Probióticos de uso ambiental

PROBIÓTICOS DE USO AMBIENTAL Realizado por Nieves Borrallo Sánchez TRABAJO FIN DE GRADO UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA GRADO EN FARMACIA Supervisado por Juan Parrado Rubio Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Revisión bibliográfica Junio 2020 1 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO GRADO EN FARMACIA PROBIÓTICOS DE USO AMBIENTAL Nieves Borrallo Sánchez Curso 2019/2020 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Tutor: Juan Parrado Rubio Revisión Bibliográfica 2 RESUMEN La agricultura es la actividad más importante de la historia del ser humano. Las plantas presentan una gran interacción con el microbioma del medio ambiente, generándose mutuamente beneficios, lo que ha derivado en el uso de los microorganismos como herramientas para el desarrollo de una agricultura sostenible. Así, se conocen como probióticos de plantas a los microorganismos promotores del crecimiento vegetal o PGPM (Plant Growth Promoting Microorganisms) utilizados y formulados en nuevos productos para su aplicación agronómica, por parte de la industria biotecnológica. Los probióticos entran en la categoría de bioestimulantes ambientales. El Consejo Europeo de la Industria de Bioestimulantes (EBIC) los define como "sustancias y/o microorganismos que, aplicadas a plantas o a la rizosfera, estimulan los procesos naturales, mejorando/beneficiando la absorción de nutrientes, la eficiencia nutricional, la tolerancia al estrés abiótico y la calidad del cultivo”. Los probióticos, además de aportar beneficios a la producción del cultivo, son una prometedora alternativa al uso de los fertilizantes minerales y pesticidas, para así alcanzar el equilibrio correcto de los ecosistemas. Algunos de los más relevantes e innovadores probióticos ambientales desarrollados tanto a partir de bacterias (Bacillus, Pseudomonas, Azotobacter, Serratia y Azospirillum), como de hongos (Trichodermas y hongos micorrícicos, Gigaspora o Rhizophagus) se van a describir a lo largo de este trabajo así como los distintos mecanismos que les confieren ser incluidos en la categoría de productos bioestimulantes y la cual contempla a los biofertilizantes, biocontroladores y/o biopesticidas, con objetivo de mostrar la importancia de esta rama de la biotecnología en el alcance de una agricultura sostenible. Palabras claves: probióticos, plantas, biofertilizantes, biocontrol, biopesticidas. 3 ÍNDICE INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………………………4 OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………………………7 METODOLOGÍA……………………………………………………………………………………………………….7 RESULTADO Y DISCUSIÓN……………………………………………………………………………………….8 1. MICROORGANISMOS PROMOTORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL……………….8 1.1. PGP TRAITS…………………………………………………………………………………………..9 1.2. Formulación biotecnológica de probiótico……………………………………………11 2. PROBIOTICOS BIOFERTILIZANTES…………………………………………………………………12 2.1.- Aporte de Nitrógeno: Fijación biológica del N₂ atmosférico…………………13 2.2.- Aporte de Fósforo: Solubilización/Mineralización del fósforo………..……15 2.3.- Aporte de Hierro: Producción de sideróforos…………………………………..….17 2.4.- Producción de fitohormonas……………………………………………………………....18 2.5.- Actividad ACC desaminasa…………………………………………………………………..19 3. PROBIOTICOS BIOPESTICIDAS………………………………………………………………………20 3.1.- Producción de enzimas hidrolíticas………………………………………………………20 3.2.- Producción de HCN………………………………………………………………………………21 3.3.- Producción de antibióticos, antifúngicos y otros tóxicos……………………...21 4. PROBIOTICOS BIOCONTROLADORES…………………………………………………………….22 4.1.- Competición………………………………………………………………………………………..22 4.2.- Resistencia sistémica inducida…………………………………………………………….23 5. EJEMPLOS DE PRINCIPALES PROBIÓTICOS……………………………………………………23 5.1.- Biofertilizantes fijadores de Nitrógeno………………………………………………..23 5.2.- Otros microorganismos…………….…………………………………………………………27 6. PERSPECTIVAS FUTURAS Y LIMITACIONES DEL USO DE PROBIÓTICOS EN LA AGRICULTURA …………………………………………………………………………………………….30 CONCLUSIONES..