Estudio de electrodos modificados con películas de las bases del adn y nucleolípidos derivados mediante la combinación de métodos electroquímicos y espectroscópicos
Abstract
En esta tesis se han estudiado las adsorciones y co-adsorciones de las bases complementarias del ADN, así como las interacciones entre ellas, en las interfases organizadas de electrodos monocristalinos de oro o de películas de oro nanoestructuradas. Se ha utilizado para ello una metodología que combina técnicas de tipo puramente electroquímico, tales como los de voltametría cíclica, coulombimetría y espectroscopia electroquímica de impedancias (EIS, por sus siglas en inglés) con diversas técnicas espectro-electroquímicas por transformada de Fourier en el infrarrojo (FT-IR) “in-situ” . En concreto, se han utilizado las técnicas de absorción-reflexión en el infrarrojo en las configuraciones de reflexión externa (SNIFTIRS, por sus siglas en inglés) y (PM-IRRAS, por sus siglas en inglés) e interna (ATR-SEIRAS, por siglas en inglés), utilizando las correspondientes células espectro-electroquímicas que permiten la aplicación y variación de potenciales eléctricos a los electrodos de oro, de manera simultánea al experimento FT-IR. Los estudios de adsorción de las bases del ADN sobre electrodos metálicos son interesantes debido a la relevancia biológica de las mismas y las analogías de sus organizaciones en las interfases electródicas con las organizaciones en las membranas biológicas. Las técnicas que se han utilizado proporcionan una información estructural a escala microscópica interesante en función del campo eléctrico en las interfases. Por otra parte, los estudios tienen interés aplicado en relación con el diseño de biosensores o de plataformas de liberación de medicamentos. Los sistemas a estudiar se han seleccionado con dos grados de aproximación a las interfases biológicas. Así, en la primera parte (parte I de la tesis) se han estudiado las adsorciones de las cuatro bases del ADN y las co-adsorciones de los dos pares de bases complementarias sobre electrodos monocristalinos y sobre películas nanoestructuradas de oro en función del potencial. En la segunda parte (parte II), se ha realizado una aproximación mayor a las interfaces biológicas mediante el estudio de monocapas y bicapas de compuestos que contienen tanto cadenas alifáticas como alguna de las bases del ADN. En concreto, se han preparado estructuras organizadas del nucleolípido 1,2- dipalmitoil-sn-glicero-3-citidina, que contiene la base citosina, sobre electrodos Au(111). Se han caracterizado dichas estructuras y se han estudiado sus posibilidades de reconocimiento molecular en relación con la base complementaria guanina. La tesis se ha estructurado en 7 capítulo. El capítulo 1 consiste en una introducción general de la tesis que contiene los objetivo, los antecedentes acerca de de la adsorciones y co-adsorciones de las bases del ADN, de sus propiedades ácido bases y de los equilibrios tautoméricos en los que participan. Incluye también la descripción de la estructura de la tesis. El capítulo 2 está dedicado a la metodología utilizada en la tesis y en él se describen los fundamentos teóricos y técnicos de las metodologías electroquímicas y espectro-electroquímicas FT-IR. En el capítulo 3 se presentan los estudios de las adsorciones y co-adsorciones de las bases complementarias adenina y timina. El grupo de investigación realizó previamente el estudio de la adsorción de la adenina en algunas condiciones experimentales, pero en esta tesis se han extendido los estudios acerca de los equilibrios ácido-base, mediante el estudio de las adsorciones de las dos especies que participan en el segundo pKa de la adenina. Se ha podido caracterizar mediante ATR-SEIRAS la adsorción de la forma aniónica de la adenina y determinar el valor del pKa2 en la interfase. El valor encontrado es muy próximo al de la adenina en disolución lo que confirma el modelo de adsorción previamente propuesto por el grupo de investigación en el que los sitios de interacción de la molécula con el electrodo no incluyen la participación del nitrógeno (N9) que experimenta la desprotonación en el segundo equilibrio ácido-base. En cuanto a los estudios de la adsorción de la timina en el rango de pH 1 a 12 se ha podido determinar la estabilidad de los diferentes tautómeros de la timina. Los espectros de ATR-SEIRA muestran que, independientemente del valor del pH, la interacción con la superficie nanoestructurada de oro se produce por los tautómeros desprotonados de la timina. En base a cálculos DFT, se comprueba que en medio ácido se adsorbe sobre oro el tautómero desprotonado en N3, mientras en el medio básico lo hace el tautómero desprotonado en N1. Además, la deconvolución de las señales obtenidas en el espectro de ATR-SEIRA a pH neutro pone de manifiesto que ambos tautómeros coexisten a pH 7. A partir de la deconvolución y determinación de intensidades de las señales correspondientes a los modos normales de vibración de tensión de CH y CH3 de la molécula de timina se propone un modelo de adsorción para los diferentes tautómeros y los cambios que sus orientaciones con el potencial eléctrico. Así, a pH ácido,se ha propuesto que el tautómero desprotonado en N3 interacciona a potenciales bajos mediante el grupo carbonilo C2O y reorienta su plano molecular al aumentar el potencial para permitir la interacción con la superficie del electrodo también por el nitrógeno N3 y el carbonilo C4O. A valores de pH básicos se ha propuesto que la interacción del tautómero desprotonado en N1 con el electrodo implica los grupos N1 y C2O en todo el rango de potenciales. Por último, en el capítulo 3 se ha abordado la co-adsorción de las bases complementarias timina y adenina sobre superficies nanoestructuradas de Au a diferentes valores de pH. Los resultados de ATR-SEIRAS muestran que el cambio de intensidad en las señales de adenina y timina puede estar provocado por variaciones en la organización molecular sobre el electrodo de Au. Estas variaciones implican un aumento en el ángulo de inclinación molecular respecto al electrodo para el caso de la adenina y una disposición paralela al electrodo para el caso de la timina. El alto límite de detección de la metodología ATR-SEIRAS ha permitido comprobar que el efecto de la presencia de las dos bases complementaria parece ser cooperativo y se detecta incluso con muy bajas concentraciones de adenina. En el capítulo 4 se presenta el estudio mediante EIS de la cinética de adsorción de la adenina sobre electrodos Au(111) en medios de pH ácido, neutro y básico. Se ha pretendido de esta forma caracterizar la cinética de adsorción de las tres formas de la adenina que existen en los tres medios. El grupo de investigación había aplicado previamente esta metodología electroquímica a la adsorción de la forma neutra de la adenina, pero en vista de los resultados espectro-electroquímicos en medio ácido que indican la desprotonación previa a la adsorción de la forma catiónica, se ha extendido el análisis a un rango más amplio de valores de pH. Ha sido preciso para ello desarrollar la teoría que permite deducir las ecuaciones de impedancia para el modelo de adsorción que incluye una etapa de desprotonación previa a la adsorción. Las nuevas ecuaciones de impedancia implican una dependencia de la impedancia con la frecuencia de la perturbación de alterna de la técnica distinta de la que cabe esperar para un modelo simple de adsorción que solo está controlado por la difusión del adsorbato y/o por la activación del proceso de adsorción química. Sin embargo, se distinguen casos límites (de alta y de baja frecuencia) en los que la dependencia con la frecuencia de la impedancia del modelo que incluye la etapa química es idéntica a la del modelo de adsorción simple. En base a dichas ecuaciones se propone el análisis de los datos experimentales en función de la frecuencia y se determinan los parámetros característicos de la cinética de la adsorción en función del potencial eléctrico. Del análisis de dichos parámetros se ha podido determinar en medios ácidos la constante de equilibrio para la desprotonación de la adenina, y las variaciones de la función que incluye las constantes de velocidad de la adsorcióncon el potencial, en los tres medios considerados. El capítulo 5 explora la adsorción y co-adsorciones de guanina y citosina sobre electrodos de oro a tres valores de pH que comprenden medios ácidos, neutros y básicos, con objeto de estudiar las adsorciones de las especies con distinto grado de protonación de las bases y de establecer el rango de potenciales en los que las dos bases pueden adsorberse simultáneamente. Sin embargo, no se ha sobrepasado el segundo pKa por ser demasiado alto y afectar la estabilidad de las nanoestructura del electrodo de oro. La comparación de los espectros de ATR-SEIRA para la citosina con los correspondientes espectros de transmisión en la región de 1300-1800 cm-1 ha permitido decidir que la forma neutra de la citosina se adsorbe en todos medios. Ello implica que en medio ácido la adsorción debe incluir una etapa de desprotonación previa. El análisis de detallado de las intensidades integradas de las señales de los espectros de ATR-SEIRAS ha permitido detectar que en medios neutros o ligeramente básicos y a bajos potenciales se adsorben dos especies distintas de citosona, lo que sugiere la posibilidad de tautómeros distintos. Los cálculos mediante DFT de los espectros de las moléculas aisladas y de las moléculas adsorbidas sobre clústeres de oro de los distintos tautómeros ha permitido asignar las señales de los espectros FT-IR y proponer el tautómero más estable en estado adsorbido así como el modelo de adsorción. Los estudios espectro-electroquímicos similares para la guanina realizados a los mismos valores de pH que los de la citosina han permitido concluir que en medios neutros y ácidos se adsorbe la guanina neutra mientras que en medios fuertemente básicos lo hace la forma aniónica y proponer las orientaciones moleculares de dichas formas sobre el electrodo, así como los sitios de interacción con el mismo en cada caso. En los estudio de las co-adsorciones de las bases sitosina y guanina se han observado efectos muy parecidos a los ya comentados para el caso de las co-adsorciones adeninatimina, que se han atribuido de igual forma a una orientación más paralela de la citosina y más perpendicular de la guanina respecto a la superficie electródica. El capítulo 6 corresponde a la segunda parte de la tesis y en el mismo se presenta la preparación, caracterización electroquímica y espectro-electroquímica de monocapas y bicapas de Langmuir en las que participa el nucleolípido 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- citidina (que contiene la base citosina), adsorbidas sobre electrodos de oro Au(111). En estos casos ha resultado particularmente interesante la utilización de la modalidad PMIRRAS de la espectroscopia FT-IR. Los estudios comprende las estructuras que se obtienen tanto en ausencia como en presencia de la guanina. Las asignaciones de las señales ha sido posible por comparación con los espectros de transmisión del nucleolípido y de la citosina así como de los de ATR-SEIRA de las bases adsorbidas. Los resultados indican que la monocapa se une a la superficie del electrodo a través del grupo citosina. La presencia de guanina en el medio induce la adsorción de la misma sobre el electrodo que induce una reorientación de la citosina hacia una disposición más plana respecto a la superficie el electrodo, como en el caso de las co-adsorciones guanina citosina. El cálculo de los ángulos de inclinación de la cadena carbonada respecto a la superficie del electrodo sobre la base de las intensidades de las señales de los modos característicos de vibración de dichas cadenas, permite decidir acerca del grado de organización de las monocapas. Se han preparado bicapas que expongan la parte hidrofílica del nucleolípido, que incluye la citosina, hacia la disolución mediante el uso de un derivado tiólico de cadena alifática similar a la del nucleolípido. Dichas bicapas se han caracterizado de manera similar al caso de las monocapas. Los resultados de PM- IRRAS han permitido decidir acerca de la organización tanto en ausencia como en presencia de guanina y se han alcanzado conclusiones de interés con vistas a las posibilidades del uso de las mismas con fines de reconocimiento molecular. Finalmente, en el capítulo 7 se recogen las conclusiones más relevantes de esta tesis.
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DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FÍSICA FACULTAD DE QUÍMICA. UNIVERSIDAD DE SEVILLA Estudio de Electrodos Modificados con Películas de das Bases del ADN y Nucleolípidos Derivados Mediante la Combinación de Métodos Electroquímicos y Espectroscópicos TESIS DOCTORAL Memoria para optar al grado de Doctor en Química presentada por Julia Álvarez Malmagro Sevilla, 2017
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FÍSICA FACULTAD DE QUÍMICA. UNIVERSIDAD DE SEVILLA Vº Bº La Directora de la Tesis Fdo. Manuela Rueda Rueda Catedrática de Universidad Departamento de Química Física Universidad de Sevilla Vº Bº El Director de la Tesis Fdo. Francisco Prieto Dapena Profesor Titular de Universidad Departamento de Química Física Universidad de Sevilla
ÍNDICE Summary / Resumen Summary 1 Resumen 6 Capítulo 1: Introducción General 1.1 Objetivos 12 1.2 Estructura de la tesis 15 1.3 Antecedentes 17 1.4 Bibliografía 32 PARTE I Capítulo 2 : Metodología y Procedimientos Experimentales 2.1 Técnicas electroquímicas 42 2.1.1 Fundamento teórico 42 2.1.1.1 Voltametría cíclica 42 2.1.1.2 Cronoculumbimetría 43 2.1.1.3 Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIS) 43 2.1.2 Medidas electroquímicas 43 2.2 Espectroscopía Infrarroja de Reflexión Absorción. 47 2.2.1 Fundamento teórico 47 2.2.1.1 Attenuated Total Reflection Surface Enhanced Infrared Absorption Spectroscopy (ATR-SEIRAS) 54 2.2.1.2 Substractively Normalised Interfacial Fourier Transform InfraRed Spectroscopy (SNIFTIRS) 55 2.2.1.3 Polarization Modulated Infrared Reflection Absorption Spectroscopy (PM-IRRAS) 56 2.2.2 Medidas espectroelectroquímicas de infrarrojos 57 2.2.2.1 Reflexión interna: ATR-SEIRAS 58 2.2.2.2 Experimentos de absorción en disolución 59 2.2.2.3 Reflexión externa: SNIFTIRS 59 2.2.2.4 Reflexión externa: PM-IRRAS 61 2.2.3 Preparación de electrodos metálicos nanoestructurados 63 2.2.3.1 Electrodos de oro depositados químicamente 63 2.2.3.2Electrodos de oro depositados por sputtering 63 2.3 Membranas biomiméticas 64 2.3.1 Isoterma superficial o Isoterma de Langmuir 64 2.3.2 Preparación de membranas soportadas sobre electrodos 65 2.3.2.1 Autoensamblado de monocapas (SAMs) 65 2.3.2.2 Método de transferencia de Langmuir-Blodgett y LangmuirSchaeffer. 68 2.4 Cálculos cuánticos GAUSIAN 69 2.5 Bibliografía 70
Capítulo 3: Adsorción y co-adsorción de Adenina y Timina en función del pH 3.1 Influencia del pH en la Adsorción de Adenina 73 3.1.1. Introducción 73 3.1.2. Experimental 74 3.1.2.1. Reactivos 74 3.1.3. Resultados de voltametría cíclica 74 3.1.4. Resultados y Discusión de los Espectros FT-IR de transmisión en disoluciones neutras y básicas. 76 3.1.5. Resultados y Discusión de los Espectros FT-IRRA para Adenina Adsorbida sobre Electrodos de Oro desde Disoluciones Neutras y Básicas en D2O. 77 3.1.6. Resultados y Discusión de los Espectros ATR-SEIRA para Adenina Adsorbida sobre Electrodos de Oro desde Disoluciones Neutras y Básicas en H2O. 84 3.1.7. Conclusiones 89 3.2 Adsorción de timina sobre electrodos de oro. Influencia del pH 91 3.2.1. Introducción 91 3.2.2. Experimental 92 3.2.2.1. Reactivos 92 3.2.3. Resultados de Voltametría cíclica 92 3.2.4. Resultados y Discusión de los Espectros FT-IR de transmisión en disolución 94 3.2.5. Resultados y Discusión de los Espectros FT-IRRA para la timina adsorbida sobre Electrodos de Oro 98 3.3.5.1. Espectros ATR-SEIRA en la Región Espectral 1300 a 1800 cm - 1 98 3.2.5.2. Espectros ATR-SEIRA en la Región Espectral 2800 a 3900 cm - 1 104 3.2.5.3. Influencia del potencial en la adsorción de timina adsorbida sobre electrodos de oro 108 3.2.6. Conclusiones 114 3.3. Co-Adsorción de Adenina y Timina sobre Electrodos de oro 116 3.3.1. Introducción 116 3.3.2. Experimental 117 3.3.2.1. Reactivos 117 3.3.3. Resultados de Voltametría cíclica sobre electrodos Au(111) 117 3.3.4. Resultados y Discusión de los Espectros FT-IR de transmisión en disolución 120 3.3.5. Resultados y Discusión de los Espectros FT-IRRA para la adenina y timina co-adsorbidas sobre Electrodos de Oro. 122 3.3.5.1. Espectros ATR-SEIRA en la Región Espectral 1300 a 1800 cm - 1 122 3.3.5.2. Espectros ATR-SEIRA en la Región Espectral 2800 a 3900 cm - 1 135 3.3.6. Conclusiones 139 3.4 Bibliografía 140 Capítulo 4: Estudio Cinético de la Adsorción de la Adenina sobre Electrodos de Au(111)mediante espectroscopía electroquímica de impedancias 4.1 Introducción 144 4.2 Espectroscopía Electroquímica de Impedancias para un proceso de adsorción con una etapa química previa acoplada. 146
