Control redox de la percepción de metales y del metabolismo del carbono en cianobacterias

Control redox de la percepción de metales y del metabolismo del carbono en cianobacterias Trabajo presentado para optar al grado de Doctor en Bioquímica por la Graduada: Raquel Mª García Cañas Sevilla, junio de 2021 Directores Dr. Francisco Javier Florencio Bellido Dr. Luis López Maury Catedrático Profesor Titular de Bioquímica y Biología Molecular 2 3 AGRADECIMIENTOS Esta tesis ha sido realizada en el Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis (IBVF), un centro mixto de la Universidad de Sevilla y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). Por tanto, quiero agradecer a ambas instituciones y a su personal tanto los medios prestados para poder realizar esta tesis como haberme acogido durante la misma. También quiero agradecer al Ministerio de Educación, Cultura y Deporte español (MECD) la concesión del contrato FPU (FPU15/05025) que ha permitido que pueda realizar esta tesis, así como a la financiación recibida por los diferentes proyectos concedidos al grupo del que he formado parte por el Ministerio de Economía y Competitividad (BIO201675634-P) y el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (PID2019104513GB-I00). En primer lugar tengo que agradecer profundamente a mis directores de tesis, Luis López Maury y Francisco Javier Florencio, el haberme permitido continuar mi formación investigadora mediante esta tesis doctoral y confiar en mí a lo largo de ella. Gracias Luis, por todas las horas que has invertido respondiendo a cualquier pregunta (no todas muy lógicas), animándome, aprendiendo a entender mi letra y entendiéndome hasta mejor que yo cuando escribo, enseñándome a ser crítica y enseñándome genética (aunque no sé si te alegrabas de esta parte cuando tocaba refrescar la colección). Has conseguido que diferencie entre ave y pájaro y has aprendido a traducirme mejor que nadie, incluso mis “circunstancias”. Gracias Javier por tu experiencia, tranquilidad y por todo lo que me has enseñado. Siempre has sido el primero al que preguntarle dudas de rutas metabólicas o metabolitos. De forma general quiero agradecer a todos los integrantes del Lab 2-3 y a todos los que han pasado por aquí por cuidar de mí, animarme en cualquier situación, hacerme reír y aceptarme como soy tan rápidamente. Gracias Migue, sin ti no habría podido hacer ni la mitad de la tesis. No tengo palabras para agradecerte todo lo que has hecho tanto profesionalmente, mediante baterías de placas diferentes hechas a maldad, como personalmente animándome y apoyándome. Gracias Sandra, Maribel y Mª José por todas las veces que me habéis ayudado con un experimento, por escucharme y por motivarme para ser mejor investigadora y persona. Gracias Manuel por todo, por las charlas de ciencia, de nuestra vida y del futuro. Porque contigo se puede discutir de los fotosistemas y 5 minutos después hablar de galletas. He aprendido mucho de ti y aprecio todo el apoyo y la ayuda que me has brindado en estos años, incluso cuando me decías que había engordado en Navidad (lo cual tengo que admitir que era verdad). Gracias Pablito por tu alegría y entusiasmo, porque contigo me he dado cuenta de que pararme a echar purpurina a un puente navideño puede animarme. Gracias por siempre estar ahí para ofrecer teorías científicas o para ayudarme en lo que fuera necesario. Gracias Mai, lo único malo que puedo decir de ti es que ojalá hubieras estado más tiempo. Me he reído y he aprendido mucho contigo, aunque no sé si algún día podre olvidar la interrelación pato-pata. Muchas gracias Toñi, siempre has estado para apoyarme y animarme a superarme a mí misma, tanto en el trabajo como fuera de él. Echaré de menos ponernos juntas a calcular números para disolver compuestos. Gracias Ernesto por tu positividad, siempre preocupado por la seguridad del laboratorio. 4 Muchas gracias a mis compañeros de desayuno, he echado mucho de menos llegar al trabajo cada mañana y poder estar un rato con vosotros. Isa, Pablo, Ana, Diego, Laura, Fran, Nuria…Hacéis las mañanas menos mañanas. Gracias Sergio, has sido un amigo y un gran compañero. Gracias por responder a mis preguntas sobre Anabaena, por las charlas junto a la centrífuga y por las salidas para animarnos. Gracias a Jose Enrique por su paciencia conmigo, disculpa todas las veces que he olvidado apuntarme. Gracias Esther por enseñarme a hacer valoraciones redox, sin ti no sé cuánto tiempo habría tardado, y gracias Alicia e Isidro por ayudarnos con Anabaena cuando no sabíamos nada de ella. Gracias a todos mis compañeros doctorandos, aprecio muchos que siempre nos hayamos apoyado y ayudado entre nosotros. Muchas gracias a Quique y Antonio, saber que siempre que pasase por la puerta de entrada me reiría y pasaría un buen rato hacía que los días fueran mucho mejores. Echaré de menos hablar de animales y gorros cada mañana. De forma general muchas gracias a todos/as los que han formado y forman parte del cicCartuja, no podría haber hecho esta tesis sin vosotros. Muchas gracias a mis bioquímicos y amigos. Gracias a Jose (oso polar), Aaron (mejor no pongo tu sobrenombre), Javi (romerito), Clara (shunga), Víctor, Pedro...Gracias a todos porque, aunque pase más o menos tiempo entre cada vez que estamos juntos, siempre nos hemos apoyado y animado. Por supuesto, tengo que agradecer a Bea, a pesar de la distancia siempre has estado para aconsejarme cuando era necesario. Gracias también a mi “novia” Andrea, gracias por estar siempre ahí y apoyarme en todo. Porque independientemente de que supieras más o menos sobre cianobacterias siempre me has escuchado e intentado ayudarme. Has sido una parte esencial para poder terminar esta tesis y no sabría qué anécdota escribir de las miles que tenemos juntas. Gracias a mis padres por confiar en mí y apoyarme, por escucharme e intentar comprenderme siempre, muchas gracias por solucionar cualquier problema que pudiera tener. Aprecio enormemente todo el sacrificio que vosotros también habéis hecho para que yo llegue a este momento, la mayor verdad es que no podría haber conseguido nada de lo que he conseguido sin vosotros. Sois esenciales. Gracias Alfonso por animarme, por todas las veces que nos hemos saltado la dieta, por todos los programas que hemos visto juntos. Aunque a veces me enfade aprecio que hayas estado ahí cada día al volver a casa. Gracias a toda mi familia por confiar en mí y gracias a Anivia, Henry, Fievel y Willy por sacarme una sonrisa cada día. Muchísimas gracias a todas las personas que de una forma u otra me han ayudado y acompañado durante estos años. Todos habéis sido esenciales para obtener esta tesis, de corazón. 5 Índice 6 7 Índice ....................................................................................................................... 5 Índice de tablas ............................................................................................... 15 Índice de figuras .............................................................................................. 17 Abreviaturas .......................................................................................................... 21 Introducción ........................................................................................................... 25 1. Las cianobacterias. ..................................................................................... 27 2. El proceso fotosintético y respiratorio en cianobacterias ............................. 30 2.1. Fotosíntesis en cianobacterias. ............................................................. 31 2.1.1. Los ficobilisomas (PBS) y la OCP. .................................................. 31 2.1.2. El transporte lineal de electrones (LET). ......................................... 32 2.1.3. El transporte cíclico de electrones (CET). ....................................... 33 2.2. Fijación de carbono en cianobacterias por el ciclo de Calvin-BensonBassham (CBB). .......................................................................................... 33 2.2.1. Sistemas de concentración de carbono. ......................................... 36 2.3. Respiración en cianobacterias. ............................................................. 36 2.3.1. Oxidasas terminales respiratorias. .................................................. 37 3. Metabolismo del carbono en cianobacterias ............................................... 37 3.1. Ruta oxidativa de las pentosas fosfato (OPP) ....................................... 39 3.2. Ruta de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) o glucólisis. ........................ 40 3.3. Ruta de Entner-Doudoroff (ED). ............................................................ 41 3.4. Ciclo de Krebs o Ciclo de los Ácidos Tricarboxílicos (TCA). ................. 41 4. Regulación redox del metabolismo del carbono en cianobacterias. ............ 42 4.1. Regulación enzimática mediada por tiorredoxinas. ............................... 43 4.2. Regulación enzimática mediada por glutarredoxinas. ........................... 45 5. Las actividades FBPasa y SBPasa en organismos fotosintéticos. .............. 45 5.1. La actividad FBPasa en plantas. ........................................................... 46 5.1.1. FBPasa citosólica. .......................................................................... 47 5.1.2. FBPasa cloroplastídica. .................................................................. 47 5.2. La actividad SBPasa en plantas. .......................................................... 48 5.3. Las actividades FBPasa y SBPasa en cianobacterias. ......................... 49 5.3.1. La enzima FBPasa en Synechocystis. ............................................ 49 5.3.2. La enzima FBP/SBPasa en Synechocystis. .................................... 50 6. Regulación génica en cianobacteria. ........................................................... 52 6.1. Regulación transcripcional. ................................................................... 52 6.2. Regulación post-transcripcional. ........................................................... 54 6.2.1. Regulación por riboswitches. .......................................................... 54 8 6.2.2. Regulación por RNAs. .................................................................... 54 7. Regulación por proteólisis en bacterias. ...................................................... 54 7.1. Regulación por proteasas tipo M48 y reguladores transcripcionales BlaI/MecI en bacterias. ................................................................................ 55 7.1.1. Regulación mediada por proteasas tipo M48. ................................. 56 7.1.2. Regulación mediada por reguladores BlaI/MecI ............................. 58 8. Metabolismo de hierro y cobre, dos metales esenciales para la fotosíntesis en cianobacterias. ................................................................................................ 59 8.1. Metabolismo y homeostasis del hierro. ................................................. 59 8.2. Metabolismo y homeostasis del cobre. ................................................. 61 Materiales y Métodos............................................................................................. 65 1. Organismos y condiciones de cultivo .......................................................... 67 1.1. Cianobacterias. ..................................................................................... 67 1.1.1. Estirpes de cianobacterias utilizadas. ............................................. 67 1.1.2. Medios y condiciones de cultivo...................................................... 69 1.2. Escherichia coli (E. coli). ....................................................................... 70 1.2.1 Estirpes de E. coli utilizadas. ........................................................... 70 1.2.2. Medios y condiciones de cultivo...................................................... 71 1.3. Métodos de recogida de células............................................................ 71 2. Métodos de biología molecular.................................................................... 72 2.1. Plásmidos y oligonucleótidos utilizados. ............................................... 72 2.1.1. Oligonucleótidos. ............................................................................ 72 2.1.2. Plásmidos ....................................................................................... 75 2. 2. Aislamiento y manipulación del DNA ................................................... 81 2.1.2. Aislamiento de DNA plasmídico de E. coli. ..................................... 81 2.2.2. Aislamiento de DNA genómico de cianobacterias. ......................... 82 2.3. Introducción de DNA exógeno en organismos. ..................................... 82 2.3.1. Transformación de células de E. coli. ............................................. 82 2.3.1.1. Transformación por choque térmico. ........................................ 82 2.3.1.2. Transformación por electroporación. ........................................ 83 2.3.1.3. Expresión de proteínas en E. coli. ............................................ 83 2.3.2. Transformación de células de Synechocystis. ................................ 83 2.3.3. Transferencia de DNA a Anabaena por conjugación triparental. .... 84 2.4. Análisis y cuantificación del DNA. ......................................................... 85 2.4.1. Cuantificación de la concentración de DNA. ................................... 85 2.4.2. Electroforesis en geles de agarosa. ................................................ 85 2.4.3. Extracción de DNA de geles de agarosa. ....................................... 85 9 2.4.4. Amplificación de fragmentos de DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ............................................................................ 85 2.4.4.1. Generación de mutantes dirigidos mediante PCR. ................... 86 2.4.5. Manipulación enzimática del DNA. ................................................. 87 2.4.6. Secuenciación del DNA. ................................................................. 87 2.4.7. Ensayos de retardo de la movilidad electroforética (EMSA) de fragmentos de DNA. ................................................................................. 87 2.4.8. Marcaje radioactivo de fragmentos de DNA. ................................... 88 2.5. Análisis y cuantificación del RNA. ......................................................... 88 2.5.1. Tratamiento del material. ................................................................ 88 2.5.2. Aislamiento de RNA total de Synechocystis. .................................. 88 2.5.3. Cuantificación del RNA aislado. ...................................................... 89 2.5.4. Electroforesis de RNA..................................................................... 89 2.5.5. Detección del RNAm mediante hibridación RNA-DNA (Northern blot). ................................................................................................................. 89 2.5.7. Secuenciación del transcriptoma (RNA-Seq). ................................. 90 3. Métodos bioquímicos. ................................................................................. 90 3.1. Preparación de extractos celulares. ...................................................... 90 3.1.1. Rotura con perlas de vidrio. ............................................................ 90 3.1.2. Rotura por ultrasonidos. .................................................................. 91 3.1.3. Preparación de muestras con células enteras ................................ 91 3.2. Cuantificación de proteínas. .................................................................. 91 3.3. Electroforesis de proteínas ................................................................... 91 3.3.1. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes. .................................................................................... 91 3.3.2. Tinción con Coomasie. ................................................................... 92 3.4. Inmunodetección de proteínas en membrana (Western Blot). .............. 92 3.5. Purificación de proteínas. ...................................................................... 93 3.5.1. Cromatografía de afinidad por níquel. ............................................. 93 3.5.2. Cromatografía de exclusión molecular. ........................................... 94 3.6. Oxidación o reducción de proteínas purificadas. ................................... 94 3.7. Concentración de proteínas por ultrafiltración. ...................................... 95 3.8. Alquilación de proteínas. ....................................................................... 95 4. Métodos biofísicos. .................................................................................. 96 4.1. Evolución de oxígeno mediante el electrodo de Clark. .......................... 96 5. Ensayos enzimáticos. .............................................................................. 96 5.1. Determinación de la actividad fructosa-1,6-bisfosfatasa. ...................... 96 16 17 Índice de figuras Figura 1.Estirpes de cianobacterias empleadas en este trabajo. . ......................... 28 Figura 2. Cadena de transporte electrónico fotosintético en Synechocystis.. ........ 30 Figura 3. Cadena de transporte electrónico respiratorio en Synechocystis. .......... 31 Figura 4. Ciclo de Calvin-Benson-Bassham en cianobacterias.. ............................ 35 Figura 5. Esquema de las rutas de asimilación del carbono en Synechocystis. .... 38 Figura 6. Mecanismos de reacción con proteínas de las tiorredoxinas y glutarredoxinas de cianobacterias. ....................................................................... 44 Figura 7. Regulación de la regulación de las FBPasa de plantas. ......................... 46 Figura 8. Regulación de la enzima SBPasa de plantas.. ....................................... 49 Figura 9. Regulación y estructura de las enzimas FBPasa y FBP/SBPasa de Synechocystis. ....................................................................................................... 51 Figura 10. Esquema de la regulación por las proteasas BlaR1 y MecR1 (tipo M48) sobre los reguladores transcripcionales BlaI y MecI. ............................................. 56 Figura 11. Distribución en las cianobacterias de los genes que codifican para petR, PetP, petJ y petE. ................................................................................................ 106 Figura 12. Características principales de PetR determinadas mediante análisis bioinformático. ..................................................................................................... 108 Figura 13. Acumulación en PetR, PetJ y PetE de forma dependiente de cobre. . 109 Figura 14. Generación y comprobación del mutante PETR. ................................ 110 Figura 15. Análisis de la expresión y acumulación de la plastocianina y el citocromo c6 en respuesta en el mutante PETR. .................................................................. 111 Figura 16. Características principales de PetP determinadas mediante análisis bioinformático.. .................................................................................................... 113 Figura 17. Generación y comprobación del mutante PETP.. ............................... 114 Figura 18. Análisis de la expresión y acumulación de la plastocianina y el citocromo c6 en respuesta en el mutante PETP. .................................................................. 115 Figura 19. Construcción del mutante PETRP y análisis de la expresión y acumulación de la plastocianina y el citocromo c6 en respuesta a cobre en él. ... 116 Figura 20. Cuantificación de PetJ, PetE y PetR en las estirpes WT, PETR y PETP en distintas disponibilidades de cobre. ................................................................ 119 Figura 21. Análisis por RNA-seq de la regulación que depende de PetR-PetP. .. 121 Figura 22. Análisis de la unión de PetR a los promotores de petJ y petE. ........... 123 Figura 23. Análisis de los sitios de unión de PetR con los promotores de petJ y petE. ............................................................................................................................ 124 Figura 24. Análisis de la unión de PetR al promotor de slr0601. 125 Figura 25. Construcción, comprobación y fenotipo de la estirpe SLR0601. ......... 126 Figura 26. Determinación de la actividad proteasa de PetP sobre PetR de forma dependiente de cobre. ........................................................................................ 128 Figura 27. Construcción de las estirpes PETRP+RP, PETRP+HAHA, PETRP+M53A, PETRP+M58A y PETRP+M53AM58A. ....................................... 129 Figura 28. Comprobación de la recuperación del fenotipo WT en la estirpe PETRP+RP. ........................................................................................................ 130 Figura 29. Comparación del crecimiento de las estirpes WT, PETRP, PETRP+RP, PETRP+HAHA, PETRP+M53A, PETRP+M58A y PETRP+M53AM58A ante diferente disponibilidad de cobre. ........................................................................ 131 18 Figura 30. Determinación del efecto de la sustitución de las histidinas H150 y H154 en PetP en el intercambio PetJ/petE y su actividad proteasa sobre PetR. .......... 132 Figura 31. Determinación del efecto de la sustitución de las metioninas M53 y/o M58 en la percepción de cobre de PetP. ..................................................................... 134 Figura 32. Determinación de los cambios en la respuesta proteica a cobre debido a la alteración de las metioninas M53 y/o M58. ..................................................... 135 Figura 34. Comprobación de la segregación de las estirpes PETJ, PETE, PETEJ, PETER, PETEP, PETERP, PETJR, PETJP y PETJRP. ...................................... 137 Figura 34. Análisis del crecimiento de las estirpes PETE, PETJ, PETEP, PETJR y PETJRP ante diferente disponibilidad de cobre. .................................................. 138 Figura 36. Análisis del crecimiento y la capacidad fotosintética de distintas condiciones de disponibilidad de cobre para las estirpes PETR, PETP, PETJ, PETE, PETEP y PETJR. ................................................................................................. 141 Figura 36. Estructura tridimensional de PetP en Anabaena y contexto genético de los genes que codifican para PetR, PetP, plastocianina y los citocromos c6. ....... 143 Figura 37. Construcción de las estirpes PETR_An y PETP_An. .......................... 144 Figura 38. Análisis del sistema de regulación PetR-PetP y su control en el intercambio petJ/petE ante cobre en Anabaena. ................................................. 145 Figura 39. Regulación de la cantidad de FBP/SBPasa y FBPasa dependiente de las condiciones de luz y carbono. ............................................................................. 150 Figura 41. Crecimiento de los mutantes ΔF y ΔF/S en diferentes condiciones de disponibilidad de carbono y luz. ........................................................................... 151 Figura 41. Consumo de glucosa extracelular y glucógeno de las estirpes WT ΔF y ΔF/S en mixotrofía y fotoautotrofía. ..................................................................... 154 Figura 42. Desprendimiento de oxígeno ante diferentes condiciones de disponibilidad de carbono de las estirpes ΔF/S y ΔF.. ......................................... 156 Figura 43. Consumo de oxígeno de las estirpes ΔF/S y ΔF e mixotrofía y fotoheterotrofía.. .................................................................................................. 157 Figura 44. Medida in situ de la actividad fructosa-1, 6-bisfosfatasa. .................... 158 Figura 45. Regulación redox in vitro de la actividad de la FBP/SBPasa y FBPasa de Synechocystis. ..................................................................................................... 159 Figura 46. Regulación de la actividad fructosa-1, 6-bisfosfatasa de las enzimas FBP/SBPasa y FBPasa de Synechocystis mediada por tiorredoxina. ................. 161 Figura 47. Análisis bioinformático de la conservación de cisteínas en la FBP/SBPasa.. ...................................................................................................... 164 Figura 48. Purificación de las proteínas con las cisteínas 75, 84 y/o 99 alterados a serina y regulación redox de las proteínas FBP/SBPasa C75S, C84S y C99S. .. 166 Figura 49. Las proteínas C75SC99S y C84SC99S, a diferencia de C75SC84S, no son susceptibles de regulación redox. ................................................................. 167 Figura 50. Cambios conformacionales en la proteína FBP/SBPasa y sus variantes con una cisteína alterada ante la oxidación-reducción.. ...................................... 169 Figura 51. Cambios conformacionales en las proteínas FBP/SBPasa con dos de sus cisteínas alteradas ante la oxidación-reducción.. ................................................ 171 Figura 52. Construcción de las estirpes C99S y C75SC84S de Synechocystis. .. 172 Figura 53. Análisis del fenotipo de los mutantes sobreexpresores de la FBP/SBPasa C75SC84S y C99S. ............................................................................................. 174 Figura 54. Ensayos de alquilación de las proteínas FBP/SBPasa y FBPasa tras su reducción/oxidación. ............................................................................................ 176 19 Figura 55. Análisis de los cambios en el estado redox de las proteínas FBPasa y FBP/SBPasa dependientes de luz. ...................................................................... 177 Figura 56. Análisis de los cambios en el estado redox de las proteínas FBP/SBPasa y FBPasa en autotrofía, mixotrofía y heterotrofía. ( ............................................ 179 Figura 57. Construcción de las estirpes sobreexpresoras de la SBPasaAt. ....... 181 Figura 58. Construcción de las estirpes que expresaban la FBPasaPs.. ............. 182 Figura 59. Comprobación de las estirpes ΔF/S y ΔF.. ......................................... 183 Figura 60. Determinación de la supervivencia y crecimiento en fotoautotrofía, mixotrofía y fotoheterotrofía de las estirpes sobreexpresoras de la SBPasaAt. ... 185 Figura 61. Determinación de la supervivencia y crecimiento en fotoautotrofía, mixotrofía y fotoheterotrofía de las estirpes sobreexpresoras de la FBPasaPs. .. 187 Figura 62 Determinación de la supervivencia y crecimiento en fotoautotrofía, mixotrofía y fotoheterotrofía de las estirpes sobrexpresoras de la FBPasaPs y SBPasaAt. ........................................................................................................... 189 Figura 63. Crecimiento de los mutantes S y ΔF+S ante diferentes intensidades luminosas. ........................................................................................................... 190 Figura 64. Crecimiento del mutantes F ante diferentes intensidades luminosas. ............................................................................................................................ 191 Figura 65. Medida de actividad fructosa-1, 6-bisfosfatasa en mutantes que expresan SBPasaAt y FBPasaPs. ....................................................................................... 193 Figura 66. Construcción de las estirpes que expresaban la tiorredoxina f1 de A. thaliana.. .............................................................................................................. 195 Figura 67. Crecimiento a diferentes intensidades luminosas de la estirpe ΔF/S+S+F+TrxF. ................................................................................................. 196 Figura 68. Análisis de la actividad FBPasa y de la evolución de oxígeno de la estirpe ΔF/S+S+F+TrxF dependiendo de la intensidad luminosa. ................................... 198 Figura 69. Análisis del estado redox de la FBPasa cloroplastídica dependiente de luz de la presencia de TrxF1. .............................................................................. 200 Figura 70. Análisis de la reducción de TrxF1 en la estirpe ΔS/F+S+F+TrxF dependiente de la intensidad luminosa. ............................................................... 202 Figura 71. Análisis de la expresión de petRP en respuesta a cobre. ................... 206 Figura 72. Análisis de la degradación de PetR en los mutantes PETR2 y PETR3. ............................................................................................................................ 207 Figura 73. Esquema del mecanismo de regulación PetR/PetP. ........................... 209 Figura 74. Niveles de isaR1 en los mutantes PETR y PETP. .............................. 214 Figura 75. Análisis de la ausencia de la FBPasa FBP/SBPasa en las cianobacterias.. ............................................................................................................................ 217 Figura 76. Regulación por luz de las FBPasas de Synechocystis.. ..................... 223 Figura 77. Resumen de las características de las diferentes enzimas con actividad FBPasa en Synechocystis. .................................................................................. 