…………………………………………………………………………………………………….32 BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………………………………………32 4 INTRODUCCIÓN Del área total del planeta, la parte acuática representa el 71% y la terrestre el 29%; de la parte terrestre solo se puede utilizar el 13% para la producción agrícola. Aun así, el 98% de los alimentos provienen del área agrícola y tan solo un 2% de la parte acuática. Para el 2050 la población mundial se calcula en cerca de 9 billones de personas, por lo que la producción de alimentos debería aumentar para entonces en un 70%. Para aumentar la producción de cultivos existen tres estrategias principales de crecimiento: aumento de la tierra cultivada, incremento de la frecuencia de las cosechas y aumento de los rendimientos. Sin embargo, hay indicios de que podríamos estar llegando al límite de las posibilidades para las tres estrategias (Grageda-Cabrera et al., 2012). Esta creciente necesidad de abastecimiento de productos agrícolas para la alimentación y transformación en bienes de consumo por parte de la sociedad moderna ha suscitado un inmenso desarrollo de actividades agrícolas en las últimas décadas (Carvajal y Mera, 2010). La aplicación de químicos como pesticidas y fertilizantes se ha convertido en una práctica muy común. Desafortunadamente, esto influye en la contaminación del agua y el suelo, y toda la cadena alimentaria sufre efectos adversos debidos a esta práctica, lo cual influye en la salud humana (Porto de Souza et al., 2017). Además, con la agricultura tradicional se está reduciendo la producción o incrementando los costes, o bien ambos. Los monocultivos, que se producen de forma reiterada en la misma tierra, dan lugar al agotamiento de la superficie de la tierra, de la vitalidad de la tierra, de la pureza del agua subterránea y de los microorganismos beneficiosos, haciendo vulnerables a las plantas a parásitos y patógenos (Singh et al., 2011). En este contexto, los agricultores están llamados a producir más, con menos fertilizantes, menos plaguicidas y más practicas sostenibles, lo que incluye la labranza mínima, la agricultura de precisión y el control biológico (Moreno-Velandia et al., 2018). 5 Además, se reconoce que la productividad del suelo depende de su buen mantenimiento y existe una especial atención al desarrollo de tecnologías biológicas para promover el uso sostenible de este recurso. Es por todo esto por lo que comienza a plantearse la posibilidad de usar probióticos en la agricultura con el objetivo de mejorar la producción. Las plantas, al igual que los humanos se encuentran en simbiosis con ciertos microorganismos conocidos como probióticos. Estos microorganismos son una alternativa al uso de pesticidas y fertilizantes (Picard et al., 2008), por lo que se esquivarían los problemas mencionados anteriormente relacionados con su uso. Los probióticos de plantas son productos englobados en la categoría de bioestimulantes ambientales, los cuales son definidos por el Consejo Europeo de la Industria de Bioestimulantes (EBIC) como "sustancias y/o microorganismos que, aplicadas a plantas o a la rizosfera, estimulan los procesos naturales, mejorando/beneficiando la absorción de nutrientes, la eficiencia nutricional, la tolerancia al estrés abiótico y la calidad del cultivo”. Los bioestimulantes consiguen estos beneficios con independencia de su contenido nutricional y, por lo tanto, se diferencian claramente de los fertilizantes. A día de hoy, se conoce que los bioestimulantes ofrecen una herramienta para regular y/o modificar los procesos fisiológicos en plantas estimulando su crecimiento y rendimiento, reduciendo las limitaciones inducidas por diferentes estreses (Yakhin et al. 2017). La industria biotecnología ambiental está en una fuerte expansión, se ve reflejado en los datos económicos de éstos en el mercado global, que mostraron un crecimiento de un 12,5 % entre 2013 y 2018, año en el que se estima que alcanzaron los 2.241 millones € (Calvo et al. 2014). Estudios más recientes sugieren que el índice de crecimiento entre 2016 y 2021 es del 10,4 %, año en que se alcanzarán los 2.900 millones €. Estos aumentos son la consecuencia de una mayor demanda de productividad de los cultivos, así como de la calidad y protección de los mismos frente a una gran cantidad de estreses ambientales (Fleming et al. 2019). Aunque el uso 6 global de los bioestimulantes es variable, Europa está en cabeza con una media anual de 6,2 millones de hectáreas tratadas con bioestimulantes (EBIC). El uso de probióticos, uno de los bioestimulantes más utilizados, es respaldado por estudios científicos y organizaciones tales como la FAO. La utilización de esta bioherramienta puede dar una amplia gama de beneficios como mayor crecimiento de la planta, defensa, solubilización de minerales o fijación de nitrógeno