Papel de la proteína LRRK2 en la enfermedad de Parkinson.

FACULTAD DE BIOLOGÍA Papel de la proteína LRRK2 en la enfermedad de Parkinson Autora: Lucía Jiménez Terceño Tutor: Antonio José Herrera Carmona Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Titulación: Grado en Bioquímica Curso académico: 2022-2023 Universidad de Sevilla ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 1 1.1. Generalidades de la enfermedad de Parkinson .............................................................. 1 1.2. Epidemiología y etiología de la enfermedad de Parkinson ........................................... 2 1.2.1. Genética de la enfermedad de Parkinson .............................................................. 2 1.3. Neuropatología de la enfermedad de Parkinson ............................................................ 3 1.3.1. Alfa sinucleína: proteína clave en la enfermedad de Parkinson ........................... 3 1.3.2. Disfunción en los sistemas de eliminación proteicos ............................................ 4 1.3.3. Disfunción mitocondrial y estrés oxidativo ........................................................... 4 2. OBJETIVO .......................................................................................................................... 6 3. METODOLOGÍA ............................................................................................................... 6 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 6 4.1. La proteína quinasa LRRK2 .......................................................................................... 6 4.1.1. Una proteína con dos funciones enzimáticas distintas .......................................... 7 4.1.1.1. La actividad quinasa de la proteína LRRK2.................................................. 7 4.1.1.2. La actividad GTPasa de la proteína LRRK2 ................................................. 8 4.1.2. Mecanismo de acción de la proteína LRRK2 ........................................................ 8 4.1.3. Los sustratos de la proteína LRRK2...................................................................... 9 4.2. Papel de la proteína LRRK2 en la enfermedad de Parkinson ..................................... 11 4.2.1. Sistema endolisosomal ........................................................................................ 11 4.2.1.1. Tráfico de vesículas ..................................................................................... 12 4.2.1.2. Red trans-Golgi ........................................................................................... 13 4.2.1.3. Autofagia ..................................................................................................... 14 4.2.1.4. Autofagia mediada por chaperona ............................................................... 14 4.2.1.5. Lisosomas .................................................................................................... 15 4.2.2. Función mitocondrial .......................................................................................... 16 4.2.2.1. Interacción mitocondria-retículo endoplásmico .......................................... 17 4.2.2.2. Mitofagia ..................................................................................................... 18 4.2.2.3. Transporte mitocondrial axonal ................................................................... 18 4.2.3. Tráfico de vesículas y motilidad del citoesqueleto .............................................. 19 4.2.3.1. Transporte y maduración de vesículas autofágicas ..................................... 19 4.2.3.2. Dinámica del citoesqueleto ......................................................................... 20 4.2.4. Apoptosis inducida por LRRK2 ........................................................................... 22 5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS ...................................................... 23 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 25 1 ABSTRACT La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo que se caracteriza por la aparición de alteraciones motoras debidas a la muerte progresiva de las neuronas dopaminérgicas localizadas en la substantia nigra pars compacta (SNpc). Aunque la mayoría de los casos son de naturaleza esporádica, un pequeño porcentaje se debe a mutaciones en ciertos genes. Uno de los genes implicados en la enfermedad codifica para LRRK2, una proteína grande y compleja constituida por diversos dominios de interacción con proteínas y una región enzimática con actividad quinasa y GTPasa, que se encuentra involucrada en una gran variedad de procesos celulares. Dado el importante papel de LRRK2 en la patogenia de la enfermedad de Parkinson, se están desarrollando estrategias para controlar su función, abriéndose un nuevo campo en la investigación para el tratamiento de la EP. KEYWORDS: Enfermedad de Parkinson, proteína quinasa rica en repeticiones de leucina 2 (LRRK2), substantia nigra pars compacta, actividad quinasa, actividad GTPasa, Rab GTPasas, disfunción mitocondrial, sistema endolisosomal 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Generalidades de la enfermedad de Parkinson La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo complejo caracterizado por la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas localizadas en una estructura mesencefálica denominada substantia nigra, específicamente en su pars compacta (SNpc) [1]. Como consecuencia de esta denervación dopaminérgica, se produce una alteración del funcionamiento fisiológico de los ganglios basales que afecta principalmente al núcleo estriado. La depleción del neurotransmisor dopamina (DA) subyace a los síntomas primarios de la enfermedad, que se caracteriza también por la presencia de cuerpos de Lewy (CLs) [2]. El rasgo más reconocible de la EP es el deterioro de la capacidad motora, que se manifiesta con la aparición de la triada motora característica de dicho trastorno: bradiquinesia y aquinesia, rigidez y temblor en reposo; además, algunos pacientes muestran inestabilidad postural a medida que la enfermedad progresa [3]. Por todo ello, la EP se ha considerado clásicamente como un trastorno motor y se ha estudiado como tal. No obstante, en las últimas décadas se ha demostrado que esta patología también presenta síntomas no motores en su fase prodrómica, entre los que destacan el deterioro cognitivo, los trastornos del sueño (incluyendo alteraciones en la fase REM), la depresión, la anosmia, el cansancio y la fatiga y la apatía, entre otros [4]. 2 1.2. Epidemiología y etiología de la enfermedad de Parkinson La EP es la segunda enfermedad neurodegenerativa más frecuente después de la enfermedad de Alzheimer. La prevalencia de la EP se estima en 0,3% en la población general, 1,0% en mayores de 60 años y 3,0% en personas mayores de 80 años. La incidencia estimada es de 8 a 18 casos por 100 000 habitantes/año [5]. La EP se ha considerado tradicionalmente un trastorno esporádico de causa desconocida, siendo la edad el principal factor de riesgo [5,6]. En realidad, las evidencias indican que es un trastorno multifactorial con una etiología muy compleja, en buena parte, aún desconocida. Sustancias como la 1-metil-4-fenil tetrahidropiridina (MPTP) [7,8], el 1-metilfenilpiridinio (MPP+), la rotenona o el disolvente tricloroetileno causan disfunción mitocondrial y aumentan el riesgo de padecer la enfermedad [9,10]. Se está investigando el riesgo asociado a la exposición a metales pesados (hierro, cobre, aluminio, zinc y plomo), aunque aún no se ha encontrado una relación clara con la EP [11]. En cambio, hay una asociación inversa entre el riesgo de padecer la EP y el tabaquismo, o el consumo de cafeína y de antiinflamatorios no esteroideos [12,13,14]. La mayoría de los estudios sugieren que para el inicio y el desarrollo de la EP es necesaria una cierta predisposición genética además de una exposición continua a diversos agentes tóxicos. La predisposición a la EP es independiente de la raza, aunque no del sexo biológico. Diversos estudios epidemiológicos muestran que la enfermedad es 1,5 a 2 veces más frecuente en hombres que en mujeres, lo que ha sugerido una posible acción protectora de los estrógenos [15,16]. 1.2.1. Genética de la enfermedad de Parkinson Aunque la mayoría de los casos diagnosticados son idiopáticos, en torno un 5-15% son debidos a mutaciones genéticas específicas y se corresponden con una aparición temprana de la enfermedad. Esta versión de la enfermedad presenta una forma de herencia mendeliana autosómica dominante o recesiva [17]. Los genes que se han identificado como causa potencial de EP se designan como PARK en el orden en el que han sido identificados [3]. A día de hoy, se han identificado 23 genes PARK asociados a la EP. La implicación de algunos de estos genes, como PARK5, PARK11, PARK13, PARK18, PARK21 o PARK23, aún no se ha confirmado con certeza. Por el contrario, los genes PARK3, PARK10, PARK12, PARK16 y PARK22 constituyen un factor de riesgo importante para la enfermedad [3]. Las mutaciones con mayor interés se localizan en los genes que codifican para las proteínas α-sinucleína, LRRK2, PINK1, DJ-1 y parkina [17]. 3 Los genes PARK1/4 y PARK8 se correlacionan con versiones autosómicas dominantes de la enfermedad. El gen SNCA (PARK1) codifica para la proteína α-sinucleína, el principal componente de los cuerpos de Lewy. Las mutaciones en este gen son muy penetrantes y se relacionan con un rápido progreso de la enfermedad tanto en las versiones de aparición temprana como tardía [17]. El gen LRRK2 (PARK8) codifica para la proteína multidominio LRRK2, en la que se han identificado 7 mutaciones patogénicas, siendo la variante G2019S la más común [3]. Las principales mutaciones autosómicas recesivas tienen lugar en los genes PRKN (PARK2), PINK1 (PARK6) y DJ-1 (PARK7), relacionadas con la aparición temprana de la enfermedad [18]. Estos genes se han relacionado con la homeostasis mitocondrial, estando las proteínas PINK1 y parkina (codificada por el gen PRKN/PARK2) implicadas en la misma vía de control mitocondrial [3]. Finalmente, asociados a parkinsonismos atípicos se encuentran algunos genes autosómicos recesivos, entre los que se incluyen ATP13A2 (PARK9), PLA2G6 (PARK14), FBX07 (PARK15) y SYNJ1 (PARK20) [3]. 1.3. Neuropatología de la enfermedad de Parkinson Las características fisiopatológicas principales de la EP son la muerte progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la SNpc y la presencia de los cuerpos de Lewy [19]. Se ha estimado que cuando comienzan los síntomas motores se han perdido aproximadamente el 30% de estas neuronas dopaminérgicas. Tras la aparición de los síntomas motores, la pérdida neuronal puede superar el 60%. Esto conlleva a la denervación de la vía nigroestriada, lo que explica la aparición de los síntomas motores de la enfermedad [3]. 