229 20 21 Abreviaturas 1,3-BPG 1,3-bisfosfoglicerato 2-OGDC 2-oxoglutarato descarboxilasa 2-PG 2-fosfoglicerato 3-PG 3-fosfoglicerato ACO Aconitasa DNA Ácido desoxirribonucleico ADP Adenosina monofosfato Ala (A) Alanina AMP Adenosina difosfato AMS Ácido 4-acetamido-4’-maleidimilestilbeno-2,2’- disulfónico Ap Ampicilina Arg (R) Arginina RNA Ácido ribonucleico RNANC RNA no codificante RNAm RNA mensajero RNAS RNA pequeño Asn (N) Asparragina Asp (D) Ácido aspártico ATP Adenosina trifosfato ATPasa ATP sintasa BCSA Ácido batocuproinedisulfónico BLAST Basic Local Alignment Search Tool BSA Seroalbúmina bovina Chl Clorofila Cm Cloranfenicol CoA Coenzima A CBB Ciclo de Calvin-Benson-Bassham CET Transporte cíclico de electrones Ciclo TCA Ciclo de los ácidos tricarboxílicos Cit b6f Citocromo b6f Cit c6 Citocromo c6 CS Citrato sintasa COX Citocromo c oxidasa Cyd Quinol oxidasa bd Cys (C) Cisteína Da Dalton DCMU 3-(3,4-dichlorofenil)-1,1-dimetilurea DDOR Flavin disulfuro oxidoreductasa DEPC Dietilpirocarbonato DHAP Dihidroxiacetona fosfato DNAsa Desoxirribonucleasa dNTPs Desoxirribonucleótidos DTT Ditiotreitol DO Densidad óptica E Einstein e− Electrón E-4-P Eritrosa-4-fosfato 22 ED Entner-Doudoroff EDA KDPG aldolasa EDD 6-fosfogluconato dehidratasa EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EMP Embden-Meyerhof-PRNAas EMSA Ensayo de retardo de la movilidad electroforética Eno Enolasa F-1,6-BP Fructosa 1,6-bisfosfato F-6-P Fructosa-6-fosfato FAD Flavín adenín dinucleótido FBPasa Fructosa-1,6-bisfosfatasa FBP/SBPasa Fructosa-1,6-bisfosfatasa/Sedoheptulosa-1,7bisfosfatasa Fd Feredoxina Fe Hierro FFTR Ferredoxina flavin-tiorredoxina reductasa FNR Ferredoxina:NADP+ reductasa FTR Ferredoxina-tiorredoxina reductasa FUM Fumarasa g Gramo G-6-P Glucosa-6-fosfato G-3-P Gliceraldehído 3-fosfato GADPH Gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa GK Gluconato quinasa Gly (G) Glicina GDH Glutamato deshidrogenasa GND 6-fosfogluconato deshidrogenasa Gln (Q) Glutamina Glu (E) Glutamato GR Glutatión reductasa GRX Glutarredoxinas GSI Glutamina sintetasa tipo I GSSG Glutatión disulfuro GST Glutatión S-transferasa h Hora H2O2 Peróxido de hidrógeno His (H) Histidina HK Hexoquinasa IDH Isocitrato deshidrogenassa IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido Ile (I) Isoleucina Kb Kilobase KDPG 2-ceto-3-deoxi-6-fosfogluconato Km Kanamicina l Litro LB Medio Luria-Bertani LET Transporte lineal de electrones Leu (L) Leucina Lys (K) Lisina m Metro M Molar MDH Malato deshidrogenasa 23 Met (M) Metionina Mg Magnesio min Minuto MM(PEG24) Metil-PEG-Maleimida Mn Manganeso N Normal NAD+/ NADH Nicotinamida adenina dinucleótido oxidado / reducido NADP+/ NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido-fosfato oxidado / reducido NDH-1 NAD(P)H deshidrogenasa tipo I NDH-2 NAD(P)H deshidrogenasa tipo II NEM N-etilmaleimida NTR NAD(P)H tiorredoxina reductasa NTRC Tiorredoxina reductasa dependiente de NADPH tipo C NCBI National Center for Biotechnology Information OCP Proteína carotenoide naranja ORF Open Reading Frame (Marco abierto de lectura) OPP Ruta oxidativa de las pentosas p/p Relación peso/peso p/v Relación peso/volumen PBP Ficobiliproteínas PBS Ficobilisomas PC Plastocianina PCC Colección de cultivos del Instituto Pasteur PCR Reacción en cadena de la polimerasa PDB Protein Data Bank PDH Piruvato deshidrogenasa PEP Fosfoenolpiruvato PFK Fosfofructoquinasa PGI Fosfoglucoisomerasa PGK Fosfoglicerato quinasa PGM Fosfoglicerato mutasa Phe (P) Fenilalanina PK Piruvato quinasa PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo poly (dI-dC) Ácido poli(desoxiinosínicodesoxicitidílico) PQ PRK Plastoquinonina Fosforibuloquinasa Pro (P) Prolina PSI Fotosistema I PSII Fotosistema II R5P Ribosa-5-fosfato RBS Ribosome binding site RNAsa Ribonucleasa ROS Especies reactivas de oxígeno RPE Ribulosa-5-fosfato epimerasa RPI Ribulosa-5-fosfato isomerasa rpm Revoluciones por minuto Ru-1,5-BP Ribulosa-1,5-bisfosfato 24 Ru-5-P Ribulosa-1-fosfato Rubisco Ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa / oxigenasa s Segundos S-1,7-BP Sedoheptulosa-1,7-bisfosfato S-7-P Sedoheptulosa-7-fosfato SDH Succinato deshidrogenasa SDS Dodecilsulfato sódico Ser (S) Serina Sp Espectinomicina sp. Especie SSADH Succinil semialdehido deshidrogenasa SSPE Tampón compuesto por una mezcla de NaCl, fosfato de sodio y EDTA St Estreptomicina TA Transaldolasa TCA Ácido tricloroacético TEMED N, N, N', N'-tetra-metiletilendiamida Thr (T) Treonina TK Transcetolasa TPI Triosafosfato isomerasa TR Tiorredoxina reductasa Tricina N-tris(hidroximetil)metilglicina Tris Tris(hidroximetil)aminometano Trp (W) Triptófano Trx Tiorredoxina Tyr (Y) Tirosina U Unidad de actividad enzimática UTR Región no traducida del gen (untranslated region) v/v Relación volumen/volumen Val Valina WT X-gal Estirpe silvestre 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido Xu-5-P Xilulosa-5-fosfato 25 Introducción 32 2005; Watanabe y Ikeuchi, 2013) junto con los carotenoides y la clorofila a, aumentando por tanto el espectro de luz que son capaces de captar las cianobacterias respecto a otros organismos fotosintéticos (Zakar et al., 2016). Los PBS se encuentran formados por el ensamblaje de ficobiliproteínas, las cuales cuentan con cromóforos (ficobilinas) y esto hace que sean capaces de captar la energía luminosa, y proteínas que actúan como enlace con los fotosistemas. Los ficobilisomas captan fotones en el intervalo de entre 500-670 nm mientras que la clorofila a de los fotosistemas lo hace en el intervalo de 440 a 680 nm. Dentro de los diferentes tipos de ficobiliproteínas podemos encontrar ficocianinas, aloficocianinas y ficoeritrinas (Li et al., 2019). Estos ficobilisomas se disponen en forma de varilla generada por discos aplanados, transportando así la energía al fotosistema. Además de esta función en la captación de energía los ficobilisomas también actúan como un mecanismo de fotoprotección (Zakar et al., 2016). Estos complejos, dependiendo de los requerimientos energéticos, se cree que pueden rotar al unirse al PSII o PSI (Joshua y Mullineaux, 2004). Otra proteína relacionada con la cadena de transporte fotosíntetico es la proteína carotenoide naranja (OCP), que está implicada en la regulación de la transferencia de energía entre ficobilisomas y fotosistemas. La OCP contiene un caroteno que puede cambiar su conformación entre su forma inactiva (OCPO) y su forma activa (OCPR). De forma que a altas intensidades luminosas pasa a un estado activo y esto le permite actuar disipando el exceso de energía que llega al PSII en forma de calor (Kirilovsky y Kerfeld, 2013; Kirilovsky, 2015). 2.1.2. El transporte lineal de electrones (LET). Los tres macrocomplejos implicados en el transporte lineal de electrones son: PSII, citocromo b6f y PSI. En este proceso se produce la liberación de O2 a la atmósfera y la generación de poder reductor y energía. En el LET los fotones de luz son tomados por los PBS que excitan a las clorofilas de los centros de reacción de los fotosistemas (P680 y P700, PSII y PSI respectivamente). De forma que desde el centro de reacción del PSII se cede un electrón a la quinona A (QA) reduciéndola y esta a su vez se lo cede a QB que, tras haber aceptado dos electrones, capta dos protones para formar PQH2. El PSII es un homodímero constituido por las proteínas D1 y D2, las subunidades antena CP47 y CP43, 12 subunidades pequeñas intrínsecas de membrana (PsbE, PsbF, PsbH-M, PsbN, PsbX, PsbY, PsbZ, y PsbYcf12) y 3 extrínsecas (PsbO, PsbU, y PsbV) (Gao et al., 2018). Cuando el PSII cede el electrón se oxida TyrZ de su subunidad D1 y esta a su vez toma un electrón del cluster de manganeso (Mn4CaO5) que une con dos moléculas de agua produciendo su oxidación y, por tanto, rotura. De forma que por cada rotura de una molécula de agua se liberan 2 protones en el lumen tilacoidal y dos electrones (Vinyard et al., 2013). Tras reducirse PQH2 difunde por la membrana hasta el complejo citocromo b6f donde la quinona se oxida y deprotona, liberándose estos al lumen del tilacoide. De forma que un electrón es transportado desde el citocromo b6f (a través de la proteína de Rieske y el citocromo f) a la Pc/Cit c6 del lumen. El otro electrón es transferido por el grupo hemo al lado citosólico donde se reduce PQ hacia PQH, el proceso se repetirá para generar PQH2 y se realizará el ciclo de las quinonas. En general 2 PQH2 se oxidan en el lado luminal liberándose dos PQ, dos electrones que son transferidos a Pc/Cit c6 y 4 protones en el lumen (Kurisu et al., 33 2003). En cianobacterias dependiendo de la disponibilidad de cobre en el medio se expresará PC o, en caso de que no hubiera cobre, Cit c6. Ambos actúan con la misma eficiencia para reducir al PSI in vivo (Durán et al., 2004). Se cree que la plastocianina, una cuproproteína, surge como un transportador de electrones alternativo al citocromo c6 debido a la disminución de la biodisponibilidad de hierro originada por la liberación de oxígeno fotosintética (Ochiai, 1983; Crichton y Pierre, 2001). El PSI en cianobacterias se presenta en forma trimérica generalmente, aunque se han determinado casos en lo que aparece en forma dio tetramérica (Rögner et al., 1990; Malavath et al., 2018; Kato et al., 2019). Está formado por 12 polipéptidos y, de estos, PsaA y PsaB están unidos a P700 (principal donador), al principal aceptor que son dos moléculas de clorofila accesoria y a la filoquinona. Es está última quien transporta los electrones de la clorofila a los centros sulfoférricos Fx, FA y FB y a Fx. Por otro lado, PsaC, PsaD y PsaE están en el lado citosólico. PsaC contiene los centros de hierro-azufre FA y FB, PsaF está relacionada con la interacción con Pc/Cit c6 (en el lumen) y PsaL está encargada de la trimerización de los monómeros. Tras este proceso, por el que P700 excitado cede los electrones a la cadena de transportadores, estos electrones llegarán a la ferredoxina (que se encuentra en la parte citosólica de la membrana) por las proteínas sulfoférricas y de esta a la ferredoxina-NADP+ reductasa (FNR) que reducirá NADP+ a NADPH, generándose poder reductor (Karapetyan et al., 1999). El centro de reacción del PSI recupera su estado tras aceptar los electrones desde Pc/Cit c6 (Figura 2). Durante todo este proceso se ha producido un gradiente electroquímico a través de la membrana tilacoidal por los protones generados de la fotólisis del agua y del ciclo de las quinonas entre PQH2 y el citocromo b6f, este gradiente será empleado por la ATPasa para la síntesis de ATP. De forma que se necesitan 4 protones para sintetizar una molécula de ATP (Van Walraven et al., 1996) y por cada ciclo de fotólisis de obtiene un gradiente de 6 protones . 2.1.3. El transporte cíclico de electrones (CET). El transporte cíclico de electrones da lugar a la generación de ATP por un gradiente electroquímico como en el caso del LET pero sin la generación de poder reductor. Así, en el transporte lineal se genera una relación media de 1,33 moléculas de ATP y 1,5 moléculas de NADPH (Bendall y Manasse, 1995). Puesto que en el Ciclo de Calvin-Benson-Bassham se emplean 1,5 moléculas de ATP por cada molécula de NADPH y que el ATP es necesario para otros procesos celulares la generación de energía de forma independiente a la del poder reductor es necesaria para los organismos fotosintéticos (Nawrocki et al., 2019). Este ciclo se genera mediante el regreso de los electrones del PSI al pool de plastoquinonas generándose también un potencial en la membrana por el bombeo de protones, aunque ya no participa la fotolisis del agua (Nawrocki et al., 2019). En este proceso participa el complejo NDH1 que transfiere los electrones al pool de plastoquinonas (Peltier et al., 2016; Laughlin et al., 2019). Para que este proceso sea posible de forma cíclica NDH-1 recibe los electrones de la ferredoxina , que a su vez los recibe de PSI (He et al., 2015; Laughlin et al., 2019). 2.2. Fijación de carbono en cianobacterias por el ciclo de CalvinBenson-Bassham (CBB). 34 En los organismos fotosintéticos se emplea el poder reductor en forma de NADPH y la energía en forma de ATP generados en la cadena de transporte electrónico para la fijación de carbono inorgánico. Este proceso se realiza a través del ciclo de CBB, de forma que este es un ciclo cuya regulación tiene gran importancia para el metabolismo de los organismos fotosintéticos. El CBB comienza con la actividad RuBisCO (formada por sus dos subunidades RbcL, que contiene el centro activo, y RbcS, una subunidad regulatorio (Andersson y Backlund, 2008). Esta enzima cataliza la entrada del CO2 atmosférico en un esqueleto carbonado orgánico, la ribulosa-1,5-bisfosfato (Ru-1,5-BP). De forma general este proceso es realizado en el carboxisoma y de él se generan dos moléculas de 3-fosfoglicerato (3-PG), constituyendo la etapa de fijación del carbono. La mayor o menor presencia de carboxisomas depende de la concentración de bicarbonato y CO2 en el medio, disminuyendo esta cuando uno u otro son altos. Tras esto se da una etapa de reducción donde desde las moléculas generadas se originan 2 moléculas de gliceraldehído-3-fosfato (G-3-P) con un gasto de poder reductor y ATP. Posteriormente continua la fase de regeneración que tiene como fin la regeneración de Ru-1,5-BP (Figura 4). En esta, una molécula de G-3-P y otra de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) se unen mediante una aldolasa generando fructosa-1, 6-bisfosfato que será desfosforilada por una actividad fructosa-1, 6bisfosfatasa hasta fructosa-6-fosfato (F-6-P). La DHAP puede obtenerse a partir del G-3-P mediante la enzima triosa fosfato isomerasa. Esta F-6-P y G-3-P, mediante una enzima transcetolasa, generarán una molécula de 4 átomos de carbono (eritrosa-4-fosfato o E-4-P) y una de cinco (xilulosa-5-fosfato o Xu-5-P). Posteriormente, E-4-P se combina mediante una actividad aldolasa con otra de las moléculas DHAP generadas para dar lugar a la sedoheptulosa-1,7-bisfosfato (S-1, 7-BP) que será desfosforilada por una actividad sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa a sedoheptulosa-7-fosfato (S-7-P). La sedoheptulosa generada, mediante una actividad transcetolasa, se combina con un G-3-P, para generar Xu-5-P y ribosa-5fosfato (R-5-P), ambas pentosas darán lugar a la ribulosa-5-fosfato (Ru-5-P) mediante una actividad epimerasa e isomerasa respectivamente. Finalmente, con gasto de ATP, esta Ru-5-P se fosforila mediante la enzima fosforribuloquinasa hasta Ru-1,5-BP. De esta forma se completa un ciclo cerrado donde por cada 3 moléculas de CO2 fijadas se genera de forma neta una triosa fosfato (Raines, 2003; Michelet et al., 2013). De forma que por cada tres moléculas de CO2 fijadas se produce en esta etapa el gasto de 9 ATP y 6 NADPH, generando 6 moléculas de G-3-P donde una de ellas no continua el ciclo y se libera para la síntesis de compuestos de interés. Este carbono fijado se emplea para la síntesis de diversos compuestos (ácidos grasos, aminoácidos, ácidos nucleicos…) y, normalmente, parte del mismo se convierte en glucógeno para su almacenaje. De esta forma puede utilizarse esta carbono cuando fuera necesario o en oscuridad (Ball y Morell, 2003). La síntesis de glucógeno comienza en el citoplasma con la síntesis de ADP-glucosa desde glucosa-1-fosfato con gasto de ATP; la enzima que cataliza esta reacción es la ADPglucosa pirofosforilasa. Posteriormente la glucógeno sintasa (de la que Synechocystis cuenta con dos isoformas) une los residuos de glucosa, que toma en forma de ADP-glucosa, con enlace glucosídico α-1,4 sobre glucógeno existente (Yoo et al., 2014). Finalmente la enzima ramificante añade los enlaces α-1,6. Cuando la movilización del glucógeno es necesaria intervienen las enzimas GlgP, que cataliza la liberación de glucosa-1-fosfato, y GlgX, que es la enzima desramificante (Fu y 35 Xu, 2006). El glucógeno presenta un patrón de síntesis por el día y degradación durante la noche o en periodos de oscuridad (Sarkar et al., 2019). Además para mantener el equilibrio carbono/nitrógeno su acumulación se relacionará con la limitación de nitrógeno en cianobacterias, situación en la que se acumula a una alta concentración (Gründel et al., 2012). Figura 4. Ciclo de Calvin-Benson-Bassham en cianobacterias. Esquema del ciclo de fijación de carbono en Synechocystis. F-6-P: fructosa-6-fosfato; F-1,6-BP: fructosa1,6-bisfosfato; DHAP: dihidroxiacetona fosfato; G-3-P: gliceraldehido-3-fosfato; 1,3BPG: 1,3-bisfosfoglicerato; 3-PG: 3fosfoglicerato; E-4-P: eritrosa-4-fosfato; Xu-5-P: xilulosa-5-fosfato;S-1,7-BP: sedoheptulosa-1,7bisfosfato; S-7-P: sedoheptulosa-7-fosfato; R-5-P: ribosa-5-fosfato;Ru-5-P: ribulosa-5-fosfato; Ru-1,5-BP: ribulosa-1,5-bisfosfato. En cianobacterias la actividad FBPasa y SBPasa corresponden a la misma enzima. En plantas se ha determinado que varias de las enzimas que participan en este ciclo presentan regulación luz/oscuridad, es decir, sus actividades enzimáticas actúan durante las horas de luz debido a su regulación por reducción-oxidación (regulación redox). Estas enzimas reguladas serían la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa / oxigenasa (RuBisCO), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), 36 fosforribuloquinasa (PRK), fructosa-1,6-bisfosfatasa (FBPasa) y sedoheptulosa-1,7bisfosfatasa (SBPasa) (Michelet et al., 2013). 2.2.1. Sistemas de concentración de carbono. La enzima RuBisCO además de su actividad carboxilasa presenta también actividad oxigenasa, de forma que en lugar de la reacción anterior por la que fija el carbono esta enzima es capaz de sintetizar la incorporación de oxígeno a la ribulosa-1,5bisfosfato, generándose 2-fosfoglicolato. Este compuesto de 2C es tóxico pues inhibe a la triosa fosfato isomerasa y a la fosfofructoquinasa (Anderson, 1971; Kelly y Latzko, 1976). Synechocystis cuenta con 3 rutas que constituyen el metabolismo de fotorrespiración de este compuesto para eliminarlo y evitar su toxicidad, de forma que además del ciclo C2 característico de las plantas (donde se regenera 3-PG con pérdida de carbono) (Bauwe et al., 2010) también posee la ruta del glicerato bacteriana y además, es capaz de descarboxilar el glioxilato por la vía del oxalacetato (Eisenhut et al., 2008). Para evitar estos procesos y la consiguiente pérdida de carbono la fijación de este se realiza en el carboxisoma, compartimento icosaédrico donde se encuentra la RuBisCO. El sistema proteico de concentración de CO2, o CCM, está compuesto por bombas de bicarbonato asociadas a la membrana y el carboxisoma. Es este último, además de la RuBisCO se encuentra la anhidrasa carbónica, favoreciendo así un ambiente donde la concentración de CO2 sea alta y se dificulte la actividad oxigenasa de la RuBisCO (Kupriyanova et al., 2013; Kerfeld y Melnicki, 2016; Long et al., 2016). Los genes que codifican para las proteínas que encapsulan a la RuBisCO están presentes en el operón ccm (Whitehead et al., 2014; Kerfeld y Melnicki, 2016). El Cinorgánico citosólico acumulado por los sistemas de entrada del mismo (transportadores) difunde al carboxisoma donde la anhidrasa carbónica, cerca de la RuBisCO, unida a la estructura del carboxisoma (Cai et al., 2016) transforma HCO3en CO2, tras esto la enzima realiza la reacción de carboxilación (Figura 4). Además la estructura del carboxisoma impide la salida del CO2, favoreciendo así su concentración (Cai et al., 2009). Respecto a los transportadores de carbono en la membrana podemos distinguir: SbtA (Shibata et al., 2002), BicA (Price et al., 2004), NDH-14 (Burnap et al., 2015), NDH-13 (Maeda et al., 2002; Prommeenate et al., 2004; Burnap et al., 2015) y BCT1, codificado por el operón cmpABCD (Omata et al., 1999). 2.3. Respiración en cianobacterias. En las cianobacterias los procesos de fotosíntesis y respiración están localizado en el mismo compartimento celular, en la misma membrana y compartiendo sistemas de transporte electrónico como son el pool de plastoquinonas, el citocromo b6f y Pc/Cit c6 (Scherer, 1990; Peschek et al., 2004). Serán NDH-1, NDH-2 (mediante la oxidación de NAD(P)H) y SDH (succinato deshidrogenasa, mediante la transformación de succinato a fumarato) quienes van a reducir en oscuridad al pool de plastoquinonas mediante el proceso respiratorio (Figura 3), puesto que la inactivación de cualquiera de estos complejos se relaciona con disminución de la capacidad respiratoria (Cooley y Vermaas, 2001; Peltier et al., 2016). Se especula que FNRs, una de las dos isoformas de FNR en Synechocystis que es capaz de oxidar el NADPH y se acumula durante el crecimiento heterotrófico, podría participar 37 en la respiración mediante la reducción de la ferredoxina que le donaría estos electrones a NDH-1 (Thomas et al., 2006; Korn, 2010; Laughlin et al., 2019) (Figura 3). La respiración ayuda a mantener el gradiente de protones que permitirá la producción de ATP y el poder reductor se obtendrá mediante las reacciones catabólicas. 2.3.1. Oxidasas terminales respiratorias. Hay dos tipos principales de oxidasas terminales respiratorias: una representada por la superfamilia de oxidasas tipo citocromo c (COX) y la otra por las del tipo quinol bd (Cyd), siendo las primeras capaces de bombear protones al lumen tilacoidal. Las COX además de realizar el bombeo de protones de forma acoplada reducen el oxígeno para generar agua. Estas oxidasas son capaces de usar al sistema Pc/Cit c6 como donador de electrones y se caracterizan por contar con dos centros hemo redox donde uno de ellos participa en la organización del centro catalítico binuclear que consiste en un ion hierro (del grupo hemo) y un ion cobre localizados de forma cercana. El otro grupo hemo será quien tome los electrones del donador (Lockau, 1981; Michel et al., 1998). Las Cyd se caracterizan por ser capaces de reducir moléculas de oxígeno para generar agua y tienen como donadores de electrones a los grupos quinol (Abramson et al., 2000), de forma que obtienen los electrones necesarios para reducir al oxígeno del pool de plastoquinonas reducidas. En su centro de reacción cuentan con dos grupos hemo y no participa en el bombeo de protones para generar energía (Musser et al., 1993). Ambas oxidasas terminales participan en la protección frente a especies reactivas de oxígeno del sistema fotosintético sirviendo como fuente de salida de electrones en condiciones donde haya un exceso de estos (Ermakova et al., 2016; Shimakawa y Miyake, 2018). Sin embargo la afinidad de estas por el oxígeno es diferente, así la KM para el mismo en Synechocystis de COX es de 1,0 μM mientras que el de Cyd es de 0,35 μM (Pils y Schmetterer, 2006). 3. Metabolismo del carbono en cianobacterias Además del proceso de fijación de carbono que se realiza durante el ciclo de CBB hay otros procesos donde están implicados esqueletos carbonados en cianobacterias como son la ruta de las pentosas fosfato (OPP), la ruta EmbdenMeyerhof-Parnas (EMP), la ruta de Entner-Doudoroff (ED) o el ciclo de Krebs (Figura 5). De forma general en condiciones de crecimiento fotoautotrófico con suficiente luz estas rutas apenas contribuyen al flujo metabólico total de las cianobacterias (Yang et al., 2002). 38 Figura 5. Esquema de las rutas de asimilación del carbono en Synechocystis. De color amarillo está representada la ruta Embden-Meyerhof-Parnas, de color azul la ruta oxidativa de las pentosas fosfato, de verde la ruta de Entner-Doudoroff y de gris el ciclo de Krebs. PDH: piruvato deshidrogenasa; CS: citrato sintasa; ACO: aconitasa; IDH: isocitrato deshidrogenasa; 2OGDC: 2-oxoglutarato descarboxilasa; GABD: succinato semialdehido deshidrogenasa; FUM: fumarasa; MDH: malato deshidrogenasa; PK: piruvato quinasa; Eno: enolasa; PGM: fosfoglicerato mutasa; PGK: fosfoglicerato quinasa; GADPH: gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa; TPI: triosas fosfato isomerasa; PFK: fosfofructoquinasa; PGI: fosfoglucoisomerasa; HK: hexoquinasa; GDH: glucosa deshidrogenasa; GK: gluconato quinasa; EDD: 6-fosfogluconato dehidratasa; KDPG: 2-ceto-3-deoxi-6-fosfogluconato; EDA: KDPG aldolasa; ZWF: engloba las actividades de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y la gluconolactonasa; GND: 6-fosfogluconato deshidrogenasa; RPE: ribulosa-5-fosfato epimerasa; RPI: ribulosa-5-fosfato isomerasa; TK: transcetolasa; TA: transaldolasa; FBPasa: fructosa-1,6bisfosfatasa;G-6-P: glucosa-6-fosfato; F-6-P: fructosa-6-fosfato; F-1,6-BP: fructosa-1,6bisfosfato; DHAP: dihidroxiacetona fosfato; G-3-P: gliceraldehido-3-fosfato; 1,3-BPG: 1,3- 39 bisfosfoglicerato; 3-PG: 3-fosfoglicerato; 2-PG: 2-fosfoglicerato; PEP: fosfoenolpiruvato; Ru-5P: ribulosa-5-fosfato; R-5-P: ribosa-5-fosfato; Xu-5-P: xilulosa-5-fosfato; S-7-P: sedoheptulosa-7fosfato; E-4-P: eritrosa-4-fosfato. 3.1. Ruta oxidativa de las pentosas fosfato (OPP) La ruta oxidativa de las pentosas fosfato es una vía catabólica de asimilación de glucosa donde se generan diversos intermediarios que pueden emplearse para la síntesis de otros compuestos, entre otros, los ácidos nucleicos. Durante esta ruta se genera poder reductor en forma de NADPH de forma que puede ser empleada para regenerar este poder reductor cuando sea necesario en condiciones de oscuridad donde la fotosíntesis no sea funcional (Kruger y Von Schaewen, 2003). Podemos diferenciar principalmente dos fases en la misma: fase oxidativa donde se sintetiza NADPH y la fase de interconversion donde se generan los distintos esqueletos carbonados. En la primera fase estarían implicadas la glucosa.6-fosfato deshidrogenasa (G-6-PDH), la gluconolactonasa y la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6-PGDH); al final de estas transformaciones se obtiene 2 NADPH y ribulosa-5-fosfato, perdiéndose un carbono como CO2. La otra fase comprende una serie de reacciones reversibles donde finalmente se obtiene G-3-P y fructosa6-fosfato (F-6-P) (Figura 5). En caso de que se necesitase regenerar poder reductor empleando enzimas de la gluconeogénesis como la fructosa-1,6-bisfosfatasa (FBPasa) podría generarse un ciclo continuo de la OPP con pérdida de carbono (Kruger y Von Schaewen, 2003). Se ha demostrado que la primera enzima de esta ruta, G-6-PDH es susceptible tanto de regulación redox como de regulación alostérica. Así, en Nostoc punctiforme ATCC 29133 y Anabaena, se ha determinado que esta proteína presenta un regulador alostérico positivo, OpcA (proteína conservada y específica de cianobacterias), que al interaccionar con la misma potencia su actividad. Además, al estar presente permite la acción de las tiorredoxinas sobre la G-6-PDH, enzima que es activa cuando está oxidada. Por tanto el efecto de las tiorredoxinas en esta proteína de la ruta produce una inactivación de la misma, aunque este efecto solo se ha demostrado en presencia de OpcA (Hagen y Meeks, 2001; Mihara et al., 2018). Además, se ha demostrado que esta enzima, a pesar de poder emplear tanto NADP+ como NAD+, presenta una mayor afinidad por NADP+, como ocurre con la 6-PGDH (Ito y Osanai, 2020). Además, tanto NADPH como NADH son inhibidores de las mismas, lo que favorece su inactivación cuando se realiza la fotosíntesis (Ito y Osanai, 2020). De estas enzimas también destaca su regulación por diferentes metabolitos, en su mayoría intermediarios del ciclo TCA. Así, la actividad de la G-6-PDH está regulada negativamente por fosfoenolpiruvato, oxalacetato, citrato y 2-oxoglutarato. Por otro lado, la actividad de 6-PGDH se regula negativamente por oxalacetato, citrato y 2oxoglutarato (Ito y Osanai, 2020). La relación entre esta vía y el ciclo de Krebs no solo se establece mediante estos compuestos sino que los mutantes carentes de la primera enzima de la ruta al pasar de condiciones de luz a condiciones de oscuridad acumulan intermediarios del ciclo de Krebs, por lo que ambas podrían ser rutas alternativas en oscuridad para la metabolización de glucosa (Maruyama et al., 2019). Estudios metabolómicos demuestran que esta vía en cianobacterias no estaría activa en condiciones de fotoautotrofía (Yang et al., 2002). Se especula que su 40 principal función se realizaría en condiciones de crecimiento fotomixotrófico o heterotrofía. Aun así, solo se ha observado un flujo significativo por esta vía a una intensidad luminosa igual o menor de 40 μmol fotones·m-2 ·s-1 (Nakajima et al., 2014, 2017; You et al., 2014), incluso en presencia de glucosa. Todo esto, unido al hecho de que el mutante de la primera enzima de la ruta no es capaz de crecer en baja luz y mixotrofía o heterotrofía parece indicar que esta ruta actuaria en condiciones de baja luz, donde se produciría la degradación del glucógeno para generar NADPH (Wan et al., 2017; Ueda et al., 2018; Makowka et al., 2020). Por otro lado, algunos estudios señalan a esta ruta, junto con ED, como la encargada de metabolizar el carbono acumulado en forma de glucógeno tras periodos de falta de nitrógeno en el medio (Doello et al., 2018). Además, esta ruta es necesaria en la transición de oscuridad a luz para degradar el glucógeno y permitir así la obtención de los esqueletos carbonados necesarios para la fotosíntesis (Shinde et al., 2020). 3.2. Ruta de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) o glucólisis. La ruta de Embden-Meyerhof-Parnas es una ruta catabólica en la que se oxida glucosa para obtener poder reductor (NAD(P)H) y energía (ATP). De forma general esta ruta está relacionada con la respiración. En ella podemos distinguir dos fases: una primera donde se transforma la molécula de glucosa en dos moléculas de triosa fosfato con gasto de dos moléculas de ATP y otra segunda fase donde se obtienen cuatro moléculas de ATP y dos moléculas de NAD(P)H; de forma que el balance total de la ruta es de positivo para la generación de energía y poder reductor (Figura 5) (Romano y Conway, 1996). En esta ruta todas las enzimas son bidireccionales con respecto a las de la gluconeogénesis excepto la hexoquinasa y la fosfofructoquinasa (PFK) que se intercambian por la glucosa-6-fosfatasa y por la FBPasa (Bennett et al., 2010). Se ha demostrado que esta vía no se encuentra presente en todas las cianobacterias. Algunas cianobacterias como las del género Prochlorococcus carecen de la enzima PFK de forma que no sería posible realizar esta ruta para ellas (Chen et al., 2016). De forma que sugieren que sería la ruta de Entner-Doudoroff la principal encargada, junto con la OPP, de metabolizar la glucosa en estas especies. Puesto que estas estirpes suelen habitar en zonas con una menor presencia de nutrientes la ruta ED podría estar más favorecida termodinámicamente (Chen et al., 2016). Sin embargo, algunos estudios señalan que esta ruta podría tener una alta implicación en el metabolismo de la glucosa en crecimiento mixotrófico para la generación de intermediarios de la fijación del carbono (Ge et al., 2018). Además, análisis de flujo en estas condiciones, tanto en alta como en baja luz, demuestran la existencia de un flujo por la ruta EMP; especialmente en alta luz (Wan et al., 2017; Ueda et al., 2018). El hecho de que tanto esta ruta como la ruta OPP compartan intermediarios con el ciclo CBB hace posible que además de la generación de energía y poder reductor provean al ciclo CBB de los metabolitos necesarios para que, en condiciones de luz (tras la noche), el ciclo de fijación de carbono funcione adecuadamente o se reactive. De esta forma el ciclo de CBB dispondría de los esqueletos carbonado necesario para fijar CO2 atmosférico. La degradación del glucógeno por tanto proveerá de 41 energía y de los esqueletos carbonados (Shimakawa et al., 2014; Sarkar et al., 2019; Makowka et al., 2020). 3.3. Ruta de Entner-Doudoroff (ED). La ruta de Entner-Doudoroff es una ruta catabólica que transforma glucosa en piruvato. Esta ruta comparte un intermediario con la ruta oxidativa de las pentosas fosfato, el 6-fosfoguconato, a pesar de que en este caso este intermediario se obtiene desde la glucosa mediante la actuación de dos enzimas (Figura 5). Finalmente, de esta vía se obtiene piruvato y G-3-P a partir de 2-ceto-3-desoxi-6fosfogluconato. El G-3-P puede seguir por la vía glucolítica para obtener poder reductor o ATP, obteniéndose una molécula de ATP y 2 de NADPH (Conway, 1992). Recientemente se ha descubierto que esta ruta también está presente en cianobacterias y plantas (Chen et al., 2016). Estudios recientes han relacionado esta vía con la degradación del glucógeno en fotoautotrofía o la movilización del mismo tras largos periodos de déficit de nitrógeno, situación donde se acumula el glucógeno (Doello et al., 2018; Makowka et al., 2020). De tal forma que se cree que estaría implicada en la utilización de glucógeno en cianobacterias estando operativo el ciclo de CBB, pues al no compartir intermediarios con el mismo se favorecería que actuara esta ruta y no una de las anteriores. 3.4. Ciclo de Krebs o Ciclo de los Ácidos Tricarboxílicos (TCA). Este ciclo en cianobacterias presenta diferencias con respecto a otras bacterias como Escherichia coli (E. coli) o en células eucariotas. A diferencia de estos organismos las cianobacterias carecen de la enzima 2-oxoglutarato deshidrogenasa que cataliza uno de los pasos del ciclo, la conversión de 2-oxoglutarato en succinilCoA. A pesar de esto algunas cianobacterias, como Synechocystis, cuentan con los genes que codifican para las enzimas 2-oxoglutarato descarboxilasa (2-OGDC) y succinato semialdehido deshidrogenasa (GABD), donde la primera transforma 2oxoglutarato en succinil semialdehido y la segunda transforma este en succinato (Figura 5) (Zhang y Bryant, 2011; Ito et al., 2019). A diferencia de de la 2oxoglutarato deshidrogenasa del ciclo canónico, donde se produce una molécula de GTP y otra de NADH en este solo se generaría una molécula de NADPH; además, como en el ciclo de Krebs canónico se generan dos moléculas más de NADPH y una de FADH2 (Zhang y Bryant, 2011). Sin embargo, el flujo a través de este cierre de ciclo es bajo y, por tanto, en cianobacterias es, principalmente, un ciclo abierto. Una de las diferencias del ciclo de Krebs en cianobacterias, con respecto al ciclo de Krebs en organismos heterótrofos, es que se ha demostrado que la enzima encargada de generar succinato, la isocitrato deshidrogenasa y las deshidrogenasas del ciclo oxidativo de las pentosas fosfato, unen preferentemente NADP+ con respecto a NAD+ como coenzima (Ito y Osanai, 2020). Las cianobacterias también presentan la enzima succinil-CoA deshidrogenasa, enzima reversible que cataliza la conversión de succinil-CoA en succinato, ya que es requerida para sintetizar ciertos aminoácidos (Zhang et al., 2016). 