Papel de la respuesta táctica en el transporte bacteriano a través del suelo y su implicación en la biodisponibilidad y biodegradación de naftaleno

PAPEL DE LA RESPUESTA TÁCTICA EN EL TRANSPORTE BACTERIANO A TRAVÉS DEL SUELO Y SU IMPLICACIÓN EN LA BIODISPONIBILIDAD Y BIODEGRADACIÓN DE NAFTALENO Memoria que presenta Celia Jiménez Sánchez para optar al título de Doctor por la Universidad de Sevilla Sevilla, Abril de 2013 AGRADECIMIENTOS Quiero agradecer a todos los que han contribuido a la elaboración de esta Tesis Doctoral: En primer lugar, un especial agradecimiento al Dr. José Julio Ortega Calvo, director de esta Tesis Doctoral, por haberme brindado la oportunidad de adentrarme en el mundo de la Investigación, por su excelente labor de dirección y por todo el conocimiento que me ha transmitido a lo largo de estos años. A la Dra. Patricia Paneque, por aceptar la tutoría de esta Tesis y su actitud siempre disponible. A los Dres. Lukas Wick Y Jan Sorensen, que han hecho posible que mis estancias en el extranjero sean una experiencia enriquecedora tanto profesional como personalmente. Especialmente, al Dr. Lukas Wick por la ayuda prestada en todo momento. A la dirección del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (CSIC), por las facilidades prestadas para la elaboración de este trabajo. A la Dra. Patricia Velasco Casal, por la ayuda ofrecida en los comienzos de la experimentación en el laboratorio. A José Luis Sánchez-Quiñones, por dejarse guiar por mis consejos durante su estancia en nuestro grupo. A mis compañeros de laboratorio. A José Luis Niqui, por ser tan paciente conmigo, cuando le agobiaba con miles de preguntas, mientras él estaba inmerso en la escritura de su Tesis. A Nadine, por su inagotable sonrisa con la que me recibía cada mañana al entrar en el laboratorio. A Mari Carmen, mi compañera desde el primer día, gracias por los momentos que hemos compartido. A Eleonora, mi italiana preferida. Gracias por estar ahí incondicionalmente cada vez que lo he necesitado. A Rungroch, por esas largas discusiones en inglés, y por tantas risas compartidas. Gracias a todos por crear un ambiente tan agradable para el trabajo. A mis compis del IRNAS, por los ratos inolvidables que hemos pasado en nuestro rincón de la cuarta planta. Especialmente a Alfonso, por ser como uno más de nuestro grupo. A mis amigas, con las que he vivido tantos momentos, por haberme apoyado en la realización de este trabajo. Porque ellas también han recorrido este camino conmigo. Por último, quiero agradecer de forma especial, a mi familia. Porque han vivido intensamente esta experiencia tanto como yo. Y de manera muy especial a mis padres, este trabajo también es vuestro. Una vez más, gracias a todos. RESUMEN……………………………………………………………………………….....IX CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN…………………………………………………………...1 I.1 ESTRATEGIAS DE RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS….......................................................................................2 I.2 BIODEGRADACIÓN DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS…………………………………………………5 I.3 MOVILIDAD BACTERIANA………………………………………………………..7 I.3.1 Quimiotaxis bacteriana……………………………………………………9 I.3.1.1 Señalización de la respuesta quimiotáctica……………………10 I.3.1.2 Estudio del patrón de movilidad en la respuesta táctica…………………………………………………….11 I.3.1.3 Modificación del patrón de movilidad como método de bioestimulación……………………………….14 I.4 ADHESIÓN BACTERIANA SOBRE SUPERFICIES SÓLIDAS……………………16 I.4.1 Tipos de adhesión………………………………………………………….17 I.4.1.1 Interacciones de largo alcance…………………………………..17 I.4.1.2 Las interacciones de corto alcance……………………….……..18 I.4.1.3 Teoría DLVO aplicada a células bacterianas.............................19 I.4.2 Factores que afectan a la adhesión bacteriana…………………...20 I.5 TRANSPORTE BACTERIANO A TRAVÉS DE MEDIOS POROSOS SATURADOS…………………………………………………………21 I.5.1 Teoría de filtración de coloides (CFT)…………………………………21 I.5.2 Bloqueo del colector……………………………………………………..23 I.5.3 Factores que afectan al transporte bacteriano……………………25 I.5.3.1 Fuerza iónica del medio…………………………..………………..25 I I.5.3.2 Velocidad de flujo……………………………………..…………….25 I.5.3.3 Concentración celular……………………..………...……………..25 I.5.3.4 Propiedades hidrodinámicas………………………………….……26 I.5.3.5 Rugosidad de la superficie del colector……………..…………..27 I.5.3.6 Tamaño de partícula del colector………………………………….27 I.5.3.7 Movilidad bacteriana.....................................................................27 I.5.3.8 Materia orgánica………………………………………………………29 I.6 BIODISPONIBILIDAD Y BIODEGRADACIÓN DE CONTAMINANTES………………………………………………………..29 I.6.1 Quimiotaxis bacteriana como mejora de la biodisponibilidad y biodegradación…………………………30 I.6.2 La nanotecnología como aplicación en biorremediación…………………………………………..............32 CAPÍTULO II: OBJETIVOS……………………………………………………………….33 CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………..35 III.1 REACTIVOS……………………………………………………………………36 III.2 EFECTORES TÁCTICOS………………………………………………………36 III.3 MATERIALES POROSOS……………………………………………………..39 III.4 ANILLAS DE SILICONA……………………………………………………….40 III.5 ESTIRPES BACTERIANAS, MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO……40 III.5.1 Pseudomonas putida G7..........................................................40 III.5.2 Escherichia coli/pRL 1063...........................................................42 III.5.3. Escherichia coli/Prk 2063............................................................43 III.5.4 Transformantes obtenidos…………………………………………43 II III.6 OBTENCIÓN Y SELECCIÓN DE MUTANTES QUIMIOTÁCTICOS………..43 III.6.1 Conjugación triparental con el transposón Tn5.……………...43 III.6.2 Selección de mutantes válidos…………………………………..44 III.7 CARACTERIZACIÓN DE P. putida G7……………………………………..45 III.8 ANÁLISIS DE LA MOVILIDAD BACTERIANA……………………………….46 III.9 EXPERIMENTOS PARA EL ANÁLISIS DE LA RESPUESTA TÁCTICA………48 III.9.1 Ensayo capilar………………………………………………………48 III.9.2 Ensayo de gota con hidroxipropilmetilcelulosa……………...50 III.10 ENSAYO DE ADHESIÓN……………………………………………………51 III.11 ENSAYOS DE TRANSPORTE EN COLUMNAS…………………………….52 III.11.1 Empleo de quimioefectores en los ensayos de transporte…………………………………………………..…55 III.11.1.1 Efecto directo………………………………………………..55 III.11.1.2 Efecto del pre-bombeo…………………………………...55 III.11.1.3 Reversión del transporte de bacterias adheridas en las columna……………………………….56 III.11.1.4 Empleo del quimioefector naftaleno en las columnas…………………………………………….56 III.11.1.5 Caracterización físico-química de los quimioefectores empleados………………………….56 III.12 ENSAYOS DE BIODEGRADACIÓN DE NAFTALENO…………………..57 III.12.1 Carga de anillas de silicona con naftaleno marcado con 14C radiactivo…………………………………...57 III.12.2 Ensayos de mineralización en columnas……………………...58 III.12.3 Ensayo de mineralización en fase acuosa……………………60 III.12.4 Balance de masas…………………………………………………61 III CAPÍTULO IV: RESULTADOS………………………………………………………….…63 IV.1 CARACTERIZACIÓN DE LA ESTIRPE OBJETO DE ESTUDIO ………......64 IV.2.1 Curva de crecimiento en función de la fuente de carbono…………………………………………...…64 IV.2.2 Hidrofobicidad celular y carga superficial……………………..66 IV.2.3 Morfología y tamaño celular………………………………...……66 IV.2 OBTENCIÓN Y SELECCIÓN DE MUTANTES QUIMIOTÁCTICOS …………………………………………………………68 IV.1.1 Resistencia a antibióticos…………………………………………..68 IV.1.2 Mutantes deficientes en la respuesta táctica……………...….68 IV.3 ANÁLISIS DE LA MOVILIDAD BACTERIANA …………………………….70 IV.3.1 Movimiento de respuesta táctica positiva……………………..70 IV.3.1.1 Patrón de movilidad frente a atrayentes…………………71 IV.3.1.2 Patrón de movilidad del mutante 55…………………….71 IV.3.2 Movimiento abrupto…………………………………………………73 IV.3.2.1 Patrón de movilidad de la estirpe P. putida G7 en presencia de NPsAg y glucosa…………………….…73 IV.3.2.2 Patrón de movilidad del mutante 184…………….…..75 IV.3.2.3 Patrón de movilidad en la fase exponencial…….…..77 IV.3.3 Influencia de la materia orgánica disuelta sobre el patrón de movilidad……………………………………...79 IV.3.4 Estudio comparativo de los patrones de movilidad………….81 IV IV.4 ANÁLISIS DE LA RESPUESTA TÁCTICA…………………………………...85 IV.4.1 Respuesta táctica detectada por ensayo capilar…………...85 IV.4.1.1 Respuesta táctica positiva………………..…………….……85 IV.4.1.2 Respuesta táctica negativa ……………..…………….…..86 IV.4.1.3 Hipermovilidad causada por la glucosa ………….……91 IV.4.1.4 Efecto de la materia orgánica disuelta en la respuesta táctica……………..……………………………...93 IV.4.2 Respuesta táctica en medio semisólido………………………...95 IV.5 INFLUENCIA DEL PATRÓN DE MOVILIDAD EN LA ADHESIÓN BACTERIANA ……………..…………………………………...96 IV.5.1 Adhesión a arena……………..………………………………….…..96 IV.5.2 Adhesión a las anillas de silicona ……………..………………….99 IV.5.3 Adhesión a la interfase NAPL-agua……………………………....99 IV.6 TRANSPORTE BACTERIANO A TRAVÉS DE MEDIOS POROSOS SATURADOS……………..…………………………..………..100 IV.6.1 Factores independientes de la movilidad que afectan al transporte …..………………………………….100 IV.6.1.1. Efecto de la fuerza iónica…..………………………….….100 IV.6.1.2 Efecto del tamaño del colector…..………………………101 IV.6.1.3 Efecto de la velocidad de flujo…..……………………….102 IV.6.2 Papel de la movilidad intrínseca en el transporte…………..103 IV.6.2.1 Saturación del colector por alta densidad de células con movilidad intrínseca…………………………103 V IV.6.2.2 Fases del ciclo celular bacteriano………………………...105 IV.6.2.3 Inmovilización celular……………………………………...…107 IV.6.2.3a Inactivación del movimiento…………………………...........107 IV.6.2.3b Inducción de muerte celular………………………………....110 IV.6.3 Influencia del patrón de movilidad inducido…………………...111 IV.6.3.1 Promoción del transporte en presencia de quimioefectores positivos………………………….111 IV.6.3.2 Promoción del transporte debido al bloqueo del colector………………………………...112 IV.6.3.2.1 Efecto de las nanopartículas de plata (NPsAg)...…112 IV.6.3.2.2 Efecto de la glucosa…………………………….………115 IV.6.3.3 Transporte bacteriano de los mutantes 55 y 184………117 IV.6.4 Efecto de la materia orgánica en el transporte bacteriano...120 IV.6.4.1 Materia orgánica disuelta (MOD)…………………………120 IV.6.4.2 Materia orgánica adsorbida……………………………….122 IV.6.4.3 Movilización de células adheridas……………………..….125 IV.6.4.4 Transporte bacteriano a través de suelo agrícola y un suelo forestal rico en materia orgánica…………...127 IV.6.5 Efecto de los compuestos sobre las propiedades físico-químicas de la superficie de arena……………………129 IV.6.6 Ausencia de respuesta quimiotáctica……………………………131 IV.6.6.1 Efecto de la fuente de cultivo en el transporte bacteriano………………………………….131 IV.6.6.2 Mutante defectuoso en la quimiotaxis hacia exudados de girasol………………………………134 VI Introducción 1. Dejar la zona contaminada tal como está, pero restringiendo su uso 2. Confinamiento completo o parcial de la contaminación 3. Excavación, retirada y depósito en vertedero controlado 4. Recuperación del emplazamiento contaminado. A largo plazo, la única alternativa factible es la descontaminación o remediación para la recuperación del suelo o emplazamiento. La recuperación de un suelo contaminado puede hacerse mediante tratamientos in situ, si se lleva cabo en el emplazamiento a descontaminar, o tratamientos ex situ, donde el foco de contaminación ser retira para ser tratado externamente al emplazamiento en cuestión. En función de la naturaleza del proceso de descontaminación se distinguen 3 tipos de tratamiento: recuperación físico-química, térmica o biológica. En la tabla I.1 se recogen algunas técnicas empleadas para la recuperación de suelos, teniendo en cuenta la clasificación anteriormente comentada. Los tratamientos in situ tienen la ventaja de su bajo coste, así como la menor exposición tóxica de los contaminantes para la población, ya que su empleo no requiere la excavación y retirada del suelo afectado. Si el tratamiento para la recuperación del suelo es de tipo biológico, se podrían aprovechar los recursos naturales del medio para favorecer la descontaminación, como es el caso de la biorremediación o remediación biológica del suelo (que será el objetivo de nuestro estudio). 3 Introducción Tabla I.1 Técnicas empleadas en el tratamiento de suelos contaminados según el lugar de aplicación y la naturaleza del proceso de recuperación Tratamiento In situ Ex situ Físico-químico Biológico Físico-químico Biológico Térmico Extraccción con vapor Lavado Solidificación y estabilización Separación electrocinética Biorremediación Fitorremediación Rizzorremediación Extracción con disolventes Lavado Óxido-reducción Deshalogenación química Solidificción y estabilización Laboreo agrícola Biopilas Bioreactores Desorción térmica Incineración La remediación biológica o biorremediación es una tecnología que utiliza el potencial metabólico de los microorganismos (bacterias, hongos y levaduras) para transformar contaminantes orgánicos en compuestos más simples, poco o nada contaminantes. Esta técnica constituye un campo de la ingeniería ambiental que está evolucionando de forma notable, principalmente por su bajo coste y su menor impacto ambiental, y en los últimos años se está empezando a considerar como una seria alternativa a técnicas físico-químicas de remediación de suelos contaminados. Se pueden considerar 3 tipos de biorremediación (Alexander, 1999) Bioatenuación natural: se trata de la degradación de contaminantes por las poblaciones microbianas autóctonas de la zona afectada. Se caracteriza por su largo periodo de tiempo para poder alcanzar el nivel de contaminantes deseado. Como alternativas a este proceso de degradación natural, se tiende a mejorar el proceso de recuperación, aumentando la población microbiana de manera exógena (inoculando bacterias que no sean 4 Introducción autóctonas) o mejorando la actividad degradadora de las estirpes existentes en el emplazamiento contaminado, mediante las técnicas del bioaumento y bioestimulación, respectivamente. Bioaumento: consiste en la adición de estirpes competentes capaces de degradar los contaminantes presentes en un determinado emplazamiento. Requiere del conocimiento previo del tipo de contaminación, capacidad degradador de las estirpes y estudio de compatibilidad entre microflora autóctona y exógena(El Fantroussi y Agathos, 2005). Bioestimulación: consiste en promover una ambiente favorable para las comunidades microbianas autóctonas, siendo capaces, así, de degradar eficientemente los contaminantes. Esto incluye manipulaciones tales como la adición de nutrientes (nitrógeno y fósforo), adición de aceptores de electrones como el oxígeno, y la mejora de la humedad y temperatura del suelo. Así como el empleo de compuestos que mejoren la movilidad y distribución de las comunidades microbianas en el suelo. Bajo este marco de perspectivas tecnológicas, nuestro estudio puede tener cabida tanto en el bioaumento como en la bioestimulación. Por una parte, en la utilización de inoculantes quimiotácticos, y por otra, mediante el empleo de sustancias que afectan a la movilidad bacteriana, mejorando, de esta manera, su capacidad degradadora. I.2 BIODEGRADACIÓN DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS Los HAP son susceptibles de ser biodegradados. Es decir, los microorganismos son capaces de asimilar estos compuestos como fuente de carbono y energía, reduciendo así su concentración ambiental. Se ha descrito que de los 16 HAP clasificados por la US-EPA, aquellos cuyo peso molecular se encuentre por encima de 202 g/mol, pueden ser degradados aeróbicamente, estando vinculadas las reacciones oxidativas de los HAP con el crecimiento microbiano. Los de alto peso molecular como el pireno y el fenantreno también pueden ser mineralizados, con el fin de utilizar la energía obtenida de la degradación, para el desarrollo de las comunidades bacterianas en el suelo. El resto de HAP, como el benzo(a)pireno sólo pueden degradarse por cometabolismo (Kanaly y Harayama, 2000). El cometabolismo no ofrece a los microorganismos la 5 Introducción posibilidad de proliferar, ya que la transformación de los contaminantes no conlleva un aumento de la biomasa ni la conversión en CO2. Así que la biodegradación resulta ser muy lenta, siendo incompleta la transformación de los contaminantes (Ortega-Calvo y col., 2013). Durante el proceso de degradación por cometabolismo, se producen intermediarios metabólicos que sí pueden ser utilizados como fuente de carbono y energía por otros microorganismos, poniendo en evidencia el fenómeno de comensalismo. Aunque existe una gama importante de microorganimos capaces de degradar estos compuestos, hay que destacar que el proceso de descontaminación nunca llegaa ser completo, debido, entre otros factores, a la baja biodisponibilidad de los HAP en el suelo. El suelo contituye un sistema complejo, donde los HAP pueden estar ocluídos en microporos de difícil acceso para los microorganismos, disueltos en fases orgánicas líquidas denominadas líquidos en fase no acuosa o NAPLs (de sus siglas en inglés). También puede encontrarse adsorbidos a componentes del suelo, principalmente a las arcillas o a la materia orgánica. Es en estos casos donde la biodisponibilidad está limitada, y la biodegradación no se ve favorecida. La biodisponibilidad de los HAP puede aumentarse por varios mecanismos: empleo de tensioactivos biológicos, movilización bacteriana mediada por quimiotaxis, bioestimulación dirigida en la interfase de contaminantes hidrofóbicos, rizorremediación y electrobioremediación. Con el empleo de estas estrategias es posible aumentar la biodisponibilidad de los contaminantes orgánicos en el suelo, pero sin necesidad de aumentar el riesgo de toxicidad para el medio ambiente (Ortega-Calvo y col., 2013). En el caso de la quimiotaxis bacteriana, la biodisponibilidad del contaminante aumenta por la facilitación del desplazamiento de los microorganismos al foco de contaminación. Por tanto, no se fomenta la liberación del contaminante al medio. En estudios anteriores, la tendencia a mejorar las técnicas de biorremediación en cuanto a la mejora de la biodisponibilidad de contaminantes, habían sido dirigidas a intentar aumentar la desorción del compuesto desde la fase orgánica o compartimento donde se encuentre retenido en el suelo, hacia la fase acuosa. Lo que conllevaría a un riesgo de toxicidad en el medioambiente, ya que si la tasa de mineralización fuese menor a la de reparto, el 6 Introducción contaminante quedaría en solución sin ser degradado. Por lo que, a veces, es mejor la opción de retener los contaminantes de manera controlada en el suelo, con el uso de adsorbentes, para que secuestren los contaminantes y no supongan una amenaza para el medioambiente. A la hora de evaluar un foco de contaminanción para su posible tratamiento, habría que tener en cuenta esta consideración. Es decir, evaluar la posibilidad de degradación sin provocar un riesgo para el ecosistema. Además de la baja biodisponibilidad de HAP en el suelo, los microorganismos pueden no estar disponibles para degradar los compuestos, enténdiéndose como una restricción física del movimiento bacteriano. De esta forma, los microorganismos pueden encontrarse a una una larga distancia respecto del foco de contaminación o adsorbidos a partículas del suelo, incapaces de desplazarse hacia el foco de contaminación. Bajo estas condiciones de escasa movilidad, las técnicas de biorremediación pueden verse disminuidas, ya que para el crecimiento microbiano es necesario el contacto directo entre la célula bacteriana y el contaminante. I.3 MOVILIDAD BACTERIANA La movilidad bacteriana supone una ventaja de adaptación frente a aquellas bacterias que carecen de esta propiedad. A lo largo de la evolución se han ido adoptando distintas formas de movimiento según los