EL SISTEMA DE SEÑALIZACIÓN DE LA
REELINA EN LA HOMEOSTASIS Y EN LA
INFLAMAMACIÓN DEL COLON
ANA ELOISA CARVAJAL VÁZQUEZ
SEVILLA, 2016
Facul ad de Fa macia
EL SISTEMA DE SEÑALIZACIÓN DE LA
REELINA EN LA HOMEOSTASIS Y EN LA
INFLAMACIÓN DEL COLON
Tesis p esen ada pa a op a al g ado de Doc o po la Uni e sidad de
Se illa po :
Ana Eloisa Ca ajal Vázquez
DIRECTORAS:
D a. Mª Luisa Calonge
D a. Mª José Pe al
Depa amen o de Fisiología
Facul ad de Fa macia
Dña. MªLUISA CALONGE CASTRILLO y Dña. MARÍA JOSÉ PERAL RUBIO, P o eso as
Ti ula es de Uni e sidad del Depa amen o de Fisiología de la Facul ad de Fa macia de la
Uni e sidad de Se illa,
CERTIFICAN:
Que Dña. Ana Eloisa Ca ajal Vázquez, Licenciado en Biología, ha ealizado, bajo su
di ección en el Depa amen o de Fisiología de la Facul ad de Fa macia de la Uni e sidad
de Se illa, la Tesis que lle a po í ulo “EL SISTEMA DE LA REELINA EN LA
HOMEOSTASIS E INFLAMACIÓN DEL COLON” pa a op a al g ado de Doc o po la
Uni e sidad de Se illa.
Y pa a que así cons e, i man el p esen e ce i icado en Se illa a 10 de mayo de 2016
Mª Luisa Calonge Cas illo Ma ía José Pe al Rubio
Es e abajo ha sido inanciado po la Jun a de Andalucía, “P oyec o de In es igación de
Excelencia” (CTS-5884), y con una Beca p edoc o al de Fo mación del Pe sonal
In es igado adsc i a a es e p oyec o.
A mis pad es
y he manos

Ag adecimien os
T as es os años de abajo, me gus a ía exp esa mi ag adecimien o a odas las pe sonas
que han es ado a mi lado du an e la ealización de es e p oyec o:
A mis di ec o as de Tesis, las D as. Mª Luisa Calonge y Ma ía José Pe al, y a la
esponsable de g upo de in es igación la Ca ed á ica Ana Ilundáin, po habe me o ecido
la opo unidad de abaja en su g upo de in es igación y po la dedicación, paciencia y
ca iño que me han o ecido du an e mi o mación p edoc o al.
A mis compañe os del g upo de in es igación, José Manuel Se ano, el D . Pablo
Ga cía y, en especial, la D a. Lola Vázquez, po su compañe ismo en el abajo dia io, su
apoyo, consejo y amis ad. Al es o del p o eso ado del Depa amen o y compañe os de
labo a o io con los que he enido la sue e de coincidi po el buen a o y ca iño ecibido.
A F ancisco F ie as, écnico de labo a o io, po su buena disposición.
Al ca ed á ico Fe mín Sánchez de Medina del Depa amen o de Fa macología de la
Uni e sidad de G anada po su consejo y o ien ación en la écnica de inducción de coli is
en a ones. A la D a. Mª del Reposo Ramí ez del Ins i u o de Biomedicina de Se illa po
su ayuda en los ensayos de me ilación del p omo o de la Reelina. A odos aquellos que
me han mos ado su conocimien o y aseso amien o en di e en es écnicas, en especial a
los compañe os del Depa amen o de Fa macología de la Facul ad de Fa macia.
Al ca iño y o ien ación de Flo encio Rojo.
Y sob e odo a mis pad es, Ca men y Nicomedes, a mis he manos, É ica y Rubén, a
odos mis amigos y mis compañe os de yoga y baile po su amo , apoyo y ánimo dia ios.
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….
1
Mo ología del colon……………………………………………………….
3
Epi elio…………………………………………………………………………………………
3
Colonoci os………………………………………………………………………………
4
Células calici o mes o Goble s…………………………………………………….
4
Células en e oendoc inas…………………………………………………………..
5
Células b ush o ca eoladas…………………………………………………………
5
Células M…………………………………………………………………………………
6
Uniones in e celula es……………………………………………………………………
6
Uniones es echas……………………………………………………………………..
7
Uniones adhe en es…………………………………………………………………..
8
Desmosomas…………………………………………………………………………….
8
Lámina p opia………………………………………………………………………………
8
P incipales ías de señalización implicadas en la
homeos asis del epi elio del colon…………………………………….
10
Vía Wn ………………………………………………………………………………………..
11
Vía No ch……………………………………………………………………………………..
11
Vía Hedgehog……………………………………………………………………………….
12
Vía TGFβ/BMP…………………………………………………………………………….
12
En e medades in lama o ias in es inales………………………….
13
Sis ema de señalización de la Reelina……………………………….
14
Regulación de la ansc ipción de la Reelina……………………………………
17
Implicación de la Reelina en p ocesos pa ológicos y en la
egene ación isula ……………………………………………………………………….
19
MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………..
23
Animales de expe imen ación………………………………………….
23
Apa a os………………………………………………………………………..
23
Reac i os……………………………………………………………………….
24
Geno ipado de a ones……………………………………………………
26
Ma e ial biológico empleado…………………………………………..
26
Ob ención de la capa mucosa y muscula del colon de a ón……………..
26
Aislamien o de acciones celula es del colon de a ón……………………..
27
Ob ención de los ex ac os p o eicos……………………………………………….
28
De e minación de la concen ación de p o eína………………..
28
P epa ación de las mues as biológicas pa a su obse ación
al mic oscopio………………………………………………………………..
28
Mic oscopio óp ico………………………………………………………………………..
28
Mic oscopio elec ónico de ansmisión………………………………………….
29
Análisis mo omé ico…………………………………………………….
29
Inmunohis oquímica………………………………………………………
29
Inmunohis oquímica en células aisladas…………………………………………
30
Inmunohis oquímica en ejido……………………………………………………….
31
Medidas de p oli e ación y mig ación celula ……………………
32
Medidas de apop osis celula …………………………………………..
33
De ección de las células calici o mes………………………………..
34
Análisis de Wes e n Blo …………………………………………………
34
Reacción en cadena de la polime asa en iempo eal………….
35
PCR especí ica de me ilación (MSP) y secuenciación
genómica……………………………………………………………………….
37
Inducción de la in lamación…………………………………………….
39
E aluación de la in lamación…………………………………………..
40
Indice de la ac i idad de la en e medad…………………………………………..
40
Análisis mac oscópico del in es ino………………………………………………..
41
Análisis his ológico del colo……………………………………………………………
41
Medida de la ac i idad de la mielope oxidasa………………………………….
41
Ni eles de exp esión de ma cado es de la in lamación……………………..
42
P esen ación de los esul ados y análisis es adís icos……………………….
42
RESULTADOS………………………………………………………………
45
El sis ema de señalización de la Reelina en el colon de a ón
45
Exp esión de los genes Reelina y Dab1 en ce eb o e in es ino de a ón
45
Exp esión de los genes Reelina y Dab1 en el colon de a ón en unción
de la edad……………………………………………………………………………………..
46
Exp esión de los genes Reelina, Dab1, VldlR y ApoER2 en células
aisladas del colon…………………………………………………………………………..
47
Inmunolocalización de las p o eínas Reelina, Dab1, VldlR y ApoER2
en células aisladas del colon……………………………………………………………
49
E ec o de la mu ación del gen Reelina sob e el colon de
a ón…………………………………………………………………………………………..
51
4
In oducción
selec i o, que pe mi e el paso de sus ancias desde el lumen a la ci culación. Se pensaba que
las células de la supe icie es aban especializadas en la abso ción y las de las c ip as en la
sec eción, sin emba go, se ha demos ado que ambas ealizan unciones abso i as y
sec e o as y p esen an una amplia can idad de canales e in e cambiado es iónicos (Geibel,
2005). Las células p esen es en el epi elio del colon son:
Colonoci os
Son las células más abundan es en el epi elio del colon, jun o con las células
calici o mes. Los colonoci os es án especializados en la abso ción de agua y sales mine ales
y además pueden abso be algunos nu ien es como i aminas hid osolubles ( e e isión
Said, 2011). Son células mo ológica y uncionalmen e pola izadas. En su dominio apical
p esen an mic o ellosidades mien as que la memb ana basola e al es lisa ( e e isión
Noah y cols., 2011). Las p o eínas anspo ado as y canales p esen es en la memb ana
apical di ie en de los p esen es en la basola e al, lo que pe mi e el anspo e ec o ial
ansepi elial de agua y solu os. Los colonoci os madu os exp esan la enzima anhid asa
ca bónica 1 (AC-1), esponsable de ca aliza la con e sión del ácido ca bónico en
bica bona o y p o ón y que se u iliza como ma cado de los colonoci os (Sowden y cols.,
1993).
