección y se ans i ió a un ubo de ensayo de
15 mL, que se incubó en un baño e mos a izado a 37°C du an e 10 minu os, agi ando
ené gicamen e a los 5 y 10 minu os. El ejido panc eá ico en diges ión se de u o
MATERIALES Y MÉTODOS
76
median e la adición de solución de Hanks a 4°C. A pa i de es e momen o comienza la
p ime a ase de la ado; el dige ido se agi ó sua emen e con una pipe a, pa a disg ega y
esuspende el ejido, después se sedimen ó median e cen i ugación a 1.200
e oluciones po minu o ( pm) du an e 2 minu os y po úl imo se decan ó el líquido
sob an e, dejando solo el sedimen o de ejido. Es e p oceso se epi e 2 eces con el in
de elimina la colagenasa del medio. A pa i del ejido panc eá ico dige ido inal se
ecupe an los islo es panc eá icos indi idualmen e, median e succión con pipe a
au omá ica con la inalidad de sepa a bien los islo es panc eá icos del es o de ejido
exoc ino. Los islo es panc eá icos ue on en onces almacenados a -80°C has a se
some idos al p oceso de ex acción del RNA.
3.2. Cul i o Celula
3.2.1. Líneas celula es cul i adas y condiciones de
cul i o
Las dis in as líneas celula es u ilizadas incluyen CTEs de o igen mu ino (ES-D3) y humano
(HS181), una línea celula de iPSC de o igen humano (MSUH-001) y una línea de i ada a
pa i de células be a panc eá icas mu inas de o igen umo al (INS-1E):
 ES-D3: Línea de CTEs mu inas come cial (ATCC®; CRL-1934™), de i adas de la
masa celula in e na de blas ocis o de a ón 129S2/S Pas (RF32835) y gene adas
po el g upo de Doe schman (F ied ich-Miesche -Laboa a o ium de Max-Planck-
Gesellscha Ins i u e, Alemania) (Doe schman e al., 1985). Las células ES-D3 no
necesi an se cul i adas sob e una capa de células nod izas o ma iz p o eica,
sino que pa a el man enimien o de su es ado plu ipo encial no di e enciado es
su icien e la adición en el medio de cul i o del LIF, acili ando algunos abo dajes
expe imen ales (p. ej. ans ección). Las células ue on man enidas en medio de
cul i o DMEM Glu aMAX™ (Gibco, 32430) con 15% de sue o e al bo ino
inac i ado (FBS Lonza, DE14-801F), suplemen ado con penicilina 100 U/mL y
MATERIALES Y MÉTODOS
77
es ep omicina 100 µg/mL (Gibco, 15140), aminoácidos no esenciales 2mM
(In i ogen, 25030-024), 2-me cap oe anol 0,1 mM (In i ogen, 31350-010) y LIF
106 U/mL (Millipo e, ESG1107) e incubadas a 37°C y 5% de CO2.
 HS181: Línea de CTEs humana cedida po pa e de Ho a a, de i ada en la Unidad
de Fe ilidad del Hospi al Uni e si a io Ka olinska, después de la ap obación po
el Consejo é ico de in es igación del Ins i u o Ka olinska, D no 454/02. Es a línea
se de i ó de un emb ión que no pod ía se u ilizado pa a el a amien o de la
in e ilidad de una pa eja, p e io consen imien o in o mado pa a la donación del
emb ión con el in de de i a una posible línea de CTEs pe manen e pa a se
u ilizado en in es igación. La línea HS181 es á incluida en el egis o de la Unión
Eu opea hESC (h p://www.hesc eg.eu/). A di e encia de las CTEs de o igen
mu ino, las CTEs humanas deben cul i a se sob e un sus a o celula o bien una
ma iz p o eica jun o con el h bFGF pa a man ene su es ado de plu ipo encia, lo
que pe mi e que las células c ezcan o mando colonias de bo des bien de inidos y
man engan su es ado no di e enciado. Las células ue on cul i adas según lo
desc i o en el abajo de Ho a a (Ho a a e al., 2003). Las placas de cul i o
ue on a adas con ma igel (1:60) y las células ue on man enidas con medio de
cul i o condicionado ob enido a pa i de una línea de ib oblas os humanos
e ales come cial (ATCC® CRL-2429) que p e iamen e habían sido inac i ados con
mi omicina C (10 µg/mL) du an e 3h a 37 °C. El medio condicionado ob enido a
pa i del cul i o de ib oblas os e ales inac i ados (ATCC®; CRL-2429™) que
libe an al medio FGF, es á cons i uido po medio de cul i o DMEM
KnockOu ™(Gibco, 10829-018) con 20% de eemplazan e de sue o (Gibco, 10828-
028), L-Glu amina 2 mM (Gibco, 25030-032), aminoácidos no esenciales 2mM
(Gibco, 11140-035), penicilina 50 U/mL y es ep omicina 50 μg/mL (Gibco, 15140-
122), 2-Me cap oe hanol 0,1 mM (Gibco, 31350-010) y al que pos e io men e se
le suplemen ó con h bFGF 8 ng/mL (R&D Sys em, 234-FSE), pa a man ene las
células HS181 que son incubadas a 37°C y 5% de CO2.
MATERIALES Y MÉTODOS
84
con ol de ans ección Dy547-labeled miRIDIAN mimic (Dha macon, CP-004500) que
pe mi e una ápida isualización de la en ada de mimic-miRNAs en las células, ya que la
ans ección puede se moni o izada y isualizada po epi luo escencia con mic oscopia
óp ica.
3.4. Técnicas de biología molecula
3.4.1. Ex acción del RNA
La ex acción del RNA se lle ó a cabo u ilizando la écnica del TRIzol desc i a po
(Chomczynski y Sacchi, 1987). A pa i de los mues as celula es o ejidos se p ocedió a
la homogenización añadiendo 1 mL de TRIzol® Reagen (The mo Fishe Scien i ic,
15596026), u ilizando la pipe a au omá ica e incubando 5 minu os a empe a u a
ambien e (20-25°C). A con inuación pa a consegui la sepa ación de ases que pe mi a
aisla el RNA, se añadie on 200 µL de clo o o mo 99,2% (BDH, 22711.290), agi ando
igo osamen e en o ex 15 segundos e incubando 2-3 minu os a empe a u a
ambien e (20-25°C) y se cen i ugó a 13.000 pm du an e 15 minu os a 4°C de o ma
que se consiguió ob ene una ase in e io , una in e ase de enol-clo o o mo y una ase
supe io acuosa que con enía el RNA, po lo que se ecogió es a ase acuosa con
p ecaución de no al e a las o as ases.
La siguien e e apa comp ende la p ecipi ación del RNA con 500 µL de isop opanol 98,5%
(SIGMA, I9392), pa a ellos se mezcló po in e sión a ias eces pa a p ecipi a lo
incubando 10 minu os a empe a u a ambien e (20-25°C) y se cen i ugó a 13.000 pm
du an e 10 minu os a 4°C desca ándose el sob enadan e esul an e.
Po úl imo, se p ocedió a una ase de la ado del RNA. Pa a ello, se esuspendió en 1 mL
de e anol 75% (Me ck, 08543) pa a elimina sales y se cen i ugó a 13.000 pm du an e
5 minu os a 4°C, desca ando nue amen e el sob enadan e y secando el pelle a
empe a u a ambien e (20-25 °C) du an e 10 minu os. Finalmen e, se esuspendió el

MATERIALES Y MÉTODOS
85
pelle en 10-20 µL de agua g ado biología molecula lib e de RNasas, DNasas y p o easas
(5PRIME, 2500010).
La cuan i icación espec o o omé ica se lle ó a cabo median e Nanod op (ND-100),
empleándose como c i e ios de pu eza del RNA el a io 260/280 (1,8-2) y se
man u ie on los RNAs esul an es a -80°C has a el momen o de su u ilización.
3.4.2. Re o ansc ipción o ansc ipción In e sa
La ansc ipción in e sa, ansc ipción e e sa o e o ansc ipción es una eacción que
implica la gene ación de una cadena de DNA de doble cadena complemen a ia al RNA o
miRNA de cadena simple.
La sín esis del DNA complemen a io (cDNA) de los genes de in e és iene luga a pa i
del RNA o al, empleándose cebado es alea o ios y la enzima ansc ip asa in e sa del
Vi us de la Leucemia Mu ina Moloney (M-MLV). La sín esis se ealizó siguiendo las
ecomendaciones del ab ican e en ubos de mic ocen í uga es é iles. En p ime luga ,
se cons i uyó la mezcla de 1 µg del RNA o al y 1 µL de cebado es alea o ios o andom
p ime s (P omega, C118A), comple ándose has a un olumen inal de 10 µL con agua
g ado biología molecula lib e de RNasas, DNasas y p o easas (5PRIME, 2500010). A
con inuación, se desna u alizó a 70°C du an e 5 minu os pa a elimina las es uc u as
secunda ias en iándose inmedia amen e a 4°C pa a p e eni la e o mación de
es uc u as secunda ias. En segundo luga , se añadie on 15 µL de la mezcla de eacción
con los componen es de allados en la Tabla 5, pa a el alineamien o cebado /mues a,
inalmen e se mezcla on odos los componen es agi ando sua emen e y el ubo se
incubó a 37 °C du an e 60 minu os.
MATERIALES Y MÉTODOS
86
Mezcla de Reacción
Volumen (µL )
Concen ación
Solución de eacción M-MLV RT 5x (P omega,M531A)
5
1x
dNTPs 10mM (Bioline, BIO39029)
1,25
0,5 mM
Inhibido RNasas 40 U/ µL (P omega, N211B)
0,6
1 U/µL
M-MLV RT 200U/ µL (P omega, M170A)
0,5
4 U/µL
cDNA 100 ng/µL
10
40 ng/µL
Agua g ado biología molecula (5PRIME, 2500010)
7,65
Volumen Final
25
TABLA 5. Desc ipción de los eac i os y concen aciones de los mismos u ilizadas du an e la
ansc ipción in e sa del RNA.
La sín esis del cDNA de los miRNAs de in e és iene luga a pa i del RNA o al
ajus ando su concen ación a 5 ng/µL y se u iliza el ki de sín esis uni e sal de cDNA
pa a miRNAs (Exiqon, 203301), siguiendo las ecomendaciones del ab ican e. Pa a ello,
se incuba la mezcla de eacción (Tabla 6) a 60°C du an e 1 ho a, anscu ido es e
iempo se inac i a la eacción enzimá ica aumen ando la empe a u a has a los 95°C
du an e 5 minu os e inmedia amen e se en ía a 4°C.
Mezcla de Reacción
Volumen (µL )
Concen ación
Solución de eacción 5x (Exiqon, 203300-04)
2
1x
Mezcla enzimá ica 10x (Exiqon, 203300-03)
1
1x
RNA o al 100 ng/µL
2
20 ng/µL
Agua g ado biología molecula (Exiqon, 203300-01)
5
Volumen Final
10
TABLA 6. Desc ipción de los eac i os y concen aciones de los mismos u ilizadas du an e la
ansc ipción in e sa de los miRNAs.
3.4.3. Reacción en cadena de la polime asa con
ansc ip asa In e sa (RT-PCR)
Realizada la ansc ipción in e sa a pa i del cDNA ob enido de una secuencia
especi ica del RNA de los genes de in e és, se ob u ie on múl iples copias median e la
Reacción en Cadena de la Polime asa (PCR), un mé odo enzimá ico de sín esis in i o.
La RT-PCR se lle ó a cabo con un olumen inal de 20 µL y se emplea on los siguien es
componen es (Tabla 7):
MATERIALES Y MÉTODOS
87
Mezcla de Reacción
Volumen (µL)
Concen ación
Solución de eacción 10x (Bioline, BIO-37025)
2
1x
MgCl2 50Mm (Bioline, BIO-37026)
0,6
1,5 mM
dNTPs 10mM (Bioline, BIO-39028)
0,4
0,2 mM
BIOTAQ™ 5 U/µL (Bioline,BIO-21040)
0,2
0,05 U/µL
Cebado es 5 µM
2
500 nM
cDNA 10 ng/µL
4
2 ng/µL
Agua g ado biología molecula (5PRIME, 2500010)
10,8
Volumen Final
20
TABLA 7. Composición de la mezcla de eacción u ilizada pa a lle a a cabo la RT-PCR.
