PREPARACIÓN DE CONJUGADOS
ALÉRGENO-ADYUVANTE PARA EL
DESARROLLO DE VACUNAS SINTÉTICAS
Jo ge Losada Méndez
Se illa, 2021
Ins i u o de In es igaciones Depa amen o de
Químicas Química O gánica
Cen o de In es igaciones Cien í icas
Isla de la Ca uja
PREPARACIÓN DE CONJUGADOS
ALÉRGENO-ADYUVANTE PARA EL
DESARROLLO DE VACUNAS SINTÉTICAS
Memo ia p esen ada po el
G aduado Jo ge Losada Méndez
pa a op a al G ado de Doc o en Química
Se illa, 2021
D . F ancisco Ja ie Rojo Ma cos, In es igado Cien í ico (CSIC).
CERTIFICA: Que el p esen e abajo i ulado “P epa ación de conjugados alé geno-
adyu an e pa a el desa ollo de acunas sin é icas” ha sido ealizado bajo mi di ección y
aseso amien o en los labo a o ios del Ins i u o de In es igaciones Químicas (CSIC-
Uni e sidad de Se illa) del Cen o de In es igaciones Cien í icas Isla de la Ca uja,
cons i uyendo la Memo ia que p esen a el G aduado Jo ge Losada Méndez pa a op a al
g ado de Doc o en Química.
Se illa, 2021
Fdo.: F ancisco Ja ie Rojo Ma cos
Di ec o del abajo

El p esen e abajo ha sido ealizado po Jo ge Losada Méndez con un con a o asociado
al p oyec o RD16/0006/0011, Ins i u o de Salud Ca los III, Red ARADyAL, en el
Labo a o io de Glicosis emas del Ins i u o de In es igaciones Químicas (CSIC-
Uni e sidad de Se illa) bajo la di ección del D . F ancisco Ja ie Rojo Ma cos. El abajo
ha sido u elado po la P o eso a Ma ía del Ca men O iz Melle en el ma co del P og ama
de Doc o ado en Química de la Uni e sidad de Se illa.
Fdo.: Jo ge Losada Méndez
Fdo.: F ancisco Ja ie Rojo Ma cos Fdo.: Ma ía del Ca men O iz Melle
Di ec o del abajo Tu o a del abajo
Ag adecimien os
A ención, es a sección puede con ene azas de his o ias emo i as, lee con
p ecaución.
Echa la is a a ás pa a eco da odo lo sucedido en es os úl imos cua o años en el que
se ha desa ollado es a Tesis Doc o al me hace eco da y ag adece a odos los miemb os
del g upo de in es igación en el que se ha desa ollado y a la gen e que ealmen e ha
con ibuido a lle a la a cabo, muchas eces de una o ma no cien í ica.
En p ime luga , me gus a ía ag adece al D . F ancisco Ja ie Rojo Ma cos la
opo unidad que me b indó al pe mi i uni me a su g upo de in es igación, así como la
con ianza deposi ada pa a pode desa olla in es igaciones po mí mismo y abaja con
au onomía. Sin ol ida ampoco, su g an hospi alidad en las ba bacoas celeb adas en su
casa, dónde nunca al a on las isas egadas con excelen es inos.
A la p o eso a Ma ía del Ca men O iz po acep a se la u o a de es a Tesis Doc o al.
A la Red ARADyAL po la inanciación, po odo lo ap endido en mis nume osos iajes
a Mad id pa a asis i a sus euniones y las colabo aciones ealizadas en los ensayos
biológicos, especialmen e a la D a. C is obalina Mayo ga y la D a. F ancisca Paloma es.
A los miemb os de mi g upo de in es igación, con los que compa í una ingen e can idad
de ho as en el labo a o io. No puedo e i a des aca a mis dos p incipales compañe os de
labo a o io que se con i ie on en g andes amigos (los Mosque e os!), es á cla o que es o
sólo pudo se pu a química. A An onio Di Maio, po odo lo que ap endí de él, su olun ad
inqueb an able hacia los amigos, nues as nume osas con e saciones desde mecánica de
bombas de acío a his o ia clásica g iega, compa imos buenos iempos abajando y
es oy con encido que con inua án en el u u o, aunque nos sepa en países independizados
de la UE o la Ronda de T iana. A Ped o Domínguez, po da me siemp e calma, su g an
co azón e ins ui me sob e inanzas, g acias po es a siemp e dispues o a compa i una
buena comida y una buena música. A i pude dis u a e algo más de iempo, ya que
ol is e al labo a o io, enacido como pos -doc. Adicionalmen e, g acias po pe mi i me
conoce a Anna e Inma, con las que compa imos buenos momen os jun os.
A Noelia, o a g an compañe a, po mos a me el sac i icio, la dedicación de un abajo
bien hecho y u g an disponibilidad pa a ayuda siemp e que ue a necesa io. Es á cla o
que solo podías eni de ie as palen inas.

Ab e ia u as, Siglas y Ac ónimos
μg Mic og amo
μL Mic oli o
μM Mic omola
Ac Ace ilo
ACN Ace oni ilo
ADN Ácido desoxi ibonucleico
AIT Inmuno e apia especí ica con alé genos
Anh. Anhid o
APC Célula p esen ado a de an ígeno
A A omá ico
ARADyAL Red de Asma, Reacciones Ad e sas y Alé gicas
ARN Ácido ibonucleico
Asc Asco ba o
Células B Células B especí icas de i adas de la médula ósea
BCR Recep o es de células B
Boc e -Bu iloxica bonilo
BODIPY Bo o-dipi ome eno
Bu Bu ilo
CD Clús e de di e enciación
CITIUS Cen o de In es igación, Tecnología e Inno ación de la
eUni e sidad de Se illa
CLR Lec ina ipo C
CRD Dominio de econocimien o de ca bohid a os
CuAAC Cicloadición 1,3-dipola en e alquinos y azidas ca alizada po
k Cu(I)
Cuan . Cuan i a i o
CTL Lin oci o T ci o óxico
CpG Mo i os ci osina desme ilada-guanosina de ADN
DC Célula dend í ica
DCC N,N’-diciclohexil ca bodiimida
DCM Diclo ome ano
DC-SIGN Lec ina no in eg ina p esen e en células dend í icas que
k econoce ICAM-3 selec i amen e
DIPEA N,N’-diisop opile ilamina
DMF N,N’-dime il o mamida
DMEN N,N´-dime ile ilendiamina
DMSO Dime ilsul óxido
DOX Doxo ubicina
DTX Doce axel
DPTS p-Toluensul ona o de (N,N´-dime ilamino)pi idinio
ELISA Ensayo po inmunoabso ción ligado a enzimas
EPIT Inmuno e apia epicu ánea
ESI-MS Espec ome ía de masas con ionización po elec osp ay
E E ilo
e . al. e alii (locución la ina, aducido como “y o os”)
E OAc Ace a o de e ilo
FDA Adminis ación de alimen os y medicamen os
Fmoc Fluo enilme oxica bonilo
g G amo
GDP Glicodend opép ido
h Ho a
HATU Hexa luo o os a o de 2-(7-aza-1-H-benzo iazol-1-il)-1,1,3,3-
ddddddddddddddddddd e ame ilu onio
HPLC C oma og a ía líquida de al a e icacia
HRMS Espec ome ía de masas de al a esolución
HSQC Co elación he e onuclea de ni el cuán ico indi idual
HTS C ibado de al a e icacia
IC50 Concen ación pa a una inhibición del 50%
ICAM-3 Molécula de adhesión in e celula -3
IFN In e e ón
Ig Inmunoglobulina
IgE Inmunoglobulina especí ica
IL In e leucina o in e leuquina
J Cons an e de acoplamien o
K Kel in
kDa Kilodal on
L Li o
LBP P o eína de unión a lipopolisacá idos
LPS Lipopolisacá ido
LRR Repe iciones icas en leucina
LTC4 Leuco ieno C4
LTD4 Leuco ieno D4
LTP P o eína anspo ado a de lípidos
M Mola idad
m/z Relación masa/ca ga
MALDI-TOF Deso ción/ionización láse asis ida po ma iz con de ección
po iempo de uelo
MAPS Sis emas múl iples de pép idos an igénicos
MD-2 Fac o de di e enciación mieloide 2
Me Me ilo
mg Milig amo
MHC Complejo mayo de his ocompa ibilidad
MHz Megahe cio
min Minu o
mL Milili o
mM Milimola
mmol Milimol
moDC DCs de i adas de monoci os
MPL Lípido A mono os o ilado
MR Recep o de manosa
MS Espec ome ía de masas
MW Mic oondas
MWCO Lími e de peso molecula
MyD88 Fac o de di e enciación mieloide 88
NBS N-b omosuccinimida
NHS N-hid oxisuccinimida
Células NK Células na u ales asesinas
nM Nanomola
ODN Oligodesoxi ibonucleó ido
OIT Inmuno e apia o al
OMS O ganización Mundial de la Salud
OVA O oalbúmina
PAMPs Pa ones molecula es asociados a pa ógenos
PBS Tampón os a o salino
PBMC Célula mononuclea de sang e pe i é ica
PEG Polie ilenglicol
Ph Fenilo
PI Índice de p oli e ación
ppm Pa es po millón
PRRs Recep o es de econocimien o de pa ones
PTX Pacli axel
Keq Cons an e de equilib io
R Fac o de e ención
RMN Resonancia magné ica nuclea
RP Fase e e sa
SAR Relación es uc u a-ac i idad
SCIT Inmuno e apia subcu ánea
SFN Sul o a ano
SLIT Inmuno e apia sublingual
pm Re oluciones po minu o
SPAAC Cicloadición 1,3-dipola en e ciclooc inos y azidas
ñlllllllllllllllllllllllllllllllllllllllp omo ida po la ensión
SNA Sus i ución nucleó ila a omá ica
SPPS Sín esis de pép idos en ase sólida
Tiempo
Células T Células T de i adas del imo
.a. Tempe a u a ambien e
TBAF Fluo u o de e abu ilamonio
TBAI Yodu o de e abu ilamonio
TBTA T is[(1-bencil-1H-1,2,3- iazol-4-il)me il]amina e -bu ilo
TC Lin oci os T ci o óxicos
TCR Recep o es de células T
TES T ie ilsililo
TFA Ácido i luo oacé ico
TH Lin oci os T colabo ado es
THF Te ahid o u ano
TIPS T iisop opopilsililo
TLC C oma og a ía en capa ina
TLR Recep o de ipo Toll
TMS T ime ilsililo
TNF Fac o de nec osis umo al
T eg Lin oci o T egulado
TRIF Adap ado que con iene el domino TIR induc o de
in e e ón-β
UHPLC C oma og a ía líquida de ul a al a e icacia
UV Ul a iole a
Vis. Visible

Índice
1. In oducción 1
1.1. La Ale gia 1
1.1.1. Ale gia alimen a ia 4
1.2. El sis ema inmune 6
1.2.1. Leucoci os 8
1.2.1.1. Lin oci os 9
1.2.2. Células Dend í icas: En e la Inmunidad Inna a y la Inmunidad
Adap a i a 15
1.2.2.1. DC-SIGN 17
1.2.2.2. Recep o es de ipo Toll (TLRs) 19
1.3. Inmuno e apia 21
1.3.1. Pép idos sin é icos en el desa ollo de acunas con a la ale gia 25
1.3.2. El papel de los adyu an es en las acunas 27
2. Obje i os 33
3. Sín esis de conjugados alé geno-pi imido[5,4-b]indol pa a el
ecep o TLR4 37
3.1. In oducción 37
3.2. TLR4 como diana e apéu ica en ale gia 38
3.2.1. Ligandos lipídicos de TLR4 39
3.2.2. Ligandos no lipídicos de TLR4 42
3.3. Obje i os 47
3.4. Sín esis del ligando de TLR4 47
3.5. Conjugación del ligando de TLR4 a dis in os pép idos ale génicos 59
3.6. E aluación biológica de los conjugados pép ido-pi imido[5,4-b]indol 65
4. Sín esis de conjugados alé geno-8-oxoadenina pa a el ecep o
TLR7 75
4.1. In oducción 75
4.2. TLR7 como diana e apéu ica en ale gia 78
4.2.1. Ligandos de TLR7 79
4.3. Obje i os 83
4.4. Sín esis del ligando de TLR7 84
4.5. Conjugación del ligando de TLR7 a dis in os pép idos ale génicos 96
4.6. E aluación biológica de los conjugados pép ido-8-oxoadenina 104
5. Combinaciones de ligandos de TLR4 y TLR7 conjugados con
alé genos y es udio de su ac i idad biológica 117
5.1. In oducción 117
5.2. Combinación co alen e de agonis as de TLR 120
5.2.1. 1,3,5-T iazinas como pla a o mas 123
5.3. Obje i os 127
5.4. Sín esis de homodíme os de TLR4, TLR7 y del he e odíme o (TLR7/TLR4)
conjugados al pép ido P u p 3 128
5.4.1. Sín esis de homodíme os de ligandos de TLR4 y 7 a pa i de iazinas
bi uncionales 129
5.4.2. Sín esis del he e odíme o de ligandos de TLR4 y TLR7 a pa i de
iazinas i uncionales 149
5.5. Conjugación de los díme os de ligandos de TLR con el pép ido de
P u p 3 163
5.6. E aluación biológica de los conjugados díme o-pép ido 169
6. Sín esis de conjugados alé geno-glicodend ón y es udio de su
ac i idad biológica 177
6.1. In oducción y an eceden es 177
6.2. Obje i os 194
6.3. Es udios complemen a ios de glicodend ones conjugados 194
6.4. P esen ación de moléculas de in e és e apéu ico o d ug deli e y 201
6.4.1. Espaciado es sensibles al medio ácido 205
6.5. Sín esis de glicodend ones con un espaciado sensible al medio ácido 208
6.6. Conjugación del pép ido de P u p 3 al glicodend ón con un espaciado de
ipo hid azona 230
6.7. E aluación biológica del conjugado con un espaciado de ipo
hid azona 232
7. Conclusiones 237
7.1. Capí ulo 3 237
7.2. Capí ulo 4 237
7.3. Capí ulo 5 238
7.4. Capí ulo 6 238
8. Expe imen al sec ion 243
8.1. Reagen s, sol en s and analy ical echniques 243
8.2. Syn hesis o TLR4 ligand conjuga es 245
8.3. Syn hesis o TLR7 ligand conjuga es 253
8.4. Syn hesis o TLR ligand dime conjuga es 262
8.5. Syn hesis o conjuga ed glycodend ons 284
8.6. E alua ion o hyd azone 62 hyd olysis a di e en pH 293
8.7. Biological assays 294
8.7.1. Alle gic pa ien s and o elan con ols 294
8.7.2. Gene a ion o moDCs 294
8.7.3. Flo escen labelling o P u p 3 conjuga es 295
8.7.4. S udies by low cy ome y and con ocal mic oscopy 295
8.7.5. moDC ma u a ion s udies 296
8.7.6. Speci ic p oli e a i e esponse o di e en cell subpopula ions 296
8.7.7. Cy okine de e mina ion 297
8.7.8. S a is ic 297
Appendix 1. Selec ion o spec a and ch oma og ams 301
Appendix 2. S uc u e and abb e ia ions o essen ial amino
33 acids 323
Capí ulo 1
4
1.1.1. Ale gia alimen a ia
Como se ha comen ado p e iamen e, una de las uen es de o igen de alé genos son los
alimen os. Se es ima que del 4-8% de la población mundial iene al menos algún ipo de
ale gia alimen a ia.
15
Las asas de ale gia alimen a ia a ían según la edad, la die a, la
egión y muchos o os ac o es. Son más comunes en niños que en adul os y se obse a
un inc emen o en la ecuencia. Un in o me de 2008 del Cen o pa a el Con ol y la
P e ención de En e medades señala un aumen o del 18% en la ale gia alimen a ia in an il
en el pe iodo de 1997 a 2007.
16
Aunque una ale gia puede se p o ocada po p ác icamen e cualquie alimen o, los
esponsables de las eacciones más impo an es son la leche, el hue o, los u os secos, el
cacahue e (no es un u o seco, sino una legumb e), los ma iscos, los pescados, el igo y
la soja. A menudo, se hace e e encia a ellos como “los ocho g andes alé genos”. Po el
con a io, la ale gia a los adi i os y conse an es alimen a ios es gene almen e poco
común.
17
La ale gia alimen a ia puede se con undida ácilmen e con o os as o nos que ambién
in oluc an alimen os y p o ocan sín omas iguales o pa ecidos. La in ole ancia
alimen a ia y la in oxicación alimen a ia son a ecciones dis in as, cuyo o igen no se debe
a una espues a inmuni a ia.
18
En pa icula , la in ole ancia alimen a ia puede se
especialmen e di ícil de di e encia de la ale gia, que se dis ingue de és a en que el iempo
de apa ición de los sín omas desde la exposición al alimen o suele se mayo .
19
O a
di e encia es que las in ole ancias suelen es a ocasionadas po la ausencia de enzimas o
mecanismos diges i os, po ejemplo, la in ole ancia a la lac osa se debe a la ausencia de
la enzima lac asa, lo que impide descompone el disacá ido de lac osa (el azúca de la
leche), p o ocando sín omas gas oin es inales.
20
Es impo an e no con undi con la
ale gia a la leche, que es ocasionada po una o a ias p o eínas p esen es en la misma que
ac úan como alé genos. La OMS ecomienda denomina a las comúnmen e llamadas
in ole ancias, como hipe sensibilidad alimen a ia no alé gica.
21
(Esquema 1.1.)
15
Siche e , S.H.; Sampson, H.A.; J. Alle gy Clin. Immunol. 2014, 133, 291-307.
16
B anum, A.M.; Lukacs, S.L.; NCHS. Da a B ie 2008, 10, 1-8.
17
Randhawa, S.; Bahna, S.L.; Cu . Opin. Alle gy Clin. Immunol. 2009, 9, 278-283.
18
Siche e , S.H.; Sampson, H.A.; J. Alle gy Clin. Immunol. 2014, 133, 291-307.
19
Ozdemi , O.; Me e, E.; Ca al, F.; Ozol, D.; Dig. Dis. Sci. 2009, 54, 8-14.
20
Heine, R.G.; e al.; Wo ld Alle gy O gan. J. 2017, 10, 41-50.
21
Johansson, S.G.O.; e al.; J. Alle gy Clin. Immunol. 2004, 113, 832-836.

In oducción
5
Esquema 1.1. Rep esen ación de los ipos de hipe sensibilidad alimen a ia.
El p oceso de desapa ición de la ale gia alimen a ia ha sido es udiado ecien emen e.
22
En gene al, las ale gias alimen a ias a la leche, el hue o, el igo y la soja suelen esol e se
po sí mismas du an e la in ancia, mien as que las ale gias al cacahue e, los u os secos,
el pescado y los ma iscos son pe sis en es.
Es impo an e des aca ambién que la ale gia a los alimen os es á in luida po el g ado
de cocción de los mismos. Gene almen e, una mayo cocción se elaciona con una mayo
ole ancia a dicho alimen o, ya que da luga a la deg adación de sus p o eínas, en e las
que se encuen an los alé genos.
23
Po ejemplo, en un es udio del 2012 se obse ó que la
mayo ía de los niños con ale gia al hue o pueden ole a alimen os que con ienen hue o
en p oduc os de panade ía, en e o os, si son p ocesados é micamen e.
24
Sin emba go,
hay que ema ca que los p ocesos é micos no a ec an po igual a odos los alé genos
alimen a ios, ni eliminan po comple o el iesgo de su i una eacción alé gica.
También se han ealizado una g an can idad de es udios elacionando di e en es ale gias
en un mismo pacien e.
25
Po ejemplo, las eacciones alé gicas a u as suelen es a
asociadas con el sínd ome polen- u a- e du a, desencadenado po el consumo de
e du as c udas o u as escas. Es o se a ibuye comúnmen e a p o eínas homólogas de
22
Bu ks, A.W.; e al.; J. Alle gy Clin. Immunol. 2012, 129, 906-920.
23
Chandan, R.C.; Kila a, A.; Dai y Ing edien s o Food P ocessing, 2011, Wiley-Blackwell.
24
Leona d, S.A.; e al.; J. Alle gy Clin. Immunol. 2012, 130, 473-480.
25
Hassan, A.K.G.; Venka esh, Y.P.; Eu . Ann. Alle gy Clin. Immunol. 2015, 47, 180-187.
Hipe sensibilidad
alimen a ia
Ale gia alimen a ia
Leche
Hue o
Cacahue e
Hipe sensibilidad
alimen a ia no alé gica In ole ancia a la lac osa
In ole ancia a la uc osa
Capí ulo 1
6
eac i idad c uzada que se encuen an en los alimen os ege ales y en el polen. Dado que
los dis in os epí opos de las p o eínas se encuen an en odo el eino ege al, la apa ición
de di e en es alé genos ege ales con es uc u as simila es no es so p enden e. En un
es udio lle ado a cabo en Ingla e a en 274 adul os alé gicos al menos a un ipo de polen
(abedul, hie ba y/o a emisa), el 34% esul ó ambién sensibles a la manzana, el 25% a la
pa a a, el 23% a la zanaho ia y el apio, el 22% al meloco ón y el 16% al melón.
26
Además,
se obse ó una g an a iabilidad con la egión geog á ica, po ejemplo, el meloco ón es
la u a más común que causa ale gia en España.
27
En los países del á ea medi e ánea se ha obse ado la incidencia en ale gias a u as de
la amilia de las osáceas que incluyen, meloco ón, manzana, pe a y almend a, siendo las
dos p ime as las más mayo i a ias. Sus alé genos es án elacionados con un g upo de
p o eínas ege ales conocidas como p o eínas anspo ado as de lípidos (LTPs, del inglés
Lipid T ans e P o eins).
28
Conc e amen e, en una se ie de es udios sob e es a amilia, se
ha demos ado que el meloco ón es el p ime alimen o desencadenan e que se asocia
pos e io men e con o as u as de las osáceas como la manzana, debido a la g an
eac i idad c uzada de sus alé genos, denominados panale genos.
29
1.2 El sis ema inmune
En es e apa ado se hace una e isión de los aspec os más impo an es elacionados con
el sis ema inmuni a io, ya que esul a undamen al pa a pode comp ende los
mecanismos implicados en las eacciones alé gicas, así como los a amien os
e apéu icos de las mismas.
El sis ema inmune humano ag upa una g an can idad de células, ejidos y ó ganos
epa idos po odo el o ganismo. Su unción es el econocimien o y la gene ación de la
co espondien e espues a en e agen es ex e nos, llamados an ígenos, que en el caso de
la ale gia son los denominados alé genos. El é mino an ígeno o iginalmen e se a ibuía
a una molécula capaz de p omo e la p oducción de an icue pos especí icos, pe o
26
Bi che , A.J.; Van Melle. G.; Halle , E.; Cu y, B.; F ei, P.C.; Clin. Exp. Alle gy 1994, 24,
367-74.
27
Cues a-He anz, J.; e al.; J. Alle gy Clin. Immunol. 1999, 104, 688-694.
28
Ga cía-Casado G.; e al.; J. Alle gy Clin. Immunol. 2003, 112, 599-605.
29
Ase o R., P a e oni V.; Cu . Opin. Alle gy Clin. Immunol. 2013, 13, 379-385.
In oducción
7
ac ualmen e su signi icado es más comple o y ag upa a cualquie molécula que pueda se
econocida po el sis ema inmune.
Las espues as del sis ema inmuni a io pueden di idi se en dos g upos: las inna as o no
especí icas y las adap a i as o adqui idas.
30
(Figu a 1.2.)
Figu a 1.2. Inmunidad inna a y adap a i a, en unción de sus componen es y del iempo.
Ab e ia u as: DCs (Células dend í icas) y NK (Células asesinas na u ales). Imagen modi icada
de la e e encia 30.
 La espues a inmune inna a p opo ciona la p ime a espues a en e a los agen es
ex e nos o incluso an es de que exis a es e con ac o. Se puede clasi ica en unción
del ipo de ba e a: mecánica (la piel y las mucosas), química (moléculas como
las de ensinas, lisosomas, pH y enzimas diges i as) y biológica ( lo a in es inal).
Po an o, es a espues a en e a pa ógenos des aca po se gené ica.
31
 La espues a inmune adap a i a anscu e después de la an e io y des aca po que
es á mediada po lin oci os con ecep o es especí icos pa a an ígenos. Po lo an o,
es una espues a al amen e especí ica y es la pa e que p opo ciona la adap ación.
30
A. A. Abbas, A. H. Lich man, S. Pillai; Cellula and Molecula Immunology, 2017, 9 h
Edi ion, Else ie .
31
Albe s, B. e al.; Molecula Biology o he Cell, 2002, 4 h Edi ion, Else ie .
Capí ulo 1
8
Es o se debe a que, as sucesi as exposiciones al an ígeno, las espues as inmunes
mejo an an o en in ensidad como en iempo, es la llamada memo ia inmunológica
que es la base de la acunación. Es a espues a es posible debido a dos
ac i aciones bien di e enciadas. Po un lado, la inmunidad humo al mediada po
lin oci os B y an icue pos y po o o, la inmunidad celula mediada po lin oci os
T.
32
A pesa de que el sis ema inmune da luga a es as espues as bien di e enciadas, exis e
una g an coope ación y modulación en e ellas pa a la p o ección del o ganismo.
1.2.1 Leucoci os
Los leucoci os, ambién denominados glóbulos blancos, nomb e dado debido a la
ausencia de pigmen os, son un conjun o he e ogéneo de células sanguíneas mediado as
de la espues a inmuni a ia y que, po an o, pa icipan en la de ensa del o ganismo en e
a los agen es pa ógenos. Fo mados en la médula ósea a pa i de células mad e
hema opoyé icas, ienen la ca ac e ís ica de se las únicas células sanguíneas que se
encuen an an o en la sang e como en el sis ema lin á ico.
33
Su ecuen o suele encon a se
en alo es en e 4.000-11.000 leucoci os po mic oli o y un aumen o de es os alo es es
un cla o indicio de una in ección en el o ganismo.
34
Exis en cinco ipos de leucoci os, clasi icados en dos g andes g upos: los ag anuloci os
(lin oci os y monoci os) que son aquellos que p esen an o gánulos en su ci oplasma y los
g anuloci os (neu ó ilos, eosinó ilos y basó ilos) que son aquellos que ca ecen de los
mismos.
35
(Esquema 1.2.)
32
Coope . M.D.; Na . Re . Immunol. 2015, 15, 191-195.
33
Ma on, D., e al.; Human Biology and Heal h, 1997, Englewood Cli , P en ice Hall.
34
Hollowell, J.G.; e al.; Vi al and Heal h S a is ics Se ies, 2005, 11, 247-249.
35
O kin, S.H.; Zon, L.I.; Cell 2008, 4, 712.
In oducción
9
Esquema 1.2. Clasi icación de los di e en es ipos de leucoci os.
1.2.1.1 Lin oci os
Son el p incipal ipo de leucoci os, ci culan po odo el o ganismo a a és del apa a o
ci cula o io y el sis ema lin á ico, p o ienen de la di e enciación de las células mad e
hema opoyé icas de la médula ósea y se desa ollan en di e sos ó ganos lin á icos ( imo,
bazo, ganglios lin á icos y mucosas), dando luga a di e sos ipos, como se desc ibe a
con inuación.
Células o lin oci os B
La ac i ación de es e ipo de lin oci o iene luga en el bazo y los ganglios lin á icos.
Des acan po posee en su memb ana celula ecep o es denominados BCR (del inglés
B-Cell Recep o ),
36
que poseen una al a especi icidad po un único an ígeno. Cada
lin oci o B iene un solo ipo de BCR haciendo, po an o, que cada una de las células
econozca un an ígeno de o ma exclusi a. Cuando se p oduce es e econocimien o, los
lin oci os B se mul iplican y sec e an g andes can idades de unas glicop o eínas
denominadas an icue pos o inmunoglobulinas (Ig).
37
Es os an icue pos no se unen de
o ma homogénea al agen e ex e no. De hecho, pueden exis i di e sos an icue pos en e
a un mismo pa ógeno, cada uno de los cuales se uni á a un an ígeno di e en e que o ma
36
Owen, J.; Pun , J.; S an o d, S; Jones, P.; Kuby, J.; Kuby Immunology, 2013, 7 h Edi ion,
New Yo k: W.H. F eeman and Company.
37
Eisen, H.N.; Siskind, G.W.; Biochemis y 1964, 3, 996-1008.
Leucoci os
G anuloci os
Neu ó ilos
Eosinó ilos
Basó ilos
Ag anuloci os Lin oci os
Monoci os