requerimientos nutricionales y propiedades del medio donde se desarrolla la población microbiana. Algunas de las estrategias de movilidad seguidas por las células bacterianas son: el movimiento dirigido por la rotación de los flagelos (del término en inglés, “swimming), la movilidad organizada sobre superficies sólidas de un conjunto de células formando una colonia (“swarming”), movimiento intermitente y accidentaado de una única célula bacteriana o de un grupo de bacterias en una colonia (“twiching”) o el movimiento de un a través del deslizamiento de prolongaciones celulares, sin presentar órganos especiales para la propulsión o el movimiento dirigido (gliding”) (Eisenbach, 2001). De todas las estrategias seguidas, la más extendida en la diversidad bacteriana, es la movilidad por la propulsión del flagelo. Existen distintos patrones de movilidad según la localización y el número de flagelos en la célula bacteriana, dependiendo de la especie bacteriana 7 Introducción de que se trate. La bacteria Escherichia coli presenta una distribución peritrica de los flagelos que hace que las células se muevan en una dirección (cuando el rotor flagelar gira en el sentido antihorario) y los falgelos se alinean formando un haz en un polo de la célula (figura I.1). Cuando el rotor flagelar gira en sentido horario, los flagelos se recolocan en distribución peritrica y la célula se para y se reorienta, para volver a nadar en otra dirección. En el caso de Pseudomonas putida, los cambios de dirección no van acompañados de un momento de reorientación, sino que el grupo de flagelos polares que presenta la bacteria, hace que la célula se mueva siguiendo trayectorias rectilíneas interrumpidas por cambios en la dirección de manera aleatoria (Olson, 2004). Rotación antihoraria Rotación en contra de las agujas del reloj Rotación en sentido de las agujas del reloj Rotación antihoraria Rotación en contra de las agujas del reloj Rotación en sentido de las agujas del reloj Rotación antihoraria Rotación en contra de las agujas del reloj Rotación antihoraria Rotación en contra de las agujas del reloj Rotación en sentido de las agujas del reloj A B Figura I.1 Patrón de movilidad bacteriano por flagelo en la especie Pseudomonas putida (A) y Eschreichia coli (B) La existencia del flagelo permite a las células moverse a través de medios acuosos en busca de nutrientes que no están homogéneamente distribuidos (Weiss y col., 1995) y bajo condiciones de escasez de alimento que requiera ir en busca de nuevos hábitats para la supervivencia. Por esta última razón, surge el fenómeno de la quimiotaxis, como una forma para localizar gradientes de concentración de una sustancia que sirva como fuente de carbono, dirigiéndose hacia ella para consumirla. La quimiotaxis apareció a raíz de la movilidad dirigida en la búsqueda de ambientes favorables para la supervivencia. Recientemente, se ha descrito que la respuesta táctica está marcada por la presencia de gradientes de concentración espacio-temporales. Los cambios en la concentración de 8 Introducción estos gradientes justifica el movimiento dirigido por quimiotaxis como una estrategia evolutiva importante (Celani y Vergassola, 2010). El hecho de que no todas las bacterias móviles por flagelo son quimiotácticas, hace pensar en la idea de que la movilidad sigue siendo beneficiosa y prevalece sobre la quimiotaxis en algunos casos (Witt y col., 2011) Bajo condiciones normales de abastecimiento nutricional, la quimiotaxis supondría un gasto energético innecesario, ya que no hay escasez de nutrientes para el crecimiento bacteriano. Por ello, la movilidad bacteriana es suficiente como para facilitar la ingesta de alimento. No hay necesidad de gastar energía en la transcripción y síntesis de receptores de membrana y señalizadores de respuesta, necesarios para la respuesta quimiotáctica. Es por ello por lo que la movilidad se ha seguido manteniendo en la evolución, a pesar de la aparición del fenómeno quimiotáctico. I.3.1 QUIMIOTAXIS BACTERIANA Como ya hemos comentado, la quimiotaxis bacteriana es el fenómeno mediante el cual la bacteria detecta sustancias que suponen una fuente de carbono para su crecimiento. En términos generales, es la forma de detectar compuestos atrayentes en el medio y dirigirse hacia ellos gracias al movimiento de flagelos, en respuesta a una quimiotaxis positiva o respuesta de atracción. Asimismo le permite detectar sustancias repelentes que pueden ser tóxicas, provocando que las bacterias se alejen de la fuente del compuesto. No necesariamente una sustancia atrayente tiene que ser una fuente carbono, y un repelente no tiene por qué ser un compuesto tóxico para el microorganismo. De hecho, el acetato y el triptófano, que no son productos perjudiciales, se han descrito como repelentes para la bacteria E. coli (Koshland Jr, 1977). La detección de las sustancias en el medio es posible gracias a la presencia de receptores de membrana que detectan los compuestos en solución. Estos receptores de membrana, normalmente son proteínas transmembranales que transmiten la señal de reconocimiento de la sustancia mediante un sistema de transducción de señales intracelular. Los receptores de membrana son altamente específicos, siendo diseñados 9 Introducción para detectar atrayentes o repelentes, y cada receptor puede detectar únicamente una o dos sustancias (Koshland Jr, 1977). Cabe destacar la posibilidad de que un mismo compuesto sea un atrayente para un microorganismo constituyendo, por el contrario, un repelente para otro. Tal es el caso de un contaminante en el medio ambiente, fenol, que se ha descrito como atrayente para E. coli y como repelente para el serovar Typhimurium (Imae y col., 1987) y Vibrio albinolyticus (Homma y col., 1996) I.3.1.1 Señalización de la respuesta quimiotáctica La quimiotaxis es uno de los mecanismos de transducción de señales mejor conocido y conservado a lo largo de la evolución bacteriana. El mecanismo de control se basa en el sistema de dos componentes, en el cual la fosforilación de un regulador de respuesta que refleja la fosforilación de una histidina autoquinasa, la cual a su vez, detecta parámetros ambientales a través de un receptor de membrana (Szurmant y Ordal, 2004). En quimiotaxis, el receptor localizado en la membrana plasmática detecta un gradiente químico externo que transmite vía proteína CheW a la histidina autoquinasa CheA, que se autofosforila en respuesta a la llegada de esta señal. La proteína CheA fosforilada es sustrato del regulador de respuesta CheY, que cataliza la transferencia del grupo fosforil a un aspartato. La proteína CheY fosforilada interactúa con el motor flagelar mediante la conexión a CheZ, transmitiendo la señal de cambio en el patrón de movimiento (figura I.2)(Eisenbach, 2001). 10 Introducción receptor CheW CheW CheA CheZ CheY-P CheY motor CCW CW receptor CheW CheW CheA CheZ CheY-P CheY motor CCW CW Figura I.2 Esquema de una célula bacteriana que representa la ruta de señalización celular que implica el reconocimiento de un quimioefector por el receptor localizado en la membrana para desencadenar la rotación del motor flagelar bacteriano La fuerza impulsora del motor flagelar se genera por el transporte de protones a través de un canal de protones transmembrana. La fuerza protón motriz se genera en la respiración, y en condiciones anaerobias, mediante la rotura de ATP por la ATPasa. En algunas especies, como Bacillus y Vibrio, el motor flagelar rota gracias al impulso generado por el transporte de iones sodio a través de la membrana (Eisenbach, 2001). I.3.1.2 Estudio del patrón de movilidad en la respuesta táctica La quimiotaxis bacteriana se puede estudiar desde un punto de vista macroscópico, centrándose en el movimiento de una población bacteriana o grupo de células para determinar la dirección del movimiento en un gradiente de concentración de un compuesto, o desde 11 Introducción un punto de vista microscópico, estudiando la quimiotaxis mediante el análisis de las trayectorias celulares individuales. Para estudiar el movimiento macroscópico, se ha utilizado comúnmente el ensayo “swarm plate” llevado a cabo en una placa de Petri para ver el desplazamiento bacteriano sobre una superficie semisólida (agar al 0,3%) en respuesta a la sustancia ensayada que está en solución. El desplazamiento se manifiesta como un anillo de crecimiento alrededor del punto de inoculación bacteriano en el centro de la placa de petri. A medida que aumenta la degradación del compuesto, aumenta el anillo de desplazamiento. Este ensayo cualitativo se ha empleado para la detección de mutantes deficientes en la respuesta táctica (Harwood y col., 1994a; Rashid y Kornberg, 2000; Guo y col., 2009). El inconveniente del ensayo es que sólo puede emplearse para dectar la respuesta de atracción de compuestos que sean degradables por el microorgnismo estudiado. Otro ensayo cualitativo para detectar la respuesta de atracción hacia un compuesto es el ensayo de “gota con hidroxipropilmetil celulosa, en donde se observa un anillo de turbidez alrededor del centro de una placa de petri (de 60mm de diámetro) en respuesta quimiotáctica a la sustancia colocada en el centro de la placa (Harwood y col., 1994a). En este caso, la respuesta de atracción fue evidente a la hora de la colocación del compuesto, por lo que no se requiere que la sustancia ensayada sea degradada por la bacteria. Otro método parecido es el de agarosa, en donde la sustancia que se quiere estudiar se coloca en solución con la agarosa sobre un portaobjetos en una cámara elaborada por dos pequeñas piezas de plástico. Se coloca un cubreobjetos, y a continuación se inocula la bacteria. La observación de un anillo de turbidez confirma la respuesta de atracción (Yu y Alam, 1997). Este método se ha empleado en la detección de quimiotaxis a tolueno, benceno y tricloroetileno, ya que el sistema minimizó las pérdidas de los compuestos por volatilización (Parales y col., 2000). El método capilar se emplea para observar la entrada celular dentro de un capilar de vidrio de 1 μL de capacidad, en respuesta a la sustancia atrayente colocada en el interior del mismo (Adler, 1973). El método también permite la cuantificación de la respuesta de atracción, mediante el conteo de viables que se encontraban dentro del capilar. Este metodo se ha empleado en estudios de quimiotaxis hacia naftaleno por parte de Pseudomonas putida 12 Introducción G Gel repulsión atracción H Gtot mínimo secundario GvdW mínimo primario Figura I.4 Energía de Gibbs necesaria para la interacción entre la superficie de una célula y la superficie de una partícula del sólido para la adhesión,, de acuerdo con la teoría de la estabilidad coloidal. Gtot es la resultante de una fuerza electrostática, normalmente repulsiva (Gel) y de una interacción de van der Waals atractiva (GvdW) I.4.1.3 Teoría DLVO aplicada a células bacterianas Según la teoría DLVO aplicada a las interacciones entre superficies sólidas y bacterias (Norde y Lyklema, 1989; Rijnaarts y col., 1993a), la suma total de las interacciones debe tener una componente electrostática (normalmente fuerza repulsiva) y otra de Van der Waals (normalmente atractiva) haciendo que el potencial de interacción resultante dependa de la distancia de separación de la bacteria y la superficie, así como del radio celular, potencial o carga superficial de la superficie y de la bacteria y composición iónica del medio. La adhesión bacteriana sobre superficies sólidas es posible aún en el caso de que las cargas superficieales sean del mismo signo, porque la confirmación flexible de sus membranas, hace que puedan existir alteraciones estructurales que afecten a las contribuciones de de repulsión. Cuando la bacteria se acerca a la superficie, suele ser capturada en el mínimo secundario sin ser capaz de sobrepasarlo al ser la energía del mínimo primario demasiado elevada. Por lo que la bacteria se adhiere de manera reversible. Sólo cuando se produce la liberación de productos de 19 Introducción excreción que se adhieran a la superficie por medio de enlaces de tipo químico, la bacteria cae en el mínimo primario y la reversión, en este caso, estará impedida. I.4.2 FACTORES QUE AFECTAN A LA ADHESIÓN BACTERIANA Entre los factores físicos que pueden afectar a la interacción de las superficies bacteria-sólido podemos destacar las propiedades de las superficies, hidrofobicidad y potencial zeta; así como la fuerza iónica del medio. Entre los factores fisiológicos que dependen exclusivamente de las células bacterianas, podemos destacar: la existencia de polímeros extracelulares en la superficie bacteriana que pueden interaccionar con las superficies sólidas, complicando la predicción de la adhesión determinada por la teoría DLVO. Las interacciones poliméricas pueden ser repulsivas o atractivas, permitiendo que la adhesión bacteriana tenga lugar, incluso cuando el modelo de DLVO predice que la fuerza de atracción no es suficiente para provocar la adhesión bacteriana a la superficie (Jucker, 1998a). La presencia de estructuras externas (como los flagelos) puede conducir a una adhesión orientada a la superficie del material debido a que la superficie celular no es uniforme. Se ha determinado que la causa de la adhesión orientada de la bacteria Escherichia coli K-12 sobre partículas esféricas de poliestireno no se debió a la presencia de lipopolisacáridos (LPS) en las membranas celulares, sino a la uniformidad de la membrana que depende de la presencia de protuberancias en la misma, como pudieron ser los flagelos, cilios, etc (Jones y col., 2003). El modo de interacción de la célula bacteriana con la superficie del material también es un factor a tener en cuenta en la adhesión. McClaine y Ford descubrieron que la rotación flagelar del movimiento celular de Escherichia coli aumentó la tasa de adhesión bacteriana sobre una superficie de cristal (McClaine y Ford, 2002). Según esta observación, el patrón de movilidad bacteriano, marcado por la longitud de las trayectorias celulares (en el caso de E.coli) y la frecuencia de cambios de dirección (en el caso de Pseudomonas putida) podría tener repercusión en la adhesión sobre superficies sólidas. 20 Introducción I.5 TRANSPORTE BACTERIANO A TRAVÉS DE MEDIOS POROSOS SATURADOS La tasa de adhesión está determinada por el número de células que son transportadas a la superficie del sólido a través de procesos de transporte de masas como la difusión, la convección y la sedimentación. El transporte bacteriano se determina hidrodinámicamente. Para describir las propiedades hidraúlicas del sistema se tienen en cuenta los parámetros adimensionales: número de Reynolds y número de Peclet. Estos parámetros se hacen adimensionales, para que las propiedades que se derivan de ellos no estén influidas por las dimensiones del sistema, tales como la anchura, la altura o el caudal de un fluido que pasa por un conducto. El número de Reynolds determina el régimen del flujo del fluido, describiéndolo como laminar a turbulento. Por su parte, El número de Peclet define la razón convectiva sobre el papel de la difusión en el transporte de masa en un sistema de desplazamiento de flujo. En sistemas estáticos, la difusión controla el transporte de células desde la fase acuosa hasta la superficie del sustrato. La difusión está marcada por el movimiento Browniano que se conoce como el movimiento de partículas en el seno de un líquido como consecuencia de la acción térmica causada por la agitación. Bajo condiciones dinámicas, el tranporte celular tiene lugar por convección y difusión. La convección se entiende como la propagación de calor en fluidos o líquidos debido al movimiento de sus partículas producido por la diferencia de densidad. La movilidad propia de las bacterias, así como el fenómeno de la sedimentación contribuyen en la consecución de ambos tipos de transporte (Norde y Lyklema, 1989; Rijnaarts y col., 1993a; Schafer y col., 1998; Busscher y van der Mei, 2006). El estudio de los procesos de transporte y deposición bacteriana sobre superficies sólidas se basa en la teoría de filtración de coloides (de sus siglas en inglés, CFT, que fue propuesta por Rijnaarts y colaboradores (Rijnaarts y col., 1996a; 1996b) I.5.1 TEORÍA DE FILTRACIÓN DE COLOIDES (CFT) La teoría de filtración de coloides (CFT) se emplea para cuantificar los procesos de transporte y deposición bacteriana, teniendo en cuenta la transferencia de masa (células bacterianas) desde el medio acuoso a la superficie del sustrato (colector) y tendiendo en cuenta, además, la 21 Introducción probabilidad que tiene la bacteria de colisionar con el colector fomentando la adhesión bacteriana sobre la superficie La eficiencia de transferencia de masa del colector (η) se define como la probabilidad de que una célula, que se acerca al colector, alcance la superficie. Este término incluye los efectos de la gravedad, la difusión y las fuerzas de atracción de atracción de Van der Waals. La eficiencia de colisión o adhesión (α) es la probabilidad de que una célula, que ha alcanzado la superficie, se adhiera. Este término es dependiente de la energía de interacción (∆GDLVO-AB) Cuando el sistema opera bajo condiciones de lecho limpio, es decir, en ausencia de células que ya estén adheridas a la superficie, las células que se aproximan al colector sólo interaccionan con la superficie del colector, haciendo que la deposición sea exponencial, según la siguiente fórmula: )exp() )1( 4 3 exp(/ 0LL r p CC c    (3) Donde C0 y C son las concentraciones celulares del influente y del efluente, respectivamente, L es la longitud de la trayectoria del flujo, p es la porosidad del material de empaquetamiento, rc es el radio del grano de arena colector, η es la eficiencia del colector y α es la eficiencia de colisión. Esta ecuación se simplifica a menudo, definiendo un coeficiente de filtración λ. La eficiencia de adhesión (α) corresponde a la fracción de colisiones que finalmente dan lugar a la adhesión de la partícula. En ausencia de fuerzas repulsivas, α se aproxima a 1, según la fórmula: )1( 0   B   (4) Al inicio del experimento, en ausencia de células previamente adheridas, la eficiencia de adhesión inicial (α0) es prácticamente 1 (porque las células sólo pueden colisionar con el colector, por lo que la probabilidad de colisión es máxima). La aplicación directa de la CFT implica que el sistema está operando bajo condiciones de “lecho limpio”, observándose una deposición exponencial. Pero esto no siempre ocurre así. A veces, se observa una disminución en la deposición, que es apreciable por el incremento en los valores de C/C0 (o 22 Introducción eficiencia de salida bacteriana a través de las columnas). Lo que quiere decir que está aumentando el transporte bacteriano debido al bloqueo por parte de las bacterias depositadas que impide que las células que se acercan al colector, se adhieran a la superficie. Bajo estas condiciones de “lecho no limpio”, es necesario incluir un término Langmuriano (en la fórmula 3) que tenga en cuenta, además de la interacción celular con el colector, las interacciones entre células, de la siguiente manera: )1( 0       (5) donde λ0 es el coeficiente de filtro, β es el parámetro de bloqueo, y σ es el depósito específico de coloides en el medio poroso. El valor de α está controlado por las interacciones célula-sólido y por la cantidad de células adheridas previamente. Una bacteria previamente adherida puede reducir la deposición de las que se aproximen al colector, bloqueando parte de la superficie delmismo, según la expresión en (4). Al inicio del transporte, α = α0 donde α0 es la eficiencia de adhesión de lecho vacío, en ausencia de bacterias depositadas. Por lo que el número de células en el colector es nulo (Θ=0). El valor de α se aproxima a 1 y la deposición se ve favorecida y aumenta progresivamente de maner exponencial. A medida que se van depositando las células en la superficie del colector, el factor de bloqueo (B) comienza a aumentar. El factor de bloqueo se define como la relación entre el área bloqueada por una célula adherida y el área geométrica de esa célula, y la fracción de superficie cubierta por células Θ se calcula según la fórmula: Θ= x πab2/Acol (6) donde ab representa el radio de la partícula y Acol corresponde al área de superficie presente en el medio poroso de la columna. I.5.2 BLOQUEO DEL COLECTOR El factor de bloqueo depende de las interacciones célula-célula. Mientras que el valor de α0 viene determinado, fundamentalmente, por las interacciones célula-sustrato. Además, ambo parámetros dependen de las condiciones hidrodinámicas del sistema. 