La secuencia de los cebado es de los genes de in e és u ilizados se de allan en la Tabla
8, analizándose la exp esión de Oc 4, Nanog y Sox2 como ma cado es de exp esión de
plu ipo encia; Sox17, Foxa2, Pdx1, Neu og3, Nkx6.1, Pax6, Pax4, P 1, Mis 1, Gcg, Ins-I,
Ppy, Ss , Amy2a5 y C b1 como ma cado es de exp esión del desa ollo panc eá ico;
Sox7 como ma cado de endode mo emp ano; Sox1 y B achyu y como ma cado es
ec odé mico y mesodé mico espec i amen e; y se usa on como genes de e e encia
Tbp y Ac b:
Gen
Secuencia del Cebado (5’-3’)
Tamaño Amplicón (pb)
Oc 4
F:GGCGTTCTCTTTGGAAAGGT
R:TCTCATTGTTGTCGGCTTCCT
113
Nanog
F:AGGGTCTGCTACTGAGATGCTC
R:CAACCACTGGTTTTTCTGCCACC
366
Sox2
F:CACAGATGCAACCGATGCA
R:GGTGCCCTGCTGCGAGTA
127
Sox7
F:TGGACACGTATCCCTACGGG
96
R:TCCTGACATGAGGACGAGAAG
Sox17
F:CTTTATGGTGTGGGCCAAAG
116
R:GGTCAACGCCTTCCAAGACT
Foxa2
F:CCCTACGCCAACATGAACTCG
R:GTTCTGCCGGTAGAAAGGGA
222
Pdx1
F:CCCCAGTTTACAAGCTCGCT
R:CTCGGTTCCATTCGGGAAAGG
177
Neu og3
F:CTTCACAAGAAGTCTGAGAACACCAG
R:CTGCGCATAGCGGACCACAGCTTC
232
Nkx6.1
F:CTGCACAGTATGGCCGAGATG
R:CCGGGTTATGTGAGCCCAA
136
Pax6
F:GCAGATGCAAAAGTCCAGGTG
R:CAGGTTGCGAAGAACTCTGTTT
285
Pax4
F:GCAGTGTGAATCAGCTAGGGG
R:CAGGGTCGCATCCCTCTTATT
103
La abla con inúa en la página siguien e
MATERIALES Y MÉTODOS
88
P 1
F:TCCCATCCCCTTACTTTGATGA
R:GTAGCAGTATTCGTGTAGCTGG
140
Mis 1
F:GCTGACCGCCACCATACTTAC
R:TGTGTAGAGTAGCGTTGCAGG
198
Gcg
F:TTACTTTGTGGCTGGATTGCTT
R:AGTGGCGTTTGTCTTCATTCA
149
Ins-I
F:CACTTCCTACCCCTGCTGG
R:ACCACAAAGATGCTGTTTGACA
81
Ppy
F:CAGGCGACTATGCGACACC
R:CAGGGAATCAAGCCAACTGG
175
Ss
F:ACCGGGAAACAGGAACTGG
R:TTGCTGGGTTCGAGTTGGC
160
Amy2a5
F:CCAAGGAAGCAGACCTTTCA
R:ACACGGCCATTTCCAAAGTA
149
C b1
F:AACGGAGAGGATGCTATCCCT
R:GACCACCCAGTTTTCGCTGA
108
Ac b
F:TGGGAATGGGTCAGAAGGAC
R:TGAAGCTGTAGCCACGCTCG
467
Sox1
F:AAGGAACACCCGGATTACAAGT
242
R:GTTAGCCCAGCCGTTGACAT
B achyu y
F:GCGGACAATTCATCTGCTTG
124
R:TGGGATACTGGCTAGAGCCA
Tbp*
Ta aa Biocen e ’s
174
TABLA 8. Lis a y secuencia de cebado es usados pa a RT-PCR y qPCR de las CTEs mu inas. Cebado F:
cebado sen ido; cebado R: cebado an isen ido. *Cebado del panel de genes de e e encia
humanos come ciales suminis ados po Ta aa Biocen e 's (Go embu go, Suecia).
La eacción se ealizó con los siguien es pa áme os, una desna u alización inicial
ealizada a 95°C du an e 15 minu os seguida de 26 ciclos de una RT-PCR de 3 e apas
pa a la hib idación y ex ensión: 95°C 1 minu o, 60°C 1 minu o y 72°C 1 minu o.
Finalmen e se lle ó a cabo una elongación inal a 72°C du an e 10 minu os.
El análisis de los p oduc os de ampli icación ob enidos se ealizó median e
elec o o esis (100 mV) en geles de aga osa 2% eñidos con GelRed (Bio ium, 41003),
que ue on sume gidos en ampón TAE 1x (5PRIME, 2500060). Pa a la isualización de la
banda de ampli icación, los geles ue on some idos a luz ul a iole a en el
ansiluminado (Gel Doc XR+ Sys em, Bio-Rad Labo a o ies, CA, EEUU) y las imágenes
ue on omadas y a chi adas con el so wa e Quan i y One 4.6.
La abla iene de la página an e io
MATERIALES Y MÉTODOS
89
3.4.4. PCR cuan i a i a a iempo eal (qPCR)
La PCR cuan i a i a a iempo eal (qPCR) es una a iación de la PCR es ánda desc i a
p e iamen e, u ilizada pa a la cuan i icación del DNA o RNA de una mues a, median e
el mé odo cuan i icación ela i a no malizada espec o a un gen de e e encia. La
cuan i icación de genes de in e és en nues o es udio se lle ó a cabo en un olumen
inal de 20 μl y po iplicado pa a cada mues a y se emplea on los siguien es
componen es (Tabla 9):
Mezcla de Reacción
Volumen (µL)
Concen ación
SensiFAST™ SYBR® Lo-ROX Ki 10x (Bioline, 94020)
10
1x
Cebado es 5 µM
1,6
400 nM
cDNA 10 ng/µL
4
2 ng/µL
Agua g ado biología molecula (5PRIME, 2500010)
4,4
Volumen Final
20
TABLA 9. Composición de la mezcla de eacción u ilizada pa a lle a a cabo la qPCR.
La eacción se ealizó con los siguien es pa áme os, una desna u alización inicial
ealizada a 95°C du an e 2 minu os seguida de 40 ciclos de una qPCR de 2 e apas pa a la
hib idación y ex ensión, du an e la cual se ecogen los da os de luo escencia emi idos
po los luo ó o os de las sondas en cada uno de los ciclos: 95°C du an e 5 segundos y
60°C du an e 1 minu o.
La p incipal limi ación de las sondas inespecí icas como el SYBR GREEN es que al uni se
al o al de ácidos nucleicos en la eacción de la qPCR, emi en una señal luminosa an o
pa a p oduc os especí icos como pa a aquellos que no lo son como pueden se los
díme os de los oligonucleó idos. Pa a hace en e a es a si uación ealizó un análisis de
los esul ados en la cu a de usión (Cu a de disociación o cu a de mel ing). Es e
análisis pe mi e que los p oduc os no especí icos puedan se disc iminados de los
p oduc os ampli icados especí icos. Los esul ados de la qPCR se analiza on con el ViiA™
7 So wa e (Applied Biosys ems). Los cebado es u ilizados pa a las mues as del cDNA
de las CTEs mu inas se de allan p e iamen e en la Tabla 8, u ilizándose como gen de

MATERIALES Y MÉTODOS
90
e e encia Tbp y los cebado es u ilizados pa a las mues as del cDNA de las CTEs
humanas es án de allados en la siguien e Tabla 10, u ilizando en es e caso como genes
de e e encia RPLP, ACTB y TUBB:
Gen
Secuencia del cebado (5’-3’)
Tamaño Amplicón (pb)
OCT4
F:GTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG
R:AAGGGCCGCAGCTTACACATGTTC
245
NANOG
F:GCGCGGTCTTGGCTCACTGC
R:GCCTCCCAATCCCAAACAATACGA
405
SOX2
F:ATGCACCGCTACGACGTGA
R:CTTTTGCACCCCTCCCATTT
437
SOX1
F:AACACTTGAAGCCCAGATGGA
150
R:GCAGGCTGAATTCGGTTCTC
BRACHYURY
F:TGCTTCCCTGAGACCCAGTT
121
R:GATCACTTCTTTCCTTTGCAT
FLK1
F:GTGATCGGAAATGACACTGGAG
124
R:CATGTTGGTCACTAACAGAAGCA
SOX7
F:ACGCCGAGCTCAGCAAGAT
73
R:TCCACGTACGGCCTCTTCTG
SOX17
F:TGGACCGCACGGAATTTGAACA
R:TGTGTAACACTGCTTCTGGCCT
221
FOXA2
F:TTGCTGGTCGTTTGTTGTGGCT
R:TTCATGTTGCTCACGGAGGAGT
153
PDX1
F:TACTGGATTGGCGTTGTTTGTGGC
R:AGGGAGCCTTCCAATGTGTATGGT
133
GSC
F:GAGGAGAAAGTGGAGGTCTGG
R:CTCTGATGAGGACCGCTTCTG
72
HNF1β
F:TCACAGATACCAGCAGCATCAGT
R:GGGCATCACCAGGCTTGTA
79
HNF4α
F:CATGGCCAAGATTGACAACCT
R:TTCCCATATGTTCCTGCATCAG
113
PAX6
F:CTCGGGCACCACTTCAACA
R:TCCGGGAACTTGAACTGGAA
64
NKX6.1
F:AGGGCTCGTTTGGCCTATTC
R:AGAGGCTTATTGTAGTCGTCGT
194
NKX2.2
F:ACCAAACCGTCCCAGCGTTA
116
R:GGCTGACAATATCGCTACTCACACA
MAFA
F:GTCCGCTTGTACATACGTTGA
R:AAAGGGAGGCTGAGAAGAGA
138
GLUT2
F:TTCCGGAATCAATGGCATTT
R:TGTTTACAGCGCCAACTCCA
101
INS
F:TTTGTGAACCAACACCTGTGCGG
R:TTGTTCCACAATGCCACGCTTCTG
210
NEUROG3
F:CTAAGAGCGAGTTGGCACTGA
86
R:GAGGTTGTGCATTCGATTGCG
NEUROD1
F:GGATGACGATCAAAAGCCCAA
179
R:GCGTCTTAGAATAGCAAGGCA
La abla con inúa en la página siguien e
MATERIALES Y MÉTODOS
91
ACTB
F:CGCACCACTGGCATTGTCAT
R:TTCTCCTTGATGTCACGCAC
206
TUBB*
Ta aa Biocen e ’s
150
RPLP*
Ta aa Biocen e ’s
161
TABLA 10. Lis a y secuencia de cebado es usados pa a qPCR de genes de las CTEs humanas. Cebado
F: cebado sen ido; cebado R: cebado an isen ido. *Cebado del panel de genes de e e encia
humanos come ciales suminis ados po Ta aa Biocen e 's (Go embu go, Suecia).
La qPCR pa a el análisis de los miRNAs se lle ó a cabo en un olumen inal de 10 μl y po
iplicado pa a cada mues a y se emplea on los siguien es componen es (Tabla 11):
Mezcla de Reacción
Volumen (µL)
Concen ación
ExiLENT SYBR® G een mas e mix 10x (Exiqon, 94020)
5
1x
Cebado es 10x5x
1
1x
cDNA 0,25 ng/µL
4
0,1 ng/µL
Volumen Final
10
TABLA 11. Composición de la mezcla de eacción u ilizada pa a lle a a cabo la qPCR.