4.3 Experimental 151 4.3.1 Reactivos células y electrodos 151 4.3.1 Procedimiento experimental 152 4.4 Resultados 153 4.4.1. Curvas de pseudocapacidad frente al potencial 153 4.4.2 Análisis en función de la frecuencia 157 4.5 Discusión 162 4.6 Conclusiones 170 4.7 Bibliografía 171 Capitulo 5: Adsorción y co-Adsorción de Citosina y Guanina en función del pH 5.1 Adsorción de Citosina sobre Electrodos de Oro. Influencia del pH 174 5.1.1. Introducción 175 5.1.2. Experimental 175 5.1.2.1. Reactivos 175 5.1.3. Resultados de Voltametría Cíclica 176 5.1.4. Resultados y Discusión de los Espectros FT-IR de Transmisión en Disolución 177 5.1.5. Resultados y Discusión de los Espectros FT-IRRA para la Citosina Adsorbida sobre Electrodos de Oro. 180 5.1.5.1. Espectros ATR-SEIRA en la Región Espectral 1300 a 1800 cm - 1 . 180 5.1.5.2. Influencia del potencial en la adsorción de citosina adsorbida sobre electrodos de oro 184 5.2.5.3. Región espectral 2800-3900 cm - 1 189 5.1.6. Conclusiones 190 5.2 Adsorción de Guanina sobre Electrodos de Oro 192 5.2.1. Introducción 192 5.2.2. Experimental 193 5.2.2.1. Reactivos 193 5.2.3. Resultados de Voltametría cíclica 194 5.2.4. Resultados y Discusión de los Espectros FT-IRRA para la Guanina Adsorbida sobre Electrodos de Oro 195 5.2.4.1. Espectros ATR-SEIRA en la Región Espectral 1300 a 1800 cm - 1 195 5.2.4.2. Influencia del potencial en la adsorción de guanina adsorbida sobre electrodos de oro 203 5.2.4.3. Región espectral 2800-3900 cm - 1 205 5.2.5. Conclusiones 206 5.3 Co-Adsorción de Guanina y Citosina sobre Electrodos de oro 208 5.3.1. Introducción 208 5.3.2. Experimental 209 5.3.2.1. Reactivos 209 5.3.3. Voltametría cíclica 209 5.3.4. Resultados y Discusión de los Espectros FT-IRRA para la guanina y citosina co-adsorbida sobre Electrodos de Oro 211 5.3.4.1. Espectros ATR-SEIRA en la Región Espectral 1400 a 1800 cm - 1 211 5.3.4.2. Espectros ATR-SEIRA en la Región Espectral 2800 a 3900 cm - 1 214 5.3.5. Conclusiones 216 5. 4 Bibliografía 217
PARTE II Capítulo 6: Estudio Espectro-Electroquímico Mediante PM-IRRAS de Películas de Nucleolípido de Citidina Adsorbidas Sobre Electrodos de Au(111). 6.1. Introducción 221 6.2. Formación y caracterización de monocapas de nucleolípido de citidina adsorbidas sobre electrodos de oro 225 6.2.1. Experimental 225 6.2.1.1 Reactivos y electrodos 225 6.2.1.2 Isotermas en la interfase aire/agua 225 6.2.1.3 Formación de monocapas de Langmuir 226 6.2.1.4 Caracterización electroquímica 226 6.2.1.5 Recolección de espectros y procesamiento 227 6.2.2. Isotermas del nucleolípido en la interfase aire/disolución 228 6.2.3. Caracterización electroquímica de Monocapas de 1,2-dipalmitoil-snglicero-3-citidina Adsorbidas sobre Electrodos de Au(111) 229 6.2.4. Espectros PM-IRRAS de los electrodos recubiertos de la monocapanucleolipídica 231 6.2.4.1. Región 1300-1800 cm - 1 de los espectros de monocapas preparadas en ausencia de guanina 231 6.2.4.2. Región 1300-1800 cm - 1 de los espectros de monocapas preparadas en presencia de guanina 234 6.2.4.3. Región 2800-3300 cm - 1 de los espectros de monocapas preparadas en ausencia y en presencia de guanina 238 6.3. Formación y caracterización de bicapas de 1-hexanodecanotiol / 1,2dipalmitoil-sn-glicero-3-citidina adsorbidas sobre electrodos de Au(111) 244 6.3.1. Introducción 244 6.3.2. Experimental 244 6.3.2.1 Formación de bicapas insolubles 244 6.3.3. Caracterización electroquímica de las bicapas de 1-hexadecanotiol / 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-citidina adsorbidas sobre electrodos de Au(111) 245 6.3.4. Espectros PM-IRRA de los electrodos recubiertos de bicapas de 1hexadecanotiol / 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-citidina adsorbidas sobre electrodos de Au(111) 246 6.3.4.1. Región 1300-1800 cm - 1 de los espectros PM-IRRA de las bicapas 246 6.3.4.2 Región 2800-3300 cm - 1 de los espectros de las bicapas preparadas en ausencia y en presencia de guanina 251 6.4 Conclusiones 257 6.5Bibliografía 260 Capítulo 7: Conclusions / Conclusiones 7.1 Conclusions 263 7.2 Conclusiones 271
11 Capítulo 1 Introducción General
12 1.1 Objetivos El estudio de las adsorciones y co-adsorciones de las bases del ADN sobre superficies electródicas sólidas viene siendo en los últimos años un tema de gran interés en la rama de la electroquímica debido a que las interfases electrificadas creadas entre un electrodo sólido y una disolución pueden considerarse en muchos aspectos como sistemas miméticos de las interfases biológicas y, en consecuencia, el estudio de las interfases electródicas puede ser de ayuda para entender muchos de los comportamientos y propiedades de las interfases biológicas y muy especialmente la influencia de los campos eléctricos. Así, por ejemplo, las cuatro bases del ADN son componentes indispensables en los procesos de replicación y de transcripción de la información genética desde el ADN a las proteínas. Si estos procesos genéticos implican interacciones con las interfases biológicas cabe esperar que puedan afectar a su comportamiento electródico interfacial. Además, los estudios acerca de la adsorción de bases del ADN sobre electrodos sólidos tienen interés por sus posibles aplicaciones biotecnológicas ya que estos sistemas pueden ser utilizados como biosensores o como plataformas para la liberación de fármacos. Especial interés merece el estudio de las propiedades acido-base y a los equilibrios tautoméricos de las bases del ADN, ya que se ha demostrado que el pH del medio juega papeles fundamentales tanto en la formación de puentes de hidrógeno entre bases complementarias como en la formación de tautómeros inestables, lo que puedes dar lugar a pares “raros” del ADN y esto originar mutaciones responsables de muchas enfermedades tales como el Parkinson o el Cáncer. 1 El pH del medio puede favorecer unas estructuras respecto a otras de las bases del ADN en disolución, pero, además, la adsorción en la interfase electródica de cada una de las estructuras puede ser diferente y condicionar las interacciones entre bases. Los estudios de adsorción y co-adsorción de las bases del ADN han sufrido un gran impulso debido a los avances notables de tipo metodológico que están teniendo lugar durante las dos últimas décadas: se trata, por ejemplo, de la introducción de sustratos electródicos monocristalinos, de estructuras superficiales bien definidas o el uso de técnicas espectro-electroquímicas y nanoscópicas que permiten obtener información microscópica acerca de la película adsorbida, bajo control del potencial eléctrico. El análisis termodinámico detallado de la adsorción en electrodos sólidos ha permitido
13 cuantificar parámetros importantes como los excesos superficiales, las energías libres de Gibbs, las energías de adsorción o la presencia de transiciones de fase. 2,3 La información termodinámica sobre la adsorción además puede complementarse con técnicas de microscopía superficial que ofrecen resolución a nivel molecular, como la microscopia de efecto túnel (STM), permitiendo obtener información sobre la organización de las moléculas sobre la superficie electródica. La técnica de espectroscopia superficial de infrarrojos ha resultado ser altamente versátil y ha permitido obtener información sobre los puntos de anclajes de la molécula a electrodos, además de la orientación del plano molecular con respecto a la superficie del electrodo. Estos hechos han convertido a esta técnica en una herramienta muy importante en la caracterización de las interfases electródicas que contienen adsorbidas especies de interés biológico. Además, el desarrollo de microscopías de sonda de barrido “in-situ” y espectroscopías ópticas al igual que la técnica de rayos X han contribuido de manera importante al rápido crecimiento en este campo de la electroquímica de superficies e interfases. La tesis se encuadra en este campo y en ella se pretende avanzar en la comprensión a escala molecular de algunos de los procesos biológicos de tipo electroquímico relativos a las bases del ADN. Concretamente, se trata de estudiar sus adsorciones y coadsorciones, así como las interacciones entre ellas en las interfases organizadas de electrodos monocristalinos de oro o de películas de oro nanoestructuradas, en contacto con disoluciones de electrolito. Para ello se utilizará una aproximación novedosa que combina los métodos electroquímicos con las distintas modalidades de la espectroscopía en el infrarrojo in situ. Los sistemas que se van a tratar se han elegido en dos niveles de aproximación a los sistemas vivos: Por una parte se formarán estructuras moleculares de las bases constituyentes del ADN individualmente y con su base complementaria sobre electrodos monocristalinos de oro, partiendo de las especies en disolución del electrolito, mediante el control electroquímico del potencial eléctrico. Una vez que se hayan establecido las condiciones electroquímicas de trabajo con medidas de voltametría cíclica y/o capacidad diferencial se ampliarán los estudios más microscópicos utilizando las técnicas in situ espectro-electroquímicas en el IR, tanto las de reflexión externa (SNIFTIRS, Subtractively Normalised Interfacial Fourier Transform Infra Red Spectroscopy) como las de reflexión interna (ATR-
20 Fig. 1.2 Comportamiento ácido-base de la timina La otra base pirimidínica, la citosina, en disoluciones moderadamente ácidas tiene protonado el nitrógeno N 3 , mientras que son necesarias condiciones fuertemente alcalinas para conseguir desprotonar el nitrógeno N 1 , ya que posee dos valores de pK a el primero a 4.5 mientras que el segundo tiene lugar a 12.2. Fig. 1.3 Comportamiento ácido-base de la citosina Al igual que en el caso de la timina, la citosina puede presentar distintas formas tautoméricas (Figura 1.4) que están próximas en energía y poseen barreras pequeñas de energía potencial que permiten que se interconviertan fácilmente unas en otras. 20 Estudios teóricos de DFT 23,45,46 concluyen que en fase gaseosa la más estable es la forma C2b, seguida por las C1 y C3a. Los otros tautómeros son más inestables ya que presentan energías superiores. 2 3 1 5 6 pka=9.6 H+ Tautomero desprotonado en N1 Tautomero desprotonado en N3 4 pk a1 =4.5 H + pk a2 =12.2 H +2 1 6 3 54
21 Fig. 1.4 Tautómeros más estables de la citosina En disoluciones acuosas 47 la adenina presenta dos equilibrios ácido-base; el primero de ellos relacionado con la protonación del nitrógeno piridínico en N 1 con un pK a1 de 4.2; mientras que el segundo se relaciona con la pérdida de un protón imidazólico en N 9 y presenta un pK a2 de 9.8 (Figura 5) Esto hace que la adenina en disolución pueda encontrarse en forma protonada (AdH 4+ ), neutra (AdH 3 ) y aniónica (AdH 2- ) dependiendo del valor del pH del medio. Fig. 1.5 Comportamiento ácido-base de la adenina Finalmente la guanina en disolución acuosa también participa en dos equilibrios ácidobase con valores de pK a de 4.2 y 9.5. De tal forma que al igual que en el caso de la adenina en función del pH la molécula puede estar protonada, neutra o desprotonada como se muestra en la figura 1.6. Fig. 1.6 Comportamiento ácido-base de la guanina C1 C2b C3a C4 C5 pka1=4.2 H+ pka2=9.8 H+ AdH4+AdH3AdH22 1 5 4 7 9 6 3 8 pk a1 =4.2 H + pk a1 =9.5 H + 7 9 8 61 2 3 4 5
22 La guanina es la nucleobase con mayor número de formas tautoméricas, ya que puede presentar tanto formas ceto/enol e imino/enamino (N 1 H-N 3 H, N 7 H-N 9 H). Se han realizado estudios y cálculos teóricos acerca del tautomerismo de la forma neutra de la guanina 48–52 que han puesto de manifiesto la presencia de cuatro tautómeros más estables en fase gaseosa de menor energía relacionados con los equilibrios ceto/enólico de acuerdo con la figura 1.7. Fig. 1.7 Tautómeros más estables de la guanina neutra Leonid Gorb y col . 27 han encontrado que los tres tautómeros más estables de la guanina son N 7 , N 9 y N 9 H y, que además, difieren mucho con la energía del tautomero N 7 H. Sin embargo, en disolución acuosa o disolventes polares la estabilidad es algo diferente debido a los efectos de solvatación que pueden influir en factores tales como el momento dipolar de la molécula. En estas condiciones se ha encontrado que la forma ceto predomina sobre la enol siendo el orden de estabilidad el siguiente: N 9 >N 7 >N 9 H>N 7 H. Además en disolución acuosa se ha encontrado que existe una mezcla de las dos formas ceto (N 9 y N 7 ). 49 Sin embargo los estudios de los tautómeros de la guanina protonada o desprotonada en disolución acuosa son más escasos. Los tautómeros más estables de la guanina desprotonada y protonada se muestran en las figuras 1.8 y 1.9 respectivamente. Tautómero N9Tautómero N9H Tautómero N7Tautómero N7H
23 Fig. 1.8 Tautómeros más estables de la guanina desprotonada Se ha encontrado que para los tautómeros desprotonados de la guanina los que se encuentran en su forma ceto también son más estables que los que están en forma enólica. 53 Fig. 1.9 Tautómeros más estables de la guanina protonada Según los estudios teeóricos DFT el tautomero ceto protonado en N 7 es el más estable mientras que de nuevo los tautómeros en forma enol se ha encontrado que son los menos estables. 53 Por otro lado estos compuestos tienen mucha facilidad para formar complejos con su base complementaria uniéndose a través de puentes de hidrógeno en los que un átomo actúa de donador de un átomo de hidrógeno mientras otro lo hace de aceptor. Estas interacciones son las responsables del reconocimiento molecular entre las bases complementarias del ADN y ARN y, en última instancia por tanto, del mantenimiento del código genético. De acuerdo con la bibliografía existen actualmente dos modelos que describen estas interacciones; el de Watson-Crick y el de Hoogsteen. El primero de ellos fue descrito en 1953 por J.Watson y F.Crick y publicado en la revista Nature. 54 N N N H H N OH NH2 NH N N H H N O NH2 NH N H N H N OH NH2 NH N N H N O NH NH N N H N O NH3 N N H N H N OH NH2 NH N N H N O NH3 N N N H N OH NH3
24 Este tipo de interacción es la que en principio se pensó que tenía lugar en el ADN y ARN. Según este modelo (Figura 1.10) el par adenina-timina se estabiliza por dos puentes de hidrógeno ente los átomos () ← () y () → () , mientras que el par guanina-citosina lo hace a través de tres puentes de hidrógeno entre () → () , () ← () y () → () . a) b) Fig. 1.10 Modelo de Watson-Crick de puentes de hidrógeno entre las bases complementarias; a) adenina (A)-timina (T) y b) guanina (G)-citosina(C) Por otro lado K. Hoogsteen 55 fue el primero en confirmar experimentalmente la capacidad de las nucleobases para formar pares de bases y determinó la especificidad de esta unión según la cual la adenina se une a la timina mientras que la guanina lo hace a la citosina. Se han llevado a cabo experimentos en disoluciones mixtas que fueron analizados con la técnica de difracción de rayos X, 56 encontrándose que la geometría de las interacciones era diferente a la previamente descrita por Watson-Crick. Según este modelo ambos pares de bases complementarias quedan estabilizadas por dos puentes de hidrógeno en el caso de la adenina-timina entre los átomos () → () y () ← () mientras que en el caso de la guanina-citosina se da entre los átomos () → () y () ← () (Figura 1.11). AT C G
25 a) b) Fig. 1.11 Modelo de Hoogsteen de puentes de hidrógeno entre las bases complementarias; a) adenina (A)- timina (T) y b) guanina (G)-citosina(C) Diversos estudios mecánico-cuánticos han confirmado la capacidad de las bases complementarias del ADN de formar complejos tanto en la geometría de Watson-Crick como en la de Hoogsteen. Estos estudios concluyen que las uniones de tipo Hoogsteen son más estables, 57 aunque las diferencias estructurales entre ambos tipos de interacciones son aun objeto de estudio en la actualidad. De hecho algunos artículos en la bibliografía proponen actualmente que la unión entre bases complementarias en el ARN 58 y ADN 59 es de tipo Hoogsteen en vez de Watson-Crick como se venía pensando. De hecho este tema también resulta de gran interés actualmente y muchos estudios mecanico-cuánticos se centran en intentar aclarar las peculiaridades de la estructura y organización de estas interacciones. Las interacciones entre bases nitrogenadas pueden estar estabilizadas también mediante interacciones no covalentes 60 jugando estas un papel fundamental en la distancia de separación entre bases. 61 Una de las interacciones no covalentes más significativa en biomoléculas, y por tando en el ADN, es la interacción areno-areno, también denominada como interacción π - π o “ π -stacking”. Entre las geometrías descritas para esta interacción se encuentran: (a) la geometría face-to-face o de tipo sándwich; (b) desplazamiento paralelo y (c) edge-to-face o en forma de T (Figura 1.12). 62 T A GC
26 Fig. 1.12 Modelos de interacción π-π o “π-stacking La estabilidad de cada una de estas geometrías depende del tamaño y los sustituyentes de los arenos implicados. No obstante, en base a cálculos DFT y estudios cristalográficos las geometrías más estables, en general, son la de desplazamiento paralelo y en forma de T. 63,64 Cuando se analizan anillos de tipo heteroaromáticos, la geometría más estable es la de tipo edge-to-face. 65 En este contexto, las bases nitrogenadas están implicadas en este tipo de interacciones. Así, se dan interacciones π - π entre nucleobases y aminoácidos como modelo de las interacciones proteínaDNA. 66,67 El estudio del comportamiento interfacial de las bases del ADN en interfases creadas entre un electrodo y una disolución puede proporcionar información relevante sobre su comportamiento en interfases biológicas reales. 68,69 Por tanto, la adsorción de estos compuestos ha sido ampliamente estudiada inicialmente sobre electrodos de mercurio y carbono, utilizando técnicas electroquímicas como la polarografía de corriente alterna, las medidas de capacidad diferencial y la voltametría cíclica. En los últimos años, al poder disponer de superficies metálicas sólidas limpias y bien definidas, de metales nobles tales como la plata, el cobre o el oro ha permitido el uso de técnicas microscópicas y espectroscópicas en el estudio de la adsorción de estos compuestos pudiendo estudiar de forma más detallada las interacciones entre el adsorbato y el metal en la interfase. En el caso de las bases del ADN el estudio a nivel fundamental de la morfología, la organización y la estructura cristalina y electrónica de la capa de adsorbato en la interfase puede ser muy interesante aunque compleja ya que estas biomoléculas presentan diferentes sitios por los que pueden interaccionar con la superficie metálica, además, como se ha mencionado anteriormente, presentan distinto grado de protonación en función del pH del medio y tienen también la posibilidad de encontrarse en diferentes formas tautoméricas. Sin embargo, se sabe que tanto las bases púricas como las pirimidínicas forman monocapas organizadas sobre superficies electródicas.
