Control del dopaje en el deporte mediante espectrometría de masas

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO BIBLIOGRÁFICO presentado por Carlos Mora Cubero para optar al GRADO EN FARMACIA Curso Académico 2020-2021 Tutor: José Luis Espartero Sánchez Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica Sevilla, julio 2021 CONTROL DEL DOPAJE EN EL DEPORTE MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE MASAS Control del dopaje en el deporte mediante espectrometría de masas Carlos Mora Cubero Trabajo Fin de Grado bibliográfico Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla Tutor: José Luis Espartero Sánchez Dpto. de Química Orgánica y Farmacéutica Sevilla, julio de 2021 1 RESUMEN Durante toda la historia de la humanidad, el dopaje ha formado parte de nuestra cultura. Antiguamente se utilizaba como un método de supervivencia, sin conocer los fundamentos científicos en que se basaba. En la actualidad se muestra como una herramienta que usan los deportistas frecuentemente para obtener beneficios en el rendimiento físico y, así, conseguir ganar. Ante la ascendente aparición de escándalos referentes a la práctica de dopaje (varios con desenlace fatal) a mediados del siglo XX, se comienza a realizar controles a los deportistas para evitar el consumo de sustancias potencialmente perjudiciales para la salud que hacen la competición injusta. Entre los primeros métodos de control utilizados surge la espectrometría de masas, una técnica analítica con la que se obtiene información acerca de la estructura de las moléculas, así como su masa molecular. Esta técnica, basada en la formación de iones, permite analizar muestras humanas e identificar compuestos xenobióticos prohibidos en el deporte. Su desarrollo y acoplamiento a técnicas de separación la hacen ideal para la identificación y/o determinación estructural de gran cantidad de moléculas en matrices complejas. Gracias a la espectrometría de masas y su poder de detección se consiguió desvelar gran cantidad de casos de fraude en el deporte, como el de Ben Johnson, a quien le fue retirada una medalla de oro olímpica cuando se detectó un esteroide sintético en su orina. Parecida fue la historia de Marion Jones, que se dopaba con un compuesto similar hasta entonces desconocido. Otros deportistas, mundialmente reconocidos, como el ciclista Alberto Contador y la tenista Maria Sharapova también dieron positivo en controles antidopaje realizados con esta técnica y fueron retirados de la competición durante un tiempo. Palabras clave: deporte, dopaje, espectrometría de masas. 2 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 3 2. ANTECEDENTES 5 2.1. Raíces del dopaje 5 2.2. Origen del dopaje en el deporte 6 2.3. Historia de la espectrometría de masas 10 2.4. Fundamentos teóricos de la espectrometría de masas 11 3. OBJETIVOS Y METODOLOGÍA 17 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 18 5. CONCLUSIONES 31 6. BIBLIOGRAFÍA 32 3 1. INTRODUCCIÓN El consumo de plantas y sustancias obtenidas de la naturaleza por parte del hombre para alterar las sensaciones y funciones biológicas tiene milenios de historia. Tanto es así que, al igual que en otros ámbitos, ya se realizaba esta práctica mediante la ingesta de raíz de ginseng en China, la hoja de coca en Perú o derivados de hongos en países escandinavos (Gracia et al., 2009). Su consumo se considera una costumbre adoptada por muchas culturas a lo largo de la historia siempre con el fin de aumentar el rendimiento físico consiguiendo omitir la fatiga, ya fuese el objetivo puramente recreativo o mera supervivencia. Conforme la sociedad ha ido avanzando de la mano de los avances tecnológicos, igual lo ha hecho la sofisticación y profesionalización del deporte. Todo ello ha derivado de la misma forma en el continuo desarrollo de nuevas sustancias utilizadas por el ser humano para mejorar las marcas en competición. Tras varios escándalos mediáticos relacionados con el uso y abuso de sustancias dopantes y, sobre todo, a partir de la trágica muerte del ciclista Tommy Simpson retransmitida en directo en 1967, provocada por el consumo de anfetamina, se creó la Comisión Médica del Comité Olímpico Internacional (COI). Desde su nacimiento, esta se encargó de los primeros controles antidopaje en los Juegos Olímpicos de México en 1968 y de la armonización internacional de