Capí ulo 1
10
pa e de la supe icie del mismo. (Figu a 1.3) Como se mencionó p e iamen e, la acción
de es e lin oci o se co esponde con la espues a humo al del sis ema inmune.
Figu a 1.3. Rep esen ación de la especi icidad de los an icue pos po sus an ígenos ( ojo y azul)
de un agen e ex e no.
Dado que es os an icue pos son especí icos pa a un solo ipo de an ígeno, se denominan
monoclonales. Es a adhesión y econocimien o del an ígeno pe mi e su neu alización con
la ayuda de o os agen es como neu ó ilos, mac ó agos y o os agoci os que se
desc ibi án más adelan e. Po an o, una ez eliminada la in ección, una acción de es os
lin oci os B pe sis en como células de memo ia, a eces du an e el es o de la ida del
o ganismo, y son impo an es po que en caso de ein ección del mismo an ígeno, la
espues a mediada po an icue pos es más ápida y e icaz. Es e p oceso es conocido como
memo ia inmunológica
38
y es p ecisamen e el p oceso que se induce con la acunación.
Células o lin oci os T
Es as células se denominan así po que su madu ación iene luga en el imo.
39
Es e
p oceso de madu ación p oduce una di e enciación en la que se o man lin oci os T CD4+,
38
Ai oldi, I.; e al.; Clin. Cance Res. 2004, 10, 144-154.
39
Hi oz, C.; Sai akis, M.; F on . Immunol. 2016, 7, 46.
In oducción
11
ambién llamados lin oci os T coope ado es o lin oci os TH (del inglés T helpe ). Es e
nomb e es debido a que es as células po sí mismas no pueden aniquila una célula
in ec ada o un pa ógeno, sino que es án in oluc adas en la ac i ación de o as células
inmuni a ias, po lo an o, su papel es undamen al en la de ensa del o ganismo. Una ez
ac i adas es as células, se dis inguen es subg upos p incipales: las células TH1, coope an
con los mac ó agos, po enciando su ac uación y las espues as in lama o ias; las células
TH2, que colabo an con la ac i ación de lin oci os B y en la sec eción de an icue pos y
son pa icula men e impo an es en el anscu so de eacciones alé gicas, como se habla á
más adelan e. Po úl imo, las células TH17, que undamen almen e median en la espues a
de neu ó ilos.
En el imo ambién se p oduce una di e enciación hacia o o ipo de células, los llamados
lin oci os T CD8+ o lin oci os T ci o óxicos (CTL, del inglés Cy o oxic T Lymphocy e),
cuya unción es el econocimien o y eliminación de células in ec adas po pa ógenos.
Cabe des aca que los lin oci os T solo econocen a los an ígenos po medio de las células
p esen ado as de an ígeno o APCs (del inglés An igen-P esen ing Cells).
40
Es as células
in e nalizan an ígenos ex años po medio de endoci osis y los p ocesan pa a p esen a
moléculas an igénicas sob e su p opia memb ana en o ma de pép idos a a és de unas
moléculas especializadas llamadas complejo p incipal de his ocompa ibilidad o MHC
(del inglés Majo His ocompa ibili y Complex).
41
Es as APCs in oluc an di e sos ipos
de células del sis ema inmuni a io algunas de las cuales, así como el p oceso de
p esen ación de an ígenos, se desc ibi án más adelan e. Po lo an o, una ez p esen ados
es os agmen os pep ídicos po pa e de las APCs, es os son econocidos po los
lin oci os T a a és de sus ecep o es especí icos, denominados TCR (del inglés T Cell
Recep o ), iniciándose su ac i ación (TH1, TH2 y TH17).
Adicionalmen e, exis e o a subpoblación de lin oci os T conocidos como células T
egulado as o T eg que iene un papel undamen al en las en e medades au oinmunes y
en la ale gia.
42
Es os lin oci os sup imen la ac i idad del sis ema inmune po medio de la
ac uación sob e los lin oci os TH y las APCs siendo, po lo an o, undamen ales pa a el
40
Wang, J.-H.; Reinhe z, E.L.; Immunol. Re . 2012, 250, 102-119.
41
Yokosuka, T.; Sai o, T.; Cu . Top. Mic obiol. Immunol. 2010, 340, 81-107.
42
Aga wal, A.; Singh, M.; Cha e jee, B.P.; Chauhan, A.; Chak abo i, A.; In . J. Pedia . 2014,
636238.
Capí ulo 1
12
man enimien o de la homeos asis y la gene ación de ole ancia en e a an ígenos.
43
De
es a o ma, se e i a una espues a exage ada del sis ema inmune que pod ía daña al
p opio o ganismo. Los p ocesos de allados de cómo se p oduce es a modulación del
sis ema inmune no son bien conocidos y con inúan bajo una in ensa in es igación.
44
Células NK
Las células NK (del inglés Na u al Kille ) o células asesinas cons i uyen el e ce ipo de
lin oci os. Su unción es la des ucción de células in ec adas po pa ógenos o de células
cance osas po medio de la lisis de las mismas, pa icipando en la espues a inmuni a ia
inna a, dado que no p ecisan de an ígenos sensibilizan es.
45
Las células NK p esen an
ecep o es en su supe icie que de ec an cambios en el MHC de las células dañadas. Es e
p oceso de econocimien o de células in ec adas en e a células sanas es muy e icaz.
El g an con ol y modulación en e di e en es células del sis ema inmune se p oduce
g acias a la sec eción po pa e de las mismas de ci ocinas o ci oquinas, que son p o eínas
o glicop o eínas de pequeño amaño que desempeñan di e sas unciones como la
egulación de la p oli e ación y di e enciación celula , la quimio axis, la modulación de
la sec eción de Ig y la egulación del mecanismo de la in lamación. Exis en ci oquinas
p o-in lama o ias y an i-in lama o ias. Las sec e adas po los leucoci os se denominan
in e leucinas o in e leuquinas (IL), de las cuales se han iden i icado 33 (IL-1 a IL-33).
46
Den o de es a amilia de mediado es solubles como son las ci oquinas, des aca ambién
o o subg upo po su impo ancia, los in e e ones (IFNs), dado que pa icipan en el
p oceso de p esen ación de an ígenos, así como en la ac i ación de células NK y de
mac ó agos ( e a con inuación).
Las ci oquinas poseen ca ac e ís icas muy ma cadas como es su edundancia, muchas
ci oquinas di e en es compa en unciones análogas; su pleio opismo, una misma
ci oquina iene e ec os dis in os sob e di e en es células diana; o su an agonismo, el e ec o
de una ci oquina anula o e ie e el e ec o de o a. Sin emba go, una sob e-es imulación
de ci oquinas es con ap oducen e, dado que se puede o igina un pelig oso sínd ome
43
Chen, W.; Immuno he apy 2011, 3, 911–914.
44
Wieczo ek G.; e al.; Cance Res. 2009, 69, 599-608.
45
Xu, Y.; Zhou, S.; Wah Lam, Y.; Pang, S.W.; F on . Immunol. 2017, 8, 998.
46
Schmi z, J.; e al.; Immuni y 2005, 23, 479-490.
In oducción
13
llamado o men a de ci oquinas,
47
ocasionado po una espues a exage ada del sis ema
inmune que puede esul a mo al.
Una ez desc i os es os lin oci os, es impo an e des aca el papel que juegan en las
eacciones alé gicas, ya que es as es án mediadas p incipalmen e po inmunoglobulina
especí ica o IgE, nomb e que se debe a que son especí icas pa a cada alé geno. Como se
mencionó an e io men e, las IgE son sec e adas po las células B, que a su ez han sido
es imuladas po las células TH2, po eso la espues a alé gica es conocida ambién como
espues a de ipo TH2. El mecanismo mediado po la IgE cons a de dos e apas
di e enciadas. (Figu a 1.4) P ime amen e, al gene a se la IgE, es a se adhie e a la
supe icie de los g anuloci os como los mas oci os y los basó ilos.
48
,
49
Se dice en onces
que los mas oci os y basó ilos ecubie os po IgE desa ollan una sensibilización. Es
impo an e ema ca que es e p oceso no p o oca ningún ipo de eacción ad e sa en el
o ganismo; sin emba go, la exposición pos e io men e al mismo alé geno da luga a la
unión de es e a las IgE ya unidas a la supe icie celula . Es e econocimien o p o oca la
up u a de sus o gánulos, libe ando su con enido al ex e io , en un p oceso que se conoce
como desg anulación. Las moléculas libe adas son a macológicamen e ac i as como la
his amina, leuco ienos (LTC4 y LTD4) y p os aglandinas, que ac úan sob e los ejidos
ci cundan es p o ocando la sin oma ología clásica de las eacciones alé gicas.
47
Lee, D.W.; Blood 2014, 124, 188-195.
48
Muehling, L.M.; Law ence, M.G.; Wood olk, J.A.; J. Alle gy Clin. Immunol. 2017, 140,
1523-1540.
49
No al, R.M.; Bu on, O.T.; Oe gen, H.C.; Cha ila, T.; J. Alle gy Clin. Immunol. 2016, 138,
801-811.
Capí ulo 1
20
mien as que TLR3, 7, 8 y 9 se exp esan en o gánulos in acelula es, p incipalmen e
endosomas y en el e ículo endoplasmá ico. Es e ipo de ecep o es es án exp esados
undamen almen e en mac ó agos, células dend í icas, neu ó ilos, células epi eliales y
células endo eliales.
Cada uno de es os ecep o es econoce di e sos PAMPs de mic oo ganismos o de i ados
de es os. (Figu a 1.7.) Po ejemplo, TLR3 econoce ARN de doble cadena (dsADN) en
i us, TLR4 econoce lipopolisacá idos (LPS) p esen es en bac e ias G am-nega i as,
TLR7 y TLR8 econocen ARN monoca ena io (ssARN), TLR9 econoce exclusi amen e
ADN con mo i os CpG no me ilados, encon ados en p oca io as y i us.
69
Aún no se ha
encon ado el PAMP que econoce el TLR10 humano aunque se sabe que es un ecep o
uncional.
70
Figu a 1.7. Rep esen ación de la localización celula de los TLRs humanos y sus PAMPs. Imagen
modi icada de la e e encia 69.
Cuando se p oduce es e econocimien o, es os ecep o es homodime izan o
he e odime izan en e ellos, p o ocando cascadas de señalización con e ec os muy
a iados como la mig ación y madu ación de las DCs y el aumen o en la exp esión de
ci oquinas, imp escindibles pa a la espues a inmune adap a i a, como po ejemplo IL-
10, IL-12 y las eque idas pa a la p esen ación de an ígenos (moléculas MHC-II y
69
Kanzle , H.; Ba a , F.J.; Hessel, E.M.; Co man, R.L.; Na . Med. 2007, 13, 552-559.
70
Hasan, U. e al.; J. Immunol. 2005, 174, 2942-2950.

In oducción
21
moléculas co-es imulado as como CD80 y CD86).
71
Como ya se ha comen ado
an e io men e, las células dend í icas son c uciales en el inicio de la espues a inmune
adap a i a, ya que conducen a la di e enciación de las CD4+ en di e en es eno ipos de
células T e ec o as (TH1, TH2 o TH17) o egulado as (T eg).
72
Po lo an o, la ac i ación
de los TLRs es undamen al en el con ol y modulación de las espues as del sis ema
inmune, siendo de g an in e és pa a el a amien o de en e medades inmuni a ias como la
ale gia. Es e concep o se á ampliado más adelan e.
1.3 Inmuno e apia
Si bien una de las o mas de p e eni una eacción alé gica es e i a el con ac o con el
alé geno en cues ión, muchas eces es o no es i ial. En el caso de ale gias alimen a ias
es necesa io lle a a cabo una die a es ic i a que e i e el alé geno. Sin emba go, exis en
p oblemas asociados como la con aminación c uzada
73
y la p esencia de azas del
alé geno en cues ión su icien es pa a p o oca una eacción. Po o o lado, no es posible
e i a sa is ac o iamen e alé genos es acionales (como el polen), áca os o el eneno de
himenóp e os (abejas, a ispas, e c.). Aunque pueden se adminis ados an iin lama o ios
y an ihis amínicos, es os a amien os únicamen e consiguen ali ia empo almen e los
sín omas de la ale gia.
Ac ualmen e, los es ue zos en la búsqueda de un a amien o con a las en e medades
alé gicas se cen an en la inmuno e apia especí ica con alé genos (AIT, del inglés
Alle gen-speci ic ImmunoThe apy), siendo es e el único a amien o e icaz has a el
momen o.
74
La inmuno e apia consis e en la adminis ación de dosis c ecien es del
alé geno causan e de la ale gia con el obje i o de induci un e ec o p o ec o de inmunidad
es deci , gene a ole ancia en e al alé geno en cues ión.
El p ime es udio sob e inmuno e apia especí ica se emon a a p incipios del siglo XX
(1911), cuando Noon
75
inyec ó un ex ac o de polen de g amíneas en un pacien e cuyos
sín omas alé gicos coincidían con la polinización de g amíneas. Noon obse ó que los
71
Rassa, J.C.; Ross, S.R.; Mic ob. In ec . 2003, 5, 961-968.
72
Ganglo , S.; Guenounou, M.; Clinic. Re . Alle g. Immunol. 2004, 26, 115-125.
73
Sil es e , J.A.; G a , L.A.; Rigaux, L.; Walke , J.R.; Due ksen, D.R.; Alimen . Pha macol.
The . 2016, 44, 612-619.
74
Inco aia, C.; G i i, B.L.; Ridolo, E.; Med. Econ. 2018, 21, 553-555.
75
Noon, L.; Can ab, B.C.; Lance 1911, 177, 1572-1573.
Capí ulo 1
22
pacien es inoculados p esen aban una mayo esis encia al alé geno, concluyendo que se
gene aba una espues a p o ec o a o inmunidad.
Po lo an o, los a amien os basados en AIT son conside ados acunas, ya que su
inalidad es la gene ación de inmunidad y ienen un ca ác e p o ilác ico. El mecanismo
de acción consis e en gene a la ole ancia al alé geno educiendo la p oducción de IgE
que, como se comen ó p e iamen e, es la esponsable de la sin oma ología alé gica al
uni se a mas oci os y basó ilos, p o ocando su desg anulación. Las pe sonas se
desensibilizan median e la adminis ación de dosis c ecien es del alé geno, disminuyendo
g adualmen e la espues a dominada po IgE. El obje i o de la inmuno e apia es aleja la
espues a inmune de la inmunidad humo al (mediada po lin oci os B y an icue pos) y
di igi la hacia la inmunidad celula (mediada po lin oci os T), disminuyendo la
p oducción de an icue pos IgE y p oduciendo más células T eg que sec e an IFN-γ, IL-
10 y TNF-β, con a es ando así la p oducción de IgE.
76
Po lo an o, es a modulación se puede esumi como un cambio de espues a de ipo TH2
(alé gica) hacia una espues a de ipo TH1 (no alé gica), ya que como se explicó
p e iamen e, la di e enciación de los lin oci os colabo ado es T CD4+ en lin oci os TH1
o TH2 condicionan el mecanismo de la espues a inmuni a ia. (Figu a 1.8)
76
Mu phy, K.; Wea e , C.; Janeway´s Immunobiology, 2014, 8 h Edi ion.
In oducción
23
Figu a 1.8. Rep esen ación de los ipos de di e enciación de lin oci os TH1 y TH2 y las ci oquinas
implicadas.
Es impo an e señala que el descenso de IgE no implica que el o ganismo que desa olla
ole ancia (pacien es no alé gicos) no p esen e ningún an icue po especí ico a los
alé genos, sino que es e es de o o ipo llamado IgG, que no da luga a p ocesos de
in lamación alé gicos al uni se a sus alé genos.
77
La AIT se aplica usando dis in as ías de adminis ación del alé geno. (Figu a 1.9) Las
más impo an es son:
- Inmuno e apia o al (OIT, del inglés O al ImmunoThe apy): el alé geno es
inge ido ía o al. Es a AIT se ha mos ado e ec i a undamen almen e en el caso
de alé genos ambien ales.
78
Aunque es a es la ía de adminis ación más sencilla;
sin emba go, no esul a muy e ec i a pa a alé genos alimen a ios, ya que muchos
son esis en es a los p ocesos de diges ión y pueden p oduci g a es e ec os
secunda ios. Po lo an o, es a ía es á muy limi ada.
- Inmuno e apia sublingual (SLIT, del inglés SubLingual ImmunoThe apy): el
alé geno se adminis a en disolución como go as que se man ienen debajo de la
lengua du an e unos minu os, p oduciéndose la abso ción. Es a ía ha sido la más
77
Huang, X.; e al.; Alle gy 2018, 73, 421-430.
78
Mölle , C.; D ebo g, S.; Lanne , A.; Bjö ks én, B.; Alle gy 1986, 41, 271-279.
Capí ulo 1
24
es udiada de odas du an e los úl imos 30 años debido a sus escasos e ec os
secunda ios y su éxi o en el a amien o de la ini is alé gica.
79
- Inmuno e apia subcu ánea (SCIT, del inglés SubCu aneous ImmunoThe apy): el
alé geno se inyec a bajo la piel. Es a ía, que ue de las p ime as es udiadas, iene
la en aja con espec o a las o as que puede usa se con una g an a iedad de
alé genos, no indicados pa a las an e io es, como el eneno de himenóp e os; sin
emba go, se han de ec ado algunos e ec os secunda ios.
80
- Inmuno e apia epicu ánea (EPIT, del inglés EpiCu aneous ImmunoThe apy): el
alé geno se adminis a po abso ción a a és de la piel, po ejemplo, con el uso
de pa ches. Es una de las ías más ecien es, es udiada desde hace 10 años. Su
obje i o es se una e olución de la SCIT, e i ando el uso de la inyección. Sin
emba go se han encon ado ambién e ec os secunda ios y de momen o sus
esul ados no son signi ica i amen e mejo es que los encon ados en el caso de la
SCIT.
81
Figu a 1.9. Rep esen ación de las di e sas ías de adminis ación de la AIT.
79
Passalacqua, G.; Bagnasco, D.; Canonica, G.W.; Alle gy 2020, 75, 1107-1120.
80
Do o ee a, Y.; e al.; Alle gy 2021, 76, 131-149.
81
Kim, E.H.; Pa el, C.; Bu ks, A.W.; Expe Re . Clin. Immunol. 2020, 1, 1-8.
In oducción
25
1.3.1 Pép idos sin é icos en el desa ollo de acunas con a la
ale gia
Todas las acunas basadas en AIT u ilizan ex ac os ale génicos, con eniendo las
p o eínas en e as, ob enidos de sus uen es na u ales. Es o p o oca eno mes di e encias
en e las acunas de las di e en es compañías a macéu icas. Además, debido a la
he e ogeneidad de las uen es na u ales, ambién su gen p oblemas de ep oducibilidad
en e di e en es lo es de los ex ac os. Es a a iabilidad de ex ac os, dependiendo de la
pu eza y calidad de las uen es de pa ida, plan ea se ios incon enien es.
82
,
83
En es e con ex o, el uso de pép idos sin é icos se posiciona como una al e na i a e icaz y
iable.
84
Den o de la es uc u a p o eica del alé geno se pueden de ini di e en es egiones
denominadas epí opos. Un mismo alé geno puede ene di e en es epí opos o un conjun o
de epí opos epe idos. La idea que subyace es el empleo de agmen os sin é icos de es as
egiones p o eicas, lo que ga an iza la ep oducibilidad y la monodispe sidad de los
dis in os lo es de acunas, así como la educción del iesgo de eacción alé gica, al se el
pép ido menos inmunogénico que la p o eína en e a. Adicionalmen e, la gene ación de
es os pép idos de o ma sin é ica ab e nue os e in e esan es e os en el diseño acional de
acunas pep ídicas, como es la p esen ación simul ánea de di e en es epí opos de un
mismo alé geno o la in oducción de aminoácidos no na u ales que puedan, en e o as
cosas, aumen a la es abilidad del pép ido.
85
De los mé odos es ablecidos pa a la sín esis de pép idos, des aca la sín esis en ase sólida
(SPPS, del inglés Solid-Phase Pep ide Syn hesis), cen ada en el abajo pione o de
Me i ield.
86
Es e mé odo consis e en el ensamblaje de una cadena pep ídica, a a és de
sucesi as eacciones de de i ados de aminoácidos, sob e una esina insoluble
uncionalizada con g upos amino o hid oxilo. El p ocedimien o gene al de la SPPS
consis e en sucesi os ciclos de eacciones al e nas de desp o ección y acoplamien o N-
e minal. (Figu a 1.10A) P ime o se acopla un aminoácido a la esina, pos e io men e, la
82
Focke, M.; Ma h, K.; Flicke , S.; Valen a, R.; Clin. Exp. Alle gy 2008, 38, 1400-1408.
83
Cu in, M.; Reininge , R.; Swoboda, I.; Focke, M.; Valen a, R.; Spi zaue , S.; In . A ch. Alle gy
Immunol. 2011, 154, 258-263.
84
Pu cell, A. W.; e al.; J. Pep . Sci. 2003, 9, 255-281.
85
Seebach, D.; Beck, A.K.; Bie baum; D.J.; Chem. Biodi e s. 2004, 1, 1111-1239.
86
Me i ield, R.B.; J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154.

Capí ulo 1
26
amina se desp o ege y luego se acopla con el ácido lib e del segundo aminoácido. Es e
ciclo se epi e has a que se sin e iza la secuencia deseada, c eciendo la cadena del ex emo
C- e minal al N- e minal. Al inal de la sín esis, el pép ido se escinde del sopo e sólido
mien as que simul áneamen e se eliminan odos los g upos p o ec o es usando un ácido
ue e como el ácido i luo oacé ico (TFA). El pép ido ob enido de es a o ma suele
pu i ica se po medio de HPLC de ase e e sa (RP-HPLC).
87
La SPPS pe mi e la sín esis
de pép idos de has a 70 aminoácidos con buenos endimien os. Es a sín esis se puede
lle a a cabo de o ma e icien e y en ela i amen e poco iempo usando los sin e izado es
de pép idos come ciales. (Figu a 1.10B)
87
Man , C.T.; e al.; Me h. Mol. Biol. 2007, 386, 3-55.
In oducción
27
Figu a 1.10. A) Rep esen ación esquemá ica de la SPPS. B) Imagen del sin e izado au omá ico
de pép idos Libe y Blue HT12™ (CEM Co po a ion), uno de los más a anzados del me cado.
Uno de los p oblemas del uso de pép idos sin é icos es su baja inmunogenicidad. Po ello,
es necesa io combina su adminis ación con adyu an es que mejo en la espues a
inmune.
1.3.2 El papel de los adyu an es en las acunas
Los adyu an es son odas aquellas sus ancias que po encian, acele an y p olongan la
espues a inmune en e a los an ígenos de una acuna.
88
En e las en ajas del uso de los
adyu an es cabe des aca : la mejo a de la inmunogenicidad de los an ígenos; la educción
88
Sasaki, S.; Okuda, K.; Me h. Mol. Biol. 2000, 29, 241-250.
Capí ulo 1
28
de la can idad de an ígeno necesa ia pa a alcanza una inmunización exi osa; la educción
de la ecuencia de inmunización de e ue zo necesa ias; y una mejo espues a inmune
en ancianos y pacien es inmunodep imidos.
Los adyu an es se han u ilizado como adi i os en las acunas du an e décadas.
Ac ualmen e, solo hay cua o compues os ap obados que se usan como adyu an es en la
AIT: hid óxido de aluminio, os a o cálcico, i osina mic oc is alina y el Lípido A
mono os o ilado (MPL).
89
Los es p ime os ienen una unción p incipalmen e de
libe ación len a y p olongada del an ígeno, siendo el hid óxido de aluminio el más
u ilizado desde hace casi un siglo.
90
En cuan o al MPL, es conside ado un adyu an e de
“segunda gene ación”, ya que iene una unción inmunomodulado a. El MPL es un
de i ado de los LPS, que como se comen ó p e iamen e, es el PAMP na u al del TLR4.
Conc e amen e, el MPL es el p ime adyu an e ap obado basado en un agonis a de TLR.
91
Además, desde 1999 los pacien es que han ecibido una acuna con a la ale gia
inco po an el MPL como adyu an e,
92
ya que se ha demos ado que la in e acción del
MPL con TLR4 es imula la madu ación de las DCs y es as ac i an a los lin oci os T,
omen ando la p oducción de ci oquinas, especialmen e IL-12, dando una espues a de
ipo TH1 (no alé gica).
93
Ac ualmen e, exis e una mul i ud de adyu an es de segunda
gene ación en di e sas ases de desa ollo e in es igación que es án basados en ligandos
de PRR. (Tabla 1.1.)
89
Zubeldia, J.M.; Fe e , M.; Dá ila, I.; Jus icia, J.L.; J. In es ig. Alle gol. Clin. Immunol. 2019,
29, 103-111.
90
Gamazo, C.; D’Amelio, C.; Gas aminza, G.; Fe e , M.; I ache, J.M.; Hum. Vaccin.
Immuno he . 2017, 13, 2416-2427.
91
Luchne , M.; Reinke, S.; Milicic, A.; Pha maceu ics 2021, 13, 142.
92
Rosewich, M.; Lee, D.; Zielen, S.; Hum. Vaccin. Immuno he . 2013, 9, 1523-1531.
93
Ismaili, J.; e al.; J. Immunol. 2002, 168, 926-932.
In oducción
29
Tabla 1.1. Ejemplos de adyu an es basados en ligandos de PRR en di e sas ases de desa ollo.
Po lo an o, hay un c ecien e in e és en la aplicación de es os adyu an es combinados
con alé genos pa a su uso en la AIT, (Figu a 1.11) debido a su capacidad de modula la
espues a inmune desde un pa ón TH2 hacia uno TH1.
94
Es impo an e des aca que ni
odos los PRRs, ni odos sus ligandos, pueden omen a es a modulación po lo an o, es
necesa io una p o unda in es igación sob e los mecanismos que igen es os p ocesos
inmunológicos.
94
Puggioni, F.; Du ham, S.R.; F ancis, J.N.; Alle gy 2005, 60, 678-684.
Adyu an e
Desc ipción
Fase de desa ollo
Liposomas
(AS01)
Vesículas lipídicas que con ienen un
ligando de TLR4 y saponina.
Fase III
C ema ópica
w/TLR7
Ungüen o ópico basado en un ligando
de TLR7 (Alda a) en combinación con
una acunación in adé mica.
Fase III pa a In luenza
IC31
Pép ido ca iónico complejando a un
ligando de TLR9 (CpG ssADN).
Fase II
Poly(I:C)
(Ampligen)
Análogo de políme o de ARN
bica ena io (PolyI:C12U), ligando de
TLR3.
Fase II
Del a inulin
(Ad ax)
Polisacá ido de i ado de plan as,
mic opa iculado y c is alizado.
Fase II
CAF01
Liposoma ca iónico que incluye un
ligando sin é ico de CLR.
Fase I

Sín esis de conjugados alé geno-pi imido[5,4-b]indol
pa a el ecep o TLR4
37
3. Sín esis de conjugados alé geno-pi imido[5,4-
b]indol pa a el ecep o TLR4
3.1 In oducción
El p ime abajo elacionado con los ecep o es TLR ue el descub imien o de la p o eína
ansmemb ana TLR4 en la mosca de la u a, poniéndose de mani ies o que la mu ación
del gen que exp esa dicha p o eína se asociaba a una disminución de su espues a
inmuni a ia en e a pa ógenos.66 Po es os hallazgos, B uce A. Beu le y Jules A.
Ho mann ue on gala donados con el P emio Nobel de Medicina y Fisiología en 2011.
El TLR4 es una p o eína con un peso molecula de ap oximadamen e 95 KDa que se
encuen a en el ex e io de la memb ana celula , po lo an o, se clasi ica como un ecep o
ex acelula . TLR4 econoce di e sos lipopolisaca á idos (LPS), que son el componen e
mayo i a io de la memb ana de las bac e ias G am-nega i as.
96
El mecanismo po el que
iene luga el econocimien o implica a una p o eína acceso ia, el Myeloid Di e en ia ion
ac o 2 (MD-2), o mando un complejo he e odimé ico.
97
Cabe des aca que es e
ecep o es el único de odos los TLRs que necesi a de una p o eína acceso ia pa a su
ac i ación. Sin emba go, en es e econocimien o ambién pueden pa icipa o as
p o eínas como la p o eína de unión a lipopolisacá idos (LBP, del inglés,
Lipopolysaccha ide Binding P o ein),
98
que se une a LPS y lo anspo a a una p o eína
CD14 (del inglés, Clus e o Di e en ia ion), que a su ez lo p esen a al MD-2,
induciendo la o mación del he e odíme o TLR4 / MD-2 / TLR4* / MD-2*. (Figu a 3.1)
Po lo an o, po medio de es e complejo se p oduce el econocimien o de los LPS debido
a que es e se une a una p o eína MD-2 p o ocando una dime ización de o o complejo
TLR4/MD-2. Es e p oceso de dime ización (Figu a 3.1) induce la ac i ación de cascadas
de señalización del sis ema inmune inna o.
99
Los es udios de los mecanismos de
96
B ubake , S.W.; Bonham, K.S.; Zanoni, I.; Kagan, J.C.; Annu. Re . Immunol. 2015, 33, 257-
290.
97
Shimazu, R.; Akashi, S.; Oga a, H.; Nagai, Y.; Fukudome, K.; Miyake, K.; Kimo o, M.; J. Exp.
Med. 1999, 189, 1777-1782.
98
Schumann, R.; Leong, S.; Flagg, G.; G a, P.; W igh , S.; Ma hison, J.; Tobias, P.; Ule i ch, R.;
Science 1990, 249, 1429-1431.
99
Beom, S. P.; Lee, J.; Exp. Mol. Med. 2013, 45, e66.
Capí ulo 3
38
ac i ación de es e ecep o son muy ecien es y con inúan en la ac ualidad. No ue has a
2009 cuando se publicó la es uc u a c is alina del complejo he e odimé ico TLR4/MD-
2/LPS,
100
conside ándose es a es uc u a como la con o mación ac i a de TLR4.
Figu a 3.1. Rep esen ación del econocimien o de LPS po TLR4/MD-2 o iginando una
dime ización. Figu a modi icada de la e e encia 99.
La ac i ación de TLR4 desencadena la libe ación de ci oquinas p o-in lama o ias que
p o ocan ue es espues as inmunes a a és de la madu ación de las células dend í icas
y la sec eción de IFN de ipo 1.
101
Es impo an e des aca que TLR4 di ie e del es o de
la amilia de los TLRs al ene dos ías de señalización in acelula dis in as que dan luga
a es as espues as. La ía dependien e de MyD88 (del inglés, Myeloid Di e en ia ion
Fac o 88)
102
que culmina con la sec eción de ci oquinas p o-in lama o ias y, po o o
lado, la ía dependien e de TRIF (del inglés, TIR-domain-con aining adap e inducing
in e e on-β)
103
que gene a IFN de ipo 1.
3.2 TLR4 como diana e apéu ica en ale gia
La ac i ación de algunos TLRs puede modula la espues a inmune desde una espues a
celula ipo TH2 (alé gica) a una de ipo TH1 (no alé gica), como se ha comen ado
an e io men e. En el caso conc e o del ecep o TLR4 se es án lle ando a cabo muchos
es ue zos pa a en ende los mecanismos inmuni a ios asociados a su ac i ación. Los
p ime os es udios se cen a on en la in e acción con su PAMP o iginal. A pa i de es os
100
Pa k, B.; Song, D.; Kim, H.; Choi, B.; Lee, H.; Lee, J.; Na u e 2009, 458, 1191-1195.
101
Richez, C.; e al.; J. Immunol. 2009, 182, 820-828.
102
Medzhi o , R.; e al.; Mol. Cell. 1998, 2, 253-258.
103
Yamamo o, M.; e al.; J. Immunol. 2002, 169, 6668-6672.
Sín esis de conjugados alé geno-pi imido[5,4-b]indol
pa a el ecep o TLR4
39
es udios se concluyó que los LPS son capaces de ac i a las DCs y la sec eción de IL-
12p70 e IL-10, que p oducen una di e enciación de las células CD4+, undamen almen e
a células TH.
104
Es os esul ados an p ome edo es ab ie on el camino al diseño de una
g an a iedad de acunas basadas en la ac i ación de TLR4.
Es e c ecien e in e és po pa e de la comunidad cien í ica se ha is o e lejado en la
publicación de un g an núme o de es udios elacionados con TLR4 como diana
e apéu ica.
105
Tan o es así que ac ualmen e exis en algunos candida os pa a acuna
basados en es a es a egia que se encuen an en di e sas ases de in es igación p eclínica.
La idea undamen al es el uso de agonis as de TLR4 como adyu an es en AIT, debido al
po encial de la ac i ación de es e ecep o sob e el sis ema inmune. Sin emba go, el uso
de adyu an es pa a acunas sin é icas basados en LPS es á muy limi ado debido a la
oxicidad asociada a es os compues os. Po lo an o, muchos de los es udios que se han
comen ado p e iamen e se basan en la búsqueda de nue os ligandos pa a TLR4 que sean
e icaces y segu os. A con inuación, se de allan es os nue os ligandos y los es udios
lle ados a cabo pa a e alua su ac i idad inmunológica.
3.2.1 Ligandos lipídicos de TLR4
Debido a la oxicidad de los LPS, se ha ealizado una ex ensi a in es igación sob e o os
compues os que ambién son econocidos po TLR4. En una p ime a ap oximación, se
plan ea on es uc u as simila es a las de los LPS. Los LPS son g andes moléculas
cons i uidas po un polisacá ido y una pa e lipídica. Den o de es a es uc u a, una de las
egiones más conse adas y la esponsable de la ac i ación del sis ema inmune es el
llamado lípido A, si bien ambién lle a asociada la ac i idad óxica. Es e lípido A es á
o mado po un disacá ido de glucosamina que p esen a dos és e es os a o ca gados
nega i amen e en los ca bonos C1 y C4’ y 6 cadenas de ácidos g asos unidos en las
posiciones C2, C3, C2’ y C3’. (Figu a 3.2)
Se han ealizado nume osas modi icaciones sob e las dis in as pa es de la es uc u a del
lípido A, e aluando si dichos cambios a ec aban a su capacidad de in e acciona con
104
Re, F.; S ominge , J.L.; J. Biol. Chem. 2001, 40, 37692–37699.
105
Ki land, M.E.; Tsi ou a, D.C.; Du ham, S.R.; Shamji, M.H.; F on . Immunol. 2020, 11,
599083.
Capí ulo 3
40
TLR4, in en ando educi su oxicidad.
106
Es as in es igaciones iniciales culmina on con
el MPL, que cumple es as condiciones y que como se comen ó en la In oducción de la
p esen e Tesis Doc o al, es el único compues o ap obado ac ualmen e pa a AIT basado
en un agonis a de TLR. La es uc u a del MPL es la misma que la del lípido A pe o sin
un g upo os a o y cambios en las cadenas lipídicas Las modi icaciones químicas de la
es uc u a del lípido A se ex endie on a más a ian es (Figu a 3.2). Po ejemplo, la
eliminación de dos ácidos g asos lle a a la es uc u a E i o an. La modi icación en el
núme o de ácidos g asos de es as a ian es de lípidos A, na u ales o sin é icas, pueden
bloquea o inhibi la ac i ación de TLR4, ac uando así como an agonis as. Es e hecho se
con i mó al analiza la es uc u a c is alina del homodíme o TLR4/MD-2 unido al
E i o an,
107
ya que se obse a que es e compues o inse a odas las cadenas de ácidos
g asos en el bolsillo hid o óbico de MD-2; sin emba go, a di e encia del lípido A, el
E i o an no puede induci la dime ización ni la ac i ación de TLR4, po lo que ac úa como
un an agonis a de TLR4. Cu iosamen e, o as a ian es es uc u ales siguen ence ando
so p esas, po ejemplo, el lípido IVa, un p ecu so biosin é ico e aacilado del lípido A,
ac úa como an agonis a en humanos pe o como un agonis a en a ones. Es e esul ado se
ha a ibuido a las di e encias encon adas en la o ma del bolsillo hid o óbico del MD-2
de humano y a ón, así como a los e ec os elec os á icos. Es e hecho pone de mani ies o
la c ucial impo ancia de es a unión, dando unos esul ados an dispa es incluso en e
di e en es especies de mamí e os.
108
También, se ha in es igado la in luencia de la pa e
disaca ídica encon ándose e ec os an agonis as.
106
Pe i, F.; Calab ese, V.; J. Med. Chem. 2014, 57, 3612-3622.
107
Kim, H.; e . al.; Cell 2007, 130, 906-917.
108
Oh o, U.; Fukase, K.; Miyake, K.; Shimizu, T.; P oc. Na l. Acad. Sci. USA 2012, 109, 7421-
7426.
Sín esis de conjugados alé geno-pi imido[5,4-b]indol
pa a el ecep o TLR4
41
Figu a 3.2. Es uc u a del lípido A y ejemplos de algunas de sus modi icaciones es udiadas.
Figu a modi icada de la e e encia 106.
Es as es uc u as de i adas del lípido A p esen an algunos incon enien es se ios ya que,
debido a sus egiones pola es y apola es, son moléculas an i ílicas. Es o implica que en
disolución o man ag egados, p oduciendo ambién una baja solubilidad en agua, lo que
a eces complica su manipulación an o in i o como in i o, así como unas pob es
p opiedades a macodinámicas. Po lo an o, es undamen al el desa ollo de nue as
es uc u as molecula es inspi adas po compues os na u ales ac i os pa a TLR4 con
mejo es p opiedades como solubilidad, biodisponibilidad y oxicidad, en compa ación
con los compues os basados en el lípido A. A con inuación, se expond á de o ma
esumida la búsqueda de es os nue os ligandos que cons i uyen una de las ías más
p ome edo as en el uso de la AIT basadas en TLR4.