27 En lo que respecta a la adsorción de la adenina, en los últimos años el grupo de la Universidad de Sevilla en el que se ha realizado la Tesis, viene estudiando el comportamiento espectro-electroquímico de la adsorción de adenina sobre electrodos monocristalinos y nanoestructurados de oro combinando técnicas electroquímicas y distintas modalidades de espectroscopía FT-IR in situ, así como la microscopía STMElectroquímica. Los estudios han estado limitados a los medios neutros y ácidos. En medio neutro se ha analizado mediante voltametría cíclica, medidas de capacidad diferencial y cronoamperometría, la adsorción de la adenina sobre electrodos de oro de bajo índice de Miller (Au(111) y Au(100)). 2 Se ha encontrado que la adsorción depende fuertemente de la orientación cristalográfica del electrodo y de la estructura reconstruida o no-reconstruida de la superficie del electrodo. De hecho, la adsorción de la adenina sobre electrodos recién tratados a la llama siguiendo el procedimiento de Clavilier va acompañada de la pérdida de la reconstrucción de la superficie del electrodo. Los resultados obtenidos del análisis termodinámico de la adsorción de la adenina sobre electrodos Au(111) en medios neutros han indicado que la adenina interacciona químicamente con el electrodo de oro, probablemente mediante una unión covalente entre ambos en la que la adenina se esperara que actúe como agente donador de electrones, 2 con un valor máximo de energía libre de Gibbs de -35 KJ mol -1 . Además los datos de exceso superficial máximo (3.5·10 -10 mol cm -2 ) han indicado que la adenina se debe adsorber con una cierta inclinación del plano molecular respecto a la estructura del oro. Por otra parte, se ha estudiado la cinética de la adsorción de la adenina sobre electrodos Au(111), en medio neutro, mediante la técnica de espectroscopía electroquímica de impedancias. 70 Se han podido obtener los parámetros cinéticos para el proceso de adsorción/desorción de la adenina analizando la dispersión con la frecuencia de los datos de impedancia electroquímica a los diferentes potenciales de adsorción, conforme al modelo cinético desarrollado en la bibliografía. 4,5 Para poder realizar el análisis cuantitativo se tuvo que diseñar un procedimiento de medidas de impedancia que evitara la interferencia con los fenómenos de reconstrucción/pérdida de la reconstrucción de la superficie del oro. Con el fin de obtener información microscópica sobre el proceso de adsorción así como una mayor comprensión sobre la naturaleza de las interacciones en la interfase se han venido realizando en el grupo de la Universidad de Sevilla estudios de espectroscopía de reflexión-absorción en el infrarrojo (IRRAS) y de microscopía de efecto túnel (STM)
28 ambos in situ en células electroquímicas, bajo control de potencial. Las medidas de STM electroquímico han confirmado que la quimisorción de la adenina provoca la eliminación de la reconstrucción superficial del oro, y se ha observado que el 4% de átomos en exceso contenidos en la superficie reconstruida se acomodan en muchas “islas” muy pequeñas que se agrupan siguiendo las direcciones a lo largo de las cuales discurrían los solitones de la superficie reconstruida, lo que sugiere que, en presencia de adenina quimisorbida, la movilidad de los átomos de oro de la superficie es muy baja. Además se ha encontrado que la adenina se organiza formando cordones de moléculas de adenina alineados a lo largo de las tres direcciones cristalográficas principales del monocristal. La distancia entre moléculas en una misma cadena sugiere la existencia de interacciones entre los orbitales π de los grupos aromáticos. Por otra parte, la aplicación de las técnicas “in-situ” de espectroscopía de reflexión-absorción en el infrarrojo al estudio de la adsorción en medios neutros ha aportado información acerca de los sitios de adsorción y de la inclinación del plano molecular de la especie adsorbida, entre otros aspectos. Así, se ha concluido que efectivamente la adenina se adsorbe con su plano ligeramente inclinado respecto a la superficie del electrodo e interacciona con la superficie del oro a través del nitrógeno amínico N 10 y el nitrógeno pirimidídico, N 1 , o alternativamente el nitrógeno imidazólico, N 7 . Un análisis cuantitativo posterior 71 de la adsorción de la adenina en medio neutro, que hace uso de la técnica llamada SNIFTIRS cuantitativo ha facilitado determinar exactamente que el plano de la molécula de adenina neutra adsorbida está inclinado 40º respecto a la normal a la superficie del electrodo y rota 16º alrededor de su eje normal cuando se produce un aumento del potencial. Esta orientación implica que la molécula de adenina debe interaccionar con el electrodo a través de N 10 y N 1 . Además de ello se ha propuesto que existen interacciones de tipo π stacking entre moléculas adyacentes. 71 Por otra parte, el análisis de los resultados espectro-electroquímicos en medio muy ácido permitido concluir que aunque en disolución la adenina se encuentra protonada en estas condiciones de pH, solamente la adenina neutra es capaz de interaccionar químicamente con el metal. No obstante, se ha podido detectar la adsorción física de la adenina protonada a bajos potenciales y concentraciones. Fuera de estas condiciones, la adsorción química, más favorable energéticamente, induce la desprotonación previa de la adenina que existe en la disolución.
29 Uno de los trabajos pioneros acerca de la adsorción de la timina, 72 que hace uso de las técnicas microscópicas de STM y AFM, ha concluido que la timina no se adsorbe espontáneamente sobre electrodos de Au(111) si no que es necesario aplicar un potencial superior a 0.4V SCE para que la timina se organice sobre la superficie del electrodo formando una red oblicua. Más recientemente Roelfs et al 73 han estudiado la formación de películas de timina sobre superficies de Au(100) en disoluciones acuosas mediante medidas de voltametría cíclica y capacidad diferencial. Estos estudios han permitido demostrar que sobre superficies reconstruidas recién tratadas a la llama se adsorben adcapas condensadas de timina mientras que sobre la superficie noreconstruida del electrodo no se ha observado ningún estado adsorbido condensado de la timina. Un estudio similar realizado por Holzle et al 74 sobre electrodos de Au(111) ha determinado cuatro regiones en el voltagrama separadas por picos de transiciones de fase. Así, a potenciales bajos proponen la existencia de una fase fisisorbida que se va ordenando al aumentar el potencial, mientras que a potenciales mayores la timina se adsorbe químicamente formando una fase condensada ordenada. Han observado una fuerte dependencia con el pH en la formación de la fase quimisorbida que se explica como consecuencia de la desprotonación previa de la molécula antes de adsorberse. Además sugieren que esta fase quimisorbida queda estabilizada por interacciones intermoleculares entre moléculas de timina. Por último han completado los estudios electroquímicos sobre electrodos monocristalinos de Au(111) y (100) y ampliado a electrodos de Au(210), para los que han corroborado que los diferentes estados de adsorción de la timina dependen fuertemente del potencial del electrodo, de la temperatura y de la naturaleza del disolvente, de la concentración de la disolución y del pH. Además sobre el electrodo de Au(210) no se ha observado la fase condensada desordenada. Por otra parte, sobre electrodos de Au(111) estudios “in-situ” de STM y “ex-situ” de XPS han confirmado la alta estabilidad de la región quimisorbida ordenada y que la transformación desde un estado fisisorbido a uno quimisorbido implica una desprotonación previa de la molécula de timina. 75 Se han encontrado dos fases adsorbidas que presentan diferentes estructuras. La primera de ellas se ha descrito como una fase desordenada en la que las moléculas de timina están paralelas respecto a la superficie del electrodo, mientras que la segunda a potenciales mayores está compuesta por moléculas de timina verticales unidas a la superficie del electrodo de oro a través del nitrógeno N 3 , ordenadas en filas que se conectan entre sí a través de puentes de hidrógeno. Finalmente los espectros de infrarrojo de absorción-reflexión externa de la
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41 Capítulo 2 Metodología y Procedimientos Experimentales
42 2.1 Técnicas electroquímicas 2.1.1 Fundamento teórico 2.1.1.1 Voltametría cíclica La voltametría cíclica es quizás una de las técnicas más utilizadas en la actualizad para el estudio de las reacciones y procesos electródicos. Se basa el aplicar al electrodo de trabajo un potencial que varía linealmente con el tiempo con una determinada velocidad de barrido y trascurrido un tiempo determinado se invierte la polaridad del barrido. Como respuesta se obtiene una corriente neta debida a los procesos de carga de la doble capa, de adsorción/desorción química y/o de oxidación/reducción de las especies que están presentes en la disolución. Fig. 2.1 Señal de excitación potencial-tiempo empleada en voltametría cíclica. La voltametría es una técnica muy utilizada ya que es una fuente de información importantísima y además permite comprobar el estado de limpieza superficial de los electrodos así como el de la disolución antes de comenzar los estudios. Se utiliza normalmente para estudiar reacciones rédox o procesos de adsorción que tienen lugar en la superficie del metal y que dependen del potencial aplicado. En esta tesis se ha utilizado para estudiar los procesos de adsorción/desorción de las bases del ADN individualmente o las co-adsorciones entre bases complementarias que tienen lugar sobre electrodos E Tiempo
43 metálicos monocristalinos de Au(111), así como para caracterizar las supervise nanoestructuradas de oro previamente a los estudios espectroelectroquímicos. 2.1.1.2 Cronoculumbimetría Es una técnica electroquímica que se utiliza para determinar la densidad de carga en la superficie del electrodo. Se basa en llevar inicialmente el electrodo de trabajo a un potencial base ( ) durante un tiempo ( ), transcurrido ese tiempo se aplican saltos de potencial ( ) sucesivos. En cada salto se mantiene el potencial ( ) durante un tiempo ( ) y se realizan las medidas de intensidad. Después de cada salto se recupera el potencial ( ) durante un tiempo ( ). Finalmente se aplica un potencial de desorción ( )durante un tiempo ( ). La integración de los transitorios de corriente proporciona la diferencia entre las cargas a los potenciales ( ) y ( ). 2.1.1.3 Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIS) Las técnicas electroquímicas convencionales, tales como la voltametría cíclica o la cronoamperometría, han sido muy utilizadas para estudiar reacciones que tienen lugar sobre superficies electródicas, ya que con ellas se pueden obtener de forma rápida un gran número de resultados que permiten construir una imagen aproximada del proceso. Sin embargo la información obtenida por estos métodos electroquímicos convencionales es limitada. Por un lado los resultados que se obtienen en un experimento electroquímico clásico pueden incluir información de varios fenómenos simultáneamente: carga de la dobla capa, transporte de masa, adsorción, procesos de transferencia electrónica, reacciones químicas homogéneas y/o heterogéneas acopladas, etc. Por otro lado, para el estudio de un fenómeno específico la ventana de tiempo accesible va a estar limitada por la velocidad del resto de fenómenos que contribuyen a la velocidad global. Así por ejemplo en estudios cinéticos de procesos electródicos, los valores más altos de para las constantes de velocidad que se pueden medir van a estar limitados por el transporte de materia. Para velocidades extremas de transporte de materia las limitaciones estarían impuestas por el tiempo característico de los fenómenos de doble capa. La Espectroscopía de Impedancia Electroquímica, (EIS) es una técnica electroquímica que permite separar en numerosas situaciones las diferentes contribuciones a la respuesta electroquímica, convirtiéndose así en una herramienta muy utilizada en el estudio de los mecanismos y la cinética de reacciones electródicas. En su modo potenciostático está
44 basada en la aplicación a un sistema electroquímico de una perturbación de potencial de corriente alterna (ac) de pequeña amplitud () y de frecuencia f, durante un tiempo (t) suficiente que permita alcanzar el estado estacionario. Esta perturbación de corriente alterna se superpone sobre un potencial de continua (dc). La respuesta de corriente alterna () que se obtiene tendrá la misma frecuencia que la señal de la perturbación de corriente alterna pero desfasada un ángulo (Fig. 2). Fig. 2.2 Representación gráfica de E(t) e I(t) () e () tienen forma sinusoidal por lo que las expresiones de estas funciones vendrán dadas por las ecuaciones (1) y (2). ()= () (1) ()= (+) (2) Donde e son las amplitudes de ambas señales y es la frecuencia angular. La impedancia del sistema (Z) es una magnitud compleja que se define como la relación entre el potencial y la intensidad de alterna: = () () = (3) Donde es la unidad imaginaria (−1) #.% . Tiempo 1 0 -1 0 5 10 E(t) & I(t) I ac E ac
45 Se puede realizar la descomposición en las componentes real e imaginaria de la impedancia haciendo uso de la fórmula de Euler de acuerdo con las ecuaciones (4). = &'+ = ´ + ´´ (4) La ecuación (4) puede representarse gráficamente como se muestra en la figura 3. Esta representación recibe el nombre de representación de Nyquist. Fig. 2.3 Representación de Nyquist La impedancia es por tanto función de la frecuencia de la perturbación aplicada, de tal forma que el análisis de la impedancia (o la admitancia, que es la inversa de la impedancia) en función de la frecuencia, de acuerdo a un modelo determinado, permite obtener los parámetros del proceso electródico. 1 La contribución que cada uno de los distintos procesos elementales que pueden tener lugar en una célula electroquímica a la impedancia total de la misma es formalmente equivalente a la de diversos elementos de circuito eléctrico. Así, la impedancia de la disolución de electrolito se comporta como una resistencia. Una interfase idealmente polarizable se puede representar como un condensador de placas paralelas caracterizado por su capacidad. La impedancia asociada al transporte por difusión de una especie electroactiva se puede representar, en casos elementales, por una impedancia de Warburg. Finalmente la impedancia de la célula electroquímica será el resultado de combinar las distintas impedancias de los procesos elementales que tienen lugar. El tipo de circuito, y por tanto la dependencia dela impedancia con la frecuencia, va a depender del sistema de estudio. En la tabla 1 se recogen algunos modelos de circuitos y sus impedancias asociadas. Z´´ &'
52 Fig. 2.7 Representación esquemática de los tres tipos de configuraciones ópticas utililizados en las técnicas de reflexión-absorción: a) de reflexión externa y de reflexión interna en b) configuración de Kretschmann y c) configuración de Otto. Adaptadas de ref 10 Otra alternativa para evitar la interferencia de la fuerte absorción del disolvente en las medidas de espectroscopía IRRA en células electroquímicas es la utilización de una configuración llamada de reflexión interna en condiciones de reflexión total atenuada (ATR, Attenuated Total Reflectance). Se basan en que en sistemas de reflexión total de la radiación en la interfase prisma│metal parte del haz, una vez alcanzada la interfase, es capaz de penetrar en el medio con menor índice de refracción. Esta fracción de radiación se conoce como onda evanescente y la intensidad de su campo eléctrico decae exponencialmente con la distancia a la superficie. La condición de reflexión total como se definió en la ecuación (5) se alcanza cuando el ángulo de incidencia de la radiación es superior al ángulo crítico y esto está estrechamente relacionado con los índices de refracción de la ventana, , y del medio en contacto con ella, @ . Se define la distancia de penetración de la onda evanescente, A ; , como la distancia necesaria para que la amplitud del campo eléctrico de la radiación sea igual a 1/e de su valor en la superficie (aproximadamente un 37% de su valor original) y viene definida por la ecuación (7). 11 A ; = B8 C(6DEF678 D)G D (1 > 1 ) (7) Haz de IR Onda evanescente Disolución Metal IRE Metal Prisma Dove Onda evanescente Disolución IRE MetalMetal a) b) c) Disolución