48 de Mg2+ a su sitio de unión, cofactor que se requiere para la catálisis enzimática. Sin embargo, la regulación de esta enzima es más compleja e incluye otras modificaciones, cambios de la concentración de metabolitos en el estroma del cloroplasto y regulación por interacción con otras proteínas. Esta enzima, a diferencia de la forma citosólica no es regulable por AMP. El paso de luz a oscuridad y viceversa provoca cambios en el estroma del cloroplasto, lugar donde se encuentra esta enzima. Durante el día al estar funcional la cadena de transporte electrónico cloroplastídica se produce un bombeo de protones al lumen tilacoidal, de forma que el pH en el estroma aumenta de 7, en oscuridad, a 8, en condiciones luminosas. Por otro lado, este bombeo de protones conlleva un aumento en la concentración de Mg2+ en el estroma para mantener el equilibrio de cargas positivas. Este catión es un cofactor de la enzima y en condiciones luminosas la concentración aumenta de 2 mM a 5 mM aproximadamente (Huber, 1978; Kaiser y Bassham, 1979). Además, en presencia de luz se produce la activación por reducción mediada por el sistema FTR-Trx. La FBPasa cloroplastídica es una de las dianas de las tiorredoxinas, principalmente de las tiorredoxinas f en plantas (Raines, 2003; Yoshida et al., 2015; Gutle et al., 2016; Naranjo et al., 2016; Fernández-Trijueque et al., 2019). In vitro es también susceptible de activación por Trx m pero en ningún caso por Trx x (Gutle et al., 2016; Ojeda et al., 2018a). Además se ha determinado que tiorredoxinas tipo m de cianobacterias serían capaces de reducir a esta proteína (Wagner y Follmann, 1978). Por último, se ha demostrado in vitro que esta proteína puede sufrir la Snitrosilación de una de sus cisteínas implicadas en la formación del puente disulfuro cuando está reducida, afectando a la capacidad catalítica de la enzima en condiciones de luz (Serrato et al., 2018). Se cree que, en condiciones de oscuridad, las peroxirredoxinas actuarían oxidando a las tiorredoxinas, que podrían obtener su poder reductor de nuevo de las proteínas que en luz eran sus dianas, lo que desencadenaría la pérdida de su estado reducido en oscuridad (Ojeda et al., 2018b). Recientemente se ha demostrado la existencia de una FBPasa cloroplastídica distinta a la canónica. El grado de similitud con las otras dos isoformas es menor al 50% y carece del bucle de cisteínas presente en el resto de FBPasas cloroplastídicas. Esta enzima presenta actividad FBPasa y se encuentra en el estroma del cloroplasto (solo de plantas superiores), aunque no presenta regulación redox ya que su actividad no varía en presencia de agentes oxidantes como H2O2 o reductores como el DTT (Serrato et al., 2009). 5.2. La actividad SBPasa en plantas. La SBPasa cloroplastídica es una proteína estromática que presenta una forma homodimérica donde cada subunidad presenta una masa molecular de 35 kDa. Esta enzima también presenta regulación redox y, a diferencia de la FBPasa, en su estado oxidado es totalmente inactiva, e igual que la FBPasa presenta un bucle con tres cisteínas cercanas siendo dos de estas las encargadas de constituir la forma oxidada inactiva, además de necesitar Mg como cofactor y tener mayor actividad a pH básico (Figura 8) (Dunford et al., 1998b, 1998a; Raines, 2003; Wang et al., 2011). Esta enzima también presenta actividad FBPasa, aunque en una proporción 49 aproximada de 1/100 con respecto a su actividad SBPasa. De forma que todas las SBPasas presentan cierta actividad FBPasa (Gutle et al., 2016). En cuanto al sistema de regulación de esta enzima se ha determinado in vivo que puede ser regulada negativamente por S-nitrosilación al igual que la FBPasa cloroplastídica (Hu et al., 2015). Además se ha demostrado in vitro e in vivo la regulación de esta proteína fundamentalmente por la Trx f de plantas y en menor medida por la Trx m (Yoshida et al., 2015; Gutle et al., 2016). Por tanto la regulación de esta enzima también estaría sujeta a las condiciones lumínicas ambientales como en el caso anterior (Figura 8). Se ha demostrado que la disminución de su expresión genera una bajada en los niveles de sacarosa y almidón así como de la capacidad fotosintética (Strand et al., 2000; Lawson et al., 2006), mientras que su sobreexpresión aumenta el rendimiento de los cultivos y su capacidad fotosintética (Lefebvre et al., 2005; Driever et al., 2017). 5.3. Las actividades FBPasa y SBPasa en cianobacterias. A diferencia de lo que ocurre en plantas superiores donde hay dos enzimas cloroplastídicas, una con cada actividad, en cianobacterias las actividades fructosa1,6-bisfosfatasa y sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa están catalizadas por una única enzima. Sin embargo, algunas cianobacterias también presentan una segunda proteína con actividad fructosa-1,6-bifosfatasa exclusivamente (Udvardy et al., 1982; Tamoi et al., 1998). Synechocystis presenta ambas isoformas de la FBPasa, una enzima FBP/SBPasa codificada por el gen slr2094 y una FBPasa codificada por el gen slr0952. Generalmente las cianobacterias que presentan ambas enzimas, como Synechocystis sp. PCC 6803, Anabaena sp. PCC 7120 y Plectonema boryanum tienen una alta expresión de la enzima bifuncional (FBP/SBPasa) y una baja expresión de la enzima simple (FBPasa) (Tamoi et al., 1998; Guo et al., 2014). Sin embargo, hay algunas cianobacterias que cuentan con una expresión similar de ambas enzimas como son Synechococcus leopoliensis (Gerbling et al., 1985) y Synechococcus sp. PCC 7942 (Tamoi et al., 1996). Puesto que en ninguna cianobacteria es posible encontrar una proteína con actividad SBPasa exclusivamente será la enzima dual quien realice esta actividad en el ciclo de CBB. 5.3.1. La enzima FBPasa en Synechocystis. Esta proteína muestra similitud con las FBPasa eucariota citosólica (Tamoi et al., 1996). La enzima es un homotetrámero donde cada subunidad tiene una masa molecular de 38 kDa (Tamoi et al., 1996). La máxima actividad FBPasa de esta Figura 8. Regulación de la enzima SBPasa de plantas. Esquema de la regulación por luz/oscuridad de la SBPasa cloroplastídica. En luz el estroma se basifica y aumenta la concentración de magnesio, además de actuar las tiorredoxinas, lo que favorece su actividad. La enzima presenta una cisteína susceptible de S-glutationilación. El cofactor de la enzima se representa en celeste. 50 enzima con respecto a la enzima dual se estima que es del 50% (Tamoi et al., 1996). Se determinó que su sobreexpresión en cloroplastos provocaba un aumento en el crecimiento y en la fijación de carbono de las plantas, tal como ocurre con la sobreexpresión de la FBPasa cloroplastídica (Tamoi et al., 2006). Sin embargo esta proteína no presenta regulación por AMP (Tamoi et al., 1996). Estudios realizados con esta enzima han determinado que presenta regulación redox, pero contraria a la descrita para la FBPasa cloroplastídica. La actividad de esta proteína al reducirse disminuye mientras que al oxidarse aumenta (Gómez Romero, 2015). Esta enzima cuenta con tres cisteínas cercanas entre sí en las posiciones 102, 109 y 119 y necesita magnesio como cofactor, lo que demuestra similitud con la FBPasa cloroplastídica. De estos tres residuos dos son los encargados de formar un puente disulfuro (Figura 9) (Gómez Romero, 2015). La regulación in vivo de esta proteína, sin embargo, no ha sido objeto de estudio. 5.3.2. La enzima FBP/SBPasa en Synechocystis. Esta proteína es un homotetrámero donde cada uno de los monómero que la componen tiene un peso molecular de 35 kD, por lo que tiene un peso molecular ligeramente inferior a la FBPasa (Tamoi et al., 1996). Estudios iniciales determinaron que esta enzima presentaba regulación redox pero posteriormente otros análisis realizados señalarían que carecía de esta regulación ya que no era sensible a bajas cantidades de H2O2 como sí ocurre con la FBPasa cloroplastídica (Gerbling et al., 1986; Tamoi et al., 1996). Sin embargo posteriormente se determinó que no solo era sensible a oxidación sino que presenta la regulación redox característica de las enzimas implicadas en el ciclo de CBB, de forma que al reducirse por un reductor exógeno como el DTT se activa y al oxidarse disminuye su actividad (Miyagawa et al., 2001; García-Cañas, 2015). Además también presenta una inhibición de su actividad debida a bajas concentraciones de AMP, que actuaría como un inhibidor alostérico negativo de la enzima (Daie, 1993; Tamoi et al., 1996, 1998; Feng et al., 2013). Esta proteína es activada por Mg2+ y Mn2+, ya que estos cationes actúan como cofactores de la enzima (Figura 9) (Sun et al., 2012). Estructuralmente muestra gran similitud con la FBPasa citosólica ya que en ella podemos distinguir los mismos dos dominios que en la de organismos eucariotas: presenta un dominio de unión a sustrato, que a diferencia del de la enzima citosólica no se encuentra en la interfase entre los monómeros sino en la parte exterior, y uno de unión a su regulador alostérico, el AMP. Este último dominio se encuentra en el centro de tetrámero, algo que también difiere al de la FBPasa citosólica. De forma que su similitud se debe más a la conformación similar que a la localización de las estructuras importantes en la misma (Feng et al., 2013). Se cree que esta proteína también presenta dos estados, uno R o activo y uno T o inactivo. Del mismo modo que en la FBPasa citosólica el AMP es capaz de unirse a su estado tetramérico inactivo o dimérico inactivo (ya que se cree que su formación se debe a la unión de dos homodímeros iguales) y estabilizarlo, consiguiendo por tanto una disminución de su actividad enzimática. Serán las condiciones reductoras y la presencia de Mg (o Mn) quienes favorecerán la adopción del estado R o tetramérico activo (Figura 9) (Feng et al., 2013). Dependiendo de su estado redox, es decir de si se encuentra oxidada o reducida, se formarán unos u otros oligómeros debido a las diferentes 51 conformaciones que puede adoptar, pudiendo presentarse en forma dimérica y tetramérica (Gerbling et al., 1985; García-Cañas, 2015). Figura 9. Regulación y estructura de las enzimas FBPasa y FBP/SBPasa de Synechocystis. (A) Regulación del homotetrámero FBPasa de cianobacteria por oxidación-reducción. La enzima presenta 3 cisteínas y el puente disulfuro entre dos de ellas permite el paso a estado activo El cofactor de la enzima aparece representado en celeste. (B) Esquema de la FBP/SBPasa de cianobacteria. La enzima presenta sitios de unión a fructosa-1,6-bifosfato y AMP. El cofactor de la enzima aparece representado en celeste. (C) Regulación de la FBP/SBPasa de cianobacteria. Se cree que la interacción de FBP/SBPasa con AMP, DTT y Mg2+ provoca cambios estructurales que provocan cambios en la actividad de la misma. En relación a los residuos implicados en su regulación redox hay discrepancias entre unos grupos y otros. Esto se debe a que, a diferencia de las enzimas de plantas o la otra FBPasa cianobacteriana donde el número de cisteínas es limitado, esta enzima presenta un número mayor de cisteínas. Por un lado el grupo de investigación que determinó su estructura por cristalografía realizó los mutantes puntuales de las diferentes cisteínas y determino que serían, en Synechocystis, los residuos C75 y C99 los implicados en la formación del puente disulfuro que estabiliza la conformación inactiva (Feng et al., 2013). Sin embargo, posteriormente se analizó la distancia, en la estructura, entre uno y otro residuo. De esta forma se determinó que estas dos cisteínas, en la estructura inactiva, estarían lejos una con respecto a la otra, por lo que proponen a los residuos C75 y C84 como aquellos cercanos entre si (Cotton et al., 2015). Estudios preliminares sobre estas cisteínas determinaron que la sustitución C75S o C84S no producía una activación constante de la enzima (García-Cañas, 2016). Por tanto, el puente disulfuro no podría solo deberse a una interacción C75-C84 o C75-C99. Por otro lado, estudios proteómicos in vivo apuntan a que las cisteínas implicadas serían los residuos C75 y C235 (Guo et al., 2014). Además, estudios realizados en Synechococcus sp. PCC 6301 sugerían que las tiorredoxinas podían reducir a esta proteína (Schmidt, 1981). Esta proteína es esencial para el crecimiento fotoautotrófico, su eliminación impide el crecimiento en condiciones distintas a la mixotrofía o fotoheterotrofía (Yan y Xu, 52 2008; García-Cañas, 2015). La expresión de esta enzima dual en plantas dio lugar a un aumento en la producción y crecimiento de las mismas, incrementándose su capacidad fotosintética y de asimilación de CO2 (Miyagawa et al., 2001; Ogawa et al., 2015). Por otro lado la sobreexpresión de la enzima dual en diferentes estirpes de cianobacterias genera organismos con una mejora de la capacidad fotosintética (García-Cañas, 2016; Porcellinis et al., 2018). Lo que pone de manifiesto su importancia en el metabolismo fotosintético. Estudios filogenéticos han determinado que esta proteína deriva de una FBPasa anterior a las actuales de plantas, que también dio lugar a estas. Se cree que esta FBPasa anterior, ante la necesidad de una actividad SBPasa para fijar carbono al surgir el ciclo de CBB, adquirió una mutación donde su centro activo se amplió para alojar a la sedoheptulosa-1,7-bisfosfato (Jiang et al., 2012b; Gutle et al., 2016). Por lo que, aunque la cianobacteria que dio origen a los cloroplastos presumiblemente era capaz de fijar carbono, la FBP/SBPasa fue sustituida en plantas por 2 proteínas de actividades SBPasa y FBPasa. De forma que la separación de estas dos actividades en enzimas distintas debe suponer alguna ventaja selectiva en plantas. 6. Regulación génica en cianobacteria. Para conseguir que las proteínas y genes se sinteticen y expresen cuando las condiciones ambientales lo requieran las bacterias presentan diferentes niveles de regulación. Esta regulación puede observarse a nivel transcripcional, postranscripcional, traduccional o postraduccional con la degradación de proteínas. 6.1. Regulación transcripcional. Tradicionalmente los elementos dianas de la expresión génica son los promotores. En estos elementos cianobacterias y bacterias presentan diferencias, de forma que en cianobacterias la caja -10 está muy conservada pero la región -35 no (Vijayan et al., 2011). Se cree que esto podría deberse a que la región -35 se divide en diferentes subclases que sí estarían conservadas, en lugar de una general (Vogel et al., 2003). Los promotores en cianobacterias pueden dividirse en 3 grupos en base a su secuencia de DNA. Los tipo I que contienen un elemento -10 consenso 5’-TATAAT-3’ y -35 de 5’-TTGACA-3’. Los tipo II que carecen de elemento -35 pero contienen sitios de reconocimiento de activadores transcripcionales como el de glnB que contiene un sitio de reconocimiento de NtcA. Los tipo III que no tienen secuencias consenso para ninguno de los dos motivos y suelen pertenecer a genes de respuesta estrés y cuya expresión se estimula por la unión de los factores sigma tipo III (Camsund y Lindblad, 2014). La RNA polimerasa también es diferente en cianobacterias y bacterias. Así, en bacterias las subunidades que la componen suelen ser α2ββ’ω codificadas por rpoA, rpoB, rpoC, y rpoZ. Mientras que en cianobacteria rpoC está dividido en dos subunidades, la subunidad N-terminal γ (rpoC1) y la C-terminal β’ (rpoC2) (Xie et al., 1989; Minakhin et al., 2001). Otra diferencia que presentan son los factores sigma, proteínas implicadas en la unión de la RNA polimerasa con los promotores para iniciar la transcripción. En bacterias podemos encontrar σ70 y σ54 a diferencia de cianobacterias donde solo se encuentran los primeros (Merrick, 1993; Imamura y Asayama, 2009). La familia de factores σ70 se pueden dividir en tres grupos, en relación con los promotores que 53 reconocen. El grupo 1, formado por σA, es el grupo principal y se encarga de la transcripción de genes a un nivel basal que se expresan de forma constante. El grupo 2 que son factores sigma no esenciales y que responden a estímulos ambientales como σD, σC, σB o σE. El grupo 3 presentan una estructura alternativa y también responden a estrés siendo σF, σH, σG o σI. De forma general los promotores pueden ser constitutivos o inducibles, dependiendo de si el gen cuya expresión controlan siempre se expresa o su expresión cambia en respuesta a un estímulo. Dependiendo del promotor la expresión del gen puede ser más o menos fuerte, puede tener una expresión basal que aumente en una determinada circunstancia y puede variar el rango dinámico (solo en el caso de ser inducible) (Marin et al., 2004; Zavřel et al., 2017). Existen promotores constitutivos con diferentes niveles de expresión en cianobacteria, así PcpcB o PpsbA, que codifican para la cadena β de la ficocianina y el gen que da lugar a la proteína D1 del fotosistema II respectivamente (Johnson et al., 1988; Mohamed y Jansson, 1989), son promotores fuertes. Existen promotores inducibles que responden a estímulos tan diversos como la intensidad luminosa (Lindberg et al., 2010), diferentes metales (cobre, níquel, hierro, arsénico, zinc…) (Rutherford et al., 1999; García-Domínguez et al., 2000a; López-Maury et al., 2002, 2003; Foster et al., 2012; Giner-Lamia et al., 2014) o cambios nutricionales (carbono, azufre, hierro, nitrógeno…) (Herrero et al., 2001; Omata et al., 2001; Wang et al., 2004; Flores et al., 2005; Woodger et al., 2007; Ishii y Hihara, 2008; Nishimura et al., 2008; Daley et al., 2012). Generalmente estos promotores se encuentran bajo el control de factores transcripcionales específicos. Ejemplos de este tipo de regulación es la respuesta a metales como el níquel o el arsénico en el medio. Respecto a la regulación por níquel en presencia del metal el regulador transcripcional NrsR (regulador de la familia PhoB/OmpR) actúa sobre nrsBACD que codifican para los transportadores de este metal al periplasma o al exterior celular, además de actuar sobre nrsRS activándose a sí mismo. NrsS es una histidina quinasa con un dominio periplásmico que es capaz de detectar el Ni2+ y fosforilar a NrsR permitiéndole pasar a un estado activo, actuando entonces como un activador de la transcripción. nrsD además presenta otro nivel de regulación mediante un promotor interno previo a él en el operón. Este promotor está regulado por InrS, un factor de transcripción de la familia CsoR que se une a este promotor reprimiendo su expresión. Cuando hay níquel disponible este interacciona con InrS e impide la represión (García-Domínguez et al., 2000a; López-Maury et al., 2002; Foster et al., 2012; Giner-Lamia et al., 2014). La resistencia a arsénico está mediada por el operón arsBHC, que incluye a un transportador de arsenito (arsB), una reductasa (arsH) cuya función en esta resistencia no está bien establecida y una arseniato reductasa (arsC). Este operón está regulado por ArsR, siendo este un represor del mismo. Por tanto cuando hay arsenito en el citoplasma este se une a ArsR permitiendo que el represor no actúe sobre el promotor de estos genes y por tanto favoreciendo su expresión y la resistencia al metal (López-Maury et al., 2003). En cuanto a la regulación transcripcional por los niveles de nutrientes destaca la respuesta a cambio en la disponibilidad de nitrógeno mediada por NtcA, un regulador de la familia CRP muy conservado en las cianobacterias que incluso controla la fijación de nitrógeno en cianobacterias diazotróficas mediante la unión como un dímero a su secuencia consenso GTAN8TAC del promotor de sus genes diana 54 (Vega-Palas et al., 1992; Herrero et al., 2001). Cuando no hay nitrógeno en el medio NtcA actúa como un represor y como un activador. Reprime a, entre otros, gifA y gifB que codifican para los factores inactivantes de la glutamina sintetasa IF7 e IF17 (García-Domínguez et al., 2000b) y como activador en genes como glnA, glnB y ntcB (Muro-Pastor et al., 2005). Además, en estas condiciones el 2-oxoglutarato favorece la unión al DNA; en la regulación por NtcA además intervienen otras proteínas como son PII y PipX (Forcada-Nadal et al., 2018). 6.2. Regulación post-transcripcional. La regulación a nivel post-transcripcional puede deberse a cambios a nivel de la traducción del RNAm, cambios en su estabilidad o cambios a nivel de proteína. 6.2.1. Regulación por riboswitches. Son elementos reguladores en cis del RNAm que generalmente se localiza en la 5′ región que no se traduce (UTR). En respuesta a determinados metabolitos o moléculas señal se genera un cambio conformacional que hacen que haya un intercambio entre una forma ON y OFF de la traducción de este RNA. El aptámero de los riboswitches es la parte que se une al ligando mientras que la plataforma de expresión es la que interacciona con la maquinaria de expresión (Garst et al., 2011). La regulación puede realizarse a nivel de traducción alterando el sitio de unión con el ribosoma, aunque también pueden realizarlo bloqueando o permitiendo la formación de una horquilla en el terminador. 6.2.2. Regulación por RNAs. La regulación por RNA pequeño está muy extendida en cianobacterias y participa en muchos procesos de gran importancia. Un ejemplo de esto es la aclimatación a deficiencia de hierro en cianobacteria mediante la regulación de isiA por el RNA no codificante IsrR. IsrR se transcribe de forma constitutiva y se acumula en todas las condiciones excepto ante bajo hierro. De forma que cuando este RNA está presente se une por una zona de complementariedad con isiA y ambos se degradan, impidiendo por tanto su traducción (Dühring et al., 2006). IsiA es una proteína inducida por estrés asociado a bajo hierro, alta luz o estrés redox cuya expresión sufre regulación por otros RNAs. Ambos RNA presentan otros niveles de regulación como su expresión regulada por RpaB con resultado opuesto en uno y otro (activador en isiA y represor en isrR). Además isiA está bajo el control de un regulador transcripcional, Fur, el cual reprime la expresión de este RNA cuando las concentraciones de hierro son altas permitiendo que se acumule en altas cantidades en condiciones de falta de hierro (Krynicka et al., 2019) . De forma que los RNAnc pueden, como en el ejemplo descrito, regular procesos muy diferentes mediante efectos en la transcripción y a su vez estar regulados por otros procesos ya señalados. 7. Regulación por proteólisis en bacterias. 55 La regulación por proteólisis es un mecanismo extendido en bacterias, que controla la respuesta a estrés o la esporulación, entre otros procesos. El principal regulador transcripcional en respuesta a estrés en bacteria es el factor sigma RpoS (σS). Sus niveles son bajos pero, antes diferentes tipos de estrés, su transcripción, traducción y proteólisis se ven alteradas (Lange y Hengge-Aronis, 1994). Así en respuesta a bajo carbono, nitrógeno, fósforo, bajos niveles de aminoácidos, hiperosmolaridad, bajada del pH o altas temperaturas se inhibe su degradación por proteólisis (Hengge-Aronis, 2002). La degradación de este factor depende principalmente de una proteasa ATP-dependiente, ClpXP, y de RssB que lo marca como diana para la proteasa. RssB es un regulador cuya forma fosforilada tiene gran afinidad por RpoS (Schweder et al., 1996; Becker et al., 1999; Klauck et al., 2001), una vez unido a esta proteína RpoS es reconocido por ClpXP y se degrada. Tras transferir RpoS a ClpXP RssB se libera del complejo. El reconocimiento de RpoS por ClpXP solo es posible cuando previamente se ha unido a RssB. El cambio en la degradación de RpoS está controlado, además, por IraP que impide la correcta unión con RssB y la fosforlación de RssB, en condiciones de falta de nutrientes (Hengge, 2008). Otro ejemplo es el factor transcripcional ComK de Bacillus subtilis relacionado con la esporulación que presenta una regulación postranscripcional relacionada con la proteólisis. En esta intervienen MecA, ClpC y ComS. Al unirse MecA a ComK y ClpC, se formará una estructura que favorecerá la degregación de ComK por la proteasa ClpCP (Turgay et al., 1997, 1998; Persuh et al., 1999). ComS es capaz de unirse a MecA por el mismo dominio por el que ComK se une a este, desplazar por tanto la unión y degradación de ComK. Cuando hay una alta densidad de células aumentan los niveles de ComS y esto desplaza la unión de MecA con ComK, protegiéndolo de la proteólisis (Turgay et al., 1997, 1998; Persuh et al., 1999). Por tanto, la proteólisis en bacterias es un mecanismo extendido para controlar la expresión de genes o procesos regulatorios. 7.1. Regulación por proteasas tipo M48 y reguladores transcripcionales BlaI/MecI en bacterias. Estos mecanismos de regulación controlan, entre otros procesos, la expresión de genes de resistencia a diferentes antibióticos en bacterias. Dando lugar, por tanto, a la adaptación de estas a los mismos y a la generación de bacterias resistentes. Así las proteasas tipo M48, BlaR1 y MecR1, actúan conjuntamente con los reguladores transcripcionales BlaI y MecI para regular la expresión de blaZ y mecA respectivamente (Carretto et al., 2002; Llarrull et al., 2011). Siendo estos dos últimos genes los encargados de conferir resistencia a penicilina y meticilina respectivamente. Estos genes codifican para la PC1 β-lactamasa y la transpeptidasa PBP2A, que generan resistencia a β-lactámicos. En este sistema de regulación las proteasas actúan como sensores de los diferentes antibióticos, generando una serie de cambios que las activan y actúan sobre sus dianas, los reguladores transcripcionales. Estos reguladores actúan como represores de los genes de resistencia y de ellos mismos, además son intercambiables ya que se unen a la misma secuencia de DNA (Lewis y Dyke, 2000; Carretto et al., 2002; Llarrull et al., 2011). 56 Adiccionalmente, BlaI participa en la respuesta a catelicidina de Staphylococcus aureus, aunque se desconoce la cascada regulatoria que lo permite. Se cree que podría ser mediante la represión de un represor de la respuesta a catelicidina o activándola él mismo (Pence et al., 2015). En cuanto a la función de MecR1 sobre MecI realmente no hay ninguna evidencia directa que determine que la proteasa es capaz de actuar sobre este regulador transcripcional, aunque si existen evidencias indirectas y es lo que está predicho. En la regulación del operon mec también participa MecR2 que mediante su unión con MecI favorece que este sea degradado por proteasas citoplásmicas y por tanto que se exprese el gen de resistencia (Figura 10) (Arêde et al., 2012). 7.1.1. Regulación mediada por proteasas tipo M48. Las metaloproteasas MecR1 y BlaR1 son proteínas transmembrana que cuentan con 4 segmentos transmembrana y un segmento N-terminal extracelular. Ambas proteínas presentan un dominio metaloproteasa N-terminal que comprende los primeros 338 aminoácidos y un dominio C-terminal, a partir del residuo 339, encargado de detectar el antibiótico a través de una estructura periplásmica (Golemi-Kotra et al., 2003; Cha et al., 2007). Además, estas proteínas presentan en el segmento citosólico (en el que se encuentra el centro activo de las proteasas) que une el tercer y cuarto segmento transmembrana. Este dominio contiene el motivo HEXXH (Rawlings y Barrett, 1995), se cree que son estas dos histidinas las encargadas de coordinar con un átomo Zn2+, dado que estas proteasas son dependientes de Zn (Zhang et al., 2001). Los estudios realizados en BlaR1 de Bacillus licheniformis han identificado que el residuo de ácido glutámico conservado en este motivo también está implicado en la coordinación con el átomo de Zn Figura 10. Esquema de la regulación por las proteasas BlaR1 y MecR1 (tipo M48) sobre los reguladores transcripcionales BlaI y MecI. Las metaloproteasas dependientes de zinc ante la presencia de determinados antibióticos se activan provocando la degradación 57 (Berzigotti et al., 2012). La activación de estas proteasas mediante su interacción con el antibiótico todavía es motivo de estudio. Inicialmente se creía que la unión del antibiótico generaría la acilación de un residuo de serina de su dominio sensor y esto induciría una reestructuración que activaría su capacidad catalítica sobre MecI/BlaI. Sin embargo, el cambio no solo se debe a la acilación de dichos residuos, sino que el dominio sensor en ausencia de antibiótico interacciona con el componente L2, constituido por el segmento extracelular que une los segmentos transmembrana 2 y 3. Por tanto el antibiótico, cuando está presente, compite con L2 por unirse al dominio sensor y, puesto que la afinidad por el antibiótico es mayor, el dominio sensor se separa de L2. Esto origina una reestructuración conformacional que da lugar al estado activo (Hanique et al., 2004; Marrero et al., 2006; Straude et al., 2015; Mescola et al., 2019). Se ha demostrado que BlaR1 presenta capacidad autocatalítica, independiente de que se una o no al antibiótico, esta capacidad le permite cortarse a sí misma en el segmento citosólico que une el tercer y cuarto segmento transmembrana. Además de permitir que actúe sobre su proteína diana de forma independiente a la presencia del antibiótico activador. Esta actividad depende de su unión a Zn y es independiente de cualquier otra proteína bacteriana, aunque se especula que podría existir otra proteína implicada en este sistema para hacer que la capacidad proteolítica de BlaR1 aumente en presencia del antibiótico. Se cree que es el residuo de ácido glutámico, quien coordina junto a las histidinas con el átomo de zinc, el encargado de realizar este autocorte. De forma general existe un 10% de expresión del operón bla aun sin la presencia de antibiótico, por lo que se cree que esta capacidad autocatalítica también podría estar implicada en el mantenimiento de un equilibrio entre la síntesis de BlaR1 y su degradación, de forma que aun sin estar activada se autocorte para su degradación permitiendo así la entrada en la membrana de BlaR1 recién sintetizada (Llarrull et al., 2011; Llarrull y Mobashery, 2012). MecR1, a diferencia de BlaR1, no solo presenta 4 segmentos transmembrana, sino que entre el tercero y el cuarto segmento presenta una hélice reentrante con un pequeño segmento asociado a la membrana plasmática. Los extremos que unen a esta hélice con el tercer y cuarto segmento transmembrana son citosólicos. Sería esta hélice donde se encontraría el dominio gluzincina, que incluye al motivo HEXXH, encargado de su actividad metaloproteasa. También para esta proteasa se cree que sería el residuo de ácido glutámico el encargado de promover el autocorte de la misma (Belluzo et al., 2019). En cualquier caso, el sitio de corte autocatalítico de esta proteína y el de BlaR1 lo constituiría la misma secuencia consenso conservada BLysArg/Glu(−)ArgBXXB (donde B se refiere a cualquier residuo hidrofóbico voluminoso) (García-Castellanos et al., 2003). Otra proteasa de la misma familia es la proteasa HtpX de E.coli que está implicada en la eliminación de proteínas mal plegadas citosólicas que puedan afectar al correcto funcionamiento de la célula (Sakoh et al., 2005). Se ha demostrado in vivo que la proteína está implicada en la resistencia a estrés térmico mediante su actividad proteasa (Shimohata et al., 2002; Sakoh et al., 2005; Yoshitani et al., 2019). Al igual que las dos metaloproteasas anteriores esta proteína también presenta 4 dominios transmembrana, los residuos conservados de interacción con Zn y es capaz de catalizar su propio corte. Esta capacidad autocatalítica genera cortes entre los residuos Leu-260-Cys-261 y Cys-261-Ile-262 en el dominio citosólico posterior a la cuarta hélice transmembrana (Sakoh et al., 2005; Yoshitani 64 65 Materiales y Métodos 66 67 1. Organismos y condiciones de cultivo 1.1. Cianobacterias. 