Células calici o mes o Goble
Es án si uadas en e los colonoci os y son las células sec e o as más abundan es en
el epi elio del colon. Cons i uyen ap oximadamen e el 50% del o al de células del epi elio.
Su unción es sin e iza y sec e a moco, el cual o ma un gel con inuo en la supe icie
in es inal, cons i uyendo uno de los componen es cla e de la p ime a línea de de ensa
en e a pa ógenos ( e e isión de Noah y cols., 2011). El moco es á o mado po mucinas,
que son glicop o eínas hid osolubles de al o peso molecula , agua, elec oli os,
inmunoglobulinas y pép idos “ e oil” (Schmi z y cols., 2013). En el colon, es a capa de
moco es á subdi idida en dos: una in e na, en con ac o di ec o con las células calici o mes,
que ac úa como ba e a en e a la en ada de pa ógenos, y o a ex e na, donde habi a la
mic o lo a bac e iana. El componen e undamen al del moco en el colon es la mucina de
ipo 2 (Muc2), siendo un ma cado de células calici o mes madu as ( e e isión
Johansson y Hansson, 2013). Recien emen e se ha demos ado que es a mucina egula la
exp esión po las células epi eliales de la β-de ensina 2, impo an e en la de ensa en e a

5
In oducción
las bac e ias (Cobo y cols., 2015). La p oducción y sec eción del moco así como la
p oli e ación de las células calici o mes es inducida en pa e po la p esencia y ipo de
mic o lo a en el colon. El moco desempeña unciones di e sas: i) ac úa como ba e a
ísico-química en e el lumen y el epi elio p o egiendo a és e de daños ísicos p oducidos
po el con enido in aluminal e impidiendo el con ac o di ec o de ag egados
mac omolecula es y pa ículas con las mic o ellosidades, ii) egula la hid a ación del
epi elio, iii) p o ege de la in asión de bac e ias y i us y i ) colabo a en el p oceso de
ecupe ación del epi elio as una lesión. Se ha demos ado además que las células
calici o mes pa icipan en la espues a inmunológica ya que son capaces de in e naliza
sus ancias y p esen a las a las células dend í icas de la lámina p opia ( e e isión Selle s
y Mo on, 2014).
Células en e oendoc inas
Cons i uyen una población compleja de células sec e o as dis ibuidas a lo la go de
las c ip as del colon. Son econocidas po nume osos ma cado es en e los que des aca la
c omog anina A, p o eína sec e o a neu oendoc ina ( e e isión Rindi y cols., 2004), que
es almacenada y libe ada jun o con ca ecolaminas y que, además, puede unciona como
una p o-ho mona capaz de gene a a ios pép idos biológicamen e ac i os (D´amico y
cols., 2014). Aunque ep esen an menos del 1% de las células del epi elio, p oducen g an
a iedad de pép idos y ho monas que egulan la mo ilidad, el ape i o y el me abolismo de
la glucosa. En el colon exis en, al menos, dos ipos de células en e oend oc inas: las células
L que p oducen, en e o os, GLP-1 (glucagon-like pep ide-1) y el pép ido i osina- i osina
y las células en e oc oma ines, que seg egan p incipalmen e se o onina ( e e isión May
y cols., 2010).
Células b ush o ca eoladas
Es as células ue on desc i as po p ime a ez en el ac o gas oin es inal de a ón
po Ja i y Key ilainen (1956). En el epi elio del colon se encuen an aisladas a lo la go de
oda la c ip a y en la supe icie epi elial.
Han ecibido di e en es nomb es, odos elacionados con su mo ología, así se
denominan células u , ca eoladas, ib ilo esicula es y b ush. Son células pola izadas que
p esen an un g an núme o de in aginaciones del ipo de las ca eolas y la gas
mic o ellosidades en su bo de apical, mic o ilamen os ci osólicos y un sis ema
6
In oducción
úbulo esicula abundan e. Las células b ush p esen an analogía es uc u al con las
células ecep o as de los bo ones gus a i os ya que en sus mic o ellosidades exp esan
p o eínas ecep o as del gus o y ambién p esen an p o eínas e ec o as de la ansducción,
como la p o eína G, α-gus ducina ( e e isión Ge be y cols., 2012). Además sec e an
eicosanoides como la p os aglandina D2 (PGD2), son la p incipal uen e de opioides y las
únicas células que exp esan enzimas ciclooxigenasas 1 y 2 (COX 1 y 2) (Schü z y cols.,
2015).
Células M
Las células M ambién llamadas células memb anosas se encuen an en el ejido
lin oide asociado al in es ino, e is iendo los olículos lin oides y las placas de Peye . La
mo ología y abundancia de es as células a ía según la especie animal y el ó gano donde
se localizan. Las células M es án especializadas en cap a an ígenos (p o eínas, bac e ias,
i us) de la luz in es inal y anspo a los po ansci osis hacia la submucosa, donde son
p esen ados a los lin oci os, mac ó agos y células dend í icas pa a inicia la espues a
inmune. Las células M in e nalizan los an ígenos po agoci osis, endoci osis dependien e
de cla ina o pinoci osis y man ienen la an igenicidad de los mismos g acias a que poseen
escaso núme o de lisosomas. En el homb e las células M del colon p esen an una
memb ana basola e al con in aginaciones, siendo es a zona donde se si úan las células
inmuni a ias in il adas ( e e isión Mille y cols., 2007).
Uniones in e celula es
Las uniones en e las células del epi elio in es inal son de conexión y de
comunicación. Las uniones de conexión p esen es en la memb ana la e al de las células
son: las uniones es echas, las adhe en es y los desmosomas. Todas es as uniones es án
o madas po p o eínas ansmemb ana, que po su ex emo ex acelula con ac an con
las p o eínas de células con iguas y po el ex emo ci osólico se unen al ci oesquele o. Las
uniones es echas y adhe en es con ac an con los ilamen os de ac ina del ci oesquele o,
mien as que los desmosomas se unen a los ilamen os in e medios (Figu a 3). El
ensamblaje de es as uniones es esencial pa a la in eg idad es uc u al del epi elio
in es inal. La al e ación de las uniones puede ene g a es consecuencias ales como
dia ea, edema e in ección y con ibuyen al desa ollo de en e medades in lama o ias
in es inales. Las uniones in e celula es no son es uc u as es á icas, sino que ep esen an
7
In oducción
mic o-dominios al amen e dinámicos, los cuales esponden a señales an o in a- como
ex a-celula es modi icando su composición y unción ( e isiones Gassle y cols., 2001;
Capaldo. y cols., 2014).
Figu a 3. Esquema de las uniones in e celula es de la memb ana la e a del epi elio
in es inal (esquema adap ado po Laukoe e y cols. 2008).UE: unión es echa; JAM: moléculas
de adhesión in e celula .
Uniones es echas: se localizan en la zona más apical del epi elio. Sus unciones
mejo es udiadas son el es ablecimien o y man enimien o de la pola idad celula y la
egulación de la pe meabilidad pa acelula , ac uando como p ime a línea de de ensa al
con ola selec i amen e el paso de sus ancias. Es án o madas po p o eínas
ansmemb ana en e las que se incluyen: ocludinas, claudinas, moléculas de adhesión
in e celula (JAM) y icelulinas. Las claudinas pa ecen se las esponsables de de e mina
y egula la pe meabilidad pa acelula . El ex emo ci osólico de las p o eínas
ansmemb ana se une al ci oesquele o de ac ina a a és de las p o eínas ZO (zonula
occludens) 1, 2 y 3, en e o as. A su ez los ilamen os de ac ina es án unidos a ilamen os
8
In oducción
de miosina que cuando se ac i an desencadenan la con acción y ape u a de la ía
pa acelula . En el in es ino las p o eínas de la unión es án eguladas po di e sos ac o es
que pueden a ec a a su in eg idad y uncionamien o, en e ellos las ci oquinas
in lama o ias como el ac o de nec osis umo al α (TNF-α) y la in e leucina 1β (IL-1β), y
los ac o es de c ecimien o, como el ac o de c ecimien o ans o man e β (TGFβ) y ac o
de c ecimien o epidé mico (EGF) ( e e isión Lee, 2015). Pa icipan ambién en la
egulación de los p ocesos de p oli e ación y di e enciación celula (Shin y cols., 2006).