53 donde I @ = B 68 es la longitud de onda en el medio más denso y @ = 67 68 es la relación entre los índices de refracción de ambos medios, resultando así la distancia de penetración proporcional a la longitud de onda la radiación incidente. En reflexión interna existen dos configuraciones la de tipo Krestsmann (Fig. 2.7b) y la de tipo Otto (Fig. 2.7c). En la primera de ellas se deposita una fina capa de metal sobre la superficie de un prisma cristalino con un alto índice de refracción usado como elemento de reflexión interna (IRE). En esta configuración el espesor de la disolución atravesada por el haz es mínimo, de tal forma que la absorción por parte del disolvente es menor que en la configuración de reflexión externa. Sin embargo sigue siendo necesario comparar los espectros obtenidos al potencial de la muestra con el espectro de referencia para cancelar completamente la absorción del disolvente. Además la configuración de Kretschmann presenta una gran ventaja ya que debido al uso de películas metálicas nanoestructuradas se produce una intensificación de la absorción infrarroja por parte de las moléculas adsorbidas (efecto SEIRA). 12 Sin embargo la estabilidad de las películas es limitada. Finalmente en la configuración de Otto el electrodo se sitúa cerca de un prisma que actúa de elemento de reflexión interno (IRE) de forma que entre ambos se crea una capa delgada de disolución, que el haz evanescente generado tras la reflexión en la interfase prisma/disolución puede atravesar y llegar al metal. Así esta configuración combina elementos de reflexión interna con elementos de configuración en capa fina. Por otro lado el uso de configuraciones de películas delgadas supone una alta resistencia en el electrolito, y por lo tanto, un aumento del tiempo de respuesta electroquímica. Por consiguiente la modulación del potencial implica una incertidumbre en el potencial que realmente se está aplicando. Sin embargo, la configuración de película delgada viene siendo muy utilizada para el estudio de la adsorción de compuestos sobre superficies metálicas monocristalinas. La elección del material y geometría de la ventana óptica es un factor muy importante a tener en cuenta en este tipo de configuración. En la actualidad existen cuatro tipos fundamentales de ventanas: planas en forma de disco, prismas equiláteros, semiesféricos o semicilíndricos. La principal desventaja de las ventanas planas en forma de disco es que cuando la luz las atraviesa se produce una fuerte pérdida de la radiación entre el 20 y el
54 40% debido a la reflexión de la interfase aire│ventana cuando los ángulos de incidencia son altos. Generalmente las ventanas prismáticas se fabrican con materiales de altos índices de refracción. En cuanto al material, la elección depende de la región espectral que se vaya a estudiar así como del sistema electroquímico. En los estudios de reflexión externa con electrolitos acuosos se suelen emplear ventanas de CaF 2 (4000-1050 cm -1 ), aunque adsorben radiación IR a números de onda menores de 1100 cm -1 . También es bastante común usar BaF 2 (6666-770cm -1 ). Con ambos materiales la pérdida de radiación en la interfase aire│ventana es solamente del 10%. En las medidas de reflexión interna se vienen usando ventanas semiesféricas de ZnSe que permiten estudiar regiones hasta los 700 cm -1 . Sin embargo este material no se puede utilizar para medidas en medios ácidos debido a su gran solubilidad en este tipo de disolventes. Otros materiales que vienen siendo muy utilizados para solventar estos problemas son los prismas de Si o Ge que presentan mayor estabilidad a diferentes electrolitos. Hoy en día se viene utilizando una terminología específica para este tipo de técnicas: Se utiliza el término espectroscopía ATR-SEIRAS (Attenuated Total Refllection Surface Enhanced Infrared Absorption Spectroscopy) para las técnicas de reflexión interna y espectroscopía IRRAS para referirse a las técnicas de reflexión externa. Como variedad de la espectroscopía IRRAS se conocen la técnica conocida como SNIFTIRS (Substractively Normalised Interfacial Fourier Transform InfraRed Spectroscopy) la técnica de PM-IRRAS (Polarization Modulated InfraRed Reflection Absortion Spectroscopy). 2.2.1.1 Attenuated Total Reflection Surface Enhanced Infrared Absorption Spectroscopy (ATR-SEIRAS) La espectroscopía de reflexión total atenuada (ATR) es una herramienta excelente para obtener información estructural y propiedades superficiales de muchos sistemas de interés, una de sus principales aplicaciones es la caracterización de la interfase metal│disolución. 13–15 Como electrodo de trabajo se utilizan películas nanoestructuradas de forma que cuando existen moléculas orgánicas adsorbidas sobre ellas se ha observado que éstas muestran bandas de absorción en el espectro de infrarrojos entre 10 a 1000 veces que las que se observan por los métodos convencionales, constituyendo el denominado efecto SEIRA (Surface-Enhanced Infrared Absorption). El efecto SEIRA puede considerarse como una
55 combinación del efecto que el campo magnético tiene sobre la superficie y sobre las moléculas adsorbidas sobre dicha superficie y da lugar al desarrollo de la espectroscopía de ATR-SEIRA. El incremento de las señales obtenidas en los espectros de infrarrojos cuando se utilizan películas nanoestructuradas depende de varios factores entre los que se puede destacar la morfología de la superficie metálica y el tamaño de las partículas que constituyen estas películas nanoestructuradas, encontrándose que el máximo aumento de las intensidades de las señales de infrarrojo se produce cuando las partículas están muy compactas pero no llegan a tocarse entre sí. 16 Este hecho se ha atribuido al acoplamiento cooperativo dipolo-dipolo de los plasmones apoyados por las partículas vecinas. 16 El tamaño de las partículas y el espesor de las películas delgadas se pueden controlar en función del tipo de depósito que se realice. En los depósitos químicos el control se realiza a través del tiempo de depósito mientras que en los depósitos preparados por técnicas físicas, como la evaporación en vacío o por pulverización catódica o “sputtering”, el espesor y las características de la película formadas van a depender de la temperatura, del sustrato y de la velocidad de depósito. Las películas obtenidas son generalmente rugosas no monoorientadas, aunque con un buen control de las condiciones de depósito es posible obtener superficies cuasi monoorientadas. Generalmente los depósitos químicos permiten obtener superficies más monoorientadas aunque resultan también más sucios que los depósitos realizados por procedimientos físicos. 2.2.1.2 Substractively Normalised Interfacial Fourier Transform InfraRed Spectroscopy (SNIFTIRS) Bewick y colaboradores adaptaron la espectroscopia de absorción-reflexión en el infrarrojos desarrollada por Greenler 4,5,17 para realizar estudios in-situ con sistemas electroquímicos. Para ello introdujeron en la técnica una modulación del potencial que se le aplicaba al electrodo con lo que conseguían una alta sensibilidad superficial. 8,9,18,19 Con este sistema mientras se recoge el espectro de reflectancia de absorción-reflexión dado en la ecuación 6 se va modulando el potencial entre dos valores; un potencial base E 1 al que la especie generalmente esta desorbida y un potencial que es el potencial de medida . El espectro diferencial se calcula utilizando la ecuación (8):
56 ∆- - = -(D)F-(G) -(G) (8) O bien en términos de absorbancia dados en la ecuación (9): A=−L'MN O(PD) O(PG) Q (9) Donde R(E ) y R(E ) son las reflectancias a los potenciales de referencia y de medida respectivamente. En los espectros aparecerán señales cuando se produzcan cambios en la frecuencia de vibración del adsorbato con el potencial o bien cuando se produzcan cambios en su concentración. Al representar los espectros de acuerdo a la ecuación (8) como diferencia de reflectividades relativas aparecerán bandas negativas cuando la concentración de la especie adsorbida sea mayor al potencial de medida que al de referencia, mientras que aparecerán bandas positivas en la situación inversa. Para las especies en disolución, si se produce la adsorción como consecuencia del cambio de potencial la concentración en disolución disminuirá y por tanto disminuirá la intensidad de la señal. 2.2.1.3 Polarization Modulated Infrared Reflection Absorption Spectroscopy (PMIRRAS) El estudio de películas insolubles adsorbidas sobre superficies electródicas presenta un problema adicional en el uso de las técnicas convencionales de FT-IRRAS “in-situ” ya que a la hora de obtener el espectro de referencia en estos casos no es posible encontrar el potencial de desorción. Para solventar este problema se introduce la técnica de PMIRRAS (Polarization Modulated Infrared Reflection Absorption), que emplea la regla de selección superficial, mencionada anteriormente, para obtener el espectro de referencia. La técnica viene siendo utilizada con éxito para el estudio de películas superficiales en balanza de Langmuir. 20–22 Más recientemente Lipkowski y col. la están empleando para obtener información cuantitativa sobre las orientaciones de los grupos funcionales presentes en películas orgánicas insolubles adsorbidas sobre electrodos de Au(111). 23–25 La calidad de los espectros de PM-IRRAS ha permitido caracterizar las especies superficiales y obtener información acerca de su orientación sobre la superficie electródica.
57 En esta técnica un modulador fotoelástico (PEM), que opera a altas frecuencias (~50-100 KHz) modula el haz de radiación infrarroja muy rápidamente entre una dirección perpendicular (luz polarizada-s) y una paralela (luz polarizda-p) al plano de incidencia. De esta forma el espectro obtenido con luz polarizada-p puede utilizarse como el espectro de las especies adsorbidas al potencial de medida y el de luz polarizada-s como espectro de referencia. Así al obtener la diferencia entre la reflectividad de la radiación –p y –s se elimina fácilmente la señal de fondo. Finalmente se normaliza respecto a la media entre las reflectividades de ambas radiaciones. De esta forma el espectro de infrarrojos de reflexión-absorción viene dado por: ∆- 〈-〉 = ?-<F-=? 〈-<V-=〉/ (10) donde ) y ) ; son respectivamente la reflectividad de la componente s y p del haz de infrarrojos modulado. La técnica PM-IRRAS ha sido empleada en un gran número de estudios sin embargo no ha sido tan utilizada como los métodos FTIRS más sencillos. Esto puede deberse a la complejidad de la instrumentación necesaria y/o a que no se obtienen buenas líneas bases ya que la luz polarizada-s tiene intensidad cero en la superficie del electrodo pero además presenta una intensidad muy pequeña en disolución aproximadamente hasta unos 0.1 µm, que no está compensada. 26 Por otro lado las señales obtenidas con la técnica de PM-IRRAS son más difíciles de interpretar y su análisis cuantitativo es más complejo que con otras metodologías de IRRAS que hacen uso de la modulación del potencial. Sin embargo la técnica PM-IRRAS presenta una gran ventaja ya que permite registrar bandas absolutas en espectros a un solo potencial en vez de una diferencia de espectros como las técnicas SNIFTIRS, lo que facilita el acceso a estudiar películas insolubles adsorbidas sobre superficies electródicas. 2.2.2 Medidas espectroelectroquímicas de infrarrojos En las medidas espectroelectroquímicas de ATR-SEIRAS, SNIFTIRS e infrarrojos de adsorción en disolución el control electroquímico se ha llevado ha realizado con un sistema electroquímico multifuncional de CH instruments. Las medidas espectroscópicas se llevaron a cabo con un espectrofotómetro Nicolet 6700 equipado con un accesorio de reflectancia Veemax de Pike Technologies. La purga de la cámara del espectrofotómetro
58 se realizó con aire comprimido libre de CO 2 y vapor de agua. En todas las medidas se ha usado un detector MCT-A refrigerado con nitrógeno líquido. Los espectros se recogieron con una resolución espectral de 4 cm -1 en el rango de frecuencias desde 4000 hasta 700 cm -1 . Como ventana transparente para la radiación se utilizó un prisma de ZnSe biselado a 45º para las medidas de transmisión en disolución, un prisma de CaF 2 biselado a 60º en los experimentos de reflexión externa, SNIFTIRS (Substractively Normalised Interfacial Fourier Transform InfraRed Spectroscopy ), y un prisma de silicio en los de reflexión interna, ATR-SEIRAS (Attenuated Total Reflection Surface Enhanced Spectroscopy). Los espectros se recogieron con luz polarizada s o p seleccionada con un polarizador de ZnSe. 2.2.2.1 Reflexión interna: ATR-SEIRAS En los experimentos de reflexión interna, ATR-SEIRAS se utilizó la configuración de Kretschmann (figura 2.8) lo que nos ha permitido trabajar con concentraciones pequeñas de adsorbatos. Fig. 2.8 Esquema de la célula espectroelectroquímica utilizada en los experimentos de ATR-SEIRAS La célula electroquímica se unió al prisma de silicio mediante una unión de teflón. Se empleó como electrodo de referencia un electrodo saturado de sulfato mercurioso (Radiometer) y como contraelectrodo una lámina de oro de gran superficie. El electrodo de trabajo consistió en una película de oro nanoestructurada obtenida por deposito catódico en plasma de argón directamente sobre la base del mismo prisma de silicio. Para Au Hg/Hg 2 SO 4 /K 2 SO 4 Película Au (25nm) Ar Si 60 0
59 realizar el contacto eléctrico del electrodo se utilizó una fina lámina de oro situada entre la unión de teflón y el prisma. Una vez montada la célula espectroelectroquímica se rellenó la con la disolución de electrolito y se introdujeron los electrodos restantes, se realizaron experimentos de voltametría cíclica en un amplio margen de potenciales para activar la película y conseguir el voltagrama característico, y registrar los espectros de reflectancia en ausencia de adsorbato a distintos potenciales. Posteriormente se procede a la adicción de la base del ADN objeto de estudio y al registro de los espectros de reflectancia. En este caso, la reflectancia de referencia (R1) se ha obtenido bien con la misma disolución a la que se ha obtenido la reflectancia de la muestra (R2) pero a un potencial de desorción, o bien al mismo potencial que se ha obtenido la muestra, pero antes de añadir el adsorbato a la disolución de trabajo. En el espectro se representa – log(R2/R1) en función del número de onda. Se registraron los espectros de reflectancia, compuestos de 100 interferogramas, a distintos valores de potencial en intervalos regulares. 2.2.2.2 Experimentos de absorción en disolución En los experimentos de absorción en disolución se utilizó la misma célula que en los espectros de ATR, pero usando como ventana de IR un prisma de SeZn biselado a 45º, y sin depositar la capa delgada de oro. Los espectros se obtuvieron acumulando 1000 interferogramas y en todos los casos se tomó como referencia el espectro del electrolito en las mismas condiciones experimentales. 2.2.2.3 Reflexión externa: SNIFTIRS Para las medidas espectroelectroquímicas en la configuración de reflexión externa se emplearon los mismos electrodos que los descritos para voltametría cíclica. La célula utilizada se basa en el diseño de Iwasita y colaboradores 27 y se esquematiza en la figura 9.
60 Fig. 9 Esquema de la célula espectroelectroquímica utilizada en los experimentos de reflexión externa En la parte inferior se monta un prisma de CaF 2 mientras que en la parte superior hay entradas para la corriente de argón y para los tres electrodos. La célula se colocó en configuración vertical fuera de la cámara del espectrofotómetro y por encima del elemento de reflectancia situándola para trabajar a un ángulo de incidencia de 60º. Con este tipo de configuración vertical se facilita la operación de montaje y la alineación del electrodo de trabajo antes de llevar a cabo la recogida de los espectros. Además de esta forma se pudieron realizar medidas previas de voltametría cíclica para comprobar la correcta orientación cristalográfica de la superficie del electrodo de trabajo y la pureza de la disolución en los instantes previos. Finalmente el electrodo de trabajo, cuya superficie debe estar paralela a la cara interna de la ventana presionó contra ésta para formar una capa delgada. En los experimentos de reflexión externa se usó la técnica SNIFTIRS. En ella se registran 50 interferogramas a un potencial de medida, E 2 , y seguidamente otros 50 al potencial de referencia. E 1 consiguiendo eliminar la mayor parte de la contribución de la capa delgada de disolución de electrolito. Este ciclo de medida se repite 40 veces y se promedian los espectros correspondientes, mejorándose así la relación señal/ruido de las medidas. Las medidas se realizaron con luz polarizada s y p. En los espectros que se presentan en la tesis, teniendo en cuenta la ecuación (8) se representa − ∆- - . Por tanto, los espectros obtenidos con luz polarizada s solamente proporcionan información de las moléculas que desaparecen de la disolución como consecuencia del proceso de adsorción, dando lugar a Au Au(111) Ar CaF2 600 Au (111) Hg/Hg2SO4/K2SO4
61 señales negativas Por el contrario los espectros realizados con luz polarizada p registran tanto la absorción por parte de moléculas adsorbidas al potencial de medida (señales positivas) como la pérdida de absorción de radiación por parte de especies en disolución que han pasado a la interfase (señales negativas). 2.2.2.4 Reflexión externa: PM-IRRAS Corn y colaboradores 28,29 fueron pioneros en describir como se obtenían espectros de diferencia de reflectancia de PM-FTIR utilizando velocidades normales del espejo y fueron capaces de demostrar como en ciertas ocasiones es posible evitar la necesidad de tomar el background si se conocen bien las propiedades ópticas y la dependencia con la longitud de onda teórica. El instrumento que se utiliza en técnica espectroscópica está esquematizado en la figura 10 y es el que se ha utilizado para la realización de esta tesis. Fig. 2.10 Diagrama de cajas que representa el dispositivo experimental utilizado en un experimento de PMIRRAS, adaptado de la bibliografía. 30 En el interior del TOM box, cámara externa al propio espectrofotómetro, se encuentran los elementos ópticos necesarios para la polarización modulada de la radiación, la célula electroquímica y el detector. Su disposición en el sistema puede esquematizarse como se muestra en la figura 2.11. En esta figura además pueden verse la disposición de estos elementos respecto a otros componentes del sistema.