1.1.1. Estirpes de cianobacterias utilizadas. En el trabajo aquí presentado se han empleado estirpes mutantes de la cianobacteria Synechocystis, así como de la cianobacteria filamentosa fijadora de nitrógeno Anabaena sp. PCC 7120 (referida como Anabaena). Las estirpes utilizadas y sus características se detallan en la Tabla 1. Tabla 1. Estirpes de cianobacterias utilizadas en este trabajo. Estirpe Genotipo Referencia ORF Mutada Organismo Silvestre (WT) Synechocystis sp. PCC 6803 Synechocystis PETJ petJ:: C.C1 Este trabajo sll1796 Synechocystis PETE petE::C.K1 (Giner-Lamia et al., 2012) sll0199 Synechocystis PETEJ petE::C.K1 petJ::CmR Este trabajo sll0199 sll1796 Synechocystis PETP petP::EryR Este trabajo slr0241 Synechocystis PETR petR::Sp/StR Este trabajo slr0240 Synechocystis PETR2 petR::Sp/StR glnN::PpetR:PetR:NatR Este trabajo slr0240 slr0288 Synechocystis PETR3 petR::Sp/StR glnN::PcpcB:PetR:NatR Este trabajo slr0240 slr0288 Synechocystis SLR0601 slr0601::natR Este trabajo slr0601 Synechocystis PETJP petP::EryR petJ::CmR Este trabajo slr0241 sll1796 Synechocystis PETJR petR::Sp/StR petJ::CmR Este trabajo slr0240 sll1796 Synechocystis PETEP petP::EryR petE::C.K1 Este trabajo slr0241 sll0199 Synechocystis PETER petR::Sp/StR petE::C.K1 Este trabajo slr0240 sll0199 Synechocystis PETRP ΔpetRP::Sp/StR Este trabajo slr0240 slr0241 Synechocystis PETRP+ RP ΔpetRP:: Sp/StR phaAB:petRP::Nat R Este trabajo slr0240 slr0241 slr1993 slr1994 Synechocystis PETRP+ HAHA ΔpetRP::Sp/StR phaAB:petRP_HAHA::Nat R Este trabajo slr0240 slr0241 slr1993 slr1994 Synechocystis PETRP+ M53A ΔpetRP::Sp/StR phaAB:petRP_M53A::Nat R Este trabajo slr0240 slr0241 slr1993 slr1994 Synechocystis PETRP+ M58A ΔpetRP::Sp/StR phaAB:petRP_M58A::Nat R Este trabajo slr0240 slr0241 slr1993 slr1994 Synechocystis 68 Estirpe Genotipo Referencia ORF Mutada Organismo PETRP+ M53AM58 A ΔpetRP::Sp/StR phaAB:petRP_M53AM58A::Nat R Este trabajo slr0240 slr0241 slr1993 slr1994 Synechocystis ΔF slr0952::Sp/StR Huertas Romera, María José slr0952 Synechocystis ΔF/S slr2094::EryR (GarcíaCañas, 2015) slr2094 Synechocystis C75SC84 S nrsD::PcpcB:6His_slr2094_C75S/C84S:N atR Este trabajo slr0796 Synechocystis C99S nrsD::PcpcB: 6His_slr2094_C99S:NatR Este trabajo slr0796 Synechocystis SBPasa nrsD::PcpcB: 6His_AtSBPasa:C.K1 Este trabajo slr0796 Synechocystis FBPasa glnN::PcpcB: 6His_PsFBPasa:NatR Este trabajo slr0288 Synechocystis ΔF/S+S nrsD::PcpcB: 6His_AtSBPasa:C.K1 slr2094::EryR Este trabajo slr0796 slr2094 Synechocystis ΔF/S+F glnN::PcpcB:6His_PsFBPasa:NatR slr2094::EryR Este trabajo slr0288 slr2094 Synechocystis S+F nrsD::PcpcB: 6His_AtSBPasa:C.K1 glnN::PcpcB: 6His_PsFBPasa:NatR: Este trabajo slr0796 slr0288 Synechocystis ΔF+S nrsD::PcpcB: 6His_AtSBPasa:C.K1 slr0952::Sp/StR Este trabajo slr0796 slr0952 Synechocystis ΔF+F glnN::PcpcB: 6His_PsFBPasa:NatR slr0952::Sp/StR Este trabajo slr0288 slr0952 Synechocystis ΔF/S+S+ F nrsD::PcpcB: 6His_AtSBPasa: C.K1 glnN::PcpcB:6His_PsFBPasa:NatR slr2094::EryR Este trabajo slr0796 slr2094 slr0288 Synechocystis ΔF+S+F glnN::PcpcB:6His_PsFBPasa:NatR nrsD::PcpcB: 6His_AtSBPasa:C.K1 slr0952::Sp/StR Este trabajo slr0796 slr0952 slr0288 Synechocystis ΔF/SΔF+ S nrsD::PcpcB: 6His_AtSBPasa:C.K1 slr0952::Sp/StR slr2094::EryR Este trabajo slr0796 slr0952 slr2094 Synechocystis ΔF/SΔF+ F glnN::PcpcB: 6His_PsFBPasa:NatR slr0952::Sp/StR slr2094::EryR Este trabajo slr0288 slr0952 slr2094 Synechocystis ΔF/SΔF+ S+F nrsD::PcpcB: 6His_AtSBPasa:C.K1 glnN::PcpcB:6His_PsFBPasa:NatR slr0952::Sp/StR slr2094::EryR Este trabajo slr0288 slr0796 slr0952 slr2094 Synechocystis TrxF arsBHC::PcpcB:trxF1:Sp/StR (Tejada Gómez, 2018) slr0944, slr0945 slr0946 Synechocystis S+F+ TrxF arsBHC::PcpcB:trxF1:Sp/StR nrsD::PcpcB: 6His_AtSBPasa:C.K1 glnN::PcpcB: 6His_PsFBPasa:NatR Este trabajo slr0944, slr0945 slr0946 slr0796 slr0288 Synechocystis ΔF/S+S+ F+TrxF arsBHC::PcpcB:trxF1:Sp/StR nrsD::PcpcB: 6His_AtSBPasa:C.K1 glnN::PcpcB:6His_PsFBPasa:NatR slr2094::EryR Este trabajo slr0944, slr0945 slr0946 slr0796 slr2094 slr0288 Synechocystis ΔF/SΔF slr0952::Sp/StR slr2094::EryR Este trabajo slr0952 slr2094 Synechocystis 69 Estirpe Genotipo Referencia ORF Mutada Organismo S/F glnN::PcpcB:FBP/SBPasa6His:NatR (GarcíaCañas, 2016) slr0288 Synechocystis Silvestre (WT_An) Anabaena sp. PCC 7120 Anabaena PETR_An ΔpetR Este trabajo arl2569 Anabaena PETP_An petP::NatR Este trabajo arl2570 Anabaena 1.1.2. Medios y condiciones de cultivo. Las distintas estirpes de Synechocystis se cultivaron fotoautotróficamente, mixotróficamente, o heterotróficamente en medio BG11 (Rippka et al., 1979). Este mismo medio suplementado con 12 mM de NaHCO3 se denomina BG11c y para generar las condiciones de mixotrofia y fotoheterotrofía al medio BG11c se añadió glucosa 10 mM (+G) o glucosa 10 mM y DCMU (3-(3,4-dichlorofenil)-1,1-dimetilurea) 50 μM respectivamente; la glucosa fue esterilizada mediante filtración. La composición detallada del medio se indica en la Tabla 2. Tabla 2. Composición del medio BG11 NaNO3 17,8 mM Citrato férrico amónico (17% Fe) 6mg/L MgSO4 0,30 mM MnCl2 9,1 µM CaCl2 0,24 mM Na2-EDTA 2,4 µM Na2CO3 0,20 mM Na2MoO4 1,6 µM K2HPO4 0,20 mM ZnSO4 0,8 µM H3BO3 46 µM CuSO4 0,3 µM Ácido cítrico 28,5 µM CoCl2 0,2 µM En caso de tratarse de cultivos realizados en ausencia de cobre el medio se realizó con agua miliQ, sin la adición de CuSO4 y empleando sales de alto grado de pureza (BG11c-Cu o BG11-Cu). Para el crecimiento de las estirpes generadas resistentes a antibióticos el medio se suplementó con el antibiótico requerido, siendo estos previamente esterilizados por filtración, y se añadieron al medio tras su autoclavado. La concentración de estos se detalla en la Tabla 3. Tabla 3. Concentraciones de antibióticos empleadas en las estirpes de cianobacterias. Antibiótico Concentración Kanamicina (km) 50 µg/ml Espectinomicina (Sp) 5 µg/ml Estreptomicina (St) 5 µg/ml Erytromicina (Ery) 5 µg/ml Nourseotricina (Nat) 50 µg/ml Cloranfenicol (Cm) 20 µg/ml Los cultivos en medio líquido se realizaron en matraces Erlenmeyer de 100 y 250 ml con una quinta parte del volumen del cultivo en agitación de 100 rpm en incubadores orbitales IKA Laborthechnik KS501 en cámaras de cultivo termostatizadas a 30 ºC, 70 con una iluminación continua (50 μmol fotones·m-2 ·s-1 o 10 μmol fotones·m-2·s-1 para los realizados en +G o +G+DCMU) suministrada por paneles de tubos LED. También se realizaron experimentos con cultivos en medio líquido con de burbujeo en aire suplementado con 1% CO2 (v/v), 3% CO2 (v/v) o solo en aire, en frascos de Roux de 750 ml o tubos cilíndricos de 40 a 180 ml en las mismas condiciones de temperatura e iluminación. En los experimentos donde se estudió la respuesta a estrés lumínico se emplearon distintas intensidades: 200 o 550 μmol fotones·m-2·s1. Para el crecimiento de cultivos en medio sólido se empleó medio BG11, BG11-Cu, BG11c o BG11c-Cu estéril suplementado con agar (Bacto-Agar, Difco) al 1% (p/v). La esterilización de los medios y el agar se realizó de forma independiente en autoclave a 120 ºC y más de 1 atmósfera de presión durante 20 minutos, mezclándose posteriormente. En el caso de los cultivos en mixotrofía o fotoheterotrofia se añadió la glucosa y la glucosa junto al DCMU al medio tras esterilizarlo. La mezcla de ambos se vertió en placas de Petri de 50 o 100 ml; los organismos crecieron en las mismas condiciones de iluminación y temperatura que los realizados en medio líquido. Las estirpes usadas para estudiar el intercambio petJ/petE fueron cultivadas en BG11c-Cu con condiciones de burbujeo en aire suplementado con 1% CO2 (v/v) hasta la fase exponencial, añadiéndose posteriormente la cantidad indicada de Cu2+ o de ácido batocuproinedisulfónico (BCSA) 300 µM. Para el estudio comparativo del crecimiento de distintas estirpes en fotoautotrofía, mixotrofía y fotoheterotrofía las estirpes se cultivaron en placas con medio sólido suplementado con glucosa 10 mM y posteriormente en medio líquido con glucosa hasta alcanzar la fase exponencial. Tras alcanzar dicha fase los cultivos se lavaron dos veces con medio BG11c para eliminar la glucosa del medio y se resuspendieron de nuevo en medio BG11c. Estos cultivos posteriormente se dividieron en el número de cultivos requeridos para cada experimento y se añadió glucosa 10 mM y DCMU 50 μM cuando fuese necesario. 1.2. Escherichia coli (E. coli). 1.2.1 Estirpes de E. coli utilizadas. Las estirpes de E. coli utilizadas en este trabajo y sus genotipos correspondientes se recogen en la Tabla 4. Tabla 4. Estirpes de E. coli empleadas en este trabajo. Estirpe Genotipo Referencia DH5α F-, endA1, hsdR17 (mK+,rK- ) supE44, thi-1 recA1 gyrA96 relA1 ΔlacU169 (φ80-lacZΔM15) (Hanahan, 1983) BL21 hsdS gal (λcIts857 ind1 Sam7 nin5 lac UV5-T7 gene1) (Studier y Moffatt, 1986) HB101 FhsdS20 (rB-mB-) leu supE44 ara14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20 xyl-5 mtl-1 recA13 mcrB. pRL623 (Elhai y Wolk, 1988) ED8654 lac-3 o lacY1 supE44 supF58 hsdR514 (rk – mk -) recA56 mcrA1 metB1 lacY galk2 galT22 trpR55 pRL623 (Elhai y Wolk, 1988) 71 1.2.2. Medios y condiciones de cultivo. Para los cultivos de E. coli se empleó el medio de cultivo de Luria-Bertani (LB) (Sambrook et al., 1989) cuya composición está detallada en la Tabla 5. Tabla 5. Composición del medio LB. NaCl 10 g/L Bactotriptona 10 g/L Extracto de levadura 5 g/L Para preparar el medio sólido se añadió agar a una concentración final de 1,5% (p/v). Los medios se autoclavaron como se indica en el apartado 1.1.2. Cuando fue necesario tanto el medio sólido como el medio líquido fueron suplementados con algunos de los compuestos estériles descritos en la Tabla 6. Tabla 6. Compuestos empleados en las estirpes de E. coli. Compuesto Concentración Ampicilina 100 μg/ml Kanamicina 50 μg/ml Estreptomicina 100 μg/ml Espectinomicina 100 μg/ml Nourseotricina 50 μg/ml Cloranfenicol 40 μg/ml X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosido) 0,2 μM IPTG (Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido) 0,5 μM Los cultivos en medio líquido se realizaron en tubos o matraces Erlenmeyer con 1/5 del volumen ocupado por el medio empleado y con agitación orbital continua de 200 rpm en equipos Innova®43 (New Brunswick Scientific). Para algunos de estos cultivos se empleó medio LB y para otros medio mínimo M9 (Neidhardt et al., 1974) suplementado con LB 0,1%. Los cultivos sólidos se realizaron en cajas de Petri estériles; en ambos casos se incubaron a 37 ºC. 1.3. Métodos de recogida de células. Las células de las distintas estirpes de Anabaena se recogieron mediante filtración por vacío empleando filtros de nitrocelulosa de 0,45 μm de diámetro de poro (Millipore HA). En el caso de las células de E. coli y Synechocystis se recogieron por centrifugación empleando una microcentrífuga Eppendorf 5415R a temperatura ambiente o centrifuga refrigerada (tubos de 1,5 o 2 ml), centrífuga Eppendorf 5804R (tubos de 15 o 50 ml) y centrífuga Beckman Avanti J-25 (tubos GSA o SS34). Los lavados para eliminar la glucosa del medio se realizaron a temperatura ambiente. 72 2. Métodos de biología molecular 2.1. Plásmidos y oligonucleótidos utilizados. 2.1.1. Oligonucleótidos. Los oligonucleótidos sintéticos (StabVida) empleados en esta tesis, así como el proceso en que se emplearon se detallan en la Tabla 7. Tabla 7. Oligonucleótidos utilizados en este trabajo. Oligonucleótido (número) Secuencia 5’→3’ Uso copY_KO_F (223) copY_KO_R (224) CCAAGGCAAGATTGTGGTGC CCTGTTCCGGAGACAGCAAT Generación de PETR slr0241_check_F (248) slr0241_check_R (249) CAACAGCGACAGGAGGAGAA AAAGCTCCGGTTGAGAAGGG Generación de PETP copY_KO_F (223) slr0241_check_R (249) CCAAGGCAAGATTGTGGTGC AAAGCTCCGGTTGAGAAGGG Comprobación de la segregación petR, petP y petRP copY_complementation _Fw (256) copY R NotI (234) GACTGAATTCCCCCGGCGATCGCG CCTTTATC ATGCGGCCGAAATACTGTGCATTAT TTCTCC Generación de PETR2 copY_OE_Fw_SalI (258) copY R NotI (234) GTCGACGGAGGTTATCATTATGAG CTGGATTCCCCCC ATGCGGCCGAAATACTGTGCATTAT TTCTCC Generación de PETR3 petEF (172) petER (173) ACAATCCTCGCTGGCCTTCT CGACAACTTTGCCTACCATG Generación de la sonda de petE PETEMF (277) PETEMR (278) TAAGTTAGGGAGATTGTGCCAG TCCAAATTTCTTGGCTCTGTC Comprobación de la segregación petE Prom_petE_NotI (53) petE_ATG_Sal (92) CGGCGGCCGCTGAGGCTGTATAAT CTACG CAGTCGACTTGGCGATTGTATCTAT AGGG Generación de la sonda del promotor petE de los retados oligo F1_new_petJSalI (299) oligo R3 (262) GATCGTCGACCCACTTCACAAACCT AGCCAAT CGCGAAGGTATTATGGGAGGCGGT CCAGGCAAA Generación de la sonda del promotor de petJ de los retados petJF (174) petJR (175) ATTCAACCAAGCTAGCCGAA TCCGCTTGATCAAGCACGTA Generación de la sonda de petJ petJ KO F (235) petJ KO R (236) CGAGACGGCACTGAGGATTT AGTTGGGCTTTACGGGCTAC Comprobación de la segregación de petJ y creación del mutante PETJ slr0601_KO_5F (287) slr0601_KO_5R_HindIII (288) TAGATGGCACTGTGGTGGAA ATCGAAGCTTTTTTCCGGTGACTTG GTTTC Generación del fragmento 5’ de SLR0601 slr0601_KO_3F_HindIII (289) slr0601_KO_3R (290) GGAAAAAAGCTTCGATTCCGTTGG CATGGTAGGTAT CAGGTCAGGATTTTCCCTCA Generación del fragmento 3’ de SLR0601 slr0601_KO_5F (287) slr0601_KO_3R (290) TAGATGGCACTGTGGTGGAA CAGGTCAGGATTTTCCCTCA Comprobación de la segregación de SLR0601 73 Oligonucleótido (número) Secuencia 5’→3’ Uso slr0601F (275) slr0601R (276) GTCTTTAGACTGCAGCAGCC TGATTGCTGTGCTCCATGGG Generación de la sonda de slr0601 slr0601_retardo_F_SalI (295) slr0601_retardo_R_NotI (296) GCCAGTCGACCCCGCAAATGGATT CATTAG ACATGCGGCCGCTTAGTAAATTTCT GCTAAAAG Generación de la sonda del promotor slr0601 de los retardos slr0602F (273) slr0602R (274) GGTGGTTTAACCCTCACTCTA GACGGGCCATCTCATTCATTA Generación de la sonda de slr0602 COPM1F (389) COPM1R (390) AGCATTCCCATGGGTAATCAATTCT GGATAT CATCTCGAGTCACTGACCATACCAG TTTTCATA Generación de la sonda de copM copY_complementation _Fw (256) slr0241_R_XhoI (257) GACTGAATTCCCCCGGCGATCGCG CCTTTATC ATGCGCTCGAGTCACCTGAATAGC TTGAAC Generación del mutante PETRP y del mutante PETRP+RP petP _HXA_HXA_F (283) slr0241_R_XhoI (257) TTAGCTGCTGAAAATGCCGCTCGTT TTTACCGGGAT ATCGCTCGAGTCACCTGAATAGCTT GAAC Generación del fragmento 5’ de PETRP+HAHA petP _HXA_HXA_R (284) copY_complementation _Fw (256) AAAACGAGCGGCATTTTCAGCGGC TAAGACCGCATT GACTGAATTCCCCCGGCGATCGCG CCTTTATC Generación del fragmento 3’ de PETRP+HAHA petP M53A_F (279) slr0241_R_XhoI (257) GCCTGGAAGGGCTGTGGTTGG ATCGCTCGAGTCACCTGAATAGCTT GAAC Generación del fragmento 5’ de PETRP+M53A petP M53A_R (280) copY_complementation _Fw (256) ACAGCCCTTCCAGGCGATCGC GACTGAATTCCCCCGGCGATCGCG CCTTTATC Generación del fragmento 3’ de PETRP+M53A petP M58A_F (281) slr0241_R_XhoI (257) GGTTGGAAGTTTGGCTTCCCC ATCGCTCGAGTCACCTGAATAGCTT GAAC Generación del fragmento 5’ de PETRP+M58A y de PETRP+M53A58A petP M58A_R (282) copY_complementation _Fw (256) GCCAAACTTCCAACCACAGCC GACTGAATTCCCCCGGCGATCGCG CCTTTATC Generación del fragmento 3’ de PETRP+M58A y de PETRP+M53AM58A phaA_checkF (217) phaB_checkR (218) CATCCCAACCCATGGCATTGG TAATACTTCGCCGGTGACATAG Comprobación de la segregación de PETRP+RP, PETRP+HAHA, PETRP+M53A, PETRP+M58A y PETRP+M53AM58A. An_petRKO_5_F_SacI_ BHI (292) An_petRKO_5_R_HindII I (293) AGGAGCTCGGATCCAGTGACTTTC CCACCACCACGC CTGGCAAGCTTACATTTGTTTAGGA CGATAGTCGGG Generación del fragmento 5’ de PETR_An An_petRKO_3_F_HindII I (294) An_petRKO_3_R_NcoI_ XhoI (295) AAACAAATAAGCTTGCCAGGGAGG AACAATGATGC CTCTCGAGCCATGGGTAGAAAATC AACAAGGTGAAAT Generación del fragmento 3’ de PETR_An An_petRKO_3_R_NcoI_ BHI (370) AnPetR_check_5 (371) CTGGATCCCCATGGGTAGAAAATC AACAAGGTGAAAT CCAGTTCTGGTGTGCAGTCAAGG Comprobación de la segregación de PETR_An y de PETP_An AnPetP_5_HIII_F (373) AGCAAGCTTCGCATCCCAAGTTGAT CC Generación del fragmento 5’ de PETP_An 80 Plásmidos Resistencia Características cassette también fue digerido con la misma enzima para poder ligar ambos. pCSRO_AnpetP_Nat_5 Sp/St Nat Plásmido derivado de pSPARK_AnP::nat y pCSRO donde ambos fueron cortados con XhoI-BamHI. De forma que del primer plásmido se obtuvo el inserto que contenía la región amplificada por los oligos 292-295 más la resistencia y esto se ligó con el plásmido pCSRO linealizado. pSPARK_SBPasa_C84S_C75S Ap Plásmido derivado de pSparkII que contiene la región amplificada mediante PCR solapante con los oligos 142-143 (1134 pb). La PCR solapante se realizó usando como base los fragmentos amplificados por PCR sobre pET28_slr2094_C84S usando los pares de oligos 250-143 (847 pb) y 251-142 (316 pb). pET28_SBPasa_C84S_C75S Km Plásmido derivado de pET28 que contiene el resultado de ligar pSPARK_SBPasa_C84S_C75S y pET28 que han sido cortados con NotINheI y posteriormente ligados. pSPARK_SBPasa_C99S Ap Plásmido generado mediante PCR solapante de igual forma a pSPARK_SBPasa_C84S_C75S. La PCR solapante se realizó usando como base los fragmentos amplificados por PCR de pET28_slr2094 usando los pares de oligos 254-143 (774 pb) y 255142 (387 pb). pET28 SBPasa C99S Km Plásmido derivado de pET28 que contiene el resultado de ligar pSPARK_SBPasa_C99S y pET28 que han sido cortados con NotI-NheI y posteriormente ligados. pSPARK_SBPasa_C99S_C75S Ap Plásmido generado mediante PCR solapante de igual forma a pSPARK_SBPasa_C99S. La PCR solapante se realizó usando como base los fragmentos amplificados por PCR sobre pET28_slr2094_C99S usando los pares de oligos 250-143 (847 pb) y 251142 (316 pb). pET28_SBPasa_C99S_C75S Km Plásmido derivado de pET28 que contiene el resultado de ligar pSPARK_SBPasa_C99S_C75S y pET28 que han sido cortados con NotINheI y posteriormente ligados. pSPARK_SBPasa_C84S_C99S Ap Plásmido generado mediante PCR solapante de igual forma a pSPARK_SBPasa_C99S. La PCR solapante se realizó usando como base los fragmentos amplificados por PCR sobre pET28_slr2094_C84S usando los pares de oligos 254-143 (774 pb) y 255142 (387 pb). 81 Plásmidos Resistencia Características pET28_SBPasa_C84S_C99S Km Plásmido derivado de pET28 que contiene el resultado de ligar pSPARK_SBPasa_C84S_C99S y pET28 que han sido cortados con NotINheI. y posteriormente ligados glnN_PcpcB+His_slr2094_C99S Ap Nat Plásmido derivado de pET28_SBPasa_C99S y pglnN_PcpcB_natR que han sido cortados con XbaI-XhoI, generándose del plásmido pET28_SBPasa_C99S un fragmento de 1311 pb que se ligó con el plásmido pglnN_PcpcB_natR. glnN _PcpcB+His_slr2094 C75SC84S Ap Nat Plásmido derivado de pET28_SBPasa_C84S_C75S y pglnN_PcpcB_natR que han sido cortados con XbaI-XhoI, generándose del plásmido pET28_SBPasa_C84S_C75S un fragmento de 1311 pb que se ligó con el plásmido pglnN_PcpcB_natR. pET28_AtSBPasa Km Plásmido derivado de pET28 que contiene la región de 1022 pb amplificada por PCR con los oligos 265264 de DNAc de A. thaliana cedido por el laboratorio de F.J.Cejudo. Tras la amplificación tanto el plásmido como el inserto han sido cortados con XhoI y NdeI, generándose un fragmento de 1008 pb y el plásmido pET28 linealizado. Posteriormente tanto el inserto como el plásmido se ligaron. pNRSD_PcpcB_hisAtSBPsa Ap Km Plásmido derivado de pET28_AtSBPasa y pPlat_nrsD_PcpcB_Kmv3R donde ambos fueron cortados con XbaI y XhoI. De esto se generó un fragmento de 1106 pb del plásmido pET28_AtSBPasa que se ligó con el plásmido pPlat_nrsD_PcpcB_Kmv3R linealizado. pglnN_FBPasa_guisante Ap Nat Plásmido derivado de pAMC100 y pglnN_PcpcB_natR donde ambos fueron cortados con XbaI y XhoI. Del plásmido pAMC100 se generó un fragmento de 1211 pb que se ligó con el plásmido pglnN_PcpcB_natR linealizado. 2. 2. Aislamiento y manipulación del DNA 2.1.2. Aislamiento de DNA plasmídico de E. coli. El aislamiento de DNA plasmídico se realizó siguiendo el método de lisis alcalina descrito en (Sambrook et al., 1989). La lisis alcalina de las células se realizó en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS) y NaOH, eliminando tras esto las proteínas y el DNA cromosómico mediante precipitación con acetato potásico y centrifugación. 82 El DNA plasmídico se precipitó usando etanol absoluto y se resuspendió en agua miliQ. Para eliminar el RNA de las muestras estas fueron tratadas durante 1 hora a 37 ºC con RNAsa A de páncreas bovino (Sigma Aldrich) a una concentración final de 20 μg/ml. Para aislar DNA plasmídico de alta calidad con el fin de secuenciarlo o transformar E. coli se utilizó el sistema comercial GEL/ PCR Purification Kit (FavorPrepTM) siguiendo las instrucciones del fabricante. 2.2.2. Aislamiento de DNA genómico de cianobacterias. El aislamiento de DNA de Synechocystis se realizó siguiendo el método descrito por (Cai y Wolk, 1990), que se basa en la rotura celular con perlas de vidrio. Las células de 50 ml de cultivo se recogen por centrifugación (2000 g, 4ºC y 10 minutos) y se resuspenden en 400 μl de tampón T.1E 1X (Tris HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8). A la suspensión se le añadieron 150 μl de perlas de vidrio de (Sigma Aldrich, 0.250.30 mm de diámetro) estériles, 400 μl de mezcla fenol (pH 8,0):cloroformo 1:1 (v/v) y 20 µl de SDS al 10% (p/v). Tras esto la suspensión celular se sometió a 10 ciclos de 1 minuto de agitación vigorosa y 1 minuto en hielo, posteriormente se centrifugó (16200 g, 4ºC y 15 minutos) y el sobrenadante se sometió a sucesivas extracciones con fenol:cloroformo 1:1 (v/v). En el caso de Anabaena las células se sometieron solamente a 5 ciclos de agitación:hielo. El DNA se precipitó a -20 ºC con 2 volúmenes de etanol absoluto frio y 1/10 de acetato sódico 3M (pH 5,2), tras lo cual se centrifugó a 16200 g a 4 ºC por 15 minutos y se eliminó el sobrenadante. El precipitado se secó y se resuspendió en 50 μl de tampón T.1E 1X. Para eliminar el RNA se trató con RNAsa A de páncreas bovino (Sigma Aldrich) a una concentración final de 20 μg/ml a 37 ºC durante 1 hora. 2.3. Introducción de DNA exógeno en organismos. 2.3.1. Transformación de células de E. coli. 2.3.1.1. Transformación por choque térmico. Las células competentes de la estirpe DH5α fueron adquiridas del Servicio de Cultivos Biológicos del Centro de Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja (cicCartuja). Para transformarlas se mezcló el DNA transformante (con un volumen máximo de 20 µL) con 100 µL de células transformables descongeladas en hielo. La mezcla se incubó 15 minutos en hielo, se sometió a un choque térmico de 1 minuto a 42 ºC y se incubó 1 minuto en hielo. Tras esto a las células se le añadió 1 ml de medio LB y se incubaron a 37 ºC durante 1 hora. A continuación, se sembraron en medio LB sólido con los antibióticos adecuados para seleccionar los transformantes. Cuando se emplearon plásmidos que permitían identificar clones recombinantes gracias a la inactivación por inserción del gen lacZ, al medio se añadió IPTG 0,2 mM y X-gal 40 µg/ml. De tal forma que las colonias recombinantes presentaban color blanco. 83 2.3.1.2. Transformación por electroporación. Las células electroporables de la estirpe BL21 fueron adquiridas del Servicio de Cultivos Biológicos del Centro de Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja (cicCartuja). En el caso de la estirpe HB101 para conseguir estas células electroporables se inoculó 1 L de medio LB con una colonia de la estirpe bacteriana y esta se dejó crecer a 37 ºC en agitación hasta alcanzar una DO600nm de 0,6. Tras esto el crecimiento del cultivo se paró enfriándolo en hielo 10 minutos y posteriormente se centrifugó a 2000 g en frio (4 ºC) durante 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante de estas células y las células precipitadas se resuspendieron en 100 ml de agua miliQ, siendo posteriormente centrifugado a 1600 g empleando la misma temperatura y el mismo tiempo que en el caso anterior. Este paso de lavado con agua miliQ y centrifugación se repitió una vez más. Por último,las células se resuspendieron en 950 µL de agua miliQ a la que se le añadió 200 µL de glicerol y se distribuyeron en alícuotas de 100 µL. Las células electroporables, para su transformación, se mezclaron con el DNA purificado (1-2 µg de DNA en un volumen máximo de 5 µL) con 100 µL de las mismas durante 5 minutos en hielo; tras esto se pasó la mezcla a una cubeta tipo Gene Pulser Cuvette (Bio-Rad) con 2 mm de separación entre electrodos para someterlas a su electroporación en un electroporador MicroPulser (Bio-Rad). Inmediatamente después se añadió 1 ml de LB a las células y se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Finalmente, las células se sembraron en medio LB sólido con el antibiótico adecuado para la selección de transformantes. 2.3.1.3. Expresión de proteínas en E. coli. Para la expresión de proteínas se ha utilizado un sistema de expresión heteróloga en E. coli basado en el promotor del fago T7 (plásmido pET28 de Novagen). Para expresar estas proteínas se empleó la estirpe BL21 ya que portan la secuencia codificante para la RNA polimerasa de este fago bajo el control del promotor lacUV5. Las células se cultivaron a 37 ºC en medio LB con el antibiótico adecuado hasta una DO580mm de 0,3-0,6. A continuación se enfrió el cultivo en hielo y se indujo la expresión del gen con la adición de IPTG (0,1 mM). Los cultivos se mantuvieron 1720 horas a 25 ºC antes de recogerlas según el apartado 1.3. 2.3.2. Transformación de células de Synechocystis. Synecocystis presenta un sistema natural con el que es capaz de incorporar a la célula moléculas de DNA que se encuentran en el medio (Grigorieva y Shestakov, 1982). Si este DNA presenta similitud con alguna secuencia del genoma además se integrará mediante recombinación homóloga. El método de transformación se basa en el método descrito por (Chauvat et al., 1986). Se cultivaron 50 ml de células a los que cada día, durante 3 días, se les renovó el medio BG11c para mantenerlo en fase exponencial. Cuando el cultivo alcanzó una DO750nm de 0,5 las células fueron recogidas por centrifugación (2000 g, 10 minutos) y fueron lavadas 2 veces con medio BG11c estéril para eliminar posibles nucleasas extracelulares. Tras esto se resuspendieron en 1 ml de medio BG11c 84 estéril, distribuyéndose en alícuotas de 200 μl en tubos de poliestireno-cristal de 10 ml de Soria Greiner S.A. junto a 2 μg de DNA purificado. La mezcla de ambos fue incubada durante 2-3 horas a 30 ºC y 50 μE m-2·s-1 de luz, tras lo cual se sembró en plazas de Petri con medio BG11c sólido sobre filtros IMMOBILON-NC 85 mm de WhatmanTM Millipore. Tras 20 horas en condiciones estándar de cultivo los filtros se transfirieron a placas de Petri con el antibiótico adecuado. Cuando se obtuvieron colonias resistentes (tras 7-10 días) estas se pasaron a placas nuevas de BG11c con el antibiótico adecuado y de ser necesario, para favorecer la segregación, se aumentó la concentración del antibiótico. 2.3.3. Transferencia de DNA a Anabaena por conjugación triparental. Este proceso en el que participan dos estirpes de E. coli y Anabaena, se realiza mediante un protocolo de conjugación triparental basado en el uso de un plásmido conjugativo de amplio espectro (Elhai y Wolk, 1988) . Una de las estirpes de E. coli, la estirpe HB101, porta el plásmido cargo (plásmido que se desea transferir a Anabaena, contiene la secuencia génica que quiere introducirse) que cuenta con un origen de transferencia conjugativa denominado sitio bom (basis of mobilization). Además, esta estirpe porta el vector auxiliar pRL623. pRL623 contiene el gen mob que codifica para la endonucleasa que reconoce y corta en el sitio bom de plásmido cargo, esto será esencial para la movilización. Además, pRL623 contiene genes que codifican para metilasas de sitios AvaI, AvaII y AvaIII. (Elhai et al., 1997). Las metilasas protegen al plásmido cargo de las endonucleasas de restricción de Anabaena, evitando que se degrade al introducirse en la cianobacteria. Por otro lado, la otra estirpe de E. coli (ED8654) porta el plásmido conjugativo pRL443 (Elhai y Wolk, 1988) con los genes para movilizar el plásmido cargo hacia Anabaena. Para llevar a cabo la conjugación la estirpe HB101 se transforma con el plásmido cargo siguiendo lo descrito en 2.3.1.1. Tanto este cultivo como la otra estirpe de E. coli se inoculan e incuban a 37 ºC con agitación a 200 rpm durante 12-15 horas. Para que ambas estén en fase exponencial para la conjugación se toman alícuotas de 350 μl de cada cultivo y se inoculan cultivos de 10 ml de medio LB con el antibiótico adecuado que se incuban a 37°C con agitación a 200 rpm durante 2,5 horas. A continuación, las células se recogieron y se lavaron dos veces mediante centrifugación y resuspensión suave con 10 ml de medio LB para eliminar los antibióticos. Tras esto se resuspenden suavemente en 5 ml de medio LB, combinándose ambas estirpes y se recogen por centrifugación para ser resuspendidas en 60 μl de medio. La mezcla se incubó a 30 ºC durante 2,5 horas y tras esto se combinaron con una suspensión celular de Anabaena (10 μg de clorofila) en un volumen máximo de 200-300 μl. La mezcla resultante se extendió sobre un filtro estéril IMMOBILON-NC 85 mm de WhatmanTM Millipore que se encontraba en una caja Petri con medio BG11 suplementado con LB al 5% (v/v) y se incubaron a 30 ºC a baja intensidad luminosa durante 2h; tras esto se incubaron a las condiciones habituales 18 h. Tras este tiempo los filtros se transfirieron a placas de Petri con medio BG11 y tras 24 horas pasaron a placas Petri con el antibiótico adecuado. Cada 2 días los filtros se pasaron a una nueva caja Petri igual a la anterior hasta que el fondo desapareció. Cuando se obtuvieron las colonias estas fueron pasadas a placas de Petri con el antibiótico adecuado. 85 Para la selección de clones mutantes que han incorporado el DNA transferido por doble recombinación con el genoma de Anabaena se utilizó un sistema basado en la letalidad condicional del gen sacB (Cai y Wolk, 1990). El plásmido cargo presenta este gen, el cual codifica para una levansacarasa que en presencia de sacarosa genera un compuesto letal para la cianobacteria. Por tanto, los recombinantes simples donde el vector se ha integrado en el cromosoma mueren en presencia de sacarosa, mientras que aquellos donde se ha producido una doble recombinación pierden el gen sacB. Para favorecer la segregación cromosómica de la mutación, las colonias se cultivan en líquido sin antibiótico y alícuotas de 1 ml se someten a una sonicación suave hasta obtener filamentos de 3-5 células. De estos cultivos sonicados se sembraron diluciones seriadas en placas de Petri con medio BG11 suplementado con NH4Cl 3 mM, sacarosa 5% (p/v) y el antibiótico adecuado de ser necesario. Los dobles recombinantes serán aquellos resistentes a sacarosa, para asegurarlo se ensayaba su resistencia al antibiótico del plásmido cargo (Sp/St) ya que si se hubiera producido la doble recombinación debían ser sensibles al mismo. 2.4. Análisis y cuantificación del DNA. 2.4.1. Cuantificación de la concentración de DNA. Tanto la concentración de DNA plasmídico como de fragmentos amplificados por PCR se determinó mediante un espectrofotómetro Termo Scientific NanoDropTM 1000 siguiendo las instrucciones del fabricante. 2.4.2. Electroforesis en geles de agarosa. Se realizó siguiendo el método descrito en (Sambrook et al., 1989) empleando geles de agarosa al 0.8-1.50 % (p/v) preparados con tampón TBE 0.5X (Tris-borato 45 mM, EDTA 1 mM y pH 8) y añadiendo RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution a la concentración recomendada por el fabricante. A las muestras se les añadió 1/10 del volumen de tampón de carga (azul de bromofenol al 0.25% (p/v), xileno-cianol FF al 0.25 % (p/v) y glicerol al 50% (v/v) en agua destilada). Junto a las mismas, para determinar el tamaño del DNA, se utilizó el marcado 1 Kb Plus DNA Ladder de Invitrogen. La electroforesis tuvo lugar en aparatos Mini-Sub® Cell GT de Bio-Rad y se visualizó con un transiluminador Universal Hood II (Bio-Rad) con luz ultravioleta (302 nm) y un sistema Gel-DocTM XR (Bio-Rad). Finalmente, los geles se fotrografiaron con un equipo Digital Graphic Printer UP D-897 de Sony. 2.4.3. Extracción de DNA de geles de agarosa. Para purificar DNA de los geles de agarosa las bandas se recortaron y el DNA se extrajo mediante un sistema comercial FavorPrep™ MicroElute GEL Purification Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante. Este mismo kit también se empleó para eliminar posibles contaminantes. 2.4.4. Amplificación de fragmentos de DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 86 Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador T-Personal 48 de Biometra empleando un volumen de 25 o 50 μl. De forma que cada reacción contenía 2,5 U o 5 U de VELOCITY DNA Polymersase (Bioline), tampón VELOCITY 1X, MgCl2 1,5 mM, dNTPs a final de 0,2 mM cada uno, 1,5 ng de DNA molde y 50 pmol de cada oligonucleótido específico. El programa de amplificación generalmente consistió en un primer ciclo de desnaturalización a 95 ºC (5 minutos), seguido de entre 30-35 ciclos de reacción y un ciclo final de polimerización a 72 ºC (5 minutos). Cada ciclo de reacción contaba con: 1. Etapa inicial de desnaturalización a 95 ºC (1 minuto). 2. Etapa de renaturalización a una temperatura entre 50-65 ºC ya que depende de la pareja de oligos empleada (1 minuto). 3. Etapa de polimerización a 72 ºC (1 minuto por cada kilobase del fragmento a amplificar). Los fragmentos amplificados se sometieron a electroforesis en geles de agarosa y se purificaron según los apartados 2.4.2. y 2.4.3. Para realizar PCR de colonias, con el fin de determinar la segregación de las diferentes estirpes de cianobacterias, la polimerasa empleada fue DreamTaq DNA polimerasa (ThermoFisher Scientific) (2,5 U) y el tampón utilizado fue tampón 1X DreamTaq. El resto de los procedimientos se ajustan al mismo protocolo anterior. 