Capí ulo 3
42
3.2.2 Ligandos no lipídicos de TLR4
La modelización compu acional es una pode osa he amien a en la búsqueda de nue os
ligandos de TLR4 pa a el diseño acional de á macos.
109
Po medio de es as écnicas,
ecien emen e se han iden i icado algunas moléculas pequeñas que son ligandos pa a
TLR4. Es os es udios se han cen ado en el mecanismo de acción y en la in e acción con
p o eínas especí icas (TLR4, MD-2 y CD14). (Figu a 3.3) La eno me a iedad de
es uc u as basadas en es as pequeñas moléculas es so p enden e debido a su g an
di e encia es uc u al con el ligando na u al lipídico, los LPS. Además, es os compues os
in e accionan de dis in as o mas con TLR4 y/o a MD-2 y CD14. Po o o lado, algunas
moléculas pequeñas que e an capaces de in e acciona con TLR4 p o enían de uen es
na u ales e incluso e an á macos pa a el a amien o de o as en e medades. Uno de es os
compues os es el pacli axel (PTX), (Figu a 3.3) un po en e agen e an icance ígeno
ex aído del ejo del Pací ico, que ac úa median e la sob e-es abilización de los
mic o úbulos celula es. Aunque el mecanismo de acción del PTX con a el cánce se ha
a ibuido du an e mucho iempo a los e ec os a ni el de la β- ubulina, posiblemen e la
ac i ación de una espues a inmune inna a y algunas de las p opiedades an i umo ales del
PTX es én elacionadas con el complejo TLR4/MD-2. Es a a i mación se apoya en el
hecho de que la unión del PTX a MD-2 se ha demos ado median e expe imen os in
i o.
110
De o ma análoga, ambién se ha iden i icado o o p oduc o na u al, la
Lap ocianidina B1, que se encuen a en el á bol de la canela. (Figu a 3.3) Su capacidad
de uni se a TLR4 se demos ó po medio de es udios de docking.
111
En la misma línea,
es as écnicas compu acionales demos a on la capacidad de unión a TLR4 de moléculas
an di e sas como el Xan hohumol (un ipo de Chalcona) o la Cu cumina (el p incipio
ac i o de la Cú cuma), si bien odas es as moléculas p esen an undamen almen e
p opiedades an agonis as.
112
(Figu a 3.3) Po o o lado, u ilizando la c oma og a ía
líquida acoplada a la espec ome ía de masas se puso de mani ies o que el Sul o a ano
(SFN) o ma un enlace co alen e con el esiduo Cys133 del MD-2. Los au o es
p opusie on, apoyándose en es udios de docking, un modelo en el que el SFN, una ez
109
Billod, J.M.; Lace e a, A.; Guzmán-Calden ey, J.; Ma ín-San ama ía, S.; Molecules 2016,
21, 994.
110
Resman, N.; G adisa , H.; Vasl, J.; Kebe , M.; P is o sek, P.; Je ala, R.; FEBS Le . 2008,
582, 3929-3934.
111
Xing, J.; e al.; Mol. Cell. Biochem. 2015, 407, 89-95.
112
Fu, W.; e al.; D ug Des. De . The . 2016, 10, 455-463.
Sín esis de conjugados alé geno-pi imido[5,4-b]indol
pa a el ecep o TLR4
43
unido co alen emen e a la Cys133, ocupa la misma posición que una de las cadenas
lipídicas del LPS. Es e modelo sugie e que el SFN e i a es é icamen e que o os LPS /
lípido A se ace quen y se asien en den o del bolsillo hid o óbico del MD-2 y al compe i
con ellos p esen a, po an o, una p opiedad an agonis a.
113
Figu a 3.3. Ligandos no lipídicos del complejo TLR4/MD-2. Imagen modi icada de la e e encia
109.
Es necesa io comen a que, una de las écnicas más ecien es y pode osas en el
descub imien o de nue os á macos es el c ibado de al a e icacia (HTS, del inglés High-
Th oughpu Sc eening).
114
Median e una combinación de obó ica, so wa e de con ol /
p ocesamien o de da os, disposi i os de manipulación de líquidos y de ec o es, la HTS
pe mi e ealiza ápidamen e millones de p uebas químicas, gené icas o a macológicas.
A a és de es e p oceso, se pueden iden i ica ápidamen e compues os ac i os,
an icue pos o genes que modulan una ía biomolecula pa icula . Los esul ados de es os
expe imen os p opo cionan pun os de pa ida pa a el diseño de á macos y pa a
comp ende la al a de in e acción o el papel de un si io de unión en pa icula . Debido al
113
Koo, J.E.; Pa k, Z.Y.; Kim, N.D.; Lee, J.Y.; Biochem. Biophys. Res. Commun. 2013, 434, 600-
605.
114
Maca on, R.; e al.; Na . Re . D ug Disco . 2011, 10,188-195.
Capí ulo 3
44
ele ado g ado de au oma ización de odo el p oceso, se pueden analiza has a 100000
moléculas de una quimio eca al día.
115
A pesa de ello, se siguen ealizando a ances pa a
mejo a más aún es e p oceso, po ejemplo, desa ollando un HTS que pe mi e un análisis
1.000 eces más ápido (100 millones de eacciones en 10 ho as) a una millonésima pa e
del cos e (u ilizando 10-7 eces el olumen de eac i o) en compa ación con las écnicas
con encionales que u ilizan mic o luidos basados en go as.
116
La HTS necesi a un
labo a o io de de ección al amen e especializado y cos oso pa a ejecu a una ope ación,
po lo que su uso no es á del odo ex endido.
El g upo de in es igación de Howa d B. Co am (Uni e sidad de Cali o nia), u ilizando
HTS, ealizó un amplio análisis de una quimio eca de más de 170.000 compues os,
seleccionándose 225 compues os pa a p uebas in i o con células del sis ema inmune.
De es os 225 candida os, 39 es imula on células humanas y de a ón median e la
exp esión de ci oquinas IL-6 y IL-8. De es e análisis, las 4-aminoquinazolinas sus i uidas
apa ecie on como la clase de compues os más po en es pa a la ac i ación de células
humanas. Po medio de es udios in i o, se iden i icó es a amilia de compues os como
agonis as del ecep o TLR4.
117
Es necesa io des aca que no hay muchos ejemplos en la
li e a u a que desc iban moléculas pequeñas sin é icas no lipídicas que sean agonis as de
TLR4. O a amilia de compues os iden i icados, los pi imido[5,4-b]indoles, su gió del
mismo es udio de HTS.
118
La quimio eca p ima ia de HTS con enía una amilia de 452
compues os de la clase pi imido[5,4-b]indol. Po es e mo i o, se pudo iden i ica las
ca ac e ís icas impo an es de es as es uc u as pa a la ac i ación de NFκB, un complejo
p o eico que es á implicado, en e o as unciones, en la exp esión de ci oquinas. Po lo
an o, pa a es a amilia se ealizó un es udio de elación es uc u a-ac i idad (SAR, del
inglés S uc u e-Ac i i y Rela ionship). En es os es udios, se iden i ica on los agmen os
de es as moléculas que es aban implicados en la in e acción con TLR4 median e el
análisis de la inducción de ci oquinas implicadas en su ac i ación. (Figu a 3.4) TLR4
en ía señales a a és de dos ías dis in as que conducen a las ci oquinas dependien es de
NFκB y a la p oducción de IFN ipo I. Los ensayos an e io es se u iliza on pa a compa a
la ac i idad de los de i ados de pi imidoindol pa a ac i a TLR4 humano y de a ón. La
115
Ca aus, I.; Alsuwailem, A. A.; Nadon, R.; Maka enko , V.; B ie . Bioin o m. 2015, 16, 974-
986.
116
Inglese, J.; e al.; P oc. Na l. Acad. Sci. USA 2006. 103, 11473-11478.
117
Nou , A.; e al.; Bioo g. Med. Chem. Le . 2014, 24, 4931-4938.
118
Chan, M.; e al.; J. Med. Chem. 2013, 56, 4206-4223.
Sín esis de conjugados alé geno-pi imido[5,4-b]indol
pa a el ecep o TLR4
45
ac i ación de TLR4 de a ón se e aluó po medio de la exp esión de IL-6. Se ealiza on
modi icaciones en las egiones de in e és del pi imidoindol y se compa a on odas es as
modi icaciones en e sí pa a obse a el g ado de in e acción con TLR4 humano y de
a ón median e el análisis de las ci oquinas libe adas.
Figu a 3.4. Rep esen ación de un de i ado de pi imido[5,4-b]indol y egiones que in luyen en la
p oducción de ci oquinas.
A pa i de es e es udio SAR, se ex aje on las siguien es conclusiones: la posición N-3
( egión en ama illo) debe inclui un g upo hid ó obo, p e e iblemen e un anillo de enilo
no sus i uido, pa a maximiza esa ac i idad; las sus i uciones en la posición N-5 del indol
( egión en azul) die on luga a la pé dida de la ac i idad y inalmen e, la amida e minal
( egión en ojo) equi ió un sus i uyen e al amen e hid ó obo pa a e i a la disminución
de la ac i idad, siendo un esiduo de ciclohexilo el sus i uyen e óp imo.
Es in e esan e des aca que, gene almen e es as modi icaciones es uc u ales de cada
molécula mos aban una mayo ac i idad en células mu inas que en células humanas.
Aunque el sis ema inmunológico inna o es á al amen e conse ado en e las especies, hay
algunas pequeñas di e encias en e el TLR4 humano y de a ón, como se comen ó
p e iamen e, que explica es a a iabilidad.
Una ez iden i icado el ligando más adecuado, aunque ya había sido demos ada su
ac i idad median e es udios in i o, se p ocedió a es udia su in e acción con TLR4 po
medio de écnicas compu acionales. Pa a ello, se examina on los modos de unión del
ligando al complejo TLR4/MD-2 mu ino po medio de docking. Se selecciona on las
con igu aciones del ligando unidas a es e complejo basándose en c i e ios de
complemen a iedad de la o ma de la supe icie y la ene gía in e molecula de
in e acciones más a o able, gene ándose el modelo de acoplamien o óp imo. (Figu a
3.5) En es e modelo se obse a que hay un conjun o de in e acciones elec os á icas
Capí ulo 3
52
Figu a 3.8. Espec o de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) del compues o 5.
A pa i de es e pun o, se ealiza una a iación de la sín esis o iginal plan eada po el
g upo de Co am, ya que se con inúa sin la me ilación del ni ógeno del indol. (Esquema
3.4.) Como se comen ó p e iamen e, es a modi icación no a ec a a la capacidad de unión
con TLR4 y de es a o ma se e i an e apas de p o ección y desp o ección siendo, po
an o, una u a sin é ica más simple y adecuada.
Esquema 3.4. Es a egia pa a la sín esis del compues o 7 sin me ilación del ni ógeno del indol.
Así, el siguien e paso consis ió en el a amien o del b omo de i ado 5 con ácido
b omoacé ico en p esencia de KOH a e lujo de e anol oda la noche pa a ob ene el
de i ado de ácido ca boxílico 6 de o ma cuan i a i a. Es e compues o ue
sa is ac o iamen e ca ac e izado po espec oscopía de RMN y espec ome ía de masas.
(Figu a 3.9) En el espec o de 1H-RMN se obse a cla amen e la desapa ición del p o ón
del NH de la iona a campo bajo, así como la apa ición de un singule e a 3.96 ppm, que
co esponde al me ileno del ioé e . Es os da os son consis en es con los da os de
espec ome ía de masas (ESI), obse ándose la señal co espondien e al ión molecula
p o onado ([M + H]+: m/z 432.1) con la co espondien e dis ibución iso ópica debido a
la p esencia del á omo de b omo.

Sín esis de conjugados alé geno-pi imido[5,4-b]indol
pa a el ecep o TLR4
53
Figu a 3.8. Espec o de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) (a iba) y de ESI-MS (abajo) del
compues o 6.
La amidación del ácido ca boxílico 6 se lle ó a cabo po medio del agen e de
acoplamien o hexa luo o os a o de 1-óxido-3-(bis(dime ilamino)me ilen)-3H-
[1,2,3] iazolo[4,5-b]pi idina (HATU) y ciclohexilamina, en condiciones anhid as,
o mándose el de i ado 7 con endimien o cuan i a i o. La es uc u a del compues o 7
pudo se e i icada median e el análisis de su espec o de 1H-RMN, po medio de las
señales de los cinco me ilenos de la ciclohexilo a campo al o en e 1.75-1.25 ppm, así
como del me ino a 3.54 ppm. Todas es as señales gua dan la co ec a elación de
in eg ación con el es o de p o ones del compues o 7. De la misma o ma, en el espec o
de 13C-RMN se co obo ó la apa ición de la señal del ca bono de la amida a 166.3 ppm y
las señales a campo al o co espondien es a los ca bonos de la ciclohexilo. (Figu a 3.10)
Capí ulo 3
54
Figu a 3.10. Espec o de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) (a iba) y 13C-RMN (100 MHz,
DMSO-d6, 298 K) (abajo) del compues o 7.
En es e pun o de la sín esis, una ez o mada comple amen e la es uc u a del
pi imido[5,4-b]indol, es necesa ia la de i a ización a a és del b omo de la posición C8.
Pa a ello, la química o ganome álica exhibe una g an a iedad de eacciones pa a
halogenu os de a ilo como las ípicas eacciones de acomplamien o C-C ( eacciones de
c oss-coupling) ca alizadas po paladio, como son las eacciones de Heck,
122
Suzuki,
123
122
Heck, R. F.; Nolley, J ., J. P.; J. O g. Chem. 1972, 37, 2320-2322.
123
Miyau a, N.; Suzuki, A.; Chem. Commun. 1979, 866-867.
Sín esis de conjugados alé geno-pi imido[5,4-b]indol
pa a el ecep o TLR4
55
Negishi,
124
y Sonogashi a,
125
en e muchas o as. Una de las es a egias plan eadas ue la
ans o mación en un de i ado de anilina, es deci , la con e sión de B -A a NH2-A , a
a és de una a ian e de la eacción de ipo Ullmann ca alizada po Cu(I). (Esquema 3.5)
Esquema 3.5. Sín esis del de i ado de anilina 8.
Po lo an o, se hizo eacciona el compues o b omado 7 en p esencia de CuI, azida sódica
y asco ba o sódico como agen e educ o , añadiendo ambién una diamina, la N,N-
dime ile ilendiamina (DMEN), en una mezcla DMSO/H2O y calen ando a 90ºC du an e
oda la noche. En es as condiciones, se ob u o el de i ado de anilina 8 con un endimien o
del 72%. Aunque apa en emen e pa ezca un cambio pequeño de la es uc u a química del
compues o 8 con espec o al 7, debido a es e cambio, las señales a omá icas del anillo
apa ecen más sepa adas. Además, apa ece un singule e ancho a 4.90 ppm co espondien e
a los p o ones del nue o g upo amino, que no p esen a co elación con ninguna señal del
espec o de ca bono, como se puede obse a en el espec o HSQC. (Figu a 3.11)
124
King, A.O.; Okukado, N.; Negishi, E.; Chem. Commun. 1977, 683-684.
125
Sonogashi a, K.; Tohda, Y.; Hagiha a, N.; Te ahed on Le . 1975, 50, 4467-4470.
Capí ulo 3
56
Figu a 3.10. Espec o de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) (a iba) y de HSQC (400 MHz,
DMSO-d6, 298 K) (abajo) del compues o 8.
Po espec ome ía de masas ESI se obse an las señales m/z co espondien es a la masa
del compues o 8, así como la pé dida del pe il iso ópico ca ac e ís ico del á omo de
b omo. (Figu a 3.12)
Sín esis de conjugados alé geno-pi imido[5,4-b]indol
pa a el ecep o TLR4
57
Figu a 3.12. Espec o de ESI-MS del de i ado 8.
Una ez sin e izada la amina 8, ue necesa io la in oducción del g upo maleimido pa a
la conjugación de los pép idos. Pa a ello, se lle ó a cabo la amidación con el ácido 3-
maleimidop opiónico (9), sin e izado a pa i de anhíd ido maleico y β-alanina, siguiendo
las condiciones desc i as en la bibliog a ía.
126
(Esquema 3.6)
Esquema 3.6 Sín esis del de i ado de maleimida 10.
Pa a es e acoplamien o, se usa on las condiciones ya es ablecidas pa a la eacción de
amidación, como es el empleo de HATU como agen e de acoplamien o, DIPEA (N,N’-
diisop opile ilamina) como base y DMF en condiciones anhid as. De es a o ma, se
ob u o el de i ado de malemida 10 con un buen endimien o (73%). Pa a con i ma la
comple a amidación del compues o 8, dicho compues o ue ca ac e izado po RMN y
espec ome ía de masas. En el espec o de 1H-RMN, se obse a la apa ición de un
126
Man o ani, G.; e al.; J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2966-2973.

Capí ulo 3
58
singule e a campo bajo a 10.06 ppm que co esponde al p o ón de la amida gene ada, así
como un singule e a 7.05 ppm ca ac e ís ico de los p o ones ole ínicos de la malemida.
En el espec o de ESI-MS se de ec a la señal co espondien e al ión molecula más sodio
([M + Na]+: m/z 621.2). (Figu a 3.12)
Figu a 3.12. Espec o de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) (a iba) y de ESI-MS (abajo)
del compues o 10.
Una ez sin e izado el pi imido[5,4-b]indol 10, uncionalizado con el g upo maleimido,
se puede lle a a cabo la conjugación con di e en es pép idos ale génicos. Es as
es uc u as son muy in e esan es dado que, a pa i de un mismo in e medio sin é ico
común, pueden conjuga se di e en es pép idos con aplicaciones como acunas en e a
di e en es ale gias.
Sín esis de conjugados alé geno-pi imido[5,4-b]indol
pa a el ecep o TLR4
59
3.5. Conjugación del ligando de TLR4 a dis in os pép idos
ale génicos
Como se comen ó en la In oducción de la p esen e esis doc o al, el meloco ón es la u a
que más ale gia p oduce en España,27 con una g an p edominancia ambién en el es o del
á ea medi e ánea. Su alé geno p incipal es una p o eína LTP (del inglés Lipid T ans e
P o ein) llamada P u p 3. Se ha demos ado que es as LTPs es án ampliamen e
conse adas y p esen an una g an simili ud con o as LTPs del eino ege al como las
encon adas en o as u as y en pólenes como la a emisa (A emisa ulga is, alé geno
Pla a 3)
127
y el plá ano de somb a (Pla anus ace i olia, alé geno A 3),
128
ocasionando
eacciones alé gicas c uzadas en e di e en es ege ales.
El único a amien o ac ual pa a la ale gia al meloco ón consis e en una acuna de AIT
basada en el ex ac o de es a p o eína (SLIT Meloco ón Alk-Abelló Labs) con odos los
p oblemas de ep oducibilidad asociados al uso de es os ex ac os que se comen a on
p e iamen e.
En base a los es udios sob e alé genos ege ales de la P o . Díaz Pe ales (Uni e sidad
Poli écnica de Mad id), se iden i ica on las egiones ale génicas de la p o eína P u p
3.
129
,
130
De es a o ma pudo desa olla se un pép ido sin é ico basado en uno de los
epí opos seleccionados, conc e amen e la egión que comp ende desde el aminoácido 26
al 46. Se ealiza on algunas modi icaciones de es a es uc u a o iginal como ue la
sus i ución de los aminoácidos cis eína (C) po se ina (S) pa a e i a eacciones de c oss-
linking, eniendo como secuencia inal ASSNGIRNVNNLARTPDRQA. Po úl imo, se
añadió a es a secuencia una cis eína e minal, pa a u iliza el g upo iol de la cadena la e al
en la conjugación a un g upo maleimido, a a és de la eacción iol-eno (un ipo de
adición de Michael). En la bibliog a ía se pueden encon a nume osos ejemplos de es e
ipo de conjugaciones de pép idos debido a sus múl iples en ajas como son: su g an
selec i idad, la o ogonalidad de los g upos implicados, la ausencia de o mación de
p oduc os secunda ios, la compa ibilidad con medios acuosos, la ausencia de o os
eac i os o ca alizado es me álicos. Todas es as en ajas hacen que es e ipo de
127
Lomba de o, M.; e al.; Clin. Exp. Alle gy 2004, 34, 1415-1421.
128
Laue , I.; e al.; Clin. Exp. Alle gy 2007, 37, 261-269.
129
To desillas, L.; e al.; Mol. Immunol. 2009, 46, 722-728.
130
To desillas, L.; e al.; Mol. Immunol. 2009, 47, 534-540.
Capí ulo 3
60
conjugaciones es én conside adas como eacciones de ipo click.
131
En p ime luga , se
abo dó la conjugación de la malemida 10 con es e pép ido sin é ico (P u p 3-SH) a a és
de la adición iol-eno. Debido a la insolubilidad del ligando 10 y pa a e i a la
p ecipi ación de los eac i os du an e la eacción, se ealizó una cuidadosa op imización
de los disol en es y las concen aciones que se debían u iliza , siendo una mezcla de
DMSO y ampón os a o (50 mM, pH= 7.4) como la más adecuada. (Esquema 3.7).
Esquema 3.7. Sín esis del conjugado 11 con el pép ido P u p 3-SH.
Siguiendo la me odología es ablecida pa a la conjugación de pép idos, la maleimida y el
pép ido P u p 3-SH ue on disuel os en DMSO y ampón os a o (50 mM, pH 7.4),
espec i amen e, en p opo ciones equimolecula es. Seguidamen e, se mezcla on po
medio de agi ación o bi álica du an e 25 min a empe a u a ambien e. El a ance de la
eacción ue moni o izado po RP-HPLC, con i mando la desapa ición de los p oduc os
de pa ida y o mándose exclusi amen e el conjugado 11. Po lo an o, solamen e ue
necesa io una ul a il ación a a és de una memb ana de co e molecula de 3 KDa pa a
elimina las sales p esen es en la eacción, ob eniéndose el conjugado 11 con un
endimien o excelen e (85%). Es e conjugado ue ca ac e izado sa is ac o iamen e po
medio de RP-HPLC mos ando una única señal y po espec ome ía de masas (ESI),
donde se obse ó la p esencia de dos señales co espondien es a la del conjugado con dos
y es ca gas, demos ando su pu eza y monodispe sidad. (Figu a 3.13)
131
Nolan, M.D.; Scanlan, E.M.; F on . Chem. 2020, 8, 583272.
Sín esis de conjugados alé geno-pi imido[5,4-b]indol
pa a el ecep o TLR4
61
Figu a 3.13. Ca ac e ización del conjugado 11 po medio de su c oma og ama de RP-HPLC
(a iba) y su espec o de ESI-MS (abajo).
Una ez ca ac e izado es e conjugado, se conside a on o os pép idos ale génicos con el
obje i o de desa olla acunas en e a di e en es ale gias a pa i de un in e medio
común. Como se comen ó en la In oducción de la p esen e Tesis Doc o al, el pescado se
co esponde con uno de los ocho alé genos p incipales. Los alé genos del pescado
p incipalmen e se elacionan con unas p o eínas llamadas pa albúminas, que se localizan
en los músculos de dichos pescados. Den o de es a amilia exis en dos ipos: α-
pa albúmina, encon ada en peces ca ilaginosos (cazón, aya, e c.) y β-pa albúmina,
asociada a peces óseos (bacalao, sa dina, salmón, e c.). Sin emba go, los p incipales
alé genos alimen a ios se co esponden con la β-pa albúmina, cuya inges ión po pa e
de pacien es alé gicos p o oca sín omas como dolo abdominal, ini is, angioedema,
asma y en algunos casos puede p o oca sín omas mo ales como ana ilaxia.
132
En un
es udio publicado en 2019 po el g upo de la D a. Ca e a (Ins i u o de In es igaciones
Ma inas-CSIC), analizando quince especies de pescados y usando écnicas de p o eómica,
132
Kuehn, A.; Swoboda, I.; A umugam, K.; Hilge , C.; F ançois, H.; F on . Immunol. 2014, 5,
179.
Capí ulo 3
68
Figu a 3.19. Las ba as ep esen an la mediana y el e o es ánda de la media del índice de
madu ación (A) pa a los di e en es ma cado es de supe icie en moDC (CD80, CD83, CD86 y
PD-L1) (B) y de la p oducción de ci oquinas (IL-4, IL-5, IL-10 and IFN) en los sob enadan es
de los ensayos de moDC pa a Pp3, TLR4lig, TLR4lig-Pp3 y TLR4lig+Pp3 de pacien es alé gicos
(n= 9) y con oles (n= 9) a 10 nM. La p ueba U de Mann-Whi ney se usó pa a compa aciones po
pa es en e g upos no elacionados y la p ueba de ango con signo de Wilcoxon se usó pa a
compa aciones po pa es en mues as elacionadas, mos ando di e encias signi ica i as como **,
(p <0.0125, co ección de Bon e oni. La línea de pun os ep esen a el índice de madu ación> 2.

