Tentativas de síntese de análogos da Immucilina H a partir de um derivado da D-Eritrose

António Valdmiro Mango Baptista Tentativas de Síntese de Análogos da Immucilina H a Partir de um Derivado D-Eritrose Outubro de 2019 UMinho | 2019 António Valdemiro Mango Baptista Tentativas de Síntese de Análogos da Immucilina H a Partir de um Derivado D-Eritrose Universidade do Minho Escola de Ciências Universidade do Minho Escola de Ciências António Valdmiro Mango Baptista Tentativas de Síntese de Análogos da Immucilina H a partir de um Derivado da D-Eritrose Dissertação de Mestrado em Química Medicinal Trabalho efetuado sob a orientação: Professora Doutora Maria José da Chão Alves Professora Doutora Maria Alice Gonçalves Carvalho outubro de 2019 ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do Repositório UM da Universidade do Minho. Atribuição-NãoComercial-SemDerivações CC BY-NC-ND https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ iii AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus pela proteção durante esta árdua caminhada, aos meus pais, familiares pelo apoio moral e financeiro. Assim, endereço um agradecimento muito especial aos meus orientadores do projeto, a Professora Doutora Maria José da Chão Alves e a Professora Doutora Maria Alice Gonçalves Carvalho pela paciência, estímulo, e sábios conselhos que me orientaram na elaboração deste trabalho tanto na componente experimental como na estruturação da redação. Gratamente reconheço que se preocuparam com o desenvolvimento do Projeto Laboratorial, e com o meu bem-estar, gesto que me enchia de confiança e força. Aos meus dois grandes amigos Artem Drogalin e David Freitas pelo apoio, e pelos muitos conselhos científicos no decorrer do trabalho laboratorial. Também os meus agradecimentos ao André Carvalho, à Joana Parente, à Sofia Teixeira, à Cátia, à Catarina, à Beatriz, ao Felipe, à Teresa Pereira, à Diana Brandão, ao Diogo Costa e ao Rodrigo. À minha Benilde que, mesmo estando distante, sempre mostrou o seu amor, carinho e consolo o que me encheu de força durante a minha atividade laboral. Agradeço também aos meus colegas angolanos na batalha pela convivência e pela disponibilidade demonstrada nos momentos mais difíceis ao longo deste percurso. À Dr.ª Elisa Pinto e à Dr.ª Vânia Azevedo pelo profissionalismo e prontidão demonstrado na realização dos espectros de Ressonância Magnética Nuclear. Não me posso esquecer dos meus primeiros orientadores, José Alberto Martins e Paula Margarida Ferreira, que mesmo chegando atrasado mostraram disponibilidade em receber-me para desenvolver o projeto laboratorial, inecentivaram-me muito durante esta caminhada. Aos Professores Gil Fortes; Susana Costa e Fernanda Proença pelo seu apoio moral e científico durante as aulas. Ao Departamento de Química da Universidade do Minho que sempre forneceu todos os meios para que as experiências resultassem. Finalmente, o pessoal dos bolos compartilhado nas datas de aniversários. iv DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v RESUMO Neste trabalho foram sintetizados derivados de imidazoles e purinas proveniente do diaminomaleonitrilo comercialmente disponível de acordo os procedimentos reportados na literatura. Foi também sintetizada a D-eritrose e δ-lactona derivada da D-eritrose, partindo da D-glucose, também seguindo os procedimentos experimentais conhecidos. Este trabalho está dividido em três partes: a parte A relativa a síntese de derivados de imidazoles; a parte B relativa à síntese da D-eritrose a partir da D-glucose seguida da síntese das respetivas iminas em condições anidras por reação direta com benzilamina, 4-fluor-benzilamina, 4-cloro-benzilamina. A reatividade e seletividade das iminas nas reações de adição nucleofílica foi avaliada usando o cianeto de trimetilsilano, que levou à formação de produtos com o grupo nitrilo incorporado. Noutro momento, foi adicionado o cianeto de trimetilsililo às iminas obtendo-se os adutos sililados. A parte C consiste na tentativa de adição nucleofílica de imidazoles e purinas ao sistema α,β-insaturado da lactona. Na falta de resultados, foi ainda feita a tentativa de redução de uma imina com o objetivo de a incorporar nos imidazoles/purinas a partir de um precursor comum. Infelizmente não foi possível obter um procedimento válido para melhorar o rendimento, e por isso tal estratégia não foi prosseguida. Palavras-Chave: Bases de purina, bases de imidazole, D-eritrose, fosfonatos de nucleosídeos acíclicos. vi ABSTRACT In this work were obtained imidazoles and purines derivatives from commercially available diaminomaleontrile, according to the procedures reported in the literature. D-erythrose and derived δlactone were obtained from D-glucose, also following known experimental procedures. This work is divided into three parts: part A concerning the synthesis of imidazole derivatives; Part B relating to the synthesis of D-erythrose from D-glucose followed by the synthesis of the respective imines under anhydrous conditions by direct reaction with benzylamine, 4-fluorobenzylamine, 4-chloro-benzylamine. The reactivity and selectivity of the imines to trimethylsilane cyanide was evaluated, leading to the formation of products incorporating the nitrile group. At another moment trimethylsilyl cyanide was added to the imines giving the silylated adducts. Part C consisted in attempts to nucleophilic addition of imidazoles and purines to the α,β-unsaturated lactone system. In the absence of results, an attempt was made to reduce an imine in order to incorporate the formed imine into imidazoles / purines from a common precursor. Unfortunately, it was not possible to obtain a valid procedure to improve the yield of the amine, so this strategy was not pursued. Keywords: Acyclic nucleoside phosphonates, purine bases, imidazole bases, D-erythrose. Capítulo 1 – Introdução 3 Figura 1-ANPs (1, 2 e 3) Nucleosídeos acíclicos (4, 5) Os ANPs podem ser classificados em nucleosídeos púricos e pirimidínicos de acordo as suas bases, de acordo com a cadeia alifática podem ser classificados em nucleosídeos acíclicos quirais e aquirias [9]. A introdução de um grupo quiral na cadeia lateral com uma determinada configuração afeta obviamente a atividade biológica. Por isso a síntese assimétrica destes compostos tem sido alvo de grande atenção. O maior volume de trabalho concentra-se principalmente na utilização de compostos de partida quirais e de auxiliares quirais. A catálise assimétrica deste tipo de compostos está ainda a dar os seus primeiros passos. Além da atividade os ANPs apresentam também atividade anti-cancerígena. Existem atualmente dois análogos de nucleósidos em ensaios clínicos para tratamento do cancro, células T e B: a Immucilin-H 6, de primeira geração e DADMe-immucilin-H 7, de segunda geração [10]. Figura 2-Estruturas da Immucilin-H (6), e da DADMe-immucilin - H (7). Capítulo 1 – Introdução 4 1.2 Estratégias de síntese dos fosfonatos nucleosídeos acíclicos (ANPs) Os fosfonatos nucleosídeos acíclicos (ANPs) podem ser sintetizados através de uma das seguintes estratégias: alquilação, reação a partir de epóxidos, reação de Mitsunobu, N -hidroxilação sililativa e organocatálise. De acordo com os diferentes agentes alquilantes, a alquilação pode ser feita usando um haleto de aquilo, um metilsulfonato ou um tosilato [11]. 