las listas de sustancias y protocolos para luchar contra esta práctica (Gracia et al., 2009). Desde entonces la Ciencia se ha visto fuertemente implicada en una doble vertiente. Por un lado, en el desarrollo de nuevas sustancias para su uso ilícito en el deporte, y por otro, en la creación de métodos aptos para su identificación en muestras humanas. Es en este último aspecto donde cobra especial importancia la espectrometría de masas (EM), una técnica analítica basada en el estudio detallado de los iones que se forman al suministrar energía a una molécula, mediante la cual se puede obtener información acerca de la estructura de las moléculas analizadas y su masa (Carey, 2014). 4 Gracias a las sucesivas innovaciones de esta técnica, así como a su acoplamiento a otros métodos de separación y a la optimización de todos los protocolos llevados a cabo desde la recogida de muestras, en apenas medio siglo los controles realizados sobre deportistas para evitar el uso fraudulento de sustancias o métodos para obtener ventajas han conseguido desmantelar la administración de muchos compuestos nocivos para la salud humana y a la vez hacer más justa la competición. 5 2. ANTECEDENTES 2.1. RAÍCES DEL DOPAJE “El dopaje es una práctica antideportiva contra la que se actúa ejerciendo diferentes tipos de acciones cuyo objetivo es disuadir al deportista de utilizar sustancias y métodos prohibidos. Entre estas acciones se encuentran las que se conocen como control del dopaje. Y entre estos procedimientos de dicho control, se encuentran los analíticos, desarrollados por laboratorios específicos, acreditados internacionalmente, …” (Rodríguez Cano, 2008). Así entiende el Consejo Superior de Deportes (CSD) de España en su obra Historia del dopaje, sustancias y procedimientos de control (Rodríguez Cano, 2008) la lucha contra el dopaje, una actividad relacionada específicamente con el deporte. Sin embargo, el concepto de dopaje como tal se remonta a miles de años atrás, cuando las tribus consumían plantas y brebajes administrados por el chamán para luchar, ya fuese durante la caza, en enfrentamientos entre pueblos o dentro de uno mismo; incluso con fin afrodisíaco para mejorar sus cualidades sexuales (Rodríguez Bueno, 2008). Dentro de la cultura china se encuentran referencias al uso de algunas especies del género Ephedra que se remontan a más de 5000 años atrás. Estas contienen efedrinas, conocidas por sus efectos estimulantes adrenérgicos y posteriormente clasificadas como dopantes. Además, el mismo emperador chino Shen Nung en 2737 a.C. proporcionó información sobre el efecto estimulante de Panax ginseng que, aunque su consumo no está prohibido actualmente, produce un incremento evidente en el rendimiento físico (Rodríguez Bueno, 2008). Por otra parte, en gran parte del territorio americano se reportaron usos de la hoja de coca (Erythroxylon coca, entre otras especies) por sus efectos estimulantes, anorexígenos y desfatigantes. Sobre todo, en las civilizaciones de América Central y América del Sur era común que los trabajadores indígenas masticasen hojas de coca para afrontar fuertes trabajos como largas caminatas en las que cargaban grandes pesos. Gracias al efecto producido podían evitar el hambre, la sed y la fatiga para realizar 12 detector, este procesa la información recibida. Los datos recogidos se plasman en un espectro de masas, que no es más que un diagrama de barras en el que cada ion detectado aparece reflejado según dos variables: abundancia relativa y relación masa/carga (m/z) (Carey, 2014). De los espectros de masas que ofrecen estos equipos se puede deducir valiosa información acerca de la estructura de las moléculas, así como su masa molecular, por lo que además conforma una herramienta útil en la identificación de compuestos desconocidos. En la figura 1 se muestra como ejemplo, el espectro de masas de la anfetamina. Figura 1. Espectro de masas de la anfetamina (NIST Chemistry WebBook) La EM se diferencia de otras técnicas como las técnicas espectroscópicas en que estas últimas se basan en la absorción de energía por la muestra al hacer incidir un haz de radiación electromagnética (REM) sobre la misma. En la EM, la fuente de energía suele ser más potente al tener que ionizar la muestra, y lo que se detectan son los iones producidos (Carey, 2014). Por lo tanto, la EM es una técnica destructiva, a diferencia de las anteriores. Un espectrómetro de masas siempre debe constar de tres componentes principales: la fuente de ionización, el analizador y el detector. Comenzaremos hablando de diferentes técnicas para la producción de iones. 