Regulación y modificación de rutas biosintéticas de metabolitos con interés industrial en Fusarium fujikuroi

I Regulación y modificación de rutas biosintéticas de metabolitos con interés industrial en Fusarium fujikuroi Trabajo presentado para optar al Grado de Doctor en Biología ISMAEL BORREGO SERRANO Sevilla, 2024 Departamento de Genética Universidad de Sevilla Grupo Agrotecnología, S.L. Tesis realizada bajo la dirección de la Dra. María del Carmen Limón Mirón en el Departamento de Genética de la Facultad de Biología de la Universidad de Sevilla y la Dra. Rita María Palma Padilla en la empresa Grupo Agrotecnología, S.L. Dra. María del Carmen Limón Mirón Dra. Rita María Palma Padilla Ismael Borrego Serrano II I A mis padres, hermanos, familia y amigos II III ABREVIACIONES RELEVANTES METABOLITOS DMAPP Difosfato de dimetilalilo FAD Flavín adenín dinucleótido FPP Farnesil difosfato o farnesilo GAs Giberelinas GGPP Geranilgeranil difosfato o geranilgeranilo GlyNX Neurosporaxantina glicosil éster GPP Geranil difosfato o geranilo IPP Isopentenil difosfato o difosfato de isopentenilo MTHF 5,10-metiltetrahidrofolato NRP Péptido no ribosómico NX Neurosporaxantina PK Policétido ÁCIDOS NUCLEICOS A Adenina ADNc ADN complementario ARN-T ADN transferente ARNlnc ARN largo no codificante ARNm ARN mensajero ARNsn ARN pequeño nuclear C Citosina dNTP Desoxirribonucleótido trifosfato G Guanina kb Kilobase MNP Polimorfismo múltiple o de múltiples nucleótidos pb Par de bases IV T Timina SNP Polimorfismo puntual o de un solo nucleótido PROTEINAS Y DOMINIOS aa Aminoácido CPS/KS ent-copalil difosfato sintasa/ent-kaureno sintasa DES Desaturasa ent-CDP ent-copalil difosfato GGS Geranilgeranil difosfato sintasa HAT Acetiltransferasa de histonas HMG-CoA 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima-A HMGR 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima-A reductasa KAO Ácido ent-kaurenoico oxidasa KO ent-Kaureno oxidasa LOV Dominio Luz Oxígeno Voltaje PAS Domino Per-Arnt-Sim RALDH Retinaldehído deshidrogenasa RF Dominio RING finger SC Subdominio de unión a cofactor SD Subdominio de dimerización SS Subdominio de unión a sustrato SSD Dominio sensor de esteroles WCC Complejo White-Collar TÉCNICAS Y UNIDADES °C Grados centígrados Ct Umbral de ciclo FPKM Fragmentos por kilobase de transcripto por millón de lecturas mapeadas GC Cromatografía de gases V HPLC Cromatografía líquida de alta resolución kDa Kilodalton mbar Milibar nm Nanómetro OD (%) Porcentaje de oxígeno disuelto PCR Reacción en cadena de la polimerasa RNA-seq Secuenciación masiva de ARN rpm Revoluciones por minuto RT-qPCR Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real vvm Volumen de aire por volumen por minuto LÍPIDOS 14:0 Ácido mirístico (ácido tetradecanoico) 16:0 Ácido palmítico (ácido hexadecanoico) 18:0 Ácido esteárico (ácido octadecanoico) 18:1 Ácido oleico (ácido cis-9-octadecanoico) 18:2 Ácido linoleico (ácido cis,cis-9,12-octadecadiencoico) 20:0 Ácido araquídico (ácido eicosanoico) 22:0 Ácido behénico (ácido docosanoico) DAGs Diacilglicéridos FAMEs Ésteres metílicos de ácidos grasos FFAs Ácidos grasos libres LLL Glicerol 1,2,3-trilinoleico M1 Ácido graso desconocido 1 M2 Ácido graso desconocido 2 M3 Ácido graso desconocido 3 MAGs Monoacilglicéridos OLL Glicerol 1-oleico-2,3-dilinoleico OOL Glicerol 1,2-dioleico-3-linoleico OOLn Glicerol 1,2-dioleico-3-linolénico VI OOO Glicerol 1,2,3-trioleico o trioleína PC Fosfatidilcolina PE Fosfatidiletanolamina PG Fosfatidilglicerol PI Fosfatidilinositol PLL Glicerol 1-palmítico-2,3-dilinoleico PLLn Glicerol 1-palmítico-2-linoleico-3-linolénico PLnO Glicerol 1-palmítico-2-linolénico-3-oleico PLnP Glicerol 1-palmítico-2-linolénico-3-palmítico PLP Glicerol 1-palmítico-2-linoleico-3-palmítico PLPo Glicerol 1-palmítico-2-linoleico-palmitoleico POL Glicerol 1-palmítico-2-oleico-3-linoleico POO Glicerol 1-palmítico-2,3-dioleico POP Glicerol 1-palmítico-2-oleico-3-palmítico POS Glicerol 1-palmítico-2-oleico-3-esteárico PPop Glicerol 1-palmítico-2-palmitoleico-3-palmítico PPoPo Glicerol 1-palmítico-2,3-dipalmitoleico PS Fosfatidilserina SOS Glicerol 1-esteárico-2-oleico-3-esteárico SOO Glicerol 1-esteárico-2,3-dioleico SOLn Glicerol 1-esteárico-2-oleico-3-linolénico TAG Triacilglicéridos OTRA ABREVIACIONES 14C Carbono 14 ICN Código Internacional de Nomenclatura MAT Tipo de apareamiento NTG Nitrosoguanidina PC Pareja de cebadores RE Retículo endoplasmático VII RTC Pareja de cebadores de la retrotranscripción SmF Fermentación sumergida SSF Fermentación en estado sólido SSSF Fermentación en estado semisólido STR Biorreactor tanque agitado UV Ultravioleta Nota: Se utilizaron los códigos internacionales para las bases y los aminoácidos. 6 7 Introducción Género Fusarium El género Fusarium comprende un amplio y heterogéneo grupo de ascomicetos (clase Sordariomicetos, orden Hipocreales, familia Nectriaceae) ampliamente distribuido en la naturaleza, siendo uno de los grupos de hongos fitopatógenos que afecta a prácticamente todas las especies de plantas cultivables y económicamente importantes (Geiser et al., 2013; Moss & Smith, 1984; O’Donnell et al., 2018). Este género causa marchitez vascular en los cultivos, causando cada año grandes daños económicos en la agricultura en todo el mundo (Aoki et al., 2014), debido al eficiente mecanismo de dispersión de Fusarium basado en diferentes tipos de conidios que le permite adaptarse a nuevos ecosistemas y evolucionar (Leslie & Summerell, 2006; Summerell, 2019). Fusarium fue definido como género por Link in 1809 (Booth, 1971) y reúne a numerosos hongos caracterizados por la producción de conidios sin septo y fusiformes, aunque la definición de las especies del género Fusarium se ha visto históricamente obstaculizada por la ausencia de ciclo sexual y escasez de rasgos morfológicos fácilmente observables (Leslie et al., 2001; Leslie & Summerell, 2006). A lo largo de los años, tras detectar reproducción sexual (estado perfecto o teleomorfo) en algunas especies se les cambió el nombre y se las trasladó al género Gibberella. Un ejemplo es Fusarium moniliforme, cuyo teleomorfo fue denominado Gibberella fujikuroi (Nelson et al., 1983). Años más tarde, diferentes cepas pertenecientes a diferentes grupos de cruzamiento se englobaron en un grupo más grande conocido como “complejo de especies” de G. fujikuroi. El complejo comprende al menos 11 grupos de cruce (A-K), cada uno correspondiente a una especie diferente. Las cepas de cada grupo son generalmente heterotálicas, con sexos separados y determinados por un locus sexual con dos alelos, MAT-1 y MAT-2 (Steenkamp et al., 2000) que definen el tipo de apareamiento de cada hongo (+ o -). En años recientes, tras la implementación del Código Internacional de Nomenclatura (ICN) para plantas, algas y hongos (May et al., 2019; McNeil et al., 2012), 8 las especies de Fusarium se clasificaron en 20 complejos de especies, albergando al menos unas 330 especies o complejo de especies filogenéticamente distintos (Geiser et al., 2013; Yilmaz et al., 2021). Aunque el término “complejo de especies” no está bien definido y no tiene estatus de nomenclatura formal dentro del ICN (Turland et al., 2017), generalmente implica una agrupación de especies con marcadores filogenéticos y características morfológicas compartidas. El complejo de especies de Fusarium fujikuroi (FFC), anteriormente llamado Gibberella fujikuroi, incluye más de 60 especies distintas que comparten características importantes, como la producción de toxinas y otros rasgos fenotípicos (Summerell, 2019; Yilmaz et al., 2021). Las especies de FFC se agrupan en tres clados: el clado americano, el clado africano y el clado asiático (Niehaus et al., 2016; O’Donnell et al., 1998; Yilmaz et al., 2021). Figura I.1. Clados del complejo Fusarium fujikuroi y algunas especies representativas. La estirpe F. fujikuroi, anteriormente dentro del grupo de cruzamiento C del complejo G. fujikuroi, pertenece al clado patógeno de cereales asiáticos del FFC (Kvas et al., 2009; Leslie & Summerell, 2006) y es responsable de causar la enfermedad bakanae en la planta de arroz (Oryza sativa), identificado por primera vez en 1828 en Japón (Ito & Kimura, 1931; Karthik & Shu, 2023). Las plantas infectadas desarrollan tallos inusualmente largos, delgados y quebradizos, una característica alteración del crecimiento atribuida a la acción de hormonas inductoras del crecimiento, las giberelinas, excretadas por el hongo. Avanzada la enfermedad, las plantas presentan síntomas de marchitamiento y producen granos de arroz anormales, provocando grandes pérdidas de cultivos en las principales zonas de cultivos de arroz de todo el mundo (Avalos et al., 2007; Matic et al., 2017; Niehaust et al., 2016; Tudzynski, 2016). 9 F. fujikuroi se reproduce asexualmente mediante la formación de esporas, llamadas conidios, que dependiendo del tamaño y la morfología puede ser macroconidios o microconidios. Los macroconidios son grandes, con forma de medialuna, septados y multinucleados mientras que los microconidios son más pequeños y uninucleados (Kuhlman, 1982; Leslie & Summerell, 2006). Los macroconidios son generalmente producidos en abundancia por muchas especies de Fusarium, aunque son menos frecuentes en F. fujikuroi. Por su parte, la formación de microconidios unicelulares haploides facilita la manipulación genética y la aislación de estirpes con mutaciones recesivas en esta especie en el laboratorio (Avalos et al., 1985). Bajo condiciones ambientales favorables, el conidio germina formando hifas que se desarrollan y entrelazan formando un denso micelio. Figura I.2. Estados del ciclo infectivo de F. fujikuroi en plantas de arroz. Modificada de Castrillo, 2014; Gupta et al., 2014. Durante la infección, el conidio propagado por el viento o el agua de riego en primavera infecta las semillas o accede a través de pequeñas lesiones en las raíces, desarrollándose dentro de la planta hasta debilitarla y deteriorarla durante el verano (Gupta et al., 2014). Finalmente, el micelio emerge y esporula durante el invierno, dispersando los conidios y empezando de nuevo el ciclo (Ou, 1985). El ciclo sexual de F. fujikuroi es raramente observado en la naturaleza, aunque puede ser inducido bajo condiciones de laboratorio. La adición de conidios de tipo sexual (-) a micelio de tipo sexual (+) cultivado en un sustrato a base de planta, como el medio de extracto de zanahoria, e incubado con fotoperiodos de 12 horas de luz blanca cercana a la radiación ultravioleta alternados con periodos de oscuridad (Leslie et al., 2005), puede provocar la 10 formación de estructuras sexuales o peritecios, los cuales contienen tétradas desordenadas formadoras de ascosporas. Metabolismo secundario en F. fujikuroi La capacidad para producir una amplia variedad de metabolitos secundarios, algunos con efectos tóxicos en humanos y animales y otros inocuos o de interés biotecnológico, es una de las principales características de las especies del género Fusarium (Li et al., 2020). Aunque el metabolismo secundario no es esencial para la supervivencia de los hongos, su fuerte predominio en muchas especies indica que les proporciona ventajas adaptativas en sus ambientes naturales o en interacciones con otros organismos (Avalos & Limón, 2021; Tudzynski, 2014). A diferencia de otras especies de Fusarium, cuyo interés investigador se ha centrado principalmente en su patogenicidad o desarrollo, F. fujikuroi destaca como modelo en el estudio de la regulación del metabolismo secundario. Los metabolitos secundarios derivan de las vías metabólicas centrales y de grupos de metabolitos primarios, ya que el acil-Coenzima A (acil-CoA) es la molécula principal para la síntesis de terpenos, policétidos (PKs) o aminoácidos para la síntesis de péptidos no ribosómicos (NRP), que junto con los híbridos de policétidos y péptidos no ribosómicos (NRP/PKs), forman las cuatro principales familias químicas en las que se engloban la mayoría de los metabolitos secundarios que produce F. fujikuroi (Avalos & Limón, 2021; Janevska & Tudzynski, 2018). Sin embargo, la biosíntesis de metabolitos secundarios ocurre generalmente bajo condiciones ambientales muy específicas, sujetas a diferentes niveles de regulación como la específica de las rutas de biosíntesis, las vías de traducción de señales, los reguladores globales y los controles epigenéticos (Macheleidt et al., 2016; Tudzynski, 2014). En los genomas fúngicos, los genes implicados en el metabolismo secundario de los genomas fúngicos a veces se encuentran organizados en clústeres o agrupaciones génicas, cuya regulación depende de una variedad de señales ambientales como la disponibilidad y el tipo de fuente de carbono y nitrógeno, la luz, la temperatura o el pH, y controlados por diferentes proteínas reguladoras, las cuales generalmente están involucradas en los mismos factores de transcripción y sistemas de regulación globales 11 (Avalos & Limón, 2021; Rokas et al., 2020). Un ejemplo es la proteína WcoA, una flavoproteína perteneciente al complejo White-Collar, que en F. fujikuroi es el principal regulador de la luz, afectando positiva o negativamente a diferentes agrupaciones de genes de metabolitos secundarios o clústeres (Pardo-Medina et al., 2023). Este doble rol positivo/negativo en las diferentes rutas es frecuentes en estos sistemas de regulación global, incluso cuando responde a la misma señal. Figura I.3. Estructuras químicas de los metabolitos secundarios más representativos de Fusarium. Los metabolitos señalados en naranja son productos de la ciclasa de terpenos, los marcados en amarillo son productos de diferentes sintasas de policétidos , los destacados en violeta son productos derivados de sintasas de péptidos no ribosómicos y los productos híbridos NRP/PKs están marcados en verde. Modificado de Avalos & Limón, 2021; Franco-Losilla, 2023; Janevska & Tudzynski, 2018. 12 Algunos metabolitos secundarios tienen aplicaciones potencialmente útiles debido a sus propiedades biológicas. Entre los metabolitos secundarios producidos por F. fujikuroi con aplicaciones biotecnológicas encontramos la bicaverina, un policétido con propiedades antimicrobianas (dos Santos & Bicas, 2021; Studt & Tudzynski, 2014), y varios terpenoides. Los terpenoides son una familia muy diversa de más de 55.000 compuestos derivados de una molécula de cinco átomos de carbono, el isopentenil difosfato (IPP) (Sacchettini & Poulter, 1997), que en las plantas puede ser producido por dos vías biosintéticas diferentes. En la vía del mevalonato (MVA), el IPP es sintetizado a partir del mevalonato (Goldstein & Brown, 1990). Esta es la vía de síntesis que utilizan las arqueas, los animales y los hongos (Figura I.4). Por otra parte, en eubacterias, algas verdes y cianobacterias, el IPP es producido a través de la vía del metileritritol 4-fosfato (MEP), en el que el IPP se genera a partir de la condensación de piruvato y gliceraldehído 3-fosfato (Kant et al., 2023). Figura I.4. Ruta del mevalonato y de la síntesis de los precursores de los terpenoides en Fusarium. La vía del mevalonato (MVA) está resaltada en amarillo, mientras que la síntesis de precursores de los terpenoides está resaltada en gris. Los genes de Fusarium implicados en ambas rutas se encuentran señalados en rojo. 13 La síntesis de los terpenoides empieza con la fusión de una molécula de IPP (C5) con una molécula de difosfato de dimetilalilo (DMAPP), isómero de IPP, dando lugar al geranil difosfato (C10, GPP) precursor de los monoterpenoides. La adición sucesiva de una o dos moléculas más de IPP da lugar al farnesilo (C15, FPP) y al geranilgeranilo (C20, GGPP), precursores de los sesquiterpenoides y diterpenoides, respectivamente (Nagel et al., 2019). La unión de dos moléculas FPP da lugar a los triterpenoides, mientras que la unión de dos GGPP da lugar a los tetraterpenoides. Los terpenoides incluyen compuestos esenciales para la vida como los esteroles, vitales para la integridad de la membrana celular (Kodedová & Sychrová, 2015), los carotenoides, pigmentos tetraterpenoides con propiedades saludables (Rodríguez-Concepción et al., 2018) y que actúan como elementos estructurales o fotorreceptores (Sun et al., 2018), o las giberelinas, fitohormonas que actúan regulando el crecimiento vegetal en agricultura, horticultura y viticultura (Rademacher, 2016). Giberelinas Las giberelinas conforman una gran familia de ácidos carboxílicos diterpenoides tetracíclicos. La nomenclatura utilizada para nominar a cada una de las giberelinas es muy simple, ya que se les conocen por las letras GA seguidas de un número de serie; por ejemplo: GA3, GA9 o GA53. Aunque las giberelinas (GAs) son una clase de fitohormonas, inicialmente fueron identificadas como un metabolito secundario del hongo Gibberella fujikuroi, posteriormente clasificado como F. fujikuroi, por ello recibieron el nombre de giberelina A. La identificación de la enfermedad bakanae en un cultivo de arroz, y su posterior atribución a la presencia de F. fujikuroi, permitió el descubrimiento de una sustancia secretada por el hongo responsable de los síntomas de esta enfermedad (Hori, 1898; Kurosawa, 1926; Sawada, 1912). Durante años, se aislaron muchas variantes de giberelinas a partir de diferentes cultivos de F. fujikuroi (Takahashi et al., 1955; Yabuta & Sumiki, 1938). Los síntomas son un crecimiento anormal de las plantas por la elongación de los internudos, hojas de color verde amarillentos, lesiones en las raíces y granos parcialmente llenos, estériles o vacíos, lo que reduce drásticamente el rendimiento del grano (Matic et al., 2017). La investigación de las giberelinas en hongos permitió su descubrimiento en las plantas, donde actúan como reguladores naturales del 14 crecimiento y desarrollo en las plantas superiores y donde muchas otras giberelinas han sido descubiertas (MacMillan & Suter, 1958). Actualmente, hay 136 giberelinas identificadas de plantas, hongos e incluso bacterias, que se nombran de GA1 a GA136 en orden según su descubrimiento. Sin embargo, solo las GA1, GA3, GA4 y GA7 son giberelinas bioactivas (Bömke & Tudzynski, 2009; Sponsel & Hedden 2010). La giberelina más abundante en F. fujikuroi y la primera en ser estructuralmente caracterizada fue la giberelina A3 (GA3), también conocida como ácido giberélico (Curtis & Cross, 1954). Esto generalmente ha provocado bastante confusión, ya que en los tejidos vegetales normalmente se mide la concentración de GA3 en lugar de las giberelinas GA1 y GA4, compuestos activos de mayor relevancia biológica en las plantas (Hedden, 2020). La GA3 difiere de la GA1 en que posee un doble enlace entre los átomos de carbono C1 y C2 (Figura I.5). Estudios recientes sugieren que las giberelinas están en todas las plantas vasculares. En las