Extractos de Agaricus bisporus como moduladores de la replicación del virus de la Hepatitis C y de la progresión de la fibrosis hepática, inflamación y estrés oxidativo. Papel del complejo NLRP3 inflamasoma en la enfermedad hepática

Paloma Gallego Yerga Tesis Doctoral Sevilla, 2020 Extractos de Agaricus bisporus como moduladores de la replicación del virus de la Hepatitis C y de la progresión de la fibrosis hepática, inflamación y estrés oxidativo. Papel del complejo NLRP3 inflamasoma en la enfermedad hepática. 2 3 4 UGC de Enfermedades Digestivas & CIBERehd Extractos de Agaricus bisporus como moduladores de la replicación del virus de la hepatitis C y de la progresión de la fibrosis hepática, inflamación y estrés oxidativo. Papel del complejo NLRP3 inflamasoma en la enfermedad hepática. TESIS DOCTORAL Paloma Gallego Yerga Sevilla, 2020 5 6 UGC de Enfermedades Digestivas & CIBERehd Extractos de Agaricus bisporus como moduladores de la replicación del virus de la hepatitis C y de la progresión de la fibrosis hepática, inflamación y estrés oxidativo. Papel del complejo NLRP3 inflamasoma en la enfermedad hepática. Memoria presentada por la Graduada Paloma Gallego Yerga para optar al título de Doctora por la Universidad de Sevilla Sevilla, 2020 7 8 El presente trabajo ha sido realizado por la Graduada en Bioquímica Paloma Gallego Yerga, con DNI 28836549-T, en la Unidad Clínica de Gestión (UCG) de Enfermedades Digestivas & CIBERehd del Hospital Universitario Ntra. Sra. Virgen de Valme, Sevilla, bajo la dirección del Dr. José Antonio del Campo Castillo y de la Dra. Lourdes Grande Santamaría. Los directores del trabajo: Fdo.: Dr. José Antonio del Campo Castillo Fdo.: Dra. Lourdes Grande Santamaría 9 16 “En algún lugar, algo increíble está esperando ser conocido” Carl Sagan 17 18 A mis padres A mi tata 19 20 ÍNDICE 21 22 ÍNDICE DE CONTENIDOS ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................. 30 INDICE DE TABLAS ............................................................................................... 38 RESUMEN ................................................................................................................ 42 ÍNDICE DE ABREVIATURAS ................................................................................ 50 1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 60 1.1. El hígado y la enfermedad hepática ............................................................ 60 1.2. Hepatitis C como enfermedad hepática ...................................................... 60 1.2.1. Estructura del virus de la Hepatitis C .............................................................................. 61 1.2.2. Variabilidad genética del virus de la Hepatitis C y sus implicaciones .............................. 63 1.2.3. Ciclo de replicación del virus de la Hepatitis C............................................................... 65 1.2.4. Sistema de infección in vitro .......................................................................................... 68 1.3. Enfermedad del hígado graso no alcohólica (EHGNA) ............................. 69 1.3.1. EHGNA y metabolismo lipídico..................................................................................... 70 1.3.2. EHGNA, estrés oxidativo y lipotoxicidad ....................................................................... 71 1.3.3. EHGNA, inflamación e inflamasoma ............................................................................. 72 1.3.4. EHGNA y fibrosis hepática ............................................................................................ 74 1.4. Tratamientos actuales en la enfermedad hepática ..................................... 76 1.4.1. Tratamientos actuales frente a la hepatitis C ................................................................... 76 1.4.2. Tratamientos actuales frente a la EHGNA y fibrosis hepática ......................................... 79 1.5. Tratamientos naturales con extractos de hongos ....................................... 82 23 1.5.1. Tratamientos naturales en la Hepatitis C ......................................................................... 82 1.5.2. Tratamientos naturales en la EHGNA y fibrosis hepática ................................................ 85 1.5.3. Agaricus bisporus y sus propiedades terapéuticas ........................................................... 86 2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 90 3. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................... 94 3.1. Reactivos ...................................................................................................... 94 3.2. Preparación y caracterización de extractos de champiñones .................... 97 3.2.1. Preparación del extracto de Agaricus bisporus (AbAEE) ................................................ 97 3.2.2. Fraccionamiento del extracto crudo AbAEE para ensayo in vitro NS3/4A del VHC ........ 99 3.2.3. Análisis químico de las diferentes fracciones de AbAEE .............................................. 100 3.3. Líneas celulares y técnicas de cultivo celular ........................................... 101 3.3.1. Línea celular de hepatoma humano Huh7.5 .................................................................. 101 3.3.2. Línea celular estrellada hepática LX2 ........................................................................... 101 3.3.3. Generalidades para el cultivo celular ............................................................................ 101 3.3.4. Descongelación de células............................................................................................ 102 3.3.5. Preparación de la línea celular para su uso .................................................................... 102 3.3.6. Conteo celular .............................................................................................................. 103 3.4. Infección de células Huh7.5 por VHC. Producción de partículas virales 104 3.5. Tratamiento de líneas celulares con extractos de Agaricus bisporus ....... 105 3.5.1. Ensayos para determinar los efectos citotóxicos del extracto de Agaricus bisporus en células 105 3.5.2. Tratamiento de Huh7.5 con extractos de Agaricus bisporus y quercetina ...................... 105 24 3.5.3. Tratamiento de células LX2 con extractos de Agaricus bisporus ................................... 105 3.6. Modelos animales ...................................................................................... 106 3.6.1. Ensayos para determinar los efectos citotóxicos del extracto de Agaricus bisporus en animales 106 3.6.2. Modelo animal KO LDLr ............................................................................................. 108 3.6.3. Modelo animal KO NLRP3 .......................................................................................... 110 3.7. Ensayo fluorimétrico proteasa NS3/4A del virus de Hepatitis C ............. 111 3.8. Extracción de ADN total con TRISURETM .............................................. 113 3.8.1. Extracción de ADN de homogenado celular de Huh7.5 infectadas con VHC y de LX2 . 113 3.8.2. Extracción de ADN de homogenado tisular hepático de ratones KO LDLr ................... 114 3.9. Transcripción inversa ............................................................................... 114 3.10. Extracción de proteínas............................................................................. 115 3.10.1. Extracción de proteínas de homogenado celular de Huh7.5 infectadas con VHC y de LX2 115 3.10.2. Extracción de proteínas de homogenado tisular hepática de ratones KO NLRP3 .......... 115 3.11. Análisis de expresión génica en células LX2 y tejidos hepáticos: PCR ... 116 3.12. Determinación de los niveles de ARN y proteínas del VHC en células Huh7.5 infectadas con VHC ............................................................................................. 117 3.13. Análisis de expresión proteica en células Huh7.5 infectadas con VHC, células LX2 y tejidos hepáticos: WESTERN-BLOT ............................................................... 117 3.14. Evaluación histológica del hígado ............................................................. 119 3.15. Análisis de actividad SOD ......................................................................... 120 25 3.16. Análisis estadístico..................................................................................... 121 4. RESULTADOS................................................................................................. 124 4.1. EXTRACTOS NATURALES DE CHAMPIÑONES (AGARICUS BISPORUS) SIN EFECTO CITOTÓXICO EN CÉLULAS Y ANIMALES. ................................ 124 4.2. EXTRACTOS NATURALES DE CHAMPIÑONES (AGARICUS BISPORUS) COMO INHIBIDORES DE LA REPLICACIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C. 127 4.2.1. Fracciones de bajo peso molecular AbAEE inhiben a la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C ................................................................................................................................... 127 4.2.2. Fracciones solubles AbAEE inhiben a la proteasa NS3/4A del virus de la Hepatitis C ... 128 4.2.3. El extracto AbAEE presenta capacidad de inhibición de diferentes genotipos de proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C ............................................................................................... 130 4.2.4. El extracto AbAEE impide la replicación viral del virus de la hepatitis C ...................... 132 4.2.5. Caracterización química del extracto AbAEE ............................................................... 135 4.3. EXTRACTOS NATURALES DE CHAMPIÑONES (AGARICUS BISPORUS) COMO MODULADORES DE LA FIBROSIS, ESTRÉS OXIDATIVO E INFLAMACIÓN HEPÁTICA IN VITRO Y EN UN MODELO ANIMAL DE EHGNA. 139 4.3.1. El tratamiento de células LX2 con extractos de AbAEE reducen los niveles de marcadores fibróticos y estrés oxidativo e incrementan los niveles del factor protector GATA4. .................... 139 4.3.2. Los extractos AbAEE regulan el peso corporal de los ratones EHGNA alimentados con dieta alta en grasa. ....................................................................................................................... 143 4.3.3. Los extractos AbAEE reducen los niveles génicos de marcadores fibróticos y de estrés oxidativo en ratones EHGNA. ..................................................................................................... 145 32 Figura 23. Niveles de expresión génica del marcador de estrés oxidativo Sod2 en células LX2 tratadas con AbAEE durante 24 horas. (Pág 142) Figura 24. Niveles de expresión génica del marcador de estrés oxidativo Nos2 en células LX2 tratadas con AbAEE durante 24 horas. (Pág 143) Figura 25. Peso corporal y parámetros bioquímicos en sangre (niveles de glucosa y niveles de GOT/AST) en ratones knock-out (KO) del receptor de LDL (LDLr-/-) durante 12 semanas de intervención nutricional con AbAEE. (Pág 145) Figura 26. Niveles de expresión génica de marcadores de fibrosis fibróticos COL-1α-1 y GATA4 en muestras de hígados de ratones knock-out (KO) del receptor de LDL (LDLr-/-) tras 12 semanas de intervención nutricional con AbAEE. (Pág 146) Figura 27. Niveles de expresión génica de marcadores de estrés oxidativo Sod2 y Nos2 en muestras de hígados de ratones knock-out (KO) del receptor de LDL (LDLr-/-) tras 12 semanas de intervención nutricional con AbAEE. (Pág 147) Figura 28. Análisis histológico del daño en el hígado inducidos por una dieta alta en grasa (HFD, del inglés High Fat Diet) en ratones knock-out (KO) del receptor de LDL (LDLr-/-) y cuantificación de fibras de colágeno y células positivas para GATA4 tras un período de 12 semanas de intervención nutricional con AbAEE. (Pág 148) Figura 29. Análisis de la inflamación inducida por una dieta alta en grasa (HFD, del inglés High Fat Diet) en ratones knock-out (KO) del receptor de LDL (LDLr-/-) y cuantificación de células positivas para MOMA-2 tras un período de 12 semanas de intervención nutricional con AbAEE. (Pág 149-150) 33 Figura 30. Peso corporal, ingesta de alimentos y parámetros bioquímicos (niveles de glucosa y colesterol) en ratones knock-out (KO) del complejo NLRP3 inflamasoma (NLRP3-/-) y ratones control (WT, del inglés wild type) durante 20 meses. (Pág 153) Figura 31. Niveles de expresión proteica del marcador de metabolismo lipídico MTP en muestras de hígados de ratones knock-out (KO) del complejo NLRP3 inflamasoma (NLRP3-/-) y ratones control (WT, del inglés wild type) tras un período de 20 meses. (Pág 154) Figura 32. Niveles de expresión proteica del marcador de metabolismo lipídico FASN en muestras de hígados de ratones knock-out (KO) del complejo NLRP3 inflamasoma (NLRP3-/-) y ratones control (WT, del inglés wild type) tras un período de 20 meses. (Pág 155) Figura 33. Niveles de expresión proteica del marcador de metabolismo lipídico DGAT1 en muestras de hígados de ratones knock-out (KO) del complejo NLRP3 inflamasoma (NLRP3-/-) y ratones control (WT, del inglés wild type) tras un período de 20 meses. (Pág 156) Figura 34. Niveles de actividad SOD en muestras de hígados de ratones knock-out (KO) del complejo NLRP3 inflamasoma (NLRP3-/-) y ratones control (WT, del inglés wild type) tras un período de 20 meses. (Pág 157) Figura 35. Niveles de expresión proteica del marcador de estrés oxidativo PTPRG en muestras de hígados de ratones knock-out (KO) del complejo NLRP3 inflamasoma (NLRP3-/-) y ratones control (WT, del inglés wild type) tras un período de 20 meses. (Pág 158) Figura 36. Análisis histológico del daño en el hígado en ratones knock-out (KO) del complejo NLRP3 inflamasoma (NLRP3-/-) y ratones control (WT, del inglés wild type). Tinción tricrómica de Masson y aspecto de hígados de ratones. (Pág 159) 34 Figura 37. Niveles de expresión proteica del marcador fibrótico COL-1α-1 en muestras de hígados de ratones ratones knock-out (KO) del complejo NLRP3 inflamasoma (NLRP3-/-) y ratones control (WT, del inglés wild type) tras un período de 20 meses. (Pág 160) Figura 38. Niveles de expresión proteica del marcador fibrótico TPM2β en muestras de hígados de ratones ratones knock-out (KO) del complejo NLRP3 inflamasoma (NLRP3-/-) y ratones control (WT, del inglés wild type) tras un período de 20 meses. (Pág 161) Figura 39. Niveles de expresión proteica del marcador fibrótico GATA4 en muestras de hígados de ratones ratones knock-out (KO) del complejo NLRP3 inflamasoma (NLRP3-/-) y ratones control (WT, del inglés wild type) tras un período de 20 meses. (Pág 162) 35 36 ÍNDICE DE TABLAS 37 38 INDICE DE TABLAS Tabla 1. Tratamientos actuales frente a la Hepatitis C. (Pág 78) Tabla 2. Anticuerpos para medición de expresión proteica usados en el estudio. (Pág 94) Tabla 3. Cebadores para medición de expresión génica usados en el estudio. (Pág 95) Tabla 4. Kits y reactivos utilizados para los diferentes experimentos desarrollados en el estudio. (Pág 96-97) Tabla 5. Resultado del procesamiento de Agaricus bisporus (Pág 99) Tabla 6. Distribución de los grupos de ratas controles y tratados con AbAEE por sexo y dosis del extracto para el estudio preliminar de toxicidad de AbAEE. (Pág 107) Tabla 7. Composición de macronutrientes de las dietas experimentales de los ratones knock-out (KO) del receptor de LDL (LDLr-/-) . (Pág 109) Tabla 8. Viabilidad y toxicidad en células Huh7.5 usando diferentes concentraciones de AbAEE. (Pág 124) Tabla 9. Viabilidad y toxicidad en células LX2 usando diferentes concentraciones de AbAEE. (Pág 125) Tabla 10. Toxicidad aguda (estudio preliminar de toxicidad) en ratas tratadas con dosis de 5000 mg/kg de AbAEE. (Pág 126) Tabla 11. Lista de metabolitos identificados por LC/MS-QTOF en las diferentes fracciones de AbAEE: fracciones UF-3kDa, AcF-3kDa y fracciones orgánicas HF-3kDa, DCM-3kDa y EAF3kDa agrupadas obtenidas por extracción líquido-líquido (ELL) secuencial. (Pág 137-138) 39 40 RESUMEN 41 48 ABREVIATURAS 49 50 ÍNDICE DE ABREVIATURAS %: Tanto por ciento λexc/em: Longitud de onda de excitación/emisión A - AbAEE: Extractos enzimáticos acuosos de Agaricus bisporus (del inglés, Agaricus bisporus Aqueous Enzymatic Extract) - ACC: acetil-CoA carboxilasa - AcF: Fracción de AbAEE acuosa 3 kDa - AAD: Antivirales de acción directa - ADN: ácido desoxirribonucleico - AEF-3kDa: Fracción de AbAEE en acetato de etilo 3 kDa - AGs: Ácidos grasos - AL: agua de lavado - ARN: Ácido ribonucleico - ASC: del inglés Apoptosis-associated Speck-like Protein - TA: Toxicidad aguda B: - BPV: Boceprevir C: - C: Core o núcleo - CCl4: Tetracloruro de carbono - CEH: Células estrelladas hepáticas - CHC: Carcinoma hepatocellular 51 - ChREBP: Proteína de unión al elemento de respuesta de carbohidratos (del inglés, Carbohydrate-response element-binding protein) - CL: cromatografía líquida - CM: Características moleculares - cm2: centímetro cuadrado - CO2: Dióxido de carbono - Ct: Valor del ciclo umbral - DMF-3kDa: Fracción de AbAEE en diclorometano 3 kDa D: - DEPC: dietilpirocarbonato - DGAT: Diacilglicerol aciltransferasa - DMEM: del inglés, Dulbecco’s Modified Eagle Medium - DMN: dimetilnitrosamina - DMSO: Dimetilsulfóxido - DTT: Ditiotreitol E: - E: Enzima - EDTA: Ácido etilendiamiltetracético - EHGNA: Enfermedad de hígado graso no alcohólica - EHNA: Esteatohepatitis no alcohólica - ENA: Esteatosis no alcohólica - eIF: Factor de iniciación eucariota (del inglés, eukaryotic initiation factor) - ELL: Extracción líquido-líquido - EM: Espectrómetro de masas 52 - EROS: Especies reactivas de oxígeno - ET: Ergotioneina - EtOH: etanol F: - FAS: Ácido graso sintasa (del inglés Fatty Acid Synthase) - FDA: Administración de Alimentos y Medicamentos (del inglés Food and Drug Administration) G: - g: Fuerza centrífuga relativa - g: Gramo - GAPDH: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa H: - H2Od: Agua destilada - HCl: Cloruro sódico - HDL: Lipoproteína de alta densidad (del inglés High density lipoprotein) - HF-3kDa: Fracción de AbAEE en hexano 3 kDa - HFD/HFD+AB: Dieta alta en grasa (del inglés High Fat Diet) sin extracto de Agaricus bisporus / con extracto de Agaricus bisporus - HRP: peroxidasa del rábano picante (del inglés, horseradish peroxidase) - HSPs: Proteínas de shock térmico (del inglés, Heat shock proteins) - HSPGs: proteoglicanos heparán sulfato (del inglés heparan sulfate proteoglycans) - Huh7.5: Línea celular de hepatoblastoma derivada de Huh7 - Huh7: Línea celular de hepatoblastoma 53 - HVR: Región hipervariable (del inglés, hypervariable region) I: - IFN: Interferón - IL: interleuquina - iNOS: Óxido nítrico sintasa inducible (del inglés inducible nitric oxide synthase) - Ip: Índice de polaridad - IRES: Región interna de entrada al lugar ribosomal (del inglés Internal Ribosome Entry Sites) - ISDR: Región determinante de la sensibilidad al interferón (del inglés, interferon sensitivity determining region) J: - JAK-STAT: Janus Kinase-Signal Transducers and Activators of Transcription - JFH-1: Hepatitis japonesa fulminante (del ingles, Japanese fulminant hepatitis) K: - Kb: Kilobase - KCl: Cloruro de potasio - kDa: Kilodalton - KO: Knock-out L: - LC-MS: Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (del inglés Liquid chromatography-tandem mass spectrometry) - LDL: Lipoproteína de baja densidad (del inglés, Low density lipoprotein) 54 - LDLr: receptor LDL - LDs: Gotas lipídicas (del inglés, lipid droplets) - LFD/LFD+AB: Dieta baja en grasa (del inglés, Low Fat Diet) con extracto de Agaricus bisporus/ sin extracto de Agaricus bisporus - LVP: Lipoviropartícula - LX2: Línea Celular estrellada hepática M: - MEC: matriz extracelular - Met-ARNt: Metionil-ARN transferente - mg: Miligramo - mL: Mililitro - mM: Milimolar - MMP: Metaloproteinasas - MOI: multiplicidad de infección (del inglés, multiplicity of infection) - MTTP: Proteína de transferencia de triglicéridos microsomal (del inglés, Microsomal Trygliceride Transfer Protein) - μg: Microgramo N: - NaOH: Hidróxido sódico - ng: Nanogramo - NLR: Receptores de tipo NOD - nm: Nanómetro - nM: Nanomolar 55 O: - OMS: Organización Mundial de la Salud - oXLDL: partículas de LDL oxidadas P: - PBS: del inglés, Phosphate-buffered salin - PDGF: Factor de crecimiento derivado de plaquetas (del inglés, platelet derived growth factor) - PRR: Receptores de reconocimiento de patrones (del inglés, Pattern Recognition Receptor) - PTPRG: Receptor de la proteína tirosina fosfatasa tipo G (del inglés, Protein Tyrosine Phosphatase Receptor Type G) R: - RBV: Ribavirina - RE: Retículo endoplasmático - RI: Resistencia a insulina - RIG-I: Gen I inducible de ácido retinoico citosólico - RNAsa: Ribonucleasa - RT: Retrotranscripción - RT-qPCR: Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real del inglés Real Timequantitative polymerase chain reaction S: - S: Sustrato - SFB: Suero fetal bovino 56 - SM: Síndrome Metabólico - SOD: Superóxido dismutasa - SRB1: Receptor scavenger tipo I clase B (del inglés, Scavenger Receptor class B type 1) - SREBP-1c: Proteína de unión al elemento regulador de esteroles (del inglés, Sterol Regulatory Element-Binding Protein 1c) T: - TGF-β1: Factor transformador de crecimiento β1 (del inglés, Transforming growth factor β1) - TGs: Triacilglicéridos - TIMP: Inhibidores tisulares de las metaloproteinasas (del inglés, Tissue Inhibitors of Metalloproteinases) - TNF-α: Factor de necrosis tumoral alfa (del inglés, Tumor Necrosis Factor Alpha) - TPM: Tropomiosina - TPV: Telaprevir - Tris: Tris (hidroximetil) aminometano - TRIsure: Tiocianato de guanidina U: - U/mL: Unidades por mililitro - U/μL: Unidades por microlitro - UF: Ultrafiltrado V: - VHC: Virus de la hepatitis C - VLDL: Lipoproteína de muy baja densidad (del inglés, Very low density lipoprotein) 57 64 explican la alta capacidad de mutación del VHC, generando una población heterogénea de genomas relacionadas entre sí (homología >98%), y denominadas cuasiespecies 15,16. El virus de la hepatitis C, además, contiene tres regiones hipervariables (HVR) que incrementan su variabilidad genética. De las tres, la región HVR1 localizada en el extremo Nterminal de la proteína E2 se considera la principal diana de la respuesta inmune. Contiene tres microdominios con tres funciones diferentes, entre las que se encuentran la de servir de unión entre E2 y receptores de clase B, la de facilitar la entrada del virus HCV y la neutralización de anticuerpos 17. Por otro lado, las regiones hipervariables HVR2 y HVR3 están implicadas en la entrada del virus a la célula y en el proceso de unión de éste, respectivamente 18. La acumulación de mutaciones acumuladas en estas regiones debido a la alta tasa de error de la enzima polimerasa y la alta tasa de replicación del virus, incrementa el número de variantes intergenoma del virus, lo que da lugar a los genotipos y subtipos 19. Los genotipos son los genomas con grado de homología entre el 66 y el 69 %, y existen siete hasta el momento (genotipos 1-7). Estos genotipos se subdividen a su vez en subgenotipos o subtipos, cuando el grado de homología se encuentra entre el 77 y el 80 % (genotipo 1a, 1b, 3a, entre otros), existiendo 67 subtipos. Finalmente, si el grado de homología es superior al 91-95 %, se denominan aislados 20. Esta hipervariabilidad permite al virus evadir al sistema inmune, contribuyendo a que las infecciones permanezcan, y a que el tratamiento antiviral no tenga una respuesta eficiente. Además, la variabilidad genética tiene gran importancia en la epidemiología del VHC, pues ésta se basa en la divergencia de genotipos debido a los cambios de sus secuencias de nucleótidos. El primer ancestro común del VHC apareció hace más de 2000 años. Desde entonces, y debido a las migraciones y transfusiones sanguíneas, entre otros motivos, se generó la divergencia geográfica. De este modo, los genotipos 1,2 y 3 son los más comunes, más 65 repartidos y responsables de la mayoría de las enfermedades de hepatitis C. En concreto, abundan en Estados Unidos, Japón y Europa Occidental. En África del Norte predomina el genotipo 4, mientras que, en África del Sur, el genotipo 5. En el sudeste asiático prevalece el genotipo 6, mientras que el 7, con menor relevancia clínica, abunda en paciente de África central y Tailandia 21 (Figura 3). Figura 3. Distribución geográfica de los genotipos del virus de la Hepatitis C (VHC). 1.2.3. Ciclo de replicación del virus de la Hepatitis C El ciclo de replicación del virus de la hepatitis C es un tema del cual no se tienen claras referencias debido a la carencia de modelos in vitro e in vivo eficientes de este virus. Es por ello por lo que los mecanismos moleculares que subyacen al virus de replicación no están completamente descifrados debido a su extrema complejidad. Aun así, y gracias a la información de otros virus pertenecientes a la familia de flavivirus y a la caracterización de las proteínas recombinantes del VHC, se conocen algunas claves importantes en el proceso de replicación viral. El primer paso en el ciclo de replicación viral es la entrada a la célula a través de la interacción de las glicoproteínas E1 y E2 del virus con la membrana basolateral del hepatocito. En esta etapa es 66 importante destacar la asociación del VHC a lipoproteínas. Estas lipoproteínas forman un complejo con el virus denominado lipoviropartícula (LVP), que suelen tener alta similitud con las VLDL y las LDL, lo que le permite pasar desapercibido ante el sistema inmune del huésped (Figura 4). Figura 4. Estructura de una lipoviropartícula (LVP). Esta asociación está implicada en la entrada del virus al hepatocito humano y al de chimpancé, sus dos únicas dianas, y en etapas posteriores de replicación, maduración y ensamblaje 22. El VHC es capaz de circular unido a las lipoproteínas secretadas por los hepatocitos, estableciendo a continuación interacciones con distintos receptores de membrana. En primer lugar, la región apoE y la región hipervariable E2 interactúan con proteoglicanos heparán sulfato (HSPGs, del inglés heparan sulfate proteoglycans) de la superficie de los hepatocitos, uniéndose posteriormente con el receptor de LDL (LDLr) para la fijación inicial del VHC al hepatocito. Posteriormente, el virus se une a factores de entrada, entre los que se encuentran el receptor scavenger SRB1, tetraspanina CD81 y proteínas de uniones estrechas como claudina-1, para penetrar finalmente al interior celular por una vía de entrada productiva. Tras varias uniones, la partícula viral es endocitada por un proceso mediado por clatrina y dependiente de pH 23,24 (Figura 5). 