La eacción se lle ó a cabo con los siguien es pa áme os, una desna u alización inicial
ealizada a 95°C du an e 10 minu os seguida de 40 ciclos de una qPCR de 2 e apas pa a
la hib idación y ex ensión, du an e la cual se ecogen los da os de luo escencia
emi idos po los luo ó o os de las sondas en cada uno de los ciclos: 95°C du an e 10
segundos y 60°C du an e 1 minu o. Realizándose como se desc ibió p e iamen e un
análisis de especi icidad de los esul ados con la cu a de disociación y los esul ados de
la qPCR se analiza on ambién con el ViiA™ 7 So wa e (Applied Biosys ems). Los
cebado es u ilizados se ob u ie on de Exiqon y se de allan en la siguien e Tabla 12,
empleándose como gen de e e encia un pequeño RNA nucleola , SNORD48 o RNU48:
miRNA
Nº Acceso
Secuencia del cebado (5’-3’)
Nº Ca álogo
hsa-miR-7-5p
MIMAT0000252
UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU
205877
hsa-miR-15a-5p
MIMAT0000068
UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG
204066
hsa-miR-15b-5p
MIMAT0000417
UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA
204243
hsa-miR-16-5p
MIMAT0000069
UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG
205702
hsa-miR-26a-5p
MIMAT0000082
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU
206023
hsa-miR-29a-3p
MIMAT0000086
UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA
204698
hsa-miR-29b-3p
MIMAT0000100
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
204679
hsa-miR-29c-3p
MIMAT0000681
UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA
204729
La abla iene de la página an e io
La abla con inúa en la página siguien e
MATERIALES Y MÉTODOS
92
hsa-miR-30d-5p
MIMAT0000245
UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG
206047
hsa-miR-148a-3p
MIMAT0000243
UCAGUGCACUACAGAACUUUGU
205867
hsa-miR-195-5p
MIMAT0000461
UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC
205869
hsa-miR-200a-3p
MIMAT0000682
UAACACUGUCUGGUAACGAUGU
204707
hsa-miR-200c-3p
MIMAT0000617
UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA
204482
hsa-miR-375
MIMAT0000728
UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA
204362
hsa-miR-376a-3p
MIMAT0000729
AUCAUAGAGGAAAAUCCACGU
204508
SNORD48
NR_002745
AGUGAUGAUGACCCCAGGUAACUCUGAGUGU
GUCGCUGAUGCCAUCACCGCAGCGCUCUGACC
203903
TABLA 12. Lis a y secuencia de cebado es usados pa a qPCR de los miRNAs.
El análisis po PCR en iempo eal se ha ealizado de mane a ela i a, es e ipo de
cuan i icación mide los cambios en el es ado basal de un gen de in e és espec o a un
gen de exp esión cons an e que ac úa como con ol endógeno o cons i u i o. Debido a
que no se conoce la can idad absolu a del es ánda in e no, sólo se pueden de e mina
los cambios ela i os del gen de in e és con e e encia al gen endógeno. Es necesa io
no maliza los da os en e el alo que se ob iene pa a el gen blanco y el del gen
endógeno, de al mane a que los alo es esul an es sean e lejo de los cambios de
exp esión del gen y no de las di e encias en la can idad de mues a añadida. La
no malización de la exp esión génica se lle ó a cabo median e el mé odo compa a i o
de C (2-∆∆C )(Li ak y Schmi gen, 2001). Es e mé odo es un modelo ma emá ico que
calcula los cambios de exp esión génica como un cambio ela i o en és a (núme o de
eces) en e una mues a expe imen al o gen de in e és y un calib ado o gen
endógeno, cuyas e iciencias de ampli icación (E) deben se compa ables. Se ob ienen los
alo es de ∆C = (C gen-C endógeno) y la can idad ela i a en cada mues a iene de inida
po la siguien e ó mula: 2-(∆C , -∆C , cb) =2-∆∆C , donde es la mues a de e e encia y cb la
mues a calib ado .
3.4.5. Mic oa ay de exp esión génica de miRNAs
El mic oa ay u ilizado en es e es udio p esen a un o ma o de 8x15K, es o implica que
en un solo po a (slide) se in eg an 8 a ays indi iduales imp esos u ilizando la
ecnología Agilen 's 60-me Su eP in echnology, pe mi iendo así analiza 8 ensayos
dis in os de un solo colo en un mismo c is al. A su ez, cada a ay incluye
La abla iene de la página an e io
MATERIALES Y MÉTODOS
93
ap oximadamen e 15.000 sondas diseñadas a pa i de la in o mación exis en e en la
base de da os Sange miRBase. Las sondas son oligonucleó idos de 60-me di ec amen e
sin e izados sob e el slide. El mic oa ay ue ealizado po la unidad de apoyo de
Genómica de CABIMER u ilizando los p o ocolos y las ecomendaciones del ab ican e
pa a es e ipo de a ay. En el Human mic oRNA Mic oa ay es án ep esen ados 939
miRNAs (850 humanos y 89 i ales). La mayo ía de es os miRNAs iene en la placa a ios
cebado es pa a de ec a los, aumen ando la especi icidad. El es o de sondas son
con oles eplicados a ias eces y en a ias posiciones den o de cada a ay, los cuales
el ab ican e Agilen no ecomienda que se u ilicen pa a no maliza sino únicamen e
pa a e alua la e iciencia del ma caje e hib idación. Los da os de in ensidad de
luo escencia de cada uno de las sondas han sido ob enidos median e el so wa e
GenePix P o 7.0. Pos e io men e, se co igió el uido de ondo (backg ound) median e el
algo i mo no mexp (Ri chie e al., 2007) y se ha ealizó una no malización en e a ays
po cuan iles. Finalmen e, las sondas que se co esponden con un mismo miRNA han
sido suma iadas median e la mediana de los espec i os da os de exp esión
no malizados. Una ez hecho, es o se aplicó el es es adís ico limma (Smy h, 2004) pa a
el es udio de la exp esión di e encial en las dis in as condiciones expe imen ales y se
ep esen a os los esul ados median e Hea map, que consis e en una ep esen ación
g á ica de los da os a pa i de alo es indi iduales con enidos en una ma iz
ep esen ada con una escala de colo es, elabo ado con el so wa e lib e pa a análisis
es adís ico R.
Como se puede ap ecia de o ma esquema izada en la Figu a 11, los esul ados
signi ica i amen e es adís icos del análisis de exp esión de los miRNAs median e
mic oa ay deben se alidados, pa a ello no malmen e se u ilizan una se ie de écnicas
como qPCR, No he n blo ing (NB), Wes e n Blo ing (WB) e incluso el uso de múl iples
pla a o mas de mic oa ays, siendo la he amien a de alidación más ampliamen e
u ilizada la qPCR pa a con i ma los da os de exp esión génica ob enidos.
MATERIALES Y MÉTODOS
100
3.5. Mic oscopía
La isualización de las células se ealizó median e un mic oscopio in e ido Olympus
IX71 (Olympus, Tokyo, Japón), con sis ema de cap u a de imágenes (Nikon Eclipse
TS100/TS100-F) con con as e de ases pa a ob ene campos cla os y lámpa a de
me cu io con los il os co espondien es pa a la isualización de luo escencia. El
con ol de la cáma a y p ocesamien o de las imágenes equi ió del so wa e Olympus DP
con olle y DP manage e sión 1.2.1.107 (Olympus, Tokyo, Japón). Las imágenes
con ocales ue on ob enidas u ilizando el mic oscopio con ocal in e ido TCS SP5 Leica
DMI6000 (Leica, We zla , Alemania) que equie e el so wa e LAS-AF e sión (Leica,
We zla , Alemania) pa a el con ol de la explo ación, isualización y adquisición de las
imágenes.
El análisis de cuan i icación de la lo escencia se ealizó median e el so wa e
Me aMo ph e sión 7.5.1.0. (MDS Analy ical echnologies, Sunny ale, CA, USA). Pa a
ello, se u ilizó la elación de los alo es de in ensidad del ma cado luo escen e (Alexa
Fluo ®) y el ma cado de núcleos (Hoechs 33342), po encima de la señal inespecí ica
de uido de ondo (backg ound) p oceden e de la IF emi ida po el sus a o y los da os
se exp esa on como unidades a bi a ias (AU). La cuan i icación ue ealizada en al
menos 50 células po expe imen o de 3 expe imen os independien es.
3.6. Análisis bioin o má ico
El es udio nos p opo ciona el es ado de exp esión (inhibición o sob eexp esión) de una
lis a de genes du an e el p oceso de di e enciación panc eá ico, que se elacionó con la
lis a de los miRNAs con di e encias de exp esión signi ica i as de ec ados en el
mic oa ay de mues as de pánc eas, islo es panc eá icos, y las CTEs di e enciadas y no
di e enciadas.
Se p ocedió a la combinación de ambos esul ados en un análisis bioin o má ico, pa a
in en a elucida las u as de señalización y edes de exp esión génica en las que es án

MATERIALES Y MÉTODOS
101
implicados los miRNAs di e encialmen e exp esados. Pa a ello, con el obje i o de
acili a la in e p e ación de las unciones biológicas a ec adas po los miRNAs con una
exp esión di e encial e lejada en el Mic oa ay y con i mado po qPCR, una p edicción
an o uncional como de dianas génicas ue ealizada usando la base de da os
miRSys em. Es a se encuen a in eg ada po un sis ema pa a la ca ac e ización de
unciones y u as de señalización en iquecidas de dianas de miRNAs. Pa a iden i ica
u as de señalización o unciones biológicas des acadas, se aplicó la elación
Obse ados-Espe ados (O/E) de genes diana, donde la p obabilidad de iden i icación
obse ada (O) pa a un gen dado iene dado po la p opo ción de los miRNAs
consul ados p edichos como diana de ese gen, mien as que la p obabilidad espe ada
(E) la de e mina la p opo ción de odos los miRNAs de la base de da os miRsys em
p edichos como dianas de ese gen. Es e pa áme o cons i uye un indicado de la
signi icación es adís ica que se le o o ga a la posible unión miRNA/mRNA diana,
dependien e de una se ie de alo aciones ene gé icas y de posición pa a esa unión y
ep esen a la p obabilidad de que un gen diana sea seleccionado al aza po los miRNAs,
así como ambién se aplica on o os análisis es adís icos como el alo hipe geomé ico
y empí ico de la pe mu ación, y un anking de pun uación de las u as de señalización a
pa i del alo de exp esión ela i a de los miRNAs.
3.6.1. Análisis p edic i o de dianas de miRNAs
El análisis bioin o má ico de los genes diana po encialmen e egulados po los miRNAs
en es udio a pa i de los genes di e encialmen e exp esados, se lle ó a cabo aplicando
los ecu sos bioin o má icos ac ualmen e disponibles en la Red como es la base de
da os online Mi Sys em que albe ga 2 bases de da os de expe imen os alidados y 7
bases de da os de p edicción de dianas de los miRNAs:
 Ta Base (Ve sion 7.0)
 miReco ds (Ab il, 2013)
MATERIALES Y MÉTODOS
102
 Diana-mic oT (Ve sion 5.0)
 miRanda (Agos o, 2010)
 miRB idge (Ab il, 2010)
 PicTa (Ma zo, 2007)
 PITA (Agos o, 2008)
 RNA22 (Ve sion 2.0)
 Ta ge Scan (Ve sion 7.1)
Pa a aumen a la iabilidad de las p edicciones con un núme o manejable de egis os,
los miRNAs y su exp esión ela i a ue on in oducidos en la base de da os miRSys em,
con el in de dilucida las u as de genes, unciones biológicas y u as canónicas más
al e adas en nues os da os. Solo las dianas de miRNAs alidadas o iden i icadas po al
menos 4 p og amas de p edicción ue on conside adas pa a la ano ación en las u as de
señalización de la base de da os KEGG o de unciones molecula es egis adas en el
p oyec o On ología Génica (GO). Además, los pa áme os ue on con igu ados pa a un
lími e de 25-500 genes po u a de señalización o unción biológica, una elación
obse ados-espe ados igual o supe io a 1,8 (O/E ≥ 1,8) y un anking de pun uación igual
o supe io a 1 (sco e ≥ 1). Es a pun uación se de e mina a pa i de los ni eles de
exp esión de los miRNAs a compa a en e el g upo expe imen al y con ol median e el
mé odo weigh ed pa hway- anking, que consi e en asigna les un peso calculado
di idiendo el alo absolu o de la exp esión de cada miRNA po la suma absolu a de los
alo es de exp esión de odos los miRNAs de en ada (∑∀miRNAwi). A con inuación,
después de iden i ica los genes diana median e los algo i mos de selección de inidos
an e io men e se ob iene un alo p (Pi) pa a ellos y inalmen e se calcula la pun uación
o sco e (∑∀miRNAwi [-log10(pi)]).