Uniones adhe en es: se si úan po debajo de las uniones es echas, ijan
mecánicamen e las células ecinas median e la unión del ci oesquele o. Pa icipan en el
man enimien o de la in eg idad del epi elio, de la pe meabilidad pa acelula y de la o ma
y pola idad celula . En es e ipo de uniones las p o eínas ansmemb ana son las
cadhe inas, glicop o eínas cuya adhesión ex acelula depende de calcio. El ex emo
in acelula de las cadhe inas se une a p o eínas ci oplasmá icas de la amilia de las
ca eninas (p120, α-ca enina y β-ca enina), las cuales se unen al ci oesquele o de ac ina. La
E-cadhe ina y la β-ca enina es án implicadas en la egulación de la p oli e ación y
di e enciación celula y sus ni eles ci osólicos es án egulados po la ía de señalización
Wn ( e e isión Rudini y Dejana, 2008).
Desmosomas: P opo cionan una ue e unión en e células con iguas, ya que
ac úan como un nexo en e ellas y los ilamen os in e medios del ci oesquele o. Las
p o eínas ansmemb ana que pa icipan son la desmogleína y la desmocolina, ambas
pe enecien es a la amilia de las cadhe inas. Los ex emos ci osólicos se unen a una placa
ci oplasmá ica, compues a po un complejo de p o eínas de anclaje in acelula , que se
unen al ci oesquele o. Además pa icipan en la egulación de los p ocesos de p oli e ación
y mig ación celula ( e e isión Ga od y Chidgey, 2008).
Lámina p opia
Es un ejido conec i o laxo, que se ex iende en e las c ip as. La lámina p opia
p opo ciona un sopo e pa a el epi elio y con iene los asos sanguíneos y lin á icos, las
ib as ne iosas y muscula es lisas, y células mesenquimales como pe ici os, ib oblas os
y mio ib oblas os y o os ipos celula es como lin oci os y células dend í icas (Figu a 4).
9
In oducción
Figu a 4. Rep esen ación esquemá ica del epi elio y de las células mesenquimales de
la lámina p opia en la mucosa de colon (esquema adap ado de Mi lin y cols., 2011). Co e
ans e sal de las c ip as. MB: Memb ana basal; CE: célula endo elial; Epi: epi elio; FB: ib oblas o;
L: aso lin á ico; MF: mio ib oblas o; P: pe ici os; VS: aso sanguíneo.
Los mio ib oblas os subepi eliales se localizan jus o po debajo de la memb ana basal
que sepa a las células epi eliales de la lámina p opia. Fo man un sinci io idimensional
bajo el epi elio supe icial o odeando las c ip as, po lo que es os úl imos son llamados
ib oblas os pe ic íp icos. Poseen ca ac e ís icas mo ológicas y uncionales de
ib oblas os y de células de músculo liso. Así, po ejemplo, exp esan p o eínas como la α-
ac ina del músculo liso (α-SMA), conside ada el mejo ma cado de los mio ib oblas os
subepi eliales. Sec e an p o eínas de la ma iz ex acelula además de di e en es
ci oquinas, quimoquinas, ho monas, neu o ansmiso es, p o eínas de adhesión, ac o es
de c ecimien o y mediado es de la in lamación. Los mio ib oblas os ambién exp esan
ecep o es pa a muchos de esos ligandos, lo que les pe mi e media in o mación pa ac ina
en ambas di ecciones: hacia y desde las células epi eliales, el sis ema inmune y o as
células mesenquimales de la lámina p opia. De es a mane a con olan la homeos asis del
epi elio in es inal e in e ienen en p ocesos in lama o ios e inmunológicos, así como en la
p o ección, emodelación, egene ación y epa ación de lesiones de la mucosa in es inal
(Andoh y cols., 2005; e e isiones de Powell y cols., 2005; Mi lin y cols., 2011).

10
In oducción
Nues o g upo de in es igación demos ó po p ime a ez que los mio ib oblas os
subepi eliales del in es ino delgado del a ón y a a ambién p oducen la p o eína Reelina
(Ga cía-Mi anda y cols., 2010 y 2012) y que és a egula la homeos asis c ip a- ellosidad
(Ga cía-Mi anda y cols., 2013).
PRINCIPALES VÍAS DE SEÑALIZACIÓN IMPLICADAS EN LA
HOMEOSTASIS DEL EPITELIO DEL COLON
Se han iden i icado y es udiado nume osas moléculas y ías de señalización que
a ec an a los p ocesos de p oli e ación, mig ación, di e enciación y apop osis del epi elio
del colon. En e las ías de señalización podemos des aca las ía de Wn , No ch, Hedgehog
y la del ac o de c ecimien o ans o man e β (TGFβ) /p o eína mo ogené ica del hueso
(Bmp) (Figu a 5). Los mecanismos molecula es po los que ocu en es os p ocesos no son
bien conocidos y aún menos los implicados en los p ocesos de in lamación, egene ación y
cánce de colon. Es as u as de señalización no son independien es unas de las o as sino
que in e accionan en e sí lo que pe mi e una comple a egulación de la homeos asis
epi elial ( e e isiones Be and y cols., 2012; Jeon y cols., 2013).
Figu a 5. Rep esen ación esquemá ica de las p incipales ías de señalización
implicadas en la homeos asis de la c ip a del colon. Las lechas indican los g adien es de
ac uación de las ías. (Esquema adap ado de Be and y cols., 2012).
11
In oducción
Vía Wn
La ía de señalización Wn es la p incipal ía de ac i ación de la p oli e ación y
di e enciación de las células mad e de la c ip a en el colon adul o.
La ía de señalización Wn incluye dos posibles u as, la canónica y la no canónica.
La u a no canónica es independien e de β-ca enina y u iliza di e en es mecanismos de
señalización como espues a a la señal Wn . La u a canónica es dependien e de β-
ca enina, siendo la u a esencial en la egulación de la p oli e ación celula in es inal. En
ella, el ligando Wn se une al complejo o mado po los ecep o de memb ana, F izzled, y
los ecep o es de lipop o eínas de baja densidad. La ac i ación del complejo ecep o
conduce a la inhibición del complejo APC (Adenoma osis Polyposis Coli) y a la
acumulación de β-ca enina en el ci oplasma. La β-ca enina iaja al núcleo, donde ac i a
ac o es de ansc ipción celula de los genes diana de Wn , como po ejemplo, c-Myc,
ciclina D, E ina B, ecep o es de e ina B, SOX9 (“SRY-box con aining gene 9”) y Cdx-2
(“caudal ype homeobox 2”).
En ausencia del ligando Wn , las β-ca eninas ci oplasmá icas son deg adadas po el
complejo mul ip o eico o mado po APC y cinasas, cuya unción es ma ca , median e
os o ilación, a las β-ca eninas pa a su ubiqui inación y ápida deg adación median e
p o eosomas.
También se ha desc i o que Wn pa icipa en la di e enciación de los colonoci os a
a és de la os o ilación e inhibición del ac o de ansc ipción A oh-1 (“P o ein a onal
homolog 1”) (pe enecien e a la ía No ch), y jun o con la ía TGFβ/Bmp es á implicada en
la o mación de las c ip as ( e e isión Noah y cols., 2011). Es udios ecien es demues an
que es a ía es á in oluc ada ambién en los p ocesos de egene ación isula ( e
e isiones Yang y cols., 2014; Sebio y cols., 2014; K auso a y Ko inek, 2014).
Vía No ch
La ía de señalización No ch es la p incipal ía de egulación de la di e enciación de
las células de la c ip a en el colon adul o. No ch1, No ch2, Dll1 y Dll4 son los ecep o es y
ligandos que se exp esan en el epi elio in es inal. La unión ligando- ecep o esul a en una
cascada p o eolí ica que libe a el dominio in acelula de No ch, el cual se anspo a al
12
In oducción
núcleo ac i ando la exp esión de genes como Hes-1 (“Hai y and enhance o Spli 1”) y
Ol m4 (Ol ac omedina 4).
La ac i ación de Hes-1 p oduce una disminución de A oh1 y que las células no
di e enciadas se di e encien hacia células abso i as o colonoci os. Una ep esión de Hes-
1 aumen a la ac i idad de A oh1, y el des ino celula es hacia el desa ollo de células
sec e o as como las calici o mes, en e oendoc inas y u s.
La ía No ch pa icipa ambién en la p oli e ación y supe i encia de las células
mad e a a és de la ac i ación del gen Ol m4. Es a ía es á implicada en la mayo ía de los
cánce es de colon y en las en e medades in lama o ias ( e e isiones Be and y cols.,
2012; Jeon y cols., 2013; Noah y Sh oye , 2013).