67 Figura 5. Esquema del proceso de ensamblaje del virus de la Hepatitis C (VHC) en forma de lipoviropartícula a los hepatocitos. 1. Unión del VHC a los factores de fijación inicial a hepatocitos (HSPGs y LDLr). 2. Unión a los receptores de entrada SRB1 y CD81. 3. Internalización mediada por clatrina activadas por CLDN1. Una vez liberado en el citoplasma celular, se produce la traducción del ARN y procesamiento de la poliproteína en la región IRES del extremo 5’UTR, donde se forma un complejo de traducción con subunidades ribosomales 40S y 60S y otros factores de iniciación (eIF3, eIF2) y metionil-ARN transferente (met-ARNt) 25. Tras el procesamiento de la poliproteína, se constituye el complejo de replicación, formado principalmente por la NS5B y NS3, además de otras proteínas no estructurales como NS4A, NS4B y NS5A, anclándose el complejo a la membrana del retículo endoplasmático. Allí, por acción de la proteína NS4B, se forma un surco llamado membrana web, lugar donde ocurrirá la síntesis de nuevas cadenas de ARN negativo, que servirán para la traducción o para la encapsidación de nuevas partículas víricas 26. Finalmente se produce un ensamblaje, maduración y liberación dependiente de lipoproteínas, siendo la partícula viral que sale una lipoviropartícula (Figura 6). 68 Figura 6. Esquema del proceso liberación, maduración y salida del virus de la Hepatitis C (VHC) en forma de lipoviropartícula en los hepatocitos. 1. Liberación del VHC, traducción de la poliproteína y replicación de su genoma. 2. Ensamblaje del VHC a lipoproteínas y maduración de la lipoviropartícula en el retículo endoplasmático. 3. Salida de las lipoviropartículas, que serán secretadas al torrente sanguíneo. 1.2.4. Sistema de infección in vitro Desde la identificación del genoma del virus de la hepatitis C en el año 1989 en un chimpancé infectado 4, se ha intentado desarrollar algún modelo para poder comprender el modo de replicación de este virus y así, desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. Los primeros estudios de la replicación del VHC in vitro se realizaron inoculando un suero con VHC en células MOLT4 derivada de células T 27. Una semana después de la inoculación, se detectó ARN de cadena negativa en las células y expresión de antígenos virales de la cápsida y la proteína NS4, aunque el nivel de replicación fue muy bajo, no resultando un modelo in vitro eficiente. Continuando con las investigaciones, los esfuerzos se concentraron en la inoculación de líneas celulares con origen hepático, debido a que en un estudio in vitro, sueros de pacientes VHC positivos infectaron más favorablemente a células humanas derivadas de hepatocitos antes que a aquellas derivadas de células T 28. Sin embargo, los nuevos modelos de inoculación de cultivos de células primarias 69 hepáticas no presentaron alta reproducibilidad. Esta limitación fue resuelta gracias al desarrollo de los replicones subgenómicos del VHC 29. Los replicones son fragmentos del genoma del VHC que tienen la capacidad de autorreplicarse, debido a que presentan todos los elementos genómicos de los virus necesarios para la replicación y la traducción. Los primeros replicones del VHC fueron del genotipo 1b (Con 1) donde los genes estructurales fueron reemplazados por un gen de resistencia a la neomicina, y a los que se añadió un elemento IRES que aumentó la traducción de proteínas no estructurales del virus. A pesar de que tenían capacidad de autorreplicación, el sistema de replicón no fue capaz de producir partículas virales al no contener genes estructurales. Es por ello por lo que se desarrollaron replicones con todo el genoma completo del VHC 30, pero la aparición de mutaciones adaptativas interfirieron en la producción de partículas 31. Finalmente, se descubrió un replicón subgenómico del VHC de secuencia de genotipo 2a denominado JFH-1 (del inglés, Japanese fulminant hepatitis), única cepa de VHC que inducía una hepatitis fulminante, capaz de replicar entre 50 y 500 veces más que los replicones ya conocidos 32. Más tarde, se desarrolló un modelo del cultivo celular del VHC basado en el genoma completo de la cepa JFH-1, capaz de producir partículas infecciosas in vitro en células de hepatoblastoma humano (Huh7), las cuales son infecciosas en células, chimpancé y ratón 33. Al mismo tiempo, se realizaron otros estudios con una línea celular derivada de Huh7, la Huh7.5, en el cual se obtuvieron mejores resultados de producción de partículas infecciosas 34. Se realizó una mejora del sistema de replicón con la generación de una quimera de las cepas J6CF y JFH-1 35. 1.3. Enfermedad del hígado graso no alcohólica (EHGNA) La EHGNA se define por primera vez en 1980 36 como una acumulación de grasa (>5 %) en células hepáticas en ausencia de una ingesta excesiva de alcohol 37. La enfermedad afecta a más del 30 % de la población del mundo occidental, especialmente a pacientes que padecen síndrome metabólico, obesidad (76 %) y diabetes tipo II (50 %) 38. El espectro histológico de la EHGNA comienza en una simple esteatosis no alcohólica (ENA) benigna, evolucionando hasta una EHNA 70 (Figura 7). A partir de este punto comienza la consecuente cicatrización y sustitución del tejido por colágeno tipo I, desarrollándose una fibrosis hepática, cirrosis y finalmente, complicándose en muchos casos hasta un carcinoma hepatocelular (CHC) 39. La patogénesis de esta enfermedad es compleja, y se explica por dos impactos o daños principales al tejido hepático: por una parte, una acumulación lipídica en los hepatocitos, a lo cual se suma un segundo daño por estrés oxidativo 40,41. Figura 7. Esquema del espectro histológico de la enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA), desde un hígado sano hasta el desarrollo de un carcinoma hepatocelular. 1.3.1. EHGNA y metabolismo lipídico Uno de los primeros daños hepáticos que se producen en el inicio de la EHGNA es el acúmulo anormal de triglicéridos en el hepatocito, bien por una ingesta alta de grasas saturadas, sumada a obesidad, o bien por deficiencias genéticas o resistencia a insulina (RI) por hiperglucemia e hiperinsulinemia 42,43. La hiperinsulinemia y el aumento de la producción hepática de glucosa inducen la expresión de la proteína de unión al elemento regulador de esteroles (SREBP-1c, del inglés Sterol Regulatory Element-Binding Protein 1c) y de la proteína de unión al elemento de respuesta de carbohidratos (ChREBP, del inglés Carbohydrate-response element-binding 71 protein), respectivamente, las cuales activan a su vez la transcripción de la mayoría de los genes que participan en la maquinaria enzimática necesaria para la síntesis hepática de ácidos grasos (AGs) a partir del exceso de hidratos de carbono, disminuyéndose la beta oxidación de los mismos 44. Además, existen una serie de moléculas mediadoras en la secreción y acumulación anormal de lípidos en el tejido hepático, como la enzima ácido graso sintasa (FAS, del inglés Fatty Acid Synthase,), implicada en la síntesis excesiva de ácido grasos, ya que cataliza el último paso en la biosíntesis de éstos 45,46. La secreción de lípidos en el hígado está mediada por la apolipoproteína apoB100 y por la proteína de transferencia de triglicéridos microsomal (MTTP, del inglés Microsomal Trygliceride Transfer Protein), por lo que su sobreexpresión puede causar cambios en la secreción de lípidos, y está relacionada con una mayor hiperlipidemia en la enfermedad hepática 47. Asimismo, existen enzimas involucradas en la inducción de la esteatosis hepática, como la diacilglicerol aciltransferasa 1 (DGAT1), una proteína transmembrana que funciona como una clave metabólica, ya que es responsable de la esterificación de los ácidos grasos exógenos, contribuyendo al desarrollo de una mayor esteatosis hepática 48. 1.3.2. EHGNA, estrés oxidativo y lipotoxicidad Sumado al daño por acumulación lipídica, un segundo impacto que explica las lesiones histológicas características de la EHGNA es el estrés oxidativo y la peroxidación lipídica 40,49. Como consecuencia del daño hepático y la inflamación del hígado, tanto las células inflamatorias como el propio hepatocito liberan citoquinas, tales como el factor de necrosis tumoral alpha (TNFα, del inglés, Tumor Necrosis Factor alpha) y especies reactivas de oxígeno (EROS). Estos mediadores pueden provocar la peroxidación de membranas plasmática y mitocondrial, lo cual deriva en muerte celular por necrosis o apoptosis 40,50. Todo ello activa las células endoteliales del hígado, que incrementan la expresión de citoquinas, y finalmente activa a las células estrelladas hepáticas (CEH), produciéndose un cambio fenotípico de las mismas, asociado a la adquisición 72 de funciones pro-fibrogénicas y pro-inflamatorias 51,52. La alta acumulación de triglicéridos y colesterol en forma de partículas VLDL y LDL, sumado al estrés oxidativo desarrollado en los hepatocitos, tiene como consecuencia la oxidación del colesterol unido a LDL, generándose partículas de LDL oxidadas (oxLDL) que constituyen un importante factor de riesgo de la enfermedad 53,54. Recientes estudios demuestran que las oxLDL contribuyen también al proceso de inflamación e incremento de los niveles de EROS, participando a la activación de las CEH y al desarrollo de la fibrosis hepática 54. 1.3.3. EHGNA, inflamación e inflamasoma La inflamación se considera el principal factor involucrado en el daño hepático, ya que participa en la progresión de EHGNA a fibrosis severa, hasta que finalmente desarrolla carcinoma hepatocelular 55. La EHGNA, tal y como se ha desarrollado en apartados anteriores, se inicia por la acumulación de lípidos en los hepatocitos y daño por estrés oxidativo 40, generando un entorno necroinflamatorio que termina activando a las CEH 56. Ante este daño oxidativo en los hepatocitos 57, se activan enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa (SOD) para mitigar este efecto. Además, la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS, del inglés Inducible Nitric Oxide Synthase) es una de las consecuencias directas de este proceso inflamatorio y oxidativo 58, que contribuye a la destrucción del tejido local durante la inflamación crónica 59. Estas enzimas se presentan como buenos marcadores de estrés oxidativo, así como la proteína-1-quimioatrayenye de infiltración de macrófagos y monocitos 58,60–62, o el receptor de la proteína tirosina fosfatasa tipo G (PTPRG, del inglés Protein Tyrosine Phosphatase Receptor Type G). Las PTP son moléculas de señalización que regulan varios procesos, entre los que se encuentran la diferenciación, el ciclo celular o la transformación oncogénica. Recientemente se ha relacionado con el proceso inflamatorio en un contexto de obesidad, ya que su expresión es inducida por una señalización inflamatoria 63. La acumulación excesiva de lípidos causa un daño en los hepatocitos, 73 activando una respuesta inflamatoria que agrava el progreso de la enfermedad, alimentando la activación de la inflamación 64. La liberación de estos ácidos grasos saturados y lípidos peroxidados durante el daño celular se reconocen como moléculas endógenas por los receptores de reconocimiento de patrones (PRR, del inglés Pattern Recognition Receptor), entre los cuales se encuentran los receptores de tipo NOD (NLR), siendo el inflamasoma NLRP3 el mejor caracterizado. El inflamasoma NLRP3, una vez que reconoce estas moléculas, se activa y puede asociarse y formar un complejo con la proteína ASC (ASC, del inglés Apoptosis-associated Speck-like Protein), activando la caspasa-1 e induciendo la maduración y secreción de citoquinas proinflamatorias como interleuquina 1B (IL-1B) e interleuquina 18 (IL-18) 65,66. De esta manera induce una señalización proinflamatoria, al mismo tiempo que produce la activación de las CEH, conduciendo a la progresión del proceso fibrogénico (Figura 8). Figura 8. Esquema relacional entre la enfermedad de hígado graso no alcohólica (EHGNA), fibrosis hepática e inflamasoma. 1. La acumulación lipídica debido a dieta alta en grasa, obesidad, hiperglucemia e hiperinsulinemia relacionado con el desarrollo de EHGNA, provocan un daño en el hígado que desencadena la producción de citoquinas 80 gliotoxina, de manera que podría revertirse la fibrosis 82. Esta reversión puede ser explicada porque las CEH, tras su activación, pueden volver a un estado parcialmente inactivado. Durante ese estado de inactividad parcial, algunas CEH activadas revierten a inactivadas, mientras que las restantes se activan y se vuelven apoptóticas. Parece ser que la falta de señales de supervivencia en un entorno no fibrogénico contribuye a esta reversión y a la apoptosis de las células estrelladas hepáticas. El problema radica en que aquellas CEH revertidas parecen ser más susceptibles a señales pro-fibrogénicas 83, por lo que vuelven con mayor facilidad a un estado activo. Otros estudios apuestan por la aplicación de sistemas de nanopartículas en el tratamiento de la fibrosis hepática. Ésta se basa en el uso de nanopartículas como las nanomicelas y los liposomas para la administración de fármacos que sean específicos para atacar a las CEH activadas en una fase temprana, donde la reversión aún es posible 84. A pesar de estos estudios, aún se necesita indagar en el tratamiento antifibrótico, ya que, como se describía al inicio de este capítulo, las terapias están enfocadas a frenar los agentes causantes de la misma, entre los que también se encuentra la EHGNA. La EHGNA puede combatirse desde diferentes dianas terapéuticas. Una de ellas es la resistencia a insulina característica de esta enfermedad, que genera una acumulación lipídica en el tejido 85. Para ello, las tiazolidinedionas como rosigilatozona y pioglitazona, modulan la distribución de lípidos en el tejido adiposo y regulan la sensibilidad a insulina 86. El estrés oxidativo también está implicado en la progresión de la fibrosis en pacientes con NAFLD. Es por ello por lo que la vitamina E se ha establecido como un tratamiento para esta enfermedad debido a su capacidad antioxidante, que protege la estructura celular frente al daño por radicales libres de oxígeno y peroxidación lipídica 87. El receptor X fernesoide es un receptor de hormonas que parece estar implicado en la reducción de la esteatosis hepática, por lo que su regulación a través de agonistas como el ácido obeticólico, cilofexor y tropifexor también ayudarían a disminuir la adiposidad y, por tanto, tratar de manera indirecta la EHGNA y la fibrosis hepática 88. Sumado a estas terapias, los receptores PPAR suelen establecerse como una posible diana para el desarrollo 81 de fármacos frente a EHGNA, debido sobre todo a su papel, en función del tipo de receptor, en el metabolismo lipídico y la inflamación. En este contexto, elafibranor es un fármaco agonista tanto de PPARα y PPARδ, funcionando como tratamiento para la EHGNA por sus efectos protectores frente a la esteatosis, inflamación y la fibrosis hepática 89,90. La lipogénesis de novo ha sido otra diana clave en el desarrollo de terapias frente a esta enfermedad, existiendo inhibidores de la misma como aramchol, el cual, además, inhibe a la esteatoil-coenzima A desaturasa implicada en la lipotoxicidad y la microinflamación 91. Las hormonas tiroideas también juegan un papel principal en la regulación de la homeostasis y del metabolismo lipídico, por lo que disfunciones tiroideas como las del hipotiroidismo se asocian a resistencia a insulina y dislipemia, además de ser un factor de riesgo para la EHGNA 92. Esto hace que agonistas del receptor β de hormona tiroidea, como resmetirom, mejoren la función tiroidea, teniendo efectos a su vez de reducción de los niveles de colesterol y triglicéridos 93. Emricasan, un inhibidor irreversible de caspasa, reduce la inflamación fibrosis en modelos animales de EHGNA, reduciéndose la acumulación de lípidos 94 (Figura 10). A pesar de la ingente cantidad de fármacos descritos frente a la EHGNA, actualmente se encuentran en su mayoría en diferentes fases en ensayos clínicos, no estando aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, del inglés Food and Drug Administration). Por ello, el tratamiento de EHGNA y fibrosis sigue limitándose al control de factores de riesgo, existiendo la necesidad de indagar aún más en el desarrollo de estrategias terapéuticas específicas frente a esta enfermedad. 82 Figura 10. Tratamientos actuales frente a la enfermedad de hígado graso no alcohólica (EHGNA) y la fibrosis hepática. 1.5. Tratamientos naturales con extractos de hongos 1.5.1. Tratamientos naturales en la Hepatitis C En estos últimos años ha aparecido un gran interés por productos de origen natural que puedan tener poder inhibidor frente a la replicación del VHC, siendo utilizados como tratamientos preventivos. Un ejemplo de ello es la quercetina, flavonoide abundante en frutas y vegetales, con un papel protector en numerosas enfermedades por su actividad antioxidante, fundamentalmente. Además, presenta la capacidad de modificar niveles de lípidos, disminuyéndolos tanto en suero como en tejidos hepáticos, pues a corto plazo impide la síntesis de AG y triacilglicéridos (TGs). Esta acción se debe a que la quercetina es capaz de inhibir a dos proteínas, acetil-CoA carboxilasa (ACC) y diacilglicerol aciltransferasa (DGAT), implicadas en la síntesis de TGs. Como ya se dijo antes, el VHC está asociado al 83 metabolismo lipídico, pues desarrolla su ciclo de vida en forma de LVP. De este modo, si se reducen los niveles de lípidos, se podría actuar en la entrada, replicación, ensamblaje, maduración y liberación de partículas virales del VHC 95. Por otro lado, la quercetina también es capaz de impedir la traducción del ARN viral al bloquear la formación del complejo de traducción, formado en parte por NS5A y proteínas HSPs (del inglés, Heat shock proteins), pues disminuye los niveles de expresión de estas últimas. Estas propiedades otorgan a la quercetina un importante papel en la enfermedad de la hepatitis C como nuevo fármaco de origen natural con carácter preventivo. Otros estudios han descrito inhibidores naturales de la proteasa NS3/4A, como los elagitaninos presentes en el extracto crudo de granada 96 y otros compuestos encontrados en extractos de esponja de mar, como halisulfato 3 y suvanina, inhibidores de la actividad helicasa NS3 del VHC 97. Entre estos inhibidores de origen natural, los hongos comestibles como el champiñón común (Agaricus bisporus), la seta de ostra (Pleurotus ostreatus), o el Shiitake (Lentinus edodes) , están cobrando una gran fuerza como fuente de antioxidantes y otros elementos que pudieran tener un papel importante en enfermedades como la hepatitis C. Se ha descubierto que los hongos comestibles son una fuente primaria de ergotioneina, conocida por sus propiedades antioxidantes 98,99. Estudios de la composición de la pared celular y otras estructuras de los hongos, revelan numerosos componentes susceptibles de ser evaluados como posibles inhibidores de la replicación del VHC. Entre ellos, y formando un complejo con la quitina, se encuentran los βglucanos, los cuales parecen tener un papel en la activación del sistema inmune frente a una infección por el VHC, ya que favorecen la liberación de citoquinas 100,101. A estas propiedades se le suma su alto contenido en fibra, que facilita la evacuación de toxinas y regula el contenido de colesterol, disminuyendo niveles de ácidos grasos, y su alto contenido en vitaminas y minerales, importantes en la nutrición y salud. Esta composición es diferente en los tallos y 84 cuerpos fructíferos (carpóforos) de los hongos, siendo mayor el contenido en oligoglucanos (α y β) y oligopéptidos de bajo peso molecular, quitina, polifenoles, antioxidantes, vitaminas y metabolitos secundarios en los cuerpos fructíferos, mientras que los tallos contienen sobre todo quitina, glucanos y proteínas de alto peso molecular 102–104. El estudio de estos hongos comestibles como fuente de posibles inhibidores del VHC parece interesante, más aún cuando se conoce su alto contenido en compuestos que ya han mostrado capacidad beneficiosa y buenos resultados en el tratamiento de la hepatitis en general. De las posibles dianas, la ARN polimerasa NS5B y la proteasa NS3/4A del VHC son las más estudiadas, pues están implicadas directamente en la replicación viral, lo que conlleva a la formación exitosa de nuevas partículas virales. La importancia de que estas proteínas sean las dianas hace posible que las estrategias terapéuticas vayan mucho más allá del tratamiento de un único virus, como el de la hepatitis C, pues existen otros, como el virus del Dengue o el de la Fiebre amarilla, que comparten características con el VHC. Ambos pertenecen a la familia de los flavivirus, y las diferentes partículas virales tienen una estructura similar entre ambos, y con el VHC. De hecho, sofosbuvir, fármaco inhibidor de la polimerasa NS5B del VHC, presenta la capacidad de bloquear también a la polimerasa del virus de la Fiebre amarilla 105. Respecto al virus del dengue, sofosbuvir también presenta actividad inhibidora frente a su ARN polimerasa 106. En cuanto a su proteasa NS3/4A ocurre algo similar, ya que comparten características estructurales en los distintos virus, habiendo inhibidores propios de la NS3 del VHC, como telaprevir y asunaprevir, con actividad inhibidora frente a la proteasa NS3 del virus del Dengue 107. Estos datos abren un campo de posibilidades en el tratamiento natural con champiñones, que no sólo se centraría en el virus de la hepatitis C, ya que podría extenderse al tratamiento de infecciones por otros flavivirus como el del Dengue y la Fiebre Amarilla en un futuro. 85 1.5.2. Tratamientos naturales en la EHGNA y fibrosis hepática Las nuevas estrategias basadas en productos de origen natural aparecen también como una opción para el tratamiento de la fibrosis hepática. Entre dichas estrategias se encuentran el uso de alcaloides como la halofunginona, aislada de la planta Dichroa febrífuga y capaz de disminuir la síntesis de colágeno-1α 108, o la toxina fúngica gliotoxina, producida por Aspergillus fumigatus, que induce la apoptosis en células del sistema inmune y en las CEH 109. En la medicina tradicional se ha utilizado un compuesto obtenido de la planta Salvia mitiorrhiza, el Sho-saiko, capaz de inhibir la proliferación y promover la apoptosis en las CEH 110. La genisteína, una isoflavona bioactiva extraída de la soja, también ha resultado beneficiosa en el tratamiento de la EHGNA, actuando frente a la lipotoxicidad, inflamación, fibrosis e incluso con tumores relacionados con esta enfermedad hepática 111. Diferentes estudios realizados en modelos animales han desvelado una estrategia terapéutica frente la fibrosis hepática y la acumulación lipídica en la inhibición de la expresión de una enzima implicada en la formación de triglicéridos, la diacilglicerol aciltransferasa. Este efecto inhibitorio es realizado por el flavonoide quercetina, abundante en frutas y vegetales, el cual presenta, además de una importante actividad antioxidante, la capacidad de disminuir niveles lipídicos en suero y en tejido hepático por la ya dicha inhibición de la DGAT 112,113. Cabe destacar, entre estas estrategias terapéuticas, y del mismo modo que para el tratamiento de VHC, el uso de hongos ricos en compuestos bioactivos como polisacáridos, terpenos, ácidos fenólicos, esteroides y otros metabolitos, los cuales presentan una potente actividad antiinflamatoria, además de actuar frente al crecimiento tumoral y la acumulación de lípidos en sangre 114. Actualmente se conocen varias especies de hongos, incluyendo las especies Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus y Lentinus edodes, capaces de reducir el nivel de colesterol en sangre e hígado 115,116. A estos se le suma la especie de hongo Mukitake (Panellus serotinus), pues un estudio demostró su capacidad para 86 paliar los efectos de la EHGNA en ratones ob/ob 117, aunque los compuestos bioactivos y su mecanismo de acción no han sido identificados. La activación de las CEH y el desarrollo de EHGNA están promovidos por el estrés oxidativo, por lo que sustancias antioxidantes tales como la vitamina E, glutatión y L-cisteína inhiben dicha activación, frenando la progresión de fibrosis hepática 118. Recientemente, se han encontrado numerosos antioxidantes en plantas, incluyendo el té, la fruta y los vegetales. El hongo Lentinus edodes, conocido comúnmente como Shiitake, contiene numerosos compuestos con propiedades inmunopotenciadoras, hepatoprotectoras y antioxidantes 119,120. En concreto, el micelio de este hongo presenta una importante actividad antioxidante que protege al hígado del daño por CCl4, siendo el responsable de esta actividad la dimetilnitrosamina (DMN), capaz de suprimir el desarrollo de fibrosis hepática y la activación y proliferación de las CEH. Todo ello hace de los champiñones un potente recurso para el desarrollo de estrategias terapéuticas naturales frente a la fibrosis y la EHGNA. 