MATERIALES Y MÉTODOS
103
3.7. Análisis es adís ico
Todos los expe imen os ue on ealizados po iplicado. Se p esen an los da os, pa a
cada conjun o de mues as, como el alo p omedio ± el e o es ánda de la media
(SEM). Pa a el a amien o es adís ico de los da os de los que cons an los di e en es
es udios de es e abajo, ue necesa io el uso del so wa e G aphPad P ism e sión 6
(G aphPad So wa e, San Diego, CA, USA). El análisis de las di e en es condiciones
expe imen ales pa a de e mina las di e encias es adís icamen e signi ica i as se lle ó a
cabo median e análisis de a iación unidi eccional (ANOVA) pa a múl iples
compa aciones, seguido po la co ección de Holm-Šídák pa a compa a p omedios
en e 2 g upos a un ni el de signi icancia del alo p de al menos 0,05 (p≤0,05).
4. RESULTADOS

RESULTADOS
107
4.1. Ca ac e ización de líneas celula es plu ipo en es
El es udio ealizado equie e líneas celula es plu ipo en es capaces de di e encia se in
i o en de i ados de alguno de los posibles linajes emb iona ios: endode mo,
mesode mo y ec ode mo. En nues o labo a o io con amos con a ias líneas celula es
de CTEs de o igen humano (HS181) o mu ino (ES-D3), así como líneas celula es de iPSCs
de o igen humano (MSUH-001). La azabilidad de las líneas celula es plu ipo en es
u ilizadas con el in de de ini inequí ocamen e que se a a de poblaciones de CTEs o
iPSCs y demos a su plu ipo encia, es lle ada a cabo po un pe sonal écnico cuali icado
y en dedicación exclusi a a los p ocesos a es a ca ac e ización que incluye
p incipalmen e los siguien es pa áme os:
 Mo ología Celula : las células ue on cul i adas in i o como se ha desc i o
p e iamen e po un la go núme o de pases (<100) sin que p esen en
modi icaciones en su mo ología o aspec o. Una ez iniciado el cul i o las células
ue on obse adas dia iamen e bajo mic oscopía óp ica (Figu a 12), pa a e alua
su mo ología, obse ándose du an e los sucesi os pases la o mación de
colonias que adop an la ípica o ma desc i a con bo des ne os y compac os. Las
células emb iona ias p esen an una elación núcleo/ci oplasma al a, con
nucléolos p ominen es.
FIGURA 12. Se obse an o og a ías en campo cla o de las células plu ipo en es de o igen mu ino
(ES-D3) y humano (HS181 y MSHU-001), ag upadas densamen e y o mando colonias de bo des ne os
ca ac e ís icas de un es ado no di e enciado man enido en cul i o in i o. Ba a de escala =50 µm.
RESULTADOS
108
 Análisis de ac o es de asc ipción esponsables de la plu ipo encialidad: el
ca ác e plu ipo en e de las colonias de células no di e enciadas iene de inido
po di e sos ac o es de ansc ipción en e los que podemos des aca la
exp esión de los ma cado es plu ipo en es OCT4, NANOG y SOX2. Como se
mues a en la Figu a 13, es udios de RT-PCR indica on que las CTEs mu inas (ES-
D3) y humanas (HS181), exp esan ma cado es nuclea es de plu ipo encia (OCT4,
NANOG Y SOX2), los cuales se han desc i o como egulado es cla e de las edes
de plu ipo encia y nos indica que conse an un es ado no di e enciado cuando
son cul i adas en las condiciones in i o de man enimien o eque idas.
Es a exp esión a ni el génico ue con i mada ambién po la iden i icación de
es os ac o es de ansc ipción plu ipo en es median e WB que e leja además
como la abundan e exp esión en células no di e enciadas se pie de con la
di e enciación de las células, mien as que la IF nos mues a la exp esión
homogénea en las colonias de los ma cado es de plu ipo encia (OCT4, NANOG y
SOX2), que puede e se disminuida en las células de la pe i e ia de las colonias
debido al inicio de p ocesos de di e enciación en es a zona.
La igu a con inúa en la página siguien e
RESULTADOS
109
FIGURA 13. Ca ac e ización de los ma cado es de plu ipo encia (OCT4, NANOG y SOX2) de las células
plu ipo en es en es ado no di e enciado median e RT-PCR, WB y de ección de inmuno luo escencia en las CTEs
mu inas (ES-D3) y humanas (HS181). Ba a de escala = 2 µm.
 Análisis de ma cado es de memb ana. O o ac o impo an e que de ine a las
células plu ipo en es es la exp esión de ma cado es de supe icie de memb ana
exclusi os como SSEA-4 y las glicop o eínas ansmemb ana TRA-1-60 y TRA-1-
80, odas ellas de ec adas median e IF e lejado en la Figu a 14A. O o mé odo
pa a el seguimien o de la plu ipo encia de las células Las células plu ipo en es es
la de e minación de la exp esión de os a asa alcalina (AP), que puede se
ácilmen e ensayada debido a la capacidad de es a enzima pa a cambia la
con o mación de un eac i o colo imé ico de un es ado soluble a un p ecipi ado,
gene ando la inción de colonias celula es ácilmen e iden i icables.
FIGURA 14. Ca ac e ización de ma cado es de supe icie (SSEA-4, TRA-1-60 Y TRA-1-80) y inción de
la AP en las CTEs (HS181) e iPSCs (MSHU-001) de o igen humano. Ba a de escala =50 µm.
La igu a iene de la página an e io
RESULTADOS
116
di e enciadas ue de e minada median e ELISA en espues a a las di e en es
concen aciones de glucosa (2,7-20 mM). Las células di e enciadas espon áneamen e al
e i a del medio de cul i o el LIF (LIF-), no esponden a la es imulación y solo se obse a
una libe ación de insulina basal independien e de la p esencia o ausencia de glucosa.
Mien as que en las células di e enciadas a baja concen ación de glucosa (2,7 mM), ya
se obse ó una libe ación de insulina que ue ap oximadamen e 4 eces mayo (p≤0,05)
en las células di e enciadas sin ans ec a (Con ol) y 6 eces mayo (p≤0,05) en las
células di e enciadas ans ec adas con los miRNAs (miRNAs-pool) espec o a las células
di e enciadas espon áneamen e (LIF-). Las células no ans ec adas (Con ol) aunque
mani ies an una espues a inicial a bajas concen aciones de glucosa, no espondie on a
un inc emen o en la concen ación de glucosa (10 mM), mien as que en las células
ans ec adas (miRNAs-pool) si aumen o la libe ación de insulina signi ica i amen e
has a 10 eces (p≤0,05), sin emba go con al as concen aciones de glucosa (20 mM)
pa ece que las células no esis ie on las condiciones y no pudie on esponde al
es ímulo como pod ía hace lo una célula be a panc eá ica o almen e uncional como
podemos obse a en la Figu a 18.
FIGURA 18. Sec eción de insulina en e a la es imulación con glucosa (2,7-20 mM) du an e 1 ho a en
las células ob enidas al inal del p oceso de di e enciación: CTEs di e enciadas espon áneamen e
(LIF-); CTEs some idas al p o ocolo de di e enciación sin adición del pool de miRNAs (Con ol); CTEs
con la adición del pool de miRNAs (miRNAs-pool). Los alo es son mos ados (media±SEM). n=3;
∗p≤0,05; aco de al es holm-šídák.

RESULTADOS
117
Po an o, pa ece que los miRNAs pueden cons i ui candida os pa a mejo a las
es a egias de di e enciación ac uales pa a ob ene células p oduc o as de insulina
madu as a pa i de las CTEs in i o. Po lo que, nos p opusimos p o undiza en el
es udio de la implicación de los miRNAs en el desa ollo panc eá ico y de e mina su
e ec o en los p ocesos de di e enciación. Es a p ime a ap oximación con las pequeñas
moléculas de ncRNA especí icas de los islo es panc eá icos, apoyó nues a hipó esis de
abajo en la egulación que pueden eje ce los miRNAs en los p ocesos de
di e enciación de las CTEs a ni el pos - ansc ipcional, cla e pa a con ola la
coo dinación de la exp esión génica. Po ello, pa a p o undiza en el es udio del papel
que los miRNAs pueden eje ce en es e con ol, nos p opusimos analiza el pa ón de
exp esión di e encial de los miRNAs du an e el p oceso de di e enciación de las CTEs
humanas hacia células p oduc o as de insulina.
4.2.2. Exp esión de los miRNAs ca ac e ís icos del
pánc eas
Ya se ha demos ado que muchos miRNAs mues an pa ones de exp esión empo al y
especí ica de ejidos, deses abilizando di e sos p ocesos de ansc ipción génica pa a
de ini aún más los pe iles de ansc ipción especí icos de ejidos. El análisis uncional
puede se co ompido po el es udio de in e acciones en e miRNAs y mRNAs diana que
no se exp esan en el ejido conside ado, po ello analizamos la exp esión di e encial de
miRNAs en di e sos ejidos humanos (pánc eas, co azón, iñón, hígado, pulmón y
ce eb o), pa a ello ecu imos a la base de da os de exp esión de miRNAs
(h p://www.mic o na.o g), que nos p opo ciona un amplio conjun o de da os sob e la
exp esión de los miRNAs y la p edicción de mRNAs diana de i ado de un amplio
p oyec o de secuenciación de un g an conjun o de ejidos de mamí e os y líneas
celula es de o igen animal, como podemos obse a en la Figu a 19 cada ejido
p esen a un pe il de exp esión de miRNAs ca ac e ís ico.
RESULTADOS
118
FIGURA 19. Base de da os de exp esión de miRNAs en los ejidos del o ganismo. La escala en
g adien e de colo ep esen a los alo es de exp esión de un pe il especí ico de miRNAs en los
ejidos del o ganismo, en las columnas se ep esen a el ni el de exp esión de los miRNAs y en las
ilas los di e en es ejidos.
El análisis de los esul ados nos pe mi ió iden i ica el subconjun o de miRNAs
exp esados abundan emen e y de o ma p e e en e en cada ejido. El pánc eas
p esen a un subconjun o o g upo de miRNAs que se puede asocia con la adquisición y
el man enimien o del eno ipo panc eá ico en e los podemos des aca miR-7, -15a, -16,
-26a, -29a/b/c, -30d, -124, -148a, -214, -200a/c, -375 y -376a (Figu a 20A). Pa a
comp oba la co elación en e el subconjun o de miRNAs panc eá icos iden i icado en
la base de da os y los miRNAs exp esados en nues a mues a del pool de miRNAs de
islo es panc eá icos u ilizadas pa a la ans ección de las CTEs mu inas desc i a
an e io men e, se analizó la exp esión di e encial de miRNAs en e dicha mues a del
pool de islo es panc eá icos y un nue o pool gene ado a pa i de mues as de co azón
mu ino median e qPCR. Es e análisis e eló que el miRNA con mayo exp esión en las
mues as panc eá icas ue miR-375, seguido de las amilias miR-29 (miR-29a/b/c) y miR-
200 (miR-200a/c) y ambién des aca la exp esión de miR-7, -15a, -148a y -214. Sin
emba go, a di e encia de los ni eles de exp esión e lejados po la base de da os pa a
RESULTADOS
119
los miRNAs panc eá icos donde des aca miR-124, los esul ados de qPCR no
e idencia on exp esión de es e miRNA en el pool de miRNAs ans ec ados como
podemos en obse a en la Figu a 20B.
FIGURA 20. A) La base de da os de exp esión de miRNAs e ela un conjun o de miRNAs con una
exp esión p e e en emen e panc eá ica. B) Análisis median e qPCR del pool de miRNAs panc eá icos
u ilizado en la ans ección de las CTEs en e a un pool de miRNAs de mues as de co azón mu ino.
Los alo es son mos ados (media±SEM). n=3; ∗p≤0,05, ∗∗p≤0,01, ∗∗∗p≤0,001; aco de al es holm-
šídák.
RESULTADOS
120
4.3. Análisis de miRNAs en la di e enciación de las CTEs
4.3.1. Di e enciación de las CTEs hacia células
p oduc o as de insulina
Con el obje i o de es udia el pa ón de exp esión de miRNAs ca ac e ís icos de las CTEs
en di e enciación hacia células p oduc o as de insulina, u ilizamos el p o ocolo CABIMER
de di e enciación en las CTEs humanas (HS181) es ablecido en nues o labo a o io. Es e
p o ocolo ha sido desc i o en de alle p e iamen e en el apa ado 3.2 y p e ende simula
las e apas del desa ollo panc eá ico in i o ins uyendo a las CTEs a a és de cada
e apa in e media del desa ollo endodé mico, simila a lo que ocu e du an e el
desa ollo panc eá ico (endode mo de ini i o, endode mo del in es ino p imi i o,
endode mo panc eá ico y p ecu so es endoc inos), median e la combinación de
di e en es ac o es de c ecimien o que ac i en o inac i en secuencialmen e las ías de
desa ollo adecuadas, como se obse a esquema izado en la Figu a 21.
