Uni e sidad de San iago de Compos ela
Depa amen o de Mic obiología y Pa asi ología
La p o eína MIP de Neisse ia meningi idis: Un
candida o acunal p ome edo con a la meningi is
meningocócica
Memo ia p esen ada po Liliana Cos oya Seco
pa a op a al G ado de Doc o en Biología
San iago de Compos ela, julio de 2013
Dª. Ma ía Te esa C iado Ál a ez, Ca ed á ica de Mic obiología del
Depa amen o de Mic obiología y Pa asi ología de la Uni e sidad de San iago de
Compos ela, y D. Juan Ma zoa Fandiño, Doc o en Biología po la Uni e sidad de
San iago de Compos ela,
INFORMAN: Que la p esen e Tesis Doc o al, i ulada “La p o eína MIP de
Neisse ia meningi idis: Un candida o acunal p ome edo con a
la meningi is meningocócica”, que p esen a Doña Liliana Cos oya
Seco pa a op a al G ado de Doc o en Biología, ha sido ealizada
bajo nues a di ección en es a Uni e sidad y, hallándose concluida,
au o izamos su p esen ación a in de que pueda se juzgada po el
ibunal co espondien e.
San iago de Compos ela, julio de 2013.
P o . Mª Te esa C iado Ál a ez D . Juan Ma zoa Fandiño
III
La ealización de es a Tesis Doc o al ue posible g acias a:
- La sub ención ob enida del Minis e io de Ciencia e Inno ación. P oyec os
Plan Nacional. Re . SAF2011 30125.
- La sub ención ob enida de la Conselle ía de Educación e O denación
Uni e si a ia. Xun a de Galicia. Re . INCITE 09 203 335 PR.
- La sub ención ob enida de la Conselle ía de Economía e Indus ia. Di ección
Xe al de In es igación, Desen ol emen o e Inno ación. Xun a de Galicia.
Re . 2009/AX613.
IV
A ículos publicados y en p oceso de publicación elacionados con el abajo de la
p esen e Tesis Doc o al
Cos oya L, Sánchez S, F eixei o P, -Casal E, Ma zoa J, , C iado
MT. Cons uc ion o p o eoliposomes con aining he ecombinan meningococcal
Mac ophage In ec i i y Po en ia o p o ein (MIP) and analysis o hei immunogenici y in
mouse. En p epa ación.
-Casal E, High
esolu ion Clea Na i e Elec opho esis analysis o he Se a ia ma cescens cell en elope
complexome. En p epa ación.
- ez S.
Cha ac e iza ion o he complexome o Esche ichia coli ou e memb ane esicles using high
esolu ion Clea Na i e Elec opho esis. J. P o eome Res. Some ida.
-
S. 2013. High esolu ion Clea Na i e Elec opho esis (h CNE) allows a de ailed analysis o
he he e o ime ic s uc u e o ecombinan Neisse ia meningi idis po ins inse ed in o
liposomes. J. P o eome Res. 12: 777−784.
F eixei o P, Dieguez-Casal E, Cos oya L, Seijo B, Fe ei ós C, C iado MT, Sánchez S.
2013. S udy o he s abili y o p o eoliposomes as ehicles o accines agains Neisse ia
meningi idis based on ecombinan po in complexes. In J Pha m. 443:1-8.
Ma zoa J, Sánchez S, Cos oya L, Diéguez-Casal E, F eixei o P, B ookes C, Allen L,
Taylo S, Go inge AR, Fe ei ós C, C iado MT. 2012. Induc ion o immune esponses
by pu i ied ou e memb ane p o ein complexes om Neisse ia meningi idis. Vaccine.
30:2387-2395.
A Tamia
7
Índice de igu as
Página
Figu a 1
Mic og a ías elec ónicas de Neisse ia meningi idis y esículas de memb ana
ex e na………………………………………………………………………………….
16
Figu a 2
Dis ibución global de los p incipales se og upos de N. meningi idis causan es de
en e medad……………………………………………………………………………..
19
Figu a 3
P e alencia dependien e de edad de la en e medad meningocócica en elación a la
inmunidad poblacional calculada po la ac i idad bac e icida del sue o………………
25
Figu a 4
Sis ema del complemen o……………………………………………………………...
27
Figu a 5
Pa ed celula de Neisse ia meningi idis……………………………………………….
48
Figu a 6
Esquema del sis ema de elec o-elución Elec o-elu e 422…………………………...
70
Figu a 7
Sepa ación de complejos p o eicos p esen es en OMVs de la cepa N. meningi idis
H44/76 po h CNE……………………………………………………………………..
91
Figu a 8
Sepa ación de la p o eína de N. meningi idis MSP63 po SDS-PAGE………………..
92
Figu a 9
Comp obación de la composición p o eica del eluído de la p o eína MSP63…………
93
Figu a 10
Ti ulación po do -blo ing del sue o an i-MSP63……………………………………..
93
Figu a 11
Wes e n-blo con el sue o an i-MSP63a pa i de OMVs de las cepas de N.
meningi idis H44/76, NZ98/254, 3061, 3063, Nm26 y Nmp27 sepa adas po SDS-
PAGE………………………………………………………………………………….
94
Figu a 12
Wes e n-blo a pa i de OMVs de las cepas de N. meningi idis H44/76, NZ98/254,
3061, 3063, Nm26 y Nmp27 sepa adas po h CNE con el sue o an i-MSP63………...
94
Figu a 13
Do -blo de las alícuo as ob enidas con la columna Bio-ScaleTM A i-P ep® P o ein A
eñidas con Rojo Pounceau…………………………………………………………….
95
Figu a 14
Do -blo eñido con Rojo-Pounceau de las alícuo as en la c oma og a ía de a inidad
con sue o an i-MSP63………………………………………………………………….
96
Figu a 15
:
Comp obación del p oduc o ob enido en la PCR po elec o o esis ho izon al en gel
de aga osa al 0,8%..........................................................................................................
100
Figu a 16
Comp obación de la exp esión de la p o eína MIP median e SDS-PAGE al 10% y
Wes e n-blo ing con el sue o an i-OMVs H44/76…………………………………….
101
Figu a 17
Do -blo con Rojo-Pounceau de las alícuo as ob enidas en la c oma og a ía de
a inidad a iones me álicos inmo ilizados……………………………………………...
102
Figu a 18
SDS-PAGE 10% PA de las alícuo as ob enidas en la IMAC: Ca ga (C), salida de
ca ga (SC), e ce a alícuo a de la ado (LV), y 9 alícuo as de elución (E1-E9)………..
102
Figu a 19
Wes e n-blo de una SDS-PAGE e elado con sue o an i-OMVS de la cepa N.
meningi idis H44/76 de las alícuo as ob enidas en la IMAC co espondien es a la
ca ga (C), salida de ca ga (SC), la ado nº 3 (LV3), la ado nº 26 (LV26) y es
alícuo as de elución (E4,E5 y E8)……………………………………………………...
103
Figu a 20
SDS-PAGE 10% de PA de la p o eína MIP concen ada……………………………..
103
Figu a 21
SDS-PAGE con geles de 10 % PA de una alícuo a de elución ealizada pa a la
iden i icación de las bandas indicadas en la igu a con los núme os 1- 7…………….
104
8
Figu a 22
Do -blo con sue o an i-MIP (1:10.000) de los liposomas con MIP inco po ada……
106
Figu a 23
SDS-PAGE en gel del 12% de PA de la MIP y LipMIP. Wes e n-blo con sue o an i-
MIP (1:10.000) de una SDS-PAGE 12% de PA con los liposomas
LipMIP………………………………………………………………………………....
107
Figu a 24
Ti ulación po do -blo ing del sue o an i-MIP………………………………………...
108
Figu a 25
Ti ulación del sue o an i-MIP-Alum…………………………………………………...
108
Figu a 26
Ti ulación del sue o an i-MIP-F eund…………………………………………………
108
Figu a 27
Ti ulación del sue o an i-Lip-MIP……………………………………………………..
108
Figu a 28
Wes e n- blo de los sue os ob enidos (an i-MIP, an i-MIP-Alum, an i-MIP-F eund y
an i-Lip-MIP) a pa i de la sepa ación po SDS-PAGE de OMVs de la cepa H44/76
de N. meningi idis……………………………………………………………………...
109
Figu a 29
Wes e n-blo con el sue o an i-MIP (1:10.000), a pa i de OMVs de las cepas de N.
meningi idis H44/76, H44/76*(sin es icción de hie o), NZ98/254, 3061 y 3063,
sepa adas po SDS-PAGE……………………………………………………………..
110
Figu a 30
Do -blo con el sue o an i-MIP (1:10.000) empleando como mues a células en e as
de las cepas indicadas………………………………………………………………….
110
Figu a 31
Wes e n-blo a pa i de OMVs de la cepa N. meningi idis H44/76 sepa adas po
h CNE, con los sue os an i-OMVs H44/76 (1:1000) y an i-MIP (1:10.000)………….
111
Figu a 32
Es uc u a idimensional hipo é ica de la p o eína MIP de N. meningi idis……..........
127
9
Índice de ablas:
Página
Tabla 1
Vacunas disponibles y en desa ollo con a los se og upos A, C, X, Y y W135 de N.
meningi idis…………………………………………………………………………………….
33
Tabla 2
P incipales acunas disponibles o en desa ollo con a el se og upo B de N.
meningi idis…………………………………………………………………………...
37
Tabla 3
Relación de cepas u ilizadas en es e abajo……………………………………………...
66
Tabla 4
Ac i idad bac e icida del sue o an i-MSP63………………………………………....
97
Tabla 5
Resul ados de ci ome ía de lujo en los ensayos de opsono agoci osis (OPA),
deposición del complejo de a aque a memb ana (CDA C5b-9), deposición de
complemen o (CDA C3b) y unión a supe icie (SLA) con el sue o an i-MSP63……
99
Tabla 6
Iden i icación po MALDI-TOF/TOF de las p incipales bandas de ec adas
median e elec o o esis SDS-PAGE………………………………………………….
105
Tabla 7
Ac i idad bac e icida de los sue os an i-MIP, an i-MIP-Al, an i-MIP-F y an i-Lip-
MIP en e a la cepa homóloga N. meningi idis H44/76………………………..........
112
Tabla 8
Ac i idad bac e icida de los sue os an i-MIP, an i-MIP-Al, an i-MIP-F y an i- Lip-
MIP en e a las cepas de N. meningi idis 3063, NZ98/254, Nm26 y Nmp27……….
113
Tabla 9
Resul ados de ci ome ía de lujo en los ensayos de opsono agoci osis(OPA),
deposición del complejo de a aque a memb ana (CDA C5b-9) y deposición de
complemen o (CDA C3b) con los sue os an i-MIP, an i-MIP-Al, an i-MIP-F y
an i-Lip-MIP………………………………………………………………………….
114
11
Tabla de ab e ia u as:
2D
Segunda dimensión
AI
An es de la inducción con IPTG
BCA
Ácido bicinconínico (Bicinchoninic acid)
BCECF
bisca boxie ilca boxí- luo esceina
BCR
Recep o de células B (B Cell Recep o )
BSA
Se oalbúmina bo ina
C´
Fuen e de complemen o
CBB
Coomassie B illan Blue
CDA
Ensayo de Deposición de Complemen o (Complemen Deposi ion Assay)
CEACAM
Ca cinoemb yonic An igen Rela ed Cell Adhesion Molecule
CFU
Unidad o mado a de colonia
Chap
Chape onina de 60 kDa
Cx
Complejo p o eico
DDM
n-dodecil-β-D-mal ósido
DI
Después de la inducción con IPTG
DO
Densidad óp ica
DOC
Ácido deoxicola o sódico
ELISA
Enzyme-Linked Immuno So ben Assay
H
Fac o H
Hbp
P o eína de unión al ac o H (Fac o H Binding P o ein)
FI
Índice de luo escencia
FITC
Fluo esceína-5-iso iociana o (Fluo escein iso hiocyana e)
GBSS
Solución gela in-salina de equilib ado (Gela in Balanced Sal Solu ion)
GNA
An ígeno de Neisse ia de i ado de genoma (Genome-de i ed neisse ial an igen)
h CNE
high esolu ion Clea Na i e Elec opho esis
H2Od
Agua des ilada
ID
Código de iden i icación
IgG
Inmunoglobulina G
IMAC
C oma og a ía de a inidad a iones me álicos inmo ilizados
IPP
In e acción p o eína-p o eína
Lg-MIP
P o eína MIP de Legionella pneumophila
LOS
Lipooligosacá idos
LPS
Lipopolisacá ido
MAC
Complejo de a aque a memb ana (Memb ane A ack Complex)
MATS
Sis ema de ipi icación de an ígenos meningococales
12
MBL
Lec ina de unión a manosa (Mannose Binding Lec in)
MCH
Complejo mayo de his ocompa ibilidad (Mayo Complex His ocompa ibily)
ME
Memb ana ex e na
MI
Memb ana in e na
MIP
Po enciado de la in ec i idad a mac ó agos (Mac ophage In ec i i y Po encia o )
NadA
Adhesina A de Neisse ia meningi idis
Ng-MIP
P o eína MIP de Neisse ia gono hoeae
NVI
Na ional Vaccine Ins i u e
OPA
Ensayo de opsono agoci osis (Opsonophagocy osis Assay)
OMP
P o eína de memb ana ex e na
OMV
Vesícula de memb ana ex e na (Ou e Memb ane Vesicle)
PA
Poliac ilamida
PAGE
Polyac ylamide Gel Elec opho esis
PCR
Reacción en cadena de la polime asa
PBS
Tampón os a o salino
PPIasa
Ac i idad enzimá ica pep idyl-p olyl cis/ ans isome asa
PVDF
Poli inilideno luo u o (Poly inylidene luo ide)
SBA
Ensayo de ac i idad bac e icida del sue o (Se ium Bac e icidal Assay)
SDS
dodecilsul a o de sodio (Sodium Dodecyl Sul a e)
SLA
Ensayo de unión a supe icie (Su ace Labeling Assay)
ST
Tipos de secuencia (Sequence Type)
TAE
T is-ace a o-EDTA
TBS
T is-bu e ed saline
TCA
Ácido iclo oacé ico
TEMED
N,N,N′,N′-Te ame ile ilendiamina
TX100
T i on X-100
1. In oducción
In oducción
__________________________________________________________________________
15
1.1. Ca ac e ís icas gene ales de Neisse ia meningi idis
Neisse ia meningi idis es la bac e ia causan e de la meningi is
meningocócica y la p incipal esponsable de la meningi is bac e iana. Es a
en e medad in asi a iene una dis ibución global y a ec a p incipalmen e a niños de
co a edad y adolescen es, siendo una en e medad in ecciosa, con agiosa y
po encialmen e le al.
Es a bac e ia es un diplococo que, como la mayo ía de las especies
pe enecien es al géne o Neisse ia, posee espi ación ae óbica y su c ecimien o se e
es imulado po una a mós e a húmeda con una concen ación de dióxido de ca bono
en e el 5% y el 10%, una empe a u a de 35 a 37 º C y un pH en e 7,4 y 7,6.
N. meningi idis puede es a odeada po una cápsula que la p o ege de la
agoci osis y de la ac i idad bac e icida del complemen o (Figu a 1). En su
supe icie p esen a imb ias que le pe mi en adhe i se a las células y coloniza la
o o a inge y la naso a inge. P ác icamen e odas la cepas aisladas de pacien es son
capsuladas. En unción de la es uc u a del polisacá ido capsula , se pueden di idi
los meningococos en 13 se og upos, de los cuales los g upos A, B, C, W135 e Y
causan casi la o alidad de las in ecciones en odo el mundo. En Eu opa, la g an
mayo ía de las in ecciones meningocócicas es án causadas po meningococos de los
se og upos B y C
1
. N. meningi idis se clasi ica ambién en ipos, sub ipos e
inmuno ipos en base a la eac i idad inmunológica de sus p o eínas de memb ana
ex e na Po A y Po B, y de los lipooligosacá idos espec i amen e
2
,
3
.
1
Ha ison L.H., T o e C.L., Ramsay M.E. 2009. Global epidemiology o meningococcal disease.
Vaccine. 27S: B51-B63.
2
F asch CE, Zollinge WD, Poolman JT. 1985. Se o ype an igens o Neisse ia meningi idis and a
p oposed scheme o designa ion o se o ypes. Re In ec Dis. 7: 504-510.
3
Schol en RJ, Kuipe s B, Valkenbu g HA, Danke J, Zollinge WD e al. 1994. Lipo-
oligosaccha ide immuno yping o Neisse ia meningi idis by a whole-cell ELISA wi h monoclonal
an ibodies. J Med Mic obiol. 41: 236-243.
In oducción
__________________________________________________________________________
22
cápsula polisaca ídica. Pa a los pili ipo IV de N. meningi idis el ecep o p opues o
es la p o eína CD46
29
, que pe enece a una amilia de p o eínas exp esadas en
p ác icamen e odos los ipos celula es con excepción de los e i oci os. Aunque
es udios en Neisse ia gono hoeae
30
, pa ecen e idencia que es posible que o os
ac o es además del CD46 es én implicados en la mediación en e los pili
meningococales y las células o ejidos humanos
31
,20. T as el p ime con ac o y en el
mismo luga , el mic oo ganismo p oli e a en la supe icie de las células epi eliales no
ciliadas o mando mic ocolonias.
La cápsula impide la unión de o as adhesinas, pe o sin emba go, el anclaje
a las células epi eliales puede ac i a un sis ema egulado que conduce a la pé dida
o a una meno exp esión de la cápsula
32
. Sin es a, se posibili a la adhe encia es echa
del meningococo a las células epi eliales y la o mación de placas co icales,
conduciendo al “ eclu amien o” de ac o es que a o ece án la in e nalización del
meningococo
33
. Es a adhe encia es echa es mediada po las p o eínas de memb ana
ex e na Opa y Opc
34
. Las p o eínas Opa son una amilia de p o eínas ansmemb ana
con es uc u a be a ba il, con cua o loops expues os supe icialmen e. La egión
be a ba il cons i uye una egión conse ada de es as p o eínas, mien as que es de
los cua o loops supe iciales a ían en e los dis in os ipos de p o eínas Opa
35
. A
pesa de su a iabilidad an igénica, la mayo ía de las p o eínas Opa econocen uno o
29
Källs öm H, Liszewski MK, A kinson JP, Jonsson AB. 1997. Memb ane co ac o p o ein (MCP
o CD46) is a cellula pilus ecep o o pa hogenic Neisse ia. Mol Mic obiol. 25: 639-647.
30
Edwa ds JL, Apicella MA. 2005. I-Domain-Con aining in eg ins se e as pilus ecep o s o
Neisse ia gono hoeae adhe ence o human epi helial cells. Cell. Mic obiol. 7: 1197-1211.
31
Ki chne M, Meye TF. 2005. The Pil C adhesion o he Neisse ia ype IV pilus-binding
speci ici ies and new insigh s in o he na u e o he hos cell ecep o . Mol. Mic obiol. 56: 945-957.
32
Hamme schmid S, Mülle A, Sillmann H, Mühlenho M, Bo ow R e al. 1996. Capsule phase
a ia ion in Neisse ia meningi idis se og oup B by slipped-s and mispai ing in he
polysialyl ans e ase gene (siaD): co ela ion wi h bac e ial in asion and he ou b eak o
meningococcal disease. Mol Mic obiol. 20: 1211-1220
33
Doule N, Donnadieu E, La an-Chich MP, Niede gang F, Nassi X e al. 2006. Neisse ia
meningi idis in ec ion o human endo helial cells in e e es wi h leukocy e ansmig a ion by
p e en ing he o ma ion o endo helial docking s uc u es. J Cell Biol. 173: 627-637.