1.5.3. Agaricus bisporus y sus propiedades terapéuticas Agaricus bisporus (champiñón común) es una especie de hongo comestible con un alto contenido en compuestos biológicamente activos, lo cual le confiere diferentes propiedades, muchas de ellas terapéuticas, para poder desarrollar nuevos tratamientos debido a su potencial y, sobre todo, a su alta disponibilidad y bajo coste. Entre las diferentes especies de hongos, Agaricus bisporus es la especie más cultivada y consumida en todo el mundo, siendo por tanto la más estudiada. Sus cualidades nutricionales se conocen desde la antigüedad, ya que presenta un alto contenido de fibra, gran cantidad de vitaminas, minerales y aminoácidos esenciales, y a su vez, bajo contenido en grasas y colesterol 121. También es importante su alto contenido en compuestos bioactivos como los complejos proteicos y polisacáridos, β-glucanos y polifenoles. Esta especie de hongo contiene compuestos fenólicos, terpenos, betacarotenos e importantes vitaminas, relacionándose todos estos compuestos con sus propiedades antivirales, antioxidantes y antiinflamatorias. 104. 87 Una de las principales propiedades de los hongos, y, en este caso, de la especie Agaricus bisporus, es su función bactericida. Existen metabolitos secundarios de bajo peso molecular como terpenos, esteroides y quinolonas, así como de alto peso molecular, como péptidos y proteínas, que convierten a Agaricus bisporus en un agente antimicrobiano 122. Al mismo tiempo, diferentes estudios han posicionado a los hongos comestibles como excelentes antioxidantes debido a la presencia de compuestos fenólicos en su composición 123. Estos compuestos bioactivos son beneficiosos en una gran variedad de enfermedades, incluyendo trastornos inmunes e inflamatorios, cáncer, hipertensión, diabetes e hiperlipidemia 124. 88 OBJETIVOS 89 96 Tabla 4. Kits y reactivos utilizados para los diferentes experimentos desarrollados en el estudio. Producto Referencia Casa comercial Kits y reactivos SensoLyte520 HCV Protease Assay Kit 71145 AnaSpec, Inc. HCV NS3/4A protease genotype 1b, recombinant AS-61017-5 AnaSpec, Inc. HCV NS3/4A protease genotype 2a, recombinant AS-72167-5 AnaSpec, Inc. HCV NS3/4A protease genotype 3a, recombinant AS-72168-5 AnaSpec, Inc. Quercetin 117-39-5 HWI ANALYTIK GmbH Amaxa cell line nucleofector kit T (260 V, 950 μF Lonza VC-1002 Bioscience Lonza COBAS ® TaqMan ® HCV Test v2.0 - Roche Diagnostic QuantiTect Rev. Transcription Kit 205311 QIAGEN SensiFASTTM cDNA Synthesis Kit BIO-65054 Bioline GoTaq® qPCR Master Mix 2x A6001 Promega TRIsure Reagent BIO-38033 Bioline Reagents RNeasy Lipid Tissue Kit 74804 Qiagen, Hilden, Germany HEPES A1069,0250 Applichem NaCl A1149,1000 Applichem EDTA A3234,0500 Applichem PMSF A0999,0025 Applichem NaF A0547,0500 Applichem Na3VO4 A2196,0010 Applichem Protease Inhibitor Cocktail P8340 Sigma-Aldrich Nonidet NP-40 (IGEPAL) A1694,0250 Applichem DCTM Protein Assay Reagent A DCTM Protein Assay Reagent B DCTM Protein Assay Reagent C 5000113 5000114 5000115 BioRad BioRad BioRad Precision Plus ProteinTM Standards Dual Color 1610374 BioRad Any kD™ Criterion™ TGX Stain-Free™ Protein Gel, 18 well 5678124 BioRad Tris-Base pH 8,3 (48 mM) T1503 SIGMA SDS (0,0375%) A2263 AppliChem Metanol (20% v/v) 179957 SIGMA 97 Glicina (39 mM) A4554 AppliChem Inmuno Blot® PVDF Membranes for Protein Blotting (26c, x 3,3 m 0,2 um) 1620177 BioRad Extra Thick Western Blotting Filter Paper 20 cm x 20 cm 88620 Thermo Scientific Albumin (BSA) Fraction V (pH 7.0) A6588,0100 AppliChem Tween-20 A4974 AppliChem Clarity™ Western ECL substrate 170-5061 BioRad DMEM Low Glucose w/o Lgltuamine w/ sodium pyruvate L0064-500 Biowest DPBS 1X 14190-144 Gibco (Life Technologies) Trypsin-EDTA (0,05%) phenol red 25300-062 Gibco ThermoScientific Sterile-filtered FBS F7524 Sigma Penicillin-Streptomycin (100 U/mL) 15140-112 Gibco ThermoScientific L-glutamine (200 mM) 25030081 Invitrogen Life Technologies MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) 11140-035 Gibco ThermoScientific Trypan Blue 15250-061 Gibco (Life Technologies) SOD Assay Kit CA061 Canvax 24(S)-Hydroxycholesterol ELISA Kit Ab204530 Abcam Glucose Assay Kit Ab65333 Abcam 3.2.Preparación y caracterización de extractos de champiñones 3.2.1. Preparación del extracto de Agaricus bisporus (AbAEE) Las variedades de champiñones Agaricus bisporus fueron cultivados en el invernadero de la Universidad de Sevilla (CITIUS) de acuerdo con los procedimientos estándar 125. Se utilizaron 5 lotes diferentes de champiñones para comprobar la consistencia de los experimentos. Los extractos AbAEE se prepararon a partir de los cuerpos fructíferos, también llamados carpóforos, de los hongos. El procedimiento seguido se muestra en la figura 11. Una vez lavados con citrato (2 g/L), se escurrieron y trocearon para añadir a continuación un volumen de agua destilada igual 98 a su peso en gramos (10 g de champiñón + 10 mL de agua destilada). A continuación, la mezcla se homogeneizó en un homogeneizador tipo aspas. Una vez obtenido el homogenado, se realizó un tratamiento enzimático con una mezcla de enzimas glucanasas y quitinasas (Novo Nordisk ®) con el fin de favorecer la liberación de productos intracelulares. Las condiciones para este tratamiento fueron pH 5, temperatura de 55 ºC±1 y una relación enzima-sustrato de 0,01 (E/S=0,01), manteniéndose dichas condiciones durante 24 horas en un biorreactor. Finalizado el tratamiento enzimático, la inactivación de las enzimas se llevó a cabo subiendo la temperatura a 90 ºC y manteniéndola durante 120 minutos. Una vez enfriado a temperatura ambiente, se ajustó el pH a 7,0 con NaOH 1 M y se centrifugó a 8000 x g. Figura 11. Esquema del proceso de preparación de los extractos AbAEE Finalmente, para mantener las condiciones de esterilidad, los extractos fueron filtrados mediante filtros estériles comerciales con un tamaño de poro de 0,22 μm, obteniendo el extracto AbAEE. 99 El proceso de enriquecimiento de los extractos se muestra en la tabla 5. El agua de escaldado tras el lavado con citrato se recolectó, denominándose agua de lavado (AL). Tabla 5. Resultado del procesamiento de la variedad de hongo Agaricus bisporus. Peso inicial (g) de material fresco, peso final (g) tras el secado, % de peso seco y volumen de H2Od (mL) requerido para una concentración de 42 mg/mL. Especie hongo Peso inicial (g) Peso final (g) Peso seco (%) H2Od (mL) A. bisporus 12,91 0,37 2,86 8,81 3.2.2. Fraccionamiento del extracto crudo AbAEE para ensayo in vitro NS3/4A del VHC El extracto crudo AbAEE fue fraccionado por dos métodos distintos: ultrafiltración por tamaño y fraccionamiento químico por extracción secuencial líquido-líquido. El fraccionamiento bruto de AbAEE por ultrafiltración se llevó a cabo utilizando membranas de utrafiltración con diferentes cortes nominales: 100 kDa, 20 kDa y 3 kDa. Las membranas de ultrafiltración utilizadas se obtuvieron de Amicon (Bedford, MA, USA) y Pall (Ann Arbor, MI, USA). El extracto AbAEE se ultrafiltró a través de una membrana de ultrafiltración de 100 kDa, obteniendo el pre-UF-100; el pre-UF-100 se filtró a través de una membrana de ultrafiltración de 20 kDa, obteniendo el pre-UF-20, y, finalmente, el pre-UF-20 se filtró a través de una membrana de ultrafiltración de 3 kDa, obteniendo el pre-UF-3. Cada una de las fracciones (5 mL) se concentraron hasta 0,5 mL por evaporación al vacío en un rotavapor (Büchi, Zurich, Suiza). El secado de cada una de las fracciones concentradas se realizó por liofilización, haciendo uso de un liofilizador (Telstar, Terrasa, Barcelona). Las fracciones pre-UF-100, pre-UF-20 y pre-UF-3 liofilizadas se disolvieron en un volumen de agua (mL) requerido para obtener una concentración de 5 mg/mL, obteniendo las fracciones UF-100, UF-20 y UF-3. 100 El segundo fraccionamiento se realizó mediante ELL secuencial utilizando tres disolventes (hexano, diclorometano y acetato de etilo) caracterizados por tener diferentes índices de polaridad (pI), todos ellos inmiscibles en agua, según el procedimiento descrito por Delgado-Povedano 126. Este procedimiento sólo se realizó para la fracción UF-3 obtenida en el fraccionamiento anterior por ultrafiltración. La fracción UF-3 se centrifugó a 1500 x g durante 5 minutos tras la adición de cada uno de los disolventes (volumen de 5 mL), obteniendo cada una de las fases o extractos (5 mL) de hexano, diclorometano, acetato de etilo y fracción acuosa. Del mismo modo que en el fraccionamiento por ultrafiltración, se procedió a la concentración de dichas fracciones hasta un volumen de 0,5 mL, por evaporación al vacío en un rotavapor (Büchi, Zurich, Suiza). El secado de cada una de las fracciones concentradas se realizó por liofilización, haciendo uso de un liofilizador (Telstar, Terrasa, Barcelona). Las fracciones obtenidas ya liofilizadas se disolvieron en un volumen de agua (mL) requerido para obtener una concentración de 5 mg/mL, obteniendo las fracciones de hexano (HF-3 kDa), de diclorometano (DMF-3 kDa), de acetato de etilo (AEF3 kDa) y fracción acuosa (AcF-3 kDa). Este segundo fraccionamiento se llevó a cabo en colaboración con la Prof. Dra. María Dolores Luque de Castro, del Departamento de Química Analítica de la Universidad de Córdoba (Campus Universitario de Rabanales). 3.2.3. Análisis químico de las diferentes fracciones de AbAEE La composición de los diferentes extractos fue analizada en colaboración y según el procedimiento descrito por Delgado-Povedano 126. Para ello se hizo uso de un sistema de cromatografía líquida (serie Agilent 1200; Santa Clara, CA, EE. UU.) acoplada a un espectrómetro de masas (Agilent 6540 UHD Accurate-Mass QTOF; Santa Clara, CA, EE. UU.). Este equipo emplea una fuente de doble ionización por electropulverización para la pulverización simultánea de una solución de masa conocida y monitorización continua de las relaciones m / z detectadas. Las fracciones UF3, obtenida por ultrafiltración, AqF-3 kDa, obtenida por ELL, y las fracciones orgánicas HF-3 101 kDa, DCM-3 kDa y EAF-3 kDa. obtenidas también por ELL, fueron sometidas a dicho análisis químico por LC/MS-QTOF para la identificación de los diferentes elementos que las componen. 3.3.Líneas celulares y técnicas de cultivo celular Para abordar este estudio se utilizaron dos líneas celulares diferentes: línea celular Huh7.5 derivada de hepatoblastoma humano y línea celular LX2 de células estrelladas hepáticas humanas en estado activo. 3.3.1. Línea celular de hepatoma humano Huh7.5 La línea celular Huh-7.5 es una variante de la línea celular Huh-7, la cual deriva de un carcinoma celular originalmente aislado de un tumor de hígado de un hombre japonés de 57 años, en 1982 127. Esta variante presenta una mutación en el gen I inducible de ácido retinoico citosólico (RIGI), lo cual favorece la transfección y replicación del VHC. Es una línea inmortal de células tumorigénicas con una morfología similar a las células epiteliales. 3.3.2. Línea celular estrellada hepática LX2 Por su parte, la línea celular LX2 son células aisladas de lipocitos hepáticos (o células estrelladas o de Ito) y células de Kupffer de un hígado humano normal, las cuales son inmortalizadas por la transfección del plásmido pRSTaf que codifica el antígeno TSV40 bajo el control del promotor del virus del sarcoma de Rous (VSR). Esta línea celular presenta un metabolismo de fibrogénesis que la hace altamente adecuada para el estudio de la fibrosis hepática humana 128. 3.3.3. Generalidades para el cultivo celular Durante todo el proceso se mantuvieron estrictas condiciones de esterilidad. Todo aquel material que no hubiera sido preparado en una cabina de flujo laminar fue esterilizado mediante filtros estériles comerciales con tamaño de poro de 0,22 μm. Todo el material de plástico usado, pipetas serológicas, placas de pocillos, botellas de cultivos y tubos de tipo Falcon era material desechable. Las puntas de pipeta y otros materiales de plástico como micro-tubos de 1,5 mL fueron 102 autoclavados. Finalmente, todas las manipulaciones fueron realizadas en el interior de una campana de flujo laminar vertical. En general, los cultivos celulares fueron mantenidos en una estufa de cultivo celular a una temperatura constante de 37ºC, a una atmósfera de 95 % de aire, 5 % de CO2 con humedad saturada. 3.3.4. Descongelación de células El pellet de células, tanto de la línea Huh-7.5 como LX2, fue previamente almacenado en condiciones óptimas, a una temperatura de -80ºC y en crioviales suplementados con Criomax®. Para realizar el cultivo de células, fueron descongeladas. Dicho proceso de descongelación se realizó en un baño calentado previamente a 37ºC. Se hizo una dilución 1:10 del precipitado celular con medio DMEM con bajo nivel de glucosa (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (Biowest®), suplementado con 10 % de suero bovino fetal (SBF), 2 mM de L-Glutamina (Invitrogen®), 100 U/mL penicilina y 100 U/mL estreptomicina (Gibco®), además de aminoácidos no esenciales 100X (Gibco®). Tras homogeneizarlo, se centrifugó a 200 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente (25ºC). El sobrenadante fue desechado y el precipitado de células se resuspendió en medio de cultivo DMEM suplementado. Las células fueron contadas y se distribuyeron en botellas o flask de cultivo de 75 cm2 (Sarsted®), incubándose finalmente a 37ºC, 5 % de CO2. En función de la línea celular, éstas pueden crecer con una confluencia determinada. Las Huh-7.5 no pueden crecer con más de un 70 % de confluencia, ya que de lo contrario comenzarían un proceso de diferenciación. Por ello, para el mantenimiento de las células hasta la puesta en marcha de los experimentos, se realizaron cambios de medios y pases sucesivos controlando la viabilidad celular, morfología y confluencia. 3.3.5. Preparación de la línea celular para su uso Para los distintos pases de ambas líneas celulares, se procedió, en primer lugar, a retirar el medio de cultivo de las botellas. Seguidamente las células se lavaron dos veces con DPBS 1X 103 (Dulbecco’s Phosphate-buffered salin) (Gibco®), para ser levantadas de la superficie por la adicción de 1,5 mL de tripsina a 37ºC y 5 % de CO2 durante cinco minutos. Finalizado el tiempo, se neutralizó el efecto de la tripsina-EDTA (Gibco®) con la adicción de medio de cultivo suplementado (contiene SBF para dicha neutralización). Con ayuda de una pipeta serológica, fueron transferidas a un tubo de tipo Falcon de 15 mL para ser centrifugadas a 200 x g durante cinco minutos y a temperatura ambiente (25ºC). A continuación, el sobrenadante fue desechado y el precipitado se resuspendió en un volumen de medio de cultivo DMEM suplementado equivalente al número de células necesario para cada experimento, ya que antes de la siembra, las células fueron contadas. Finalmente, el homogenado celular fue sembrado en placas de 6 pocillos (M6) (Sarsted®) para los diferentes experimentos, y en botellas o flask de cultivo de 75 cm2 para el mantenimiento de las líneas celulares. En ambos casos, los cultivos celulares se incubaron a 37ºC y 5 % de CO2. Todo el proceso fue realizado bajo condiciones de esterilidad en una cabina de flujo laminar vertical. 3.3.6. Conteo celular El conteo celular se determinó utilizando una cámara de Neubauer. Esta cámara es una gruesa placa de cristal con forma de portaobjetos, de unos 30 x 70 mm y unos 4 mm de grosor. La porción central, zona donde se realiza el conteo, está dividida en tres partes, donde se encuentra grabada una retícula cuadrangular de 3 mm x 3 mm de lado y subdivida a su vez en nueve cuadrados de 1 mm de lado cada uno. La cámara fue lavada con agua destilada (H2Od) y etanol 96 % antes de colocar un cubreobjetos sobre ella de manera que cubriese su parte central. De la muestra de células previamente preparadas y homogeneizadas, se pipeteó 20 μl del homogenado celular + 20 μl de azul de tripán, tomando finalmente 10 μl de mezcla que, por capilaridad, penetra entre la cuadrícula y el cubreobjetos cubriendo toda la cuadrícula. El azul de tripán es un colorante azoico que tiñe las 104 células muertas, pudiendo diferenciarlas de las vivas. A continuación, se procedió al conteo de las células en el microscopio (Leica DM IL HC), utilizando un objetivo de 10X. Se contó el número de células vivas existentes en los cuadrantes externos y central, calculando el promedio. Para calcular el número de células totales, se aplicó la siguiente fórmula: - Células/ mL= (promedio) x (10.000) x (2); siendo 10.000 el factor de conversión de la cámara; y siendo 2 el factor de dilución del azul de tripán. El resultado es el número de células que se tienen por mL. - El número total de células se calculó multiplicando el resultado obtenido por mL por el volumen total de la muestra (mL). 3.4. Infección de células Huh7.5 por VHC. Producción de partículas virales La producción de partículas virales de VHC se llevó a cabo usando el método de electroporación con 5 μg de ARN transcrito de longitud completa de la cepa JFH1 (genotipo 2a) 33 a células Huh7.5 (3x106 células). Para ello se utilizó el kit Cell Line NucleofectorTM (260 V, 950 μF Lonza). Tras un período de tiempo de 72 horas, se recolectó el sobrenadante del cultivo, se filtró a través de membranas de difluoruro de polivinilideno (0,45 μm de tamaño de poro), y se tituló, finalmente, infectando a células Huh7.5 sanas con diluciones en serie. Las células se fijaron con metanol a - 20ºC para hacer una inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-VHC core (C7/50) (Enzo Life Science) y comprobar la presencia de las partículas virales. Se utilizaron reservas virales de alta carga para inocular células Huh7.5 a una multiplicidad de infección (MOI, del inglés multiplicity of infection) de 1. Para ello, se inocularon células Huh7.5 con partículas JFH1-VHC durante un período de 6 horas a 37ºC, período tras el cual se retiró el inóculo para realizar los distintos ensayos experimentales. La producción de partículas virales de VHC se realizó en colaboración con la doctora Mª de los Ángeles Rojas Álvarez-Ossorio, del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS). 105 3.5.Tratamiento de líneas celulares con extractos de Agaricus bisporus 3.5.1. Ensayos para determinar los efectos citotóxicos del extracto de Agaricus bisporus en células Para determinar los posibles efectos citotóxicos del extracto de Agaricus bisporus sobre las líneas celulares Huh7.5 y LX2, se realizó un ensayo de viabilidad con azul de tripán para determinar el número de células muertas vs las células vivas. En primer lugar, se examinó la morfología y el crecimiento celular bajo el microscopio, seguido de un contaje de células vivas y muertas. Para ello, ambas líneas celulares fueron tratadas con la siguiente batería de concentraciones de AbAEE: 10 mg/mL, 5 mg/mL, 2 mg/mL, 1 mg/mL y 0,2 mg/mL. 3.5.2. Tratamiento de Huh7.5 con extractos de Agaricus bisporus y quercetina Para los experimentos in vitro de análisis de la capacidad de AbAEE para inhibir la replicación del VHC, se utilizaron células Huh7.5 inoculadas con JFH1-VHC. Se cultivaron células Huh7.5 infectadas (50.000 células por pocillo en placas M6) con medio DMEM suplementado, como se indica en el apartado 3.3.5. Las células fueron tratadas con diferentes compuestos durante un período de 72 horas: extracto AbAEE (0,2 mg/mL), quercetina (50 μM). Las concentraciones fueron elegidas en base a la prueba de toxicidad para AbAEE y a las recomendaciones de autores para la quercetina. La infección de Huh7.5 con partículas virales JFH1-VHC y el tratamiento con AbAEE y quercetina se realizó en colaboración con la doctora Mª de los Ángeles Rojas Álvarez-Ossorio, del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS). 3.5.3. Tratamiento de células LX2 con extractos de Agaricus bisporus Para los experimentos in vitro de evaluación de parámetros fibróticos, inflamatorios y de estrés oxidativo, se cultivaron células estrelladas hepáticas en estado activo (LX2) (106 células por pocillo en placas M6) con medio DMEM suplementado, como se indica en el apartado 3.3.5. Las 112 Figura 12. Esquema del funcionamiento del kit fluorimétrico AnaSpec® de la actividad proteasa NS3/4A del virus de la Hepatitis C (VHC). Las diferentes soluciones se prepararon de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (AnaSpec® Kit NS3/4A proteasa), y las muestras se analizaron en microplacas opacas negras. El ensayo de inhibición del extracto AbAEE bruto y las diferentes fracciones obtenidas por ultrafiltración y ELL se analizaron utilizando 20 µL de muestra con 22,5 µg de producto/μL por ensayo. Se utilizó TPV 0,5 mM como control positivo, y muestras E+S sin inhibidores (100 % actividad NS3) como control negativo. Para este ensayo se utilizó la proteasa NS3/4A del VHC de tres genotipos diferentes (1b, 2a y 3a). El ensayo de actividad se realizó en un lector de microplacas de fluorescencia (Synergy Biotek, VT, EE. UU.) A λex = 490 nm y λem = 520 nm. 113 3.8.Extracción de ADN total con TRISURETM 3.8.1. Extracción de ADN de homogenado celular de Huh7.5 infectadas con VHC y de LX2 El análisis de la expresión de los diferentes genes de interés requiere la extracción del ARN de las células cultivadas (Huh-7.5 y LX2) sometidas a los tratamientos ya especificados en apartados anteriores. Tras un período de 72 horas (Huh7.5) o de 24 horas (LX2), se procedió a la extracción de ARN mediante el uso del reactivo TRIsureTM (tiocianato de guanidina). Para ello, se retiró el medio de cultivo de cada pocillo de cultivo, lavando con PBS y añadiendo 500 μL TRIsure en una campana de extracción de gases. Una vez se obtuvo una solución homogénea, la mezcla se traspasó a tubos eppendorf y se añadió un volumen de 100 μL de cloroformo. A continuación, se agitó vigorosamente en vórtex y se centrifugó a 12.000 x g durante 15 minutos a 4ºC en una microcentrífuga. De esta manera se obtuvieron dos fases: una fase acuosa que contenía el ARN, y la parte orgánica que contenía las proteínas y el ADN. En una campana de extracción de gases se retiró la fase acuosa, obteniendo aproximadamente 250 μL, y se traspasó a nuevos tubos eppendorf. A la fase acuosa se añadieron 250 μL de isopropanol y se dejó incubar 20 minutos en frío (4ºC). Se centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos a 4ºC y el precipitado se lavó con EtOH al 75 % en H2O-DEPC. Se centrifugó a 7500 x g durante 5 minutos y 4ºC y el precipitado se resuspendió en 30 μL de H2O-DEPC. Finalmente, cada muestra se cuantificó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ((Thermo Scientific, Wilmington, DE, EE. UU.). Todo el procedimiento se realizó en condiciones asépticas para evitar posible contaminación de ARN, tanto con impurezas orgánicas como inorgánicas (fenol, cloroformo). El grado de pureza de ARN se determinó con la relación de absorbancia de A260/280 y A260/230, que debía ser =1,8. Las muestras se almacenaron a -80ºC para su posterior uso. 114 3.8.2. Extracción de ADN de homogenado tisular hepático de ratones KO LDLr El ARN del homogeneizado de tejido hepático de ratón KO LDLr se extrajo de los tejidos hepáticos incluidos en parafina con el kit de tejido lipídico RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania). La cantidad de ARN se determinó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. La calidad del ARN se evaluó con un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania). 3.9.Transcripción inversa El ARN es un material extremadamente sensible a la contaminación por ribonucleasas, enzimas que hidrolizan y degradan el ARN sin necesidad de cofactores para su función, además de que soportan los métodos estándar de inactivación de proteínas. Debido a esta sensibilidad, se procedió a realizar una transcripción inversa o retrotranscripción con el objetivo de obtener ADNc. Se partió de muestras con 0,1 μg de ARN para obtener 30 μL de ADNc mediante el proceso de transcripción reversa o retrotranscripción (RT). Para ello se utilizó el SensiFASTTM cDNA Synthesis Kit (Bioline®). Para cada muestra de ARN, se preparó una mezcla de volumen final de 10 μL (Oligo (dT), dnTP, Random Hexamer y ARN extraído de la muestra celular o tisular) según instrucciones del fabricante. Cada una de las muestras con el ARN incorporado fue incubada a 65ºC durante 10 minutos, tiempo tras el cual se pasó a hielo durante 2 minutos. Cada muestra con ARN fue complementada con 10 μl de la mezcla de reacción, la cual fue preparada según instrucciones del fabricante (RT buffer, inhibidor de RNasa y retrotranscriptasa). Finalmente, la mezcla fue incubada a 40ºC durante 45 minutos, y a 70ºC durante 15 minutos. Las muestras se mantuvieron en hielo para proceder a la cuantificación por espectrofotometría utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. El grado de pureza de ADN se determinó con la relación de absorbancia de A260/280 y A260/230, que debía ser =2, aproximadamente. Finalmente, todas las 115 muestras se igualaron a una concentración de 100 ng/μL diluyendo con H2O ultrapura Milli-Q. Las muestras se almacenaron a -20ºC para su posterior uso. 3.10. Extracción de proteínas 3.10.1. Extracción de proteínas de homogenado celular de Huh7.5 infectadas con VHC y de LX2 El análisis de expresión proteica de las diferentes proteínas de interés también requiere la extracción de proteínas de las células (Huh-7.5 y LX2) sometidas a los tratamientos ya especificados en apartados anteriores. Tras un período de 72 horas (Huh7.5) o de 24 horas (LX2), se procedió a la extracción de ADN mediante una solución de lisis casera que incluía HEPES 50 mM (Applichem), pH 7,5, EDTA 5 mM (Applichem), NaCl 150 mM (Applichem), 4 % nonilfenil-polietilenglicol (Nonidet NP-40 (IGEPAL)), cóctel comercial de inhibidores de la proteasa (CIP, Sigma-Aldrich), fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF, Applichem), fluoruro de sodio 1 mM (NaF, Applichem) y ortovanadato de sodio 1 mM (Na3VO4, Applichem). Se retiró el medio de cultivo de cada uno de los pocillos y tras un lavado con PBS, se añadieron 200 μL de solución de lisis casera por pocillo. La cuantificación de proteínas se llevó a cabo haciendo uso de un reactivo de ensayo para la cuantificación proteica (DCTM Protein Assay Reagent, BioRad). 