FIGURA 21. Esquema de las e apas eque idas pa a la di e enciación de las CTEs humanas (HS181) en
células p oduc o as de insulina, jun o con imágenes de mic oscopio ep esen a i as de las
di e en es e apas. Rep esen ación esquemá ica del p o ocolo de di e enciación di igida basado en la
ac i ación secuencial de ías de señalización du an e el desa ollo, induciendo la di e enciación de
las CTEs humanas (HS181) hacia un des ino de célula be a panc eá ica. Ba a de escala =200 µm.
Al inal de es e p o ocolo de di e enciación pa a comp oba su e ec i idad, analizamos
la exp esión de genes asociados a la plu ipo encia, ma cado es de linaje emb iona io
RESULTADOS
121
(ec ode mo, mesode mo y endode mo) y ma cado es panc eá icos median e qPCR,
como se puede obse a en la Figu a 22. En p ime luga , la exp esión de los genes de
plu ipo encia OCT4, NANOG y SOX2 su ie on una ápida inhibición signi ica i a a día 5
an o en las células di e enciadas espon áneamen e (SD-hCTE) como en las células
di e enciadas con el p o ocolo CABIMER (DD-hCTE) espec o a las CTEs no di e enciadas,
indica i o de la ápida salida del es ado no di e enciado de las células. A con inuación,
pa a e alua la posible o mación inespecí ica de células p o enien es de linajes
emb iona ios no deseados (ec ode mo y mesode mo), se e aluó la exp esión de
ma cado es ec odé micos (SOX1) y mesodé micos (FLK1, BRACHYURY), los cuales no
p esen aban un aumen o de exp esión signi ica i o en las células some idas al p o ocolo
de di e enciación CABIMER (DD-hCTE), sin emba go las células di e enciadas
espon áneamen e (SD-hCTE) sí que mos a on un aumen o signi ica i o de los ni eles
de exp esión de SOX1, FLK1 y BRACHYURY.
FIGURA 22. Inducción de la di e enciación in i o de las CTEs humanas (HS181), median e el p o ocolo CABIMER.
Las CTEs ue on di e enciadas a células p oduc o as de insulina (DD-hCTE) o di e enciadas espon áneamen e
(SD-hCTE). Se analiza on ma cado es de genes de plu ipo encia, ec ode mo y mesode mo median e qPCR. Los
alo es de exp esión ela i a de los genes de ec ados (calculadas a pa i de los alo es de C no malizados po
el mé odo de 2-ΔΔC ), asumiendo como mues a de e e encia las CTEs no di e enciadas y RPLP como gen
no malizado . Los alo es son mos ados (media±SEM). n=6; ∗p≤0,05 aco de al es holm-šídák.

RESULTADOS
122
Con el obje i o de alida si las células di e enciadas median e el p o ocolo CABIMER
(DD-hCTE) pod ían es a comp ome idas con la u a de di e enciación endodé mica, se
analizó la exp esión de genes di e encialmen e exp esados que cons i uyen ma cado es
del endode mo de ini i o du an e la p ime a e apa del p o ocolo. Es a se ca ac e iza
po condiciones de cul i o con baja concen ación de sue o (FBS) pa a inhibi la
ac i ación de la ía de señalización PI3K y la adición combinada de ac o es esenciales
como la ac i ina A ac i ado de la ía de señalización Nodal y el Wn 3a ac i ado de la
ía de señalización Wn , pa a induci la o mación del mesendode mo con el obje i o
inal de ob ene el endode mo de ini i o, e lejado en un aumen o signi ica i o de los
ni eles de exp esión de SOX17, GSC y HNF3β (FOXA2), dando luga a una población de
células GSC+/SOX17+/HNF3β+ ca ac e ís ica del endode mo de ini i o.
El p oceso de di e enciación p osiguió hacia el endode mo panc eá ico inducido
median e la adición p og esi a de sue o (FBS, 0-5%) y la e i ada de la ac i ina A del
cul i o a los 5 días, e lejado en un aumen o de exp esión signi ica i o de ma cado es
génicos como HNF1β y HNF4α, además NEUROG3 un egulado esencial de la
di e enciación celula endoc ina panc eá ica con sus dianas NEUROD1 y NKX2.2 ue
ansi o iamen e inducido en es a población celula , aunque su exp esión ue inhibida
ápidamen e impidiendo la inducción p ema u a del p og ama panc eá ico endoc ino.
La adición combinada del h bFGF, induc o del eno ipo panc eá ico y el ácido e inoico
un po en e mo ógeno induc o de la di e enciación du an e 3 días pe mi e inhibi la ía
de señalización Shh, dando luga a la inducción del p og ama panc eá ico. Po an o,
pa a induci la o mación de los p ecu so es endoc inos in i o, las células ue on
a adas secuencialmen e du an e 6 días en o al con los ac o es nogina pa a inhibi la
ía de señalización Bmp (3 días) y ciclopamina que o alece la inhibición de la ía de
señalización Shh (3 días), ob eniéndose un desa ollo endoc ino p e e en e a expensas
de o os de i ados endodé micos. Las células mani es a on un aumen o signi ica i o de
la exp esión de PAX6, NKX2.2 y PDX1, es e úl imo un ac o esencial pa a el desa ollo
RESULTADOS
123
del pánc eas y la o mación de las células be a panc eá icas, gene ándose una población
celula esul an e de p ogeni o es panc eá icos ácilmen e iden i icable po la exp esión
NKX2.2+/PAX6+/PDX1+.
La úl ima e apa, se ca ac e iza po el cul i o de las células en suspensión induciendo la
o mación de ag egados celula es simila es a los clus e de los islo es panc eá icos,
cons i uyéndose una es uc u a idimensional impo an e en la inducción de células
madu as uncionales p oduc o as de insulina a pa i de las CTEs.
Además, pa a complemen a es e p oceso de madu ación du an e es a e apa inal de
cul i o en suspensión se p opo cionó al medio una mezcla de ac o es cons i uida po
insulina, ans e ina, selenio y ib onec ina du an e 6 días, suplemen ada con
es e a ol los úl imos 2 días, cuyo obje i o es la madu ación de la población
NKX2.2+/PAX6+/PDX1+ ob enida p e iamen e, di e enciándose en células que exp esan
especí icamen e insulina, pe o no o as ho monas panc eá icas, ales como glucagón y
soma os a ina. En p ime luga , obse amos como la e apa de madu ación eac i a la
exp esión de NEUROG3 acompañado de un aumen o signi ica i o en la exp esión de
a ios ma cado es que cons i uyen egulado es ansc ipcionales impo an es pa a
de e mina la iden idad de células endoc inas con una exp esión es ingida a las células
be a como son NEUROD1, NKX6.1 y MAFA y además, se obse ó un aumen o de
exp esión signi ica i o de algunos de los ma cado es clásicos de células be a de los
islo es panc eá icos que incluyen a la insulina (INS) y un anspo ado de glucosa
(GLUT2) eque ido pa a la sec eción de insulina es imulada po glucosa (GSIS) en la
úl ima e apa del p o ocolo de di e enciación.
El análisis de exp esión di e encial de los genes especí icos de endode mo y pánc eas
esumido, en e los g upos celula es DD-hCTE y SD-hCTE, puede se isualizado a
con inuación con más de alle en la Figu a 23.
RESULTADOS
124
FIGURA 23. Inducción de la di e enciación in i o de las CTEs humanas (HS181), median e el p o ocolo CABIMER.
Las CTEs ue on di e enciadas a células p oduc o as de insulina (DD-hCTE) o di e enciadas espon áneamen e
(SD-hCTE). Se analiza on ma cado es de genes del desa ollo endodé mico y panc eá ico median e qPCR. Los
alo es de exp esión ela i a de los genes de ec ados (calculadas a pa i de los alo es de C no malizados po
el mé odo de 2-ΔΔC ), asumiendo como mues a de e e encia las CTEs no di e enciadas y RPLP como gen
no malizado . Los alo es son mos ados (media±SEM). n=6; ∗p≤0,05, ∗∗p≤0,01, ∗∗∗p≤0,001 aco de al es
holm-šídák.
RESULTADOS
125
La de ección de las p o eínas FOXA2, PDX1, PÉPTIDO-C e INSULINA en las CTEs
di e enciadas in i o (Figu a 24) con i ma on los esul ados de exp esión ansc ipcional
ob enidos median e qPCR. En las p ime as e apas se obse ó una exp esión
gene alizada en el cul i o de un ma cado emp ano del endode mo de ini i o como
FOXA2 (días 5-8), pos e io men e se gene a on colonias celula es posi i as pa a un
ma cado esencial en el desa ollo panc eá ico como PDX1 (días 11-22) y en las úl imas
e apas la colocalización de INSULINA y PÉPTIDO-C (días 14-22) e ela la sín esis de
insulina po colonias de células p oduc o as de insulina ob enidas a pa i de las CTEs.
FIGURA 24. De ección median e IF du an e el p oceso de di e enciación de ma cado es de células y
p ogeni o es panc eá icos pa a la de e minación de células p oduc o as de insulina ob enidas a
pa i de las CTEs (HS181) en es adios emp anos, in e medios y a anzadas del p oceso de
di e enciación. A) FOXA2 ( e de) en las células di e enciadas hacia el endode mo de ini i o en la
e apa emp ana. B) PDX1 ( e de) en células comp ome idas a p ogeni o es panc eá icos en la e apa
in e media. C) INSULINA ( ojo) y PÉPTIDO-C ( e de) en clus e simila es a islo es panc eá icos en la
e apa a anzada de di e enciación. Ba a de escala =50 µm.
Po an o, es os da os con i man la ob ención de células p oduc o as de insulina
ob enidas a pa i de las CTEs median e el p o ocolo CABIMER de di e enciación y nos
p opo ciona la base de es udio de exp esión de los miRNAs du an e el p oceso de
di e enciación.
BIBLIOGRAFÍA
228
Sande , M., A. Neubüse , J. Kalama as, H.C. Ee, G.R. Ma in, y M.S. Ge man. 1997. Gene ic analysis e eals ha PAX6
is equi ed o no mal ansc ip ion o panc ea ic ho mone genes and isle de elopmen . Genes De . 11:1662-
73.
Sca le , J.A., R.S. G ay, J. G i in, J.M. Ole sky, y O.G. Kol e man. Insulin ea men e e ses he insulin esis ance o
ype II diabe es melli us. Diabe es Ca e. 5:353-63.
Scha p, D.W., J.J. Mu phy, W.T. New on, W.F. Ballinge , y P.E. Lacy. 1975. T ansplan a ion o isle s o Lange hans in
diabe ic hesus monkeys. Su ge y. 77:100-5.
Schisle , J.C., P.B. Jensen, D.G. Taylo , T.C. Becke , F.K. Knop, S. Takekawa, M. Ge man, G.C. Wei , D. Lu, R.G.
Mi mi a, y C.B. Newga d. 2005. The Nkx6.1 homeodomain ansc ip ion ac o supp esses glucagon
exp ession and egula es glucose-s imula ed insulin sec e ion in isle be a cells. P oc. Na l. Acad. Sci. U. S. A.
102:7297-302.
Sch oede , I.S., A. Rolle schek, P. Blyszczuk, G. Kania, y A.M. Wobus. 2006. Di e en ia ion o mouse emb yonic s em
cells o insulin-p oducing cells. Na . P o oc. 1:495-507.
Schuldine , M., O. Yanuka, J. I sko i z-Eldo , D.A. Mel on, y N. Ben enis y. 2000. E ec s o eigh g ow h ac o s on
he di e en ia ion o cells de i ed om human emb yonic s em cells. P oc. Na l. Acad. Sci. U. S. A. 97:11307-
12.
Schul z, J., P. Lo enz, G. G oss, S. Ib ahim, y M. Kunz. 2008. Mic oRNA le -7b a ge s impo an cell cycle molecules
in malignan melanoma cells and in e e es wi h ancho age-independen g ow h. Cell Res. 18:549-57.