13 Uno de las primeras fuentes de ionización desarrolladas fue el impacto electrónico (Electron Ionization, EI), en el que la muestra se bombardea con un haz de electrones acelerados bajo un potencial de 70 V (energía de 70 eV). Este impacto consigue, al menos, arrancar un electrón de las moléculas de la muestra, formándose un catión, denominado ion molecular, [M]+·, que posee un electrón desapareado. Frecuentemente este ion molecular acumula suficiente energía residual para escindirse en más fragmentos (Harris, 2006), como se ilustra en la figura 2. Figura 2. Esquema del fundamento de la ionización por EI (Espartero, 2021) Existen también otras técnicas como la ionización química (Chemical Ionization, CI) que es un modo de ionización más suave y, por lo tanto, provoca menos fragmentación del analito que por EI, que muchas veces no proporciona el ion molecular. La CI consiste en el bombardeo electrónico de gases reactivos con el que se generan reactivos cargados positivamente (Figura 3), que son los que donan posteriormente protones al analito de la muestra formándose los iones cuasimoleculares (Harris, 2006). Figura 3. Esquema del fundamento de la ionización por CI (Espartero, 2021) 14 La introducción a finales de la década de 1980 de técnicas de ionización más suaves supuso una revolución dentro de la EM que permitió el análisis de gran cantidad y variedad de moléculas (Griffiths, 2008). Una de estas técnicas destacadas es la ionización por electrospray (Electrospray Ionization, ESI). En la ESI (Figura 4), el analito se encuentra disuelto en un solvente que se hace pasar por un capilar de acero sometido a un alto voltaje. En la punta del capilar por la que salen, se producen gotas cargadas, que se separan (nebulización) y van reduciendo su tamaño, dividiéndose de nuevo debido a la rápida evaporación del disolvente. Se generan así gotículas cada vez más pequeñas y altamente cargadas que acaban estallando literalmente con producción de iones multicargados en fase gaseosa (Maher et al., 2015). Estos iones cuasimoleculares se mantienen prácticamente intactos sin romperse, de ahí que se considere como suave a la técnica. La deconvolución de estos picos multicargados permite la determinación de iones de muy alta masa molecular, pero detectados a baja m/z (Martínez, 2002). Figura 4. Esquema de ionización por ESI (Espartero, 2021) Esta técnica de ionización es ideal para su acoplamiento con un método previo de separación como es la cromatografía de líquidos (CL), lo que permite el análisis de muestras complejas de sustancias termolábiles, como pueden ser por ejemplo los fluidos biológicos. Además, la ESI se puede acoplar a equipos con analizadores como son cuadrupolo (Q), Orbitrap, tiempo de vuelo (TOF), trampa de iones (IT) así como combinaciones de los mismos (Muñoz, 2018). Por último, la técnica MALDI se fundamenta principalmente en la naturaleza de la matriz en la que se deposita la muestra previamente disuelta. Esta matriz debe ser de bajo peso molecular y absorber fácilmente la luz a la longitud de onda con la que trabaje el láser. Al hacer vacío conseguimos la evaporación del disolvente fijándose el analito a la matriz, 15 que ahora es irradiada con luz láser UV. La matriz transmite la energía a las moléculas de analito provocando su desorción e ionización, consiguiéndose así grandes cantidades del ion molecular monocargado con pocos fragmentos iónicos (Maher et al., 2015; Muñoz, 2018). Esta técnica se asocia usualmente a un analizador de tiempo de vuelo (Time Of Flight, TOF), y además de la frecuencia del láser lo que varía en su implementación es la naturaleza de la matriz empleada, que depende asimismo de la naturaleza de la sustancia a analizar (Muñoz, 2018). Figura 5. Esquema de ionización por MALDI (Espartero, 2021) El analizador de masas es el componente encargado de la separación de los iones en función de su relación m/z. Existe gran variedad de analizadores, clasificados según los métodos de desviación de los iones y cada uno con sus propias ventajas y aplicaciones. Entre ellos se encuentra el cuadrupolo (Q), consistente