atmosférico, entre otras (Lichtfouse, 2013). El término de probióticos de uso ambiental se utiliza para referirse a un grupo de microorganismos beneficiosos para las plantas (Menéndez y García-Fraile, 2017) ya sea mejorando la salud del suelo, favoreciendo la absorción de nutrientes o favoreciendo la resistencia a estreses bióticos y abióticos. La asociación entre el microorganismo probiótico y la planta se da principalmente en el suelo. La estrategia consiste en inocular o estimular el crecimiento de ciertos microorganismos que permitan obtener a la planta un beneficio concreto, como, por ejemplo, fijación de nitrógeno atmosférico. Estos microorganismos, normalmente, se encuentran de forma natural dentro de la raíz o en las inmediaciones, creando una serie de complejas interacciones en la rizosfera. La mayoría de estas interacciones entre el suelo, la planta y el microorganismo son aún desconocidas debido a que es un sistema abierto muy complejo (Hartmann et al., 2009). Existe un interés creciente, tanto por la comunidad científica como por las empresas comerciales, en el desarrollo de probióticos y en la evaluación de sus efectos sobre las plantas y la rizosfera. Estos estudios se han desarrollado mediante diferentes enfoques metodológicos, incluyendo caracterización microbiana, estudios de rendimiento y crecimiento sobre plantas, y la aplicación de las llamadas estrategias ómicas, incluyendo transcriptómica, genómica, proteómica y metabolómica, que requieren de su integración para aportar legitimidad al campo de los bioestimulantes (Yakhin et al. 2017). 7 OBJETIVOS En este trabajo se ha considerado de gran relevancia por su importancia en la actualidad realizar una revisión bibliográfica sobre un nuevo tipo de productos biológicos de aplicación ambiental como alternativa a los fertilizantes y pesticidas químicos con los siguientes objetivos. 1. Descripción de la naturaleza de los probióticos de uso ambiental, 2. Descripción de los diferentes mecanismos de acción debajo de la cual estará su potencial aplicación como biofertilizantes, biocontroladores y/o biopesticidas, 3. Descripción de principales probióticos 4. Marco legal y económico METODOLOGÍA Para la realización del presente trabajo se ha realizado una búsqueda bibliográfica en artículos científicos y revisiones sobre los probióticos de uso ambiental, sus mecanismos y sus aplicaciones. Para ello se han realizado búsquedas en distintas bases de datos como Google académico, SciELO y ScienceDirect. Para obtener unos resultados más concretos, se utilizaron las palabras claves “biofertilizante, biocontrol, biopesticida, probióticos, suelo, plantas” tanto en inglés como en español, en las bases de datos nombradas anteriormente. Criterios de inclusión - Artículos publicados en los últimos 20 años, eligiendo los más actuales siempre que sus evidencias no fueran de menor peso que en los más antiguos. - Artículos en inglés o español. - Artículos de acceso libre o accesibles a través de la Biblioteca de la Universidad de Sevilla. Criterios de exclusión - Artículos publicados hace más de 20 años. - Artículos en un idioma diferente al inglés o español. - Artículos a los que no se pudiera acceder al texto completo gratuitamente. 8 - Artículos o fuentes poco fiables o con contenido que pueda ser manipulado por cualquier usuario. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. MICROORGANISMOS PROMOTORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL. Los probióticos de plantas son microorganismos promotores de crecimiento vegetal o PGPM (Plant Growth Promoting Microorganisms) que son formulados por parte de la industria biotecnológica para uso agronómico. Los PGPM se definen como microorganismos ambientales ubicados en la rizosfera y que estimulan significativamente el crecimiento de las plantas (Puente et al.,2011). La rizosfera es la porción de suelo que está fuertemente influenciada por las raíces de las plantas. Las plantas son capaces de excretar sustancias a través de la raíz y estas sustancias atraen a bacterias, que quieren utilizarlas como fuente de nutrientes para su crecimiento, dando inicio de esta forma a una relación de beneficio mutuo (Contreras et al., 2017). Los PGPM son una herramienta muy útil en agricultura, tanto de forma directa como indirecta. De forma directa incrementan el crecimiento y la productividad vegetal facilitando la disponibilidad de recursos nutritivos para la planta o también pueden modular los niveles de hormonas vegetales o producirlos. De forma indirecta pueden disminuir o inhibir los efectos nocivos de diversos patógenos vegetales (Menéndez y García-Fraile, 2017) (Fig 1). A su vez, protegen a la planta del estrés abiótico, como pueden ser las temperaturas extremas, el pH, la salinidad, la sequía, los metales pesados o la contaminación debida a pesticidas (Woo y pepe, 2018). Los microorganismos, aparte de promover el crecimiento de las plantas, deben cumplir además una serie de criterios para ser designados como PGPM: 1. Que no invadan los tejidos internos de la planta. 