23 Introducción Si el factor de bloqueo es muy fuerte, el transporte bacteriano aumenta porque la deposición no es posible. Por lo que se observa un aumento en la salida bacteriana a través de las columnas (C/C0). El factor de bloqueo depende de factores como el tamaño y forma celular y del modo de interacción de la bacteria con la superficie del colector. De manera que existen especies con propiedades bloqueantes más altas que otras. B se relaciona con la máxima cobertura de superficie de la siguiente manera: Θmax = 1/B (7) Cuando transporte opera bajo condiciones de bloqueo, el cubrimiento de superficie nunca llega a ser máximo. Si el bloqueo es débil, pueden darse situaciones de deposición en multicapas donde α > 0. Las células previamente adheridas no son bloqueantes y no se da la repulsión entre células, haciendo que el colector se sature de capas multicelulares (lo que se conoce como “ripening” de su término en inglés). Esta situación puede conducir a otros fenómenos entre los que se destaca la colmatación del colector (o del término en inglés, “straining”) o el atascamiento u obstrucción del colector (conocido como “clogging” en inglés). El bloqueo se ve favorecido bajo condiciones en las que la solución electrolítica promueva la repulsión entre células. Mientras que la adhesión en monocapas en el colector (o “ripenning”) está favorecido bajo condiciones químicas que provoquen el contacto interparticular y, con ello, la asociación en multicapas (Liu y col., 1995). Cuando las características de la solución electrolítica promueven el bloqueo frente al “ripenning” o adhesión de células en multicapa, el contacto interparticular está inhibido y la densidad máxima de partículas que puede depositarse en el colector tiene que hacerlo en forma de monocapa. No sólo la composición electrolítica de la solución es el único factor influyente en la deposición bacteriana, sino que también hay que tener en cuenta las características físico-químicas de la superficie del colector y los coloides implicados en el transporte. 24 Introducción I.5.3 FACTORES QUE AFECTAN AL TRANSPORTE BACTERIANO Hay muchos factores que afectan al transporte bacteriano. Estre ellos podemos destacar factores físicos, que pueden ser dependientes de las características del material poroso empleado, como la rugosidad, la porosidad, el diámetro de partícula y propiedades de la superficie del material como la hidrofobicidad y la carga superficial. Los factores físicos también pueden ser dependientes de la hidrodinámica del sistema donde influye notablemente la velocidad del fluido o el volumen de poro. Además, hay que tener en cuenta las características físico-químicas del fluido en el que se transportan las células bacterianas, como el pH o la fuerza iónica. Entre los factores fisiológicos se citan aquellos que dependen de las células bacterias, como son el tamaño, movilidad celular y la caracterización de su superficie de membrana como la hidrofobicidad y carga superficial(Camper y col., 1993). I.5.3.1 Fuerza iónica del medio En general, la fuerza iónica influye en la deposición bacteriana afectando a la eficiencia de adhesión inicial (α0) y al factor de bloqueo (B). Cuando la fuerza iónica del medio disminuye, el valor de α0 disminuye, y el de B aumenta, causando una reducción de α a medida que baja la fuerza iónica del medio. De esta manera, el transporte bacteriano se ve favorecido en condiciones de baja fuerza iónica (Rijnaarts y col., 1996b). I.5.3.2 Velocidad de flujo Cuando la velocidad de flujo disminuye, aumenta la probabilidad de que las partículas coloidales (o en su caso, las células bacterianas) colisionen con la superficie del colector (Rijnaarts y col., 1996a). I.5.3.3 Concentración celular A mayor concentración celular se favorece el fenómeno de asociación en multicapas sobre la superficie del colector o “ripenning” (si la estirpe no tiene propiedades bloqueantes) y la repulsión y aumento del transporte si la estirpe es muy bloqueante. 25 Introducción Los estudios teóricos predicen que el bloqueo causa una bajada rápida en la deposición seguida de una bajada gradual indicativa de que el límite de cobertura en monocapa en la superficie del colector, está próximo. De esta manera, el efecto de bloqueo impide que se cubra toda la superficie del colector (máximo cubrimiento celular de la superficie). La máxima cobertura del colector en presencia del factor de bloqueo no es posible debido a que la zona bloqueda no deja opción a ser cubierta por células, además del efecto de “sombra” creado por la corriente del fluido y el ángulo de interacción del coloide con la superficie del colector. Este efecto ha sido descrito por Ko y Elimelech, como una zona de “sombra” creada corriente debajo de las células que se van depositando en el colector, constituyendo una zona de menor probabilidad de intercepción por el colector (Ko y Elimelech, 2000). Esto es debido al efecto del flujo del fluido a su paso por la superficie del colector que genera una fuerza de cizalla responsable del efecto descrito. Al aumentar la zona de “sombra”, la máxima superficie a ser cubierta por las células disminuye. La zona de sombra puede aumentar con el incremento del tamaño del coloide y la velocidad de aproximación, así como con la bajada de la fuerza iónica (porque aumenta el espesor de la doble capa y la repulsión). I.5.3.4 Propiedades hidrodinámicas Para entender la importancia de las interacciones hidrodinámicas en la deposición en concidiciones de máxima cobertura de superficie, el número de Peclet cobra gran importancia. Este número se calcula según la siguiente relación: (8) kT aV D aV Pe pp 2 6    Donde Vp es la velocidad de aproximación, a es el radio de la partícula, µ es la viscosidad del fluido, D∞ es el coeficiente de difusión de la partícula de Stokes-Einstein, K es la cte de Boltzmann y T es la temperatura. La influencia de las interacciones hidrodinámicas es más pronunciada para las partículas (coloides) de mayor tamaño, ya que el incremento en la deposición de partículas modificará la trayectoria de acercamiento de 26 Introducción una partícula de igual tamaño. Esto se refleja en que los valores de Peclet normalmente son altos para el caso de las partículas de gran tamaño (Ko y Elimelech, 2000). I.5.3.5 Rugosidad de la superficie del colector Cabe destacar que cuando la superficie de adhesión es rugosa, una zona de “sombra” se crea corriente abajo de las protuberancias en los granos de arena, de manera análoga a lo que ocurre con las partículas una vez se han depositado (Ko y Elimelech, 2000). I.5.3.6 Tamaño de partícula del colector El tamaño de partícula también puede afectar al transporte bacteriano. Cuando el tamaño de partícula disminuye, la superficie específica para la adhesión aumenta. A su vez, con la disminución del tamaño de partícula, disminuye el espacio interparticular. Bajo estas condiciones, la deposición se ve favorecida frente al transporte. La reducción en el tamaño de poro disminuye la probabilidad de que la bacteria entre por los canales verticales existentes entre las partículas del medio poroso (Kusy y Ford, 2007). I.5.3.7 Movilidad bacteriana Cuando los coloides son células bacterianas, la deposición se ve favorecida por la propia movilidad del microorganismo, cuyo movimiento de propulsión contracorriente hace posible que acceda a las zonas influidas por el efecto de “sombra” que son inaccesibles para aquellas bacterias no móviles, haciendo que el valor de cubrimiento máximo de superficie pueda ser mayor (Kerchove y Elimelech, 2008). La movilidad bacteriana favoreció la deposición sobre superficies sólidas, ya que le permitió caer en el mínimo secundario, haciendo que la probabilidad de dhesión reversible sea mayor (Becker y col., 2004). Así como la propulsión creada por el flagelo contraresta la fuerza de las interacciones (Pompilio y col., 2008). No obstante, la presencia mera del flagelo, aún cuando la bacteria no es móvil, provoca una mayor deposición que para el caso de las bacterias que carecen de flagelo. Estas estructura celulares parecen aumentar, por ello, las interacciones celulares con la superficie(Haznedaroglu y col., 2010). 27 Introducción El patrón de movilidad bacteriano afectó al modo de interacción con la superficie sólida, tal como hemos comentado en el capítulo I.4.2. De la misma manera, el modo de interacción con la superficie afectó al transporte y deposición bacteriana. La relación entre los efectos de adhesión y transporte se hacen evidentes en un estudio llevado a cabo por DeFlaun y colaboradores, para determinar el efecto de la adhesión en el transporte bacteriano de un mutante deficiente en adherirse a la superficie de arena empaquetada en columnas. El mutante se transportó mucho más rápido que la silvestre. El estudio concluyó que las diferencias en los polímeros de superficie podían ser la causa de la diferencia en la adhesión entre las bacterias (DeFlaun y col., 1999). Del mismo modo, diferencias en el patrón de movilidad bacteriana podría conducir a diferencias en la adhesión a superficies sólidas, y con ello, afectar de forma diferente al transporte bacteriano. Los valores de eficiencia de adhesión inicial (α) y del factor de bloqueo (B) podrían variar en función del patrón de movilidad bacteriano, fomentando la adhesión o el aumento del transporte en un caso u otro. Una evaluación del patrón de movilidad bacteriana en medios porosos puede hacerse usando gráficas de regresión lineal α0 - B, que pueden dar lugar a distintas situaciones según la combinación de los parámetros de transporte(Rijnaarts y col., 1996b): Combinación de bacteria-colector con alto valor de α0 y bajo valor de B: esta situación provocaría una alta deposición bacteriana y un alto nivel de recubrimiento celular de la superficie del colector. Un flujo continuado de células podría contribuir a la formación de capas celulares cubriendo la superficie y un leve atascamiento del colector. Combinación de bacteria-colector con una alta deposición inicial (alto α0), pero el fuerte bloqueo inicial (B alto) resultará en un bajo nivel de recubrimiento que conllevará a la ausencia de atascamiento y un favorecido transporte bacteriano tras el bloqueo del colector. Combinación de células bacterianas con una baja deposición inicial (bajo α0) que puede dar lugar a alcanzar altos niveles de recubrimiento de la superficie (ya que B es bajo) pero a altos valores de volúmenes de poro. 28 III. MATERIALES Y MÉTODOS 35 Materiales y Métodos III.1 REACTIVOS Los compuestos utilizados como fuente de carbono para los cultivos bacterianos han sido salicilato sódico, acetato sódico y triptona, todos obtenidos de la casa comercial Panreac Química S.L.U (Barcelona, España). El naftaleno de pureza analítica (≥ 99%) se obtuvo de la casa comercial Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, USA). Así como el de Naftaleno-UL-14C (actividad específica, 31,3 mCi mml-1) de pureza radioquímica (> 98%). El Di (2-etilhexil) ftalato (DEHP) (≥ 99%) (GC) se utilizó como líquido en fase no acuosa, de sus siglas en ingles, NAPL. Se obtuvo de la casa comercial Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, USA). Todos los disolventes utilizados (acetona, etanol, diclorometano y metanol) (calidad HPLC) fueron suministrados por Teknokroma Analítica S.A. (Barcelona, España). Los biocidas nitrato de plata y cloruro de mercurio se emplearon en concentraciones muy bajas, 0,1 mg L-1 y 1,3 mg L-1, y se adquirieron de Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, USA) y Panreac Química S.L.U. (Barcelona, España), respectivamente. III.2 EFECTORES TÁCTICOS Como fuentes de materia orgánica disuelta (MOD), se han utilizado exudados de origen vegetal, ácidos húmicos y el fertilizante oleofílico S-200. Los exudados de raíces de girasol (Helianthus annuus) fueron obtenidos en colaboración con el grupo del Dr. Manuel Cantos del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología (IRNAS, CSIC). El método de obtención así como las técnicas utilizadas para la caracterización de los exudados constituyeron una parte de otra Tesis Doctoral del grupo (Tejeda-Agredano y col., 2013), y aquí se describe brevemente. La exudación de las raíces de plantas de girasol se concentró en botes de cristal, con sellado hermético, que contenían 500 mL de medio mineral (MM), denominado como medio de mineralización (puesto que es el medio que se utiliza para llevar a cabo los ensayos de mineralización de naftaleno, y en ausencia de una fuente de carbono adicional. Los recipientes, de 1 L de capacidad, se incubaron 36 Materiales y Métodos durante un mes en cámara de cultivo a 25 ± 1 ºC bajo una luz incidente de 65,24 μEm-2 s-1 y 18 horas de fotoperíodo. Tras este tiempo, los exudados se recogieron bajo condiciones asépticas en cámara de flujo laminar y se centrifugaron durante 3 horas a 31.000 g con el fin de obtener una mezcla homogénea de materia orgánica disuelta (Haftka y col., 2008). La caracterización de los exudados se ha llevado a cabo en colaboración con el grupo de la Dra. Magdalena Grifoll de la Universidad de Barcelona. Se determinó la presencia de los componentes que, conmúmente, son mayoritarios en los exudados de origen vegetal: hidratos de carbono, aminoácidos, ácidos orgánicos y ácidos grasos (tabla III.1) Los exudados se concentraron por liofilización para la caracterización de los distintos componentes mediante técnicas cromatográficas y de espectrometría de masas realizadas en los Servicios Científico-Técnicos de la Universidad de Barcelona. Tabla III.1 Descripción de los componentes individuales mayoritarios detectados en los exudados de raíces de girasol (Tejeda-Agredano y col. 2013) Componente orgánico Compuesto individual Hidratos de carbono Galactosa, Fructosa Aminoácidos Fenilserina, Taurina, Fosfoetanolamina, Ácido aspártico, Treonina, Serina, Asparragina, Glutamina, Glicina, Alanina, Cisteína, Isoleucina, Leucina, Tirosina, Fenilalanina, Ornitina, Lisina, Histidina, Arginina Ácidos orgánicos Ácido ftálico, Parabeno, Ácido protocatéquico, Ácido gálico, Ácido acetilsalícílico, Ácido abiético, Ácido hidroxi dehidroabiético Ácidos grasos Ácido azelaico, Ácido mirístico, Ácido palmítico, Ácido esteárico, Ácido linoleico 37 Materiales y Métodos Los ácidos húmicos (AH) se obtuvieron con anterioridad por nuestro grupo de investigación. Para su extracción, se tomaron muestras de un suelo localizado en el Parque Nacional de Doñana, adyacente a la laguna de Santa Olalla, en la provincia de Huelva (Lahlou y col., 2000). El suelo se clasificó como arenoso (Typic Humaquept), con un contenido en materia orgánica de 4,3 % y pH 6,5. Para la purificación de la fracción de AH, se llevó a cabo una extracción con NaOH, precipitación con ácido y diálisis (Schnitzer, 1982). Los análisis de 13C-NMR dieron como resultado una composición típica de sustancias húmicas del suelo, por la presencia de grupos carboxílicos (200-170 ppm), grupos aromáticos (160-100 ppm) y carbonos alquílicos (50-0 ppm). Los resultados de los análisis elementales dieron valores de C: 47,0 %, H: 5,31 %, O: 43,72 % y N: 3,97 %. El extracto de AH se disolvió en NaOH 0,1M a una concentración de 1 mg mL-1, ajustando el pH a 6 con HCl (Ortega Calvo y Sáiz-Jiménez, 1998). A partir de esta disolución stock se prepararon las que se utilizarían en los posteriores experimentos usando medio mineral (MM) como disolvente. Previamente al uso de los AH naturales, se utilizaron como modelo los proporcionados por la casa comercial Sigma-Aldich, Co. (St. Louis, MO, USA) “Humic acid, sodium salt, technical grade” con No CAS 68131-04-4, con un contenido de carbono de 38,28 % (Mayer y col., 2007). El fertilizante S-200 fue suministrado por IEP Europe S.L. (Madrid, España). Se presenta en forma de microcápsulas oleicas de 20 y 200 amstrongs de diámetro con núcleo equilibrado de nutrientes N y P. Su composición consta de urea y ésteres fosfóricos que se presentan en una mezcla de ácidos grasos saturados e insaturados en la que predomina el ácido oleico. El disolvente básico es agua, aunque también presenta 2-butoxi-etanol y glicol-éter (Tejeda Agredano y col., 2011). La cantidad de carbono orgánico en los tres bioestimulantes se determinó en un analizador de carbono orgánico total y módulo de nitrógeno Shimadzu TOC-V sch en el servicio de análisis del IRNAS, siendo los valores de 129 ± 3,5 mg L-1 para el caso de los exudados diluídos en MM en proporción 1:1, 138 ± 7,8 mg L-1 para AH (concentración nominal:100mg L-1) y 123 ± 0,7 para el fertilizante S200 a una concentración de 0,1 mL/70 mL de MM. Para conseguir una concentración de carbono 10 veces menor, los bioestimulantes se diluyeron en MM, obteniendo unos valores de 16 ± 0,1 38 Materiales y Métodos mg L-1, 16 ± 1,3 mg L-1 y 13 ± 0,1 mg L-1 para exudados (1:10), AH 10 mg L-1 y S200 10 μL 35 mL-1, respectivamente. Los otros compuestos empleados como efectores tácticos fueron las nanopartículas de plata (NsAg), con diámetro máximo ≤100 nm, y un 99% pureza, obtenidas de la casa comercial Sigma-Aldrich, Co. (St. Louis, MO, USA). Para evitar la agregación de las NPsAg, las disoluciones stock de 100 mg L-1 se sonicaron durante 1 hora en baño de ultrasonido Bransonic 3510EDTH (Grupo Taper, S.A. Madrid, España), justo antes de utilizarlas para preparar las disoluciones de 55 mg L-1 y 0,2 mg L-1. La glucosa se obtuvo de la casa comercial Panreac Química S.L.U. (Barcelona, España) y se utilizó a distintas concentraciones en MM: 0,1 mM, 1 mM, 10 mM y 100 mM. III.3 MATERIALES POROSOS Se utilizó arena de mar de grano fino, suministrada por Panreac Química S.L.U (Barcelona, España). El material se tamizó y lavó por gravedad con agua destilada, consiguiendo, así, dos tipos de fracciones con diferentes rangos de tamaño de partícula: una gruesa de 500-400 μm y otra fina de 400-250 μm. Se emplearon, además, dos tipos de suelo, estudiados en un trabajo previo del grupo de investigación. Uno es de tipo forestal, caracterizado por su alto contenido en materia orgánica, y otro de tipo agrícola. El suelo forestal procedía del Monte de La Teja perteneciente al campo de Gibraltar (Cádiz). El suelo agrícola se ha obtenido de la estación experimental “La Hampa”, propiedad del IRNAS, situada en el término municipal de Coria del Río (Sevilla). Las propiedades de estos suelos se determinaron con anterioridad por el grupo (Posada, 2007). En la tabla III.2 se describen dichas propiedades, además, del tipo de suelo en función de la clasificación de la USDA (Departamento de Agricultura de los Estados Unidos). 