2.4.4.1. Generación de mutantes dirigidos mediante PCR. En ocasiones esta técnica se empleó para generar mutantes donde la secuencia génica final amplificada difiere en un nucleótido de la secuencia base amplificada. Para esto emplean oligonucleótidos complementarios, de una longitud entre 15 y 20 pb, y complementarios a la región génica donde en su interior se ha alterado un codón/codones de la secuencia original hacia el aminoácido/aminoácidosos que se usará para sustituir a ese aminoácido original. Con estos oligonucleótidos, y los que aparean con la secuencia 5’ y 3’ del gen original, se generan dos fragmentos de PCR que solapan por la región donde se ha alterado la secuencia génica. La reacción y reactivos empleados es igual a la del apartado 2.4.4. Tras la obtención de estos fragmentos se realiza otra PCR donde el molde serían ambos fragmentos (en igual proporción) y los oligonucleótidos empleados serán los de los extremos no solapantes empleados para amplificar cada uno de los fragmentos. El resto de los pasos del proceso serían los mismos que los de una PCR simple. Tanto los oligonucleótidos empleados para esto como los genes alterados durante este trabajo se recogen en la tabla 10. Tabla 10. Genes alterados mediante PCR solapante. Gen y residuo alterado Pares de oligonucleótidos para cada reacción Plásmido amplificado slr2094 C99S Fragmentos generados por la amplificación de 254-142 y 255-142. Posteriormente ambos se unieron mediante su amplificación pET28_slr2094 pET28_slr2094_C84S 87 empleando los oligonucleótidos 142142 slr2094 C75S Fragmentos generados por la amplificación de 250-142 y 251-142. Posteriormente ambos se unieron mediante su amplificación empleando los oligonucleótidos 142142 pET28_slr2094_C84S pET28_slr2094_C99S slr0241 M53A Fragmentos generados por la amplificación de 280-256 y 279-257. Posteriormente ambos se unieron mediante su amplificación empleando los oligonucleótidos 256257 pPHAB_Nat_petRP_WT slr0241 M58A Fragmentos generados por la amplificación de 282-256 y 281-257. Posteriormente ambos se unieron mediante su amplificación empleando los oligonucleótidos 256257 pPHAB_Nat_petRP_WT pPHAB_Nat_petRP_M53A slr0241 H150AH154A Fragmentos generados por la amplificación de 284-256 y 282-257. Posteriormente ambos se unieron mediante su amplificación empleando los oligonucleótidos 256257 pPHAB_Nat_petRP_WT 2.4.5. Manipulación enzimática del DNA. Para la manipulación enzimática del DNA se siguió el método descrito por (Sambrook et al., 1989) empleando endonucleasas de restricción suministradas por Takara y New Englands Biolabs. Los extremos de vectores abiertos por restricción se desfosforilaron para evitar su religación, para esto se incubaron con una fosfatasa alcalina (Roche) en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), MgCl2 10 mM y 2mercaptoetanol 10 mM durante 1 hora a 37 ºC. Tras esto los fragmentos se purificaron siguiendo lo descrito en el apartado 2.4.3. Las ligaciones se llevaron a cabo mediante el uso de la ligasa de DNA del fago T4 (Promega). En todos los casos se siguieron las instrucciones del fabricante. 2.4.6. Secuenciación del DNA. La comprobación de las secuencias de DNA se realizó mediante secuenciación automática en el servicio de secuenciación comercial de StabVida (Portugal). 2.4.7. Ensayos de retardo de la movilidad electroforética (EMSA) de fragmentos de DNA. El DNA sintetizado para los distintos promotores a evaluar se obtuvo siguiendo las indicaciones señalas en la Tabla 7 y el método descrito en el apartado 2.4.4. Tras esto el DNA se dirigió con la enzima de restricción SalI y se marcó con [α-32P]-dCTP (3000 Ci mmol–1) empleando Sequenase v2.0 (Affymetrix). Tras esto la reacción de union de PetR con los promotores se realizó en un volumen final de 20 µL que 88 contenía 4 ng del DNA marcado y 4 μg de DNA de esperma de salmón en 20 mM Tris HCl (pH 8), 150 mM KCl, 10 mM DTT, 1 mM EDTA, 10 % glicerol diferentes cantidades de PetR purificada. La mezcla se incubó durante 30 minutos a temperature ambiente tras lo cual se cargaron en un gel no desnaturalizante de poliacrilamida 6 % (acrilamida:bisacrilamida 30:0,6). La electroforesis se realizó a 4 ºC y 200V en 0,25X TBE. Tras la electroforesis el gel se transfirió a un papel Whatman 3 MM, se secó y autorradiografió empleando un Cyclone Phosphor System (Packard). 2.4.8. Marcaje radioactivo de fragmentos de DNA. Los fragmentos de DNA usados como sondas se obtuvieron por PCR usando los oligonucleótidos descritos en la Tabla 7 y los plásmidos de la Tabla 8 y Tabla 9 adecuados. Los fragmentos se purificaron siguiendo lo descrito en los apartados 2.4.2. y 2.4.3. Para el marcaje se utilizó el sistema comercial Amersham Rediprime™ II DNA Labeling System (GE Healthcare) de extensión de cebadores aleatorios, según las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 100 ng de DNA desnaturalizado se marcó radioactivamente usando 20 µCi de 5’[α-32P]dCTP (3000 mCi/mmol) en un volumen de 50 µL. Tras una incubación de 1 hora a 37 ºC los nucleótidos que no habían sido incorporados se eliminaron con la filtración de las muestras en columnas IllustraTM MicroSpinTM S-200 HR columns (GE Healthcare). La diferencia en el marcaje se estimó mediante la cuantificación de la radioactividad de 1 µL de la muestra con un contador de centelleo Beckman LS 2800. 2.5. Análisis y cuantificación del RNA. 2.5.1. Tratamiento del material. Para evitar la degradación del RNA con RNAsas el material empleado se sometió a diferentes tratamientos. Las soluciones usadas se prepararon con agua MiliQ tratada con dietil-pirocarbonato (DEPC) 0,1% durante 16 horas a 37 ºC, posteriormente se autoclavó para inactivar el DEPC. El material de vidrio se esterilizó por calentamiento en un horno JP de Selecta a 200 ºC durante 2 horas. El material de plástico fue tratado con H2O2 (33% v/v) durante 10 minutos o autoclavado. Todos los productos utilizados eran libres de RNAsas y los procesos se llevaron a cabo en frío. 2.5.2. Aislamiento de RNA total de Synechocystis. Para el aislamiento de RNA de estas cianobacterias se empleó el método desarrollado por (García-Domínguez y Florencio, 1997). Se recogieron aproximadamente 30 U DO750nm en fase exponencial de crecimiento (1 U DO750nm) por centrifugación (7800 g, 5 minutos y 4 °C) y se resuspendieron en 400 μl de tampón STET (NaCl 0,1 M, Triton X-100 al 5% (v/v), EDTA 1 mM, Tris HCl 10 mM, pH 8). Para la rotura de las células se añadieron perlas de vidrio de 0.45-0.6 mm de 89 diámetro (Sigma Aldrich) tratadas previamente con agua regia y horneadas, y 400 μl de fenol (pH 4,5):cloroformo 1:1 (v/v). Esta mezcla se sometió a 10 ciclos de 1 minuto de agitación vigorosa y 1 minuto en hielo y posteriormente se centrifugó (16200 g, 15 minutos y 4°C) y el sobrenadamente se trató, como mínimo, tres veces con una mezcla de fenol:cloroformo 1:1 (v/v) para así eliminar las proteínas. El DNA y RNA se precipitaron con LiCl 0,5 M y 2,5 volúmenes de etanol absoluto durante, como mínimo, 2 horas a -20 ºC. El precipitado se secó y fue resuspendido en agua tratada con DEPC y se trató con Turbo DNase (Ambion) siguiendo las indicaciones del fabricante. Posteriormente se sometió de nuevo a una extracción con fenol:cloroformo 1:1 (v/v) y el RNA se precipitó con acetato de sodio 0,1 M y etanol absoluto. El precipitado se resuspendió en 30 μl de agua tratada con DEPC. 2.5.3. Cuantificación del RNA aislado. La concentración de RNA de las muestras se determinó con un espectrofotómetro Termo Scientific NanoDropTM 1000 siguiendo las instrucciones del fabricante. 2.5.4. Electroforesis de RNA. El RNA cianobacteriano aislado se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1 % (p/v), preparado en tampón MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico (MOPS) 20 mM, pH 7, acetato de sodio 8 mM, EDTA 1 mM) en presencia de bromuro de etidio (1 μg/ml) y formaldehido 6.5%. Las muestras cargadas en este gel contenían entre 5-10 μg de RNA en tampón MOPS 0,5X, formaldehido al 6,5% (v/v) y formamida desionizada al 50%. Todo esto en un volumen de 27 μl Estas muestras se incubaron a 65 ºC durante 15 minutos para que el RNA fuera desnaturalizado y tras esto se les añadió 3 μl de tampón de carga (azul de bromofenol al 0,25 % (p/v), xileno-cianol FF al 0,25 % (p/v) y glicerol al 50% (v/v) en agua destilada). La electroforesis se realizó durante 35-40 minutos a 90 V en tampón MOPS 1X. 2.5.5. Detección del RNAm mediante hibridación RNA-DNA (Northern blot). Tras lo descrito en el apartado 2.5.4. el gel se lavó tres veces durante 15 minutos con agua tratada con DEPC en agitación suave, tras esto se equilibró dos veces con SSPE 10X (1,5 M NaCl, 0,1 M NaH2PO4, 10 mM EDTA) 20 minutos cada una de ellas con agitación suave. Posteriormente el RNA del gel se transfirió a membranas Immobilon-NY+ (Millipore) empleando un aparato de transferencia por vacío TransVacTM TE80 (Hoefer Scientific Instruments) y tampón SSPE 10X durante 2 horas como mínimo. Tras la transferencia el filtro se horneó durante 10-15 horas a 70 ºC. Posteriormente se realizó la prehibridación de los filtros con la solución de hibridación (fosfato sódico 0,5 M, pH 7,2, EDTA 10 mM y SDS 7% (p/v)) a 65 ºC durante 30 minutos, tras esto fueron incubados con las sondas radioactivas deseadas entre 15-20 horas (Tabla 11). Posteriormente el filtro se lavó a temperatura ambiente y posteriormente se realizaron 3 lavados de 15 minutos a 65 ºC con solución de lavado (fosfato sódico 40 mM, pH 7,2 y SDS 1% (p/v)). Para revelar la señal radioactiva se emplearon pantallas de autorradiografía y un escáner Cyclone Storage Phosphor System. Como control de carga se empleó una sonda 96 4. Métodos biofísicos. 4.1. Evolución de oxígeno mediante el electrodo de Clark. La producción y el consumo de oxígeno en Synechocystis se determinó mediante el uso de un electrodo de tipo Clark (Chlorolab 2+ System de Hansatech). Para esto se tomaron 0,5 U DO750nm de células en fase exponencial en medio BG11c, BG11cCu+BCSA, BG11c+G o BG11c+G+DCMU y se les añadió 10 mM de NaHCO3 previamente al inicio de las medidas. Para determinar la producción de oxígeno a diferentes intensidades luminosas se empleó un método donde las células se mantuvieron durante 4 minutos en oscuridad y posteriormente se les aplicaron intensidades crecientes (25, 60, 95, 120, 170, 245, 485, 1000, 1500μmoles fotones·m-2 ·s-1) con una duración de 4 minutos cada una. Por otro lado, para determinar el consumo de oxígeno las células en las mismas condiciones se sometieron a 5 minutos de oscuridad, 15 minutos de luz de crecimiento y 60 minutos de oscuridad. Siendo este último dato el que corresponde al consumo de oxígeno. 5. Ensayos enzimáticos. 5.1. Determinación de la actividad fructosa-1,6-bisfosfatasa. Esta actividad enzimática se determinó mediante la medida del fosfato liberado en la reacción en la que la fructosa-1,6-bisfosfato pasa a fructosa-6-fosfato por acción de la enzima. Para determinar el fosfato liberado de la reacción se hace reaccionar el mismo con el reactivo de Fiske-Subbarow ((NH4)6Mo7O24.4H2O 0,053 M, FeSO4.7H2O 0,30 M y 4% H2SO4 9 N) generándose un compuesto azul cuya absorbancia se mide a 660 nm. 5.1.1. Determinación in vitro de la actividad fructosa-1,6-bisfosfatasa. Para realizar estos ensayos se preparó una mezcla de reacción con MgSO4.7H2O 15 mM, tampón Tris-HCL pH 8 0,15 M y una cantidad variable de agente reductor, pudiendo ser este DTT y/o tiorredoxina (TrxA, TrxB, TrxQ) a la que se añadió 1 µg de enzima pura; de forma que el volumen final fuese de 175 µL. La mezcla permaneció en hielo durante 30 minutos para favorecer la total reducción de la enzima por los agentes reductores y tras esto se adicionó el sustrato de la reacción (fructosa-1,6-bisfosfato) a una concentración final de 15 mM. Tras la incubación a 30 ºC durante 30 minutos la reacción se paró al añadir 1 ml de Fiscke-Subbarow. Previamente a su medida se mantuvo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para conocer la cantidad de Pi liberado se realizó una recta patrón de fosfato (0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1, 1,2 mM de fosfato) a la que se sometió al mismo proceso. 5.1.2. Determinación in situ de la actividad fructosa-1,6-bisfosfatasa. Para la realización de la medida con cultivos de distintas estirpes de Synechocystis se recogieron 4 muestras del mismo cultivo, cada una de 5 unidades de DO750nm, y 97 se centrifugaron a 4 ºC durante 5 minutos a 3500 g. Tras eliminar el sobrenadante las células se resuspendieron en tampón Tris-HCL pH 8 0,15 M con una concentración de MgSO4.7H2O variable. A dos de las muestras se les añadió DTT 10 mM, de forma que finalmente todas las muestras tengan un volumen final de 293 µL. Para permeabilizar las células se le añadió a cada muestra 7 µL de una mezcla de bromuros de alquil-trimetilamonio (MTA) al 20% (p/v) y se agitó en vórtex durante 5 segundos. Tras esto se añadió fructosa-1,6-bisfosfato 7,15 mM a una muestra con DTT y a otra muestra sin DTT y se incubó durante 30 minutos a 30 ºC. A continuación, las muestras se centrifugaron a 13400 g durante 1 minuto y se tomó el sobrenadante de cada una; siendo este sobrenadante a lo que se añadió 2 ml de reactivo Fiske-Subbarow. Tras esto la mezcla se agitó con vórtex durante 10 segundos y se dejó reposar 15 minutos. 5.2. Determinación enzimática de glucógeno y glucosa extracelular La cantidad de glucógeno intracelular se determinó siguiendo el método descrito en (Díaz-Troya et al., 2014) con modificaciones. Para ello se recogieron 2 ml de cada cultivo a medir y fue sometido a centrifugación (13400 g, 5 minutos a 4 ºC) para eliminar el medio. Estos precipitados se lavaron tres veces con agua miliQ para eliminar posibles contaminantes. Tras esto las células se resuspendieron en 300 μl de acetato sódico 30 mM (pH 5,2) y se rompieron como en el apartado 3.1.1. pero sin la adición de PMSF. Tras eliminar las perlas de vidrio mediante centrifugación a baja velocidad cada muestra se hierve durante 20 minutos a 100 ºC. De cada muestra se tomaron dos alícuotas de 100 μl, una de ellas se trató con 10 U de amiloglucosidasa de Asperguillus niger (Sigma Aldrich) y la segunda sin adición de amiloglucosidasa; todas las muestras se incubaron durante 12-15 horas a 55 ºC. La glucosa liberada de cada alícuota se determinó mediante el método de la glucosa oxidasa/peroxidasa (#GAGO-20 catálogo de Sigma Aldrich). Para determinar la cantidad exacta se realizó una curva patrón con glucógeno comercial, tratados con amioglucosidasa e incubado con las muestras anteriores. La cantidad de glucosa liberada se determinó mediante la absorbancia a 540 y en cada par de muestras se restó la medida correspondiente a la muestra sin amiloglucosidasa. Para determinar la glucosa extracelular de aquellos cultivos en mixotrofía y fotoheterotrofía se siguió el mismo proceso que el empleado para el glucógeno tras la incubación con amiloglucosidasa. En esta medida se realizó una recta de glucosa pura, en lugar de glucógeno, en concentraciones entre 0 y 0,35 μM. 5.3. Medida de la actividad proteasa de PetP La medida de la actividad proteasa de PetP se ensayó tanto en cultivos de E. coli como en cultivos de Synechocystis. Los cultivos de Synechocystis en medio BG11cCu y los de E. coli en medio mínimo M9 (Neidhardt et al., 1974) suplementado con LB 0,1%. En ambos casos se recogieron 20 U DO y se resuspendieron en 300 µL de tampón 10 % glicerol, 1 mM Zn, 50 mM NaCl y 50 mM Tris-HCl pH8, siendo tras esto sometidos al ciclo de rotura descrito en el apartado 3.1.1. Posteriormente se centrifugó a baja velocidad (1000 g) en frío, para eliminar las células enteras que pudieran continuar en la muestra. Tras esto se separan 130 µL de cada muestra en dos tubos distintos, a uno se le añade 0.5 µM de Cu2+ y al otro tubo se le añadió la 98 misma cantidad de tampón de rotura. Finalmente, a cada muestra se le añadió 2 µg de PetR-GST. Las muestras se incuban a 30 ºC y se van tomando volúmenes iguales de ambas a diferentes tiempos de incubación, tras lo cual a cada una de estas muestras se les añade tampón de carga de proteínas 1X y se hierve a 100 ºC durante 10 minutos. 6. Métodos bioinformáticos. 6.1. Obtención de las secuencias y análisis básico Las secuencias de los genes y las proteínas analizadas en este trabajo se obtuvieron de la base de datos Cyanobase (http://genome.microbedb.jp/cyanobase/), de las bases de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y/o de ExPASy así como sus herramientas asociadas (https://www.expasy.org/). El cálculo del coeficiente de extinción de las distintas proteínas se realizó mediante la aplicación ProtParam de ExPASy (https://web.expasy.org/protparam/). Para determinar la posible estructura de PetR se empleó SwissModel de ExPASy (https://swissmodel.expasy.org/). Para estudiar la familia a la que pertenecen proteínas de función desconocida se empleó InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/). Para calcular la cantidad de proteína relativa se empleó Image Lab Software (Bio-Rad) (https://www.bio-rad.com/eses/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z). Para determinar los parámetros cinéticos en base a curvas de Michaelis-Meten se utilizó GraphPad Prism versión 5.00 para Windows; GraphPad Software, San Diego California USA (www.graphpad.com). Para la visualización de proteínas cuya estructura ya está descrita se empleó UCSF CHIMERA (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/). La localización de dianas de restricción de DNA, así como fases de lectura o traducción de secuencias nucleotídicas a proteínas, se realizó con SerialCloner 2.6. La búsqueda de similitud de una secuencia nucleotídica o proteica de Synechocystis con secuencias de otros organismos existentes en bases de datos se realizó mediante la aplicación BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Tras esto las secuencias se alinearon con el algoritmo “MUSCLE” incorporado en el programa MEGA 7.0.26. (Kumar et al., 2016) y posteriormente la conservación de residuos en estos alineamientos se calculó empleando ConSurf (Landau et al., 2005; Ashkenazy et al., 2016) y WebLogo3 (http://weblogo.threeplusone.com/). Para determinar la conservación de los residuos de los diferentes promotores bajo el control de PetR se empleó MEME (http://meme-suite.org/). Para determinar los diferentes dominios de la proteína PetP se empleó la herramienta online TMHMM version 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ ). Para estudiar los promotores de petE y petJ se empleó la base de datos MGcV (http://mgcv.cmbi.ru.nl/) y MEME (http://meme-suite.org/). En el caso de comprobar la co-presencia de varias proteínas se empleó STRING (http://www.bork.embl-heidelberg.de/STRING/) (Szklarczyk et al., 2019). 99 7. Otros métodos analíticos. 7.1. Determinación de la concentración de clorofila. La concentración de clorofila se determinó según el método (Mackinney, 1941) expectrofotométricamente. Para esto se tomó 1 ml de células, se centrifugó (12000 rpm durante 1 minuto) y se eliminó 900 µL de sobrenadante. En el sobrenadante sobrante se resuspendió el sedimento y se añadieron 900 µL de metanol absoluto. Esta mezcla se agitó durante 30 segundos en el vórtex y volvió a centrifugarse (3800 g durante 1 minuto). La concentración de clorofila se determinó del sobrenadante a 665 nm utilizando el coeficiente de extinción de 74.46 mM-1 cm-1. 7.2. Medidas espectrofotométricas. Las medidas de absorbancia de luz visible se realizaron con un espectrofotómetro Biomate 5 (Thermo Electron Corporation) siguiendo las instrucciones del fabricante. 7.3. Medidas de pH. El pH de las distintas disoluciones se midió con un pH Meter Basic 20 (Crison) siguiendo las instrucciones del fabricante. 100 101 Resultados 102 103 A. Regulación del intercambio citocromo c6/plastocianina mediada por proteasa 104 105 1. Análisis de la co-presencia con otros genes de petE y petJ. Para intentar determinar cuál sería la posible proteína reguladora implicada en el cambio de expresión de citocromo (petJ) a plastocianina (petE) en respuesta a cobre se analizaron los genomas disponibles de 169 cianobacterias. De forma que, en dichas especies, se identificaron los genes que codifican para ambas proteínas (petJ y petE) utilizando BLAST. De esta forma se comprobó en qué estirpes estaban presentes ambos o solo uno de los transportadores, pues si solo una de las proteínas estaba presente el intercambio entre uno y otro no ocurriría. Posteriormente se buscaron reguladores transcripcionales que estuvieran relacionados con estas proteínas mediante el análisis de los genomas de las cianobacterias donde las dos estuvieran presentes, buscando por tanto reguladores que estuvieran conservados en estas especies. De forma que manualmente se realizó un análisis del genoma de estas cianobacterias y se determinó que existía un regulador transcripcional de la familia BlaI, codificado por la ORF slr0240 en Synechocystis (petR), que estaba presente en estas cianobacterias. Aguas abajo de este gen, y formando un operón con el mismo en todas las cianobacterias que presentan este regulador transcripcional, se encontraba el gen slr0241 (petP) para Synechocystis que codifica para una proteasa tipo M48 (Figura 11A). El hecho de que el codón de STOP de slr0240 solape con el ATG del gen slr0241 sugiere que ambos se expresan como una misma unidad transcripcional, lo que señala que posiblemente estén implicados en un mismo proceso de regulación como ocurre con sus homólogos BlaI-BlarR1 y MecI-MecR1 (Safo et al., 2005, 2006). Al analizar cianobacteria por cianobacteria la presencia o ausencia de los genes que codifica para el regulador y la proteasa, así como su contexto genómico, se determinó que en el 20% de las 169 cianobacterias analizadas los genes petJ y petE se encontraban adyacentes uno con respecto al otro (Synechococcus, Cyanobium, Microcystis, Cyanothece, Pleurocapsa, Gloeocapsa y algunos Nostocales entre otros) y que en el 40% de las mismas estos se encuentran adyacentes o cercanos a petR y petP (Pseudoanabaena, Chroococcidiopsis, Gloeocapsa, Nodosilinea, Geitlerinema, Spirulina, Moorea Producens, Trichodesmium, Lyngbya y Microcoleus) (Figura 11B). Sin embargo, el 18% de las cianobacterias analizadas que presentaban petJ y petE no contaban con el operón petRP, perteneciendo a los géneros Synechococcus o Prochlorococcus. Como se ha comentado anteriormente esta familia de factores transcripcionales y proteasas suelen estar implicadas en la regulación de la expresión de genes ante una determinada señal que induce la degradación del regulador mediada por la proteasa (Carretto et al., 2002; Llarrull et al., 2011; Llarrull y Mobashery, 2012). Esto unido al hecho de que estén correlacionados en cianobacterias con la plastocianina y el citocromo c6 sugería una posible relación entre este sistema regulador-proteasa y el intercambio entre los transportadores electrónicos. De esta forma se determinó que estas cuatro proteínas se encontraban en todos los grupos cianobacterianos a excepción de los clados Synechococcus y Prochlorococcus. En base a estos resultados se presupone que donde se produce este intercambio entre plastocianina y citocromo c6, de forma dependiente a la disponibilidad de cobre en el medio, también presentaba en su genoma los genes petR y petP. 112 Igualmente se analizaron en este mismo experimento los niveles de las proteínas Cit c6, Pc, CopM y GSI mediante Western Blot (Figura 15B). Para la estirpe silvestre los resultados correlacionaron con los obtenidos en cuanto a la expresión génica, ya que aumentó la cantidad de Pc y disminuyó la de Cit c6. De igual forma, en respuesta a cobre empezó a acumularse CopM, primero en su forma no procesada y posteriormente en su forma procesada (Giner-Lamia et al., 2015). En el caso de PETR se mantuvo la ausencia de Cit c6 y la expresión constitutiva de Pc. Aunque en esta estirpe se acumuló Pc incluso en medio sin cobre parece haber una mayor acumulación de Pc tras 24h de la adición de cobre respecto a medio sin cobre (Figura 15B), pese a que los niveles de expresión del RNA de la misma eran constitutivos (Figura 15A). También se comprobó que la estirpe PETR carecía de PetR y, como en el caso anterior (Figura 13B), tras la adición de 500 nM de cobre en la estirpe silvestre la cantidad del regulador disminuye y en tiempos cortos (media hora tras añadir cobre) se presentó un doble bandeado por la aparición de una banda de menor peso molecular a PetR que indicaba que esta proteína posiblemente se procesaba mediante un corte en la misma (Figura 15C). 2.2. Análisis in sílico de la proteína PetP y su papel en la regulación mediada por cobre. Puesto que al igual que PetR la función en cianobacterias de PetP es desconocida se realizó una primera aproximación bioinformática para determinar su similitud con las proteasas de bacteria. Para esto se introdujo la secuencia de PetP de Synechocystis en InterPro, determinándose de esta forma que PetP pertenecía a la superfamilia de proteasas M48/M56 (familias PFAM PF01435 y PF05569) (Figura 16A). Además, a diferencia de PetR (Figura 12A), la predicción para esta proteína determinó la presencia de varias regiones transmembrana (Figura 16A). Estos datos unidos a los obtenidos para PetR (Figura 12) apoyarían la hipótesis de que PetP podría actuar sobre el regulador como ocurre en los sistemas de regulación bacterianos BlaI/BlaR1-MecI/MecR1 (Carretto et al., 2002; Llarrull et al., 2011). Al ser una proteína con regiones ancladas a la membrana se analizó más profundamente mediante el programa bioinformático TMHMM, especifico de proteínas de membrana, qué partes de la proteína estarían insertadas en la membrana y cuáles serían las regiones solubles (Figura 16B). De esta forma se determinó la presencia de cuatro segmentos transmembrana como ocurre con las proteasas M48 (Figura 16B), apoyando así los datos obtenidos por InterPro (Figura 16A). La principal región soluble de PetP, en base a estas predicciones, se encontraba entre el tercer y cuarto segmento transmembrana que contenía aproximadamente 154 residuos, por lo que las otras regiones solubles eran de menor tamaño. A diferencia de otras proteasas M48, PetP carece del gran segmento C-terminal soluble que en esta familia se encarga de alterar la estructura de las proteasas ante la señal de activación de las mismas. Para profundizar sobre su similitud con los sistemas BlaI/BlaR1 y MecI/MecR1 de bacterias se analizó la conservación de los residuos conservados en las proteasas bacterianas como son los aminoácidos de coordinación con zinc o los sitios de corte y reconocimiento. Así, se analizaron las secuencias de PetP de las cianobacterias que además presentaban PetR, Cit c6 y Pc. Estas secuencias se alinearon y, posteriormente, se comprobó con ConSurf y WebLogo3 dicha conservación, 113 determinándose que los residuos implicados en la coordinación con zinc en PetP se encontraban conservados en todas las secuencias analizadas, por lo que presenta el motivo HEXXH entre las histidinas 150-154 (Figura 16C). Figura 16. Características principales de PetP determinadas mediante análisis bioinformático. (A) Análisis empleando InterPro de la proteína PetP, determinando su familia funcional y su solubilidad. (B) Análisis empleando TMHMM de la proteína PetP, determinando que esta proteína presenta 4 segmentos transmembrana. (C) Determinación de la conservación 114 de residuos en PetP mediante el análisis de 260 secuencias de PetP cianobacterianas. Las secuencias se alinearon con MUSCLE y el grado de conservación se determinó mediante el uso de WebLogo3. En rojo están señaladas las metioninas 53 y 58 mientras que en morado se reseña el sitio de coordinación con zinc. A pesar de que el sitio de corte autocatalítico típico de bacterias de la proteasa no parece estar conservado entre las diferentes proteasas cianobacterianas estas si presentan secuencias altamente conservadas en el lazo que une el tercer y cuarto segmentos transmembrana que incluyen argininas como ocurre en BlaI/MecI. Por lo que es posible que los residuos que rodean a estas argininas puedan ser distintos en bacterias y cianobacterias, de forma que este motivo podría estar alterado. Ya que si PetP fuera la proteasa implicada en el intercambio Cit c6/Pc debería ser capaz de detectar cobre se analizó la conservación de residuos de metionina en la misma, puesto que varios estudios señalan a estos aminoácidos como los principales implicados en coordinar con cobre (Lu, 2003; Le Sueur et al., 2016). Así se determinó que presentaba dos metioninas altamente conservadas, M53 y M58 (Figura 16C). Por lo que estas metioninas podrían estar implicadas en la capacidad de detectar cobre de PetP y en la activación de su respuesta. 2.2.1. Generación de la estirpe PETP. Para comprobar la posible implicación de esta proteasa en la degradación de PetR en respuesta a cobre y en el intercambio petJ/petE ante la presencia del mismo metal se generó la estirpe mutante PETP que no expresaba petP. Esta estirpe se generó mediante la transformación de la estirpe silvestre con el plásmido pPETP_Ery, donde el gen slr0241 que codifica para la proteasa estaba interrumpido por un cassette de resistencia a eritromicina (Figura 17A). La segregación de esta estirpe se comprobó mediante PCR empleando los oligonucleótidos que aparean a ambos lados del operón slr0240-0241 (Figura 17B). Figura 17. Generación y comprobación del mutante PETP. (A) Representación esquemática de la región genómica petRP de la estirpe WT (silvestre) y PETP. (B) Análisis mediante PCR de la segregación de slr0241 en PETP usando los oligonucleótidos 248-249. 115 2.2.2. Caracterización del intercambio citocromo c6/plastocianina en el mutante PETP. Como en el apartado 2.1.3, para comprobar la relación de PetP con el intercambio Cit c6/Pc se analizaron cambios en la expresión de estos genes en la estirpe PETP respecto a la estirpe silvestre. Puesto que, presumiblemente, esta proteasa estaría implicada en la degradación de PetR también se analizaron los cambios en esta proteína (Figura 18). Como en el caso anterior copM se indujo en respuesta a cobre independientemente a la ausencia de la proteasa (Figura 18A). Sin embargo, el intercambio de petJ a petE, como en el caso del mutante PETR (Figura 15A), se vio alterado. En el mutante PETP este cambio no se produce ya que se mantuvo una expresión constitutiva y constante de petJ mientras que la expresión de petE nunca se activó (Figura 18A). Estos datos fueron apoyados con los niveles de proteína, mediante Western Blot, donde se analizó la cantidad de Cit c6, Pc, CopM y GSI (Figura 18B). Así en respuesta a cobre en la estirpe PETP se acumuló la forma procesada de CopM tanto en la estirpe mutante como en la estirpe silvestre pero no se produjo una acumulación de Pc, sino que se mantuvo una cantidad alta de Cit c6 de forma casi constitutiva incluso 24 horas después de la adición de cobre. Respecto a los cambios en la acumulación de PetR en respuesta a cobre se observó que en la estirpe PETP la cantidad de esta proteína se mantuvo constante incluso 24 horas tras la adición de cobre (Figura 18C). Todo esto indicaba que PetP degradaba a PetR y que el regulador está implicado en el intercambio petJ/petE de forma dependiente de cobre. Figura 18. Análisis de la expresión y acumulación de la plastocianina y citocromo c6 en respuesta a cobre en el mutante PETP. (A) Análisis mediante Northern Blot de petE, petJ, copM y rnpB en las estirpes WT (silvestre) y PETP cultivadas en BG11c-Cu en respuesta a la adición de 500 nM de Cu a los tiempos indicados. Los filtros se hibridaron con las sondas para petE, petJ y copM y posteriormente, tras eliminar estas sondas, se rehibridó con la sonda de rnpB. (D) Western Blot de PetJ, PetE, CopM y GSI en las estirpes WT (silvestre) y PETP cultivadas en BG11c-Cu tras la adición de 500 nM de Cu a los tiempos indicados. Se cargaron 5 µg de proteína total de los extractos solubles y estas se separaron con un gel al 15% mediante 116 electroforesis SDS-PAGE. (C) Western Blot de PetR y GSI en las estirpes WT (silvestre) y PETP cultivadas en BG11c-Cu tras la adición de 500 nM de Cu a los tiempos indicados. Tras esto las células enteras fueron cargadas (0,2 DO750nm) y separadas con un gel al 15% mediante electroforesis SDS-PAGE. Los resultados son representativos de, al menos, tres experimentos independientes. Los anticuerpos empleados en estos análisis, así como su concentración, están descritos en la Tabla 12. 