1.3 Síntese de fosfonatos nucleosídeos acíclicos a partir de haletos de alquilo Vemishetti, Panzica e Abushanab [12] relataram em 1990 reações de alquilação de pirimidinas com cloretos de alquilo quirais para obtenção de nucleosídeo acíclico quirais (Esquema 1). Usaram o ácido D-isoascórbico (8) como material de partida. Posteriormente, o (2 R ,3 S )-3,4-epoxi-1,2O - isopropilidenobutano-1,2-diol (9) foi obtido em 6 etapas [13-14] sendo depois convertido no triol 10 em 4 etapas. Na presença de paraformaldeido e HCl (g), 10 sofreu clorometilação para dar 11 com 88 % de rendimento. Depois disso, o cloreto de alquil quiral foi acoplado ao uracil persililado 12a e timina 12b na presença de uma quantidade catalítica de iodeto de tetrabutilamónio (TBAI) para fornecer o produto alquilado 13a e 13b com bons rendimentos. A desbenzilação de 13a e 13b forneceu os nucleosídeos acíclicos quirais desejados, 2'-deoxi-2'-fluoroarabinofuranosiltimina (FMAU) 14a e 14b com excelentes rendimentos. Capítulo 1 – Introdução 5 Esquema 1-Reagentes e condições reacionais: (a) 6 etapas; (b) 4 etapas; (c) HCHO, HCl (g), DCM; (d) TBAI; (e) Pd (OH)2/C (20 mol%), EtOH. Jones et al. [15] sintetizaram o Adefovir a partir da adenina 15 comercialmente disponível. A adenina foi previamente tratada com 1,3-dioxalano-2-ona formando-se o álcool derivado 16 com 68% de rendimento. O álcool foi depois transformado no fosfonato 17 com 48% de rendimento por reação com o fosfonato de dietil metil tosilo, sendo depois convertido em ácido 18 por reação com TMSBr, com 48% de rendimento. O análogo Tenofovir, um potente inibidor contra o vírus HIV, pode ser preparado de forma idêntica [16-17]. Esquema 2-Reagentes e condições reacionais: (a) 1,3-dioxolano-2-ona, NaOH, DMF, refluxo; (b) fosfonato de dietil metil tosilato, t-butóxido de magnésio (3 eq.), DMF, 75 ºC, 24h; (c) TMSBr. Capítulo 1 – Introdução 6 A análise retrossintética do composto 17 permitiu identificar dois conjuntos de sintões: 19 e 20, e 15 e 21 (Esquema 3). O sintão 21 serviu como material de partida para a síntese de outros análogos de ANPs. Esquema 3Análise retrossintética do composto 17 para formação dos sintões (19, 20, 15 e 21). O composto 21 pode ser obtido a partir de 2-cloroetil-clorometil éter 22 comercialmente disponível. Em condições do rearranjo de Arbuzov o fosfonato 23 é obtido a partir de 22 com rendimento quantitativo. O fosfonato 23 quando tratado com iodeto de sódio em acetona originou o composto 21. A alquilação da adenina 15 com o fosfonato 21 sob condições suaves permitiu a formação do composto 17 com rendimento de 70%. Quando a alquilação foi feita a partir do 22 o produto 17 foi obtido com rendimento de 58%, sendo também isolado o regioisómero alquilado na posição N7, 24, com rendimento de 16 %, após cromatografia em coluna (Esquema 4). Capítulo 1 – Introdução 7 Esquema 4 - Reagentes e condições reacionais: (a) trietilfosfito, 125-140 ºC, 100%; (b) NaI, acetona, refluxo, 24h, 83%; (c) adenina, K2CO3, DMF, 30 h, t.a. O mesmo grupo de investigação estudou um conjunto de parâmetros como sejam temperatura, solvente e tipo de base de forma a melhorar a regioselectividade da alquilação. De acordo com esses estudos ficou a saber-se que a seletividade diminui com a utilização de bases hidroxílicas (tabela 1, entradas 1 e 2), que a temperatura não tem influência na regioselectividade da reação, e que a substituição da DMF ou NPM ( N -metil-2-pirrolidona) por outros solventes apróticos não altera a seletividade (Tabela 1). Tabela 1Influência da base, solvente e temperatura na regioselectividade durante a alquilação Capítulo 1 – Introdução 8 O composto 21 foi utilizado na síntese de outros análogos de Adefovir com bases de purina. A alquilação da 6-cloropurina (25) e da N6-benziladenina (28), deu a origem aos isómeros N9 respetivos (27 e 30), como produtos maioritários, com razões de régio-selectividade diferentes; para a 6cloropurina a razão de régio-isómeros N9: N7 é de 3: 1, e para a N6-benziladenina a razão é 5: 1. Os dois compostos 27 e 30 foram convertidos no fosfonato 17. Quando a posição 6 da purina incorporava um grupo amidina a seletividade subiu para 6:1( Esquema 5) Entrada base Solvente Temperatura ºC N9: N7 Conversão 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 NaOH KOH NEt3 DBU DMAP Cs2CO3 K2CO3 K2CO3 K2CO3 DBU NaI K2CO3 K2CO3 K2CO3 K2CO3 DMF DMF DMF DMF DMF DMF DMF NMP DMF MeCN DMF EtOAc Acetona DMF EtOH t.a t.a t.a t.a t.a t.a t.a t.a 0 t.a t.a t.a t.a 50 t.a 3:1 3:1 -a 4:1b -a 4:1 4:1 4:1 4:1 -a 4:1 -a -a 4:1 -c 100% 100% Vestígios 33% N.P. 100% 100% 100% 100% N.P. 100% N.P. N.P. 100% Vestígios (a)- Apenas material de partida; (b)-a reação não foi concluída; (c)- degradação do eletrófilo 21 por espectroscopia de 1H RMN; N.P. = produto não formado. Capítulo 1 – Introdução 9 Esquema 5Síntese de análogos de Adefovir a partir do iodeto 21. Reagentes e condições reacionais: i (a) 2iodoetoximetilfosfonato de O , O -dietilo, K2CO3, DMF, t.a, 24h; (b) NH3, MeOH, refluxo, 6h, 81%; ii (a) 2-iodoetoximetilfosfonato de O , O -dietilo, K2CO3, DMF, t.a, 24h; (b) H2, Pd/C (5 mol%), 1 atm, t.a., EtOH, 24h, 89 %; iii (a) 2-iodoetoximetilfosfonato de O , O -dietilo, K2CO3, DMF, t.a, 24h. Capítulo 1 – Introdução 10 Para introduzir os grupos pivaloximetilo no fósforo, converteu-se previamente o fosfonato 23 em ácido fosfónico 34 e este depois no fosfonato 35. Tentivas subsequentes de converter 35 no iodeto 35a não funcionou. A alquilação direta do sal de tetrabutilamónio da adenina com o composto 35 para gerar a pró-droga do Adefovir, Adefovir dipovixil (2) também não ocorreu (Esquema 6). Nas duas reações citadas o produto maioritário é o heterociclo 36. É provável que a clivagem de um dos grupos pivaloximetil ocorra inicialmente seguindo-se uma