39 Materiales y Métodos Tabla III.2 Propiedades y clasificación de los suelos utilizados Muestra Materia orgánica (%) Arena gruesa (%) Arena fina (%) Limo (%) Arcilla (%) Clase Textural Clasificación USDA Suelo forestal 6,10 61,9 21,4 11,2 5,5 Arenosa Franca Lithic Xerochrept Suelo agrícola 0,76 73,3 6,0 14,0 6,7 Arenosa Typic Xerochrept III.4 ANILLAS DE SILICONA Para los ensayos de biodegradación se emplearon anillas de silicona, obtenidas a través de Altec Products Ltd. (Cornwall, Reino Unido) de 2,57 mm de diámetro interno y 1,78 mm de sección transversal. La silicona presenta ciertas ventajas para el estudio de mineralización del compuesto absorbido ya que se caracteriza por una dosificación pasiva del compuesto, incluyendo biocompatibilidad, alta capacidad para compuestos orgánicos hidrófobos (COHs) y baja resistencia interna a la transferencia de masa COHs (Smith y col., 2012). III.5 ESTIRPES BACTERIANAS, MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO III.5.1 Pseudomonas putida G7 La estirpe utilizada en este estudio es Pseudomonas putida G7, cedida por la Dra. Caroline S. Harwood de la Universidad de Washington (EEUU). Fue aislada de suelos contaminados por HAP y seleccionada para nuestro estudio por su capacidad para degradar naftaleno (Dunn y Gunsalus, 1973). La estirpe bacteriana se cultivó en un medio mineral (MM), cuya composición se detalla en la tabla III.3., utilizando salicilato sódico (5mM) como fuente de carbono. Este es un compuesto intermediario de la ruta de degradación del naftaleno (Yen y col., 1988). En algunos experimentos, se emplearon, además, medios de cultivo con la base del MM y con acetato sódico (5 mM) y triptona (15mM) como fuentes de carbono en 40 Materiales y Métodos lugar del salicilato. El inóculo procedía de colonias cultivadas en placas de agar con naftaleno. Los cultivos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 250 mL de capacidad que contenían 100 mL de medio. Los cultivos bacterianos se mantuvieron en agitación continua (150 rpm) a 30ºC. Una vez alcanzada la fase estacionaria temprana, las células se lavaron y resuspendieron en MM tras centrifugar durante 10 minutos a 2570 rpm (1.000g), para su posterior uso en los experimentos. Esta velocidad de centrifugación se seleccionó para evitar la rotura de los flagelos y, por tanto, la pérdida de la movilidad (Velasco-Casal, 2007). Tabla III.3 Composición por litro del medio de mineralización (MM). Los reactivos señalados en negrita se autoclavan por separado de los que aparecen en cursiva, mezclándose una vez enfriados. El resto de reactivos se filtran a través de filtro Millipore de diámetro de poro 0,2 µm. Una vez autoclavado, el pH del medio fue 5,7 Reactivos Cantidad KH2PO4 900 K2HPO4 100 CaCl2 80 NH4NO3 100 MgSO4· 7H2O 100 Macroelementos (mg) FeCl3 · 6H2O 10 Na2BO4O7· 10H2O 2 MnSO4· H2O 2 CuSO4· H2O 2 Na2MoO4 · 2H2O 4 Microelementos (µg) ZnSO4 · H2O 2 41 Materiales y Métodos El mantenimiento de la estirpe se realizó renovando los cultivos semanalmente en placas con medio sólido MSB (tabla III.4). En la tapadera de las placas se añadió 0,1 g de naftaleno sólido esterilizado por disolución en diclorometano (proporción 1:1) y recristalización. El cultivo con naftaleno se aseguraba la presencia del plásmido NAH7 que contiene los genes que codifican las enzimas necesarias para la degradación de naftaleno (Yen y Gunsalus, 1982). Para el crecimiento de la estirpe en medio rico, se utilizaron placas de petri que contenían las sales del medio MSB más 42 g L-1 de TSA (triptona, soja y agar) (tabla III.4), en las que el crecimiento se evidenció por la presencia de colonias blanquecinas de forma esférica y aspecto mucoso. Tabla III.4 Composición por litro del medio mínimo de sales (MSB), a PH 7, utilizado en los medios sólidos para siembras en placas de Petri Reactivos Cantidad (mg) Na2HPO4·12H2O 670 KH2PO4 340 CaCl2 14 NH4Cl 500 MgSO4·7H2O 112 ZnSO4·7H2O 5 Na2MoO4·2H2O 2.5 FeCl3·6H2O 0,22 Agar 16.000 III.5.2 Escherichia coli/pRL 1063 E. coli/pRL 1063 fue la bacteria empleada para ceder, por conjugación, el plásmido pRL 1063 a P. putida G7 y conseguir así una batería de transformantes con el plásmido o parte del plásmido insertado en el genoma de P. putida G7. 42 Materiales y Métodos E. coli/pRL 1063 se cultivó en medio Luria-Bertani (LB) conteniendo 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl y 1 g de glucosa por cada litro de disolución (pH 7,2) (Sambrook y col., 1989). El cultivo se mantuvo durante toda la noche a 37 ºC, tras lo cual se lavó y resuspendió en una solución estéril de NaCl 9 %. III.5.3. Escherichia coli/Prk 2063 E. coli/Prk 2063 se utilizó para favorecer la inserción del plásmido en P. putida G7. Las condiciones de cultivo fueron similares a la estirpe donante del plásmido, explicadas en el epígrafe anterior. III.5.4 Transformantes obtenidos La colección de mutantes obtenida se seleccionó por la disminución o ausencia de actividad quimiotáctica mediante una técnica que se explicará en el siguiente epígrafe. Las estirpes seleccionadas, denominadas como mutante 91, 55 y 184, se cultivaron en el mismo medio mineral utilizado para cultivar a la silvestre (P. putida G7) con salicilato sódico como fuente de carbono (5mM). III.6 OBTENCIÓN Y SELECCIÓN DE MUTANTES QUIMIOTÁCTICOS III.6.1 Conjugación triparental con el transposón Tn5 Para la obtención de mutantes deficientes en la respuesta quimiotáctica se llevó a cabo una mutagénesis no dirigida mediante la inserción del plásmido pRL1063 en el genoma de Pseudomonas putida G7. El objetivo era que dicha inserción afectase a la región donde se localizan los genes codificadores de la respuesta quimiotáctica hacia naftaleno. El plásmido pRL1063, presente en Escherichia coli contiene los genes de resistencia a los antibióticos estreptomicina (Sm) y kanamicina (Km), insertados en el transposón Tn5 (que se corresponde con una región de genes de fácil inserción en el genoma de otras especies). El plásmido se puede mobilizar por una conjugación no específica entre las especies Escherichia coli y Pseudomonas putida con la ayuda de otro plásmido, pRK2013 (presente en Escherichia coli), que contiene los genes de transferencia, tra y mob, que permiten la traslocación del transposón Tn5 (Wolk y col., 1991; Hansen y Sorensen, 2001). De ahí que el nombre de la 43 Materiales y Métodos técnica se denomine conjugación triparental, dado que intervienen 3 especies bacterianas, el receptor (P. putida G7), el donante (E. coli/pRL1063) y el ayudante (E. coli/pRK2013). Para llevar a cabo la conjugación, se mezclaron 50 μL de cada cultivo celular en un Eppendorf, colocando 100 µL de la mezcla resultante en el centro de placas de conjugación sin antibióticos hasta el completo secado de la gota. A continuación, las placas se dejaron durante toda la noche a 37 ºC (temperatura óptima de crecimiento de E. coli), impidiendo que la maquinaria replicativa de P. putida tuviera lugar (puesto que su temperatura óptima es 28ºC). Ello favorecía la inserción del plásmido de E. coli en el genoma de P. putida G7. Al día siguiente, se recogió el material celular resultante con un asa de Henle y se resupendió en 1 mL de NaCl 0,9 %. A continuación, se sembraron 50 μL de la solución de NaCl en placas de LB en presencia de los antibióticos a los que la estirpe E. coli y P. putida eran resistentes y se incubaron a 28 ºC durante dos días. De esta manera, sólo crecieron aquellos transformantes de P. putida que habían incorporado el gen de resistencia a Km y, que por tanto, podían crecer en presencia de ambos antibióticos. La incorporación del plásmido pRL1063 en el genoma de P. putida G7 se manifiestó mediante el crecimiento de colonias en placas de Petri con agar y medio rico con 1,5 % Bacto Agar (Becton Dickinson, Sparcks, MD, USA) en presencia de los antibióticos Km y Cm, a los que P. putida G7 era sensible antes de incorporar el plásmido de E.coli en su genoma. III.6.2 Selección de mutantes válidos De la colección de mutantes obtenidos en las placas nos interesaban aquellos que pudieran degradar naftaleno pero que hubieran perdido la capacidad quimiotáctica de detectarlo. De esta manera, se procedió a sembrar por separado cada colonia obtenida de la transformación, para aislarla en una placa con agar y naftaleno sólido en la tapa, seleccionando, así, en un primer escrutinio, aquellas mutantes que podían degradar naftaleno. Para facilitar la selección se eligió el salicilato como quimioefector en lugar de naftaleno, que requiere un cuidado especial en su manipulación. Para ello, en un segundo escrutinio, se tomaron las colonias crecidas en las 44 Materiales y Métodos se colocó dicho compuesto. La turbidez comenzó a observarse después de aproximadamente una hora y siguió siendo evidente durante las siguientes 3 o 4 horas. III.10 ENSAYO DE ADHESIÓN Para comprobar la eficiencia de adhesión bacteriana al material poroso empleado, se utilizaron viales de vidrio de 20 mL de capacidad conteniendo 1,5 g del material poroso y 1 mL de las suspensiones celulares resuspendidas en los distintos quimioefectores, manteniéndose en agitador orbital a 80 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para cuantificar la adhesión bacteriana, se midió la diferencia de la DO600nm de las supensiones celulares antes y después de la incubación, expresándose el % de células adheridas al material. No fue posible llevar a cabo ensayos con suelo, ya que la medida de turbidez debida al suelo enmascaraba los valores de DO obtenidos, sin poder discriminar entre la aportación de turbidez debido a la presencia bacteriana o a la de partículas del suelo en. El % de adhesión sobre superficie de anillas de silicona se cuantificó en ausencia y presencia de exudados a baja concentración de carbono y NPsAg a 0,2 mg L-1, como ejemplos de quimioefector positivo y negativo, respectivamente. En este caso, se tomaron un total de 23 anillas para utilizar la misma cantidad de material empleado que en los ensayos de adhesión en medio poroso (1,5 g). Las diferencias significativas entre tratamientos se hizo mediante el test ANOVA de un factor, HSD Tukey, P=0.05, con el programa SPSS 11.5. Se visualizó en el microscopio óptico la adhesión bacteriana a la interfase DEHP-agua de la estirpe P. putida G7 en ausencia y presencia de NPsAg a una concentración de 0,2 mg L-1 según una adaptación de la técnica descrita para la adhesión microbiana a hidrocarburos (BATH) (Rosenberg y col., 1980). El DHEP se utilizó como ejemplo de líquido en fase no acuosa (del término en inglés, NAPL), para estudiar el efecto del patrón de movilidad abrupto en la adhesión a la fase orgánica. Se cuantificó, también, el % de adherencia a la fase orgánica mediante la disminución en la DO600nm antes y después de la interacción con la fase orgánica (promovida por la agitación mecánica durante 60 segundos de un tubo de ensayo con 3 mL de la mezcla de la suspensión bacteriana en NPsAg y 0,25 mL de NAPL). 51 Materiales y Métodos III.11 ENSAYOS DE TRANSPORTE EN COLUMNAS Los ensayos de transporte se llevaron a cabo a temperatura ambiente en columnas de percolación según el método de Rijnaarts y colaboradores (Rijnaarts y col., 1993b; Rijnaarts y col., 1996b). El material poroso se empaquetó en húmedo (con MM) en columnas de vidrio de 10 cm de longitud y 1 cm de diámetro interno. La cantidad de material empaquetado presente en cada columna fue del orden de 12 g. El suelo agrícola se mezcló con la arena de grano fino en proporción 1:1 para facilitar el empaquetamiento. El suelo forestal mezclado con arena (1:1) se empaquetó en los primeros 2 cm del extremo inferior de la columna, con aproximadamente 2 g de material, completando el relleno con 10 g de arena de la fracción fina (0.4-0.25 mm). Las columnas se conectaron a una bomba peristáltica funcionando a 23 rpm, y las suspensiones bacterianas (DO600nm ~ 0,3, 108 células mL-1) se bombearon a través de las columnas a una velocidad de flujo constante e igual a 0,135 ± 0,02 mL min-1 (figura III.3). Previamente al bombeo de la suspensión celular, las columnas se lavaron con MM durante 30 minutos (aproximadamente 1 volumen de poro, VP). Para el caso de los experimentos con suelo, el MM se bombeó hasta que dejó de evidenciarse turbidez en los eluyentes. Se comprobó que la absorbancia del influente permaneció inalterada durante la duración de los experimentos. Figura III.3 Dispositivo diseñado para estudiar el trasporte bacteriano en columnas 52 Materiales y Métodos El transporte de las bacterias a través de las columnas se siguió fotométricamente a determinados intervalos de tiempo. La eficacia de la salida bacteriana se expresó como DO600nm en el efluente a la salida de la columna (C) dividido por la DO600nm en el influente en la columna (C0). Tabla III.5 Propiedades hidrodinámicas de los materiales porosos empleados Material poroso Arena de grano fino Arena de grano grueso Arena+Suelo Agrícola (1:1) Flujo Hidraúlico (cm min-1) 0,50 0,41 0,47 VP (mL) 2,677 3,265 2,865 Porosidad 0,34 0,41 0,36 Todos los resultados se dan como la media de ensayos realizados por duplicado. Los resultados se exponen mediante la representación de las curvas de rotura o curvas de elución de cada uno de los tratamientos. Para ello, es necesario obtener los valores de los volúmenes de poro en las columnas empleadas en el ensayo, así como los valores de la eficacia de la salida bacteriana (C/C0) a través de éstas. Las propiedades hidrodinámicas de los distintos materiales aparecen reflejadas en la tabla III.5. 53 Materiales y Métodos El volumen de poro (mL) es el volumen de líquido que ocupa la columna en ausencia de sólido. Se determinó, para cada material, mediante la diferencia de peso de la columna, una vez empaquetada, antes y depués de ser secada en estufa a 60ºC. El flujo hidráulico se calculó dividiendo el producto de la velocidad de flujo del fluido y la longitud de la columna entre el volumen de poro (mL) en la misma. La porosidad se obtuvo de la relación entre VP (mL) en la columna y volumen total (mL) de líquido que puede ocuparse en la misma, siendo, por tanto, un parámetro adimensional. El transporte puede describirse en términos de eficiencia de adhesión bacteriana a la superficie del material empleado en las columnas, pudiéndose distinguir entonces, entre valores altos de C/C0, que se corresponderán con una baja adhesión y un transporte bacteriano alto, y valores bajos de C/C0, indicativos de una alta eficiencia de adhesión. La eficiencia de adhesión, α, puede calcularse por la relación entre la tasa de adhesión, ηt, y la tasa de de transporte bacteriano hacia la superficie del colector, ηtrans, según la fórmula (Elimelech y Omelia, 1990) : α = ηt / ηtrans La eficiencia de adhesión depende de las interacciones electrostáticas e hidrofóbicas que gobiernan las interacciones entre superficies bacterianas y superficie del colector. Al inicio del experimento de transporte, el sistema opera bajo condiciones de lecho limpio, es decir, la única superficie disponible para la deposición es la del colector. Por lo que ηt = ηtrans, acercándose el valor de α a 1, bajo condiciones favorables para la adhesión (en ausencia de fuerzas repulsivas entre células). El cálculo de ηtrans tiene en cuenta las contribuciones de convección, difusión, atracción de Van der Waals y sedimentación (Martin y col., 1992; Rijnaarts, 1994). El valor de ηt se calcula a partir de los valores de C/C0 obtenidos en los experimentos de transporte (Jucker, 1998b). A medida que transcurre el experimento, el número de células adheridas al colector va aumentando y la adhesión bacteriana a la superficie empieza a estar impedida por la repulsión que ejercen las bacterias que están depositadas en el colector. Bajo estas condiciones de bloqueo del filtro, 54 Materiales y Métodos hay que tener en cuenta el factor de bloqueo, B, que depende del recubrimiento celular en la superficie del material, Θ (Rijnaarts, 1994): α = α0 (1-B Θ) En condiciones de lecho limpio, Θ = 0, por lo que α = α0, fomentando que las condiciones de adhesión sean óptimas, tal como hemos visto que ocurre al inicio del experimento (bajo ausencia de repelencia). Los valores obtenidos para los parámetros de α, Θ y B, caracteriza el transporte bacteriano en los distintos tratamientos estudiados en función del efecto que provoquen en el transporte y la adhesión. Para ello se tuvieron en cuenta dos momentos para el cálculo de los mismos, uno al comienzo del experimento, justo a la salida del frente bacteriano (~1 VP) y otro casi al final del experimento (~ 4 VP), donde se tuvo en cuenta el factor bloqueo. III.11.1 Empleo de quimioefectores en los ensayos de transporte III.11.1.1 Efecto directo Los quimioefectores glucosa y NPsAg se utilizaron a distintas concentraciones. Para el caso de la glucosa se empleó el barrido de concentraciones utilizado en el análisis de la respuesta táctica, 0,1M, 1M, 10M y 100M. Las disoluciones de NPsAg de 0,2 mg L-1 y 55 mg L-1 fueron sonicadas justo antes de comenzar el experimento, para asegurar la estabilidad de las NPsAg y evitar la aglomeración coloidal. Los ensayos de transporte con las distintas fuentes de carbono orgánico disuelto (exudados, ácidos húmicos y el fertilizante oleofílico) se llevaron a cabo con cultivos bacterianos resuspendidos en las disoluciones de las mismas. Para ello, una vez lavado y centrifugado el cultivo bacteriano, el pellet se resuspendió en las soluciones conel carbono orgánico disuelto (COD). III.11.1.2 Efecto del pre-bombeo En algunos experimentos de transporte bacteriano, las columnas se preacondicionaron con las soluciones de COD antes de bombear la suspensión bacteriana. Para ello, una vez empaquetadas las columnas, se 55 Materiales y Métodos procedió al bombeo de las soluciones durante 90 minutos (4 VP), tras lo cual se bombeó MM durante 60 minutos (2,5 VP) para lavar el exceso de carbono que quedase en disolución, seguido del bombeo de la suspensión bacteriana. De esta manera, podría determinarse el efecto de la materia orgánica adsorbida a la arena sobre el transporte bacteriano. III.11.1.3 Reversión del transporte de bacterias adheridas en las columnas En determinados experimentos, se estudió la reversión de la adhesión de aquellas bacterias que quedaban adheridas al colector mediante el bombeo de COD a distintas concentraciones. Para ello, se procedió a bombear la suspensión bacteriana en MM en ausencia de COD durante 90 minutos, seguidamente del bombeo de MM durante 60 minutos para lavar las células que quedasen en solución. A continuación, se bombeó la disolución de COD para estudiar su efecto en la reversión de la adhesión de las bacterias que habían quedado depositadas en la arena. Para discriminar si el efecto reversor del transporte era por mecanismos físicos o fisiológicos, se añadió HgCl2 (a una concentración de 1,32 mg L-1) a la supensión bacteriana antes de bombearla a través de las columnas para inactivar las células. III.11.1.4 Empleo del quimioefector naftaleno en las columnas Dado que la solubilidad del naftaleno es baja, los ensayos de transporte se prepararon con el naftaleno en forma de cristales en la parte superior de las columnas. El naftaleno se introdujo sobre el material empaquetado como una disolución de acetona y se dejó evaporar bajo corriente de nitrógeno. III.11.1.5 Caracterización físico-química de los quimioefectores empleados El potencial zeta y ángulo de contacto de las disoluciones de los quimioefectores en MM se determinaron según el método descrito en el epígrafe III.7. Las medidas de ángulo de contacto se determinaron sobre superficie de arena. 