2.3. Efectos de la mutación del operón slr0240-41 en la regulación mediada por cobre. Con el fin de comprobar que PetP actuaba aguas arriba de PetR se realizó este mismo estudio para una estirpe que careciera tanto de PetR como de PetP, la estirpe PETRP (Figura 19). Para generar este mutante se transformó la estirpe silvestre con el plásmido pPETRP_Sp (Figura 19A), de forma que ambos genes quedaban interrumpidos por el casette de resistencia a Sp/St. La segregación de esta nueva estirpe se comprobó por PCR (Figura 14B). Figura 19. Construcción del mutante PETRP y análisis de la expresión y acumulación de la plastocianina y el citocromo c6 en respuesta a cobre en él. (A) Representación esquemática de la región genómica petRP de la estirpe WT (silvestre) y PETRP. (B) Análisis mediante PCR de la segregación de slr0240 en PETRP usando los oligonucleótidos 223-224. (C) 117 Análisis mediante Northern Blot de petE, petJ y rnpB en las estirpes WT (silvestre) y PETRP cultivadas en BG11c-Cu en respuesta a la adición de 500 nM de Cu a los tiempos indicados. Los filtros se hibridaron con las sondas para petE y petJ y posteriormente se rehibridó con la sonda de rnpB. (D) Western Blot de PetR y GSI en las estirpes WT (silvestre) y PETRP cultivadas en BG11c-Cu tras la adición de 500 nM de Cu a los tiempos indicados. Las células enteras fueron cargadas (0,2 DO750nm) y separadas con un gel al 15% mediante electroforesis SDS-PAGE. (E) Western Blot de PetJ, PetE, CopM y GSI en las estirpes WT (silvestre) y PETRP cultivadas en BG11c-Cu tras la adición de 500 nM de Cu a los tiempos indicados. Se cargaron 5 µg de proteína total de los extractos solubles y estas se separaron con un gel al 15% mediante electroforesis SDS-PAGE. Los resultados son representativos de, al menos, tres experimentos independientes. Los anticuerpos empleados en estos análisis, así como su concentración, están descritos en la Tabla 12. Para poder comparar las características de esta nueva estirpe con las estirpes PETR y PETP se realizaron los mismos que en las Figuras 15 y 18. Los resultados obtenidos para PETRP fueron idénticos a los observados en el mutante PETR, no se observó expresión de petJ, ni siquiera en un medio sin cobre, mientras que la expresión de petE fue constitutiva (Figura 19C). Como se esperaba no se detectó PetR en ninguna condición (Figura 19D). En cuanto a los niveles de proteína, mientras que Cit c6 no se acumuló ni siquiera en ausencia de cobre en el medio, Pc se acumuló tanto en esta condición como tras la adición de cobre (Figura 19E). Esto coincidía con lo que ocurría en el mutante PETR, donde Pc se expresaba y acumulaba de forma constitutiva (Figura 15). Sin embargo, como también ocurría en dicho mutante, la acumulación de Pc parece ser mayor tras 24 horas de la exposición al metal. Que el mutante PETRP sea igual al mutante PETR señalaba que PetP actúa aguas arriba de PetR regulando, probablemente mediante proteólisis, su actividad. 2.4. Cuantificación de los niveles de Pc, Cit c6 y PetR en relación a la disponibilidad de cobre. Como una primera aproximación para conocer la variación en la cantidad de estos transportadores electrónicos en las estirpes PETR y PETP se cultivaron tanto estas como la estirpe silvestre en medios con diferente disponibilidad de cobre: BG11c (330 nM Cu), BG11c-Cu (~30 nM Cu) o BG11c-Cu+BCSA (sin cobre disponible) (Figura 20A). De forma que se analizó mediante Western Blot la cantidad de Cit c6, Pc, PetR y GSI en cada una en las diferentes condiciones. De esta forma se ratificó que, independientemente de la disponibilidad de cobre, la acumulación de Cit c6 era constante en el mutante PETP, aunque ligeramente menor a mayor disponibilidad de cobre. En el mutante PETR, aunque siempre estaba presente Pc independientemente de la presencia o ausencia de cobre, la proteína disminuía considerablemente cuanto menor fuera la cantidad de cobre en el medio. Esto establecía una relación directa entre estas dos proteínas y la regulación Pc/Cit c6, de modo que PetR impediría la expresión de la plastocianina y PetP la del citocromo c6. Además, PetR se acumuló en el mutante PETP independientemente de la disponibilidad de cobre (Figura 20A). Estos datos apoyan que la proteasa sería quien degradaría al regulador en un proceso dependiente de la presencia de cobre. Para determinar si realmente la cantidad de proteína era constitutiva o presentaba variaciones dependiendo de la disponibilidad de cobre en el medio se calculó la cantidad de Cit c6, Pc y PetR mediante Western Blot en las estirpes silvestre, PETR 118 y PETP en las diferentes condiciones de disponibilidad de cobre anteriormente descritas. Para esto se comparó la acumulación de estas proteínas respecto a la cantidad que presentaba la estirpe silvestre en condiciones ideales para la síntesis de Cit c6, Pc o PetR. Para Cit c6 y PetR se tomó como máximo los cultivos de silvestre que habían crecido en BG11c-Cu+BCSA y en el caso de Pc los cultivos que crecieron en BG11c (Figura 20). De esta forma se determinó que la cantidad de Pc en el mutante PETR, a pesar de que se diera en todas las condiciones de crecimiento, dependía de la disponibilidad de cobre, algo que no se observaba a nivel de transcrito (Figura 15A), donde la cantidad de petE no parecía cambiar en medio con Cu respecto a medio sin cobre. Por lo que la acumulación de esta proteína en el mutante PETR variaba en función de la disponibilidad de cobre en el medio (disminuyendo un 70% al pasar de un medio con cobre a un medio sin cobre) (Figura 20B y 20F), no obstante, no se alteró cuando esta estirpe había crecido en un medio con baja o con nula disponibilidad de cobre. La cantidad de Pc en la estirpe silvestre fue mucho menor que en la estirpe PETR incluso cuando ambas estirpes habían crecido con cobre en el medio, en este caso la cantidad de esta proteína en la estirpe silvestre era casi la mitad de la obtenida en PETR. Tanto en esta como en el resto de las condiciones de crecimiento la cantidad de proteína en la estirpe silvestre fue menor que en la estirpe PETR en dichas condiciones, disminuyendo hasta un 60% ante una baja disponibilidad de cobre y un 95% ante la ausencia de cobre en el medio (Figura 20B y 20F). En el caso del citocromo los resultados son idénticos a los observados para la Pc, pero en el mutante PETP (Figura 20C, 20D, 20G). En dicha estirpe, aunque siempre se acumula el Cit c6, independientemente de la disponibilidad de cobre del medio, la acumulación de la proteína era mayor en medio sin cobre con respecto a medio con cobre disponible. En este caso de que el medio presentase cobre, BG11c-Cu o BG11c, la cantidad de Cit c6 en PETP disminuyó a la mitad, aunque su acumulación no varió entre estas dos condiciones. En cualquier caso, la acumulación de Cit c6 en la estirpe PETP en medio sin cobre disponible fue un 50% superior a la de la estirpe silvestre en estas condiciones. La acumulación de citocromo en BG11c-Cu para ambas estirpes fue similar, pese a esto en condiciones donde la disponibilidad de cobre era alta (BG11c) la acumulación de esta proteína en la estirpe silvestre se encontraba por debajo de los límites de detección mientras que en la estirpe PETP era similar a la observada en condiciones con una baja disponibilidad de cobre (Figura 20F y 20G). En lo relativo a PetR la variación de esta proteína en la estirpe PETP dependiendo de la disponibilidad de cobre fue mínima (Figura 20C, 20D, 20H). Sin embargo, con una baja disponibilidad de cobre, medio BG11c-Cu, en la estirpe silvestre la disminución de PetR fue de un 90%, esto indicaba que el sistema de regulación de PetR (debido a PetP) debe tener una alta sensibilidad a cobre (Figura 20C, 20D, 20H). Estos resultados demostraron que, excepto en el caso de PetR, la expresión constitutiva de los genes no se tradujo en una acumulación constitutiva de Pc y Cit c6 en las estirpes PETR y PETP respectivamente, pese a que de forma independiente de la disponibilidad de cobre en estas estirpes se expresaron dichas proteínas (Figuras 15, 18 y 20). 119 Figura 20. Cuantificación de PetJ, PetE y PetR en las estirpes WT (silvestre), PETR y PETP en distintas disponibilidades de cobre. (A) Western Blot de PetJ, PetE, PetR y GSI en las estirpes WT (silvestre), PETR y PETP cultivadas en BG11c-Cu+BCSA (B), BG11c-Cu (-) o BG11c (+). Se cargaron 10 µg de proteína de los extractos. (B) Western Blot de PetE y GSI en las estirpes WT (silvestre) y PETR donde la WT (silvestre) ha crecido en BG11c y PETR en BG11c, BG11c-Cu, BG11c-Cu+BCSA. Se cargaron cantidades decrecientes de proteína total de la estirpe WT (silvestre) (10, 5, 2,5 y 1,25 µg) y 10 µg del PETR en cada condición. (C) Western Blot de PetJ, PetR y GSI en las estirpes WT (silvestre) y PETP. Se realizó el mismo proceso que el del apartado B pero la estirpe WT (silvestre) creció en medio BG11c-Cu+BCSA (D) Western Blot de PetE y GSI en la estirpe WT (silvestre) que ha crecido en BG11c, BG11c-Cu, BG11cCu+BCSA. Se cargaron cantidades decrecientes de proteína total de la estirpe WT (silvestre) en BG11c (10, 5, 2,5 y 1,25 µg) y 20 µg de las otras condiciones. (E) Western Blot de PetJ, PetR y GSI. Se realizó el mismo proceso que el del apartado D pero se cargaron cantidades decrecientes de la estirpe WT (silvestre) en BG11c-Cu+BCSA (F) Cuantificación de los niveles de PetE en las estirpes WT (silvestre), PETR y PETP que se han cultivado en medio BG11c-Cu +BCSA, BG11c-Cu o BG11c. Se cargaron 10 µg de extracto soluble de WT (silvestre), PETR y 120 PETP en cada condición y estos fueron comparados con diluciones seriadas (100%, 50%, 25% and 12.5%) de extractos de WT (silvestre) que había crecido en BG11C. Las barras azules representan el medio BG11c-Cu+BCSA, las naranjas el medio BG11c-Cu y las grises el medio BG11c. El cálculo de la cantidad de proteína relativa se realizó empleando Image Lab Software y normalizando a la cantidad de GSI de las distintas muestras. (G) Cuantificación de los niveles de PetJ realizada de igual forma a la descrita en el apartado F. En este caso se compararon con la estirpe WT (silvestre) que había crecido en BG11c-Cu+BCSA. (H) Cuantificación de los niveles de PetR en las estirpes WT (silvestre), PETR y PETP realizada de igual forma a la descrita en el apartado F. Los resultados son representativos o representan la media de, al menos, tres experimentos independientes. Las barras de error corresponden al error estándar de las mismas. En todos los casos las estirpes han crecido burbujeadas con aire enriquecido con 1% (vol/vol) de CO2. Las proteínas fueron separadas en un gel al 15% mediante electroforesis SDS-PAGE. Los anticuerpos empleados en estos análisis, así como su concentración, están descritos en la Tabla 12. 2.5. Identificación de los genes regulados mediante el sistema petRP/PetRP. Puesto que se ha demostrado que la mutación de cada uno de los genes del operón petRP genera cambios en la expresión de petJ y petE (Figuras 15B, 18B) se procedió a analizar si estos cambios eran extensibles para otros genes. Ya que PetR es un regulador transcripcional es posible que no solo actúe sobre estos dos genes, sino que podrían existir otros genes regulados por la proteína PetR en Synechocystis. 2.5.1. Efectos de la alteración de PetR y PetP en el transcriptoma. Para caracterizar el sistema de regulación mediado por PetR/PetP se realizó un análisis transcriptómico utilizando RNA-seq de las estirpes silvestre, PETR, PETP. Este análisis permitía determinar los diferentes genes cuya expresión pudiese alterarse de forma dependiente de PetR. Así, las estirpes se cultivaron en medio BG11c-Cu hasta fase exponencial, tras lo cual se añadió 500 nM de Cu. Para el análisis de los transcritos se tomaron puntos previamente a la adición de Cu y tras dos horas de su adición en las tres estirpes. Por lo que se extrajo el RNA de las estirpes en ambas condiciones y se analizó el transcriptoma de estas por RNA-seq. Para determinar si existía una expresión diferencial de algún gen se compararon las lecturas para cada transcrito de cada mutante con las de la estirpe silvestre. Con el fin de determinar cuáles eran los genes con expresión diferencial para las comparaciones a realizar, se determinó un nivel de selección donde la diferencia de expresión debía ser de, al menos, un cambio de 2 veces y un FDR (False Discovery Rate) mayor que 0,01. Para la estirpe silvestre se identificaron 11 genes inducidos (petE, copMRS, copBAC y nrsBAC) y 3 genes reprimidos (petJ, slr0601, slr0602) tras añadir cobre al medio, coincidiendo esto con los de estudios transcriptómicos anteriores (Giner-Lamia et al., 2014). Para esta misma comparación en el mutante PETR, se obtuvieron resultados similares para copMRS, copBAC y nrsBAC en cuanto a su inducción con cobre. Puesto que el mRNA de petE estaba ya presente previamente a la presencia de cobre sus niveles de expresión no variaron en dicha estirpe tras añadir el metal, a diferencia de lo que ocurría para la estirpe silvestre. En relación con los genes reprimidos en presencia de cobre, a diferencia de la estirpe silvestre, en el mutante PETR la expresión de petJ, slr0601, slr0602 se mantuvo baja. Por lo que, ya que no 121 estaban inducidos en ausencia de cobre, la adición de cobre no reprimió su expresión. De tal forma que, si se comparaba la expresión en PETR en ausencia de cobre de petJ, slr0601, slr0602 respecto a la estirpe silvestre en dichas condiciones, estos genes resultaron reprimidos en la estirpe PETR. De igual forma si se comparaba la expresión de petE en ausencia de cobre en ambas estirpes esta estaba inducida en PETR. Sin embargo, al analizar la estirpe PETP se determinó que la plastocianina no se expresaba en ninguna condición mientras que petJ, slr0601 y slr0602 no se reprimieron tras la adición de cobre (Figura 21). Por lo que al comparar la expresión de petE entre esta estirpe y la silvestre tras la adición de cobre el gen estaba reprimido en PETP. Mientras que, si se analizaba la expresión de petJ, slr0601 y slr0602 en presencia de cobre respecto a la silvestre los genes estaban inducidos en PETP. Estos datos indican que la regulación mediada por PetR-PetP solo se produciría sobre petJ, petE y slr0601-slr0602 en Synechocystis. Además, los genes que se expresaban en un mutante estaban reprimidos en el otro. Figura 21. Análisis por RNA-seq de la regulación que depende de PetR-PetP. (A) Lecturas de petJ detectadas en el RNA-seq de las estirpes WT (silvestre), PETR y PETP previa y posteriormente a la adición de 500 nM de Cu. (B) Lecturas de slr0601-02 detectadas en el RNAseq de las estirpes WT (silvestre), PETR y PETP previa y posteriormente a la adición de 500 nM de Cu. (C) Lecturas de petE detectadas en el RNA-seq de las estirpes WT (silvestre), PETR y PETP previa y posteriormente a la adición de 500 nM de Cu. Las flechas indican los sitios de 128 degradando a PetR, y en este mecanismo proteolítico y de transducción de la señal solo están implicados PetR y PetP. Figura 26. Determinación de la actividad proteasa de PetP sobre PetR de forma dependiente de cobre. (A) Las estirpes WT (silvestre), PETR y PETP crecieron en medio BG11c-Cu burbujeado con aire enriquecido con 1% (vol/vol) de CO2. Posteriormente se obtuvieron los extractos de las mismas y se incubaron con la proteína PetR-GST durante los tiempos indicados tras la adición o no de 500 nM de CuSO4. (B) Las estirpes PpetRP y Pvacío crecieron en medio mínimo M9 (Neidhardt et al., 1974) suplementado con LB 0,1%. Se obtuvieron los extractos de las mismas y se incubaron con la proteína PetR-GST durante los tiempos indicados tras la adición o no de 500 nM de CuSO4. Los resultados son representativos de, al menos, tres experimentos independientes. En ambos casos las proteínas se separaron con un gel al 12% mediante SDS-PAGE. PetR-GST se detectó mediante Western Blot. Los anticuerpos empleados en estos análisis, así como su concentración, están descritos en la Tabla 12. 4.2. Determinación de residuos implicados en la actividad proteasa. Los resultados obtenidos indicaban que PetP sería capaz de detectar cobre y, como resultado degradar a PetR. Con el objetivo de determinar qué residuos de PetP podrían estar implicados en este proceso se procedió a generar mutantes puntuales tanto de las histidinas conservadas del motivo HEXXH como las metioninas conservadas que podrían estar implicadas en detectar del cobre. 4.2.1. Generación de mutantes PETP con residuos alterados. Para la generación de los diferentes mutantes puntuales de PetP se transformó el mutante PETRP con varias construcciones, siendo una de estas la complementación de la mutación PETRP. De forma que, para generar la estirpe PETRP+RP este se transformó con el plásmido pPHAB_Nat_petRP_WT (Figura 27A). Para generar la estirpe PETRP+HAHA, donde las histidinas 150 y 154 de PetP fueron sustituidas por alaninas, el mutante PETRP se transformó con el plásmido pPHAB_Nat_petRP_HAHA. En cuanto a la generación de los mutantes PETRP+M53A, PETRP+M58A y PETRP+M53AM58A, donde las metioninas 53, 58 o ambas de PetP se alteraron por alaninas, la estirpe PETRP se transformó con el plásmido pPHAB_Nat_petRP_M53A, pPHAB_Nat_petRP_M58A o pPHAB_Nat_petRP_M53A_M58A. En todos los casos los genes que codifican para petR y petP se introdujeron bajo su propio promotor (Figura 27A). La segregación de estas estirpes se comprobó mediante PCR (Figura 27B). 129 Figura 27. Construcción de las estirpes PETRP+RP, PETRP+HAHA, PETRP+M53A, PETRP+M58A y PETRP+M53AM58A. (A) Representación esquemática de la región genómica phaAB de la estirpe WT (silvestre) y de los mutantes PETRP+RP, PETRP+HAHA, PETRP+M53A, PETRP+M58A y PETRP+M53AM58A donde los genes slr0240-41 (slr0241 puede tener residuos alterados dependiendo del mutante) se expresaron bajo su mismo promotor en otra región del genoma de Synechocystis. (B) Análisis mediante PCR de la región entre phaA y phaB para comprobar la segregación de las inserciones de slr0240-41 en los mutantes PETRP+RP, PETRP+HAHA, PETRP+M53A, PETRP+M58A y PETRP+M53AM58A empleando los oligonucleótidos 217 y 218. Como control se empleó la estirpe PETRP, parental de los mutantes. 4.2.2. Análisis fenotípico del mutante PETRP complementado. Ya que todas las estirpes generadas de mutantes de PetP se basaron en la complementación del mutante PETRP bajo su propio promotor se procedió a comprobar que la estirpe PETRP+RP recuperaba el fenotipo silvestre (Figura 28). Para ello se realizó un experimento donde a las estirpes silvestre y PETRP+RP al llegar a fase exponencial, creciendo en un medio BG11c-Cu, se les añadió 500 nM de cobre. A continuación, se analizó la acumulación de las proteínas Cit c6, Pc, CopM y GSI mediante Western Blot. Como se muestra en la Figura 28A la estirpe PETRP+RP presentaba un fenotipo silvestre a diferencia de su parental PETRP (Figura 19). Además, en esta estirpe se observó la presencia de PetR en medio sin cobre y su degradación dependiente del mismo (Figura 28B). Por otra parte, para comprobar la actividad proteasa de la estirpe PETRP+RP se realizó el mismo experimento analizado en el apartado 4.1 con el extracto total de las estirpes 130 silvestre, PETRP y PETRP+RP (Figura 28C). Con este experimento se determinó que la estirpe PETRP+RP, a diferencia de las de la estirpe PETRP, es capaz de degradar la proteína PetR+GST añadida. Por tanto, la transformación de la estirpe PETRP con el plásmido pPHAB_Nat_petRP_WT recupera el fenotipo silvestre completamente. Figura 28. Comprobación de la recuperación del fenotipo WT en la estirpe PETRP+RP. (A) Western Blot de PetJ, PetE, CopM y GSI en las estirpes WT (silvestre) y PETRP+RP, cultivadas en BG11c-Cu tras la adición de 500 nM de Cu. La proteína total se aisló en los tiempos indicados. Se cargaron 5 µg de proteína total de los extractos solubles y estas se separaron con un gel al 15% mediante electroforesis SDS-PAGE. (B) Western Blot de PetR y GSI en las estirpes WT (silvestre) y PETRP+RP cultivadas en BG11c-Cu tras la adición de 500 nM de Cu. Tras esto las células fueron recogidas a los tiempos indicados y las células enteras fueron cargadas (0,2 DO750nm) y separadas con un gel al 15% mediante electroforesis SDS-PAGE. (C) Las estirpes WT (silvestre) y PETRP+RP crecieron en medio BG11c-Cu burbujeado con aire enriquecido con 1% (vol/vol) de CO2. Posteriormente se obtuvieron los extractos de las mismas y se incubaron con la proteína PetR-GST durante los tiempos indicados tras la adición o no de 500 nM de CuSO4. Las proteínas se separaron con un gel al 12% mediante electroforesis SDS-PAGE. PetRGST se detectó mediante Western Blot. Los resultados son representativos de, al menos, tres experimentos independientes. Los anticuerpos empleados en estos análisis, así como su concentración, están descritos en la Tabla 12. 4.2.3. Análisis fenotípico de los mutantes puntuales de PetP. Puesto que la estirpe PETRP+RP era fenotípicamente igual a la estirpe silvestre (Figura 28) y que se siguió el mismo diseño experimental que para obtener las estirpes PETRP+HAHA, PETRP+M53A, PETRP+M58A y PETRP+M53AM58A (Figura 27) se empleó PETRP+RP como control en los experimentos relativos a las 131 mutaciones puntuales de PetP. Por tanto, la similitud del comportamiento de estas estirpes con la silvestre se dedujo con respecto a la similitud con PETRP+RP. Como una primera aproximación se analizó si se producían cambios en el crecimiento de estas estirpes mutantes con respecto a las estirpes silvestre, PETRP, y PETRP+RP en medios con diferente disponibilidad de cobre (Figura 29). Se determinó que, a diferencia de la estirpe PETRP que crecía más lentamente en medio sin cobre disponible, todas las estirpes generadas parecen crecer a la misma velocidad que la estirpe silvestre independientemente de la disponibilidad de cobre. Figura 29. Comparación del crecimiento de las estirpes WT, PETRP, PETRP+RP, PETRP+HAHA, PETRP+M53A, PETRP+M58A y PETRP+M53AM58A ante diferente disponibilidad de cobre. Crecimiento de las estirpes en medio solido con diferente disponibilidad de cobre a 50 μmol fotones·m-2 ·s-1; los cultivos en fase exponencial de cada una de las estirpes se igualaron a DO750 nm de 0,2 y se hicieron 4 diluciones 1/10 sembrándose 5 µl de cada una. Los resultados son representativos de, al menos, tres repeticiones independientes. 4.2.3.1. Análisis fenotípico del mutante PETRP+HAHA. La primera estirpe analizada fue PETRP+HAHA, aquella en la que se habían eliminado las histidinas del motivo conservado HEXXH. Estas histidinas en otras proteasas de la misma familia dependientes de zinc están implicadas en la coordinación con el átomo de Zn2+ (Rawlings y Barrett, 1995; Zhang et al., 2001) . En dichas proteasas la pérdida de la capacidad de coordinar con este metal conlleva una pérdida de la actividad proteasa. Para determinar el fenotipo de esta estirpe se realizaron los mismos experimentos de la sección 4.2.2., solo que en esta ocasión la estirpe control fue PETRP+RP (Figura 30). De forma que primero se estudió la acumulación de las proteínas Cit c6, Pc, CopM y GSI (Figura 20A) en respuesta a cobre. Este mutante presentó grandes semejanzas con la estirpe PETP ya que acumulaba constitutivamente Cit c6, independientemente de la disponibilidad de cobre, y no acumulaba Pc aún tras 24 horas en presencia de cobre (Figura 30A). Para analizar si esta proteína alterada conservaba cierta actividad proteasa se comprobó la acumulación de PetR en respuesta a cobre respecto a la estirpe PETRP+RP mediante Western Blot (Figura 30B). La estirpe PETRP+HAHA acumulaba PetR de forma constitutiva e independiente de la presencia o ausencia de cobre, como ocurría en la estirpe PETP. Por último, se quiso determinar si los extractos (incluyendo las membranas donde estaría PetP) de esta estirpe 132 presentaban actividad proteasa (Figura 30C). Por lo que el extracto total de las estirpes PETRP+RP y PETRP+HAHA se incubó en presencia o no de cobre con PetR-GST y se determinó que tanto en presencia como en ausencia de cobre las membranas de la estirpe PETRP+HAHA, a diferencia de la estirpe PETRP+RP, eran incapaces de degradar PetR-GST, tal como ocurría en la estirpe PETP (Figura 26). Figura 30. Determinación del efecto de la sustitución de las histidinas H150 y H154 en PetP en el intercambio PetJ/petE y su actividad proteasa sobre PetR. (A) Western Blot de PetJ, PetE, CopM y GSI en las estirpes PETRP+HAHA y PETRP+RP que han sido cultivadas en BG11c-Cu tras la adición de 500 nM de Cu. Se cargaron 5 µg de proteína total de los extractos solubles y estas se separaron con un gel al 15% mediante electroforesis SDS-PAGE. (B) Western Blot de las proteínas PetR y GSI en las estirpes PETRP+HAHA y PETRP+RP cultivadas en BG11c-Cu tras la adición de 500 nM de Cu. Las células fueron recogidas a los tiempos indicados, cargadas (0,2 DO750nm) y separadas con un gel al 15% mediante electroforesis SDS-PAGE. (C) Las estirpes WT (silvestre) y PETRP+HAHA crecieron en medio BG11c-Cu burbujeado con aire enriquecido con 1% (vol/vol) de CO2. Posteriormente se obtuvieron los extractos de las mismas y se incubaron con la proteína PetR-GST durante los tiempos indicados tras la adición o no de 500 nM de CuSO4. Las proteínas se separaron con un gel al 12% mediante electroforesis SDSPAGE. PetR-GST se detectó mediante Western Blot. Los resultados son representativos de, al menos, tres experimentos independientes. En todos los casos los cultivos fueron burbujeado con aire enriquecido con 1% (vol/vol) de CO2. Los anticuerpos empleados en estos análisis, así como su concentración, están descritos en la Tabla 12. El conjunto de los resultados obtenidos con el mutante PETRP+HAHA indican que la eliminación de las histidinas conservadas inactiva la actividad proteasa de PetP, probablemente por impedir su unión con el átomo de Zn. Como ocurre en las proteasas de la familia M48/M56. 133 4.2.3.2. Análisis fenotípico de los mutantes puntuales de las metioninas M53 y M58. Ya que las metioninas pueden ser residuos implicados en la coordinación con cobre (Lu, 2003; Le Sueur et al., 2016) y las metioninas M53 y M58 de PetP están totalmente conservadas en las cianobacterias (Figura 16A) se generaron los mutantes de la proteasa M53A, M58A y M53AM58A. De forma que la introducción de estas proteínas alteradas permitiera determinar si estos residuos estaban o no implicadas en el proceso de percepción de cobre de la proteasa. La primera aproximación para determinar si existía una relación real entre estas metioninas y la capacidad de detectar cobre de la proteasa se realizó mediante la transformación de células de E. coli con los plásmidos pPHAB_Nat_petRP_WT, pPHAB_Nat_petRP_M53A, pPHAB_Nat_petRP_M58A y pPHAB_Nat_petRP_M53AM58A, por lo que estas bacterias expresarían en sus membranas la proteasa de Synechocystis con o sin las metioninas alteradas. Con estas células se realizó el mismo experimento que en la sección 4.1., por lo que los extractos de las diferentes estirpes generadas se incubaron en presencia o ausencia de cobre con PetR-GST. En este caso, a diferencia de en la sección 4.1., se añadieron concentraciones crecientes de cobre con el objetivo de determinar si presentaba una sensibilidad a cobre diferente a la de la estirpe control. De los extractos incubados con cada una de estas concentraciones se tomó un punto tras 5 horas de la adición de cobre y también se tomó un punto antes y tras 5 horas de incubación sin haber añadido cobre, usando este último como control de que realmente el medio no contenía un elemento que promoviera la actividad proteasa. En ninguno de los casos PetP ejercía su actividad proteasa sobre PetR-GST si no había cobre presente (Figura 31B). Se comprobó que el doble mutante de ambas metioninas era incapaz de detectar el cobre independientemente de la concentración del mismo mientras que en una proteasa silvestre el cobre se detecta por encima de 50 nM eficientemente (Figura 31A). En el caso de los mutantes simples de M53A y M58A se observó una ligera capacidad proteasa con la consiguiente disminución de PetR-GST, pero en ningún caso comparable con la de PetP silvestre (Figura 31A). 134 Figura 31. Determinación del efecto de la sustitución de las metioninas M53 y/o M58 en la percepción de cobre de PetP. (A) La proteína PetR-GST se incubó durante 5 horas con extracto total de E. coli que habían sido transformadas con los plásmidos pPHAB_Nat_petRP_M53A, pPHAB_Nat_petRP_M58A, pPHAB_Nat_petRP_M53AM58A o pPHAB_Nat_petRP_WT. Los resultados son representativos de, al menos, tres experimentos independientes. (B) La proteína PetR-GST se incubó durante 5 horas a las concentraciones de cobre indicadas con extracto total de E. coli que habían sido transformadas con los plásmidos pPHAB_Nat_petRP_M53A, pPHAB_Nat_petRP_M58A, pPHAB_Nat_petRP_M53AM58A o pPHAB_Nat_petRP_WT. En ambos casos las células habían crecido en medio mínimo M9 suplementado con LB 0,1% y las proteínas se separaron con un gel al 12% mediante electroforesis SDS-PAGE. PetR-GST se detectó mediante Western Blot. Los anticuerpos empleados en estos análisis, así como su concentración, están descritos en la Tabla 12. Los resultados obtenidos sugerían que ambas metioninas estarían implicadas en la detección de cobre y cuando se carece de una de ellas la actividad proteasa se vería mermada, mientras que en el doble mutante la proteína es insensible al cobre añadido (Figura 31). Para determinar si estas mutaciones afectan in vivo en Synechocystis a la actividad proteasa se analizó la acumulación de Cit c6, Pc, CopM y GSI en las estirpes PETRP+RP, PETRP+M53A, PETRP+M58A y PETRP+M53AM58A en respuesta a la adición de cantidades crecientes de cobre. Así, mediante Western Blot se determinó la respuesta a 500 nM de Cu (Figura 32A, 32B) y 1 µM de Cu (Figura 32C, 32D). Ante la concentración de cobre estándar (500 nM) se determinó que el mutante PETRP+M53AM58A presentaba un comportamiento similar al de la estirpe PETP y PETP+HAHA, ya que en esta estirpe se observó una expresión constitutiva de Cit c6 independientemente de si había o no cobre presente. Además, en ningún punto tras añadir cobre se detectó Pc, pese a que sí se indujo CopM en respuesta a este metal. Relativo a la expresión de PetR se comprobó que la cantidad de proteína no se alteraba, siendo mayor la cantidad de esta proteína que en la estirpe PETRP+PR incluso en medio BG11c-Cu (Figura 32A, 32B). Estos datos coincidían con los obtenidos empleando las membranas de E. coli transformada con los plásmidos pPHAB_Nat_petRP_M53A, pPHAB_Nat_petRP_M58A y pPHAB_Nat_petRP_M53A_M58A. (Figura 31). Sin embargo, los mutantes simples de una u otra metionina presentaron un fenotipo menos acusado que el de la estirpe PETP. A pesar de que ambos acumulaban PetR de forma constitutiva, tras añadir 500 nM de cobre (Figura 32B) la cantidad de esta 135 proteína resultó mucho menor a la observada para el doble mutante de las metioninas. Lo mismo se observó para la acumulación de Cit c6 que sufrió un ligero descenso tras la adición de cobre. De hecho, en estos mutantes incluso se observó una ligera acumulación de Pc de forma dependiente de cobre. Ya que PetR sería un represor de petE en las estirpes mutantes PETRP+M53A y PETRP+M58A debe existir cierto grado de degradación del regulador que permita esta acumulación de Pc que no se daba en el mutante PETP (Figuras 18, 32A, 32B). Cuando la cantidad de cobre añadido fue mayor (1 µM) la estirpe PETRP+M53AM58A volvió a presentar la misma acumulación de PetR y Cit c6 constitutiva junto con la no acumulación de Pc (Figura 32C, 32D). Al ser mayor la cantidad de cobre añadido la degradación de PetR en la estirpe PETRP+RP ocurrió más rápidamente. Sin embargo, en estas condiciones las estirpes PETRP+M53A y PETRP+M58A presentaban una acumulación menor de PetR con respecto a los cultivos a los que se les añadió menos cobre (Figura 32D). En cualquier caso, esta disminución fue muy leve. El resultado más significativo en las estirpes PETRP+M53A y PETRP+M58A fue la menor acumulación de Cit c6, donde la disminución tras la adición de cobre fue más acusada y, además, se observó una mayor acumulación de Pc (Figura 32C). Figura 32. Determinación de los cambios en la respuesta proteica a cobre debido a la alteración de las metioninas M53 y/o M58. (A) Western Blot de PetJ, PetE, CopM y GSI en 136 las estirpes PETRP+M53A, PETRP+M58A, PETRP+M53AM58A y PETRP+RP cultivadas en BG11c-Cu tras la adición de 500 nM de Cu. La proteína total se aisló a los tiempos indicados tras esto. Se cargaron 5 µg de proteína total de los extractos solubles. (B) Western Blot de PetR y GSI en las estirpes PETRP+M53A, PETRP+M58A, PETRP+M53AM58A y PETRP+RP cultivadas en BG11c-Cu tras la adición de 500 nM de Cu. Tras esto las células fueron recogidas a los tiempos indicados y cargadas (0,2 DO750nm). (C) Análisis mediante Western Blot igual al realizado en el apartado A. A los cultivos se les añadió 1 µM de Cu. (D) Análisis mediante Western Blot igual al realiza en el apartado B. A los cultivos se les añadió 1 µM de Cu. Los resultados son representativos de, al menos, tres experimentos independientes. Puesto que el anticuerpo frente a PetE genera una reacción cruzada con PetJ en caso de sobreexposición la banda correspondiente a PetE aparece remarcada con *. En todos los casos las proteínas se separaron con un gel al 15% mediante electroforesis SDS-PAGE. Los anticuerpos empleados en estos análisis, así como su concentración, están descritos en la Tabla 12. Esto, unido a los resultados anteriores, señaló que la capacidad de detectar cobre al alterar la metionina 53 o 58 se veía parcialmente comprometida mientras que al eliminar ambas PetP perdía esta capacidad. Por tanto, se determinó que ambas metioninas participan en el proceso por el cual PetP es capaz de percibir la presencia de cobre, siendo un proceso cooperativo que implica tanto a M53 como a M58. 