2. Que puedan colonizar la superficie de la raíz. 3. Que alcance una elevada concentración microbiana en la rizosfera, de manera que puedan realizar el efecto deseado. 15 La fijación biológica del N₂ pueden llevarla a cabo tanto bacterias de vida libre, como Azoarcus sp., Gluconacetobacter diazotrophicus o Azotobacter sp., como bacterias simbióticas, tales como las del género Rhizobium, Sinorhizobium, Frankia y Nostoc. Así, estas bacterias podrían reemplazar a los fertilizantes minerales, dado que proporcionan a las plantas cultivadas el nitrógeno necesario para su crecimiento y desarrollo (Warshan et al., 2017; Alori y Babalola, 2018). 2.2. Solubilización/Mineralización del fósforo. El fósforo es un elemento indispensable para la constitución celular y las reacciones bioquímicas en las plantas, pero las formas químicas que estas pueden utilizar son escasas a pesar del gran contenido de fósforo que hay en la mayoría de los suelos. Uno de los principales motivos de esta limitada disponibilidad se debe a la unión de los aniones fosfatos con otros elementos, con los que forma complejos poco solubles, como los fosfatos de hierro (FePO₄), aluminio (AlPO₄) o fosfatos de calcio [Ca₃(PO₄)₂] (Hernández-Leal et al., 2011) Figura 3. Adquisición de fósforo por las plantas. Se ha demostrado que algunas bacterias del suelo son capaces de movilizar el fósforo que no es accesible para las plantas mediante procesos de solubilización y mineralización, permitiendo que las plantas lo absorban (Alori et al., 2017; Alori y Babalola, 2018). Inmovilizado ed Orgánico o Inorgánico 16 Los microorganismos que solubilizan el fósforo que forma parte de compuestos inorgánicos, lo hacen produciendo ácidos orgánicos (ácido málico, fumárico, butírico, glucurónico, …), iones hidroxilo, protones, dióxido de carbono, agentes quelantes y enzimas. Estos ácidos orgánicos producen una bajada local del pH, modificando el equilibrio químico de las reacciones de secuestro del fósforo y secuestrando los cationes unidos al fosfato por lo que lo convierte en su forma soluble. Por otro lado, los procesos de mineralización del fósforo tienen lugar mediante enzimas fosfatasas y fitasas que desfosforilan los fitatos, la forma orgánica de fósforo predominante en el suelo, para así liberar el fósforo de una manera disponible para la planta (Figura 3) (Alori et al., 2017). Figura 4. Sustancias orgánicas e inorgánicas producidas por bacterias responsables de la solubilización/mineralización del fósforo de los suelos (Ahemad y Kibret, 2014). Algunas bacterias que son capaces de solubilizar/mineralizar fósforo son Azotobacter spp., Pseudomonas spp., y Rhizobium spp., entre muchas otras. De nuevo el uso de este tipo de bacterias tiene el potencial de reemplazar a los fertilizantes minerales (Alori et al, 2017; Alori y Babalola, 2018). 17 2.3. Aporte de Hierro: Producción de sideróforos. El hierro (Fe) es fundamental para diversas funciones celulares como puede ser la síntesis de ADN. Este suele encontrarse en la naturaleza en la forma Fe³⁺ como parte de sales e hidróxidos que son de baja solubilidad, por lo que muchos se han centrado en buscar formas para la solubilización de hierro. En la actualidad, a nivel agrícola, la quelación del hierro suele hacerse mediante secuestrantes sintéticos como el EDTA y el EDDHA, pero sin embargo, estos suponen un peligro ambiental, pues liberan también otros metales pesados que se encuentran en el suelo o el agua , lo que representa un riesgo para la salud de los organismos vivos (Restrepo-correa et al., 2017). De este modo es necesario avanzar en la búsqueda de alternativas menos perjudiciales. Los sideróforos son moléculas orgánicas de pequeño tamaño (0.5 – 1.0 kDa), solubles en solución acuosa a pH neutro y cuya función principal es la captura del ion férrico (Fe³⁺), en