3.10.2. Extracción de proteínas de homogenado tisular hepática de ratones KO NLRP3 La extracción de proteínas del homogenado tisular hepático de los ratones KO NLPR3 (grupos controles WT y NLRP3-/-) se llevó a cabo haciendo uso de la misma solución de lisis que para las células. En este caso, se pesó 1 mg de tejido hepático que se homogeneizó con 200 μL de solución de lisis de manera manual y haciendo uso de homogeneizadores de plástico esterilizados. A 116 continuación, la cuantificación proteica, separación de proteínas, transferencia e incubación con anticuerpos se realizó del mismo modo que para los homogenados obtenidos de células. 3.11. Análisis de expresión génica en células LX2 y tejidos hepáticos: PCR Para cuantificar pequeñas cantidades de ARN y detectar la expresión génica de varios genes marcadores se utilizó la técnica de RT-qPCR con las muestras de ADNc previamente preparadas. Esta técnica permite amplificar un fragmento de ADN que queda delimitado entre 2 oligonucleótidos con secuencia complementaria a los ácidos nucleicos diana seleccionados. El producto de amplificación se detecta a medida que se va produciendo el ciclo, siendo más sensible y rápida que la PCR clásica. Toda PCR precisa de un gen no modulable, con expresión constante e independiente del estado patológico de la célula, conocido como gen Housekeeper, y necesario para el proceso de normalización de la expresión del gen objetivo y el control. En este caso, y tras probar varios genes controles, se determinó como gen constitutivo el GAPDH (gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa). La reacción se llevó a cabo con 100 ng de ADNc ajustados a 1 μL en un paso previo, 1 μL del cebador específico para gen, 3 μL de H2O ultrapura Milli-Q y 5 μL de la mezcla GoTaq ® qPCR Master Mix 2X (Promega®), para cada muestra y pocillo de la placa. La reacción se llevó a cabo en el software Eco Real-time PCR System v3.0 del termociclador (Illumina® California, EEUU). Las condiciones de la RT-qPCR fueron 10 minutos a 95ºC para la activación de la ADN polimerasa, 10 segundos a 95ºC para la desnaturalización, 30 segundos a 65ºC para el alineamiento y 15 segundos a 72ºC para la extensión. Una vez obtenidos los valores del ciclo umbral (Ct) de cada muestra, se cuantificó la variación relativa en la expresión génica mediante el método de comparación de Ct usando la fórmula aritmética desarrollada por Pedersen, 2001: Variación en los niveles de expresión = 2Δ (ΔCt) 117 - ΔCt= Ct problema – Ct control interno - Δ (ΔCt) = ΔCt situación experimental – ΔCt situación control. Todos los experimentos fueron realizados por duplicado. La técnica RT-qPCR fue utilizada para la medición de expresión génica de varios marcadores para los diferentes experimentos realizados. De este modo, y en ensayos in vitro con células LX2 tratadas con AbAEE, se midieron los genes Col-1α-1(QIAGEN), Acta-2α (QIAGEN), Tpm2β (QIAGEN), Gata4 (QIAGEN), Sod2 (QIAGEN) y Nos2 (QIAGEN). En los ensayos in vivo con el modelo animal KO LDLr, se analizó la expresión génica de los marcadores Col-1α-1(QIAGEN), Gata4 (QIAGEN), Sod2 (QIAGEN) y Nos2 (QIAGEN). 3.12. Determinación de los niveles de ARN y proteínas del VHC en células Huh7.5 infectadas con VHC Tras los ensayos de infección por VHC en células Huh7.5, detallados en el apartado 3.4., se llevó a cabo un análisis de expresión génica de ARN y un ensayo de replicación en dicha línea celular infectada. La replicación del genoma del VHC se evaluó midiendo los niveles intracelulares del ARN del VHC de cadena negativa utilizando una técnica de RT-qPCR específica del transcrito de ARN JFH1 (genotipo 2a) 129. Para la cuantificación de ARN de VHC en los sobrenadantes de los cultivos celulares filtrados a las 72 horas de la infección, se utilizó un kit comercial estándar para ensayos de carga viral (COBAS® TaqMan® HCV Test v2.0, Roche Diagnostic). 3.13. Análisis de expresión proteica en células Huh7.5 infectadas con VHC, células LX2 y tejidos hepáticos: WESTERN-BLOT Para el análisis de expresión proteica de los diferentes marcadores de interés, y tras la cuantificación de proteínas de los homogenados celulares y tisulares (detallado en los apartados 3.10.1 y 3.10.2.), las proteínas (50-100 μg) se separaron mediante un gel de proteínas Any kD ™ Criterion ™ TGX Stain-Free ™, 18 pocillos, 30 μL (BioRad, Hercules, CA, EE. UU.) y se 118 transfirieron a membranas de PVDF (BioRad). Las membranas se incubaron con los correspondientes anticuerpos primarios y secundarios comerciales, los cuales serán detallados en un apartado posterior para los diferentes experimentos, que se acoplaron a la peroxidasa de rábano o HRP (del inglés horseradish peroxidase) para revelar el contenido de proteína mediante el sustrato Clarity ™ Western ECL (BioRad). Las imágenes se analizaron en un sistema de imágenes táctiles ChemiDoc ™. El sistema ChemiDoc utiliza la cantidad de proteínas como control de carga, evitando el uso de una proteína control adicional como la albúmina. Este sistema, además, parece ser más fiable que los convencionales 130. Aun así, y puntualmente en los experimentos realizados con muestras de homogenado celular Huh7.5 infectadas con partículas de VHC, se llevó a cabo el método convencional usando la proteína β-actina como proteína control. La técnica Western Blot fue utilizada para la medición de expresión proteica de varios marcadores para los diferentes experimentos realizados. De este modo, y en ensayos in vitro con células Huh7.5 infectadas con partículas de VHC y tratadas con quercetina y con AbAEE, se analizó la expresión de los marcadores proteicos del CORE del VHC (Enzo Life Scientific) y de la proteasa NS3/4A del VHC (BioFront Technologies). Como proteína control se utilizó a β-actina citoplasmática (Cell Signaling). Para los ensayos in vitro con células LX2 tratadas con AbAEE, se midieron los marcadores proteicos COL-1α-1 (Abcam) y GATA4 (Cell Signaling). Por su parte, y los ensayos in vivo realizados en el modelo animal KO NLRP3 (grupos controles y grupos NLRP3-/-), se analizaron los marcadores COL-1α-1 (Abcam), TPM2β (Thermo Fisher Scientific), GATA4 (Cell Signaling), MTP (Abcam), FASN (Abcam), DGAT1 (Abcam), SOD2 (Abcam) y PTPRG (Thermo Fisher Scientific). Para los distintos experimentos con células, y como ya se ha descrito anteriormente, los anticuerpos se obtuvieron comercialmente. Los anticuerpos secundarios utilizados fueron Goatantimouse (BioRad), Goat-antimouse (BioRad) y Goat-antirrabit (Santa Cruz Biotechnology 119 Inc.). Las diluciones de anticuerpos primarios y secundarios fueron 1:1.000 y 1:10.000, respectivamente. El análisis de la imagen se realizó utilizando el software Image Lab 6.0 de BioRad (Berkeley, California). 3.14. Evaluación histológica del hígado Para la evaluación histológica del hígado del modelo animal KO LDLr, las secciones de hígado (5 μm) embebidas en parafina se tiñeron con hematoxilina-eosina (H&E) para evaluar los cambios patológicos en los hígados. El análisis del área fibrótica en los hígados del modelo KO LDLr se determinó como depósito de fibras de colágeno con tinción Sirius Red, evaluándose mediante el conteo directo de píxeles en imágenes binarias (aumento 10x). El área promedio se calculó a partir de 10 imágenes por hígado. Por su parte, la evaluación de las células estrelladas hepáticas positivas para GATA4 sirvió como un segundo análisis del área fibrótica en estos hígados del modelo KO LDLr. Para ello, las secciones de hígado se desparafinaron e hidrataron. Tras un paso previo para inactivar la peroxidasa endógena, los cortes se bloquearon e incubaron con un anticuerpo específico dirigido contra GATA4 (dilución 1:100, Santa Cruz Biotechnology) a 4ºC durante una noche. La incubación con GATA4 se realizó con el sustrato de peroxidasa diaminobenzidina (DAB) para desarrollar el color, utilizando el kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.). Esta inmunotinción se observó bajo microscopía de luz de campo brillante (Leica, Wetzlar, Alemania). Para el análisis de marcadores de inflamación para el modelo KO LDLr, y del mismo modo que para GATA4, las secciones hepáticas se desparafinaron e hidrataron y tras el bloqueo, los cortes hepáticos se incubaron con el anticuerpo específico dirigido contra MOMA-2 (dilución 1:100, Abcam). La incubación de MOMA-2 se realizó con un anticuerpo secundario Goat Anti-mouse 120 IgG H&L (Alexa Fluor® 647) (dilución 1:300, Abcam) y los cortes se observaron bajo microscopía de fluorescencia (Leica, Wetzlar, Alemania). Para visualizar los núcleos, se realizó una contratinción con DAPI (dilución 1:500, Sigma Aldrich). El análisis se realizó con el software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU.) Por su parte, y para el análisis del área fibrótica en los hígados del modelo animal KO NLRP3 (grupos controles WT y grupos NLRP3-/-), las secciones cortadas (5 μm) de hígado incluidas en parafina se tiñeron con la tinción tricrómica de Masson. Las áreas fibróticas se calcularon mediante el conteo directo (aumento 40x), obteniendo el área promedio a partir de 10 imágenes por hígado. 3.15. Análisis de actividad SOD En análisis de la actividad superóxido dismutasa en tejidos hepáticos del modelo KO NLRP3 se realizó mediante un kit comercial de ensayo de actividad SOD (Canvax), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para ello se utilizaron homogenados tisulares de secciones de hígado del modelo de ratón KO NLRP3 (grupos controles WT y grupos NLRP3-/-). En este ensayo, la detección de actividad SOD se mide como el porcentaje de inhibición de la tasa de formación del compuesto WST-1 formazán (absorbancia a 450 nm). En la reacción de conversión de Xantina y O2 a ácido úrico y H2O2 por la xantina oxidasa, se generan iones superóxidos. El anión superóxido convierte el producto de tetrazolio WST-1 en un producto coloreado WST-1 formazán. La adición de SOD a esta reacción reduce los niveles de iones superóxido, disminuyendo así la velocidad de formación del compuesto WST-1 formazán. De este modo, y como se ha explicado anteriormente, la actividad de SOD es un reflejo de la inhibición de formación de este complejo. 121 3.16. Análisis estadístico Las comparaciones estadísticas entre pares se realizaron utilizando la prueba t de Student no pareada cuando las variables son paramétricas. Cuando están normalmente distribuidas se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov, mientras que cuando las variaciones son homogéneas, se utilizó la prueba F de Levenne. Para las variables no paramétricas, los grupos se compararon mediante una prueba de Mann-Whitney. Las comparaciones entre grupos con variables paramétricas se probaron utilizando ANOVA de una vía y una prueba post hoc de Tukey. En el caso de variables no paramétricas, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis. Todos los análisis se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 5.0 (La Jolla, CA, EE. UU.). Los valores se expresaron como medias ± SEM, donde los valores de p menores de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. 128 resultados indican la presencia de un inhibidor o inhibidores de la proteasa NS3/4A en todas las fracciones ensayadas, y que este o estos compuestos tienen un peso molecular bajo (≤3 kDa). Figura 13. Inhibición de la proteasa NS3/4A del VHC (genotipo 1b) en presencia de diferentes extractos de AbAEE obtenidos ultrafiltración. Control (-): control negativo de inhibición (E+S, 100 % actividad): Control (+): control positivo de inhibición (TPV 0,5 mM). Todos los datos se expresan como la media± SEM (n= 5). *p≤ 0,05/**p≤ 0,01/ ***p≤ 0,001 vs. Control. 4.2.2. Fracciones solubles AbAEE inhiben a la proteasa NS3/4A del virus de la Hepatitis C Con el fin de obtener información sobre la naturaleza química del compuesto o compuestos responsables de la inhibición de la proteasa NS3/4A in vitro, UF-3, la fracción con la mayor actividad de inhibición se fraccionó mediante ELL secuencial utilizando tres disolventes con polaridad diferente (hexano, diclorometano y acetato de etilo). El UF-3 es un extracto complejo, que contiene compuestos polares, debido a su carácter acuoso, aunque también cuenta con A c tiv id a d p ro te a s a N S 3 /4 A (1 b ) (% ) C o n tro l (-) (E + S ) A b A E E U F -1 0 0 k D a U F -2 0 k D a U F -3 k D A C o n tro l (+ ) (T P V ) 0 5 0 100 150 *** *** * *** *** 129 compuestos apolares. Este hecho justifica la selección de extractantes con diferente índice de polaridad, con el fin de mejorar el fraccionamiento y la cobertura de los compuestos identificados. De este modo, la fracción UF-3 fue fraccionada por segunda vez mediante ELL secuencial, tal y como se ha descrito en el apartado de materiales y métodos, obteniendo cuatro fracciones: fracción de hexano (HF-3 kDa), fracción de diclorometano (DMF-3 kDa), fracción de acetato de etilo (AEF-3 kDa) y fracción acuosa (AcF-3 kDa). Las cuatro fracciones obtenidas por ELL secuencial (HF-3 kDa, DMF-3 kDa, AEF-3 kDa y AqF-3 kDa), utilizando TPV 0,5 mM como control positivo, fueron analizadas para probar la actividad inhibidora de la proteasa NS3/4A VHC (genotipo 1b) in vitro. Los niveles de actividad de la proteasa (utilizando la proteína NS3 recombinante del genotipo 1b) se expresan como porcentajes referidos a un control negativo (100 %) en ausencia de inhibidores (E+S). El porcentaje de actividad NS3/4A del VHC fue de 12,3 ± 6,0 % (p≤0,001) en presencia de AcF-3 kDa, 21,1 ± 2,7 % (p≤0,001) en presencia de AEF-3 kDa, 16,4 ± 9 % (p≤0,001) en presencia de DMF-3 kDa, y finalmente, 32,8 ± 13 % (p≤0,01) en presencia de HF-3 kDa, en comparación con el control negativo. Estos datos mostraron que los grados de inhibición fueron: 87,7 % (AcF-3 kDa), 83,6 % (DMF-3 kDa), 78,9 % (AEF-3 kDa) y 67,2 % (HF-3 kDa) (Figura 14). Los extractos orgánicos se reconstituyeron en DMSO y el extracto acuoso de UF en agua destilada. Los altos niveles de actividad de proteasa en presencia de DMSO y agua destilada sugieren que ninguno de ellos interfiere con la actividad inhibitoria (datos no mostrados). 130 A c tiv id a d p r o te a s a N S 3 /4 A (1 b ) (% ) C o n tro l (-) (E + S ) H F -3 k D a A E F -3 k D a D M F -3 k D a A c F -3 k D a C o n tro l (+ ) (T P V ) 0 5 0 100 150 ** *** *** *** *** Figura 14. Inhibición de la proteasa NS3/4A del VHC (genotipo 1b) en presencia de diferentes extractos de AbAEE obtenidos por ELL secuencial. Control (-): control negativo de inhibición (E+S, 100 % actividad): Control (+): control positivo de inhibición (TPV 0,5 mM). Todos los datos se expresan como la media± SEM (n= 5). *p≤ 0,05/**p≤ 0,01/ ***p≤ 0,001 vs. Control. 4.2.3. El extracto AbAEE presenta capacidad de inhibición de diferentes genotipos de proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C Los resultados obtenidos hasta el momento en un ensayo in vitro de actividad proteasa NS3/4A del VHC (genotipo 1b), ha determinado que son fracciones de bajo peso molecular (inferior a 3 kDa) y carácter polar las que producen inhibición. Con el fin de comprobar la capacidad inhibitoria de estas fracciones de AbAEE en otros genotipos virales, se comprobó dicho efecto utilizando proteasas NS3/4A recombinante de los genotipos 2a y 3a del VHC. Los niveles de actividad de la proteasa (utilizando la proteína NS3 recombinante del genotipo 2a y 3a) se expresan como porcentajes referidos a un control negativo (100 %) en ausencia de inhibidores (E+S). El 131 porcentaje de actividad NS3/4A del VHC (genotipo 2a) fue de 22,5 ± 3,0% (p≤0,001) en presencia de AbAEE bruto y 19,47 ± 3,53% (p≤0,001) en presencia de AcF-3 kDa. Esto indica unos porcentajes de inhibición el 77,5±3,0 % (p≤0,001) en presencia de AbAEE y del 80,53±3,53 % (p≤0,001) en presencia de AcF-3 kDa (Figura 15). Usando el genotipo 3a NS3/4A del VHC, el porcentaje de actividad de proteasa fue 31,79 ± 2,27% (p≤0,001) en presencia de AbAEE bruto, y 27,09 ± 4,0% (p≤0,001) en presencia de AcF-3 kDa. Los niveles de inhibición para este genotipo son, por tanto, del 68,21±2,27 % (p≤0,001) en presencia de AbAEE y del 72,91±4,0 % (p≤ 0,001) en presencia de AcF-3 kDa (Figura 16). A c tiv id a d p r o te a s a N S 3 /4 A (2 a ) (% ) C o n tro l (-) (E + S ) A b A E E A c F -3 k D a C o n tro l (+ ) (T P V ) 0 5 0 1 0 0 1 5 0 *** *** *** Figura 15. Inhibición de la proteasa NS3/4A del VHC (genotipo 2a) en presencia de diferentes extractos de AbAEE obtenidos por ultrafiltración y ELL secuencial (AbAEE y AcF-3 kDa). Control (-): control negativo de inhibición (E+S, 100 % actividad): Control (+): control positivo de inhibición (TPV 0,5 mM). A). Todos los datos se expresan como la media± SEM (n= 5). *p≤ 0,05/**p≤ 0,01/ ***p≤ 0,001 vs. Control. 132 A c tiv id a d p ro te a s a N S 3 /4 A (3 a ) (% ) C o n tr o l (-) (E + S ) A b A E E A c F -3 k D a C o n tr o l (+ ) (T P V ) 0 5 0 1 0 0 1 5 0 *** *** *** Figura 16. Inhibición de la proteasa NS3/4A del VHC (genotipo 3a) en presencia de diferentes extractos de AbAEE obtenidos por ultrafiltración y ELL secuencial (AbAEE y AcF-3 kDa). Control (-): control negativo de inhibición (E+S, 100 % actividad): Control (+): control positivo de inhibición (TPV 0,5 mM). A). Todos los datos se expresan como la media± SEM (n= 5). *p≤ 0,05/**p≤ 0,01/ ***p≤ 0,001 vs. Control. 4.2.4. El extracto AbAEE impide la replicación viral del virus de la hepatitis C Los resultados obtenidos hasta el momento indican que aquellas fracciones AbAEE de carácter polar y peso molecular inferior a 3 kDa fueron las que presentaron mayores niveles de inhibición de actividad proteasa NS3/4A in vitro, en torno a un 88 %. Estos resultados se demuestran para los genotipos 1b, 2a y 3a del VHC. Para evaluar el efecto de estos extractos sobre la replicación del genoma del VHC, se realizó un ensayo con células Huh7.5 infectadas ARN JFH-1 del VHC (genotipo 2a). Las células fueron tratadas, tal y como se indica en el apartado de materiales y métodos, con extracto de AbAEE (0,2 mg/mL) y quercetina (50 μM), durante un período de 72 133 horas. Como era de esperar, no se observó ningún efecto tóxico. Los resultados mostraron una reducción significativa con grado de inhibición 93,3±0,21 % (p≤0,01) de los niveles intracelulares de ARN del VHC con el tratamiento de AbAEE (Figura 17). La quercetina también produjo una reducción significativa de estos niveles, con un grado de inhibición del 66,2±1 % (p≤0,01), pero no tanto como los extractos de Agaricus bisporus. En cuanto a los niveles de ARN extracelular de VHC, para lo cual se recogieron los sobrenadantes de cultivo, los tratamientos con quercetina y AbAEE redujeron la carga viral de una manera significativa, alcanzando un grado de inhibición del 39,7±0,55 % (p≤0,01) y del 33,6±3,1 % (p≤0,01), respectivamente, como consecuencia de la inhibición de la replicación del genoma del VHC (Figura 18). N iv e le s in tra c e lu la re s d e A R N V H C d e c a d e n a n e g a tiv a (% re s p e c to a l c o n tro l) J F H -1 J F H -1 + Q u e rc e tin a J F H -1 + A b A E E 0 5 0 100 150 ** ** Figura 17. Niveles de ARN intracelular de cadena negativa del VHC en células Huh7.5 infectadas con JFH1 (MOI de 1) tratadas con 50 μM de quercetina (JFH1+ Quercetina) y 0,2 mg/mL de AbAEE (JFH1+ AbAEE). Todos los datos se expresan como la media± SEM (n= 5). *p≤ 0,05/**p≤ 0,01/ ***p≤ 0,001 vs. Control. 134 N iv e le s e x tra c e lu la re s d e A R N V H C (% re s p e c to a l c o n tr o l) J F H -1 J F H -1 + Q u e r c e tin a J F H -1 + A b A E E 0 5 0 1 0 0 1 5 0 ** ** Figura 18. Niveles de ARN extracelular (%) del VHC en células Huh7.5 infectadas con JFH1 (MOI de 1) tratadas con 50 μM de quercetina (JFH1+ Quercetina) y 0,2 mg/mL de AbAEE (JFH1+ AbAEE). Todos los datos se expresan como la media± SEM (n= 5). *p≤ 0,05/**p≤ 0,01/ ***p≤ 0,001 vs. Control. Estos resultados se confirmaron con el análisis de producción extracelular de las partículas virales en células Huh7.5 tras los tratamientos indicados. Los niveles proteicos del núcleo (core) y de la proteasa NS3/4A se redujeron significativamente con el tratamiento de quercetina (0,49± 0,13, p≤0,05; 0,72±0,04, p≤0,01), respectivamente (Figura 19A). El extracto AbAEE produjo mejores resultados de inhibición, siendo los niveles proteicos del núcleo y de la proteasa NS3/4A de 0,08±0,04 (p≤0,01) y 0,02±0,02 (p≤0,001), respectivamente (Figura 19B). Estos resultados fueron normalizados frente a los niveles de β-actina. 135 Figure 19. A) Western blot representativo de los niveles proteicos de la proteasa NS3 del VHC, el núcleo o core del VHC y la β-actina en células Huh7.5 transfectadas con ARN JFH-1 (VHC genotipo 2a) y tratadas con quercetina (Q) 50 μM y AbAEE (Ab) 0,2 mg/mL. B) Niveles proteicos de la proteasa NS3 y el núcleo o core del VHC normalizados frente a los niveles de β-actina. Todos los datos se expresan como la media± SEM (n= 5). *p≤ 0,05/**p≤ 0,01/ ***p≤ 0,001 vs. Control. 4.2.5. Caracterización química del extracto AbAEE Con el objetivo de realizar una primera caracterización del extracto AbAEE para el estudio de los elementos que lo componen y su posible implicación en la inhibición de la proteasa NS3/4A, se realizó un análisis químico, tal y como se ha detallado en el apartado de materiales y métodos, por LC/MS-QTOF, en colaboración con la Prof. Dra. María Dolores Luque de Castro, del Departamento de Química Analítica de la Universidad de Córdoba (Campus Universitario de 136 Rabanales). Dado que los resultados ya obtenidos muestran que la mayor inhibición de actividad NS3 es promovida por la fracción UF-3kDa (87,7 % de inhibición) y AqF-3kDa (76,3 % de inhibición), la caracterización se realizó para dichas fracciones, además de compararlas con el resto de las fracciones orgánicas (HF-3kDa, DMF-3kDa y EAF-3kDa) obtenidas por ELL secuencial, que se muestran agrupadas por presentar resultados similares de composición. El análisis de UF-3, sin fraccionamiento por ELL secuencial, mostró 87 compuestos presentes, mientras que el análisis de AcF-3kDa detectó 91 compuestos, que pueden atribuirse al fraccionamiento orgánico por ELL (Tabla 11). La composición del extracto es compleja, y por ello se puede apreciar como la mayoría de los compuestos están presentes en las dos fracciones indicadas. Si se analiza la información obtenida de este análisis químico, existen cinco compuestos que aparecen en todas las fracciones, incluidas las orgánicas (ergotioneina, adenina, guanina, hipoxantina y xantina), destacadas en color azul en la tabla 11. Estos cinco compuestos podrían ser los posibles candidatos que participaran de manera activa en la inhibición de la proteasa, por el hecho de estar presente en fracciones para las cuales se ha encontrado actividad inhibitoria frente a la NS3/4A del VHC. Además, existen cuatro compuestos, marcados en color verde en la tabla 11 (ácido succínico, glucosamina, p-aminofenol y ornitina), que aparecen en la fracción AcF3kDa y en la UF-3kDa, pero no en las fracciones orgánicas, pudiendo completar, como elementos más específicos o con mayor potencial de inhibición, el conjunto de compuestos inhibidores frente a la proteasa NS3, ya que es la fracción AcF-3kDa la que mayores porcentajes de inhibición presenta en comparación con el resto de las fracciones. 137 Tabla 11. Lista de metabolitos identificados por LC/MS-QTOF en las diferentes fracciones de AbAEE (UF-3kDa, AcF-3kDa y fracciones orgánicas obtenidas por ELL secuencial HF-3kDa, DCM-3kDa y EAF-3kDa agrupadas). Metabolito UF-3kDa AcF-3kDa OrgF-ELL Derivados de alcaloides 2metilpirrolidina + + - Alquilaminas Ácido pantoténico + + - Espermidina + + - Pirrolinas Pirrolina-1 + + - Aminoácidos y derivados Acetilcarnitina + + - Citrulina + + - Ergotioneina + + + L-agaritina + + - L-arginina + + - L-asparagina + + - Ácido L-aspártico + + - L-carnitina + + - L-glutamato + + - L-glutamina + + - L-isoleucina + + - L-Leucina + + - L-Lisina + + - L-metionina + + - L-fenialanina + + - L-prolina + + - L-serina + + - L-treonina + + - L-triptófano + + - L-tirosina + + - L-valina + + - Ornitina + + - Péptidos Glutatión oxidado + + - Indoles Formil-indol - - + Indol-3-acetato - - + Ácidos carboxílicos y derivados Ácido cítrico + + - Ácido láctico + + - Ácido málico + + - Ácido succínico + + - Ácido cinámico y derivados Ácido p-cumárico + + - Disacáridos 144 Los primeros resultados obtenidos corresponden a la cinética del peso corporal del ratón durante el período de tiempo de 12 semanas. Los grupos alimentados con dieta alta en grasa, tanto los grupos control (HFD45) como los alimentados con el extracto AbAEE (HFD60+AB), mostraron un peso corporal significativamente mayor en comparación con los grupos alimentados con dieta baja en grasa o grupos LFD (p≤0,01 entre grupos de control, p≤0,05 entre grupos tratados) (Figura 25A). Sin embargo, al hacer la comparación entre aquellos ratones alimentados con dieta alta en grasa, el análisis de los resultados es diferente. Los ratones HFD60+AB presentan un mayor contenido en grasa (60%) que su control HFD45 (45% contenido en grasa) y, a pesar de esta diferencia, presentan valores de peso corporal final similares (Figura 25A). Esto es un indicativo de que los extractos AbAEE regulan el peso corporal, ya que el alto contenido en grasa de los grupos tratados no generó una subida de peso en comparación con su control, con menor contenido en grasa. En cuanto a la ganancia de peso, el área bajo la curva para el peso corporal aumentó significativamente en los grupos HFD en comparación con los grupos LFD (p≤0,001 en grupos control; p≤0,01 en grupos tratados con AbAEE) (Figura 25B). Los niveles de glucosa en sangre aumentaron significativamente en ambos grupos HFD, control HFD45 y HFD60+AB, tras un período de 12 semanas, en comparación con los dos grupos LFD, tanto el control como LFD+AB (p≤0,05 entre los grupos de control, p≤0,01 entre los grupos tratados) (Figura 25C). Del mismo modo que con el parámetro de peso corporal, no se observaron diferencias en los niveles de glucosa entre grupos HFD45 y HFD60+AB, a pesar del mayor contenido de grasa y calorías de la dieta en este último grupo (Figura 25C). Finalmente, los niveles de GOT/AST aumentaron significativamente en el grupo control HFD45 en comparación con los niveles del grupo control LFD (p≤0,001) tras 12 semanas (Figura 25D). En los grupos tratados con AbAEE la tendencia fue similar, aunque menos pronunciada, y sin encontrar diferencias significativas (Figura 25D). Es importante tener en cuenta que la dieta HFD60+AB mostró los mismos niveles de GOT/AST que el grupo HFD45, a pesa del mayor contenido en grasa y calorías. 