en cuatro barras paralelas que crean entre ellas un campo llamado cuadrupolar que hace oscilar a los iones desviándolos según su relación m/z. Por otra parte, está el analizador Orbitrap, que consta de un electrodo interior en forma de huso y otro exterior en forma de tubo que provoca el movimiento de los iones tanto alrededor del huso como hacia delante y hacia atrás induciendo una señal imagen de la que se puede deducir su relación m/z. En el analizador TOF por último, se aplica un campo eléctrico para acelerar los iones y se mide el tiempo que tarda cada uno en llegar desde la cámara de ionización al detector, que es función de su masa, suponiendo que todos son monocargados, pudiendo así distinguir su relación m/z (Muñoz, 2018). Por último, el detector se encarga de procesar la información recibida con el impacto de cada ión. 16 Cabe destacar la amplia diversidad de analizadores y fuentes de ionización, siendo de vital importancia la selección de los más adecuados en su asociación para cada aplicación concreta (Espartero, 2021). De la misma forma, cobra especial trascendencia el acoplamiento de diferentes técnicas de separación a los equipos de EM, desembocando en un aumento de la sensibilidad que ha permitido la determinación de moléculas provenientes de matrices complejas como la orina, donde es esenciar diferenciar la señal del analito con el ruido químico o biológico de fondo (López et al., 2020). El primer acoplamiento descrito fue en 1975 cuando se asoció un cromatógrafo de gases con columnas capilares a un espectrómetro de masas. Posteriormente McLafferty describe el primer acoplamiento de un cromatógrafo de líquidos HPLC a un equipo de EM, y en 1982 aparece la espectrometría en tándem a raíz del primer triple cuadrupolo, que permitió realizar la técnica sobre iones previamente seleccionados (Martínez, 2002). Pronta fue la implementación de técnicas que acoplaban la espectrometría de gases al equipo de EM para la determinación de compuestos xenobióticos en el control del dopaje, donde se estudia la presencia de agentes anabolizantes sintéticos en muestras de orina (López et al., 2020). El acoplamiento de cromatografía líquida también dio buenos resultados. En un primer momento esta combinación no superaba en rendimiento a las ya asentadas CG-EM (Shackleton et al., 1997), y comenzaron a través de cromatografía líquida en fase reversa acoplado a detector UV y luego pasaron por termospray con EM. Sin embargo, a raíz del desarrollo de la ionización suave por ESI se consiguió un óptimo acoplamiento que, además de proveer de mayor cantidad de información espectral, facilitó enormemente los análisis de muestras de deportistas como la orina. Esto se debe a que la preparación se simplificó, se hizo más rápida y versátil para compuestos polares y no volátiles sin necesidad de derivatización previa (Badoud et al., 2011). 17 3. OBJETIVOS Y METODOLOGÍA El objetivo general de esta revisión bibliográfica es la actualización acerca del tema relacionado con la EM y el papel que representa en los protocolos de control antidopaje en la actualidad. La metodología llevada a cabo para la revisión comenzó con una búsqueda bibliográfica en la que las principales palabras clave relacionadas con el tema tratado han sido: espectrometría de masas, dopaje, determinación, control antidopaje, análisis. El proceso de documentación de este TFG se ha realizado a través de la búsqueda de una bibliografía que permitiese una primera aproximación adecuada al tema propuesto, centrándonos en los trabajos de revisión publicados con anterioridad. A raíz de la puesta al día realizado con estos, se llevó a cabo una segunda búsqueda en la que nos centramos en la profundización de cada caso expuesto en los resultados, para poder realizar un análisis completo y en el adecuado contexto. Las búsquedas bibliográficas se realizaron en las bases de datos PubMed, SciFinder, American Association for the Advancement of Science (AAAS o Science), Google Académico, así como las páginas web del Depósito de Investigación de la Universidad de Sevilla (idUS) o de la biblioteca de la Universidad de Sevilla (FAMA) y Dialnet. Una vez finalizada la búsqueda bibliográfica e identificados los artículos considerados más relevantes para el tema de la revisión, se procedió a la selección de los mismos para incluirlos en la bibliografía de este TFG. Se han seleccionado aquellos artículos cuyo resumen se adecuaba más a los objetivos de la revisión. 