ciclização com formação do composto 36. Esquema 6 -Reagentes e condições reacionais:(a) TMSBr, MeCN (100%) t.a; (b) Pivalato de iodometilo, DBU MeCN,48h (54 % ); (c) adenina, K2CO3, DMF; (d) NaI, MeCN, refluxo, ou NaI, acetona refluxo; (e) DBU, MeCN, 120 ºC, 20 min (88%). Capítulo 1 – Introdução 11 Zang e seus colaboradores [18] sintetizaram o nucleosídeo S - DZ2002, tendo como base o ácido ( S )-málico comercialmente disponível. O ácido málico (37) foi tratado com 2,2-dimetoxipropano na presença de quantidade catalítica de p -TSA. Formou-se o acetonido 38 com rendimento de 61%, que foi subsequentemente reduzido ao álcool 39 na presença de trimetilsulfonilborano em THF. O álcool 39 foi convertido no tosilato 40 por reação com cloreto de tosilo em piridina. Por acoplamento do tosilato 40 com núcleo de adenina obteve-se o produto 41 com rendimento de 32%. A desproteção do acetonido ocorre espontaneamente originando o ácido que é transformado em ( S )-DZ2002 (42) por esterificação em MeOH / HCl (Esquema 7). Esquema 7–Reagentes e condições reacionais : (a) 2,2-dimetoxipropano, cat. p -TSA, 6h, 61%; (b) (CH3)2SBH3, THF, 0 ºCt.a, 12h, rendimento quantitativo; (c) TsCl, piridina, 0 ºC-t.a 5h, 67%; (d) K2CO3 adenina, DMF, 50 ºC, 12h 32%; (e) HCl, MeOH, 0 ºC-t.a, 5h, 50%. O mesmo grupo de investigação tentou sintetizar um análogo de ( S )-DZ2002, o composto (ceto)- DZ2002 por oxidação direita do composto ( S )-DZ2002. A reação não ocorreu. Seguiu-se uma nova metodologia de síntese envolvendo 5 etapas: 1) adição da adenina 15 ao acrilato de etilo com formação do éster 43; 2) transformação do éster em ácido carboxílico 44 por tratamento com uma solução de HCl (3N) [19]; 3) acoplamento com trifenilfosforanilideno de nitrilo na presença de um agente de Capítulo 1 – Introdução 12 acoplamento (EDCI) na presença de DMAP, obtendo-se o composto 45 [20]; 4) ozonólise com obtenção do composto 46 (88%) (Esquema 8). Os compostos ( S )-DZ2002 e a sua congénere in vivo (ceto)-DZ2002, mostraram actividade inibitória da enzima S -adenosilhomocisteína hidrolase (SAHase) e potencial imunosupressivo. A redução do composto 46 com NaBH4 deu origem a uma mistura racémica 47 (60%) que também possui o mesmo tipo de atividades biológicas. Esquema 8Reagentes e condições reacionais: (a) EtONa, benzeno, refluxo, 12 h, 83%; (b) HCl (3 N) refluxo, 3h, 95%; (c) EDCI, DMAP, DMF, t.a, 12 h, 71%; (d) O3, MeOH, 78 º C, 20 min, 88%; (e) NaBH4, MeOH, t.a, 30 min, 60%. Capítulo 1 – Introdução 19 1.5 Síntese de fosfonatos nucleosídeos acíclicos a partir da reação de Mitsunobu Compostos quirais contendo um hidroxilo primário podem sofrer reação de Mitsunobu e este método pode ser aplicado na obtenção de nucleosídeos acíclicos quirais [28]. Em 2003, Yuasa e Yokomatsu [28] obtiveram ANP contendo um grupo difluormetileno na cadeia derivada do açúcar ( R - gliceraldeído) por reação de Mitsunobu com 6-cloropurina (87) (Esquema 15) Partindo do R - gliceraldeído (84) obtiveram o derivado 85 [29], que foi posteriormente transformado no álcool 86 em 3 passos. Por condensação do álcool 86 com 6-cloropurina em condições de Mitsunobu (PPh3, DIAD, THF) foi obtido o nucleósido 88 com 88% de rendimento. Esquema 15-Síntese de ANP a partir da adição de Mitsunobu. Em 2010, Guo [30] e o seu grupo de investigação aplicaram a reação de Mitsunobu ao acoplamento de um derivado da L-serina e várias nucleobases de purina e pirimidina (Esquema 16). Formaram-se os ANP 92 e 93 com rendimentos moderados. Estas moléculas podem ser transformadas em vários compostos com interesse biológico incluindo o derivado de S -willardiina (92a) [31] e o seu análogo S -DHPA (93a). Capítulo 1 – Introdução 20 Esquema 16 -reagentes e condições reacionais: (a) PPh3, DIAD, solvente, 25 ºC; (b) LiOH; (c) LiAlH4 /THF. 1.6 Síntese de fosfonatos nucleosídeos via organocatalise Em 2011, Guo e Qu [32] obtiveram os primeiros nucleosídeos acíclicos quirais por adição de bases de purina 94 a aldeídos α,β-insaturados 95. Trata-se de reações de adições de aza-Michael catalisadas por um indutor de quiralidade, o prolinol silil éter 96. Obtiveram-se os produtos com bons rendimentos e elevada seletividade 82-89% e 89-99% (Esquema 17). Capítulo 1 – Introdução 21 Esquema 17Síntese de nucleósidos acíclicos via organocatálise. A reação com o aldeído cinâmico originou o produto respetivo com rendimento muito baixo. A adição de 6-cloro-purina (98) ao crotonaldeído (99) na presença do catalisador 96, seguida de redução in situ com NaBH4, levou à obtenção do nucleosídeo 100 com 87% de rendimento e 89% ee . Finalmente, o tratamento do nucleosídeo 100 com fosfonato 101, deu origem ao análogo 102, que após amonificação proporcionou a síntese de um análogo ( R )-9-(2-fosfanometoxipropil)adenina ( R -PMPA), o composto 103. O excesso enantiomérico do produto final corresponde ao excesso enantiomérico obtido inicialmente para o nucleosídeo quiral 100 (Esquema 18). Capítulo 1 – Introdução 22 Esquema 18 - reagentes e condições reacionais (a) 96 (10 mol %), PhCOOH ( 10 mol %), -30 ºC, tolueno, 48h, NaBH4, MeOH, 0 ºC; (b) NaH, THF, 0ºC; (b) NH3/CH3OH. Em 2012, o grupo Huang e Wang [33] relataram adições organocatalíticas de aza-Michael assimétrica de bases de purina a cetonas α,β-insaturadas. Na presença de catalisador da tioureia 106, foi adicionada uma série de bases de purinas 104 a cetonas alifáticas 105, dando origem aos adutos 107 com 67-96% de rendimento e 80-> 99% ee (Esquema 19a). Quando as cetonas aromáticas α,βinsaturadas 109 foram escolhidas como aceitadores de Michael, foi alterado o catalisador, para a amina primária 110 que provou ser ideal (Esquema 19b). Foi usada uma variedade de bases purinas 108 e enonas aromáticas α,β-insaturadas 109 conforme o esquema 19b. Os adutos aza-Michael 111 foram obtidos com rendimentos de 46-63% e 80-94% ee . Capítulo 1 – Introdução 23 Esquema 19a – Adição organocatalítica de aza-Michael com cetonas α,β-insaturadas como aceitadoras de Michael. Esquema 19bAdição organocatalítica de aza-Michael com cetonas α,β-insaturadas como aceitadoras de Michael. Capítulo 1 – Introdução 24 Um dos adutos obtidos foi transformado no nucleosídeo não natural semelhante a R -PMPA conforme o (Esquema 20). Por adição de Aza-Michael da 6-cloro-purina 112 à cetona alifática α,βinsaturada 113 obteve-se o aduto 114 com rendimento de 88% e 93% ee. A redução com NaBH4 proporcionou a formação de nucleosídeos acíclicos quirais syn -(2 S ,4 R ) 115a, e anti -(2 R ,4 R ) 115b, na razão syn : anti 2:1. O isómero 115a foi isolado com 50% de rendimento e 86% ee . A esterificação e amonificação sequenciais do nucleosídeo acíclico 115a originou o análogo do Tenofovir 116. Esquema 20 - reagentes e condições reacionais: (a) 1-((1 S )-2-aminocicloexil)-3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil) tioureia (10 mol %), PhCO2H (10 mol%), 30 ºC, tolueno, 48h; (b) NaBH4, MeOH, 0 ºC; (c) ref 32 Capítulo 1 – Introdução 25 1.7 Síntese de fosfonatos nucleosídeos acíclicos por N -hidroxialquilação sililativa Battistini [34] e seus colaboradores desenvolveram uma abordagem sintética de nucleosídeos acíclicos quirais por N -hidroxialquilação sililativa. A abordagem sintética partiu do R -gliceraldeido (117) utilizado como material quiral de partida, que foi protegido na forma de acetal, o 2,3O -isopropiledeno quiral D-gliceraldeído (118). Na fase seguinte ocorreu o acoplamento entre o composto 119 e o gliceraldeído na presença de TBSOTf-DIPEA como catalisador, formando os produtos syn / anti (120a, 120b) com rendimentos de 78% na proporção de (70:30), sendo o aduto syn o produto maioritário. O adutosyn 120 por tratamento com AcOH (aq) 80% a 50 ºC originou o diol 121 com bom rendimento, e retenção do hemiaminal protegido com grupo TBS ( Esquema 21). Esquema 21-reagentes e condições reacionais: (a) TBSOTf, DIPEA, (b) AcOH, 50 ºC. Capítulo 2 - Discussão de Resultados Discussão e Resultados Capítulo 2 – Discussão e Resultados 27 2.1. Introdução Este trabalho está dividido em três partes: a parte A relativa à síntese de derivados do diaminomaleonitrilo; a parte B relativa à síntese da D-eritrose a partir da D-glucose seguida da síntese das respetivas iminas e δ-lactona; a parte C consiste na tentativa de adição nucleofílica de imidazoles e purinas ao sistema α,β-insaturado da lactona, tendo como objetivo final a obtenção de pirrolidinas. O DAMN (1) comercialmente disponível serviu como reagente de partida para síntese de imidazoles e purinas [35-36]; a D-glucose foi transformada em dois passos na D-eritrose. A D-eritrose originou por reação direta com aminas: benzilamina, 4-cloro-benzilamina e 4-fluor-benzilamina, a formação de eritrozilimina que foram usadas como eletrófilos em reações de adição nucleofílicas com cianeto de trimetilsilano na presença de BF3.OEt2 e ambiente seco [37]. A seletividade facial é baixa, originando dois diastereómeros na razão 3:1, sendo o R isómero maioritário resultante da adição pela face re. O TMSCN foi também adicionado às iminas 37a-c na presença de ar previamente seco, sendo obtidos os adutos sililados 39a (Esquema 1). Esquema 1-Adição de TMSCN às iminas. Capítulo 2 – Discussão e Resultados 28 A partir da D-eritrose por reação de Wittig obteve-se um composto α,β-insaturado que por ciclização formou a lactona 36. Esta lactona foi utilizada como eletrófilo nas reações de adição nucleofílica com imidazoles/purinas em dioxano / DMSO a 80ºC. As reações não originaram os nucleótidos previsíveis (Esquema 2). Esquema 2Adição nucleofílica de imidazoles / purina à lactona. 2.2. Parte A: Síntese de derivados do DAMN (1) 2.2.1. Síntese de etil-(Z) -N -((Z)-2-amino-1,2-dicianovinil) formimidato (2) A síntese do imidato 2 foi realizada segundo os procedimentos reportados na literatura [38] utilizando como reagentes de partida o diaminomaleonitrilo (1) e o ortoformiato de trietilo. A reação ocorreu quando os dois reagentes foram submetidos a aquecimento em dioxano. O etanol resultante como subproduto da reação foi eliminado da mistura reacional através do sistema de destilação fracionada acoplado ao balão de reação. O imidato 2 foi isolado sob a forma de cristais amarelo-claros e a pureza foi confirmada por TLC, por comparação com um padrão. Este composto 2 serviu como intermediário para síntese de outros reagentes (Esquema 3) Capítulo 2 – Discussão e Resultados 35 2.2.6. Reações do 1,5-diamino-1 H -imidazol-4-carbonitrilo (8) com ácido fórmico e clivagem do grupo formilo. Bollier [40] e o seu grupo de investigação reportaram a síntese de purinas, com rendimentos entre 37-78%, por reação de N1-alquil-5-amino-4-cianoimidazoles com ácido fórmico, sob refluxo. No presente trabalho reproduziram-se as condições reportadas na literatura, na tentativa de obter a 9-amino6-oxopurina 19. O imidazole 8 foi colocado em refluxo, em ácido fórmico (20 equiv.), e a reação foi seguida por TLC. Após 1,5 h, por TLC, verificou-se a ausência de imidazole 8 e a reação deu-se por terminada. Após arrefecimento obteve-se um óleo que por TLC mostrava ser composto por 3 substâncias. Um dos compostos foi identificado como sendo 9 por comparação com um padrão autêntico. A reação foi repetida usando 5 equivalentes de ácido e o refluxo foi mantido por 9 h num caso e 14 h noutro. Os sólidos isolados mostraram ser o composto 18, mas os rendimentos eram muito baixos (7% e 11,5%), respetivamente. Como os rendimentos eram muito baixos considerou-se a hipótese de o produto ser muito solúvel em ácido fórmico e por isso não se conseguia isolar. Assim, a reação foi repetida usando uma quantidade menor de ácido, 3 equivalentes. Após 16 h de refluxo precipitou um sólido beije abundantemente da mistura reacional. O sólido foi isolado e identificado como 17 (73,4%). Como o composto 17 é um intermediário no processo de síntese de 18 a partir de 8, este composto 17 foi colocado de novo em ácido fórmico e submetido a refluxo durante 48h. O produto 18 foi isolado com rendimento 66% neste ensaio. Uma vez que quando se usou apenas 3 equivalentes de ácido fórmico isolou-se o intermediário 17, a reação do imidazole 8 voltou a repetir-se usando 5 equivalentes de ácido fórmico. Após 16 h de refluxo, o produto foi obtido com 31% de rendimento, quando foi isolado de uma mistura de ácido fórmico, etanol e acetonitrilo. Contudo, quando o produto se isolou após eliminar o ácido fórmico e adicionar um pouco de água e etanol o rendimento subiu para 61% (Esquema11). Capítulo 2 – Discussão e Resultados 36 Esquema 11Reação do imidazole (8) com ácido fórmico. Uma vez que a reação do imidazole 8 com ácido fórmico gerou a 6-oxopurina 18 em que o grupo amino de N9 se encontrava formilado, foi necessário clivar esse grupo. Foi preparada uma solução da oxopurina formilada 18 em DMSO-d6 e à solução adicionou-se uma pequena quantidade de TFA. A solução foi mantida à temperatura ambiente, durante 24 h, e a reação foi seguida por 1H RMN. Após 48 h de reação, o espetro de 1H RMN mostrava novos sinais compatíveis com a presença de composto 19 (20%). Após mais 3 dias à temperatura ambiente a percentagem de composto 19 na mistura reacional subiu para 40%. A