145 Figura 25. Peso corporal y parámetros bioquímicos en sangre de ratones knock-out (KO) del receptor de LDL (LDLr- /-) durante 12 semanas de intervención nutricional con AbAEE. A) Cambios en el peso corporal durante un período de 12 semanas B) Área bajo la curva de los pesos corporales C) Glucemia durante un período de 12 semanas D) Niveles finales de GOT/AST. Todos los datos se expresan como la media± SEM (n= 5 por grupo). *p≤ 0,05/ **p≤ 0,01/ ***p≤ 0,001 LFD vs HFD45; #p≤0,05/ ##p≤0,01/ ###p≤ 0,001 LFD+AB vs HFD60+AB; αp≤0,05/ ααp≤0,01/ αααp≤0,001 LFD vs LFD+AB; βp≤0,05/ ββp≤0,01/ βββp≤0,001 HFD45 vs HFD60+AB; †p≤0,05/ ††p≤0,01/ †††p≤0,001 LFD vs HFD60+AB; γp≤ 0,05/ γγp≤ 0,01/ γγγp≤ 0,001 HFD45 vs LFD+AB. 4.3.3. Los extractos AbAEE reducen los niveles génicos de marcadores fibróticos y de estrés oxidativo en ratones EHGNA. Los resultados obtenidos en relación con los procesos de fibrosis hepática y estrés oxidativo in vitro hacen necesario el estudio de los mismos marcadores en un modelo in vivo (modelo animal de ratón KO LDLr), con el fin de confirmar los efectos antifibróticos y antioxidantes de los extractos AbAEE. Tal y como se sospechaba, los resultados obtenidos in vivo fueron un claro 146 reflejo de los obtenidos in vitro. El tratamiento con AbAEE redujo significativamente los niveles génicos de Col-1α-1 (0,45±0,06 en el grupo LFD+AB (Control LFD 1±0,40) y 0,56±0,03 (p≤0,05) en el grupo HFD60+AB (Control HFD45 1,65±0,38) (Figura 26A), incrementando los niveles del factor protector Gata4 en el grupo LFD+AB hasta alcanzar valores de 1,38±0,13 (p≤0,05) (Control LFD 0,5±0,22) y de 1,44±0,03 (p≤0,01) en el grupo HFD60+AB (Control HFD45 0,18±0,02) (Figura 26B). Los niveles génicos de estrés oxidativo también se vieron reducidos con el tratamiento con AbAEE: los ratones LFD+AB presentaron niveles de Sod2 de hasta 0,05±0,002 (p≤0,05) (Control LFD 0,9±0,06) y 0,7±0,02 (p≤0,01) en el grupo HFD+AB (Control HFD 5,7±0,23) (Figura 27A), y del marcador inflamatorio Nos2 de 0,65±0,08 en el grupo LFD+AB (Control LFD 0,66±0,18) y 0,73±0,03 (p≤0,05) en el grupo HFD+AB (Control HFD 2,5±0,38) (Figura 27B). Figura 26. Análisis de expresión génica de marcadores de fibrosis y estrés oxidativo en hígados de ratones knock-out (KO) del receptor de LDL (LDLr-/-) tras 12 semanas de intervención nutricional con AbAEE. A) Col-1-α-1 B) Gata4. Todos los datos se expresan como la media± SEM (n= 5 por grupo). *p≤ 0,05/ **p≤ 0,01/ ***p≤ 0,001 LFD vs HFD45; #p≤0,05/ ##p≤0,01/ ###p≤ 0,001 LFD+AB vs HFD60+AB; αp≤0,05/ ααp≤0,01/ αααp≤0,001 LFD vs LFD+AB; βp≤0,05/ ββp≤0,01/ βββp≤0,001 HFD45 vs HFD60+AB; †p≤0,05/ ††p≤0,01/ †††p≤0,001 LFD vs HFD60+AB; γp≤ 0,05/ γγp≤ 0,01/ γγγp≤ 0,001 HFD45 vs LFD+AB. 147 Figura 27. Análisis de expresión génica de marcadores de fibrosis y estrés oxidativo en hígados de ratones knock-out (KO) del receptor de LDL (LDLr-/-) tras 12 semanas de intervención nutricional con AbAEE. A) Sod2 B) Nos2. Todos los datos se expresan como la media± SEM (n= 5 por grupo). *p≤ 0,05/ **p≤ 0,01/ ***p≤ 0,001 LFD vs HFD45; #p≤0,05/ ##p≤0,01/ ###p≤ 0,001 LFD+AB vs HFD60+AB; αp≤0,05/ ααp≤0,01/ αααp≤0,001 LFD vs LFD+AB; βp≤0,05/ ββp≤0,01/ βββp≤0,001 HFD45 vs HFD60+AB; †p≤0,05/ ††p≤0,01/ †††p≤0,001 LFD vs HFD60+AB; γp≤ 0,05/ γγp≤ 0,01/ γγγp≤ 0,001 HFD45 vs LFD+AB. 4.3.4. Los extractos AbAEE reducen la fibrosis e inflamación hepática en ratones EHGNA alimentados con dieta alta en grasa. Se hicieron diferentes análisis para comprobar el efecto que los extractos AbAEE tenían sobre la esteatosis y los niveles proteicos de marcadores fibrogénicos y de inflamación en el modelo de ratón KO LDLr. La tinción con H&E dio una idea del grado de esteatosis en los distintos grupos de ratones. La esteatosis aumentó en aquellos grupos tratados con AbAEE en comparación con los grupos control no tratados, con independencia de las dietas (Figura 28A, arriba). A pesar de ello, los resultados con tinción Sirius Red mostraron, de manera significativa, una menor acumulación de fibras de colágeno, y, por tanto, menor grado de fibrosis, en los grupos tratados con AbAEE en comparación con los no tratados (LFD vs LFD+AB (p≤0,05); HFD45 vs HFD60+AB (p≤0,05)). Además, la acumulación de fibras de colágeno fue mayor, de manera significativa, en el grupo control HFD45 en comparación con el control LFD (p≤0,01), mientras que esto no ocurrió entre 148 los grupos HFD60+AB y LFD45+AB, a pesar del mayor porcentaje en grasa y calorías que la dieta del grupo de ratones HFD60+AB presentaban (Figura 28A, medio y Figura 28B). Figura 28. Análisis histológico del daño en el hígado inducido por una dieta HFD en ratones knock-out (KO) del receptor de LDL (LDLr-/-) tras un período de 12 semanas de intervención nutricional con extracto AbAEE. A) Secciones representativas del hígado. Arriba: Tinción H&E, Medio: Tinción Sirius Red, Abajo: Inmunohistoquímica GATA4 (40x, escala =100 µm) B) % área de fibras hepáticas de colágeno teñidas con Sirius Red. C) Cuantificación de células positivas para GATA4. Todos los datos se expresan como la media± SEM (n= 5 por grupo). *p≤ 0,05/ **p≤ 0,01/ ***p≤ 0,001 LFD vs HFD45; #p≤0,05/ ##p≤0,01/ ###p≤ 0,001 LFD+AB vs HFD60+AB; αp≤0,05/ ααp≤0,01/ αααp≤0,001 LFD vs LFD+AB; βp≤0,05/ ββp≤0,01/ βββp≤0,001 HFD45 vs HFD60+AB; †p≤0,05/ ††p≤0,01/ †††p≤0,001 LFD vs HFD60+AB; γp≤ 0,05/ γγp≤ 0,01/ γγγp≤ 0,001 HFD45 vs LFD+AB. 149 El número de células hepáticas estrelladas positivas para GATA4 (Figura 28A, abajo) fue similar entre los grupos de alimentación de LFD, tanto los tratados con AbAEE como los controles. Los resultados obtenidos de los grupos de alimentación HFD determinaron niveles similares, sin diferencias significativas, entre los grupos HFD45 y HFD60+AB, a pesar de estar este último grupo alimentado con una dieta más alta en grasa y calorías (Figura 28A, abajo y Figura 28C). Finalmente, y debido a la relación existente entre fibrosis, estrés oxidativo e inflamación, se midieron la cantidad de células positivas para MOMA-2 (marcador inflamatorio) en los diferentes grupos de ratones KO LDLr. Los resultados mostraron una reducción significativa de células MOMA-2 en el grupo HFD60+AB (p≤0,01), en comparación con su control HFD45 (Figura 29A y Figura 29B), a pesar del mayor contenido de grasas y calorías en esta dieta. También se observó una reducción significativa en las células MOMA-2 en el grupo LFD+AB (p≤0,05) en comparación con su control LFD (Figura 29). Figura 29. Análisis de la inflamación inducida por una dieta HFD en ratones knock-out (KO) del receptor de LDL (LDLr-/-) tras un período de 12 semanas de intervención nutricional con extracto AbAEE. A) Inmunohistoquímica con un anticuerpo específico dirigido contra MOMA-2 (rojo). Núcleo fue contrateñido con DAPI (azul) (40x, escala= 50 150 µm). B) Cuantificación de células positivas para MOMA-2. Todos los datos se expresan como la media± SEM (n= 5 por grupo). *p≤ 0,05/ **p≤ 0,01/ ***p≤ 0,001 LFD vs HFD45; #p≤0,05/ ##p≤0,01/ ###p≤ 0,001 LFD+AB vs HFD60+AB; αp≤0,05/ ααp≤0,01/ αααp≤0,001 LFD vs LFD+AB; βp≤0,05/ ββp≤0,01/ βββp≤0,001 HFD45 vs HFD60+AB; †p≤0,05/ ††p≤0,01/ †††p≤0,001 LFD vs HFD60+AB; γp≤ 0,05/ γγp≤ 0,01/ γγγp≤ 0,001 HFD45 vs LFD+AB. 151 4.4. EL COMPLEJO NLRP3 INFLAMASOMA COMO DIANA CLAVE EN LA REGULACIÓN DE LA ENFERMEDAD EHGNA: FIBROSIS, METABOLISMO LIPÍDICO Y ESTRÉS OXIDATIVO. Los resultados obtenidos hasta el momento, tal y como se ha descrito en apartados anteriores, otorgan propiedades antifibróticas, antioxidantes y antiinflamatorias a los extractos de Agaricus bisporus. El proceso de fibrosis hepática puede desencadenarse por daños hepáticos provocados, inicialmente, por diferentes factores, siendo uno de ellos la acumulación anormal de lípidos, derivada de una esteatosis o, concretando en algo más específico, una EHGNA. Esta acumulación anormal de lípidos genera un incremento de especies reactivas de oxígeno que activan las vías inflamatorias, provocando finalmente la activación de células estrelladas hepáticas que se vuelven fibrogénicas, y que derivan a un proceso fibrótico más grave. Estos procesos, como ya se ha descrito en apartados anteriores, son regulados por los extractos AbAEE, por lo que el estudio de cada uno de ellos en un modelo animal KO NLRP3 podría aportar información sobre cómo la vía inflamatoria influye en dichos procesos, y, por tanto, cómo se regulan a través de esta. Con el fin de profundizar en el mecanismo por el que los extractos reducen marcadores de daño hepático y su relación con las vías inflamatorias, se realizó un estudio con ratones KO del complejo inflamasoma NLRP3 para medir diferentes marcadores de fibrosis, metabolismo lipídico y estrés oxidativo. 4.4.1. La ausencia del complejo NLRP3 inflamasoma no afecta al peso corporal de los ratones, pero reduce los niveles de colesterol en sangre Los primeros resultados obtenidos corresponden a los valores de peso corporal de los ratones durante el período de tiempo de 20 meses. Los resultados no mostraron diferencias significativas en la ganancia de peso final entre los ratones control WT y aquellos que carecen del complejo NLRP3, tan sólo una leve reducción en ratones jóvenes (3 meses) y adultos (12 meses) del grupo NLRP3-/-, valores que incrementaba en ratones viejos (20 meses) respecto a su control WT, aunque 152 prácticamente se mantenía en valores similares de peso (Figura 30A). Lo que sí se observó fue una tendencia ascendente en la ganancia de peso a lo largo del tiempo desde 3 hasta los 20 meses (Figura 30A). La ganancia de peso se relaciona con la ingesta, la cual tampoco muestra diferencias significativas entre grupos controles WT y grupos NLRP3-/- (Figura 30B). La ingesta es ligeramente mayor en ratones jóvenes (3 meses) y adultos (12 meses) NLRP3-/- en comparación con sus controles WT, mientras que, en aquellos de 20 meses, la ingesta se ve ligeramente incrementada en los ratones WT. La tendencia en la ingesta de alimentos es descendente a lo largo del tiempo. Esto quiere decir que la ingesta de alimentos y la ganancia de peso a lo largo de 20 meses es inversamente proporcional, efecto que se ve más claro en aquellos ratones ausentes del complejo NLRP3 (Figura 30B). Por su lado, los niveles de colesterol en sangre se redujeron significativamente en los ratones NLRP3-/- JO (p≤0,05) y aún más en los grupos de ratones NLRP3-/- VJ (p≤0,001) en comparación con sus controles WT (Figura 30C). Los niveles de glucosa no mostraron diferencia entre los grupos controles WT JO y los grupos ausentes del complejo NLRP3 en ratones jóvenes, aunque sí se apreció una reducción significativa (p≤0,001) de los niveles de glucosa en aquellos ratones viejos NLRP3-/- VJ en comparación con sus controles WT VJ (Figura 30D). 153 Figura 30. Peso corporal, ingesta y parámetros bioquímicos en sangre de ratón knock-out (KO) del complejo NLRP3 inflamasoma (NLRP3-/-) durante 20 meses. A) Ganancia peso corporal (g) B) Ingesta de alimentos (g) por gramo de peso corporal C) Niveles finales de colesterol (mg/g de hígado) D) Niveles finales glucosa en sangre (mg/dL). Todos los datos se expresan como la media± SEM (n= 2 por grupo). *p≤ 0,05/ **p≤ 0,01/ ***p≤ 0,001 NLRP3-/- (JO/VJ) vs WT (JO/VJ); #p≤0,05/ ##p≤0,01/ ###p≤ 0,001 WT JO vs WT VJ; αp≤0,05/ ααp≤0,01/ αααp≤0,001 NLRP3-/- JO vs NLRP3-/- VJ. 4.4.2. La ausencia del complejo NLRP3 inflamasoma mejora los niveles de marcadores de metabolismo lipídico en ratones KO NLRP3 La ausencia del complejo NLRP3 inflamasoma alteró los niveles de marcadores metabólicos en comparación con los controles WT. Se observaron niveles proteicos reducidos de MTP, un marcador de metabolismo lipídico, en aquellos ratones NLRP3-/- en comparación a sus controles inhibits mTOR and triggers autophagy in breast, ovarian, and cervical cancer cell lines (Brüning, Rahmeh, & Friese, 2013). Sorafenib promoted an early perturbation of the mitochondrial function, ATP depletion and AMPK‐dependent inhibition of the mTORC1 pathway in breast cancer cells (Fumarola et al., 2013). In addition, the sustained activation of phosphatidylinositol 3‐Kinase (PI3K)/AKt upregulating mTOR has also been related to sorafenib resistance in HCC cells (Chen et al., 2011). In the current study, we observed that sorafenib (10 µM) caused an early and progressive reduction (3–24 hr) of Ser2481 P‐mTOR phosphorylation in HepG2 (Figure 4a), as well as in Hep3B and Huh7 cells (Supporting Information Figure S3). Sorafenib (10 µM) induced an early upregulation of Thr308 P‐AKt phosphorylation (6–12 hr) followed by downregulation of Thr308 P‐Akt and Ser473 P‐Akt phosphorylation (24–48 hr; Figure 4b). Sorafenib also induced a rapid and transient increase of Thr172 P‐AMPK phosphorylation (6–12 hr; Figure 4c). Data suggest that mTOR inhibition may be related to the combined signaling of AKt inhibition and AMPK activation. The inhibition of mTOR by sorafenib has a great impact on protein translation. The polysome profiles in control cells were obtained by observing free 40S and 60S ribosomal subunits, 80S ribosomes, and actively translating polysomes. However, sorafenib (10 µM) resulted in abnormal polysome profiles, with a dramatic increase of the 80S peak and a reduction of polysomes (Figure 4d). Salt treatment dissociated most of the 80S peak into free 40S and 60S ribosomal subunits, indicating that the large 80S ribosome population was mostly nontranslating vacant ribosomes rather than monosomes engaged with mRNA (Supporting Information Figure S4). The nutrient deprivation, growth factor withdrawal or hypoxia are related to autophagy induction (He & Klionsky, 2009). The most important pathways involved in autophagy modulation are mTORC1 and AMPK (Prieto‐Dominguez et al., 2016). We used the double fluorescent‐tagged LC3 (pDest‐LC3‐GFP‐mCherry) plasmid to distinguish autophagosomes from autolysosomes, transmission electronic microscopy (TEM), and biochemical markers to follow RODRÍGUEZ‐HERNÁNDEZ ET AL. | 699 FIGURE 4 Kinetic study of the phosphorylation of mTOR (a), AKt (b), AMPK (c), as well as the alteration in the polysome profile (d) in HepG2 cells treated with sorafenib (10 µM). The protein expression was determined by western‐blot. Polysome profiles were generated following the procedure described in Material and Methods after 12 hr of sorafenib (10 µM) treatment. Results are expressed as mean ± standard error of the mean, and with the blots are representative of four independent experiments. *p≤0.05, **p≤0.01 and ***p≤0.001 between control and sorafenib‐treated cells. The groups with different letters (a, b, c, or d) were significantly different (p≤0.05). AMPK, 5′AMP‐activated protein kinase; mTOR, mammalian target of rapamycin the induction and progression of autophagy flux. We found that sorafenib induced autophagolysosome formation in mRFP‐EGFP‐ LC3‐transfected cells (Figure 5a), a fact confirmed by TEM imaging (Figure 5b). The quantification of the phagolysosomes (black line) and phagosomes (grey line; Supporting Information Figure S5) and biochemical markers (p62, Beclin‐1, and LC3II/I) in HepG2 (Figure 5c) showed that autophagy induced by sorafenib (10 µM) was only transiently active (6–12 hr). 3.5 | The inhibition of the ER stress and AMPK downregulated autophagy and increased apoptosis in sorafenib‐treated HepG2 cells We have evaluated the specific role of ER stress arms and AMPK on autophagy and apoptosis using si‐RNA technology and dorsomorphin, respectively. Data showed that IRE1αand PERK were deeply involved in sorafenib‐induced autophagy, whereas a minor effect of ATF6 was also observed (6 hr; Figure 6a). Thus, the reduction of autophagy by si‐IRE1αand si‐PERK increased sorafenib (10 µM)‐induced caspase‐3 activity (Figure 6b) and PARP cleavage (Figure 6c) in HepG2. Moreover, the AMPK inhibition by dorsomorphin reduced Thr172 P‐AMPK/AMPK, Ser413 P‐Foxo3a/Foxo3a, and Beclin‐1 expression induced by sorafenib (Figure 6d; 12 hr). However, the sustained reduction of the activating phosphorylation of Thr172 P‐AMPK/AMPK by dorsomorphin was related to a drastic upregulation of Beclin‐1 expression (Figure 6d), and downregulation of caspase‐3 activity (Figure 6e) and PARP cleavage (Figure 6f) at 24 hr in sorafenib‐ treated HepG2 cells. In addition, the antiapoptotic properties of autophagy were further confirmed using autophagic inhibitors 3MA and CQ by the upregulation of sorafenib (10 µM)‐induced caspase‐3 activity (Figure 6g) and PARP cleavage (Figure 6h) in HepG2 (24 hr). 3.6 | Sorafenib regulated the activation of JNK and Foxo3a, and the expression of proapoptotic, and antiapoptotic Bcl‐2 family members The Bcl‐2 family is a well characterized protein family including antiapoptotic members (Bcl‐2, Mcl‐1, and Bcl‐xL), proapoptotic effectors (Bax and Bak) and proapoptotic BH3‐only members, which include the BH3‐only direct activators Bim, Bid, and Puma (Kim et al., 2006) and the sensitizers/repressors such as Noxa, Bad, Bik, Bmf, and HRK (Willis et al., 2007). The interactions among them, as well as with the autophagic component Beclin‐1, result in a potential switch between autophagic and apoptotic cell death pathways. The induction of apoptosis by sorafenib has been related to activation of Bax and Bak, and increased expression of proapoptotic “BH3‐domain only”PUMA and BIM, as well as decreased protein levels of the antiapoptotic Mcl‐1 (Fernando et al., 2012). The expression of Bim, Bak, Bax, tBid, Bcl‐2, Bcl‐xL, Beclin‐1, and Mcl‐1 in sorafenib (10 nM and 10 µM)‐treated HepG2 cells is shown in Figure 7a and Supporting Information S6a and S6b. The line chart in Figure 7b shows the profile throughout time in the expression of mentioned proteins. Our data suggest that sorafenib (10 µM) induced a rapid drop of Mcl‐1 protein expression, as well as transient and moderate increase of tBid, Bim EL Bcl‐2 and Bcl‐xL (3–6 hr) overlapping with the increase of Beclin‐1(3–12 hr). The expression of tBid drastically dropped below the control value at 6 hr, and Bcl‐2, Bcl‐xL and Beclin‐1 expressions were reduced at 12 hr after sorafenib treatment (Figure 7b). Among the proapoptotic members, only Bim EL showed a sustained increase throughout the kinetic study, reaching the highest value at 24 hr (Figure 7). Bak also showed a moderate rise throughout the study, while Bax expression increased transiently (3–6 hr) returning expression to the control level (Figure 7). The activation of JNK has been related either to ER‐related autophagy (Ogata et al., 2006) or apoptosis (Dhanasekaran & Reddy, 2008) according to different experimental conditions. The stimulation of ER‐induced autophagy by sorafenib showed above was associated with the transient activation of JNK as measured by Thr183, Tyr185 P-JNK1/2/JNK1/2 ratio (3–12 hr; Figure 7c and 7d). The inhibition of the Thr183,Tyr185 P-JNK1/2/JNK1/2 ratio was assessed using the specific inhibitor SP600125 (Figure 7d). The treatment reduced cell proliferation in control and sorafenib‐treated HepG2 cells (33% and 41% at 12 hr, and 53% and 22% at 24 hr, respectively; Figure 7e). In contrast, SP600125 increased caspase‐3 in control and sorafenib‐treated HepG2 cells (Figure 7f). The activation of Foxo and its proapoptotic properties is under regulation of multiple cell signaling (Farhan et al., 2017). The inhibitory phosphorylation Thr32 P‐Foxo3a was transiently upregulated at 6–12 hr, while dropped afterwards in sorafenib (10 µM)‐ treated HepG2 cells (Figure 7g). The role of Bim, Bak, and Bax has also been assessed using si‐RNA technology. The reduction of Bim, but not Bak and Bax, by si‐RNA recovered caspase‐3 control levels in sorafenib (10 µM)‐ treated HepG2 (Figure 8a; 24 hr). The reduction of apoptosis by si‐RNA Bim was associated with upregulation of p62 expression and LC3II/LC3I ratio, but without alteration of Beclin‐1 expression in sorafenib‐treated HepG2 cells (Figure 8b). The immunoprecipitation experiments showed that Bim, but not Bak and Bax, was able to bind Beclin‐1 (Figure 8c). 4 | DISCUSSION Sorafenib is, to date, the only approved first‐line systemic therapy for patients in advanced stages of HCC. This chemotherapeutic drug has demonstrated a moderate but significant increase of mean overall survival in patients with good liver function based on the results in SHARP and Asia‐Pacific clinical trials (7.9 to 10.7 months in Llovet et al., 2008; and from 4.2 to 6.5 months in Cheng et al., 2009; respectively). Beneficial effects have also been reported in patients with thyroid cancer, acute myeloid leukemia, advanced renal cell carcinoma, or prostate cancer (Antar, Kharfan‐Dabaja, Mahfouz, & Bazarbachi, 2015; Chi et al., 2008; Escudier et al., 2007; Luo et al., 2014). Although sorafenib has been effective in extending the overall 700 | RODRÍGUEZ‐HERNÁNDEZ ET AL. RODRÍGUEZ‐HERNÁNDEZ ET AL. | 701 FIGURE 5 Evaluation of autophagic flux (a), presence of autophagolysosomes by electronic transmission microscopy (b) and expression of autophagy markers p62, Beclin‐1, and LC3II/I (c) in HepG2 cells treated with sorafenib (10 nM and 10 µM). The autophagic flux was assessed in HepG2 transfected with double‐tagged pDest‐LC3‐GFP‐mCherry plasmid, which is a pH‐sensitive sensor to monitor autophagy in live cells (6 hr). The GFP tag is acid‐sensitive while the mCherry tag is acid‐insensitive. Yellow merge punctate structures indicate autophagosomes which neutral pH allows both tags emit fluorescent light resulting in a yellow staining. Subsequent fusion of autophagosomes with lysosomes results in red‐positive acidic vacuoles where the green fluorescence from GFP is lost. Arrows indicate a typical example of colocalized particles of GFP and mCherry signal, while the arrowhead indicates a typical example of a particle with mCherry signal but without GFP signal due to its degradation. Sorafenib was used at a concentration of 10 µM, while EBSS was used as positive control treatment and chloroquine (50 µM) was used to inhibit autophagic flux. The presence of autophagolysosomes in HepG2 cells treated with sorafenib (10 µM) was also detected by transmission electronic microscopy (12 hr) following the procedure described in Material and Methods. The protein expression of autophagy markers (p62, Beclin‐1, and LC3 II/I) was assessed at 6, 12 and 24 hr in sorafenib (10 nM and 10 µM)‐treated HepG2 cells by western‐blot procedure as described in Material and Methods. Results are expressed as mean ± standard error of the mean, and with the blots and images are representative of four independent experiments. *p≤0.05, **p≤0.01, and ***p≤0.001 between control and sorafenib‐treated cells. The groups with different letters (a, b, c, or d) were significantly different (p≤0.05) [Color figure can be viewed at wileyonlinelibrary.com] 702 | RODRÍGUEZ‐HERNÁNDEZ ET AL. FIGURE 6 Effect of knock‐down of ER stress branches, and inhibition of AMPK and autophagy in sorafenib‐induced autophagy and apoptosis in HepG2. HepG2 cells were first transfected with IRE1α, PERK, and ATF6 si‐RNA duplexes for 48 hr to assess their role in autophagy (a) and apoptosis (b,c). The expression of IRE1α, Ser51 P‐eIF2α/eIF2αand ATF6 was determined to validate si‐IRE1α,si‐PERK, and si‐ATF6 treatments (a). Afterwards, cells were treated for 6 hr with sorafenib (10 nM and 10 µM) and harvested for analysis. The inhibition of AMPK was carried out by dorsomorphin (5 µM) with or without coadministration with sorafenib (10 µM) being measured Thr172 P‐AMPK/AMPK, Ser413 FOXO3a/FOXO3a, and Beclin‐1 (d) as well as caspase‐3 activity (e) and cleaved PARP (f) at 12 and 24 hr. The inhibition of autophagy by 3‐methyl adenine (3MA; 5 µM) or chloroquine (50 µM) administered 2 hr before sorafenib (10 µM) induced caspase‐3 activity (g) and cleaved PARP protein expression (h) at 24 hr. Autophagy was biochemically followed by the measurement of p62, Beclin‐1 and LC3II/I protein expression by western‐blot analysis as described in Material and Methods. Apoptosis was analyzed by caspase‐3 activity and cleaved PARP protein expression as described in Material and Methods. Results are expressed as mean ± standard error of the mean, and with the blots are representative of four independent experiments. *p≤0.05, **p≤0.01 and ***p≤0.001 between Control and sorafenib‐treated cells. The groups with different letters (a, b, c, d, e, or f) were significantly different (p≤0.05). AMPK, 5′AMP‐activated protein kinase; ER, endoplasmic reticulum; PERK, pancreatic ER kinase (PKR)‐like ER kinase survival of patients, only a minor percentage of patients (2%) displayed partial response to therapy based on response evaluation criteria in solid tumors (RECIST) criteria (Llovet et al., 2008), the low response rate being mainly attributed to intrinsic resistance of HCC cells to sorafenib (Villanueva & Llovet, 2012). Several studies have provided mutational profile and identified an average of 30–40 