18 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Dentro del dopaje en los Juegos Olímpicos, los anabolizantes predominan con clara diferencia sobre el resto de sustancias, seguidos por los estimulantes (Gracia et al., 2009). Los esteroides anabólicos son derivados sintéticos de la testosterona que simulan su actividad en el organismo. Son administrados en deportistas para aumentar la masa muscular al incrementar la síntesis proteica, consiguiendo así una ventaja que, con el entrenamiento y la dieta, ayuda a mejorar el rendimiento físico. Su uso se comenzó a generalizar a mediados del siglo XX, con gran éxito debido a que, además de dar grandes resultados, resultaban a menudo difíciles de detectar por las técnicas colorimétricas empleadas en esa época para el control del dopaje. Un ejemplo muy conocido fue el caso de Ben Johnson, el atleta canadiense que consiguió el récord mundial en la categoría de 100 metros lisos en los Juegos Olímpicos de Seúl 1988 al cruzar la meta en tan sólo 9,79 segundos (Figura 6). Sin embargo, tres días después se dio a conocer el resultado positivo en su control antidopaje, en el que se detectó la presencia de estanozolol. Este compuesto había sido incluido en la lista de sustancias prohibidas por el COI en 1974 (Poelmans et al., 2002), y tras la noticia se le retiró la medalla de oro al deportista canadiense (Marshall, 1988). Figura 6. Ben Johnson (derecha) en los Juegos Olímpicos de Seúl 1988 (Marshall, 1988) El estanozolol es un derivado muy parecido a la metiltestosterona, con un anillo de pirazol unido al sistema de anillos esteroideo, cuyo espectro de masas se muestra en la 19 figura 7. Esta diferencia estructural hace su extracción y separación más complicada. Además, los niveles excretados en orina de esta sustancia son bajos, debido a su reducida excreción renal y rápida metabolización, por lo que las concentraciones disponibles en orina son realmente reducidas. Todo esto, añadido a su bajo rendimiento en separación cromatográfica, hacía que su uso antes de 1986 pasase relativamente desapercibido, ya que era difícil de detectar en orina (Poelmans et al., 2002). Figura 7. Espectro de masas del estanozolol (NIST Chemistry WebBook) Por ello, la investigación relativa a mejorar la detección de estazonolol se centró en los metabolitos monoy dihidroxilados (Figura 8) de su degradación en el organismo, que resultaron ser más fácilmente detectables y durante más tiempo que el compuesto original. En 1985, los estudios de Donike y Schänzer les llevaron a un nuevo método de derivatización del estanozolol con el que consiguieron aumentar suficientemente la sensibilidad de la técnica usando CG-EM para detectar el metabolito 3’- hidroxiestanozolol, al hacerlo compatible con esta técnica (Schänzer y Thevis, 2015). Es por ello que el avance científico llegó justo a tiempo para desenmascarar este caso. 20 Figura 8. Estructuras químicas del estanozolol y sus derivados, en comparación con la estructura de la metiltestosterona (Poelmans et al., 2002) Años más tarde se implementó otra técnica en la que acoplando el espectrómetro de masas a un cromatógrafo de líquidos (CL-EM), se consiguió la determinación del derivado glucurónido 3’-hidroxiestanozolol sin necesidad de derivatización previa, como ocurría al usar CG-EM, aumentando la sensibilidad del análisis y el poder de detección (Poelmans et al., 2002). En un estudio realizado durante seis meses en 659 deportistas se comprobó la eficacia de esta técnica, CL-EM, en la que 85 resultados fueron positivos en estanozolol. Con la anterior técnica de CG-EM, sólo 13 de estos casos habrían sido detectados (Schänzer et al., 2013). Así, esta nueva técnica se asentó como la de elección para la determinación de estanozolol. Otro caso notorio en la historia del deporte es el de Marion Jones, una atleta estadounidense que tras ganar los 100 metros (récord incluido) en el Mundial de Sevilla 1999, arrasó en los Juegos Olímpicos de Sydney del año 2000 con cinco medallas: tres de oro y dos de bronce (Figura 9). Figura 9. Marion Jones en Sidney 2000 (CBSnews, 2007) 21 En cambio, pasó a la historia por ser partícipe de una trama de fraude en el deporte, ayudada por los laboratorios Balco (Martínez de Osaba y