1.3.1. Alfa sinucleína: proteína clave en la enfermedad de Parkinson La α-sinucleína es una proteína de 140 aminoácidos perteneciente a la familia de las sinucleínas, que incluye a las β y γ-sinucleínas. En humanos existen 3 isoformas de esta proteína generadas mediante splicing alternativo. La forma principal de la proteína presenta una longitud de 140 aminoácidos, mientras que las dos isoformas restantes tienen 126 y 112 aminoácidos, derivadas de la deleción de los exones 3 y 5, respectivamente [20]. La α-sinucleína está implicada en el control de los procesos y la biogénesis de las membranas sinápticas, en el control de la liberación de neurotransmisores y en la plasticidad sináptica [20,21]. La región amino terminal interacciona con las membranas lipídicas modificando la fluidez de las mismas. Asimismo, esta proteína juega un papel importante en la regulación de las funciones sinápticas al interaccionar y modular la acción de diversas proteínas implicadas en los procesos de tráfico, exocitosis y liberación de las vesículas sinápticas. Otra 4 de las funciones de la α-sinucleína es la interacción con componentes del citoesqueleto, garantizando un correcto transporte axonal [21]. La acumulación de proteínas mal plegadas en determinadas zonas del cerebro es un rasgo característico de algunas enfermedades neurodegenerativas como son la enfermedad de Alzheimer y la EP [3,22]. Al perder su conformación nativa, muchas proteínas adquieren una estructura amiloide fibrilar ordenada rica en láminas beta, que son más propensas a la agregación y generan oligómeros que finalmente acabarán formando las fibras y los agregados de mayor tamaño [3,22]. La concepción de la enfermedad de Parkinson como proteinopatía tiene como punto central la agregación de la α-sinucleína, el principal componente de los cuerpos de Lewy (CLs) [23,24]. Los CLs son pequeñas inclusiones citoplasmáticas localizadas en los cuerpos neuronales dopaminérgicos, que con frecuencia están acompañados de neuritas de Lewy [23]. Además de α-sinucleína, los CLs incluyen otras moléculas tales como ubiquitina, tau, parkina, proteínas de choque térmico, proteínas oxidadas/nitradas, elementos lisosómicos y proteasomales y proteínas del citoesqueleto, entre otros [25]. Braak et al. (2003) presentaron un modelo de progresión de la EP basándose en la distribución y localización de los CLs, proponiendo que los CLs se extienden de forma rostrocaudal a través del cerebro, lo que puede explicar la aparición de los síntomas no motores y motores característicos de la enfermedad [26]. 1.3.2. Disfunción en los sistemas de eliminación proteicos Una de las principales características de las proteinopatías es la acumulación anormal de proteínas debido a fallos en los sistemas de eliminación. Los dos elementos más destacables son el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) y la vía autofagia-lisosomal [3]. Mutaciones en los genes que codifican componentes esenciales de estos dos sistemas (PINK1, parkina, ATP13A2, GBA1, UCH-L1) conducen a la acumulación de proteínas y orgánulos defectuosos, causando la muerte neuronal [17]. 1.3.3. Disfunción mitocondrial y estrés oxidativo El daño mitocondrial es un elemento importante en la patogénesis de la EP. La alteración del complejo I mitocondrial debido a la exposición a tóxicos [7,8,9] produce una depleción energética en las neuronas, lo que conlleva la muerte neuronal [27]. No obstante, la deficiencia en el complejo mitocondrial I no es el único causante de la disfunción mitocondrial. Se han descrito algunos genes responsables de la versión familiar de la EP que juegan un papel crucial en la homeostasis mitocondrial [17], entre los que destacan aquellos que codifican para las 5 proteínas PINK1 y parkina, encargadas de la eliminación de las mitocondrias disfuncionales en un proceso conocido como mitofagia, que garantiza el correcto funcionamiento mitocondrial [27,28]. Mutaciones en parkina y PINK1 impiden la eliminación de las mitocondrias dañadas, originando versiones autosómicas recesivas de la enfermedad de Parkinson [3]. Otro elemento importante en el control del estrés oxidativo es la proteína DJ-1, que actúa como antioxidante en este tipo de condiciones. Se ha demostrado la actividad chaperona de DJ-1, que impide la agregación de α-sinucleína y la toxicidad bajo condiciones de estrés oxidativo [29]. Las mutaciones en esta proteína, que favorecen la agregación y formación de fibras de α-sinucleína, son causantes de versiones autosómicas recesivas de la enfermedad. La disfunción mitocondrial no solo provoca una depleción energética en la célula sino la generación de estrés oxidativo. El aumento de especies reactivas de oxígeno (ROS) debido a alteraciones en las mitocondrias produce daño en el ADN, peroxidación lipídica y oxidación proteica, lo que conlleva una anomalía en el funcionamiento normal de la célula y la muerte celular [17,27]. Algunos de estos mecanismos bioquímicos de neurodegeneración que tienen lugar en la EP se resumen en la Figura 1. Figura 1. Mecanismos bioquímicos de la neurodegeneración en la enfermedad de Parkinson (imagen tomada de la referencia 29). 