Vía Hedgehog
La ía de Hedgehog es undamen al en la o mación del sis ema ne ioso en é ico y
de la capa muscula du an e el desa ollo emb iona io del colon. Su unción p incipal es la
di e enciación de las células mesenquimales en células muscula es, mio ib oblas os y
pe ici os, egulando la homeos asis del mesénquima.
La unión de los ligandos Hedgehog a los ecep o es Pa ched libe a la p o eína
Smoo hened, que se inse a en la memb ana y ac i a la anslocación al núcleo de los
ac o es de ansc ipción Gli, los cuales p omue en la p oli e ación y di e enciación
celula . En ausencia de ligandos, los ecep o es Pa ched inhiben la señal aducida po el
ecep o Smoo hened.
La ía Hedgehog inhibe de o ma pa ac ina la ía Wn en las células de la c ip a,
egulando la o mación de la c ip a.
Se ha demos ado que la señalización de es a ía disminuye cuando se p oduce daño
isula y aumen a du an e la ase de epa ación, lo que indica que la ía Hedgehog iene
una unción impo an e en la egene ación del epi elio in es inal. ( e e isiones Bülle y
cols., 2012; Be and y cols., 2012; Jeon y cols., 2013).
Vía TGFβ/BMP
La señalización de la supe amilia de ac o es de c ecimien o ans o man es ipo β
(TGFβ) egula el desa ollo emb iona io, la cica ización de he idas, la p oli e ación y la
13
In oducción
di e enciación celula . La supe amilia TGFβ cons a de ci oquinas, como la iso o ma TGFβ,
de la p o eína mo ogené ica del hueso (BMP) y de ac i inas.
La unión de los ligandos a sus ecep o es se ina/ eonina quinasa os o ila a los
ac o es de asc ipción Smad (BMP os o ila p incipalmen e a Smad 1,5 y 8 y TGFβ a Smad
2 y 3), los cuales o man un complejo con Smad -4 que se aslada al núcleo y egula la
asc ipción y la exp esión de sus genes diana, con olando así el desa ollo in es inal.
La ía Bmp an agoniza a la ía Wn /β-ca enina, po lo que pa icipa jun o a és a en
la egulación de la o mación de la c ip a y de la p oli e ación celula . Mu aciones en la ía
Bmp a o ece la p og esión del cánce y de en e medades como la poliposis in es inal
ju enil, demos ando su papel inhibi o io en la p oli e ación celula ( e e isiones Noah
y cols., 2011; Be and y cols., 2012; Jeon y cols., 2013).
ENFERMEDADES INFLAMATORIAS INTESTINALES
Las en e medades in lama o ias in es inales cons i uyen un p oblema sani a io cuya
incidencia ha ido inc emen ándose en los úl imos años. P incipalmen e incluye dos
pa ologías: la en e medad de C ohn y la coli is ulce osa. La en e medad de C ohn puede
cu sa con una in lamación ansmu al y a ec a a cualquie pa e del ac o
gas oin es inal, aunque suele se más común en el íleon o en la egión pe ianal. Po o o
lado, la coli is ulce osa cu sa con una in lamación de la mucosa limi ada a la egión del
colon. Aunque la e iología de las en e medades in lama o ias in es inales es á oda ía po
de e mina , es udios ecien es indican que se debe a la in eg ación de dis in os ac o es,
ales como la suscep ibilidad gené ica, las condiciones ambien ales ex e nas, la lo a
mic obiana in es inal y la espues a inmune ( e e isión Zhang y Li, 2014). Es udios
ecien es han iden i icado una g an a iedad de genes asociados a las en e medades
in lama o ias in es inales (Jos ins y cols., 2012).
Du an e las dos úl imas décadas la mayo ía de los es udios sob e la espues a
inmuni a ia en las en e medades in lama o ias in es inales se han cen ado en la espues a
inmune adap a i a, sin emba go, las in es igaciones más ecien es lo hacen en la espues a
inmune inna a de la mucosa du an e la in lamación aguda o en la p ime a ase de la
in lamación c ónica. En es e ipo de espues a desempeña una unción undamen al la
ba e a in es inal que o ma el epi elio, el moco que ecub e el epi elio, los
en e oci os/colonoci os y las células especializadas en la de ensa e in lamación como las
células de Pane h y los neu ó ilos ( e e isión Zhang y Li, 2014).
20
In oducción
Nues o g upo de in es igación iden i icó po p ime a ez los componen es del
sis ema de señalización de la Reelina (Reelina, VldlR, ApoER2 y Dab1) en el in es ino
delgado de a a y a ón y demos ó que las p o eínas Reelina y Dab1 es án implicadas en
la dinámica del eje c ip a- ellosidad. O os esul ados obse ados en los a ones eele
(de icien es en Reelina) mos aban: i) al e aciones en la mo ología de la mucosa del
in es ino delgado obse ándose mayo anchu a de las uniones adhe en es, lo que pod ía
pe mi i el acceso de an ígenos de la luz in es inal; ii) una disminución en el núme o de
células Pane h, que educi ía la de ensa an imic obiana in es inal; y iii) a iaciones en la
exp esión de genes implicados en la espues a inmune e in lamación. Todo ello nos hizo
pensa que la Reelina pod ía ene una unción en las pa ologías in es inales.
Po lo an e io men e expues o, el obje o del p esen e abajo es es udia la exp esión,
unción y egulación del sis ema de señalización de la Reelina en la mucosa del colon
no mal e in lamado de a ón, de acue do con el siguien e plan de abajo:
1. Exp esión de los genes Reelina, Dab1, VldlR y ApoER2 en la mucosa del colon de
a ón, y el e ec o de la edad en dicha exp esión.
2. Localización de las p o eínas Reelina, VldlR, ApoER2 y Dab1 en las células de la
mucosa del colon de a ón.
3. Análisis de la mo ología y homeos asis de la mucosa del colon de a ón en
p esencia y ausencia de la Reelina.
4. E ec o de la ausencia de la Reelina en la exp esión de los genes SOX9, Ciclina D1,
Cdx-2, Smad5, Hes-1 y A oh-1 en el colon de a ón.
5. E ec o del a amien o con un agen e in lama o io en la exp esión de Reelina, Dab1,
VldlR y ApoER2.
6. Análisis del g ado de in lamación en el colon de a ones con ol y eele .
7. E ec o de la in lamación en la exp esión de los genes SOX9, Ciclina D1, Cdx-2,
Smad5, Hes-1 y A oh-1 en el colon de a ones con ol y eele .
8. Regulación de la exp esión de la Reelina en el colon de a ón du an e la in lamación.

MATERIALES Y MÉTODOS
23
Ma e iales y Mé odos
ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
Se han u ilizado a ones de la cepa C57BL/6J y a ones con ol ( ipo sal aje) y eele
(mu an e) de la cepa B6C3Fe/J.
Los a ones de la cepa C57BL/6J p ocedían del Cen o de P oducción y
Expe imen ación animal de la Uni e sidad de Se illa (Espa inas) y las pa ejas de a ones
he e ocigó icos pa a el gen de la Reelina ( l+/ l-) (cepa B6C3Fe/J) de los Labo a o ios
Jackson (Es ados Unidos), a a és de los Labo a o ios Cha les Ri e (España). Los
a ones homocigó icos pa a la mu ación ( l-/ l-) se ob u ie on median e el c uce de
pa ejas de he e ocigó icos en el animala io de la Facul ad de Fa macia de la Uni e sidad
de Se illa. La cepa de a ones mu an es pa a el gen de la Reelina u ilizada ue la
“Edinbu gh”, que posee una deleción de 150 kb, de mane a que al ansc ibi se el gen de
la Reelina se o igina un ARN mensaje o que posee una deleción de 8 kb en el ex emo 3’
de las 12 kb de las que cons a, no pudiendo se de ec ado ni el ARN mensaje o ni la p o eína
(D’A cangelo y cols., 1996, Royaux y cols., 1997).
Los animales se man u ie on con ciclos de luz-oscu idad de 12 ho as, en condiciones
adecuadas de empe a u a y humedad en el animala io de la Facul ad de Fa macia de la
Uni e sidad de Se illa, con lib e acceso al agua y al pienso. El pienso u ilizado ue Global
Roden Die pa a los a ones C57BL/6J y pienso ex usionado Global 2019 pa a los a ones
ansgénicos, ambos de Ha lan Ibe ica S.L.
Las edades de los a ones ue de 16 días, 1, y 3 meses.