56 Materiales y Métodos La tensión superficial se midió a temperatura ambiente utilizando un tensiómetro de anillo de platino TD1 Lauda, Hucoa-Erlös (Laha y Luthy, 1992). Tras cada medida, se eliminaron las posibles trazas de compuesto mediante flameo del anillo. Los resultados se dan como la media de las medidas obtenidas por triplicado para cada uno de los quimioefectores (a las distintas concentraciones ensayadas) en comparación con las medidas obtenidas para el control (MM). Las diferencias significativas entre el valor obtenido para cada quimioefector y el del control (MM) se analizaron mediante el test pareado de t-student, P=0.01, con el programa Sigmaplot 8.0. III.12 ENSAYOS DE BIODEGRADACIÓN DE NAFTALENO Los ensayos de biodegradación de naftaleno se llevaron a cabo en las columnas descritas en el epígrafe III.9, bajo las mismas condiciones de los experimentos de transporte, utilizando los exudados a baja concentración de carbono y las NPsAg a 0,2 mg L-1, como quimioefectores. III.12.1 Carga de anillas de silicona con naftaleno marcado con 14C radiactivo Se usó el método de dopaje dinámico (Smith y col., 2012). Para ello, se colocaron un máximo de 8 anillas (según el experimento) en el fondo de un vial de cristal de 20 mL de capacidad y se añadió 1 mL de una solución de naftaleno en acetona (50 mg L-1) a la que, previamente, se le había añadido el volumen de stock de naftaleno radiactivo (en acetona) para obtener 200.000 dpm por anilla. El vial se dejó en campana extractora durante toda la noche para que se evaporara la acetona en disolución. Posteriormenete, se aplicaron gotas de agua milli-Q en series de 25 a 200 μL cada 5 minutos durante 35 minutos, bajando la frecuencia a 15 minutos en las últimas 5 dosis realizadas. Al siguiente día, se repitieron 3 series de dosificación de 1 mL de agua cada hora. Para conocer la cantidad de naftaleno marcado que la anilla había absorbido, se dejaron dos anillas (utilizadas como control) en un vial de cristal, por separado, añadiendo 1 mL de metanol para extraer el naftaleno marcado. Después de 72 horas de extracción en metanol, se midió la cantidad de radiactividad (dpm) disuelta en metanol mediante centelleo líquido en un contador de centelleo líquido modelo Beckman LS6500 (Beckman Instruments, Fullerton, 57 Materiales y Métodos California, USA). Se determinó por duplicado la radiactividad (un tubo procedente de cada columna por duplicado) mediante un contador de centelleo líquido modelo Beckman LS6500 (Beckman Instruments, Fullerton, California, USA). III.12.2 Ensayos de mineralización en columnas Las anillas cargadas con naftaleno marcado radiactivamente (con~200.000 dpm cada una) se colocaron en el fondo de las columnas por encima de 2 cm de arena empaquetada previamente. Las anillas se recogieron con la ayuda de unas pinzas del vial de cristal en el que se encontraban embebidas en agua y se lavaron, por separado, en agua milli-Q antes de introducirlas (una vez secas con papel secante) en las columnas. Se completaron las columnas con 10 g de arena fina, que se empaquetaron siguiendo las mismas condiciones que para el experimento de transporte descrito en el epígrafe III.9. Para medir la mineralización de naftaleno, se tomaron muestras de los eluyentes de las columnas en tres intervalos de tiempo durante el transporte bacteriano, correspondiéndose con la salida del frente (a la hora del comienzo del experimento, a 1VP), dos horas después (~ 5 VP) y tres horas y media tras el comienzo del experimento (~ 10 VP). Cada muestra se recogió en un dispositivo diseñado para recuperar el naftaleno transformado en CO2 (figura III.4). 58 Materiales y Métodos Tubo de teflón para extracción de muestra para medirla radiactividad total Tubo masterflexde conexión Trampa con 1 mL NaOH 0,5 M para recoger el CO2 liberado Eluyente de suspensión bacteriana Aguja para evitar sobrepresión Suspensión celular Anilla de silicona con 14C naftaleno Tubo de teflón para extracción de muestra para medirla radiactividad total Tubo masterflexde conexión Trampa con 1 mL NaOH 0,5 M para recoger el CO2 liberado Eluyente de suspensión bacteriana Aguja para evitar sobrepresión Suspensión celular Anilla de silicona con 14C naftaleno Figura III.4 Dispositivo diseñado para la recogida de muestras del transporte bacteriano usadas para el estudio de la mineralización de naftaleno desorbido de la anilla en las columnas de transporte Los eluyentes se recogieron durante 20 minutos, tras lo cual se separó el dispositivo de la columna y se tomaron 0,5 mL para medir la radiactividad presente en la muestra. Éste sería el valor de la cantidad de naftaleno desorbido desde la anilla y eluído a través de la columna. A continuación se añadió 1mL de HCl 2N para inactivar las células bacterianas presentes en los eluyentes y recoger el CO2 producido por la mineralización de las bacterias presentes en ese punto concreto. Los tubos, con la trampa de sosa incorporada, se dejaron en agitación continua a 80 rpm durante 12 59 Materiales y Métodos horas, para recoger el total de CO2 producido de la mineralización del naftaleno (cuyo valor de radiactividad, que conocemos por la medida de los 0,5 mL tomados, constituiría el 100 % presente inicialmente en cada muestra. La muestra (1 mL) recogida de la trampa de sosa se mezcló con 5 mL de líquido de centelleo (Ready Safe, Beckman Instruments, Fullerton, California, USA), dejándose la mezcla en oscuridad durante al menos 8 horas para la disipación de la quimioluminiscencia. III.12.3 Ensayo de mineralización en fase acuosa Se determinó la desorción de naftaleno desde la anilla a la fase acuosa y la biodegradación del naftaleno desorbido. Para ello, se prepararon 12 tubos para permitir la toma de muestras, en duplicado por tratamiento, con 5 mL de suspensión bacteriana en contacto con los exudados, NPsAg o MM (control). En el fondo de cada tubo se colocó una anilla que contenía 14C naftaleno (~ 200.000 dpm), que había sido preparada como se ha descrito anteriormente. En cada toma de muestra, se sacrificaron dos tubos por tratamiento, tomando 2,5 mL de la suspensión bacteriana (volumen de eluyente recogido durante 20 minutos en los ensayos en columna). Las muestras se añadieron a otro tubo que tenía incorporada una trampa de sosa para medir el CO2 producido. De estos 2,5 mL se recogieron 0,5 mL para medir la radiactividad total con el contador de centelleo, para determinar, así, la desorción de naftaleno a lo largo del tiempo. Se añadió 1mL de HCl 2N, de la misma manera que en el experimento en columnas. Los tubos que contenían la suspensión bacteriana con el HCl añadido, se mantuvieron en agitación a 80 rpm a temperatura ambiente durante 12 horas, para recoger el CO2 producido por la población bacteriana en cada momento de muestreo (figura III.5) 60 Resultados Del mismo modo, la movilidad en medio rico a base de triptona fue muy alta, en contraposición con la observada con el acetato sódico, donde prácticamente fue nula. En el caso del saliciliato sódico, la movilidad fue muy alta, especialmente, en la fase temprana estacionaria. De ahí a que este fuera el momento seleccionado como idóneo para llevar a cabo los experimentos. Tabla IV.2 Caracterización de la superficie y longitud celular de la estirpe Pseudomonas putida G7 en la fase estacionaria cutlivada con diferentes fuentes de carbono. Salicilato sódico Acetato sódico Triptona Ángulo de contacto (º) 47,2 ± 6,1 39,7 ± 6,8 47,5 ± 2,4 Potencial zeta (ζ) (mV) -30,9 ± 2,1 -30,7 ± 2,3 -31,2 ± 0,4 Longitud celular (µm) 1,58 ± 0,1 1,44 ± 0,2 3,3 ± 0,2 La morfología exhibida por el microorganismo varió según la fuente de carbono y la fase de cultivo. Así pues, cuando la bacteria se cultivó con salicilato sódico, la forma celular fue más alargada en fase temprana exponencial, donde los nutrientes son abundantes y la densidad poblacional baja, pudiendo ser la elongación celular mayor. En este caso, la longitud fue significativamente mayor (1,88 ± 0,1 µm) a la longitud en fase temprana estacionaria (1,58 ± 0.1 µm). En el comienzo de la fase estacionaria, la alta densidad celular hizo que la célula adquiera una forma más redondeada, con una longitud de 1,58 ± 0.11 µm. Así pues, a medida que avanza el ciclo celular, la longitud de la bacteria fue cada vez menor, siendo de 1,45 ± 0,2 µm en el inicio de fase de latencia, aunque la longitud no fue significativamente diferente a la que presenta la bacteria en fase temprana estacionaria. La comparación con la longitud celular en fase estacionaria es debido a que, como ya comentamos con anterioridad, fue la fase seleccionada para llevar a cabo los experimentos por la máxima movilidad observada (% de células móviles y grado de movilidad). 67 Resultados IV.2 OBTENCIÓN Y SELECCIÓN DE MUTANTES QUIMIOTÁCTICOS IV.2.1 RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS El proceso de mutagénesis requiere el conocimiento de los antibióticos a los que la estirpe P. putida G7 es resistente. Se ensayó el crecimiento en presencia de kanamicina (Km), gentamicina (Gm), ampicilina (Am), cloranfenicol (Cm), estreptomicina (Sm) y tetraciclina (Tet) en un rango de concentraciones entre 3 mg L-1 y 80 mg L-1. La bacteria creció en placas de medio rico LB que contenían Am y Gm a todas las concentraciones, Cm a concentraciones menores de 60 mg L-1 y Sm a concentraciones menores de 40 mg L-1. No se observó crecimiento en Tet y Km a ninguna de las concentraciones estudiadas. Puesto que el plásmido PRL1063, presente en el genoma de E. coli, contiene los genes de resistencia a Km, se escogió este antibiótico para la obtención de los mutantes, ya que P. putida G7 es sensible al mismo. Tras varios ensayos para comprobar la concentración de antibióticos de resistencia con la que fuera posible la obtención de mutantes, conseguimos que la transformación fuera viable empleando los antibióticos Cm a 10 mg L -1 y Km a 50 mg L-1. De esta manera, los transformantes eran las únicas bacterias que podían crecer en placas LB en presencia de ambos antibióticos. IV.2.2 MUTANTES DEFICIENTES EN LA RESPUESTA TÁCTICA Del primer escrutinio de la mutagénesis llevada a cabo, se obtuvo un número muy alto de transformantes de P. putida G7 que habían incorporado los genes de resistencia a Km desde E.coli, sin haberse afectado el plásmido NAH7 de degradación de naftaleno (figura IV.2). Un segundo escrutinio permitió seleccionar mutantes deficientes en la respuesta quimiotáctica a salicilato (figura IV.3) que serían válidos para el estudio de movilidad y quimiotaxis. 68 Resultados A A B Figura IV.2 Transformantes de P.putida G7 creciendo en agar con naftaleno (A) y medio rico, TSA (B) ABC Figura IV.3 Selección de mutantes de P. putida G7 deficientes en quimiotaxis a salicilato. Ausencia de halo en la mutante 91 (A) y formación de halo debido a la respuesta quimiotáctica debilitada de la mutante 55 (B) y 184 (C) El mutante 91 se escogió por la ausencia de respuesta táctica positiva frente a salicilato. Ello se confirmó mediante la carencia del anillo de turbidez alrededor del punto de inoculación en la placa de agar semisólido con salicilato (figura IV.3A). Los mutantes 55 y 184 se seleccionaron por su deficiencia en quimiotaxis a salicilato, evidenciada por la presencia de un anillo difuso alrededor del punto de inoculación (figuras IV.3B y IV.3C). El mutante 91 sirvió como control no quimiotáctico (Chem -) del estudio del efecto de la respuesta táctica en el transporte bacteriano. Los mutantes 55 y 184, cuyos patrones de movilidad intrínseca fueron diferentes al de la 69 Resultados silvestre, se emplearon para elucidar el papel que el patrón de movilidad bacteriano juega en el transporte. IV.3 ANÁLISIS DE LA MOVILIDAD BACTERIANA El estudio de la movilidad bacteriana consistió en el análisis de las trayectorias celulares individuales de Pseudomonas putida G7 en la fase estacionaria temprana en presencia de distintos compuestos. Se analizó, también, el movimiento celular en fase exponencial tardía para determinar las diferencias en el patrón de movilidad a lo largo del ciclo celular bacteriano, así como el patrón de movilidad de los mutantes descritos en el epígrafe IV.2.2. Para ello, se han utilizado dos parámetros de movilidad: la tasa de cambio de dirección, de sus siglas en inglés, RCDI (º s-1) y la velocidad lineal (μm s-1). De esta forma, se han descrito dos patrones de movilidad inducidos: el movimiento observado en presencia de un atrayente, caracterizado por unas trayectorias rectilíneas mantenidas sin cambios de dirección. Y el patrón de movimiento detectado en presencia de un repelente, que se caracterizó por la alta frecuencia de cambios de dirección. Estos patrones de movilidad se han observado bajo otras condiciones experimentales, como con los mutantes de movilidad y la movilidad intrínseca de la estirpe silvestre P. putida G7 en fase exponencial. IV.3.1 MOVIMIENTO DE RESPUESTA TÁCTICA POSITIVA Este patrón de movimiento se caracteriza por la presencia de trayectorias rectilíneas o curvas con una escasa frecuencia de cambios de dirección. Este tipo de movimiento es típico para la estirpe P. putida G7 en presencia de un atrayente, aunque también se observó para el caso del mutante 55 en ausencia de compuesto. 70 Resultados IV.3.1.1 Patrón de movilidad frente a atrayentes Cuando la estirpe bacteriana detectó un atrayente en solución, como el salicilato sódico a una concentración de 10 mM, su patrón de movimiento pasó a seguir trayectorias mantenidas sin cambios bruscos en la dirección (figuras IV. 4A, D, G) en comparación a la movilidad en ausencia de compuesto, donde la bacteria cambió de dirección de forma aleatoria (figuras IV.4B, E,H). El número total de cambios de dirección superiores a 1000 º s-1 fue nulo cuando las células bacterianas detectaron el salicilato en solución, en comparación a los 51 ± 0,7 cambios de dirección cuantificados en ausencia de compuesto. IV.3.1.2 Patrón de movilidad del mutante 55 La visualización en el microscopio óptico del movimiento celular del mutante 55 en ausencia de compuesto hizo pensar que se trataba de un mutante deficiente en el cambio de dirección. Su movimiento estaba caracterizado por trayectorias rectilíneas mantenidas en el tiempo. De ahí que se analizaran las trayectorias seguidas con el programa Celltrak, comparándose con la estirpe silvestre en presencia y ausencia de salicilato, como ejemplo de patrón de movilidad sin cambios de dirección. Las trayectorias celulares fueron rectilíneas, caracterizadas por la baja frecuencia de cambios de dirección (figura 4C, F, I), de forma similar a las trayectorias llevadas a cabo en presencia de un atrayente como el salicilato (figura 4A, D, G) en comparación a la movilidad intrínseca de la estirpe silvestre P.putida G7 en ausencia de compuesto (figura 4B, E, H ). El número de cambios de dirección superiores a 1000 º s-1 del sumatorio de trayectorias analizadas para el caso del mutante 55 fue de 19 ± 5,7, significativamente inferiores a los 51 ± 0,7 cambios de dirección que se cuantificaron para la estirpe silvestre. De esta manera, la mutante 55 podría definirse como deficiente en cambiar la dirección de su movimiento, pudiendo denominarse como mutante “smooth”, que es el movimiento típico en presencia de un atrayente. 71 Resultados 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 012345 Tiempo (s) RCDI (º s-1) 0 20 40 60 80 100 012345 Tiempo (s) Velocidad lineal (m s -1 ) 0 100 200 300 400 500 0 200 400 600 800 Coordenadas-X (mm) Coordenadas-Y (mm) 0 20 40 60 80 100 012345 Tiempo (s) Velocidad lineal (m s -1 ) 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 012345 Tiempo (s) RCDI (ºs -1 ) * * 0 100 200 300 400 500 0 200 400 600 800 Coordenadas-X (m) Coordenadas-Y (m) 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 012345 Tiempo (s) RCDI (º s-1) 0 20 40 60 80 100 012345 Tiempo (s) Velocidad lineal (m s -1 ) 0 100 200 300 400 500 0 200 400 600 800 Coordenadas-X (m) Y-Coordenadas (m) Salicilato Control (sin compuesto) Mutante 55 C F B H G E I D A Figura IV.4 Diagrama del patrón de movilidad de la la estirpe silvestre P. putida G7 en ausencia (A) y presencia del quimioefector positivo salicilato(B) en comparación con el movmiento del mutante 55 (C). Tasa de cambios de dirección (D-F) y velocidad (G-I) de trayectorias celulares representativas, rodeadas por un círculo punteado en las figuras A-C. Las líneas horizontales representan los valores umbrales de detección de los cambios de dirección superiores a 1000 ºs-1 (D-F) y los picos de aceleración mayores de 60 µm s-1 (G-I). Los cambios de dirección por encima del umbral se representan con asteriscos. 72 Resultados IV.3.2 MOVIMIENTO ABRUPTO En contraposición al movimiento suave sin cambios de dirección descrito anteriormente, se ha descrito otro tipo de patrón de movilidad que se caracteriza por la alta frecuencia de cambios de dirección que siguen las trayectorias celulares. Esta variable de movimiento se ha observado en varios casos que analizaremos a continuación. IV.3.2.1 Patrón de movilidad de la estirpe P. putida G7 en presencia de NPsAg y glucosa Como se ha descrito más arriba, la movilidad intrínseca de la bacteria, esto es, en ausencia deefector táctico, se caracterizó por seguir trayectorias cortas con algunos cambios bruscos de dirección ocasionales en su movimiento (figuras IV.5A, D, G). En presencia de NPsAg (a 0,2 mg L-1), las trayectorias pasaron a ser más cortas y los cambios de dirección fueron más frecuentes (figuras IV.5B, E,H), cuantificándose un total de 114 ± 3 cambios de dirección superiores a 1000º s-1. Las trayectorias celulares en presencia de glucosa fueron similares a cuando la bacteria detectó las nanopartículas en solución (figuras IV.5C, F, I), caracterizándose también por un alto número de cambios de dirección superiores a 1000 º s-1, 78 ± 18. En este caso, la velocidad celular también fue mayor, con un alto número de picos de aceleración superiores a 60 µm s-1, concretamente, 76 ± 3 picos de aceleración en comparación a los 18 ± 0,3 picos cuantificados en ausencia de compuesto (control). La movilidad bacteriana en presencia de las nanopartículas se correspondía con las trayectorias celulares seguidas por una bacteria en cuando detecta un repelente en el medio. La alta frecuencia de cambios de dirección, marcada por un alto número de cambios superiores a 1000 ºs-1 fue observada por primera vez por otros autores que atribuyeron este tipo de movimiento a una respuesta de repelencia (Oosawa y Imae, 1983). En presencia de glucosa, además del número alto de cambios de dirección, la bacteria presentó una velocidad elevada, por lo que la glucosa indujo una respuesta de hipermovilidad que será comentada más adelante (veáse epígrafe IV.4.1.3). 