plantas inferiores, como los helechos o los musgos, los precursores de GAs estarían involucrados en el desarrollo reproductivo (Miyazaki et al., 2018), mientras que, en las plantas superiores, las giberelinas estimularían el crecimiento de la planta y activarían los procesos del desarrollo como la germinación de semillas, la estimulación de la floración y la maduración de los frutos (Hernández-García et al., 2020; Tudzynski et al., 2016; Yamaguchi, 2008). Figura I.5. Giberelinas bioactivas. Las diferentes modificaciones químicas que presentan las giberelinas se encuentran resaltadas en color; en rojo el doble enlace C1=C2 y en naranja la 3βhidroxilación del C13. Las giberelinas también las producen algunas especies de hongos y bacterias asociados a las plantas tanto como patógenos o como simbiontes (Salazar-Cerezo et al., 2018). Además de encontrarse en F. fujikuroi, las giberelinas están presentes en otros hongos, incluidos otros Fusarium como F. sacchari, F. kozum y F. proliferatum (Troncoso et al., 2010; Tsavkelova et al., 2008). Entre ellos se encuentran Sphaceloma manihoticola 15 (Rademacher & Graebe, 1979), Neurospora crassa (Kawanabe et al., 1983), Phaeosphaeria sp. (Kawaide & Sassa, 1993) o Aspergillus fumigatus (Khan et al., 2011). Como metabolitos secundarios, las giberelinas no son esenciales para el crecimiento ni el desarrollo de los hongos, pero debido a que su producción ocurre principalmente cuando los hongos están en ambientes hostiles, posiblemente constituyen una ventaja para sobrevivir en esos nichos ecológicos. También, la producción de las giberelinas se ha relacionado con la patogénesis. Cuando se estudió si un mutante de F. fujikuroi, carente del agrupamiento de genes completo para la síntesis de GAs, era capaz de infectar e invadir las raíces del arroz, se observó que consiguió penetrar la epidermis de la raíz y crecer de forma apoplástica dentro de las células del parénquima. Sin embargo, el número de simplastos invadidos en la raíz fue significativamente inferior al invadido por la estirpe silvestre (Wiemann et al., 2013). En un estudio diferente se observó que las GAs interfieren en la defensa de las plantas suprimiendo la señalización por jasmónico y comprometiendo la capacidad de la planta para eludir una infección fúngica (Lu et al., 2014; Navarro et al., 2008). Actualmente, también se conoce la existencia de bacterias productoras de estas fitohormonas. La primera bacteria capaz de producir GA4 fue Rhizobium phaseoli (Atzorn et al., 1988). Luego, otras especies como Azospirillum lipoferum, Acetobacter diazotrophicus o Herbaspirillum seropedicae son capaces de producir giberelinas bioactivas GA1 y GA3 (Bastián et al., 1998; Bottini et al., 1989). El rol de las giberelinas en las bacterias también está ligado a la patogénesis, donde las GAs actúan como factores de virulencias, probablemente mediante la supresión del ácido jasmónico al igual que se sugiere en hongos. Por el contrario, en los rizobios fijadores de nitrógeno, las giberelinas regulan la formación de los nódulos (McAdam et al., 2018). Biosíntesis de giberelinas en Fusarium: genes y enzimas Las giberelinas forman una gran familia de diterpenos de 19 (GAs C19) o 20 (GAs C20) átomos de carbono formando sistemas de cinco o cuatro anillos, respectivamente, en los que el quinto anillo variable es una lactona. Las giberelinas C19 contienen una estructura pentacíclica derivadas de las giberelinas C20 tetracíclicas tras la eliminación 22 transcripcionales ampliamente reconocidos son los de la familia de proteínas velvet, las cuales presentan varias funciones en la regulación del metabolismo secundario en hongos (Eom et al., 2018). Además de participar en diferentes procesos como la reproducción sexual y asexual, la morfogénesis, la virulencia o en la producción de pigmentos, las proteínas Vel1, Vel2 y Lae1 participan en la producción de giberelinas en F. fujikuroi. Vel1 y Lae1 interaccionan en el núcleo durante la producción de giberelinas, actuando como un activador de la biosíntesis de GA3. Además, la deleción de vel1 o vel2 conduce a un silenciamiento de todo el clúster de GAs y la pérdida total de GA3 (Wiemann et al., 2010). La regulación del complejo velvet es parecida a la regulación de AreA y ambas proteínas regulan positivamente los genes del clúster de las GAs de forma individual y aditivamente. Vel1 es capaz de superar la represión por nitrógeno de una forma dependiente de AreA (Wiemann et al., 2010), ya que la deleción de areA resultó en la disminución de Vel1 en presencia de un alto contenido de nitrógeno (López-Berges et al., 2014). También, la expresión de Lae1 podría estar afectada por Vel1 (Tudzynski, 2014). La sobreexpresión de lae1 condujo a una de-represión de los genes de la síntesis de GAs en condiciones represoras de alto nitrógeno. Además, la sobreexpresión de una acetiltransferasa de histonas, HAT1, en un mutante Δlea1 complementó la expresión de los genes de la GAs y su producción, sugiriendo que Lae1 podría estar actuando como una acetiltransferasa de histonas en la de-represión de los genes del clúster de las GAs (Niehaus et al., 2018). La actividad transcripcional de la mayoría de los clústeres de genes del metabolismo secundario está correlacionada con las diferentes configuraciones de la cromatina, empaquetadas de manera suelta o densa y determinadas principalmente por la metilación y la acetilación de histonas (Bok et al., 2009). En F. fujikuroi también existen factores reguladores de histonas del clúster de biosíntesis de las giberelinas como acetiltransferasas y metiltransferasas. Además de Lae1, la acetiltransferasa Spt-AdaGcn5 (SAGA) de F. fujikuroi es esencial para la acetilación de varios sitios de las histonas, donde especialmente la acetilación en el sitio H3K9 induce la expresión del clúster de las GAs (Rösler et al., 2016). Otra de las marcas epigenéticas relacionada con la expresión génica es la metilación de la histona 3 en la lisina 4 (H3K4), implicada en el silenciamiento y activación de clústeres. La dimetilación de la H3K4 se correlaciona positivamente con 23 la biosíntesis de giberelinas, al aumentar los niveles de transcripción de los genes P4504 y P450-2 mediante la dimetilación de H3K4 en F. fujikuroi (Wiemann et al., 2013). Por lo tanto, la manipulación de la metilación de histonas en el genoma puede ser una herramienta muy útil en la investigación de la regulación génica, especialmente en los clústeres de genes de metabolitos secundarios (Douillet et al., 2020). Avances en la producción industrial de giberelinas en Fusarium Debido a la capacidad de promover el crecimiento de las plantas y aumentar la fructificación (Shah et al., 2023), el ácido giberélico es producido a escala industrial a partir de cultivos de Fusarium fujikuroi, el principal productor de giberelinas, por su aplicación en la agricultura y horticultura, siendo un ejemplo el uso de GA3 en la producción de uva sin semillas (Gao et al., 2020). El mercado global de GA3 está creciendo sustancialmente debido principalmente al crecimiento de la población global y al aumento de la demanda de productos para una agricultura sostenible (Keswani et al., 2022). Los avances en la mejora de la producción de GA3 se han centrado principalmente en la generación de cepas con altos rendimientos mediante técnicas como la manipulación genética y la optimización de la fermentación, evitando la mutagénesis por su inestabilidad genética durante el cultivo y su baja tasa de mutagénesis positiva (Peng et al., 2020; Zhang et al., 2020). A lo largo de los años se han ido utilizando otras estrategias de ingeniería metabólica en F. fujikuroi (Wang et al., 2022). La expresión constitutiva de varios genes de la ruta de biosíntesis de giberelinas como el gen ggs2 o el gen cps/ks condujo a un aumento de la productividad total de giberelinas en un 50%. Sin embargo, la sobreexpresión de los genes fpps y hmgR resultó en una reducción de la producción total de giberelinas. Además, la expresión de una versión truncada de la HgmR en un mutante deficiente de la P450-3 aumentó la producción de una mezcla de GA4/GA7 en un 250% (Albermann et al., 2013). El uso del sistema CRISPR/Cas9 para aumentar la cantidad de precursores de la biosíntesis de giberelinas provocó un aumento de la producción de una mezcla de GA4/GA7 de hasta ocho veces en F. fujikuroi (Shi et al., 2019). Sin embargo, la disrupción de rutas competidoras de precursores, como 24 la carotenogénesis, no afectó a la capacidad de producir giberelinas de los mutantes carRA o carB (Linnemannstöns et al., 2002). También se han intervenido los genes implicados en la regulación del nitrógeno (Tudzynski, 2014). Gracias a los análisis transcripcionales, la modificación de la regulación de la síntesis de giberelinas con la sobreexpresión de AreA y Lae1, dos factores positivos de la red de regulación, y la manipulación de la expresión de los genes gss2 y cps/ks mediante el uso de promotores bidireccionales inducibles por bajo nitrógeno han permitido la generación de estirpes de F. fujikuroi capaces de producir hasta 3 g L-1 de GA3 (Wang et al., 2023). La optimización de la fermentación también es un procedimiento clave en la producción de ácido giberélico. El medio de cultivo se ha suplementado con diferentes residuos agrícolas, incluyendo la cáscara del arroz y el bagazo de yuca (Otálvaro et al., 2008), la caña de azúcar y el bagazo de soja (Rodríguez et al., 2009), aceites vegetales (Rios-Iribe et al., 2016), pulpa de cítricos (de Oliveira et al., 2017) o harina de arroz y harina de maíz (Peng et al., 2020). La fermentación industrial más utilizada para la síntesis de GA3 es la fermentación sumergida (SmF), aunque también se han utilizado estrategias de fermentación avanzadas, como la fermentación en estado sólido (SSF) (Rangaswamy, 2012) o la fermentación por lotes alimentados (Shukla et al., 2005). Recientemente se ha descrito a nivel de laboratorio un sistema de fermentación en estado semisólido (SSSF) para la producción de giberelinas, utilizando partículas de pulpa sumergida y consiguiendo mejores rendimientos de GA3 que el sistema SmF (de Oliveira et al., 2017). Otros factores que afectan a la producción del ácido giberélico son la temperatura, la cinética del metabolismo de los nutrientes, el impacto de otros nutrientes como el glicerol o la oxigenación durante la fermentación (Borrow et al., 1964; Brückner et al., 1991; Peng et al., 2020; Wang et al., 2017). Actualmente, los estudios se centran en establecer modelos de fermentación optimizados para mantener el equilibrio entre el crecimiento celular y la síntesis de giberelinas dentro de las condiciones nutricionales limitadas. Un bajo nivel de nitrógeno y un alto aporte de oxígeno disuelto durante la etapa de biosíntesis de GA3 son esenciales en la productividad. 25 Carotenoides Los carotenoides son pigmentos tetraterpenoides lipofílicos presentes en los principales grupos taxonómicos (Rodríguez-Concepción, et al., 2018), sintetizados por todas las especies fotosintéticas, incluidas las plantas, las algas y las cianobacterias, pero también son producidos por muchos organismos heterótrofos (Britton et al., 2004), incluidos las bacterias no fotosintéticas (Boronat & Rodríguez-Concepción, 2014; Phadwal, 2005) y los hongos (Avalos & Limón, 2015; Sandmann et al., 2002). La mayoría de los carotenoides son moléculas de polienos alifáticas derivadas de ocho unidades de isoprenos, a veces ciclados en sus extremos. El color característico de cada carotenoide, generalmente en el rango del rojo al amarillo, depende tanto del número de dobles enlaces conjugados que contiene como de la presencia de anillos en la molécula (Meléndez-Martínez et al., 2007). Dependiendo de la composición química, los carotenoides se clasifican en dos principales grupos: carotenos y xantofilas (Britton, 2020). Los carotenos, como el licopeno y β-caroteno, están compuestos de carbonos e hidrógenos, mientras que las xantofilas, como la zeaxantina y la astaxantina, también poseen moléculas de oxígeno en su estructura. Actualmente, más de 1.200 carotenoides naturales se han descrito en más de 720 organismos (Carotenoid Database), los cuales son responsables de su típica pigmentación roja, naranja o amarilla. Al igual que las giberelinas, la síntesis de los carotenoides deriva de la condensación de unidades de isopentenil difosfato. Como se ha mencionado anteriormente, el IPP puede ser sintetizado por dos rutas diferentes: la ruta del mevalonato (MVA) y la ruta del metileritritol 4-fosfato (MEP). En los hongos, el IPP es producido por la vía del mevalonato a partir del 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) (Goldstein & Brown, 1990). La agregación sucesiva de unidades IPP para producir GPP, FPP y GGPP durante las primeras etapas en la biosíntesis de los terpenos es catalizada por diferentes transferasas de prenilo. Como vimos anteriormente, el geranilgeranil difosfato es catalizado por dos GGPP sintasas en F. fujikuroi. La GGPP sintasa codificada por el gen ggs1 es la responsable de la síntesis de GGPP para la producción de carotenoides. 26 Tanto en las plantas como en los organismos fotoautótrofos, los carotenoides participan en la fotorrecepción de la luz y en la fotoprotección de la maquinaria fotosintética (Lichtenthaler, 2012; Rodríguez-Concepción et al., 2018). Como antioxidantes, los carotenos participan en la desintoxicación del oxígeno singlete e inhiben la formación de radicales libres (Avalos & Limón, 2015). También son responsables de los colores de muchas flores y frutas, lo cual promueve la polinización y la dispersión de las semillas debido a la atracción de los animales por los vivos colores. Son responsables de la pigmentación de algunos animales, como las aves, los peces o los crustáceos. Los animales, a excepción de algunos casos raros en áfidos (Moran & Jarvik, 2010), carecen de la capacidad para sintetizar carotenoides y lo obtienen a través de la dieta. También, los carotenoides son una importante fuente de retinoides involucrados en la visión y en la morfogénesis (von Lintig et al., 2010) como la vitamina A, cuya deficiencia causa problemas de salud en muchos países en desarrollo (Dawson, 2000; Rodríguez-Concepción et al., 2018). Además, son beneficiosos en diferentes enfermedades humanas como la diabetes, la obesidad, la osteoporosis o la degeneración macular, por lo que al consumo de carotenoides se le atribuye un papel beneficioso en la protección frente al envejecimiento o el cáncer y la mejora en la respuesta inmunológica (Eggersdorfer & Wyss, 2018; Britton, 2020). Los carotenoides son ampliamente utilizados en la industria, gracias a sus valiosas propiedades, como en la cosmética, en la farmacéutica o en la alimentación (Kiki, 2023; Rather et al., 2022; Sen et al., 2019). Gracias a la manipulación genética y facilidad de crecimiento de muchos microorganismos, se usan en la producción industrial de carotenoides (Avalos & Limón, 2015). Síntesis de carotenoides en Fusarium: genes y enzimas La neurosporaxantina (NX), principal carotenoide producido por las especies del género Fusarium, es un apocarotenoide carboxílico C35, químicamente definido como ácido β-apo-4’-carotenoico (Aasen & Jensen, 1965). Fue detectada por primera vez en Neurospora crassa (Zalokar, 1957) y, posteriormente, en Fusarium aquaductuum (Bindl et al., 1970), junto a otros carotenoides naturales como ζ-carotenos, neurosporeno, licopeno, γ-caroteno o toruleno. A diferencia del β-caroteno o la astaxantina, la NX no es 27 un carotenoide frecuente en hongos, aunque también se han encontrado en Verticillium (Valadon et al., 1982) y Podospora (Strobel et al., 2009). La neurosporaxantina también se describió en F. fujikuroi junto con el resto de los precursores (Avalos & Cerdá-Olmedo, 1987; Hornero-Méndez et al., 2018), aunque se detectó más cantidad de β-zeacaroteno que de licopeno. Esto indica que la ciclación se puede producir tanto en el neurosporeno como en el licopeno, dependiendo de la especie. Además, la presencia de β-caroteno en F. fujikuroi indica que la ciclasa CarRA también es capaz de reconocer el γ-caroteno como sustrato. Debido a su grupo carboxílico, la neurosporaxantina puede ser esterificada, como ocurre en una especie marina de Fusarium, donde una parte de la NX es convertida en glicosil-éster (Sakaki et al., 2002). La biosíntesis de carotenoides en Fusarium se ha estudiado durante años (Avalos et al., 2017b) y su ruta se muestra en la Figura I.7A. La identificación de los genes de la carotenogénesis en Fusarium comenzó con el estudio del gen carB de F. fujikuroi, identificado por su similitud de secuencia con el gen al-1 de N. crassa (Schmidhauser et al., 1990). La complementación de un mutante albino que acumula fitoeno y la aparición del mismo fenotipo tras la mutación dirigida del gen carB confirmo la función de este gen (Linnemannstöns et al., 2002). La enzima CarB es responsable de los 5 pasos de desaturación de la ruta de biosíntesis de NX, tal como se identificó por un alelo mutante específicamente afectado en la quinta desaturación (Prado-Cabrero et al., 2009). Simultáneamente, y por su cercanía al gen carB, el siguiente gen que se identificó fue el gen carRA, ortólogo del gen al-2 que codifica la fitoeno sintasa de N. crassa (Schmidhauser et al., 1994). La deleción del gen carRA en F. fujikuroi generó mutantes albinos, lo que permitió concluir que el gen carRA también codifica la fitoeno sintasa en este hongo (Linnemannstöns et al., 2002). Posteriormente, se identificó un dominio ciclasa en la enzima CarRA al igual que en su ortólogo de N. crassa. Aunque no se han descrito mutantes del dominio ciclasa de CarRA en F. fujikuroi, la identificación de mutantes del gen al-2 en N. crassa con un fenotipo rojizo debido a la acumulación de intermediarios no ciclados y la elevada homología de sus secuencias génicas sugieren una misma funcionalidad dual (Arrach et al., 2002; Díaz-Sánchez et al., 2011b). 