Sín esis de conjugados alé geno-pi imido[5,4-b]indol
pa a el ecep o TLR4
69
La e aluación de los cambios eno ípicos de madu ación inducidos po TLR4lig-Pp3 en
la exp esión de ma cado es de ac i ación/ egulación (CD83 y PD-L1) y ma cado es de la
supe icie celula de madu ación (CD80 y CD86) puso de mani ies o que, en compa ación
con los con oles, u o luga un aumen o signi ica i o de CD83 en pacien es alé gicos.
(Figu a 3.19A) El análisis del e ec o p o ocado únicamen e po el compues o TLR4lig
(8) indicó que ambién e a capaz de es imula CD80 en pacien es alé gicos en
compa ación con los con oles. Es e e ec o ya ha sido epo ado en es udios p e ios en
los que se demos ó que di e en es adyu an es de TLR (sin alé genos) e an capaces de
modula la ac i idad y/o madu ación de las moDC.
136
De es e es udio, ambién se desp ende el hecho de que los cambios en la exp esión del
ma cado CD83 disc iminan mejo la espues a especí ica inducida po TLR4lig-Pp3,
hecho que no ocu e con el ligando TLR sin pép ido. Además, es o se con i mó po el
hecho de que el pép ido Pp3 incluido como con ol ambién indujo un aumen o
signi ica i o de la exp esión de CD83 en pacien es alé gicos en compa ación con los
con oles.
Po o o lado, se es udió el e ec o de la inse ción del pép ido Pp3 conjugado
co alen emen e al ligando (TLR4lig-Pp3) compa ado con el e ec o de usa es os
elemen os de o ma conjun a pe o no unidos co alen emen e (TLR4lig+Pp3). Los da os
mos a on que TLR4lig-Pp3 condujo a un aumen o signi ica i o de los ma cado es CD80,
CD83 y PD-L1 en compa ación con la es imulación p o ocada con TLR4lig+Pp3 (Figu a
3.19A). Es os esul ados demos a on que se p oduce una espues a inmunológica más
e icien e cuando an o el alé geno como el adyu an e in e ac úan conjun amen e con las
DCs. La cap ación de TLR4lig-Pp3 se co elaciona con cambios uncionales en las
moDC, po an o, una p esen ación e icaz del an ígeno equie e la ac i ación de moléculas
co-es imulado as.
137
En es e es udio, TLR4lig-Pp3 ac i a, egula y madu a la exp esión
del ma cado de supe icie de las moDC, lo que demues a que la ac i ación de TLR4 es
impo an e pa a inicia la espues a inmuni a ia.
Pa a es udia el pa ón de espues a du an e la madu ación de las moDCs después de la
incubación con TLR4lig-Pp3, se analizó la libe ación de ci oquinas en el sob enadan e
del cul i o. (Figu a 3.19B) El análisis en pacien es alé gicos, en compa ación con los
136
Kaisho, T. & Aki a, S.; Cu . Mol. Med. 2003, 3, 373-385.
137
Gue monp ez, P.; Valladeau, J.; Zi ogel, L.; The y, C; Amigo ena, S.; Ann. Re . Immunol.
2002, 20, 621-667.
Capí ulo 3
70
con oles, demos ó aumen os signi ica i os de IL-5 en los p ime os, al es imula an o
con TLR4lig-Pp3 como con TLR4lig+Pp3. Además, no se obse a on di e encias en la
inducción de la p oducción de IL-10 en pacien es alé gicos en compa ación con los
con oles pa a cualquie a de las es uc u as p obadas. Tampoco se obse a on di e encias
en la p oducción de ci oquinas después de la es imulación con TLR4lig-Pp3 y
TLR4lig+Pp3, mien as que los ni eles de IFNγ ue on simila es.
En esumen, TLR4lig-Pp3 (11) p odujo una madu ación di e encial de las moDCs
(CD83) en pacien es alé gicos con una educción de la exp esión de ci oquinas de ipo
TH2 en compa ación con el pép ido, aunque sin cambios en los ni eles de IFN e IL-10.
Es a le e espues a en la p oducción de ci oquinas (IFN e IL-10) pod ía es a asociada
con la e apa de madu ación de las moDCs, ya que los ligandos TLR pueden in lui de
di e en e mane a en la ac i ación de las moDCs, en la p esen ación de an ígenos, en la
co-es imulación y ambién en la p oducción de ci oquinas.
138
El conjugado TLR4lig-Pp3 ue cap ado po las moDCs, a ec ando a su ac i ación y
madu ación, in luyendo en los siguien es pasos de la espues a inmunológica, donde las
moDCs madu as p esen an el alé geno a los lin oci os TH. Pa a e alua es e p oceso, se
de e minó la p oli e ación de lin oci os u ilizando moDCs homólogas p e-es imuladas
con los ligandos y se analizó el pe il de la espues a en é minos de p oducción de
ci oquinas. Pa a ello, se analiza on di e en es subpoblaciones de lin oci os T (CD3+,
CD4+ y CD8+), lin oci os B (CD19+) y lin oci os NK (CD56+) que dan o ma a las
espues as inmunológicas de di e en e mane a. Es os esul ados y su análisis se de allan
a con inuación. (Figu a 3.20)
138
Re, F.; S ominge , J. L.; J. Biol. Chem. 2001, 276, 37692-37699.
Sín esis de conjugados alé geno-pi imido[5,4-b]indol
pa a el ecep o TLR4
71
Figu a 3.20. Las ba as ep esen an la mediana y el e o es ánda de la media de (A) índice de
p oli e ación (PI) de las células T (CD3+ y CD4+), (B) de la p oducción de ci oquinas en los
sob enadan es del ensayo de p oli e ación de lin oci os (IL-4, IL-5 e IFN) y (C) de los
po cen ajes de células T eg y la p oducción de IL-10; pa a Pp3, TLR4lig, TLR4lig-Pp3 y
TLR4lig+Pp3 de pacien es alé gicos (n= 9) y con oles (n= 9) a 10 nM. La p ueba U de Mann-
Whi ney se usó pa a compa aciones po pa es en e g upos no elacionados y la p ueba de ango
con signo de Wilcoxon se usó pa a compa aciones po pa es en mues as elacionadas, mos ando
di e encias signi ica i as como **, (p <0.0125, co ección de Bon e oni). La línea de pun os
ep esen a el PI> 2.
Capí ulo 3
72
Los esul ados encon ados en es os es udios indica on que TLR4lig-Pp3 pa ecía
es imula la p oli e ación de células T sin induci una di e encia signi ica i a en e los
dis in os g upos de células. (Figu a 3.20A) Es des acable que en pacien es alé gicos hubo
un aumen o signi ica i o en la p oli e ación de células T CD3+ y CD4+ después de la
es imulación con TLR4lig-Pp3 en e a TLR4lig y en e a TLR4lig+ Pp3. (Figu a 3.20A)
Es os esul ados sugie en que TLR4lig-Pp3 (11) induce una espues a p oli e a i a
especí ica pa a P u p 3 en los lin oci os T. No se encon ó di e encia en la espues a
p oli e a i a pa a o as subpoblaciones como células B y células NK con TLR4lig-Pp3
en e pacien es alé gicos y con oles, ya que la p oli e ación de esa subpoblación celula
ue nega i a (índice de p oli e ación <2).
En cuan o al pe il de ci oquinas du an e la espues a p oli e a i a, los esul ados
señalaban que TLR4lig-Pp3 (11) p oducía una disminución del ni el de IL-5, en
compa ación con el pép ido Pp3 únicamen e (Figu a 3.20B). Es os cambios, que se
obse an solo en pacien es alé gicos, indica on que es e compues o, que combina el
pép ido ale génico y el adyu an e, enía la capacidad de modula la espues a TH2 de
mane a especí ica, siendo un esul ado muy p ome edo pa a el desa ollo de acunas en
ale gia.
Po úl imo, se es udió la capacidad de las moDCs a adas con TLR4lig-Pp3 a la ho a de
induci células T eg. Se ealiza on expe imen os de co-cul i o y se analiza on los
po cen ajes de células T eg p oducidas. Los esul ados indica on po cen ajes
signi ica i amen e más al os de células T eg; sin emba go, la p oducción de IL-10 no ue
signi ica i a en ningún caso (Figu a 3.20C). Es os bajos ni eles de IL-10 no deben se
conside ados como una baja ac i ación, ya que cada TLR p oduce señalizaciones
di e en es.
139
Es os da os sugie en que las moDCs ac i adas po TLR4lig-Pp3 (11) p omo ie on la
p esen ación del alé geno y gene a on una espues a inmunológica especí ica con un
pa ón inmunológico de ipo TH1 / T eg y la sup esión de las células e ec o as TH2. Po
lo an o, es un esul ado muy p ome edo pa a el desa ollo y pos e io es es udios in i o
usando es e conjugado como acuna en e a en e medades alé gicas en el ma co de la
AIT.
139
Dei l, S.; e al.; Alle gy 2014, 69, 1602-1609.
Capí ulo 4
Sín esis de conjugados alé geno-8-
oxoadenina pa a el ecep o TLR7

Sín esis de conjugados alé geno-8-oxoadenina
pa a el ecep o TLR7
75
4. Sín esis de conjugados alé geno-8-oxoadenina
pa a el ecep o TLR7
4.1 In oducción
Den o de la amilia de los TLRs, TLR7 se clasi ica como un ecep o in acelula (jun o
a los TLR3, 8 y 9), ya que se exp esa en la supe icie de compa imen os celula es como
los endosomas. TLR7 es uno de los ecep o es mejo es udiados, poniéndose de
mani ies o su papel esencial en la ac i ación del sis ema inmune inna o. Los p incipales
es ue zos po pa e un g an núme o de g upos de in es igación se han cen ado
undamen almen e en el es udio de su papel en los p ocesos de in ección i al, como los
causados po el VIH o el i us in luenza.
140
Desde el 2002, se han ido ealizando de o ma con inuada nume osos a ances pa a
es ablece los mecanismos molecula es de los p ocesos biológicos en los que es á
in oluc ado TLR7. En el año 2002, se demos ó que algunas pequeñas moléculas
an i i ales e an capaces de ac i a TLR7;
141
sin emba go, no ue has a 2004 cuando se
iden i icó el PAMP na u al pa a TLR7, ARN monoca ena io (una sola cadena de
nucleó idos) ico en guanina y u idina.
142
Sin emba go, el econocimien o de ácidos
nucleicos no es exclusi o de es e ecep o , TLR8 ambién econoce ARN monoca ena io
y TLR9 econoce ADN con mo i os CpG no me ilados.
143
Además, odos ellos son
ecep o es in acelula es y se encuen an es echamen e elacionados, o mando una
sub amilia (TLR7-8-9). Pa a en ende la es uc u a y ac i idad de TLR7 es necesa io, po
an o, un conocimien o de TLR8 y 9 ya que, g acias a los es udios p e ios de es a
sub amilia, se ealiza on los descub imien os de los mecanismos que in oluc an a TLR7.
140
Ba che , W.; e al.; Eu . J. Immunol. 2005, 35, 236-242.
141
Hoshino, K.; Ho iuchi, T.; Tomizawa, H.; Takeda, K.; Aki a, S.; Na . Immunol. 2002, 3, 196-
200.
142
Diebold, S.S.; Kaisho, T.; Hemmi, H.; Aki a, S.; Reis e Sousa, C.; Science 2004, 303, 1529-
31.
143
Ma ínez-Campos, C.; Bu gue e-Ga cía, A.I.; Mad id-Ma ina, V.; Vi al Immunol. 2017, 30,
98-105.
Capí ulo 4
76
La p ime a es uc u a c is alina del dominio ex acelula de TLR8 ue ob enida en 2013
u ilizando un sis ema de exp esión de D osophila.
144
Pos e io men e en 2015, se
de e minó la es uc u a c is alina de TLR9.
145
TLR7 es á especialmen e elacionado con TLR8, ya que ambos ecep o es econocen
ARN monoca ena io. TLR8 econoce p oduc os deg adados, an o u idina como
oligonucleó idos co os de i ados de ARN, a a és de dos si ios de econocimien o
di e en es. Es e hecho p opo ciona un con ex o impo an e pa a comp ende la es uc u a
de TLR7.
146
Es udios p elimina es demos a on que TLR7 es capaz de econoce al
nucleósido guanosina y sus de i ados.
147
Po lo an o, esul a muy in e esan e des aca
que, aunque TLR7 y TLR8 poseen una es uc u a simila , pueden econoce di e en es
ligandos.
Una ca ac e ís ica cla e de TLR7 es el llamado bucle Z (o Z-loop en inglés), que se
localiza en la egión en e LRR14 y LRR15 de su es uc u a p o eica. Es a po ción se
conse a den o de la sub amilia TLR7-8-9 y se escinde p o eolí icamen e, p o ocando
su ac i ación. A a és de un es udio del g upo de Shimizu en 2016,
148
se puso de
mani ies o que TLR7 p esen aba una con o mación de monóme o en ausencia de
ligandos; sin emba go, la unión po medio de guanosina y mo i os de u idina p oducía la
dime ización. Así, TLR7 o maba un díme o ac i ado de o ma simila a los obse ados
pa a TLR8 y TLR9. De mane a análoga a la es uc u a de TLR8 que econoce u idina y
ARN monoca ena io en dis in os luga es, se encon ó que TLR7 in e ac úa con guanosina
y epe iciones de u idina en dos egiones di e en es siendo, po an o, un ecep o dual.
(Figu a 4.1)
144
Tanji, H.; Oh o, U.; Shiba a, T.; Miyake, K.; Shimizu, T.; Science 2013, 339, 1426-1429.
145
Oh o, U.; e al.; Na u e 2015, 520, 702-705.
146
Kazuhiko, M.; Shizuo, A.; Immuni y 2016, 45, 705-707.
147
Shiba a, T.; e al.; In . Immunol. 2016, 28, 211-222.
148
Zhang, Z.; e al.; Immuni y 2016, 45, 737-748.
Sín esis de conjugados alé geno-8-oxoadenina
pa a el ecep o TLR7
77
Figu a 4.1. Rep esen ación esquemá ica de la sub amilia TLR7-8-9 que mues a la escisión de
su egión de bucle Z (en ojo), necesa ia pa a la dime ización en su o ma ac i a. Además, se
ep esen an sus co espondien es PAMPS y sus di e en es si ios de unión. Figu a modi icada de
la e e encia 146.
A a és de es e es udio del g upo de Shimizu, llega on a la conclusión de que el segundo
si io de TLR7 se une a esiduos de u idina uncados, con al menos es bases. Es os
esul ados mos aban que TLR7 con iene dos si ios dis in os de unión a ligandos, uno pa a
ligandos pequeños y o o pa a ARN monoca ena io. De es os dos si ios, el p ime o es
undamen al pa a econoce ligandos pequeños. Es e hecho, ue con i mado a a és de
un es udio en el que se demos ó que un pequeño ligando de i ado de guanosina se unía
al p ime si io de TLR7 y que es a unión e a su icien e pa a induci la o mación de un
díme o ac i o. Po an o, la unión de ligandos al p ime si io de econocimien o pod ía
induci la dime ización de TLR7 en ausencia de un ligando pa a el segundo si io.
Cu iosamen e, la es uc u a de bucle Z en el TLR7 es di e en e a la p esen e en los o os
dos miemb os de la sub amilia. De hecho, los bucles Z de TLR7 y TLR8 es án
in oluc ados en el econocimien o de ARN monoca ena io, pe o sus o ien aciones son
muy di e en es.
149
149
Tanji, H.; e al.; Na . S uc . Mol. Biol. 2015, 22, 109-115.
Capí ulo 4
84
de unión al ecep o TLR7. Pos e io men e, es os conjugados adyu an e-alé geno se án
e aluados en ensayos in i o median e colabo aciones con di e en es g upos biomédicos.
Pa a consegui es e obje i o gene al, se de inen a con inuación una se ie de obje i os
especí icos:
- Sín esis de una es uc u a basada en un de i ado de 8-oxoadenina
con enien emen e uncionalizada pa a su conjugación.
- Conjugación de es a es uc u a con di e en es pép idos inmunogénicos sin é icos
de o ma ápida, sencilla y e icaz.
- E aluación biológica de es os conjugados pép ido-adyu an e.
4.4 Sín esis del ligando de TLR7
A endiendo a los es udios SAR desc i os en la bibliog a ía pa a es as es uc u as, se
decidió lle a a cabo la de i a ización de la 8-oxoadenina en la posición pa a del anillo
a omá ico p esen e en el N9 de la es uc u a. El g upo de Isobe había demos ado
an e io men e que es a posición e a adecuada pa a la de i a ización sin una pé dida de la
capacidad de unión al TLR7.
177
(Figu a 4.5)
Figu a 4.5. Es uc u a de un de i ado de 8-oxoadenina con la posición pa a ma cada (R), donde
es posible la de i a ización sin pé dida de su ac i idad.
El g upo malemido, necesa io pa a la conjugación del alé geno ía eacción de ipo iol-
eno, como se ha is o a lo la go de la p esen e Tesis Doc o al, se unió a la posición
indicada a a és de un espaciado de e ilenglicol. Es a elección se debe a que se ha
demos ado que es e espaciado o ece un impedimen o es é ico mínimo, de al o ma que
no in luye nega i amen e en el econocimien o del ligando po pa e de TLR7, además
de p opo ciona una mejo solubilidad en medios acuosos.
178
En el Esquema 4.1 se
177
Ku imo o, A.; e al.; J. Med. Chem. 2010, 53, 2964–2972.
178
Chan, M.; e al.; Bioconjuga e Chem. 2009, 20, 1194-1200.

Sín esis de conjugados alé geno-8-oxoadenina
pa a el ecep o TLR7
85
p esen a el esquema e osin é ico p opues o pa a la sín esis de es e nue o de i ado de 8-
oxoadenina, inco po ando un g upo maleimido.
Esquema 4.1. Ru a e osin é ica del de i ado de 8-oxoadenina obje i o 22 (en ojo).
Una ez es ablecida una u a e osin é ica, se abo dó la sín esis del compues o obje i o.
En p ime luga , se lle ó a cabo la p epa ación del espaciado de e ilenglicol
uncionalizado en sus ex emos con un g upo azido y o o amino, siguiendo las
condiciones desc i as en la bibliog a ía.
179
(Esquema 4.2)
179
Bakleh, M.E. e al.; Te ahed on 2009, 36, 7385-7392.
Capí ulo 4
86
Esquema 4.2. Sín esis del espaciado aminoazida 15.
Pa a ello, se lle ó a cabo la azidación del espaciado come cial bis[2-(2-
clo oe oxi)e il]e e en DMF a 60ºC du an e dos días, ob eniéndose la diazida 14 con buen
endimien o (87%). El siguien e paso consis ió en la educción selec i a de una de las
azidas median e una eacción de S audinge , en una mezcla de die ilé e , e ahid o u ano
y HCl 1M, usando como agen e educ o i enil os ina, ob eniéndose el espaciado
aminoazida 15 con un endimien o del 85%. El compues o ue ca ac e izado
undamen almen e po su espec o de 13C-RMN donde se obse ó la apa ición de una
señal a 41.7 ppm, ca ac e ís ica del me ileno unido a la amina o mada, así como po
espec ome ía de masas (ESI-MS), donde se pudo de ec a la señal co espondien e al
ión molecula p o onado (Figu a 4.6).
Sín esis de conjugados alé geno-8-oxoadenina
pa a el ecep o TLR7
87
Figu a 4.6. Espec o de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3, 298 K) (a iba) y ESI-MS (abajo) del
compues o 15.
La siguien e e apa consis ió en la modi icación de la es uc u a de la adenina, siguiendo
las condiciones desc i as en la bliblog a ía.177 (Esquema 4.3)
Esquema 4.3. Sín esis del de i ado de adenina 16.
Pa a ello, se hizo eacciona el compues o come cial 2-amino-6-clo opu ina con sodio
me álico y bu anol anhid o, calen ado oda la noche a 140ºC pa a gene a la sal del
bu óxido in si u y desplaza el á omo de clo o de la es uc u a. Así se ob u o el de i ado
Capí ulo 4
88
16 con buen endimien o (84%) y se con i mó su es uc u a po medio de 1H-RMN, donde
se obse ó la apa ición de las señales ca ac e ís icas del g upo bu óxido, así como su
elación de in eg ación con el es o de señales. (Figu a 4.7)
Figu a 4.7. Espec o de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) del compues o 16.
Según lo es ablecido en la u a e osin é ica, el siguien e paso consis ió en la o mación
de una amida en e el espaciado 15 y el ácido 4-b omome ilbenzoico come cial.
(Esquema 4.4)
Esquema 4.4. P epa ación del compues o 17.
En p ime luga , se hizo eacciona el ácido 4-b omome ilbenzoico con clo u o de ionilo
a e lujo du an e 3 ho as pa a o ma el co espondien e clo u o de acilo, que ue
inmedia amen e añadido a la amina 15 disuel a en diclo ome ano anhid o pa a o ma la
amida 17. El análisis po espec oscopía de 1H-RMN mos aba dos señales del me ileno
unido al halógeno, una a 4.63 y o a a 4.52 ppm, lo que indicaba la exis encia de una
mezcla de dos compues os, uno con Cl y o o con B , espec i amen e, debido a una
clo ación pa cial po el clo u o de ionilo. Es a mezcla con una elación ap oximadamen e
(60:40, B :Cl), que posee el mismo R , ambién ue iden i icada po medio de
Sín esis de conjugados alé geno-8-oxoadenina
pa a el ecep o TLR7
89
espec ome ía de masas (ESI) en el que se obse a el ión molecula de cada uno con el
pa ón iso ópico co espondien e. (Figu a 4.8)
Figu a 4.8. Espec o de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3, 298 K) (a iba) y de ESI-MS (abajo) del
compues o 17.
A la is a de es e esul ado, se in en a on o as al e na i as de amidación que e i a an es a
clo ación pa cial, como el uso de HATU como agen e de acoplamien o; sin emba go, es a
al e na i a ue in uc uosa, ya que no se o mó el p oduc o buscado. Po an o, se decidió
con inua con la sín esis, ya que la siguien e e apa, consis en e en la N-alquilación del
de i ado de adenina 16, e a posible con los dos halogenu os 17. (Esquema 4.5)
Esquema 4.5. N-alquilación pa a la o mación del compues o 18.

Capí ulo 4
90
Pa a ello, se usa on unas condiciones simila es a las desc i as pa a la N-alquilación de
o as adeninas.
180
El compues o 16 ue disuel o en DMF anhid a y a ado con K2CO3,
seguidamen e se añadió el espaciado 17 y la eacción se agi ó a .a. du an e 72 h,
ob eniéndose el de i ado 18 con buen endimien o (69%). Es e compues o ue
sa is ac o iamen e ca ac e izado po RMN, así como po espec ome ía de masas (ESI).
(Figu a 4.9)
Figu a 4.9. Espec o de ESI-MS del compues o 18.
Llegados a es e pun o, se abo dó la sín esis de la es uc u a de la 8-oxoadenina, siendo
necesa io en p ime luga la b omación de la posición C8, usando las condiciones
desc i as pa a o os de i ados simila es.
181
(Esquema 4.6)
Esquema 4.6. Sín esis del de i ado b omado 19.
Sob e el compues o 18 en clo o o mo, se adicionó b omo y la mezcla ue agi ada
p o egida de la luz. Después de la pu i icación po medio de una c oma og a ía en
columna de gel de sílice, se ob u o el de i ado b omado 19. El compues o ue
iden i icado po medio de su espec o de 1H-RMN, en el que se obse a cla amen e la
desapa ición de la señal a 7.62 ppm co espondien e al p o ón en la posición C8. En su
espec o de masas (ESI) se pudo obse a la señal co espondien e al ion molecula más
180
Siah, H.S.M.; Gunde sen, L.L.; Syn h. Commun. 2013, 43, 1469-1476.
181
Mesza oso a, K.; Holy, A.; Masojidko a, M.; Collec . Czech. Chem. Commun. 2000, 65,
1109-1125.
Sín esis de conjugados alé geno-8-oxoadenina
pa a el ecep o TLR7
91
sodio, el cual p esen a el ca ac e ís ico pe il iso ópico de compues os que con ienen
b omo. (Figu a 4.10)
Figu a 4.10 Compa ación de espec os de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3, 298 K) de los compues os
18 y 19 (a iba) y de ESI-MS (abajo) del compues o 19.
El siguien e paso pa a la o mación de la es uc u a de la 8-oxoadenina consis ió en la
hid ólisis del b omo en la posición C8. (Esquema 4.7)
Capí ulo 4
92
Esquema 4.7. Sín esis del de i ado de 8-oxoadenina 20.
Es a eacción equie e de condiciones muy ene gé icas como es el a amien o con ácido
ó mico a e lujo du an e una noche. De es a o ma se ob u o el compues o 20 con un
endimien o mode ado (47%). Es e compues o ue sa is ac o iamen e ca ac e izado po
1H-RMN, en el que se obse a la apa ición de una nue a señal a campo bajo (10.00 ppm)
co espondien e a la o mación del p o ón unido al ni ógeno de la imidazolina. En su
espec o de ESI se obse ó la señal co espondien e al ion molecula con sodio del
compues o 20. (Figu a 4.11)
Figu a 4.11. Espec o de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K) (a iba) y de ESI-MS (abajo)
del compues o 20.
Sín esis de conjugados alé geno-8-oxoadenina
pa a el ecep o TLR7
93
Una ez sin e izado el de i ado 20, ue necesa ia la in oducción del g upo maleimido
pa a la conjugación de los pép idos. Pa a ello, la maleimida 9 (Capí ulo 3) ue
de i a izada pa a pode inco po a un g upo alquino median e es e i icación con el
alcohol p opa gílico usando las condiciones desc i as en la bibliog a ía.
182
Una ez
sin e izado es e alquino-maleimida 21, ue u ilizado en la eacción click CuAAC jun o a
la azida 20. Es a eacción click u o que se op imizada debido a una se ie de
incon enien es encon ados. En p ime luga , no se pudo usa el TBTA como
es abilizan e de Cu(I), ya que enía un R idén ico al del p oduc o de la eacción, a pesa
de la g an a iedad de eluyen es y/o condiciones de p ecipi ación p obadas. Tampoco ue
posible el uso del asco ba o sódico, pa a educi in si u el Cu(II) a Cu(I), ya que como se
ha comen ado p e iamen e, es e puede eacciona con el g upo maleimido. Po lo an o,
la única al e na i a plausible consis ió en el uso de CuB como uen e de Cu(I), añadido
a lo la go de la eacción bajo condiciones anhid as. Se p oba on dis in as condiciones,
a iando el núme o de equi alen es, el iempo en e cada adición e incluso el
calen amien o median e el uso de un eac o de mic oondas; sin emba go, odos es os
es ue zos ue on in uc uosos. O a di icul ad añadida pod ía se que la azida 20 y el
alquino 21, al se insolubles en medios acuosos, enían que se disuel os en una mezcla
ace oni ilo/DMSO y, po lo an o, es o imposibili aba el uso de disoluciones ampón
lige amen e básicas, di icul ando la desp o onación del alquino, imp escindible pa a
inicia el ciclo ca alí ico de la eacción CuAAC.
Debido a que es e in e medio e a el úl imo de la sín esis del ligando obje i o, se busca on
o as posibles modi icaciones de la eacción CuAAC. Dado que es a eacción click ha
enido una g an aplicabilidad, en la bibliog a ía se ecoge una amplia a iedad de
condiciones de eacción. Po ejemplo, el g upo de Fokin ue el p ime o en inmo iliza el
TBTA sob e una esina de Ten aGel,
183
(Figu a 4.12) demos ando que e a capaz de
quela el Cu(I) y po lo an o, de es abiliza lo en e a la oxidación de una o ma más
e icien e que el TBTA monomé ico en disolución. Es o es debido a la g an concen ación
local de TBTA sob e la supe icie de la esina, que eje ce un impo an e e ec o es é ico
sob e el Cu(I), p o egiéndolo más e icien emen e con a la oxidación.
182
Rod iguez, M. J. e al.; Mol. Nu . Food Res. 2017, 10, 1700110.
183
Chan, T.R.; Fokin, V.V.; QSAR Comb. Sci. 2007, 26, 1274-1279.
Capí ulo 4
100
Figu a 4.16. C oma og ama de RP-HPLC (a iba) y espec o de ESI-MS (abajo) del conjugado
24.
También se lle ó a cabo la conjugación de es a maleimida 22 con o o pép ido, el Ole109-
130-SH, que como se ha comen ado p e iamen e co esponde a la p o eína Ole e 1, el
alé geno más p edominan e en pacien es alé gicos al polen del oli o. (Esquema 4.11)

Sín esis de conjugados alé geno-8-oxoadenina
pa a el ecep o TLR7
101
Esquema 4.11. Sín esis del conjugado 25 con el pép ido Ole109-130-SH.
En es e caso, al ealiza se la conjugación y moni o iza se po RP-HPLC, se obse ó la
o mación mayo i a ia de dos señales con in ensidades simila es. Siguiendo el mismo
p o ocolo es ablecido, se ealizó una ul a il ación a a és de una memb ana de co e
molecula de 3 KDa, man eniéndose es as dos señales. So p enden emen e, el análisis po
espec ome ía de masas e eló que ambas señales co espondían a compues os con la
misma masa co espondien e al conjugado 25, no obse ándose señales de los p oduc os
de pa ida u o as impu ezas. (Figu a 4.17)
Capí ulo 4
102
Figu a 4.17. C oma og ama de RP-HPLC con la apa ición de dos señales (a iba) y espec o de
ESI-MS (abajo) del conjugado 25.
Es os esul ados ponen de mani ies o la o mación de dos conjugados con el mismo peso
molecula du an e el ascu so de la eacción, así como idén icos espec os de abso ción
pa a ambas señales, lo que sugie e la o mación de es e eoisóme os. Como se comen ó
p e iamen e, la eacción iol-eno pa a la conjugación de ioles a maleimidas iene luga
median e una adición de ipo Michael, en la que se p oduce un a aque nucleó ilo de un
iola o al doble enlace de la maleimida. Es a adición no es enan ioselec i a ya que no hay
ningún ipo de inducción asimé ica (como un ca alizado qui al). Es deci , el iola o se
adiciona de o ma inespecí ica po ambas ca as del doble enlace de la maleimida.
Conc e amen e, debido a la es uc u a de la malemida, en el ca bono en el que se p oduce
la adición, se gene a un cen o qui al. Los p o ones adyacen es a es e pun o son
dias e eo ópicos. De es a o ma se gene a ían dos enan ióme os en la misma p opo ción,
lo que es conocido como mezcla acémica o acema o, (Figu a 4.18) que esul a
óp icamen e inac i o.
184
184
Jacques, J.; Colle , A.; Wilen, S.H.; Enan iome s, acema es, and esolu ions. 1981, New Yo k:
Wiley.
Sín esis de conjugados alé geno-8-oxoadenina
pa a el ecep o TLR7
103
Figu a 4.18 Rep esen ación del a aque nucleó ilo de un iola o al doble enlace de la maleimida,
en la que se gene an los dos enan ióme os equimolecula men e ( acema o).
Sin emba go, en el caso de que el iol sea qui al, como es el caso de un pép ido con una
cis eína e minal, no se o ma ía un acema o, sino una mezcla de epíme os que son
dias e eoisóme os.
Los dias e eoisóme os, a p io i,
185
pueden se sepa ados po c oma og a ía. De hecho, en
un abajo ecien e del g upo de Geye , se es udió la adición iol-eno en e maleimidas y
pép idos en el que demues a la o mación de es os epíme os. En es e es udio, ambién
p oponen p ocesos mediados po equilib ios de epime ización, así como la sepa ación de
es os epíme os po RP-HPLC.
186
(Figu a 4.20)
Figu a 4.20. C oma og ama de RP-HPLC, en el que se obse a la sepa ación de los dos epíme os
(DS1 y DS2). Figu a ex aída de la e e encia 186.
185
Clayden, J.; G ee es, N.; Wa en, S.; O ganic Chemis y, 2 h Edi ion, 2012, Ox o d Uni e si y
P ess, 1112.
186
Lenz, S.; Ho x, P.; Geye , A.; J. Pep. Sci. 2018, 24, e3075.
Capí ulo 4
104
A la is a de es os an eceden es y con los da os que disponíamos pa ecía cla o que las dos
señales obse adas en el c oma og ama de la Figu a 4.17 se co espondían con los dos
epíme os del conjugado 25. Cabe des aca que es e conjugado ue el único con el que se
consiguió isualiza la sepa ación de sus epíme os de oda la p esen e Tesis Doc o al.
Es e hecho se puede a ibui a la secuencia pa icula del pép ido, que puede o igina
in e acciones con el elleno de la columna c oma og á ica, a o eciendo es a sepa ación.
Los epíme os de pép idos que solamen e di ie en en la disposición espacial de uno de sus
cen os qui ales, no a ían signi ica i amen e las p opiedades ísico-químicas del
conjugado, aumen ando así la di icul ad de la sepa ación c oma og á ica.
187
Es os
incon enien es implican que la esolución de epíme os de pép idos cons i uye odo un
desa ío en el que ac ualmen e se sigue ealizando una in ensa in es igación.
188
,
189
En es e es udio de conjugación del ligando de i ado de la 8-oxoadenina 22 a es pép idos
di e en es, se ha demos ado la e sa ilidad de es a es a egia sin é ica y el po encial que
iene pa a el desa ollo de nue as e apias basadas en AIT en e a di e en es ale gias en
unción del ipo de pép ido elegido.
4.6 E aluación biológica de los conjugados pép ido-8-
oxoadenina
Una ez sin e izados y ca ac e izados los conjugados de los di e en es pép idos
ale génicos, se p ocedió a su e aluación biológica pa a de e mina su capacidad de media
en el as o no de en e medades alé gicas a a és de la modulación del sis ema inmune.
Es as e aluaciones biológicas se ealiza on median e colabo aciones con dis in os g upos
de in es igación. Es os ensayos se ealiza on siguiendo el mismo p ocedimien o que pa a
los conjugados de TLR4 (Capí ulo 3).
La e aluación biológica de los conjugados del alé geno del pescado (24) y del oli o (25)
se es á lle ando a cabo ac ualmen e. Los es udios que es án más a anzados se
co esponden con el conjugado del pép ido del alé geno de meloco ón (P u p 3) 23, que
187
Zhang, B.; Soukup, R.; A ms ong, D.W.; J. Ch oma og . A 2004, 1053, 89-99.
188
Li, G.; DeLaney, K.; Li, K.; Na . Commun. 2019, 10, 5038.
189
Du, S.; Readel, E.R.; Wey, M.; A ms ong, D.W.; Chem. Commun. 2020, 56, 1537-1540.
Sín esis de conjugados alé geno-8-oxoadenina
pa a el ecep o TLR7
105
se han ealizado en el g upo de ale gología de la D a. C is obalina Mayo ga del Hospi al
Regional Uni e si a io de Málaga.
En p ime luga , se lle a on a cabo expe imen os de in e nalización del conjugado 23 en
moDCs. Pa a ello, el conjugado 23 ue ma cado luo escen emen e en la egión del
pép ido po medio del eac i o come cial Alexa luo 647. Con el compues o ma cado, se
analizó la in e acción e in e nalización con las moDCs usando ci ome ía de lujo y
mic oscopía con ocal. Los esul ados de los es udios de ci ome ía de lujo indica on que
el conjugado 23 ue in e nalizado po las moDCs de una mane a dependien e del iempo
(Figu a 4.21)
Figu a 4.21. A) G á icos de ci ome ía de lujo a di e en es iempos que mues an los po cen ajes
del conjugado 23 cap ado po las moDC CD86+. B) Imágenes con ocales de las moDCs incubadas
con el conjugado 23 (10 nM) a di e en es iempos (de 1h a 24h). Los da os son consis en es con
el análisis de ci ome ía de lujo, que mues a el conjugado 23 ma cado (en osa) p ác icamen e
sin in e nalización en la p ime a ho a de la incubación, aumen ando en las ho as siguien es.
En es os es udios se obse a que no hay in e nalización e ec i a has a las 9 h, es o se
puede explica debido a que como se ha comen ado p e iamen e, TLR7 es un ecep o
in acelula , po lo an o, la in e nalización no es dependien e del ecep o , como ocu ía
en el caso del TLR4, y iene luga median e o os mecanismos como la endoci osis, siendo
un p oceso más len o.
La cap ación del conjugado con inuó aumen ando has a las 48 ho as. Median e
mic oscopía con ocal y la inción de di e en es es uc u as in acelula es se pudo