34
Co be A, Exley R, Bou doulous S, Tang CM. 2004. In e ac ions be ween Neisse ia meningi idis
and human cells ha p omo e colonisa ion and disease. Expe Re Mol Med. 6: 1-14.
35
Malo ny B, Mo elli G, Kusecek B, Kolbe g J, Ach man M. 1998. Sequence di e si y, p edic ed
wo-dimensional p o ein s uc u e, and epi ope mapping o neisse ial Opa p o eins. J.Bac e iol.
180:1323-1330.
In oducción
__________________________________________________________________________
23
más miemb os de la amilia de ecep o es CEACAM (ca cinoemb yonic an igen-
ela ed cell adhesion molecule) humanos, una ama de la supe amilia de las
inmunoglobulinas
36
. Den o de la amilia de los ecep o es, el CEACAM1 es el
exp esado en más ipos celula es, ya que se encuen a an o en células epi eliales
como endo eliales y ambién en células del sis ema inmune
37
. Las p o eínas Opc
compa en p opiedades isicoquímicas y una cie a homología con las p o eínas Opa
y son di e en es en es uc u a y con ol gené ico. Es udios ecien es mues an que as
la in asión las Opc se unen a la p o eína α-ac inina del ci oesquele o, an o en células
endo eliales como del epi elio
38
. En es udios ecien es, han sido desc i as o as
moléculas implicadas en la adhesión e in asión del epi elio espi a o io, como la
NhhA (Neisse ia Hia/hs homologue), la App (adhesion and pene a ion p o ein), la
H pA (haemagglu in/haemolysin- ela ed p o ein A), NadA (Neisse ia meningi idis
Adhesin A) y MspA (meningococcal se ine p o ease A)
39
.
Los pos e io es pasos de in e nalización, supe i encia in acelula y
diseminación en el o en e sanguíneo son más desconocidos
40
. Ayudada po ac o es
de i ulencia, como la p o easa IgA1 (deg ada p o eínas de memb ana asociadas al
lisosoma p e iniendo la madu ación del mismo, y ac i ando la exp esión de la
cápsula la bac e ia) la bac e ia a a iesa el espacio in acelula en el in e io de
acuolas memb anosas. Una ez en el o en e sanguíneo puede, en ocasiones,
mul iplica se ápidamen e p oduciendo in ección sis émica o a a esa la ba e a
hema o-meningea, p oli e a en el sis ema ne ioso cen al y causa meningi is. La
al e ación de los genes elacionados con la sín esis de la cápsula y los LOS da luga a
un aumen o de la sensibilidad del meningococo a la mue e po el sue o, indicando
36
Vi ji M, Makepeace K, Fe guson DJ, Wa SM. 1996. Ca cinoemb yonic an igens (CD66) on
epi helial cells and neu ophils a e ecep o s o Opa p o eins o pa hogenic neisse iae. Mol Mic obiol.
22: 941-950.
37
Hamma s öm S. 1999. The ca cinoemb yonic an igen (CEA) amily: s uc u es, sugges ed
unc ions and exp ession in no mal and malignan issues. Semin Cance Biol. 9: 67-81.
38
Cunha CS, G i i hs NJ, Mu illo I, Vi ji M. 2009. Neisse ia meningi idis Opc in asin binds o
he cy oskele al p o ein alpha-ac inin. Cell Mic obiol. 11: 389-405.
39
Ca bonnelle E, Hill DJ, Mo and P, G i i hs NJ, Bou doulous S e al. 2009. Meningococcal
in e ac ions wi h he hos . Vaccine. 27: 78-89.
40
S ephens DS, G eenwood B, B and zaeg P. 2007. Epidemic meningi is, meningococcemia and
Neisse ia meningi idis. Lance . 369: 2196-2210.
In oducción
__________________________________________________________________________
24
así, la impo ancia de es os polisacá idos pa a sob e i i en el o en e sanguíneo
41
.
N. meningi idis es obje o de cons an es p esiones selec i as y su habilidad pa a
adap a se ápidamen e a los cambios en el ambien e es esencial pa a su
supe i encia
42
.
1.2.2.2. Respues a inmune en e al meningococo
Los mecanismos in oluc ados en la espues a inmune en e a la en e medad
meningocócica, que pueden se an o inna os como adqui idos, econocen es uc u as
de la supe icie bac e iana. Es e p oceso iene luga en múl iples localizaciones,
empezando en la mucosa naso a íngea, y con inuando en el sis ema ascula y
ó ganos in ec ados a medida que la en e medad a anza.
Respues a inmune humo al. An icue pos y sis ema del complemen o
El papel p incipal de los an icue pos en la p o ección con a la en e medad
meningocócica ha sido demos ado indi ec amen e po la elación in e sa en e los
í ulos de an icue pos an i-meningococales (ac i idad bac e icida del sue o) y la
incidencia de la en e medad según la edad del pacien e.
43
,
44
Un al o po cen aje de
ecién nacidos p esen an ac i idad bac e icida del sue o como esul ado del paso de
inmunoglobulinas p o ec i as ma e nas a a és de la placen a. Es a inmunidad a
disminuyendo as el pa o has a alcanza los 12 meses de edad (pe iodo en el cual la
suscep ibilidad a la en e medad es más al a). Es a inmunidad aumen a has a la edad
41
Geo oy MC, Floque S, Mé ais A, Nassi X, Pelicic V. 2003. La ge-scale analysis o he
meningococcus genome by gene dis up ion: esis ance o complemen -media ed lysis. Genome Res.
13: 391-398.
42
Gup a S, Ande son RM. 1999. Popula ion s uc u e o pa hogens: he ole o immune selec ion.
Pa asi ol Today. 15: 497-501.
43
Goldschneide I, Go schlich EC, A ens ein MS. 1969. Human immuni y o he meningococcus.
I. The ole o humo al an ibodies. J Exp Med. 129: 1307-1326.
44
Polla d AJ, F asch C. 2001. De elopmen o na u al immuni y o Neisse ia meningi idis. Vaccine.
19: 1327-1346.
In oducción
__________________________________________________________________________
25
adul a en la que el 65-85% de los indi iduos p esen an sue o bac e icida con a el
meningococo (Figu a 3).
Figu a 3. P e alencia dependien e de edad de la en e medad meningocócica en elación a la inmunidad
poblacional calculada po la ac i idad bac e icida del sue o ( omada y modi icada de Polla d AJ, 2001).
El sis ema implicado en la ac i idad bac e icida del sue o es el sis ema del
complemen o, compues o po un g upo de p o eínas (muchas con ac i idad
enzimá ica) que in e accionan secuencialmen e con un o den p ede inido. La
ac i ación de la cascada enzimá ica depende an o de la unión de un an icue po a la
supe icie bac e iana como po mecanismos de inmunidad inna a.
Exis en es ías de ac i ación del complemen o (Figu a 4-A): (i) ía clásica,
ac i ada po la in e acción an ígeno-an icue po; (ii) ía al e na i a, ac i ada po la
in e acción de es uc u as de la supe icie mic obiana con el componen e C3b y los
ac o es B y D; (iii) la ía de la lec ina, ac i ada cuando la lec ina de unión a manosa
se une a esiduos manosa p esen es en la supe icie bac e iana. Las es ías
comienzan con una secuencia de eacciones p o eolí icas en las que los p oduc os
gene ados con ibuyen a la ac i ación del siguien e componen e. Es os subp oduc os
In oducción
__________________________________________________________________________
26
pueden se ana ilo oxinas, ac o es quimio ác icos que es ablecen una ía química
pa a a ae células agocí icas e in lama o ias al luga de la in ección. Las es u as
con luyen en la o mación del enzima C3 con e asa, que ompe la p o eína C3
p oduciendo el componen e C3b, que ac i a los componen es a díos p o ocando la
lisis de la bac e ia.
En la ía clásica, cuando los an icue pos de iso ipo IgM, IgA, IgG1, IgG2 o
IgG3 se unen al an ígeno ocu e un cambio con o macional en su egión Fc,
pe mi iendo la unión del p ime componen e C1q, ac i ando así la ía clásica. El
esul ado es la o mación del complejo de a aque a memb ana (MAC), que es
al amen e lipo ílico y se inse a en las memb anas bac e ianas p o ocando la lisis
celula . Du an e la ac i ación del complemen o se libe an los agmen os C3a y C5a,
que son p omo o es de las unciones de los agoci os y la in lamación.
La ía al e na i a es un es ado de ac i ación pe manen e del componen e C3
que gene a C3b. En ausencia de an ígenos pe manece inac i o po la acción del
ac o I. An e la p esencia de pa edes bac e ianas, el C3b gene ado se une
co alen emen e a es as, impidiendo la ac uación del ac o I y pe mi iendo la
ac i ación del complemen o po es a ía, induciendo la opsonización y ac i ación del
MAC (Figu a 4-B).
La ía de la lec ina se ac i a po la unión de la p o eína lec ina de unión a
manosa (Mannose Binding Lec in [MBL]), que uniéndose a polisacá idos con
esiduos manosa (p esen es en las supe icies bac e ianas) ija los componen es C4,
C2, y C3 a la supe icie celula , ca alizando la o mación del MAC y p o ocando así
la lisis de la bac e ia. El complejo MBL-polisacá ido es semejan e a los complejos de
C1 de la ía clásica del complemen o.
En las memb anas de las células del huésped se encuen an moléculas de
egulación nega i a, que acele an la disociación de la con e asa de C3 en la p opia
memb ana o impiden la unión de MAC.
In oducción
__________________________________________________________________________
27
A)
B)
Figu a 4: A) Rep esen ación esquemá ica de las es ías de ac i ación del sis ema del complemen o. Las es
ías con luyen en la o mación de la con e asa de C5, desencadenando la o mación del complejo de a aque a
memb ana (C5-9) y la lisis celula . B) Fo mación del complejo de a aque a memb ana con capacidad ci olí ica
p opia de la cascada del complemen o ( omada y modi icada de Bo ego F e al, 2013).
In oducción
__________________________________________________________________________
28
Indi iduos con de iciencias en el sis ema del complemen o p esen an un
aumen o de suscep ibilidad a la en e medad meningocócica, lo que nos mues a la
impo ancia de es e sis ema en la espues a inmune en e al meningococo. C3 es un
componen e cen al del sis ema del complemen o en el que con luyen las es ías de
ac i ación, y cuya o u a a C3b pone en ma cha los mecanismos bac e icidas de lisis
y de opsono agoci osis. Es o explica que las de iciencias en C3 es én asociadas a un
inc emen o de la suscep ibilidad a la en e medad.
45
,
46
La de iciencia de la MBL
p edispone a un amplio ango de in ecciones bac e ianas
47
. La ca encia de los
componen es inales del complemen o (C5-C9) supone una elación más es echa
con el inc emen o en la suscep ibilidad a la en e medad meningocócica
48
,
49
,
50
. O os
dos componen es del complemen o cuya de iciencia se ha elacionado con la
en e medad meningocócica son los ac o es P
51
y D
52
,
53
.
Dis in os mecanismos pa a modi ica los componen es de supe icie pe mi en
a N. meningi idis e adi la acción del complemen o. La p esencia de cápsula en odos
los aislados ob enidos de pacien es y el hecho de que cepas mu an es sin cápsula sean
45
Bo o M, Fong KY, So AK, Ba low R, Rou ie R e al. 1992. Homozygous he edi a y C3
de iciency due o a pa ial gene dele ion. P oc Na l Acad Sci U S A. 89: 4957-4961.
46
Peleg D, Ha i -Bus an H, Ka z Y, Pelle S, Schlesinge M e al. 1992. Inhe i ed C3 de iciency
and meningococcal disease in a eenage . Pedia In ec Dis J. 11: 401-404.
47
Gup a K, Gup a RK, Hajela K. 2008. Disease associa ions o mannose-binding lec in & po en ial
o eplacemen he apy. Indian J Med Res. 127: 431-440.
48
A nold DF, Robe s AG, Thomas A, Fe y B, Mo gan BP e al. 2009. A No el Mu a ion in a
Pa ien wi h a De iciency o he Eigh h Componen o Complemen Associa ed wi h Recu en
Meningococcal Meningi is. J Clin Immunol. 29: 691-695.
49
Rameix-Wel i MA, Régnie CH, Bienaimé F, Blouin J, Schi e li J e al. 2007. He edi a y
complemen C7 de iciency in nine amilies: sub o al C7 de iciency e isi ed. Eu J Immunol. 37:
1377-1385.
50
Rosa DD, Pasqualo o AC, de Quad os M, P ezzi SH. 2004. De iciency o he eigh h componen
o complemen associa ed wi h ecu en meningococcal meningi is--case epo and li e a u e e iew.
B az J In ec Dis. 8: 328-330.
51
Fijen CA, Kuijpe EJ, Bul e MT, Daha MR, Danke J. 1999. Assessmen o complemen
de iciency in pa ien s wi h meningococcal disease in The Ne he lands. Clin In ec Dis 28: 98–105.
52
Sp ong T, Roos D, Weemaes C, Neeleman C, Geesing CL e al. 2006. De icien al e na i e
complemen pa hway ac i a ion due o ac o D de iciency by 2 no el mu a ions in he complemen
ac o D gene in a amily wi h meningococcal in ec ions. Blood. 107: 4865-4870.
53
Biesma DH, Hannema AJ, an Velzen-Blad H, Mulde L, an Zwie en R e al. 2001. A amily
wi h complemen ac o D de iciency. J Clin In es . 108: 233-240.
In oducción
__________________________________________________________________________
29
al amen e suscep ibles a la acción del complemen o
54
sugie en la i al impo ancia de
es a es uc u a en la i ulencia del meningococo
55
.
O o ac o impo an e que con ie e esis encia al complemen o son los LOS
(lipooligosacá idos). Exis en doce a ian es en N. meningi idis inmunológicamen e
dis inguibles. Los inmuno ipos L3, L7 y L9 son p edominan es en aislados de
in ecciones, que compa en la ca ac e ís ica de que su cadena ca bohid a ada α
con iene una acción que es idén ica a un an ígeno de g upo sanguíneo humano
56
.
Es os, así como L2 y L5, pueden se modi icados po sialización
57
, con i iéndoles las
ca ac e ís icas inhibido as del sis ema del complemen o.
Di e sos pa ógenos ienen la capacidad de cap a “ egulado es nega i os” del
sis ema del complemen o de la ase soluble pa a aumen a su supe i encia en el
sue o
58
, como C4BP y H, que ac úan a dis in os ni eles del sis ema del
complemen o
59
,
60
.
Respues a inmune celula .
Aunque la unción de la espues a inmune celula en e al meningococo es
menos cla a que la de la espues a inmune humo al, el mayo conocimien o de es os
54
Geo oy MC, Floque S, Me ais A, Nassi X, Pelicic V. 2003. La ge-scale analysis o he
meningococcus genome by gene dis up ion: esis ance o complemen media ed lysis. Genome Res. 13:
391–398.
55
an Deu en M, B and zaeg P, an de Mee JW. 2000. Upda e on meningococcal disease wi h
emphasis on pa hogenesis and clinical managemen . Clin Mic obiol Re . 13: 144–166.
56
Tsai CM. 2001. Molecula mimic y o hos s uc u es by lipooligosaccha ides o Neisse ia
meningi idis: cha ac e iza ion o sialyla ed and nonsialyla ed lac o-N-neo e aose (Galbe a1-
4GlcNAcbe a1-3Galbe a1-4Glc) s uc u es in lipooligosaccha ides using monoclonal an ibodies and
speci ic lec ins. Ad Exp Med Biol. 491: 525–542.
57
Pa liak V, B isson JR, Michon F, Uh ín D, Jennings HJ. 1993. S uc u e o he sialyla ed L3
lipopolysaccha ide o Neisse ia meningi idis. J Biol Chem. 268: 14146-14152.
58
Blom AM. 2004. S a egies de eloped by bac e ia and i us o p o ec ion om he human
complemen sys em. Scand J Clin Lab In es . 64: 479–496.
59
Ja a H, Ram S, Vogel U, Blom AM, Me i S. 2005. Binding o he complemen inhibi o C4bp o
se og oup B Neisse ia meningi idis. J Immunol. 174: 6299-6307.
60
Pizza M, Donnelly J, Rappuoli R. 2008. Fac o H-binding p o ein, a unique meningococcal
accine an igen.Vaccine. 26: 46-148.
In oducción
__________________________________________________________________________
30
aspec os ha pues o de mani ies o la c ucial impo ancia de la ac i ación de las células
del sis ema inna o en el desa ollo de una inmunidad humo al p o ec i a
61
Los
p incipales ipos celula es implicados en es a espues a son los g anuloci os
neu ó ilos, las células dend í icas y los mac ó agos.
La p edominancia de neu ó ilos en el líquido ce eb oespinal de pacien es con
meningi is meningocócica y su emp ana ac i ación en el anscu so de la in ección,
nos mues an su impo ancia en la eliminación del meningococo
62
, lo que ha sido
cons a ado en es udios con sue os de icien es en los úl imos componen es del sis ema
del complemen o
63
. Los neu ó ilos humanos eliminan los meningococos
opsonizados a a és de los ecep o es Fc-gamma. A su ez, son capaces de cap a y
elimina al meningococo de mane a no opsónica median e la unión de los ecep o es
CEACAM a las p o eínas Opa
64
.
Las células dend í icas y los mac ó agos uncionan como nexo de unión en e
la inmunidad inna a y la adap a i a. También egulan el inicio y desa ollo de la
espues a inmune, debido a su doble papel como células agocí icas y células
p esen ado as de an ígenos41. Pa a los se og upos A, B y C, la exp esión de la
cápsula educe conside ablemen e el acoplamien o a células dend í icas y la
agoci osis.
La unción de los lin oci os B y T en la espues a inmune p esen a g andes
di e encias, y según cual sea es imulado po los di e en es an ígenos se á
de e minan e en la inmunidad en e al meningococo. El polisacá ido capsula ,
excep o el polisacá ido A
65
, es imula las células B po unión con el ecep o de
61
Schmi C, Villwock A, Ku zai O. 2009. Recogni ion o meningococcal molecula pa e ns by
inna e immune ecep o s. In J Med Mic obiol. 299: 9-20.
62
Pe e s MJ, Heyde man RS, Faus S, Dixon GL, Inwald DP e al. 2003. Se e e meningococcal
disease is cha ac e ized by ea ly neu ophil bu no pla ele ac i a ion and inc eased o ma ion and
consump ion o pla ele -neu ophil complexes. J Leukoc Biol. 7: 722-730.
63
Pla ono AE, Ve shinina IV, Käyh y H, Fijen CA, Wü zne R e al. 2003. An ibody-dependen
killing o meningococci by human neu ophils in se um o la e complemen componen -de icien
pa ien s. In A ch Alle gy Immunol. 130: 314-321.
64
Sa an is H, G ay-Owen SD. 2007. The speci ic inna e immune ecep o CEACAM3 igge s
neu ophil bac e icidal ac i i ies ia a Syk kinase-dependen pa hway. Cell Mic obiol. 9: 2167-2180.
65
Mulle E, Apicella MA. 1988. T-cell modula ion o he mu ine an ibody esponse o Neisse ia
meningi idis g oup A capsula polysaccha ide. In ec Immun. 56: 259-266.