diferentes ambientes. Estos se clasifican en tres grupos: catecolatos, hidroximatos e hidroxicarboxilatos, según si el ligando que une hierro es catecol, ácido hidroxámico o ácido hidroxicarboxílico (Aguado-Santacruz et al., 2012; Saha et al., 2016; Alori y Babalola, 2018). Estos compuestos son sintetizados por algunas plantas (fitosideróforos), sobre todo gramíneas, pero principalmente son los hongos y las bacterias, mayoritariamente Gram negativas, los que los secretan al medio como respuesta a un déficit de hierro para satisfacer sus necesidades nutricionales (Aguado-Santacruz et al., 2012; Alori y Babalola, 2018). Los sideróforos actúan como quelantes específicos de Fe³⁺, formándose un complejo Fe³⁺-sideróforo, que ocasiona que este metal no se encuentre disponible para otros microorganismos que no sean capaces de reconocer dicho complejo (AguadoSantacruz et al., 2012) y, además, los sideróforos secretados por hongos y bacterias pueden suministrar hierro a la planta favoreciendo su crecimiento y también su germinación. Algunas de las bacterias que tienen capacidad de producir sideróforos pertenecen a los géneros Chryseobacterium sp. y Pseudomonas sp. (Alori y Babalola, 2018). 18 2.4. Producción de fitohormonas. Las plantas son capaces de producir de forma endógena una serie de hormonas vegetales que regulan parámetros como el crecimiento, la división celular o la extensión de la raíz. Estas reciben el nombre de fitohormonas (Ramos et al.,2018) y pueden ser de 5 tipos diferentes: auxinas, giberelinas, citoquininas, etileno y ácido abscísico. Algunos microorganismos pueden producir fitohormonas como parte de su metabolismo secundario y aparentemente, la producción de estas sustancias es una respuestas de los microorganismos a la producción de sustancias de la planta hacia la rizosfera (Loredo-Osti et al.,2004). Las dos más destacables son las auxinas y las giberelinas por lo que vamos a verlas un poco más en profundidad. Auxinas: estas hormonas favorecen el desarrollo de las raíces laterales de la planta, lo que permite una mejora en la captación de los nutrientes del suelo (Luo et al., 2018). El ácido indol acético (AIA) es la auxina más estudiada. Su síntesis en las rizobacterias se realiza por diversas vías metabólicas en función de la bacteria implicada y se produce a partir del triptófano (Camelo et al., 2011), que está presente en los exudados de las raíces. Entre las principales rutas de biosíntesis están la del ácido indol-3-piruvico (IPA), la indol 3-acetonitrilo (IAN), la triptamina (TAM) y la del indol-3-acetamida (IAM) (Molina-romero et al.,2015). Figura 5. Rutas de síntesis de AIA en bacterias y plantas (Rodríguez, 2013). 19 Giberelinas: son un grupo de moléculas complejas con grupos di-terpenos tetracarboxílicos (Molina-romero et al., 2015). Hay varios tipos diferentes, pero solo 4 de ellos pueden ser sintetizados por las PGPM (GA1, GA2, GA3 Y GA20). Estas hormonas son transportadas desde las raíces a las partes aéreas de la planta, donde los efectos que ejercen son notables y más aún cuando las bacterias tienen también la capacidad de producir auxinas, que estimulan el crecimiento radicular mejorando el suministro de nutrientes y facilitando el crecimiento en la parte aérea (Ramos et al., 2018) influyendo en procesos como la germinación, la floración y el desarrollo de los frutos (Alori y Babalola, 2018). 2.5. Actividad ACC desaminasa. Determinados microorganismos pueden producir el enzima ACC (ácido 1aminociclopropano-1-carboxilico) desaminasa, que actúa sobre el ACC, precursor inmediato del etileno, y lo transforma en α-cetobutirato y amonio (Alori y Babalola, 2018). El etileno, una de las hormonas vegetales mencionadas anteriormente, está muy relacionado con la senescencia de la planta y en situaciones de estrés, juega un papel fundamental para la supervivencia de esta, ya que se encarga de activar los mecanismos de señalización o actúa siendo el efector final de la respuesta (Alcántara et al., 2019). Sin embargo, esto puede ser contraproducente ya que cantidades muy elevadas de etileno provocan la supresión de la elongación de las raíces inhibiendo el desarrollo de la planta (Cetin et al., 2011). Cuando se produce una situación de estrés, el etileno producido por la planta regula su homeostasis lo que da lugar a una reducción en el crecimiento de los brotes y las raíces de la planta. Los microorganismos son capaces de producir la ACC desaminasa, que degrada la ACC para suministrar nitrógeno y energía. Además, al degradarse la ACC, se produce menos cantidad de etileno, lo que alivia el estrés de la planta y promueve su crecimiento (Vurukonda et al., 2016) (Figura 6). 