El sac i icio de és os se ealizó de acue do a las no mas é icas de expe imen ación
con animales 86/609/EEC del Consejo Eu opeo, median e dislocación ce ical.
APARATOS
Pa a la ealización del p esen e abajo se han empleado los siguien es apa a os:
 Agi ado de balanceo (Heidolph, Duomax 1030)
 Au ocla e (Selec a, Au es e -E)
24
Ma e iales y Mé odos
 Baño e mo egulable (Selec a, P ecisdig)
 Cabina de lujo lamina (Mic o low, 25674)
 Cáma a de o os digi al (SPOT Insigh V 3.5)
 Cáma a de o os manual (POLAROID, DS34)
 Campana ex ac o a (CRUMA, 870)
 Cen í uga e ige ada (Beckman, J2-21) con o o JA-17
 C ios a o (Leica, CM 1510 S)
 Cube a de elec o o esis pa a geles de ac ilamida (Bio-Rad, Mini T ans-Blo
Cell)
 Cube a de elec o o esis pa a geles de aga osa (Sigma-Ald ich, SHU6)
 Espec o o óme o (Hi achi, U-2001)
 Es u a digi al (Selec a, Digi hea , 2001242)
 Fuen es de alimen ación Powe -Pac 200, Powe -Pac 300 y Powe -Pac 3000
(Bio-Rad)
 Homogeneizado Poli ón (Ys al, T-1500)
 Incubado a con agi ación o bi al (Inno a 4000, 152)
 Lámpa a de luz ul a iole a (CE, TFX-20M)
 Lec o de placas (ASYS, UVM 340)
 Mic ocen í uga (Eppendo , 5415C)
 Mic oscopio elec ónico (Philips, CM-10)
 Mic oscopio óp ico (Axioskop 40, Ca l Zeiss)
 Mic o omo (His o-line Labo a o ies, MR 2258)
 pHme o (HANNA, HI 221)
 Sonicado (Sonic&Ma e ials Inc.Danbu y, Vib a Cell)
 Te mociclado (Techne, P ogenie)
 Te mociclado pa a iempo eal (Bio-Rad, MJ MiniOp icom)
REACTIVOS
Los p oduc os químicos u ilizados se ob u ie on de Sigma-Ald ich (España), sal o
que se indique o a p ocedencia.
25
Ma e iales y Mé odos
Los an icue pos pa a las dis in as écnicas inmunológicas ealizadas se esumen en
la Tabla 1.
Tabla 1. An icue pos empleados
ANTICUERPO
PROCEDENCIA
LABORATORIO
DILUCIÓN
An icue pos p ima ios
Inmunohis oquímica
α Ac ina de músculo liso Clon1A4 (A2547)
Ra ón
Sigma-Ald ich
1:100
ApoER2 (H-135): sc-20746
Conejo
San a C uz Bio echnology, INC.
1:25
B dU (Clon BU 33) (B2531)
Ra ón
Sigma-Ald ich
1:300
CA I (H48):sc-134853
Conejo
San a C uz Bio echnology, INC.
1:50
Caspasa 3 ac i a (Asp175)
Conejo
Cell Signaling
1:200
C omog anina A (NB120-15160)
Conejo
No us Biologicals
1:100
Dab1 (AB5840)
Conejo
Chemicon
1:200
Mucina 2 (H-300):sc-15334
Conejo
San a C uz Bio echnology, INC.
1:50
Reelina (G10) (NB600-1081)
Ra ón
No us Biologicals
1:500
Reelina (H-221): sc-5578
Conejo
San a C uz Bio echnology, INC.
1:50
Sox9 (H-90):sc-20095
Conejo
San a C uz Bio echnology, INC.
1:50
Vilina Ab-1(Clone CWWB1)
Ra ón
The mo Scien i ic
1:100
VldlR (6A6):sc-18824
Ra ón
San a C uz Bio echnology, INC.
1:25
Wes e n Blo
α Ac ina de músculo liso (A5228)
Ra ón
Sigma-Ald ich
1:10.000
β-Ac ina (AC-74) (A5316)
Ra ón
Sigma-Ald ich
1:4000
DNMT1 (D4692)
Conejo
Sigma-Ald ich
1:4000
GAPDH Clon71.1 (G8795)
Ra ón
Sigma-Ald ich
1:15.000
An icue pos secunda ios
IH
IgG de conejo conjugado con bio ina
Ce do
Dako
1:300
IgG de a ón conjugado con bio ina
Conejo
Dako
1:300
IgG de cab a conjugado con bio ina
Conejo
Dako
1:300
IgG de conejo conjugado con bio ina
Cab a
Vec o Labo a o ies
1:200
IgG de a ón conjugado con bio ina
Cab a
Vec o Labo a o ies
1:200
W-B
IgG de a ón conjugado con pe oxidasa de
ábano
Cab a
Sigma-Aldich
1:8000
IgG de a ón conjugado con pe oxidasa de
ábano
O eja
Sigma-Aldich
1:8000
26
Ma e iales y Mé odos
GENOTIPADO DE RATONES
El geno ipado de los a ones se ealiza siguiendo el p o ocolo desc i o po
D’A cangelo y cols., (1996). P ime o se ex ae el ADN genómico p oceden e de alguno de
los dedos de los a ones siguiendo un código pa a su iden i icación y u ilizando la solución
de ex acción QuickEx acTM (EPICENTRE), con o me a las ins ucciones del ab ican e.
Pos e io men e, con 5 µl del ADN genómico ex aído se ealiza una eacción en
cadena de la polime asa (PCR) usando es cebado es especí icos del gen de la Reelina, de
los cuales, uno es sen ido (TAATCTGTCCTCACTCTGCC) y dos son an i-sen ido
(CAGTTGACATACCTTAAT; TGCATTAATGTGCAGTGT). La polime asa de ADN usada
pa a es a eacción ue la MyTaq (Bioline), y las condiciones de eacción ue on: una
p ime a e apa de desna u alización del ADN de 2 min a 95ºC, pos e io men e, cua en a
ciclos que comp endían: 20 segundos a 95ºC, 20 segundos a 55ºC y 15 segundos a 72ºC, y
po úl imo, una e apa de elongación de 2 min a 72ºC.
El p oduc o de es a eacción se analiza median e una elec o o esis en gel de aga osa
al 2%. Los es posibles geno ipos se iden i ican en unción del amaño de las bandas
ob enidas: 266 pb pa a el geno ipo no mal (+/+), 266 y 363 pb pa a el he e ocigó ico
(+/-) y 363 pb pa a el eele (-/-).
MATERIAL BIOLÓGICO EMPLEADO
T as el sac i icio de los a ones los ejidos se ex aen ápidamen e del animal y se
la an con solución salina isiológica ía (4ºC). Se miden, pesan y se co an en ozos que
se p ocesan según pa a lo que an a se u ilizados. Así se p ocede a su congelación en
ni ógeno líquido, ijación en p- o maldehído al 4% o incubación en 1mM di io ei ol
(DTT) en PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,1 mM Na2HPO4 y 1,8 mM KH2PO4), según
la inalidad del mismo.
Las p epa aciones biológicas empleadas ue on: ejido ce eb al, ejido in es inal y
mucosa, muscula , células aisladas y ex ac os p o eicos de colon.
Ob ención de la capa mucosa y muscula del colon de a ón
Pa a ob ene la capa mucosa del colon p oximal y dis al, una ez ex aídos los ejidos
se ab en longi udinalmen e y, sob e una placa de id io y en baño de hielo, se aspa la

27
Ma e iales y Mé odos
mucosa con un po aobje os y se gua da en ubos de 1,5 ml, congelándose en ni ógeno
líquido y conse ándose a -80ºC has a su u ilización. Luego se con inúa aspando pa a
asegu a la e i ada de posibles es os de la capa mucosa y submucosa y se e mina
ecogiendo el ejido es an e que co esponde a la capa muscula . Al igual que con la
mucosa, el ejido se gua da en ubos de 1,5 ml, se congela en ni ógeno líquido y se conse a
a -80ºC. Pa a asegu a que la ob ención de las dos capas ha sido co ec a se ija un ozo
del ejido muscula aislado en un po aobje o con adhesi o y se p ocede luego a su inción
con hema oxilina pa a su obse ación al mic oscopio óp ico.