mutations per tumor; among which 5–8 might be driver mutations, as well as high‐level amplifications of oncogenes in specific chromosome RODRÍGUEZ‐HERNÁNDEZ ET AL. | 703 FIGURE 7 Kinetic study of the expression of Bcl‐2 family members and Beclin‐1 (a,b), JNK phosphorylation (c), and its inhibition on JNK phosphorylation (d), cell proliferation (e) and caspase‐3 (f), as well as Foxo3a phosphorylation (g) in sorafenib‐treated HepG2 cells. The effect of sorafenib (10 nM and 10 µM) on the expression of Bcl‐2 family members and Beclin‐1werefollowedat3,6,12,and24hrbywestern‐blot analysis. The effect of sorafenib (10 nM and 10 µM) on the Thr183,Tyr185 P-JNK1/2/JNK1/2 and Thr32 P‐Foxo3a/Foxo3a protein expression ratio was determined at different time points according to the experiment (3–48 hr). The inhibition of JNK was assessed by the administration of SP600125 (20 µM) added to cell culture 12 hr before sorafenib (10 µM) treatment. Cell proliferation was determined by BrdU incorporation as described in Material and Methods. Caspase‐3 activity was measured by commercial chemiluminescence‐based assay as described in Material and Methods. Results are expressed as mean ± standard error of the mean, and with the blots are representative of four independent experiments. *p≤0.05 and **p≤0.01 between control and sorafenib‐treated cells. The groups with different letters (a, b, c, d, e, or f) were significantly different (p≤0.05). JNK, c‐Jun‐N‐terminal kinase regions. All influence high resistance and reduced extended survival rate during sorafenib treatment in HCC (Llovet, Villanueva, Lachenmayer, & Finn, 2015). Sorafenib triggers antiproliferative and antiangiogenic effects through inhibition of the activity of several tyrosine kinase receptors including VEGFR‐2/3, PDGFR‐β, Flt3, and c‐Kit, nonreceptor tyrosine kinase receptors such as Flt3, as well as Raf serine/threonine kinase (Cervello et al., 2012; Wilhelm et al., 2004). Antiproliferative and antiangiogenic effects induced by sorafenib, both in vitro and in vivo conditions, are driven through different mechanisms and promote apoptosis via both the extrinsic and the intrinsic pathway in HCC cells (Fernando et al., 2012). The in vivo administration of sorafenib (200 mg/kg) reduced tumor growth characterized by reduction of cell proliferation (ki67) and promoted apoptosis (caspase‐3, cleaved PARP, and TUNEL) in tumors developed from subcutaneously HCC implanted cells in nude mice (Figure 1 and Supporting Information Figure S1). Sorafenib also increased Beclin‐1 and LC3II/LC3I, but did not reduce the p62 expression in tissue homogenate, which may reflect high autophagic turnover in coexistence with apoptotic processes (Figure 1d). The effectiveness of sorafenib is probably a result of a balance between targeting cancer cells and the microenvironment (Llovet et al., 2015). In this sense, it is interesting to notice that the administration of sorafenib reduced fibrogenesis (α‐SMA), angiogenesis (CD31), and the presence of hematopoietic stem cells (CD34) in tumors (Supporting Information Figure S1). These results, as well as those related to the antiproliferative 704 | RODRÍGUEZ‐HERNÁNDEZ ET AL. FIGURE 8 Effect of knock‐down of Bim, Bak, and Bax on caspase‐3 activity (a) and autophagic markers (p62, Beclin‐1, and LC3II/I) (b), as well as the binding capacity of Beclin‐1 to Bim, Bak, and Bax (c) in sorafenib‐treated HepG2 cells. The expression of Bim, Bak, and Bax was determined to validate si‐Bim, si‐Bak, and si‐Bax treatments (a). The variables were determined at 24 hr after sorafenib (10 µM) administration. Caspase‐3 activity was measured by commercial chemiluminescence‐based assay as described in Material and Methods. The protein expression of autophagy markers and proapoptotic Bcl‐2 family members was assessed by western‐blot analysis. The immunoprecipitation procedure of Beclin‐1 is described in Material and Methods. The immunoprecipitation using unspecific mouse IgG and anti‐Beclin‐1 antibodies were run in parallel. The expression of Bim, Bak, and Bax has also been measured in the cell lysate. Results are expressed as mean ± standard error of the mean, and with the blots are representative of eight independent experiments. *p≤0.05, **p≤0.01, and ***p≤0.001 between control and sorafenib‐treated cells. The groups with different letters (a, b, c, and d) were significantly different (p≤0.05) properties of the drug, are mostly dependent on the inhibition of tyrosine kinase receptors and the Raf/MEK/ERK. The mechanism by which sorafenib induces apoptosis is not fully elucidated, and the effectiveness and adverse events are related to the dose used. The mean trough sorafenib concentration is 4.3 ± 2.5 mg/L in cancer patients under sorafenib monotherapy with the recommended dose (400 mg, 12 hr), which are increased up to 7.7 ± 3.6 mg/L in patients who experienced grade 3 drug‐related adverse events (Blanchet et al., 2009). The corresponding therapeutic concentration of sorafenib used in the study is 10 µM. It has been associated with the inhibition of phosphorylation of the initiation factor eIF4E and loss of the antiapoptotic Bcl‐2 family members Mcl‐1 which appear to occur through a MEK/ERK independent mechanism in different cancer cell lines treated with sorafenib (Rahmani, Davis, Bauer, Dent, & Grant, 2005; Yu et al., 2005). Mcl‐1, an antiapoptotic member of the Bcl‐2 family, has been shown to be an important factor for apoptosis resistance in HCC (Fleischer et al., 2006). Sorafenib (10 µM) reduced the level of P‐eIF4E and Mcl‐1at2 and 16 hr after treatment in HepG2 and PLC/PRF/5 cells (Liu et al., 2006). However, we found that there is no temporal relationship between Mcl‐1 downregulation and induction of apoptosis by sorafenib in HCC cells. In our conditions, caspase‐3 activity was significantly increased 24 hr after the administration of sorafenib (10 µM) in HepG2 cells. HCC cells with mutated p53 (Huh7) and nonsense p53 mutation (Hep3B) required high sorafenib concentration (100 µM) to induce caspase‐3 activation (Figure 2a). Data showed that the antiproliferative and proapoptotic kinetics induced by the drug were more potent in HCC cell lines than in primary human hepatocytes (Figure 2). In this sense, primary human hepatocytes were resistant to the proapoptotic properties of sorafenib treatment (Figure 2a). This aspect is relevant for the specificity of sorafenib for liver cancer cells instead of healthy hepatocytes. We undertook experiments to identify the differential pattern of miRNA expression upon sorafenib treatment among primary human hepatocytes and cancer cells. One well‐characterized function of mTORC1 is to maintain protein synthesis through phosphorylationofatleasttwodirecttargets, eukaryotic initiation factor (eIF) 4E‐binding proteins (4E‐BPs) and ribosomal protein S6 kinases (S6Ks) (Hay & Sonenberg, 2004). mTOR is regulated by different cell signaling involving ER stress, AKt, and AMPK (Rashid, Yadav, Kim, & Chae, 2015). The induction of PERK signaling by antitumoral drugs inhibits mTOR and triggers autophagy in different cancer cell lines (Bruning et al., 2013). Sorafenib (10 µM) significantly increased PERK‐and IRE1α‐related signaling at 6 hr in HepG2cells(Figure3).Thesignificant reduction of ATF6 (Figure 3d) may be related to the alteration of trafficking between the ER and the Golgi apparatus, as well as the overall secretory pathway induced by sorafenib (Yi et al., 2012). The activation of PERK and IRE1αsignaling was associated with alteration of Thr172 P‐AMPK (Figure 4c) and Ser2481 P‐ mTOR (Figure 4a). In addition, the early downregulation of mTOR activation appeared not to be related to reduced AKt phosphorylation. In fact, Thr308 P‐AKt increased 6–12 hr after sorafenib administration in HepG2 (Figure 4b). The activation of survival pathways on mTOR inhibition has been associated with upregulation of IGF‐Ireceptorin breast (O'Reilly et al., 2006) and rhabdomyosarcoma (Wan, Harkavy, Shen, Grohar, & Helman, 2007) cell lines. The inhibition of the mTOR pathway is in agreement with the drastic alteration of polysome profile we observed in sorafenib‐treated HepG2 cells. In agreement with Sauzay et al. (2018), sorafenib induced a blockage of translation at initial stage (Figure 4d and Supporting Information Figure 4). The most important pathways involved in autophagy modulation are mTORC1 and AMPK (Prieto‐Dominguez et al., 2016). The inhibition of mTOR by sorafenib appeared to be stronger in HepG2 (Figure 4a) than in Hep3B and Huh7 (Supporting Information Figure S3). However, the activation of autophagic process using the tandem pDest‐LC3‐GFP‐ mCherry plasmid transfected to sorafenib‐treated cells (Figure 5a), TEM (Figure 5b) and biochemical markers (Figure 5c) were more closely correlated to the activation of ER stress (Figure 3) and AMPK (Figure 4c) than mTOR inhibition (Figure 4a). The respective use of si-RNA and inhibitory compounds showed that ER stress (Figure 6a) and AMPK activation (Figure 6d) played an essential role during sorafenib‐ induced autophagy in HepG2. The inhibition of autophagy by si‐IRE1α and si‐PERK,aswellas3MA,andCQincreasedcaspase‐3(Figure6band 6g, respectively) and PARP cleavage (Figure 6c and 6h, respectively). It was also interesting to notice that the downregulation of autophagy by reduction of Thr172 P‐AMPK/AMPK ratio using dorsomorphin observed at 12 hr was followed by a drastic upregulation of Beclin‐1(Figure6d)and reduction of caspase‐3 activity (Figure 6e) and PARP cleavage (Figure 6f) in sorafenib‐treated HepG2 cells at 24 hr. The experiments confirmed Thr172 P‐AMPK/AMPK ratio was positively correlated to the Ser413 P‐Foxo3a/Foxo3a ratio (Figure 6d). Our results support the survival properties of autophagy, and it may suggest an autophagic alternative activation pathway in dorsomorphin and sorafenib cotreated HepG2 cells. Urano et al. (2000) reported that ER stress and, in particular the IRE1 kinase activity, increases JNK activity. The autophagic process, as apoptosis, appeared to be tightly regulated by anti‐and proapoptotic members of the Bcl‐2 family. The activation of the autophagic process (6– 12 hr) by sorafenib was associated with a drastic increase of Beclin‐1 expression, which it was preceded by rapid downregulation of Mcl‐1and upregulation of tBid and Bim EL ,whileBcl‐2andBcl‐xL remained at moderate levels during this period after drug administration (Figure 7a and 7b, and Supporting Information Figure S6). Interestingly, tBid and Bim EL have been shown to promote autophagy by displacing Beclin‐1 from its interaction with Bcl‐2 (Erlich et al., 2007; Marquez & Xu, 2012). In fact, Beclin‐1 has been identified as a BH3‐only protein (Maiuri et al., 2007) that allows its interaction with Bcl2 and its homologue Bcl‐xL (Oberstein, Jeffrey, & Shi, 2007). The expression of Beclin‐1(Parketal., 2009) and Bcl‐2 phosphorylation that disrupts Beclin‐1‐Bcl‐2complex‐1 (Wei, Pattingre, Sinha, Bassik, & Levine, 2008) have been related to the activation of JNK1. It was interesting to observe that Thr183,Tyr185 P-JNK1/ 2/JNK1/2 was induced by sorafenib (10 µM) during the period in which autophagy was activated (3–12 hr; Figure 7c). The inhibition of Thr183, Tyr185 P-JNK1/2/JNK1/2 (Figure 7d) by SP600125 was related to a reduction in cell proliferation (Figure 7e) that resulted in an increased apoptosis (Figure 7f), suggesting that JNK played a survival role during RODRÍGUEZ‐HERNÁNDEZ ET AL. | 705 sorafenib‐induced apoptosis. In addition, a timeframe relationship existed between JNK and AMPK activation, supporting the existence of a complex signaling module involving LKB1, AMPK and JNK, in which early phase of JNK activation was also promoting cell survival by inducing AMPK activity, whereas the late phase of JNK activation induced apoptosis (Yun et al., 2009). The activation of apoptosis by sorafenib was coincident with a sustained increase in Bim EL expression, remaining Bak and Bax at a moderate expression level (Figure 7a and 7b, and Supporting Information Figure S6). JNK has also been observed to induce phosphorylation of Bim, promoting its release from its binding to dynein and myosin V motor complexes (Lei & Davis, 2003). Sorafenib (10 µM) induced a sustained and progressive increase of CHOP expression (6–24 hr; Figure 3b). The main effector of PERK‐mediated apoptosis is the proapoptotic transcription factor CHOP which can be induced by ATF4, ATF6, as well as XBP1s (Verfaillie, Salazar, Velasco, & Agostinis, 2010). Interestingly, CHOP suppresses the expression of the antiapoptotic Bcl‐2 (McCullough, Martindale, Klotz, Aw, & Holbrook, 2001) and promotes the transcription of the proapoptotic BH3‐only protein Bim (Puthalakath et al., 2007). The induction of thapsigargin‐induced ER has also been related to a stabilization of Bim by PP2A‐related dephosphorylation that prevents its ubiquitination and degradation, as well as by transcriptional regulation though CHOP‐ATF4 in breast cancer cells (Puthalakath et al., 2007). The expression of Bim is also under positive transcriptional regulation of Foxo3a (Nakamura & Sakamoto, 2008) whose activity is regulated by a plethora of kinases such as GSK3β, MST1, JNK, CS1, AMPK, and AKt (Farhan et al., 2017). As described above, a positive correlation appeared between Thr172 P‐AMPK/AMPK ratio and related activation phosphorylation of Ser413 P‐Foxo3a/Foxo3a ratio (Figure 6d). In addition, PI3K/AKt survival signaling increases the inhibitory phosphorylation Thr32 P‐Foxo3a, preventing its nuclear translocation and transcriptional activity (Brunet et al., 1999). Our study also showed that the expression of Bim EL raised shortly after sorafenib administration which was maintained at moderate expression levels during autophagic‐related phase (6–12 hr). This expression level might be the result of the interaction between the upregulation of Thr308 P‐AKt (Figure 4b)‐ dependent Thr32 P‐Foxo3a (Figure 7g), and Thr172 P‐AMPK (Figure 4c)‐ dependent Ser413 P‐Foxo3a (Figure 6d) in sorafenib‐treated HepG2. Additional studies should be undertaken to identify the relevance of each pathway in the expression of Bim EL . The sustained increase of PERK and CHOP expressions (Figure 3a and 3b, respectively) and reduction of AKt phosphorylation (24 hr; Figure 4b) supports Bim EL upregulation during sorafenib‐induced apoptotic phase (24 hr) in HepG2. The administration of Bim si‐RNA, but not Bak or Bax, prevented sorafenib‐ induced caspase‐3 activity in HepG2 cells (Figure 8a). The reduction of apoptosis by Bim si‐RNA was associated with upregulation of p62 expression and LC3II/LC3I ratio, but without alteration of Beclin‐1 expression in sorafenib‐treated HepG2 cells (Figure 8b). The proapoptotic BH3‐only members such as Bim EL , and others like BNIP3, Bad, Bik, Puma, and Noxa, induce autophagy by disrupting the Beclin‐1‐Bcl2 complex (Marquez & Xu, 2012). The immunoprecipitation studies demonstrated the formation of Beclin‐1 and Bim complex (Figure 8c). In this sense, our study may also suggest that the absence of Bim by si‐RNA promotes the induction of early autophagic structures by sorafenib (10 µM) independently of Beclin‐1 expression which remain at low level at 24 hr (Figure 8b). In conclusion, our study showed that the induction of ER stress by sorafenib was the driving mechanism involved in the sequential induction of autophagy and apoptosis in HepG2 cells (Figure 9). The early sorafenib‐induced ER stress and regulation of JNK and AMPK‐ dependent signaling were related to the induction of survival autophagic process (3–12 hr). The sustained treatment with sorafenib induced a progressive increase of ER stress and PERK‐CHOP‐ dependent rise of Bim EL , which induced the shift from autophagy to apoptosis (24 hr). However, the kinetic of Bim EL expression profile might also be related to the tight balance between AKt‐and AMPK‐ related signaling in Foxo3a‐dependent Bim EL upregulation. ACKNOWLEDGMENTS We thank CIBEREHD and CIBERNED, founded by the ISCIII and cofinanced by European Development Regional Fund “A way to achieve Europe”ERDF, for their financial support. The tandem fusion pDest‐LC3‐ GFP‐mCherry was kindly provided by Dr. Terje Johansen (Molecular Cancer Research Group, Department of Medical Biology, University of Tromsø‐The Arctic University of Norway, Tromsø, Norway). CONFLICTS OF INTEREST The authors have no commercial associations that might create a conflict of interest in connection with the present submitted 706 | RODRÍGUEZ‐HERNÁNDEZ ET AL. FIGURE 9 The early sorafenib‐induced ER stress and the regulation of JNK and AMPK‐dependent signaling were related to the induction of the survival autophagic process. The shift from autophagy to apoptosis was related to the decline of tBid, Beclin‐1, Mcl‐1, Bcl‐xL, and Bcl‐2, as well as the increase of proapoptotic BimEL, Bak, and Bax. BimEL appeared to be critical for the induction of apoptosis by sorafenib. AMPK, 5′AMP‐activated protein kinase; ER, endoplasmic reticulum; JNK, c‐Jun‐N‐terminal kinase [Color figure can be viewed at wileyonlinelibrary.com] manuscripts. The authors declare there are any competing financial interests in relation to the work described. ORCID Jordi Muntané http://orcid.org/0000-0002-6744-1121 REFERENCES Antar, A., Kharfan‐Dabaja, M. A., Mahfouz, R., & Bazarbachi, A. (2015). 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José A Del Campo, Paloma Gallego, Lourdes Grande MINIREVIEWS 1 January 27, 2018 | Volume 10 | Issue 1 | WJH | www.wjgnet.com Role of inflammatory response in liver diseases: Therapeutic strategies José A Del Campo, Paloma Gallego, Lourdes Grande, Department of Digestive Diseases, Valme University Hospital and CIBERehd, Sevilla 41014, Spain ORCID number: José A Del Campo (0000-0002-6037-1028), Paloma Gallego (0000-0002-7233-0127), Lourdes Grande (0000-0001-7685-0464). Author contributions: Del Campo JA designed the study and drafted the manuscript; Gallego P and Grande L drafted the manuscript and designed the Figure. Supported by Andalusian Government, No. PI0892-2012; Instituto de Salud Carlos III, PI14/01349 co-financed by the European Regional Development Fund (ERDF). Conflict-of-interest statement: Authors declare no conflicts of interest. Open-Access: This article is an open-access article which was selected by an in-house editor and fully peer-reviewed by external reviewers. It is distributed in accordance with the Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0) license, which permits others to distribute, remix, adapt, build upon this work non-commercially, and license their derivative works on different terms, provided the original work is properly cited and the use is non-commercial. See: http://creativecommons.org/ licenses/by-nc/4.0/ Manuscript source: Invited manuscript Correspondence to: José A Del Campo, PhD, Department of Digestive Diseases, Valme University Hospital and CIBERehd, Avda. Bellavista s/n, Sevilla 41014, Spain. [email protected] Telephone: +34-955-015485 Fax: +34-955-015485 Received: November 8, 2017 Peer-review started: November 9, 2017 First decision: December 4, 2017 Revised: December 21, 2017 Accepted: January 15, 2018 Article in press: January 15, 2018 Published online: January 27, 2018 Abstract Inflammation and tumorigenesis are tightly linked pathways impacting cancer development. Inflammasomes are key signalling platforms that detect pathogenic microorganisms, including hepatitis C virus (HCV) infection, and sterile stressors (oxidative stress, insulin resistance, lipotoxicity) able to activate pro-inflammatory cytokines interleukin-1β and IL-18. Most of the inflammasome complexes that have been described to date contain a NOD-like receptor sensor molecule. Redox state and autophagy can regulate inflammasome complex and, depending on the conditions, can be either proor antiapoptotic. Acute and chronic liver diseases are cytokinedriven diseases as several proinflammatory cytokines (IL-1α, IL-1β, tumor necrosis factor-alpha, and IL-6) are critically involved in inflammation, steatosis, fibrosis, and cancer development. NLRP3 inflammasome gain of function aggravates liver disease, resulting in severe liver fibrosis and highlighting this pathway in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. On the other hand, HCV infection is the primary catalyst for progressive liver disease and development of liver cancer. It is well established that HCV-induced IL-1β production by hepatic macrophages plays a critical and central process that promotes liver inflammation and disease. In this review, we aim to clarify the role of the inflammasome in the aggravation of liver disease, and how selective blockade of this main pathway may be a useful strategy to delay fibrosis progression in liver diseases. Key words: Caspase-1; Fibrosis; Hepatitis C virus; Inflammasome; Interleukin-1α; Interleukin-1β; Liver disease; Non-alcoholic fatty liver disease; NLRP3; Tumor necrosis factor-alpha © The Author(s) 2018. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved. Core tip: Inflammasomes are newly recognized vital players in innate immunity. Several factors have been Submit a Manuscript: http://www.f6publishing.com DOI: 10.4254/wjh.v10.i1.0000 World J Hepatol 2018 January 27; 10(1): 0000-0000 ISSN 1948-5182 (online) identified able to activate the NLRP3 inflammasome. Inappropriate activation of NLRP3 can contribute to the onset and progression of various diseases, particularly age-related diseases. It is well established that hepatitis C virus infection plays a critical role in the promotion of liver inflammation and disease, inducing the production of IL-1β and the activation of NLRP3. NLRP3 inflammasome gain of function aggravates liver disease, resulting in severe liver fibrosis and lately, hepatocellular carcinoma. In non-alcoholic fatty liver disease, the regulation of inflammation processes may prevent the progression of non-alcoholic steatohepatitis to fibrosis. Del Campo JA, Gallego P, Grande L. Role of inflammatory response in liver diseases: Therapeutic strategies. World J Hepatol 2018; 10(1): 00-00 Available from: URL: http://www. wjgnet.com/1948-5182/full/v10/i1/00.htm DOI: http://dx.doi. org/10.4254/wjh.v10.i1.00 INTRODUCTION Hepatic inflammation is a common trigger of liver disease, and is considered the main driver of hepatic tissue damage, triggering the progression from nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) to severe fibrogenesis and, finally, hepatocellular carcinoma (HCC). Liver diseases, whose etiology can be diverse, are becoming one of the most serious public health problems. The diseases usually occur in response to chronic hepatocellular injury caused mainly by the abuse of alcoholic intake, chronic infections such as those caused by the hepatitis C virus (HCV), bile duct damage, NAFLD or non-alcoholic steatohepatitis (NASH)[1] NAFLD was defined for the first time in 1980[2] as an accumulation of fat (> 5%) in liver cells in the absence of excessive alcohol intake[3]. The disease affects more than 30% of the population of the western world, especially patients suffering from metabolic syndrome, obesity (76%), and type II diabetes (50%)[4]. The histological spectrum of NAFLD begins in a simple benign steatosis, evolving to a NASH. From this point, the consequent scarring and tissue replacement begins with type I collagen, developing fibrosis, cirrhosis and finally, in many cases complicating a HCC[3]. This pathogenesis, which is complex, is explained by two main impacts or damages to the liver tissue: on the one hand, a lipid accumulation in the hepatocytes, to which a second oxidative stress damage is added [5]. It is this second damage, which produces a lipotoxicit that triggers the inflammatory response by the release of dangeractivated molecular patterns (DAMPS) and pathogenicactivated molecular patterns (PAMPs), such as lipopolysaccharide (LPS). Finally, they activate the innate immunity that causes the hepatic inflammation, being able to aggravate the process of fibrosis, ci2 January 27, 2018 | Volume 10 | Issue 1 | WJH | www.wjgnet.com Del Campo JA et al . Inflammasome and liver diseases rrhosis, causing HCC. That is why the knowledge of the relationship between liver disease and uncontrolled activation of the immune response, resulting in aggravating liver inflammation of disease progression, can be crucial for the design of therapeutic strategies blocking the immune response uncontrolled. PATHOGENESIS OF NAFLD The pathogenesis of this disease is complex, and is explained by two major impacts or damage to the liver tissue: on the one hand, a lipid accumulation in the hepatocytes, to which a second oxidative stress damage is added[5]. Lipid accumulation in hepatocytes The first of these is the abnormal accumulation of triglycerides in the hepatocyte, either due to a high intake of saturated fats and obesity, genetic deficiencies or insulin resistance (IR) due to hyperglycemia and hyperinsulinemia[6], what is known as metabolic syndrome. Hyperinsulinemia and increased hepatic glucose production induce the expression of the sterol regulatory element binding protein (SREBP-1c) and the carbohydrate response element binding protein (ChREBP), respectively, which activate in turn the transcription of most of the genes involved in the enzymatic machinery necessary for free fatty acids (FFA) synthesis, decreasing the beta oxidation thereof[7]. In addition, there are many mediating molecules such as peroxisome proliferator activating ligand receptors (PPAR), among which PPAR-γ, whose expression in conditions of liver damage is usually high, contribute to the accumulation of FFA[7]. The liver X receptor (LXR), another important mediator, activates genes involved in the synthesis of FFA, such