68 Fig. 2.14 Representación esquemática del proceso de formación de una SAM. Debe tenerse en cuenta que existen otros muchos factores que pueden alterar la formación y la estructura de la SAM como es la correcta elección del disolvente, la temperatura, la concentración de adsorbato y el tiempo de inmersión, la pureza del adsorbato, la cantidad de oxígeno en la disolución y la limpieza y activación del sustrato. 2.3.2.2 Método de transferencia de Langmuir-Blodgett y Langmuir-Schaeffer. La técnica de Langmuir-Blodgett (LB) se basa en el movimiento vertical de un sustrato sólido a través de una monocapa comprimida en la interfase aire│disolución. La presión superficial y la temperatura de la monocapa deben controlarse para conseguir que en el momento de la transferencia la película orgánica esté en un estado condensado. De forma general esto ocurre para valores de presiones superficiales comprendidos entre 10 y 40 mN/m -1 . La transferencia de LB puede realizarse tanto sobre sustratos hidrofílicos como hidrofóbicos aunque el proceso es algo diferente. En el caso más común, donde el sustrato es hidrofílico el depósito se realiza elevando el sustrato sólido desde la subfase a través de la monocapa. Por el contrario en el caso de sustratos hidrofóbicos el depósito se hace sumergiendo el sustrato a través de la monocapa. En ambos caso la transferencia de la película se caracteriza por la relación de transferencia, τ que se define en la ecuación 12: _ = `a `b (12) Donde A L es la disminución en el área ocupara por la monocapa en la subfase y A S es el área de sólido que queda revestida por las moléculas de sustrato. 33
69 Para que la transferencia haya sido perfecta la relación de transferencia debe ser 1 o para considerarla buena estar en el intervalo entre 0.9-1.1. Si esto ocurre es muy probable que la película que se haya formado sea lo suficientemente homogénea. Para obtener una buena relación de transferencia es necesario elegir correctamente la velocidad de deposición, es decir la velocidad que lleva el sustrato a través de la monocapa mientras se está llevando a cabo la transferencia. En una transferencia de LS el sustrato, que debe estar orientado paralelo a la superficie de monocapa comprimida, se pone en contacto con ella y se retira a velocidad muy lenta. Este procedimiento permite la transferencia de una sola monocapa sobre una superficie hidrofóbica. Cabe destacar en este punto que si se quieren depositar bicapas se puede utilizar una combinación de ambos métodos de deposición, concretamente una combinación LB, LS con un electrodo de Au(111) daría como resultado una bicapa de tipo Y, en la que la primera monocapa queda unida al electrodo a través de las cabezas hidrofilicas mientras que la segunda capa de la bicapa expondría sus colas hidrofóbicas hacia el exterior. 2.4 Cálculos cuánticos GAUSIAN En las últimas décadas la Química Cuántica Computacional también ha adquirido un fuerte desarrollo debido al gran avance tecnológico en el campo de la informática, unido al desarrollo de la teoría del funcional de la densidad (DFT, “Density Funtional Theory”). Todo este desarrollo ha permitido realizar cálculos con bajo costo computacional pero que a la vez permitían obtener gran cantidad de información ofreciendo unos resultados con gran exactitud. Las aplicaciones de la teoría DFT son bastante extensas. Para sistemas adsorbato metal permite obtener buena información sobre las propiedades de adsorción; es decir geometrías optimizadas de la molécula adsorbida, energías de adsorción o frecuencias de vibración entre otras. Concretamente en esta tesis se han ejecutado cálculos DFT, con el programa Gaussian 09, que han permitido estudiar la geometría de algunas moléculas adsorbidas sobre sustratos sólidos de Au(111). Estos cálculos cuánticos se han llevado a cabo utilizando los funcionales B3LYP y PBEPBE, y como base, 6311 ++ G(d,p), que ha empleado B. Giese 34 para el uracilo. El funcional B3LYP es el funcional híbrido más popular. Este tipo de funcional apareció a principios de los 90 y desde entonces su utilización ha crecido rápidamente y ha alcanzado gran popularidad. Este funcional permite obtener resultados muy precisos con bajos costes computacionales
70 sin embargo no puede utilizarse para los clúster de Au en este caso se ha tenido que utilizar el funcional LANL2DZ. 2.5 Bibliografía 1. Sluyters, J. H. On the Impedance of Galvanic Cells .1. Theory. Recl. des Trav. Chim. des Pays-Bas-Journal R. Netherlands Chem. Soc. 79, 1092–1100 (1960). 2. Clavilier, J., Armand, D., Sun, S. G. & Petit, M. Electrochemical adsorption behaviour of platinum stepped surfaces in sulphuric acid solutions. J. Electroanal. Chem. 205, 267– 277 (1986). 3. Clavilier J. in Interfacial electrochemistry: theory: experiment, and applications (ed. Wieckowski, A.) 4. Greenler, R. G. Infrared Study of Adsorbed Molecules on Metal Surfaces by Reflection Techniques. J. Chem. Phys. 44, 310–15 (1966). 5. Greenler, R. G. Reflection Method for Obtaining the Infrared Spectrum of a Thin Layer on a Metal Surface. J. Chem. Phys. 50, 1963–1968 (1969). 6. Francis, S. A. & Ellison, A. H. Infrared Spectra of Monolayers on Metal Mirrors. J. Opt. Soc. Am. 49, 131 (1959). 7. Hoffmann, F. M. Infrared reflection-absorption spectroscopy of adsorbed molecules. Surf. Sci. Rep. 3, 107 (1983). 8. Bewick, Kunimatsu & Pons, S. Infrared spectrocopy of the electrode-electrolyte interphase. Electrochim. Acta 25, 465–468 (1980). 9. Bewick, A. & Kunimatsu, K. Infra red spectroscopy of the electrode-electrolyte interphase. Surf. Sci. 101, 131–138 (1980). 10. Brooksby, P. A. & Fawcett, W. R. Determination of the electric field intensities in a midinfrared spectroelectrochemical cell using attenuated total reflection spectroscopy with the otto optical configuration. Anal. Chem. 73, 1155–1160 (2001). 11. Milosevic, M. Internal Reflection and ATR Spectroscopy. Appl. Spectrosc. Rev. 39, 365–384 (2004). 12. Osawa, M. Dynamic Processes in Electrochemical Reactions Studied by SurfaceEnhanced Infrared Absorption Spectroscopy (SEIRAS). Bulletin of the Chemical Society of Japan 70, 2861–2880 (1997). 13. Ataka, K., Yotsuyanagi, T. & Osawa, M. Potential-Dependent Reorientation of Water Molecules at an Electrode/Electrolyte Interface Studied by Surface-Enhanced Infrared Absorption Spectroscopy. J. Phys. Chem. 100, 10664–10672 (1996). 14. Wan, L.-J., Terashima, M., Noda, H. & Osawa, M. Molecular Orientation and Ordered Structure of Benzenethiol Adsorbed on Gold(111). J. Phys. Chem. B 104, 3563–3569 (2000). 15. Huck, C. et al. Surface-enhanced infrared spectroscopy using nanometer-sized gaps. ACS Nano 8, 4908–4914 (2014). 16. Osawa, M. Surface-Enhanced Infrared Absorption. 81, 163–187 (2001). 17. Greenler, R. G. Design of a reflection–absorption experiment for studying the ir spectrum of molecules adsorbed on a metal surface. J. Vac. Sci. Technol. 12, 1410–1417 (1975). 18. A, E. S. S., Britz, D. & Mortensen, J. J. Electroanal. Chem., 127 (1981) 231-240. 127, 231–240 (1981). 19. Pons, S., Davidson, T. & Bewick, A. Vibrational spectroscopy of the electrode-solution interface. 2. Use of Fourier transform spectroscopy for recording infrared spectra of radical ion intermediates. J. Am. Chem. Soc. 105, 1802–1805 (1983). 20. Blaudez, D. et al. Investigations at the air / water interface using polarization modulation IR spectroscopy. 92, 525–530 (1996). 21. Gilli, E., Horvath, A. E., Horvath, A. T., Hirn, U. & Schennach, R. Analysis of CMC attachment onto cellulosic fibers by infrared spectroscopy. Cellulose 16, 825–832
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72 Capítulo 3 Adsorción y co-adsorción de Adenina y Timina en función del pH
73 3.1 Influencia del pH en la Adsorción de Adenina 3.1.1. Introducción En disolución acuosa la adenina presenta dos equilibrios ácido base con valores de pK a de 4.2 y 9.8 1 como se describió en el capítulo 1 de esta tesis. Fig. 3.1 Comportamiento ácido-base de la adenina En los últimos años el estudio de la adsorción de adenina sobre electrodos de oro monocristalinos o nanoestructurados viene siendo uno de los principales objetos de estudio del Grupo de investigación dentro del cual se ha desarrollado esta tesis. Como se ha descrito en el capítulo 1 estos estudios se han realizado a valores de pH que incluyen el pK a1 de la adenina. Están basados en medidas electroquímicas, 2 de STM 3 y espectroscópicas de infrarrojos tanto en la modalidad de reflexión interna (utilizando la configuración de Kretschmann) como en la de reflexión externa (SNIFTIRS, y PMIRRAS en el caso de pH neutro) 4–6 a valores de pH neutros y ácidos concluyendo que las interacciones de la molécula de adenina con el electrodo no dependen de la orientación cristalográfica ni del pH, siendo la especie que se quimisorbe la adenina neutra (AdH 3 ) a través de N 10 y N 1 . Además se ha observado la fisisorción de la adenina protonada a valores bajos de potenciales y concentraciones bajas de adenina. En esta parte del capítulo se va a ampliar el estudio espectroelectroquímico al caso particular de la adsorción de adenina sobre electrodos de oro a valores de pH que cubren el valor del pK a2 , con el objetivo de poder determinar las características de la adsorción de la forma aniónica de la adenina y determinar el valor del pK a2 en la interfase. Además se estudiará la co-adsorción de la adenina con las moléculas de agua del disolvente. Para ello se van combinar la voltametría cíclica con las técnicas espectroscópicas de infrarrojos en la modalidades de reflexión interna (configuración de Kretschmann) y/o reflexión externa (SNIFTIRS) como vienen descritas en el capítulo 2. pka1=4.2 H+ pka2=9.8 H+ AdH4+AdH3AdH22 1 5 4 7 9 6 3 8
74 Los resultados obtenidos en esta primera parte del capítulo han dado lugar a una publicación en la revista Electrochimica Acta. 6 3.1.2. Experimental 3.1.2.1. Reactivos Se utilizó D 2 O y H 2 O (Sigma-Aldhrich®) para preparar la disolución de electrolito soporte (KClO 4 0.1 M y KClO 4 0.1 M + NaOH) y la disolución de stock de adenina (Sigma-Aldhrich® sin más purificación) de concentración 10 mM. Los experimentos de infrarrojos obtenidos en configuración de reflexión externa se realizaron en medio deuterado mientras que los experimentos de reflexión interna se realizaron tanto en H 2 O como en D 2 O en los mismos electrolitos soportes (KClO 4 0.1 M o KClO 4 0.1 M + NaOH). Tanto en los experimentos de reflexión externa como interna la concentración de adenina fue 1 mM. Los experimentos de transmisión se realizaron en agua y en medio deuterado con una concentración de adenina 10 mM. 3.1.3. Resultados de voltametría cíclica Los resultados de voltametría cíclica para la adsorción de la adenina desde disoluciones 1mM de diferentes valores de pH sobre electrodos monocristalinos de Au(111) se muestran en la figura 2. En todas las figuras se presenta el voltagrama estacionario para el proceso de adsorción. Además en las figuras 3.2a y 3.2b se incluye el primer barrido registrado con el electrodo tratado a la llama y puesto en contacto con la disolución a un potencial menor que el de inicio de la adsorción. Se observa que en cada primer ciclo de potencial, en el sentido creciente de potenciales aparecen picos que están relacionados con la adsorción de adenina y con la pérdida de la reconstrucción de la superficie del electrodo, 7 mientras que a partir del segundo ciclo ya hay un comportamiento estacionario, en el que solo se registran picos relacionados con la adsorción y la desorción de la adenina sobre la superficie no-reconstruida del oro. El tiempo de permanencia a los potenciales más bajos en el transcurso de los barridos no es suficiente para que la superficie del electrodo recupere la forma reconstruida por vía electroquímica. 7 Por tanto, los picos que se observan en los barridos estacionarios solamente se deben al proceso de adsorción/desorción de adenina sobre la forma no reconstruida de la superficie del electrodo.
75 Al pasar de medios ácidos a neutros las señales de adsorción/desorción de la figura 2 se desplazan a potenciales menores, lo que indica que es necesaria la desprotonación previa de la forma catiónica de la adenina antes de adsorberse químicamente. Sin embargo los potenciales de pico de adsorción/desorción en medios neutros y básicos son muy parecidos lo que podría indicar que a valores de pH próximos al pK a2 o superiores podrían adsorberse tanto la forma aniónica de la adenina (AdH 2- ) como la forma neutra (AdH 3 ). E vs SCE / V -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0 20 I / µA cm - 2 -10 0 10 -20 0 20 pH 8 pH 3 pH 1 -20 0 20 pH 11.6 d) c) b) a) Fig. 3.2 Voltagramas de la región capacitativa del Au(111) en presencia de adenina 1 mM a los valores de pH indicados. Velocidad de barrido = 50 mVs -1 . Voltagramas estacionarios (líneas continuas). Primeros barridos obtenidos con el electrodo tratado a la llama, comenzando a los valores de potencial más bajos en cada caso (líneas discontinuas).
76 3.1.4. Resultados y Discusión de los Espectros FT-IR de transmisión en disoluciones neutras y básicas. En la figura 3.3 se muestran los espectros de transmisión obtenidos en disoluciones 0.1 M KClO 4 0.1M o K KClO 4 0.1M + NaOH y 10 mM de adenina en H 2 O y D 2 O a dos valores de pH. Dado el valor de pK a2 de la adenina en disolución de 9.8 1 los espectros a pH 7 corresponden a la forma neutra de la adenina mientras que los de pH 11 se deben asociar a su forma aniónica. Sólo se muestra la región comprendida entre 1300-1800 cm -1 en la que aparecen las bandas más interesantes en el presente estudio, consistentes en una señal intensa debida a tensiones de anillo y a la flexión de tijera del grupo amino, que en óxido de deuterio se desplaza a menores frecuencias. En esta misma región aparece la banda de flexión de OH del agua. Fig. 3.3 Región 1300-1800 cm -1 del espectro de transmisión de adenina 10 mM en disoluciones 0.1 M KClO 4 0.1M o KClO 4 0.1M + NaOH : a) D 2 O y b) H 2 O a distintos valores de pH / pD: 7 (- • - • -) y 11 (——). Número de onda / cm-1 1550160016501700 Absorbancia / u.a. 1652 1639 1602 a) 1580 1624 b) 1614 1599 1640 D 2 O 5 u.a. H 2 O pka2=9.8 H+ 2 1 5 4 7 9 6 3 8
77 En los espectros obtenidos a los dos valores de pH se observan dos bandas intensas y solapadas, algo más desplazadas hacia el rojo en el caso del medio básico. La de mayor número de onda se asocia con la vibración de tijera del grupo amino mientras que la de menor número de onda corresponde a tensiones de anillo, que incluye fundamentalmente las tensiones C 5 -C 6 y C 6 -N 10 , y además C 4 -C 5 , C 2 -N 3 , y N 1 -C 2 . 8 En esa misma región aparece la vibración de flexión de OH correspondiente al agua, en torno a los 1650 cm -1 . Como consecuencia, las señales de interés en disolución acuosa se observan como bandas anchas. En D 2 O se elimina por completo la contribución de la señal del disolvente ya que el modo de vibración de flexión O-D se desplaza a 1200 cm - 1 . Así, en la figura 3.3 a las señales correspondientes a la adenina son más estrechas. En estas condiciones sólo aparece una señal intensa correspondiente a las tensiones de anillo que al igual que en medio acuoso se desplaza hacia el rojo al aumentar el pH. La señal asociada al grupo amino se desplaza a frecuencias más bajas (< 1200 cm -1 ) como consecuencia de su deuteración. 3.1.5. Resultados y Discusión de los Espectros FT-IRRA para Adenina Adsorbida sobre Electrodos de Oro desde Disoluciones Neutras y Básicas en D 2 O. Cuando la adenina se adsorbe sobre superficies metálicas de oro, según la regla de selección superficial, solamente serán activos los modos vibracionales que contengan una componente del momento dipolar de la transición perpendicular a la superficie del electrodo. Para obtener información estructural y poder proponer un modelo para la adsorción de la adenina a valores próximos al pK a2 se realizan experimentos de infrarrojo de reflexión interna y externa sobre electrodos de oro utilizando como disolvente tanto agua como D 2 O para evitar así la interferencia de la señal de flexión de OH del agua (aproximadamente a 1650 cm -1 ). Así, la comparación de los espectros en disolución con los espectros de reflexión externa e interna de la adenina adsorbida sobre electrodos de oro permite proponer cuáles son los centros de coordinación en la molécula y la orientación molecular respecto a la superficie del electrodo. En la figura 3.4 se muestran los espectros de reflexión externa con luz polarizada s y p para electrodos de Au(111) en contacto con disoluciones a) neutras y b) básicas de adenina 1mM en perclorato, preparadas en D 2 O. Estos espectros se obtuvieron utilizando la técnica SNIFTIRS a -0.2V vs SCE , potencial al cual la adenina está
84 3.1.6. Resultados y Discusión de los Espectros ATR-SEIRA para Adenina Adsorbida sobre Electrodos de Oro desde Disoluciones Neutras y Básicas en H 2 O. Se han realizado experimentos ATR-SEIRA para la adenina adsorbida desde disoluciones acuosas a distintos valores de pH y de potencial. Algunos de los resultados obtenidos para la adsorción desde disoluciones 1 mM de adenina a distintos potenciales para valores de pH 6.1 y 10.6 se muestran en la figura 3.9. Los espectros están referidos a los obtenidos en el electrolito soporte a los mismos potenciales del electrodo. Se pueden observar los mismos efectos ya comentados para los experimentos en D 2 O, en lo que respecta a la influencia del potencial y del pH, sin embargo las señales espectroscópicas son más anchas porque engloban además de las debidas al modo normal de vibración de anillo, las debidas al modo de vibración de flexión de tijera del grupo amino de la adenina. Además, las señales podrían estar afectadas por la señal de vibración de flexión de los grupos OH del agua, que también aparece en torno a 1600 cm -1 . En la figura 3.9 también se incluye la región de 2800-3900 cm -1 en la que se observa una señal ancha y negativa alrededor de 3600 cm -1 asignada a la vibración de tensión de los OH del agua. Su carácter negativo en los espectros referidos a los obtenidos en ausencia de adenina en disolución a los mismos potenciales, indica la pérdida de moléculas de agua de la interfase al adsorberse la adenina.
85 160031503600160031503600 0.02 u.a. pH 6.1 1679 1674 3368 3217 3490 pH 10.6 1660 1665 3370 3217 3500 0.2V 0V -0.2V -0.4V 0.2V 0V -0.2V -0.4V 0.02 u.a. a) b) Fig. 3.9 Espectros de ATR-SEIRA de la adenina adsorbida sobre oro desde disoluciones de adenina 1 mM en H 2 O, a los potenciales indicados a a) pH = 6.1 y b) pH = 10.6. Espectros referidos a los obtenidos en el electrolito soporte al mismo potencial. En la figura 3.10 se comparan las señales principales de la región en torno a 1600 cm -1 de los espectros de la adenina adsorbida a un valor de potencial alto (0.2V vs SCE ) en H 2 O con los correspondientes en D 2 O a dos valores de pH, uno neutro y otro básico. Efectivamente se observa que las señales más anchas en H 2 O que en D 2 O. Por otro lado, a ambos valores de pH las señales en medio acuoso aparecen a número de onda más alto que en medios deuterados, al igual que ocurre con los espectros de transmisión (Fig. 3.3). Por otra parte, muestran un comportamiento similar al modificar el pH: la señal se hace más estrecha y se desplaza hacia el rojo 10 cm -1 al aumentar el pH.