6 2. OBJETIVO Este trabajo tiene como objetivo realizar una revisión actualizada acerca de las implicaciones de la proteína LRRK2 en la enfermedad de Parkinson. Se revisarán los conocimientos existentes sobre las funciones de LRRK2, la forma en que estas se alteran debido a mutaciones y cómo esto constituye un factor importante en el desarrollo de esta enfermedad. 3. METODOLOGÍA Para alcanzar el objetivo propuesto en este trabajo, se ha llevado a cabo una revisión bibliográfica empleando las bases de datos PubMed, Scopus, Google Scholar y Web of Science. Para la búsqueda inicial se han utilizado palabras claves generales como “Parkinson’s disease”, “α-synuclein”, “dopaminergic cell death”, “genetics Parkinson’s disease”, “neurodegeneration”, “leucine-rich repeat kinase 2” y “LRRK2 pathogenic”; esta búsqueda se ha ido refinando con términos más específicos derivados de la información encontrada en la anterior. Se han utilizado como criterios de cribado para la selección de los artículos la fecha de publicación y el factor de impacto de la revista. Los criterios de inclusión fueron artículos científicos publicados en su gran mayoría entre 2010-2023, en inglés y accesibles mediante la Biblioteca de la Universidad de Sevilla. No obstante, algunos artículos consultados datan de fechas anteriores a 2010, que resultaron útiles para apoyar conceptos o características generales de las cuestiones que se plantean en este trabajo. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. La proteína quinasa LRRK2 La quinasa con repeticiones ricas en leucina (LRRK2) es una proteína compleja de 2527 aminoácidos que presenta un peso molecular de 268 kDa. El locus que codifica para esta proteína (PARK8) se localiza en el cromosoma 12p11.2-q13.1 en humanos [30]. LRRK2 es una proteína grande y multifuncional que consta de dos dominios enzimáticos: un dominio GTPasa (ROC-COR) y un dominio quinasa (KIN). El dominio GTPasa ROC-COR lleva a cabo la hidrólisis de GTP, mientras que el dominio serina/treonina quinasa está involucrado en la fosforilación de diversos sustratos (Figura 2). Este centro catalítico está flanqueado por diversos dominios conservados que están implicados en interacciones proteína-proteína, tales como un dominio armadillo (ARM), un dominio anquirina (ARK) y un dominio con repeticiones ricas en leucina (LRR) situados en la región N-terminal, y una región C-terminal con un dominio WD40 [31,32]. Además de las actividades 7 catalíticas ya mencionadas, LRRK2 es una proteína importante por su función de andamiaje, implicada en la formación de complejos de señalización multiproteicos [31]. Los primeros estudios de GWAS efectuados sobre la EP permitieron identificar diversas mutaciones en esta proteína, algunas de las cuales son consideradas variantes patogénicas, otras se han identificado en pacientes aislados y otras constituyen factores de riesgo para la EP [33, 34]. No obstante, mediante el refinamiento de las técnicas de análisis de variación genética, a día de hoy se han identificado 7 mutaciones patogénicas de esta proteína involucradas en la EP. Estas mutaciones dominantes patogénicas se localizan en la región central de la proteína (Figura 2), lo que demuestra la importancia de los dominios enzimáticos de la proteína LRRK2 en la EP. Todas estas mutaciones conducen a una ganancia de función de la actividad quinasa de la proteína LRRK2 [35]. Figura 2. Estructura de la proteína humana LRRK2. Representación esquemática de la proteína LRRK2 junto con las principales mutaciones patogénicas asociadas con la EP (representadas con una estrella), los sitios de autofosforilación y residuos susceptibles a la fosforilación por diversas quinasas (CK1α, IKK, PKA) y desfosforilación (PP1). Asimismo, se muestran las regiones de interacción con las proteínas 14-3-3 y Rab29 (imagen tomada de la referencia 36). 4.1.1. Una proteína con dos funciones enzimáticas distintas 4.1.1.1. La actividad quinasa de la proteína LRRK2 El gran interés por el estudio del dominio quinasa de la proteína LRRK2 radica en la presencia de la mutación G2019S, la variante patogénica más frecuente en pacientes con EP. El residuo G2019 se localiza en el segmento de activación del dominio quinasa de la enzima, y la variante patogénica G2019S corresponde a un mutante de ganancia de función, al producir un aumento de la actividad quinasa de la proteína en comparación con la versión silvestre de la misma [35,37] que correlaciona con un incremento de la toxicidad neuronal in vivo [38]. En base a los modelos estructurales existentes de la proteína, ha surgido una hipótesis que afirma que la sustitución de glicina por serina en este residuo provoca la permanencia de la proteína LRRK2 en un estado activo persistente, que podría explicar este incremento de la actividad quinasa asociado a esta mutación. La presencia del pequeño residuo de glicina en el lazo de 14 4.2.1.3. Autofagia Los procesos de autofagia están muy relacionados con el sistema endolisosomal de la célula. En la EP se ha descrito la desregulación de los sistemas de proteostasis debido a la alteración de los sistemas ubiquitina proteasoma (UPS) y autofagia-lisosoma, lo que conlleva a la acumulación de proteínas, sustratos y orgánulos en mal estado que pueden resultar tóxicos para la célula [69]. En