28 Figura I.7. Biosíntesis de carotenoides en Fusarium. (A) Ruta de síntesis de carotenoides en F. fujikuroi. Las modificaciones químicas y las enzimas encargadas de cada reacción están resaltados en el mismo color. El color aproximado cada carotenoide está resaltado bajo el nombre. (B) Organización genómica de los genes car responsables de la carotenogénesis en Fusarium. Los genes estructurales carX, carRA y carB se encuentran en un clúster junto con el gen carO, mientras que los genes ggs1, carT y carD se encuentran en otras zonas del genoma. Los huecos en los genes representan los intrones. Modificado de Avalos et al., 2021. Por lo que la condensación de dos moléculas GGPP por la fitoeno sintasa CarRA genera fitoeno, la primera molécula de 40 carbonos con la típica estructura de 29 carotenoide. Posteriormente, la enzima CarB cataliza tres pasos de desaturación que originan fitoflueno, ζ-caroteno y neurosporeno, respectivamente. Por una parte, la actividad ciclasa de CarRA introduce un anillo β en uno de los extremos del neurosporeno formándose β-zeacaroteno, el cual se transforma en γ-caroteno tras una desaturación por la enzima CarB. Por otra parte, el neurosporeno sufre una desaturación por CarB formándose licopeno, el cual sirve como precursor para la formación de γcaroteno tras la ciclación de uno de los extremos por parte de la enzima CarRA (Figura I.7A). La formación de toruleno o β-caroteno a partir del γ-caroteno, depende de si ocurre una quinta desaturación catalizada por CarB o una segunda ciclación del extremo libre catalizada por CarRA, respectivamente. Ambos carotenos son sustratos de enzimas de la familia de las oxigenasas de carotenoides, que por escisión oxidativa interna producen apocarotenoides (Sui et al., 2013). Inicialmente, la identificación del gen carX localizado junto al gen carRA y transcrito divergentemente sugirió que la enzima CarX estaba implicada en la síntesis de NX a partir del toruleno. Sin embargo, la mutación dirigida del gen carX no evito la síntesis de neurosporaxantina (Thewes et al., 2005). El estudio de la actividad enzimática de CarX reveló que escinde simétricamente el βcaroteno para producir dos moléculas de retinal (Prado-Cabrero et al., 2007b). Junto a los genes carX, carRA y carB se encuentra un gen que codifica una rodopsina, el gen carO, cuya regulación es muy parecida al resto de los genes (Avalos et al., 2017b). La rodopsina generalmente se une al retinal como un grupo prostético que absorbe luz; este hecho le aporta una coherencia biológica a la agrupación de genes para la síntesis de carotenoides o clúster car formado por los tres genes para la síntesis de retinal carX, carRA, carB y el gen de la rodopsina carO (Figura I.7B). Por su parte, el retinal también puede ser utilizado por una segunda rodopsina de F. fujikuroi, codificada por el gen opsA (Estrada & Avalos, 2009), o sujeto a otras reacciones químicas, como su conversión en ácido retinoico por una deshidrogenasa de aldehído muy similar a la enzima retinaldehído deshidrogenasa (RALDH) de mamíferos. La actividad enzimática de la deshidrogenasa CarY de Fusarium verticilloides se demostró in vitro (Díaz-Sánchez et al., 2016) y, aunque la mutación del gen carY no afectó a la carotenogénesis, causó varias alteraciones en el desarrollo del hongo (Díaz-Sánchez, 2013). Sin embargo, el ácido 30 retinoico no se ha detectado en el micelio de Fusarium por lo que la función biológica de carY no se ha determinado de forma concluyente (Avalos et al., 2017b). La búsqueda en el genoma de Fusarium de otras enzimas de la familia de las oxigenasas de carotenoides permitió la identificación de los genes responsables de la síntesis de neurosporaxantina a partir de toruleno. El gen carT codifica una oxigenasa capaz de escindir el toruleno para producir β-apo-4’-carotenal (Prado-Cabero et al., 2007). La función de carT se confirmó mediante el análisis de alelos mutantes en estirpes acumuladoras de toruleno y mediante la complementación del fenotipo mutante tras reintroducir el alelo silvestre. En estudios similares, la mutación dirigida del gen ortólogo cao-2 de N. crassa causó una acumulación de toruleno y un bloqueo de la síntesis de NX (Saelices et al., 2007), al igual que ocurrió con la disrupción dirigida del ortólogo en Gibberella zeae, teleomorfo de Fusarium graminearum (Jin et al., 2010). El estudio de un mutante amarillo en N. crassa permitió la identificación del gen responsable de la síntesis de síntesis de neurosporaxantina. Este mutante estaba afectado en el gen ylo-1, que codifica una deshidrogenasa de aldehído responsable de la oxidación final del grupo aldehído del β-apo-4’-carotenal, demostrado con la actividad in vitro de la proteína YLO1 purificada y con la complementación del fenotipo ylo-1 (Estrada et al., 2008b). La identificación del gen ortólogo en F. fujikuroi, el gen carD, se confirmó a través de la mutación dirigida, que resultó en la pérdida total de neurosporaxantina y una acumulación de carotenoides, posiblemente derivados del β-apo-4’-carotenal (DíazSánchez et al., 2011). Los genes carT y carD, necesarios para la síntesis de neurosporaxantina a partir del toruleno, no se encuentran en el clúster de la carotenogénesis (Figura I.7B). Además, tanto esta organización génica como su regulación se conserva en otras especies de Fusarium (Avalos et al., 2017b). Regulación de la carotenogénesis en Fusarium La expresión de los genes estructurales de la carotenogénesis en hongos, incluidos los de Fusarium, puede estar regulada por diferentes señales ambientales como la luz, la temperatura o el estrés, entre otros (Avalos et al., 2017b). 31 Regulación por luz Una de las señales regulatorias más estudiada en muchos organismos es la luz; ésta controla importantes respuestas morfológicas y fisiológicas como el ritmo circadiano, el tropismo, la morfogénesis o la síntesis de pigmentos, incluidos los carotenoides, en hongos filamentosos como Phycomyces blakesleeanus, Mucor circinelloides, Blakeslea trispora, F. fujikuroi y N. crassa (Avalos & Cerdá-Olmedo, 1987; Bejarano et al., 1991; Morelli et al., 1993; Navarro et al, 1995; Quiles-Rosillo et al., 2005). La producción de carotenoides regulada por luz o fotocarotenogénesis se ha analizado en profundidad en Neurospora (Avalos & Corrochano, 2013) y en Fusarium (Avalos et al., 2017). En Fusarium, el efecto de la luz fue estudiado en detalle en F. aquaedectuum (Rau, 1959). El rápido incremento de los niveles de transcripción de los genes carRA, carB, carT, carX, y en menor medida, carD, tras la iluminación del micelio de Fusarium crecido en oscuridad durante la fotoinducción de la carotenogénesis condujo a un aumento de la producción de carotenoides, reflejado en una pigmentación del micelio hacia el naranja. El análisis de los genes del clúster car de F. fujikuroi mediante northen blot y RTPCR reveló una inducción similar a la del gen carT, responsable de la síntesis de neurosporaxantina (Avalos et al., 2017b) y similar a lo observado para los genes de la carotenogénesis en Fusarium oxysporum (Rodríguez-Ortiz et al., 2012) y F. verticillioides (Adám et al., 2011; Díaz-Sánchez et al., 2016). En Fusarium, existen cuatro familias de fotorreceptores responsables de detección de la luz y la transmisión de las señales: flavoproteínas, fitocromos, rodopsinas y criptocromos/fotoliasas (Pardo-Medina et al., 2023). Estos funcionan junto a los cromóforos, moléculas capaces de detectar rangos de longitud de onda específicos de luz o radiación, provocando un cambio conformacional o químico en las proteínas contiguas y produciendo una respuesta directa o a través de una transducción de señales (Beattie et al., 2018). Las flavoproteínas son el principal sistema de regulación por luz en los hongos (Corrochano, 2019; Yu & Fischer, 2019), en el que diferentes grupos de proteínas pueden detectar la luz azul a través del cromóforo flavina (Iwata et al., 2021). El complejo Whitecollar (WCC) fue el primer sistema de fotorrecepción identificado en los hongos (Harding 38 39 Objetivos 40 41 Objetivos El objetivo principal de esta tesis es potenciar la producción de metabolitos de interés industrial como las giberelinas y los carotenoides en F. fujikuroi mediante la regulación de sus rutas biosintéticas y la producción en un biorreactor a escala piloto. Para ello, se han abordado los siguientes objetivos específicos: • Sobreexpresar el dominio catalítico de la enzima HMG-CoA reductasa en la estirpe silvestre y en el mutante carSde F. fujikuroi para estudiar su efecto en la producción de giberelinas y carotenoides. • Aislar estirpes superproductoras de carotenoides con un perfil enriquecido en βcaroteno en un mutante en fondo genético ΔcarX. • Establecer los parámetros óptimos de producción de giberelinas y carotenoides de la estirpe silvestre de Fusarium fujikuroi en un biorreactor de tanque agitado. • Comparar la producción de giberelinas y carotenoides de las estirpes mutantes en el biorreactor con las estirpes parentales. 42 43 Resultados 44 45 Capítulo 1 46 47 Capítulo 1: Sobreexpresión del dominio catalítico de la HMG-CoA reductasa INTRODUCCIÓN La gran capacidad de producción de los hongos del género Fusarium se debe a la complejidad de su metabolismo secundario. Muchos de estos metabolitos son micotoxinas que se encuentran en los alimentos derivados de las plantas contaminados por Fusarium y que pueden causar enfermedades a los animales y humanos que los consumen (Desjardins, 2006; Desjardins & Proctor, 2007). Otros metabolitos, en cambio, tienen un gran valor por sus aplicaciones biotecnológicas, o incluso deseables para el consumo humano (Namitha & Negi, 2010), entre los que se encuentran los terpenoides. Los terpenoides son una familia muy diversa de más de 55.000 compuestos que tienen su origen en el difosfato de isopentenilo (IPP), que por isomerización mediante la enzima isopentenil difosfato delta isomerasa da lugar al difosfato de dimetilalilo (DMAPP). La condensación sucesiva de una a tres moléculas de IPP con una de DMAPP, catalizada por la isoprenil difosfato sintasa, da lugar a largas moléculas de difosfato de prenilo con diez (C10, geranilo, GPP), quince (C15, farnesilo, FPP), o veinte carbonos (C20, geranilgeranilo, GGPP) (Nagel et al., 2019). Los terpenoides incluyen compuestos esenciales para la vida como los esteroles, vitales para la integridad de la membrana celular (Kodedová & Sychrová, 2015), los carotenoides, pigmentos tetraterpenoides que actúan como elementos estructurales o fotorreceptores en plantas (Sun et al., 2018) y como precursores de compuestos implicados en la visión y morfogénesis de animales (Dawson, 2000; von Lintig, 2010), o las giberelinas, fitohormonas que actúan regulando el crecimiento vegetal y se usan en agricultura, como por ejemplo en la horticultura y en la viticultura (Rademacher, 2016). Las plantas utilizan dos rutas independientes para producir IPP y DMAPP; la vía del mevalonato (MVA) principalmente y la vía del fosfato de metileritritol (MEP) o independiente del mevalonato. La vía del mevalonato le proporciona los precursores para la síntesis de los sesquiterpenos, poliprenoles, fitoesteroles y triterpenoides, mientras que los precursores de la vía independiente del mevalonato se utilizan para la 54 Figura C1.4. Análisis Southern del ADN genómico de la estirpe silvestre, del mutante carSy de los transformantes SG272, SG273, SG274 y SG275. (A). Esquema genómico del gen hmgR silvestre y de la versión truncada (thmgR). La sonda de hibridación se indica como una barra roja y las bandas de hibridación esperadas tras la digestión con EcoRI y SacII se indican como líneas azules y naranja, respectivamente. La sonda de 730 pb se amplificó mediante PCR utilizando la pareja de cebadores PC4. Los sitios de corte de EcoRI y SacII están indicados como E y S. (B) Análisis Southern de las diferentes estirpes de F. fujikuroi analizadas. M: Marcador de tamaño (kb). IMI58289: Estirpe silvestre F. fujikuroi. SG39: Mutante carS-. SG272-274: Transformantes thmgR. 55 El resultado de la hibridación (Figura C1.4B) muestra una banda de 7,8 kb y de 2,5 kb en todas las estirpes al cortar el ADN genómico con EcoRI y SacII, respectivamente, que corresponden con la copia silvestre del gen hmgR. La estirpe silvestre y el mutante carSsolo presentan la copia silvestre, mientras que los transformantes, además de la copia silvestre, presentan una o más bandas de diferentes tamaños correspondientes a las nuevas copias truncadas. Singularmente, el transformante SG274 presenta entre dos o tres copias más de la versión truncada del gen hmgR, dependiendo de si el ADN está digerido con EcoRI o SacII. Figura C1.5. Niveles de ARNm del gen hmgR en los transformantes thmgR de F. fujikuroi. Las muestras se obtuvieron a partir de cultivos de 3 días en medio mínimo DG líquido a 30°C en oscuridad. Los niveles relativos de ARNm se refirieron al contenido de ARNm de la estirpe silvestre. El par de cebadores utilizado para la expresión del gen hmgR fue RTC3. Los niveles de transcripción se normalizaron frente al gen FFUJ_04397 que codifica la β-tubulina, (pareja de cebadores RTC1), y al gen FFUJ_13490, que codifica a la enzima gliceraldehido 3-P deshidrogenasa o GPDH (pareja de cebadores RTC2). Los resultados muestran la media y el error estándar de tres réplicas biológicas independientes; prueba t de Student. Las letras indican agrupaciones estadísticas con un nivel de significancia del 0,05%. Con el propósito de averiguar si se estaba sobreexpresando la copia del gen hmgR que codifica el dominio catalítico de la HMG-CoA reductasa (thmgR), se estudiaron mediante RT-qPCR los niveles de ARN mensajero (ARNm) del gen hmgR en los diferentes transformantes de F. fujikuroi (Figura C1.5). El ARN se extrajo del micelio de las diferentes estirpes (ver materiales y métodos) cultivadas en oscuridad, y se retrotranscribió a ADN 56 complementario (ADNc) para cuantificar las cantidades del gen hmgR mediante RTqPCR. Tras analizar los datos, se observó que todos los transformantes tenían más cantidades relativas de ARNm del gen hmgR respecto a la estirpe silvestre y a la estirpe mutante carS-. Por lo tanto, se confirma que varios transformantes de F. fujikuroi sobreexpresan el dominio catalítico de la HMG-CoA reductasa (OE:thmgR). Caracterización de los transformantes OE:thmgR. Fenotipo y síntesis de carotenoides El fenotipo de los transformantes OE:thmgR se analizó en diferentes medios de cultivos con diferentes fuentes y cantidades de nitrógeno, tanto en oscuridad como iluminación constante. Las colonias de los transformantes OE:thmgR cultivadas en medio sólido mostraron una morfología, un desarrollo micelial, una capacidad de crecimiento o una pigmentación, bajo cualquiera de las condiciones observadas, muy similares a la de las estirpes parentales: la estirpe silvestre y el mutante SG39 (Figura C1.6). Las transformantes OE:thmgR SG272 y SG273 no presentaron pigmentación al igual que la estirpe silvestre cuando se incubaron en oscuridad y un aspecto naranja pálido cuando crecieron bajo iluminación, al igual que ocurre en la estirpe silvestre. En cambio, los transformantes carS-/OE:thmgR SG274 y SG275 presentaron una intensa pigmentación anaranjada, tanto en luz como en oscuridad, tal como ocurre en la estirpe mutante carS- . Para comprobar el posible efecto de la sobreexpresión del dominio catalítico de la HMG-CoA reductasa en la carotenogénesis, se analizó el contenido de carotenoides de los diferentes transformantes OE:thmgR y se comparó con el de las estirpes parentales. La acumulación de carotenoides se analizó en los micelios de las estirpes cultivadas tanto en cajas con medio sólido como en matraces en cultivo líquido, bajo diferentes condiciones de iluminación. Las diferentes estirpes se cultivaron en cajas con medio mínimo DG durante 7 días en oscuridad como con iluminación, se recogieron los micelios y se determinó el contenido en carotenoides (Figura C1.7A). 57 Figura C1.6. Caracterización fenotípica de los transformantes OE:thmgR. Crecimiento y pigmentación de la estirpe silvestre, el mutante carSy los transformantes OE:thmgR en los diferentes medios. DG: medio mínimo, DG bajo nitrógeno: DG con 0,3 g L-1 NaNO3, DG pH 7: DG con HK2PO4 (pH neutro) en lugar de H2KPO4 (pH ácido), DGasn: DG con asparagina en lugar de nitrato, DG peptona: DG suplementado con 2 g L-1 de peptona, PDA: patata dextrosa agar. Todas las estirpes fueron cultivadas por triplicado durante 7 días a 30°C, en condiciones de luz y oscuridad. La disposición de las estirpes en las cajas Petri se muestra abajo. 58 Los resultados mostraron unas cantidades de carotenoides similares en los transformantes SG272 y SG273 con respecto a la estirpe silvestre, tanto en luz como en oscuridad. Como ya se ha descrito previamente, al analizar la producción de carotenoides de las estirpes en fondo mutante carS- (SG39, SG274 y SG275) se observó un aumento de la producción de hasta unas 50 veces con respecto a la estirpe silvestre en oscuridad (Figura C1.7A). Sin embargo, la producción de carotenoides en el transformante SG274 fue menor con respecto a la estirpe mutante SG39 y al transformante SG275, tanto en luz como en oscuridad. Figura C1.7. Efecto de la sobreexpresión de del dominio catalítico de la HMG-CoA reductasa de F. fujikuroi en la producción de carotenoides. (A) Producción de carotenoides en cajas con medio sólido DG tras 7 días de incubación a 30°C en luz y oscuridad. (B) Producción de carotenoides en matraces con medio optimizado para producir neurosporaxantina tras 28 días de incubación a 30°C en oscuridad. Los datos muestran la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes; prueba t de Student. Las letras indican agrupaciones estadísticas con un nivel de significancia del 0,01%. También, se estudió la producción de carotenoides de los diferentes transformantes en cultivo líquido en matraces con medio optimizado para la producción de neurosporaxantina durante 28 días en oscuridad (Parra-Rivero et al., 2020). Los resultados mostraron un patrón muy similar de acumulación de carotenoides en todas las estirpes y condiciones al observado en medio sólido (Figura C1.7B). 59 La cantidad de carotenoides de los transformantes SG272 y SG273 fue parecida a la de la estirpe silvestre. La producción de carotenoides en el transformante SG274 fue menor a la del mutante SG39 y del transformante SG275. Además, el contenido total de carotenoides en el cultivo líquido durante 28 días aumentó hasta 6 veces con respecto a la producción de todas las estirpes de F. fujikuroi cultivadas en medio sólido y en oscuridad. Producción de giberelinas Otro grupo de terpenoides de gran interés en esta tesis son las giberelinas. Durante el proceso de selección de los transformantes OE:thmgR de F. fujikuroi, se observó que la síntesis de giberelinas en estas estirpes está alterada. Por este motivo, se ha analizado el efecto de la sobreexpresión del dominio catalítico de la HMG-CoA reductasa en la producción de las giberelinas. Los diferentes transformantes se cultivaron en matraces con diferentes medios líquidos, bajo diferentes condiciones de iluminación. Figura C1.8. Efecto de la sobreexpresión de del dominio catalítico de la HMG-CoA reductasa de F. fujikuroi en la producción de giberelinas. (A) Producción de giberelinas en medio ICI 10% en condiciones de luz y oscuridad. (B) Producción de giberelinas en medio complejo en oscuridad. En ambos casos las estirpes se cultivaron en matraces con medio líquido durante 17 días a 30°C. Los datos muestran la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes.; prueba t de Student. Las letras indican agrupaciones estadísticas con un nivel de significancia del 0,05%. 