Schulz, T.C., H.Y. Young, A.D. Agulnick, M.J. Babin, E.E. Bae ge, A.G. Bang, A. Bhoumik, I. Cepa, R.M. Cesa io, C.
Haakmees e , K. Kadoya, J.R. Kelly, J. Ke , L.A. Ma inson, A.B. McLean, M.A. Moo man, J.K. Payne, M.
Richa dson, K.G. Ross, E.S. She e , X. Song, A.Z. Wilson, E.P. B andon, C.E. G een, E.J. K oon, O.G. Kelly, K.A.
D’Amou , y A.J. Robins. 2012. A scalable sys em o p oduc ion o unc ional panc ea ic p ogeni o s om
human emb yonic s em cells. PLoS One. 7:e37004.
Schwa z, D.S., G. Hu ágne , T. Du, Z. Xu, N. A onin, y P.D. Zamo e. 2003. Asymme y in he assembly o he RNAi
enzyme complex. Cell. 115:199-208.
Sege , H., B. Fishman, A. Ziskind, M. Shulman, y J. I sko i z-Eldo . 2004. Di e en ia ion o human emb yonic s em
cells in o insulin-p oducing clus e s. S em Cells. 22:265-74.
Selbach, M., B. Schwanhäusse , N. Thie elde , Z. Fang, R. Khanin, y N. Rajewsky. 2008. Widesp ead changes in
p o ein syn hesis induced by mic oRNAs. Na u e. 455:58-63.
Sen, G.L., y H.M. Blau. 2005. A gonau e 2/RISC esides in si es o mammalian mRNA decay known as cy oplasmic
bodies. Na . Cell Biol. 7:633-6.
Shannon, J.M., y B.A. Hya . 2004. Epi helial-mesenchymal in e ac ions in he de eloping lung. Annu. Re . Physiol.
66:625-45.
Shapi o, A.M., J.R. Lakey, E.A. Ryan, G.S. Ko bu , E. To h, G.L. Wa nock, N.M. Kne eman, y R. V Rajo e. 2000. Isle
ansplan a ion in se en pa ien s wi h ype 1 diabe es melli us using a glucoco icoid- ee immunosupp essi e
egimen. N. Engl. J. Med. 343:230-8.
Shapi o, A.M.J., C. Rico di, B.J. He ing, H. Auchincloss, R. Lindblad, R.P. Robe son, A. Secchi, M.D. B endel, T.
Be ney, D.C. B ennan, E. Caglie o, R. Alejand o, E.A. Ryan, B. DiMe cu io, P. Mo el, K.S. Polonsky, J.-A. Reems,
R.G. B e zel, F. Be uzzi, T. F oud, R. Kandaswamy, D.E.R. Su he land, G. Eisenba h, M. Segal, J. P eiksai is,
G.S. Ko bu , F.B. Ba on, L. Vi iano, V. Sey e -Ma golis, J. Blues one, y J.R.T. Lakey. 2006. In e na ional ial o
he Edmon on p o ocol o isle ansplan a ion. N. Engl. J. Med. 355:1318-30.
Sheka , P.C., A. Naim, D.P. Sa a hi, y S. Kuma . 2011. A gonau e-2-null emb yonic s em cells a e e a ded in sel -

BIBLIOGRAFÍA
229
enewal and di e en ia ion. J. Biosci. 36:649-57.
Shen, M.M. 2007. Nodal signaling: de elopmen al oles and egula ion. De elopmen . 134:1023-34.
She wood, R.I., T.-Y.A. Chen, y D.A. Mel on. 2009. T ansc ip ional dynamics o endode mal o gan o ma ion. De .
Dyn. 238:29-42.
Shi, W., H. Wang, G. Pan, Y. Geng, Y. Guo, y D. Pei. 2006. Regula ion o he Plu ipo ency Ma ke Rex-1 by Nanog and
Sox2. J. Biol. Chem. 281:23319-25.
Shi, Y., L. Hou, F. Tang, W. Jiang, P. Wang, M. Ding, y H. Deng. 2005. Inducing emb yonic s em cells o di e en ia e
in o panc ea ic be a cells by a no el h ee-s ep app oach wi h ac i in A and all- ans e inoic acid. S em Cells.
23:656-62.
Shim, J., y J.-W. Nam. 2016. The exp ession and unc ional oles o mic oRNAs in s em cell di e en ia ion. BMB Rep.
49:3-10.
Shim, J.H., S.E. Kim, D.H. Woo, S.K. Kim, C.H. Oh, R. McKay, y J.H. Kim. 2007. Di ec ed di e en ia ion o human
emb yonic s em cells owa ds a panc ea ic cell a e. Diabe ologia. 50:1228-38.
Shiozaki, S., T. Tajima, Y.Q. Zhang, M. Fu ukawa, Y. Nakaza o, y I. Kojima. 1999. Impai ed di e en ia ion o endoc ine
and exoc ine cells o he panc eas in ansgenic mouse exp essing he unca ed ype II ac i in ecep o .
Biochim. Biophys. Ac a. 1450:1-11.
Shi oi, A., M. Yoshikawa, H. Yoko a, H. Fukui, S. Ishizaka, K. Ta sumi, y Y. Takahashi. 2002. Iden i ica ion o insulin-
p oducing cells de i ed om emb yonic s em cells by zinc-chela ing di hizone. S em Cells. 20:284-92.
Sil a, J., J. Nichols, T.W. Theunissen, G. Guo, A.L. an Oos en, O. Ba andon, J. W ay, S. Yamanaka, I. Chambe s, y A.
Smi h. 2009. Nanog is he ga eway o he plu ipo en g ound s a e. Cell. 138:722-37.
Simó, R., y C. He nández. 2002. [T ea men o diabe es melli us: gene al goals, and clinical p ac ice managemen ].
Re . espanola Ca diol. 55:845-60.
Simonson, D.C., E. Fe annini, S. Be ilacqua, D. Smi h, E. Ba e , R. Ca lson, y R.A. DeF onzo. 1984. Mechanism o
imp o emen in glucose me abolism a e ch onic glybu ide he apy. Diabe es. 33:838-45.
Singh, A.M., y S. Dal on. 2009. The cell cycle and Myc in e sec wi h mechanisms ha egula e plu ipo ency and
ep og amming. Cell S em Cell. 5:141-9.
Sinkkonen, L., T. Hugenschmid , P. Be ninge , D. Gaida zis, F. Mohn, C.G. A us-Re el, M. Za olan, P. S oboda, y W.
Filipowicz. 2008. Mic oRNAs con ol de no o DNA me hyla ion h ough egula ion o ansc ip ional
ep esso s in mouse emb yonic s em cells. Na . S uc . Mol. Biol. 15:259-67.
Slack, F.J., M. Basson, Z. Liu, V. Amb os, H.R. Ho i z, y G. Ru kun. 2000. The lin-41 RBCC gene ac s in he C. elegans
he e och onic pa hway be ween he le -7 egula o y RNA and he LIN-29 ansc ip ion ac o . Mol. Cell. 5:659-
69.
Smalheise , N.R., y V.I. To ik. 2005. Mammalian mic oRNAs de i ed om genomic epea s. T ends Gene . 21:322-6.
Smy h, G.K. 2004. Linea models and empi ical bayes me hods o assessing di e en ial exp ession in mic oa ay
expe imen s. S a . Appl. Gene . Mol. Biol. 3:A icle3.
Son, M.-Y., H. Choi, Y.-M. Han, y Y. Sook Cho. 2013. Un eiling he c i ical ole o REX1 in he egula ion o human
s em cell plu ipo ency. S em Cells. 31:2374-87.
Song, S.Y., M. Gannon, M.K. Washing on, C.R. Scoggins, I.M. Meszoely, J.R. Golden ing, C.R. Ma ino, E.P. Sandg en,
R.J. Co ey, C. V W igh , y S.D. Leach. 1999. Expansion o Pdx1-exp essing panc ea ic epi helium and isle
neogenesis in ansgenic mice o e exp essing ans o ming g ow h ac o alpha. Gas oen e ology. 117:1416-
BIBLIOGRAFÍA
230
26.
So di, V., F. Be uzzi, y L. Piemon i. 2008. Diabe es melli us: an oppo uni y o he apy wi h s em cells? Regen. Med.
3:377-97.
So ia, B., F.J. Bedoya, J.R. Tejedo, A. Hmadcha, R. Ruiz-Salme ón, S. Lim, y F. Ma in. 2008. Cell he apy o diabe es
melli us: an oppo uni y o s em cells? Cells. Tissues. O gans. 188:70-7.
So ia, B., E. Mon anya, F. Ma ín, y A. Hmadcha. 2016. A Role o he Hos in he Roadmap o Diabe es S em Cell
The apy. Diabe es. 65:1155-7.
So ia, B., E. Roche, G. Be ná, T. León-Quin o, J.A. Reig, y F. Ma ín. 2000. Insulin-sec e ing cells de i ed om
emb yonic s em cells no malize glycemia in s ep ozo ocin-induced diabe ic mice. - PubMed - NCBI. Diabe es.
49:157-62.
So ia, B., A. Skoudy, y F. Ma ín. 2001. F om s em cells o be a cells: new s a egies in cell he apy o diabe es
melli us. Diabe ologia. 44:407-15.
So igue , F., A. Goday, A. Bosch-Comas, E. Bo diú, A. Calle-Pascual, R. Ca mena, R. Casami jana, L. Cas año, C.
Cas ell, M. Ca alá, E. Delgado, J. F anch, S. Gaz ambide, J. Gi bés, R. Gomis, G. Gu ié ez, A. López-Alba, M.T.
Ma ínez-La ad, E. Menéndez, I. Mo a-Peces, E. O ega, G. Pascual-Manich, G. Rojo-Ma ínez, M. Se ano-
Rios, S. Valdés, J.A. Vázquez, y J. Vend ell. 2012. P e alence o diabe es melli us and impai ed glucose
egula ion in Spain: he Di@be .es S udy. Diabe ologia. 55:88-93.
Spence, J.R., A.W. Lange, S.-C.J. Lin, K.H. Kaes ne , A.M. Lowy, I. Kim, J.A. Whi se , y J.M. Wells. 2009. Sox17
egula es o gan lineage seg ega ion o en al o egu p ogeni o cells. De . Cell. 17:62-74.
S adle , B., I. I ano ska, K. Meh a, S. Song, A. Nelson, Y. Tan, J. Ma hieu, C. Da by, C.A. Blau, C. Wa e, G. Pe e s, D.G.
Mille , L. Shen, M.A. Clea y, y H. Ruohola-Bake . 2010. Cha ac e iza ion o mic oRNAs in ol ed in emb yonic
s em cell s a es. S em Cells De . 19:935-50.
S a o d, D., A. Ho nb uch, P.R. Muelle , y V.E. P ince. 2004. A conse ed ole o e inoid signaling in e eb a e
panc eas de elopmen . De . Genes E ol. 214:432-41.
S a k, A., J. B ennecke, N. Busha i, R.B. Russell, y S.M. Cohen. 2005. Animal Mic oRNAs con e obus ness o gene
exp ession and ha e a signi ican impac on 3’UTR e olu ion. Cell. 123:1133-46.
S ens öm, G., I. E nes , y L.E. Tisell. 1988. Long- e m esul s in 64 pa ien s ope a ed upon o pheoch omocy oma.
Ac a Med. Scand. 223:345-52.
S e ana o, L., y J.D. Sinden. 2014. The e ec s o mic oRNAs on human neu al s em cell di e en ia ion in wo- and
h ee-dimensional cul u es. S em Cell Res. The . 5:49.
Sub amanyam, D., S. Lamouille, R.L. Judson, J.Y. Liu, N. Bucay, R. De ynck, y R. Blelloch. 2011. Mul iple a ge s o
miR-302 and miR-372 p omo e ep og amming o human ib oblas s o induced plu ipo en s em cells. Na .
Bio echnol. 29:443-48.
Suh, M.-R., Y. Lee, J.Y. Kim, S.-K. Kim, S.Y.S.-H.S.Y. Moon, J.Y. Lee, K.-Y. Cha, H.M. Chung, H.S. Yoon, S.Y.S.-H.S.Y.
Moon, V.N. Kim, y K.-S. Kim. 2004. Human emb yonic s em cells exp ess a unique se o mic oRNAs. De . Biol.