Goenega, 2008). Todo por el descubrimiento de un nuevo compuesto: la tetrahidrogestrinona (THG). Se trata de un compuesto sintético cuya existencia permanecía oculta al mundo hasta que una persona, de forma anónima, entregó en junio de 2003 a la Agencia Antidopaje de los Estados Unidos una jeringa, procedente del vestuario de Marion Jones, que supuestamente contenía un esteroide anabólico imposible de detectar con los controles de dopaje de la época (Catlin et al., 2004). A raíz de esta evidencia, se comenzó a estudiar el misterioso caso. En primer lugar, se procedió a analizar la muestra con CG-EM, tanto la forma nativa como los compuestos derivados al tratarse con reactivos estándares de derivatización utilizados en EM. Donde se esperaba observar un solo componente, se obtuvieron varios picos, uno de ellos claramente mayoritario, de sustancias desconocidas a excepción de uno correspondiente a la norboletona. Este conocido esteroide estaba presente en pequeña proporción, lo que sugería que se trataba de una impureza contaminante o de un subproducto sintético, por lo que se pensó que el compuesto mayoritario desconocido debería tener un esqueleto de carbono idéntico. La muestra nativa analizada por CG-EM reveló la presencia de un ión molecular [M]+. a m/z 312. Tras analizarla con CL-EM se obtuvo un espectro de masas que mostró el ión más abundante [M+H]+ a m/z 313. Por último, mediante CG-HRMS 2 se dedujo la fórmula molecular de este compuesto desconocido, C21H28O2, con masa molecular teórica de 312.2089 (Catlin et al., 2004). A continuación, se llevó a cabo un segundo análisis en el que se compararon los espectros de masas de los compuestos sin derivatizar de gestrinona y la sustancia desconocida, que se muestran en la figura 10. En esta figura se puede observar cómo todos los iones por debajo de m/z 240 coinciden en las dos sustancias, lo que sugiere un esqueleto carbonado común. En el artículo se indica, además: “En el espectro del compuesto desconocido, comparado con el de gestrinona, los fragmentos por encima de m/z 240 aumentan en 4 unidades porque el 2 HRMS son las siglas en inglés de espectrometría de masas de alta resolución (High Resolution Mass Spectrometry) 28 procedió a añadirlo a su lista de sustancias prohibidas de 2016 (Schobersberger et al., 2017). Este último acontecimiento fue el que pasó por alto la tenista rusa Maria Sharapova (Figura 16), que fue acusada en 2016 por dopaje al dar positivo en meldonium. Admitió estar tomando este fármaco desde 2006, durante diez años, cuando aún no estaba prohibido. Sin embargo, desde el 1 de enero de 2016 entró en vigor la nueva lista de prohibiciones de la AMA donde se incluyó por primera vez esta sustancia. Sharapova alegó no haber leído la carta en la que se le informaba de las nuevas sustancias incluidas en el nuevo reglamento, pero a pesar de ello fue apartada de la competición durante más de un año (Marca, 2016). Figura 16. Maria Sharapova admitiendo en rueda de prensa el uso de meldonium (BBC, 2016) A pesar del actual predominio del empleo de CL-EM en la confirmación analítica de la mayoría de sustancias dopantes, la CG-EM conserva su utilidad al seguir siendo preferente en la detección de ciertos anabolizantes, al igual que sirve para la detección de nuevos métodos de dopaje. En este contexto tenemos el ejemplo del gas noble xenón, el cual, tras los Juegos Olímpicos de Invierno de 2014 se detectó en muchos deportistas rusos, sospechándose incluso que la práctica de la inhalación de xenón llevaba años siendo utilizada por el equipo deportivo ruso en pasadas Olimpiadas. De hecho, ya en un documento interno del Instituto Nacional de Investigación Ruso (dependiente del Ministerio de Defensa) publicado en 2010, se recomendaban pautas de administración de este gas a los atletas, según recoge la Agencia Española de 29 Protección de la Salud en el Deporte en su blog (AEPSAD, 2014). Por esta razón, el 1 de septiembre de ese mismo año de 2014 la AMA lo incluyó en la lista de sustancias prohibidas, dentro del grupo 2 (Hormonas peptídicas, factores de crecimiento y sustancias relacionadas) como agente estabilizante y activador de la eritropoyesis (AEPSAD, 2014). En palabras del doctor Santos: “El gas xenón estimula el llamado HIF-1-alfa (del inglés Hypoxia Inducible Factor o factor inducible de la hipoxia), que es un factor