60 Las diferentes estirpes de F. fujikuroi se cultivaron en medio líquido ICI 10% durante 17 días en oscuridad y bajo iluminación. Finalizado el cultivo, las giberelinas totales de los transformantes se cuantificaron mediante espectrofotometría de fluorescencia a partir de los cultivos filtrados y se compararon con las de las estirpes parentales (Figura C1.8A). Los resultados mostraron una disminución significativa en la producción de giberelinas de la estirpe mutante SG39 con respecto a la estirpe silvestre. La producción de giberelinas en los transformantes SG272 y SG273 aumentó significativamente con respecto a la de la estirpe silvestre, tanto en luz como en oscuridad. El transformante SG274 presentó un notable aumento en la síntesis de giberelinas con respecto a la estripe silvestre y la estirpe mutante SG39, en luz y en oscuridad. Sin embargo, la producción del transformante SG275 solo aumentó significativamente con respecto a la estirpe mutante SG39 en condiciones de iluminación. Además, se apreció una reducción no significativa de la síntesis de giberelinas en la mayoría de las estirpes estudiadas al cultivarlas en luz, posiblemente debida a una represión por luz. Tabla C1.2. Biomasa y pH final de las diferentes estirpes de F. fujikuroi cultivadas en matraces con medio complejo. Las estirpes se cultivaron en matraces con medio complejo y se incubaron durante 17 días en oscuridad a 30°C a 200 rpm. La biomasa y el pH final se cuantificó al final de los cultivos. Los datos muestran la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes. Estirpe Biomasa (g L-1) pH final S1 22,15 ± 0,85 2,68 ± 0,10 SG272 OE:thmgR 23,26 ± 0,93 2,69 ± 0,13 SG273 OE:thmgR 24,57 ± 1,08 2,67 ± 0,11 SG39 carS23,70 ± 1,21 2,95 ± 0,02 SG274 carS-/OE:thmgR 23,43 ± 1,33 2,76 ± 0,02 SG275 carS-/OE:thmgR 25,18 ± 1,09 2,83 ± 0,05 También, se estudió la producción de giberelinas de los diferentes transformantes en matraces con medio complejo, en las mismas condiciones del ensayo anterior. Este medio está compuesto de sustancias orgánicas complejas y está optimizado para la producción de giberelinas, lo que permite alcanzar mayores cantidades de giberelinas totales. Todas las estirpes analizadas mostraron un crecimiento similar, como se recoge en la Tabla C1.2, y los valores de pH de sus cultivos oscilaron entre 2,67 y 2,95. 61 Los datos mostraron un aumento en la síntesis de giberelinas en todas las estirpes analizadas en el medio complejo con respecto al medio ICI 10%, generalmente utilizado para una cuantificación y comparación de la producción de las diferentes estirpes de F. fujikuroi en el laboratorio (Figura C1.8B). Las cantidades de giberelinas de los diferentes transformantes en estas condiciones de cultivo mostraron un patrón de producción muy similar entre ellas al observado con el medio ICI 10%. Los transformantes SG272 y SG273 produjeron más giberelinas con respecto a la estirpe silvestre y la producción del transformante SG274 aumentó de forma considerable con respecto a la de todas las estirpes analizadas. Expresión de los genes de la ruta de síntesis de giberelinas y carotenoides Para determinar si los cambios en la producción de carotenoides y giberelinas en los diferentes transformantes se deben a una alteración de la transcripción de los genes estructurales de la ruta de síntesis de los carotenoides y de las giberelinas, se determinaron los niveles de ARNm de los genes carRA y cps/ks mediante RT-qPCR en los diferentes transformantes OE:thmgR y se compararon con los de la estirpe silvestre S1 y el mutante SG39. También se determinaron los niveles de ARNm del gen hmgR en las diferentes estirpes de F. fujikuroi en esas mismas condiciones. Para ello, las estirpes se incubaron cinco días en oscuridad en medio ICI 10% y, tras 5 horas de adaptación en placas de Petri en oscuridad, se determinaron las cantidades de ARNm de los genes hmgR (vía del mevalonato), carRA (carotenogénesis) y cps/ks (síntesis de giberelinas) mediante RT-qPCR (Figura C1.9). La expresión del gen hmgR en los diferentes transformantes SG272, SG273, SG274 y SG275 aumentó significativamente con respecto a la estirpe silvestre y al mutante SG39, al igual que se observó durante la caracterización previa de los transformantes. En consonancia con los datos de carotenoides de las diferentes estirpes, las cantidades de ARNm del gen carRA en los transformantes OE:thmgR SG272 y SG273 fueron parecidas a la de la estirpe silvestre. Los niveles de expresión del gen carRA aumentaron significativamente en todas las estirpes en fondo mutante carScon respecto a todas las estirpes en fondo silvestre, lo cual explica el aumento de producción 62 de carotenoides en las estirpes en fondo mutante carS-. A pesar de una reducción en la producción de carotenoides en el transformante SG274 con respecto al resto de estirpes en fondo mutante carS-, las cantidades de ARNm del gen carRA en los transformantes carS-/OE:thmgR SG274 y SG275 fueron similares a la de la estirpe mutante SG39. Figura C1.9. Análisis de la expresión de los genes carRA, cps/ks y hmgR en la estirpe silvestre, el mutante carSy los transformantes OE:thmgR. Niveles de ARNm de los genes carRA, cps/ks y hmgR en las diferentes estirpes cultivadas durante 5 días en medio líquido ICI 10% a 30°C en oscuridad. Se utilizó la pareja de cebadores RTC5 para medir la expresión del gen carRA, RTC4 para el gen cps/ks y RTC3 para el gen hmgR. Los niveles de transcripción se normalizaron frente al gen de la β-tubulina FFUJ_04397 (pareja de cebadores RTC1) y al gen de la GPDH FFUJ_13490 (pareja de cebadores RTC2). Los niveles relativos de ARNm se refirieron al contenido de ARNm en la estirpe silvestre. Los resultados muestran la media y el error estándar de dos réplicas biológicas independientes; prueba t de Student. Las letras indican agrupaciones estadísticas con un nivel de significancia del 0,05%. Con respecto a la expresión de uno de los genes estructurales de la síntesis de giberelinas, el gen cps/ks, sus niveles de ARNm en los transformantes SG272 y SG273 fueron inferiores a los de la estirpe silvestre. La expresión del gen cps/ks en el transformante SG275 fue similar a la encontrada en la estirpe mutante SG39. Sin embargo, el transformante SG274 mostró un aumento significativo en la cantidad de ARNm con respecto al resto de las estirpes. La presencia de más copias de la secuencia 63 codificante de la HmgR en el transformante SG274 podría estar alterando la expresión de los genes estructurales de la ruta de síntesis de carotenoides y giberelinas, entre otros, lo que provocaría una desviación de los precursores implicados en la síntesis de los terpenoides, afectando a la producción de éstos. Análisis del metabolismo de lípidos en F. fujikuroi También se ha estudiado el efecto de la sobreexpresión del dominio catalítico de la HMG-CoA reductasa en la composición lipídica en la estirpe silvestre y en el mutante carS-. Los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs), los lípidos neutros y los polares de los diferentes transformantes se extrajeron y se analizaron mediante HPLC y cromatografía de gases, para compararlos con los de la estirpe silvestres y el mutante SG39. Tabla C1.3. Composición de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs) en las diferentes estirpes de F. fujikuroi. Las estirpes se cultivaron en medio líquido ICI 10% a 30°C durante 5 días en oscuridad a 200 rpm. A partir de una extracción previa de los lípidos totales, se extrajeron los FAMEs y se analizaron mediante cromatografía de gases. Los datos muestran la media porcentual y desviación estándar de tres experimentos independientes. Los datos de color corresponden a diferencias significativas. Ácidos Grasos Silvestre IMI58289 OE:thmgR SG272 OE:thmgR SG273 carSSG39 carS-/ OE:thmgR SG274 carS-/ OE:thmgR SG275 14:0 0,38 ± 0,03 0,32 ± 0,04 0,31 ± 0,05 0,32 ± 0,07 0,49 ± 0,03 0,43 ± 0,06 16:0 34,45 ± 0,66 33,25 ± 0,45 34,95 ± 1,59 36,45 ± 1,67 38,10 ± 1,82 39,34 ± 1,70 18:0 25,32 ± 1,41 24,20 ± 1,02 24,92 ± 0,20 23,02 ± 1,77 19,83 ± 0,42 20,00 ± 1,82 18:1 13,96 ± 0,83 15,75 ± 1,71 13,16 ± 1,19 13,21 ± 1,74 13,81 ± 1,38 13,25 ± 0,77 18:2 7,05 ± 1,65 6,90 ± 0,32 6,57 ± 0,77 10,29 ± 1,60 12,59 ± 1,67 10,49 ± 1,19 20:0 1,19 ± 0,41 1,29 ± 0,44 1,40 ± 0,39 1,45 ± 0,24 1,21 ± 0,45 1,33 ± 0,42 22:0 0,56 ± 0,09 0,63 ± 0,18 0,54 ± 0,23 0,46 ± 0,21 0,61 ± 0,19 0,69 ± 0,23 M1 16,02 ± 1,47 15,91 ± 1,54 16,43 ± 1,13 12,80 ± 1,58 12,18 ± 1,91 12,99 ± 1,64 M2 0,60 ± 0,18 1,27 ± 0,58 1,12 ± 0,58 1,06 ± 0,39 1,28 ± 0,61 0,97 ± 0,41 M3 0,98 ± 0,37 0,97 ± 0,34 1,21 ± 0,22 0,95 ± 0,09 0,83 ± 0,32 1,01 ± 0,09 M1: ácido graso no determinado 1; M2: ácido graso no determinado 2; M3: ácido graso no determinado 3. 70 los esteroles activa una regulación de retroalimentación negativa que reduce la actividad de la enzima HmgR mediada por los productos finales o intermediarios de la vía isoprenoide, tal como ocurre en animales (Faulkner & Jo, 2022). Por esta razón, el efecto de la expresión constitutiva del dominio catalítico de la HMG-CoA reductasa fue analizado en la estirpe silvestre y en el mutante carS-, superproductor de carotenoides, de F. fujikuroi IMI58289. Los transformantes OE:thmgR no presentaron alteraciones en la morfología, desarrollo micelial, capacidad de crecimiento ni en la pigmentación de las colonias en las diferentes condiciones de cultivo. El único efecto conocido de la sobreexpresión del dominio catalítico de la HmgR en F. fujikuroi es el aumento de la producción de giberelinas (Albermann et al., 2013). Por lo que, un análisis previo de la producción de giberelinas nos permitió cribar y seleccionar los transformantes en función de su mayor producción. Estos transformantes se confirmaron posteriormente mediante RT-qPCR, comprobando que presentaban un aumento en los niveles de ARNm del gen hmgR respecto a la estirpe parental, lo cual apoya el enfoque de partida. Con el fin de averiguar si se había conseguido potenciar la síntesis de terpenoides en los transformantes OE:thmgR, se realizó un análisis más profundo de las giberelinas que producían en diferentes condiciones de cultivo. Los transformantes OE:thmgR cultivados en medio con bajo nitrógeno mostraron un aumento en la producción total de giberelinas, aunque inferior a lo alcanzado durante la expresión de una versión truncada de la HmgR sin el extremo N-terminal en un mutante deficiente de la monooxigenasa citocromo P450-3 de F. fujikuroi, que condujo a un aumento de la producción de giberelinas GA4/GA7 de 2,5 veces (Albermann et al., 2013). El análisis Southern del ADN genómico de las diferentes estirpes mostró que los transformantes OE:thmgR, además de la copia silvestre del gen hmgR presente en la estirpe silvestre, presentaban una copia más, ambas del mismo tamaño. Aunque la integración ocurre de forma aleatoria, existen zonas del genoma transcripcionalmente más activas propensas a todo tipo de modificaciones genómicas (Girelli et al., 2020). De ser ese el caso, ambos transformantes debían de expresar el gen hmgR al mismo nivel. 71 Para entender si los cambios en la producción en los diferentes transformantes se debían a una alteración de la transcripción de los genes implicados en la síntesis de las giberelinas, se determinó los niveles de ARNm de ciertos genes. Tras analizar la expresión de los genes hmgR y cps/ks en las mismas condiciones de cultivo, vimos que se había producido un aumento similar en la cantidad de ARNm del gen hmgR en los diferentes transformantes OE:thmgR. Estos datos apoyan lo ya observado durante la selección de los transformantes. Sin embargo, la cantidad de ARNm del gen cps/ks disminuyó respecto a la estirpe silvestre. Esta disminución en la expresión del gen inicial de la ruta de síntesis de las giberelinas podría estar limitando una mayor producción en los transformantes OE:thmgR; aunque con los datos que tenemos no lo podemos confirmar ya que sólo se ha analizado uno de los siete genes implicados en la síntesis de giberelinas y, además, los niveles de expresión de ese gen se observaron tras cinco días de cultivo mientras que los valores de producción de giberelinas corresponden a más de dos semanas de cultivo. La interpretación es más compleja en el caso del efecto de la sobreexpresión del dominio catalítico de la HmgR en el fondo mutante carS-, pues los dos mutantes se comportaron entre sí de forma diferente. Mientras uno de los transformantes carS- /OE:thmgR, el SG275, mostró un leve aumento de la producción de giberelinas con respecto al mutante carSen la luz, el transformante SG274 aumentó 2,5 veces respecto a la estirpe silvestre, siendo superior con respecto a la estirpe parental, y similar a lo previamente alcanzado en otras estirpes de F. fujikuroi (Albermann et al., 2013). El análisis Southern del ADN genómico de las diferentes estirpes mostró que uno de los transformantes carS-/OE:thmgR, SG275, presentaba una copia adicional del gen hmgR, mientras que el transformante SG274 poseía al menos dos copias más. A pesar de ello, la expresión del gen hmgR en el transformante SG274 fue parecida al resto de transformantes OE:thmgR en fondo silvestre. La integración de las nuevas secuencias en zonas del genoma transcripcionalmente menos activa, podría ser la causa de este comportamiento. Sin embargo, de forma opuesta al transformante carS-/OE:thmgR, los niveles de ARNm del gen cps/ks aumentaron en el transformante SG274. Aunque desconocemos la expresión del resto de los genes de la ruta de la síntesis de las giberelinas, el aumento de la expresión del gen de la enzima bifuncional ent-copalil 72 difosfato sintasa/ent-kaureno sintasa podría ser, en parte, responsable del aumento de la producción de giberelinas en esta estirpe. Entre las estrategias llevadas a cabo para potenciar la producción de giberelinas se encuentra el uso de aceites y extractos vegetales en los cultivos de F. fujikuroi (Camara et al., 2018). El cultivo de F. fujikuroi en un medio complejo, compuesto de sustancias orgánicas complejas, provocó un aumento de la producción de giberelinas en todas las estirpes analizadas, posiblemente debido al parecido del medio con el ambiente natural. Especialmente, la producción de giberelinas en el transformante SG274 aumentó hasta tres veces, alcanzando valores de producción similares a los publicados para diferentes estirpes de F. fujikuroi (Albermann et al., 2013; de Oliveira et al., 2017; Rios-Iribe et al., 2011). También se ha visto que la sobreexpresión del gen de la HmgR en M. circinelloides o N. crassa aumenta la producción de los carotenoides (Nagy et al., 2014; Wang & Keasling, 2002). Sin embargo, la expresión constitutiva del dominio catalítico de la HmgR en F. fujikuroi no parece tener efecto directo en la producción de carotenoides. Todos los transformantes acumularon cantidades de carotenoides similares a sus respectivas estirpes parentales, excepto el transformante SG274, cuya acumulación fue inferior en todas las condiciones de cultivo. A pesar de todo, el análisis mediante RT-qPCR de la expresión del gen carRA mostró que los transformantes carS-/OE:thmgR, tenían la misma cantidad de ARNm de este gen que la estirpe parental carS-. Todos estos resultados sugieren que la introducción de varias copias del dominio catalítico de la HmgR en el transformante SG274 habrían alterado el flujo metabólico de los precursores de los terpenoides hacia la producción de giberelinas en deterioro de la producción de carotenoides. Esto podría deberse a una alteración de la expresión de los genes implicados en la regulación y síntesis de ambos terpenoides, aunque actualmente no tenemos suficiente información para confirmarlo. Otro de los efectos de la sobreexpresión del dominio catalítico de la HMG-CoA es el aumento del contenido de esteroles y lípidos en levaduras como Yarrowia lipolytica (Shaikeh & Odaneth, 2021) o en plantas como Arabidopsis thaliana (Wang et al., 2023). 73 Todo ello sugiere que podría darse un aumento en el contenido de esteroles en los transformantes OE:thmgR, aunque dicha presunción no ha sido estudiada por falta de tiempo. Además, el uso de inhibidores de la síntesis de ergosterol junto con la sobreexpresión de la HMG-CoA reductasa en S. cerevisiae provoca un aumento de la producción de β-caroteno (Yan et al., 2012). Por lo que, una eficaz alternativa para aumentar la producción de carotenoides en F. fujikuroi sería el uso de inhibidores de rutas que comparten precursores, permitiendo un mayor flujo de esos precursores hacia la biosíntesis de carotenoides y/o giberelinas. El bloqueo de rutas que compiten con la producción de lípidos es una de las estrategias llevadas a cabo para la acumulación de lípidos y su uso como biocombustibles en ciertos hongos (Ward et al., 2017). Una de esas rutas es la vía del mevalonato, que puede ser bloqueada mediante el uso de estatinas, un grupo de inhibidores de la HMGCoA reductasa tales como la rosuvastatina o la atorvastatina (Chaturvedi et al., 2020; Markowska et al., 2020). En este sentido, se analizó el efecto de la sobreexpresión del dominio catalítico de la HmgR en el metabolismo de los triglicéridos (TAGs), de los lípidos neutros y polares y en los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs). El análisis de los FAMEs indicó que los ácidos grasos palmítico (16:0), esteárico (18:0), oleico (18:1) y linoleico (18:2) son los principales constituyentes en F. fujikuroi. Una composición de ácidos grasos que parece ser la más característica en los hongos (Lacey et al., 2021), incluido Fusarium oxysporum (Starratt & Madhosingh, 1967). En el caso de F. fujikuroi, también destacó como mayoritario otro ácido graso no determinado. Este ácido graso fue atribuido por su tiempo de retención en un análisis anterior de la composición lipídica de F. fujikuroi como un ácido graso 16:3 (Franco-Losilla, 2023; Tesis doctoral), aunque la falta de más información dificulta la confirmación de dicha asunción. Respecto a los transformantes OE:thmgR, no se observaron diferencias significativas en la composición de los FAMEs respecto a sus estirpes parentales, indicando que la sobreexpresión del dominio catalítico de la HmgR en F. fujikuroi no afecta al metabolismo de los ácidos grasos. Tampoco se observaron diferencias significativas en la composición de los lípidos polares, neutros y TAGs de los transformantes OE:thmgR. 