Aislamien o de acciones celula es del colon de a ón
El aislamien o secuencial de acciones en iquecidas en colonoci os y
mio ib oblas os de la mucosa del colon se ealiza siguiendo el p o ocolo desc i o po Leeb
y cols. (2002) con algunas modi icaciones. Pa a ello, los ejidos del colon p oximal y dis al
del animal, una ez ex aídos y la ados, se ab en longi udinalmen e y se co an en
segmen os de ap oximadamen e 2 cm. Las piezas se incuban a empe a u a ambien e
du an e 15 min en PBS con 1 mM DTT. A con inuación se incuban du an e 30 min en un
baño a 37ºC con agi ación en PBS que con iene 1 mM EDTA y 2 mM glucosa. Los
segmen os de in es ino se agi an manualmen e con una a illa, du an e 30 segundos, pa a
a o ece el desp endimien o de los colonoci os y, la suspensión celula esul an e se il a
a a és de una malla de nylon de 60 µm de po o. Se ecogen los colonoci os po
cen i ugación a 900 g du an e 2 min a 4oC. A con inuación se epi e el p oceso
(incubación, agi ación y il ación) pa a a o ece el desp endimien o de los colonoci os y
c ip as es an es que son desechados.
Pa a el aislamien o de los mio ib oblas os se con inúa con el ejido no desca ado.
Pa a ello se la a con PBS y se incuba a 37ºC con agi ación du an e 30 min en PBS que
con iene 1 mg/ml de colagenasa y 2 mg/ml de hialu onidasa. Finalmen e se agi a median e
ó ex du an e 30 segundos y se ecogen los mio ib oblas os subepi eliales po
cen i ugación a 900 g du an e 2 min a 4oC.
Las dis in as acciones celula es se mon an sob e po aobje os con adhesi o y se
almacenan a -20ºC has a su uso en inmunohis oquímica o bien se congelan en ni ógeno
líquido y se conse an a -80ºC has a su u ilización pa a ex acción de ARN.
28
Ma e iales y Mé odos
El en iquecimien o celula de cada una de las acciones se e alúa midiendo ,
median e PCR en iempo eal, el ARNm de ma cado es especí icos de cada ipo celula :
Vilina pa a colonoci os (Wes y cols., 1998) y la α-ac ina del músculo liso (α-SMA) pa a los
mio ib oblas os (Mahida y cols., 1997).
Ob ención de los ex ac os p o eicos
Se ob ienen del colon in ac o median e su homogeneización con Poly on (Ys al) a
al a elocidad en “solución de lisis” (50 mM T is-HCl (pH 7,5), 1% NP40, 0,1% Na
deoxicola o, 150mM NaCl, 2 mM EDTA, 10mM EGTA) que con ienen inhibido es de
p o easas: ap o inina (20 µg/ml), leupep ina (10 µg/ml) y enilme ilsul onil luo u o
(PMSF) (1 mM). El homogenado se incuba a 4ºC du an e 10 min y se cla i ica median e
cen i ugación a 14.000 g du an e 30 min.
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA
La concen ación de p o eínas p esen e en los ex ac os se de e mina median e el
mé odo desc i o po B ad o d (1976) empleando la γ-Globulina como p o eína es ánda .
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS PARA SU OBSERVACIÓN
AL MICROSCOPIO
Mic oscopio óp ico
Los ejidos ex aídos del colon p oximal y dis al se ijan con p- o maldehído al 4%
du an e oda la noche a 4ºC y con agi ación o bi al. Dependiendo de si se quie e inclui en
pa a ina o en esina el ejido a obse a , se ealiza uno u o o de los siguien es
p ocedimien os:
En el p ime o de los casos, los ejidos ya ijados se some en a un p oceso de
deshid a ación u ilizando alcoholes de concen aciones c ecien es (70%, 80%, 90% y
100%) y po úl imo xilol, a empe a u a ambien e y con agi ación o bi al. A con inuación
se pasan po una mezcla de xilol: pa a ina (1:1) a 60ºC y se incluyen en pa a ina
p e iamen e calen ada a 60ºC, donde se man ienen oda la noche. Po úl imo, los bloques
de pa a ina con los ejidos co ec amen e o ien ados se dejan solidi ica a empe a u a
29
Ma e iales y Mé odos
ambien e. Se ealizan secciones de 5 m con un mic o omo, se mon an en po aobje os con
adhesi o (S a F os ® adhesi e slides, Kni el Glase , Alemania) y se conse an a
empe a u a ambien e has a su u ilización.
Cuando se quie e inclui el ejido en esina, los ejidos ya ijados se sume gen en
soluciones con concen aciones c ecien es de saca osa (20 y 30%) y se congelan en
isopen ano a -15ºC. Se ealizan co es his ológicos de 10 m con un c ios a o y, as se
mon ados en po aobje os con adhesi o (S a F os ® adhesi e slides, Kni el Glase ,
Alemania), se conse an a –20ºC has a su u ilización.
En el caso de las p epa aciones con células aisladas ( e Aislamien o de acciones
celula es), el olumen del pelle ob enido de colonoci os y mio ib oblas os es diluido en
PBS y se mon an alícuo as de 20 µl sob e po aobje os con adhesi o, ex endiéndolas
ap oximadamen e en 1 cm2. Las p epa aciones se secan du an e 10 min a 37ºC y se
almacenan a -20ºC.
Mic oscopio elec ónico de ansmisión
Los ejidos ex aídos del colon dis al se ijan en Glu a aldehído al 4% en ampón
Cacodila o 0,1 M (pH 7,4) du an e 3 ho as a 4ºC. Pos e io men e se la an en ampón
Cacolida o 0,1 M y se uel en a ija a 4ºC du an e 1-2 ho as con Te óxido de Osmio
(OsO4) al 1%. T as un nue o la ado en ampón Cacolida o con Saca osa al 7,5%, los ejidos
son some idos a un p oceso de deshid a ación a 4ºC pasándolos po can idades c ecien es
de Ace ona (30, 50 y 70%) y se iñen con una solución al 2% de ace a o de u anilo en
ace ona al 70%. Finalmen e los ejidos son incluidos en esina SPURR y se ealizan
secciones ul a inas (80-100nm) con mic ó omo (Reiche -Jung, Ul acu E.) que son
ecogidas en ejillas de cob e (Elec on Mic oscopy Science, G200-Cu). Tan o la inclusión
en esina como la p epa ación del co e del ejido se ealizan en el CITIUS (Cen o de
In es igación, Tecnología e Inno ación de la Uni e sidad de Se illa).
ANÁLISIS MORFOMÉTRICO
Se ealizan medidas mo ológicas de la mucosa y muscula de la pa ed del colon y de
las mic o ellosidades y uniones in e celula es del epi elio del colon.
30
Ma e iales y Mé odos
Las medidas mo ológicas de la pa ed del colon se hacen en secciones de pa a ina de
5 µm, ob enidas del colon p oximal y dis al de a ones con ol y eele de 1 y 3 meses. Pa a
uni ica el es udio, se ealizan las medidas en co es de la misma po ción de colon, pa a lo
cual se co ó un segmen o de un cen íme o de longi ud de la zona más p oximal del colon
p oximal y más dis al del colon dis al. Pa a es as medidas se u iliza el mic oscopio óp ico
y el p og ama de a amien o de imágenes SPOT Ad ance. Las p epa aciones u ilizadas
ue on p e iamen e eñidas con hema oxilina-eosina, de acue do a mé odos u ina ios.
Las medidas mo ológicas del epi elio del colon se hacen en secciones ul a inas de
esina de 80-100 nm, ob enidas del colon dis al de a ones con ol y eele de 3 meses. Las
secciones son examinadas y o og a iadas en el CITIUS median e mic oscopio elec ónico
de ansmisión (Philips CM-10) equipado con cáma a (Olympus Vele a).
Las medidas son ealizadas po es obse ado es.
INMUNOHISTOQUÍMICA
Los ensayos de inmunohis oquímica se han ealizado en p epa aciones de células
aisladas y en secciones de ejido del colon p oximal y dis al de a ón. Los an icue pos
empleados en el p esen e es udio, así como las diluciones de los mismos, se de allan en la
Tabla 1.
Inmunohis oquímica en células aisladas
Las p epa aciones de acciones celula es se descongelan y se ijan du an e 10 min
con p- o maldehído al 2% en PBS a empe a u a ambien e. Pasado es e iempo, se la an
con PBS y se pe meabilizan con i ón X-100 al 0,1% en PBS du an e 20 min a empe a u a
ambien e. T as la a con PBS, se incuban du an e 30 min con H2O2 al 0,3% en me anol,
pa a inhibi la ac i idad pe oxidasa endógena. Las uniones inespecí icas del an icue po se
bloquean incubando las mues as en solución de bloqueo (1% sue o de cab a, 1% albúmina
bo ina sé ica, 0,1% i ón en PBS) du an e 30 min a empe a u a ambien e, en cáma a
húmeda y con agi ación. Seguidamen e, se incuban con el an icue po p ima io en solución
de bloqueo o únicamen e con solución de bloqueo, sin an icue po p ima io (pa a el
con ol), a 4ºC du an e oda la noche.