de transcripción que, entre otros efectos, estimula la producción de eritropoyetina o EPO endógena. Y bueno, todos conocemos los efectos de la EPO: estímulo de la síntesis de glóbulos rojos e incremento de los parámetros hematológicos en general, que tienen como consecuencia última una mejora del transporte de oxígeno a los tejidos y, por consiguiente, un incremento en el rendimiento” (Santos, 2014). Poco después se desarrolló una primera técnica de CG-EM, tanto con analizador TOF como de triple cuadrupolo, para su identificación en muestras de sangre y plasma humanos (Thevis et al., 2014). El xenón se pudo rastrear hasta niveles de 0,5 nmol/mL mediante la monitorización de los tres principales isótopos de xenón a m/z 129, 131 y 132. Figura 17. Cromatograma de iones totales (arriba) de una muestra de plasma conteniendo xenón y el correspondiente espectro de masas (abajo) mostrando la distribución isotópica característica del xenón (Thevis et al., 2014) 30 En la figura 17 se presenta un cromatograma de iones totales y el espectro de masas medido a partir de una muestra de sangre extraída a un paciente que ha recibido anestesia asistida por xenón 24 horas después de su administración, lo que proporciona una prueba de concepto para futuras aplicaciones en el control antidopaje. 31 5. CONCLUSIONES Los enormes avances producidos desde el origen de la espectrometría de masas y su implementación en el control antidopaje en el deporte, así como su acoplamiento a técnicas de separación, no han hecho más que demostrar su enorme utilidad a la hora de prevenir (y detener) que los deportistas consuman sustancias prohibidas para aumentar su rendimiento físico y así conseguir ganar. Los protocolos analíticos más recientes que utilizan CL-EM han supuesto un paso de gigante en el análisis de muestras complejas como la orina humana, donde es imprescindible poder discernir la señal de un compuesto en concreto de las correspondientes a sustancias endógenas o aquellas exógenas que no suponen ningún riesgo. Aún así, las técnicas basadas en CG-EM no han quedado obsoletas y sigue siendo de elección en la detección de algunos compuestos. Sin embargo, los intentos de aquellos que siempre harán cualquier cosa por ganar hacen que los métodos de control expuestos siempre vayan un paso por detrás. A medida que se mejora y amplía la detección de sustancias, otro sector del deporte estará buscando un nuevo compuesto no descubierto o no prohibido aún, o un método para enmascarar el uso de alguna sustancia ya prohibida. 32 6. BIBLIOGRAFÍA AEPSAD. “La AMA incluye el xenón en la Lista de Sustancias Prohibidas ¿Qué es este gas?” [en línea]. 2014. [Consultado en junio de 2021]. Disponible en: http://blog.aepsad.es/la-amaincluye-el-xenon-en-la-lista-de-sustancias-prohibidas-que-es-este-gas/ Badoud F, Guillarme D, Boccard J, Grata E, Saugy M, Rudaz S, et al. Analytical aspects in doping control: Challenges and perspectives. Forensic. Sci. Int. 2011; 213: 49–61. Bazo E, Cantalejo M, Chicaiza I, Grau I, Gutiérrez Á, Padín JF. Dopaje con clembuterol: ¿es posible la contaminación con carne en el “Caso del ciclista Alberto Contador”? Actual. En Farmacol. y Ter. 2013; 11: 73–9. BBC. "¿Qué es el meldonium, el medicamento soviético que tiene en problemas a Maria Sharapova?" [en línea]. 2016. [Consultado en julio de 2021]. Disponible en: https://www.bbc.com/mundo/noticias/2016/03/160308_deportes_salud_meldonium_maria_ sharapova_dopaje_tenis_jmp Carey, F. Química Orgánica, 6ª edición. McGraw-Hill; 2014. Catlin DH, Sekera MH, Ahrens BD, Starcevic B, Chang YC, Hatton CK. Tetrahydrogestrinone: Discovery, synthesis, and detection in urine. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004; 18: 1245– 1049. CBSnews. "Marion Jones Returns Five Olympic Medals" [en línea]. 2007. [Consultado en junio de 2021]. Disponible en: https://www.cbsnews.com/news/marion-jones-returns-five-olympicmedals/ Espartero J.L. Apuntes de la asignatura "Análisis Estructural de Fármacos". 2021. Universidad de Sevilla. Görgens C, Guddat S, Dib J, Geyer H, Schänzer W, Thevis M. Mildronate (Meldonium) in professional sports - monitoring doping control urine samples using hydrophilic interaction liquid chromatography - high resolution/high accuracy mass spectrometry. Drug. Test. Anal. 2015; 7: 973–9. Gracia L, Rey JP, Casajús JA. El dopaje en los Juegos Olímpicos de verano (1968-2008). Apunt. Medicina de l'Esport. 