73 Resultados 0 20 40 60 80 100 012345 Tiempo (s) Velocidad lineal (  m s -1 ) G 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 012345 Tiempo (s) RCDI ( ºs-1 ) * * 0 100 200 300 400 500 0 200 400 600 800 Coordenadas-X (m) Coordenadas-Y (  m ) A 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 012345 Tiempo (s) RCDI (º s -1 ) * * * * * * * * * * * * * 0 20 40 60 80 100 012345 Tiempo (s) Velocidad lineal (  m s -1 ) H 0 100 200 300 400 500 0 200 400 600 800 Coordenadas-X (m) Coordenadas-Y (  m ) B 0 100 200 300 400 500 0 200 400 600 800 Coordenadas-X (m) Coordendadas-Y (  m ) C 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 012345 Tiempo (s) RCDI ( º s -1 ) F ** * *** * * * 0 20 40 60 80 100 012345 Tiempo (s) Velocidad lineal (  m s -1 ) I ** ** * * * * * E D NPsAg Glucosa Control (sin compuesto) Figura IV.5 Análisis de la movilidad celular de P. putida G7 en ausencia (A, B, C) y presencia de nanopartículas de plata(NPsAg) a 0,2 mg L-1 (B, E, F) y glucosa a 10 mM (C, F, I). En A, B y C, se muestran 10 trayectorias celulares del vídeo como representación del patrón de movilidad celular. La tasa de cambios de dirección (D-F) y la velocidad lineal (G-I) con respecto al tiempo que duró el vídeo se corresponden con las trayectorias celulares rodeadas del círculo punteado en las figuras A-C. Las líneas horizontales representan los valores umbrales de detección de los cambios de dirección superiores a 1000 ºs-1 (D-F) y los picos de aceleración mayores de 60 µm s-1 (G-I). Los cambios de dirección y picos de aceleración por encima del umbral se representan con asteriscos 74 Resultados IV.3.2.2 Patrón de movilidad del mutante 184 La selección del mutante 184 también se basó, como en el caso anterior, en su peculiar patrón de movimiento que, en este caso, fue similar al exhibido por la estirpe G7 en presencia de un repelente. Cuando se visualizó el movimiento del mutante 184 en el microscopio óptico se distinguió un patrón de movilidad celular característico de la respuesta de repelencia, con la peculiaridad de una alta frecuencia de giros sobre el mismo eje celular y trayectorias en zig-zag para los tramos en línea recta. El diagrama de movimiento reflejado mediante las trayectorias celulares del mutante 184 en ausencia de compuesto puede observarse en las figuras IV.6B,E,H en comparación con el diagrama de movilidad de la estirpe silvestre en ausencia (figuras IV.6A, D, G) y presencia de NPsAg (figuras IV.6C, F, I) como ejemplo de repelente para P.putida G7. El análisis cuantitativo de la movilidad del mutante 184 detectó un alto número de cambios de dirección, 97 ± 13, parecido al obtenido para el caso de la exposición a NPsAg, 114 ± 3, lo que lo caracterizó al mutante 184 como deficiente en mantener trayectorias rectilíneas durante un prolongado periodo de tiempo. La intermitencia en la representación gráfica de la velocidad lineal del mutante 184 pudo reflejar el patrón de trayectoria en zig-zag característico durante el recorrido en línea recta. 75 Resultados 0 100 200 300 400 500 0 200 400 600 800 Coordenadas-X (m) Coordenadas-Y (m) A 0 20 40 60 80 100 0 Velocidad lineal (m s -1 ) * 12345 Tiempo (s) C B 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 012345 Tiempo (s) RCDI (º s -1 ) ** * ** * * * * * 0 100 200 300 400 500 0 200 400 600 800 Coordenadas-X (m) Coordenadas-Y (m) D 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 012345 Tiempo (s) RCDI (º s -1 ) * * * ** * * *** * * * E 0 20 40 60 80 100 01 Velocidad lineal (m s -1 ) 2345 Tiempo (s) Figura IV.6 Diagrama de las trayectorias de movilidad del mutante 184 en ausencia de compuesto (A, B, C), en comparación con la movilidad de la estirpe silvestre P. putida G7 en presencia de NPsAg como ejemplo de repelente (D, E, F). Tasa de cambios de dirección (B y E) y velocidad (C y F) de las trayectorias celulares rodeadas del círculo punteado en las figuras A y D. Las líneas horizontales representan los valores umbrales de detección de los cambios de dirección superiores a 1000 ºs-1 (B y E) y los picos de aceleración mayores de 60 µm s-1 (C y F). Los cambios de dirección y picos de aceleración se re p resentan con asteriscos F 76 Resultados L a baja frecuencia de cambios de dirección de la mutante 55 fue significativamente menor al número de cambios detectados para la movilidad intrínseca de la estirpe silvestre en ausencia de compuesto, por lo que podemos concluir que se trata de un mutante “smooth” deficiente en cambiar la dirección en sus trayectorias celulares. El movimiento abrupto, caracterizado por la alta frecuencia de cambios de dirección, se confirmó para la respuesta táctica negativa observada frente a NPsAg en el ensayo capilar de repelencia, ya que el número de cambios de dirección con respecto al control fue significativamente mayor. Así, pues, la respuesta de hipermovilidad fue comprobada para el caso de la glucosa, donde se confirmó que el número de aceleraciones mayores de 60 m s-1 fue significativamente mayor respecto al control. Para el caso del mutante 184, las diferencias entre el número de cambios de dirección fueron también significativas con respecto a la silvestre (control), confirmándose, con ello, que se trata de una mutante deficiente en seguir trayectorias rectilíneas mantenidas sin cambios de dirección. La movilidad de la estirpe en fase temprana exponencial refejó unas trayectorias abruptas, marcadas por un número alto de cambios de dirección, siendo significativamente diferente a los cambios cuantificados en fase temprana estacionara en ausencia de efector táctico (control). El número de picos de aceleración detectado, también superior al del control, verificó la hiperactividad observada en fase exponencial donde abunda la cantidad de nutrientes. La velocidad celular de la estirpe P. putida G7 en presencia del fertilizante a 123 mg L-1 fue más alta que en ausencia de compuesto, dado que el número de picos de aceleración cuantificados fue significativamente mayores al observado en ausencia del fertilizante. La explicación a este aumento de velocidad podría encontrarse en que el fertilizante supone una fuente adicional de los nutrientes N y P, que provocarían el mismo efecto disipador de energía comentado en el caso de la glucosa, aunque en menor grado. Además, se ha comprobado el efecto fertilizante oleofílico en la interfase NAPL-agua proporcionando los nutrientes necesarios para que las bacterias degraden con mayor facilidad los contaminantes inmersos en el NAPL (del inglés, Non-Aqueous Phase Liquids) 83 Resultados (Tejeda Agredano y col., 2011). Lo cual indica que el fertilizante proporciona energía para el desarrollo de la actividad microbiana. A su vez, el mutante 184, caracterizado por la alta frecuencia de cambios de dirección en sus trayectorias celulares, presentó un número de aceleraciones mayores que en la silvestre, lo cual hace que difiera aún más del patrón de movilidad intrínseco de la silvestre, P. putida G7 (control). Por lo que, el empleo de este mutante en los ensayos de transporte, ayudará a entender el papel del comportamiento móvil bacteriano en el transporte y adhesión a materiales porosos. Así como el mutante 55, cuyo patrón de movilidad es el contrapuesto al del 184. 84 Resultados IV.4 ANÁLISIS DE LA RESPUESTA TÁCTICA IV.4.1 RESPUESTA TÁCTICA DETECTADA POR ENSAYO CAPILAR IV.4.1.1 Respuesta táctica positiva La respuesta de atracción manifestada en presencia de salicilato como un movimiento suave sin cambios de dirección en las trayectorias celulares se confirmó con el ensayo capilar. El número de células que entró en los capilares que contenían una disolución de salicilato (10mM) fue mayor que en ausencia de compuesto (sólo MM dentro del capilar), tal como se observa en la figura IV.9. El número de unidades formadoras de colonias (ufc) fue mayor también para el caso de la solución saturada de naftaleno. 0 100 200 300 400 500 600 700 Salicilato 10 mM Naftaleno (sat) ufc x 10/ capila r a b b a Figura IV.9 Respuesta táctica positiva de Pseudomonas putida G7 frente a salicilato 10mM y naftaleno (disolución saturada en MM) (barras grises) en comparación con el control en ausencia de NPsAg (barras negras) Las diferencias fueron significativas (P=0.01) para las barras marcadas con letra distinta 85 Resultados IV.4.1.2 Respuesta táctica negativa El efecto de repelencia causado por las nanopartículas (NPsAg) fue evidente, en los ensayos capilares, en un intervalo estrecho de concentración, que comprendió desde 0,1 mg L-1 a 0,2 mg L-1. Ello indicó que la respuesta de taxis negativa era muy sensible a la concentración del compuesto. El número de células que entró en los capilares repelidas por las NPsAg en suspensión fue mayor que en ausencia de las nanopartículas (figura IV.10A). La respuesta táctica negativa o de repelencia es más sensible que la de atracción y resulta más difícil de visualizar y reproducir. Esto es porque la respuesta de repelencia frente a un determinado compuesto puede ser apreciable sólo a unas concentraciones determinadas. De hecho, no se observó taxis negativa a concentraciones de 1 mg L-1 y 10 mg L-1 e incluso, a la máxima concentración ensayada de 100 mg L-1, el número de células que entró dentro de los capilares fue menor que en el control en ausencia de NPsAg, lo cual puede explicarse por la disminución de la viabilidad celular a esa concentración. Con la finalidad de evaluar si la respuesta táctica negativa observada en presencia de nanopartículas de plata podría atribuirse a otros efectos sobre la movilidad celular, se realizó otro experimento en el que las nanopartículas (0,2 mg L-1) se colocaron tanto en contacto con la suspensión celular como dentro del capilar. Los resultados (fig. IV.10B) indicaron que la respuesta de repelencia no ocurría en presencia de nanomateriales a ambos lados de la cámara de quimiotaxis, no habiendo diferencias significativas en el número de células que entraron dentro del capilar con respecto al control (P = 0.01). 86 Resultados Figura IV.10 En A, respuesta táctica negativa de Pseudomonas putida G7 frente a nanopartículas de plata verificada por la mayor entrada de células en capilares huyendo de las NPsAg en solución (barras grises) en comparación con el control en ausencia de NPsAg (barras negras). En B, inhibición de la respuesta táctica negativa de Pseudomonas putida G7 frente a nanopartículas de plata (0.2 mgL-1) presentes a ambos lados de la cámara quimiotáctica (dentro del capilar y en la suspensión bacteriana). Las diferencias fueron significativas (P=0.01) p ara las barras marcadas con letra distinta 0 50 100 150 200 250 300 350 400 NPsAg en suspensión celular ufc x 100/capilar B a b NPsAg dentro del capilar y en suspensión celular a a 0 50 100 150 200 250 300 350 0.05 0.1 0.2 NPsAg (mg L -1 ) ufc x 100 / capilar a a a a b b A 87 Resultados En colaboración con el grupo del Dr. Thompson de la Universidad de Oxford se caracterizó la superficie de las nanopartículas. El área superficial específica, determinada mediante la teoría BET por el método de adsorción de nitrógeno, fue de 7,92 m2 g-1. La distribución del tamaño de partícula estimada mediante una centrífuga de disco CPS confirmó la escasa agregación de las NPSAg, dada la la riqueza en partículas de pequeño tamaño (figura IV.11). Las imágenes de las NPsAg obtenidas mediante el microscopio electrónico de transmisión apoyaron los resultados obtenidos para la distribución de partícula (figura IV.12). Figura IV.11 Distribución del tamaño de nanopartículas de plata (NPsAg) 88 Resultados Figura IV.12 Micrografías al microscopio electrónico de transmisión del tamaño de las nanopartículas de plata (NPsAg) Se estudió la respuesta táctica negativa hacia distintas concentraciones de NO3Ag para determinar si la repelencia observada frente a NPsAg se debía a la presencia de los iones de plata que son liberados al medio por las NPsAg, o si se debe a la detección directa delas nanopartículas. Para ello, se utilizó un barrido de concentraciones de NO3Ag en MM por debajo y por encima de las utilizadas para el caso de las NPsAg. La respuesta táctica de repelencia no se observó a ninguna de las concentraciones utilizadas (figura IV.13). Como comentamos anteriormente, a la concentración de NPsAg de 100 mg L-1 se observó una menor viabilidad celular, lo que podía ser debido a la toxicidad de los iones Ag+ en solución. Recientemente se ha comprobado que el mecanismo antimicrobiano de las NPsAg se debe a la acción tóxica de los iones plata que se liberan de forma lenta y eficaz en las proximidades de la membrana celular (Xiu y col., 2012). De ahí que se justifique el uso de la plata como agente biocida en su estado nano y no en forma iónica, ya que el umbral de toxicidad es mucho más bajo para el último caso. 89 Resultados 0 50 100 150 200 0.1 0.05 0.01 0.005 0.001 NO3Ag (mg L-1) ufc x 100/capila r a aa a a aaa aa Figura IV.13 Ausencia de respuesta táctica negativa de Pseudomonas putida G7 frente a NO3Ag. La misma letra encima de las barras indica que no existieron diferencias significativas (P=0,01) entre el control en ausencia de NO3Ag (barras negras) y las distintas concentraciones del compuesto (barras grises). En nuestro estudio, a concentración de 1 mg L-1, las NPsAg no resultaron ser tóxicas para Pseudomonas putida G7, pero sí lo fue el NO3Ag a esa misma concentración (figura IV.13) e incluso a la concentración de 0.1 mg L-1. Por lo que podríamos decir que la repelencia a NPsAg supone una estrategia evolutiva de aviso hacia un posible efecto tóxico a concentraciones superiores del compuesto repelente, ya que además de ser sensible a concentraciones muy bajas del compuesto, la respuesta de repelencia se manifiesta como un mecanismo directo de las NPsAg en solución que no requiere de la liberación de los iones plata (que sí es necesaria para ejercer su acción bactericida). 90 Resultados IV.4.1.3 Hipermovilidad causada por la glucosa Los resultados del experimento capilar del ensayo de atracción (figura IV.14A), sugirieron que la glucosa podría tratarse de un repelente, ya que el número de células que entraron dentro de los capilares que contenían glucosa era significativamente menor que en el control (P = 0.01). Por lo que se llevó a cabo un ensayo capilar de repelencia para confirmar el papel de la respuesta táctica de la glucosa en P. putida G7. La entrada de células en los capilares huyendo del compuesto en solución fue mayor que en su ausencia (fig. IV.14B), siendo las diferencias estadísticamente significativas para P= 0.01. En presencia de glucosa, las células bacterianas presentaron una movilidad acelerada. De hecho, la mayor entrada bacteriana en los capilares durante los ensayos de repelencia puede también atribuirse a hipermovilidad, puesto que siguió siendo evidente cuando la glucosa se colocó dentro y fuera de los capilares (fig. IV.14C). Cabe destacar que, en este caso, el número de células en el interior de los capilares fue menor que cuando la glucosa sólo se encontraba en contacto con la suspensión bacteriana (figura fig. IV.14B), lo que puede ser debido a que, una vez dentro del capilar, las bacterias vuelven a detectar la glucosa, y la alta movilidad les conduce a salir de nuevo hacia la suspensión celular. Tal como ocurre en el ensayo capilar de atracción, las células tienen tendencia a salir de los capilares que contenían glucosa debido a una mayor dispersión celular en presencia de una fuente rica de carbono (Banitz y col., 2011). Se comprobó el crecimiento de la estirpe Pseudomonas putida G7 en presencia de glucosa a concentración de 5mM, caracterizado por una tasa de duplicación de 15 h (µ = 0,05 h-1) por lo que la mayor entrada celular en presencia de glucosa no pudo deberse a la proliferación celular utilizando glucosa como fuente de carbono. 91 Resultados 0 100 200 300 400 500 600 0.1 1 10 100 Glucosa (mM) ufc x 100/capilar b aa a b b b a Figura IV.14 Ausencia de respuesta táctica positiva de la estirpe P. putida G7 frente a glucosa 100 mM determinada mediante ensayo capilar de atracción (A). Ensayo capilar de repelencia frente a glucosa a distintas concentraciones. El número de células dentro de los capilares fue mayor cuando la glucosa estaba en la suspensión bacteriana (barras grises) en comparación con el control (barras negras) (B). Ausencia de repelencia confirmada por la mayor entrada de células en los capilares que contenían glucosa dentro y fuera junto con la suspensión celular (C). Las letras diferentes indican que las diferencias son significativas para P = 0,01.Cambiar epigrafe 0 100 200 300 400 500 600 0.1 Glu ufc x 100/capilar ab a 1 10 100 cosa (mM) aaa b bb 0 50 100 150 200 250 300 Glucosa 100 mM ufc x 10/capilar b ABC 92 Resultados IV.5.2 ADHESIÓN A LAS ANILLAS DE SILICONA El patrón de movilidad en presencia de un atrayente como los exudados de raíces de girasol a concentración de 16 mg L-1, provocó que la adhesión sobre la superficie de la anilla de silicona fuese menor, 30,6 ± 3 % frente a 45,7 ± 0,2 % de adhesión de la bacteria en ausencia de compuesto (diferencias significativas para P=0,05). Aunque, en este caso, la adhesión no fue tan baja como en la arena. Esto puede deberse a la capacidad adherente de la silicona, que ha sido evidenciada en otros estudios (Smith y col., 2012). La movilidad seguida por la estirpe P. putida G7 en presencia de las nanopartículas a 0,2 mg L-1 provocó una mayor adhesión en la superficie de anilla, 55,5 ± 1,8 % en comparación a la que se dio en ausencia de compuesto, 45,7 ± 0,2 % (diferencias significativas par P=0,05). IV.5.3 ADHESIÓN A LA INTERFASE NAPL-AGUA El patrón de movilidad en presencia de una disolución de NPsAg a 0,2 mg L-1 hizo que las bacterias que se acercaron a la interfase DEHP-agua permanecieran adheridas, creando una película de células justo en la interfase, tal como se observa en la figura IV. 2A. En ausencia de nanopartíclas de plata en la fase acuosa, las células no permanecieron asociadas a la interfase (figura IV.2B). La tendencia a adherirse al NAPL, en este caso, al DEHP, fue comprobada por la medida de la DO600 según el método BATH, que determinó el % de células adheridas a la interfase en ausencia (3,2 ± 0,7 %) y presencia de NPsAg (36,2 ± 0 %). AB AB Figura IV.18 Adhesión bacteriana a la interfase DEHP-agua en presencia (A) y ausencia de NPsAg a concentración de 0,2 mg L-1 99 Resultados IV.6 TRANSPORTE BACTERIANO A TRAVÉS DE MEDIOS POROSOS SATURADOS IV.6.1 FACTORES INDEPENDIENTES DE LA MOVILIDAD QUE AFECTAN AL TRANSPORTE IV.6.1.1. Efecto de la fuerza iónica Según la teoría DLVO, al bajar la fuerza iónica del medio, aumenta el espesor de la doble capa eléctrica y, con ello, la repulsión electrostática. De esta manera, cuando el medio de mineralización que se utilizó para resuspender el cultivo celular, estuvo diez veces diluído, la deposición bacteriana en las columnas fue menor y, con ello, fue apreciable un aumento del transporte bacteriano (figura IV.19a). En condiciones de baja fuerza iónica, la eficacia de la salida bacteriana fue similar en presencia o ausencia de naftaleno (figura IV.19b). Se deduce que el efecto promotor del transporte por parte del quimioefector positivo naftaleno fue menos pronunciado a una menor fuerza iónica. Aún así, la quimiotaxis a naftaleno provocó que la curva de rotura estuviera por encima del control (en ausencia de compuesto). 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0246 Volumen de poro C/C 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0246 Volumen de poro C/Cº ab Figura IV.19 En a, efecto de la bajada de la fuerza iónica (■) en el transporte bacteriano de la estirpe Pseudomonas putida G7 comparado con el control (○). En la figura b, la presencia de naftaleno (■) no provocó un aumento del transporte significativamente mayor que en su ausencia (○) 100 Resultados IV.6.1.2 Efecto del tamaño del colector Al utilizar partículas de arena con un mayor diámetro, hubo un incremento del volumen de poro de 2,677 a 3,265 mL, lo que condujo a un aumento del transporte bacteriano (figura IV.20). La superficie específica de las partículas de arena fue menor, siendo la probabilidad de intercepción de las bacterias con la superficie de arena también más baja. El mayor aumento del espacio interparticular permitió mayor libertad de movimiento favoreciendo la elución bacteriana a través de las columnas. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 012345 Volumen de poro C/C 0 Figura IV.20 Transporte bacteriano de la estirpe P. putida G7 en columnas empaquetadas con arena de grano fino de diámetro 0,4-0,25 mm (●) en comparación con aquellas preparadas con arena de grano más grueso de diámetro 0,4-0,5 mm (■) 101 Resultados IV.6.1.3 Efecto de la velocidad de flujo Cuando la velocidad del flujo se redujo de 23 rpm a 11,5 rpm, la retención bacteriana en las columnas empaquetadas con arena fina fue mayor que a la velocidad de flujo habitual (figura IV.21). El tiempo de residencia en las columnas fue mayor, facilitando la intercepción de las células bacterianas con el colector. Los resultados de otro estudio se asemejan a los nuestros, donde se puso de manifiesto que a mayor tiempo de residencia, mayor adhesión al colector (Liu y col., 2011). 