mistura reacional foi colocada a 43 ºC e após 11 h o composto 19 encontrava-se na mistura numa proporção de 50%. A mistura reacional foi então colocada a 80 ºC e após 24 h o 1H RMN mostrava sinais compatíveis com a presença de um só composto identificado como 19. Este resultado mostrou que a clivagem do grupo formilo podia ocorrer de forma limpa na presença de TFA, contudo a Capítulo 2 – Discussão e Resultados 37 utilização de DMSO como solvente poderia impossibilitar o isolamento do produto. Assim tentou-se a clivagem usando como solvente o etanol. O composto 18 foi suspenso em etanol, na presença de TFA, e a mistura reacional foi submetida a 80 ºC durante 27h. O sólido isolado era constituído por uma mistura de 18 e 19 numa proporção de 68:32. A reação repetiu-se, mas aumentando o tempo de reação. Após 4 dias, a 80 ºC, obteve-se um sólido cujo espetro de 1H RMN mostrou ser constituído por uma mistura de 18 e 19, numa proporção de (22:78). A reação estava a ser muito demorada pelo que se repetiu utilizando como solvente o acetonitrilo. Após 5 dias de reação a 80 ºC, na presença de TFA, foi isolado um sólido cujo espetro e 1H RMN mostrou uma mistura de 18 e 19 numa proporção de 82:18. Mais uma vez a reação estava a mostrar-se muito demorada. Tentou-se então usar como solvente uma mistura de EtOH /H2O (1:1). Após 48 h a 80 ºC, na presença de um equivalente de TFA, foi isolado um sólido identificado como 19 com 79% de rendimento (Esquema 12). Esquema 12Clivagem do grupo formilo. Capítulo 2 – Discussão e Resultados 38 2.2.6.1. Mecanismo de síntese da 9-amino-6-oxopurina (19) De acordo os resultados experimentais obtidos, o primeiro passo será a hidrólise do grupo nitrilo. Em meio ácido deve ocorrer a protonação dos nitrogénios presentes em 8. A protonação do nitrogénio do grupo nitrilo conduz à formação do intermediário 20, que por ataque nucleofílico da água presente no meio gera 21. A eliminação do protão leva à formação de 9. Uma vez formada a amida 9, ocorre o ataque nucleofílico de N9 de 9 ao grupo carbonílico do ácido fórmico formando o intermediário 23. Por eliminação de uma molécula de H2O gera-se o produto 24. Posteriormente ocorre o ataque nucleofílico do grupo amino presente em C5 a uma nova molécula de ácido fórmico gerando o intermediário 25. Por eliminação de uma nova molécula de H2O forma-se 26. Finalmente, ocorre o ataque nucleofílico intramolecular do nitrogénio do grupo amida ao grupo carbonílico próximo fechando o anel de seis membros, e gerando 27. A eliminação de uma molécula de H2O gera 18. A clivagem do grupo formilo ocorreu em presença de TFA, em meio aquoso, com aquecimento (Esquema 13). O processo deve começar pela protonação do grupo carbonilo da amida 18, formando o intermediário 28. Na presença de água ocorre o ataque nucleofílico ao carbono eletrofílico de 28, formando o intermediário 29. A eliminação de ácido fórmico e H+ gera a 6-oxopurina final 19. Capítulo 2 – Discussão e Resultados 39 Esquema 13Mecanismo de síntese da 9-amino-6-oxopurina Capítulo 2 – Discussão e Resultados 40 2.3. Parte B: Síntese e reatividade do aldeído 33 e da lactona 36 2.3.1. Síntese do aldeído 33 O aldeído 33 foi sintetizado em dois passos a partir da D-glucose [41-44] comercialmente disponível. O primeiro passo consistiu na proteção da D-glucose com grupo benzilideno por reação da Dglucose com benzaldeido dimetilacetal em DMF seca na presença de catalise ácida (ácido p -tolueno sulfónico) a 70 ºC. Após a recristalização foi obtida a D-glucose protegida 32 com 55,0% de rendimento (Esquema 14). Esquema 14Síntese da D-eritrose na forma de acetal a partir da D-glucose 31. No segundo passo reacional ocorreu a clivagem oxidativa do composto 32 com periodato de sódio a pH =4 e temperatura compreendida entre 0 e 10 ºC. Após 3 horas, o pH foi ajustado a 6,5 por adição de uma solução de NaOH (8N) e a mistura reacional foi mantida sob agitação magnética à temperatura ambiente por mais 2 horas, de forma a garantir a total clivagem oxidativa de 4,6O - benzilideno-D-glucopiranose (32). Ao fim desse tempo a mistura reacional foi evaporada à secura e ao sólido branco resultante foi adicionado acetato de etilo de modo a extrair o aldeído 33 da mistura de sais. A solução de acetato de etilo foi seca com sulfato de magnésio anidro, filtrada e o solvente foi evaporado, obtendo-se um óleo incolor que por adição de éter etílico formou o aldeído 33 na forma de um sólido branco com rendimento de 91,0% Capítulo 2 – Discussão e Resultados 41 2.3.2. Síntese da lactona 36 A reação de Wittig [45] constitui um método de eleição para a obtenção de alcenos. A reação ocorre entre um aldeído e um ileto de fósforo. A natureza do ileto de fósforo define habitualmente a geometria da dupla ligação: formação do isómero trans ( E ) e do isómero cis ( Z ). Geralmente um ileto estabilizado gera o isómero trans ( E ) e um ileto não estabilizado gera o isómero cis ( Z ). A D-eritrose 33 reagiu com o acetato de metilo de 2-(trifenilfosforanilideno) (34) na presença de ácido p -tolueno sulfónico, formando-se uma mistura de isómeros 35 Z / E que foi separada por cromatografia, com 93 % de rendimento, na proporção 1:6,5 favorável ao alceno E . A ciclização do isómero Z ocorre no evaporador rotativo a 75 ºC e 500 mbar de pressão, após 9-10 horas de reação. Posteriormente foi realizada cromatografia [46], obtendo-se a 𝜹-lactona α, β-insaturada 36 (Esquema 15). Esquema 15Síntese da lactona α,β-insaturado derivado da D-eritrose. 2.3.3. Síntese de iminas 37a-c a partir do aldeído 33 As iminas 37a-c foram sintetizados a partir do aldeído 33 com aminas diferentes. As reações foram realizadas em THF (seco) sob atmosfera de N2 à temperatura de 35 ºC na presença de crivos moleculares 4Å ativados. Ao fim de 1h:30 min as reações estavam completas de acordo com os espectros de 1H RMN (CDCl3) da mistura reacional. O pico CH da função imina aparece a δH =7,97 ppm. O produto, foi obitido como um sólido branco após evaporação da mistura reacional no evaporador rotativo. (Esquema 16). As iminas foram utilizadas no passo seguinte sem purificação. Capítulo 2 – Discussão e Resultados 42 Esquema 16Síntese das iminas 37a-c a partir do aldeído. Tabela 2: Síntese das iminas 37a-c: amina reagente, tempo da reação e desvio químico do protão funcional. Entrada Amina Tempo de reação δH do pico imina (ppm) 37a 1h:30 min 7,97 37b 1h:30 min 7,97 37c 1 1h:30 min 7,97 2.3.4. Reações de adição nucleofílica às iminas. Adição TMSCN. As iminas foram submetidas a reações de adição nucleofílicas com cianeto de trimetilsilano