74 Sin embargo, las estirpes en fondo mutante carSsí que mostraron diferencias significativas respecto a la estirpe silvestre. El contenido de ácido linoleico y del ácido no determinado 1 se vio afectado en los mutantes carS-. Un análisis previo de los FAMEs en los mutantes carSde F. fujikuroi también mostró una alteración en otros ésteres metílicos de ácidos grasos cuando se cultivaron en un medio de cultivo diferente (FrancoLosilla, 2023; Tesis doctoral). Aunque la composición de lípidos neutros no se alteró en los mutantes carS-, sí que se observaron diferencias significativas en 6 de los 16 TAGs analizados respecto a la estirpe silvestre. Además, la composición de fosfatidilcolina y fosfatidilglicerol varió en los mutantes carS-. Esto no nos sorprendió, considerando el gran número de genes con funciones diversas afectados por la mutación carS en F. fujikuroi (Ruger-Herreros et al., 2019). En resumen, este capítulo viene a confirmar que el efecto de la sobreexpresión del dominio catalítico de la HMG-CoA reductasa en F. fujikuroi no produce cambios fenotípicos en los transformantes OE:thmgR, más allá del aumento de la producción de giberelinas. La normal producción de carotenoides que muestran los transformantes OE:thmgR indica una ausencia de efecto directo en la regulación de la carotenogénesis, aunque los datos sugieren que la alteración del flujo metabólico de los precursores de los terpenoides afectaría a la síntesis de estos. Además, el metabolismo de los lípidos tampoco se vio afectado por la sobreexpresión del dominio catalítico de la HmgR, aunque sí que se vio alterado en los mutantes carS-. 75 Capítulo 2 76 77 Capítulo 2: Producción de giberelinas en un biorreactor de tanque agitado INTRODUCCIÓN Una de las principales características del género Fusarium es su capacidad para producir una amplia variedad de metabolitos secundarios. La producción de estos compuestos químicos no es esencial para la viabilidad de los hongos, pero implica una ventaja adaptativa en la interacción con otros organismos en la naturaleza (Avalos & Limón, 2021). Se han identificado una gran variedad de metabolitos secundarios en hongos (Avalos & Limón, 2021; Robey et al., 2021), principalmente pertenecientes a cuatro familias químicas: terpenoides, péptidos no ribosómicos (NRPs), policétidos (PKs) e híbridos de péptidos no ribosómicos y policétidos (NRP/PKs). Desde hace décadas, se ha prestado especial atención a las aplicaciones de algunos metabolitos secundarios de F. fujikuroi como los policétidos, entre ellos la bicaverina (Studt & Tudzynski, 2014), y los terpenoides, entre ellos los carotenoides y las giberelinas, éstos últimos de considerable interés biotecnológico (Avalos et al., 2017; Camara et al., 2018). Las giberelinas son hormonas vegetales que regulan diferentes procesos del desarrollo de las plantas, como la inducción de enzimas hidrolíticas durante la germinación, la elongación del tallo, la estimulación de la floración o la formación de los frutos (Li et al., 2011; Muñoz-Fambuena et al., 2012; Urbanova & Leubner-Metzger, 2016; Wang et al., 2017b), y cuyas propiedades estimulantes dan como resultado numerosas aplicaciones en la agricultura (Keswani et al., 2022). Los carotenoides son pigmentos con propiedades promotoras de la salud, usados como aditivos alimentarios, y obtenidos biotecnológicamente de diferentes fuentes, incluyendo a algunos hongos (Meléndez-Martínez, 2019). Además de las plantas, muy pocos organismos son capaces de sintetizar giberelinas, entre los que destaca F. fujikuroi por su alta capacidad biosintética. De hecho, la producción industrial de giberelinas se basa en el uso de cultivos de F. fujikuroi debido a su gran capacidad de producir ácido giberélico (GA3). La optimización de las condiciones de fermentación para la producción de giberelinas comenzó a principio de 78 la década de 1950 (Borrow et al., 1955; Darken et al., 1959). La represión por catabolito del carbono se conoce desde hace mucho tiempo y, aunque poco se sabe de la base molecular de este fenómeno, la adicción de una gran cantidad de glucosa inhibe la producción de GAs (Kerkaert & Huberman, 2023). La inhibición por nitrógeno también se conoce desde hace muchos años y las bases moleculares de la inhibición ha sido estudiada durante años (Fuska et al., 1961; Tudzynski, 2014). El uso de aceites vegetales como fuente de carbono ha potenciado la fermentación de giberelinas (Gökdere & Ateş, 2014), posiblemente debido a que las fuentes de carbono más complejas se parecen más al ambiente natural. El uso de extractos de plantas, como la sacarosa, el licor de maíz, el glicerol, la pulpa de soja, la harina de cacahuete, etc.., promueven también la síntesis de giberelinas (Camara et al., 2018). Desde hace años, se han estudiado otros parámetros de fermentación como la temperatura, la cinética del metabolismo de los nutrientes y el impacto de otros nutrientes (Borrow et al., 1964; Brückner et al., 1991). Actualmente, la fermentación industrial más utilizada para la síntesis de GA3 es la fermentación sumergida (SmF), alcanzándose valores en torno a 3 g L-1 con una estirpe mutante de F. fujikuroi tras 5 días de fermentación (Wang et al., 2023). Sin embargo, la SmF generalmente requiere de un alto consumo de energía, es más propensa a la contaminación, suele ser deficiente en aireación y genera una gran cantidad de aguas residuales. Por su parte, la fermentación en estado sólido (SSF) ha conseguido mejores rendimientos de giberelinas, alcanzando 105 g kg-1 de GA3 tras 4 días de fermentación, posiblemente debido, en gran medida, a una mayor aireación (Rangaswamy, 2012). Aunque, actualmente sólo se utiliza a escala de laboratorio debido a que la SSF necesita de una infraestructura de producción no convencional. La producción de giberelinas en un sistema de fermentación en estado semisólido (SSSF), utilizando partículas de pulpa sumergida, ha conseguido mejores rendimientos de GA3 que el sistema SmF a nivel de laboratorio (de Oliveira et al., 2017). El sistema SSSF podría usarse para reemplazar al sistema SmF mientras se sigue avanzando en nuevos procesos de producción e instalaciones industriales. Los avances en la optimización industrial de giberelinas se han centrado principalmente en la mejora de la producción industrial de GA3 reduciendo los costes de producción (Wang et al., 2022). Uno de los factores que afecta a la producción de ácido giberélico está relacionado con el control y escalado de los parámetros de 79 fermentación a nivel industrial, aunque apenas se encuentran referencias en la bibliografía sobre este aspecto. Este capítulo se ha centrado en la producción de metabolitos de interés industrial en un biorreactor de tanque agitado (STR) a escala piloto a partir de cultivos de F. fujikuroi. Se ha llevado a cabo la puesta a punto de los diferentes parámetros de fermentación de la producción de giberelinas a partir de un cultivo de la estirpe silvestre de F. fujikuroi en un biorreactor de tanque agitado y se ha comparado con la producción de las estirpes mutantes del Capítulo 1 en las mismas condiciones. RESULTADOS Planificación de los ensayos de producción de giberelinas en un biorreactor. Los ensayos para la puesta a punto de la producción de giberelinas a partir de un cultivo de F. fujikuroi en el biorreactor se realizaron en la planta piloto de la empresa Grupo Agrotecnología, S.L., como parte de los objetivos enmarcados dentro del programa para el desarrollo del Doctorado Industrial. Durante el estudio, solo se tuvo acceso a un biorreactor de tanque agitado con un volumen de trabajo de 3 a 5 litros, por lo que los ensayos se realizaron de forma secuencial y tras analizar y tratar los diferentes parámetros de cultivo y resultados de producción de giberelinas. Se realizaron hasta siete ensayos independientes de optimización de la producción de giberelinas en el biorreactor con 5 litros de cultivo, en los que se fueron optimizando las condiciones de fermentación y que se recogen en la Tabla C2.1. El medio de fermentación utilizado para la producción de giberelinas en el biorreactor se componía principalmente de aceite de girasol y de extracto de maíz (Medio complejo; ver en materiales y métodos), ya que se partió de los resultados de optimización de la producción de giberelinas a partir de un cultivo de F. fujikuroi en matraces con ese mismo medio complejo (Brückner et al., 1991). Las condiciones de partida se establecieron en base a los estudios precedentes sobre producción de giberelinas en fermentación sumergida o SmF (velocidad de agitación de 500 rpm, flujo 86 masas en tándem (LC-MS/MS) de las giberelinas activas (GA1, GA3, GA4 y GA7) presentes en los extractos obtenidos de los filtrados tras 7 días de fermentación indicó que se produjo una media de 31% de GA1, 59% de GA3, 9% de GA4 y 1% de GA7. El porcentaje de GA4 en el ensayo de reproducibilidad R3 aumentó respecto a los otros dos ensayos, disminuyendo el porcentaje de GA3. Dicho cambio podría estar relacionado con el aumento del oxígeno disuelto en el ensayo R3 durante el último día de fermentación. Tabla C2.2. Producción de giberelinas activas tras 7 días de fermentación de F. fujikuroi FKMC1995 en el biorreactor y porcentajes de giberelinas activas. Los datos son la media y el error estándar de dos muestras de la misma réplica biológica. Ensayo Biomasa (g L-1) Giberelinas (µg mL-1) pH mínimo GA1 (%) GA3 (%) GA4 (%) GA7 (%) R1 22,87 316,54 2.46 32,0 62,8 4,3 0,8 R2 21,54 323,76 2.42 30,3 62,6 6,1 0,9 R3 21,78 339,76 2.40 29,8 52,9 16,4 0,9 Media ± S.E 22,06 ± 0,71 326,69 ± 0,71 - 30,7 ± 1,2 59,4 ± 5,7 9,0 ± 6,5 0,9 ± 0,1 S.E: Error estándar. Producción de giberelinas de los transformantes OE:thmgR en el biorreactor. Una vez optimizados y validados los parámetros de fermentación de F. fujikuroi FKMC1995 para la producción de giberelinas en el biorreactor de tanque agitado, se estudió la producción de giberelinas de los mutantes descritos en el Capítulo 1 en el biorreactor. Se escogió el mutante SG272 entre los que sobreexpresan el gen truncado de la HmgR, OE:thmgR, el SG274 de los dobles mutantes carS-/OE:thmgR y sus respectivas estirpes parentales: la estirpe silvestre F. fujikuroi IMI58289, y el mutante carSSG39. Los ensayos de producción de giberelinas con estas estirpes de F. fujikuroi se realizaron en las mismas condiciones de producción optimizadas para el biorreactor (Figura C2.4A). Los datos de la biomasa de los diferentes cultivos mostraron un crecimiento similar de todas las estirpes analizadas (Tabla C2.3). Los resultados 87 mostraron una evolución del pH similar en todas las estirpes (Figura C2.4B). En este caso, el pH alcanzó un valor máximo de 7 y un valor mínimo de 2,5. En cuanto a la evolución del oxígeno disuelto en el medio, también fue muy parecida en todas las estirpes (Figura C2.4C). El porcentaje de oxígeno disuelto subió a partir de las 40-44 horas de cultivo hasta llegar al 90% de oxígeno disuelto en todas las estirpes al final de la fermentación. Tabla C2.3. Biomasa de las estirpes silvestre, mutantes OE:thmgR, carSy carS-/OE:thmgR de F. fujikuroi IMI58289 a lo largo del cultivo en el biorreactor. Los datos son la media y el error estándar de dos réplicas biológicas independientes. Biomasa (g L-1) Estirpe 0 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h IMI 58289 0,62 25,03 ± 0,62 22,89 ± 0,35 22,90 ± 0,06 28,93 ± 0,26 24,24 ± 0,47 SG272 0,59 24,49 ± 0,23 22,73 ± 0,15 22,87 ± 0,05 27,73 ± 0,28 23,48 ± 0,34 SG39 0,61 23,92 ± 0,04 22,50 ± 0,21 22,95 ± 0,06 27,78 ± 0,26 23,13 ± 0,18 SG274 0,64 24,01 ± 0,19 22,16 ± 0,13 22,50 ± 0,37 28,17 ± 0,23 23,34 ± 0,15 A pesar de ello, se observó un aumento gradual de la producción de giberelinas a lo largo del cultivo en todas las estirpes (Figura C2.4D). La producción de giberelinas de la estirpe silvestre fue de 193,24 µg mL-1 tras 7 días de fermentación en el biorreactor de tanque agitado. Tras analizar la producción de giberelinas de las estirpes mutantes de F. fujikuroi, se observó un aumento significativo en la producción de giberelinas en el transformante SG272 respecto a la de la estirpe silvestre a lo largo del cultivo. La producción de giberelinas en el transformante SG272 fue de 340,78 µg mL-1 tras 7 días de cultivo; un aumento aproximadamente del 176%. 88 Figura C2.4. Producción de giberelinas de la estirpe silvestre y los mutantes OE:thmgR, carSy carS-/OE:thmgR de F. fujikuroi en el biorreactor. (A) Pigmentación de los cultivos de las diferentes estirpes de F. fujikuroi tras 3 días de fermentación en el biorreactor. (B) Evolución del pH. (C) Evolución del oxígeno disuelto. (D) Producción de giberelinas totales de las diferentes estirpes de F. Fujikuroi cultivadas en medio complejo en el biorreactor durante 7 días a 28°C. Los datos son la media y el error estándar de dos réplicas biológicas independientes. En el caso de la estirpe mutante SG39, la producción de giberelinas disminuyó respecto a la estirpe silvestre durante todo el cultivo, alcanzando una producción final de 138,54 µg mL-1. Por el contrario, la producción de giberelinas en el transformante 89 SG274 aumentó significativamente respecto a la de la estirpe parental SG39 y a la de la estirpe silvestre IMI58289, alcanzando una producción final de 473,23 µg mL-1; lo cual supone un aumento del 341% y del 245%, respectivamente. También se observó que las cantidades de giberelinas producidas por los mutantes que sobreexpresaban la versión truncada de la HMG-CoA reductasa seguían aumentando incluso a los 7 días, mientras que las producidas por el silvestre y el mutante carSse habían estabilizado a los 6 días (Figura C2.4D). Esto sugiere que los máximos podrían seguir aumentando. Por último, el análisis mediante LC-MS/MS de las giberelinas activas a partir de los extractos obtenidos de los filtrados del medio del cultivo indicó que todas las estirpes presentaban un perfil muy parecido (Tabla C2.4). Más del 99,5% de las giberelinas detectadas fueron GA1 y GA3, siendo ésta última la de mayor presencia en los cultivos de todas las estirpes (entre el 90,5 y el 97%); mientras que sólo se encontraron trazas de las giberelinas GA4 y GA7. Por lo que, todas las estirpes de F. fujikuroi IMI58289 producen más giberelinas GA3 que la estirpe silvestre FKMC1995. Tabla C3.4. Perfil de las giberelinas biológicamente activas producidas por las estirpes silvestre, SG272, SG39 y SG274 de F. fujikuroi en el biorreactor. Estirpe Genotipo GA1 (%) GA3 (%) GA4 (%) GA7 (%) IMI58289 Silvestre 9,13 90,46 0,40 0,02 SG272 OE:thmgR 3,64 96,28 0,08 0,01 SG39 carS3,80 96,05 0,13 0,02 SG274 carS-/OE: thmgR 2,43 97,30 0,22 0,05 90 DISCUSIÓN Las giberelinas son fitohormonas cuyas propiedades estimulantes tienen numerosas aplicaciones en la agricultura. Debido al crecimiento de la población global, se está produciendo un aumento en la demanda de giberelinas para una agricultura más sostenible (Keswani et al., 2022). Actualmente, la producción industrial de giberelinas se basa en el uso de cultivos de F. fujikuroi debido a su gran capacidad de producir ácido giberélico (Pandya et al., 2023). Los avances hacia una mayor producción de giberelinas se han centrado en el aislamiento de nuevas cepas, en la optimización del medio de cultivo y en la obtención de cepas con altos rendimientos mediante ingeniería metabólica (RiosIribe et al., 2016; Wang et al., 2022; Zhang et al., 2020). También, el uso de residuos agroindustriales como fuente de carbono o nitrógeno se ha empleado usando diferentes sistemas de fermentación para la producción de GA3 (Camara et al., 2018; Gökdere & Ateş, 2014). La fermentación sumergida de F. fujikuroi es la más utilizada a nivel industrial para la síntesis de GA3. Sin embargo, uno de sus inconvenientes con respecto a otros sistemas es la posible falta de aireación que, junto a que muchas de las enzimas implicadas en las síntesis de giberelinas son enzimas monooxigenasas (Tudzynski, 2005), podría estar limitando el rendimiento de producción de GAs debido a un bajo aporte de oxígeno. Por lo que, un bajo nivel de nitrógeno y un alto aporte de oxígeno disuelto serían esenciales para la productividad durante la etapa de biosíntesis de GA3. Sin embargo, actualmente apenas hay información sobre el efecto de parámetros como la agitación o la aireación en la producción de giberelinas en un biorreactor (Shukla et al., 2003). Por esta razón, el principal objetivo de este capítulo fue la puesta a punto de los diferentes parámetros de fermentación de F. fujikuroi para la producción de giberelinas en un biorreactor de tanque agitado. Aunque se conocen medios de cultivo para la producción de ácido giberélico más productivos que la combinación del aceite de girasol con el extracto de maíz (Wang et al., 2022), en este caso, y teniendo en cuenta el rendimiento de giberelinas en el Capítulo 1, se utilizó este medio para la optimización de los parámetros de producción en el 91 biorreactor por ser un medio económicamente rentable y para favorecer la obtención de un perfil diferente de giberelinas (Oller-López et al, 2003). La temperatura óptima para la producción de giberelinas en la mayoría de los trabajos publicados se establece en un rango de 25-32°C (Jefferys, 1970), por lo que todos los experimentos de producción de giberelinas en el biorreactor se llevaron a cabo a una temperatura de 28°C. Inicialmente también se establecieron la velocidad de agitación y el flujo de aireación en base a la bibliografía disponible (Camara et al., 2018; Cen et al., 2020; Wang et al., 2022). Los resultados de la optimización de los parámetros de producción de giberelinas en el biorreactor mostraron que la velocidad de agitación juega un papel muy importante en la homogenización del cultivo. Aunque apenas existe referencia sobre el efecto de la velocidad de agitación de los cultivos de F. fujikuroi en la producción de giberelinas (Wang et al., 2022), el rango de velocidad más utilizado oscila entre las 500 y las 600 revoluciones por minuto. Sin embargo, hemos podido comprobar que el aumento de la agitación tras una primera etapa de crecimiento a una velocidad más baja permite una mejor homogenización del cultivo, favoreciendo una mayor solubilización y dispersión del oxígeno durante la etapa de producción de giberelinas. Este efecto también se comprobó el aumento de la producción y productividad de GA3 en un biorreactor de tanque agitado a partir de un cultivo de F. fujikuroi, donde la aireación forzada y la agitación mecánica promovieron una mejor homogeneidad y transferencia de masa y oxígeno durante la fermentación, a diferencia de cuando se cultivó en matraces (de Oliveira et al., 2017). El aumento de la solubilidad del oxígeno tras una mayor agitación permitió un mejor control del oxígeno disuelto en el medio de cultivo. Los datos sugieren que un porcentaje alto de oxígeno disuelto durante la etapa de síntesis de giberelinas afectaría de forma negativa a la producción, mientras que un porcentaje de oxígeno disuelto en torno al 15-30% favorecería dicha producción, a diferencia de las premisas sobre el efecto de la falta de oxígeno en la producción de giberelinas. Estos resultados coinciden con lo observado en un estudio sobre el efecto del control de la oxigenación en la producción de giberelinas en un medio totalmente soluble en agua (Wang et al., 2017b). 