este trabajo se revisa el sistema autofagia-lisosoma y su subtipo más conocido, la autofagia mediada por chaperona. La autofagia es el término referido al proceso catabólico que se encarga de eliminar los componentes citosólicos no funcionales e innecesarios de la célula para su reciclado. Existen tres tipos de autofagia: la macroautofagia, la microautofagia y la autofagia mediada por chaperona (CMA). El orgánulo por excelencia de estos tres procesos es el lisosoma, pero a diferencia de la microautofagia y la CMA, en la macroautofagia también existe otro elemento adicional: el autofagosoma. Las implicaciones de LRRK2 en la autofagia no están claras. Algunos estudios muestran la presencia de alteraciones en los niveles de LC3-II y p62 en ratones KO LRRK2 [70]. Ensayos in vitro, muestran un aumento en el número de vesículas autofágicas LC3-positivas en células SH-SY5Y con la variante G2019S [71] y aumento de la formación de autofagosomas en células HEK293 con sobreexpresión de LRRK2 [72]. Por el contrario, se ha comprobado que el knockdown de LRRK2 y la inhibición de la actividad quinasa estimulan la actividad autofágica [73]. Aunque es evidente el papel de LRRK2 en el proceso de autofagia, aún no se ha elucidado si LRRK2 la facilita o la suprime. 4.2.1.4. Autofagia mediada por chaperona La disfunción en el sistema de autofagia mediada por chaperona (CMA) se ha descrito en la EP [74]. La CMA es un subtipo de autofagia que degrada hasta un 30% de las proteínas citosólicas. Los sustratos de esta vía presentan un motivo KFERQ [74] en su superficie que es reconocido por la chaperona citosólica hsc70, que dirige el sustrato a la membrana del lisosoma donde interacciona con LAMP-2A. Este oligomeriza y forma el complejo de translocación que permite la entrada del sustrato al interior del lisosoma para su degradación proteolítica [75]. Una vez finalizada la degradación del sustrato, se desarma el complejo de translocación y LAMP-2A se degrada para ser reciclado [74]. Dos de los sustratos de esta vía proteolítica son α-sinucleína y LRRK2. LRRK2 presenta una característica peculiar en comparación con otros sustratos de esta vía: la unión de LRRK2 15 a la membrana del lisosoma se ve favorecida por la presencia de otros sustratos de la vía CMA [75]. Mutaciones en LRRK2 afectan a la organización del complejo de translocación al unirse de forma aberrante a LAMP-2A impidiendo su oligomerización. La inhibición de la CMA por LRRK2 tiene consecuencias en la degradación de otros sustratos como es la α-sinucleína [74,75]. LRRK2 favorece la unión, asociación y oligomerización de α-sinucleína en la superficie lisosomal, impidiendo su translocación y la de otros sustratos al interior del lisosoma para su degradación (Figura 7) [75]. Figura 7. Papel de la proteína LRRK2 en la autofagia mediada por chaperona (CMA) (imagen tomada de la referencia 76). 4.2.1.5. Lisosomas Aunque los lisosomas cumplen diversas funciones, estos son considerados los principales orgánulos degradativos de la célula. Los lisosomas tienen un papel importante en la EP, al existir diversas mutaciones en genes lisosomales, entre los que destacan ATP13A y GBA, que constituyen factores de riesgo para las versiones familiares y esporádicas de la enfermedad, respectivamente [77]. Debido a la composición de estos orgánulos, es crucial la existencia de mecanismos encargados de garantizar la correcta funcionalidad de los lisosomas. En este proceso de control de calidad de lisosomas interviene la proteína LRRK2. Un estímulo estresante genera un daño en la membrana lisosomal, produciendo la salida de protones y calcio al citoplasma, que favorece el reclutamiento de la proteína LRRK2 al lisosoma disfuncional. LRRK2 atrae y fosforila a Rab8a, que potencia el reclutamiento de galectina-3 (Gal3) en un proceso mediado por transferrina y su receptor TfR. Asimismo, se recluta el complejo ESCRTIII para la reparación de la membrana dañada [78,79]. No obstante, si el daño persiste se induce la activación de otra vía molecular para eliminar el orgánulo disfuncional. En estas condiciones se produce un aumento de la proteína LRRK2 mediada por Rab29. La quinasa recluta y fosforila a Rab10 y Rab35 en los residuos Thr73 y Thr72, respectivamente, permitiendo el reclutamiento de la proteína JIP4 al lisosoma. JIP4, a través de su dominio RHD2, interacciona con Rab10 16 fosforilada, reclutando proteínas motoras para formar estructuras tubulares en el lisosoma, que al unirse a estas estructuras se escinde en pequeñas vesículas que interaccionan con otros lisosomas. Este proceso es conocido como tubulación lisosomal mediada por LRRK2 (LYTL) (Figura 8) [80]. Figura 8. Papel de la proteína LRRK2 en la disfunción lisosomal (imagen tomada de la referencia 68). Eguchi et al. (2018) propusieron una hipótesis ligeramente distinta. Según estos autores la proteína Rab GTPasa Rab29 recluta a LRRK2 al lisosoma disfuncional, donde la quinasa fosforila a Rab10 en su residuo Thr73, y recluta a Rab8a, la cual atrae a las proteínas efectoras de estas Rab: EHBP1 (efector Rab10) y EHBP1L1 (efector Rab8a). Estos efectos serían los responsables de producir la exocitosis lisosomal y la liberación del contenido no degradado al espacio extracelular, en un proceso aún desconocido (Figura 9) [81]. Figura 9. Papel de la proteína LRRK2 en la disfunción lisosomal (imagen tomada de la referencia 68). 