5. Estudio de la interacción genética entre petJ, petE, petR y petP. Con el fin de determinar que realmente no hubiera ningún transportador fotosintético de electrones alternativo a los canónicos Pc y Cit c6 se intentó obtener una estirpe carente de ambas proteínas. Para esto se generó un plásmido que permitiera obtener una estirpe donde no se expresara petJ, el plásmido pPETJ_Cm. Con este se transformaron tanto la estirpe silvestre como la estirpe PETE (Giner-Lamia et al., 2012), generándose así las estirpes PETJ y PETEJ (Figura 33A). Sin embargo, la estirpe que carecería de ambos transportadores a pesar de encontrarse totalmente segregada para la inserción en petE (Figura 33E) no segregó la inserción en petJ ni tras más de 2 años mantenida en presencia del antibiótico de selección (Figura 33B). Esto sugiere que no debe existir un tercer transportador fotosintético de electrones en el lumen tilacoidal. Igualmente, esto plantea la cuestión de si podría ser factible sobre un mutante petRP. Para comprobarlo se generaron los mutantes PETER, PETEP, PETERP (Figura 33C) y PETJR, PETJP, PETJRP (Figura 33D). Ya que estos mutantes se habían generado mediante la transformación de PETE y PETJ con los plásmidos adecuados se verificó la segregación del operón slr0240-41 en los mismos. De forma que solo fueron capaces de segregar PETJR y PETJRP, es decir aquellos que expresaban constitutivamente petE, y PETEP, es decir aquel que expresaba constitutivamente petJ. Concluyendo que no es posible obtener un mutante carente de ambos transportadores a pesar de estudios muy anteriores a este que aseguran que Synechocystis puede crecer sin ambos (Zhang et al., 1994). 137 Figura 33. Comprobación de la segregación de las estirpes PETJ, PETE, PETEJ, PETER, PETEP, PETERP, PETJR, PETJP y PETJRP. (A) Esquema de la región genómica petE y petJ en la estirpe WT (silvestre) y los mutantes PETE y PETJ. (B) Análisis mediante PCR de la segregación de petJ usando los oligonucleótidos 235-236. (C) Análisis mediante PCR de la segregación de slr0240-41 en los mutantes generados sobre fondo PETE usando los oligonucleótidos 223-248. (D) Análisis mediante PCR de la segregación de slr0240-41 en los mutantes generados sobre fondo PETJ usando los oligonucleótidos 223-248. (E) Análisis mediante PCR de la segregación del gen que lo codifica para petE usando los oligonucleótidos 277-278. 5.1. Estudio de los cambios fisiológicos de los mutantes PETJ y PETE. Puesto que los niveles de expresión en la estirpe silvestre de petJ en medio con cobre y de petE en medio sin cobre parecen despreciables (Figura 15) se procedió a analizar el crecimiento de las estirpes mutantes generadas. Para ello se realizaron diluciones seriadas de las mismas donde de una dilución a otra la cantidad de células disminuía del orden de 10 veces. Estas estirpes, que provenían de un cultivo exponencial en BG11c-Cu, se cultivaron en placas con medio BG11c (330 nM Cu), BG11c-Cu (~30 nM Cu) o BG11c-Cu+BCSA (no hay cobre disponible) y se analizó su crecimiento (Figura 34A). De esta forma se determinó que la estirpe PETE, a 144 Figura 37. Construcción de las estirpes PETR_An y PETP_An. (A) Representación esquemática de la región génica de alr2569-70 en la estirpe silvestre de Anabaena y el mutante PETR_An. (B) Representación esquemática de la región génica de alr2569-70 en la estirpe silvestre de Anabaena y el mutante PETP_An. (C) Análisis mediante PCR de la segregación de alr2560 en el mutante PETR_An usando los oligonucleótidos 370-371. (D) Análisis mediante PCR de la segregación de alr2570 en el mutante PETP_An usando los oligonucleótidos 370-371. 6.2. Caracterización de los mutantes en el sistema petRP de Anabaena. Con el fin de determinar si en esta cianobacteria también se mantiene la regulación por cobre de PetR mediada por PetP se realizó el experimento que se había realizado para comprobar la respuesta del mutante PETR a la adición de cobre (Figura 15) empleando las estirpes silvestres, PETR_An y PETP_An. Analizando su expresión génica mediante Northern Blot y proteica mediante Western Blot (Figura 38). En este caso el tampón de rotura empleado en las muestras utilizadas para Western Blot contenía, además, 5% de glicerol y 1 mM de EDTA. Con el objetivo de evitar la degradación de PetR al romper las células para obtener los extractos proteicos. De forma que mediante el análisis de la expresión génica se determinó que, al igual que ocurre en Synechocystis, el intercambio petJ/petE en respuesta a cobre era 145 dependiente de la presencia de PetR y PetP. En el mutante PETR_An nunca se expresaba petJ ni siquiera en medio con una baja disponibilidad de cobre (BG11Cu), condición en la que sí se expresaba en la estirpe silvestre. Además, en este mutante la expresión de petE era constitutiva, independientemente de la presencia o no de cobre en el medio (Figura 38A); la expresión de petE en la estirpe silvestre se observaba solo tras la adición de cobre. De hecho, como ocurría en Synechocystis en el mutante PETP_An el efecto fue el contrario al del mutante PETR_An. En PETP_An petJ se expresó constitutivamente, aunque hubiera cobre en el medio (Figura 38A) y no se observó expresión de petE, incluso tras 24 horas de la adición de cobre. Estos resultados son similares a los obtenidos en Synechocystis (Figuras 15 y 18), indicando que este mecanismo y su funcionamiento están conservados en aquellas cianobacterias que presentan los genes petJ, petE y petRP. Figura 38. Análisis del sistema de regulación PetR-PetP y su control en el intercambio petJ/petE ante cobre en Anabaena. (A) Análisis mediante Northern Blot de petE y petJ en las estirpes silvestre, PETR_An y PETP_An. Los filtros con el RNA aislado se hibridaron con las sondas para petE, petJ y copM y posteriormente se rehibridó con la sonda de rnpB. (B) Western Blot de PetJ, PetR y GSI en las estirpes de Anabaena silvestre, PETR_An y PETP_An. Se cargaron 5 µg totales de proteína total de los extractos solubles y estas se separaron con un gel al 15% mediante electroforesis SDS-PAGE. El símbolo * señala la banda específica de PetR. Los resultados son representativos de, al menos, tres experimentos independientes. En ambos casos las células fueron cultivadas en medio BG11-Cu burbujeado con aire enriquecido con 1% (vol/vol) de CO2 y se tomaron las muestras a los tiempos indicados tras añadir 500 nM de Cu. Los anticuerpos empleados en estos análisis, así como su concentración, están descritos en la Tabla 12. Respecto a la acumulación de estas proteínas solo se estudiaron los niveles de Cit c6 y PetR puesto que debido a las diferencias entre la plastocianina de Anabaena y Synechocystis los anticuerpos empleados anteriormente no detectaban la proteína de Anabaena. El resultado fue similar (Figura 38B) al observado para Synechocystis (Figuras 15, 18). En la estirpe silvestre se observaba una degradación de PetR 146 dependiente de cobre, algo que no ocurrió en la estirpe PETP_An, en la estirpe PETR_An no se detectó PetR en ninguna condición. Por tanto, en esta cianobacteria también sería la proteasa la encargada de catalizar la proteólisis de PetR en respuesta a cobre. El que PetR no disminuyera ante la presencia de cobre en PETP_An correlaciona con una acumulación de Cit c6 en esta estirpe respecto a la silvestre, mientras que en PETR_An Cit c6 no está presente (Figura 38B). Esto que apoyaba que su expresión estaría activada por el regulador. Sin embargo, algo diferencial en Anabaena con respecto a Synechocystis fue que para esta misma cantidad de cobre añadido PetR reaparece tras 24 horas de exposición a cobre, mientras que este fenómeno en Synechocystis solamente ocurría a concentraciones menores (Figura 13). Por tanto, el tiempo de activación de la proteasa sería menor en esta cianobacteria o la cantidad de cobre efectiva en ambos organismos debe diferir ante una misma concentración exterior. Este hecho coincidió con la menor disminución en la cantidad de Cit c6 en la estirpe silvestre de Anabaena (Figura 38B), semejante a lo que sucede en Synechocystis para menor cantidad de cobre añadido (Figura 13). Por tanto, en una cianobacteria diazotrófica como Anabaena parece ser que el regulador controla de forma dependiente de cobre la expresión de los genes petE y petJ. Esta proteína activa la expresión de petJ y reprime al gen petE y, a su vez, sería degradada por PetP ante la presencia de cobre en el medio. 147 B. Estudio funcional y caracterización de las FBPasas de Synechocystis sp. PCC 6803. 148 149 1. Análisis fenotípico y fisiológico de los mutantes de la FBPasa y FBP/SBPasa en Synechocystis. La actividad FBPasa en organismos fotosintéticos está implicada tanto en la ruta oxidativa de las pentosas fosfato como el ciclo CBB y la actividad SBPasa está implicada exclusivamente en el ciclo CBB. En cianobacterias, a diferencia de plantas, no existe una compartimentalización y separación de los procesos entre cloroplasto (Ciclo CBB) y citoplasma (ruta PPP). Por tanto, el estudio de la regulación y relación de estas proteínas de cianobacterias respecto a estos procesos es necesaria. Las cianobacterias, presentan una enzima doble que presenta tanto actividad FBPasa como SBPasa (FBP/SBPasa). Algunas cianobacterias (incluida Synechocystis) además presentan una enzima con actividad FBPasa exclusivamente (FBPasa) (Tamoi et al., 1998). Por tanto, se han realizado estudios para profundizar el conocimiento sobre la regulación y esencialidad de estas actividades 1.1. Determinación de los niveles de ambas proteínas ante distintas condiciones de crecimiento. Como primera aproximación para conocer los posibles procesos en los que podrían estar implicados ambas enzimas se realizó la cuantificación de los niveles de ambas en distintas condiciones de crecimiento. Para esto se cultivó la estirpe silvestre en diferentes condiciones respecto a la disponibilidad de carbono y/o luz. De forma que durante 30 horas esta estirpe creció en un medio con limitación de carbono (BG11 sin suplementación de carbono y 50 μmol fotones·m-2 ·s-1), condiciones estándar de crecimiento (BG11c con suplementación de carbono al 1% y 50 μmol fotones·m-2 ·s1), alto carbono (BG11c con suplementación de carbono al 3% y 50 μmol fotones·m2 ·s-1), oscuridad (BG11c con suplementación de carbono al 1% y 0 μmol fotones·m2 ·s-1), alta luz (BG11c con suplementación de carbono al 1% y 185 μmol fotones·m2 ·s-1), baja luz (BG11c con suplementación de carbono al 1% y 5 μmol fotones·m-2 ·s-1), mixotrofía (BG11c con suplementación de carbono al 1%, glucosa 10 mM y 5 μmol fotones·m-2 ·s-1) y fotoheterotrofía (BG11c con suplementación de carbono al 1%, glucosa 10 mM, DCMU 50 μM y 5 μmol fotones·m-2 ·s-1). En estos cultivos se determinó la cantidad de ambas proteínas mediante Western Blot (empleando los anticuerpos obtenidos previamente por el laboratorio), utilizando como valor de referencia las condiciones de cultivo estándar. De forma general, los niveles de proteína permanecen constantes independientemente de las condiciones de crecimiento, observándose solo un aumento de ambas cuando la cantidad de carbono estaba limitada (Figura 39). Por tanto la cantidad de estas enzimas permanece constante de forma general, aunque la actividad FBPasa total aún podría variar por su regulación, como ocurre en las enzimas de plantas (Michelet et al., 2013). Por tanto, que no hubiera grandes diferencias en la cantidad de ambas enzimas no significa que las actividades FBPasa y SBPasa permanezcan constantes en estas condiciones. 150 Figura 39. Regulación de la cantidad de FBP/SBPasa y FBPasa dependiente de las condiciones de luz y carbono. mediante por Western Blot de la cantidad de FBP/SBPasa o FBPasa con respecto a la cantidad de las mismas en BG11c burbujeado con aire enriquecido con 1% (vol/vol) de CO2 a 50 μmol fotones·m-2 ·s-1 (μE). G hace referencia a medio BG11c con 10 mM de glucosa (mixotrofía) y G+D a medio BG11c con 10 mM de glucosa y 50 μM de DCMU (fotoheterotrofía). Se cargaron 5 µg totales de proteína total de los extractos solubles y estos se separaron mediante un gel al 10% de SDS-PAGE. A menos que se indique el porcentaje de carbono burbujeado corresponden al 1% (vol/vol) de CO2. El cultivo realizado aire se tamponó con 10 mM pH 7,5 TES-NaOH. Los resultados se normalizaron con la cantidad de GSI. Los resultados representan la media de, al menos, tres experimentos independientes. Las barras de error corresponden al error estándar de las mismas. Los anticuerpos empleados en estos análisis, así como su concentración, están descritos en la Tabla 12. 1.2. Estudio de los mutantes ΔF y ΔF/S. Para determinar la importancia de ambas enzimas en Synechocystis se realizó el análisis fenotípico y fisiológico de los mutantes carentes de la enzima bifuncional (ΔF/S; slr2094::EryR; Tabla 1) (García-Cañas, 2015) o de la enzima que solo presentaba actividad FBPasa (ΔF; slr0952::Sp/StR; Tabla 1). La segregación de las estirpes se comprobó mediante PCR y la no expresión de la FBPasa en el mutante ΔF y de la FBP/SBPasa en el mutante ΔF/S se comprobó mediante Western Blot (Figura 40). El mutante ΔF/S solo segregaba ante la presencia de glucosa en el medio de cultivo (Yan y Xu, 2008; García-Cañas, 2015). Sin embargo, el doble mutante carente de ambas enzimas no segregaba en ninguna de las condiciones de cultivo empleadas (Figura 40A). Para analizar en mayor detalle el comportamiento de estas estirpes se cultivaron en condiciones de fotoautotrofía, mixotrofía o fotoheterotrofía; midiéndose su crecimiento (como DO750nm), acumulación de clorofila y capacidad de crecer en dichas condiciones. En todos los casos las 151 estirpes provenían de cultivos sólidos donde ya estaban adaptadas a mixotrofía y los preinóculos de cultivos líquidos también crecieron en condiciones de mixotrofía. Este proceso de preadaptación se realizó para asegurar que las posibles diferencias en el crecimiento realmente se debieran a cambios en el metabolismo debidos a las características de cada estirpe y no a una alteración en la capacidad de adaptarse a glucosa. Figura 40. Crecimiento de los mutantes ΔF y ΔF/S en diferentes condiciones de disponibilidad de carbono y luz. (A) Representación esquemática de la región genómica slr2094 en la estirpe WT (silvestre) y el mutante de inserción ΔF/S. Comprobación de la 152 segregación de ΔF/S y de la estirpe ΔF/SΔF cultivados en mixotrofía mediante PCR con los oligonucleótidos 143 y 164. (B) Representación esquemática de la región genómica slr0954 en la estirpe WT (silvestre) y el mutante de inserción ΔF. Comprobación de la segregación de ΔF cultivado en mixotrofía mediante PCR con los oligonucleótidos 144 y 145. (C) Análisis mediante Western Blot de la enzima FBP/SBPasa en las estirpes WT (silvestre), ΔF/S y ΔF cultivadas en mixotrofía. Se cargaron 5 µg totales de proteína total de los extractos solubles y estas se separaron con un gel al 12% mediante electroforesis SDS-PAGE. (D) Western Blot de la enzima FBPasa realizado de igual forma al del apartado C. (E) Crecimiento de las estirpes WT (silvestre), ΔF/S y ΔF en diferentes condiciones tróficas: fotoautotrofía, mixotrofía o fotoheterotrofía (con 10 mM de glucosa y 0,05 mM de DCMU). Los cultivos en fase exponencial de cada una de las estirpes se igualaron a DO750 nm de 0,2 y se hicieron 4 diluciones 1/10 sembrándose 5 µl de cada una. (F) Crecimiento de las estirpes WT (silvestre), ΔF/S y ΔF en agitación y condiciones de fotoheterotrofía. (G) Crecimiento de las estirpes WT (silvestre), ΔF/S y ΔF en agitación y condiciones de mixotrofía. (H) Crecimiento de las estirpes WT (silvestre), ΔF/S y ΔF en agitación y condiciones de fotoautotrofía. (I) Cantidad de clorofila normalizada por el crecimiento de las estirpes WT (silvestre), ΔF/S y ΔF en agitación y condiciones de fotoautotrofía (BG11c), mixotrofía (G) y fotoheterotrofía (G+D) (J) Crecimiento de las estirpes WT (silvestre) y ΔF en diferentes regímenes de luz: luz continua, día largo (16 horas de luz) o día corto (8 horas de luz. El experimento se realizó como el apartado E En este caso las estirpes se cultivaron en un fitotrón con una luz de crecimiento fue de 60 μmol fotones·m-2 ·s-1. Las placas de día corto se cultivaron durante 11 días mientras que las placas de día largo y luz continua solo 7 días. Los resultados representan la media de, al menos, tres experimentos independientes. Las barras de error corresponden al error estándar de los mismos. Los anticuerpos empleados en estos análisis, así como su concentración, están descritos en la Tabla 12. En una primera aproximación se determinó el crecimiento de cada estirpe en las diferentes condiciones. Por tanto, se realizaron diluciones seriadas de los cultivos en medio sólido y fotoautotrofía, mixotrofía o fotoheterotrofía (Figura 40E). Del mismo modo, se analizaron más detalladamente sus características en medio líquido y las diferentes condiciones mediante el estudio de su crecimiento y la acumulación de clorofila. Ya que la estirpe ΔF/S era sensible a luz los experimentos se realizaron a baja luz (5 μmol fotones·m-2 ·s-1). De esta forma se ratificó que dicha estirpe era incapaz de crecer fotoautotróficamente (Figura 40E, 40H), posiblemente debido a que sin una actividad SBPasa la cianobacteria es incapaz de fijar carbono fotosintéticamente. Además, esta estirpe en condiciones de mixotrofía y fotoheterotrofía alcanzó un mayor crecimiento que el resto de las estirpes a los tiempos estudiados (Figura 40E, 40F, 40G). Puesto que las rutas del catabolismo de la glucosa y la fijación de carbono comparten intermediarios esta mejora del crecimiento podría deberse a una menor toma de estos intermediarios desde las rutas catabólicas hacia la fijación (Makowka et al., 2020). Sin embargo, pese a que la estirpe ΔF resultó indistinguible de la estirpe silvestre tanto en fotoautotrofía como en mixotrofía o fotoheterotrofía, se determinó que cuando dicha estirpe crecía en ciclos de luz/oscuridad presentaba una disminución en el crecimiento respecto a la estirpe silvestre (Figura 40J). Este efecto se potenciaba en ciclos de día corto (8 horas de luz y 16 horas de oscuridad) respecto a ciclos de día largo (16 horas de luz), lo que apoyaba que la enzima tuviera un papel en la ruta de las pentosas fosfato durante la oscuridad. 1.2.2. Determinación del consumo de carbono. Ya que tanto la actividad FBPasa como la actividad SBPasa son importantes para los ciclos del carbono en organismos fotosintéticos, se analizó la capacidad de acumular carbono en forma de glucógeno o tomar la glucosa del medio de las 153 estirpes mutantes ΔF/S y ΔF respecto a la estirpe silvestre. Como la estirpe ΔF/S es incapaz de crecer sin un aporte exógeno de carbono, se determinó el consumo de glucosa del medio en mixotrofía y, debido a la sensibilidad a la luz de esta estirpe, estos experimentos se realizaron a baja luz (5 μmol fotones·m-2 ·s-1). A esta intensidad de luz la actividad metabólica a través de las pentosas fosfato debe estar activa para la metabolización de la glucosa (Nakajima et al., 2014). Para estudiar la metabolización del carbono se determinó la cantidad de glucosa extracelular que quedaba en el medio en las distintas estirpes tras inocularlas en medio fresco que contenía glucosa 10 mM; estos cultivos fueron burbujeados con aire que contenía CO2 (1% vol/vol) (Figura 41B). Para cuantificar la glucosa se tomaron muestras de sobrenadante de los cultivos a la vez que se determinaba el crecimiento de los cultivos. Tanto en agitación como en esta condición, donde las estirpes contaban con un suplemento de CO2, la estirpe silvestre y la estirpe ΔF crecieron a la misma tasa y más lentamente que la estirpe ΔF/S en mixotrofía (Figuras 40G, 41A). Se determinó que las estirpes silvestre y ΔF casi no empleaban esta glucosa añadida para crecer, ya que la cantidad de glucosa en el medio durante los primeros dos días varió muy levemente. Sin embargo, estas estirpes sí que presentaron un aumento en su crecimiento al emplear el CO2 del aire. En el caso del mutante ΔF/S, este utilizó la glucosa extracelular para crecer puesto que esta disminuyó progresivamente conforme aumentaba el crecimiento del cultivo (Figura 41A, 41B). Tras 96 horas de crecimiento mixotrófico esta estirpe solo presentaba el 4% de la glucosa inicial mientras que las otras estirpes aun contaban con más del 45% de la glucosa inicial en el medio. De hecho, tras solo 24 horas de cultivo, las estirpes ΔF y silvestre habían consumido menos del 10% de glucosa extracelular mientras que en el caso del mutante ΔF/S ya se había consumido casi el 40% de la glucosa. Por otro lado, se determinó la cantidad de glucógeno en estas estirpes tanto en condiciones de mixotrofía como en fotoautotrofía (Figuras 41C, 41E). En este caso hay que señalar que la estirpe ΔF/S no sobrevive tras 72 horas sin glucosa, de forma que fue imposible determinar la cantidad de glucógeno en fotoautotrofía a las 72 horas (Figura 41D). Tanto en mixotrofía como fotoautotrofía, durante las primeras horas, el mutante ΔF presentaba una menor disminución en los niveles de glucógeno por lo que probablemente lo consumía más lentamente. Así, tras 24 horas creciendo en condiciones fotoautotróficas los niveles de glucógeno fueron un 20% mayor que los de la estirpe silvestre (Figura 41E), mientras que en mixotrofía fueron un 11% mayor (Figura 41C). Los niveles de glucógeno del mutante ΔF/S en fotoautotrofía (Figura 41E) no presentaron cambios tras las primeras 24 horas en dicha condición, mientras que las estirpes ΔF y silvestre sí presentaron una leve disminución paulatina de glucógeno. Sin embargo, en condiciones mixotróficas la estirpe ΔF/S sí que movilizó este glucógeno de una forma similar a la observada en las otras estirpes analizadas (Figura 41C). Por tanto, la mayor cantidad de glucosa que interiorizó la estirpe ΔF/S con respecto a las estirpes silvestre y ΔF no se acumuló en forma de glucógeno, sino que se empleó para su crecimiento. Posiblemente la toma de glucosa del medio fue preferente para la estirpe ΔF/S respecto al consumo de glucógeno propio. 256 • Karapetyan, N. V., Holzwarth, A.R., y Rögner, M. (1999). The photosystem I trimer of cyanobacteria: Molecular organization, excitation dynamics and physiological significance. FEBS Lett. 460, 395-400. • Kato, K., Nagao, R., Jiang, T.Y., Ueno, Y., Yokono, M., Chan, S.K., Watanabe, M., Ikeuchi, M., Shen, J.R., Akimoto, S., et al. (2019). Structure of a cyanobacterial photosystem I tetramer revealed by cryo-electron microscopy. Nat. Commun. 10, 1-9. • Kaur, K., Sharma, A., Capalash, N., y Sharma, P. (2019). Multicopper oxidases: Biocatalysts in microbial pathogenesis and stress management. Microbiol. Res. 222, 113. • Kaushik, M.S., Srivastava, M., y Mishra, A.K. (2018). Iron homeostasis in cyanobacteria. • Kay, K.L., Zhou, L., Tenori, L., Bradley, J.M., Singleton, C., Kihlken, M.A., Ciofi-Baffoni, S., y Le Brun, N.E. (2017). Kinetic analysis of copper transfer from a chaperone to its target protein mediated by complex formation. Chem. Commun. (Camb). 53, 13971400. • Ke, H.M., Zhang, Y.P., y Lipscomb, W.N. (1990). Crystal structure of fructose-1,6bisphosphatase complexed with fructose 6-phosphate, AMP, and magnesium. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 5243-5247. • Ke, H.M., Zhang, Y.P., Liang, J.Y., y Lipscomb, W.N. (1991). Crystal structure of the neutral form of fructose-1,6-bisphosphatase complexed with the product fructose 6phosphate at 2.1-A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 2989-2993. • Kehrer, J.P. (2000). The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology 149, 43-50. • Kelly, G.J., y Latzko, E. (1976). Inhibition of spinach-leaf phosphofructokinase by 2phosphoglycollate. FEBS Lett. 68, 55-58. • Kelly, G.J., Zimmermann, G., y Latzko, E. (1982). Fructose-bisphosphatase from spinach leaf chloroplast and cytoplasm. Methods Enzymol. 90, 371-378. • Keren, N., Aurora, R., y Pakrasi, H.B. (2004). Critical Roles of Bacterioferritins in Iron Storage and Proliferation of Cyanobacteria. Plant Physiol. 135, 1666 LP - 1673. • Kerfeld, C.A., y Melnicki, M.R. (2016). Assembly, function and evolution of 257 cyanobacterial carboxysomes. Curr. Opin. Plant Biol. 31, 66-75. • Kerfeld, C.A., Heinhorst, S., y Cannon, G.C. (2010). Bacterial Microcompartments. Annu. Rev. Microbiol. 64, 391-408. • Khoo, K.K., y Norton, R.S. (2011). Role of Disulfide Bonds in Peptide and Protein Conformation. Amin. Acids, Pept. Proteins Org. Chem. 5, 395-417. • Kirilovsky, D. (2015). Modulating energy arriving at photochemical reaction centers: Orange carotenoid protein-related photoprotection and state transitions. Photosynth. Res. 126, 3-17. • Kirilovsky, D., y Kerfeld, C.A. (2013). The Orange Carotenoid Protein: A blue-green light photoactive protein. Photochem. Photobiol. Sci. 12, 1135-1143. • Klauck, E., Lingnau, M., y Hengge-Aronis, R. (2001). Role of the response regulator RssB in sigma recognition and initiation of sigma proteolysis in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 40, 1381-1390. • Kobayashi, D., Tamoi, M., Iwaki, T., Shigeoka, S., y Wadano, A. (2003). Molecular characterization and redox regulation of phosphoribulokinase from the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7942. Plant Cell Physiol. 44, 269-276. • Kobmann, J., Sonnewald, U., y Willmitzer, L. (1994). Reduction of the chloroplastic fructose-l,6bisphosphatase in transgenic potato plants impairs photosynthesis and plant growth. Plant J. 6, 637-650. • Korn, A. (2010). Respective roles of the ferredoxin:NADP-oxidoreductase isoforms in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Université Paris Sud - Paris XI. • Kranzler, C., Lis, H., Finkel, O.M., Schmetterer, G., Shaked, Y., y Keren, N. (2014). Coordinated transporter activity shapes high-affinity iron acquisition in cyanobacteria. ISME J. 8, 409-417. • Kropat, J., Gallaher, S.D., Urzica, E.I., Nakamoto, S.S., Strenkert, D., Tottey, S., Mason, A.Z., y Merchant, S.S. (2015). Copper economy in Chlamydomonas : Prioritized allocation and reallocation of copper to respiration vs. photosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 2644-2651. • Kruger, N.J., y Von Schaewen, A. (2003). The oxidative pentose phosphate pathway: Structure and organisation. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 236-246. 258 • Krynicka, V., Georg, J., Jackson, P.J., Dickman, M.J., Hunter, C.N., Futschik, M.E., Hess, W.R., y Komenda, J. (2019). Depletion of the FtsH1/3 proteolytic complex suppresses the nutrient stress response in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC 6803. Plant Cell 31, 2912-2928. • Kumar, S., Stecher, G., y Tamura, K. (2016). MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Mol. Biol. Evol. 33, 1870-1874. • Kupriyanova, E. V, Sinetova, M.A., Cho, S.M., Park, Y.-I., Los, D.A., y Pronina, N.A. (2013). CO2-concentrating mechanism in cyanobacterial photosynthesis: organization, physiological role, and evolutionary origin. Photosynth. Res. 117, 133-146. • Kurisu, G., Zhang, H., Smith, J.L., y Cramer, W.A. (2003). Structure of the cytochrome b6f complex of oxygenic photosynthesis: tuning the cavity. Science (80-. ). 302, 10091014. • Labarre, J., Chauvat, F., y Thuriaux, P. (1989). Insertional mutagenesis by random cloning of antibiotic resistance genes into the genome of the cyanobacterium Synechocystis strain PCC 6803. J. Bacteriol. 171, 3449-3457. • Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685. • Lambrecht, S.J., Steglich, C., y Hess, W.R. (2020). A minimum set of regulators to thrive in the ocean. FEMS Microbiol. Rev. • Landau, M., Mayrose, I., Rosenberg, Y., Glaser, F., Martz, E., Pupko, T., y Ben-Tal, N. (2005). ConSurf 2005: The projection of evolutionary conservation scores of residues on protein structures. Nucleic Acids Res. 33, 299-302. • Lange, R., y Hengge-Aronis, R. (1994). The cellular concentration of the subunit of RNA polymerase in Escherichia coli is controlled at the levels of transcription , translation , and protein stability. Genes Dev. 8, 1600-1612. • Latunde-Dada, Y. (2017). Ferroptosis: Role of lipid peroxidation, iron and ferritinophagy. Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj. 1861. • Laughlin, T.G., Bayne, A.N., Trempe, J.F., Savage, D.F., y Davies, K.M. (2019). Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature 566, 411-414. 259 • Lawson, T., Bryant, B., Lefebvre, S., Lloyd, J.C., y Raines, C.A. (2006). Decreased SBPase activity alters growth and development in transgenic tobacco plants. Plant, Cell Environ. 29, 48-58. • Lee, S.-W., y Hahn, T.-R. (2003). Light-regulated differential expression of pea chloroplast and cytosolic fructose-1,6-bisphosphatases. Plant Cell Rep. 21, 611-618. • Lefebvre, S., Lawson, T., Fryer, M., Zakhleniuk, O. V, Lloyd, J.C., y Raines, C.A. (2005). Increased Sedoheptulose-1 , 7-Bisphosphatase Activity in Transgenic Tobacco Plants Stimulates Photosynthesis and Growth from an Early Stage in Development 1. Plant Physiol. 138, 451-460. • Leonhardt, K., y Straus, N.A. (1994). Photosystem II genes isiA, psbDI and psbC in Anabaena sp. PCC 7120: cloning, sequencing and the transcriptional regulation in ironstressed and iron-repleted cells. Plant Mol. Biol. 24, 63-73. • Lewis, R.A., y Dyke, K.G.H. (2000). MecI represses synthesis from the β-lactamase operon of Staphylococcus aureus. J. Antimicrob. Chemother. 45, 139-144. • Li, W.K.W. (1994). Primary production of prochlorophytes, cyanobacteria, and eucaryotic ultraphytoplankton: Measurements from flow cytometric sorting. Limnol. Oceanogr. 39, 169-175. • Li, M., Yang, Q., Zhang, L., Li, H., Cui, Y., y Wu, Q. (2007). Identification of novel targets of cyanobacterial glutaredoxin. Arch. Biochem. Biophys. 458, 220-228. • Li, W., Su, H.N., Pu, Y., Chen, J., Liu, L.N., Liu, Q., y Qin, S. (2019). Phycobiliproteins: Molecular structure, production, applications, and prospects. Biotechnol. Adv. 37, 340353. • Liang, F., y Lindblad, P. (2016). Effects of overexpressing photosynthetic carbon flux control enzymes in the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803. Metab. Eng. 38, 5664. • Liberton, M., Howard Berg, R., Heuser, J., Roth, R., y Pakrasi, H.B. (2006). Ultrastructure of the membrane systems in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. Protoplasma 227, 129-138. • Lin, C.-T., Wu, C.-C., Chen, Y.-S., Lai, Y.-C., Chi, C., Lin, J.-C., Chen, Y., y Peng, H.-L. (2011). Fur regulation of the capsular polysaccharide biosynthesis and iron-acquisition 260 systems in Klebsiella pneumoniae CG43. Microbiology 157, 419-429. • Lindahl, M., y Florencio, F.J. (2003). Thioredoxin-linked processes in cyanobacteria are as numerous as in chloroplasts, but targets are different. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 16107 LP - 16112. • Lindberg, P., Park, S., y Melis, A. (2010). Engineering a platform for photosynthetic isoprene production in cyanobacteria, using Synechocystis as the model organism. Metab. Eng. 12, 70-79. • Liu, L.-N. (2016). Distribution and dynamics of electron transport complexes in cyanobacterial thylakoid membranes. Biochim. Biophys. Acta 1857, 256-265. • Liu, L.N., Bryan, S.J., Huang, F., Yu, J., Nixon, P.J., Rich, P.R., y Mullineaux, C.W. (2012). Control of electron transport routes through redox-regulated redistribution of respiratory complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 11431-11436. • Liu, T., Chen, X., Ma, Z., Shokes, J., Hemmingsen, L., Scott, R.A., y Giedroc, D.P. (2008). A Cu(I)-sensing ArsR family metal sensor protein with a relaxed metal selectivity profile. Biochemistry 47, 10564-10575. • Llarrull, L.I., y Mobashery, S. (2012). Dissection of Events in the Resistance to βLactam Antibiotics Mediated by the Protein BlaR1 from Staphylococcus aureus. Biochemistry 51, 4642-4649. • Llarrull, L.I., Toth, M., Champion, M.M., y Mobashery, S. (2011). Activation of BlaR1 protein of methicillin-resistant Staphylococcus aureus, its proteolytic processing, and recovery from induction of resistance. J. Biol. Chem. 286, 38148-38158. • Lloyd, D.R., y Phillips, D.H. (1999). Oxidative DNA damage mediated by copper(II), iron(II) and nickel(II) Fenton reactions: evidence for site-specific mechanisms in the formation of double-strand breaks, 8-hydroxydeoxyguanosine and putative intrastrand cross-links. Mutat. Res. Mol. Mech. Mutagen. 