92 En cuanto al pH, la información disponible en la bibliografía no era muy clara. Generalmente, el pH de inicio en los cultivos suele variar entre 3 y 6, debido a que un pH ácido favorece la formación de giberelina GA3 (Pandya et al., 2023). Por el contrario, un pH 7 o superior en el cultivo fomenta el aumento de la producción de otras giberelinas no activas (Jefferys, 1970). Sin embargo, no quedaba claro si esos valores se mantenían durante todo el cultivo, lo cual dificulta la interpretación de los resultados. Partiendo de un pH inicial de 4 y sin controlar durante el tiempo de cultivo, vimos que la disminución del pH durante la producción de giberelinas era un punto clave en la optimización del proceso hacia la obtención de un perfil diferente de giberelinas. El uso de medios de cultivo con varias fuentes de nitrógeno y con pH iniciales bajos, en el rango de 2-3, favorecen la producción de giberelinas GA1 y GA3 (Kuhr et al., 1961). Además, en el Capítulo 1 vimos que el pH final de todos los cultivos en matraces era inferior a 3. Por lo que existe una relación directa entre el aumento de la producción de giberelinas y la disminución del pH hasta valores ácidos. En este caso, la optimización de los parámetros de cultivo de F. fujikuroi para optimizar la producción de giberelinas en un biorreactor logró un aumento de la producción del 550% respecto a las condiciones generales de cultivo descritas en la bibliografía. Además, estos resultados se confirmaron posteriormente en los ensayos de reproducibilidad. El análisis de la producción de giberelinas de las diferentes estirpes de F. fujikuroi IMI58289 del Capítulo 1 cultivadas en el biorreactor tras la optimización de los diferentes parámetros aportó información relevante. Las cantidades de giberelinas obtenidas dependían exclusivamente de la capacidad de producción de cada estirpe, ya que tanto el perfil de pH, como la evolución del oxígeno disuelto o la tasa de crecimiento fueron muy parecidos en todas las estirpes de F. fujikuroi IMI58289. Sin embargo, el uso del biorreactor para la producir giberelinas permitió reducir el tiempo de incubación, similar a lo descrito por de Oliveira et al. (2017). El tiempo necesario para alcanzar la misma producción de giberelinas en la estirpe silvestre IMI58289 de F. fujikuroi se redujo de 17 días a 7 días, cuando se cultivó en el biorreactor. Por su parte, la producción de giberelinas del mutante carSen el biorreactor se redujo un 30%, al igual que ocurre en los cultivos en matraces. La 93 producción de giberelinas en el biorreactor de los transformantes OE:thmgR también alcanzó valores parecidos a los obtenidos en matraces, destacando el transformante carS-/OE:thmgR SG274 por encima del resto. Por lo que, el patrón de producción de giberelinas de todas las estirpes de F. fujikuroi se mantuvo al cultivarlas en el biorreactor. El ácido giberélico o GA3 es la giberelina activa predominante en el cultivo de F. fujikuroi IMI58289 (Oller-López et al., 2003). A diferencia de la estirpe silvestre F. fujikuroi FKMC1995 donde el 59,5% y el 30,5% de las giberelinas totales correspondieron a GA3 y GA1, respectivamente, más del 90% de las giberelinas totales en todas las estirpes mutantes y silvestre de F. fujikuroi IMI58289 analizadas correspondían al ácido giberélico. En conclusión, en este capítulo se ha llevado a cabo la optimización de los parámetros de cultivo de F. fujikuroi en un biorreactor de tanque agitado para la producción de giberelinas. El aumento de la velocidad de la agitación favorece la homogenización del cultivo y la solubilización de oxígeno disuelto, lo cual tiene un efecto positivo en la producción de las giberelinas. Un bajo porcentaje de oxígeno disuelto junto con un valor de pH bajo a partir de varios días de cultivo potencia la producción de giberelinas. Además, usar el biorreactor para producir giberelinas reduce mucho el tiempo del cultivo, por lo que la producción de giberelinas es un proceso industrial más rentable. Este estudio muestra el potencial de escalada del bioproceso utilizando estirpes modificadas para la producción de giberelinas mediante la valorización de subproductos agroindustriales como medios de cultivo. 94 95 Capítulo 3 102 Caracterización de los mutantes superproductores ΔcarX. Fenotipo Las colonias de los mutantes anaranjados en fondo mutante ΔcarX al crecer en cajas con agar mostraron una morfología y una capacidad de crecimiento muy similar a los de la estirpe silvestre, el mutante ΔcarX y el mutante carS-. En cuanto al aspecto, los mutantes SG292 y SG313 presentaron un color naranja intenso a diferencia del naranja pálido que presenta el mutante ΔcarX SG291, tanto en luz como en oscuridad. Además, los mutantes SG292 y SG313 presentaron una pigmentación un poco diferente a la de la estirpe mutante SG39 (Figura C3.3). Figura C3.3. Aspecto de las colonias de la estirpe silvestre, el mutante ΔcarX, el mutante carSy dos mutantes anaranjados en fondo mutante ΔcarX. Las diferentes estirpes se cultivaron en cajas con medio mínimo DG durante 7 días a 30°C en oscuridad y con iluminación continua. 103 Síntesis de carotenoides Se analizó el contenido de carotenoides de los mutantes SG292 y SG313 y se comparó con el de la estirpe silvestre, el mutante carSy el mutante ΔcarX. La producción de carotenoides se analizó tanto en cajas con medio mínimo solidificado como en cultivos líquidos en matraces (Figura C3.4). Figura C3.4. Producción de carotenoides en la estirpe silvestre, el mutante carS-, el mutante ΔcarX y los mutantes superproductores en fondo mutante ΔcarX de F. fujikuroi. (A) Producción de carotenoides en cajas en medio mínimo DG sólido tras 7 días de incubación a 30°C en condiciones de oscuridad e iluminación. (B) Producción de carotenoides en matraces con medio optimizado para producir neurosporaxantina tras 28 días de incubación a 30°C en oscuridad a 150 rpm. Los datos muestran la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes; prueba t de Student. Las letras indican grupos estadísticos con un nivel de significancia del 0,05%. 104 Los resultados mostraron que en medio mínimo los mutantes SG292 y SG13 acumulaban una cantidad de carotenoides significativamente superior a la de la estirpe silvestre y a la de la estirpe parental SG291, tanto en luz como en oscuridad, alcanzando niveles parecidos a los del mutante carS-. Sin embargo, la producción de carotenoides en los mutantes superproductores en fondo ΔcarX, SG292 y SG313, fue similar a los niveles de producción de la estirpe mutante SG39 en oscuridad. Para conocer en detalle los carotenoides acumulados en las diferentes estirpes de F. fujikuroi, se realizó un análisis mediante HPLC del perfil de carotenoides de cada una de las estirpes cultivadas tanto en condiciones estándar de laboratorio, es decir, en cajas de Petri con medio mínimo, como en condiciones de producción en medio líquido optimizado (Figura C3.5). En los cromatogramas se visualizaron los diferentes picos de absorción de la neurosporaxantina, del β-caroteno y de algunos de los precursores de estos. Además, se observó que todas las estirpes superproductoras de carotenoides, SG39, SG292 y SG313, presentaban un pico de absorción destacable con un tiempo de retención menor que el de la neurosporaxantina (marcado con un asterisco) cuando se cultivaron en cajas de Petri. Sin embargo, dicho pico no se detectó o era menor cuando las estirpes superproductoras se cultivaban en agitación (columna derecha de la Figura C3.5). Recientemente, se ha analizado químicamente el compuesto que se detecta en el minuto 10 y se averiguado que corresponde a un derivado de la neurosporaxantina, el glicosil éster de neurosporaxantina (Hornero-Méndez, comunicación personal). El análisis de la composición de los carotenoides acumulados en los micelios cultivados en condiciones estándar, en medio mínimo con agar, mostró que existían diferencias estadísticamente significativas entre las estirpes. La estirpe mutante SG39 tenía el doble de concentración de NX y β-caroteno con respecto a la de la estirpe silvestre (Figura C3.6A). Por su parte, la estirpe mutante ΔcarX mostró un aumento del doble de β-caroteno y una reducción casi a la mitad del contenido de neurosporaxantina con respecto a la estirpe silvestre. En cambio, el perfil de carotenoides de las estirpes mutantes en fondo ΔcarX, SG292 y SG313, fue muy similar al de la estirpe mutante SG39. A diferencia de la estirpe parental SG291, los mutantes superproductores SG292 y SG313 105 contenían casi el triple de neurosporaxantina a expensas de una menor proporción de sus precursores γ-caroteno y toruleno. Figura C3.5. Comparación de los cromatogramas de la separación mediante HPLC de los carotenoides acumulados por las estirpes silvestre, carS-, ΔcarX, y superproductores ΔcarX de F. fujikuroi en cultivo estándar y optimizado. A la izquierda se muestran los cromatogramas de las mismas estirpes cultivadas en medio sólido DG tras 7 días a 30°C en luz. A la derecha se muestran los cromatogramas obtenidos en condiciones de producción en medio líquido optimizado tras 28 días a 30°C en oscuridad y en agitación. Los asteriscos corresponden con el glicosil éster de neurosporaxantina, hasta ahora no determinado. B: bicaverina. NX: neurosporaxantina. 1: neurosporaxantina. 2: toruleno. 3: −caroteno. 4: -caroteno. Longitud de onda de detección a 450 nm. 106 Figura C3.6. Análisis del perfil de carotenoides de la estirpe silvestre, el mutante carS-, el mutante ΔcarX y los mutantes superproductores en fondo mutante ΔcarX mediante HPLC. (A) Perfiles de carotenoides de las estirpes cultivadas en medio mínimo sólido en luz durante 7 días (condición estándar). (B) Perfiles de carotenoides de las estirpes tras cultivarlas en condiciones de producción en medio líquido optimizado en agitación, durante 28 días. El porcentaje del glicosil éster de neurosporaxantina está integrado en el de la neurosporaxantina (NX). 107 También, se estudió la producción de carotenoides de los diferentes mutantes tras cultivarlos en matraces con medio optimizado para la producción neurosporaxantina, durante 28 días en oscuridad y con agitación (Parra-Rivero et al., 2020). Los resultados de la acumulación de carotenoides en los micelios procedentes de estos cultivos líquidos en las condiciones optimizadas fueron muy diferentes de los de los cultivos en condiciones estándar en medio mínimo con agar (sólido) (Figura C3.4B). A pesar de que el contenido total de carotenoides en la estirpe silvestre no se vio afectado al cultivase en estas condiciones respecto al cultivo en cajas, los análisis por HPLC revelaron que en el medio optimizado el γ-caroteno fue el carotenoide presente en mayor proporción seguido de la neurosporaxantina, mientras que de toruleno y β-caroteno solo se encontraron trazas (Figura C3.6B). Los resultados mostraron un aumento significativo de la producción de carotenoides en el mutante SG39, aproximadamente 9,4 mg de carotenoides totales g-1 de peso seco, es decir, unas 340 veces más con respecto a la estirpe silvestre (Figura C3.4B). Además, el análisis HPLC de los carotenoides acumulados por el mutante SG39 confirmó que la neurosporaxantina es el principal carotenoide en estas condiciones de cultivo, mientras que los precursores de la neurosporaxantina se encontraron en concentraciones muy bajas (Figura C3.6B). Por su parte, el mutante ΔcarX SG291 produjo el doble de carotenoides que la estirpe silvestre, que está muy por debajo de lo alcanzado con la estirpe mutante SG39 (Figura C3.4B). El análisis de HPLC del mutante ΔcarX reveló un aumento significativo en la proporción de β-caroteno con respecto a la estirpe silvestre, llegando a ser más de la mitad de los carotenoides totales (Figura C3.6B). Además, el mutante SG291 presentó una menor proporción de neurosporaxantina y solo trazas de toruleno cuando se cultivó en condiciones de producción optimizada, a diferencia de cuando se cultivó en medio sólido o estándar, donde la mitad de los carotenoides totales correspondían al toruleno (Figura C3.6A). Los mutantes superproductores en fondo ΔcarX, SG292 y SG313, mostraron un aumento significativo de la producción de carotenoides totales con respecto al resto de 108 las estirpes analizadas, alcanzando valores de carotenoides totales de 24,26 y 13,64 mg g-1 de peso seco, respectivamente (Figura C3.5B). Es decir, un aumento de la producción de carotenoides totales del 877% y del 493,5%, respectivamente, respecto a la estirpe silvestre y, un aumento del 255% y del 143,5%, respectivamente, respecto a la estirpe mutante SG39. Sin embargo, al analizar el perfil de carotenoides mediante HPLC se pudo comprobar que el porcentaje de neurosporaxantina de los mutantes cultivados en estas condiciones fue muy inferior a cuando se cultivaron en cajas con medio mínimo (Figura C3.6B). El análisis mediante HPLC de los carotenoides acumulados por los mutantes SG292 y SG313 reveló que el β-caroteno es el principal carotenoide en las condiciones de producción optimizadas en cultivo líquido, y que además se observó una disminución de la cantidad de neurosporaxantina (Figura C3.6B). La combinación de la producción total de carotenoides analizada mediante espectrofotometría y del perfil de carotenoides analizado mediante HPLC permitió estimar la producción de cada uno de los carotenoides identificados en cada una de las estirpes (Tabla C3.1). El perfil de carotenoides de la estirpe mutante ΔcarX permitió estimar que prácticamente el 96,5% de los carotenoides totales del mutante SG291 eran una mezcla de toruleno, γ-caroteno y β-caroteno. Sin embargo, no se pudo obtener el perfil de carotenoides de la estirpe silvestre debido a una baja concentración de los carotenoides en la muestra analizada en el HPLC. Con la combinando los datos de espectrofotometría y HPLC se estimó que el 84% de los carotenoides producidos por el mutante SG39 cultivado en medio líquido correspondían a la neurosporaxantina, resultando en una producción de neurosporaxantina de aproximadamente 8 mg g-1 de peso seco (Tabla C3.1). El resto de los carotenoides apolares (γ-caroteno, toruleno y βcaroteno) se encontraron en menores cantidades. 109 Tabla C3.1. Producción de los diferentes carotenoides en la estirpe silvestre, el mutante carS-, el mutante ΔcarX y los mutantes superproductores en fondo mutante ΔcarX de F. fujikuroi. Las cantidades se estimaron a partir de la producción total y de los perfiles de carotenoides de cada una de las estirpes cultivadas en condiciones estándar (sólido) y de optimización (líquido). Los datos muestran la media y la desviación estándar de dos experimentos independientes. Cultivo Estirpe Producción (µg g-1 peso seco) GlyNX NX Toruleno γ-caroteno β-caroteno Total Estándar Osc IMI58289 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 19,4 ± 1,1 SG39 52,9 ± 3,1 287,1 ± 17,1 520,7 ± 31,0 95,4 ± 5,7 116,8 ± 6,9 1072,9 ± 63,8 SG291 N.D. 1,9 ± 0,3 19,3 ± 2,8 19,7 ± 2,9 11,4 ± 1,7 52,3 ± 7,7 SG292 29,3 ± 2,4 299,6 ± 24,5 397,6 ± 32,5 73,5 ± 6,0 118,8 ± 9,7 918,8 ± 75,2 SG313 20,2 ± 3,2 175,5 ± 27,4 385,8 ± 60,2 73,3 ± 11,4 114,8 ± 17,9 769,7 ± 120,1 Estándar Luz IMI58289 N.D. 21,9 ± 2,2 35,8 ± 3,6 10,6 ± 1,1 4,5 ± 0,4 72,8 ± 7,3 SG39 78,8 ± 8 518,4 ± 52,8 406,9 ± 41,4 115,9 ± 11,8 132,6 ± 13,5 1252,3 ± 127,5 SG291 N.D. 20 ± 1,1 57,5 ± 3,1 18,2 ± 1,0 16,2 ± 0,9 112,0 ± 6,1 SG292 34,7 ± 3,1 473,7 ± 42,8 312,6 ± 28,2 78,1 ± 7,0 114,6 ± 10,3 1013,6 ± 91,5 SG313 43,4 ± 2,7 367,1 ± 22,9 305,6 ± 19,1 95,6 ± 6,0 107,5 ± 6,7 919,3 ± 57,3 Optimizado Osc IMI58289 N.D. 8 ± 1,7 N.D. 19,7 ± 4,3 N.D. 27,7 ± 6,0 SG39 N.D. 7995,5 ± 157,4 260,1 ± 5,1 401,9 ± 7,9 844,2 ± 16,6 9501,7 ± 187,0 SG291 N.D. 4,9 ± 0,9 N.D. 27 ± 4,9 34,7 ± 6,3 66,6 ± 12,0 SG292 N.D. 2305,5 ± 256,8 2398,2 ± 267,1 3353,6 ± 373,5 16202,6 ± 1804,4 24259,8 ± 2701,7 SG313 N.D. 426,7 ± 19,9 2318 ± 107,9 903,8 ± 42,1 9992,3 ± 465,2 13650,8 ± 635,1 N.D: No detectado. GlyNX: Glicosil éster de neurosporaxantina. 110 En el caso del mutante superproductor en fondo ΔcarX SG292, solo el 9,5% de la producción de carotenoides se correspondía con la neurosporaxantina, lo cual permitió la estimación de una producción de neurosporaxantina de aproximadamente 2,3 mg g-1 peso seco; muy por debajo de lo obtenido en la estirpe mutante carSen las mismas condiciones. Sin embargo, el perfil de carotenoides del mutante SG292 indicó que el 67% de la producción de carotenoides totales se correspondía con el β-caroteno, resultando en una producción aproximada de β-caroteno de 16,2 mg g-1 peso seco; una producción casi 20 veces mayor que la producción de β-caroteno del mutante SG39. También se observó un aumento de la producción de toruleno y γ-caroteno en la estirpe mutante SG292 de casi 10 veces con respecto a la estirpe mutante carS-. Por su parte, el perfil de carotenoides del mutante superproductor en fondo ΔcarX SG313 cultivado en condiciones de producción optimizadas mostró que el 3% y el 73% de los carotenoides producidos se correspondían con la neurosporaxantina y el βcaroteno, respectivamente, estimándose una producción de neurosporaxantina y βcaroteno de 0,43 mg g-1 peso seco y 9,99 mg g-1 peso seco, respectivamente. A pesar de una disminución en la producción de neurosporaxantina y el β-caroteno respecto a la estirpe mutante SG292, la estirpe mutante SG313 alcanzó una producción de β-caroteno doce veces mayor con respecto a la estirpe mutante SG39 (Tabla C3.1). Secuenciación del genoma completo de los mutantes superproductores ΔcarX. Se conocía que los mutantes superproductores procedentes de F. fujikuroi IMI58289 como es el caso de SG1, SG22, SG36 y SG39 tenían mutaciones en el gen carS (Rodríguez-Ortiz et al. 2013). También los mutantes originados a partir de F. fujikuroi FKMC1995 como SF4, SF114, SF116 y SF134, tenían mutaciones en el gen carS (Avalos et al., 2017b; Rodríguez-Ortiz, 2012; Rodríguez-Ortiz et al 2013). Se secuenciaron los alelos del gen carS en las estirpes SG292 y SG313, pero como no se encontró ninguna mutación, se realizó una secuenciación del genoma completo de ambas estirpes con el fin de hallar las causas del fenotipo anaranjado de estos mutantes. 