270:488-98.
Sui, L., L. Bouwens, y J.K. M opou. 2013. Signaling pa hways du ing main enance and de ini i e endode m
di e en ia ion o emb yonic s em cells. In . J. De . Biol. 57:1-12.
Sui, L., J.K. M opou, M. Geens, K. Se mon, y L. Bouwens. 2012. FGF signaling ia MAPK is equi ed ea ly and
imp o es Ac i in A-induced de ini i e endode m o ma ion om human emb yonic s em cells. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 426:380-5.
BIBLIOGRAFÍA
231
Sun, B., K.-H. Roh, S.-R. Lee, Y.-S. Lee, y K.-S. Kang. 2007. Induc ion o human umbilical co d blood-de i ed s em cells
wi h emb yonic s em cell pheno ypes in o insulin p oducing isle -like s uc u e. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 354:919-23.
Sun, L.-L.L., B.-G.G. Jiang, W.-T.T. Li, J.-J.J. Zou, Y.-Q.Q. Shi, y Z.-M.M. Liu. 2011. Mic oRNA-15a posi i ely egula es
insulin syn hesis by inhibi ing uncoupling p o ein-2 exp ession. Diabe es Res. Clin. P ac . 91:94-100.
Sussel, L., J. Kalama as, D.J. Ha igan-O’Conno , J.J. Meneses, R.A. Pede sen, J.L. Rubens ein, y M.S. Ge man. 1998.
Mice lacking he homeodomain ansc ip ion ac o Nkx2.2 ha e diabe es due o a es ed di e en ia ion o
panc ea ic be a cells. De elopmen . 125:2213-21.
Su he land, D.E., R.W. G uessne , y A.C. G uessne . 2001. Panc eas ansplan a ion o ea men o diabe es
melli us. Wo ld J. Su g. 25:487-96.
Szebenyi, G., y J.F. Fallon. 1999. Fib oblas g ow h ac o s as mul i unc ional signaling ac o s. In . Re . Cy ol. 185:45-
106.
Tada, S., T. E a, C. Fu usawa, H. Saku ai, S.S.-I. Nishikawa, M. Kinoshi a, K. Nakao, T. Chiba, y S.S.-I. Nishikawa. 2005.
Cha ac e iza ion o mesendode m: a di e ging poin o he de ini i e endode m and mesode m in emb yonic
s em cell di e en ia ion cul u e. De elopmen . 132:4363-74.
Takahashi, K., K. Tanabe, M. Ohnuki, M. Na i a, T. Ichisaka, K. Tomoda, y S. Yamanaka. 2007. Induc ion o plu ipo en
s em cells om adul human ib oblas s by de ined ac o s. Cell. 131:861-72.
Takahashi, K., y S. Yamanaka. 2006. Induc ion o plu ipo en s em cells om mouse emb yonic and adul ib oblas
cul u es by de ined ac o s. Cell. 126:663-76.
Takaya, T., K. Ono, T. Kawamu a, R. Takanabe, S. Kaichi, T. Mo imo o, H. Wada, T. Ki a, A. Shima su, y K. Hasegawa.
2009. Mic oRNA-1 and Mic oRNA-133 in spon aneous myoca dial di e en ia ion o mouse emb yonic s em
cells. Ci c. J. 73:1492-7.
Tang, X., L. Muniappan, G. Tang, y S. Ozcan. 2009. Iden i ica ion o glucose- egula ed miRNAs om panc ea ic {be a}
cells e eals a ole o miR-30d in insulin ansc ip ion. RNA. 15:287-293.
Ta aso , V., P. Jung, B. Ve dood , D. Lodygin, A. Epanchin se , A. Menssen, G. Meis e , y H. He meking. 2007.
Di e en ial egula ion o mic oRNAs by p53 e ealed by massi ely pa allel sequencing: miR-34a is a p53 a ge
ha induces apop osis and G1-a es . Cell Cycle. 6:1586-93.
Ta iko a, S.G., T. Ra hjen, S.J. McAnul y, H.-H. Wessels, I. Ake man, M. an de Bun , J. Hausse , J.L.S. Esgue a, A.
Musahl, A.K. Pandey, X. You, W. Chen, P.L. He e a, P.R. Johnson, D. O’Ca oll, L. Eliasson, M. Za olan, A.L.
Gloyn, J. Fe e , R. Shalom-Feue s ein, D. Abe dam, y M.N. Poy. 2014. A gonau e2 media es compensa o y
expansion o he panc ea ic β cell. Cell Me ab. 19:122-34.
Ta iko a, S.G., M.D. Su y, T. Ra hjen, H.-H. Wessels, A.K. Pandey, X. You, C. Becke , W. Chen, M. Selbach, y M.N. Poy.
2013. A gonau e2 egula es he panc ea ic β-cell sec e ome. Mol. Cell. P o eomics. 12:1214-25.
Tay, Y., J. Zhang, A.M. Thomson, B. Lim, y I. Rigou sos. 2008a. Mic oRNAs o Nanog, Oc 4 and Sox2 coding egions
modula e emb yonic s em cell di e en ia ion. Na u e. 455:1124-28.
Tay, Y.M.-S., W.-L. Tam, Y.-S. Ang, P.M. Gaughwin, H. Yang, W. Wang, R. Liu, J. Geo ge, H.-H. Ng, R.J. Pe e a, T.
Lu kin, I. Rigou sos, A.M. Thomson, y B. Lim. 2008b. Mic oRNA-134 modula es he di e en ia ion o mouse
emb yonic s em cells, whe e i causes pos - ansc ip ional a enua ion o Nanog and LRH1. S em Cells. 26:17-
29.
Teo, A.K.K., N. Tsuneyoshi, S. Hoon, E.K. Tan, L.W. S an on, C.V.E. W igh , y N.R. Dunn. 2015. PDX1 binds and
ep esses hepa ic genes o ensu e obus panc ea ic commi men in di e en ia ing human emb yonic s em
cells. S em cell epo s. 4:578-90.
BIBLIOGRAFÍA
232
Thomas, E.D., H.L. Loch e, J.H. Cannon, O.D. Sahle , y J.W. Fe ebee. 1959. Sup ale hal whole body i adia ion and
isologous ma ow ansplan a ion in man. J. Clin. In es . 38:1709-16.
Thomson, J.A., J. I sko i z-Eldo , S.S. Shapi o, M.A. Wakni z, J.J. Swie giel, V.S. Ma shall, y J.M. Jones. 1998.
Emb yonic s em cell lines de i ed om human blas ocys s. Science. 282:1145-7.
Tisco nia, G., y J.C. Izpisúa Belmon e. 2010. Mic oRNAs in emb yonic s em cell unc ion and a e. Genes De .
24:2732-41.
Toi onen, S., K. Lundin, D. Balboa, J. Us ino , K. Tamminen, J. Palgi, R. T oko ic, T. Tuu i, y T. O onkoski. 2013. Ac i in
A and Wn -dependen speci ica ion o human de ini i e endode m cells. Exp. Cell Res. 319:2535-44.
T ounson, A. 2006. The p oduc ion and di ec ed di e en ia ion o human emb yonic s em cells. Endoc . Re .
27:208-19.
Tsialikas, J., y J. Rome -Seibe . 2015. LIN28: oles and egula ion in de elopmen and beyond. De elopmen .
142:2397-404.
Tu ne , R.C., R.R. Holman, D. Ma hews, T.D. Hockaday, y J. Pe o. 1979. Insulin de iciency and insulin esis ance
in e ac ion in diabe es: es ima ion o hei ela i e con ibu ion by eedback analysis om basal plasma insulin
and glucose concen a ions. Me abolism. 28:1086-96.
Tzakis, A.G., C. Rico di, R. Alejand o, Y. Zeng, J.J. Fung, S. Todo, A.J. Deme is, D.H. Min z, y T.E. S a zl. 1990.
Panc ea ic isle ansplan a ion a e uppe abdominal exen e a ion and li e eplacemen . Lance (London,
England). 336:402-5.
Uchizono, Y., C. Ala cón, B.L. Wicks eed, B.J. Ma sh, y C.J. Rhodes. 2007. The balance be ween p oinsulin
biosyn hesis and insulin sec e ion: whe e can imbalance lead? Diabe es. Obes. Me ab. 9 Suppl 2:56-66.
Umpie ez, G.E., M.M. Casals, S.P. Gebha , P.S. Mixon, W.S. Cla k, y L.S. Phillips. 1995. Diabe ic ke oacidosis in
obese A ican-Ame icans. Diabe es. 44:790-5.
U ano, F. 2016. Wol am Synd ome: Diagnosis, Managemen , and T ea men . Cu . Diab. Rep. 16:6.
Uusi upa, M.I., L.K. Niskanen, O. Sii onen, E. Vou ilainen, y K. Pyö älä. 1993. Ten-yea ca dio ascula mo ali y in
ela ion o isk ac o s and abno mali ies in lipop o ein composi ion in ype 2 (non-insulin-dependen ) diabe ic
and non-diabe ic subjec s. Diabe ologia. 36:1175-84.
Vaca, P., G. Be ná, R. A aujo, E.M. Ca nei o, F.J. Bedoya, B. So ia, y F. Ma ín. 2008. Nico inamide induces
di e en ia ion o emb yonic s em cells in o insulin-sec e ing cells. Exp. Cell Res. 314:969-74.
Vaca, P., F. Ma ín, J.M. Vega a-Mesegue , J.M. Ro i a, G. Be ná, y B. So ia. 2006. Induc ion o di e en ia ion o
emb yonic s em cells in o insulin-sec e ing cells by e al soluble ac o s. S em Cells. 24:258-65.
Valencia-Sanchez, M.A. 2006. Con ol o ansla ion and mRNA deg ada ion by miRNAs and siRNAs. Genes De .
20:515-24.
Vallie , L., T. Touboul, Z. Chng, M. B impa i, N. Hannan, E. Millan, L.E. Smi he s, M. T o e , P. Rugg-Gunn, A. Webe ,
y R. a. Pede sen. 2009. Ea ly cell a e decisions o human emb yonic s em cells and mouse epiblas s em cells
a e con olled by he same signalling pa hways. PLoS One. 4:e6082.
Va lakhano a, N. V., R.F. Co e man, W.N. deV ies, J. Mo gan, L.R. Donahue, S. Mu ay, B.B. Knowles, y P.S.
Knoep le . 2010. myc main ains emb yonic s em cell plu ipo ency and sel - enewal. Di e en ia ion. 80:9-19.
Vaxillai e, M., P. D, A. Bonne ond, y P. F oguel. 2009. B eak h oughs in monogenic diabe es gene ics: om pedia ic
o ms o young adul hood diabe es. Pedia . Endoc inol. Re . 6:405-17.
Vaxillai e, M., y P. F oguel. 2008. Monogenic diabe es in he young, pha macogene ics and ele ance o
BIBLIOGRAFÍA
233
mul i ac o ial o ms o ype 2 diabe es. Endoc . Re . 29:254-64.
Vijaya agha an, J., E.C. Maggi, y J.S. C ab ee. 2014. miR-24 egula es menin in he endoc ine panc eas. Am. J.
Physiol. Endoc inol. Me ab. 307:E84-92.
Wandzioch, E., y K.S. Za e . 2009. Dynamic signaling ne wo k o he speci ica ion o emb yonic panc eas and li e
p ogeni o s. Science. 324:1707-10.
Wang, G., H. Zhang, Y. Zhao, J. Li, J. Cai, P. Wang, S. Meng, J. Feng, C. Miao, M. Ding, D. Li, y H. Deng. 2005. Noggin
and bFGF coope a e o main ain he plu ipo ency o human emb yonic s em cells in he absence o eede
laye s. Biochem. Biophys. Res. Commun. 330:934-42.
Wang, Y., S. Baske ille, A. Shenoy, J.E. Babia z, L. Baehne , y R. Blelloch. 2008. Emb yonic s em cell-speci ic
mic oRNAs egula e he G1-S ansi ion and p omo e apid p oli e a ion. Na . Gene . 40:1478-83.
Wang, Y., J. Liu, C. Liu, A. Naji, y D. a. S o e s. 2013a. Mic oRNA-7 egula es he mTOR pa hway and p oli e a ion in
adul panc ea ic b-cells. Diabe es. 62:887-895.