86 160016501700 1679 1665 1645 1636 Número de onda / cm-1 b) a) 0.04 u.a 0.04 u.a Fig. 3.10 Comparación de los espectros de ATR-SEIRA para la adsorción de adenina 1mM sobre películas nanoestructuradas de oro a pH/pD: a) 11 y b) 7. Las líneas continuas corresponden a espectros en H 2 O y las discontinuas en D 2 O. Todos los espectros están recogidos a 0.2 V vs SCE y referidos al electrolito soporte al mismo potencial. A pesar de las complicaciones debidas a la mayor complejidad de las señales de la región en torno a 1600 cm -1 , se ha realizado un análisis similar al efectuado en medio D 2 O en función del pH, a distintos potenciales de adsorción, para calcular el pK a2 en la interfase. En la figura 11 se resumen algunos resultados obtenidos a un potencial alto de adsorción (0.2V vs SCE ). Los resultados son análogos a los obtenidos en D 2 O. En la figura 3.11b puede observarse como ha sido necesario introducir en la deconvolución la señal correspondiente a los modos de vibración de tensión de OH (1648 cm -1 ) del agua que aparecen en esta región espectral y que no han sido completamente corregidas al referir los espectros a los obtenidos en ausencia de adenina. Con todo, el valor de pK a2
87 que se obtiene en la interfase es el mismo que en disolución, dentro de los errores experimentales. 155016501750 0.02 u.a 1600165017001750 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 1665 1679 pH 10.6 pH 10 pH 9.4 pH 9.2 pH 8.4 pH 6.1 Área de pico normalizada Número de onda / cm-1 pH a) b) c) pH 9.6 pH 9.8 Fig. 3.11 a) Espectros de ATR-SEIRA para la adenina adsorbida sobre películas de oro a 0.2 V vs SCE desde disoluciones 1 mM en H 2 O a los valores de pH indicados y referenciados a los obtenidos en el electrolito soporte a 0.2V vs SCE . b) Deconvolución de la banda experimental a pH 9.6 (——) en una componente a 1665 cm -1 (——), 1679 cm -1 (——) y otra a 1648 cm -1 (——). Se muestra también el resultado de la deconvolución por combinación de todas las señales (- - -). c) Representación en función del pH de las áreas normalizadas de las señales de las bandas a 1679 cm -1 (▼) y 1665 cm -1 (●) que se obtienen al deconvolucionar las bandas experimentales en a). Se muestran también (en líneas continuas rosas y azules) las mejores líneas sigmoidales que se ajustan a las curvas intensidades vs pH. En estudios previos del grupo de investigación, 4 se ha comprobado que en medios fuertemente ácidos la adsorción de adenina implica también la co-adsorción del disolvente, tal como indicaban las bandas en la región de 2800-3900 cm -1 , características de la tensión de OH del agua. La intensidad de estas bandas aumenta con el potencial, al igual que las señales de adenina. 4 Además se propuso que la adsorción
88 de agua está determinada por la co-adsorción de iones perclorato en las regiones del electrodo libres de adenina adsorbida. Sin embargo, en los espectros de ATR-SEIRA para la adenina adsorbida a valores de pH neutros y básicos en la región de 2800-3900 cm -1 (Fig. 3.12) no se observan bandas positivas que se puedan asignar a los modos normales de vibración de tensión de OH. En esa región espectral solamente se observan dos señales positivas en torno a 3217 cm - 1 y 3370 cm -1 que corresponden a los modos normales de vibración de tensión simétrico y asimétrico del grupo amino, respectivamente. Por el contrario, tal como ya se ha comentado, el carácter negativo de la banda ancha a 3490 cm -1 , que se asigna a un modo de tensión característico de agua, sugiere que ésta es desplazada de la superficie del electrodo al adsorberse la adenina. Parece, por tanto, que en medios neutros y básicos no se co-adsorbe el agua, contrariamente a lo observado en medio ácido, por lo que se puede pensar que en medio ácido debe ser el ion hidronio el que induce la co-adsorción. Por otra parte, cabe destacar que la adsorción de la adenina desde los medios neutros y básicos tiene lugar a potenciales más negativos que en medio ácido, a los que no se detecta la adsorción de aniones perclorato, por lo que también podría entenderse que no se produce la co-adsorción del agua, al estar inducida por la co-adsorción de los aniones perclorato, tal como los experimentos en medio ácido parecen indicar. 3000330036003900 0.005 u.a. 3370 3217 3500 3365 3370 3490 Número de onda/ cm-1
89 Fig. 3.12 Espectros de ATR-SEIRA para la adenina adsorbida sobre electrodos nanoestructurados de oro desde disoluciones 1mM de adenina a diferentes valores de pH. Los espectros se obtuvieron a 0.2 V vs SCE y están referidos al espectro obtenido en el electrolito soporte al mismo potencial. 3.1.7. Conclusiones Tanto los espectros de reflexión externa de la adenina adsorbida sobre electrodos de Au(111) como los de ATR-SEIRA de la adenina adsorbida sobre electrodos nanoestructurados de oro, han puesto de manifiesto la adsorción de dos formas distintas de la adenina en función del pH de la disolución. La conclusión se ha basado en que la señal más intensa en torno a 1600 cm -1 , asignada a un modo normal de vibración de tensión del anillo pirimidinínico, presenta características distintas en medios neutros y básicos: la señal en medio básicos es más intensa y estrecha y está desplazada hacia números de onda más bajos que la señal en medios neutros, en buena concordancia con los espectros de transmisión de la adenina en disoluciones básicas y neutras en las que las formas que predominan en disolución son la forma aniónica desprotonada (AdD 2- ) y la neutra (AdD 3 ) de la adenina respectivamente. La alta resolución y sensibilidad de los experimentos ATR-SEIRAS han permitido deconvolucionar las bandas en torno a 1640 cm -1 correspondientes a las vibraciones de anillo de las dos formas moleculares de la adenina en un rango de pD desde 8.6 hasta 10.8. A partir del análisis de las variaciones de las áreas normalizadas de dichas señales se ha podido obtener el valor del pK a2 de la adenina adsorbida. Este valor de pK a2 coincide con el de la adenina en disolución y es independiente del potencial de la interfase, lo que confirma el modelo propuesto en trabajos anteriores para la adsorción de adenina sobre electrodos de oro, en el que los átomos implicados en la interacción con el electrodo son el nitrógeno del grupo amino, N 10 , y N 1 , pero no el N 9 que es el que está implicado en el segundo equilibrio ácido-base de la adenina. Los experimentos de FT-IRRAS similares, realizados en H 2 O a distintos valores de potenciales y de pH del medio presentan bandas más anchas en la región en torno a los 1600 cm -1 ya que aparecen además en esta región las señales de flexión de tijera del grupo amino y la de flexión de los OH de la molécula de agua (esta última puede no corregirse bien). No obstante, los experimentos confirman las conclusiones acerca de la adsorción de las dos formas de la adenina implicadas en el segundo equilibrio ácidobase, y el análisis de las áreas normalizadas de las señales en función del pH del medio
90 han permitido obtener el mismo valor de pK a2 . Por otra parte, la comparación de los espectros ATR-SEIRA en la región de altos número de onda (2800-2900 cm -1 ) obtenidos en disoluciones acuosas a valores de pH neutros y básicos ponen de manifiesto que en estas condiciones no tiene lugar la co-adsorción de agua ni la de iones perclorato, contrariamente a lo observado en medio ácido.
91 3.2 Adsorción de timina sobre electrodos de oro. Influencia del pH 3.2.1. Introducción La timina en disolución está implicada en un único equilibrio ácido-base con un valor de pKa de 9.6. La desprotonación de la timina a su vez puede dar lugar a dos especies tautoméricas (Fig. 3.13) tal y como se describió en el capítulo 1. Fig. 3.13 Comportamiento ácido-base de la timina La estabilidad de ambos tautómeros en disoluciones acuosas ha sido estudiada por espectroscopía ultravioleta visible (UV-vis) y técnicas espectroscópicas concluyendo que en disoluciones básicas están presentes en las proporciones similares. 9 La adsorción de la timina sobre electrodos de Au(111) ha sido estudiada utilizando métodos electroquímicos clásicos, XPS “ex situ”, STM “in-situ” y Espectroscopía de reflexión absorción infrarroja por transformada de Fourier in situ (FT-IRRAS) en la configuración de reflexión externa 10,11 concluyendo que el estado quimisorbido o fisisorbido y la orientación que la timina adopta respecto al electrodo depende fuertemente del potencial aplicado como se describió en el capítulo 1. Además la adsorción de la timina sobre el electrodo de oro parece indicar la desprotonación previa de la misma antes de adsorberse. Estudios posteriores en los que se combinan cálculos teóricos DFT con técnicas de espectroscopía Raman han sugerido que adsorbido sobre nanopartículas de oro y plata el tautómero más estable es el N 3 , sin embargo el tautómero N 1 también puede detectarse. En esta parte del capítulo de utiliza la espectroscopía de ATR-SEIRA (descrita en detalle en el capítulo 2) para estudiar la adsorción de timina sobre electrodos de oro en un amplio rango de pH con el fin de analizar el equilibrio tautomérico de la timina adsorbida. Los resultados espectroscópicos se han interpretado haciendo uso de cálculos pk a =9.6 H + 3 1 5 2 4 6 Tautómero desprotonado en N 1 Tautómero desprotonado en N 3
92 DFT de ambas formas tautoméricas adsorbidas sobre superficies de oro. La gran sensibilidad de la técnica espectroelectroquímica nos ha permitido analizar la preponderancia de cada tautómero de timina en función del pH. Además se ha determinado la influencia del campo eléctrico en la orientación del plano molecular y los sitios de interacción con el metal de los tautómeros adsorbidos estudiando la región espectral entre 2800-3300 cm -1 que comprende las tensiones de CH y CH 3 . Los resultados se han explicado sobre la base de la energía de interacción electrostática con el momento dipolar permanente. También se incluye el estudio de la coadsorción del agua con los tautómeros desprotonados en N 1 y N 3 a partir del análisis de la región espectral 2800-3900 cm -1 . Los resultados obtenidos en esta segunda parte del capítulo han dado lugar a una publicación en la revista Electrochimica Acta. 12 3.2.2. Experimental 3.2.2.1. Reactivos Se utilizó H 2 O ultrapura y D 2 O (Sigma-Aldhrich®) para preparar la disolución de electrolito soporte (HClO 4 0.1 M, KClO 4 0.1 M y KClO 4 0.1 M + NaOH) y la disolución de stock de timina (Sigma-Aldhrich® sin más purificación) de concentración 10 mM. Los experimentos de infrarrojos obtenidos en configuración de reflexión interna se realizaron tanto en H 2 O como en D 2 O en los mismos electrolitos soportes (HClO 4 0.1 M a pH 1, KClO 4 0.1 M a pH 7 y KClO 4 0.1 M + NaOH a pH 12). La concentración de timina en estos experimentos fue 1 mM. Los experimentos de transmisión se realizaron en agua y en medio deuterado con una concentración de timina de 10 mM. 3.2.3. Resultados de Voltametría cíclica En la figura 3.14 se muestran los voltagramas cíclicos obtenidos a diferentes valores de pH para disoluciones de timina 1 mM sobre electrodos monocristalinos de Au(111). A pH 1 se pueden distinguir claramente tres regiones en función del potencial descritas por Roelfs y colaboradores. 10 Los límites entre cada fase vienen marcados por picos de transición de fase T1/T1* y T2/T2*. En orden creciente de potencial la primera corresponde a una fase fisisorbida desordenada (I), la siguiente se debe a una fase
93 fisisorbida con las moléculas ordenadas (II) y la última se atribuye a una fase en la que las moléculas de timina están quimisorbidas (III). -10 0 10 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 -10 0 10 E vs SCE / V I / µA cm - 2 pH = 7 -10 0 10 pH = 1 pH = 12 T1 T1* T2* T2 a) b) c) III III T1* T1 T2* T2 Fig. 3.14 Voltagramas estacionarios de electrodos Au(111) obtenidos en disoluciones de timina 1mM a los valores de pH indicados. Velocidad de barrido 50 mV/s. Al aumentar el pH los picos de transición de fase T2/T2* se desplazan a potenciales menores al tiempo que se hace cada vez más pequeña la región (II) del voltagrama hasta que finalmente desaparece a valores de pH altos. Por su parte, los picos de adsorción química se desplazan hacia valores más bajos de potencial a medida que aumenta el pH del medio. Esto sugiere que la formación de la fase quimisorbida está conectada con una desprotonación previa de la molécula como ya han sugirieron previamente Roelfs y colaboradores. 10
100 pueden plantear dos posibilidades sobre la naturaleza de las dos especies adsorbidas dependientes del pH: por una parte, se podría pensar en la co-adsorción de las dos formas implicadas en el equilibrio ácido-base de la timina, es decir, la forma neutra protonada de la timina y alguno de los tautómeros de la timina aniónica desprotonada. Por otra parte, cabe la posibilidad de que solo la timina desprotonada pueda adsorberse, pero en sus dos formas tautoméricas. La comparación de los espectros de la timina adsorbida a los distintos valores de pH con los correspondientes espectros en disolución puede ayudar a dilucidar estas cuestiones. Así, se observan en la figura 16 claras diferencias en los comportamientos a pH 1 y 12. A pH 12 las señales de los espectros de ATR-SEIRAS para la timina adsorbida aparecen casi a los mismos números de onda que las señales correspondientes de los espectros en disolución, por lo que es probable que a este valor de pH la misma forma de timina que está presente en disolución sea la que se encuentre en estado adsorbido, por lo tanto debe ser la forma aniónica desprotonada. Sin embargo a pH 1 las señales en el espectro de ATR-SEIRA se desplazan al rojo respecto a la disolución cuando la timina se adsorbe. Este efecto se puede deber a la desprotonación de la timina al adsorberse, lo que estaría de acuerdo con los resultados voltamétricos (Figura 3.12c). Por tanto las diferencias en los espectros de adsorción de timina a pH 1 y 12 solamente pueden estar relacionadas con la adsorción de diferentes tautómeros de la timina desprotonada a diferentes valores de pH, de tal forma que el tautómero desprotonado en N 3 sea probablemente el que este adsorbido en medio ácido mientras que el desprotonado en N 1 sea la especie adsorbida en medio básico. Roelfs y colaboradores ya descartaron la adsorción de una forma neutra de timina incluso en medio muy ácidos basándose en estudios de STM electroquímico in-situ y en medidas de SNIFTIRS y SXPS para la timina adsorbida sobre electrodos de oro. 10,11 Estos autores propusieron un modelo para la quimisorción de la timina en medio ácido con la molécula desprotonada en N 3 orientada en posición vertical sobre la superficie electródica de tal forma que la molécula interacciona con el electrodo a través de N 3 y ambos grupos carbonilos. Para confirmar esta hipótesis se han calculado por el método DFT los espectros de ambos tautómeros de timina adsorbidos sobre superficies de oro. Se ha optimizado la geometría y calculado las propiedades vibracionales de la timina utilizando una superficie no re-reconstruida de Au(111) de 19 átomos, de tal forma que el tamaño del
101 clúster es suficientemente grande como para evitar la unión de la molécula de timina en los bordes durante la optimización de la geometría. Fig. 3.17 Geometrías optimizadas para los tautómeros de la timina desprotonado en a) N 1 y b) N 3 adsorbidos sobre un clúster de 19 átomos de oro Las geometrías optimizadas se representan en la figura 3.17 de tal forma que una vez optimizadas el tautómero desprotonado en N 3 está orientado en la dirección normal a la superficie con ambos grupos carbonilos y el nitrógeno N 3 dirigidos hacia el electrodo, quedando el plano girado ligeramente (c.a. 10 grados) respecto a la dirección principal del cristal de oro. Las distancias entre el nitrógeno en N 3 y los dos átomos de oxígeno (O 7 y O 8 ) y el correspondiente átomo de oro más cercano son 2.59 Ǻ, 3.19 Ǻ y 2.45 Ǻ,
102 respectivamente por lo que la interacción con el electrodo se lleva a cabo principalmente por N 3 y O 8 . El tautómero desprotonado en N 1 también está orientado en la dirección normal al electrodo pero en este caso N 1 y O 8 son los átomos más próximos al átomo de oro superficial con unas distancias de 2.77 Ǻ y 2.89 Ǻ respectivamente. Las frecuencias de vibración en la región alrededor de 1600 cm -1 calculadas para las geometrías optimizadas de los tautómeros de timina desprotonados en N 3 y N 1 adsorbidos sobre electrodos de oro vienen dadas en la Tabla 2, en comparación con los valores experimentales a pH 1 y 12 en D 2 O y H 2 O. Cabe destacar que la mayoría de las señales calculadas en la región espectral entre 1300-1800 cm -1 muestran contribución de diferentes modos normales de vibración individuales. En D 2 O el espectro teórico para el tautómero desprotonado en N 3 muestra dos bandas intensas de adsorción; una a 1640 cm -1 debido a la vibración de tensión de C 5 C 6 y otra a 1586 cm -1 debido a las vibraciones de tensión de los grupos carbonilo, así como una señal débil a 1463 cm -1 como consecuencia de los modos normales de flexión de los grupos metileno y metileno. Estas señales pueden correlacionarse con las bandas experimentales del espectro de ATR-SEIRA obtenidas a pD 1 (dos bandas intensas a 1648 cm -1 y 1581 cm -1 y una banda débil a 1478 cm -1 ). Las señales aparecen a frecuencias más bajas que en el espectro calculado para el mismo tautómero en disolución, lo que indica que la molécula interacciona con electrodo de oro por los átomos que participan en estos modos de vibración. Los cálculos DFT proporcionan una señal intensa a 1414 cm -1 debida fundamentalmente a los modos vibracionales de tensión de C 4 O y C 2 O que pueden asociarse con la banda experimental a 1440 cm -1 aunque ésta es más débil. Se puede encontrar una correlación similar para este tautómero desprotonado en N 3 en el caso de disoluciones acuosas. De esta forma el espectro calculado presenta dos bandas intensas a 1645 cm -1 y 1599 cm -1 correspondientes a la vibración de tensión de C 5 C 6 y a la vibración de tensión de los grupos carbonilos acoplada con la flexión de N 1 H, respectivamente. Además se observan bandas débiles a 1463 cm -1 1447 cm -1 y 1410 cm -1 que podrían corresponderse con las señales de los espectros experimentales de ATR-SEIRA que aparecen a 1490 cm -1 , 1440 cm -1 y 1403 cm -1 respectivamente.