20 Figura 6. Modelo del mecanismo de la enzima desaminasa del ácido 1-aminociclopropano-1carboxílico (ACC) mediante el cual las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal disminuyen los niveles de etileno en plantas (Esquivel-Cote et al., 2013). 3. PROBIÓTICOS BIOPESTICIDAS. El uso de biopesticidas como alternativa a los pesticidas químicos es algo cada vez más extendido para el control de plagas y enfermedades en los cultivos, debido a los efectos negativos que estos tienen sobre los seres humanos y el medio ambiente (Fernández y Juncosa, 2002). Los mecanismos por los cuales actúan estos biopesticidas se basan en la producción y secreción de distintas sustancias, como enzimas hidrolíticas o metabolitos secundarios tóxicos (Alori y Babalola, 2018). 3.1. Producción de enzimas hidrolíticas. Algunos probióticos son capaces de hacer frente a determinadas infecciones fúngicas gracias a que son capaces de producir y secretar enzimas hidrolíticas como las quitinasas, proteasas, lipasas y 1,3-glucanasas. Estas, conjuntamente, pueden atacar la pared celular de los hongos patogénicos y alterar la permeabilidad de su membrana (Alori y Babalola, 2018; Menéndez y Paço, 2020). Es cierto que hay que tener en cuenta que, estas enzimas se secretan al medio en bajas cantidades, y, además, son susceptibles a la desnaturalización y a la degradación por procesos químicos, físicos y biológicos (Menéndez y Paço, 2020). 21 Las enzimas hidrolíticas pueden ser secretadas por microorganismos como los hongos Trichoderma spp. (Alori y Babalola, 2018). 3.2. Producción de HCN. El cianuro de hidrógeno (HCN), es un metabolito secundario producido por algunas rizobacterias, que evita el crecimiento de las malas hierbas y además tiene poder antifúngico. Este tiene la capacidad de inhibir metaloproteinas esenciales para la vida de estos organismos, como por ejemplo la enzima citocromo C oxidasa, que forma parte de la cadena de transporte de electrones en la membrana interna de la mitocondria (Alori y Babalola, 2018). 3.3. Producción de antibióticos, antifúngicos y otros tóxicos. La producción de antibióticos, antifúngicos y otros metabolitos tóxicos es el mecanismo más conocido e importante utilizado por los probióticos para limitar la invasión de patógenos en las plantas. (Moreno et al., 2018). Existe una gran cantidad de microorganismos capaces de producir estos metabolitos, como por ejemplo las bacterias del género Pseudomonas, capaces de producir ácido pseudomónico (inhibe la síntesis de proteínas bacterianas), ácido fenazina-1carboxilico (es antifúngico, aumenta el nivel de especies reactivas de oxígeno), 2,4diacetilfloroglucinol (DAPG, activo frente a un gran número de organismos, como los nematodos, a los que afecta en la eclosión de los huevos) y muchos otros más metabolitos como la karacilina, la zwittermicina, etc. Las bacterias del género Bacillus también pueden producir antibióticos, tales como la subtilina (actúa sobre la pared de los hongos), la bacilisina (inhibe la síntesis de peptidoglucanos en bacterias), la clorotetaina, la iturina, etc. Por último, algunos hongos también pueden producir estos metabolitos, como por ejemplo Trichoderma harzianum, que produce metabolitos volátiles que impiden la podredumbre de la raíz provocada por hongos patógenos, o algunos hongos de los géneros Aspergillus y Penicillium, que son efectivos frente al hongo patógeno Phytophthora infestans (Alori y Babalola, 2018). 22 Muchos de estos fitopatógenos pueden desarrollar resistencia a algunas de estas sustancias, por lo que es muy interesante que los microorganismos que actúan como biopesticidas tengan la capacidad de sintetizar distintas sustancias tóxicas. Además, es importante también realizar ensayos previos, ya que se ha demostrado que algunos probióticos pueden ser muy efectivos frente algunos fitopatógenos, pero no frente a otros (Alori y babalola, 2018). 4. PROBIÓTICOS BIOCONTROLADORES. Los probióticos biocontroladores son difíciles de definir, ya que comparten propiedades biofertilizantes y biopesticidas. La literatura los define como microorganismos que protegen a la planta de forma inespecífica de los efectos deletéreos de los patógenos y de los estreses abióticos, permitiendo su crecimiento de forma indirecta (Menéndez y Paço, 2020). Los microorganismos pueden ejercer su función de biocontrol mediante mecanismos como la competición o la resistencia sistémica inducida. 