In oducción
__________________________________________________________________________
31
células B (BCR), induciendo su di e enciación a células plasmá icas p oduc o as de
an icue pos, pe o sin es imula las células T, po lo que no se p oducen células B de
memo ia nue as y desapa ece el ese o io exis en e, lo que esul a en una meno
espues a en subsiguien es dosis acunales, además de no se inmunogénico en
niños
66
,
67
. La p oducción y man enimien o de memo ia inmunológica equie e la
conjugación química de una p o eína anspo ado a al polisacá ido, induciendo una
espues a T-dependien e, posibili ando la di e enciación de células T colabo ado as
especí icas, que ayuda án a la es imulación de células B p oduc o as de an icue pos y
de memo ia. La p o ección a la go plazo a ni el de indi iduo depende de la
pe sis encia de an icue pos uncionales y el man enimien o de la memo ia
inmunológica. La elocidad con la que el meningococo in ade y p oduce
en e medad (en un plazo incluso de ho as) hace que la acción po pa e de las células
B sea ine icaz, ya que equie e 4 días o más pa a su pues a en uncionamien o,
excep o en casos con un pe íodo de incubación la go. Especialmen e en los pe íodos
con un mayo núme o de casos de en e medad meningococócica, la pe manencia de
an icue pos uncionales pod ía se cla e en la inmunidad indi idual y, al educi el
núme o de po ado es, en la inmunidad poblacional
68
.
1.3. Vacunas en e a la en e medad meningocócica
Neisse ia meningi idis es la bac e ia causan e de la mayo ía de casos de
meningi is en el mundo, la apidez de la en e medad y la di icul ad pa a dis ingui la
en ocasiones de o a in ección eb il, pueden lle a a la mue e de un indi iduo
p e iamen e sano en ho as. El a amien o de la en e medad educe la mo alidad
pe o un g an núme o de los pacien es sob e i en con secuelas impo an es
69
. La
mayo ía de los casos de en e medad meningocócica son causados po cinco de los
66
MacLennan J, Oba o S, Deeks J, Lake D, Elie C e al. 2001. Immunologic memo y 5 yea s a e
meningococcal A/C conjuga e accina ion in in ancy. J In ec Dis. 183: 97-104.
67
G ano DM, Polla d AJ. 2007. Reconside a ion o he use o meningococcal polysaccha ide
accine. Pedia In ec Dis J. 26: 716-722.
68
Polla d AJ, Pe e KP, Be e ley PC. 2009. Main aining p o ec ion agains in asi e bac e ia wi h
p o ein-polysaccha ide conjuga e accines. Na Re Immunol. 9: 213-220.
69
Vipond C, Ca e R, Fea e s IM. 2012. His o y o meningococcal accines and hei se ological
co ela es o p o ec ion. Vaccine. 30: B10-17.
In oducción
__________________________________________________________________________
38
NOMVs
WRAIR, USA
OMVs na i as de
cepa cápsula
de ec i a y con LOS
no sializados
Fase I
Segu a e
inmunogénica.
XXIV
Vacuna LOS
de oxi icados
GlaxoSmi hKline, Bélgica
OMVs Po A- con
sob eexp esión de
los LOS L2, L3 y
L7 de oxi icados
Fase I
Gene a espues a
bac e icida.
Al a eac i idad
c uzada.
XXV
Vacunas basadas en p o eínas ecombinan es
Vacuna
Fo mulación
E apa de desa ollo
ac ual
E icacia e inmunogenicidad
Re .
Bexse o (4CMenB)
No a is
GNA1030-NHBA
GNA2091- Hbp
NadA
OMVs B:4:P1.7-2,4
Opinión posi i a de
la Agencia Eu opea
de Medicina pa a su
uso a pa i de los 2
meses de edad.
Ap obada Ene o
2013
Basándose en el ipado de
Po A y MATS, p e isión de
cobe u a casi o al de las
cepas ci culan es en Eu opa.
La e icacia eal pod á
comp oba se una ez
in oducida en calenda ios
acunales de uno o más
países.
XXVI,
XXVII
Vacuna bi alen e Hbp
( LP2086)
P ize
Hbp sub amilia A
Hbp sub amilia B
Fase III
Respues a dependien e de
dosis. Inmunogénica y buena
ole abilidad. Buenos í ulos
de ac i idad bac e icida
con a 8 cepas del se og upo
B.
XXVIII
Las e e encias se mues an en la página 151.
T as el acaso del polisacá ido capsula B como an ígeno acunal, las
moléculas que más in e és han susci ado son las p o eínas de memb ana ex e na.
Tan o pacien es como po ado es de la en e medad, desa ollan an icue pos
bac e icidas di igidos con a an ígenos subcapsula es, lo que sugie e que las
p o eínas de memb ana ex e na puedan se candida os pa a el desa ollo de
acunas.
89
Las p ime as acunas de p o eínas de memb ana ex e na se desa olla on
a pa i de 1970, esul ando inmunogénicas en animales de expe imen ación pe o sin
gene a an icue pos bac e icidas en ensayos con humanos85.
Las p ime as o mulaciones que han mos ado e icacia con a la en e medad
meningocócica del se og upo B han sido aquellas basadas en esículas de memb ana
89
F asch CE, Chapman SS. 1973. Classi ica ion o Neisse ia meningi idis g oup B in o dis inc
se o ypes. Applica ion o a new bac e icidal-inhibi ion echnique o dis ibu ion o se o ypes among
cases and ca ie s. J In ec Dis. 127:149-154.
In oducción
__________________________________________________________________________
39
ex e na (OMVs) desa olladas en espues a a b o es epidémicos causados po una
cepa de e minada, siendo e icaces únicamen e en e a esa cepa conc e a, lo que se
conoce como es icción de cepa. La e icacia de es as acunas ue demos ada en
No uega (MenB acTM)
90
, Nue a Zelanda (MeNZB®)
91
,
92
, Chile
93
, Cuba y B asil
(VA-Mengoc-BC®)
94
, donde se han p oducido b o es epidémicos.
La espues a inducida po las acunas de esículas de memb ana ex e na es,
en g an pa e, especí ica del se osub ipo. Los an icue pos con a las p o eínas Po A y
Opc son los más impo an es en la mediación de la ac i idad bac e icida del sue o,
siendo la Po A la más inmunogénica de las p o eínas, pe o p esen a el incon enien e
de su hipe a iabilidad.
Pa a e adi el p oblema de la a iación an igénica de la p o eína Po A, en e
o as, el desa ollo de acunas ha sido en ocado desde dos pun os de is a di e en es.
Po un lado, en el desa ollo de o mulaciones que con engan las a ian es más
ep esen a i as de an ígenos inmunodominan es, y po o o lado se apues a po el uso
de an ígenos conse ados, no malmen e mino i a ios, y no inmunodominan es. Es e
úl imo en oque ha sido posible debido al g an a ance de las écnicas de gené ica
molecula en las úl imas décadas.
Pa a aumen a la cobe u a acunal y educi así el p oblema de la
es icción de cepa, ue on desa olladas cepas meningococales modi icadas
90
Høiby EA, Bjune G, F øholm LO, Eng J, Hals ensen A e al. 1991. The No wegian
meningococcal se og oup B ou e memb ane esicle accine p o ec ion ials: case acing,
meningococcal an igen de ec ion and se ological diagnosis. NIPH Ann. 14: 107-121.
91
Kelly C, A nold R, Galloway Y, O'Hallahan J. 2007. A p ospec i e s udy o he e ec i eness o
he New Zealand meningococcal B accine. Am J Epidemiol. 166: 817-823.
92
Wong SH, Lennon DR, Jackson CM, S ewa JM, Reid S e al. 2009. Immunogenici y and
ole abili y in in an s o a New Zealand epidemic s ain meningococcal B ou e memb ane esicle
accine. Pedia In ec Dis J. 28: 385-390.
93
Boslego J, Ga cia J, C uz C, Zollinge W, B and B e al. 1995. E icacy, sa e y, and
immunogenici y o a meningococcal g oup B (15:P1.3) ou e memb ane p o ein accine in Iquique,
Chile. Chilean Na ional Commi ee o Meningococcal Disease. Vaccine. 13: 821-829.
94
Sie a GV, Campa HC, Va cacel NM, Ga cia IL, Izquie do PL e al. 1991. Vaccine agains
g oup B Neisse ia meningi idis: p o ec ion ial and mass accina ion esul s in Cuba. NIPH Ann. 14:
195-210.
In oducción
__________________________________________________________________________
40
gené icamen e que exp esan di e en es ipos de Po A. Siguiendo es a ap oximación
el Ne he lands Vaccine Ins i u e (NVI) ha desa ollado dos o mulaciones,
“Hexamen”
95
,
96
y “Nonamen”
97
. Inicialmen e, la acuna hexa alen e (“Hexamen”)
ue desa ollada incluyendo los seis se osub ipos (OMVs de dos cepas con es Po A
di e en es cada una) que cub ían el 80% de odos los aislados clínicos de casos de
en e medad en Holanda. Los ensayos clínicos mos a on que HexaMen ue
inmunogénica en ecién nacidos, p eescola es y niños de co a edad. Sin emba go, se
equi ie on nume osas dosis pa a alcanza una ac i idad bac e icida signi ica i a y se
encon a on di e encias en la in ensidad de la espues a en e a las di e en es Po A
98
.
“Nonamen” incluye nue e Po A di e en es (OMVs de es cepas ecombinan es con
es Po A cada una) cub iendo el 75% de las cepas del se og upo B a ni el mundial,
según el NVI. Pe o debido al uso de de e gen es pa a su ob ención, las OMVs
esul aban de mala calidad. Desa olla on una “Nex -gene a ion Nonamen”, con las
mismas cepas (pu i icadas sin de e gen es) pe o a enuando el gen pxL1, esul ando
en un LPS menos óxico y a la ez man eniendo el e ec o adyu an e necesa io pa a
po encia la espues a inmune
99
. Ac ualmen e es a acuna se encuen a a la espe a de
comenza los ensayos clínicos pe inen es.
O as ap oximaciones de dis in os g upos se basan en acunas con OMVs
mejo adas gené icamen e en las que se egula la exp esión de de e minados
an ígenos. El Wal e Reed A my Ins i u e o Resea ch (USA), ha desa ollado es
cepas modi icadas gené icamen e en las que cada cepa incluye 2 p o eínas Po A
95
an de Ley P, an de Biezen J, Poolman JT. 1995. Cons uc ion o Neisse ia meningi idis
s ains ca ying mul iple ch omosomal copies o he po A gene o use in he p oduc ion o a
mul i alen ou e memb ane esicle accine. Vaccine. 13: 401–407.
96
Claassen I, Meylis J, an de Ley P, Pee e s C, B ons H e al. 1996. P oduc ion, cha ac e iza ion
and con ol o a Neisse ia meningi idis hexa alen class 1 ou e memb ane p o ein con aining esicle
accine. Vaccine. 14: 1001–1008.
97
an den Dobbels een GP. 2009. Nonamen, a mul i alen MenB accine, om de elopmen o
clinical s udies. En: 2nd In e na ional Wo kshop on Neisse ial Vaccines. Pág 18.
98
de Kleijn ED, de G oo R, La ebe AB, Labadie J, an Limp KC e al. 2000. Immunogenici y
and sa e y o a hexa alen meningococcal ou e -memb ane- esicle accine in child en o 2–3 and 7–8
yea s o age. Vaccine. 18: 1456–1466.
99
Kaaijk P, an S aa en I, an de Wa e beemd B, Boo EP, Le els LM e al. 2013. P eclinical
sa e y and immunogenici y e alua ion o a nona alen Po A na i e ou e memb ane esicle accine
agains se og oup B meningococcal disease. Vaccine. 31: 1065-1071.
In oducción
__________________________________________________________________________
41
di e en es, exp esan di e en es inmuno ipos de LOS y ienen una exp esión
inc emen ada de p o eínas conse adas (Ej. Hbp, NadA, Opc), ac ualmen e en
es udios clínicos ase I
100
. Po su pa e, Poolman y colabo ado es (GlaxoSmi hKline
Biologicals, Bélgica) es án ealizando es udios p eclínicos de di e en es
o mulaciones basadas en OMVs mejo adas en las que se han sob eexp esado
p o eínas mino i a ias (Omp85, TbpA, Hs , NspA) y educido la exp esión de
Po A
101
.
G acias al a ance de la genómica ha sido posible el desa ollo de nue as
es a egias pa a la iden i icación y de ección de an ígenos. La ecnología conocida
como acunología e e sa
102
u iliza la secuencia comple a del genoma del pa ógeno
de in e és pa a iden i ica in sílico nue os an ígenos, median e la de ección de genes
codi ican es pa a ac o es de pa ogenicidad y p o eínas asociadas a memb ana, cuya
ac i idad se con i ma expe imen almen e. A es os an ígenos se les denomina, en el
caso de N. meningi idis, Genomic-de i ed Neisse ial An igen (GNA). Pizza y
colabo ado es, jun o con The Ins i u e o Genomic Resea ch (USA) han aplicado po
p ime a ez es a es a egia con el obje i o de desa olla una acuna uni e sal en e
al se og upo B
103
.
T as secuencia el genoma de la cepa de N. meningi idis MC58 (se og upo
B) y median e el uso de he amien as compu acionales se de ec a on 600 posibles
p o eínas de memb ana o sec e ables, de las cuales 355 ue on pu i icadas y
u ilizadas pa a inmuniza a ones. Se selecciona on los an ígenos capaces de gene a
an icue pos bac e icidas, con una secuencia nucleo ídica conse ada y p esen es en
los p incipales clones i ulen os. Como esul ado, se desa olló una acuna con cinco
100
Keise PB, Biggs-Cica elli S, Mo an EE, Schmiel DH, Pin o VB e al. 2011. A phase 1 s udy o
a meningococcal na i e ou e memb ane esicle accine made om a g oup B s ain wi h dele ed
lpxL1 and synX, o e -exp essed ac o H binding p o ein, wo Po As and s abilized OpcA exp ession.
Vaccine. 29: 1413-1420.
101
Weynan s V, Denoël P, De os N, Janssens D, Fe on C e al. 2009. Gene ically modi ied L3,7
and L2 lipooligosaccha ides om Neisse ia meningi idis se og oup B con e a b oad c oss-
bac e icidal esponse. In ec Immun. 77: 2084-2093
102
Bambini S, Rappuoli R. 2009. The use o genomics in mic obial accine de elopmen . D ug
Disco e y Today. 14: 252-260.
103
Se u o D, Se ino L, Masignani V, Pizza M. 2009. Genome-based app oaches o de elop
accines agains bac e ial pa hogens. Vaccine. 27: 3245-3250.
In oducción
__________________________________________________________________________
42
an ígenos, GNA1870 ( Hbp), GNA1994 (NadA), GNA2132 (NHBA), GNA1030 y
GNA2091) que se denominó 5CVMB. Es a acuna indujo an icue pos bac e icidas
en a ones con a el 78-90% de un panel del 85 cepas gené icamen e di e en es
104
, es
ole able e inmunogénica en humanos. Los es udios en ase II demos a on que su
eac i idad c uzada es más limi ada de lo espe ado, po lo que se incluye on OMVs
en o mulación. La acuna pasó a denomina se 4CMenB, adop ando inalmen e el
nomb e Bexse o (No a is). La composición de ini i a se mues a en la Tabla 2.
T as una opinión posi i a po el “Comi ee o Medicinal P oduc s o Human Use”
de la Agencia Eu opea de Medicina con echa del 15 de No iemb e de 2012, en
Ene o de 2013 ue ap obado su uso a pa i de los 2 meses de edad po la Comisión
Eu opea. Finalmen e, en España, ha sido es ingido su uso a hospi ales po la
AEMPS (Agencia Española de Medicamen os y P oduc os Sani a io).
La emp esa P ize y colabo ado es han desa ollado una acuna bi alen e
LP2086, basada en dos p o eínas Hbp pe enecien es a dis in as sub amilias, que se
encuen a ac ualmen e en ase III
105
, con buenos esul ados que pa ecen indica que
end á una amplia cobe u a.
O as p o eínas de memb ana, de ec adas an o po acunología clásica
como e e sa, se encuen an o mando pa e de acunas en ensayos p eclínicos o
clínicos. En e es as p o eínas se incluyen nume osas adhesinas (Opc, Opa, NadA,
App, Nhha o la p o eína PiliQ)y p o eínas eguladas po hie o (TbpA y TbpB, LbpA
y LbpB, Fe A), en e o as.
104
Giuliani MM, Adu-Bobie J, Comanducci M, A icò B, Sa ino S e al. 2006. A uni e sal accine
o se og oup B meningococcus. P oc Na l Acad Sci U S A. 103: 10834-10839.
105
Ma shall HS, Richmond PC, Nissen MD, Wou e s A, Babe J e al. 2013. A phase 2 open-label
sa e y and immunogenici y s udy o a meningococcal B bi alen LP2086 accine in heal hy adul s.
Vaccine. S0264-410X: 00078-00079.
In oducción
__________________________________________________________________________
43
1.4. Valo ación de la capacidad p o ec o a de los candida os acunales en e a
Neisse ia meningi idis
En el caso de la en e medad meningocócica no es posible la ealización de
es udios alea o ios pa a de e mina la e icacia de las acunas, debido a una
incidencia demasiado baja pa a al in. Po ello, se de e mina a pa i de ensayos en
los que se es udia una de e minada unción inmunológica, ob eniendo esul ados que
se u ilizan como indicado es de p o ección en e al meningococo.
1.4.1. Ac i idad bac e icida del sue o
La ac i idad bac e icida del sue o es conside ada el mejo indicado de
p o ección en e a la en e medad meningocócica, especialmen e en e al se og upo
C. A pa i de una se ie de obse aciones se acep ó el hecho de que los an icue pos
bac e icidas desempeñan un papel p imo dial en la de ensa con a el meningococo
106
,
en e las cuales es án:
- la a eza de segundos episodios de en e medad meningocócica del mismo
se og upo en una epidemia.
- la al a suscep ibilidad a la en e medad en indi iduos con de ec os en los
componen es inales de la cascada.
- la capacidad de educción de la mo alidad po pa e del an isue o
e apéu ico.
La ac i idad bac e icida del sue o se de e mina median e el denominado
ensayo de ac i idad bac e icida, incubando diluciones se iadas del sue o es con a
la cepa diana y una uen e de complemen o exógena. Los an icue pos especí icos se
unen a la supe icie del meningococo a a és de an ígenos capsula es o
subcapsula es, así se ac i a la ía clásica del complemen o, esul ando en la mue e
de la bac e ia. El í ulo de ac i idad bac e icida del sue o es la máxima dilución a la
106
F asch CE, Bo ow R, Donnelly J. 2009. Bac e icidal an ibody is he immunologic su oga e o
p o ec ion agains meningococcal disease. Vaccine. 27: 112-116.
In oducción
__________________________________________________________________________
44
cual se p oduce una mo alidad del 50% o más con espec o al inicio de la
incubación
107
.
En los años 60 Goldschneide y colabo ado es es ablecie on el í ulo de
ac i idad bac e icida ≥4, con a el se og upo C, como indicado de p o ección
108
.