as SREBP-1c and ChREBP, contributing to steatosis[8]. Finally, the AMP-activated protein kinase (AMPK) functions as a sensor of the energy levels of the cell, stimulating catabolic pathways such as mitochondrial beta oxidation, and inhibiting ATP-consuming processes, such as lipogenesis. All this is done by phosphorylating different proteins involved in these pathways, such as acetyl-CoA carboxylase (ACC), ChREBP and SREBP-1c, which end up being inhibited. In the process of lipid accumulation, several molecules act as DAMPs and pathogen-activated molecular patterns (PAMPs), that is, molecules that trigger inflammation. These may include the fatty acids, adenosine triphosphate (ATP), uric acid or proteins derived from the extracellular matrix, among others. In addition, recent research suggests that in the liver tissue of humans and mice with steatohepatitis, cholesterol crystals are present within hepatocytes, and they can act as DAMPs. Oxidative stress and liver inflammation A second impact that explains the characteristic his- 3 January 27, 2018 | Volume 10 | Issue 1 | WJH | www.wjgnet.com tological lesions of NAFLD is oxidative stress and lipid peroxidation[5,9]. As a result of liver damage and liver inflammation, the inflammatory cells and the hepatocyte itself release cytokines, such as TNF-α and reactive oxygen species (ROS). These mediators can cause peroxidation of plasma and mitochondrial membranes, which leads to cell death due to necrosis or apoptosis[5,9]. All this activates endothelial cells of the liver, which increase the expression of cytokines, and finally activates the hepatic stellate cells (HSCs), producing a phenotypic change, associated with the acquisition of pro-fibrogenic and pro-inflammatory functions[10]. Significant accumulation of triglycerides and cholesterol in VLDL and LDL particles, added to the oxidative stress developed in the hepatocytes, produces the oxidation of the cholesterol linked to LDL, generating particles of LDL oxidase (oxLDL) that constitute an important risk factor of the disease[11]. Recent studies show that oxLDL also contribute to the process of cellular inflammation and apoptosis. ACTIVATION OF THE INNATE IMMUNE RESPONSE DURING NAFLD Excessive lipids accumulation leads to hepatocyte damage, activating an inflammatory response that aggravates the progress of the liver disease, and which, in turn, feeds back the activation of the inflammation[12]. The immune response of the liver is produced by the action of immune cells such as Kupffer cells, monocytes, neutrophils, dendritic cells (DCs), natural killer cells (NK), and NK T cells (NKT), which initiate and maintain the hepatic inflammation through the production of cytokines and chemokines, especially TNF and interleukin (IL) -1β, as well as reactive oxygen species[13]. The triggering of hepatic inflammation, as noted above, is caused by the accumulation of infectious and non-infectious material, which is released during cell damage and is recognized by pattern recognition receptors (PRRs). These PRRs include Toll-like receptors (TLRs), NOD-like receptors (NLRs), C-type lectin receptors (CLRs), and several other receptors[14]. The endogenous molecules produced by cellular damage or stress result in an inflammatory response (DAMPs). These molecules are very diverse and don’ t have a common structure between them. In the pathology of the liver disease and liver inflammation, induced-inflammation particles are included, such as cholesterol crystals. These cholesterol crystals produce the development, not only of the atheroma plaques, but of the inflammation, being present in humans and mice with NASH[15] candidates are free fatty acids (FFA) that are released during liver damage. A specific mechanism by which they act is to activate TLR4, while fetuin-A, a 64-kDa protein specific for hepatocytes, is required. It has been proven that the reduction of fetuin-A in mice with high fat diet results in a decrease of inflammatory signalling mediated by TLR4 in adipose tissue. Normally, in patients with NAFLD, the expression of fetuin-A is high[16]. Palmitic acid (PA) is another molecule that causes liver inflammation, and it has recently been linked to the TLR2 receptor. The palmitic acid ligand of TLR2 induces the activation of caspaseOther 1 and the release of IL-1α and IL1β, having an evident role in the liver inflammatory process[17]. Many of these DAMPs activate PRR present in immune cells, of which the TLRs are the best characterized. In liver disease, saturation of fatty acids produces inflammation in the hepatocytes, which increases the induction of caspase-1 activation and the release of IL1β. This results in a release of more DAMPs from the hepatocytes, generating a feedback that amplifies the inflammatory response. Among the various NLR receptors, the NLRP3 inflammasome is the best characterized and associated with a wider range of diseases including infections, autoinflammatory diseases and other autoimmune diseases. The NLRP3 inflammasome has the characteristic of forming a complex with apoptosis-associated specklike protein to CARD (ASC), to activate caspase-1 and induce the maturation and secretion of important proinflammatory cytokines such as IL-1β and IL-18. Cytokines act directly against the damage and infection of the liver tissue[18]. Role of NLRP3 inflammasome in liver inflammation Activation of the NLRP3 inflammasome is important in the inflammatory process, and occurs in two steps. The first includes the activation of TLRs by different molecules DAMPs and PAMPs (Figure 1). TLRs belong to the family of PRRs and their function is to maintain tissue homeostasis through the regulation of inflammatory responses. In the liver, TLRs are expressed in Kupffer cells, endothelial cells, DCs, epithelial biliary cells, HSCs and hepatocytes. Activated TLRs activate the cells and contribute to the release of cytokines that facilitate the progression of liver disease. There are at least 13 known TLRs, whose structure is characterized by having a leucine-rich repeat structure (LRR) in the extracellular domain and a Toll/IL-1 receptor (TIR) in its intracellular domain[19]. TLR4 has an interesting role in liver inflammation and fibrogenesis[20]. The Kupffer cells of the liver are the first to be attacked by the damage produced, and express TLR4 to which lipopolysaccharides (LPS) bind. This produces the activation of NF-kB, mitogenactivated protein kinase (MAPK)[21] extracellular signalregulated kinase-1 (ERK1), p38, c-jun N-terminal kinase (JNK) and interferon regulatory factor 3(IRF3)[22], which finally triggers the production of proinflammatory cytokines and enhances IFN-β and STAT1 expression[23]. The proinflammatory stimulus facilitates hepatocyte damage, contributing to the secretion of profibrogenic cytokines such as transforming growth factor beta (TGF-β) and the platelet-derived growth factor (PDGF), inflammasome formation. The inflammasome consists of an NLR protein, the adapter molecule ASC and procaspase-1, which is an effector molecule[26]. The formation of this complex serves to activate cysteine protease caspase-1, which, in turn, produces the maturation of proinflammatory cytokines, including IL-1b and IL-18, and the proteolytic inactivation of IL-33[27]. In short, and specifically in NAFLD, the saturated fatty acids from the excess lipid in the liver represent harmful endogenous molecules that finally induce the activation of the inflammasome. In addition, hepatocytes exposed to these saturated fatty acids release signals that trigger the activation of immune cells. Activation of the inflammasome activates caspase-1 in Kupffer cells, inducing proinflammatory signaling and activation of HSCs. In this way, collagen deposition occurs that triggers liver fibrosis[28] have shown that cholesterol crystals could be one pathway 4 January 27, 2018 | Volume 10 | Issue 1 | WJH | www.wjgnet.com promoting the activation of HSCs. This activation, in turn, up-regulates transcription of inflammasomerelated components, including inactive NLRP3, pro-IL1β and proIL-18[24,25]. The second step of inflammasome activation is the oligomerization of NLRP3 and subsequent assembly of NLRP3, ASC, and procaspase-1 into a complex (Figure 1). This triggers the transformation of procaspase-1 to caspase-1, as well as the production and secretion of mature IL-1β and IL-18[18]. NLRP3 signaling during liver inflammation After NLRs overexpression, members of this family play an important role in the formation of intracellular multiprotein complexes called inflammasomes. The union of microbial components or activators of the inflammasome (DAMPs and PAMPs) that enter the cytoplasm are detected by these cytosolic NLRs, activating the Nucleus Hepatic fibrosis activated by inflammasome NLRP3 DAMPs Fatty acids (palmitic acid) ATP Proteins Cholesterol crystals Obesity Insulin resistance (IR) Hyperglycemia Hyperinsulinemia Lipid accumulation DAMPs PAMPs Hepatocyte Damage PAMPs DAMPs PRR PRR Liver damage Metabolic syndrome Non alcoholic steatohepatitis (NASH) Non alcoholic fatty liver disease (NAFLD) Mature IL1βPro-IL1β Mature caspase1 NLRP3 oligomerization ASC Pro-caspase1 Pro-IL1βNLRP3 NLRP3 transcription Pro-IL1β transcription Pro-IL18 transcription NFkβ Proinflammatory cytokines HSCs activation Activated HSCs Quiescent HSCs Kupffer cell PRR = TLR / NLRP3 DAMPs PAMPs DAMPs PAMPs PRR TGF-β IL-1β IL-1β DAMPs PRR PAMPs Cytoplasm FIRST STEP Proinflammatory cytokines IFN-type1 TGF-β PDGF IL-1β IL-1β SECOND STEP Liver fibrosis Liver damage Figure 2 Hepatic fibrosis caused by the activation of the inflammasome-NLRP3 complex. The accumulation of lipids derived from the metabolic syndrome produces a non-alcoholic steatohepatitis (NASH) that progresses to a non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). The accumulated lipids, fatty acids, cholesterol crystals, among others, produce an alteration in the homeostasis of the liver cells, producing liver damage. Danger-activated molecular patterns (DAMPs) and pathogenic-activated molecular patterns (PAMPs) bind to and activate PRR receptors (TLRs, NLRPs, etc.) in hepatocytes, immune cells, hepatic stellate cells (HSCs), endothelial cells and DCs. Activated TLRs activate the cells and contribute to the release of cytokines that facilitate progression of liver disease. The proinflammatory stimulus facilitates hepatocyte damage, contributing to the secretion of profibrogenic cytokines such as transforming growth factor beta (TGF-β), promoting the activation of HSCs. This activation, in turn, up-regulates transcription of inflammasome-related components, including inactive NLRP3, pro-IL-1β and proIL-18. The second step of inflammation activation is the oligomerization of NLRP3 and subsequent assembly of NLRP3, ASC, and procaspase-1 into a complex. This triggers the transformation of procaspase-1 to caspase-1, as well as the production and secretion of mature IL-1β and IL-18, which produces liver damage and facilitates the progression of hepatic fibrosis. 5 January 27, 2018 | Volume 10 | Issue 1 | WJH | www.wjgnet.com to activate the inflammasome in NASH. To test whether inflammasome blockade alters inflammatory recruitment, they used a drug called MCC950, which has already been shown to block NLRP3 activation, in an attempt to reduce liver injury in NASH. This drug partly reversed liver inflammation, particularly in obese diabetic mice. Release of cytokines by immune cells Inflammatory signaling of the liver is regulated by cytokines capable of activating effector functions in immune cells. Kupffer cells are the first to detect the presence of PAMPs and DAMPs through TLRs, activating the release of cytokines such as TNF-α, IL-1 and IL-6, as well as chemokines chemokine (C-X-C motif) ligand 13 (CXCL13), chemokine (C-X-C motif) ligand 8 CXCL-8 and Chemokine (C-C motif) ligand 24 (CCL24), which initiate an acute phase inflammatory response. These cytokines can produce apoptosis of hepatocytes, steatosis and inflammation, including the onset of a fibrosis process after interaction with HSCs via TGF-β. Cytokines can also activate hepatic sinusoidal endothelial cells that are ultimately involved in the recruitment of neutrophils, monocytes and NKT cells, being a feature of acute liver damage. Neutrophils can be activated, and their phenotype changed, releasing ROS, defensins and other chemokines that attract more neutrophils and monocytes. Monocytes can be differentiated into TNF-α, IL-1β, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) and granulocytemacrophage colony stimulating factor (GM-CSF) macrophages, increasing the life expectancy of these neutrophils[29,30]. Finally, the inflammation resolves with the apoptosis of the neutrophils, being these apoptotic neutrophils signals involved in the onset of phagocytosis and in the increase of IL-10 and TGF-β, cytokines related to the end of the inflammatory response and the repair of the tissue[31]. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a heterogeneous subset of stromal stem cells with immunonodulatory characteristics. MSCs are considered to act through multiple mechanisms to coordinate a dynamic, integrated response to liver inflammation and fibrosis, which prevents the progressive distortion of hepatic architecture. Management of inflammatory patterns is crucial also in case of potential treatment of liver diseases with stem cells[32]. Adult stem cells have gained in attractiveness over embryonic stem cells for liver cell therapy due to their origin, multipotentiality, and the possibility of autologous transplantation. ACTIVATION OF HSCS AND HEPATIC FIBROSIS Any of these necroinflammatory mechanisms described above can activate HSCs, the main ones involved in the process of hepatic fibrogenesis[33]. In normal liver, stellate cells are described as being in a quiescent state. Quiescent stellate cells represent 5%-8% of the total number of liver cells[34]. When the liver is damaged, stellate cells can change into an activated state. The activated stellate cell is characterized by proliferation, contractility, and chemotaxis. This state of the stellate cell is the main source of extracellular matrix production in liver injury[35]. The hepatic stellate cells are characterized by having in their cytoplasm small droplets of fat 1-2 microns in diameter that allow the storage of vitamin A, one of its main functions. Besides, they control intercellular communication through the release of mediators, and participate in the homeostasis of the MEC of the liver by the production of collagens and noncollagens, synthesis of metalloproteinases (MMP) that catabolize the components of the MEC, and synthesis of inhibitors of MPPs, also called tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) that control the catalytic activity of MMPs to maintain a homeostasis of the MEC[36]. Therefore, after the chronic injury of the liver tissue, both the HSC and other cells producing the ECM undergo activation, a pathological process characterized by the loss of fat droplets, an increase in the number and size of the cells, and phenotypic transdifferentiation to proliferating, fibrogenic and contractile cells, which will be very similar to myofibroblasts. All this is mediated by different factors that induce cell proliferation, fibrogenic mediators such as TGF-β1 and IL-6, inducers of HSC contraction, such as endothelin-1, thrombin or angiotensin II and finally mediators of anti-inflammatory and anti-fibrogenic activity, such as IL-10 and interferon-γ (IFN-γ)[36]. Because of the activation of HSCs, phenotypic changes occur that affect the development of hepatic fibrosis, such as the production of collagen and noncollagen proteins of the MEC (collagen type I, type III, type IV, laminin, elastin, fibronectin and various proteoglycans) by the CEH[37]. CONCLUSION Many evidences reported in the literature suggest that the activation of the NLRP3 inflammasome complex and the consequent generation of the acute inflammatory response in the liver, facilitates the progress of steatohepatitis to liver fibrosis, cirrhosis and finally, HCC development. However, recent studies show that the KO mice of NRLP6 and NLRP3 inflammasomes have a worse progression in the NAFLD/NASH disease. The absence of the inflammasome is associated with changes in the homeostasis of the intestinal microbiota, resulting in a strong hepatic steatosis and inflammation through TLR receptor agonists, such as TLR4, which allows the release of TNF-α which leads to the progression of NASH[38]. This demonstrates the complexity of the effects of the activation of the inflammasome, which can generate an acute inflammation or, conversely, be protective. However 6 January 27, 2018 | Volume 10 | Issue 1 | WJH | www.wjgnet.com and in general terms, this activation is usually proinflammatory in the liver, and its inactivation and absence in relation to the microbiota should be carefully studied. Recently, Pierantonelli et al[39] have shown that the progression of liver fibrosis is associated with the downregulation of NLRP3 in the gut which, together with the current evidence of a strong correlation between intestinal changes (including modification of microbiota composition) and liver disease, makes the role of NLRP3 in the intestine extremely attractive as a protective factor. Finally, MCC950 has been proven as an effective NLRP3 inhibitor, being able to reduce liver injury and inflammation. 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Padillo 3 , Jordi Muntane ´ 3 , Manuel Romero-Go ´mez 2 1Department of Digestive Diseases and CIBERehd, Valme University Hospital, Servicio Andaluz de Salud, Seville, Spain, 2Department of Digestive Disease, Biomedicine Institute of Seville & CIBERehd, Rocı ´o University Hospital, Seville, Spain, 3Department of General Surgery, Rocı ´o University Hospital, CSIC and University of Seville, Seville, Spain ☯These authors contributed equally to this work. *[email protected] Abstract Hepatitis C virus (HCV) infection has been related to increased risk of development of hepatocellular carcinoma (HCC) while metformin (M) and statins treatment seemed to protect against HCC development. In this work, we aim to identify the mechanisms by which metformin and simvastatin (S) could protect from liver cancer. Huh7.5 cells were infected with HCV particles and treated with M+S. Human primary hepatocytes were treated with M+S. Treatment with both drugs inhibited Huh7.5 cell growth and HCV infection. In non-infected cells S increased translational controlled tumor protein (TCTP) and phosphatase and tensin homolog (PTEN) proteins while M inhibited mammalian target of rapamycin (mTOR) and TCTP. Simvastatin and metformin co-administered down-regulated mTOR and TCTP, while PTEN was increased. In cells infected by HCV, mTOR, TCTP, p62 and light chain 3B II (LC3BII) were increased and PTEN was decreased. S+M treatment increased PTEN, p62 and LC3BII in Huh7.5 cells. In human primary hepatocytes, metformin treatment inhibited mTOR and PTEN, but up-regulated p62, LC3BII and Caspase 3. In conclusion, simvastatin and metformin inhibited cell growth and HCV infection in vitro. In human hepatocytes, metformin increased cell-death markers. These findings suggest that M+S treatment could be useful in therapeutic prevention of HCV-related hepatocellular carcinoma. Introduction The natural history of hepatitis C infection frequently ranges from chronic infection to liver cirrhosis and liver cancer. The majority of HCC occurred on chronic liver diseases or cirrhosis [1]. The proportion of HCC caused by the HCV ranges from 50% to 70% in developed countries, depending on the prevalence of HCV-related cirrhosis [2]. In addition, HCV-related HCC was significantly related to poor survival [3]. Hepatitis C virus interacts with lipid PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191805 January 31, 2018 1 / 13 a1111111111 a1111111111 a1111111111 a1111111111 a1111111111 OPEN ACCESS Citation: del Campo JA, Garcı ´a-Valdecasas M, GilGo ´mez A, Rojas A ´, Gallego P, Ampuero J, et al. (2018) Simvastatin and metformin inhibit cell growth in hepatitis C virus infected cells via mTOR increasing PTEN and autophagy. PLoS ONE 13(1): e0191805. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0191805 Editor: Matias A Avila, University of Navarra School of Medicine and Center for Applied Medical Research (CIMA), SPAIN Received: December 18, 2017 Accepted: January 11, 2018 Published: January 31, 2018 Copyright: ©2018 del Campo et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Data Availability Statement: All relevant data are within the paper and its Supporting Information files. Funding: This work was supported by the Spanish Ministry of Economy, Innovation and Competitivity, Instituto de Salud Carlos III, grant numbers PI13/ 01192, PI14/01349, co-funded by European Union (ERDF/ESF, “Investing in your future”) and Consejerı ´a de Salud de la Junta de Andalucı ´a (PI- metabolism affecting assembly and virion maturation [4,5]. Statins use resulted in 37% reduction in HCC risk in clinical practice [6]. Moreover, the use of statins increased survival rate in HCC-cirrhotic patients [7]. Statins mechanisms influencing liver cancer development and progression include anti-proliferative, pro-apoptotic, anti-angiogenic, immunomodulatory and anti-infective effects via: a) deregulation of cell cycle regulatory cyclins; b) increase in p19, p21 and p27 proteins; c) inhibition of Myc and AKT/mTOR pathways [6,8]. Metformin use in cirrhotics reduced HCC incidence [9]. This drug activates AMP-activated protein kinase (AMPK) and prevents mTOR phosphorylation [10]. The mTOR pathway is a major tumor-initiating pathway in hepatocellular carcinoma, with up-regulation seen in up to 50% of tumors [11]. Cultured cells treated with metformin showed cell cycle arrest at G0/G1 phase [12] and, in nude mice, this treatment caused xenograft HCC-tumor growth suppression [13]. Phosphatase and tensin homolog (PTEN) is a tumor suppressor which inhibits mTOR pathway. The most accepted hypothesis supports that HCV infection down-regulates PTEN to activate mTOR [10] and promotes HCC growth [14]. Translational controlled tumor protein (TCTP) has been classified as an oncogene and its effects include an anti-apoptotic role inhibiting BCL2-associated X Protein (Bax), down-regulates p53, induces a faster cell cycle progression which promotes higher mutation rate, and induces cytokines production that promote inflammation [15–17] suggesting TCTP could be a target for anti-cancer drugs. The aim of the present study was to investigate the mechanisms by which metformin and simvastatin could prevent liver cancer in HCV infection using in vitro models based on Huh7.5 and human primary hepatocytes culture. Methods Cell culture and human primary hepatocytes Huh7.5 cells (Apath LLC, New York, USA) were grown in DMEM culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100U/ml) streptomycin (100μg/ml) antibiotics, L-glutamine and non-essential aminoacids. Cells were incubated at 37˚C, 5% CO 2 . Infective particles of JFH-1 were added to cell plate at 1 particle/cell, and simvastatin (2μM) (Sigma, San Louis, Missouri, USA) and/or metformin (2mM) (Acofarma, Barcelona, Spain) treatment were added 3 hours after cell seeding, and incubated together for 72 hours. To calculate cell viability, cells were seeded with three different concentrations of metformin (1mM, 2mM and 10mM) or simvastatin (1μM, 2μM and 4μM) over 24, 48 or 72 hours. Cell number and viability were determined using trypan blue test on a Neubauer chamber. Human hepatocytes were prepared from liver biopsies obtained from 3 donors undergoing surgical resection of a liver tumor. Biopsy sampling was with informed consent of the patient, and the study was approved by the Rocio University Hospital’s Ethics Committee and was performed in accordance with approved guidelines. Hepatocytes isolation was based on the twostep collagenase procedure [18]. Cell viability was consistently 85%, as determined by trypan blue exclusion. Hepatocytes (8×10 6 cells; 150,000 cells/cm 2 ) were pooled and seeded at confluence on type I collagen-coated dishes (Iwaki, Gyouda, Japan) and maintained in a DMEM-- Ham-F12: William’s E (1:1) supplemented medium for 12 h. The medium was then removed and replaced with a fresh culture medium supplemented, when indicated, with metformin (2mM) or simvastatin (2μM) for 72 hours. Cell-cycle arrest study After treatment, Huh7.5 cells were trypsinized and 1×10 6 cells were washed with PBS and fixed with 70% cold ethanol in PBS at -20˚C overnight. After centrifugation (700 ×g; 5 min), Simvastatin and metformin promote cell growth inhibition via autophagy PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191805 January 31, 2018 2 / 13 0892-2012). JA Del Campo was supported by Nicola ´s Monardes Program from Servicio Andaluz de Salud (SAS). Competing interests: The authors have declared that no competing interests exist. A recent meta-analysis reported that the use of metformin reduced the ratio of liver cancer by 48%(22). A subgroup adjusted for the use of statins, showed a reduction in HCC incidence rate (OR = 0.75; 95% CI, 0.68–0.83; P<0.001), suggesting a synergistic effect of metformin and statins for liver cancer [22]. The increased cell number in G0/G1 phase and the cell reduction in S phase could be an explanation of these results. MTOR plays an important role in HCC [11]. Metformin decreases mTOR expression through AMPK activation. Statins also inhibited mTOR in several tissues [23] as we observed in Huh7.5 cells, albeit this effect was not observed in primary hepatocytes. The role of statins on mTOR-Akt pathway was pointed out by Roudier et al.