4.2.2. Función mitocondrial La mitocondria es un elemento fundamental en las neuronas dopaminérgicas, por lo que su correcto funcionamiento es esencial para mantener la funcionalidad de estas. LRRK2 interviene en ciertos procesos en los que la mitocondria se encuentra involucrada. 17 4.2.2.1. Interacción mitocondria-retículo endoplásmico La disfunción mitocondrial es un rasgo de las enfermedades neurodegenerativas, pero la alteración de este orgánulo es de vital importancia en la EP [27]. En torno a un 5-20% de las superficies de la mitocondria y el retículo endoplásmico (RE) se encuentran asociadas a través de unas regiones denominadas membranas mitocondriales asociadas al retículo endoplásmico (MAMs). Este contacto es importante para mantener la bioenergética de la mitocondria [82] y preservar una variedad de procesos de señalización entre ambos elementos, entre los que se incluyen el intercambio de calcio y fosfolípidos [83,84], la producción de ATP, la autofagia, el correcto plegamiento proteico y la apoptosis, entre otros [84,85]. Sobre la membrana mitocondrial externa se localizan una serie de proteínas E3 ubiquitina ligasas (MARCH5, MULAN y parkina) que se encargan del control de la calidad de las proteínas mitocondriales, además de regular la formación de MAMs y la morfología mitocondrial [86]. Otro aspecto importante a tener en cuenta es el aumento de estrés del RE en pacientes con EP. El estado de estrés en el RE inducidos por diversos estímulos es percibido por la quinasa PERK [87], que activa una vía de señalización mediada por el complejo UPR, que intenta restaurar la homeostasis del RE. Si este sistema falla, se activará el proceso de apoptosis, con el objetivo de eliminar la célula “estresada”. Hay evidencias que muestran el papel de la proteína LRRK2 en la interacción mitocondria-RE. LRRK2 se une a través de su región N-terminal al dominio RING de las E3 ubiquitinas ligasas, favoreciendo la interacción de proteínas localizadas en las membranas de ambos orgánulos, entre ellas la mitofusina 2, generándose las zonas MAMs. El acercamiento entre ambos orgánulos también permite la interacción entre IP3R y VDAC1 y, por consiguiente, se establece un flujo de calcio entre ambos elementos. La hiperactividad quinasa de LRRK2 promueve la autofosforilación de su residuo Ser1292, lo que conlleva a su disociación de las ubiquitina ligasas y a la fosforilación y activación de las ubiquitinas ligasas en un proceso mediado por PERK. Como resultado se aumenta la degradación de los componentes MAMs y disminuye la interacción mitocondria-RE (Figura 10), produciendo una alteración de la transferencia de calcio entre estos dos elementos y una disminución de la producción de ATP por la mitocondria [88]. 18 Figura 10. Papel de la proteína LRRK2 en la interacción mitocondria-retículo endoplásmico (RE) (imagen tomada de la referencia 88). 4.2.2.2. Mitofagia El control de calidad mitocondrial es fundamental para asegurar el correcto funcionamiento del orgánulo, garantizando la producción de energía y evitando la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) [27]. Durante el proceso de mitofagia, la presencia de PINK1/parkina en la mitocondria despolarizada favorece el reclutamiento de Rab10 a la membrana mitocondrial externa, donde se une al receptor de autofagia optineurina (OPTN), produciendo su acumulación en la mitocondria y, por consiguiente, la formación de un autofagosoma alrededor de la mitocondria disfuncional para su eliminación. La existencia de ciertas formas mutada de LRRK2 (G2019S y R1441C) produce un aumento de la fosforilación de Rab10 en su residuo Thr73, impidiendo su reclutamiento a la mitocondria y deteniéndose la mitofagia (Figura 11) [89]. Figura 11. Papel de la proteína LRRK2 en la mitofagia (imagen tomada de la referencia 68). 4.2.2.3. Transporte mitocondrial axonal Las mitocondrias son orgánulos móviles pero sus movimientos han de estar muy controlados para mantener la homeostasis mitocondrial y evitar el estrés oxidativo. Miro es una proteína localizada en la membrana mitocondrial externa [90] que une a las proteínas motoras dineína y quinesina a la mitocondria para favorecer su movimiento por la célula [91]. Es importante que las mitocondrias dañadas frenen su motilidad para que pueda iniciarse la 19 mitofagia, proceso que comienza con la eliminación de Miro de la superficie mitocondrial disfuncional [92]. En condiciones fisiológicas, la despolarización de la mitocondria activa la vía PINK1/parkina que ubiquitina a Miro, la cual se une y forma un complejo con LRRK2 en un proceso independiente de la actividad quinasa de LRRK2, desprendiéndose esta de la membrana mitocondrial para que pueda iniciarse el proceso de mitofagia. Bajo condiciones patológicas, LRRK2 no interacciona con Miro, de forma que esta permanece más tiempo unida a la mitocondria, ralentizándose el proceso de mitofagia (Figura 12). Las mitocondrias disfuncionales producen y acumulan ROS, que provocarán la muerte de las neuronas dopaminérgicas [93]. Figura 12. Papel de la proteína LRRK2 en el transporte mitocondrial por el axón (imagen tomada de la referencia 93). 