2009; 44: 66–73. Griffiths J. A brief history of mass spectrometry. Anal. Chem. 2008; 80: 5678–83. Harris D. C. Análisis químico cuantitativo. 3ª ed. Madrid: Reverté; 2006. López D, Martínez D, Correa T, Montes de Oca R. Implementación de una técnica de Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas Triple Cuadruplo para detectar compuestos 33 xenobióticos en muestras de orina para el control del dopaje. Rev. CENIC Cienc. Quím. 2020; 51(1): 35–48. Maher S, Jjunju FPM, Taylor S. Colloquium: 100 years of mass spectrometry: Perspectives and future trends. Rev. Mod. Phys. 2015; 87: 113–35. Mandell R. D. Historia cultural del deporte. Barcelona: Bellaterra, 1986. Marca. "Meldonium: la sustancia prohibida que consumía Sharapova" [en línea]. 2016. [Consultado en mayo de 2021]. Disponible en: https://cuidateplus.marca.com/ejerciciofisico/2016/03/08/meldonium-sustancia-prohibida-consumia-sharapova-110042.html Marshall E. The Drug of Champions. Science. 1988; 242: 183–184. Martínez de Osaba y Goenega JA. El caso Marion Jones o el llanto de una reina. Podium. 2008; 3: 51–6. Martínez R. La espectrometría de masas: Nacimiento, desarrollo, evolución y aplicaciones modernas. An. Quím. 2002; 3(1): 51-56. Moldes Farelo R. Cuando batir el récord es secundario: “Deporte Espectáculo”, construcción de mitos y consumo de sustancias prohibidas. 2004: 425–439. Muñoz Muñoz, E. (2018). El vuelo de los elefantes. El nacimiento de una nueva era. (Trabajo Fin de Grado). Universidad de Sevilla, Sevilla. NIST Chemistry WebBook. https://webbook.nist.gov/chemistry (consultado en junio de 2021). Poelmans S, De Wasch K, De Brabander HF, Van De Wiele M, Courtheyn D, Van Ginkel LA, et al. Analytical possibilities for the detection of stanozolol and its metabolites. Anal. Chim. Acta. 2002; 473: 39–47. Rodríguez Bueno A. F. Introducción al Volumen I. En: Consejo Superior de Deportes, editor. Historia de dopaje, sustancias y procedimientos de control, Vol. I. Madrid: Ministerio de Educación, Política Social y Deporte; 2008. 19-22. Rodríguez A. F., Rodríguez C. Las sustancias y métodos prohibidos en el deporte. En: Consejo Superior de Deportes, editor. Historia de dopaje, sustancias y procedimientos de control, Vol. I. Madrid: Ministerio de Educación, Política Social y Deporte; 2008. 95-126. Rodríguez Cano C. La historia del dopaje. En: Consejo Superior de Deportes, editor. Historia de dopaje, sustancias y procedimientos de control, Vol. I. Madrid: Ministerio de Educación, Política Social y Deporte; 2008. 24-54. RTVE. "Contador sentencia el Tour en el Tourmalet" [en línea]. 2010. [Consultado en Junio 2021]. Disponible en: https://www.rtve.es/deportes/20100722/contador-sentencia-tourtourmalet/340760.shtml 34 Santos J. "Gas xenón: ¿dopaje del futuro o campaña de desprestigio?" [en línea]. 2014. [Consultado en junio de 2021]. Disponible en: https://www.martiperarnau.com/gas-xenondopaje-del-futuro-o-campana-de-desprestigio/ Schänzer W, Guddat S, Thomas A, Opfermann G, Geyer H, Thevis M. Expanding analytical possibilities concerning the detection of stanozolol misuse by means of high resolution/high accuracy mass spectrometric detection of stanozolol glucuronides in human sports drug testing. Drug Test Anal. 2013; 5: 810–8. Schänzer W, Thevis M. Human sports drug testing by mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 2015; 9999: 221–35. Schobersberger W, Dünnwald T, Gmeiner G, Blank C. Story behind meldonium-from pharmacology to performance enhancement: A narrative review. Br. J. Sports Med. 2017; 51: 22–5. Shackleton CHL, Chuang H, Kim J, De La Torre X, Segura J. Electrospray mass spectrometry of testosterone esters: Potential for use in doping control. Steroids. 1997; 62: 523–9. Sharma KS. Mass spectrometry-The early years. Int. J. Mass Spectrom. 2013; 349–350: 3–8. Thevis M, Piper T, Geyer H, Thomas A, Schaefer MS, Kienbaum P, Schänzer W. Measuring xenon in human plasma and blood by gas chromatography/mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom., 2014; 28 (13): 1501-1506. https://doi.org/10.1002/rcm.6926 World Anti-Doping Agency. The 2021 prohibited list: international standard. Montreal, Canada, 2021. [Consultado en mayo de 2021]. Disponible en: https://www.wadaama.org/en/resources/science-medicine/prohibited-list-documents