na presença de BF3.OEt2 à temperatura de -84 ºC e em condições anidras. Foi obtida uma mistura de isómeros na razão de 3:1, sendo o isómero maioritário o diasteriómero R . Os isómeros foram separados por cromatografia de coluna, obtendo-se as α-cianoaminas com configuração R , com rendimentos de 47,6 (38c), 57,2 (38b). O isómero R do derivado 38a foi isolado puro com o rendimento de 44,4%; o restante material saiu da coluna como uma mistura de isómeros 1: 1 correspondente a 47 % (Esquema 17). Os isómeros S não foram isolados. Capítulo 2 – Discussão e Resultados 43 Esquema 17-Adição de cianeto de trimetilsilano às iminas 37a-c. Tabela 3-Adição nucleofílica as iminas 37a-c. Imina nucleófilo solvente composto Razão diastereómerica ( R : S ) 37a TMSCN THF 38a 3:1 37b TMSCN THF 38b 3:1 37c TMSCN THF 38c 3:1 O espectro de 1H de RMN mostra claramente o desaparecimento do pico CH da função imina, e o aparecimento do pico H -1’ como um dupleto com J =2,0-2,4 Hz a δH= 3,95-3,96 ppm nos isómeros R dos compostos (38a, 38b e 38c). Quanto ao RMN de 13C dos isómeros R, os picos do C-1’ aparecem na zona alifática a δc= 49,9 ppm. O grupo CN aparece δc=118,0-118,2 (ver parte experimental). O sinal do protão H -2 para cada um dos compostos é sempre um singleto com δH= 5,55-5,56, tabela 4. O protão H -5 em todos os casos surge sempre como um duplo dupleto de dupletos a δH 4,24-4,45 ppm. Os protões H -6 dos compostos 38a, 38b e 38c dos isómeros R surgem como um tripleto a δH =3,63 ppm com constante de acoplamento de 10,4 Hz e o outro H -6 é um dupleto de dupletos com J vicinal de 5,2-5,6 Hz. Capítulo 2 – Discussão e Resultados 44 Tabela 4– Principais dados espectroscópicos de 1H RMN das α-aminociano 38a-c ( R ) em (CDCl3) Composto δ(ppm) H -2 H4 H -5 H -6 H -1’ H -1’’ 38a ( R ) 5,56 (s) 3,86 (dd, J =9,2,2,4 Hz) 4,25 (ddd, J =10,0, 9,2,5,2 Hz) 3,63 (t, J =10,4 Hz) 4,31 (dd, J =10,4,5,6 Hz) 3,96 (d, J =2,0 Hz) 3,84 (d, J =13,2 Hz) 4,14 (d, J =13,2 Hz) 38b ( R ) 5,55 (s) 3,90 (dd, J =9,2,2,4 Hz) 4,24 (ddd, J =10, 6,9, 5,2 Hz) 3,63 (t , J =10,4 Hz) 4,32 (dd, J =10,4, 5,2 Hz) 3,96 (d, J =2,4Hz) 3,83 (d, J =13,2 Hz) 4,12(dd, J =13,6 Hz) 38c ( R ) 5,55 (s) 3,86 (dd, J =9,2, 2,4 Hz) 4,24 (ddd, J =10,9, 9,2, 5,6 Hz) 3,63 (t, J =10,4 Hz) 4,32 (dd, J =10,4, 5,2 Hz) 3,94 (d, J =2,4 Hz) 3,82 (d, J =13,2 Hz) 4,12 (d, J =13,2 Hz) Capítulo 2 – Discussão e Resultados 51 Tabela 11Principais dados espectroscópicos de 13C RMN do composto 41 em (CDCl3) Composto δ (ppm) 41 C-2 C-4 C-5 C-6 C-1’ C-1’’ 100,3 77,2 66,2 69,8 51,1 52,9 2.4. Reações a partir da lactona 36 2.4.1. Acoplamento da base heterocíclica 9 com a lactona 36. Em estudos anteriores [48], foram adicionadas aminas primárias à lactona 36 sob condições anidras tendo sido obitidos compostos de estrutura 42. (Esquema 21). Esquema 21-Condições reacionais: amina primaria, CH3CN (seco), N2(g), -10 ºC-t.a., 2 horas. Capítulo 2 – Discussão e Resultados 52 Neste trabalho foram usados derivados de imidazoles e purinas como nucleófilos para tentar gerar novos derivados 42. As condições reacionais e os resultados obitidos nos vários ensaios efetuados apresentam-se na tabela 12. Tabele 12Tentativas de adição nucleofílica á lactona 36 Entrada Nucleófilo Condições Resultados 1 CH3-CN (seco), -15.ºC t.a, N2(g), 3h Por 1H RMN apenas reagentes de partida 2 MeOH, Et3N (10eq), t.a 3 Dioxano/DMSO, Et3N (10.eq), 80 ºC, 7 dias Por 1H RMN presença de imidazole numa mistura complexa 4 Dioxano / DMSO, Et3N (10.eq), N2(g) 80 ºC, 7dias Por 1H RMN observava-se mistura complexa de com dois componentes maioritários As tentativas de adição nucleofílicas ao sistema carbonilico α,β-insaturado não surtiram efeitos. Os nucleófilos utilizados assim como as condições reacionais usadas nas várias tentativas efectudas estão reportados na tabela 12. O insucesso destas reações pode dever-se quer à insolubilidade dos nucleófilos quer à falta de reatividade dos mesmos. Na entrada 2 quando se colocou em contacto a lactona com imidazol-carboxamida na presença de Et3N e metanol, obteve-se o éster da lactona por ataque do MeOH ao carbono carbonilico. Capítulo 2 – Discussão e Resultados 53 2.5. Perspetivas futuras Os resultados obtidos nas reações de adição nucleofílica com TMSCN levaram à formação de uma mistura de isómeros na proporção (3:1). A seletividade parcial destas adições com predominância para o ataque na face re deve ser melhorada. Para resolver esta questão propõe-se a ativação da imina com outros catalisadores metálicos como agentes complexantes/ativadores bidentados, para além do boro, que foi utilizado na forma BF3.éter. O solvente usado nas reações foi THF que tinha mostrado anteriormente melhor seletividade do que DCM e ACN. O que significa que neste particular a margem para a variação do solvente é pequena. (Esquema 22). Esquema 22Adição de cianeto de trimetilsilano às iminas. A adição de TMSCN às iminas 37a-c na presença de ar seco permitiu obter iminas ligadas pelo nitrogénio ao grupo trimetilsilano. Os produtos formam-se com rendimentos quantitativos. Não foi possível obter as amidas como esperado de acordo os procedimentos reportados na literatura para outros casos [49] (Esquema 23). Esquema 23Adição de cianeto de trimetilsilano às iminas 37a-c. Capítulo 2 – Discussão e Resultados 54 Uma vez que a adição de nucleófilos de nitrogénio integrando um grupo hidrazina de imidazole/purina ao sistema α,β-insaturado da lactona derivada da D-eritrose falhou, propõe-se uma estratégia alternativa para ligar a unidade açúcar com a base purínica/imidazole. A estratégia consiste em obter em 3 passos o nucleósido: 1) obter a amina primária derivada da D-eritrose 43 por redução das iminas e hidrogenólise do grupo benzilo; 2) adicionar a amina obtida ao imidato 2 na presença de catálise ácida, com o objetivo de se obter a amidina 44; 3) adicionar KOH (1M) primeiro à temperatura ambiente para se obter o produto 45; 4) aquecer a mistura á 78 ºC para se obter a carboxamida 46. (Esquema 24). Esquema 24Possível síntese do nucleótido 46 a partir da reação da amina derivada do D-eritrose 43 com o imidato 2. Capítulo 3 - Parte experimental Parte experimental Capítulo 3 – Parte Experimental 56 3.1. Parte Experimental Os espetros de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C foram registados num aparelho Bruker Avance III (1H: 400MHz, 13C: 100MHz), usando o pico do solvente como referência interna. A atribuição dos sinais de 1H e 13C foi efetuada recorrendo às técnicas heteronuclear bidimensionais HMQC e HMBC. Os dados de cada espetro de RMN são indicados na seguinte ordem: desvio químico (δ/ppm), multiplicidade do sinal, constantes de acoplamento ( J /Hz), número de protões (nH) e atribuição do sinal. As multiplicidades de sinais são: singleto (s), singleto largo (slargo), dupleto (d), dupleto de dupletos (dd), tripleto (t), dupleto de tripletos (dt), quarteto (q), multipleto (m). A numeração atribuída a cada estrutura foi usada apenas para facilitar a atribuição dos dados espectroscópicos e pode não seguir a numeração relativa ao nome do composto. Na espetroscopia de ressonância magnética nuclear foram usados os solventes deuterados: CDCl3, com 99,8% de grau de pureza; D2O, com 99,9 % de grau de pureza; DMSO-d6, com 99,9% de grau de pureza, todos da marca Aldrich. O aldeído 33 e a lactona 36 foram sintetizadas seguindo os procedimentos descritos por Barker et al.