37
Ma e iales y Mé odos
Tabla 2. Cebado es especí icos pa a PCR en Tiempo Real
RATON
GEN
GenBank ID
SENTIDO (5’…3’)
ANTISENTIDO (5’…3’)
ApoER2
NM_001080926.1
GAATGAAGGCAGCCAGAT
GTTGTCGAAATTCATGCTC
α-SMA
NM_007392.3
CTTTGCTGGTGATGATGCTC
GCGAAGCTCGTTATAGAAGG
β-ac ina
NM_007393.3
ACCCACACTGTGCCCATCTA
CGGAACCGCTCATTGCC
Cask
NM_001284503.1
TCTCCAGAAAGTGCTAACGG
ATGAAGTGTACCTTGCCTGTG
Cdx2
NM_007673.3
AACTACAGGAGCCAGAGGCA
AGGGACAGGAAGTCCAGGTT
CycD1
NM_007631.2
AGGCTACAGAAGAGTATTTATGGGAA
TGCGTTTGAATCAAGGGAGAT
Dab1
NM_010014.2
GACATCACAGATCATCGG
CTGGTACACAGATTGTTCAC
Dnm 1
NM_ 010066.4
CAAGTTCTGCCTATCTTGTATCC
TGATGTTGAAAGTAAAGGCCTC
IFN-g
NM_008337.3
CAGCAACAGCAAGGCGAAA
CTGGACCTGTGGGTTGTTGAC
Il1b
NM_008361.4
TTGACGGACCCCAAAAGATG
AGAAGGTGCTCATGTCCTCAT
Il6
NM_031168.1
ACAAGTCGGAGGCTTAATTACACAT
TTGCCATTGCACAACTCTTTTC
Reln
NM_011261.2
GGACTAAGAATGCTTATTTCC
GGAAGTAGAATTCATCCATCAG
Smad5
NM_021692.1
GACAGCAGCATCTTTGTTCAG
ATCCATGGTTGACTGACTGAG
Sox9
NM_011448.4
TCGTGTGTGTGTGTTTATAG
ATTCCTATTGCTACACTCAG
Sp1
NM_ 013672.2
AACAACTACTACCACCAGCA
AACTAGCTGAGGCTGAATAAGGA
TGFβ1
NM_011577.1
ATCCTGTCCAAACTAAGGCTC
TGACCTCTTTAGCATAGTAGTCC
TNF-α
NM_013693.3
TCTCATCAGTTCTATGGCCC
GGGAGTAGACAAGGTACAAC
Vilina
NM_009509.2
TGGAAGAGTTTCAACAGAGG
GTGGTTCATAATTGCCATCAG
VldlR
NM_013703.2
GTGTACTTGAAGACCACTGAAGAG
GCTGGCTCTGTTACCATTC
PCR ESPECÍFICA DE METILACIÓN (MSP) Y SECUENCIACIÓN GENÓMICA
El ADN o al del colon dis al de los a ones se ex ae median e el ki come cial
“DNeasy® Blood & Tissue” (QUIAGEN). La concen ación y la pu eza del ADN o al
ob enido se de e minan median e espec o o ome ía (abso bancia a 260 nm y 280 nm).
Pa a iden i ica los si ios CpG me ilados del p omo o génico de la Reelina se u iliza
el ki come cial “EZ DNA Me hyla ionTM” (Zymo Resea ch), en el que el ADN es a ado
con bisul i o sódico ans o mando así las ci osinas me iladas en ci osinas no me iladas y

38
Ma e iales y Mé odos
las ci osinas no me iladas en iminas. El p oduc o ob enido se ampli ica median e PCR
usando: 200 ng del ADN ans o mado, 0,4 µM de cebado es especí icos
(5´GTGATAGTGGTTATGTATGATATGTAG 3´ y 5´ACCTTCTTAAAACCCCTAAC 3´) y 2
µl de la enzima ADN polime asa MyFiTM (Bioline). Los cebado es se diseñan con el
p og ama “Me hyl P ime Exp ess So wa e” ( .1.0).
La ampli icación se ealiza en el e mociclado MiniOp iconTM (Bio-Rad) u ilizando
el siguien e p o ocolo: 1 min a 95ºC pa a desna u aliza el ADN, seguido de 40 ciclos de 15
s a 95ºC, 15 s a 61ºC y 30 s a 72ºC y po úl imo, una e apa de elongación de 5 min a 72ºC.
Pos e io men e se ealiza un análisis de las cu as de disociación al y como se menciona
en el apa ado “PCR en iempo eal”
El p oduc o que se ob iene de es a eacción se ca ga en un gel de aga osa al 2%. A
con inuación se ecoge la banda ob enida y se p ocede a pu i ica el ADN usando el ki
come cial “ QIAquick® Gel Ex ac ion”. Con es e ADN pu i icado se ealiza una segunda
PCR idén ica a la p ime a pa a ob ene mayo can idad de p oduc o de ADN que se ex ae
y pu i ica siguiendo el mismo mé odo an e io . Las mues as de ADN ex aídas son
en iadas al se icio de Genómica y Secuenciación del Ins i u o de Biomedicina de Se illa
(IBiS) pa a el p ocesamien o y análisis de las secuencias esul an es.
Pa a de e mina el po cen aje de me ilación de cada uno de los si ios CpG se analiza
di ec amen e el c oma og ama ob enido en la secuenciación de cada una de las mues as.
Pa a ello se aplica el c i e io p opues o po Ka e Pa e son y cols.(2011): 0% me ilado
(cuando la onda ob enida en el c oma og ama es una imina), 25%me ilado (cuando
apa ecen dos ondas, una co espondien e a la imina, más al a, y o a co espondien e a la
ci osina, más baja), 50% me ilado (cuando apa ecen dos ondas , una co espondien e a la
imina y o a a la ci osina, y se encuen an a la misma al u a), 75% me ilado (cuando
apa ecen dos ondas, una co espondien e a la ci osina, más al a, y o a co espondien e a
la imina, más baja), 100% me ilado (cuando la onda ob enida en el c oma og ama
co esponde a ci osina).
Los esul ados se exp esan como la media del po cen aje ob enido pa a cada si io
CpG as analiza 5 secuencias/mues a, de un o al de 5 mues as po cada condición
expe imen al.
Las medidas son analizadas po es obse ado es di e en es.
39
Ma e iales y Mé odos
INDUCCIÓN DE LA INFLAMACIÓN
En las úl imas décadas se han desa ollado di e en es modelos animales que
ep oducen la en e medad in lama o ia in es inal con ca ac e ís icas muy pa ecidas a la
humana. Es os modelos pueden di idi se en modelos de coli is inducible y animales
gené icamen e modi icados. La inducción de la coli is a a és de sus ancias químicas es
uno de los más usados ya que son simples de gene a y ácilmen e con olables en cuan o
al inicio, du ación y g a edad de la in lamación. Los compues os químicos más usados en
las úl imas dos décadas son el dex ano sul a o sódico (DSS) y el ácido sul ónico
ini obencénico (TNBS).
El DSS es un polisacá ido sul a ado con a iable peso molecula que puede i desde
los 5 kDa has a los 1400 kDa. Es á demos ado que es óxico pa a las células epi eliales del
colon al e ando la in eg idad de la ba e a epi elial po a ec ación de las uniones
ocluyen es, p incipalmen e. El peso molecula del DSS es un pa áme o impo an e pa a
la inducción y localización de la coli is. En a ones la coli is más se e a se alcanza con la
adminis ación de DSS con peso molecula de 40 kDa, a ec ando p incipalmen e a la pa e
media y dis al del colon ( e e isión Pe se y Ce a , 2012).
Po lo desc i o an e io men e, en el p esen e abajo hemos escogido el modelo de
coli is inducido po DSS po que nos pe mi e gene a una coli is aguda de mane a sencilla
y ep oducible. La coli is se induce median e la adminis ación de DSS (TdB Consul ancy,
Pm= 40 KDa) al 3% en el agua de bebida ( e e isión Solomon y cols., 2010). Dado que
los a ones eele beben una media de 5-6 ml al día, se limi a a odos los animales a es e
olumen pa a que la inges a sea la misma.
El sac i icio de los animales se ealiza: 1) a los 9 días de adminis ación de DSS,
cuando la pé dida de peso es supe io al 10% de su peso inicial, en g upos expe imen ales
de coli is aguda y 2) a los 3, 6 y 9 días de adminis ación de DSS, en g upos expe imen ales
en los que se e alúa la p og esión de la en e medad.