0 0.2 0.4 0.6 0.8 012345 Volumen de poro C/C 0 Figura IV.21 Transporte bacteriano a una velocidad de flujo de 11,5 rpm en columnas empaquetadas con arena de grano fino en presencia (■) y ausencia (○) de salicilato 10mM. 102 Resultados La salida del frente bacteriano se produjo a partir de 2 VP, indicando la influencia del factor de bloqueo en las columnas. Al aumentar la probabilidad de que las bacterias interaccionen con el colector, la superficie cubierta por células evitó que las bacterias que se acercaron posteriormente a la superficie, se adhierieran, siendo transportadas a lo largo de las columnas. A una velocidad de flujo menor, la movilidad bacteriana se ve favorecida y aumentada por la reducción en las interacciones hidrodinámicas (Kerchove y Elimelech, 2008). En condiciones no favorables para la retención (como en el caso de la fuerza iónica) la salida del frente bacteriano se dio a 1 VP, coincidiendo con la mitad del valor máximo de C/ C0. Mientras que al disminuir la velocidad de flujo, el valor de C/C0 a 1 VP no coincidió con la mitad del valor máximo observado, lo que indicó que hubo una pequeña retención bacteriana gradual. A medida que se fue bombeando la suspensión celular, una parte de las células se fueron reteniendo, ya que la disminución en la velocidad de flujo favoreció la adhesión bacteriana al aumentar el tiempo de residencia en las columnas, lo que fomentó la adhesión bacteriana a la arena, y el bloqueo del colector. IV.6.2 PAPEL DE LA MOVILIDAD INTRÍNSECA EN EL TRANSPORTE IV.6.2.1 Saturación del colector por alta densidad de células con movilidad intrínseca El transporte bacteriano de células móviles presentó una curva de rotura con un valor de eficiencia de la salida bacteriana menor del 10 %. Lo que indicó que la movilidad intrínseca de la bacteria favoreció la adhesión bacteriana sobre la superficie de la arena (figura IV.22). A partir de 4 volúmenes de poro se observó un aumento de la salida bacteriana, que se debió al bloqueo del colector. Hasta ese momento, la adhesión bacteriana había sido de manera gradual, y una vez que la superficie de arena estuvo cubierta de células, las siguientes que llegaron a las columnas fueron transportadas a través de las mismas, ya que no podían adherirse a la superficie. 103 Resultados 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 024681012 Volumen de poro C/C 0 Figura IV.22 Transporte bacteriano de la estirpe Pseudomonas putida G7 (en fase estacionaria temprana) en columnas empaquetadas con arena de grano fino (0,25-0,4 mm) bombeadas a un flujo de 23 rpm En este caso, el colector se fue cubriendo de células de manera gradual, por lo que no hubo repelencia entre las bacterias ya adheridas a la arena y las que se aproximaban a la superficie. La salida bacteriana a través de las columnas comenzó a aumentar a partir de 4 volúmenes de poro, siiendo el valor máximo de la eficacia de salida celular de aproximadamente el 60 %. La superficie cubierta por células evitó la interacción posterior de otras bacterias que se aproximaban al colector. El resultado de este tratamiento, es decir, el tansporte bacteriano de la estirpe Pseudomonas putida G7 (en fase estacionaria temprana) en columnas empaquetadas con arena de grano fino (0,25-0,4 mm) y bombeadas a un flujo de 23 rpm, es el caso que consideraremos como control. En los experimentos posteriores, se explicarán diferentes curvas de rotura que atenderán a distintos patrones de movilidad bacteriana (entre otros parámetros fisiológicos), que serán comparadas con la curva de rotura obtenida para el control. 104 Resultados IV.6.2.2 Fases del ciclo celular bacteriano El movimiento celular intrínseco puede verse afectado según la fase del ciclo en que se encuentre la célula bacteriana. En la fase estacionaria temprana todas las células eran móviles siguiendo trayectorias rectilíneas con cambios de dirección en su movimiento. Durante esta fase, las bacterias presentaron una alta movilidad que se manifestó por la competitividad que existía por el consumo de los escasos nutrientes que quedaban en el medio. Bajo estas condiciones, la intercepción de las bacterias con el colector fue muy alta y la mayoría de las células (90%) quedaron retenidas en las columnas (figuras IV.22 y IV.23). 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 012345 Volumen de poro C/C 0 Figura IV.23 Transporte bacteriano en fase estacianaria (○) en comparación con el transporte en fase exponencial (□) y en fase de latencia (∆) 105 Resultados En la fase de latencia la movilidad fue muy reducida y el aumento del transporte se hizo evidente con la salida del frente bacteriano a partir de 1 volumen de poro, coincidiendo con la mitad del valor máximo de C/C0. Este dato indicó que no hubo retención bacteriana en las columnas de arena (tabla IV.5). La escasa movilidad celular hizo que la probabilidad de intercepción de las células con el colector no estuviese favorecida por la movilidad aleatoria, y las bacterias fueron transportadas como meros coloides a la velocidad de flujo determinada por la bomba peristáltica (23 rpm). La eficacia de la salida bacteriana fue cercana a 0.5, lo que indicó que prácticamente la mitad de las bacterias quedaron retenidas en las columnas y la otra mitad se transportaron desde 1 VP, siendo indicativo de una baja intercepción por el colector. Tabla IV.5 Influencia de la fase del ciclo celular en la movilidad y transporte bacteriano a través de medios porosos saturados Análisis de movilidad Transporte y deposición a Fase del ciclo celular RCDI b,c Velocidad c,d C/C0 e VP f Temprana exponencial 91 ± 27 32 ± 7 0,04 (0,29) 1,10 (4,49) Temprana estacionaria 51 ± 0,7 18 ± 0,3 0,04 (0,08) 1,10 (4,86) Fase de latencia NA g NA g 0,23 (0,38) 1,44 (4,45) aLos valores experimentales finales están dados entre paréntesis como una indiciación del bloqueo de filtro. b RCDI, sumatorio del número de cambios de dirección superiores a 1000 º s-1. cLos valores son dados como la media ± desviación estándar. d Velocidad, sumatorio de los picos de aceleraciones mayores de 60 µm s-1. e C/C0, eficiencia de la salida bacteriana a través de las columnas. f VP, volumen de poro. f NA, no aplicable 106 Resultados El transporte de las células bacterianas en fase exponencial tardía fue mayor a partir de 2 volúmenes de poro. Esta curva de rotura fue parecida a la obtenida para el caso de un flujo bajo (11,5 rpm). La movilidad bacteriana en fase exponencial tardía presentó una frecuencia de cambios de dirección superior a la exhibida en fase estacionaria temprana (tabla IV. 4). Por lo que se relacionó el mayor número de cambios de dirección, con el aumento de la adhesión a la superficie de arena. Cada cambio de dirección le ofreció a la bacteria la oportunidad de interaccionar con el colector. Cabe destacar que la longitud celular en la fase exponencial tardía fue mayor que en la fase estacionaria (véase tabla IV.2), lo que pudo contribuir a que se depositara en mayor grado. Según algunos autores, una mayor longitud celular se relaciona con una mayor adhesión bacteria sobre superficies (Gannon y col., 1991; Weiss y col., 1995) IV.6.2.3 Inmovilización celular El aumento de transporte observado en condiciones de reducida movilidad, como es el caso del cultivo en fase de latencia, fue atribuído a la menor probabilidad de interaccionar con el colector, razón que fue corroborada cuando la célula bacteriana era inmóvil. La inmovilidad se indujo por varias causas: inactivación del movimiento por efecto de la sonicación o de un aumento de la temperatura y muerte celular provocada por los biocidas nitrato de plata y cloruro de mercurio. IV.6.2.3a Inactivación del movimiento El transporte bacteriano de células inmóviles fue mayor que cuando la bacteria era móvil debido a que la deposición en la superficie de arena fue menor por la inexistencia de cambios de dirección en sus trayectorias (figura IV.24). La salida del frente bacteriano se produjo aproximadamente a 1 VP, coincidiendo, además, con un valor de C/C0 de 0,55 y 0,5 para el transporte de células sonicadas y sometidas a un choque térmico a 45ºC, respectivamente. 107 Resultados La forma de las curvas de rotura indicó que la retención no fue alta y que la mayoría de las células se movilizaron hasta el final de las columnas. El 80% de las células sometidas a 45º se recogió en el efluente de las columnas. Mientras que en caso de las células sonicadas, la recuperación celular fue del 60 % aproximadamente. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0246 Volumen de poro C/C 0 Figura IV.24 Transporte de células bacterianas inmóviles debido al efecto de un choque térmico a 45 ºC (▲) y de la sonicación (■) en comparación con el transporte de las bacterias móviles en fase estacionaria, condiciones fijadas como control (○) Las células bacterianas se transportaron como coloides en suspensión. Esta observación fue descrita con anterioridad por otros autores (Camper y col., 1993). En dichos estudios se puso de manifiesto que la movilidad intrínseca favorecía la intercepción con las superficies sólidas. Se ha comprobado que la viabilidad celular no se vio alterada por los cambios inducidos en la conformidad de los componentes de la pared celular bacteriana por el efecto causado por la sonicación o el efecto de la temperatura de 45º (tabla IV. 6). El número de unidades formadoras de colonias (ufc) obtenido del conteo de viables en placas de TSA no difirió 108 Resultados IV.6.3.2.2 Efecto de la glucosa El bloqueo del colector y el consecuente aumento del transporte se observó también en presencia de glucosa a concentración de 10 mM (figura IV.28). Al no encontrarse diferencias significativas en cuanto a las propiedades de la superficie celular en presencia de glucosa (tabla IV.8), y debido a que el patrón de movilidad exhibido por las células se parecía al observado frente a un repelente, se atribuyó como efecto promotor del transporte, el patrón de movilidad bacteriano en presencia de glucosa que provocó una mayor adhesión bacteriana en las columnas, desencadenando la saturación del colector y el consecuente aumento del transporte. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 012345 Volumen de poro C/C 0 a Figura IV.28 Perfil bacteriano del transporte de P.putida G7 en columnas empaquetadas con arena de grano fino en presencia de glucosa 0.1mM (▲), 10 mM (■) y 100 mM (♦) en comparación con el control en ausencia de compuesto (○) 115 Resultados El aumento de transporte bacteriano también se observó a otras concentraciones de glucosa, por debajo y por encima de 10 mM, maniféstandose como curvas de rotura parecidas para las distintas concentraciones. Esto es una prueba de la respuesta fisiológica (hipermovilidad) que supuso la presencia de glucosa para la estirpe Pseudomonas putida G7. Tabla IV.8 Efecto de glucosa a 10 mM en el transporte bacteriano de P. putida a través de medios porosos saturados Análisis de movilidad Superficie celular Transporte y deposición a Tratamiento RCDI b,c Velocidad c,d θw c,e ζ c,f C/C0 g VP h Control (MM) 51 ± 0.7 18 ± 0.3 47 ± 6 -31 ± 2 0,04 (0,08) 1,10 (4,86) Glucosa (10mM) 78 ± 18 76 ± 3 47 ± 4 -29 ± 2 0,02 (0,44) 1,18 (4,65) aLos valores experimentales finales están dados entre paréntesis como una indiciación del bloqueo de filtro. b RCDI, sumatorio del número de cambios de dirección superiores a 1000 º s-1. c Los valores son dados como la media ± desviación estándar. d Velocidad, sumatorio de los picos de aceleraciones mayores de 60 µm s-1. e θw, ángulo de contacto .f ζ, Potencial zeta. gC/C0, eficiencia de la salida bacteriana a través de las columnas. h VP, volumen de poro. El aumento de la eficacia de salida bacteriana en presencia de glucosa tras el bloqueo del filtro (el valor de C/C0 aumentó de 0,08 a 0,44) se debió a la movilidad marcada por la alta frecuencia de cambios de dirección, 78 ± 18, así como por un número mayor de aceleraciones en su movimiento, 76 ± 3. La hipermovilidad observada con glucosa fue la causa del aumento de la adhesión, así como del aumento del transporte una vez que el colector se colapsó de células adheridas. 116 Resultados IV.6.3.3 Transporte bacteriano de los mutantes 55 y 184 Se han obtenido dos transformantes de Pseudomonas putida G7 que presentaron un patrón de movilidad distinto al de la silvestre en ausencia de compuesto. Estos patrones de movilidad se asemejaron a los observados en presencia de un atrayente (mutante 55) y un repelente (mutante 184). El estudio del transporte bacteriano de los mutantes en ausencia de compuesto sirvió para comprobar si el efecto del patrón de movimiento en la deposición bacteriana en las columnas de arena pudo ser la causa del perfil de transporte bacteriano observado en los tratamientos anteriormente descritos. Las curvas de transporte obtenidas con estas estirpes en ausencia de efector corroboran la hipótesis de que el cambio en el patrón de movilidad afectó al transporte bacteriano (figura IV.29). 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 012345 Volumen de poro C/C 0 Figura IV.29 Transporte bacteriano del mutante 55 (■) y del mutante 184 (♦) a través de columnas empaquetadas con arena de grano fino. De esta manera, el mutante 55 mostró un perfil de transporte similar al observado en presencia de un atrayente, ya que su patrón de movilidad fue parecido al de la estirpe P. putida G7 en presencia de salicilato, donde el movimiento con trayectorias rectilíneas o curvas mantenidas sin cambios 117 Resultados de dirección, permitió que la eficiencia de adhesión fuera baja (veáse tabla IV.9), y con ello, el transporte bacteriano fue alto desde que salió el frente celular (1 VP aproximadamente). Aunque cabe destacar que el % de recuperación celular estuvo por debajo del obtenido para la estirpe silvestre en presencia de salicilato. Se recuperó el 50 % de las células del mutante en comparación a la recuperación del 80 % para la silvestre en presencia de salicilato. Esta diferencia de recuperación se puede explicar en base a los resultados obtenidos en el ensayo de adhesión a arena, donde se determinó que la adhesión del mutante 55 no fue tan baja como la de la silvestre en presencia de salicilato. Mientras que el patrón de movilidad del mutante 184, que se parecía a la movilidad característica de la estirpe silvestre en presencia de un repelente, hizo que la probabilidad de adherise a la matriz arenosa fuese mayor, provocando el bloqueo del filtro, y el consecuente aumento de transporte bacteriano, tal como ocurrió en presencia de NPsAg. Los cambios de dirección, más frecuentes y abruptos, fueron aprovechados por las células mutantes para adherirse a la matriz arenosa, provocando el bloqueo del colector a partir de 2 volúmenes de poro. En la tabla IV.9 se recogen los datos del transporte bacteriano en cuanto a los valores de dhesión que pueden explicar el aumento del transporte bacteriano en las columnas. 118 Resultados Tabla IV.9 Influencia del patrón de movilidad de los mutantes 55 y 184 en el transporte bacteriano a través de medios porosos saturados aLos valores experimentales finales están dados entre paréntesis como una indiciación del bloqueo de filtro. b RCDI, sumatorio del número de cambios de dirección superiores a 1000 º s-1. cLos valores son dados como la media ± desviación estándar. d Velocidad, sumatorio de los picos de aceleraciones mayores de 60 µm s-1. e C/C0, eficiencia de la salida bacteriana a través de las columnas. f VP, volumen de poro. Análisis de movilidad Transporte y deposición a Mutante RCDI b,c Velocidad c,d C/C0 e VP f 55 19 ± 5,7 16 ± 0,7 0,36 (0,46) 1,49 (4,56) 184 97 ± 13 40 ± 2,8 0,09 (0,23) 1,46 (4,49) El patrón de movilidad del mutante 55 confirmó los resultados obtenidos en el transporte bacteriano en presencia de un atrayente, donde el movimiento rectilíneo con baja frecuencia de cambios de dirección 19 ± 5,7, provocó una menor adhesión bacteriana en la superficie de arena haciendo que C/C0 aumentase desde la salida del frente bacteriano (1 VP). La eficacia de la salida bacteriana es de 0,36 frente al valor de 0,09 para la mutante 184. En este caso, su patrón de movilidad, marcado por la alta frecuencia de cambios de dirección en sus trayectorias celulares (97 ± 13), provocó una mayor adhesión que causó el bloqueo del colector y el aumento de transporte a partir de 2 VP, siendo el máximo valor de C/C0 de 0,23 a 4,49 VP. 119 Resultados IV.6.4 EFECTO DE LA MATERIA ORGÁNICA EN EL TRANSPORTE BACTERIANO IV.6.4.1 Materia orgánica disuelta (MOD) La materia orgánica disuelta (MOD) a una concentración de carbono del orden de 130 mgL-1 promovió el transporte bacteriano de la estirpe Pseudomonas putida G7 en las columnas de arena, tal como se muestra en la figura IV.30a. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 012345 Volumen de poro C/C 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 01234 Volumen de poro C/C 0 ab Figura IV.30 Efecto de la materia orgánica disuelta a alto (a) y bajo (b) contenido de carbono orgánico en la deposición bacteriana en columnas empaquetadas con arena de grano fino. Los exudados promovieron (▲) el transporte incluso a baja concentración, mientras que los ácidos húmicos (■) y el fertilizante oleofílico (♦) sólo cuando la cantidad de carbono fue alta, en comparación con el control (○) en ausencia de materia orgánica disuelta La salida del frente bacteriano se produjo a 1 VP coincidiendo con la mitad del valor máximo de la eficacia de salida bacteriana (C/C0), lo que indicó que la deposición fue baja y la mayoría de las células se transportaron a lo largo del perfil de arena (del 60 al 80 %). En ausencia de materia orgánica, el transporte bacteriano fue prácticamente nulo, ya que la eficacia de la salida bacteriana fue menor de 0,1. Cuando 120 Resultados la concentración de carbono fue 10 veces menor, del orden de 15 mg L-1, sólo los exudados promovieron el transporte bacteriano (figura IV.30b). A efectos comparativos, y para comprender las causas del aumento de transporte bacteriano por parte de la materia orgánica en solución, se caracterizó la superficie bacteriana en presencia de la materia orgánica disuelta, tal como se muestra en la tabla IV.8. Tabla IV. 10 Efecto de la materia orgánica disuelta (MOD) en el transporte bacteriano de P. putida G7 a través de medios porosos saturados Análisis de movilidad Superficie celular Transporte y deposición c MOD [Corg] a,b (mg L-1) RCDI b,d θw b,e ζ b,f C/C0 g VP h Control (MM) NA i 51 ± 0,7 47,1 ± 6,2 30,9 ± 2,1 0,04 (0.08) 1,10 (4,86) 129 ± 3,5 16 ± 7,1 39,2 ± 7,4 31,5 ± 3,0 0,67 (0,77) 1,79 (4,15) Exudados vegetales 16,3 ± 0,1 13 ± 0,1 41,1 ± 6,5 31,6 ± 2,5 0,63 (0,85) 1,33 (3,70) 138 ± 7,8 44 ± 3,8 41,8 ± 6,7 32,7 ± 1,6 0,49 (0,67) 1,61 (3,78) Ácidos húmicos 15,5 ± 1,3 40 ± 14 44,4 ± 4,9 33,5 ± 1,9 0,03 (0,09) 1,61 (3,34) 123 ± 0,7 46 ± 2,1 47,4 ± 4,6 30,5 ± 4,6 0,50 (0,89) 1,53 (4,15) Fertilizante oleofílico 13,3 ± 0,1 54 ±17 ND j ND j 0,07 (0,14) 1,37 (3,30) a[Corg], concentración de carbono orgánico. b Los valores son dados como la media ± desviación estándar. c Los valores experimentales finales están dados entre paréntesis como una indicación del bloqueo de filtro. d RCDI, número de cambios de dirección mayores de 1000º s-1 e θw, ángulo de contacto. f ζ, Potencial zeta. gC/C0, eficiencia de la salida bacteriana a través de las columnas. h VP, volumen de poro. i NA, no aplicable. j ND, no determinado. 