4.1. Competición. Algunos microorganismos como la bacteria Pseudomonas fluorescens pueden limitar la proliferación de fitopatógenos en la rizosfera mediante la competición por los nutrientes. En este caso, en P. fluorescens, esto se debe a su propia motilidad, que está determinada por varios genes, y la generación de mutantes hipermoviles hace que la bacteria sea más competitiva, incrementando su habilidad de colonizar la rizosfera sin causar daños a la planta (Barahona et al., 2011). El lugar específico de colonización en la raíz también es muy relevante en el biocontrol de fitopatógenos, ya que si el probiótico ocupa el mismo lugar en la raíz que el fitopatógeno la efectividad de la competición será mayor. Collimonas fungivorans es un ejemplo de bacteria que controla el crecimiento de determinados hongos patógenos de esta manera (Kamilova et al., 2007). Sin embargo, la competición por sí sola no es suficiente para controlar la proliferación 23 de patógenos, sino que se requieren otras propiedades biopesticidas (Alori y Babalola, 2018). 4.2. Resistencia sistémica inducida. Algunos microrganismos son capaces desencadenar el desarrollo de mecanismos no específicos de resistencia a patógenos en las plantas. Esto se conoce como Resistencia Sistémica Inducida (ISR) e implica la activación por parte de los probióticos de mecanismos de resistencia a fitopatógenos e insectos dependientes de hormonas vegetales, concretamente de jasmonatos y etileno (Alori y Babalola, 2018). 5. EJEMPLOS DE PRINCIPALES PROBIÓTICOS 5.1. Biofertilizantes fijadores de Nitrógeno Como se ha visto anteriormente, los cultivos demandan altas cantidades de nitrógeno para su crecimiento y desarrollo, lo que ha hecho necesario el uso de fertilizantes minerales para mantener el rendimiento. En consecuencia, se han generado graves problemas ambientales, como son el deterioro de los suelos y la eutrofización. Una solución al problema que supone el uso intensivo de abonos sintéticos reside en los organismos fijadores de nitrógeno atmosférico, N₂, que pueden transformar el nitrógeno molecular en formas de nitrógeno asimilables por la planta (Singh et al., 2016). Las bacterias fijadoras de N₂ pueden estar presentes como organismos de vida libre en la rizosfera o estableciendo simbiosis con la planta. Entre las bacterias simbióticas fijadoras de N₂ más estudiadas, se encuentran Rhizobium sp. o Azospirillum sp., que han demostrado incrementar el crecimiento vegetal y el rendimiento de determinados cultivos del orden Fabales, como por ejemplo Vicia sativa, Vigna radiate, Vigna mungo o Pisum sativum, entre otros (Igiehon y Babalola, 2018). El uso de las bacterias fijadoras de N₂ en la agricultura, tanto simbióticas como de vida libre, es común hoy en día dado que existen biofertilizantes comerciales que contienen algunas de las bacterias que se han mencionado, como por ejemplo Vitasoil® 24 (Symborg, contiene Azotobacter sp. y Azospirillum sp.). Rhizobium sp. Se trata de un habitante común en los suelos agrícolas, pero frecuentemente su población es insuficiente para alcanzar una relación benéfica con la planta o no son capaces de fijar cantidades suficientes de N₂, por lo que es necesario inocularla la semilla para asegurar la FBN (Lázaro et al., 2017). Azotobacter sp. Los microorganismos pertenecientes a este género son bacterias asociativas de vida libre. Estos, además de ser capaces de producir la fijación biológica de nitrógeno atmosférico, pueden secretar fitohormonas y vitaminas (Rodríguez et al., 2016), solubilizar fosfato y movilizar hierro. Las bacterias del género Azotobacter no solo se limitan a favorecer el crecimiento vegetal, sino que también actúan como agentes biocontroladores y biopesticidas, ya que excretan metabolitos antifungicidas y tienen actividad ACC desaminasa, además de producir enzimas antioxidantes, como la superóxido dismutasa y la catalasa. Estas bacterias han resultado ser beneficiosas para una gran variedad de cultivos de importancia económica a nivel mundial, como por ejemplo el tomate (Solanum lycopersicum), el trigo (Triticum aestivum) y el sorgo (Sorghum bicolor) (Woo and Pepe, 2018). Cianobacterias Además de las bacterias que se acaban de