Capí ulo 4
106
isualiza el p oceso de in e nalización del compues o 23 y su co-localización con dichas
es uc u as. (Figu a 4.22)
Figu a 4.22. Imagen con ocal a las 48 h que mues a di e sas egiones celula es y el conjugado
23 in e nalizado ( osa). La ac ina de la submemb ana se iñó con A o 488- aloidina ( e de) y los
núcleos con Hoechs (azul).
Es os es udios demues an que el conjugado 23 es in e nalizado po pa e de las moDCs
y se localiza en la zona pe inuclea , ce ca del apa a o de Golgi, ya que hay un al o á ico
de o mación de esículas, en e ellas los endosomas que es donde se exp esa el TLR7.
A con inuación, se analizó el e ec o de es e conjugado en el p oceso de madu ación de
las DCs, a a és de ma cado es como son moléculas co-es imulado as y ci oquinas.
En es os ensayos se e alua on el pép ido ale génico (Pp3); la es uc u a de la 8-
oxoadenina 20 (TLR7lig); el conjugado 23 (TLR7lig-Pp3); y la combinación del ligando
20 y el pép ido Pp3 sin es a unidos co alen emen e (TLR7lig+Pp3). Es a nomencla u a
se u iliza á de aho a en adelan e pa a una mayo sencillez. (Figu a 4.23)
Sín esis de conjugados alé geno-8-oxoadenina
pa a el ecep o TLR7
107
Figu a 4.23. Las ba as ep esen an la mediana y el e o es ánda de la media del índice de
madu ación (A) pa a los di e en es ma cado es de supe icie en las moDCs (CD80 y CD86) y
ma cado es de exp esión de ac i ación/ egulación (CD83 y PD-L1, espec i amen e); (B)
de la p oducción de ci oquinas (IL-4, IL-5, IL-10 e IFN), en los sob enadan es de los ensayos
de las moDCs pa a Pp3, TLR7lig, TLR7lig-Pp3 y TLR7lig+Pp3 de pacien es alé gicos (n = 9) y
con oles (n = 9) a 10 nM. La p ueba U de Mann-Whi ney se usó pa a compa aciones po pa es
en e g upos no elacionados y la p ueba de ango con signo de Wilcoxon se usó pa a
compa aciones po pa es en mues as elacionadas, mos ando di e encias signi ica i as como **,
(p <0.0125, co ección de Bon e oni. La línea de pun os ep esen a el índice de madu ación > 2.
Pa a con i ma la madu ación de las moDCs se analiza on los ma cado es de supe icie
(CD80 y CD86). TLR7lig-Pp3 induce ni eles signi ica i os de es os ma cado es en
Capí ulo 4
108
pacien es alé gicos compa ados con los con oles. También se ealizó es a compa ación
pa a los ma cado es de exp esión de ac i ación/ egulación (CD83 y PD-L1,
espec i amen e), en el que se e leja un aumen o signi ica i o de ambos po pa e de
TLR7lig-Pp3. De es e análisis ambién se concluye que la es uc u a de la 8-oxoadenina
es capaz de induci la madu ación de las moDCs, ya que el compues o TLR7lig (20)
es imula la sec eción de CD86 únicamen e en pacien es alé gicos. (Figu a 4.23A) Es e
hecho, ecogido en la bibliog a ía an e io men e, demues a que es posible la ac i ación
de DCs p o enien es de indi iduos alé gicos po medio de ligandos sin é icos de TLR sin
lle a alé genos conjugados.
190
Adicionalmen e, ambién se demues a que el pép ido P u p 3 conjugado es imula la
exp esión del ma cado CD83 en pacien es alé gicos, según lo obse ado pa a TLR7lig-
Pp3, cosa que no ocu e con el ligando TLR sin pép ido. Además, es o se con i mó po
el hecho de que el pép ido Pp3, incluido como con ol, ambién indujo un aumen o
signi ica i o de la exp esión de CD83 en pacien es alé gicos en compa ación con los
con oles.
Po o o lado, se es udió el e ec o de la unión en e el ligando y el pép ido an o unidos
de o ma co alen e (TLR7lig-Pp3) como adminis ados de o ma conjun a pe o no unidos
co alen emen e (TLR7lig+Pp3). Los da os mos a on que TLR7lig-Pp3 condujo a un
aumen o signi ica i o de los ma cado es CD83, CD86 y PD-L1 en compa ación con la
es imulación p o ocada con TLR7lig+Pp3 (Figu a 4.23A). Es os esul ados indican que
la unión co alen e en e el ligando y el pép ido es esencial pa a induci una espues a
signi ica i a. (Figu a 4.24)
190
Go , P. H; e al.; J. Vi ol. 2015, 89, 3221-3235.
Sín esis de conjugados alé geno-8-oxoadenina
pa a el ecep o TLR7
109
Figu a 4.24. Rep esen ación de los e ec os que inducen en las moDCs el ligando de 8-oxoadenina
y el pép ido P u p 3 (unidos co alen emen e o combinados) en la exp esión de ma cado es
celula es.
Po lo an o, es e conjugado 23 ac i a, egula y madu a la exp esión de los ma cado es de
supe icie de las moDCs, siendo es as células esenciales pa a inicia la espues a inmune,
lo que demues a la impo ancia de la ac i ación de TLR7 en es e p oceso.
Pa a es udia el pa ón de espues a du an e la madu ación de las moDCs después de la
incubación con TLR7lig-Pp3, se midió la libe ación de ci oquinas en el sob enadan e del
cul i o. (Figu a 4.23B) En el análisis de las células p oceden e de pacien es alé gicos, en
compa ación con los con oles, se obse ó aumen os signi ica i os de IL-5 e IFN pa a
odas las es uc u as que inco po aban la 8-oxoadenina (TLR7lig, TLR7lig-Pp3 and
TLR7lig+Pp3). Además, no se obse a on di e encias en la inducción de la p oducción
de IL-10 en pacien es alé gicos en compa ación con los con oles pa a cualquie a de las
es uc u as p obadas. Tampoco se obse a on di e encias en la p oducción de ci oquinas
después de la es imulación con TLR7lig-Pp3 y TLR7lig+Pp3.
Cu iosamen e, se obse ó que la es uc u a TLR7lig-Pp3 (23) indujo ni eles
signi ica i amen e más bajos de IL-4 e IL-5, y ni eles más al os de IFNγ en compa ación
con Pp3, solo en pacien es alé gicos, lo que indica la capacidad inmunomodulado a
especí ica de es e compues o. Es os esul ados son consis en es con la biblog a ía, ya que
se ha elacionado la ac i ación de TLR7 po pa e de ligandos con un aumen o de los
ni eles de IFN.
191
Po lo an o, es os da os indican que la es imulación con TLR7lig-Pp3
191
Chan, M.; e al.; Bioconjuga e Chem. 2009, 20, 1194-1200.

Combinaciones de ligandos de TLR4 y TLR7 conjugados con alé genos
y es udio de su ac i idad biológica
117
5. Combinaciones de ligandos de TLR4 y TLR7
conjugados con alé genos y es udio de su ac i idad
biológica
5.1 In oducción
En las úl imas dos décadas se ha desa ollado una g an ac i idad en o no a los TLRs.
Du an e es os años, las in es igaciones han ido abo dando di e en es aspec os:
descub imien o de nue os TLRs y sus ligandos, de e minación de sus es uc u as
molecula es, mecanismos de ac i ación, cascadas de señalización, e c.
195
A medida que
se conocía más in o mación ace ca de es os ecep o es, se gene aban nue as cues iones,
po ejemplo, qué ocu e cuando se ac i aban dis in os ecep o es simul áneamen e.
Debido a la g an simili ud es uc u al que ienen algunos TLRs, po ejemplo, TLR7 y
TLR8 (Capí ulo 4), es os ecep o es pueden compa i el mismo ligando, como es el caso
del Resiquimod, un ligando an o pa a TLR7 como TLR8. De es a o ma, el mismo
ligando puede ac i a de o ma independien e dos ecep o es dis in os, lo que apun a a
una posible edundancia en la ac i idad de es os dos ecep o es.
196
En un es udio de 2008, se e aluó la exposición simul ánea y secuencial de di e en es
ligandos de TLRs, an o in i o como in i o (en a ones). Ese es udio p elimina cons a ó
que, a pesa de las di e en es ías de ac i ación de es a amilia de ecep o es, se obse aba
inc emen os en la exp esión de ci oquinas, dando luga a un e ec o siné gico, es deci , la
coope ación en e di e en es ipos de TLRs, po enciando sus e ec os. Po o o lado, en la
bibliog a ía hay desc i os nume osos ejemplos en los que se obse a el e ec o con a io,
la ac i ación de a ios TLRs que conlle a la sec eción de ci oquinas que se con a es an
unas con o as, dando luga a una inhibición en su ac i idad.
197
Sin emba go, es impo an e ema ca que odo el sis ema de de ensa basado en los TLRs
es á di igido cla amen e a la lucha con a pa ógenos. La es imulación siné gica de TLRs
es p obablemen e lo que sucede ealmen e, ya que los pa ógenos pueden con ene di e sos
PAMPs que in e accionan con los co espondien es TLRs que se encuen an en di e en es
195
Jiménez-Dalma oni, M.J.; Ge swhin, M.E.; Adamopoulos, I.E.; Au oimmun. Re . 2016, 15, 1-
8.
196
Heil, F.; e al.; Science 2004, 303, 1526-1529.
197
Theine , G.; e al.; Mol. Immunol. 2008, 45, 244-252.
Capí ulo 5
118
localizaciones celula es. Po ejemplo, se ha desc i o que componen es del i us he pes
simplex son econocidos po TLR2 y 9, es imulando espues as siné gicas en la lucha
con a es e i us.
198
Es os componen es i ales co esponden a glicop o eínas
199
de su
en ol u a i al que son PAMP de TLR2 y su ADN que es un PAMP de TLR9.
Figu a 5.1 Rep esen ación del i us he pes simplex que con iene PAMPS econocidos po TLR2
y 9.
Po o o lado, se ha es udiado el e ec o de agonis as del ecep o TLR2 con o os PAMPs,
po ejemplo, con el ARN bica ena io (un in e medio en la eplicación i al) como PAMP
de TLR3. En un abajo del g upo de Hi sch, se es udió el e ec o de los agonis as de es os
ecep o es en una línea celula de mac ó agos de a ón. Se obse ó que, en compa ación
con la es imulación de los agonis as po sepa ado, la es imulación de mac ó agos con
ambos ligandos (ya sea de o ma simul ánea o secuencial) dio luga a la exp esión
siné gica de mediado es in lama o ios.
200
En la línea de es as in es igaciones, se puso de mani ies o que, en unción de las
concen aciones de los agonis as indi iduales, es os ienen di e en es umb ales de
inducción. Es e descub imien o iene un cla o sen ido biológico ya que la p esen ación de
198
Sø ensen, L.N.; Reine , L.S.; Malmgaa d, L.; Ba holdy, L.; Thomsen, A.R.; Paludan, S.R.;
J. Immunol. 2008, 181, 8604-8612.
199
Leoni, V.; Gianni, T.; Sal ioli, S.; Campadelli-Fiume, G.; J. Vi ol. 2012, 86, 6555-6562.
200
Ilie ski, V.; Hi sch, E.; Biol. Rep od. 2010, 83, 767-773.
Combinaciones de ligandos de TLR4 y TLR7 conjugados con alé genos
y es udio de su ac i idad biológica
119
an ígenos p omue e adicionalmen e la gene ación de células e ec o as po encialmen e
dañinas y, po lo an o, es e mecanismo debe se man enido bajo un es ic o con ol. Po
ello, la es imulación siné gica de TLRs puede ep esen a un “código de segu idad”
combina o io (dos p oduc os mic obianos p esen es en di e en es compa imen os
celula es) que asegu a que una po en e espues a del sis ema inmune solo se gene a á
en e a una pelig osa in asión de un pa ógeno.
201
Como se ha comen ado en capí ulos an e io es, debido al a dío descub imien o de los
TLRs, muchos á macos u ilizados en e a una amplia gama de en e medades esul a on
ene in e acción con dichos ecep o es sin conoce lo p e iamen e. Algo pa ecido ocu ió
con el e ec o siné gico en e los TLRs. Po ejemplo, la acuna de la ieb e ama illa (YF-
17D) es conside ada una de las acunas más e icaces de la his o ia, siendo ampliamen e
usada desde hace más de 65 años con una asa de p o ección mayo del 98%. En muchos
pacien es se han encon ado an icue pos neu alizan es has a 35 años después de habe
ecibido una sola dosis de la acuna.
202
Es a p o ección no se gene a únicamen e median e
an icue pos, ambién se ha demos ado que es a acuna es un po en e induc o de células
T ci o óxicas.
203
Es a acuna es á basada en una cepa del p opio i us a enuado;
204
sin
emba go, a pesa de la e icacia de es a acuna pa a con ola la ieb e ama illa, los
mecanismos molecula es y celula es in oluc ados en es a inmunización no es aban del
odo cla os. En un in e esan e es udio del g upo de Pulend an, publicado en 2006, se
demues a que es a acuna YF-17D es imula a las DCs a a és de la ac i ación de 4
ecep o es, TLR2, 7, 8 y 9, p o ocando la sec eción de las ci oquinas p o-in lama o ias,
IL-12p40, IL-6 e IFN-α.
205
Las espues as inmuni a ias adap a i as esul an es se
ca ac e iza on po una mezcla del pe il de ci oquinas de células colabo ado as TH1 y
TH2, así como de células T CD8+ especí icas de an ígeno. El es udio se lle ó a cabo con
a ones con di e sas modi icaciones, en e ellas, un g upo que no p esen aba la p o eína
acceso ia MyD88, asociada a la ac i ación de odos los TLRs excep o TLR3.
206
También
se u ilizó un g upo de a ones que no exp esaban el ecep o TLR2. De es a o ma y con
201
Napoli ani, G.; Rinaldi, A.; Be oni, F.; Sallus o, F.; Lanza ecchia, A.; Na . Immunol. 2005,
6, 769–776.
202
Poland, J.D., C.H. Calishe , T.P. Mona h, W.G. Downs, and K. Mu phy; Bull. Wo ld Heal h
O gan. 1981, 59, 895-900.
203
Co, M.D.; Te ajima, M.; C uz, J.; Ennis, F.A.; Ro hman, A.L.; Vi ology 2002, 293, 151-163.
204
No by, E.; J. Exp. Med. 2007, 204, 2779-2784.
205
Que ec, T.; e al.; J. Exp. Med. 2006, 203, 413-424.
206
Yamamo o, M.; e al.; Science 2003, 301, 640-643.
Capí ulo 5
120
el conocimien o del pe il de ci oquinas gene ado po la ac i ación de un TLR en
conc e o, se consiguió ealiza la iden i icación de los TLRs implicados. Además,
dis in os TLRs pa ecen con ola di e encialmen e el equilib io TH1/TH2. Mien as
a ones de icien es de la p o eína MyD88 mues an un p o undo de e io o de las
ci oquinas asociadas a TH1, los a ones de icien es de TLR2 mues an espues as TH1 muy
mejo adas. Es os es udios demues an el po encial de las es a egias de acunación que
u ilizan combinaciones de di e en es ligandos TLR pa a es imula espues as inmunes
poli alen es.
5.2. Combinación co alen e de agonis as de TLR
El e ec o siné gico en el ámbi o de los ecep o es TLR aún sigue siendo un campo po
explo a , en el que es necesa io una p o unda in es igación. Muchas combinaciones de
agonis as de TLR in luyen en la señalización inmuni a ia con una dependencia an o del
o den como del iempo en el que se p oduce la adición.
207
,
208
La comp ensión de cómo la disposición espacial de los agonis as p esen es en una única
es uc u a a ec a la ac i ación de los TLRs y al sis ema inmunológico en gene al, es muy
limi ada, siendo un ac o c í ico en la bioconjugación.
209
Es o es debido a que la
búsqueda de sine gias en e dis in os agonis as se ha limi ado a la combinación de mezclas
de agonis as de TLR en disolución. En la bibliog a ía se encuen an algunos ejemplos
in e esan es. Se ha desc i o el encapsulamien o del Imiquimod (ligando de TLR7) y el
GLA (ligando de TLR4) en un liposoma. Es a encapsulación dio luga a una po en e
espues a de ipo TH1, a a és de la sec eción de IL12p70 e IFNγ en células humanas.
Es os ma cado es aumen aban su exp esión cuando e an ac i ados con el liposoma
con eniendo ambos ligandos, en compa ación a cuando se p obaban los ligandos po
sepa ado, demos ándose un cla o e ec o siné gico.
210
Como se ha comen ado p e iamen e, la p esen ación más idónea se ía una única molécula
que con enga co alen emen e unidos los agonis as de TLR. De es a o ma, la sepa ación
207
Honda, K.; e al.; Na u e 2005, 434, 1035-1040.
208
Ghosh, T. K.; Mickelson, D. J.; Solbe g, J. C.; Lipson, K. E.; Ingle ield, J. R.; Alkan, S. S. In .
Immunopha macol. 2007, 7, 1111-1121.
209
Liu, H.; I ine, D. J.; Bioconjuga e Chem. 2015, 26, 791-801.
210
Go , P. H.; e al.; J. Vi ol. 2015, 89, 3221-3235.
Combinaciones de ligandos de TLR4 y TLR7 conjugados con alé genos
y es udio de su ac i idad biológica
121
espacial en e ambos ligandos siemp e se ía cons an e y se consigui ía un mejo con ol
y ep oducibilidad de los e ec os siné gicos. Si los es udios sob e los e ec os siné gicos
en la ac i ación de TLRs son escasos, los ejemplos sob e es uc u as que engan dichos
ligandos de TLR combinados po medio de enlaces co alen es, son aún más limi ados,
siendo undamen almen e aquellos desa ollados po el g upo de Esse -Kahn.
En 2014, es e g upo sin e izó una es uc u a que combinaba co alen emen e un agmen o
de ADN con mo i os CpG no me ilados (PAMP de TLR9) y un ácido lipo eicoico, que
es uno de los p incipales componen es de la pa ed celula de bac e ias g am-posi i as
(PAMP de TLR2), u ilizándose un espaciado bi uncional de PEG.
211
(Figu a 5.2)
Figu a 5.2. Rep esen ación de la es uc u a que combina de o ma co alen e un ligando de TLR9
y o o de TLR2, a a és de un espaciado de ipo PEG.
Es e compues o ue capaz de induci una p oducción de ci oquinas implicadas en una
espues a de ipo TH1 signi ica i amen e mayo que la simple combinación de los dos
ligandos sin unión co alen e. Como conclusión, los au o es plan ean la hipó esis de que
una p esen ación espacial de inida de los agonis as al e a d ás icamen e la es imulación
de las células dend í icas.
En 2021 se publicó una con inuación de es e abajo, ampliando el es udio a más
combinaciones de pa ejas de ligandos TLR, usando la misma es a egia de unión a a és
de un espaciado de ipo PEG. Con es os díme os, se ealiza on una se ie de ensayos in
i o, compa ando el ma cado NF-κB, así como la exp esión del pe il de ci oquinas y
TNF-α. Es os es udios demos a on la exis encia de múl iples ac o es que a ec an en la
211
Mancini, R. J.; Tom, J. K.; Esse -Kahn, A. P; Angew. Chem. In . Ed. 2014, 53, 189-192.

Capí ulo 5
122
ac i idad de es os sis emas duales, como la ciné ica de ac i ación inicial, la especi icidad
del ligando, así como la dosis del agonis a. Adicionalmen e, ambién se ealiza on
es udios sob e el mecanismo de ac i ación de los he e odíme os, sugi iendo que las
in e acciones ligando- ecep o in luyen en la ciné ica ansc ipcional inicial y, po lo
an o, en la sec eción de ci oquinas. La espues a inmune depende de múl iples ac o es,
como in e acciones a ibuidas a los ligandos que o man los díme os, la po encia del pa
agonis a, o la ía de señalización que se ac i a.
212
En 2019 se publicó un sis ema en el que se combinó simul áneamen e de o ma co alen e
es agonis as pa a los ecep o es TLR4, 7 y 9. Como núcleo de unión se escogió un
de i ado de 1,3,5- iazina.
213
(Figu a 5.3)
Figu a 5.3. Rep esen ación del compues o i uncional con eniendo ligandos pa a los ecep o es
TLR4, 7 y 9 en una única es uc u a.
Es a es uc u a con es ligandos, en compa ación con sus homólogos díme icos,
p opo ciona una espues a especí ica y más equilib ada en los ensayos in i o, cambiando
la pola ización de la espues a ipo TH1 a una más equilib ada TH1/TH2. Es e compues o
aumen ó la ac i ación del ac o de ansc ipción NF-κB y dio luga a una p oducción
mejo ada de ci oquinas, en con as e con las células a adas con una mezcla no conjugada
de los mismos es agonis as. El uso de inhibido es de la señalización de TLR y es udios
in i o con a ones knock-ou con i ma on que es a molécula i-agonis a e a capaz de
ac i a múl iples ías de señalización que conducen a la mayo ac i idad. Pa a con i ma
212
Kimani, F.W.; e al.; ACS Chem. Biol. 2021, 16, 380-388.
213
Albin, T.J.; e al.; ACS Cen . Sci. 2019, 5, 1137-1145.
Combinaciones de ligandos de TLR4 y TLR7 conjugados con alé genos
y es udio de su ac i idad biológica
123
que se ac i aban ealmen e los TLR co espondien es a los ligandos seleccionados, se
ealiza on es udios mecanicis as con a ones knock-ou de la p o eína adap ado a y los
co espondien es inhibido es y agonis as de TLRs, pa a mos a los ecep o es especí icos
y las ías a a és de las cuales ac uaba el compues o i uncionalizado. Adicionalmen e,
es os au o es ealiza on es udios de inmunización en un modelo de a ón. Los a ones
a ados con los agonis as unidos co alen emen e mos a on un aumen o en la p oducción
de an icue pos, en compa ación con el a amien o con es os mismos agonis as po
sepa ado. Es os es udios demues an cómo la ac i ación de múl iples TLRs a a és de
una es uc u a con una o ganización espacial bien de inida ayuda a guia las espues as
inmunes, p opo cionando la base pa a el diseño y desa ollo de acunas más e icaces.
5.2.1 1,3,5-T iazinas como pla a o mas
La necesidad de una disposición espacial bien de inida de los agonis as de TLR en una
es uc u a única ha demos ado se un aspec o esencial pa a ob ene una ac i idad
siné gica en es os compues os. Pa a ello, esul a undamen al el es udio de pla a o mas
que pe mi an la inco po ación selec i a y sencilla de es os ligandos de o ma con olada.
Como se ha demos ado en el abajo comen ado an e io men e, las iazinas cons i uyen
una al e na i a muy a ac i a pa a la conjugación de di e sas es uc u as. Di e en es
de i ados de iazinas han sido usados ampliamen e como he bicidas,
214
aunque ambién
han demos ado ac i idad a macológica como agen es an imic obianos,
215
an icance osos
216
o an i í icos con a el VIH.
217
La es uc u a de la iazina es la de un anillo he e ocíclico, análogo al anillo de benceno,
pe o con es á omos de ca bono eemplazados po á omos de ni ógeno. Los es
isóme os de la iazina se dis inguen en e sí po la posición de sus á omos de ni ógeno,
1,2,3- iazina, 1,2,4- iazina y 1,3,5- iazina. (Figu a 5.4)
214
Ralebi so, T.K.; Senio , E.; an Ve se eld, H.W.; Biodeg ada ion 2002, 13, 11-19.
215
Saleh, M.; Abbo , S.; Pe on, V.; Lauzon, C.; Penney, C.; Zacha ie, B.; Bioo g. Med. Chem.
Le . 2010, 20, 945-949.
216
Zheng, M.; e al.; Bioo g. Med. Chem. 2007, 15, 1815-1827
217
Xiong, Y.Z.; Chen, F.E.; Balza ini, J.; De Cle cq, E.; Pannecouque, C. Eu . J. Med. Chem.
2008, 43, 1230-1236.
Capí ulo 5
124
Figu a 5.4 Isóme os de la iazina.
Es e capí ulo se cen a á en la 1,3,5- iazina, que p esen a á omos de ca bono y de
ni ógeno al e nados en el anillo, siendo es e isóme o el más in e esan e desde el pun o
de is a de la conjugación.
El mé odo más común pa a ob ene de i ados de 1,3,5- iazina es a pa i de la 2,4,6-
iclo o-1,3,5- iazina, ambién conocido como clo u o cianú ico, un p oduc o de pa ida
de bajo cos e.
218
Es a iazina puede se ácilmen e uncionalizada de o ma secuencial
median e el con ol de la empe a u a de eacción. El p ime a aque nucleó ilo ocu e a
0ºC, mien as que el segundo equie e de empe a u a ambien e y el e ce o necesi a de
calen amien o.
219
(Esquema 5.1)
Esquema 5.1. Rep esen ación del o den de adición nucleó ila a pa i del clo u o cianú ico con
dependencia de la empe a u a en la o mación de iazinas isus i uidas.
Es e con ol an ma cado en la eac i idad se debe a que es a dec ece con cada sus i ución
nucleó ila, ya que se p oduce una ganancia de densidad elec ónica en el o bi al π, lo que
educe la e ec i idad de las eacciones de sus i ución nucleó ila. Es deci , con cada nue a
sus i ución, el anillo de iazina es á cada ez más desac i ado y es necesa io un
inc emen o de la empe a u a. Es o es debido a que las iazinas son uncionalizadas po
218
Ha al, K. P.; Synle . 2006, 13, 2156-2157.
219
Sha ma, A.; Sheyi, R..; de la To e, B.G.; El-Faham, A.; Albe icio, F.; Molecules 2021, 26,
864.
Combinaciones de ligandos de TLR4 y TLR7 conjugados con alé genos
y es udio de su ac i idad biológica
125
medio de eacciones de sus i ución nucleó ila a omá ica (SNA ).
220
Es e ipo de eacciones
no ocu en en sus homólogos de benceno, debido a las di e en es zonas de densidad
elec ónica p esen es en e es as dos es uc u as.
221
Los anillos de benceno poseen una
al a densidad elec ónica dis ibuida homogéneamen e en odos sus ca bonos, sin
emba go, debido a la es uc u a del clo u o cianú ico, los á omos de clo o e i an densidad
de ca ga del anillo de iazina. Adicionalmen e los á omos de ni ógeno a aen densidad
elec ónica. Es os e ec os elec ónicos pe mi en que las posiciones 2, 4 y 6 del clo u o
cianú ico sean suscep ibles de pa icipa en eacciones de ipo SNA , al o ma se egiones
de baja densidad elec ónica. A medida que se an in e cambiando á omos de clo o en la
es uc u a po di e en es sus i uyen es, se inc emen a la densidad de ca ga en el anillo de
la iazina debido a la pé dida de es os e ec os induc i os nega i os.
222
(Figu a 5.5) Es os
e ec os elec ónicos explican el hecho de que la ene gía de ac i ación aumen e con cada
sus i ución en el clo u o cianú ico, equi iéndose cada ez mayo es empe a u as en cada
e apa.
223
,
224
220
S e ensen, M.B.; Hollink, E.; Kuschel, F.; Baue , M.; Simanek, E.E.; J. Polym. Sci. A.
Polym. Chem. 2006, 44, 3411-3433.
221
Ugozzoli, F.; Masse a, C.; C ysEngComm 2005, 7, 121-128.
222
Ramak ishna, S.; Ma, Z.; Ma suu a, T.; Polyme Memb anes in Bio echnology: P epa a ion,
Func ionaliza ion and Applica ion, 2011, London: Impe ial College P ess.
223
Sha ma, A.; Sheyi, R.; Kuma , A.; El-Faham, A.; de la To e, B.G.; Albe icio, F.; O g. Le .
2019, 21, 7888-7892.
224
Blo ny, G.; Te ahed on 2006, 62, 9507-9522.
Capí ulo 6
228
Figu a 6.30. Supe posición de los espec os de abso ción de la ce ona 61 (en azul) y la hid azona
62 (en ojo).
La ecuación de Lambe -Bee es ablece que A= lƐC, siendo, A la abso bancia, l es la
longi ud del camino óp ico, Ɛ la abso i idad de la sus ancia y C la concen ación de la
misma.
345
Realizando la medición a λ=275.6 nm, podemos es ablece que las
abso i idades de la ce ona y la hid azona son equi alen es, de es a o ma se sa is ace la
ecuación de Lambe -Bee . Po lo an o, a es a longi ud de onda es posible cuan i ica el
po cen aje de hid ólisis de la hid azona 62 median e in eg ación de los picos de los dos
glicodend ones. Pa a la co-elución an e io a la misma concen ación de ambos anali os,
a una λ = 275.6 nm, la in eg ación de cada uno de los picos esul ó del 50%.
Una ez op imizadas las condiciones pa a ealiza la medición, se p epa a on cua o
disoluciones ampón pa a e alua el g ado de hid ólisis de la hid azona 62 en cada una de
ellas. Un ampón os a o a pH= 7.4 y ampones ci a o a pH= 6, 5 y 3. Una ez p epa adas,
una disolución de la hid azona 62 ue diluida en cada una de es as disoluciones ampón y
agi adas a una empe a u a de 37ºC. Se oma on alícuo as de las incubaciones de la
hid azona 62 a di e en es in e alos de iempo (1, 2, 4, 8, 24 y 36 h) y ue on analizadas
po RP-HPLC a λ= 275.6 nm.
Como se comen ó p e iamen e, a pa i de la in eg ación de los picos de la hid azona 62
que se a hid olizando y de la ce ona 61 o mándose, se ob u ie on los po cen ajes de
hid ólisis. Con es os da os se cons uyó la g á ica mos ada en la igu a 6.31.
345
Maye hö e , T.G.; Pipa, A.; Popp, J.; ChemPhysChem 2019, 20, 2748-2753.