103 Tabla 2. Frecuencias experimentales de ATR-SEIRAS de la timina químicamente adsorbida sobre electrodos de oro en H 2 O y D 2 O y las frecuencias teóricas obtenidas por cálculos DFT para los tautómeros desprotonados en N 1 y N 3 para la timina adsorbida sobre un clúster de 19 átomos de oro, optimizando H 2 O N 1 tautómero w-3051 cm -1 ; as str -CH 3 w-3038cm -1 ; str C 5 H 2956 cm -1 ; sym str –CH 3 1639 cm -1 ; str C 4 O + bend N 3 H w-1567 cm -1 , str C 4 O bend N 3 H vw -1493cm -1 ;Str–C 5 C 6 -C 2 C 3 bend CH w-1445 cm -1 ; bend CH, CH 3 w-1399 cm -1 ; ring brth ( vw - muy débil, w - débil, m - medio, s - fuerte, str - tensión y bend - flexión ) N 3 tautómero w-3101 cm -1 ; str CH w-3032cm -1 ; as str –CH 3 2959 cm -1 ; sym str CH 3 s-1645 cm -1 , str C 5 C 6 bend CH s-1599 cm -1 ; str C 2 O+C 4 O bend N 1 H m-1463 cm -1 ; bend CH 3 + CH w-1447 cm -1 ; bend N 1 H m-1410 cm -1 , str C 4 O pH 12 1643 cm -1 1558 cm -1 1506 cm -1 1390 cm -1 pH = 1 3072 cm -1 2973 cm -1 2931 cm -1 1656 cm -1 1597 cm -1 1490 cm -1 1440 cm -1 1403 cm -1 D 2 O N 1 tautómero w-3051cm -1 ; υ as -CH 3 w-3039 cm -1 ; str C 5 H w-2954 cm -1 , sym str CH 3 str C 4 O w-1558 cm -1 ;str C 2 O + bend CH vw-1483 cm -1 ; str C 5 C 6 bend CH + CH w-1445 cm -1 ; bend CH 3 + CH w -1393 cm -1 ; ring brth N 3 tautómero w-3101 cm -1 ; str -CH w-3032 cm -1 ; asym -strCH 3 w-2959 cm -1 ; sym str –CH 3 s-1642 cm -1 , str C 5 C 6 +bend CH s-1586 cm -1 ; str C 2 O+C 4 O w-1463 cm -1 ; bend CH 3 +CH s-1414 cm -1 ; str C 4 O+C 2 O m-1393 cm -1 ; ring brth pD 12 3070 cm -1 2977 cm -1 2926 cm -1 1631 cm -1 1574 cm -1 1527 cm -1 1413 cm -1 pD = 1 3070 cm -1 2985 cm -1 2962 cm -1 (sh) 1648 cm -1 1581 cm -1 1567 (sh) 1478 cm -1 1440 cm -1 1407 cm -1
104 El espectro teórico de la forma deuterada del tautómero desprotonado en N 1 exhibe una banda de absorción intensa a 1624 cm -1 , asociada con la vibración de tensión de C 4 O, y dos bandas débiles a 1558 cm -1 y 1483 cm -1 que se atribuyen a los modos normales de vibración de tensión de C 2 O y C 5 C 6 respectivamente. Estos resultados concuerdan bastante bien con los resultados experimentales en medio básico, en los que se observa una banda intensa y ancha a 1627 cm -1 y dos bandas débiles a 1573 cm -1 y 1521 cm -1 . En medio acuoso el espectro experimental a pH 12 contiene una banda intensa y ancha a 1643 cm -1 que se relaciona bastante bien con los cálculos teóricos para el tautómero en N 1 en los que se obtiene una señal intensa a 1639 cm -1 debido a la vibración de tensión de C 4 O acoplada con la vibración de tensión de N 3 H, dos señales muy débiles a 1558 cm -1 y 1506 cm -1 que pueden asociarse con las frecuencias teóricas calculadas a 1567 cm -1 asociada a los modos normales de tensión de C 2 O y flexiones de N 3 H y una banda a 1493 cm -1 que tiene contribuciones de los modos normales de vibración de tensión de C 5 C 6 y C 2 C 3 así como de flexiones CH 3 . 3.2.5.2. Espectros ATR-SEIRA en la Región Espectral 2800 a 3900 cm -1 . En la figura 18 se muestran algunos espectros de la timina adsorbida, en la región comprendida entre 2800 y 3200 cm -1 , obtenidos en medios deuterados a potenciales altos. En esta región se encuentran las bandas débiles asociadas a los modos normales de vibración de tensión del grupo metilo (CH 3 .) y las de tensión del grupo metileno intracíclico (CH).
105 290030003100 pD = 1 pD = 12 pD = 7 3072 2985 2932 2962 0.0002 u.a. 2926 νs (CH3) 2977 ν (CH) 3070 νas (CH3) 2962 νs (CH3) 2986 ν as (CH 3 ) 3070 ν (CH) 0.2 V 0.5 V 0.86 V Fig. 3.18 Espectros de ATR-SEIRA, en la región entre 2800-3300 cm -1 , para la timina adsorbida sobre películas nanoestructuradas de oro a los potenciales indicados a partir de disoluciones en D 2 O a los valores de pH indicados. Los espectros están referidos a las señales obtenidas en el electrolito soporte al mismo potencial. La figura incluye los resultados de la deconvolución de las señales experimentales correspondientes a los modos normales de vibración del grupo metilo: simétrica (- - -) y asimétrica (- - -). Al comparar con los espectros en disolución (Fig. 3.15) tanto a pD 1 como a pD 12 se observa un desplazamiento de las señales hacia números de ondas mayores como era de esperar para las frecuencias de estos modos normales de vibración de tensión. Los espectros obtenidos a los dos valores de pD extremos se pueden deconvolucionar en tres bandas gausianas-lorentzianas, que muestran cambios en la altura relativa en función del
106 pD del medio. Además, al aumentar el pD también se produce un cambio en las frecuencias de las dos bandas hacia números de ondas más bajos. El espectro a valores de pD intermedios es una combinación de los espectros de los dos valores de pD extremos. Si se asume que la timina orienta su plano molecular perpendicular a la superficie del electrodo estas bandas deben corresponderse con las vibraciones de tensión del grupo metilo (la vibración simétrica, y la vibración asimétrica en el plano que contiene una componente del momento dipolar de la transición que se localiza en el plano de la molécula) y la vibración de tensión del metileno. El modo normal de tensión asimétrico de metileno fuera del plano tendría un momento dipolar de la transición que es normal al plano molecular por lo que no es activo para esta orientación de la molécula. En la Tabla 2 se recogen también las frecuencias calculadas en esta región del espectro para los tautómeros de la timina desprotonados en N 1 y N 3 : los valores de las frecuencias calculadas para las vibraciones en esta región de los dos tautómeros son bastante parecidas, lo que dificulta la identificación de los isómeros. No obstante, las asignaciones a los distintos modos es diferente en cada tautómero, de ahí la significativa diferencia de perfiles espectrales que se observan experimentalmente a pD 1 y a pD 12. Así, en el caso del tautómero desprotonado en N 3 la señal a mayor número de onda es debida a la vibración de tensión de CH mientras que para el tautómero desprotonado en N 1 se debe a la vibración de tensión asimétrica de CH 3 en el plano molecular. Los cálculos para las moléculas libres de los dos tautómeros (Tabla 1) también mostraban este intercambio de asignaciones entre las señales ʋ(CH) y ʋ as (CH 3 ) de los dos tautómeros, por lo que no está originado por la adsorción. Las asignaciones de las bandas experimentales de los espectros a pD 1 y pD 12 que se indican en la figura 18 se han llevado a cabo conforme a los cálculos teóricos realizados para los tautómeros de la timina desprotonados en N 3 y N 1 respectivamente. En disolución acuosa, la proximidad de las bandas asociadas a los modos normales de vibración de tensión OH del disolvente en esta región espectral no permite una visualización adecuada de las señales debidas a los grupos metileno y metilo. Sin embargo en la región espectral comprendida entre 2800-3900 cm -1 es posible estudiar la posible co-adsorción las moléculas de agua con los tautómeros N 1 y N 3 de la timina dependiendo del pH del medio como puede verse en la figura 3.19. Además en esta figura también se incluye la región entre 1300-1800 cm -1
107 150028003500 pH 1 Número de onda / cm-1 150028003500 150028003500 3411 3417 3212 3421 pH 8 pH 12 1656 1597 1490 1658 1598 1486 1643 0.01 u.a. 0.005u.a. 0.005u.a. 0.6V 0.2V -0.2V -0.3V 0.1V 0.5V -0.4V -0.2V 0.1V 1403 3419 3212 a) b) c) 3440 Fig. 3.19 Espectros de ATR-SEIRA en H 2 O de la timina 1 mM adsorbida sobre electrodos nanoestructurados de oro a los potenciales indicados a a) pH = 1, b) pH = 7 y c) pH = 12. Referidos frente al electrolito soporte al mismo potencial. A pH 1 a potenciales a los que la timina no está adsorbida químicamente (-0.2V vs SCE en la Fig. 3.19a) en la región de 2800-3900 cm -1 se observa una banda ancha a 3411 cm - 1 asignada a las vibraciones de tensión de OH del agua. Esta banda va desapareciendo a medida que aumenta el potencial y la timina va adsorbiéndose químicamente sobre la superficie electródica hasta convertirse en una banda negativa a -0.6V vs SCE lo que sugiere que la timina al adsorberse químicamente desplaza moléculas se agua de la superficie del electrodo. Sin embargo a pH 8 a potenciales en los que la timina esta adsorbida físicamente sobre la superficie electródica (-0.3V vs SCE Fig. 3.19b) en la región de 3000-4000 cm -1 se puede observar una banda ancha 3440 cm -1 con un hombro a 3212 cm -1 que se asignan con la vibración de tensión de OH del agua y la vibración de tensión de NH de los tautómeros N 1 y N 3 de timina. La señal a mayor número de onda disminuye su intensidad a medida que aumenta el potencial sin que cambie significativamente de forma. Estas características están en consonancia con la pérdida de agua poco ligada a la interfase al adsorberse químicamente la timina. Sin embargo a pH 8 la timina no llega a desplazar completamente a las moléculas de agua de la interfase.
108 Finalmente en medios fuertemente básicos (Fig. 3.19c) resulta más complicado estudiar la co-adsorción de las moléculas ya que en la región espectral entre 3000-4000 cm -1 aparecen señales muy anchas debido a las tensiones de OH libre del disolvente. 3.2.5.3. Influencia del potencial en la adsorción de timina adsorbida sobre electrodos de oro En la figuras 3.20 a y b se representan los espectros de ATR-SEIRA (en las dos regiones que se han venido considerando) para la timina adsorbida a distintos potenciales desde disoluciones de pD 1 y de pD 12 en D 2 O. 29503050 Número de onda / cm-1 150016001700 a) Número de onda / cm-1 29503050 150016001700 b) 0.02 u.a. -0.3 V 0 V 0.1 V 0.2 V 0.3 V 0.4 V 0.5 V 0.6 V 0.7 V 0.8 V 1582 1567 1630 x 10 x 30 0.02 u.a. -0.1 V 0 V 0.1 V 0.2 V -0.4 V -0.3 V -0.2 V 1576 1526 1630 Fig. 3.20 Espectros de ATR-SEIRAS para la timina adsorbida sobre electrodos de oro a los potenciales indicados desde disoluciones 1mM de timina y 0.1 M de KClO 4 y KClO 4 + NaOD en D 2 O a: a) pD1 y b) pD 12. Los espectros están referidos a las señales registradas desde disoluciones del electrolito soporte al mismo potencial. En los espectros registrados en disoluciones de pD 1 no se observan bandas características para la timina en la región de 1600 cm -1 ni de 3000 cm -1 , cuando se aplican potenciales menores a los de comienzo de la quimisorción (pico T2 el voltagrama, (Fig. 3.13) lo que indica que la timina fisisorbida está orientada con el plano molecular paralelo a la superficie del electrodo. En la región II, sin embargo, comienzan a aparecer señales características, cuyas intensidades van aumentando
109 conforme aumenta el potencial. A potenciales mayores que 0.3V vs SCE existen dos bandas solapadas a 1567 y 1582 cm -1 cuyas alturas relativas varían claramente con el potencial. El aumento de la señal a 1582 cm -1 con el potencial es claramente mayor que el de las otras dos bandas de esta región. Se puede observar un comportamiento similar de las señales espectrales que aparecen a números de onda próximos a 3000 cm -1 , pero en este caso la altura de las señales a mayor número de onda aumentan con el potencial más que la señal a 2960 cm -1 y puede observarse como a valores de potencial lo suficientemente altos los espectros son independientes del potencial aplicado. En los espectros registrados en disoluciones de pD 12 se puede observar un comportamiento diferente con el potencial. Las señales de los espectros aparecen desde potenciales muy bajos y van aumentando con el potencial incluso a valores de potenciales lejanos a los potenciales de quimisorción. Esto indica que la molécula fisisorbida no se orienta paralela al electrodo si no que presenta cierta inclinación desde potenciales negativos. Por otra parte, en este medio los cambios en las alturas relativas de las señales con el potencial son menos significativos, todas las señales parecen crecer en la misma proporción cuando aumenta el potencial. Los cambios en las intensidades relativas de las bandas de los espectros con de cada tautómero de timina adsorbido a medida que se cambia el potencial se pueden utilizar para determinar los posibles cambios en las orientaciones moleculares de cada uno de los tautómeros respecto al electrodo, inducidas por el campo eléctrico. La intensidad integrada de una banda de reflexión-absorción para una película de moléculas adsorbidas, obtenida con luz polarizada-p es proporcional al producto escalar del vector dipolo de transición y al campo eléctrico del fotón, pudiéndose expresar por la ecuación (1). 17 ∝ × = || 〈 〉 () (1) Donde es la concentración superficial de moléculas responsables de la absorción de la radiación de luz, es el ángulo entre el momento dipolar de la transición y el campo eléctrico del fotón que para la luz polarizada p tiene una dirección normal a la superficie del electrodo, |μ| es el módulo del momento dipolar de la transición y 〈 〉es la intensidad cuadrática media del campo eléctrico para un haz de luz polarizada-p en la superficie de reflexión. El cambio en las intensidades de las bandas con el potencial
116 3.3. Co-Adsorción de Adenina y Timina sobre Electrodos de oro 3.3.1. Introducción Los estudios de las interacciones entre la timina y la adenina en interfaces organizadas resultan de gran interés tanto para la comprensión de sus actividades biológicas como por sus posibles aplicaciones en biotecnología. Los estudios de las adsorciones individuales de adenina y timina sobre superficies electródicas de oro han puesto de manifiesto que estas moléculas se unen al electrodo curiosamente por los mismos átomos implicados en la formación de puentes de hidrógeno, de Watson–Crick (WC) o de Hoogsteen (HG), entre ambas bases complementarias (Fig. 3.23) a) b) Fig. 3.23 Modelo de interacciones por puentes de hidrógeno entre timina (T) y adenina (A) a) WatsonCrick (WC) y b) Hoogsteen (HG) En esta última parte del capítulo se utiliza la espectroscopia de ATR-SEIRA para estudiar la co-adsorción de timina y adenina sobre electrodos de oro en el mismo rango de pH que están estudiadas las adsorciones individuales de dichas bases. Los resultados se analizan sobre la base de la adsorción de dos formas de la adenina y dos tautómeros de timina dependiendo del pH del medio. La comparación de los espectros de ATRSEIRA de la co-adsorción con los correspondientes espectros para la adsorción de las bases individuales a los distintos valores de pH ha permitido decidir sobra las interacciones de la timina y la adenina sobre la superficie del electrodo. AT (WC) (HG) T A
117 Estos estudios han dado lugar a una publicación en la revista Electrochemistry Communications 18 y actualmente se está preparando otra publicación que comprende resultados de esta parte de capítulo de la tesis. 3.3.2. Experimental 3.3.2.1. Reactivos Se utilizó D 2 O (Sigma-Aldhrich®) y H 2 O Ultrapura (Millipore y ELGA) para preparar la disolución de electrolito soporte (HClO 4 , KClO 4 0.1 M y KClO 4 0.1 M + NaOH) y la disoluciones de stock de adenina y timina (Sigma-Aldhrich® sin más purificación) de concentraciones 10 mM. Los experimentos de infrarrojos obtenidos en configuración de reflexión interna se realizaron tanto en H 2 O como en D 2 O en los mismos electrolitos soporte (HClO 4 a pH 1, KClO 4 0.1 M a pH 7 y KClO 4 0.1 M + NaOH a pH 11.5). Las concentraciones de adenina y timina se variaron desde 0.01 hasta 1 mM mediante la adición de la cantidad necesaria de la disolución stock correspondiente a potenciales a los que ambas bases están adsorbidas químicamente sobre el electrodo de oro. 3.3.3. Resultados de Voltametría cíclica sobre electrodos Au(111) En la figura 3.24 se muestran los voltagramas cíclicos a diferentes valores de pH obtenidos con electros de Au(111) en disoluciones que contienen adenina 0.01 mM o timina 1mM y se comparan con los obtenidos cuando ambas bases están presentes en la disolución a las mismas concentraciones. Las medidas electroquímicas se han centrado en la región de doble capa para evitar la evolución de hidrógeno a los potenciales bajos y los picos de oxidación/reducción del oro a los potenciales altos. El comportamiento voltamétrico de la adsorción individual de adenina y timina sobre oro ha sido estudiada por métodos electroquímicos y espectroscópicos en los apartados previos de este capítulo, así como en la bibliografia. 4,6,10–12,19 En los voltagramas de la timina a los diferentes valores de pH se observan las regiones características de adsorción separadas por los picos de transición de fase que se han descrito en el apartado 3.2.3 de esta capítulo. Los voltagramas obtenidos en disoluciones de adenina muestran que esta base permanece adsorbida químicamente en un rango más amplio de potenciales que la timina a los tres valores de pH estudiados. Si
118 a un potencial en el que la adenina y la timina deben estar adsorbidas químicamente, se adiciona adenina 0.01 mM a disoluciones que contenían timina adsorbida químicamente se produce la desaparición de los picos de transición de fase característicos de la timina adsorbida sobre electrodos de Au(111) 10,12,20 y además solamente a pH 1 (Fig. 3.24a) los picos voltamétricas correspondientes a la adsorción/desorción química de la timina se desplazan hacia potenciales más bajos. Se observa además en todas las condiciones de pH que la región de potenciales en los que las dos moléculas están adsorbidas químicamente es relativamente estrecha ya que las señales de desorción química de la timina aparecen a potenciales altos. Por su parte, los picos debidos a la desorción/adsorción de adenina apenas se modifican por la presencia de timina en disolución, posiblemente porque a los valores tan bajos de potencial a los que aparecen, la timina no se encuentra adsorbida químicamente sino más bien formando fases más o menos condensadas de moléculas adsorbidas físicamente.