nombrar, existe un grupo de bacterias fijadoras de N₂ con un alto potencial biotecnológico, sobre las que cada vez se hacen más estudios: las cianobacterias. Las cianobacterias son bacterias Gram-negativas muy ubicuas que tienen un gran impacto en los contenidos de carbono y nitrógeno en el suelo como consecuencia de su capacidad de fijar CO₂ mediante el proceso fotosintético, así como de fijar N₂. Como el complejo de la nitrogenasa, encargado de 31 microorganismos como probióticos para el desarrollo de una agricultura sostenible en los últimos años, existen limitaciones que aún no se han resuelto. La investigación sobre los beneficios que pueden aportar bacterias y hongos a los cultivos incrementa cada vez más año a año, pero desgraciadamente nunca es suficiente, ya que las relaciones planta-microbio son muy selectivas. Además, la extrapolación de los estudios de laboratorio al campo es relativamente escasos. Por otro lado, una de las limitaciones más importantes es que, en líneas generales, los probióticos no se producen a gran escala como lo hacen los pesticidas sintéticos o los fertilizantes minerales, por lo que para que la funcionalidad de los microorganismos sea la óptima en los cultivos, se debe poner esfuerzo en generar inóculos, ya sea en forma líquida o sólida, en grandes cantidades de manera económica y eficiente. También hay que tener en cuenta que el inóculo debe mantener su viabilidad desde que se produce hasta que se aplica al cultivo. Por ello, lo ideal es desarrollar probióticos que se puedan conservar a temperatura ambiente, lo que disminuiría los costes asociados. A esto, se suma que el uso de probióticos puede llegar a generar un impacto medioambiental severo. Por ejemplo, un microorganismo autóctono no patogénico se puede ver afectado por los metabolitos que secretan los probióticos para combatir microbios patogénicos, o bien se puede producir el desplazamiento de algunas especies de microorganismos indígenas, lo que es bastante propenso a ocurrir con el uso de microorganismos modificados genéticamente. Como consecuencia final, el equilibrio del ecosistema se vería alterado (Alori y Babalola, 2018). El acuerdo entre científicos, políticos y agricultores es necesario para la superación de estas limitaciones y el avance en el desarrollo de los probióticos para cumplir sus principales objetivos: satisfacer las necesidades alimentarias, tanto en países pobres como en países desarrollados en los que la población está en aumento; limitar los usos de fertilizantes minerales y pesticidas y solucionar los problemas ocasionados en el medioambiente con anterioridad. En definitiva, el uso de probióticos para el desarrollo de una agricultura sostenible es una estrategia que merece la pena explorar, ya que aporta beneficios a toda la humanidad, así como al planeta que habitamos (Menéndez y García-Fraile, 2017). 32 CONCLUSIONES El uso de probióticos en la agricultura es de una gran actualidad e importancia. Suponen una mejora agrícola tanto a nivel de absorción de nutrientes y de la estructura del suelo como de resistencia a estrés biótico y abiótico. El uso de microorganismos probióticos de plantas que sustituyan, en la medida de lo posible, el uso de pesticidas y fertilizantes minerales es una estrategia prometedora para alcanzar una agricultura sostenible. Los probióticos pueden actuar de formas muy variadas y sobre organismos diferentes, por lo que la investigación en este ámbito es fundamental. Los probióticos pueden actuar como agentes biofertilizantes, biocontroladores y/o biopesticidas, dando lugar, en todos los casos, al desarrollo vegetal y, en ocasiones, a la restauración del medioambiente. Por último, incidir en una necesidad de una mayor investigación a un mayor estudio de las posibles relaciones entre la microbiota indígena y la cepa inoculada, búsqueda de nuevos probióticos, mediante técnicas moleculares y la investigación en tecnologías de formulación y producción industrial van a permitir el uso masivo de estas tecnologías. BIBLIOGRAFÍA • Aguado-Santacruz GA, Moreno-Gómez B, Jiménez-Francisco B, García-Moya E, Preciado-Ortiz R. Impacto de los sideróforos microbianos y fitosideróforos en la asimilación de hierro por las plantas: una síntesis. Rev Fitotec Mex. 2012; 35(1): 9-21. • Ahemad M, Kibret M. Mechanisms and applications of plant growth promoting rhizobacteria: Current perspective. 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