Sín esis de conjugados alé geno-glicodend ón
y es udio de su ac i idad biológica
229
Figu a 6.31. G á ica que ep esen a el po cen aje de hid ólisis de la hid azona 62 a di e en es
iempos a pH= 7.4 (azul), 6 (ama illo), 5 ( e de) y 3 ( ojo).
Cómo e a p e isible, los esul ados demues an una mayo up u a de la hid azona a
alo es de pH más bajos. En odos los casos se obse a un alo cons an e a las 24 ho as
de la incubación. Desde la p ime a ho a se obse a una hid ólisis del 12% pa a un pH=
7.4 que no p og esa, siendo lige amen e supe io (15%) pa a pH= 6. La incubación a pH=
5.0 p esen a una hid ólisis p og esi a a lo la go del iempo, siendo cons an e a las 24
ho as, obse ándose una up u a del 54%. Po úl imo, en las condiciones más ácidas a
pH= 3.0, se obse a una ápida hid ólisis de la hid azona 62, siendo comple a a las 8 h.
Si bien es e úl imo pH es demasiado ex emo pa a el in e io celula , es u ilizado como
con ol pa a demos a las condiciones en la que la hid azona 62 es comple amen e
hid olizada. Es e expe imen o se ealizó po duplicado obse ándose el mismo esul ado.
Cómo se comen ó p e iamen e, en compa imen os celula es como los lisosomas se
alcanza ap oximadamen e un pH= 5.0. Con es e pequeño ensayo, que eplica ía las
condiciones en el in e io celula , se p oduci ía una up u a de ap oximadamen e la mi ad
de la hid azona, lo que pod ía mejo a la p esen ación del pép ido. También se con i ma
que, en un ambien e isiológico de pH= 7.4, no se obse a una hid ólisis ele an e de la
hid azona, po lo que du an e las e apas de adminis ación, anspo e e in e nalización
celula no se libe a ía una p opo ción signi ica i a de pép ido.
Capí ulo 6
230
Pa a e i ica el g ado de hid ólisis du an e su almacenamien o, se ealizó un expe imen o
adicional con la hid azona 62 Después de un almacenamien o sin disol en e a -20ºC
du an e un año y cinco meses, se ealizó un análisis po RP-HPLC. (Figu a 6.32)
Figu a 6.32. C oma og ama que mues a la hid ólisis de la hid azona 62 después de 1 año y 5
meses almacenada a -20ºC.
Es e análisis po RP-HPLC demos ó que du an e odo es e iempo, solamen e se había
p oducido un 8.5% de hid ólisis de la hid azona 62, siendo un da o undamen al pa a su
po encial aplicación en el desa ollo de un á maco.
Es os esul ados ponen de mani ies o una buena obus ez de la hid azona 62 du an e
la gos pe íodos de almacenamien o que, jun o a su capacidad de hid ólisis en condiciones
in acelula es, cons i uyen unos p ome edo es esul ados.
6.6 Conjugación del pép ido P u p 3 al glicodend ón con un
espaciado de ipo hid azona
Como se ha comen ado p e iamen e, una ez demos ada las ca ac e ís icas de hid ólisis
ácida de es a hid azona 62, el siguien e paso consis ió en la conjugación del pép ido P u
Sín esis de conjugados alé geno-glicodend ón
y es udio de su ac i idad biológica
231
p 3-SH. Pa a es a adición iol-eno se usa on las condiciones pues as a pun o a lo la go de
la p esen e Tesis Doc o al. (Esquema 6.13)
Esquema 6.13. Sín esis del conjugado 63.
El pép ido P u p 3-SH y la hid azona glicodend í ica 62 ue on disuel os en ampón
os a o (50 mM, pH= 7.4), en p opo ciones equimolecula es. Seguidamen e, se mezcla on
po medio de agi ación o bi álica du an e 25 min a empe a u a ambien e. En la
moni o ización po RP-HPLC se obse ó la desapa ición de la hid azona 62. Después de
una pu i icación po medio de ul a il ación, a a és de una memb ana de co e
molecula de 3 KDa, se ob u o el conjugado 63 con un excelen e endimien o (94%).
Es e conjugado ue ca ac e izado sa is ac o iamen e po espec ome ía de masas (ESI),
donde se de ec ó la p esencia del conjugado 63 median e la elación de señales m/z
co espondien es. (Figu a 6.33)
Figu a 6.33. Espec o ESI-MS del conjugado 63.
Median e la pues a a pun o de es e p o ocolo de conjugación, pudo se ob enido el
conjugado 63 con el enlace hid azona inal e ado.
Capí ulo 6
232
6.7 E aluación biológica del conjugado con un espaciado
de ipo hid azona
Una ez sin e izado y ca ac e izado el glicodend ón conjugado 63, se p ocedió a su
e aluación biológica pa a de e mina su capacidad de media en el as o no de
en e medades alé gicas a a és de la modulación de la espues a inmune. Como se ha
comen ado p e iamen e, se p e ende e alua si el enlace hid azona en e el glicodend ón
y el pép ido se hid oliza su icien emen e en el in e io celula pa a mejo a la p esen ación
del epí opo de P u p 3. Es os es udios se es án ealizando ac ualmen e en el g upo de
ale gología de la D a. C is obalina Mayo ga del Hospi al Regional Uni e si a io de
Málaga. A con inuación, se p esen an los esul ados p elimina es de los que disponemos
has a el momen o.
En p ime luga , se e aluó la capacidad de la hid azona conjugada 63, pa a se
in e nalizada en las moDCs, en compa ación con el conjugado de glicodend ón de nue e
manosas V, sin e izado p e iamen e, y el pép ido P u p 3-SH como con ol. Los es
compues os ue on ma cados luo escen emen e en la egión del pép ido po medio del
eac i o come cial Alexa luo 647. Una ez ma cados, se analizó la in e nalización en
las moDCs usando ci ome ía de lujo y mic oscopía con ocal. (Figu a 6.34)
Sín esis de conjugados alé geno-glicodend ón
y es udio de su ac i idad biológica
233
Figu a 6.34. Es udios de in e nalización de P u p 3-SH, glicodend ón V e hid azona 63 ma cados
luo escen emen e. His og amas de cada uno de ellos, así como las imágenes de mic oscopía
con ocal a di e en es iempos (a iba). G á ico que ep esen a la in e nalización a di e en es
iempos (abajo).
Las mediciones de ci ome ía de lujo indica on que los glicodend ones conjugados V y
63 e an in e nalizados po las moDCs de una mane a dependien e del iempo, si bien

Capí ulo 6
234
p esen an di e encias en su elocidad, se obse a el mismo g ado de in e nalización a las
48 ho as. Es os esul ados son consis en es, debido a que ambos glicodend ones es án
deco ados con nue e manosas en su pe i e ia, de o ma que son econocidos po la lec ina
DC-SIGN de igual o ma, lo que induce dicha in e nalización. Es e hecho ambién explica
la baja in e nalización del pép ido P u p 3-SH, que puede a ibui se a p ocesos de
endoci osis no especí icos.
La cap ación de es os compues os con inuó aumen ando has a las 48 ho as. Median e
mic oscopía con ocal y la inción de di e en es es uc u as in acelula es se pudo
isualiza el p oceso de in e nalización de los es compues os ma cados. (Figu a 6.35)
Figu a 6.35. Imágenes con ocales a las 48 h que mues an di e sas egiones celula es (la ac ina
de la submemb ana se iñó con A o 488- aloidina ( e de) y los núcleos con Hoechs (azul)) y los
di e en es compues os ma cados con Alexa luo 647 ( osa).
Es os esul ados indican que la dis ibución in acelula de los glicodend ones 63 y V en
las moDCs es simila a la del pép ido, mos ando una acumulación en la egión
ci oplasmá ica/pe inuclea . Es a zona es especialmen e in e esan e en el caso de la
hid azona 63, pues es aquí donde se encuen an compa imen os celula es como los
lisosomas, donde se p oduce una disminución del pH.
Todos es os es udios p e ios ponen de mani ies o que la hid azona conjugada 63 es
econocida e in e nalizada po las moDCs, lo que esul a undamen al pa a la p esen ación
del pép ido. Ac ualmen e se es án desa ollando es udios in i o adicionales, como la
exp esión de ma cado es de moléculas co-es imulado as y ci oquinas pa a pode
comp oba si con es e nue o compues o se mejo a la p esen ación del pép ido.
Capí ulo 7
Conclusiones
Conclusiones
237
7. Conclusiones
7.1 Capí ulo 3
 Se ha ealizado la sín esis de una es uc u a basada en un pi imido[5,4-b]indol como
ligando de TLR4 con enien emen e uncionalizado pa a su conjugación y se ha
demos ado su e sa ilidad pa a la conjugación de es pép idos ale génicos di e en es
a a és de la eacción click iol-eno, de una o ma ápida, simple y e icien e.
 Po medio de es udios in i o se ha e aluado el conjugado del pép ido de P u p 3
con células de pacien es alé gicos al meloco ón. Es os es udios han demos ado que
es e conjugado es imula la madu ación y ac i ación de las moDCs de es os pacien es
alé gicos. Adicionalmen e, se ha demos ado que la ac i ación po pa e de las moDCs
p omue e la p esen ación del alé geno y gene a una espues a inmunológica
especí ica con un pa ón inmunológico de ipo TH1 / T eg y la sup esión de las células
e ec o as TH2. Es os esul ados ponen de mani ies o el uso de es e ligando de TLR4,
conjugado a pép idos ale génicos, como po enciales acunas en e a la ale gia en el
ámbi o de la AIT. Sin emba go sin bajos los alo es de T eg de
7.2 Capí ulo 4
 Se ha ealizado la sín esis de una es uc u a basada en un de i ado de 8-oxoadenina
como ligando de TLR7 con enien emen e uncionalizado pa a su conjugación y se ha
demos ado su e sa ilidad pa a la conjugación de es pép idos ale génicos di e en es
a a és de la eacción click iol-eno, de una o ma ápida, simple y e icien e.
 Po medio de es udios in i o se ha e aluado el conjugado del pép ido de P u p 3
con células de pacien es alé gicos al meloco ón. Es os es udios han demos ado que
es e conjugado es imula la madu ación y ac i ación de las moDCs de es os pacien es
alé gicos. Adicionalmen e se ha demos ado que la ac i ación po pa e de las moDCs
p omue e la p esen ación del alé geno y gene a una espues a inmunológica
especí ica con un pa ón inmunológico de ipo TH1 / T eg y la sup esión de las células
e ec o as TH2. Es os esul ados ponen de mani ies o el uso de es e ligando de TLR7,
conjugado a pép idos ale génicos como po enciales acunas en e a la ale gia en el
ámbi o de la AIT. Si bien pa ece que se obse a una meno ac i ación y egulación
Capí ulo 8
244
ESI Mass spec a we e ob ained wi h an Esqui e 6000 ESI‐Ion T ap, B uke Dal onics
(Mass Spec ome y Se ice o he Ins i u e o Chemical Resea ch, IIQ, CSIC-US) and
ESI HRMS Mass spec a we e ob ained wi h a Q Exac i e MS/MS (The mo Scien i ic,
CITIUS-US). MALDI-TOF MS expe imen s we e ca ied ou in a bench- op Mic o lex
LRF (B uke Dal onics, Inc., Biomolecula In e ac ions, Pla o m a CicCa uja).
UHPLC-MS we e egis e ed a he Mass Spec ome y Se ice o he Ins i u e o
Chemical Resea ch (uni 824861, IIQ, CSIC-US) using an Elu e UHPLC sys em coupled
o a B uke Amazon SL spec ome e ins umen . The e e se phase ch oma og aphy was
pe o med wi h an analy ical C18 column (100 × 2.1 mm, 2 µm, ACE Excel). The
op imized me hod used a bina y g adien mobile phase wi h wa e and 0.1 % o mic acid
as mobile phase A, and ace oni ile wi h 0.1% o mic acid as mobile phase B. The low
a e was 0.25 mL/min. AmaZon SL Dual Fuel Ion T ap mass spec ome e equipped wi h
Compass HyS a so wa e was used o he de ec ion o he analy es in posi i e ioniza ion
mode
Analy ical HPLC was ca ied ou on column BioZen, 3.6 µm, Pep ide XB-C8 o BioZen,
2.6 µm, Pep ide XB-C18 wi h a Wa e s Aliance 2690. Sol en s A and B we e Milli-Q
H2O (0.05 % TFA) and CH3CN, espec i ely. Elu ion was pe o med wi h linea
g adien s o sol en B in o A o e 15 min, a a 1 mL min-1 low a e. Fo HPLC
pu i ica ions he same condi ions we e used bu wi h semip epa a i e columns Luna C8
and Luna C18, o e 30 min, a a 3 mL min-1 low a e. Mic owa e eac ions we e
pe o med on a Bio age Ini ia o EXP US Mic owa eReac o Syn hesis Sys em w Robo
Six y/Eigh . The eagen s and echniques used in biological s udies will be de ailed in he
nex sec ion " Biological assays ".

Expe imen al sec ion
245
8.2 Syn hesis o TLR4 ligand conjuga es
2-Amino-5-b omobenzoni ile (1)121
2-Aminobenzoni ile (8.472 g, 71.71 mmol) was dissol ed in anhyd ous ACN (72 mL),
he solu ion was hen cooled o 0°C wi h an ice ba h and a solu ion o NBS (12.763 g,
71.71 mmol) in anhyd ous ACN (95 mL) was added slowly. The mix u e was s i ed a
. . o e nigh . Then, 15 mL o des illed wa e was added and he mix u e was concen a ed
unde acuum and pu i ied by column ch oma og aphy on silica gel (hexane/e hyl
ace a e, 3:1⟶ 1: 1) o a o d he p oduc as a lu y yellow solid (9.465 g, 67% yield).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.49 (A CH, d, J= 2.2 Hz, 1H), 7.45-7.38 (A CH, m, 1H),
6.66 (A CH, d, J= 8.8 Hz, 1H), 4.50 (NH2, b s, 2H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ:
148.7 (CNH2), 137.0 (A CH), 134.1 (A CH), 116.8 (A CH), 116.3 (CCN), 108.7 (CB ),
97.5 (CCN).
E hyl 2-((4-B omo-2-cyanophenyl)amino)ace a e (2)
The aniline de i a i e 1 (8.18 g, 41.51 mmol), e hyl b omoace a e (41.59 g, 249 mmol)
and po assium ca bona e (6.31 g, 45.66 mmol) we e combined in anhyd ous DMF a 75°C
o 2 days. Then, he sol en was emo ed unde high acuum and he c ude was pu i ed
by column ch oma og aphy on silica gel (hexane/e hyl ace a e, 8:1) a o ding 2 (7.37 g,
63%) as a whi e solid. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.53 (A CH, d, J= 2.3 Hz, 1H),
7.49 (A CH, dd, J= 8.9, 2.3 Hz, 1H), 6.47 (A CH, d, J= 8.9 Hz, 1H), 5.23 (NH, b s, 1H),
4.28 (CH2CH3, q, J= 7.1 Hz, 2H), 3.98 (NHCH2, d, J= 5.5 Hz, 2H), 1.32 (CH2CH3, , J=
Capí ulo 8
246
7.1 Hz, 3H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 169.4 (CO), 148.2 (CNH), 137.2 (A CH),
134.8 (A CH), 116.1 (CCN), 112.5 (A CH), 108.4 (CB ), 98.2 (CCN), 61.9 (OCH2CH2,
45.0 (COCH2NH), 14.2 (OCH2CH2).
E hyl 3-Amino-5-b omo-1H-indole-2-ca boxyla e (3)120
In a lame-d ied lask, a suspension o po assium e -bu oxide (1.72 g, 15.38 mmol) in
8.3 mL anhyd ous e ahyd o u an was s i ed and main ained below 30°C wi h a wa e
ba h unde a gon. To his solu ion was added a solu ion o compound 2 (14.35 g, 15.38
mmol) in anhyd ous THF (12.3 mL) o e 45 min and s i ed o an addi ional 2 h. The
eac ion was hen pou ed in o ice-wa e (35 mL), ex ac ed wi h E OAc (2x100 mL), and
d ied o e anhyd ous MgSO4. The sol en was concen a ed unde acuum, and he
esul an esidue was pu i ied by column ch oma og aphy on silica gel (hexane/e hyl
ace a e, 4:1) a o ding compound 3 (1.61 g, 39%) as a yellow solid. 1H NMR (CDCl3, 400
MHz) δ: 7.99 (NH, b s, 1H), 7.71 (A CH, s, 1H), 7.40 (A CH, d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.17
(A CH, d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.7 (NH2, b s, 2H), 4.43 (CH2CH3, q, J= 7.0 Hz, 2H), 1.44
(CH2CH3, , J = 7.0 Hz, 3H).
E hyl 5-B omo-3-(3-phenyl hiou eido)-1H-indole-2-ca boxyla e (4)120
To a solu ion o compound 3 (1.21 g, 4.27 mmol) in wa m E OH (18 mL) was added
d opwise unde s i ing phenyl iso hiocyana e (0.56 mL, 4.70 mmol). The eac ion was
Expe imen al sec ion
247
e luxed o 6 h and cooled o e nigh . Solid esidues we e il e ed o , washed wi h E OH,
and d ied o e nigh unde acuum o gi e he p oduc as a whi e solid (1.624 g, 93%). 1H
NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 12.07 (SCNHC, s, 1H), 9.84 (NH, s, 1H), 9.38 (A NHCS,
s, 1H), 8.46 (A CH, s, 1H), 7.73 (A CH, s, 1H), 7.52 (A CH, d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.51
(A CH, s, 2H), 7.34 (A CH, m, 2H), 7.14 (A CH, m, 1H), 4.34 (CH2CH3, q, J = 7.0 Hz,
2H), 1.33 (CH2CH3, , J = 7.0 Hz, 3H). ESI-MS m/z calcd. o C18H17O2N3B S: 418.3
[M]+; ound: 419.9 [M + H]+, 441 [M + Na]+.
8-B omo-3-phenyl-2- hioxo-2,3-dihyd o-1H-py imido[5,4-b]-indol-4(5H)-one (5)120
To a sealed lame-d ied lask cha ged wi h a gon, a solu ion o compound 4 (1.09, 2.61
mmol) in anhyd ous E OH (20 mL) was s o ed. Sepa a ely, in a lask wi h anhyd ous
e hanol (27 ml), cooled o 0°C wi h an ice ba h was added ace yl chlo ide (7.78 mL,
109.44 mmol) d opwise (cau ion, exo he mic eac ion) unde a gon a mosphe e. This
solu ion was added d opwise o he i s solu ion unde s i ing. A e comple ion, he
mix u e was s i ed a e lux o e nigh . Once comple ed, he eac ion mix u e was cooled
a 0°C and solids we e il e ed o and washed wi h cold E OH o gi e compound 5 as a
whi e solid (697 mg, 72%). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 13.70 (NHCS, s, 1H),
12.44 (NH, s, 1H), 8.46 (A CH, s, 1H), 7.80 (A CH, d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.59-7.41 (A CH,
m, 2H), 7.29 (A CH, d, J= 7.4 Hz, 2H).
2-((8-B omo-4-oxo-3-phenyl-4,5-dihyd o-3H-py imido[5,4-b]indol-2-yl) hio)ace ic
acid (6)
Capí ulo 8
248
In a schlenk lask, o a solu ion o b omo de i a i e 5 (697 mg, 1.87 mmol) in wa m E OH
(15 mL) was added po assium hyd oxide (210 mg, 3.74 mmol) wi h s i ing. To his
solu ion was added a solu ion o b omoace ic acid (269 mg, 1.87 mmol) in E OH (3 mL)
and he mix u e was e luxed o e nigh . Then, abou hal olume o he mix u e was
emo ed on a o a ap and he mix u e was acidi ied o pH= 4 wi h 4M HCl. The solid
was il e ed o and washed wi h dis illed wa e and inally wi h E OH o gi e compound
6 as a whi e solid (810 mg, quan .). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 12.36 (NH, s, 1H),
8.09 (A CH, s, 1H), 7.61-7.49 (A CH, m, 7H), 3.96 (SCH2, s, 2H). 13C-NMR (100 MHz,
DMSO-d6) δ: 170.3 (CO), 155.3 (NCHS), 153.5 (OCN-Ph), 137.9 (A C), 136.6 (A C),
136.3 (A C), 130.5 (NCCNH), 130.3 (A C), 130.1 (A CH), 129.9 (A CH), 122.7 (A CH),
122.4 (A CH), 120.7 (A C), 115.6 (A CH), 112.9 (A CH), 35.7 (SCH2). ESI-MS m/z
calcd. o C18H12O3N3B S: 430.3 [M]+; ound: 432.1. [M + H]+. ESI-HRMS m/z calcd.
o C18H11O3N3B NaS: 451.9680; ound: 451.9675.
2-((8-B omo-4-oxo-3-phenyl-4,5-dihyd o-3H-py imido[5,4-b]indol-2-yl) hio)-N-
cyclohexylace amide (7)
Compound 6 (1.732 g, 4.025 mmol), anhyd ous ie hylamine (1.12 mL, 8.05 mmol), and
cyclohexylamine (0.51 mL, 4.428 mmol) we e dissol ed in anhyd ous DMF (29 mL). To
his solu ion, HATU (823 mg, 2.16 mmol) dissol ed in anhyd ous DMF (5.7 mL) was
added and s i ed a oom empe a u e o 6 h. The sol en was emo ed unde high
acuum and he c ude ma e ial was washed wice wi h MeOH, yielding compound 7 as a
whi e solid (2.036 g, quan ). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 12.32 (NH, s, 1H), 8.29
(OCNH, s, 1H), 8.22 (A CH, d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.61-7.49 (A CH, m, 7H), 3.86 (SCH2,
s, 2H), 3.54 (HNCH, m, 1H, o e lapped wi h wa e signal), 1.75-1.54 (cyclohexyl, m,
5H), 1.25 (cyclohexyl, m, 5H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 166.3 (CO), 155.3
(NCHS), 153.8 (OCN-Ph), 137.9 (A C), 136.8 (A C), 136.4 (A C), 130.4 (NCCNH),
Expe imen al sec ion
249
130.2 (A C), 130.0 (A CH), 129.9 (A CH), 123.3 (A CH), 122.5 (A CH), 120.7 (A C),
115.4 (A CH), 112.8 (A CH), 48.5 (HNCH), 37.2 (SCH2), 33.0 (cyclohexyl-CH2), 25.5
(cyclohexyl-CH2), 25.0 (cyclohexyl-CH2). ESI-MS m/z calcd. o C24H23O2N4B S: 510.1
[M]+; ound: 511.1 [M + H]+. ESI-HRMS m/z calcd. o C24H23O2N4B NaS: 533.0623,
ound: 533.0617.
2-((8-Amino-4-oxo-3-phenyl-4,5-dihyd o-3H-py imido[5,4-b]indol-2-yl) hio)-N-
cyclohexylace amide (8)
Compound 7 (295 mg, 0.58 mmol), sodium azide (375 mg, 5.77 mmol), coppe (I) iodide
(549 mg, 2.88 mmol), and sodium asco ba e (286 mg, 1.44 mmol) we e combined in a
lask unde a gon a mosphe e. A mix u e o DMSO:H2O (5:1, 9.1 mL) was degassed wi h
a gon and added o he mix u e, ollowed by he addi ion o N,N-
dime hyle hylenediamine (310 μL, 2.88 mmol) degassed as well. The eac ion was hea ed
o 90°C o e nigh wi h s i ing. The suspension was ex ac ed wi h E OAc and b ine. The
o ganic laye was d ied o e anhyd ous MgSO4 and concen a ed unde acuum. The
c ude esidue was pu i ied by column ch oma og aphy on silica gel (DCM:MeOH, 100/3)
a o ding he amine de i a i e 8 as a b own solid (185 mg, 72%). 1H NMR (DMSO-d6,
400 MHz) δ: 11.61 (NH, s, 1H), 8.12 (OCNH, d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.59 (A CH, m, 3H),
7.44 (A CH, m, 2H), 7.24 (A CH, m, 1H), 7.13 (A CH, s, 1H), 6.90 (A CH, d, J= 8.5 Hz,
1H), 4.90 (NH2, b s, 2H), 3.89 (SCH2, s, 2H), 3.50 (HNCH, m, 1H, o e lap wa e signal),
1.74-1.66 (cyclohexyl, m, 4H), 1.52 (cyclohexyl, m, 1H), 1.25-1.11 (cyclohexyl, m, 5H).
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 166.1 (CO), 155.4 (NCHS), 151.2 (OCN-Ph), 142.9
(A C), 136.7 (A C), 133.3 (NCCNH), 130.3 (A C), 130.2 (A C), 130.1 (A CH), 129.9
(A CH), 121.7 (A CH), 119.6 (NCCNH), 119.1 (A CH), 113.5 (A CH), 102.0 (A CH),
48.4 (HNCH), 37.2 (SCH2), 32.7 (cyclohexyl-CH2), 25.6 (cyclohexyl-CH2), 24.9
(cyclohexyl-CH2). ESI-S m/z calcd. o C24H25O2N5S: 447.2 [M]+; ound: 448.1 [M +

Capí ulo 8
250
H]+, 470.1 [M + Na]+, 917.2 [2M + Na]+. ESI-HRMS m/z calcd. o C24H26O2N5S:
448.1807; ound: 448.1802.
3-Maleimido-p opionic acid (9)126
To a solu ion o maleic anhyd ide (5.5 g, 56.12 mmol) in acid ace ic acid (70 mL), was
added d opwise ano he solu ion o β-alanine (5 g, 56.12 mmol) in he same sol en (25
mL). The mix u e was kep unde s i ing a oom empe a u e o 3 hou s. Then, ace ic
acid (50 mL) was added and he mix u e was hea ed a 115°C o e nigh unde s i ing.
Then, he sol en was emo ed unde high acuum and he c ude was pu i ed by column
ch oma og aphy on silica gel (DCM/e hyl ace a e, 9:1) a o ding he acid 9 (3.0 g, 32%)
as a whi e solid. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 6.72 (CH, s, 2H), 3.81 (NCH2CH2, , J=
7.3 Hz, 2H), 2.86 (NCH2CH2, , J= 7.3 Hz, 2H).
N-(2-((2-(Cyclohexylamino)-2-oxoe hyl) hio)-4-oxo-3-phenyl-4,5-dihyd o-3H-
py imido[5,4-b]indol-8-yl)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihyd o-1H-py ol-1-yl)p opanamide
(10)
Compound 8 (185 mg, 0.41 mmol), anhyd ous DIPEA (144 µL, 0.83 mmol), 3-
maleimidop opionic acid (9) (77 mg, 0.45 mmol) we e dissol ed in anhyd ous DMF (3
mL). To his solu ion, HATU (173 mg, 0.45 mmol) dissol ed in anhyd ous DMF (1.7
mL) was added and s i ed a oom empe a u e o e nigh . The sol en was emo ed
unde high acuum and he c ude ma e ial was washed wice wi h MeOH yielding
compound 10 as a whi e solid (182 mg, 73%). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 12.05
Expe imen al sec ion
251
(NH, s, 1H), 10.06 (OCNH-A , 1H), 8.49 (OCNH, s, 1H), 8.21 (A CH, d, J= 6.2 Hz, 1H),
7.60-7.42 (A CH, m, 7H), 7.05 ((OCCH)2N, s, 2H), 3.94 (SCH2, s, 2H), 3.77 (NCH2CH2,
, J= 7.2 Hz, 2H), 3.50 (HNCH, m, 1H, o e lapped wi h wa e signal), 2.64 (NCH2CH2,
, J= 7.2 Hz, 2H), 1.74-1.54 (cyclohexyl, m, 5H), 1.21-1.10 (cyclohexyl, m, 5H). 13C-
NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 171.3 (COmalemide), 168.6 (HNCO-malemide), 165.9
(HNCO), 155.4 (NCHS), 152.7 (OCN-Ph), 137.6 (A C), 136.6 (A C), 136.1 (A C), 135.1
(CHmalemide), 132.54 (NCCNH), 130.3 (A C), 130.1 (A CH), 130.0 (A CH), 121.7
(A CH), 120.6 (NCCNH), 120.4 (A CH), 113.4 (A CH), 110.8 (A CH), 48.5 (HNCH),
37.5 (SCH2), 35.4 (CH2CH2-maleimide), 34.4 (CH2CH2-maleimide), 32.7 (cyclohexyl-
CH2), 25.6 (cyclohexyl-CH2), 24.9 (cyclohexyl-CH2). ESI-MS m/z calcd. o
C31H30O5N6S: 598.2 [M]+; ound: 621.2 [M + Na]+. ESI-HRMS m/z calcd. o
C31H30O5N6NaS: 621.1896; ound: 621.1891. RP-HPLC R= 14.31 min (Column:
analy ical BioZen, 2.6 µm, Pep ide XB-C18; A: Milli-Q H2O (0.05 % TFA), B:
Ace oni ile; i s wo minu es wi h 10% o B, he es , 10 o 95% linea g adien o B
in o A o e 15 min, F= 1 mL/min).
Conjuga e o TLR4 ligand, 11
A solu ion o pep ide P u p 3 SH (2.60 mg, 1.15 µmol) in sodium phospha e bu e (50
mM, pH 7.4, 80 µL) and Milli-Q wa e (160 µL) was added o a solu ion o maleimide
de i a i e 10 (0.69 mg, 1.15 µmol) in DMSO (390 µL). A e shaking o ap ox. 25 min
a oom empe a u e ( he p og ession o he eac ion was moni o ed by analy ical RP-
HPLC), only a signal co esponding o he inal p oduc was obse ed. To emo e sal s,
he solu ion was il e ed in an Amicon Ul a cen i ugal il e (Ul a-15, MWCO 3KDa)
and a e washing wi h Milli-Q wa e in a cen i uge a 4000 pm, he collec ed aqueous
phase was lyophilized, p o iding he co esponding conjuga e 11 as a whi e solid (2.79
mg, 85%). ESI-MS m/z calcd.: 2853.8 [M]+, ound: 952.5 [M + 3H]3+, 1427.8 [M +
2H]2+. RP-HPLC R= 10.65 min (Column: analy ical BioZen, 2.6 µm, Pep ide XB-C18;
Capí ulo 8
252
A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Ace oni ile; i s wo minu es wi h 10% o B, he es ,
10 o 95% linea g adien o B in o A o e 15 min, F= 1 mL/min).
Conjuga e o TLR4 ligand, 12
A solu ion o pep ide β-PRVB-SH (1.32 mg, 1.37 µmol) in sodium phospha e bu e (50
mM, pH 7.4, 96 µL) and Milli-Q wa e (192 µL) was added o a solu ion o maleimide
de i a i e 10 (0.82 mg, 1.37 µmol) in DMSO (464 µL). A e shaking o ap ox. 25 min
a oom empe a u e ( he p og ession o he eac ion was moni o ed by analy ical RP-
HPLC), he eac ion mix u e was pu i ied by semip epa a i e RP-HPLC (C8
Phenomenex Luna column, 10 × 250 mm, 10 μm; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B:
Ace oni ile; 20 o 60% linea g adien o B in o A o e 30 min, F= 3 mL/min). The
co esponding analyzed ac ions we e collec ed and lyophilized o a o ding he
co esponding conjuga e 12 (1.7 mg, 79%) as a whi e amo phous solid. ESI-MS m/z
calcd.: 1560.94 [M]+; ound: 521.3 [M + 3H]3+, 781.3 [M + 2H]2+, 1560.5 [M + H]+ . RP-
HPLC R= 10.57 min (Column: analy ical BioZen, 3.6 µm, Pep ide XB-C8; A: Milli-Q
H2O (0.05% TFA), B: Ace oni ile; 20 o 60% linea g adien o B in o A o e 15 min,
F= 1 mL/min).
Expe imen al sec ion
253
Conjuga e o TLR4 ligand, 13
A solu ion o pep ide Ole109-130-SH (2.35 mg, 0.93 µmol) in 65 µL o sodium phospha e
bu e (50 mM, pH 7.4, 150 µL) and Milli-Q wa e (180 µL) was added o a solu ion o
maleimide de i a i e 10 (0.56 mg, 0.93 µmol) in DMSO (317 µL). A e shaking o
ap ox. 25 min a oom empe a u e ( he p og ession o he eac ion was moni o ed by
analy ical RP-HPLC), he eac ion mix u e was di ec ly pu i ied by semip epa a i e RP-
HPLC (C18 Phenomenex Luna column, 10 × 250 mm, 10 μm; A: Milli-Q H2O (0.05%
TFA), B: Ace oni ile; i s ou minu es wi h 30% o B, he es , 30 o 70% linea g adien
o B in o A o e 30 min, F= 3 mL/min). The co esponding analyzed ac ions we e
collec ed and lyophilized, a o ding he co esponding conjuga e 13 as a whi e solid (0.7
mg, 34%). ESI-MS m/z calcd.: 3119.7 [M]+; ound: 1040.4 [M + 3H]3+, 1559.3 [M +
2H]2+. RP-HPLC R= 8.8 min (Column: analy ical BioZen, 3.6 µm, Pep ide XB-C8; A:
Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Ace oni ile; 20 o 60% linea g adien o B in o A o e
15 min, F= 1 mL/min).
8.3 Syn hesis o TLR7 ligand conjuga es
1-Azido-2-(2-(2-(2-azidoe hoxy)e hoxy)e hoxy)e hane (14)179
Bis[2-(2-chlo oe hoxy)e hyl] e he (4.72 g, 20,42 mmol) was dilu ed in o N,N-
dime hyl o mamide (69 mL) and ea ed wi h an excess o sodium azide (13,27 g, 204.2
mmol) a 60 °C o 2 days. The sol en was emo ed unde educed p essu e and he
esul ing mix u e was dilu ed in o e he and il e ed. The il a e was again concen a ed
Capí ulo 8
260
= 5.0 Hz, 2H), 3.65 (CH2CH2 iazole, , J= 7.0 Hz, 2H), 3.52-3.38 (CH2PEG, m, 12H,
o e lap wa e signal), 2.61 (CH2CH2N, , J= 7.0 Hz, 2H), 1.61 (CH3CH2CH2CH2, q, J=
7.4 Hz, 2H), 1.38 (CH3CH2CH2CH2, q, J= 7.2 Hz, 2H), 0.90 (CH3CH2CH2CH2, , J= 7.4
Hz, 3H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 171.1 (COmalemide), 170.7 (HNCO-
malemide), 166.4 (HNCO), 160.6 (NCNH2), 152.7 (COBu), 149.6 (HNCON), 148.3
(NH2CNHCCN), 141.9 (CH iazol), 140.6 (A C), 135.0 (CHmaleimide), 134.0 (A C), 127.9
(A CH), 127.6 (A CH), 125.6 (CH iazol), 98.7 (NH2CNHCCN), 70.14, 70.06, 69.97,
69.32, 69.06 (CH2PEG), 66.32 (CH3CH2CH2CH2O), 57.9 ( iazoleCH2O), 49.8 ( iazole-
CH2CH2), 42.6 (NCH2A ), 40.0 (CH2CH2-maleimide, o e lapping wi h DMSO signal),
33.6 (CH2CH2-maleimide), 32.7 (OCNHCH2-PEG), 31.0 (CH3CH2CH2CH2O), 19.2
(CH3CH2CH2CH2O), 14.2 (CH3CH2CH2CH2O). ESI-MS m/z calcd. o C35H44O10N10:
764.6 [M]+; ound: 787.2 [M + Na]+. ESI-HRMS m/z calcd. o C35H45O10N10: 765.3320;
ound:765.3304. RP-HPLC R= 11.07 min (Column: analy ical BioZen, 3.6 µm, Pep ide
XB-C8; A: Milli-Q H2O (0.05 % TFA), B: Ace oni ile, 10 o 60% linea g adien o B
in o A o e 15 min, F= 1 mL/min).
Conjuga e o TLR7 ligand, 23
A solu ion o pep ide P u p 3-SH (1.3 mg, 0.59 µmol) in sodium phospha e bu e (50
mM, pH 7.4, 40 µL) and Milli-Q wa e (80 µL) was added o a solu ion o maleimide
de i a i e 22 (0.45 mg, 0.59 µmol) in DMSO (195 µL). A e shaking o ap ox. 25 min
a oom empe a u e ( he p og ession o he eac ion was moni o ed by analy ical RP-
HPLC), only a signal co esponding o he inal p oduc was obse ed. To emo e sal s,
an Amicon Ul a cen i ugal il e (Ul a-15, MWCO 3KDa) was used and a e washing
wi h Milli-Q wa e in a cen i uge a 4000 pm, he collec ed aqueous phase was
lyophilized, a o ding he co esponding conjuga e 23 as a whi e solid (1.7 mg, 96%).