121 Resultados La superficie celular no se vio afectada en cuanto a la carga superficial (medida por el potencial zeta) e hidrofobicidad (medida por el ángulo de contacto) en presencia de la materia orgánica disuelta, ya que los valores obtenidos para los distintos compuestos no fueron significativamente diferentes al valor del control. De esta manera, el aumento del transporte bacteriano no puede atribuirse a un cambio de estas propiedades físicas de la superficie celular debido al contacto con la materia orgánica, como ya habían sugerido con anterioridad otros autores (Johnson y Logan, 1996). Más bien, la explicación del aumento del transporte podría ser debido a algún efecto fisiológico causado por la materia orgánica, como podría tratarse de la respuesta táctica positiva detectada hacia los exudados vegetales por parte de P. putida G7. Las trayectorias celulares caracterizadas por una baja frecuencia de cambios de dirección en presencia de exudados (tabla IV.10) fomentarían una menor intercepción de las bacterias con el colector de arena, provocando una menor adhesión y, por tanto un transporte mayor. Los AH y el fertilizante no provocaron ninguna respuesta táctica en la estirpe P. putida G7, por lo que la razón del aumento del transporte bacteriano podría deberse a la competencia entre la materia orgánica y las células bacterianas por la adhesión a la arena, tal como ya había sido descrito en publicaciones anteriores (Lahlou y col., 2000; Foppen y col., 2008; Park y Kim, 2009). En estos estudios se comprobó el impedimento estérico que suponen los AH, previamente adsorbidos sobre la superficie del colector, para la adhesión bacteriana a la superficie. IV.6.4.2 Materia orgánica adsorbida Para comprobar que el efecto promotor del transporte observado en la figura IV.30a podía deberse a la competencia entre la materia orgánica y las células bacterianas por adherirse a la superficie de arena, se estudió el efecto del pre-bombeo de la materia orgánica sobre el transporte bacteriano. En este caso, el efecto promotor del transporte fue evidente tanto a alta concentración de carbono (figura IV.31a) como a baja concentración (figura IV.31b). 122 Resultados Figura IV.31 Transporte bacteriano de la estirpe P. putida G7 en columnas de arena preacondicionadas con exudados (▲), ácidos húmicos (■) y el fertilizante oleofílico(♦) a alta (a) y baja (b) concentración de carbono, en comparación con el control en ausencia de materia orgánica adsorbida(○) En la figura IV.31 se corroboró el aumento del transporte bacteriano cuando la materia orgánica estuvo adsorbida a la superficie de arena, pero cabe destacar que, aunque en el caso de los exudados no influyó la concentración de carbono, en el de los ácidos húmicos y el fertilizante, sí. Los valores de eficacia de la salida bacteriana (C/C0) fueron menores cuando se prebombearon los AH y el fertilizante a concentración baja comparado con los valores de C/C0 a concentración alta de carbono, tal como se indica en la tabla IV.11. A mayor concentración de carbono, mayor fue el transporte bacteriano, ya que la superficie de arena pudo quedar cubierta por una mayor cantidad de materia orgánica que impidió a las células bacterianas adherirse a la arena. Estos datos están en concordancia con los resultados obtenidos por otros autores (Park y Kim, 2009) en donde se comprobó que la adhesión de E. coli sobre arena cubierta de hierro disminuyó con el aumento de la concentración de ácidos húmicos debido a la pre-ocupación de los sitios favorables para la adhesión por parte de la materia orgánica. De manera que se observó un incremento del transporte bacteriano del 63,4 % (cuando se bombearon AH a 4mg L-1) al 94,6% al bombear la solución de AH a 16 mg L-1. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 012345 Volumen de poro C/C 0 1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 01234 Volumen de poro C/C 0 ab 1 123 Resultados Tabla IV. 11 Efecto de la materia orgánica adsorbida en el transporte bacteriano de P. putida G7 a través de medios porosos saturados. a[Corg], concentración de carbono orgánico. b Los valores son dados como la media ± desviación estándar. c Los valores experimentales finales están dados entre paréntesis como una indiciación del bloqueo de filtro. d C/C0, eficiencia de la salida bacteriana a través de las columnas. e VP, volumen de poro. f NA, no aplicable. Transporte y deposición c Materia orgánica adsorbida [Corg] a, b (mg L-1) C/C0 d VP e Control (MM) NA j 0,04 (0.08) 1,10 (4,86) 129 ± 3,5 0,63 (0,78) 1,46 (4,13) Exudados vegetales 16,3 ± 0,1 0,68 (0,73) 1,46 (3,49) 138 ± 7,8 0,64 (0,70) 1,57 (3,70) Ácidos húmicos 15,5 ± 1,3 0,34 (0,56) 1,66 (3,51) 123 ± 0,7 0,46 (0,76) 1,53 (3,63) Fertilizante oleofílico 13,3 ± 0,1 0,46 (0,58) 1,46 (3,48) En nuestro estudio, el transporte bacteriano en presencia de exudados adsorbidos previamente a la arena, no se vio afectado por la concentración utilizada. Los valores de C/C0 fueron similares al comienzo de la salida bacteriana, 0,63 para la alta concentración de carbono, y 0,68 para la baja. Estos datos apoyan la idea de la respuesta táctica como efecto promotor del transporte bacteriano que, como se vio anteriormente, es independiente de la concentración de carbono orgánico. Por lo que la quimiotaxis frente a exudados sería más efectiva que bombear AH o el fertilizante oleofílico, ya que el efecto promotor del transporte es el mismo a menor concentración de carbono. 124 Resultados Además, cabe destacar que el fertilizante presentó un valor de ángulo de contacto sobre la superficie de arena en ausencia de bacterias de 109 ± 3,6 º en comparación al valor del MM en contacto con la arena, 16 ± 2,6 º, indicando, por tanto, la hidrofobicidad del compuesto. Ello da idea de la complejidad de las interacciones que podrían darse entre las moléculas del fertilizante oleofílico y la superficie de arena, desencadendantes del aumento de transporte bacteriano. Los valores de hidrofobicidad y carga superficial del resto de compuestos no fueron significativamente diferentes con respecto al control (MM). Se comprobó, además, que el volumen de poro en presencia de materia orgánica no cambió significativamente con respecto al control. El conjunto de estos datos contribuyen al refuerzo de la hipótesis de que el patrón de movilidad es determinante en el transporte y deposición de las células bacterianas en las columnas empaquetadas con arena. IV.6.6 AUSENCIA DE RESPUESTA QUIMIOTÁCTICA IV.6.6.1 Efecto de la fuente de cultivo en el transporte bacteriano La quimiotaxis de Pseudomonas putida G7 hacia naftaleno es un fenómeno inducible (Grimm y Harwood, 1997), puesto que es necesaria la exposición a este durante el crecimiento de la estirpe (o bien un intermediario de su ruta de degradación) para que se transcriban los genes codificadores de la respuesta quimiotáctica (receptores y transductores de la señal). De ahí que hayamos utilizado el salicilato sódico (intermediario de la ruta de degradación del naftaleno) como fuente de carbono y asegurarnos, así, la capacidad quimiotáctica de la estirpe Pseudomonas putida G7 en todo momento. Se probó el efecto de una fuente de cultivo distinta a salicilato para comprobar que la taxis positiva a naftaleno era inexistente durante el transporte bacteriano. Se utilizaron dos compuestos diferentes, descritos en el epígrafe IV.2.1, donde se estudió la curva de crecimiento en función de la fuente de carbono usada por el microorganismo. No hubo evidencia de aumento del transporte bacteriano en presencia de naftaleno (figura IV.35). Las curvas de rotura en presencia y ausencia de quimioefector son muy parecidas, lo que indicó que la ausencia de quimiotaxis a naftaleno no provocó un aumento del transporte. Al no haber crecido con naftaleno 131 Resultados (o algún intermediario de su ruta de degradación), los genes que codifican para los receptores de la respuesta táctica a naftaleno no estaban inducidos. Así pues, no hubo diferencias significativas entre el transporte bacteriano en ausencia y presencia de naftaleno. La fuente de carbono distinta afectó al transporte bacteriano, ya que se observó una modificación de la curva de rotura típica obtenida en ausencia de quimioefector (cuando las bacterias crecieron con salicilato sódico). En el caso del cultivo en triptona, aunque la hidrofobicidad y carga superficial no variaron con respecto a la superficie bacteriana cuando se cultivó en salicilato, posiblemente la composición y/o distribución de los componentes de la membrana celular sea diferente, haciendo que se favoreciera el transporte bacteriano en vez de la adhesión (figura IV.35a). En el caso del acetato, la movilidad celular fue tan reducida que el aumento de transporte, en este caso, fue debido a la escasa interpeción por el colector en ausencia de movilidad (que conlleva cambios en la dirección de movimiento para interaccionar con la superficie de arena) (figura IV.35b). Además, la superficie celular fue más hidrofílica cuando la bacteria se cultivó en salicilato, lo que pudo haber contribuido al aumento de transporte por repulsiones electrostáticas con la arena (tambíen hidrofílica). 132 Resultados 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 012345 Volumen de poro C/Cº 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0246 Volumen de poro C/C0 b a Figura IV.35 Transporte bacteriano en ausencia (○) y presencia de naftaleno (●) cuando el cultivo bacteriano de Pseudomonas putida G7 se preparó a base de triptona (a) y acetato (b)como fuente de carbono. La ausencia de quimiotaxis bacteriana a naftaleno, y su intermediario de la ruta de degradación, salicilato, fue comprobada mediante ensayos capilares para el caso de la triptona (fig IV.36). El acetato no constituyó una fuente energética para el microorganismo y el ensayo capilar no fue posible (la movilidad celular era muy reducida cuando la bacteria se cultivó en acetato). El número de células que entró en los capilares que contenían naftaleno y salicilato fue incluso menor que el control, aunque las diferencias no fueron significativas (P=0,01). 133 Resultados 0 50 100 150 200 250 300 Salicilato Naftaleno ufc x 10 / capilar a a a a Figura IV.36 Ausencia de quimiotaxis positiva hacia salicilato y naftaleno cuando Pseudomonas putida G7 se cultivó usando triptona como fuente de carbono. IV.6.6.2 Mutante defectuoso en la quimiotaxis hacia exudados de girasol El mutante 91 se seleccionó para corroborar el papel de la quimiotaxis a exudados en el aumento del transporte bacteriano en las columnas, ya que se seleccionó por ser deficiente en la respuesta quimiotáctica hacia salicilato y exudados a concentración de 129 mg L-1, tal como puede observarse en la figura IV.37 del ensayo capilar de atracción. El número de células que entró en los capilares que contenían exudados y salicilato no fue significativamente diferente al número de células que había dentro de los capilares que sólo contenían medio de mineralización (P=0,01). 134 Resultados 0 50 100 150 200 250 300 Exudados Salicilato ufc x 10 / capila r a a a a Figura IV.37 Deficiencia de quimiotaxis positiva hacia salicilato y exudados de raíces de girasol de la estirpe mutante 91 El transporte del mutante 91 fue mayor cuando los exudados, a concentración de 129 mg L-1, estuvieron presentes en las columnas como materia orgánica disuelta, poniendo de manifiesto que la menor deposición en la arena se debió a la competencia que existe entre los exudados y las células bacterianas por los sitios de interacción en el colector de arena (figura IV.38a). Mientras que la reversión del transporte de células previamente adheridas, fue menor en el caso del mutante que para el caso de la estirpe silvestre P. putida G7 que sí tiene capacidad quimiotáctica frente a los exudados que fueron bombeados para provocar el transporte de las células adheridas (figura IV.38b). 135 Resultados 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0246 Volumen de poro C/C 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 024 Volumen de poro C/C 0 ab 6 Figura IV.38 En a, transporte bacteriano del mutante 91 en presencia (▲) y ausencia de (Δ) de exudados a 129 mg L-1, en comparación al transporte de la estirpe silvestre Pseudomonas putida G7 en presencia (■) y ausencia de (□) de exudados a 129 mg L-1. En b, movilización de bacterias mutantes adheridas (▲) y bacterias silvestres (■) con el bombeo de exudados a 129 mg L-1 Este ensayo contituye un refuerzo para la hipótesis de que el patrón de movilidad seguido por la bacteria cuando detectó los exudados en solución fue una de las causas por las que aumentó el transporte bacteriano. Se ha comprobado que en ausencia de quimiotaxis, el efecto de los exudados en la reversión del transporte de bacterias adheridas fue menor para el caso del mutante 91 que para el de la silvestre P. putida G7. 136 Resultados IV.7 INFLUENCIA DEL PATRÓN DE MOVILIDAD BACTERIANO EN LA BIODEGRADACIÓN DE NAFTALENO Los ensayos de biodegradación se llevaron a cabo con el objetivo de determinar si el aumento de transporte observado al modificar el patrón de movilidad podría conllevar a un aumento de la degradación de naftaleno en condiciones de baja biodisponibilidad (naftaleno adsorbido en las anillas de silicona) en un sistema poroso. Para ello, los experimentos se llevaron a cabo en las mismas columnas de percolación y bajo las mismas condiciones de ensayo que para el estudio del transporte bacteriano. La biodegradación se determinó según la cantidad de 14C-naftaleno mineralizado. Se seleccionaron como efectores tácticos, exudados (16 mg L-1) y NPsAg (0,2 mg L-1). IV.7.1 BIODEGRADACIÓN DE NAFTALENO EN COLUMNAS DE TRANSPORTE Para la representación gráfica de la biodegradación de naftaleno en presencia y ausencia de los efectores tácticos, se midió la cantidad (en ng) de 14C-naftaleno mineralizado en las columnas de transporte. La mineralización de naftaleno por parte de P. putida G7 fue mayor en presencia de ambos compuestos, en comparación a la mineralización detectada en su ausencia (figura IV.39). La tasa de mineralización en presencia de exudados y NPsAg fue de 278 ± 51 ng mL·h-1 y 441 ± 63 ng mL·h-1 respectivamente, en comparación a la tasa de mineralización máxima en el control, 191 ± 39 ng mL·h-1. Las diferencias fueron significativas con respecto al control para P=0,05. Cabe destacar que la mineralización en ausencia de efector táctico fue mayor de lo esperado, lo que puede explicarse por el efecto quimioefector positivo que supondría el naftaleno desorbido de la anilla debido al flujo del fluido. La detección quimiotáctica del naftaleno, hizo que las bacterias se dirigieran hacia el extremo final de las columnas de manera más eficaz que cuando no hubo naftaleno. Esto se ha comprobado por el perfil de la curva de rotura, siendo el valor de C/C0 igual a 0,2 a (1,5 VP), mientras que en ausencia de naftaleno, el valor de C/C0 fue 0,04 (a 1, 6 VP). 137 Resultados 0 500 1000 1500 2000 024681012 Volumen de poro 14C-Naftaleno mineralizado (ng) Figura IV.39 Mineralización de naftaleno marcado con 14C en ausencia (□) y presencia de exudados vegetales a 16 mg L-1(■) y de NPsAg a 0,2 mg L-1(▲) en las columnas empaquetadas con arena El fenómeno que explica el aumento de la biodegradación de naftaleno es diferente para cada efector táctico utilizado, y puede relacionarse con el efecto de los compuestos sobre el patrón de movilidad bacteriano y la adhesión a la arena, tal como se refleja en la tabla IV.13. Los valores del naftaleno desorbido en cada tratamiento pueden explicar los datos de mineralización obtenidos. Los exudados aumentaron la biodisponibilidad del naftaleno adsorbido, haciendo que la desorción fuese mayor (tanto a 2 como a 6 VP). Mientras que las NPsAg no afectaron a la desorción de naftaleno desde la anilla, no habiendo diferencias significativas entre los valores de desorción (a 2 y 6 VP) en ausencia y presencia de nanopartículas. La explicación a este fenómeno está en la adhesión bacteriana inducida por el patrón de movilidad. En presencia de NPsAg, la alta frecuencia de cambios de dirección, provocó una mayor adhesión a la arena y a la anilla, lo que condujo a un aumento de la degradación del naftaleno adsorbido mediante las bacterias adheridas. En el caso de los 138 Resultados exudados, la mineralización fue mayor por el aumento de la biodisponibilidad del naftaleno debido la movilización de las células a lo largo del perfil de arena hasta el extremo final de las columnas (donde se encontraba el foco del contaminante). El escaso número de cambios de dirección en el patrón de movilidad bacteriano en presencia de exudados, provocó que las bacterias se dirigiesen de una forma más eficiente hacia el foco de contaminación. Tabla IV.13 Influencia de la quimiotaxis bacteriana en la biodegradación de naftaleno en las columnas a Los valores corresponden a la media ± desviación estándar. b Los valores experimentales finales están dados entre paréntesis como una indiciación del bloqueo de filtro. c RCDI, sumatorio del número de cambios de dirección superiores a 1000 º s-1. d C/C0, Eficiencia de salida bacteriana a través de las columnas. e VP, Volumen de poro. f, Ndes, naftaleno desorbido desde la anilla. g, Nmin, naftaleno mineralizado. h, Ncol, naftaleno desorbido no degradado acumulado en las columnas. i, Los datos del control están tomados del experimento con exudados vegetales. Análisis a de movilidad Adhesión (%) a Transporte b bacteriano Mineralización a Efector táctico RCDI c Arena Anilla C/C0 d VP e Ndes f (ng) Nmin g (ng) Ncol h (ng) Ninguno i 51 ± 0,7 38± 2 46 ± 0,2 0,1 (0,3) 2,3 (6,0) 850 ± 17 (772 ± 130) 67,3 ± 5 (191± 70) 980 ± 425 Exudados 16 mg L-1 13 ± 0,1 9 ± 1 31 ± 2 0,6 (0,8) 2,6 (6,6) 1000 ± 89 (989 ± 217) 332 ± 32 (266± 3,5) 531 ± 237 NPsAg 0,2 mg L-1 114 ± 3 58 ± 4 55 ± 2 0,7 (0,6) 3,1 (6,3) 886 ± 374 (789 ± 66) 375 ± 59 (654 ± 112) 258 ± 80 En la gráfica IV.40 se representa el % de naftaleno desorbido (estimado como 14C eluído total frente al tiempo) desde la anilla en presencia de exudados (A) y de nanopartículas (B). Nótese que en B por razones desconocidas la cantidad de naftaleno desorbido desde la anilla, en ausencia de NPsAg, fue menor que en el experimento con exudados 139 Resultados ( figura IV.40A), llegando casi al 4 %, mientras que la otra vez casi se alcanzó el 6%. 0 2 4 6 8 01234 Tiempo (h) % naftaleno desorbido 0 2 4 6 8 0123 Tiempo(h) % naftaleno desorbido A B 4 Figura IV.40 Desorción de naftaleno desde la anilla de silicona colocada en el extremo final de columnas empaquetadas de arena en presencia (■) y ausencia (□) de exudados vegetales (A) y NPsAg (B) Aunque hubo menos desorción de naftaleno con NPs y (su control), la biodegradación fue mayor para NPsAg, pero en el control, la biodegradación fue prácticamente igual a la representada en la figura IV.39 (datos no mostrados). En el caso de las NPs, precisamente es la razón que apoya la hipótesis de que hay más degradación porque hay más adhesión a la anilla. Aunque la desorción sea más lenta, la mineralización no dependió del naftaleno desorbido, sino de la adhesión bacteriana. En el caso del control, la mineralización fue prácticamente igual a la del control con el experimento de exudados, por lo que se pone en evidencia que la actividad degradadora de la bacteria fue siempre la máxima, independientemente del naftaleno que hubiera para degradar. De esta manera, las diferencias que hemos visto entre NPsAg y exudados pueden atribuirse a los efectos que causan estos compuestos en la adhesión y la 140