424, 23-36. • Lockau, W. (1981). Evidence for a dual role of cytochrome c-553 and plastocyanin in photosynthesis and respiration of the cyanobacterium, Anabaena variabilis. Arch. Microbiol. 128, 336-340. • Long, B.M., Rae, B.D., Rolland, V., Förster, B., y Price, G.D. (2016). Cyanobacterial CO2-concentrating mechanism components: Function and prospects for plant metabolic 261 engineering. Curr. Opin. Plant Biol. 31, 1-8. • López-Calcagno, P.E., Howard, T.P., y Raines, C.A. (2014). The CP12 protein family: A thioredoxin-mediated metabolic switch? Front. Plant Sci. 5, 1-9. • López-Garcia, P., Moreira, D., Douzery, E., Forterre, P., Zuilen, M., Claeys, P., y Prieur, D. (2006). Ancient fossil record and early evolution (ca. 3.8 to 0.5 Ga). Earth, Moon Planets 98, 247-290. • López-Gomollón, S., Hernández, J.A., Pellicer, S., Angarica, V.E., Peleato, M.L., y Fillat, M.F. (2007). Cross-talk Between Iron and Nitrogen Regulatory Networks in Anabaena (Nostoc) sp. PCC 7120: Identification of Overlapping Genes in FurA and NtcA Regulons. J. Mol. Biol. 374, 267-281. • López-Maury, L., García-Domínguez, M., Florencio, F.J., y Reyes, J.C. (2002). A twocomponent signal transduction system involved in nickel sensing in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Mol. Microbiol. 43, 247-256. • López-Maury, L., Florencio, F.J., y Reyes, J.C. (2003). Arsenic sensing and resistance system in the cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. • López-Maury, L., Heredia-Martínez, L.G., y Florencio, F.J. (2018). Characterization of TrxC, an Atypical Thioredoxin Exclusively Present in Cyanobacteria. Antioxidants (Basel, Switzerland) 7, 164. • Lowry, O.H., Rosebrought, N.J., Farr, A.L., y Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275. • Lu, Y. (2003). 8.4 - Electron Transfer: Cupredoxins. In Comprehensive Coordination Chemistry II, J.A. McCleverty, y T.J.B.T.-C.C.C.I.I. Meyer, eds. (Oxford: Pergamon), pp. 91-122. • Lyons, J.A., Aragão, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V, Soulimane, T., y Caffrey, M. (2012). Structural insights into electron transfer in caa3-type cytochrome oxidase. Nature 487, 514-518. • Mackinney, R. (1941). Absorption of light by chlorophyll solutions. J. Biol. Chem. 140, 315-322. • Maeda, S., Badger, M.R., y Price, G.D. (2002). Novel gene products associated with NdhD3/D4-containing NDH-1 complexes are involved in photosynthetic CO2 hydration 262 in the cyanobacterium, Synechococcus sp. PCC7942. Mol. Microbiol. 43, 425-435. • Makowka, A., Nichelmann, L., Schulze, D., Spengler, K., Wittmann, C., Forchhammer, K., y Gutekunst, K. (2020). Glycolytic shunts replenish the Calvin-Benson-Bassham cycle as anaplerotic reactions in Cyanobacteria. Mol. Plant 13, 471-482. • Malavath, T., Caspy, I., Netzer-El, S.Y., Klaiman, D., y Nelson, N. (2018). Structure and function of wild-type and subunit-depleted photosystem I in Synechocystis. Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg. 1859, 645-654. • Mallen-Ponce, M.J. (2020). Esencialidad de la tiorredoxina TrxA en cianobacterias. Estudio de un mutante condicional en Synechocystis sp. PCC 6803. Universidad de Sevilla. • Marcus, F., Edelstein, I., Reardon, I., y Heinrikson, R.L. (1982). Complete amino acid sequence of pig kidney fructose-1,6-bisphosphatase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79, 7161-7165. • Mareš, J., Strunecký, O., Bučinská, L., y Wiedermannová, J. (2019). Evolutionary patterns of thylakoid architecture in Cyanobacteria. Front. Microbiol. 10, 1-22. • Marin, K., Kanesaki, Y., Los, D.A., Murata, N., Suzuki, I., y Hagemann, M. (2004). Gene expression profiling reflects physiological processes in salt acclimation of Synechocystis sp. strain PCC 6803. Plant Physiol. 136, 3290-3300. • Markwell, M.A., Haas, S.M., Bieber, L.L., y Tolbert, N.E. (1978). A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples. Anal. Biochem. 87, 206-210. • Marrero, A., Mallorquí-Fernández, G., Guevara, T., García-Castellanos, R., y GomisRüth, F.X. (2006). Unbound and acylated structures of the MecR1 extracellular antibiotic-sensor domain provide insights into the signal-transduction system that triggers methicillin resistance. J. Mol. Biol. 361, 506-521. • Marri, L., Zaffagnini, M., Collin, V., Issakidis-Bourguet, E., Lemaire, S.D., Pupillo, P., Sparla, F., Miginiac-Maslow, M., y Trost, P. (2009). Prompt and easy activation by specific thioredoxins of calvin cycle enzymes of Arabidopsis thaliana associated in the GAPDH/CP12/PRK supramolecular complex. Mol. Plant 2, 259-269. • Marteyn, B., Domain, F., Legrain, P., Chauvat, F., y Cassier-Chauvat, C. (2009). The 263 thioredoxin reductase-glutaredoxins-ferredoxin crossroad pathway for selenate tolerance in Synechocystis sp. PCC 6803. Mol. Microbiol. 71, 520-532. • Maruyama, M., Nishiguchi, H., Toyoshima, M., Okahashi, N., Matsuda, F., y Shimizu, H. (2019). Time-resolved analysis of short term metabolic adaptation at dark transition in Synechocystis sp. PCC 6803. J. Biosci. Bioeng. xxx. • Mata-Cabana, A., Florencio, F.J., y Lindahl, M. (2007). Membrane proteins from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 interacting with thioredoxin. Proteomics 7, 3953-3963. • Van de Meene, A.M.L., Hohmann-Marriott, M.F., Vermaas, W.F.J., y Roberson, R.W. (2006). The three-dimensional structure of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Arch. Microbiol. 184, 259-270. • Merino-Puerto, V., Mariscal, V., Mullineaux, C.W., Herrero, A., y Flores, E. (2010). Fra proteins influencing filament integrity, diazotrophy and localization of septal protein SepJ in the heterocyst-forming cyanobacterium Anabaena sp. Mol. Microbiol. 75, 11591170. • Merrick, M.J. (1993). In a class of its own — the RNA polymerase sigma factor σ;54 (σN). Mol. Microbiol. 10, 903-909. • Mescola, A., Dauvin, M., Amoroso, A., Duwez, A.S., y Joris, B. (2019). Single-molecule force spectroscopy to decipher the early signalling step in membrane-bound penicillin receptors embedded into a lipid bilayer. Nanoscale 11, 12275-12284. • Meyer, Y., Buchanan, B.B., Vignols, F., y Reichheld, J.-P. (2009). Thioredoxins and glutaredoxins: unifying elements in redox biology. Annu. Rev. Genet. 43, 335-367. • Michel, H., Behr, J., Harrenga, A., y Kannt, A. (1998). Cytochrome c oxidase: structure and spectroscopy. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 27, 329-356. • Michelet, L., Zaffagnini, M., Morisse, S., Sparla, F., Pérez-Pérez, M.E., Francia, F., Danon, A., Marchand, C.H., Fermani, S., Trost, P., et al. (2013). Redox regulation of the Calvin–Benson cycle: something old, something new. Front. Mol. Biosci. 4, 1-21. • Mihara, S., Wakao, H., Yoshida, K., Higo, A., Sugiura, K., Tsuchiya, A., Nomata, J., Wakabayashi, K., y Hisabori, T. (2018). Thioredoxin regulates G6PDH activity by changing redox states of OpcA in the nitrogen-fixing cyanobacterium Anabaena sp. 264 PCC 7120. Biochem. J. 475, 1091-1105. • Mihara, S., Sugiura, K., Yoshida, K., y Hisabori, T. (2020). Thioredoxin targets are regulated in heterocysts of cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 in a lightindependent manner. J. Exp. Bot. 71, 2018-2027. • Minakhin, L., Bhagat, S., Brunning, A., Campbell, E.A., Darst, S.A., Ebright, R.H., y Severinov, K. (2001). Bacterial RNA polymerase subunit ω and eukaryotic RNA polymerase subunit RPB6 are sequence, structural, and functional homologs and promote RNA polymerase assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 892-897. • Mirus, O., Strauss, S., Nicolaisen, K., von Haeseler, A., y Schleiff, E. (2009). TonBdependent transporters and their occurrence in cyanobacteria. BMC Biol. 7, 68. • Mitschke, J., Georg, J., Scholz, I., Sharma, C.M., Dienst, D., Bantscheff, J., Voß, B., Steglich, C., Wilde, A., Vogel, J., et al. (2011). An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 2124-2129. • Miyagawa, Y., Tamoi, M., y Shigeoka, S. (2001). Overexpression of a cyanobacterial fructose-1,6-/sedoheptulose-1,7-bisphosphatase in tobacco enhances photosynthesis and growth. Nat. Biotechnol. 19, 965-969. • Mohamed, A., y Jansson, C. (1989). Influence of light on accumulation of photosynthesis-specific transcripts in the cyanobacterium Synechocystis 6803. Plant Mol. Biol. 13, 693-700. • Montoya, J.P., Holl, C.M., Zehr, J.P., Hansen, A., Villareal, T.A., y Capone, D.G. (2004). High rates of N2 fixation by unicellular diazotrophs in the oligotrophic Pacific Ocean. Nature 430, 1027-1031. • Montrichard, F., Alkhalfioui, F., Yano, H., Vensel, W.H., Hurkman, W.J., y Buchanan, B.B. (2009). Thioredoxin targets in plants: The first 30 years. J. Proteomics 72, 452474. • Morel, F.M.M., Rueter, J.G., y Price, N.M. (1991). Iron Nutrition of Phytoplankton and its Possible Importance in the Ecology of Ocean Regions with High Nutrient and Low Biomass. Oceanography 4, 56-61. • Moreno-Cabezuelo, J.Á., López-Lozano, A., Díez, J., y García-Fernández, J.M. (2019). 265 Differential expression of the glucose transporter gene glcH in response to glucose and light in marine picocyanobacteria. PeerJ 2019. • Morisse, S., Michelet, L., Bedhomme, M., Marchand, C.H., Calvaresi, M., Trost, P., Fermani, S., Zaffagnini, M., y Lemaire, S.D. (2014). Thioredoxin-dependent redox regulation of chloroplastic phosphoglycerate kinase from Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 289, 30012-30024. • Morrissey, J., y Bowler, C. (2012). Iron utilization in marine cyanobacteria and eukaryotic algae. Front. Microbiol. 3, 43. • Muñoz-Marín, M. del C., Gómez-Baena, G., Díez, J., Beynon, R.J., González-Ballester, D., Zubkov, M. V., y García-Fernández, J.M. (2017). Glucose uptake in Prochlorococcus: Diversity of kinetics and effects on the metabolism. Front. Microbiol. 8, 1-17. • Muro-Pastor, A.M., y Hess, W.R. (2012). Heterocyst differentiation: from single mutants to global approaches. Trends Microbiol. 20, 548-557. • Muro-Pastor, M.I., Reyes, J.C., y Florencio, F.J. (2005). Ammonium assimilation in cyanobacteria. Photosynth. Res. 83, 135-150. • Musser, S.M., Stowell, M.H.B., y Chan, S.I. (1993). Comparison of ubiquinol and cytochrome c terminal oxidases. FEBS Lett. 327, 131-136. • Nakajima, T., Kajihata, S., Yoshikawa, K., Matsuda, F., Furusawa, C., Hirasawa, T., y Shimizu, H. (2014). Integrated metabolic flux and omics analysis of Synechocystis sp. PCC 6803 under mixotrophic and photoheterotrophic conditions. Plant Cell Physiol. 55, 1606-1612. • Nakajima, T., Yoshikawa, K., Toya, Y., Matsuda, F., y Shimizu, H. (2017). Metabolic Flux Analysis of the Synechocystis sp. PCC 6803 ΔnrtABCD Mutant Reveals a Mechanism for Metabolic Adaptation to Nitrogen-Limited Conditions. Plant Cell Physiol. 58, 537-545. • Naranjo, B., Diaz-Espejo, A., Lindahl, M., y Cejudo, F.J. (2016). Type-f thioredoxins have a role in the short-term activation of carbon metabolism and their loss affects growth under short-day conditions in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 67, 1951-1964. • Nawrocki, W.J., Bailleul, B., Picot, D., Cardol, P., Rappaport, F., Wollman, F.A., y Joliot, 272 fructose 2,6-biphosphate. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 2861-2863. • Scheffler, J.E., y Fromm, H.J. (1986). Regulation of rabbit liver fructose-1,6bisphosphatase by metals, nucleotides, and fructose 2,6-bisphosphate as determined from fluorescence studies. Biochemistry 25, 6659-6665. • Scherer, S. (1990). Do photosynthetic and respiratory electron transport chains share redox proteins? Trends Biochem. Sci. 15, 458-462. • Schirrmeister, B.E., de Vos, J.M., Antonelli, A., y Bagheri, H.C. (2013). Evolution of multicellularity coincided with increased diversification of cyanobacteria and the Great Oxidation Event. Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 1791 LP - 1796. • Schmetterer, G.R. (1990). Sequence conservation among the glucose transporter from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 and mammalian glucose transporters. Plant Mol. Biol. 14, 697-706. • Schmidt, A. (1981). A thioredoxin-activated fructose-1,6-bisphosphatase from the cyanobacterium Synechococcus 6301. Planta. • Schopf, J.W. (1993). Microfossils of the Early Archean Apex Chert: New Evidence of the Antiquity of Life. Science (80-. ). 260, 640-646. • Schopf, J.W. (2011). The paleobiological record of photosynthesis. Photosynth. Res. 107, 87-101. • Schorsch, M., Kramer, M., Goss, T., Eisenhut, M., Robinson, N., Osman, D., Wilde, A., Sadaf, S., Brückler, H., Walder, L., et al. (2018). A unique ferredoxin acts as a player in the low-iron response of photosynthetic organisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 115, E12111-E12120. • Schweder, T., Lee, K.H., Lomovskaya, O., y Matin, A. (1996). Regulation of Escherichia coli starvation sigma factor (sigma s) by ClpXP protease. J. Bacteriol. 178, 470-476. • Seo, S.W., Kim, D., Latif, H., O’Brien, E.J., Szubin, R., y Palsson, B.O. (2014). Deciphering Fur transcriptional regulatory network highlights its complex role beyond iron metabolism in Escherichia coli. Nat. Commun. 5, 4910. • Serrato, A.J., Yubero-Serrano, E.M., Sandalio, L.M., MuÑoz-Blanco, J., Chueca, A., Caballero, J.L., y Sahrawy, M. (2009). CpFBPaseII, a novel redox-independent chloroplastic isoform of fructose-1,6-bisphosphatase. Plant, Cell Environ. 32, 811-827. 273 • Serrato, A.J., Fernández-Trijueque, J., Barajas-López, J.-D.-D., Chueca, A., Sahrawy, M., y Reichheld, J.-P. (2013). Plastid thioredoxins: a " one-for-all " redox-signaling system in plants. Front. Plant Sci. 1120, 28-1. • Serrato, A.J., Romero-Puertas, M.C., Lázaro-Payo, A., y Sahrawy, M. (2018). Regulation by S-nitrosylation of the Calvin-Benson cycle fructose-1,6-bisphosphatase in Pisum sativum. Redox Biol. 14, 409-416. • Sevilla, F., Camejo, D., Ortiz-Espín, A., Calderón, A., Lázaro, J.J., y Jiménez, A. (2015). The thioredoxin/peroxiredoxin/sulfiredoxin system: current overview on its redox function in plants and regulation by reactive oxygen and nitrogen species. J. Exp. Bot. 66, 2945-2955. • Shafeeq, S., Yesilkaya, H., Kloosterman, T.G., Narayanan, G., Wandel, M., Andrew, P.W., Kuipers, O.P., y Morrissey, J.A. (2011). The cop operon is required for copper homeostasis and contributes to virulence in Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 81, 1255-1270. • Shcolnick, S., y Keren, N. (2006). Metal Homeostasis in Cyanobacteria and Chloroplasts. Balancing Benefits and Risks to the Photosynthetic Apparatus. Plant Physiol. 141, 805 LP - 810. • Shibata, M., Katoh, H., Sonoda, M., Ohkawa, H., Shimoyama, M., Fukuzawa, H., Kaplan, A., y Ogawa, T. (2002). Genes essential to sodium-dependent bicarbonate transport in cyanobacteria: function and phylogenetic analysis. J. Biol. Chem. 277, 18658-18664. • Shieh, H.L., y Chiang, H.L. (1998). In vitro reconstitution of glucose-induced targeting of fructose-1, 6-bisphosphatase into the vacuole in semi-intact yeast cells. J. Biol. Chem. 273, 3381-3387. • Shih, P.M., Wu, D., Latifi, A., Axen, S.D., Fewer, D.P., Talla, E., Calteau, A., Cai, F., Tandeau De Marsac, N., Rippka, R., et al. (2013). Improving the coverage of the cyanobacterial phylum using diversity-driven genome sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 1053-1058. • Shimakawa, G., y Miyake, C. (2018). Respiratory terminal oxidases alleviate photooxidative damage in photosystem I during repetitive short-pulse illumination in 274 Synechocystis sp. PCC 6803. Photosynth. Res. 137, 241-250. • Shimakawa, G., Hasunuma, T., Kondo, A., Matsuda, M., Makino, A., y Miyake, C. (2014). Respiration accumulates Calvin cycle intermediates for the rapid start of photosynthesis in Synechocystis sp. PCC 6803. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78, 19972007. • Shimohata, N., Chiba, S., Saikawa, N., Ito, K., y Akiyama, Y. (2002). The Cpx stress response system of Escherichia coli senses plasma membrane proteins and controls HtpX, a membrane protease with a cytosolic active site. Genes Cells 7, 653-662. • Shinde, S., Zhang, X., Singapuri, S.P., Kalra, I., Liu, X., Morgan-Kiss, R.M., y Wang, X. (2020). Glycogen metabolism supports photosynthesis start through the oxidative pentose phosphate pathway in cyanobacteria. Plant Physiol. 182, 507-517. • Skalecki, K., Rakus, D., Wiśniewski, J.R., Kolodziej, J., y Dzugaj, A. (1999). cDNA sequence and kinetic properties of human lung fructose(1, 6)bisphosphatase. Arch. Biochem. Biophys. 365, 1-9. • Solioz, M., y Stoyanov, J. V (2003). Copper homeostasis in Enterococcus hirae. FEMS Microbiol. Rev. 27, 183-195. • Solioz, M., Abicht, H.K., Mermod, M., y Mancini, S. (2010). Response of gram-positive bacteria to copper stress. J. Biol. Inorg. Chem. JBIC a Publ. Soc. Biol. Inorg. Chem. 15, 3-14. • Stanier, R.Y., y Cohen-Bazire, G. (1977). Phototrophic prokaryotes: The Cyanobacteria. Annu. Revi. Microbiol. 31, 225-274. • Stevanovic, M., Lehmann, C., y Schleiff, E. (2013). The response of the TonBdependent transport network in Anabaena sp . PCC 7120 to cell density and metal availability. BioMetals 26, 549-560. • Strand, Ê., Zrenner, R., Trevanion, S., Stitt, M., Gustafsson, P., y Gardestro, P. (2000). Decreased expression of two key enzymes in the sucrose bisphosphatase and sucrose phosphate synthase , has remarkably different consequences for photosynthetic carbon metabolism in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Cell 23, 756-770. • Straude, M.W., Frederik, T.E., Natarajan, S. V., Wilson, B.D., Tanner, C.E., Ruggiero, S.T., Mobashery, S., y Peng, J.W. (2015). Investigation of Signal Transduction Routes 275 within the Sensor/ Transducer Protein BlaR1 of Staphylococcus aureus. Biochemistry 54, 1600-1610. • Ströher, E., y Millar, A.H. (2012). The biological roles of glutaredoxins. Biochem. J. 446, 333-348. • Studier, F.W., y Moffatt, B.A. (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes*1. J. Mol. Biol. 189, 113-130. • Le Sueur, A.L., Schaugaard, R.N., Baik, M.H., y Thielges, M.C. (2016). Methionine Ligand Interaction in a Blue Copper Protein Characterized by Site-Selective Infrared Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 138, 7187-7193. • Sun, Y., Liao, X., Li, D., Feng, L., Li, J., Wang, X., Jin, J., Yi, F., Zhou, L., y Wan, J. (2012). Study on the interaction between cyanobacteria FBP/SBPase and metal ions. Spectrochim. Acta - Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 89, 337-344. • Szklarczyk, D., Gable, A.L., Lyon, D., Junge, A., Wyder, S., Huerta-Cepas, J., Simonovic, M., Doncheva, N.T., Morris, J.H., Bork, P., et al. (2019). STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Res. 47, D607-D613. • Tamarit, J., Bellı, G., Cabiscol, E., Herrero, E., y Ros, J. (2003). Biochemical Characterization of Yeast Mitochondrial Grx5 Monothiol Glutaredoxin *. J. Biol. Chem. 278, 25745-25751. • Tamoi, M., Ishikawa, T., Takeda, T., y Shigeoka, S. (1996). Molecular characterization and resistance to hydrogen peroxide of two fructose-1,6-bisphosphatases from Synechococcus PCC 7942. Arch. Biochem. Biophys. 334, 27-36. • Tamoi, M., Murakami, A., Takeda, T., y Shigeoka, S. (1998). Acquisition of a new type of fructose-1,6-bisphosphatase with resistance to hydrogen peroxide in cyanobacteria: Molecular characterization of the enzyme from Synechocystis PCC 6803. Biochim. Biophys. Acta - Protein Struct. Mol. Enzymol. 1383, 232-244. • Tamoi, M., Nagaoka, M., Miyagawa, Y., y Shigeoka, S. (2006). Contribution of Fructose-1 , 6-bisphosphatase and Sedoheptulose-1 , 7bisphosphatase to the Photosynthetic Rate and Carbon Flow in the Calvin Cycle in Transgenic Plants. Plant Cell Physiol. 47, 380-390. 276 • Teixidó, L., Carrasco, B., Alonso, J.C., Barbé, J., y Campoy, S. (2011). Fur Activates the Expression of Salmonella enterica Pathogenicity Island 1 by Directly Interacting with the hilD Operator In Vivo and In Vitro. PLoS One 6, e19711. • Tejada Gómez, I. (2018). Nuevas herramientas genéticas en Synechocystis sp . PCC 6803 basadas en el sistema de resistencia a arsénico. • Tejwani, G.A. (1983). Regulation of fructose-bisphosphatase activity. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 54, 121-194. • Thiel, T., y Poo, H. (1989). Transformation of a filamentous cyanobacterium by electroporation. J. Bacteriol. 171, 5743-5746. • Thomas, J.C., Ughy, B., Lagoutte, B., y Ajlani, G. (2006). A second isoform of the ferredoxin:NADP oxidoreductase generated by an in-frame initiation of translation. • Tomitani, A., Knoll, A.H., Cavanaugh, C.M., y Ohno, T. (2006). The evolutionary diversification of cyanobacteria: Molecular-phylogenetic and paleontological perspectives. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 5442-5447. • Torrado, A. (2017). Estudio funcional y estructural de las isoformas del citocromo c 6. • Torrado, A., Valladares, A., Puerto-Galán, L., Hervás, M., Navarro, J.A., y MolinaHeredia, F.P. (2017). Cyt c6-3: A new isoform of photosynthetic Cyt c6 exclusive to heterocyst-forming cyanobacteria. Plant Cell Physiol. 58, 256-265. • Tottey, S., Harvie, D.R., y Robinson, N.J. (2005). Understanding how cells allocate metals using metal sensors and metallochaperones. Acc. Chem. Res. 38, 775-783. • Tottey, S., Waldron, K.J., Firbank, S.J., Reale, B., Bessant, C., Sato, K., Cheek, T.R., Gray, J., Banfield, M.J., Dennison, C., et al. (2008). Protein-folding location can regulate manganese-binding versus copperor zinc-binding. Nature 455, 1138-1142. • Tottey, S., Patterson, C.J., Banci, L., Bertini, I., Felli, I.C., Pavelkova, A., y Dainty, S.J. (2012). Cyanobacterial metallochaperone inhibits deleterious side reactions of copper. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 95-100. • Tripp, H.J., Bench, S.R., Turk, K.A., Foster, R.A., Desany, B.A., Niazi, F., Affourtit, J.P., y Zehr, J.P. (2010). Metabolic streamlining in an open-ocean nitrogen-fixing cyanobacterium. Nature 464, 90-94. • Turgay, K., Hamoen, L.W., Venema, G., y Dubnau, D. (1997). Biochemical 277 characterization of a molecular switch involving the heat shock protein ClpC, which controls the activity of ComK, the competence transcription factor of Bacillus subtilis. Genes Dev. 11, 119-128. • Turgay, K., Hahn, J., Burghoorn, J., y Dubnau, D. (1998). Competence in Bacillus subtilis is controlled by regulated proteolysis of a transcription factor. EMBO J. 17, 6730-6738. • Udvardy, J., Godeh, M.M., y Farkas, G.L. (1982). Regulatory properties of a fructose 1,6-biphosphatase from the cyanobacterium Anacystis nidulans. J. Bacteriol. 151, 203208. • Ueda, K., Nakajima, T., Yoshikawa, K., Toya, Y., Matsuda, F., y Shimizu, H. (2018). Metabolic flux of the oxidative pentose phosphate pathway under low light conditions in Synechocystis sp. PCC 6803. J. Biosci. Bioeng. 126, 38-43. • Vavilin, D. V, y Vermaas, W.F.J. (2002). Regulation of the tetrapyrrole biosynthetic pathway leading to heme and chlorophyll in plants and cyanobacteria. Physiol. Plant. 115, 9-24. • Vega-Palas, M.A., Flores, E., y Herrero, A. (1992). NtcA, a global nitrogen regulator from the cyanobacterium Synechococcus that belongs to the Crp family of bacterial regulators. Mol. Microbiol. 6, 1853-1859. • Vermaas, W.F. (2001). Photosynthesis and Respiration in Cyanobacteria. Encycl. Life Sci. 245-251. • Vijayan, V., Jain, I.H., y O’Shea, E.K. (2011). A high resolution map of a cyanobacterial transcriptome. Genome Biol. 12, R47. • Villeret, V., Huang, S., Zhang, Y., Xue, Y., y Lipscomb, W.N. (1995). Crystal structure of spinach chloroplast fructose-1,6-bisphosphatase at 2.8 A resolution. Biochemistry 34, 4299-4306. • Vinyard, D.J., Ananyev, G.M., y Dismukes, G.C. (2013). Photosystem II: the reaction center of oxygenic photosynthesis. Annu. Rev. Biochem. 82, 577-606. • Vioque, A. (1992). Analysis of the gene encoding the RNA subunit of ribonuclease P from cyanobacteria. Nucleic Acids Res. 20, 6331-6337. • Vlamis-Gardikas, A., y Holmgren, A. (2002). Thioredoxin and glutaredoxin isoforms. 278 Methods Enzymol. 347, 286-296. • Vogel, J., Axmann, I.M., Herzel, H., y Hess, W.R. (2003). Experimental and computational analysis of transcriptional start sites in the cyanobacterium Prochlorococcus MED4. Nucleic Acids Res. 31, 2890-2899. • Wagner, W., y Follmann, H. (1978). Multiple Functions of Thioredoxins. Z. naturforsh 33, 517-520. • Waldron, K.J., y Robinson, N.J. (2009). How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal? Nat. Rev. Microbiol. 7, 25-35. • Waldron, K.J., Tottey, S., Yanagisawa, S., Dennison, C., y Robinson, N.J. (2007). A Periplasmic Iron-binding Protein Contributes toward Inward Copper Supply. J. Biol. Chem. 282, 3837-3846. • Waldron, K.J., Firbank, S.J., Dainty, S.J., Tottey, S., y Robinson, N.J. (2010). Structure and Metal Loading of a Soluble Periplasm. J. Biol. Chem. 285, 32504-32511. • Van Walraven, H.S., Strotmann, H., Schwarz, O., y Rumberg, B. (1996). The H+/ATP coupling ratio of the ATP synthase from thiol-modulated chloroplasts and two cyanobacterial strains is four. FEBS Lett. 379, 309-313. • Wan, N., DeLorenzo, D.M., He, L., You, L., Immethun, C.M., Wang, G., Baidoo, E.E.K., Hollinshead, W., Keasling, J.D., Moon, T.S., et al. (2017). Cyanobacterial carbon metabolism: Fluxome plasticity and oxygen dependence. Biotechnol. Bioeng. 114, 1593-1602. • Wang, M., Bi, H., Liu, P., y Ai, X. (2011). Molecular cloning and expression analysis of the gene encoding sedoheptulose-1 , 7-bisphosphatase from Cucumis sativus. Sci. Hortic. (Amsterdam). 129, 414-420. • Wang, T., Shen, G., Balasubramanian, R., Mcintosh, L., Bryant, D.A., y Golbeck, J.H. (2004). The sufR Gene (sll0088 in Synechocystis sp. Strain PCC 6803) Functions as a Repressor of the sufBCDS Operon in Iron-Sulfur Cluster Biogenesis in Cyanobacteria. J. Bacteriol. 186, 1-12. • Wang, X.-Q., Jiang, H.-B., Zhang, R., y Qiu, B.-S. (2013). Inactivation of the petE gene encoding plastocyanin causes different photosynthetic responses in cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 under light-dark photoperiod and continuous light conditions. 279 FEMS Microbiol. Lett. 341, 106-114. • Watanabe, M., y Ikeuchi, M. (2013). Phycobilisome: Architecture of a light-harvesting supercomplex. Photosynth. Res. 116, 265-276. • Weigel, M., Varotto, C., Pesaresi, P., Finazzi, G., Rappaport, F., Salamini, F., y Leister, D. (2003). Plastocyanin is indispensable for photosynthetic electron flow in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 278, 31286-31289. • Whitehead, L., Long, B.M., Price, G.D., y Badger, M.R. (2014). Comparing the in vivo function of α-carboxysomes and β-carboxysomes in two model cyanobacteria. Plant Physiol. 165, 398-411. • Whitton, B.A., y Malcolm, P. (2000). Introduction to the Cyanobacteria. In Personal Freedom through Human Rights Law?, p. • Williams, M.K., y Kantrowitz, E.R. (1992). Isolation and sequence analysis of the cDNA for pig kidney fructose 1,6-bisphosphatase (amino acid sequence/aflosteric enzyme). Biochemistry 89, 3080-3082. • Woese, C.R. (1987). Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, 221-271. • Wolk, C.P., Vonshak, A., Kehoe, P., y Elhai, J. (1984). Construction of shuttle vectors capable of conjugative transfer from Escherichia coli to nitrogen-fixing filamentous cyanobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81, 1561-1565. • Wolosiuk, R.A., y Buchanan, B.O.B.B. (1977). Thioredoxin and glutathione regulate photosynthesis in chloroplasts. Nature 266, 565-567. • Wood, Z.A., Schröder, E., Robin Harris, J., y Poole, L.B. (2003). Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends Biochem. Sci. 28, 32-40. • Woodger, F.J., Bryant, D.A., y Price, G.D. (2007). Transcriptional regulation of the CO2concentrating mechanism in a euryhaline, coastal marine cyanobacteriurn, Synechococcus sp. strain PCC 7002: Role of NdhR/CcmR. J. Bacteriol. 189, 33353347. • Xie, W.Q., Jäger, K., y Potts, M. (1989). Cyanobacterial RNA polymerase genes rpoC1 and rpoC2 correspond to rpoC of Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 1967-1973. • Xu, N., Qiu, G.W., Lou, W.J., Li, Z.K., Jiang, H.B., Price, N.M., y Qiu, B.S. (2016). Identification of an iron permease, cFTR1, in cyanobacteria involved in the iron 280 reduction/re-oxidation uptake pathway. Environ. Microbiol. 18, 5005-5017. • Xue, Y., Huang, S., Liang, J.Y., Zhang, Y., y Lipscomb, W.N. (1994). Crystal structure of fructose-1,6-bisphosphatase complexed with fructose 2,6-bisphosphate, AMP, and Zn2+ at 2.0-A resolution: aspects of synergism between inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 12482-12486. • Yagi, Y., y Shiina, T. (2014). Recent advances in the study of chloroplast gene expression and its evolution. Front. Plant Sci. 5, 1-7. • Yan, C., y Xu, X. (2008). Bifunctional enzyme FBPase/SBPase is essential for photoautotrophic growth in cyanobacterium Synechocystis sp.PCC 6803. Prog. Nat. Sci. • Yang, C., Hua, Q., y Shimizu, K. (2002). Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from 13C-labeled glucose. Metab. Eng. 4, 202-216. • Yoo, S.H., Lee, B.H., Moon, Y., Spalding, M.H., y Jane, J.L. (2014). Glycogen synthase isoforms in Synechocystis sp. PCC 6803: Identification of different roles to produce glycogen by targeted mutagenesis. PLoS One 9. • Yoon, H.S., Hackett, J.D., Ciniglia, C., Pinto, G., y Bhattacharya, D. (2004). A Molecular Timeline for the Origin of Photosynthetic Eukaryotes. Mol. Biol. Evol. 21, 809-818. • Yoshida, K., Hara, S., y Hisabori, T. (2015). Thioredoxin selectivity for thiol-based redox regulation of target Proteins in Chloroplasts. J. Biol. Chem. 290, 14278-14288. • Yoshitani, K., Hizukuri, Y., y Akiyama, Y. (2019). An in vivo protease activity assay for investigating the functions of the Escherichia coli membrane protease HtpX. FEBS Lett. 593, 842-851. • You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H.B., y Tang, Y.J. (2014). 13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis sp. PCC 6803 under lightand carbonsufficient conditions. Biotechnol. J. 6, 684-692. • Youvan, D.C., y Marrs, B.L. (1987). Molecular Mechanisms of Photosynthesis. Sci. Am. 256, 42-48. • Zaffagnini, M., Michelet, L., Massot, V., Trost, P., y Lemaire, S.D. (2008). Biochemical characterization of glutaredoxins from Chlamydomonas reinhardtii reveals the unique properties of a chloroplastic CGFS-type glutaredoxin. J. Biol. Chem. 283, 8868-8876. 281 • Zaffagnini, M., Fermani, S., Marchand, C.H., Costa, A., Sparla, F., Rouhier, N., Geigenberger, P., Lemaire, S.D., y Trost, P. (2019). Redox Homeostasis in Photosynthetic Organisms: Novel and Established Thiol-Based Molecular Mechanisms. Antioxid. Redox Signal. 31, 155-210. • Zakar, T., Laczko-Dobos, H., Toth, T.N., y Gombos, Z. (2016). Carotenoids assist in cyanobacterial photosystem II assembly and function. Front. Plant Sci. 7, 1-7. • Zavřel, T., Očenášová, P., y Červený, J. (2017). Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress. PLoS One 12, 1-21. • Zhang, S., y Bryant, D.A. (2011). The tricarboxylic acid cycle in cyanobacteria. Science (80-. ). 334, 1551-1553. • Zhang, H.Z., Hackbarth, C.J., Chansky, K.M., y Chambers, H.F. (2001). A proteolytic transmembrane signaling pathway and resistance to β-lactams in Staphylococci. Science (80-. ). 291, 1962-1965. • Zhang, L., McSpadden, B., Pakrasi, H.B., y Whitmarsh, J. (1992). Copper-Mediated Regulation of Cytochrome-c553 and Plastocyanin in the Cyanobacterium Synechocystis 6803. J Biol Chem 267, 19054-19059. • Zhang, L., Pakrasi, H.B., y Whitmarsh, J. (1994). Photoautotrophic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 in the absence of cytochrome c553 and plastocyanin. J. Biol. Chem. 269, 5036-5042. • Zhang, R., Villeret, V., Lipscomb, W.N., y Fromm, H.J. (1996). Kinetics and mechanisms of activation and inhibition of porcine liver fructose-1,6-bisphosphatase by monovalent cations. Biochemistry 35, 3038-3043. • Zhang, S., Qian, X., Chang, S., Dismukes, G.C., y Bryant, D.A. (2016). Natural and synthetic variants of the tricarboxylic acid cycle in cyanobacteria: Introduction of the GABA Shunt into Synechococcus sp. PCC 7002. Front. Microbiol. 7, 1-13. • Zhou, J., Zhang, H., Meng, H., Zhu, Y., Bao, G., Zhang, Y., Li, Y., y Ma, Y. (2014). Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Sci. Rep. 4, 4500.