Expe imen al sec ion
261
ESI-MS m/z calcd.: 3019.9 [M]+; ound: 605.3 [M + 5H]5+, 756.3 [M + 4H]4+, 1007.9 [M
+ 3H]3+, 1511.0 [M + 2H]2+. RP-HPLC R= 8.91 min (Column: analy ical BioZen, 3.6
µm, Pep ide XB-C8; A: Milli-Q H2O (0.05 % TFA), B: Ace oni ile, 10 o 60% linea
g adien o B in o A o e 15 min, F= 1 mL/min).
Conjuga e o TLR7 ligand, 24
A solu ion o pep ide β-PRVB-SH (0.75 mg, 0.78 µmol) in sodium phospha e bu e (50
mM, pH 7.4, 90 µL) and Milli-Q wa e (150 µL) was added o a solu ion o maleimide
de i a i e 22 (0.60 mg, 0.78 µmol) in DMSO (200 µL). A e shaking o ap ox. 25 min
a oom empe a u e ( he p og ession o he eac ion was moni o ed by analy ical RP-
HPLC), only a signal co esponding o he p oduc was obse ed. To emo e sal s, an
Amicon Ul a cen i ugal il e (Ul a-15, MWCO 3KDa) was used and a e washing
wi h Milli-Q wa e in a cen i uge a 4000 pm, he aqueous phase collec ed was
lyophilized, a o ding he co esponding conjuga e 24 as a whi e solid (1.3 mg, 96%).
ESI-MS m/z calcd.: 1726.6 [M]+; ound: 576.7 [M + 3H]3+, 864.4 [M + 2H]2+, 1726.7 [M
+ H]+. RP-HPLC R= 9.42 min (Column: analy ical BioZen, 3.6 µm, Pep ide XB-C8; A:
Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Ace oni ile, 20 o 60% linea g adien o B in o A o e
15 min, F= 1 mL/min).
Capí ulo 8
262
Conjuga e o TLR7 ligand, 25
A solu ion o pep ide Ole109-130-SH (3.623 mg, 1.44 µmol) in sodium phospha e bu e
(50 mM, pH 7.4, 30 µL) and Milli-Q wa e (100 µL) was added o a solu ion o maleimide
de i a i e 22 (1.0 mg, 1.31 µmol) in DMSO (367 µL). A e shaking o ap ox. 25 min
a oom empe a u e ( he p og ession o he eac ion was moni o ed by analy ical RP-
HPLC), he solu ion was il e ed using an Amicon Ul a cen i ugal il e (Ul a-15,
MWCO 3KDa). A e washing wi h Milli-Q wa e in a cen i uge a 4000 pm, he
aqueous phase collec ed was lyophilized, p o iding he co esponding conjuga e 25 as a
whi e solid (3.1 mg, 72%). ESI-MS m/z calcd.: 3285.8 [M]+; ound: 1095.9 [M + 3H]3+,
1643.6 [M + 2H]2+. RP-HPLC R= 11.50 and 11.75 min (Column: analy ical BioZen, 2.6
µm, Pep ide XB-C18; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Ace oni ile, 20 o 70% linea
g adien o B in o A o e 15 min, F= 1 mL/min).
8.4 Syn hesis o TLR ligand dime conjuga es
Me hyl (4-Chlo o-6-((2-oxop opyl)amino)-1,3,5- iazin-2-yl)glycina e (26)
A suspension o cyanu ic chlo ide (1 g, 4.92 mmol) in 40 mL o ace oni ile was cooled
o 0°C. Then, a mix u e o glycine me hyl es e hyd ochlo ide (1.24 g, 9.85 mmol) and
DIPEA (3.43 mL, 19.7 mmol) was added d opwise unde s i ing. Then, he mix u e was
allowed o each oom empe a u e o e nigh . The sol en was emo ed unde acuum
Expe imen al sec ion
263
and he solid was washed wi h des illed wa e (3x10 mL) and MeOH (3x10 mL) yielding
compound 26 as a whi e solid (1.15 g, 81%). 1H NMR (MeOH-d4, 400 MHz) δ 4.12 and
4.04 (NHCH2, s, 4H), 3.75 (CH3, s, 6H). ESI-MS m/z calcd. o C9H12N5O4Cl: 289.1
[M]+; ound: 290.1 [M + H]+. ESI-HRMS m/z calcd. o C9H13N5O4Cl: 290.0656; ound:
290.0651.
Dime hyl 2,2'-((6-((2-(2-(2-(2-azidoe hoxy)e hoxy)e hoxy)e hyl)amino)-1,3,5-
iazine-2,4-diyl)bis(azanediyl))diace a e (27)
A solu ion o iazine de i a i e 26 (595.5 mg, 2.06 mmol), DIPEA (1.43 mL, 8.24 mmol)
and amine 15 (900 mg, 4.12 mmol) in dioxane (8.24 mL) was hea ed a 100°C o e nigh .
The sol en was emo ed unde acuum and pu i ied by column ch oma og aphy on
silica gel (E OAc/MeOH, 20:1) o a o d compound 27 as a yellow oil (841 mg, 87%).
1H NMR (MeOH-d4, 400 MHz) δ: 4.07 (NHCH2, b s, 4H), 3.74 (CH3, s, 6H), 3.70 – 3.61
(m, 14H, CH2PEG), 3.39 (CH2N3, m, 2H). 13C NMR (MeOH-d4, 100 MHz) δ: 171.8 (CO),
165.8 (CNH), 165.6 (CNH), 70.2, 70.1, 69.9, 69.7, 69.5 (CH2PEG), 51.1 (CH3), 50.4
(CH2N3), 42.0, 41.8 (NHCH2PEG), 39.9 (CH2COO). ESI-MS m/z calcd. o C17H29N9O7:
471.2 [M]+; ound: 472.2 [M + H]+, 494.2 [M + Na]+. ESI-HRMS m/z calcd. o
C17H30N9O7: 472.2268; ound: 472.2263.
Capí ulo 8
264
2,2'-((6-((2-(2-(2-(2-Azidoe hoxy)e hoxy)e hoxy)e hyl)amino)-1,3,5- iazine-2,4-
diyl)bis(azanediyl))diace ic acid (28)
T iazine 27 (465 mg, 0.99 mmol) was dissol ed in THF (10 mL) and LiOH.H2O (207.7
mg, 4.95 mmol) dissol ed in 10 mL o dis illed wa e was added o he mix u e wi h
s i ing a . . o e nigh . The mix u e was acidi ied o pH= 3 wi h 2M HCl. The sol en
was emo ed unde acuum and he c ude was pu i ied by size exclusion
ch oma og aphy, Sephadex LH20 (100% MeOH), gi ing he iazine 28 as a whi e solid
(354 mg, 81%). 1H NMR (D2O, 400 MHz) δ: 3.87 (NHCH2, b s, 4H), 3.65 – 3.58 (m,
12H, CH2PEG), 3.51 (HNCH2CH2, m, 2H), 3.41 (CH2N3, m, 2H). 13C NMR (D2O, 100
MHz) δ: 175.9 (CO), 162.7, 156.0, 154.9 (CNH), 69.6, 69.4, 69.2, 68.8, 68.4 (CH2PEG),
50.2 (CH2N3), 43.9, (NHCH2PEG), 42.0 (CH2COO). ESI-MS m/z calcd. o C15H25N9O7:
443.2 [M]+; ound: 444.2 [M + H]+.ESI-HRMS m/z calcd. o C15H26N9O7: 444.1955;
ound: 444.1944.
6-Chlo o-N2,N4-di(p op-2-yn-1-yl)-1,3,5- iazine-2,4-diamine (30)
A suspension o cyanu ic chlo ide (1.5 g, 7.39 mmol) in ace oni ile (60 mL) was cooled
o 0°C. Then, a mix u e o p opa gylamine (0.95 mL, 14.78 mmol) and DIPEA (2.57 mL,
14.78 mmol) was added d opwise wi h s i ing. Then, he mix u e was allowed o each
oom empe a u e o e nigh . The sol en was emo ed unde acuum and he solid was
washed wi h des illed wa e (3x10 mL) and MeOH (3x10 mL) yielding compound 30 as
a whi e solid (1.51 g, 92%). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 8.30 (NH, , J= 5.9 Hz,
Expe imen al sec ion
265
1.3H), 8.21 (NH, , J= 5.9 Hz, 0.5H), 8.07 (NH, , J= 5.9 Hz, 0.2H), 4.09 and 4.01
(NHCH2, d, J= 5.9 Hz, 4H), 3.09 (CCH, s, 2H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 168.9,
168.5 (CCl), 165.8, 165.5, 165.4 (CNH), 81.4, 81.3, 81.1(CCH), 73.6, 73.5 (CCH),
30.1,30.0 (CH2). ESI-MS m/z calcd. o C9H8N5Cl: 221.6 [M]+; ound: 222.1 [M + H]+.
e -Bu yl (2-(2-(2-aminoe hoxy)e hoxy)e hyl)ca bama e (31)240
To a solu ion o comme cial 2,2'‐(e hane‐1,2‐diylbis(oxy))bis(e han‐1‐amine) (34
mL, 233.2 mmol) in DCM (80 mL) was cooled o 0°C. Then, di‐ e ‐bu yl dica bona e
(5.09 g, 23.32 mmol) was added in po ions du ing 2h. A e 18h o s i ing, he mix u e
was washed wi h b ine (3x60 mL), des illed wa e (3x60 mL) and was d ied o e
anhyd ous MgSO4 and concen a ed unde acuum o a o d he amine 31 (4.30 g, 74%).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 5.17 (NH, b s, 1H), 3.63 – 3.54 (CH2PEG, m, 8H), 3.31
(CH2NHBoc, m, 2H), 2.90 (CH2NH2, m, 2H), 1.45 (CH3Boc, s, 9H).
e -Bu yl (1-(9H- luo en-9-yl)-3-oxo-2,7,10- ioxa-4-azadodecan-12-yl)ca bama e
(32)240
To a solu ion o 31 (4.30 g, 17,33 mmol) in THF (80 mL), Fmoc‐Cl (5.82 g, 22.53 mmol)
was added in po ions du ing 30 min. The mix u e was s i ed a . . o 2 h hen, he
sol en was emo ed unde acuum and pu i ied by column ch oma og aphy on silica gel
(hexane/e hyl ace a e, 25:1) o a o d compound 32 as a yellow oil (3.33 g, 41% yield).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.80 (A CH, d, J= 7.5 Hz, 2H), 7.62 (A CH, d, J= 7.5 Hz,
2H), 7.43 (A CH, , J= 7.4 Hz, 2H), 7.33 (A CH, , J= 7.4 Hz, 2H), 5.71 (s, 1H, NH‐
Fmoc), 5.39 (NHBoc, b s, 1H), 5.02 (NHFmoc, b s, 1H), 4.43 (CH2OCO, d, J= 7.0 Hz,

Capí ulo 8
266
2H), 4.25 (CHFmoc, , J= 7.0 Hz, 1H), 3.64 – 3.56 (m, 10H, CH2PEG), 3.45 (CH2Fmoc,
m, 2H), 1.45 (CH3Boc, s, 9H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 156.5 (CO‐Fmoc), 155.9
(CO‐Boc), 143.9 (CA ), 141.2 (CA ), 127.6 (CA ), 126.9 (CA ), 125.0 (CA ), 119.8
(CA ), 78.9 (C(CH3)3), 70.1, 69.9, 66.4 (CPEG), 60.2 (CH2‐Fmoc), 47.2 (CHFmoc), 40.8
(CH2NH‐Boc), 40.2 (CH2NHFmoc), 28.3 (CH3).
(9H-Fluo en-9-yl)me hyl (2-(2-(2-aminoe hoxy)e hoxy)e hyl)ca bama e (33)240
To a solu ion o ca bama e de i a i e 32 (3.33 g, 7.08 mmol) in dicho ome ane (29.2
mL), TFA (13.3 mL) was added d opwise. The mix u e was s i ed a . . o 1.5 h. Then,
he sol en was elimina ed unde acuum a o ding he amine 33 as an o ange oil (2.62
g, quan .). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.79 (A CH, d, J= 7.5 Hz, 2H), 7.58 (A CH,
d, J= 7.4 Hz, 2H), 7.43-7.29 (A CH, m, 4H), 4.51-4.45 (CH2OCO, m, 2H), 4.25
(CHFmoc, b s, 1H), 3.69 (NH2CH2, b s, 2H), 3.62 – 3.21 (CH2PEG, m, 10H). ESI-MS
m/z calcd. o C21H26N2O4: 370.2 [M]+; ound: 371.3 [M + H]+.
(9H-Fluo en-9-yl)me hyl (2-(2-(2-((4,6-bis(p op-2-yn-1-ylamino)-1,3,5- iazin-2-
yl)amino)e hoxy)e hoxy)e hyl)ca bama e (34)
A solu ion o iazine de i a i e 30 (71 mg, 0.32 mmol), DIPEA (141 µL, 0.81 mmol),
and amine 33 (179 mg, 0.48 mmol) in dioxane (2.6 mL) was i adia ed, unde mic owa e
ac i a ion, o 45 min a 100ºC (closed sys em). The sol en was emo ed unde acuum
Expe imen al sec ion
267
and pu i ied by column ch oma og aphy on silica gel (DCM/MeOH, 60:1) o a o d
compound 34 as a colou less oil (92 mg, 51%). 1H NMR (MeOH-d4, 400 MHz) δ: 7.80
(A CH, d, J= 7.4 Hz, 2H), 7.64 (A CH, d, J= 7.4 Hz, 2H), 7.39 (A CH, , J= 7.3 Hz, 2H),
7.21 (A CH, , J= 7.3 Hz, 2H), 4.37 (CH2OCO, d, J= 6.9 Hz, 2H), 4.21 (CHFmoc, , J=
6.9 Hz, 1H), 3.64 – 3.56 (CH2PEG, m, 12H), 2.51 (CCH, , J= 2.5 Hz, 1H). 13C NMR
(MeOH-d4, 100 MHz) δ: 165.8, 165.4 (CNH), 157.5 (HNCO), 143.9 (CA ), 141.2 (CA ),
127.3 (CA ), 126.7 (CA ), 124.7 (CA ), 119.5 (CA ), 80.6 (CCH), 70.9 (CCH), 69.9, 69.8
69.5 (CH2PEG), 66.3 (CH2CH), 43.1 (CH2CH), 40.4 (CNHCH2), 40.2 (CH2NHCO), 28.3
(CH2CCH). ESI-MS m/z calcd. o C30H33N7O4: 555.2 [M]+; ound: 556.2 [M + H]+. ESI-
HRMS m/z calcd. o C30H34N7O4: 556.2672; ound: 556.2667.
2-Azidoace ic acid (35)246
B omoace ic acid (0.86 g, 6.22 mmol) was dissol ed in des illed H2O (12.5 mL). Sodium
azide (0.81 g, 12.44 mmol) was added and s i ed o 15h. The eac ion mix u e was
acidi ied wi h conc. HCl o pH= 1 and ex ac ed wi h die hyl e he (3x37 mL). The
combined o ganic laye s we e washed wi h b ine (37 mL). The sol en was d ied o e
Na2SO4 and e apo a ed a 25°C o ob ain he azide 35 (489 mg, 78%) as a colo less oil,
which was used wi hou u he pu i ica ion. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 11.07
(COOH, s, 1H), 3.96 (CH2N3, s, 2H). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 174.1 (CO), 49.9
(CH2N3).
Capí ulo 8
268
2-Azido-N-(2-((2-(cyclohexylamino)-2-oxoe hyl) hio)-4-oxo-3-phenyl-4,5-dihyd o-
3H-py imido[5,4-b]indol-8-yl)ace amide (36)
Compound 35 (175 mg, 0.39 mmol), anhyd ous DIPEA (272 µL, 1.56 mmol) and he
amine 8 (99 mg, 0.98 mmol) we e dissol ed in anhyd ous DMF (3.67 mL). To his
solu ion, HATU (373 mg, 0.98 mmol) dissol ed in anhyd ous DMF (1.0 mL) was added
and s i ed a oom empe a u e o e nigh . The sol en was emo ed unde high acuum
and he c ude ma e ial was washed wice wi h MeOH yielding compound 36 as a b own
pale solid (166 mg, 80%). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 12.08 (NH, s, 1H), 10.21
(N3CH2CONH, s, 1H), 8.56 (A CH, b s, 1H), 8.20 (OCNH, b s, 1H), 7.60-7.42 (A CH,
m, 7H), 4.07 (N3CH2, s, 2H), 3.93 (SCH2, s, 2H), 3.50 (HNCH, m, 1H, o e lapped wi h
he wa e signal), 1.75-1.52 (cyclohexyl, m, 5H), 1.25-1.11 (cyclohexyl, m, 5H). 13C-
NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 166.4 (SCH2CO), 166.0 (N3CH2CO), 155.4 (NCHS),
152.8 (OCN-Ph), 137.6 (A C), 136.6 (A C), 136.3 (A C), 131.9 (NCCNH), 130.3 (A C),
130.3 (A C), 130.3 (A CH), 130.0 (A CH), 121.5 (A CH), 120.7 (NCCNH), 120.5
(A CH), 113.6 (A CH), 111.0 (A CH), 49.1 (N3CH2), 48.5 (HNCH), 37.4 (SCH2), 32.7
(cyclohexyl-CH2), 25.6 (cyclohexyl-CH2), 25.0 (cyclohexyl-CH2). ESI-MS m/z calcd. o
C26H26N8O3S: 530.2 [M]+; ound: 553.0 [M + Na]+, 569.0 [M + K]+. ESI-HRMS m/z
calcd. o C26H26N8O3SNa: 553.1746; ound: 553.1741.
Expe imen al sec ion
269
TLR4 Ligand dime wi h amine, 37
To a solu ion o iazine 34 (25 mg, 0.45 mmol) and he azide ligand 36 (60 mg, 0.11
mmol) in DMSO (2 mL), CuSO4·5H2O (4.5 mg, 0.02 mmol) and TBTA (19.1 mg, 0.04
mmol) dissol ed in DMSO (2 mL) and inally a solu ion o sodium asco ba e (14.3 mg,
0.07 mmol) in 0.7 mL o phospha e bu e (50 mM, pH 7.4) we e added o he mix u e.
The solu ion was s i ed a oom empe a u e o e nigh . Then, coppe was emo ed by
adding a me al sca enge esin, Quad asil® Me cap op opyl (a spa ula ip) and s i ed o
15 min a oom empe a u e. A e ha , he mix u e was il e ed, washed wi h DMSO and
he sol en was emo ed unde high acuum. The c ude ma e ial was washed wice wi h
MeOH, he solid was dissol ed in a 20% pipe idine DMF solu ion (5 mL) and shaken a
. . o 30 minu es. Then, he sol en was emo ed unde high acuum and he solid was
washed wice wi h MeOH, yielding he compound 37 as a whi e solid (64 mg, 88%, wo
s eps). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 10.51 (OCNH-A , b s, 2H), 8.52 (A CH, s,
2H), 8.16 (OCNHCH, b s, 2H), 7.97 (H iazole, s, 2H), 7.59-7.44 (A CH, m, 14H), 5.32
( iazole-CH2CO, b s ,4H), 4.51 (HNCH2- iazole, b s ,4H), 3.90 (SCH2, s, 4H), 3.61 –
3.52 (CH2PEG, m, 12H), 3.17 (HNCH, s, 2H), 1.69-1.47 (cyclohexyl, m, 10H), 1.24-1.17
(cyclohexyl, m, 10H). 13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ: 166.2, 166.1 (CNH), 166.0
(HNCO), 164.4 (HNCO), 155.4 (NCHS), 152.8 (OCN-Ph), 146.6 (C iazole), 137.6 (A C),
136.5 (A C), 136.3 (A C), 131.9 (NCCNH), 130.4 (A C), 130.1 (A CH), 130.0 (A CH),
125.0 (CH iazole), 121.5 (A CH), 120.6 (A C), 120.5 (A CH), 113.6 (A CH), 110.9
(A CH), 70.1, 70.0, 69.7 (CH2PEG), 52.6 ( iazole-CH2CO), 48.5 (HNCH), 37.4 (SCH2),
36.0 (HNCH2-T iazole), 32.6 (cyclohexyl-CH2), 25.5 (cyclohexyl-CH2), 24.9
(cyclohexyl-CH2). ESI-MS m/z calcd. o C67H75N23O8S2: 1393.6 [M]+; ound: 465.8 [M
Capí ulo 8
276
(9H-Fluo en-9-yl)me hyl (2-(2-(2-((4-(p op-2-yn-1-ylamino)-6-((4-
( ime hylsilyl)bu -3-yn-1-yl)amino)-1,3,5- iazin-2-
yl)amino)e hoxy)e hoxy)e hyl)ca bama e (45)
A solu ion o iazine de i a i e 42 (252 mg, 0.47 mmol), DIPEA (205 µL, 1.17 mmol),
and 4-( ime hylsilyl)-3-bu yn-1-amine (78 mg, 0.61 mmol) in dioxane (3.9 mL) was
i adia ed, unde mic owa e ac i a ion, o 2h a 100ºC (closed sys em). The sol en was
emo ed unde acuum and pu i ied by column ch oma og aphy on silica gel
(hexane/THF, 3:2) o a o d compound 45 as a colou less oil (123 mg, 41%). 1H NMR
(MeOH-d4, 400 MHz) δ: 7.80 (A CH, d, J= 7.4 Hz, 2H), 7.64 (A CH, d, J= 7.4 Hz, 2H),
7.39 (A CH, , J= 7.4 Hz, 2H), 7.31 (A CH, , J= 7.4 Hz, 2H), 4.37 (CH2OCO, d, J= 6.9
Hz, 2H), 4.20 (CHFmoc, , J= 6.9 Hz, 1H), 4.09 (HNCH2CCH, b s, 2H), 3.64-3.40
(CH2PEG, HNCH2CH2, m, 14H), 2.51-2.47 (HNCH2CH2, CCH, m, 3H), 0.12 (SiCH3, m,
9H). 13C NMR (MeOD-d4, 100 MHz) δ: 165.7 (CNH), 157.5 (HNCO), 143.9 (CA ),
141.2 (CA ), 127.34 (CA ), 126.8 (CA ), 124.8 (CA ), 119.5 (CA ), 104.8 (SiCC), 84.8
(SiCC), 80.7 (CCH), 69.9 (CCH), 69.8, 69.6 (CH2PEG), 66.3 (CH2CH), 47.1 (CH2CH),
40.4, 39.9, 39.3 (NHCH2CH2), 29.4 (CH2CCH), 20.3 (NHCH2CH2), -1.2 (SiCH3). ESI-
MS m/z calcd. o C34H43N7O4Si: 641.3 [M]+; ound: 642.4 [M + H]+. ESI-HRMS m/z
calcd. o C34H44N7O4Si: 642.3224; ound: 642.3219.