4.2.3. Tráfico de vesículas y motilidad del citoesqueleto 4.2.3.1. Transporte y maduración de vesículas autofágicas El transporte de vesículas autofágicas es primordial para mantener una homeostasis axonal. Estas vesículas autofágicas se generan en los terminales axónicos de las neuronas y deben llegar al soma neuronal [94] mediante un transporte retrógrado mediado por la acción de las proteínas motoras dineínas [95]. A medida que se produce este transporte retrógrado, los autolisosomas van madurando y se van fusionando a lisosomas, disminuye su pH, se activen las enzimas hidrolíticas y se degradan las moléculas cargo de su interior [94]. Hay evidencias que demuestran que la hiperactividad quinasa de LRRK2 afecta el transporte axonal de las vesículas autofágicas. Bajo condiciones fisiológicas, ARF6 favorece la interacción del complejo dineína/dinactina con las proteínas motoras adaptadoras JIP3/4, permitiendo el transporte retrógrado de las vesículas autofágicas [96]. En condiciones patológicas, LRRK2 hiperfosforila a las proteínas Rab GTPasas localizadas en la membrana del autofagosoma, favoreciendo el reclutamiento de JIP3/4 y resultando en una activación anormal de la quinesina. La presencia de ambas proteínas motoras en la membrana del mismo 20 orgánulo provoca una situación de “tira y afloja” entre los transportes anterógrado y retrógrado, deteniéndose el transporte axonal (Figura 13) [97]. Como consecuencia de la parada del transporte axonal, las vesículas autofágicas no terminan su proceso de maduración, de forma que los sustratos que contienen en su interior no se degradan. Una de las moléculas que se transporta por este sistema de eliminación es la αsinucleína. Debido a fallos en los sistemas de proteostasis, la excesiva presencia de α-sinucleína mutada o modificada en la neurona puede provocar su agregación (formación de los CLs) en la neurona, o pueden actuar como semillas de agregación y transmitirse a otras neuronas, propagándose la patología de Lewy [98,99]. Figura 13. Papel de la proteína LRRK2 en el transporte por el axón y maduración de vesículas autofágicas (imagen tomada de la referencia 97). 4.2.3.2. Dinámica del citoesqueleto Estudios recientes indican que LRRK2 modula las funciones del citoesqueleto al regular la dinámica de la actina y la tubulina al unirse a los microtúbulos a través de su dominio ROC/GTPasa. Esta interacción requiere de la actividad quinasa de LRRK2, ya que es necesaria la autofosforilación de ciertos residuos. Asimismo, los microtúbulos actúan como un andamio para la organización estructural de LRRK2 y promueven su actividad enzimática [100]. Además de la interacción con los microtúbulos, LRRK2 es capaz de fosforilar a la βtubulina en el residuo Thr107 de la hélice H3’ en presencia de proteínas asociadas a microtúbulos (MAPs). Se postula que la fosforilación de este residuo favorece las interacciones electrostáticas entre β-tubulina y las proteínas MAPs, aumentando la estabilidad del citoesqueleto axonal de microtúbulos y, por consiguiente, restringiendo la dinámica de los mismos [101]. Una desregulación de esta dinámica interfiere en el crecimiento de las neuritas, el transporte axonal, el movimiento de la célula y la formación de sinapsis, lo que puede 21 conllevar daños y disfunciones consistentes con la patología de tau observados en algunas muestras post-mortem de pacientes con mutaciones en LRRK2 [100,101]. LRRK2 también influye de forma indirecta en la fosforilación de la proteína tau a través de las quinasas Ste20 y PKC Zeta. Mutaciones en LRRK2 afectan a estos procesos celulares, produciendo disfunción sináptica y fragmentación de las neuritas. Cuatro miembros de la familia quinasa Ste20 serina/treonina (TAOK3, STK3, STK24 y STK25) son sustratos de LRRK2, siendo STK24 y STK25 quinasas que interaccionan físicamente con LRRK2 [102]. La quinasa TAOK tiene gran homología de secuencia con la familia de quinasas MARKK [103], las cuales participan en una vía de señalización encargada de la fosforilación de la proteína tau [104]. Debido al aumento de fosforilación de tau en mutantes de sobreexpresión de LRRK2 en modelos de ratones, se postuló que LRRK2 era un elemento de la cascada de señalización TAOK/MARKKMARKtau. Esta hipótesis podría explicar la hiperfosforilación de tau en modelos animales de sobreexpresión de LRRK2 y en muestras de pacientes que portan la mutación G2019S [102]. Asimismo, LRRK2 es sustrato de la quinasa PKC Zeta in vitro. Ambas quinasas, PKC Zeta y LRRK2, fosforilan a la proteína moesina en su residuo Thr558, lo que sugiere que moesina actúa como un regulador de la elongación de las neuritas [102]. Hay evidencias que indican que la mutación G2019S induce la degeneración de las dendritas provocada por una hiperfosforilación de tau mediada por la quinasa GSK3β. Esta variante patogénica de LRRK2 se asocia a los microtúbulos a través de su dominio ROC y recluta a GSK3β a la proximidad del microtúbulo donde fosforila a tau en su residuo Thr212/Ser214 [105]. Esto favorece la desunión de tau del microtúbulo y, por consiguiente, se produce su desensamblaje y fragmentación del mismo, de forma que se ve afectado el transporte axonal. La acumulación de tau en las dendritas produce la degeneración de estas, lo que es un rasgo común en las versiones de la enfermedad de Parkinson en las que LRRK2 se encuentra mutada. Todos estos procesos están recogidos en la Figura 14. 22 Figura 14. Papel de la proteína LRRK2 en la dinámica del citoesqueleto (imagen tomada de la referencia 106). 