111 La secuenciación de las estirpes SG292 y SG313 se realizó simultáneamente a la de tres estirpes mutantes carS- (SG1, SG22 y SG39) y la de la estirpe obtenida tras la complementación de SG39 con el alelo carS silvestre (SG258). Las lecturas crudas obtenidas se procesaron tras la secuenciación (ver materiales y métodos) y las lecturas limpias se mapearon en el genoma de referencia de Fusarium_fujikuroi_IMI58289_V2 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCF_900079805.1/) con la herramienta SNIPPY, la cual identifica diferentes variantes genómicas puntuales como las inserciones, las deleciones, las variantes complejas, los polimorfismos de un único nucleótido (SNP) y de varios SNPs adyacentes considerados un polimorfismo de múltiples nucleótidos (MNP). La información general de la secuenciación se encuentra en la Tabla C3.2. Tabla C3.2 Variaciones genómicas de las diferentes estirpes de F. fujikuroi encontradas tras la secuenciación de los genomas completos y analizar sus localizaciones con SNIPPY. Se utilizó el genoma GCF_900079805.1 como genoma de referencia de F. fujikuroi IMI58289. Estirpe Variantes genómicas Complejas Deleciones Inserciones SNPs MNPs Totales SG292 64 310 385 71 12 842 SG313 79 343 434 86 15 957 SG1 83 383 479 292 13 1250 SG22 94 400 516 344 18 1372 SG39 89 384 481 114 18 1086 SG258 84 397 472 114 14 1081 Estirpe Localizaciones genómicas de las variaciones Exones + CDS Intrones Intergénicas Totales SG292 74 60 708 125 SG313 85 80 792 146 SG1 199 99 952 277 SG22 255 109 1008 322 SG39 116 97 873 193 SG258 125 85 871 192 SNPs: Polimorfismos de un único nucleótido. MNPs: Polimorfismos de múltiples nucleótidos al coincidir varios SNPs. CDS: Secuencias codificantes 118 aisladas contienen alguna mutación bien en la ORF del gen carS o en sus regiones 5’UTR y 3’UTR (Avalos y Cerdá-Olmedo, 1987; Rodríguez-Ortiz et al., 2013). El análisis de la expresión del gen carS en los mutantes SG292 y SG313 muestra una disminución significativa de la expresión con respecto a la estirpe silvestre. Esta reducción de los niveles de ARNm de gen carS podría inducir a un aumento de los niveles de ARNm de los genes estructurales carRA y carB y ser la causa del fenotipo superproductor en los mutantes anaranjados en fondo mutante ΔcarX. Aunque no tenemos datos sobre los niveles de expresión de estos genes en los mutantes SG292 y SG313, esto puede fundamentarse en varias observaciones previas descritas. Una de ellas es que los niveles de ARNm de los genes estructurales carRA y carB aumentan en los mutantes carS-, cuya proteína no es funcional (Ruger-Herreros et al., 2022). También se ha comprobado que la sobreexpresión del gen carS da lugar a niveles muy bajos de ARNm de los genes estructurales carRA y carB y al correspondiente fenotipo albino (Marente et al., 2020). Además, la deleción del gen hmbC, cuya proteína fue aislada a partir de promotores de los genes estructurales en el mutante carSSG39, produce una disminución en los niveles del gen carS y un aumento en la expresión de carRA y carB, dando lugar un aumento en la producción de carotenoides (Franco-Losilla et al., 2023b). Recientemente se ha visto que factores causantes de estrés como el choque térmico o los agentes oxidantes regulan la producción de carotenoides mediante la disminución de la transcripción del gen carS (Ruger-Herreros et al., 2022). También existe otro elemento regulador, un ARN largo no codificante (ARNlnc) llamado carP que se encuentra justo al lado del gen carS, cuya deleción incrementó la expresión del gen carS (Parra-Rivero et al., 2020b). Los mutantes ΔcarP tenían fenotipo albino y cuando el alelo silvestre se reintrodujo en su mismo locus, las estirpes recuperaban su pigmentación y tenían niveles menores de ARNm de carS (Pardo-Medina et al., 2021). En Fusarium oxysporum la deleción del ARNlnc carP también supuso un incremento de la transcripción del gen carS (Parra-Rivero et al., 2020b). En este hongo, se estudió el papel del gen carF que está localizado aguas arriba del gen carP, y se encontró un efecto similar (Parra-Rivero, 2018). Sin embargo, aún no está claro el mecanismo por el cual estos genes alteran la expresión del gen carS. Sería conveniente 119 analizar la expresión de estos genes en los mutantes SG292 y SG313. No sería sorprendente encontrar un incremento de los niveles de ARNm de ambos genes, teniendo en cuenta que en los mutantes carSde F. oxysporum se observó un aumento de la expresión tanto del gen carP como del gen carF (Parra-Rivero, 2018). Al igual que se ha descrito en Ruger-Herreros et al. (2022), el mutante carSSG39 presentó un aumento de la expresión del gen carS con respecto a la estirpe silvestre IMI58289, siendo significativo sólo en condiciones de oscuridad. Esto podría deberse a un intento por parte del microorganismo de suplir la falta de funcionalidad de la proteína CarS con un aumento de la transcripción y traducción del gen carS. El principal objetivo de este capítulo fue potenciar la producción de carotenoides en F. fujikuroi mediante la obtención y caracterización de estirpes superproductoras de carotenoides en un fondo genético mutante ΔcarX. A diferencia de la estirpe silvestre de F. fujikuroi IM58289 que únicamente tiene aspecto rosado cuando se cultiva con luz (Avalos et al., 2017b), el mutante ΔcarX SG291 presenta un fenotipo rosado pálido tanto en luz como en oscuridad debido a que la mutación del gen carX provoca una mayor acumulación de carotenoides neutros como el fitoeno, el β-caroteno y el γ-caroteno que no depende de la inducción por luz (Thewes et al., 2005). En este sentido, los mutantes SG292 y SG313 presentaron una pigmentación anaranjada muy intensa, tanto en condiciones de luz como de oscuridad, aunque con un perfil diferente al observado en la estirpe mutante carSSG39 (Marente et al., 2020). La producción total de carotenoides y el análisis de los perfiles de carotenoides de las distintas estirpes cultivadas en medio sólido y líquido confirmó esta diferencia. La producción de carotenoides mostró un incremento significativo en la acumulación de carotenoides totales en el mutante ΔcarX SG291 con respecto a la estirpe silvestre en todas las condiciones de cultivo analizadas, tal como se había descrito previamente para condiciones estándar (Thewes et al., 2005). Sin embargo, el análisis mediante HPLC del perfil de carotenoides reveló diferencias significativas en la composición de carotenoides con respecto a la estirpe silvestre, especialmente cuando las estirpes se cultivaron en matraces con medio optimizado. En este caso, el 50% de los carotenoides acumulados en la estirpe mutante SG291 correspondieron al β-caroteno; 120 teniendo en cuenta que la proteína CarX escinde el β-caroteno para producir dos moléculas de retinal, la mutación del gen carX conduce a la acumulación de β-caroteno (Prado-Cabrero et al., 2007). Además, la combinación de los datos de la producción total y del perfil de carotenoides muestra un aumento de la producción de carotenoides apolares (toruleno, β-caroteno y γ-caroteno) cuando el mutante ΔcarX se cultiva en medio sólido, confirmando lo previamente descrito (Thewes et al., 2005). La producción de carotenoides del mutante SG39 también aumentó significativamente en todas las condiciones de cultivo. Sin embargo, el efecto de la luz en los mutantes carSes menor debido al elevado contenido de carotenoides que ya presenta en condiciones de oscuridad (Avalos et al., 2017b). La máxima producción de carotenoides en el mutante SG39 se alcanzó tras cuatro semanas de cultivo en matraces con medio optimizado, al igual que se había descrito con anterioridad (Parra-Rivero et al, 2020). El análisis mediante HPLC también mostró diferencias significativas en la composición de carotenoides con respecto a la estirpe silvestre y la estirpe mutante ΔcarX. La neurosporaxantina fue el principal carotenoide acumulado en el mutante carSy su porcentaje aumentó hasta el 84% cuando se cultivó en condiciones optimizadas. La producción de NX en el mutante SG39 alcanzó unos 8 mg g-1, estimación obtenida tras combinar los datos de la producción total y de la composición de carotenoides, muy similar a la descrita previamente (Parra-Rivero et al. 2020). Por su parte, la producción de carotenoides de los mutantes anaranjados en fondo mutante ΔcarX, SG292 y SG313, mostró un aumento significativo de más de 10 veces con respecto a la estirpe silvestre y al mutante ΔcarX cuando se cultivó en medio sólido; alcanzando valores similares a la producción del mutante carS-. Esta similitud también se observó en la composición de los diferentes carotenoides analizados mediante HLPC. Sin embargo, tanto la producción total como el perfil de carotenoides fue muy diferente cuando se cultivaron en matraces en condiciones optimizadas. En este caso, la producción total en los mutantes SG292 y SG313 alcanzó valores de 24,26 y 13,64 mg g1 de peso seco, respectivamente. Nunca anteriormente se habían logrado valores tan altos de producción total a partir de un cultivo de F. fujikuroi. Además, el perfil de carotenoides reveló que más del 67% de los carotenoides correspondían al β-caroteno. 121 Estos datos sugieren que la ruta principal de la carotenogénesis en F. fujikuroi está dirigida hacia la producción de β-caroteno y, por consecuencia, hacia la producción de retinal y no hacia la producción de neurosporaxantina como se pensaba. Sólo cuando los genes de la ruta de la carotenogénesis se sobreexpresan, como es el caso de los mutantes carS-, se acumularía más neurosporaxantina (Avalos et al., 2017b). En el análisis del perfil de carotenoides mediante HPLC se detectó un pico de absorción con un tiempo de retención menor que el de la neurosporaxantina en los mutantes SG292 y SG313, al igual que en el mutante SG39. Este pico de absorción ya se observó en los cromatogramas de las estirpes silvestre y SG39 de F. fujikuroi obtenidos en un estudio anterior sobre la composición de carotenoides (Avalos et al., 2017b). Un análisis químico recientemente realizado, indicó que ese compuesto corresponde a un derivado de la neurosporaxantina, el glicosil éster de neurosporaxantina (HorneroMéndez, comunicación personal). Esté compuesto fue identificado por primera vez en una estirpe marina de Fusarium (Sakaki et al., 2002). Por el contrario, la presencia de carotenoides glucosilados es bien conocida en las plantas como el caso de Crocus sativus que acumula crocinas, ésteres de crocetinas con varios azúcares, y que son las que dan el color rojo intenso al azafrán (Ahrazem et al., 2015; López-jimenez et al., 2021). También se ha visto que la glicosilación de la astaxantina aumenta sustancialmente su solubilidad en agua, mejorando así su biodisponibilidad, fotoestabilidad y actividad biológica (Chen et al., 2023). La glucosilación tiene una función importante en los carotenoides pues aumenta su estabilidad y afecta a su actividad y localización. La presencia de la neurosporaxantina glucosilada en F. fujikuroi implica la acción de al menos una glucosiltransferasa. Lo cual invita a investigar sobre el gen o genes encargados de llevar a cabo estos pasos para continuar completando la ruta de biosíntesis de carotenoides en Fusarium. En el momento de iniciar la escritura de esta tesis, se conocía que todos los mutantes superproductores originados de F. fujikuroi IMI58289 como es el caso de SG1, SG22, SG36 y SG39 tenían mutaciones en el gen carS (Rodríguez-Ortiz et al 2013). También los mutantes originados a partir de F. fujikuroi FKMC1995 como SF4, SF114, SF116 y SF134, tenían mutaciones en el gen carS (Avalos et al., 2017b; Díaz-Sánchez et 122 al., 2011; Rodríguez-Ortiz et al 2013). Incluso en Fusarium oxysporum, los mutantes SX1 y SX2 estaban afectados en el gen carS (Rodríguez-Ortiz, 2012). Todos los mutantes tenían mutaciones puntuales que bien afectaban a aminoácidos conservados o bien generaban un STOP prematuro que daría lugar a una proteína truncada. Y todos tenían en común que se aislaron tras un tratamiento con nitrosoguanidina (Candau et al, 1991). Los estudios de expresión de los mutantes carSmostraron que el aumento de carotenoides era debido a un aumento de la inducción de los genes de la carotenogénesis (Avalos et al., 2017b; Díaz-Sánchez et al, 2011; Marente et al., 2020). Por el contrario, las estirpes superproductoras obtenidas en esta tesis, SG292 y SG313, no tenían mutaciones en el gen carS, aunque mostraban una disminución de la expresión del gen carS, por lo que debían tener mutaciones en otros genes. La secuenciación del genoma completo de ambos mutantes SG292 y SG313 corroboró que ni el gen carS ni las zonas colindantes estaban afectadas, indicando que existen otros genes que controlan la ruta de síntesis de carotenoides. Tras el análisis de las variaciones genómicas realizado con SNIPPY, doce genes se han identificado como posibles causantes del fenotipo superproductor en los mutantes SG292 y SG313, aunque solo seis de ellos se encontraron en ambos mutantes. De todos ellos, el gen FFUJ_13102 podría tener alguna implicación. Este gen codifica otra proteína no caracterizada, aunque sí que posee un dominio CID o domino de interacción al domino CTD (dominio carboxilo-terminal) de la subunidad grande de la ARN polimerasa II. La ARN polimerasa se encarga de transcribir todo el ARNm y gran parte del ARN pequeño nuclear (ARNsn) desde el inicio hasta el procesamiento y terminación de ARNm (Corden, 2013). El dominio CTD actúa como región de reclutamiento de los diferentes factores reguladores de la transcripción a la ARN polimerasa II durante la elongación. Esta región contiene una secuencia de siete aminoácidos (YS2PTS5PS) que se repite de 26 a 52 veces y que se somete a fosforilación en la Serina 2 y Serina 5 (Hsin & Manley, 2012). Los reguladores de transcripción específicos para cada etapa reconocen los diferentes patrones de fosforilación y son reclutados por la ARN polimerasa II para ejecutar la maduración de los ARNm (Yuryev et al., 1996). Un estudio comparativo de la proteína con las bases de datos sugiere que esta proteína puede ser una proteína del 123 retículo endoplasmático de homeostasis del calcio (CHERP). Recientemente, Moreno et al., (2023) han descubierto que CHERP (también llamada SCAF6) se une selectivamente a la ARN polimerasa II cuando se fosforila en la Ser2 y su desfosforilación impide el reclutamiento de CHERP. CHERP actúa como regulador, formando parte del complejo de empalme o splicing accesorio y su eliminación afecta a multitud de eventos de splicing alternativos (Yamanaka et al., 2022). Por lo que, la mutación de este gen FFUJ_13102 podría estar afectando a la expresión del gen regulador carS y provocando el fenotipo superproductor de carotenoides de los mutantes en fondo ΔcarX. El análisis de las variaciones genómicas estructurales permitió identificar otros posibles genes responsables del fenotipo superproductor de los mutantes en fondo ΔcarX. Las proteínas con una F box (FBP) junto con la proteína Cullin y Skp1 forman un complejo de ligasa de ubiquitina E3 denominado complejo Skp1–F-box protein–cullin (SFC) que se encarga de ubiquitinar a las proteínas que se degradarán en el proteasoma. Sin embargo, la presencia en la proteína de un dominio F-box no siempre implica que participe en el complejo SFC (Jonkers & Rep, 2009). Existen otras proteínas F-box que no se unen al complejo SFC o que su interacción no implica ubiquitinación y degradación por el proteasoma como es el caso de la proteína Frp1 de Fusarium oxysporum, necesaria para la invasión celular durante la patogénesis; o la proteína Pof14 de Saccharomyces pombe, implicada en la inhibición de la síntesis de ergosterol durante el estrés oxidativo (Tafforeau et al., 2006; Jonkers et al., 2012). Las proteínas F-box estudiadas hasta el momento en hongos están implicadas, por ejemplo, en la patogénesis, en la fusión vegetativa de hifas, en el ciclo circadiano y en el metabolismo del azufre (Sarikaya Bayram et al., 2022; He & Liu, 2005; Kumar & Paietta, 1998; Miguel-Rojas & Heras, 2016). El gen FFUJ_00294 relacionado con el factor de transcripción 1β de cutinasas tiene un dominio dedo de Zn(II)2Cys6 o C6 zinc similar al de GAL4 y una región con homología con los factores de transcripción de hongos, por lo que se trata de un factor de transcripción con una posible función reguladora. Los principales tipos de factores de transcripción eucarióticos incluyen los coordinadores de zinc (dedos de zinc C2H2, C4 y C6), hélice-giro-hélice (HTH), homeodomínios y proteínas con dominios básicos (bZIP o bHLH) (Weirauch & Hughes, 2011). En este sentido, se identificaron otros dos genes 124 (FFUJ_05086 y FFUJ_04876) en el mutante SG292 y otros dos genes (FFUJ_04612 y FFUJ_14838) en el mutante SG313 con dominios de dedo de zinc. El gen FFUJ_04876 codifica una proteína con un dominio dedo de zinc tipo AN1. La proteína CUZ1 del gen ortólogo de S. cerevisiae posee este domino, se une al proteosoma y participa en el catabolismo de proteínas dependientes de ubiquitina (Hanna et al., 2014). En hongos, estos factores de transcripción participan en el crecimiento, desarrollo, conidiación, síntesis de micotoxinas, estrés oxidativo y virulencia (Bailey & Ebbole, 1998; Jung et al., 2014; Li et al., 2020b; Liew et al., 2023; Wang et al., 2023b; Xiong et al., 2015). En resumen, en este capítulo se han aislado dos mutantes superproductores de carotenoides en un fondo mutante ΔcarX. La secuenciación de estos mutantes confirmó que no presentan ninguna mutación en el gen carS, a pesar de poseer el fenotipo típico de los mutantes carSpreviamente caracterizados. Sin embargo, los mutantes mostraron una disminución de la expresión de este gen, lo que indica que los mutantes podrían estar afectados en un nivel de regulación por encima del gen carS. Los datos de secuenciación del genoma completo de los mutantes superproductores en fondo mutante ΔcarX revelan una serie de posibles genes responsables del fenotipo superproductor de estos mutantes, aunque para discernir si estos genes candidatos tienen un papel en la regulación de la síntesis de carotenoides en Fusarium fujikuroi será imprescindible mutar dichos genes en la estirpe silvestre y analizar su contenido en carotenoides. El análisis de la producción total y la composición de los carotenoides en los mutantes anaranjados en fondo mutante ΔcarX fue muy parecida a la del mutante carSen medio estándar con agar, pero difirió cuando fueron cultivados en medio líquido optimizado. Además de poseer un mayor contenido en β-caroteno, el incremento de la producción total de carotenoides de los mutantes superproductores en fondo mutante ΔcarX les aporta un gran valor desde un punto de vista biotecnológico. Los mutantes carSson interesantes para la producción de NX, mientras que estos nuevos mutantes abren posibles vías para la producción de carotenoides enriquecidos en β-caroteno o compuestos derivados de los mismos. 