[41-44] .O imidato 2 foi sintetizado pelo procedimento descrito por Woodward [38], a amidrazona 3 e o imidazole 8 foram sintetizados de acordo com o reportado por Alves et al.[ 36 ]. O metanol (MeOH) foi seco com magnésio e iodo e destilado imediatamente antes de cada utilização. O tetrahidrofurano (THF) foi seco com sódio metálico e benzofenona e destilado imediatamente antes de cada utilização. A dimetilformamida (DMF) foi seca por destilação fracionada com eliminação de H2O na fração de cabeça. Os espetros de IV foram registados num espetrofotómetro Bomem MB 104 FT-IR usando misturas com Nujol em células de cloreto de sódio. Os pontos de fusão foram obtidos num aparelho Gallenkamp e não foram corrigidos. A rotação ótica dos compostos quirais foi medida no micro-polarímetro AA-1000 optical activity, expressa em ºdm-1c-1 ( c = g/100mL). Capítulo 3 – Parte Experimental 57 Os espetros de massa de alta resolução foram efetuados segundo o método ESI-MS (Bruker Microtof ou Q-TRAP). A espetrometria de massa de baixa resolução foi registada pela técnica ESI-MS no espectrofotómetro LC-MS Finnigan LXQ. Todos os outros reagentes e solventes foram utilizados na sua forma comercial. 3.2. Síntese de 1,5-diamino-1 H -imidazol-4-carboxamida (9) Ao imidazole 8 (1,75 g; 1,52 mmol) contido num balão de fundo redondo foi adicionado etanol (6mL) e KOH (1M, 6 mL). Formou-se uma suspensão que ficou sob agitação magnética a 78 ℃. Ao fim de 2 horas o sólido tinha dissolvido, dando origem a uma solução castanho-avermelhada. A mistura manteve-se sob aquecimento por mais 3 horas, até estar terminada por TLC. Deixou-se arrefecer a solução até à temperatura ambiente e concentrou-se no evaporador rotativo até precipitar um sólido de cor castanho-avermelhado, que foi filtrado e lavado com água fria e éter etílico, no funil. Do líquido mãe foi obtido uma nova fração que foi filtrada e lavada com água fria e éter etílico. As duas frações foram combinadas e identificados como produto 9 (1,35 g; 0, 97 mmol, ƞ= 63,8%). P.f: 225228 ℃. IV (nujol) banda larga entre 3500-2000 absorções mais fortes a 3340 (NH), 3332 (NH), 1649 (CO) cm-1. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 5,47 (sl, 2H, NH2-5), 5,61 (sl, 2H, NH2-1), 6,55 (sl, 1H, NHamida), 6,66 (sl, 1H, NH-amida) 7,00 (s, 1H, H -2). 13C-RMN (100 MHz, DMSO) δ 110,1 ( C -5), 130,52 ( C -2), 143,39 ( C -4), 166,6 ( C= O) ppm. MS (ESI): calculado para C5H9N4O: 141,13; obtido; 163,98 [M+Na]+. Capítulo 3 – Parte Experimental 58 Síntese de 9-amino-6,9-dihidro-1 H -purina-6-carboxamida (11) Ao imidazole 7 (0,11 g; 7,24mmol) e paraformaldeido (0,025 g) contidos num balão de 25 mL, foi adicionado etanol (3 mL) e acetonitrilo (3 mL). Formou-se uma suspensão. Ao fim de um dia a mistura reacional apresentava cor laranja, e o sólido cor-de-laranja, em suspensão, foi filtrado e lavado com etanol e éter étilico frios, no funil. O sólido foi analisado por 1HRMN usando (DMSO-d6) como solvente. Tratavase de uma mistura complexa. A mistura contida no tubo 1HRMN foi aquecida durante 15 horas a 80 ℃ e o espectro de 1HRMN adquirido nessa altura mostrou sinais compatíveis com a presença de um composto puro que foi identificado como o composto 11. 1H-RMN (400 MHz, DMSO) δ 6,31 (s, 2H, NH29) 8,04 (s, 1H, NH2 amida), 8,38 (s, 1H, NH-amida), 8,63 (s, 1H, H-8), 9,02 (s, 1H, H-2). 13C-RMN (100 MHz, DMSO) δ 129,2 ( C -5), 147,42 (C-6), 149,41( C -8), 151,50 ( C -2), 153,01 ( C -4), 164,4 ( C -6) ppm. Síntese de 5-amino-1-formamido-1 H -imidazole-4-carboxamida (17) Ao imidazole 8 (1,08 g; 0,87 mmol) contido num reator de 30 mL, foi adicionado ácido fórmico (3 eq; 1,06 mL). Formou-se uma suspensão viscosa de cor castanha que ficou sob refluxo a 100 ℃. Passado 2 horas a suspensão passou a solução adquirindo cor castanho-escura. Ao fim de 2 dias parouse o refluxo e deixou-se arrefecer a solução até à temperatura ambiente. Posteriormente adicinou-se acetonitrilo (4 mL) precipitando um sólido castanho. De seguida filtrou-se o sólido, e lavou-se com o mínimo de acetonitrilo e éter etílico. (0,97g; 0,64 mmol, ƞ= 73,4%). 1H-RMN (400 MHz, DMSO) δ 5,82 (s, 2H, NH2-5), 6,64 (sl, 1H, NH-6), 6,73 (sl, 1H, NH-6) 7,09 (s, 1H, H -2), 8,25 (s, 1H, CHO), 11,03 (s, 1H, NH-1). 13C-RMN (100 MHz, DMSO-d6) δ 109,6 ( C -4), 129,2 ( C -2), 142,7 ( C -5), 160,5 (C-6), 166,31 (C-7). Capítulo 3 – Parte Experimental 59 Síntese de N -(6-oxo-1,6-dihidro-9 H -purina-9-il) formamida (18) Ao imidazole 8 (1,37 g; 0,011 mmol) contido num balão de 25 mL, foi adicionado ácido fórmico (5 eq; 2,22 mL) tendo-se formado uma solução de cor amarelo escuro que ficou sob refluxo a 100℃. Ao fim de 9 horas deixou-se arrefecer a mistura reacional, sendo posteriormente evaporada à secura. De seguida adicionou-se água (1 mL) precipitando um sólido de cor beije, que foi filtrado e lavado com o mínimo de água, seguido por etanol e éter etílico (1,21 g; 0,67 mmol; ƞ= 61,17%). P. f: 269-273. IV (nujol) νmax 3338 3345,1684, 1708 cm-1. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,05 (s, 1H, H-2), 8,13 (s, 1H, H -8), 8,46 (s, 1H, HCONH, H-9 ), 12,5 (s, 1H, H-1).13C-RMN (100 MHz, DMSO) δ122,0 ( C -5), 140,6 ( C -8), 146,7 ( C -2), 147,6 (C-4), 156,5 ( C -6), 160,6 (CO) ppm. MS (ESI): calculado para C7H7N4O2: 179,14; obtido: 178,02. [M-H]+ Síntese de 9-amino-1,9-dihidro-6 H -purina-6-ona (19) À purina 18 (0,12 g; 0,67 mmol), contida num reator de 30 mL, foi adicionado EtOH (3,5 mL), H2O (0,5 mL) e TFA (0,05 μL). Formou-se uma suspensão castanha escura que ficou sob agitação magnética a 80 ℃. Ao fim de 48 horas a suspensão adquiriu cor castanha clara. Removeu-se o aquecimento e deixou-se arrefecer a suspensão até à temperatura ambiente. De seguida filtrou-se a suspensão de cor castanho-claro que foi lavada com etanol e éter etílico frios (0,79 g; 0,53 mmol; ƞ= 79%). P.f: 320-322. 