[24] through the inhibition of Akt phosporylation mediated by p53. Indeed, Huh7 cell lines harbor a mutated version of p53 protein [25]. Loss or down-regulation of PTEN expression leads to the activation of AKT/mTOR pathway promoting malignant progression [26]. Metformin down-regulates PTEN and enhances Protein kinase-βphosphorylation (AKT/PKB) [27]. However, we observed that simvastatin increases PTEN expression, alone or in combination with metformin. Up-regulation of PTEN with statins has been reported in breast cancer [28]. Others in vitro studies demonstrated that PTEN over-expression was able to reduce tumor proliferation in HepG2 [29], indicating a protective role for PTEN. Protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) is an inhibitor that regulates phosphorylation levels of tyrosine kinase receptors [30]. The effect of PTP1B levels in tumor tissues has been controversial; in breast, colon and prostate cancer, tumor progression was promoted. In contrast, in esophageal cancer and lymphoma, tumor suppression has been reported [31]. In HCC, PTP1B seems to act as a tumor suppressor because it is down-regulated in tumors, while low PTP1B expression is associated with poor prognosis [30]. In our study, metformin inhibited PTP1B expression in Huh7.5 cells, but did not in primary hepatocytes or in combination with simvastatin. TCTP is a pro-survival factor over-expressed in HCC. An increased TCTP is significantly associated with advanced HCC, and is an independent marker of poor prognosis [32]. TCTP plays an anti-apoptotic role, as an antagonist of pro-apoptotic Bax [17]. Lower TCTP levels reduce cell viability [33]. In this study, metformin (also in combination with simvastatin) inhibited TCTP in Huh7.5 cells and human primary hepatocytes (Fig 2c and 2e). These interesting data suggest that M + S should be considered for therapy in HCC. HCV promotes HCC by several pathways. In our study, TCTP and mTOR were increased and PTEN was reduced. However, when infected cells were treated with M + S the opposite situation was found: TCTP/mTOR were down-regulated and PTEN was induced (Fig 2c and 2d). Peng et al. showed that mTOR pathway is upregulated by HCV NS5A to block apoptosis [34], and Peyrou et al. showed a PTEN inhibition by core protein genotype 3 [35]. Our data have shown that M+S treatment could reverse the scenario where HCV infection. We have previously reported that metformin inhibits viral replication [36]. Simvastatin also decreased viral infection as previously reported by Amemiya et al [37]. Metformin plus simvastatin combination yielded the highest level of viral infection inhibition (by 80% of viral replication) (Fig 3). HCV infection induced autophagosome accumulation, but did not improve protein degradation in liver biopsies [38]. Autophagy regulates higher cholesterol level produced in HCV-infected cells, since hepatocytes have low cytoplasmic lipase levels. In genotype 3, it appears to be an inverse correlation between LC3BII/LC3BI ratio (an indicator of autophagy events), and the presence of microvesicular steatosis. This suggests that agents potentiating autophagy could prevent lipid accumulation in HCV patients [39]. Our results indicate an increased LC3BII in infected cells, but further induction of LC3B I and II was achieved with metformin alone or in combination with simvastatin. In an in vitro model of hepatocyte Simvastatin and metformin promote cell growth inhibition via autophagy PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191805 January 31, 2018 9 / 13 steatosis, a dysfunctional autophagy was induced and metformin treatment restored this process [40]. Metformin could serve as a pro-autophagic drug through activation of this process via mTOR inhibition [41] and increasing p53 [42]; an inhibitor and an activator of autophagy, respectively. Autophagy is an adaptive pro-survival program under cellular starvation but, under continual cellular stress, autophagy could be a cell killing response process promoting autophagy cell death (also known as type II programmed cell death) [43]. The less aggressive HCC cell lines and tissues have much higher autophagy levels than the more aggressive HCC cell lines or tissues with recurrent disease [44]. Metformin treatment in primary hepatocytes induced caspase 3 as well as LC3BII–a primary marker for autophagy-. This effect has also been demonstrated in melanoma, colon and endometrial cancer [45]. In our study, p62 is found increased after metformin treatment (2 mM), indicating a blockade of the autophagy flux. However, Takahashi et al. observed that higher metformin concentration (5 and 10 mM) suppressed cancer cell growth via cell cycle arrest and complete autophagy [45]. We have found that higher metformin concentration (5 and 10 mM) decreased p62 protein levels (Fig 4f), indicating that previous autophagy flux blockade could be reversed by higher metformin concentration. Since no caspase activation was detected by metformin treatment, we can rule out that cell growth inhibition promoted by this drug in Huh7.5 cells can be due to cell cycle arrest in G0/G1 phase. Conclusions In conclusion, our results showed that metformin + simvastatin combination inhibited HCV infection by reducing RNA negative strand and core protein. This treatment yields lower viral particles production, as well as cell viability inhibition by arresting cell cycle and down-regulating different oncogenic pathways. Metformin treatment inhibited mTOR pathway and the anti-apoptotic protein TCTP, while simvastatin increased the tumor suppressor PTEN. In addition, metformin treatment appears to enhance autophagy processes (probably in a dosedependent manner) promoting cell growth inhibition. Taking into consideration all the results obtained, we propose that S+M therapy should be considered for patients with high risk of HCC development. Supporting information S1 Fig. Cell viability of Huh7.5 cells treated with simvastatin, metformin, or both. A: Huh7.5 cells were treated with different concentrations of simvastatin (S1: 1μM, S2: 2μM, S3: 4μM) for 72 hours, and cell number quantified by Neubauer chamber; B: Cell viability kinetic in cells treated with metformin (M1: 0.5mM, M2: 2mM, M3:10mM). (TIF) Acknowledgments This work was supported by the Spanish Ministry of Economy, Innovation and Competitivity, Instituto de Salud Carlos III, grant numbers PI13/01192, PI14/01349 co-funded by European Union (ERDF/ESF, “Investing in your future”) and Consejerı ´a de Salud de la Junta de Andalucı ´a (PI-0892-2012). JA Del Campo supported by Nicolás Monardes Program from Servicio Andaluz de Salud (SAS). Author Contributions Conceptualization: Jose ´A. del Campo. Simvastatin and metformin promote cell growth inhibition via autophagy PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191805 January 31, 2018 10 / 13 Data curation: Marta Garcı ´a-Valdecasas. Formal analysis: Jose ´A. del Campo. Funding acquisition: Jose ´A. del Campo. Investigation: Jose ´A. del Campo, Javier Ampuero, Lourdes Grande, Francisco J. Padillo, Jordi Muntane ´. Methodology: Marta Garcı ´a-Valdecasas, Antonio Gil-Go ´mez, A ´ngela Rojas, Paloma Gallego, Rocı ´o Gallego-Dura ´n, Helena Pastor, Francisco J. 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Hospital Universitario de Valme, Sevilla, Spain. *** Unidad de Farmacología Clínica y Experimental. Hospital Universitario de Valme, Seville, Spain. **** Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, Seville, Spain. March-April, Vol. 17 No. 2, 2018: 242-249 ORIGINAL ARTICLE INTRODUCTION Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is defined as the accumulation of excessive fat in the liver in the absence of excessive drinking of alcohol.1 It has been included as a metabolic abnormality such as obesity, type 2 diabetes, arterial hypertension, and hypertriglyceridemia.2,3 NAFLD encompasses a wide spectrum of liver damage ranging from simple steatosis to non-alcoholic steatohepatitis (NASH), advanced fibrosis, and rarely, progression to cirrhosis and hepatocellular carcinoma.4 Hepatic steatosis can either be a benign, non-inflammatory condition, or can be associated with non-alcoholic steatohepatitis (NASH). The earliest stage is characterized by the excessive triglycerides (TGs) accumulation as lipid droplets (LDs) in the cytoplasm of hepatocytes. Hepatic steatosis is often self-limited, however it can progress to NASH, which is known by the presence of hepatocyte injury (hepatocyte ballooning and cell death), inflammatory infiltrate, and/or collagen deposition (fibrosis).5 It has been postulated that the inhibition of excessive lipid synthesis and uptake could be an effective intervention for NASH.6,7 Dietary fat is one of the most important environmental factors associated with the incidence of NAFLD. The search of functional food ingredients such as herbal extracts or flavonoids capable to suppress the accumulation of hepatic lipid8-12 by the modulation of several pathways is ongoing. Several polyphenols and phenolic compounds, such anthocyanins, curcumin, resveratrol, silymarin and those present in coffee and tea have been proposed as NAFLD treatment but the varying bioavailability remains poor, so further studies are needed for the future clinical applications.13 Steatosis could be modulated by genetic susceptibility.14 In 2008, Romeo, et al. performed an independent geThe Official Journal of the Mexican Association of Hepatology, the Latin-American Association for Study of the Liver and the Canadian Association for the Study of the Liver Manuscript received:Manuscript received: Manuscript received:Manuscript received: Manuscript received: May 13, 2017. Manuscript accepted:Manuscript accepted: Manuscript accepted:Manuscript accepted: Manuscript accepted: June 27, 2017. DOI:10.5604/01.3001.0010.8642 ABSTRACTABSTRACT ABSTRACTABSTRACT ABSTRACT Background & aims.Background & aims. Background & aims.Background & aims. Background & aims. G-allele of PNPLA3 (rs738409) favours triglycerides accumulation and steatosis. In this study, we examined the effect of quercetin and natural extracts from mushroom and artichoke on reducing lipid accumulation in hepatic cells. MateMate MateMate Material and methods.rial and methods. rial and methods.rial and methods. rial and methods. Huh7.5 cells were exposed to oleic acid (OA) and treated with quercetin and extracts to observe the lipid accumulation, the intracellular-TG concentration and the LD size. Sterol regulatory element binding proteins-1 (SREBP-1) , peroxisome proliferator-activated receptor (PPARα-γ) and cholesterol acyltransferase (ACAT) gene expression levels were analysed. ReRe ReRe Results.sults. sults.sults. sults. Quercetin decreased the intracellular lipids, LD size and the levels of intracellular-TG through the down-regulation of SREBP-1c , PPARγ and ACAT1 increasing PPARα . The natural-extracts suppressed OA-induced lipid accumulation and the intracellular-TG. They down-regulate the hepatic lipogenesis through SREBP-1c , besides the activation of lipolysis through the increasing of PPARα expression. Conclusions.Conclusions. Conclusions.Conclusions. Conclusions. Quercetin and the aqueous extracts decrease intracellular lipid accumulation by down-regulation of lipogenesis and up-regulation of lipolysis. Key words.Key words. Key words.Key words. Key words. Steatosis. Lipid droplets. Triglycerides. Quercetin. Cynara scolymus. Agaricus Bisporus . Mushroom. Artichoke. 243 Natural Extracts Abolished Lipid Accumulation in Cells Harbouring non-favourable PNPLA3 genotype. , 2018; 17 (2): 242-249 nome-wide association study to identify genetic determinants of liver steatosis.15 The author figured out that the polymorphism rs738409 C>G in PNPLA3 gene was robustly associated with an increased risk for hepatic steatosis. Patatin-like phospholipase domain-containing protein 3 (PNPLA3) is a transmembrane protein expressed prominently in hepatocytes and the substitution I148M has been suggested to impair TG hydrolysis in hepatocytes, favouring its accumulation.16 Recently it has been proposed that PNPLA3-148M evade ubiquitylation and proteasomal degradation, resulting in the accumulation of PNPLA3148M on the surfaces of lipid droplets impairing TGs mobilization from LDs.17 The discovery of new drugs to reduce the risk of NAFLD would be useful considering the genetics factors. The purposes of this study were to elucidate the role of quercetin and other water-soluble extracts in an in-vitro model with unfavourable genotype GG for PNPLA3.18 MATERIAL AND METHODS Cell Culture Huh7.5 cells were routinely cultured in DMEM (ThermoFisher, MA, USA) supplemented with 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin in an incubator under an atmosphere of 5% CO2 at 37 °C. The Huh7.5 cell model of OA-induced intracellular lipid accumulation was developed as previously described.19 Cells were cultured with 1mM of Oleic acid for 48 h. Control cells were treated with FFA-free medium containing the vehicle dimethyl sulfoxide (DMSO). PNPLA3 genotyping DNA from cells was extracted using the DNA isolation Kit with the MagNA Pure LC Instruments (Roche). The rs738409 SNPs were analysed using the StepOnePlus Real Time PCR System (Applied Biosystem, Foster City, USA) with a Taqman SNP Genotyping Assay, using published sequences from the NCBI Entrez SNP Database (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) (rs738409: 5’-AAGGAGGGATAAGGCCACTGTA-3 as forward and 5’- CTTTCACAGGCCTTGGTATGTTC-3’ as reverse primer). Preparation of aqueous extracts White button mushrooms (Agaricus bisporus) were used as raw material after cultivation in a pilot plant at the University of Seville (Spain), according to standard procedures. All chemicals used were of analytical grade. Agaricus bisporus Aqueous Extract (AbAE) was obtained by an enzymatic procedure based on the protocol described by Cremades and colleagues.20 Briefly, after A. bisporus homogenization (10g + 10 mL distilled water) and enzymatic digestion with a mixture of glucanase and chitinase enzymes (Novo Nordisk®, Denmark) at pH = 5, temperature 55 ºC and an enzyme/substrate ratio of 0.01, for 24 h. Finally, temperature was raised up to 90 ºC for 120 min to inactivate the enzymes. After cooling to room temperature, pH was adjusted to 7.0 with 1M NaOH and centrifuged at 8000 x g. The supernatant was collected and filtered through a 0.2 μm membrane, using the filtrate as “crude AbAE” for activity assays. Cynara scolymus aqueous extracts were obtained by a similar procedure but using a mixture of celluloses and proteases as hydrolytic agent.20 Detection of LDs by Fluorescent Microscopy. Oil Red O (ORO) cell staining. Neutral lipids stored into the LDs were visualized by fluorescence microscopy using ORO staining (SigmaAldrich, MO, USA), a vital lipophilic dye used to label fat accumulation in the cytosol, according to Hu and colleagues.21 To analyze fat accumulation 20,000 Huh7.5 cells were seeded and grown on coverslips in 24 wells plate. Huh7.5 cells were cultured in the presence of oleic acid 1mM diluted in DMSO (less than 0.01% of total volume) and treated for 48h with 50 μM of quercetin (HWI ANALYTIK, GmbH, Germany) or 0.1 mg/mL of water-soluble extract from A. Bisporus (M) or Cynara scolymus (A). The cells were rinsed two times with phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4, fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 10min and permeabilised with 0.2% Triton X-100 for 2 min. Nuclei cells were stained with 46-diamidino2phenylindole (DAPI) for 30min at room temperature, and neutral lipids were stained with ORO as previously described.22 Images were acquired with a fluorescence microscope (OLYMPUS BX41) equipped with the standard epifluorescence filter set up for DAPI and FITC. For determination of LD diameter images were captured under oil with a 100x plan apochromat objective. Analyses were performed on three independent experiments measuring at least 100 cells for each treatment using Imaging Software cell^F (Olympus, Tokyo, Japan). Fluorimetric determination of intracellular fat content - Nile red staining The intracellular fat content was determined fluorimetrically based on Nile Red staining, a vital lipophilic dye used to label fat accumulation in the cytosol.23 Ten thousand Huh7.5 cells were grown in 96 plate wells, exposed to oleic acid and treated with quercetin and water-soluble M or A for 48 h. AdipoRed™ Reagent (Lonza, Basel, Switzer- Rojas Á, et al. , 2018; 17 (2): 242-249 244 land) was added to each well and incubated at room temperature for 10 min. Intensity fluorescence was quantified using Synergy HT at 485/572 nm (BioTeK, VT, USA) and normalized to protein concentration. RNA isolation, retro-transcription and quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) Total RNA was extracted from the above-treated cells using the guanidine isothiocyanate method.24 RNA samples were treated with DNaseI. Total RNA was subjected to reverse transcription (RT) using commercially available kits (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer’s instructions. SREBP-1c, PPAR γ , PPAR α , ACAT, DGAT-1, DGAT-2, FASN, MTTP, APOB and APOE gene expression levels were analysed using commercial oligonucleotides (Qiagen, Hilden, Germany). Statistical Analysis Continuous variables are described as means ± SD of minimum three independent experiments. The Student ttest was used for comparisons between groups. P values P < 0.05 (*) p < 0.01 (**) and p < 0.001 (***) were considered statistically significant. Figure 1.Figure 1. Figure 1.Figure 1. Figure 1. Untreated Huh7.5 (A)(A) (A)(A) (A) and Huh7.5 cells cultured at OA concentrations 1 mM, for 48 hours (B)(B) (B)(B) (B). LDs and nuclei were stained with ORO (red) and Dapi (blue), respectively. Images were acquired with a fluorescence microscope (OLIMPUS BX41) equipped with the standard epifluorescence filter set up for DAPI and FITC under oil with a 100x plan apochromat objective. C.C. C.C. C. Intracellular triglycerides concentration. AdipoRed™ Assay of Huh7.5 and OA-Huh7.5 cells. The intracellular triglycerides were stained and the concentration of triglycerides was quantified by fluorescence. (Huh7.5 fold=1) (*** p < 0.01). Data are presented as the mean values ± SD obtained from three independent experiments. D.D. D.D. D. (A)(A) (A)(A) (A) mRNA gene expression levels of DGAT-1 , DGAT-2 , MTTP , FASN , apoE and apoB were determined by RT-PCR. Results were normalized using GAPDH and Huh7.5 non-treated cells were used as reference. *p < 0.05; **p < 0.01 and ***p < 0.001. Data are the mean value ± SD obtained from three independent experiments. AA AA ABB BB B DD DD D CC CC C Huh7.5 OA1mM mRNA gene expression levels (ratio to non-treated cells Huh7.5) 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Huh7.5 Huh7.5 + Q50 Huh7.5 + M Huh7.5 + A Huh7.5 + OA1 mM Huh7.5 + OA1 mM + Q50 Huh7.5 + OA1 mM + M Huh7.5 + OA1 mM + A Huh7.5 Huh7.5 + Q50 Huh7.5 + M Huh7.5 + A Huh7.5 + OA1 mM Huh7.5 + OA1 mM + Q50 Huh7.5 + OA1 mM + M Huh7.5 + OA1 mM + A Huh7.5 Huh7.5 + Q50 Huh7.5 + M Huh7.5 + A Huh7.5 + OA1 mM Huh7.5 + OA1 mM + Q50 Huh7.5 + OA1 mM + M Huh7.5 + OA1 mM + A Huh7.5 Huh7.5 + Q50 Huh7.5 + M Huh7.5 + A Huh7.5 + OA1 mM Huh7.5 + OA1 mM + Q50 Huh7.5 + OA1 mM + M Huh7.5 + OA1 mM + A Huh7.5 Huh7.5 + Q50 Huh7.5 + M Huh7.5 + A Huh7.5 + OA1 mM Huh7.5 + OA1 mM + Q50 Huh7.5 + OA1 mM + M Huh7.5 + OA1 mM + A Huh7.5 Huh7.5 + Q50 Huh7.5 + M Huh7.5 + A Huh7.5 + OA1 mM Huh7.5 + OA1 mM + Q50 Huh7.5 + OA1 mM + M Huh7.5 + OA1 mM + A DGAT1 DGAT2 MTTP FASN apoE apoB AdipoRed RFU (ratio to control) 6 5 4 3 2 1 0 ** ** * ** 245 Natural Extracts Abolished Lipid Accumulation in Cells Harbouring non-favourable PNPLA3 genotype. , 2018; 17 (2): 242-249 *** *** ***** *** *** *** *** RESULTS Huh7.5 PNPLA3 genotype Huh7.5 cells presented unfavourable genotype GG for PNPLA3 as previously was showed.18 Oleic acid-induced intracellular lipid accumulation in Huh7.5 cells Using oil red staining we observed that untreated Huh7.5 cells revealed almost absence of intracellular lipid (Figure 1A). However, as shown in figure 1B, after OA exposure LD were higher in number and size. Using a fluorescence-based AdipoRedTM assay, the amount of intracellular lipids increased in the presence of OA 78.31 ± 3.78% compared to untreated cells (Figure 1C). Effects of Quercetin and water-soluble extracts from mushroom and artichoke on hepatic lipid accumulation First, we have determined the dose by cytotoxic assay and at 0.1 mg/mL no toxic effects were observed (data not Figure 2.Figure 2. Figure 2.Figure 2. Figure 2. A.A. A.A. A. Huh7.5 (a) and OA-Huh7.5 (e) cells treated with quercetin 50 μM (b-f), aqueous extracts from mushroom (M) (c-g) and artichoke (A) (d-h) (0.1 mg/mL), for 48 h. LDs and nuclei were stained with ORO (red) and Dapi (blue), respectively. Images were taken using a fluorescence microscope (OLIMPUS BX41) equipped with a 100x objective and the standard epifluorescence filter set up for DAPI and FITC. B.B. B.B. B. LDs size were measured by Imaging Software cell^F Software. Results are expressed as fold-area μm3. C.C. C.C. C. Intracellular triglycerides concentration. AdipoRed Assay. The intracellular triglycerides were stained and the concentration of triglycerides was quantified by fluorescence (Huh7.5 fold = 1). Data are presented as the mean values ± SD obtained from three independent experiments. Experiments were performed in triplicate. (*) p < 0.05; (**) p < 0.01 (***) p < 0.001. AA AA A BB BB BCC CC C a. Huh7.5 b. Huh7.5 + Q50μM c. Huh7.5 + 0.1 mg/mL M d. Huh7.5 + 0.1 mg/mL A e. OA1 mM f. OA1 mM + Q50μM g. OA1 mM + 0.1 mg/mL M h. OA1 mM + 0.1 mg/mL A 6 5 4 3 2 1 0 AdipoRed RFU (ratio to control) Huh7.5 Huh7.5 + Q Huh7.5 + H Huh7.5 + A OA1mM OA1mM + Q OA1mM + M OA1mM + A 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 AREA (ratio to control) Huh7.5 Huh7.5 + Q Huh7.5 + M Huh7.5 + A OA1mM OA1mM + Q OA1mM + M OA1mM + A Rojas Á, et al. , 2018; 17 (2): 242-249 246 shown). A significant reduction in lipid accumulation was observed by microscopy after quercetin or extracts addition (Figure 2A). After treatment, a significant reduction of the LD size in OA-treated cells was found (Figure 2B). Intracellular lipid concentration was decreased in OAtreated cells by quercetin (66 ± 2.04%), M aqueous extract (20.40 ± 3.63%) and A aqueous extract (24.61± 0.19%) (Figure 2C). Aqueous extracts modulated lipogenesis-related gene expression Genes involved in lipogenesis (SREBP-1c, PPARγ and PPARα), significantly increased in OA-induced Huh7.5 cells at the mRNA levels (p < 0.05) (Figure 3). As shown in figure 3A, quercetin treatment decreased the expression of SREBP-1c (fold inhibition: 1.57 ± 0.13) and PPARγ (fold inhibition: 0.77 ± 0.10). The same effect was observed after treatment with the aqueous-extracts. Conversely, quercetin and artichoke extract increased the gene expression of PPAR α (Figure 3A). ACAT gene expression was increased by OA 1mM and decreased significantly (fold inhibition: 1.48 ± 0.3) after quercetin treatment being this reduction less significantly after extract addition (Figure 3B). Genes implicated on triglycerides and VLDL pathways were also modulated in OA-induced Huh7.5 cells. DGAT-1 and APOE mRNA levels were significantly increased and MTTP and APOB were decreased in OA-induced Huh7.5 cells (p > 0.05). Quercetin and artichoke extract decreased DGAT1 mRNA levels in Huh7.5 and the apolipoproteins genes were repressed by quercetin in the OA-induced model (Figure 1D). DISCUSSION Current NAFLD therapies include lifestyle modifications, physical activity and medical intervention. Probiotics, functional food and several natural compounds (i.e. resveratrol and quercetin,25 anthocyanins,26 vitamin E27) may be promising in helping therapeutic approaches. On the basis of these data, it seems that foods rich in quercetin and/or including natural extracts from mushroom and artichoke may be useful for the prevention of NAFLD. In addition to resveratrol and quercetin, other polyphenols such as Anthocyanin Cy-3-g, Proanthocyanidins, Theaflavin (a flavan-3-ol) and Ellagic acid have been studied as potential agent for both prevention and treatment of hepatic steatosis.28-31 Resveratrol is a stilbene occurring naturally in several plants and provided in the diet by various foodstuffs. In recent years, it has been shown to modify lipid metabolism, and more specifically to induce a reduction in liver triacylglycerol content.32-34 Quercetin is a natural polyphenol belonging to a group with a variable structure, known as flavonoids. It is found in onions, broccoli, tomatoes, apples and berries. Several Figure 3.Figure 3. Figure 3.Figure 3. Figure 3. A.A. A.A. A. mRNA gene expression levels of SREBP-1c , PPARγ and PPARα were determined by RT-PCR. B.B. B.B. B. ACAT-1 mRNA gene expresision levels. Results were normalized using GAPDH and Huh7.5 non-treated cells were used as reference. *p < 0.05; **p < 0.01 and ***p < 0.001. Data are the mean value ± SD obtained from three independent experiments. AA AA ABB BB B mRNA gene expression levels (ratio to non-treated cells Huh7.5) 9 7.5 6 4.5 3 1.5 0SREBP PPARγPPARα Huh7.5 Huh7.5 + Q50 Huh7.5 + M Huh7.5 + A Huh7.5 + OA1mM Huh7.5 + OA1mM + Q50 Huh7.5 + OA1mM + M Huh7.5 + OA1mM + A Huh7.5 Huh7.5 + Q50 Huh7.5 + M Huh7.5 + A Huh7.5 + OA1mM Huh7.5 + OA1mM + Q50 Huh7.5 + OA1mM + M Huh7.5 + OA1mM + A Huh7.5 Huh7.5 + Q50 Huh7.5 + M Huh7.5 + A Huh7.5 + OA1mM Huh7.5 + OA1mM + Q50 Huh7.5 + OA1mM + M Huh7.5 + OA1mM + A Huh7.5 Huh7.5 + Q50 Huh7.5 + M Huh7.5 + A Huh7.5 + OA1mM Huh7.5 + OA1mM + Q50 Huh7.5 + OA1mM + M Huh7.5 + OA1mM + A ACAT1 mRNA gene expression levels (ratio to non-treated cells Huh7.5) 9 7.5 6 4.5 3 1.5 0 ** * * * ** ***