125 Capítulo 4 126 127 Capítulo 4: Producción de carotenoides en un biorreactor de tanque agitado INTRODUCCIÓN La mayoría de los carotenoides se producen industrialmente de forma sintética, y una parte se obtiene a partir de microorganismos (Sen et al., 2019). Gracias a sus innumerables funciones, los carotenoides se utilizan ampliamente en suplementos dietéticos, cosméticos, colorantes alimenticio y piensos para la avicultura y acuicultura (Rather et al., 2023). En 2021, se estimó que el valor del mercado de los carotenoides era de 1,8 billones de dólares, y que para 2031, se prevé que tendrá un valor de 2,7 billones de dólares (https://www.alliedmarketresearch.com/carotenoids-market). Los microorganismos son una fuente de recursos fácilmente renovables que pueden generar mayores rendimientos con un bajo impacto ambiental y un coste de producción menor (Mussagy et al., 2019). Entre ellos, encontramos microalgas como Dunaliella salina (β-caroteno), Haematococus pluvialis (astaxantina) o Botrycoccus braunii (equinenona) y algunas bacterias no fotosintéticas como Agrobacterium aurantiacum (Astaxantina) o Halobacterium salinarium (bacterioruberina). También encontramos hongos productores de carotenoides como Blakeslea trispora (β-caroteno y licopeno), Mucor circinelloides (β-caroteno), Phycomyces blakesleeanus (β-caroteno), la levadura Xanthophyllomyces dendrorhous (astaxantina) o Neurospora crassa (toruleno), entre otros (Afroz Toma et al., 2023). Actualmente en el uso de la ingeniería metabólica ha permitido la producción de carotenoides a gran escala en microorganismos como las levaduras Saccharomyces cerevisiae o Yarrowia lipolytica, gracias a los últimos avances en herramientas de manipulación genética (Guo et al., 2023). Aunque la síntesis de carotenoides en el género Fusarium se ha estudiado durante años a nivel de laboratorio (Avalos et al., 2017b), no hay ninguna referencia sobre su uso industrial para la producción de carotenoides. A pesar de ello, los avances en fermentación y procesamiento posterior de los cultivos de hongos permitirán un mayor uso de estos para la extracción y purificación de carotenoides naturales a gran escala (Naz et al., 2023). 134 Por otra parte, la producción de carotenoides de la estirpe superproductora de carotenoides en fondo ΔcarX fue similar a la del mutante carS- (Figura C4.3B). Aunque la producción de carotenoides de la estirpe mutante SG292 fue de 1,04 mg g-1 de peso seco tras un día de cultivo en el biorreactor y aumentó hasta los 10,94 mg g-1 de peso seco tras 14 días de cultivo, fue algo inferior a lo producido por la estirpe mutante SG39. Además, la productividad aumentó hasta alcanzar los 0,97 mg L-1 de cultivo tras 9 días de fermentación, momento en el que empezó a disminuir (Figura C4.3D). Para estudiar en detalle la composición de los carotenoides de las diferentes estirpes de F. fujikuroi cultivadas en el biorreactor, se realizó un análisis mediante HPLC de los carotenoides durante el tiempo de cultivo (Figura C4.4). Aunque no se pudo obtener el perfil de carotenoides de la estirpe silvestre debido a la baja concentración de carotenoides que presentaban las muestras, el análisis de la composición de los carotenoides del mutante ΔcarX reveló un cambio en la proporción de toruleno y neurosporaxantina a lo largo del cultivo (Figura C4.4A). Al inicio del cultivo, se observó una mayor proporción de toruleno y γ-caroteno, mientras que al final del cultivo, la relación de toruleno disminuyó a la par que aumentó la proporción de neurosporaxantina. La relación de β-caroteno y γ-caroteno apenas varió durante el cultivo del mutante SG291 en el biorreactor. El análisis del perfil de carotenoides del mutante carSmostró una mayor tendencia hacia la producción de neurosporaxantina (Figura C4.4B). La proporción de NX en el mutante SG39 fue del 67,7% al inicio del cultivo y aumentó hasta el 92,8% al final de cultivo. Por su parte, el perfil de carotenoides del mutante superproductor en fondo ΔcarX mostró una tendencia similar, aunque diferente al inicio del cultivo (Figura C4.4C). La proporción inicial de neurosporaxantina en el mutante SG292 fue del 27,9%, aunque con la evolución del cultivo, la relación de neurosporaxantina aumentó hasta el 88,8% al final del cultivo al mismo tiempo que disminuyó la proporción del resto de carotenoides. 135 Figura C4.4. Perfil de carotenoides de los mutantes ΔcarX, carS-, y superproductor ΔcarX mediante HPLC. Perfiles de carotenoides del mutante ΔcarX (A), del mutante superproductor ΔcarX (B), y del mutante carS- (C) durante el tiempo de fermentación en el biorreactor. El porcentaje del glicosil éster de neurosporaxantina está integrado en el de la neurosporaxantina. 136 La combinación de la producción total de carotenoides analizada mediante espectrofotometría y del perfil de carotenoides analizado mediante HPLC permitió estimar la producción de cada uno de los carotenoides identificados en cada una de las estirpes (Tabla C4.1). La combinación de los datos reveló que la producción de neurosporaxantina en el mutante carSaumentaba progresivamente a lo largo del cultivo y, aunque se observó un aumento de la producción de los precursores de la síntesis de neurosporaxantina (toruleno y γ-caroteno) los primeros días de cultivo, dicha producción disminuía a partir del cuarto día de cultivo. Por su parte, el contenido de β-caroteno apenas se alteró. Por lo que, la máxima producción de neurosporaxantina en el mutante SG39 fue de 10,43 mg g-1 de peso seco tras 14 días de cultivo en el biorreactor. En el caso del mutante superproductor ΔcarX, también se observó un aumento progresivo de la producción de neurosporaxantina a lo largo del cultivo hasta alcanzar una producción de 9,40 mg g-1 de peso seco tras 14 días de cultivo, algo inferior al mutante carS-. La producción de toruleno y γ-caroteno aumentó hasta el cuarto día al igual que ocurrió en el mutante carS-, momento en el comenzó a disminuir. Por su parte, la producción del glicosil éster de neurosporaxantina en el mutante SG292 no fue tan elevada comparada con su producción en el mutante carS-, posiblemente debido a una correlación positiva entre la producción de neurosporaxantina y la formación de su derivado. Sin embargo, la producción de β-caroteno en el mutante superproductor ΔcarX aumentó durante todo el cultivo, alcanzando un valor de 0,36 mg g-1 de peso seco tras 14 días de cultivo en el biorreactor, el doble de lo producido por el mutante SG39 en el mismo tiempo de cultivo. La combinación de los datos reveló que la producción de neurosporaxantina en el mutante carSaumentaba progresivamente a lo largo del cultivo y, aunque se observó un aumento de la producción de los precursores de la síntesis de neurosporaxantina (toruleno y γ-caroteno) los primeros días de cultivo, dicha producción disminuía a partir del cuarto día de cultivo. Por su parte, el contenido de β-caroteno apenas se alteró. Por lo que, la máxima producción de neurosporaxantina en el mutante SG39 fue de 10,43 mg g-1 de peso seco tras 14 días de cultivo en el biorreactor. 137 Tabla C4.1. Producción de los diferentes carotenoides en el mutante carSy el mutante superproductor en fondo mutante ΔcarX de F. fujikuroi. Las cantidades se estimaron a partir de la producción total y de los perfiles de carotenoides de cada una de las estirpes. Los datos muestran la media y la desviación estándar de dos experimentos independientes. Estirpe Tiempo (días) Producción (µg g-1 de peso seco) GlyNX NX Toruleno γ-caroteno β-caroteno Total SG39 1 N.D. 1123,8 ± 63,2 236,0 ± 13,3 133,5 ± 7,5 167,0 ± 9,4 1660,3 ± 93,3 3 128,6 ± 14,1 925,1 ± 101,7 160,1 ± 17,6 63,1 ± 6,9 11,8 ± 1,3 1288,6 ± 141,6 4 607,9 ± 47,4 5118,4 ± 399,0 680,3 ± 53 261,8 ± 20,4 69,1 ± 5,4 6737,5 ± 525,2 7 809,7 ± 47,4 8904,6 ± 377,9 500,0 ± 21,2 168,2 ± 7,1 98,4 ± 4,2 10481,2 ± 444,9 9 739,3 ± 34,4 8932,0 ± 343,0 508,0 ± 19,5 173,0 ± 6,6 140,9 ± 5,4 10493,2 ± 420,9 11 672,5 ± 11,3 9440,0 ± 158,5 444,9 ± 7,5 166,7 ± 2,8 145,9 ± 2,4 10871,0 ± 182,5 14 441,6 ± 10,1 10434,1 ± 237,6 460 ± 10,5 218,6 ± 5,0 176,5 ± 4,0 11731,1 ± 267,1 16 485,3 ± 18,5 10307,4 ± 392,7 460,7 ± 17,6 222,9 ± 8,5 159,8 ± 6,1 11636,1 ± 443,4 SG292 1 98,4 ± 11,3 192,3 ± 22,1 410,9 ± 47,2 265,3 ± 30,5 75,5 ± 8,7 1042,3 ± 119,7 3 173,7 ± 7,1 669,0 ± 27,2 279,9 ± 11,4 113,7 ± 4,6 69,1 ± 2,8 1305,4 ± 53,2 4 269,5 ± 9,1 3728,1 ± 125,6 1227,5 ± 41,3 407,9 ± 13,7 251,9 ± 8,5 5884,8 ± 198,2 7 314,5 ± 20,8 6596,2 ± 437,1 1171,4 ± 77,6 321,0 ± 21,3 321,5 ± 21,3 8724,6 ± 578,1 9 281,1 ± 11,5 8276,1 ± 339,8 1036,9 ± 42,6 292,4 ± 12,0 353,9 ± 14,5 10240,5 ± 420,5 11 237,5 ± 0,7 8554,5 ± 24,7 873,1 ± 2,5 233,9 ± 0,7 350,4 ± 1,0 10249,4 ± 29,6 14 219,1 ± 0,9 9395,3 ± 37,8 757,5 ± 3,0 208,1 ± 0,8 362,8 ± 1,5 10942,7 ± 44,0 16 200,0 ± 11,8 9116,9 ± 536,5 641,7 ± 37,8 186,6 ± 11,0 350 ± 20,6 10495,2 ± 617,6 N.D: No detectado. GlyNX: Glicosil éster de neurosporaxantina. 138 En el caso del mutante superproductor ΔcarX, también se observó un aumento progresivo de la producción de neurosporaxantina a lo largo del cultivo hasta alcanzar una producción de 9,40 mg g-1 de peso seco tras 14 días de cultivo, algo inferior al mutante carS-. La producción de toruleno y γ-caroteno aumentó hasta el cuarto día al igual que ocurrió en el mutante carS-, momento en el comenzó a disminuir. Por su parte, la producción del glicosil éster de neurosporaxantina en el mutante SG292 no fue tan elevada comparada con su producción en el mutante carS-, posiblemente debido a una correlación positiva entre la producción de neurosporaxantina y la formación de su derivado. Sin embargo, la producción de β-caroteno en el mutante superproductor ΔcarX aumentó durante todo el cultivo, alcanzando un valor de 0,36 mg g-1 de peso seco tras 14 días de cultivo en el biorreactor, el doble de lo producido por el mutante SG39 en el mismo tiempo de cultivo. DISCUSIÓN Los carotenoides son pigmentos terpenoides de gran valor por su capacidad para proporcionar color y actuar como antioxidante. Debido a la gran variedad de funciones que se les atribuyen y al aumento de la demanda de carotenoides producidos de forma natural, la industria de los carotenoides se encuentra inmersa en la búsqueda de nuevas vías de producción (Kiki, 2023; Naz et al., 2023; Rather et al., 2023; Sen et al., 2019). Los carotenoides naturales son producidos por las plantas principalmente, aunque los microorganismos constituyen una fuente de recursos renovables con un impacto ambiental y unos costes de producción más bajos (Afroz Toma et al., 2023). En este sentido, los carotenoides también son producidos por muchos hongos (Avalos & Limón, 2015; Sandmann et al., 2002). Entre los principales carotenoides producidos por hongos encontramos el βcaroteno, el licopeno, el toruleno, la cantaxantina o la astaxantina (Avalos et al., 2017; Basiony et al., 2022; Jing et al., 2023). El uso de la modificación genética ha permitido desarrollar estirpes capaces de aumentar la producción de estos carotenoides. Un ejemplo es el hongo Mucor circinelloides, productor de β-caroteno. La sobreexpresión de una cetolasa de β-caroteno en M. circinelloides aumenta la cantidad de cantaxantina, 139 potenciando su producción biotecnológica y permitiendo una mayor producción de astaxantina (Naz et al., 2021). La neurosporaxantina es otro de los carotenoides producidos por Fusarium, además de por otros hongos filamentos (Avalos & Cerdá-Olmedo, 1987; Strobel et al., 2009; Valadon et al., 1982; Zalokar, 1957). El carácter antioxidante de los extractos enriquecidos en neurosporaxantina (Parra-Rivero et al., 2020), junto con la ausencia de toxicidad y el aumento de su biodisponibilidad en ratones tras su ingesta convierten a la neurosporaxantina en un carotenoide provitamina A de gran interés para su explotación a nivel industrial (Miller et al., 2023). Sin embargo, la síntesis de neurosporaxantina en Fusarium, al igual que del resto de los carotenoides producidos por el hongo, solo había sido estudiada a nivel de laboratorio (Avalos et al., 2017b). El objetivo principal de este capítulo fue establecer las bases para una producción industrial de carotenoides a partir de un cultivo de F. fujikuroi. Para ello, se estudió la producción de carotenoides de la estirpe silvestre F. fujikuroi IMI58289 en un biorreactor de tanque agitado a escala piloto y se comparó con la producción de las estirpes mutantes obtenidas en el Capítulo 3. La ausencia de datos de producción de carotenoides en biorreactores con el hongo Fusarium propició el uso de las condiciones de cultivo previamente utilizadas para la producción de neurosporaxantina en matraces (Parra-Rivero et al., 2020), adaptadas a los parámetros generales de producción para una fermentación sumergida. Los resultados de la producción de carotenoides de la estirpe silvestre y del mutante carSen el biorreactor muestran datos interesantes. Durante el proceso de fermentación, el pH cambia y estos cambios están relacionados con el crecimiento de los microorganismos. La producción de carotenoides durante la fermentación está influenciada por el pH del ambiente, el cual afecta tanto al crecimiento celular como a la biosíntesis de estos pigmentos (Siziya et al., 2020). El pH muestra una disminución hacia un pH más acido durante la producción de carotenoides en el biorreactor con ambas estirpes de F. fujikuroi. Esta caída durante los primeros días del cultivo también se observa durante la producción de carotenoides en otros organismos y estaría relacionado con la producción de metabolitos de carácter ácido 140 durante el consumo del medio de cultivo (Naz et al., 2023). La estabilización del pH hacia valores ácidos podría estar limitando el crecimiento de F. fujikuroi, pues la biomasa de ambas estirpes deja de aumentar tras varios días de cultivo. Generalmente, el mejor pH para la síntesis de carotenoides depende de la especie fúngica y del medio de cultivo. El análisis del control de pH durante la fermentación podría ser el siguiente paso en la optimización de la producción de carotenoides con F. fujikuroi en el futuro. Los bajos valores de producción y productividad de la estirpe silvestre IMI58289 de F. fujikuroi indican que esta estirpe no se emplearía con vistas a una producción industrial de carotenoides, aunque su estudio nos permite conocer mejor su comportamiento. Por el contrario, la producción de carotenoides de la estirpe mutante carSalcanzó valores nunca logrados con esta estirpe. La producción total de carotenoides en el biorreactor fue de 11,7 mg g-1 de peso seco tras 14 días, superando a lo producido en matraces tras 28 días (Parra-Rivero et al. 2020) y en el Capítulo 3. El análisis de la composición de carotenoides mediante HPLC indicó que el carotenoide mayoritario fue la neurosporaxantina, constituyendo el 93% del total acumulado y siendo superior a lo alcanzado durante su cultivo en matraces (Parra-Rivero et al., 2020). La combinación de los datos de producción total y de composición de carotenoides demuestran que el cultivo del mutante carSpermite alcanzar niveles de neurosporaxantina de hasta 10,4 mg g-1 de peso seco. Esta es la concentración más alta de neurosporaxantina descrita en F. fujikuroi. La producción de carotenoides de la estirpe ΔcarX y de la superproductora ΔcarX en el biorreactor también aporta información relevante. Tanto el crecimiento como la evolución del pH y el % de oxígeno disuelto del mutantes ΔcarX, SG291, y de mutante superproductor ΔcarX, SG292, durante la producción de carotenoides en el biorreactor coinciden con los de la estirpe silvestre y el mutante carS-. Por lo que las diferencias en la producción de carotenoides dependen exclusivamente de la naturaleza de cada estirpe de F. fujikuroi y no de otros factores. La producción de carotenoides del mutante ΔcarX en el biorreactor se asemeja a lo logrado en otras condiciones de cultivo (Thewes et al., 2005), aunque el análisis del perfil de carotenoides muestra un mayor contenido en neurosporaxantina y sus precursores, posiblemente a que estos ensayos son 141 realizados en unas condiciones de cultivo optimizadas para la producción de neurosporaxantina (Parra-Rivero et al., 2020). El cultivo del mutante superproductor ΔcarX en el biorreactor muestra una producción de carotenoides diferente a lo esperado. En este caso, tanto la producción total de carotenoides como la composición de los diferentes carotenoides se parecen a las del mutante carS-. Como se ha mencionado anteriormente, los parámetros de producción en el biorreactor están adaptados a partir de los ensayos de producción de neurosporaxantina optimizados en matraces (Parra-Rivero et al., 2020), lo que justificaría el aumento de la acumulación de neurosporaxantina en el mutante superproductor ΔcarX durante el cultivo. A pesar de ello, la producción de β-caroteno sigue siendo superior en el mutante superproductor ΔcarX respecto al mutante carS- (Parra-Rivero et al., 2020; Thewes et al., 2005). El uso del mismo medio optimizado de producción de neurosporaxantina con el doble de cantidad de NH4NO3 aumentó la proporción de carotenoides neutros durante el cultivo de un mutante carSen el matraz (Parra-Rivero et al., 2020). Este cambio en la composición del medio podría ser el punto de partida para aumentar la producción en β-caroteno del mutante SG292 en el biorreactor. En resumen, en este capítulo se han establecido las bases para una producción de neurosporaxantina en un biorreactor a escala piloto. Los datos muestran valores de producción de neurosporaxantina a partir de un cultivo del mutante carSde F. fujikuroi nunca alcanzados en otro sistema biológico. El análisis de la producción total y la composición de carotenoides revela que la producción del mutante anaranjado en fondo mutante ΔcarX es similar a la del mutante carScuando son cultivados en un biorreactor es las condiciones de optimización para la producción de neurosporaxantina. Sin embargo, la optimización de los parámetros de producción en el biorreactor hacia una mayor producción de β-caroteno, empleando el mutante superproductor ΔcarX, podría ser la clave para la producción de carotenoides enriquecidos en β-caroteno en el futuro. Debido a los altos costes que implica producir en la industria, una de las formas más eficientes para abaratar los procesos industriales es reducir el tiempo de producción necesario. En este sentido, la producción de carotenoides en el biorreactor ha permitido 142 reducir el tiempo de producción de cuatro semanas de cultivo a sólo una semana y aumentar el volumen del producto generado, alcanzando valores de producción de neurosporaxantina incluso superiores a los obtenidos durante la producción en matraces. Por lo que, la fermentación en biorreactores es una eficiente vía para la producción de carotenoides a gran escala. 143 Discusión general