Sus abajos ue on lle ados a cabo usando sue os humanos agammaglobulémicos
como uen e de complemen o exógena, pe o la O ganización Mundial de la Salud
ecomienda desde 1976 el uso de complemen o de conejo come cial (Baby Rabbi
Complemen ) en los ensayos ealizados pa a la e aluación de acunas
polisaca ídicas
109
, debido a la di icul ad de es anda iza y compa a los abajos
lle ados a cabo con complemen o humano. También suponía un p oblema la
di icul ad de ob ene g andes can idades de sue o humano sin an icue pos con a el
meningococo. El ensayo ue e isado pa a es ablece un nue o í ulo indicado de
p o ección usando como uen e de complemen o exógena “Baby Rabbi
Complemen ”
110
.
Ac ualmen e se conside a que un í ulo de ac i idad bac e icida ≥8, con
complemen o de conejo, es indicado de p o ección con a el meningococo C a co o
plazo. La p o ección a la go plazo pa ece se más dependien e de la memo ia
inmunológica que de los ni eles de ac i idad bac e icida exis en es69, aunque
ambién o os es udios, ealizados du an e la in oducción de las acunas conjugadas
MenC en el Reino Unido, apun an a que la p o ección a la go plazo, en cie os
107
Bo ow R, Balme P, Mille E. 2005. Meningococcal su oga es o p o ec ion--se um bac e icidal
an ibody ac i i y. Vaccine.23: 2222-2227
108
Goldschneide I, Go schlich EC, A ens ein MS. 1969. Human immuni y o he meningococcus.
The ole o humo al an ibodies. J Exp Med. 129: 1307-1326.
109
Wo ld Heal h O ganiza ion. 1976. Reque imen s o meningococcal polysacha ide accine.
Wo ld Heal h O ganiza ion echnical epo se ies, no. 594. Gene a, Swi ze land: Wo ld Heal h
O ganiza ion.
110
Bo ow R, And ews N, Goldbla D, Mille E. 2001. Se ological basis o use o meningococcal
se og oup C conjuga e accines in he Uni ed Kingdom: ee alua ion o co ela es o p o ec ion. In ec
Immun. 69: 1568-1573.
In oducción
__________________________________________________________________________
45
g upos de edad, es el esul ado de la inmunidad o al del g upo
111
debido a la
educción en el núme o de po ado es.
El ensayo de ac i idad bac e icida ha sido u ilizado e icazmen e pa a
de e mina la inmunogenicidad de acunas con a los se og upos A, C, Y y W135,
jun o con ensayos de ELISA pa a e alua la especi icidad de los an icue pos
an icapsula es.
1.4.2. O os indicado es de p o ección en e al meningococo B
La p edicción de la e icacia de las acunas con a el se og upo B ca ece de
indicado es de p o ección adecuados, debido a que és as es án basadas en OMVs o
en p o eínas mino i a ias. La inmunogenicidad de es as acunas, que han demos ado
se e ec i as has a la echa, ha sido inicialmen e de e minada po ensayos de
ac i idad bac e icida
112
, p oponiendo como í ulo p o isional ≥4. Los da os ob enidos
en los ensayos de e icacia ealizados en la campaña de acunación con MeNZB
(No a is) sugie en que, mien as es én in oluc ados an ígenos inmunodominan es
como la Po A, los ensayos de ac i idad bac e icida pueden se un buen indicado
pa a e alua candida os acunales69.
En el año 2005, en una eunión in e nacional con el in de llega a un
consenso en la aplicación de los indicado es de p o ección en la e aluación de
acunas meningococales basadas en p o eínas, se concluyó que la ac i idad
bac e icida es adecuada como p ime a ap oximación pa a e alua la
inmunogenicidad
113
.
111
Maiden MC, Iba z-Pa ón AB, U win R, G ay SJ, And ews NJ e al. 2008. Impac o
meningococcal se og oup C conjuga e accines on ca iage and he d immuni y. J In ec Dis. 197: 737-
743.
112
Hols J, Fei ing B, Fuglesang JE, Høiby EA, Nøkleby H e al. 2003. Se um bac e icidal ac i i y
co ela es wi h he accine e icacy o ou e memb ane esicle accines agains Neisse ia meningi idis
se og oup B disease. Vaccine. 21: 734-737.
113
Bo ow R, Ca lone GM, Rosens ein N, Blake M, Fea e s I e al. 2006. Neisse ia meningi idis
g oup B co ela es o p o ec ion and assay s anda diza ion--in e na ional mee ing epo Emo y
Uni e si y, A lan a, Geo gia, Uni ed S a es, 16-17 Ma ch 2005. Vaccine. 24: 5093-5107.
In oducción
__________________________________________________________________________
46
Las acunas basadas en OMVs con ienen epi opos subcapsula es que pueden
induci dis in as espues as inmunológicas, po ello han sido desa ollados di e en es
ensayos que e alúan di e sos aspec os de la espues a inmune, pa a ob ene así, un
mayo conocimien o de la espues a gene ada po es e ipo de acunas y pode
es ablece unos indicado es de p o ección adecuados. En e es os ensayos des acan
los ensayos de unión a an icue pos a supe icie, ensayos de deposición de C3b, de
deposición de MAC, opsono agoci osis y ELISA, en e o os.
El ensayo de unión a supe icie nos mues a el o al de an icue pos de un
de e minado sue o que se unen a la bac e ia y la accesibilidad de un de e minado
an ígeno. Son necesa ios expe imen os complemen a ios pa a pode elaciona es os
da os con mecanismos de p o ección
114
.
Se ha demos ado en es udios p e ios con cie os an icue pos
meningococales, que con ie en p o ección con a la bac e emia meningocócica en
ausencia de ac i idad bac e icida
115
, pudiendo es a asociada a la habilidad de los
an icue pos pa a ac i a la deposición de C3b en la supe icie del meningococo
encapsulado. Es e componen e es un ligando de ecep o es de células agocí icas
uncionando como opsoninas, po lo que el ensayo de deposición de C3b, que mide
su unión a la supe icie bac e iana, unciona ía como indicado de la capacidad del
sue o pa a con e i p o ección.
La eliminación del meningococo po opsono agoci osis es á demos ada
116
,
pe o la exis encia de dis in os mé odos pa a su medición sin es anda iza imposibili a
la compa ación en e labo a o ios
117
. Los ensayos que miden más di ec amen e la
114
Findlow J, Taylo S, Aase A, Ho on R, Heyde man R e al. 2006. Compa ison and co ela ion
o Neisse ia meningi idis se og oup B immunologic assay esul s and human an ibody esponses
ollowing h ee doses o he No wegian meningococcal ou e memb ane esicle accine MenB ac.
In ec Immun. 74: 4557-4565.
115
Welsch JA, Moe GR, Rossi R, Adu-Bobie J, Rappuoli R e al. 2003. An ibody o genome-
de i ed neisse ial an igen 2132, a Neisse ia meningi idis candida e accine, con e s p o ec ion agains
bac e emia in he absence o complemen -media ed bac e icidal ac i i y. J In ec Dis. 188: 1730–
1740.
116
B edius RG, De kx BH, Fijen CA, de Wi TP, de Haas M e al. 1994. Fc gamma ecep o IIa
(CD32) polymo phism in ulminan meningococcal sep ic shock in child en. J In ec Dis. 170: 848-
853.
117
Ples ed JS, G ano DM. 2008. Vaccine-induced opsonophagocy ic immuni y o Neisse ia
meningi idis g oup B. Clin Vaccine Immunol. 15: 799-804.
In oducción
__________________________________________________________________________
47
unción inmunológica son los basados en ci ome ía de lujo, como los desa ollados
en el Na ional Ins i u e o Public Heal h de No uega (Na ional Ins i u e o Public
Heal h Opsonophagocy ic Assay [NIPH OPA]
118
y en la Heal h Public Agency de
Reino Unido (Po on Opsonophagocy ic Assay [Po on OPA])114.
Debido a los p oblemas que p esen a abaja con ensayos bac e icidas
(ele ados olúmenes de sue o y uen es ap opiadas de complemen o humano) las
emp esas que abajan en la elabo ación de acunas han empezado a u iliza ambién
ensayos de unión an ígeno-an icue po pa a soluciona el p oblema. P ize ha
desa ollado un ensayo (MEASURE), basado en ci ome ía de lujo, pa a medi la
can idad de la p o eína Hbp en la supe icie del meningococo de di e sos aislados.
En la misma línea, No a is ha desa ollado el “meningococcal an igen yping
sys em” (MATS)
119
, basado en un ELISA pa a medi la can idad exp esada de los
componen es acunales Hbp, NHBA y NadA. Es a écnica es á siendo es anda izada
pa a p edeci la cobe u a de o as acunas en es udio
120
. De odas o mas, es os
ensayos que han sido diseñados pa a medi an ígenos meningococales más que la
espues a de los an icue pos humanos, no son sus i u i os de la ac i idad bac e icida
del sue o como indicado de p o ección. Hab á que espe a a que las acunas basadas
en p o eínas sean ap obadas y sea analizado su impac o, pa a alida es e
ace camien o a es ablece nue os indicado es de p o ección69.
118
Aase A, Michaelsen TE. 1994. Opsonophagocy ic ac i i y induced by chime ic an ibodies o he
ou human IgG subclasses wi h o wi hou help om complemen . Scand J Immunol. 39: 581-587.
119
Boccadi uoco G, B unelli B, Pizza MG, Giuliani MM. 2012. A combined app oach o assess he
po en ial co e age o a mul icomponen p o ein-based accine. J P e Med Hyg. 53: 56-60.
120
Plikay is BD, S ella M, Boccadi uoco G, DeTo a LM, Agnusdei M e al. 2012. In e labo a o y
s anda diza ion o he sandwich enzyme-linked immunoso ben assay designed o MATS, a apid,
ep oducible me hod o es ima ing he s ain co e age o in es iga ional accines. Clin Vaccine
Immunol. 19: 1609-1617.
In oducción
__________________________________________________________________________
54
asociaciones homomé icas de las p o eínas chape onina de 60 kDa, glu amina
sin e asa y ce ol-ácido educ oisome asa, y nue e son complejos de po inas,
co espondien es a homóme os de la po ina Po B y es ipos de asociaciones
he e omé icas de las po inas Po A y Po B, y las p o eína RmpM: Po A/Po B,
Po B/RmpM y Po A/Po B/RmpM. En meno p opo ción ambién se de ec a on
homóme os de Po A y complejos de al o peso molecula o mados po
Po A/Po B/RmpM/MIP. La u ilización de cepas mu an es pe mi ió ambién
con i ma el papel c ucial de la Po B en el man enimien o de la in eg idad de los
complejos de po inas
139
.
Al ma gen de sus ca ac e ís icas uncionales, los complejos p o eicos
esul an muy in e esan es desde el pun o de is a an igénico, debido a que albe gan
un g an núme o de epi opos con o macionales que pudie an se in e esan es pa a el
desa ollo de acunas.
La clasi icación de los epi opos de mac omoléculas como las p o eínas,
con iene no malmen e dos ca ego ías: epi opos lineales y epi opos con o macionales.
Los epi opos lineales es án compues os po un segmen o aminoacídico de la cadena
polipep ídica capaz de uni an icue pos especí icos con a la p o eína in ac a y los
epi opos con o macionales es án cons i uidos po nume osos segmen os discon inuos
que se ag upan en el an ígeno plegado en su es uc u a na i a. La g an mayo ía de
los epi opos de p o eínas na i as econocidos po los lin oci os B son
con o macionales (≈90%)
140
. En in es igaciones ecien es mues an que los epi opos
inmunodominan es econocidos po células B apa ecen con las es uc u as e cia ia y
cua e na ia de las p o eínas
141
. Los complejos p o eicos de memb ana ex e na
albe gan nume osos epi opos con o macionales y se ha demos ado la exis encia de
139
Ma zoa J, Sánchez S, Fe ei ós CM, C iado MT. 2010. Iden i ica ion o Neisse ia meningi idis
ou e memb ane esicle complexes using 2-D high esolu ion clea na i e/SDS-PAGE. J P o eome
Res. 9: 611-619.
140
A non R, Van Regenmo el MH. 1992. S uc u al basis o an igenic speci ici y and design o
new accines. FASEB J. 6: 3265-3274.
141
I o HO, Nakashima T, So T, Hi a a M, Inoue M. 2003. Immunodominance o con o ma ion
dependen B-cell epi opes o p o ein an igens. Biochem Biophys Res Commun. 308: 770-776.
In oducción
__________________________________________________________________________
55
algunos an igénicos , an o en N. meningi idis
142
,
143
como en N. gono hoeae
144
,
145
,
lo cual in i a a su es udio con más p o undidad.
En nues o labo a o io se han es udiado las ca ac e ís icas an igénicas de los
p incipales complejos p o eicos de memb ana ex e na del meningococo median e
dis in os ensayos de uncionalidad de an icue pos como la ac i idad bac e icida del
sue o, unión de an icue pos a la supe icie bac e iana, deposición del componen e del
complemen o C3b, deposición del componen e del complejo de a aque a memb ana,
y ac i idad opsono agocí ica del sue o
146
.
Uno de los sue os más in e esan es ue el sue o denominado an i-CxChap,
ob enido po la inmunización con el complejo Cx-Chap, de 740 KDa, cons i uido po
ca o ce subunidades de la p o eína MSP63.
Es e sue o mos ó excelen es esul ados en los ensayos mencionados,
p esen ando una al a eac i idad c uzada. Además esul ó bac e icida al menos con a
la cepa homóloga. La ca ac e ización del mismo po Wes e n-Blo ing e eló la
exis encia de an icue pos con a dos p o eínas, la MSP63 y la p o eína
MIP(“mac ophage in ec i i y po en ia o “)
147
.
La exis encia de an icue pos con a la p o eína MIP se debió posiblemen e a
la co-pu i icación de es a en el p oceso de pu i icación del complejo Cx-Chap. La
p oblemá ica que se p esen ó ue no sabe cual es el an ígeno esponsable de los
esul ados mencionados.
142
A ake e G, Kessel M, Nguyen N, F asch CE. 1993. Cha ac e iza ion o a s ess p o ein om
g oup B Neisse ia meningi idis. J Bac e iol. 175: 3664-3668.
143
Sánchez S, Abel A, A enas J, C iado MT, Fe ei ós CM. 2006. C oss-linking analysis o
an igenic ou e memb ane p o ein complexes o Neisse ia meningi idis. Res Mic obiol. 157: 136-142.
144
Newhall WJ, Wilde CE, Sawye WD, Haak RA. 1980. High-M an igenic p o ein complex in he
ou e memb ane o Neisse ia gono hoeae, In ec . Immun. 27: 475–482.
145
Ba h D, Mis a AN, Kuma A, Vasco A. 2010. A no el s a egy o epi ope design in Neisse ia
gono hoeae. Bioin o ma ion. 5: 77-85.
146
Ma zoa J, Sánchez S, Cos oya L, Diéguez-Casal E, F eixei o P e al. 2012. Induc ion o
immune esponses by pu i ied ou e memb ane p o ein complexes om Neisse ia meningi idis.
Vaccine. 30: 2387-2395.
147
Ma zoa, J, Sánchez S, B ookes C, Taylo S, Go inge A e al. 2009. Chape onin (MSP63)
complexes induce bac e icidal and opsonophagocy ic c oss- eac i e an ibodies. Vaccimoni o . 18: 87-
89
In oducción
__________________________________________________________________________
56
1.7. P o eínas MSP63 y MIP
Las p o eínas de es és, como la p o eína MSP63, que pe enecen a la
amilia de las hsp60 de las p o eínas de choque é mico (“hea shock p o eins”), son
un g upo de p o eínas al amen e conse adas que se encuen an en casi odos los
p oca io as y euca io as
148
. En el campo de la inmunopa ología es e g upo de
p o eínas die on luga a un g an in e és como diana pa a la espues a inmune du an e
la in ección
149
,
150
. En Neisse ia, Pannekoek y colabo ado es desc ibie on po p ime a
ez la GSP63
151
(homóloga en N. gono hoeae de la MSP63). Es e mismo g upo
analizó la inmunogenicidad de la MSP63 du an e la in ección na u al po el
meningococo de ec ando la p esencia de un núme o impo an e de an icue pos en e
a es a p o eína en sue os de pacien es, an o en ase aguda como en ase
con alecien e
152
.
La p o eína MIP de 33 kDa pe enece a la amilia de los “mac ophage
in ec i i y po en ia o “(MIPs). Es a amilia comp ende p o eínas que p esen an
ac i idad enzimá ica pep idil-p olil cis/ ans isome asa (PPIasa) y que pa ecen es a
implicadas en la iniciación de la in ección de mac ó agos. Han sido desc i as como
ac o es de i ulencia en pa ógenos como Legionella pneumophila, Chlamydia
achoma is, T ypanosoma c uzi y o os. En N. gono hoeae ambién ha sido desc i a
una lipop o eína que p esen a al a homología con las MIPs
153
. La p o eína MIP de N.
gono hoeae (Ng-MIP) mues a ele an es simili udes con la de Legionella (Lg-
148
Mo imo o RI, Tissie es A and Geo gopoulos C. 1990. The s ess esponse, unc ion o he
p o eins, and pe spec i es. In: Mo imo o RI, Tissie es A and Geo gopoulos C, eds. S ess P o eins In
Biology and Medicine. Cold Sp ing Ha bo Labo a o y P ess, 1-36.
149
Mu ay PJ, Young RA. 1992. S ess and immunological ecogni ion in hos -pa hogen
in e ac ions. J Bac e iol. 174: 4193-4196.
150
Kau mann SH. 1990. Hea shock p o eins and he immune esponse. Immunol Today. 11: 129-
136.
151
Pannekoek Y, an Pu en JP, Danke J. 1992. Iden i ica ion and molecula analysis o a 63-
kilodal on s ess p o ein om Neisse ia gono hoeae. J Bac e iol. 174: 6928-6937.
152
Pannekoek Y, Schuu man IG, Danke J, an Pu en JP. 1993. Immunogenici y o he
meningococcal s ess p o ein MSP63 du ing na u al in ec ion. Clin Exp Immunol. 93: 377-381.
153
Leuzzi R, Se ino L, Sca selli M, Sa ino S, Fon ana MR, e al. 2005. Ng-MIP, a su ace-exposed
lipop o ein o Neisse ia gono hoeae, has a pep idyl-p olyl cis/ ans isome ase (PPIase) ac i i y and is
in ol ed in pe sis ence in mac ophages. Mol Mic obiol. 8: 669-681.
In oducción
__________________________________________________________________________
57
MIP), en ambas especies es á expues a en supe icie y p esen a ac i idad PPIasa. La
Ng-MIP compa e ambién p opiedades es uc u ales con Lg-MIP al o ma
homodíme os en solución, ca ac e ís ica impo an e pa a la uncionalidad de la
p o eína. Sampson y Go schlich desc ibie on, en 1992, una PPIasa en N. meningi idis
que mos aba una homología del 47% al dominio C- e minal de la Ng-MIP
154
.
Con a iamen e a Ng-MIP, es a PPIasa de N. meningi idis se localiza en el
ci oplasma. Resul ados ob enidos en nues o labo a o io sugie en la p esencia de es a
p o eína en supe icie, lo cual no con adice el abajo de Sampson y Go schlich, ya
que al igual que N. gono oheae p esen a múl iples genes que codi ican pa a
p o eínas con ac i idad PPIasa con dis in as localizaciones y, eniendo en cuen a su
p oximidad ilogené ica y las simili udes an o isiológicas como pa ógenas, N.
meningi idis pod ía ambién p esen a dis in as p o eínas PPIasas.
154
Sampson BA, Go schlich EC. 1992. Neisse ia meningi idis encodes an FK506-inhibi able
o amase. P oc Na l Acad Sci U S A. 89: 1164-1168.