Expe imen al sec ion
277
In e media e he e odime o TLR4/7, 46
A solu ion o iazine 45 (29, 0.04 mmol) and he azide ligand 36 (15.9, 0.03 mmol)
DMSO (1.1 mL) was placed in o a lask unde a gon a mosphe e. To his solu ion, CuB
(0.86 mg, 6 µmol) dissol ed in DMSO (0.2 mL) was added and s i ed a oom
empe a u e o 1h in he da k. Unde a gon a mosphe e and da kness, ano he po ion o
CuB (0.86 mg, 6 µmol) in DMSO (0.2 mL) was added and s i ed o 30 minu es. Then,
coppe was emo ed by adding a me al sca enge esin, Quad asil® Me cap op opyl (a
spa ula ip) and s i ed o 15 min a oom empe a u e. A e ha , he mix u e was
il e ed, washed wi h DMSO and he sol en was emo ed unde high acuum. The c ude
ma e ial was washed wice wi h cold dichlo ome hane and he whi e c ys als we e
dissol ed in DMF (2.2 mL). Then, a TBAF solu ion (1M THF, 55 µL) was added, he
mix u e was s i ed a . . o 2 h and he sol en was emo ed unde high acuum. The
c ude ma e ial was p ecipi a ed by adding ACN and cooled o -40ºC (ace one / N2),
washed wi h ACN and il e ed o gi e compound 46 as a whi e solid (18 mg, 46%, wo
s eps). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 10.58 (OCNH-A , b s, 1H), 8.55 (A CH, s,
1H), 8.20 (OCNHCH, b s, 1H), 7.94 (H iazole, s, 1H), 7.59-7.45 (A CH, m, 7H), 5.32
( iazole-CH2CO, b s ,2H), 4.49 (HNCH2- iazole, b s ,2H), 3.91 (SCH2, s, 2H), 3.68 –
3.47 (CH2PEG, HNCH, m, 13H, o e lapped wi h wa e signal), 3.18-3.13 (HCCCH2CH2,
m, 2H), 2.79 (HCCH2CH2, s, 1H), 1.79-1.48 (cyclohexyl, m, 5H), 1.32-1.06 (cyclohexyl,
m, 10H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ:166.2, 166.1 (CNH), 165.9 (HNCO), 164.5
(HNCO), 155.4 (NCHS), 152.8 (OCN-Ph), 146.6 (C iazole), 137.6 (A C), 136.6 (A C),
136.3 (A C), 132.0 (NCCNH), 130.4 (A C), 130.1 (A CH), 130.0 (A CH), 124.9
(CH iazole), 121.4 (A CH), 120.7 (A C), 120.5 (A CH), 113.6 (A CH), 111.8 (A CH),
83.6 (HCC), 72.4 (HCC), 70.0, 69.7 (CH2PEG), 58.0 (HCCCH2CH2), 52.6 ( iazole-
CH2CO), 48.5 (HNCH), 37.6 (SCH2), 36.0 (HNCH2-T iazole), 32.6 (cyclohexyl-CH2),
Capí ulo 8
278
25.6 (cyclohexyl-CH2), 24.9 (cyclohexyl-CH2), 23.5 (cyclohexyl-CH2), 19.7
(cyclohexyl-CH2), 19.5 (HCCCH2). ESI-MS m/z calcd. o C42H51N15O5S: 877.4 [M]+;
ound: 439.8 [M + 2H]2+, 878.4 [M + H]+. ESI-HRMS m/z calcd. o C42H52N15O5S:
878.3997; ound: 878.3991.
He e odime TLR4/7 ligand wi h amine, 47
To a solu ion o iazine 46 (24.7 mg, 0.03 mmol) and he azide ligand 20 (17.3 mg, 0.03
mmol) in DMSO (2.3 mL), CuSO4·5H2O (2.8 mg, 0.01 mmol) and TBTA (12.0 mg, 0.02
mmol) we e aded in DMSO (2.3 mL) and inally a solu ion o sodium asco ba e (8.9 mg,
0.04 mmol) in 590 µL o phospha e bu e (50 mM, pH 7.4) we e added o he mix u e.
The solu ion was s i ed a oom empe a u e o e nigh . Then, coppe was emo ed by
adding a me al sca enge esin, Quad asil® Me cap op opyl (a spa ula ip) and s i ed o
15 min a oom empe a u e. A e ha , he mix u e was il e ed, washed wi h DMSO and
he sol en was emo ed unde high acuum. The esul ing c ude was pu i ied by size
exclusion ch oma og aphy, Sephadex LH20 (DMF/MeOH, 1:1) and by semip epa a i e
RP-HPLC (C8 Phenomenex Luna column, 10 × 250 mm, 10 μm); A: Milli-Q H2O (0.05
% TFA), B: Ace oni ile; 30 o 35% linea g adien o B in o A o e 30 min, F= 3 mL/min.
The co esponding analyzed ac ions we e collec ed and lyophilized a o ding he
co esponding compound 47 (6 mg, 15%) as a whi e amo phous solid. 1H NMR (DMSO-
d6, 400 MHz) δ: 12.10 (NHTLR4, s, 1H), 10.57 (OCNH-A TLR4, b s, 1H), 10.06
(CNHCONTLR7, b s, 1H), 8.48 (OCNH-PEGTLR7, A CHTLR4, m, 2H), 8.12
(OCNHCHTLR4, H iazolTLR7, m, 2H), 7.87 (H iazolTLR4, m, 1H), 7.77 (A CHTLR7, d, J= 8.2
Hz, 2H), 7.59-7.44 (A CHTLR4, m, 7H), 7.34 (A CHTLR7, d, J= 8.2 Hz, 2H), 6.49
(NH2TLR7, b s, 2H), 5.36 ( iazole-CH2COTLR4, s, 2H), 4.90 (OCH2A TLR7, s, 2H), 4.61
Expe imen al sec ion
279
( iazole-CH2CH2TLR7, b s, 2H), 4.45 (HNCH2- iazoleTLR4, b s ,2H), 4.13
(CH3CH2CH2CH2TLR7, , J= 6.6 Hz, 2H), 3.89 (SCH2TLR4, s, 2H), 3.75 ( iazole-
CH2CH2TLR7 , m, 2H), 3.75-3.30 (CH2PEGTLR7+ iazine, HNCHTLR4, m, 43H, o e lapped
wi h wa e signal), 2.96 ( iazole-CH2CH2TLR7 , b s, 2H), 2.89 (CH2CH2NH2 iazine, b s,
2H), 1.69-1.46 (CH3CH2CH2CH2TLR7, cyclohexylTLR4, m, 7H), 1.37
(CH3CH2CH2CH2TLR7, q, J= 7.6 Hz, 2H), 1.14-1.06 (cyclohexylTLR4, m, 5H), 0.89
(CH3CH2CH2CH2TLR7, , J= 7.4 Hz, 3H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 166.5
(HNCOTLR7), 166.2, 166.1 (CNH iazine), 166.0 (HNCOTLR4), 164.4 (HNCOTLR4), 160.5
(NCNH2TLR7),155.4 (NCHSTLR4), 152.8 (OCN-PhTLR4), 152.7 (COBuTLR7), 149.6
(HNCONTLR7), 148.3 (NH2CNHCCNTLR7), 146.5 (C iazol), 140.7 (A CTLR7), 137.6
(A CTLR4), 136.7 (A CTLR4), 136.3 (A CTLR4), 134.0 (A CTLR7), 132.0 (NCCNHTLR4),
130.4 (A CTLR4), 130.1 (A CHTLR4), 130.0 (A CHTLR4), 127.9 (A CHTLR7), 127.6
(A CHTLR7), 123.3 (CH iazolTLR4/7), 121.4 (A CHTLR4), 120.7 (A CTLR4), 120.0 (A CH
TLR4), 113.7 (A CHTLR4), 110.9 (A CHTLR4), 98.8 (NH2CNHCCNTLR7), 70.1, 70.0 69.3,
69.2, 68.9, 68.4, 67.2 (CH2PEGTLR7+ iazine), 66.3 (CH3CH2CH2CH2OTLR7), 52.7 ( iazole-
CH2COTLR4), 49.7 ( iazole-CH2TLR7), 48.4 (HNCH2CH2TLR7),42.6 (CH2A TLR7), 40.9
(HNCH2- iazoleTLR4), 39.0 (HNCH2CH2TLR7), 37.4 (SCH2TLR4), 32.6 (cyclohexyl-
CH2TLR4), 31.0 (CH3CH2CH2CH2OTLR7), 25.5 (cyclohexyl-CH2TLR4), 24.9 (cyclohexyl-
CH2TLR4), 19.2 (CH3CH2CH2CH2OTLR7), 14.2 (CH3CH2CH2CH2OTLR7). ESI-MS m/z
calcd. o C67H86N24O11S: 1434.7 [M]+; ound: 479.5 [M + 3H]3+, 718.8 [M + 2H]2+,
1436.4 [M + H]+. ESI-HRMS m/z calcd. o C67H87N24O11S: 1435.6707; ound:
1435.6701. RP-HPLC R= 8.01 min (Column: analy ical BioZen, 3.6 µm, Pep ide XB-
C8; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Ace oni ile, 30 o 35% linea g adien o B in o A
o e 15 min, F= 1 mL/min).
Capí ulo 8
280
He e odime TLR4/7 ligand wi h maleimide, 48
Compound 47 (6 mg, 4.18 µmol), anhyd ous DIPEA (2.18 µL, 12.5 µmol), and 3-
maleimidop opionic acid 9 (1.41 mg, 8.36 µmol) we e dissol ed in anhyd ous DMF (1.2
mL). To his solu ion, HATU (3.18 mg, 8.36 µmol) dissol ed in anhyd ous DMF (0.3
mL) was added and s i ed a oom empe a u e o e nigh . The sol en was emo ed
unde high acuum and he c ude ma e ial was washed wice wi h MeOH yielding
compound 48 as a whi e solid (5.6 mg, 84%). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 12.08
(NHTLR4, s, 1H), 10.52 (OCNH-A TLR4, s, 1H), 10.02 (CNHCONTLR7, s, 1H), 8.52
(A CHTLR4, s, 1H), 8.45 (OCNH-PEGTLR7, s, 1H), 8.16 (OCNHCHTLR4, m, 1H), 8.12
(OCNHCH2 iazina, H iazolTLR7, b s, 2H), 7.84 (H iazolTLR4, m, 1H), 7.77 (A CHTLR7, d, J=
8.2 Hz, 2H), 7.61-7.44 (A CHTLR4, m, 7H), 7.34 (A CHTLR7, d, J= 8.2 Hz, 2H), 7.02 and
6.97 (CHmalemide, s, 2H), 6.47 (NH2TLR7, b s, 2H), 5.34 ( iazole-CH2COTLR4, s, 2H), 4.90
(OCH2A TLR7, s, 2H), 4.54 ( iazole-CH2CH2TLR7, b s, 2H), 4.44 (HNCH2- iazoleTLR4,
b s ,2H), 4.13 (CH3CH2CH2CH2TLR7, , J= 6.6 Hz, 2H), 3.90 (SCH2TLR4, s, 2H), 3.75-3.30
(CH2PEGTLR7+ iazine, m, 42H, o e lapped wi h wa e signal), 3.14 (HNCHTLR4, CH2CH2-
maleimide, m, 3H), 2.86 ( iazole-CH2CH2TLR7, b s, 2H), 2.46 (CH2CH2-maleimide, m,
2H), 1.69-1.49 (CH3CH2CH2CH2TLR7, cyclohexylTLR4, m, 7H), 1.37
(CH3CH2CH2CH2TLR7, q, J= 7.6 Hz, 2H), 1.24-1.12 (cyclohexylTLR4, m, 5H), 0.89
(CH3CH2CH2CH2TLR7, , J= 7.4 Hz, 3H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 171.2
(COmalemide), 170.0 (HNCO-malemide), 166.5 (HNCOTLR7), 166.0 (CNH iazine), 164.4
(HNCOTLR4), 163.4 (HNCOTLR4), 160.5 (NCNH2TLR7),155.4 (NCHSTLR4), 152.8 (OCN-
PhTLR4), 152.7 (COBuTLR7), 149.6 (HNCONTLR7), 148.3 (NH2CNHCCNTLR7), 140.7
(A CTLR7), 137.6 (A CTLR4), 136.7 (A CTLR4), 136.3 (A CTLR4), 135.0 (CHmaleimide), 134.0
Expe imen al sec ion
281
(A CTLR7), 131.9 (NCCNHTLR4), 130.4 (A CTLR4), 130.1 (A CHTLR4), 130.0 (A CHTLR4),
127.9 (A CHTLR7), 127.7 (A CHTLR7), 123.3 (CH iazolTLR4/7), 121.4 (A CHTLR4), 120.7
(A CTLR4), 120.0 (A CH TLR4), 113.7 (A CHTLR4), 110.9 (A CHTLR4), 98.7
(NH2CNHCCNTLR7), 70.1, 70.0, 69.3 (CH2PEGTLR7+ iazine), 66.3
(CH3CH2CH2CH2OTLR7), 52.6 ( iazole-CH2COTLR4), 49.7 ( iazole-CH2TLR7), 48.4
(HNCH2CH2TLR7), 43.2 (CH2A TLR7), (HNCH2- iazoleTLR4, HNCH2CH2TLR7, o e lapped
wi h DMSO signal), 39.0 (CH2CH2-maleimide), 37.5 (SCH2TLR4), 34.5(CONHCH2PEG),
34.4 (CH2CH2-maleimide),32.6 (cyclohexyl-CH2TLR4), 31.0 (CH3CH2CH2CH2OTLR7),
25.5 (cyclohexyl-CH2TLR4), 24.9 (cyclohexyl-CH2TLR4), 19.2 (CH3CH2CH2CH2OTLR7),
14.2 (CH3CH2CH2CH2OTLR7). ESI-MS m/z calcd. o C74H91N25O14S: 1585.7 [M]+;
ound: 530.0 [M + 3H]3+, 794.3 [M + 2H]2+, 1586.5 [M + H]+. ESI-HRMS m/z calcd. o
C74H91N25O14SNa: 1608.6796; ound: 1608.6790. RP-HPLC R= 12.60 min (Column:
analy ical BioZen, 3.6 µm, Pep ide XB-C8; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B:
Ace oni ile, 10 o 60% linea g adien o B in o A o e 15 min, F= 1 mL/min).
TLR4 Ligand dime conjuga e, 49
A solu ion o pep ide P u p 3 SH (1.2 mg, 0.54 µmol) in sodium phospha e bu e (50
mM, pH 7.4, 37 µL) and Milli-Q wa e (74 µL) was added o a solu ion o dime 38 (0.70
mg, 0.45 µmol) in DMSO (220 µL). A e shaking o ap ox. 25 min a oom empe a u e
( he p og ession o he eac ion was moni o ed by analy ical RP-HPLC), 1 ml o Milli-Q
wa e was added un il p ecipi a ion and he supe na an was emo ed. The p ecipi a e was
dissol ed in DMSO and MeOH was added un il he solu ion was cloudy. A e

Capí ulo 8
282
cen i uga ion a 4000 pm, he supe na an was concen a ed unde a low o N2. The
solu ion was dilu ed in Milli-Q wa e and lyophilized o yield conjuga e 49 as a whi e
solid (1.2 mg, 70%). ESI-MS m/z calcd.: 3800.9 [M]+; ound: 543.9 [M + 7H]7+, 761.2
[M + 5H]5+, 951.0 [M + 4H]4+, 1267.6 [M + 3H]3+. RP-HPLC R= 11.4 min (Column:
analy ical BioZen, 3.6 µm, Pep ide XB-C8; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B:
Ace oni ile, i s wo minu es wi h 10% o B, he es , 10 o 80% linea g adien o B in o
A o e 15 min, F= 1 mL/min).
TLR7 Ligand dime conjuga e, 50
A solu ion o pep ide P u p 3 SH (1.1 mg, 0.5 µmol) in sodium phospha e bu e (50 mM,
pH 7.4, 150 µL) and Milli-Q wa e (82 µL) was added o a solu ion o TLR7 ligand dime
40 (0.8 mg, 0.5 µmol) in DMSO (245 µL). A e shaking o ap ox. 25 min a oom
empe a u e ( he p og ession o he eac ion was moni o ed by analy ical RP-HPLC), only
a signal co esponding o he inal p oduc was obse ed. To emo e sal s, 1 ml o Milli-
Q wa e was added un il p ecipi a ion and a e washing wi h mo e Milli-Q wa e in a
cen i uge a 4000 pm. The p ecipi a e was lyophilized, a o ding he co esponding
conjuga e 50 as a whi e solid (1.7 mg, 88%). ESI-MS m/z calcd.: 3854.9 [M]+, ound:
552.1 [M + 7H]7+, 643.8 [M + 6H]6+, 772.3 [M + 5H]5+, 965.0 [M + 4H]4+, 1286.0 [M +
3H]3+. RP-HPLC R= 10.11 min (Column: analy ical BioZen, 3.6 µm, Pep ide XB-C8; A:
Milli-Q H2O (0.05% TFA), B: Ace oni ile; 10 o 60% linea g adien o B in o A o e
15 min, F= 1 mL/min).
Expe imen al sec ion
283
He e odime TLR4/7 ligand conjuga e, 51
A solu ion o pep ide P u p 3 SH (1.53mg, 0.68 µmol) in sodium phospha e bu e (50
mM, pH 7.4, 46 µL) and Milli-Q wa e (93 µL) was added o a solu ion o he e odime
TLR4/7 ligand 48 (0.9 mg, 0.57 µmol) in DMSO (467 µL). A e shaking o ap ox. 25
min a oom empe a u e ( he p og ession o he eac ion was moni o ed by analy ical RP-
HPLC), he eac ion mix u e was pu i ied by semip epa a i e RP-HPLC (C8
Phenomenex Luna column, 10×250 mm, 10 μm; A: Milli-Q H2O (0.05% TFA), B:
Ace oni ile; 25 o 35% linea g adien o B in o A o e 30 min, F= 3 mL/min). The
co esponding analyzed ac ions we e collec ed and lyophilized a o ding he conjuga e
51 (1.0 mg, 46%) as a whi e amo phous solid. ESI-MS m/z calcd.: 3841.9 [M]+, ound:
641.7 [M + 6H]6+, 769.7 [M + 5H]5+, 961.8 [M + 4H]4+, 1281.8 [M + 3H]3+. RP-HPLC
R= 6.90 min (Column: analy ical BioZen, 3.6 µm, Pep ide XB-C8; A: Milli-Q H2O
(0.05% TFA), B: Ace oni ile; 25 o 35% linea g adien o B in o A o e 15 min, F= 1
mL/min).
Capí ulo 8
284
8.5 Syn hesis o conjuga ed glycodend ons
Conjuga ed glycodend on 53
A solu ion o pep ide β-PRVB-SH (0.67 mg, 0.69 µmol) in Milli-Q wa e (338 µL) was
added o a solu ion o glycodend on 52 (2.60 mg, 0.63 µmol) in sodium phospha e bu e
(50 mM, pH 7.4, 476 µL). A e shaking o ap ox. 25 min a oom empe a u e ( he
p og ession o he eac ion was moni o ed by analy ical RP-HPLC), only a signal
co esponding o he inal p oduc was obse ed. To emo e sal s, he solu ion was
il e ed using an Amicon Ul a cen i ugal il e (Ul a-15, MWCO 3KDa) and a e
washing wi h Milli-Q wa e in a cen i uge a 4000 pm, he collec ed aqueous phase was
lyophilized, a o ding he co esponding conjuga e 53 as a whi e solid (3.2 mg, quan ).
ESI-MS m/z calcd.: 5091.15 [M]+, ound: 1274.2 [M + 4H]4+, 1699.3 [M + 3H]3+. RP-
HPLC R= 7.96 min (Column: analy ical BioZen, 3.6 µm, Pep ide XB-C8; A: Milli-Q
H2O (0.05% TFA), B: Ace oni ile; 15 o 60% linea g adien o B in o A o e 15 min,
F= 1 mL/min).
Expe imen al sec ion
285
Glycodend on 54
To a solu ion o mannose nona alen glycodend on IV (112 mg, 0.030 mmol) and 1-
phenyl-2-p opyn-1-one (19.3 mg, 0.15 mmol) in DMF (1.6 mL), CuSO4·5H2O (3.7 mg,
0.015 mmol) and TBTA (15.7 mg, 0.03 mmol) dissol ed in DMF (1.0 mL) and inally
sodium asco ba e (9.4 mg, 0.05 mmol) in 0.4 mL o phospha e bu e (50 mm, pH 7.4)
we e added o he mix u e. The solu ion was s i ed a oom empe a u e o e nigh . Then,
coppe was emo ed by adding a me al sca enge esin, Quad asil® Me cap op opyl (a
spa ula ip) and s i ed o 15 min a oom empe a u e. A e ha , he mix u e in DMF
was il e ed and he esul ing solu ion was di ec ly pu i ied by semip epa a i e RP-HPLC
(C18 Phenomenex Luna column, 10×250 mm, 10 μm); A: Milli-Q H2O (0.05 % TFA),
B: Ace oni ile; 18 o 25% linea g adien o B in o A o e 40 min, F= 3 mL/min. The
co esponding analyzed ac ions we e collec ed and lyophilized a o ding he
co esponding glycondend on 54 (43.5 mg, 37%) as a whi e amo phous solid. 1H NMR
(D2O, 400 MHz) δ: 8.59 (H iazole, s, 1H), 7.92 (H iazole, s, 9H), 7.88-7.38 (H iazole, A CH,
m, 5H), 7.53 (A CH, , J= 7.53 Hz, 1H), 7.39 (A CH, , J= 7.53 Hz, 2H), 4.70 (H1,
Capí ulo 8
292
µL) was added and he mix u e was s i ed in he da k a oom empe a u e o 12 h. A e
ha , he sol en was emo ed unde acuum and he esul ing c ude was pu i ied by size
exclusion ch oma og aphy, Sephadex LH20 (100% MeOH), gi ing he mannose
nona alen dend on 62 as a whi e oam (9.0 mg, 97%). 1H NMR (MeOH-d4, 400 MHz)
δ: 8.01-7.95 (H iazole, A CH, m, 14H), 7.92-7.84 (A CH, m, 2H), 6.85 and 6.71
(CHmaleimide, s, 2H), 4.70 (H1, o e lapped wi h wa e signal, 9H), 4.75-4.50 (H11, H8, H7,
m, 54H), 4.13 (H2, m, 9H), 3.90-3.78 (H2, H14, CH2CH2-maleimide, m, 30H), 3.70-3.37
(H3, H4, H6, H12, H14, H17, m, 98H). 3.32 (H5, o e lapped wi h me hanol signal, 9H),
2.64 (CH2CH2-maleimide, b s, 2H), 2.35 and 2.28 (CH3, s, 3H). 13C-NMR (100 MHz,
DMSO-d6) δ: 171.2 (COmalemide), 166.9 (NHNCO), 166.3 (A -CONH), 155.4
(CH3CNNH), 147.4 (A C), 147.2 (A C), 144.5 (C10), 144.4 (C16), 135.0 (CHmaleimide),
127.7 (A CH), 126.3 (A CH), 124.5 (C9), 124.4 (C15), 100.3 (C1), 74.6 (C5), 71.5 (C3),
70.9 (C12), 70.5 (C2), 70.2, 69.6, 69.1, (C14), 67.2 (C4), 65.4 (C7), 64.6 (C11), 61.6
(C6), 49.7 (C8), 49.1 (C13), 45.4 (C17), 40.7 (CH2CH2-maleimide), 34.0 (CH2CH2-
maleimide), 20.1 (NCH3). ESI-MS m/z calcd. o C164H258O80N40: 4070.1 [M]+; ound:
815.2 [M +5H]5+, 1018.5 [M + 4H]4+, 1357.4 [M + 3H]3+. RP-HPLC R= 8.2 min
(Column: analy ical BioZen, 3.6 µm, Pep ide XB-C8; A: Milli-Q H2O, B: Ace oni ile;
15 o 35% linea g adien o B in o A o e 15 min, F= 1 mL/min).

Expe imen al sec ion
293
Conjuga ed glycodend on 63
Pep ide P u p 3-SH (0.65 mg, 0.29 µmol) and glycodend on 62 (1.17 mg, 0.29 µmol)
we e disol ed in sodium phospha e bu e (50 mM, pH 7.4, 420 µL). A e shaking o
ap ox. 25 min a oom empe a u e, he consump ion o glycodend on 62 was moni o ed
by analy ical RP-HPLC. The solu ion was il e ed using an Amicon Ul a cen i ugal il e
(Ul a-15, MWCO 3KDa) and a e washing wi h Milli-Q wa e in a cen i uge a 4000
pm, he collec ed aqueous phase was lyophilized, a o ding he conjuga e 63 as a whi e
solid (1.7 mg, 94%). ESI-MS m/z calcd.: 6325.2 [M]+; ound: 792.1 [M + 8H]8+, 905.0
[M + 7H]7+, 1055.5 [M + 6H]6+, 1266.3 [M + 5H]5+, 1582.4 [M + 4H]4+.
8.6 E alua ion o hyd azone 62 hyd olysis a di e en pH
S udies a di e en pH we e pe o med wi h hid azone 62. Fou bu e solu ions we e
p epa ed wi h a concen a ion o 50 mM. One phospha e bu e a pH 7.4 and h ee ci a e
bu e s a pH= 3, 5 and 6. 300 µL o a s ock solu ion o hyd azone 62 in MeOH (0.5 mM)
Capí ulo 8
294
we e dilu ed 1:2 wi h each o he bu e solu ions. The solu ions we e incuba ed in a
he mos a ed ba h a 37ºC wi h s i ing. Then, 10 L o sample we e analyzed a λ= 275.6
nm by RP-HPLC (analy ical column BioZen, 3.6 µm, Pep ide XB-C8; A: Milli-Q H2O,
B: Ace oni ile; 15 o 35% linea g adien o B in o A o e 15 min, F= 1 mL/min) e e y
1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h and a e 36 h.
8.7 Biological assays
All he esul s o biological s udies o he P u p 3-adju an conjuga es desc ibed in his
doc o al hesis we e ca ied ou by he alle gology g oup o D . C is obalina Mayo ga
(Hospi al Regional Uni e si a io de Málaga).
8.7.1 Alle gic pa ien s and ole an con ols
Fo all hese s udies we e included P u p 3 (peach) alle gic pa ien s. Inclusion c i e ia
we e: clea clinical his o y o peach alle gy, a posi i e skin p ick es (SPT), and speci ic
IgE (sIgE) o P u p 3 o a posi i e o al ood challenge (OFC) o unpeeled-peach. OFC
was no pe o med in pa ien s wi h a his o y o mo e han wo episodes o anaphylaxis
a e peach inges ion in he wo yea s p eceding he s udy. A ole an con ol g oup o
subjec s wi h nega i e SPT and sIgE esul s, and good ole ance o unpeeled-peach was
also included. The s udy was conduc ed in acco dance wi h he Decla a ion o Helsinki.
The s udy was app o ed by he local e hics commi ee. All pa icipan s signed in o med
consen o ms be o e he s udy began.
8.7.2 Gene a ion o moDCs
F esh pe iphe al blood mononuclea cells, ob ained by a icoll g adien om 40 mL o
blood pe indi idual, we e used o monocy e pu i ica ion by means o an i-CD14
mic obeads ollowing he manu ac u e ’s p o ocol (Mil enyi Bio ec, Be gisch Gladbach,
Ge many). The CD14− cell ac ion was placed in 10% DMSO and ozen o a la e
lymphocy e p oli e a ion es . To gene a e DCs, monocy es (CD14+ cells) we e incuba ed
in comple e medium con aining Roswell Pa k Memo ial Ins i u e 1640 medium (The mo
Expe imen al sec ion
295
Fishe Scien i ic, Ca lslab, CA) supplemen ed wi h 10% FBS (The mo Fishe Scien i ic),
s ep omycin (100 μg/mL), and gen amicin (1.25 U/mL), as well as ecombinan human
hGM-CSF (200 ng/mL) and hIL-4 (100 ng/mL) (bo h om R&D Sys ems Inc,
Mineapolis, MN) o 5 days a 37°C and 5% CO2.
8.7.3 Fluo escen labelling o P u p 3 conjuga es
P u p 3 conjuga es we e labelled wi h Alexa Fluo 647 NHS Es e (Succinimidyl Es e )
acco ding o he manu ac u e ’s ins uc ions (The mo Fishe Scien i ic). A e 1 hou o
incuba ion wi h cons an s i ing in he da k, he uncoupled ee Alexa Fluo 647 was
emo ed by gel il a ion column (PD MiniTRap G-25 column, GE Heal hca e, Chicago,
IL) wi h PBS. The conjuga es we e concen a ed wi h Nanod op 2000 spec opho ome e
(The mo Fishe Scien i ic).
8.7.4 S udies by low cy ome y and con ocal mic oscopy
Imma u e moDCs we e cul u ed wi h 10 nM o co esponding compounds a di e en
ime poin s ( om 15 min o 48 h) a 37ºC. The moDC we e s ained wi h an i-human-
CD86 (Bec on Dickinson (BD) Be gen, NJ) and analyzed using low cy ome y. Cells
we e acqui ed in a FACSCan o II Cy ome e (BD) and da a analyzed using FlowJo®
so wa e (T ee S a , Inc., Ashland, OR). Resul s we e exp essed as mean in ensi y
luo escence (MIF) and as pe cen ages o double posi i e cells o CD86 and luo escen
conjuga es. Following incuba ion wi h he co esponding compunds a di e en ime
poin s, moDCs we e ixed in PBS con aining 4% pa a o maldehyde o 1 h, washed h ee
imes wi h PBS, and s o ed p o ec ed om ligh a 4°C un il analysis. Submemb ane ac in
and nuclei (DNA) we e labeled by 20 min incuba ions wi h 10 μM A o 488-conjuga ed
phalloidin (Sigma-Ald ich, Munich, Ge many) and 1 μg/mL Hoechs 33258 (Sigma-
Ald ich), espec i ely. Once p epa ed, moDCs we e ei he moun ed on glass slides in
Fluo oshield moun ing medium (Sigma-Ald ich) o ans e ed o op ical bo om 96-well
pla es (Nunc) in PBS o obse a ion by con ocal mic oscopy. Fo he lysosome s aining,
a e ixa ion, cells we e pe meabilized wi h saponin (0.1% in PBS wi h 2% bo ine se um
albumin V ac ion (Sigma-Ald ich) ollowed by an o e nigh incuba ion a 4°C wi h he
Capí ulo 8
296
p ima y abbi LAMP-1 (San a C uz Bio echnology, San a C uz, CA) an ibody using a
1:25 dilu ion ollowed by a 1 h incuba ion a oom empe a u e wi h a seconda y an i-
abbi Cy2- conjuga ed an ibody (Jackson Labo a o ies, Ba Ha bo , ME). Cells we e
washed h ee imes a e each an ibody incuba ion and inally moun ed on glass slides.
Samples we e analyzed using a Leica DM6000 in e ed mic oscope connec ed o a Leica
SP5 lase scanning con ocal sys em and Fiji so wa e.
8.7.5 moDC ma u a ion s udies
To assess changes in he moDC ma u a ion s a e a e s imula ion, 105 moDCs /mL we e
incuba ed in 96-well pla es (The mo-Fishe Scien i ic) wi h he co esponding
compounds. All expe imen s we e done a 10 nM (This concen a ion was shown o be
e ec i e in p elimina y expe imen s). Mo eo e , LPS (Sigma-Ald ich) was included as
posi i e con ols (100 µg/mL), and comple e medium as nega i e con ol, o 48 hou s a
37ºC in 5% CO2. A e his, moDCs we e ha es ed and hei ma u a ion s a us assessed
by analysing he exp ession o CD80, CD83, CD86 and PD-L1 molecules (BD and
Biolegend, San Diego, CA). Cells we e acqui ed in a FACSCan o II Cy ome e (BD) and
da a analyzed using FlowJo® so wa e (T ee S a , Inc). Resul s we e exp essed as
ma u a ion index (MI).
8.7.6 Speci ic p oli e a i e esponse o di e en cell subpopula ions
The speci ic p oli e a ion o di e en lymphocy e subpopula ions was e alua ed using,
as an igen p esen ing cells (APC), au ologous moDCs p e-s imula ed wi h 10 nM o
di e en expe imen al combina ions o 48 h p e iously desc ibed. P oli e a ion was
de e mined using a 5,6-ca boxy luo escein diace a e N-succinimidyl es e (CFSE)
dilu ion assay (The mo Fishe Scien i ic). A o al o 1.5x106/mL p e-labelled CD14- cells
we e cul u ed wi h di e en expe imen al combina ions-p e-s imula ed-moDC (10:1
a io) a a inal olume o 250 µL o comple e medium, in 96-well pla es o 6 days a
37ºC and 5% CO2. 10 µg/mL phy ohemaglu inin (Sigma-Ald ich) was used as posi i e
p oli e a i e con ol and uns imula ed moDCs as nega i e p oli e a i e con ol. The
p oli e a i e esponses we e assessed by low cy ome y, analyzing CFSElow exp ession
in he di e en cell subse s as lymphocy es T (CD3+T, CD4+T and CD8+T), lymphocy es
B (CD19+B) and NK cells (CD56+NK). Resul s we e exp essed as p oli e a ion index
Expe imen al sec ion
297
(PI). The PI was calcula ed o each cell subse as ([% CFSElow s imula ed PBMCs+DC]-
[% CFSElow s imula ed PBMCs)/ (% CFSElow uns imula ed PBMCs+DCs). In addi ion,
he pe cen ages o egula o y T (T eg) cells we e also e alua ed by low cy ome y,
analyzing he exp ession o he CD4+CD127-/lowCD25+FOXP3+ ma ke s.
8.7.7 Cy okine de e mina ion
To de e mine cy okine p oduc ion om he co esponding compounds o speci ic T
lymphocy es, he supe na an s om moDC (48 h o cul u e) and he lymphocy e cul u es
(6 days) we e collec ed, and cy okine p oduc ion (IL-4, IL-5, IL-10 and IFNγ) was
de e mined wi h a human P oca aPlex Mul iplex Immunoassays ki (The mo Fishe
Scien i ic), ollowing he manu ac u e ’s indica ions and de ec ed in a Bio-Plex 200 (Bio-
Rad, He cules, CA). Da a we e analyzed using Bio-Plex® Da a Analysis So wa e (Bio-
Rad, He cules, CA).
8.7.8 S a is ic
The da a we e analyzed using he Shapi o-Wilk es o de e mine he no mal dis ibu ion
bu he mos a iables we e i ed o non-pa ame ic dis ibu ion. The F iedman es was
used o ind signi ican di e ences due o he e ec s o di e en compounds be ween
subjec s om he same g oup. In he case ha he F iedman es indica ed he exis ence
o signi ican di e ences be ween ea men s, we applied Mann-Whi ney U es o
pai wise compa isons be ween un ela ed g oups and Wilcoxon signed- ank es was used
o pai wise compa isons in ela ed samples. Bon e oni co ec ion was used o educe
he h eshold o signi icance as indica ed in each s udy. The K uskal-Wallis es was used
o compa e be ween di e en g oups o subjec s (alle gic pa ien s s. ole an con ols).

Capí ulo 8
298
Appendix 1
Selec ion o spec a and ch oma og ams
Selec ion o spec a and ch oma og ams
301
Appendix 1. Selec ion o spec a and ch oma og ams
Espec o de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6, 298 K), 13C-RMN (100 MHz, DMSO-d6,
298 K) y de ESI-MS del compues o 10, según o den de apa ición.
Appendix 1
308
Espec o de 1H-RMN (400 MHz, MeOH-d4, 298 K), 13C-RMN (100 MHz, DMSO-d6,
298 K) del compues o 62, según o den de apa ición.

Selec ion o spec a and ch oma og ams
309
C oma og ama y espec o de ESI-MS del compues o 62, según o den de apa ición.
Appendix 1
310
Conjugados a pép idos ale génicos
C oma og ama y espec o de ESI-MS del conjugado 11, según o den de apa ición.
Selec ion o spec a and ch oma og ams
311
C oma og ama y espec o de ESI-MS del conjugado 12, según o den de apa ición.
Appendix 1
312
C oma og ama y espec o de ESI-MS del conjugado 13, según o den de apa ición.
Selec ion o spec a and ch oma og ams
313
C oma og ama y espec o de ESI-MS del conjugado 23, según o den de apa ición.

Appendix 1
314
C oma og ama y espec o de ESI-MS del conjugado 24, según o den de apa ición.
Selec ion o spec a and ch oma og ams
315
C oma og ama y espec o de ESI-MS del conjugado 25, según o den de apa ición.
Appendix 1
316
C oma og ama y espec o de ESI-MS del conjugado 49, según o den de apa ición.
Selec ion o spec a and ch oma og ams
317
C oma og ama y espec o de ESI-MS del conjugado 50, según o den de apa ición.
Appendix 2
324