1HRMN (400 MHz, DMSO-d6.TFA) δ 8,28 (s, 1H, H -2) 9,12 (s, 1H, H-8). 13C-RMN (100 MHz, DMSO-d6.TFA) δ 116,6 ( C -5), 140,7 ( C8), 147,4 ( C -4), 154,3 ( C -6), 148,5 ( C -2) ppm. Capítulo 3 – Parte Experimental 60 3.3. Síntese de iminas derivadas da D-eritrose 33 Procedimento geral A uma solução de aldeído (100-150 mg; 0,48-0,72 mmol) em THF seco (5 mL), contendo crivos moleculares 4Å ativados foi adicionado a amina (51-102 mg; 0,48-0,72 mmol; 48-87 µL). A mistura reacional ficou sob agitação magnética à temperatura de 35 ºC e atmosfera de azoto. Ao fim de 1h:30 min, a reação tinha terminado. O solvente foi evaporado no evaporador rotativo obtendo-se um sólido branco que foi identificado como a imina com rendimento quantitativo. A mistura reacional foi utilizada no passo seguinte, sem purificação. Síntese de (2 R ,4 S ,5 R )-4-(( E )-(benzilimino)metil)-2-fenil-1,3-dioxan-5-ol (37a) Síntese da imina 37a: aldeído 33 (150 mg; 0,72 mmol); solvente: THF (5 mL); benzilamina (77 mg; 0,72 mmol; 78 µL); 1h:30 min. 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ 3,73 (t, J = 10,8 Hz, 1H, H -6), 4,04 (ddd, J = 10,4, 8,8 5,2 Hz, 1H, H -5), 4,22 (dd, J = 8,8, 1,6 Hz, 1H, H -4), 4,38 (dd, J = 10,8, 5,2 Hz, 1H, H -6), 4,77 (s, 2H, H -1’’), 5,69 (s, 1H, H -2), 7,36 - 7,65 (m, 10H, Ph-C H ), 7,98 (d, J = 1,6 Hz, 1H, H -1’) ppm. Capítulo 3 – Parte Experimental 67 Síntese de cloreto de N- (4-clorobenzil)- N -((2 R ,5 R )-5-hidroxi-2-fenil-1,3dioxan-4-il)metileno)-1,1,1-trimetilsilanamínio (39b). Solução imina (100 mg; 0,48 mmol); THF seco (5 mL); cianeto de trimetilsilano (47,6 mg; 0,48 mmol; 60 µL). Produto: óleo amarelo claro; rendimento: quantitativo. [𝛼]D25-26,8 ( c 0,5; MeOH); IV(nujol) νmax 3093-3336 cm-1. 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ 3,69 (dd, J = 10,8, 10,4 Hz, 1H, H -6), 3,93 (ddd, J = 10,0, 9,2 ,5,2, Hz, H-5), 4,23 (dd, J =8,0, 5,6, Hz, 1H, H -4),4,26 (dd, J = 10,8, 5,2, Hz, 1H, H -6), 4,60 (d, J = 14,4 Hz, 1H, H -1’’), 4,66 (d, J = 14,4 Hz, 1H, H -1’’), 5,56 (s, 1H, H -2), 7,24 – 7,52 (m, 9H, H -Ph), 7,74 (d, J = 5,6 Hz, 1H, H -1’) ppm; 13C-RMN (100 MHz, CDCl3) δ 63,7 ( C -5), 64,0 ( C -1’’), 71,5 ( C -6), 83,1 ( C -4), 100,8 ( C -2), 126,1, 126,6, 128,3, 129,1 129,5 ( C H-Ph), 136,8, 137,2 ( C -q), 161,4 ( CH -1’) ppm. Capítulo 3 – Parte Experimental 68 Síntese de cloreto N -(4-fluorobenzil)- N -((2 R ,5 R )-5-hidroxi-2-fenil-1,3dioxan-4-il)metileno)-1,1,1-trimetilsilanamínio (39c). Solução de imina (100 mg; 0,48 mmol); THF seco (5 mL); cianeto de trimetilsilano (47,6 mg; 0,48 mmol; 60 µL). Produto: óleo amarelo claro; rendimento: quantitativo. IV(nujol) νmax 3333-3645 cm1.1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ 3,69 (t, J = 10,0 Hz, 1H, H -6), 3,93 (ddd, J = 10,0, 9,2, 5,2, Hz, H -5), 4,21 (dd, J = 10,8, 5,6, Hz, 1H, H -4), 4,24 (dd, J = 11,2, 5,2, Hz, 1H, H -6), 4,61 (d, J = 14,4 Hz, 1H, H - 1’’), 4,67 (d, J = 14,4 Hz, 1H, H -1’’), 5,56 (s 1H, H -2), 7,74 (d, J = 5,6 Hz, 1H, H -1’) ppm; 13C-RMN (100 MHz, CDCl3) δ 63,7 ( C -5), 64,0 ( C -1’’), 71,5 ( C -6), 83,1 ( C -4), 100,8 ( C -2), 115,1(d, J = 21 Hz, C4’’ ou C-6’’), 128,5 (d, J =8 Hz, C-3’’ou C-7’’), 129,6 (d, J =8Hz, C-3 ou C-7’’), 126,1, 128,3, 128,7, 129,0, 129,7 ( C H-Ph), 134,1, 137,2 ( C -q), 160,6 (d, J =235 Hz, C-5’’), 161,4 ( CH -1’) ppm. Capítulo 3 – Parte Experimental 69 Síntese de cloreto de ((2 R ,4 S ,5 R )-5-hidroxi-2-fenil-1,3-dioxan-4-il)-4metanamonio (40) A uma solução de imina 37a (150 mg; 0,72 mmol) em THF seco (3 mL) e metanol seco (3 mL) foi adicionado Pd/C 10% (15 mg). A mistura reacional foi purgada 10 vezes com N2(g), H2 alternadamente, ficando sob agitação magnética e H2 durante 24 horas. Ao fim desse tempo foi adicionado ácido clorídrico 37% (0,3 eq.; 21 μL). A mistura reacional foi novamente purgada 10 vezes com N2(g), H2 (g), ficando sob agitação magnética durante 24 h. A mistura reacional foi filtrada sob uma almofada de celite, o solvente foi removido no evaporador rotativo, obtendo-se um óleo amarelo viscoso. Por adição de uma mistura de diclorometano: éter etílico (6:2), precipitou um sólido branco que posteriormente foi filtrado e analisado por 1HRMN (31 mg; ƞ= 21%). 1H-RMN (400 MHz, D2O) δ 3,28 (dd, J =13,6, 9,2 Hz, 1H, H -1’’), 3,58 ( dd, J =13,6, 3,2 Hz 1H, H -1’) 3,79 (ddd, J =10, 8,4, 5,6 Hz, 1H, H -5), 3,79 (t, J =10,4, Hz, 1H, H -6), 4,06 (dt, J =9,2, 2,8 Hz, 1H, H -4), 4,35 (dd, J = 10,4, 5,2 Hz, 1H, H - 6 ), 5,51 (s, 1H, H -2), 7,49-7,45-7,54 (m, 5H, Ph) ppm; 13C-RMN (100 MHz, CDCl3) δ 40,1 ( C -1’), 62,6 ( C -5), 70,0 ( C -6), 77,4 (C-4) 101,0 ( C -2), 126,2, 128,8, 129,9, ( C H-Ph), 136,2, ( C -q) ppm. MS (ESI): calculado para C11H15NO3: 210,11 [M+H+]; obitido: 209,95. Capítulo 3 – Parte Experimental 70 Síntese de cloreto de (2 R ,4 S ,5 R )-4-((benzilamino)-2-fenil-1,3-dioxan-4il)-4-metanamonio (41). Redução da imina 37a Ao sólido da imina 37a (150 mg; 0,72 mmol) foi adicionado THF (3,5 mL) e MeOH (3,5 mL). De seguida foi adicionado NaBH4 (1,14 mmol; 54,5 mg). A mistura ficou sob agitação magnética à temperatura ambiente durante 12h. Evaporou-se a mistura reacional num evaporador rotativo. Obtevese um sólido branco, que foi dissolvido em DCM (30 mL), e lavado com H2O (3x 30 mL). A fase orgânica foi secada com MgSO4 anidro e filtrado. O solvente foi removido num evaporador rotativo obtendo-se um sólido branco que provou ser composto 41 (100 mg; 0,33 mmol; 50%). Pf: 72-75 ºC.[𝛼]D23-25,5 ( c 0,5 ; MeOH); IV (nujol) νmax 3350, 3200 cm-1.1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ 3,00 (dd, J =12,0 ,8,8 Hz, 1H, H -1’), 3,20 (dd, J =12,0, 4,4 Hz, 1H, H -1’), 3,63 (t, J =10,4, Hz, 1H, H -6), 3,73 (td, J = 8,8, 4,4 Hz, 1H, H -4), 3,83 (td, J = 9,6, 4,8 Hz, 1H, H -5), 3,85 (d, J =12,8 Hz, 1H, H -1’’) 3,93 (d, J =12,8 Hz, 1H, H -1’’), 4,31( dd, J =10,8, 5,2 Hz, H -6), 5,50 (s, 1H, H -2), 7,30-7,38 (m, 8H, H -Ph), 7,47 (dd, J =7,6, 2,0 Hz, HPh) ppm; 13C-RMN (100 MHz, CDCl3) δ 51,1 ( C -1’), 52,9 ( C -1’’), 66,2 ( C -5), 69,8 ( C -6), 77,2 (C4), 100,3 ( C -2), 126,7, 127,3, 127,4, 129,7 128,0 ( C H-Ph), 137,5, 137,7 ( C -q) ppm. Bibliografia Bibliografia 72 Bibliografia [1]. Dayde, B.; Benzaria, S.; Pierra, C.; Gosselin, G.; Surleraux, D.; Volle, J. N.; Pirat, J. L.; Virieux, D. Org. Biomol. Chem . 2012, 10 (17), 3448–3454. https://doi.org/10.1039/c2ob25131k. [2]. Krecmerova, M.; Holý, A. ChemInform . 2010, 41 (27), 6-9 https://doi.org/10.1002/chin.201027224. [3]. 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