2. Obje i os
Obje i os
___________________________________________________________________
61
Neisse ia meningi idis con inua siendo una de las p incipales causas de
meningi is en el mundo. El desa ollo de acunas basadas en el polisacá ido capsula
casi ha conseguido la eliminación del se og upo C, y odo indica que ocu i á lo
mismo con los se og upos A, Y y W135. El se og upo B se ha con e ido en el
p incipal esponsable de las in ecciones en países desa ollados, ep esen ando la
mayo ía de los casos espo ádicos en a ios países eu opeos. Debido a la ine icacia de
es e ipo de acunas con a el se og upo B, se han seguido múl iples es a egias pa a
alcanza al in, con buenos esul ados en algunos casos, aunque dicha e icacia se
limi a a la p e ención de la en e medad causada po las cepas empleadas en la
elabo ación de las mismas.
Los a ances en genómica bac e iana y el uso de modelos de p edicción in
silico lle a on al desa ollo de una nue a gene ación de acunas pe o, a pesa de los
impo an es a ances alcanzados, oda ía no se dispone de una o mulación
o almen e e icaz y con amplia cobe u a.
En los úl imos años nues a línea de in es igación se ha cen ado en el
es udio de los complejos p o eicos de memb ana ex e na como componen es
acunales, debido a la posibilidad de que algunos de los epi opos con o macionales
que albe gan es as es uc u as sean p o ec i os y conse ados.
Los esul ados ob enidos en nues o labo a o io han mos ado que el
complejo de 740 KDa o mado po ca o ce subunidades de la p o eína MSP63 (Cx-
Chap) de Neisse ia meningi idis pod ía se un an ígeno muy in e esan e. El an i-
sue o ob enido en e a es e complejo mos ó buenos esul ados en di e sos
indicado es de p o ección además de una g an eac i idad c uzada. Sin emba go, la
ca ac e ización de es e sue o indicó la p esencia de an icue pos no solo con a la
p o eína MSP63, sino ambién en e a o a p o eína al amen e inmunogénica
denominada MIP, posiblemen e debido a la co-pu i icación de es a úl ima, sin pode
de e mina así, cual de es as dos p o eínas es la esponsable de los buenos esul ados
ob enidos con el sue o an i-CxChap.
Obje i os
___________________________________________________________________
62
La inalidad del p esen e abajo se cen a en de e mina la
impo ancia an igénica de es as dos moléculas, analizando ambién la di e encia
en la espues a inmune al emplea o no di e en es adyu an es en el p oceso de
ob ención de los sue os en e a las mismas.
Po lo an o, los obje i os conc e os plan eados pa a log a dicho in son los
siguien es:
1. Pu i icación de las p o eínas MSP63 y MIP de N. meningi idis.
2. Inclusión de las p o eínas en liposomas.
3. Ob ención y ca ac e ización de sue os inmunes empleando di e en es
adyu an es.
4. Análisis uncional de los an icue pos p esen es en los sue os ob enidos.
5. Valo ación de las p o eínas MSP63 y MIP como candida os acunales.
3. Ma e ial y Mé odos
Ma e ial y Mé odos
____________________________________________________________________
70
desna u alizada. La elec o o esis se ealizó a un ol aje cons an e de 150 V du an e
1 h, as la cual los geles se iñe on con CBB y inción de zinc. Se co ó del gel la
banda co espondien e a la p o eína y se p ocedió a la eliminación de la inción.
3.3.3. Elec o-elución
Pa a la elución de la p o eína p esen e en el gel de poliac ilamida se usó el
sis ema Elec o-Elu e Model 422 (Bio-Rad Labo a o ies, Richmond, CA, EEUU).
P e iamen e a la elución, las memb anas ue on calen adas en el ampón de elución
du an e 1 h a 60ºC. El sis ema de elec o-elución se ensambló siguiendo las
ins ucciones del ab ican e (Figu a 6).
Figu a 6. Esquema del sis ema de elec o-elución Elec o-elu e 422. El ubo e ical se llena con ampón de
elución. El elec odo nega i o se si úa en la pa e supe io y el elec odo posi i o debajo de la memb ana. Las
mac omoléculas son conducidas po la co ien e eléc ica ue a del gel, a a és del sepa ado has a se e enidas
po una memb ana de diálisis que se coloca cub iendo la apa. Tomada de: Model 422 Elec o-Elu e Ins uc ion
Manual Bio-Rad.
La i a de gel ue homogeneizada mecánicamen e y pos e io men e se
in odujo en el ubo de c is al. Una ez añadido el ampón de elec o o esis, la
Tubo de c is al
Adap ado de silicona
Memb ana de diálisis
Ti a de gel
Sepa ado
Ma e ial y Mé odos
____________________________________________________________________
71
p o eína se eluyó a 8-10 mA po ubo du an e 5 h. Finalmen e la p o eína eluída y
ecupe ada se analizó po SDS-PAGE y se cuan i icó po el mé odo BCA.
3.4. Ob ención de la p o eína MIP
La p o eína MIP ue pu i icada induciendo la exp esión de las p o eínas del
clon BL21(DE3)MIP ob enido. Todo el p oceso se de alla a con inuación.
3.4.1. Clonación de la p o eína MIP de N.meningi idis
Pa a la clonación de la p o eína MIP, se diseña on los cebado es o
“p ime s” y ue on analizados con el p og ama de acceso lib e P ime 3 ( . 0.4.0), en
los cuales se inco po a on si ios de es icción pa a las enzimas EcoRI y NcoI. Las
secuencias de los cebado es, u ilizados pa a la ealización de una PCR (“Polyme ase
Chain Reac ion”) con el in de ampli ica el gen que codi ica la p o eína MIP, se
desc iben a con inuación:
w- mip 5´-GTCCATGGACACCATTTTCAAAATCAGC-3´ Si io de es icción NcoI
e - mip 5´-GGACTCGGAATTCATTTACTTTTTTGATGT-3´Si io de es icción EcoRI
La secuencia comple a del gen con los cebado es diseñados ue la siguien e:
>P ime s + gen Mip Neisse ia meningi idis
5’GTCCATGAACACCATTTTCAAAATCAGCGCACTGACCCTTTCCGCCGCTTTGGCACTTTCCGC
CTGCGGCAAAAAAGAAGCCGCCCCCGCATCTGCATCCGAACCTGCCGCCGCTTCTTCCGCGCA
GGGCGACACCTCTTCGATCGGCAGCACGATGCAGCAGGCAAGCTATGCGATGGGCGTGGAC
ATCGGACGCTCCCTGAAGCAAATGAAGGAACAGGGCGCGGAAATCGATTTGAAAGTCTTTA
CCGAAGCCATGCAGGCAGTGTATGACGGCAAAGAAATCAAAATGACCGAAGAGCAGGCTC
AGGAAGTCATGATGAAATTCCTTCAGGAACAACAGGCTAAAGCCGTAGAAAAACACAAGGC
GGACGCGAAGGCCAATAAAGAAAAAGGCGAAGCCTTTCTGAAAGAAAATGCCGCCAAAGA
CGGCGTGAAGACCACTGCTTCCGGCCTGCAATACAAAATCACCAAACAGGGCGAAGGCAAA
CAGCCGACCAAAGACGACATCGTTACCGTGGAATACGAAGGCCGCCTGATTGACGGTACGG
TATTCGACAGCAGCAAAGCCAACGGCGGCCCGGTCACCTTCCCTTTGAGCCAAGTGATTCCG
GGTTGGACCGAAGGCGTACAGCTTCTGAAAGAAGGCGGCGAAGCCACGTTCTACATCCCGT
CCAACCTTGCCTACCGCGAACAGGGTGCGGGCGACAAAATCGGTCCGAACGCCACTTTGGTA
TTTGATGTGAAACTGGTCAAAATCGGCGCACCCGAAAACGCGCCCGCCAAGCAGCCGGCTCA
AGTCGACATCAAAAAAGTAAATGAATTCCGAGTCC3’
Ma e ial y Mé odos
____________________________________________________________________
72
Ve de bases de las secuencias consecu i as al gen den o del genoma de la cepa.
Rojo cambio de base ealizado.
Neg i a secuencia mip
Ama illo p ime s
Se ealizó la op imización de la ampli icación del gen po PCR, empleando
como molde ADN de la cepa N. meningi idis H44/76 ex aído po choque é mico.
Con los cebado es desc i os y a una concen ación de MgCl2 de 2,5 mM se p ocedió
a la ampli icación en un e mociclado MyCycle TM (Bio-Rad Lab., Richmond, CA,
EEUU). Las condiciones inales de los ciclos de la PCR se de allan a con inuación:
- Desna u alización inicial: 95 ºC, 3 minu os.
- 30 ciclos:
o Desna u alización: 95 ºC, 25 segundos.
o Alineamien o: 65 ºC, 30 segundos.
o Elongación: 72 ºC, 25 segundos.
- Elongación inal: 72 ºC, 5 minu os.
Una ez ob enido, se ealizó la limpieza del p oduc o de PCR con el
GenElu eTM PCR Clean-Up Ki (Sigma-Ald ich Inc., S . Louis, MO, EEUU) y ue
en iado a la Unidad de Secuenciación y Análisis de agmen os, pe enecien e a la
Red de In aes uc u as de Apoyo a la In es igación y Desa ollo Tecnológico
(RIADT) de la Uni e sidad de San iago de Compos ela, pa a su secuenciación
u ilizando BigDye® Te mina o 3.1.
También se ealizó una elec o o esis en gel de aga osa 0,8%, con el
p oduc o de la PCR, en TAE1X (T is/Ace ic Acid/EDTA, Bio-Rad Lab., Richmond,
CA, EEUU). Se usó como ampón de mues a Nucleic Acid Sample Loading Bu e
5X (Bio-Rad Lab., Richmond, CA, EEUU) y como ma cado es de peso molecula
EZ Load 100bp Molecula Rule (Bio-Rad Lab., Richmond, CA, EEUU). La
elec o o esis anscu ió a 100 V du an e, ap oximadamen e, 30 min.
Ma e ial y Mé odos
____________________________________________________________________
73
Se p ocedió a una doble diges ión con los enzimas Nco I y EcoR I
(In i ogen, Li e Technologies Co p., Ca lsbad, CA, EEUU), an o del p oduc o de
PCR ob enido, como del ec o de clonación pT cHis2 TOPO® (In i ogen, Li e
Technologies Co p., Ca lsbad, CA, EEUU) que incluye un gen de esis encia a la
ampicilina. Pa a el a amien o con las enzimas de es icción se empleó el bu e K,
incluido pa a su uso con el enzima NcoI , debido a p esen a la mejo ac i idad
ela i a pa a ambos enzimas. Las can idades empleadas de cada eac i o se de allan a
con inuación:
VECTOR pT cHis2 TOPO® MIP
10x Bu e K 3µL 3µL
DNA 10µL 15µL
EcoRI 1,5µL 1,5µL
NcoI 1,5µL 1,5µL
BSA 3µL 3µL
H2O es é il 11µL 6µL
Los cálculos ue on ealizados siguiendo las indicaciones del manual de la
enzima NcoI de In i ogen. T as el a amien o con los enzimas de es icción
du an e 1h 30 min, se ealizó una limpieza con el GenElu eTM PCR Clean-Up Ki
(Sigma-Ald ich Inc., S . Louis, MO, EEUU).
Pa a la ob ención del plásmido necesa io, se ealizó la unión del ec o con
el p oduc o usando la enzima T4 DNA Ligase (In i ogen, Li e Technologies Co p.,
Ca lsbad, CA, EEUU) con las can idades indicadas en la siguien e eacción de
clonación y siguiendo el p o ocolo del ab ican e:
5x Ligasa Bu e 4µL
DNA ec o 10µL
DNA mip 5µL
T4 DNA ligasa 1µL
Ma e ial y Mé odos
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74
El plásmido ob enido se usó pa a la ans o mación de las células
químicamen e compe en es de Esche ichia coli One Sho ® TOP10 (In i ogen Li e
Technologies Co p., Ca lsbad, CA, EEUU) siguiendo el p o ocolo desc i o po el
ab ican e. Se p ocedió a la siemb a de las células ob enidas en placas de medio
Lu ia Be ani (LB) aga con ampicilina (50 µg/mL) y glucosa (0,5%). Se lle ó a cabo
una selección de los clones ob enidos y se ealiza on cul i os en medio líquido LB
pa a la pu i icación de los plásmidos con QIAp ep Spin Minip ep Ki (Quiagen
Sciences Inc., Ge man own, MD, EEUU) siguiendo las indicaciones del ab ican e.
T as una nue a PCR pa a comp oba la p esencia del gen que codi ica la p o eína
MIP, se selecciona on y gua da on los clones ans o mados en LB-glice ol a -80 ºC.
A pa i de uno de los clones One Sho ® TOP10 seleccionados, se pu i icó el ADN
plasmídico pa a la ans o mación de las células químicamen e compe en es de
Esche ichia coli One Sho ® BL21(DE3) (In i ogen, Li e Technologies Co p.,
Ca lsbad, CA, EEUU), que son óp imas pa a la exp esión de p o eínas. T as las
comp obaciones, se seleccionó un clon que con enía el plásmido con el gen de la
p o eína MIP, que se denominó BL21(DE3)MIP, pa a la exp esión de la p o eína.
3.4.2. Exp esión y pu i icación de la p o eína MIP
El p ocedimien o pa a la exp esión de la p o eína es una modi icación del
p o ocolo desc i o po Samb ook y colabo ado es
162
. A pa i de un aislamien o del
clon BL21(DE3)MIP en placas con medio YTX2 aga con ampicilina a 36,5ºC
du an e 24 ho as, se inocula on 8 ubos de 10 mL del mismo medio. Los ubos se
incuba on du an e 18 ho as en agi ación cons an e a 36,5 ºC. La suspensión
bac e iana ob enida de dos ubos se u ilizó pa a inocula un ma az con 500 mL de
medio YTX2 con ampicilina (en o al 4 ma aces) y se incuba on en las mismas
condiciones du an e una ho a. Después de la incubación, y an es de la inducción, se
omó una mues a de 500 µL (AI) pa a comp oba la exp esión po SDS-PAGE. Es a
se indujo añadiendo isop opyl-β-D- hiogalac oside (IPTG, Sigma-Ald ich Inc., S .
162
Samb ook J, F i sch EF, Mania is T. 1989. Molecula cloning: a labo a o y manual. 2nd edi ion.
Pág. 17.8. Cold Sp ing Ha bo Labo a o y P ess.
Ma e ial y Mé odos
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75
Louis, MO, EEUU) a una concen ación inal de 0,5 mM y se incuba on du an e 5 h
en las mismas condiciones. Al cabo de es e iempo se omó o a mues a de 500 µL
(DI). El cul i o se cen i ugó a 10.000 x g du an e 20 min y las células se
esuspendie on en 25 mL de PBS 1x po li o de cul i o. Se le añadió inhibido de
p o easas (250 µL po g amo de p o eína) y lisozima (0,1 mg/mL). Las células se
congela on a -20 ºC.
Pa a p epa a la suspensión p o eica pa a la pu i icación de la p o eína MIP,
se descongela on las células y se esuspendie on en ampón de lisis (U ea 8M.
NaH2PO4 0,1M, T is-HCl 10mM, Imidazol 20mM, pH 8.0). T as 1 ho a de
incubación se sonica on median e 10 pulsos de 10 s con pausas de 30 s.
La pu i icación de la p o eína se ealizó po c oma og a ía de a inidad a iones
me álicos inmo ilizados (IMAC), u ilizando una columna de Ni-NTA
(HisT apTMFF-5mL, GE Heal hca e, Waukesha, WI, EEUU), según lo desc i o po
Ch is odoulides y colabo ado es
163
. El mon aje de la columna se ealizó según
ins ucciones del ab ican e. T as la ca ga de la mues a, se p ocedió al la ado de las
uniones inespecí icas con 75 mL de ampón de la ado (U ea 8M. NaH2PO4 0,1M,
T is-HCl 10mM, Imidazol 20mM, pH 6.3). La p o eína ecombinan e se ecupe ó
con 30 mL de ampón de elución (U ea 8M, NaH2PO4 0,1M, T is-HCl 10mM,
Imidazol 200mM, pH 5.9). Du an e odo el p oceso se ecogie on alícuo as de 3 mL
pa a se analizadas po do -blo ing con inción de Rojo Ponceau
164
y po SDS-
PAGE, y pode así selecciona las alícuo as con la p o eína MIP.
La concen ación de la p o eína se ealizó con las columnas Amicon Ul a 15
10K<15 mL (EMD Millipo e, Bille ica, MA, EEUU) siguiendo las ins ucciones
indicadas po el ab ican e, ealizando un la ado con agua MilliQ pa a la eliminación
de la u ea p esen e en el ampón de elución. La p o eína concen ada se cuan i icó
163
Ch is odoulides M, Jolley KA, Heckels JE. 2001. Recombinan p o eins in accine de elopmen .
En: Meningococcal accines: Me hods and P o ocols. And ew J. Polla d, Ma in CJ. Ediciones
Maiden. Pag. 167-180. Humana P ess.
164
Samb ook J, F i sch EF, Mania is T. 1989. Molecula cloning: a labo a o y manual. 2nd
edi ion.. Pág. 18.67. Cold Sp ing Ha bo Labo a o y P ess.
Ma e ial y Mé odos
____________________________________________________________________
76
po el mé odo BCA, p e iamen e desc i o, y se comp obó su p esencia po SDS-
PAGE. Se p ocedió al en ío de las bandas ob enidas en la elec o o esis pa a su
iden i icación po MALDI-TOF/TOF “Pep ide Mass Finge p in ” al Se icio de
Espec ome ía de Masas y P o eómica de la RIADT (Red de In aes uc u as de
Apoyo a la In es igación y Desa ollo Tecnológico) de la Uni e sidad de San iago
de Compos ela.
3.5. Inclusión de la p o eína MIP en liposomas
La inco po ación de la p o eína en liposomas se lle ó a cabo siguiendo el
p o ocolo desc i o po F eixei o y colabo ado es
165
, como se de alla a con inuación.
P epa ación de la solución p o eína-de e gen e
Se esuspendió 1 mg de p o eína MIP en ampón HEPES 10 mM (pH 7.2)
con un 2% de SDS has a una concen ación de 1mg/mL. La solución se comple ó
añadiendo 4 mL de HEPES 10 mM (pH 7.2) con 100 mg de n-oc il-β-D-
glucopi anósido y se incubó 3 ho as a empe a u a ambien e.
P epa ación de las memb anas lipídicas
Pa a p epa a la capa lipídica, se disol ie on L-α- os a idilcolina y coles e ol
en 3 mL de clo o o mo en una p opo ción 6:2, empleando un o al de 20 mg. El
disol en e se eliminó en un o a apo a 25 ºC, o mando así la capa lipídica.
La capa lipídica se solubilizó con la inco po ación de la solución de p o eína-
de e gen e y se incubó 1 ho a a empe a u a ambien e. Los liposomas se o ma on
po diálisis en e a PBS con un 0,0001% hime osal du an e 72 ho as a 4 ºC,
cambiando el ampón cada 24 ho as. Los liposomas unilamina es se ob u ie on po
165
F eixei o P, Diéguez-Casal E, Cos oya L, Seijo B, Fe ei ós CM e al. 2013. S udy o he
s abili y o p o eoliposomes as ehicles o accines agains Neisse ia meningi idis based on
ecombinan po in complexes. In J Pha m. 443: 1-8.