Wang, Y., R. Med id, C. Mel on, R. Jaenisch, y R. Blelloch. 2007. DGCR8 is essen ial o mic oRNA biogenesis and
silencing o emb yonic s em cell sel - enewal. Na . Gene . 39:380-5.
Wang, Y., C. Mel on, Y.-P. Li, A. Shenoy, X.-X. Zhang, D. Sub amanyam, y R. Blelloch. 2013b. miR-294/miR-302
p omo es p oli e a ion, supp esses G1-S es ic ion poin , and inhibi s ESC di e en ia ion h ough sepa able
mechanisms. Cell Rep. 4:99-109.
Wa nock, G.L., D.M. Thompson, R.M. Meloche, R.J. Shapi o, Z. Ao, P. Keown, J.D. Johnson, C.B. Ve che e, N. Pa o i,
I.S. Begg, M. Fung, S.E. Kozak, S.O. Tong, K.M. Algho aili, y C. Ha is. 2008. A mul i-yea analysis o isle
ansplan a ion compa ed wi h in ensi e medical he apy on p og ession o complica ions in ype 1 diabe es.
T ansplan a ion. 86:1762-6.
Wa ande , F., L. Faas, O. Ko ale skiy, D. Pe e s, M. Coles, A.A. An son, P. Gene e , y H. V Isaacs. 2016. lin28
p o eins p omo e exp ession o 17∼92 amily miRNAs du ing amphibian de elopmen . De . Dyn. 245:34-46.
Wei, R., J. Yang, G.-Q. Liu, M.-J. Gao, W.-F. Hou, L. Zhang, H.-W. Gao, Y. Liu, G.-A. Chen, y T.-P. Hong. 2013. Dynamic
exp ession o mic oRNAs du ing he di e en ia ion o human emb yonic s em cells in o insulin-p oducing
cells. Gene. 518:246-55.
Weissman, I.L. 2000. S em cells: uni s o de elopmen , uni s o egene a ion, and uni s in e olu ion. Cell. 100:157-
68.
Weissman, I.L. 2002. S em cells--scien i ic, medical, and poli ical issues. N. Engl. J. Med. 346:1576-9.
Wellne , U., J. Schube , U.C. Bu k, O. Schmalho e , F. Zhu, A. Sonn ag, B. Wald ogel, C. Vannie , D. Da ling, A. zu
Hausen, V.G. B un on, J. Mo on, O. Sansom, J. Schüle , M.P. S emmle , C. He zbe ge , U. Hop , T. Keck, S.
B able z, y T. B able z. 2009. The EMT-ac i a o ZEB1 p omo es umo igenici y by ep essing s emness-
inhibi ing mic oRNAs. Na . Cell Biol. 11:1487-95.
WHO S udy G oup. 1985. Wo ld Heal h O ganiza ion: Diabe es Melli us: Repo o a WHO S udy G oup. Wo ld Heal.
O g. 727:(Tech. Rep. Se ., 727).
Wia e , E., y W. Vale. 2012. Roles o ac i in amily in panc ea ic de elopmen and homeos asis. Mol. Cell. Endoc inol.
359:23-9.
Wienholds, E., W.P. Kloos e man, E. Miska, E. Al a ez-Saa ed a, E. Be eziko , E. de B uijn, H.R. Ho i z, S.
Kauppinen, y R.H. a Plas e k. 2005. Mic oRNA exp ession in zeb a ish emb yonic de elopmen . Science.
309:310-11.
Wigh man, B., I. Ha, y G. Ru kun. 1993. Pos ansc ip ional egula ion o he he e och onic gene lin-14 by lin-4

BIBLIOGRAFÍA
234
media es empo al pa e n o ma ion in C. elegans. Cell. 75:855-62.
Wing, R.R., E.H. Blai , P. Bononi, M.D. Ma cus, R. Wa anabe, y R.N. Be gman. 1994. Calo ic es ic ion pe se is a
signi ican ac o in imp o emen s in glycemic con ol and insulin sensi i i y du ing weigh loss in obese
NIDDM pa ien s. Diabe es Ca e. 17:30-6.
Wol um, C., D. Besse , E. Luca, y M. S o el. 2003. Insulin egula es he ac i i y o o khead ansc ip ion ac o Hn -
3be a/Foxa-2 by Ak -media ed phospho yla ion and nuclea /cy osolic localiza ion. P oc. Na l. Acad. Sci. U. S. A.
100:11624-9.
Wong, R.C.-B., P.J. Dono an, y A. Pébay. 2011. Molecula mechanism in ol ed in he main enance o plu ipo en
s em cells. J. S em Cells. 6:213-32.
Wu, S.M., y K. Hochedlinge . 2011. Ha nessing he po en ial o induced plu ipo en s em cells o egene a i e
medicine. Na . Cell Biol. 13:497-505.
Van Wynsbe ghe, P.M., S.-P. Chan, F.J. Slack, y A.E. Pasquinelli. 2011. Analysis o mic oRNA exp ession and unc ion.
Me hods Cell Biol. 106:219-52.
Xiao, L., X. Yuan, y S.J. Sha kis. 2006. Ac i in A main ains sel - enewal and egula es ib oblas g ow h ac o , Wn ,
and bone mo phogenic p o ein pa hways in human emb yonic s em cells. S em Cells. 24:1476-86.
Xu, G., J. Chen, G. Jing, y A. Shale . 2013. Thio edoxin-in e ac ing p o ein egula es insulin ansc ip ion h ough
mic oRNA-204. Na . Med. 19:1141-6.
Xu, N., T. Papagiannakopoulos, G. Pan, J. a. Thomson, y K.S. Kosik. 2009. Mic oRNA-145 Regula es OCT4, SOX2, and
KLF4 and Rep esses Plu ipo ency in Human Emb yonic S em Cells. Cell. 137:647-58.
Xu, R.-H., R.M. Peck, D.S. Li, X. Feng, T. Ludwig, y J.A. Thomson. 2005. Basic FGF and supp ession o BMP signaling
sus ain undi e en ia ed p oli e a ion o human ES cells. Na . Me hods. 2:185-90.
Xu, X., V.L. B owning, y J.S. Odo ico. 2011. Ac i in, BMP and FGF pa hways coope a e o p omo e endode m and
panc ea ic lineage cell di e en ia ion om human emb yonic s em cells. Mech. De . 128:412-27.
Yamakuchi, M., M. Fe li o, y C.J. Lowens ein. 2008. miR-34a ep ession o SIRT1 egula es apop osis. P oc. Na l.
Acad. Sci. U. S. A. 105:13421-6.
Yamamo o, M., Y. Saijoh, A. Pe ea-Gomez, W. Shawlo , R.R. Beh inge , S.-L. Ang, H. Hamada, y C. Meno. 2004. Nodal
an agonis s egula e o ma ion o he an e opos e io axis o he mouse emb yo. Na u e. 428:387-92.
Yang, R., J.L. Ke schne , y A. Ha is. 2016. Hepa ocy e nuclea ac o 1 coo dina es mul iple p ocesses in a model o
in es inal epi helial cell unc ion. Biochim. Biophys. Ac a. 1859:591-8.
Yang, T., Y. Liang, Q. Lin, J. Liu, F. Luo, X. Li, H. Zhou, S. Zhuang, y H. Zhang. 2013. miR-29 media es TGFβ1-induced
ex acellula ma ix syn hesis h ough ac i a ion o PI3K-AKT pa hway in human lung ib oblas s. J. Cell.
Biochem. 114:1336-42.
Yi, R., y E. Fuchs. 2011. Mic oRNAs and hei oles in mammalian s em cells. J. Cell Sci. 124:1775-83.
Yi, R., Y. Qin, I.G. Maca a, y B.R. Cullen. 2003. Expo in-5 media es he nuclea expo o p e-mic oRNAs and sho
hai pin RNAs. Genes De . 17:3011-6.
Yu, J., M.A. Vodyanik, K. Smuga-O o, J. An osiewicz-Bou ge , J.L. F ane, S. Tian, J. Nie, G.A. Jonsdo i , V. Ruo i, R.
S ewa , I.I. Sluk in, y J.A. Thomson. 2007. Induced plu ipo en s em cell lines de i ed om human soma ic
cells. Science. 318:1917-20.
Yuan, H., N. Co bi, C. Basilico, y L. Dailey. 1995. De elopmen al-speci ic ac i i y o he FGF-4 enhance equi es he
syne gis ic ac ion o Sox2 and Oc -3. Genes De . 9:2635-45.
BIBLIOGRAFÍA
235
Zahn, H., O. B inkho , J. Meienho e , E.F. P ei e , H. Di schunei , y C. Gloxhube . 1965. Combining o syn he ic
insulin chains in o biologically ac i e p epa a ions. Zei sch i u Na u o schung. Tl. B, Chemie, Biochem.
Biophys. Biol. und e wand e Gebie e. 20:666-70.
Za e , K.S. 2001. Hepa ocy e di e en ia ion: om he endode m and beyond. Cu . Opin. Gene . De . 11:568-74.
Za e , K.S. 2002. Regula o y phases o ea ly li e de elopmen : pa adigms o o ganogenesis. Na . Re . Gene . 3:499-
512.
Zelle , K.I., X. Zhao, C.W.H. Lee, K.P. Chiu, F. Yao, J.T. Yus ein, H.S. Ooi, Y.L. O lo , A. Shahab, H.C. Yong, Y. Fu, Z.
Weng, V.A. Kuzne so , W.-K. Sung, Y. Ruan, C. V Dang, y C.-L. Wei. 2006. Global mapping o c-Myc binding si es
and a ge gene ne wo ks in human B cells. P oc. Na l. Acad. Sci. U. S. A. 103:17834-9.
Zeng, Y. 2006. P inciples o mic o-RNA p oduc ion and ma u a ion. Oncogene. 25:6156-62.
Zhang, D., W. Jiang, M. Liu, X. Sui, X. Yin, S. Chen, Y. Shi, y H. Deng. 2009. Highly e icien di e en ia ion o human ES
cells and iPS cells in o ma u e panc ea ic insulin-p oducing cells. Cell Res. 19:429-38.
Zhang, Y.-Q., H. Zhang, A. Maeshima, H. Ku iha a, J.-I. Miyagawa, T. Takeuchi, y I. Kojima. 2002. Up- egula ion o he
exp ession o ac i ins in he panc ea ic duc by educ ion o he be a-cell mass. Endoc inology. 143:3540-7.
Zhao, C., G. Sun, S. Li, y Y. Shi. 2009. A eedback egula o y loop in ol ing mic oRNA-9 and nuclea ecep o TLX in
neu al s em cell a e de e mina ion. Na . S uc . Mol. Biol. 16:365-71.
Zhao, X., R. Mohan, S. Özcan, y X. Tang. 2012. Mic oRNA-30d induces insulin ansc ip ion ac o Ma A and insulin
p oduc ion by a ge ing mi ogen-ac i a ed p o ein 4 kinase 4 (MAP4K4) in panc ea ic β-cells. J. Biol. Chem.
287:31155-64.
Zhou, a-D., L.-T. Diao, H. Xu, Z.-D. Xiao, J.-H. Li, H. Zhou, y L.-H. Qu. 2012. β-Ca enin/LEF1 ansac i a es he
mic oRNA-371-373 clus e ha modula es he Wn /β-ca enin-signaling pa hway. Oncogene. 31:2968-78.
Zhou, R., G. Hu, J. Liu, A.-Y. Gong, K.M. D esche , y X.-M. Chen. 2009. NF-kappaB p65-dependen ansac i a ion o
miRNA genes ollowing C yp ospo idium pa um in ec ion s imula es epi helial cell immune esponses. PLoS
Pa hog. 5:e1000681.
Zhu, Y., W. You, H. Wang, Y. Li, N. Qiao, Y. Shi, C. Zhang, D. Bleich, y X. Han. 2013. Mic oRNA-24/MODY gene
egula o y pa hway media es panc ea ic β-cell dys unc ion. Diabe es. 62:3194-206.
Zimme , P.Z. 1992. Kelly Wes Lec u e 1991. Challenges in diabe es epidemiology-- om Wes o he es . Diabe es
Ca e. 15:232-52.
Zo n, A.M., y J.M. Wells. 2009. Ve eb a e endode m de elopmen and o gan o ma ion. Annu. Re . Cell De . Biol.
25:221-51.