40
Ma e iales y Mé odos
EVALUACIÓN DE LA INFLAMACIÓN
Índice de la ac i idad de la en e medad (DAI)
La e aluación clínica de la in lamación incluye un egis o dia io del peso co po al,
de la consis encia de las heces y de la apa ición de sang ado ec al que son alo ados según
la escala desc i a en la Tabla 3 y pe mi e calcula el índice de ac i idad de la en e medad
(DAI) (Gommeaux y cols., 2007). Es e pa áme o se ob iene ealizando la media de las
dis in as medidas y puede ene alo es en e 0-3.
La alo ación es ealizada po dos obse ado es dis in os.
Tabla 3. C i e ios de pun uación del DAI.
Pun uación
Pé dida de Peso
(%del peso inicial)
Consis encia de
heces
Sang e Rec al
0
<1
Consis en es, o madas
No
1
1-4,99
Suel as pe o no
adhe idas al ano
Pequeño sang ado
en las heces; egión
anal seca
2
5-10
Muy lige as y
adhe idas al ano
Sang ado en heces;
la sang e en el
o i icio anal
3
>10
Líquidas o muy
líquidas y ano húmedo
Al o sang ado en
las heces; la sang e
se ex iende po odo
el ano
41
Ma e iales y Mé odos
Análisis mac oscópico del in es ino
Al inaliza el a amien o los a ones son sac i icados, se ex ae el colon y se la a con
sue o salino a 4ºC como se ha desc i o an e io men e. Se ealiza un análisis mac oscópico
de los ejidos consis en e en de e mina : 1) la p esencia de sang e y 2) el peso y longi ud
de las dis in as pa es del in es ino. De es os úl imos da os se calcula la elación peso
(g)/longi ud (cm) de cada uno de los ejidos indica i o ambién del g ado de in lamación.
Análisis his ológico del colon
Los ejidos despa a inados e hid a ados (xilol- e anol 100%- 96%- 80%- 70%- 50% y
agua) se iñen con hema oxilina y eosina y se incluyen en pegamen o de mon aje EUKITT®
pa a su obse ación al mic oscopio óp ico. Las secciones se o og a ían u ilizando la
cáma a o og á ica digi al SPOT Insigh acoplada al mic oscopio óp ico.
Pa a e alua las al e aciones his ológicas se ealizan medidas mo omé icas del
ejido (p o undidad de las c ip as, ancho de la mucosa y ancho de la muscula ) y se
pun úan los siguien es pa áme os en una escala de 0-3, según el mé odo desc i o po
Gaudio y cols. (1999): 1) des ucción del epi elio y glándulas; 2) dila ación de las c ip as
glandula es; 3) educción y pé didas de células calici o mes, 4) in il ación de células
in lama o ias, 5) edema y 6) abscesos en las c ip as, u ilizando pa a ello el p og ama de
a amien o de imágenes SPOT Ad ance.
Es e es udio es ealizado po 3 in es igado es di e en es que hacen un análisis ciego
de los ejidos. La pun uación his ológica se ob iene ealizando la media a i mé ica de cada
uno de los pa áme os es udiados.
Medida de la ac i idad de la mielope oxidasa
La in il ación de los neu ó ilos se de e mina midiendo la ac i idad de la
mielope oxidasa (MPO), según el mé odo desc i o po Suzuki y cols. (1983) con algunas
modi icaciones.
Se descongela el ejido conse ado a -80ºC y se homogeneiza con el homogeneizado
Poly on (Ys al) du an e 30 segundos a 4ºC en 0,5% HTAB (b omu o de
hexame il ime ilamonio) en ampón 0,2M T is, pH 6. Es e p oceso se epi e 3 eces.
Luego se ealizan 5 ciclos de congelación y descongelación, incluyendo sonicación (10
42
Ma e iales y Mé odos
pulsos de 1 segundo) en los es p ime os ciclos. De es a o ma se a o ece la o u a de las
es uc u as celula es y la libe ación del enzima. La suspensión esul an e se cen i uga a
7000 g du an e 10 min, a 4ºC. La ac i idad de la MPO se de e mina añadiendo 50 μL del
homogenado a 150 μL de ampón de eacción MPO (50mM os a o sódico, 33,4 mg/50 ml
de o o-dianisidina-HCl, 83 μL/50 ml de H2O2 0,005%) p e iamen e sonicado y calen ado
a 37ºC. A los 5 min de eacción (a 37ºC) se mide la abso bancia a 450 nm en un
espec o o óme o y se calcula la ac i idad de la mielope oxidasa a pa i de una cu a
pa ón u ilizando MPO de ábano (5 UI/50 μL).
Se de ine como una unidad de ac i idad MPO aquella que es capaz de deg ada
1mmol de H2O2 po min, a 37ºC. Los esul ados se exp esan como unidades de MPO/mg
de p o eína x min. La de e minación de la concen ación de p o eína es de e minada po
el mé odo de B ad o d ( e apa ado “De e minación de la concen ación de p o eínas”).
Ni eles de exp esión de ma cado es de la in lamación
Se midie on los ni eles de ARNm de las ci oquinas In e leucina 1β (IL-1β) y ac o de
nec osis umo al α (TNF-α), ma cado as de in lamación, median e RT-PCR en iempo
eal.
PRESENTACIÓN DE LOS RESULADOS Y ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
Los esul ados se p esen an como la media acompañada de su e o es ánda (EEM).
A menos que se indique lo con a io en los pies de igu a, el núme o de animales (n) usados
en cada condición expe imen al oscila en e 3 y 5. La compa ación en e los dis in os
g upos expe imen ales (da os pa eados) se ealizó es adís icamen e median e el es de la
“ de S uden ”. Pa a compa aciones múl iples se u ilizó un análisis de a ianza (ANOVA)
de una sola ía, seguido del es de Newman-Keuls (p<0,05).

CONCLUSIONES
101
Conclusiones
1. La mucosa del colon de a ón exp esa las p o eínas Reelina, sus ecep o es VldlR
y ApoER2 y su p o eína e ec o a Dab1.
2. La Reelina desempeña unciones a lo la go del in es ino p incipalmen e en edades
más emp anas, mien as que la Dab1 ealiza unciones más ele an es en el in es ino
delgado a odas las edades.
3. La Reelina en la mucosa del colon sólo se exp esa en los mio ib oblas os, mien as
que el es o de componen es del sis ema se exp esa en los colonoci os y en los
mio ib oblas os.
4. La ausencia de Reelina disminuye la p o undidad y diáme o de las c ip as, el
g oso de la capa muscula del colon y el g oso de las mic o ellosidades, y aumen a
la longi ud de las mic o ellosidades y el espacio in e celula de los desmosomas del
epi elio del colon.
5. La Reelina egula la dinámica del epi elio del colon ac i ando la p oli e ación,
mig ación, di e enciación y apop osis celula .
6. La mu ación del gen Reelina disminuyó la exp esión de los ac o es de
ansc ipción SOX9 y Cdx-2, sugi iendo que la Reelina egula los p ocesos de
homeos asis del epi elio del colon a a és de es os genes pe enecien es a la ía de
señalización Wn .
7. La in lamación inducida con DSS aumen a la abundancia del ARNm y de la
p o eína Reelina debido a un aumen o de su exp esión génica en los mio ib oblas os
de la mucosa del colon.
8. El aumen o en la exp esión de Reelina du an e la in lamación del colon, se
p oduce p incipalmen e po hipome ilación de su p omo o , debido, en e o os
ac o es, a la disminución de la exp esión de la enzima ADN me il ans e asa 1
(DNMT1).
9. La disminución en la exp esión de la ADN me il ans e asa 1, du an e la
in lamación, puede se debida a un aumen o en la exp esión del ac o de c ecimien o
ans o man e be a 1 (TGF-β1) sugi iendo que el e ec o an iin lama o io de es a
ci oquina pod ía es a mediado, al menos en pa e, po la Reelina.
10. Los a ones eele son más suscep ibles a la in lamación inducida con DSS, lo
que sugie e que la Reelina eje ce una acción p o ec o a en la mucosa del colon.
11. En los a ones eele , el a amien o con DSS en el colon aumen a la exp esión
de los genes implicados en la p oli e ación y mig ación celula , Ciclina D1 y Smad-5,
pe enecien es a las ías de señalización Wn y BMP, espec i amen e, sugi iendo
que la Reelina puede pa icipa en el p oceso de epa ación del ejido dañado.
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