Ma e ial y Mé odos
____________________________________________________________________
77
ex usión (Mini-Ex ude , A an i Pola Lipids Inc., AL, EEUU), ealizando los
siguien es pases po ese mismo o den:
- 3 pases a a és de memb anas de 0,8 µm.
- 3 pases a a és de memb anas de 0,4 µm.
- 13 pases a a és de memb anas de 0,1 µm.
Finalmen e, se ealizó una cen i ugación a 200.000 x g a 4ºC pa a ecupe a
los p o eoliposomas (Lip-MIP) y esuspende los en 2 mL de PBS con un 10% (p/ )
de un agen e c iop o ec o (glucosa). Se cuan i icó el sob enadan e, con el mé odo
BCA, pa a ene una medida indi ec a del o al de p o eína inco po ada en los
liposomas. Pa a la co ec a conse ación de los p o eoliposomas ue on lio ilizados
(Lyph Lock6, Labconco, MO, EEUU) en alícuo as y se almacena on en un desecado
a empe a u a ambien e p o egidos de la luz. Se p epa a on ambién, liposomas sin
p o eína pa a se usados como con ol (LipC).
Pa a la comp obación de la composición de los p o eoliposomas se ealizó
una SDS-PAGE, Wes e n-blo ing y do -blo ing y se midió su amaño en un
Ze asize Nano ZS (Mal e n Ins umen s L d., Wo ces e shi e, Reino Unido). El
ángulo pa a la de ección de la luz dispe sada se ijó a 173° y las mediciones se
ealiza on a 25 °C.
3.6. Ob ención de sue os inmunes
Se ob u ie on un o al de cinco sue os inmunes (an i-MSP63, an i-MIP,
an i-MIP-Al, an i-MIP-F , an i-Lip-MIP), un sue o no inmune (SNI) y un sue o
con ol con liposomas (an i-LipC).
Ma e ial y Mé odos
____________________________________________________________________
78
Pa a la ob ención de los sue os se lle ó a cabo un p o ocolo de
inmunización
166
con 10 a ones CBA pa a cada sue o, de 4 semanas de edad, usando
como an ígeno:
- Pa a el sue o an i-MSP63: La p o eína MSP63 pu i icada a pa i de geles con
adyu an e de F eund (Sigma-Ald ich Inc., S . Louis, MO, EEUU).
- Pa a el sue o an i-MIP: La p o eína MIP sin adyu an es.
- Pa a el sue o an i-MIP-Al: La p o eína MIP usando como adyu an e
Al(OH)3 (Alhyd ogel 2% ,In i oGen Inc., San Diego, CA, EEUU).
- Pa a el sue o an i-MIP-F : La p o eína MIP con adyu an e de F eund
(Sigma-Ald ich Inc., S . Louis, MO, EEUU).
- Pa a el sue o an i-LipC: Los liposomas LipC, sin p o eína.
- Pa a el sue o an i-Lip-MIP: Los p o eoliposomas Lip-MIP sin adyu an es.
Se ealiza on un o al de es inmunizaciones espaciadas po 14 días. La
sang e ue ex aída as 5 días de la úl ima dosis de an ígenos.
El p o ocolo de inmunización pa a cada a ón ue:
1ª dosis de inmunización:
- Sue o an i-MSP63: 5 µg de la p o eína MSP63 en 50 µL de agua más 50 µL
de adyu an e comple o de F eund.
- Sue o an i-MIP: 5 µg de la p o eína MIP en 100 µL de agua
- Sue o an i-MIP-Al: 5 µl de la p o eína MIP en 50 µL de agua más 50 µL de
Al(OH)3.
- Sue o an i-MIP-F : 5 µg de la p o eína MIP en 50 µL de agua más 50 µL de
adyu an e comple o de F eund.
- Sue o an i-Lip-MIP: 5 µg de MIP de p o eoliposomas Lip-MIP en 100 µL de
agua.
166
B odeu BR, La ose Y, Tsang P, Hamel J, Ash on F e al. 1985. P o ec ion agains in ec ion
wi h Neisse ia meningi idis g oup B se o ype 2b by passi e immuniza ion wi h se o ype-speci ic
monoclonal an ibody. In ec Immun. 50: 510-516.
Ma e ial y Mé odos
____________________________________________________________________
79
- Sue o an i-LipC: El mismo olumen de Lip-MIP de liposomas LipC en 100
µL de agua.
2ª y 3ª dosis de inmunización:
Pa a los sue os an i-MIP, an i-MIP-Al, an i-Lip-MIP y an i-LipC, la 2ª y 3ª
dosis de inmunización ue on iguales a la 1ª dosis. Pa a los sue os an i-MSP63 y
an i-MIP-F se u ilizó la misma can idad de an ígeno pe o con adyu an e incomple o
de F eund (Sigma-Ald ich Inc., S . Louis, MO, EEUU).
Todos los a ones ue on sang ados 5 días después de la úl ima
inmunización. En ese momen o ue ex aída ambién, la sang e de o os 10 a ones
sin inmuniza , pa a ob ene el sue o no inmune. La sang e se dejó coagula 1 ho a a
empe a u a ambien e pa a pos e io men e man ene la 3 ho as a 4 ºC y así e ae el
coágulo. Una ez ecupe ado el sue o se cen i ugó 10 minu os a 2 000 x g y se
gua dó en alícuo as de 300 µL a -80 ºC.
3.7. Ca ac e ización de los sue os
3.7.1. Do -blo ing
La i ulación de los sue os se ealizó po do -blo ing como se indica a
con inuación.
Se deposi a on éplicas de 2 µL de una suspensión de OMVs de la cepa
homóloga (H44/76) con una concen ación de 1 mg/mL en memb anas de
ni ocelulosa de 0,45 µm de po o (Bio-Rad Lab., Richmond, CA, EEUU). Las
éplicas se bloquea on con Blo o al 5% en TBS du an e dos ho as a empe a u a
ambien e. T as 3 la ados con TBS-Tween, las memb anas se incuba on du an e 90
minu os a 37 ºC con dis in as diluciones se iadas de los sue os ( ac o de dilución
1:10) y después de o o ciclo de la ados de las memb anas, se incuba on con
an icue pos de conejo an i-IgG de a ón conjugados a pe oxidasa. Las memb anas se
Ma e ial y Mé odos
____________________________________________________________________
86
3.11.2. Ensayo de deposición de C3b
En una placa de mic o i ulación de 96 pocillos con ondo en U (S e ilin,
Reino Unido) se mezcla on:
5 µL de cada sue o es .
90 µL de suspensión bac e iana a DO600=0,1 en solución de bloqueo
(BSA 2% en PBS).
5 µL de complemen o humano sin IgG.
La mezcla se incubó 30 min en agi ación (900 pm) a 25 ºC. Se cen i ugó a
3000 x g du an e 5 min y as la eliminación del sob enadan e, el p ecipi ado se la ó
es eces con solución de bloqueo. Se añadie on 200 µL an icue po de o eja an i-
C3c humano ma cado con el luo ó o o FITC (Biodesign, Reino Unido) a una
dilución 1:500 en solución de bloqueo, se incubó du an e 20 min a 4ºC y se
ealiza on dos la ados más con dicha solución.
Se de e minó el alo FI-C´, como se indica en el apa ado an e io .
3.11.3. Ensayo de deposición de MAC (C5b-9)
En una placa de mic o i ulación de 96 pocillos con ondo en U (S e ilin,
Reino Unido) se mezcla on:
5 µL de cada sue o es .
90 µL de suspensión bac e iana ajus ada a DO600=0,1 en solución de
bloqueo (BSA 2% en PBS).
5 µL de complemen o humano sin IgG.
Se ealizó una incubación de la mues a du an e 30 min en agi ación (900
pm) a 25 ºC. Cada mezcla ue cen i ugada a 3000 x g du an e 5 min. El p ecipi ado
se la ó es eces con solución de bloqueo, se añadie on 200 µL de an icue po de
a ón an i-C5b-9 humano ma cado con Alexa 647 a 1:500 en solución de bloqueo, se
incubó du an e 20 min a 4 ºC y as lo cual se ealiza on dos la ados con dicha
solución. Finalmen e, se de e minó el alo FI-C´.
Ma e ial y Mé odos
____________________________________________________________________
87
3.11.4. Ensayo de Opsono agoci osis
Pa a la de e minación de la ac i idad opsono agocí ica del meningococo se
u iliza on como agoci os células de la línea celula HL60 (Ame ican Type Cul u es
Collec ion, Rock ille MD, EEUU), di e enciadas a g anuloci os con N,N-
dime ilen o mamida 0,8% (Sigma- Ald ich Inc., S . Louis, MO, EEUU) du an e 5
días.
En una placa de mic o i ulación de 96 pocillos con ondo en U (S e ilin,
Reino Unido) se mezcla on:
20 µL de cada sue o es diluido 1:10 en ampón OP (Hanks balanced
sal s solu ion [Sigma- Ald ich Inc., S . Louis, MO, EEUU] con eniendo
leche desc emada en pol o al 2% (p/ ) [Ma el, P emie In e na ional
Foods, Reino Unido], CaCl2 1,2mM y MgSO4 1mM [Sigma- Ald ich
Inc., S . Louis, MO, EEUU]).
10 µL de suspensión bac e iana eñida, a una concen ación celula de
6,25 x 108 en ampón OP.
10 µL de complemen o humano sin IgG.
T as una incubación en agi ación (900 pm) de 7,5 min a 37 ºC, se añadie on
50 µL de células HL60 di e enciadas (2.5 x 107 cel/mL en ampón OP) con inuando
la incubación du an e o os 7,5 min. La opsono agoci osis se inalizó añadiendo 80
µL de ampón PBS Dulbecco en iado en hielo con eniendo 0,02% de EDTA (Sigma-
Ald ich Inc., S . Louis, MO, EEUU).
En el canal de luo escencia pa a el pigmen o bisca boxie ilca boxil-
luo esceína (BCECF) se de e mina on en anas homogéneas en la población de
células HL60 del con ol sin an icue pos y con complemen o, incluyendo
ap oximadamen e el 10% de la población o al. En cada una de las mues as es se
midió la luo escencia de 7500 células HL60 i as. Se mul iplicó el po cen aje de
células que mos a on luo escencia BCECF en la en ana ap opiada po la
luo escencia media de la población incluida en la en ana pa a calcula el índice de
Ma e ial y Mé odos
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88
luo escencia (FI). Al FI de cada mues a se le es ó el FI del con ol pa a ob ene el
alo FI-C'.
4. Resul ados
Resul ados
____________________________________________________________________
91
4.1. Resul ados del es udio con la p o eína MSP63
4.1.1. Pu i icación de la p o eína MSP63
Pa a la ob ención del sue o inmune an i-MSP63, se p ocedió a la
pu i icación de la p o eína MSP63, eligiendo como mé odo de pu i icación la
elec o-elución a pa i de geles de PA. Pa a minimiza la co-pu i icación de o as
p o eínas jun o con la MSP63 se ealiza on dos elec o o esis secuenciales, al y
como se explica en el apa ado 3.3.3 de Ma e ial y Mé odos. En p ime luga , se
sepa a on en gel los complejos p o eicos p esen es en las OMVs median e cua o
elec o o esis na i as o h CNE (pa a ob ene la can idad necesa ia). Pos e io men e,
una mues a de cada gel ue eñido con CBB y el es o del gel con inción e e sible
de zinc. Siguiendo esul ados ob enidos en nues o labo a o io, se de ec ó la banda
co espondien e al complejo denominado CxChap de 740 KDa , o mado po ca o ce
subunidades de la p o eína MSP63 (Figu a 7).
Figu a 7. Sepa ación de complejos p o eicos p esen es en OMVs de la cepa de N. meningi idis H44/76 po
h CNE. El complejo de la p o eína MSP63, de 740 kDa y denominado CxChap, se de ec ó po inción de una
mues a del gel con Coomassie. U ilizando és a como guía, se co ó la banda co espondien e del gel eñido con
inción e e sible de zinc.
Resul ados
____________________________________________________________________
92
T as el co e y des eñido de las bandas co espondien es al complejo Cx-
Chap, y la desna u alización de los mismos, la p o eína MSP63 p esen e en las i as
de PA ue sepa ada median e una elec o o esis SDS-PAGE (Figu a 8). A pesa de
co a únicamen e la banda co espondien e al complejo p o eico o mado po la
p o eína MSP63, se obse a on un al o núme o de p o eínas de di e sos amaños
molecula es. La banda co espondien e a la p o eína MSP63 ue co ada, des eñida y
some ida a elec o-elución.
Figu a 8. Sepa ación de la p o eína MSP63 de N. meningi idis po SDS-PAGE. T as el co e y des eñido de la
i a de gel con eniendo el complejo p o eico CxChap, se some ió a una segunda dimensión desna u alizan e pa a
aisla de mane a indi idual la p o eína MSP63.
El eluído ob enido ue comp obado po SDS-PAGE y inción de zinc,
encon ando únicamen e la p esencia de la p o eína MSP63, al y como se mues a en
la Figu a 9. Po cada g amo de p o eína inicial o al se ob u ie on 50 mg de la
p o eína MSP63 en el eluído inal.
Resul ados
____________________________________________________________________
93
Figu a 9. Comp obación de la composición p o eica del eluído de la p o eína MSP63 (ca il SDS-PAGE).
Wes e n-blo con sue o an i-MSP63 en e al pe il p o eico o al de las OMVs de N. meningi idis H44/76 (ca il
Wes e n-blo ).
4.1.2. Ca ac e ización del sue o an i-MSP63
El sue o an i-MSP63 ue i ulado y ca ac e izado po do -blo ing y
Wes e n-blo ing espec i amen e, alcanzando un í ulo de 1/100 en do -blo ing
(Figu a 10). Es e í ulo ue u ilizado en los pos e io es ensayos de Wes e n-blo ing
ealizados con dicho sue o.
Figu a 10. Ti ulación po do -blo ing del sue o an i-MSP63
La ca ac e ización po Wes e n-blo ing se ealizó a pa i de gel de SDS-
PAGE en el que se ca gó como mues a OMVs de las cepas de N. meningi idis 3061,
3063, H44/76, NZ98/254, Nm26 y NmP27. Como se obse a en la Figu a 11, el
sue o an i-MSP63 econoció a la p o eína MSP63 en odas las cepas es udiadas.
Resul ados
____________________________________________________________________
94
Figu a 11. Wes e n-blo con el sue o an i-MSP63 a pa i de OMVs de las cepas de N. meningi idis H44/76,
NZ98/254, 3061, 3063, Nm26 y Nmp27 sepa adas po SDS-PAGE.
El Wes e n-blo ealizado a pa i de gel de h CNE con el sue o an i-
MSP63, con dis in as mues as de OMVs de las cepas mencionadas an e io men e,
nos e eló que dicho sue o econoce al Cx-Chap en odas las cepas de es udio, como
se indica en la Figu a 12.
Figu a 12. Wes e n-blo a pa i de OMVs de las cepas de N. meningi idis H44/76, NZ98/254, 3061, 3063, Nm26
y Nmp27 sepa adas po h CNE con el sue o an i-MSP63.
Resul ados
____________________________________________________________________
95
4.1.3. C oma og a ía de a inidad con el sue o an i-MSP63
Con el in de pu i ica el Cx-Chap sin la p esencia de o as p o eínas, se
p ocedió a la ealización de un ensayo de c oma og a ía de a inidad con el sue o an i-
MSP63.
T as un cambio de ampón del sue o an i-MSP63, se ealizó la columna Bio-
ScaleTM A i-P ep® P o ein A (Bio-Rad Lab., Richmond, CA, EEUU) con el in de
pu i ica las IgGs p esen es en el sue o. Las alícuo as ob enidas y analizadas po do -
blo ing con Rojo Pounceau se mues an en la Figu a 13.
Figu a 13: Do -blo de las alícuo as ob enidas con la columna Bio-ScaleTM A i-P ep® P o ein A (Bio-Rad Lab.,
Richmond, CA, EEUU) eñidas con Rojo Pounceau. Las alícuo as de la ado co esponden a los núme os 1-10 y
del 11- 47 a las alícuo as de elución. En la alícuo a 25 se p odujo el cambio del pH indica i o de la p esencia de
las IgGs.
La columna de a inidad se p epa ó siguiendo las ins ucciones del ab ican e,
con el A i-Gel Hz Inmunoa ini y ki , empleando como mues a 3 mL de las
alícuo as de elución ob enidas (alícuo as co espondien es a los núme os 25 a 30,
neu alizadas p e iamen e). Una ez ealizados los cambios de ampón y la
oxidación de las IgGs, se calculó la e icacia de unión a la ma iz siguiendo las
Resul ados
____________________________________________________________________
102
odas las alícuo as ob enidas (Figu a 17). Pos e io men e ue on analizadas ambién
median e SDS-PAGE (Figu a 18) y Wes e n-blo ing (Figu a 19).
Figu a 17. Do -blo con Rojo-Pounceau de las alícuo as ob enidas en la c oma og a ía de a inidad a iones
me álicos inmo ilizados. Alícuo a 1: ca ga de la columna, alícuo a 2: salida de ca ga, alícuo as 3-27: la ado,
alícuo as 28-38: elución. Alícuo as empleadas pa a la concen ación de la p o eína: 30-33.
Figu a 18 . SDS-PAGE 10% PA de las alícuo as ob enidas en la IMAC: Ca ga (C), salida de ca ga (SC), e ce a
alícuo a de la ado (LV), y 9 alícuo as de elución (E1-E9).
Resul ados
____________________________________________________________________
103
Figu a 19: Wes e n-blo de una SDS-PAGE e elado con sue o an i-OMVS de la cepa N. meningi idis H44/76
de las alícuo as ob enidas en la IMAC co espondien es a la ca ga (C), salida de ca ga (SC), la ado nº 3 (LV3),
la ado nº 26 (LV26) y es alícuo as de elución (E4,E5 y E8).
Se jun a on has a 12 mL de las alícuo as que p esen an la p o eína
pu i icada y se concen a on, al y como se indica en el apa ado 3.4.2. de Ma e ial y
Mé odos, as lo cual, se ealizó una SDS-PAGE pa a comp oba la p esencia de la
p o eína MIP (Figu a 20).
Figu a 20. SDS-PAGE 10% de PA de la p o eína MIP concen ada.
Resul ados
____________________________________________________________________
104
La can idad de p o eína ue cuan i icada po el mé odo BCA. Po cada
inducción de la exp esión con 2 L de cul i o de bac e ias se ob u ie on,
ap oximadamen e, 1,5 mg de p o eína pu i icada. Se epi ió es e p ocedimien o has a
ob ene la can idad necesa ia pa a la ealización de odos los expe imen os
p og amados.
Se ealizó una SDS-PAGE de una de las alícuo as de elución ob enidas
(Figu a 21) en la c oma og a ía de a inidad, pa a la iden i icación de las bandas
indicadas en dicha igu a po MALDI-TOF/TOF.
Figu a 21: SDS-PAGE con geles de 10 % PA de una alícuo a de elución ealizada pa a la iden i icación de las
bandas indicadas en la igu a con los núme os 1- 7.
Los esul ados ob enidos en la iden i icación de las bandas indicadas en la
Figu a 21 se mues an en la Tabla 6. Los esul ados se ob u ie on as compa a los
pép idos ob enidos en e a N. meningi idis y E. coli. Los esul ados nos mues an
que las bandas mayo i a ias co esponden a la p o eína MIP.