4.2.4. Apoptosis inducida por LRRK2 Diversos estudios in vitro muestran la participación de la proteína LRRK2 en la activación de la caspasa 8, en un proceso mediado por la interacción de LRRK2 con la proteína adaptadora FADD [107]. Ante determinadas señales, FADD se asocia al receptor Fas a través de su dominio DD (death domain), formando un complejo que recluta y activa a la caspasa 8, que resulta en la muerte de la célula por apoptosis [108]. Los estudios indican el papel de LRRK2 como una proteína andamiaje que potencia el reclutamiento de FADD al complejo II, formado por FADD, TRADD, RIP1, Traff2 [107]. Esta interacción se establece entre el dominio N-terminal armadillo de LRRK2, más concretamente la región comprendida entre los residuos Met532-Lys547, y el dominio DD de la proteína adaptadora FADD [109]. En algunas células, la activación de la caspasa 3 por la caspasa 8 es suficiente para iniciar su muerte [110]. No obstante, en ciertas células es necesario una amplificación de la señal mediada por la escisión y activación de Bid por la caspasa 8. El fragmento tBid se transloca a la mitocondria y favorece la formación del poro BAX-BAK, que permite la salida de ciertos factores como el citocromo c que, junto con la caspasa 9 y Apaf1, activan la formación del apoptosoma (Figura 15) [108]. Figura 15. Papel de la proteína LRRK2 en la activación de la muerte celular programada mediada por caspasas (imagen tomada de la referencia 111). 23 5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS La EP es una enfermedad muy compleja con una etiología aún desconocida. La edad constituye un factor de riesgo en el desarrollo de la enfermedad en las versiones de naturaleza idiopática [5,6]. No obstante, existe un pequeño porcentaje de casos de EP que son debido a mutaciones en ciertos genes, denominados PARK [17]. Uno de estos es el gen PARK8, que codifica para la proteína LRRK2 [31], una proteína multidominio de gran tamaño formada por una serie de dominios de interacción proteína-proteína que flanquean una región catalítica con actividades quinasa y GTPasa [32]. La diversidad de dominios presentes en LRRK2 hacen que esté involucrada en una gran variedad de procesos celulares, que se ven alterados por las versiones mutadas de la proteína, lo que resulta en daños celulares y muerte celular [55-111]. Actualmente, la administración de L-DOPA es el eje central del tratamiento de la EP. Aunque tiene una serie de efectos secundarios entre los que destacan las disquinesias inducidas por L-DOPA [112], sigue siendo el tratamiento por excelencia para la EP. Sin embargo, debido a la importancia creciente que se le reconoce a LRRK2 en la enfermedad, esta proteína se está convirtiendo en una diana terapéutica de interés para el tratamiento de la EP. La actividad quinasa de LRRK2 está regulada al alza en la mayoría de las mutaciones de la proteína causantes de la EP [36]. Por tanto, la opción más directa sería controlar la esta actividad quinasa. A pesar del desarrollo de numerosos inhibidores de la actividad quinasa y de su éxito in vitro, la gran mayoría de ellos fallaron en los ensayos en los modelos con roedores porque causan cambios morfológicos en los pulmones [113,114], de forma que sus ensayos se frenaron. Actualmente, muchos de ellos son utilizados en investigación para estudiar la biología de LRRK2, como por ejemplo el inhibidor MLi-2. Debido a la complejidad de los efectos de la actividad quinasa, otras líneas de investigación se han centrado en modular otros elementos que también influyen en la actividad enzimática de LRRK2, entre los que se incluyen la inhibición de la actividad GTPasa y el control de los dominios de interacción de LRRK2 con otras proteínas, el bloqueo de la dimerización de LRRK2 y el bloqueo de la interacción de LRRK2 con sus elementos upstream (Rab29, complejo retrómero) y downstream (Rab GTPasas) [115]. Con el progreso de la medicina y la terapia génica, se ha abierto una nueva línea de tratamiento de LRRK2 focalizada en la reducción de los niveles de la proteína. Esto se puede conseguir modificando su expresión génica o degradando la proteína ya producida. En 2011, Yñigo-Mojado et al. identificaron dos shRNAs específicos para las mutaciones R1441G y 30 108. Ho CC, Rideout HJ, Ribe E, Troy CM, Dauer WT. The Parkinson disease protein leucine-rich repeat kinase 2 transduces death signals via Fas-associated protein with death domain and caspase-8 in a cellular model of neurodegeneration. J Neurosci. 2009 Jan 29(4):1011-1016. 109. Antoniou N, Vlachakis D, Memou A, Leandrou E, Valkimadi PE, Melachroinou K, Re DB, Przedborski S, Dauer WT, Stefanis L, Rideout HJ. A motif within the armadillo repeat of Parkinson's-linked LRRK2 interacts with FADD to hijack the extrinsic death pathway. Sci Rep. 2018 Feb 8(1):1-17. 110. Scaffidi C, Fulda S, Srinivasan A, Friesen C, Li F, Tomaselli KJ, Debatin KM, Krammer PH, Peter ME. Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways. EMBO J. 1998 Mar 17(6):1675-1687. 111. Webber PJ, West AB. LRRK2 in Parkinson's disease: function in cells and neurodegeneration. FEBS J. 2009 Nov 276(22):6436-6444. 112. Espay AJ, Morgante F, Merola A, Fasano A, Marsili L, Fox SH, Bezard E, Picconi B, Calabresi P, Lang AE. 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