Resul ados
____________________________________________________________________
105
Banda
KDa
Código
Unip o KB
Iden i icación
Sco e
Cobe u a
secuencia
(%)
1
105,5
P0AFG5
2-oxoglu a a e dehyd ogenase E1
componen . E. coli.
123
16.5
2
43,4
A7ZSL4
Elonga ion ac o Tu 1. E. coli.
59
21.2
3
28,9
Q9JYI8
P obable FKBP- ype pep idyl-p olyl
cis- ans isome ase (FkpA o MIP). N.
meningi idis se og upo B.
61
39,3
4
28,9
Q9JYI8
P obable FKBP- ype pep idyl-p olyl
cis- ans isome ase (FkpA o MIP). N.
meningi idis se og upo B.
123
60,3
5
28,9
Q9JYI8
P obable FKBP- ype pep idyl-p olyl
cis- ans isome ase (FkpA o MIP). N.
meningi idis se og upo B.
104
43,8
6
28,9
Q9JYI8
P obable FKBP- ype pep idyl-p olyl
cis- ans isome ase (FkpA o MIP). N.
meningi idis se og upo B.
53
28,3
7
28,9
Q9JYI8
P obable FKBP- ype pep idyl-p olyl
cis- ans isome ase (FkpA o MIP). N.
meningi idis se og upo B.
101
40,1
Tabla 6: Iden i icación po MALDI-TOF/TOF de las p incipales bandas de ec adas median e elec o o esis SDS-
PAGE. Los núme os se co esponden con los ma cados en la Figu a 21. Las cobe u as de secuencia, códigos de
iden i icación en bases de da os (ID) y los pesos molecula es dados son los co espondien es a las p o eínas
homólogas de la cepa secuenciada MC58 de N. meningi idis.
Resul ados
____________________________________________________________________
106
4.2.3. P o eoliposomas incluyendo la p o eína MIP (LipMIP)
La inco po ación de la p o eína ecombinan e en liposomas se ealizó con el
in de analiza la di e encia en la espues a inmune al inmuniza con la p o eína
ecombinan e sola o inse ada en liposomas.
Se ob u ie on p o eoliposomas empleando 1 mg de p o eína o al. La
cuan i icación indi ec a de la p o eína inco po ada en los liposomas, a pa i del
sob enadan e as la cen i ugación, pe mi ió de e mina que el endimien o de la
inco po ación ue en e un 65 y un 75%. Las medidas omadas en el Ze asize Nano
ZS (Mal e n Ins umen s L d., Wo ces e shi e, Reino Unido), ealizando es
medidas (en cada una de ellas al menos 300 pa ículas ue on analizadas), mos a on
el aumen o de amaño de los liposomas con la p o eína MIP inco po ada (131,2 nm
+- 3,4) con espec o a los liposomas con ol (95,4 +- 0,1).
Se ca ac e iza on los liposomas median e do -blo ing (Figu a 22) y se
analiza on ambién median e SDS-PAGE y Wes e n-blo ing (Figu a 23). Pa a la
ealización de es os análisis se empleó sue o an i-MIP sin adyu an es, ca ac e izado
en el apa ado 4.2.4.
Figu a 22: Do -blo con sue o an i-MIP (1:10.000) de los liposomas con MIP inco po ada. Con ol nega i o
con agua MilliQ (C-), con ol posi i o con p o eína MIP (C+) y liposomas LipMIP.
Resul ados
____________________________________________________________________
107
Figu a 23: En el p ime ca il se mues a la p o eína MIP y en el segundo ca il los liposomas LipMIP sepa ados
po SDS-PAGE en gel del 12% de PA. En el úl imo ca il se mues a un Wes e n-blo con sue o an i-MIP
(1:10.000) de una SDS-PAGE 12% de PA con los liposomas LipMIP.
4.2.4. Ca ac e ización de los sue os inmunes
Se ob u ie on un o al de cua o sue os inmunes en e a la p o eína MIP
(an i-MIP, an i-MIP-Al, an i-MIP-F y an i-Lip-MIP) que ue on i ulados y
ca ac e izados po do -blo ing y Wes e n-blo ing espec i amen e. Como mues an
las Figu as 24, 25, 26 y 27, los sue os alcanza on un í ulo de 1/10.000 en do -
blo ing u ilizando como mues a OMVs de la cepa homóloga. Es e í ulo ue
u ilizado en los pos e io es ensayos ealizados con los sue os ob enidos.
Resul ados
____________________________________________________________________
108
Figu a 24. Ti ulación po Do -blo ing del sue o an i-MIP.
Figu a 25. Ti ulación del sue o an i-MIP-Alum.
Figu a 26. Ti ulación del sue o an i-MIP-F eund.
Figu a 27. Ti ulación del sue o an i-Lip-MIP.
Resul ados
____________________________________________________________________
109
Los sue os ob enidos ue on ca ac e izados po Wes e n-blo ing a pa i de
un gel de SDS-PAGE en el que se ca ga on OMVs de la cepa de N. meningi idis
H44/76. Como se puede obse a en la Figu a 28, econocen únicamen e a la
p o eína MIP en odos los casos.
Figu a 28. Wes e n- blo de los sue os ob enidos (an i-MIP, an i-MIP-Alum, an i-MIP-F eund y an i-Lip-MIP) a
pa i de la sepa ación po SDS-PAGE de OMVs de la cepa N. meningi idis H44/76.
El sue o an i-MIP ue analizado ambién po Wes e n-blo ing a pa i de un
gel de SDS-PAGE, en el que se ca ga on como mues a OMVs de las cepas de N.
meningi idis H44/76, H44/76 cul i ada sin es icción de hie o, NZ98/254, 3061 y
3063. Como se obse a en la Figu a 29, el sue o an i-MIP econoció a la p o eína
MIP en odas las cepas de es udio. También se obse a un aumen o en la señal
cuando se emplea como mues a OMVs de la cepa H44/76 cul i ada en es icción de
hie o.
Resul ados
____________________________________________________________________
110
Figu a 29. Wes e n-blo con el sue o an i-MIP (1:10.000), a pa i de OMVs de las cepas de N. meningi idis
H44/76, H44/76*(sin es icción de hie o), NZ98/254, 3061 y 3063, sepa adas po SDS-PAGE.
También se ealizó un do -blo con el sue o an i-MIP a pa i de células
en e as de N. meningi idis con las cepas de es udio H44/76, NZ98/254, 3061 y 3063.
Como se obse a en la Figu a 30, la p o eína MIP es econocida en odas las cepas
empleadas.
Figu a 30. Do -blo con el sue o an i-MIP (1:10.000) empleando como mues a células en e as de las cepas
indicadas. Con ol nega i o con agua MilliQ (C-) y con ol posi i o con OMVs de la cepa N. meningi idis H44/76
(C+).
Resul ados
____________________________________________________________________
111
Se ealizó ambién un Wes e n-blo con el sue o an i-OMVs de la cepa de N.
meningi idis H44/76 y an i-MIP a pa i de un gel en g adien e del 8 al 11% de PA
con OMVs de la cepa H44/76 sepa adas po h CNE (Figu a 31), obse ando así los
complejos en los que es á p esen e la p o eína MIP.
Figu a 31. Wes e n-blo a pa i de OMVs de la cepa N. meningi idis H44/76 sepa adas po h CNE, con los
sue os an i-OMVs H44/76 (1:1000) y an i-MIP (1:10.000).
4.2.5. Ac i idad bac e icida de los sue os
Los esul ados ob enidos en los ensayos de ac i idad bac e icida de los sue os
inmunes an i-MIP, an i-MIP-Al, an i-MIP-F y an i-Lip-MIP con a la cepa
homóloga (N. meningi idis H44/76) se mues an en la Tabla 7 y con a las 4 cepas
he e ólogas ( N. meningi idis 3063, NZ98/254, Nm26 y Nmp27) en la Tabla 8.
Como se menciona en el apa ado 4.1.4, se ha conside ado que un sue o es
bac e icida cuando alcanza una asa de mo alidad ≥50% de las bac e ias a dilución
1:8. En los sue os que esul a on bac e icidas se calculó el í ulo de ac i idad
Discusión
____________________________________________________________________
119
Las p o eínas de memb ana ex e na, p esen adas an o como p o eínas
ecombinan es pu i icadas o como p o eínas incluidas en OMVs, se han con e ido
en los p incipales candida os acunales con a el se og upo B as el acaso que
supuso el polisacá ido capsula como an ígeno acunal
168
. A pesa de los a ances de
los úl imos años, como la ecien e ap obación po pa e de la Agencia Eu opea de
Medicamen os de la acuna Bexse o® de No a is, pa a su uso a pa i de los 2
meses de edad, y de la acuna en ensayos clínicos en ase III de P ize , ambas con a
el se og upo B
169
, sigue siendo un obje i o p io i a io la búsqueda de nue os
an ígenos con secuencias conse adas y con capacidad de induci an icue pos
bac e icidas de amplia cobe u a con a es e se og upo
170
. Con espec o a la acuna
de No a is, no ha sido e aluada median e ensayos clínicos, sino que su e icacia ha
sido deducida median e es udios de inmunogenicidad, empleando un sis ema de
ipi icación de an ígenos meningocócicos (MATS) desa ollado pa a elaciona los
pe iles de an ígenos de dis in as cepas meningococales y pode p e e así la
cobe u a de la acuna. Un es udio de 1000 cepas ap oximadamen e, aisladas en
Eu opa , mos ó que en e el 73% y el 87% de és as, enían un pe il adecuado que
pod ía se cubie o po la acuna. Los da os ob enidos en España a pa i de 300
aislamien os clínicos, indican que en o no al 68,7% de las cepas del es udio enían
un pe il de MATS adecuado, con la po encialidad de se cubie as. Los ni eles de
cobe u a de la acuna en España son lige amen e in e io es al es o de países del
en o no y los in e alos de con ianza son signi ica i amen e más amplios, debido
posiblemen e a las di e encias en la dis ibución de los complejos clonales de N.
meningi idis se og upo B que se han obse ado en España
171
.
168
Fea e s IM, Pizza M. 2009. Meningococcal p o ein an igens and accines. Vaccine. 27: 42-50.
169
Nissen MD, Ma shall HS, Richmond PC, Jiang Q, Ha is SL e al. 2013. A andomized,
con olled, phase 1/2 ial o a Neisse ia meningi idis se og oup B bi alen LP2086 accine in
heal hy child en and adolescen s. Pedia In ec Dis J. 32: 364-371.
170
Phillips R, Williams JN, Tan WM, Bielecka MK, Thompson H e al. 2013. Immuniza ion wi h
ecombinan Chape onin60 (Chp60) ou e memb ane p o ein induces a bac e icidal an ibody esponse
agains Neisse ia meningi idis. Vaccine. 31: 2584-2590.
171
Vogel U, Taha MK, Vázquez JA, Findlow J, Claus H e al. 2013. P edic ed s ain co e age o a
meningococcal mul icomponen accine (4CmenB) in Eu ope: a quali a i e and quan i a i e
assessmen . Lance In ec ion Disease. 381: 825-835
Discusión
____________________________________________________________________
120
Recien emen e la AEMP (Agencia Española de Medicamen os y P oduc os
Sani a ios) emi ió un in o me es ingiendo el uso de es a acuna al ámbi o
hospi ala io:
“En base a la ausencia de da os de e icacia clínica con es a acuna, (…) y a la espe a de ob ene da os
de e ec i idad pos -au o ización, y an e la ausencia, en es os momen os, de ecomendaciones o iciales
de uso po pa e de Salud Pública, se ecomienda es ablece el uso hospi ala io de la acuna Bexse o,
has a que Salud Pública de e mine, en el seno del Consejo In e e i o ial del Sis ema Nacional de
Salud, el obje i o o la polí ica que se a a segui con espec o al uso de es a acuna”
172
.
Debido a la posibilidad de que algunos de los epi opos con o macionales
que albe gan los complejos p o eicos de memb ana ex e na sean p o ec i os y
conse ados, nues a línea de in es igación en los úl imos años se ha cen ado en el
es udio de es e ipo de epi opos como componen es acunales.
La conse ación de la secuencia y el ca ác e an igénico de la chape onina
MSP63, e aluados en es udios en nues o labo a o io143, así como ambién po o os
in es igado es152, nos lle a on a conside a la un buen candida o a es udia .
En abajos p e ios se ob u o el sue o denominado an i-CxChap (complejo
cons i uido po ca o ce subunidades de la p o eína MSP63 ob enido po elución
pasi a a pa i de la banda co espondien e de un gel con OMVs de N. meningi idis
H44/76 sepa adas po h CNE). Es e sue o mos ó buenos esul ados en di e sos
indicado es de p o ección además de una g an eac i idad c uzada y ac i idad
bac e icida. La ca ac e ización po Wes e n-blo ing e eló la exis encia de
an icue pos con a dos p o eínas, la MSP63 y la p o eína MIP. Dicho sue o esul ó
bac e icida con a la cepa homóloga y se obse ó una buena unión de los an icue pos
a la supe icie bac e iana en odas las cepas es udiadas, indicando de es a mane a
cie o g ado de conse ación de los epi opos que son econocidos. También indujo
opsono agoci osis en odas las cepas, excep o en la homóloga, y la deposición de
C3b y MAC146.
172
h p://www.aemps.gob.es/medicamen osUsoHumano/ acunas/in oU ilTe apeu ica/docs/in U ilTe a
p _Bexse o.pd
Discusión
____________________________________________________________________
121
La azón más p obable de los esul ados ob enidos es que en el p oceso de
pu i icación del complejo de la chape onina se hubiese p oducido una cie a
con aminación con o os complejos que con ienen la MIP, gene ando an icue pos
con a ella al inmuniza los a ones. Debido a su al a inmunogenicidad y a pesa de
su p esencia mino i a ia, esul ó ue emen e econocida mos ando una muy buena
señal en el Wes e n-blo .
Los obje i os plan eados en es e abajo pa a el es udio con la p o eína
MSP63 ue on: a) su pu i icación, b) la ob ención y ca ac e ización del sue o inmune
an i-MSP63 y c) el análisis uncional de los an icue pos del sue o, odo ello como
p ime a ap oximación pa a des ela cual de las dos p o eínas (MSP63 o MIP), ue la
esponsable de los buenos esul ados ob enidos con el sue o an i-CxChap y pode
de e mina ambién, la impo ancia an ígénica de cada p o eína de mane a indi idual.
Las écnicas elec o ó e icas empleadas, an o pa a la ob ención de la
p o eína desna u alizada como pa a los pos e io es análisis, esul a on adecuadas,
pudiendo de ec a y aisla an o el complejo de o ma na i a como la p o eína
desna u alizada. A pesa de que el mé odo más empleado pa a la ob ención de OMVs
es la ex acción con deoxicola o sódico, la me odología elegida pa a la ealización de
es e abajo ue la ex acción con P ensa de F ench , ya que nues os análisis p e ios
mos a on que es e mé odo pe mi e una meno con aminación con p o eínas
ci oplasmá icas
173
, ob eniéndose OMVs compa ables a las sec e adas po las
bac e ias de o ma na u al.
Un g an incon enien e a la ho a de analiza cualquie p o eína es la
ob ención o no de mues a su icien e pa a lle a a cabo odos los expe imen os
plan eados en el es udio. Aunque la elución pasi a a pa i de geles es comúnmen e
empleada po o os au o es
174
, y en es udios an e io es en nues o labo a o io esul ó
173
Ma zoa J, Abel A, Sánchez S, Chan H, Fea e s I e al. 2009. Analysis o ou e memb ane po in
complexes o Neisse ia meningi idis in wild- ype and speci ic knock-ou mu an s ains. P o eomics.
9: 648-56.
174
Ku ien BT, Sco ield RH. 2012. Ex ac ion o p o eins om gels: a b ie e iew. Me hods Mol
Biol. 869: 403-405.
Discusión
____________________________________________________________________
122
e icaz146, en el caso conc e o de la p o eína MSP63, la ob ención de una mínima
can idad de mues a ealizando es e p o ocolo, conlle ó a que la me odología de
pu i icación elegida uese la elec o-elución. Es e mé odo nos pe mi ió ob ene de
mane a sa is ac o ia la p o eína, al y como mos a on las comp obaciones del eluído
po elec o o esis y los Wes e n-blo ealizados con el sue o an i-MSP63 ( e Figu a
9).
Como se ha mencionado, el p incipal p oblema obse ado an e io men e
con la pu i icación del complejo Cx-Chap, ue la co-pu i icación de la p o eína MIP
debido a que ese complejo se eluyó di ec amen e de geles de h CNE, donde
coexis en dis in as p o eínas en la banda de in e és. En es e abajo, sin emba go, la
pos e io sepa ación en SDS-PAGE de la banda co espondien e al Cx-Chap
posibili ó aisla o almen e la p o eína MSP63 y de es e modo, se consiguió
soluciona el p oblema de la co-pu i icación de la p o eína MIP y así pode analiza
pos e io men e las ca ac e ís icas de la p ime a de mane a indi idual. La sob eca ga
de los pocillos en la SDS-PAGE pe mi ió ambién demos a la con aminación con
o os complejos jun o con el de la chape onina en el eluído que se usó en abajos
p e ios pa a ob ene el sue o an i-CxChap ( e Figu a 7).
Los esul ados de la ca ac e ización po Wes e n-blo ing del sue o ob enido
po inmunización de animales de expe imen ación con la p o eína MSP63,
demos a on que e ec i amen e solo econoce a dicha p o eína, asegu ándonos así
que los demás esul ados que ob engamos sean debidos a la p esencia únicamen e de
la misma.
Sin emba go, es a me odología no nos pe mi ió conse a la es uc u a
e cia ia y cua e na ia de la misma. Po lo an o, el sue o an i-MSP63 ob enido no
con empla los epi opos con o macionales del Cx-Chap y consecuen emen e, los
esul ados de ac i idad bac e icida ob enidos co esponden a an icue pos en e a la
MSP63 desna u alizada.
La ealización de un Wes e n-blo a pa i de una h CNE nos des eló que
es e sue o econoce al complejo Cx-Chap. Es e da o esul ó in e esan e, ya que
Discusión
____________________________________________________________________
123
median e columnas de a inidad se pod ía pu i ica e icazmen e el complejo de
chape onina, sin los con aminan es de ec ados en expe imen os p e ios y de es e
modo analiza la in luencia de los epi opos con o macionales.
Se p ocedió, en consecuencia, a la ealización de un ensayo de
c oma og a ía de a inidad al sue o an i-MSP63, esul ando no uc í e o, debido
posiblemen e a la poca can idad inicial de IgGs ob enidas con el sue o an i-MSP63
disponible, apenas el mínimo necesa io en el ango es ablecido pa a la ealización del
expe imen o, siguiendo las ins ucciones del ab ican e.
Uno de los expe imen os ealizados como indicado de p o ección ue la
ac i idad bac e icida. Ac ualmen e es án siendo es udiadas o as ías de ac uación
del sis ema inmune como la opsono agoci osis y la deposición de complemen o en la
supe icie bac e iana
175
, pe o basándose en la co elación exis en e en e los í ulos
de ac i idad bac e icida de los sue os alcanzados as la inmunización con p epa ados
acunales de OMVs y la e icacia clínica de las acunas, sigue siendo un indicado de
co elación de p o ección acep ado in e nacionalmen e, conside ándose posi i o
í ulos ≥4 al u iliza complemen o humano y ≥8 con complemen o de conejo
176
. Po
odo ello, pa a el análisis uncional de los an icue pos p esen es en los sue os
inmunes ob enidos ealizamos expe imen os de ac i idad bac e icida del sue o, de
deposición de complemen o en la supe icie bac e iana y de inducción de agoci osis.
Los expe imen os de ac i idad bac e icida del sue o ue on ealizados con
complemen o de conejo come cial, debido a nues a imposibilidad de ob ene
complemen o humano agammaglobulémico. Aunque exis e un c ecien e in e és po
su u ilización, debido a la especi icidad del egulado del complemen o H po la
FHbp en la supe icie bac e iana, que ayuda al meningococo a inc emen a su
supe i encia176, la mayo ía de los expe imen os son ealizados con complemen o
175
Siada SD, Khei andish M, No ouzian D, Behzadiyannejad Q, Naja Pee ayeh S e al. 2007.
A low cy ome ic opsonophagocy ic assay o measu emen o unc ional an ibodies elici ed a e
immuniza ion wi h ou e memb ane esicle o Neisse ia meningi idis se og oup B. Pak J Biol Sci. 10:
3578-3584.
176
Fea e s I. 2009. Choosing isola es o he e alua ion o meningococcal p o ein accines. Expe
Re Vaccines. 8: 1461-1463.
Discusión
____________________________________________________________________
124
come cial de conejo107, eniendo siemp e en cuen a el aumen o que es o supone en el
í ulo de ac i idad bac e icida debido a la inespeci icidad del egulado H de conejo
po la Hbp del meningococo
177
.
Los esul ados ob enidos en el ensayo de ac i idad bac e icida con el sue o
an i-MSP63 mos a on cie a simili ud con los conseguidos p e iamen e con el sue o
an i-CxChap. Ambos esul a on bac e icidas al menos con a la cepa homóloga; sin
emba go exis ió una impo an e di e encia en la asa de mo alidad alcanzada a la
mínima dilución (1/8). Mien as el sue o an i-CxChap alcanzó una asa de mo alidad
del 100% en e a la cepa homóloga, el sue o an i-MSP63 únicamen e alcanzó una
asa del 55%. Es o sugie e, o bien que es necesa ia la es uc u a na i a de la MSP63
(po lo an o una espues a en e a los epi opos con o macionales) pa a ob ene
an icue pos que alcancen una asa de mo alidad del 100%, o bien que es la p o eína
MIP la esponsable de es a ac i idad.
En abajos p e ios en nues o labo a o io se es udia on las ca ac e ís icas
an igénicas de los p incipales complejos p o eicos de memb ana ex e na, en e ellos
el complejo CxChap, a a és de ensayos de deposición de complemen o en la
memb ana bac e iana (C3b y MAC) y de inducción de opsono agoci osis146. Es os
expe imen os, que ue on ealizados con el sue o an i-MSP63, mos a on que no se
indujo la deposición del complemen o, la deposición del complejo de a aque a
memb ana ni opsono agoci osis. Únicamen e se obse ó la unión de an icue pos a la
supe icie bac e iana en odas las cepas es udiadas. Po an o, pa ece que la p o eína
MSP63 desna u alizada no gene a la p o ección p e iamen e de ec ada con el sue o
an i-CxChap, p esen ando una asa de mo alidad a 1:8 muy in e io y no induciendo
opsono agoci osis ni deposición del complemen o. Las p opiedades de es a p o eína
y las conclusiones ob enidas en o o es udio ealizado ecien emen e po Phillips y
colabo ado es170, sugie en la adecuación de es a p o eína como an ígeno a inclui en
p óximas acunas, aunque empleando dis in as a iaciones de la misma. A pesa de
ello, nues os esul ados con es a p o eína, a la espe a de consegui pu i ica el
177
G ano DM, Welsch JA, Ram S. 2009. Binding o complemen ac o H ( H) o Neisse ia
meningi idis is speci ic o human H and inhibi s complemen ac i a ion by a and abbi se a.In ec
Immun. 77: 764-9.
Discusión
____________________________________________________________________
125
complejo Cx-Chap median e columnas de a inidad, nos conduje on a cen a es e
es udio en la p o eína MIP.
Debido a los buenos esul ados ob enidos con el sue o an i-CxChap y su
capacidad de de ección de la p o eína MIP , se p ocedió al análisis de la impo ancia
an igénica de es a molécula y a su alo ación como candida o acunal, con el in de
con ibui al desa ollo de nue as acunas basadas en p o eínas de memb ana
ex e na, con amplia cobe u a y de e icacia ele ada. También se es udió la di e encia
en la espues a inmune al emplea dis in os adyu an es, así como la inclusión de la
p o eína MIP en liposomas, ya que son ehículos de p esen ación de an ígeno
adecuados a la ho a de elabo a acunas. Con es e in, los obje i os plan eados pa a
el es udio de la p o eína MIP de N. meningi idis como candida o acunal ue on, su
pu i icación, su inclusión en liposomas, la ob ención de di e en es sue os inmunes y
el análisis uncional de los an icue pos gene ados en ellos.
Pa a la ob ención de la p o eína MIP de N. meningi idis se p ocedió, en
p ime luga , a la pu i icación an o po elución pasi a como po elec o-elución
eniendo como e e encia, a la ho a de co a las bandas co espondien es, da os
p e ios de nues o labo a o io, ob enidos median e elec o o esis bidimensional
h CNE/SDS-PAGE, en los que se de ec ó es a p o eína en a ias bandas de dis in os
pesos molecula es 139. De es e modo no se ob u o la can idad necesa ia pa a lle a a
cabo odos los es udios plan eados, po lo que se decidió clona la MIP, que esul ó el
mé odo más e icaz a la ho a de ob ene una can idad adecuada de p o eína. El
endimien o de la exp esión y pu i icación, a pesa de nume osos expe imen os pa a
su op imización, esul ó mucho meno que en es udios con o as p o eínas
ecombinan es pu i icadas en nues o labo a o io e in e io ambién al ob enido po
o os au o es (Hung y colabo ado es) en un es udio simila
178
, pe o empleando un
ec o de clonación di e en e. Se analizó la p esencia de a ias bandas mino i a ias
( e Figu a 21), comp obando que en su mayo ía co esponden a a ian es de la
p o eína MIP y, en algún caso, a es os de p o eínas de E. coli, que no in e ie en en
178
Hung MC, Salim O, Williams JN, Heckels JE, Ch is odoulides M. 2011. The Neisse ia
meningi idis mac ophage in ec i i y po en ia o p o ein induces c oss-s ain se um bac e icidal
ac i i y and is a po en ial se og oup B accine candida e. In ec Immun. 79:3784-3791.
Discusión
____________________________________________________________________
126
es e es udio, po es a en can idades ín imas y no gene a espues a de an icue pos
especí icos.
Un mé odo e icaz pa a induci la adquisición de la es uc u a na i a de las
p o eínas es la inco po ación en liposomas. Los liposomas son pequeñas esículas
compues as de bicapas lipídicas que pueden inco po a an ígenos y ac ualmen e uno
de los ehículos de p esen ación más p ome edo es
179
. Es os sis emas p esen an una
se ie de ca ac e ís icas bene iciosas, con espec o a o o ipo de ehículos, a la ho a
de ene los en cuen a como adyu an es pa a la elabo ación de acunas, ya que
p oducen una espues a inmune humo al y no gene an g anulomas en el luga de la
inyección, ni eacciones de hipe sensibilidad, como ue comp obado en es udios de
inmunización en a ones; además, los liposomas o mados u ilizando os olípidos
adecuados, no desa ollan an icue pos con a sus p opios componen es. La
inmunización con los an ígenos inse os en liposomas log ó una p o ección e ec i a
en di e en es modelos animales
180
. Es udios ealizados en nues o labo a o io
demos a on que, as la lio ilización y con la c iop o ección adecuada (como el
empleo de glucosa), los p o eoliposomas p ese a on sus p opiedades du an e al
menos nue e meses, pe mi iendo una conse ación del an ígeno idonea165. Po odo
ello, se decidió es udia las p opiedades an igénicas de la p o eína MIP o mando
p o eoliposomas, ob eniendo y analizando el sue o que denominamos an i-Lip-MIP.
La p o eína MIP de N. meningi idis es á o mada po una secuencia de 272
aminoácidos con dos egiones cla amen e de inidas ( e Figu a 32). La p ime a de
ellas, si uada en el ex emo C- e minal, cons i uye una secuencia de anclaje a
memb anas, que aba ca desde el aminoácido 1 has a el 41. Es a egión se con o ma
en una es uc u a pseudoglobula o mada exclusi amen e po láminas be a y
p esen a una hid o obicidad ele ada, po lo que eó icamen e cons i ui ía la zona de
anclaje de la p o eína a la memb ana ex e na del meningococo. El es o de la p o eína
179
Co eia-Pin o JF, Csaba N, Alonso MJ. 2013. Vaccine deli e y ca ie s: insigh s and u u e
pe spec i es. In J Pha m. 440: 27-38.
180
G ego iadis G, McCo mack B, Ob eno ic M, Sa ie R, Zadi B e al. 1999. Vaccine en apmen
in liposomes. Me hods. 19: 156-162.
Discusión
____________________________________________________________________
127
adop a una es uc u a lineal o mada po 4 hélices al a bien de inidas, con baja
hid o obicidad, que se expandi ían eó icamen e hacia el ex e io de la memb ana.
Figu a 32. Es uc u a idimensional hipo é ica de la p o eína MIP de N. meningi idis ( po homología con la
pep idyl-p olyl cis- ans isome ase de E. coli, de acue do a la in o mación ob enida del NCBI). Las láminas be a,
que coinciden con la egión hid o óbica, se p esen an colo eadas en azul y las hélices al a en ojo.
Toda la segunda egión, p esen a una ele ada homología con los dominios
FkpA, que cons i uyen una de las p incipales amilias de chape onas bac e ianas y
den o de ella se dis inguen a su ez, dos egiones especí icas: la p ime a, que aba ca
los aminoácidos 143 a 155, pe enece a la supe amilia FKPB_N (p am01346) que
cons i uye el dominio amino e minal de una pep idyl-p olyl-isome asa de ipo FKBP
y la segunda, de los aminoácidos 162 a 250, de la supe amilia FKPB_C
(p am00254) y que po a la ac i idad pep idyl-p olyl cis- ans isome asa de ipo
FKPB (da os ob enidos en las bases de da os del NCBI “Na ional Cen e o
Bio echnology In o ma ion”).
6. Conclusiones
Conclusiones
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137
I. La p o eína MSP63 de N. meningi idis desna u alizada induce una
ac i idad bac e icida meno que los complejos Cx-Chap y, al con a io
que es os, no gene a p o ección cuando se e alua empleando o os
indicado es como la opsono agoci osis o la deposición de componen es
del complemen o.
II. La p o eína MIP de N. meningi idis puede se clonada y exp esada en E.
coli y la MIP ecombinan e se inco po a de o ma e icien e en liposomas.
Al menos pa e de la p o eína se encuen a expues a en la supe icie,
demos ando que se asocia a la capa lipídica o mando p o eoliposomas.
III. La p o eína MIP pu i icada es al amen e inmunogénica
independien emen e de la o ma de p esen ación y los an isue os que
gene a mues an una especi icidad absolu a y una eac i idad c uzada
o al. En condiciones na u ales (células en e as) la MIP es á expues a en
supe icie (y po an o es accesible a los an icue pos), o mando pa e de
a ios complejos p o eicos de memb ana ex e na.
IV. Los an isue os gene ados po la p o eína MIP son bac e icidas en e a la
cepa homóloga H44/76 y mues an una ac i idad bac e icida a iable
en e a cepas he e ólogas. Es os esul ados apoyan la exis encia de es
a ian es di e en es de la p o eína MIP en N. meningi idis. Los o os
indicado es de p o ección no p esen an una co elación signi ica i a con
la ac i idad bac e icida.
V. La p o eína MIP puede se un candida o acunal adecuado a inclui en
nue as acunas mul icomponen e con a la meningi is meningocócica.
7. Bibliog a ía
Bibliog a ía
_________________________________________________________________
141
Aase A, Michaelsen TE. 1994. Scand J Immunol. 39: 581-587.
Ach man M, an de Ende A, Zhu P, Ko ole a IS, Kusecek B e al. 2001. Eme g In ec
Dis. 7: 420-427.
A ake e G, Kessel M, Nguyen N, F asch CE. 1993. J Bac e iol. 175: 3664-3668.
A nold DF, Robe s AG, Thomas A, Fe y B, Mo gan BP e al. 2009. J Clin Immunol.
29: 691-695.
A non R, Van Regenmo el MH. 1992. FASEB J. 6: 3265-3274.
Assalkhou R, Balasingham S, Collins RF, F ye SA, Da idsen T e al. 2007.
Mic obiology. 153: 1593–1603.
Ba h D, Mis a AN, Kuma A, Vasco A. 2010. 5: 77-85.
Bake MG, Ma in DR, Kie CE, Lennon D. 2001. J Paedia Child Heal h. 37: 13-19.
Bambini S, Rappuoli R. 2009. D ug Disco e y Today. 14: 252-260.
Ba is a-Duha e A, Lindblad EB, O iedo-O a E 2011. Toxicol Le . 203: 97-105.
Biesma DH, Hannema AJ, an Velzen-Blad H, Mulde L, an Zwie en R e al. 2001. J
Clin In es . 108: 233-240.
Billke O., Göde S., Meye T.F. 2002. Eme ging S a egies In The Figh Agains
Meningi is: Molecula And Cellula Aspec s. Fe ei ós C., C iado M.T., Vázquez J. (Eds.)
Ho izon Scien i i ic P ess, Wymondham, UK.
Bjune G, Høiby EA, G ønnesby JK, A nesen O, F ed iksen JH e al. 1991. Lance . 338:
1093-1096.
Blom AM. 2004. Scand J Clin Lab In es . 64: 479–496.
Boccadi uoco G, B unelli B, Pizza MG, Giuliani MM. 2012. J P e Med Hyg. 53: 56-60.
Bo ow R, And ews N, Findlow H, Waigh P, Sou he n J e al. 2010. Clin Vaccine
Immunol. 17: 154-159.
Bo ow R, And ews N, Goldbla D, Mille E. 2001. In ec Immun. 69: 1568-1573.
Bo ow R, Balme P, Mille E. 2005. Vaccine.23: 2222-2227
Bo ow R, Ca lone GM, Rosens ein N, Blake M, Fea e s I e al. 2006.Vaccine. 24: 5093-
5107.
Boslego J, Ga cia J, C uz C, Zollinge W, B and B e al. 1995. Vaccine. 13: 821-829.
Bibliog a ía
_________________________________________________________________
142
Bo o M, Fong KY, So AK, Ba low R, Rou ie R e al. 1992. P oc Na l Acad Sci U S A.
89: 4957-4961.
Bowie JU. 2005. Na u e. 43:581-589.
B edius RG, De kx BH, Fijen CA, de Wi TP, de Haas M e al. 1994. J In ec Dis. 170:
848-853.
B odeu BR, La ose Y, Tsang P, Hamel J, Ash on F e al. 1985. In ec Immun. 50: 510-
516.
B uge J, Bou e e -Le Cam N, Dan e B, Rougon G, Schulz D. 2004. Vaccine. 22: 1087-
1096.
By ne B, Iwa a S. 2002. Cu Opin S uc Biol. 12: 239-243.
Cadbu y W. 1934. Am J Public Heal h. 24: 925–935.
Campbell H, Bo ow R, Salisbu y D, Mille E. 2009. Vaccine. 27: B20-9.
Ca bonnelle E, Hill DJ, Mo and P, G i i hs NJ, Bou doulous S e al. 2009. Vaccine. 27:
78-89.
Ca w igh K, S ua JM, Jones DM, Noah ND. 1995. Epidemiol. In ec . 99: 591-601.
Caugan DA, F øholm LO, Bø e K, Hol en E, F asch CE e al. 1986. P oc Na l Acad
Sci U S A. 83: 4927-4931.
Caugan DA, Hoiby EA, Rosenquis E, F oholm LO, Selande RK. 1992. Epidemio
In ec . 109: 241-253.
Chang Q, Tzeng Y, S ephens D. 2012. Clinical Epidemiology. 4: 237-245.
Ch is odoulides M, Jolley KA, Heckels JE. Meningococcal accines: Me hods and
P o ocols. And ew J. Polla d, Ma in CJ. Ediciones Maiden. 2001. Pag. 167-180. Humana
P ess.
Claassen I, Meylis J, an de Ley P, Pee e s C, B ons H e al. 1996. Vaccine. 14: 1001–
1008.
Co be A, Exley R, Bou doulous S, Tang CM. 2004. Expe Re Mol Med. 6: 1-14.
Co eia-Pin o JF, Csaba N, Alonso MJ. 2013. In J Pha m. 440: 27-38.
Coun s GW, G ego y DF, Spea man JG, Lee BA, Filice GA e al. 1984. Re In ec Dis.
6: 640-648.
Cunha CS, G i i hs NJ, Mu illo I, Vi ji M. 2009. Cell Mic obiol. 11: 389-405.
Bibliog a ía
_________________________________________________________________
143
de Kleijn ED, de G oo R, La ebe AB, Labadie J, an Limp KC e al. 2000. Vaccine.
18: 1456–1466.
Del ieu I, Ya o S, Tamekloé TA, Njanpop-La ou cade BM, Tall H e al. 2011. PLoS
One. 6: e19513.
Doule N, Donnadieu E, La an-Chich MP, Niede gang F, Nassi X e al. 2006. J Cell
Biol. 173: 627-637.
Echenique-Ri e a H, Muzzi A, Del To dello E, Seib KL, F ancois P e al. 2011. PLoS
Pa hog 7: e1002027
Edwa ds JL, Apicella MA. 2005. Cell. Mic obiol. 7: 1197-1211.
Emon s M, Hazelze JA, de G oo R, He mans PW. 2003. Lance In ec . Dis. 3: 565-577.
Fea e s I. 2009. Expe Re Vaccines. 8: 1461-1463.
Fea e s IM, Pizza M. 2009. Vaccine. 27: 42-50.
Fe nández-Pa ón C. The P o ein P o ocols Handbook, 2nd Edi ion. Edi ado po : JM
Walke .Human P ess Inc., To owa, NJ.
Fijen CA, Kuijpe EJ, Bul e MT, Daha MR, Danke J. 1999. Clin In ec Dis 28: 98–105.
Findlow J, Taylo S, Aase A, Ho on R, Heyde man R e al. 2006. In ec Immun. 74:
4557-4565.
Finne J, Leinonnen M, Makela PH. 1982. Lance . 2: 355-357.
F ancis T, Tille WS. 1930. J Exp Med. 52: 573-85.
F asch CE, Bo ow R, Donnelly J. 2009. Vaccine. 27: 112-116.
F asch CE, Chapman SS. 1973. J In ec Dis. 127: 149-154.
F asch CE, Zollinge WD, Poolman JT. 1985. Re In ec Dis. 7: 504-510.
F eixei o P, Diéguez-Casal E, Cos oya L, Seijo B, Fe ei ós CM e al. 2013. In J Pha m.
443:1-8.
Geo oy MC, Floque S, Mé ais A, Nassi X, Pelicic V. 2003. Genome Res. 13: 391-398.
Giuliani MM, Adu-Bobie J, Comanducci M, A icò B, Sa ino S e al. 2006. P oc Na l
Acad Sci U S A. 103: 10834-10839.
Goldschneide I, Go schlich EC, A ens ein MS. 1969. J Exp Med. 129: 1307-1326.