119 -10 0 10 20 E vs SCE / V -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 I / µA cm-2 -10 0 10 -10 0 10 pH 7 pH 1 pH 11.5 Fig. 3.24 Voltagramas cíclicos estacionarios obtenidos con electrodos de Au(111) a 50 mV s -1 para disoluciones que contienen adenina 0.01 mM (- - -), timina 1mM (- - -) y mezcla de adenina 0.01 mM y timina 1mM (—) a los valores de pH indicados. A los distintos valores de pH estudiados en los experimentos en los que se comienza con adenina 0.01 mM adsorbida químicamente y se le adiciona timina 1 mM a un valor de potencial en el que ambas bases están adsorbidas químicamente los efectos observados son los mismos que los que se han descrito anteriormente.
120 La primera conclusión que se puede deducir de los voltagramas de la figura 3.24 es que tanto la timina como la adenina están adsorbidas químicamente de forma conjunta a los mismos potenciales a los que los están de forma individual sobre electrodos de Au(111). Por otro lado, las diferencias con el pH que se observan en los voltagramas cuando ambas bases están co-adsorbidas sobre la superficie electródica deben estar relacionadas con las diferentes formas tautoméricas de la timina adsorbidas a los diferentes valores de pH; como se ha descrito en apartados anteriores de este capítulo. 3.3.4 . Resultados y Discusión de los Espectros FT-IR de transmisión en disolución. Debido a que las interacciones de tipo Watson–Crick (WC) o de Hoogsteen (HG) entre las moléculas de timina y adenina implican la formación de puentes de hidrógeno entre ambas, los efectos que causan los enlaces de hidrógeno en los espectros de infrarrojos de estas dos moléculas constituyen un tema muy estudiado. Además las moléculas de timina y adenina también pueden interaccionar a través de puentes de hidrógeno con ellas mismas o con moléculas de disolvente, así los efectos que causan los puentes de hidrógeno se suelen estudiar normalmente por comparación de los espectros de las moléculas aisladas con los correspondientes espectros de las moléculas en fase líquida o sólida. 21,22 Estudios bibliográficos han propuesto que la timina policritalina 22 forma dos puentes de hidrógeno con otra molécula de timina siendo los átomos implicados C 2 =O 8 - --N 1 H y C 2 =O 8 ---N 3 H mientras que en fase acuosa predominan los puentes de hidrógeno con moléculas de agua (O 8 ---OH y O---NH). Los cálculos predicen que la formación de puentes de hidrógeno desplazan a mayor número de onda las señales de la timina asociadas a los modos normales de vibración de tensión de C 2 =O 8 y flexión de NH (ND) en comparación con el espectro individual de la timina. Los cálculos teóricos predicen 23 que cuando tiene lugar la interacción aislada entre timina y adenina a través de puentes de hidrógeno de tipo WC se produce el desplazamiento hacia el rojo de las señales de la timina en la región de 1750-1550 cm -1 , sin embargo en esta misma región las señales de la adenina sufren un desplazamiento hacia el azul. En la figura 3.25 se muestran los espectros de transmisión obtenidos en disoluciones de HClO 4 0.1M a pH 1 en H 2 O y D 2 O de mezclas de adenina 10 mM y timina 10 mM,
121 comparados con los de las correspondientes disoluciones 10 mM de cada base por separado. Se puede observar en la figura 3.25 que las señales en la región 1400-1800 cm -1 de la timina y la adenina en disoluciones de H 2 O y D 2 O no cambian significativamente al compararlo con los espectros de transmisión que contiene ambas bases aunque en D2O la señal de adenina debida a la vibración de tensión del anillo aromático a 1666 cm-1 disminuye en intensidad en presencia de timina (en disoluciones acuosas los resultados son menos precisos debido a que las señales de interés solapan con los modos normales de vibración de flexión del H 2 O). Parece que en disolución acuosa la distinción de puentes de hidrógeno entre pares de bases complementarios y/o entre cada una de las bases y el agua resulta prácticamente imposible. Número de onda / cm-1 1550160016501700 Absorbancia / u.a. 1700 a) b) 1666 D2O H2O 0.001 u.a. 1666 1628 0.001 u.a. Fig. 3.25 Región 1400-1800 cm -1 del espectro de transmisión en disoluciones que contienen adenina 10 mM (- - -), timina 1mM (- - -) y mezcla de adenina 10 mM y timina 1mM (—) a) D 2 O y b) H 2 O a pH 1 en disoluciones de HClO 4 0.1 M.
122 3.3.5. Resultados y Discusión de los Espectros FT-IRRA para la adenina y timina co-adsorbidas sobre Electrodos de Oro. 3.3.5.1. Espectros ATR-SEIRA en la Región Espectral 1300 a 1800 cm -1 . En los espectros de ATR-SEIRA en la región comprendida entre 1300-1800 cm -1 las señales más importantes para la adenina y las diferentes formas tautoméricas de la timina adsorbida sobre electrodos de oro corresponden a vibraciones en el plano molecular. En la figura 3.26 se muestran los espectros de ATR-SEIRA en disoluciones de D 2 O a pH 1 a distintos potenciales sobre películas nanoestructuradas de oro. A cada valor de potencial se presentan dos series de experimentos cada uno comenzando con una base diferente. De esta forma se pueden comparar los espectros de co-adsorción con el espectro individual de la base con la cual se ha comenzado el experimento. Para la región de potenciales comprendidos entre 0.3V vs SCE y 0.6V vs SCE de acuerdo con la figura 3.26 ambas bases del ADN se encuentran químicamente adsorbidas sobre la superficie del electrodo. En la figura 3.26a-c se representan los correspondientes espectros de ATR-SEIRAS a tres potenciales en esa región y se observa como las bandas de adsorción características del tautómero desprotonado en N 3 descritas en el apartado 3.3.5 de esta tesis y en la Tabla 2, desaparecen al añadir una disolución madre de adenina para obtener una concentración final en célula de 0.01mM. Este efecto es especialmente claro en la banda a 1585 cm -1 , correspondiente a las tensiones de los carbonilos C 2 O y C 4 O, ya que la banda a 1649 cm -1 (tensión de C 5 C 6 y flexión CH de timina) aparece a frecuencias muy próximas a la banda de adsorción de adenina a 1654 cm -1 correspondiente a la vibración de tensión del anillo que implica los enlaces C 5 C 6 y C 6 C 10 . No obstante, al deconvolucionar la banda a 1654 cm -1 que se obtiene en las disoluciones que contienen las dos bases se obtiene una sola banda gausiana-lorentziana con la misma semi-anchura que en el caso de los espectros registrados en disoluciones que solo contienen adenina, lo que confirma la desaparición de la señal a 1649 cm -1 asignada a la timina adsorbida. Además, la sustracción de los espectros registrados en disoluciones que solo contienen timina de los correspondientes espectros registrados en disoluciones de las dos bases, claramente muestra como bandas negativas la
123 desaparición de las señal a 1581 cm -1 (y hombro a 1567 cm -1 ) de los espectros registrados en disoluciones que solo contienen timina. 1450155016501750 0.7 V 1450155016501750 0.5 V 1450155016501750 0.4 V 0.02 u.a. 1581 1649 1650 1654 1654 T T + A A A + T T T + A A A + T 1646 1648 1651 1579 1648 Número de onda / cm-1 a) b) c) d) e) f) 1450155016501750 0.3 V 1450155016501750 0.1 V 1450155016501750 -0.1 V Número de onda / cm-1 g) h) i) T T + A A A + T T T + A A A + T 0.02 u.a. 1650 1648 1648 1644 1646 1642 j) l) Fig. 3.26 Espectros de ATR-SEIRA en la región de 1300-1800 cm -1 para disoluciones de adenina 0.01mM (- • - • -), timina 1mM (- • - • -), timina 1mM y adenina 0.01mM (—), adenina 0.01 mM y timina 1mM (—) adsorbidas sobre películas nanoestructuradas de oro en D 2 O a pH1 en HClO 4 y los potenciales indicados. Los espectros están referidos al electrolito soporte al mismo valor de potencial. Se incluyen también el espectro: (—) es la diferencia entre los espectros antes y después de la adicción de adenina y (- - -) es la diferencia entre los espectros antes y después de la adicción de timina.
124 En las figuras 3.26 d-f se comparan los espectros registrados en disoluciones que solo contienen adenina (0.01 mM) con los registrados en disoluciones que contienen las dos bases (0.01 mM de adenina y 1 mM de timina) a los mismos potenciales que en las figuras 25a-c, esto es, en la región de adsorción química de ambas bases. La comparación corrobora la ausencia de señales debidas a la timina adsorbida, a pesar de que los voltagramas indican dicha adsorción (los picos de desorción de la timina aparecen en los CVs a potenciales más bajos). Por otra parte, puede observarse que la señal original debida a la vibración de anillo de la adenina adsorbida (a 1650 cm -1 ) se desplaza ligeramente a frecuencias algo mayores (1654 cm -1 ) y aumenta en intensidad. La substracción de los correspondientes espectros permite claramente detectar el aumento de intensidad de esta señal. En las figuras 3.26 g-i y 3.26 j-l se realizan comparaciones similares entre los espectros registrados en presencia solo de timina y los registrados tras la adición de adenina a dicha disolución (Figs. 3.26g-i) o entre los registrados en presencia solo de adenina y los obtenidos tras la adición de timina (Figs. 3.26 j-l) a potenciales en los que la adenina está químicamente adsorbida pero no así la timina, que estaría formando estructuras fisisorbidas más o menos organizadas, pero con el plano molecular paralelo al electrodo. 11 Efectivamente, se comprueba en los espectros en disoluciones de timina la ausencia de señales IR activas (o son muy débiles) y en los espectros en disoluciones de las dos bases solo aparece la debida a la adenina. No obstante, el efecto de aumento de intensidad de la señal debida a la vibración del anillo de adenina adsorbida, cuando se agrega timina a la disolución, se puede apreciar aún a estos potenciales, solo que el aumento es menor. El aumento de la señal a 1651 cm -1 (y su ligero desplazamiento a frecuencias mayores) depende también de las concentraciones de las bases en disolución, además de los potenciales del electrodo. Así, en la figura 3.27 se muestra el efecto producido en los espectros de ATR-SEIRAS registrados en disolución de D 2 O a pH 1 y adenina 0.01 mM por las adicciones sucesivas de timina, a un potencial al que ambas bases se pueden adsorber químicamente. La adición hasta una concentración de timina de 0.01 mM produce un gran aumento de la señal a 1651 cm -1 , sin embargo, el incremento es menor en adiciones sucesivas hasta prácticamente alcanzarse la saturación que se alcanza aproximadamente para una concentración de adenina de 0.01 mM y de timina de 1 mM.
125 Número de onda / cm-1 1450155016501750 0.5 V 1651 0.02 u.a. A + T 0.001 mM / A A + T 0.01 mM / A + T 0.001 mM A + T 0.1 mM / A + T 0.01 mM A + T 1 mM / A + T 0.1 mM Fig. 3.27 Espectros de ATR-SEIRA en la región 1300-1800 cm -1 a 0.5V vs SCE para disoluciones de adenina 0.01 mM y timina desde 0.001 mM hasta 1mM co-adsorbida sobre electrodos nanoestructurados de oro en D 2 O a pH 1. Cada espectro de ATR-SEIRA está referido al correspondiente espectro con una concentración inferior de timina. Por otro lado se ha podido comprobar que al partir de disoluciones de adenina 0.1 mM adsorbida químicamente sobre la superficie del electrodo ya no se observa ningún efecto como los descritos para la figura 3.26 al adicionar timina 1 mM a un potencial de quimisorción de ambas bases, sugiriendo estos resultados que con estas concentraciones la adenina ya ha alcanzado la saturación de la superficie del electrodo. Los estudios comparativos de los espectros ATR-SEIRA de cada base con los obtenidos tras adiciones de la base complementaria se han realizado también en disoluciones
132 Fig. 3.32 Espectros de ATR-SEIRA en las regiones de 1640-1650 cm -1 y 1320-1390 cm -1 para disoluciones de adenina 0.01mM (- • - • -), adenina 0.01 mM y timina 1mM (—) adsorbidas sobre películas nanoestructuradas de oro en D 2 O a los valores de pH y potenciales indicados. Los espectros están referidos al electrolito soporte al mismo valor de potencial. El aumento observado de las bandas IRRAS de adenina adsorbidas en presencia de timina puede cuantificarse mediante el cálculo de las intensidades integradas. Para una banda de absorción obtenida con luz polarizada-p la correspondiente intensidad Número de onda /cm-1 13251375142516251675 x 5 1650 1315 0.02 a.u. x 5 1633 1384 ∆R / R0 x 5 1380 1639 0.66V pD 1 pD 7.5 pD 11 0.5V 0.1V
133 integrada, A p , viene dada por la ecuación (3), que ya fue utilizada anteriormente en el apartado 3.2.5.3 del presente capítulo para estudiar los cambios de orientación de los tautómeros N 1 y N 3 de timina con el potencial. A # ∝ Γμ × E # = Γ|μ| 〈E # 〉cos (θ) (3) Donde, como ya se ha dicho anteriormente, Γ es la concentración superficial de moléculas responsables de la absorción de la radiación de luz, θ es el ángulo entre el momento dipolar de la transición y el campo eléctrico del fotón que para la luz polarizada p tiene una dirección normal a la superficie del electrodo, |μ| es el módulo del momento dipolar de la transición y 〈E # 〉 es la intensidad cuadrática media del campo eléctrico para un haz de luz polarizada-p en la superficie de reflexión. Si se comparan las intensidades de dos señales que poseen distinta orientación de sus momentos de transición, como es el caso de las señales de la figura 3.32, se puede prescindir del efecto del potencial sobre la magnitud de la concentración superficial. Por tanto, el aumento de área de una señal p del espectro de la adenina adsorbida, como consecuencia de la coadsorción de la timina puede representarse por la relación entre las intensidades integradas correspondientes según la ecuación (4). + ,(-./01) + ,(-.) = 2 (-./01) 2 (-.) × 345 (6) (-./01) 345 (6) (-.) (4) Donde (θ) (+7) y (θ) (+789:) representan el exceso superficial de adenine en ausencia y en presencia de timina respectivamente y (θ) y Γ tienen los mismos significados físicos que en las ecuaciones 1. Por tanto, como ya se explicó en el apartado 3.2.5.3 el cambio en las intensidades de las bandas de adenina 0.01 mM en presencia de timina 1mM puede ser consecuencia de un aumento del exceso superficial o de un cambio en la orientación de las moléculas y, por tanto, en el ángulo entre el correspondiente momento dipolar de la transición y la dirección normal al electrodo. Para determinar la causa del incremento de intensidad de las bandas de adenina 0.01 mM en presencia de timina 1mM se representan en la figura 3.33 las intensidades integradas correspondientes a las bandas marcadas en la figura 3.32 a los tres valores de pH. En algunos casos ha sido necesario realizar la deconvolución de las bandas en bandas gausianas-lorentzianas para poder obtener la intensidad integrada de la señal de interés aislada del resto de bandas con las que solapan. En todas las condiciones
134 investigadas el aumento de las intensidades de las dos señales seleccionadas de la adenina adsorbida cuando se adiciona timina es del mismo orden, pero depende en gran medida el valor de pH de la disolución. A pH 7.5 la relación de áreas obtenidas en presencia y en ausencia de timina, para las señales a 1639 y a 1380 cm -1 está en torno a 4.5 a los potenciales a los que las dos bases están químicamente adsorbidas. Este efecto se ve más claramente en la banda a 1640 cm -1 ya que tiene una relación señal/ruido mayor. A pH 1 y 11 el factor de aumento es aproximadamente de 1.4 y 1.2 respectivamente. -0.4 0.0 0.4 1633 cm -1 1384 cm -1 E vs SCE / V -0.4 0.0 0.4 1639 cm -1 1380 cm -1 -0.4 0.0 0.4 AAd+Tm/AAd 1 3 5 1650 cm -1 1315 cm -1 a) b) pH 1 pH 7 pH 11 Fig. 3.33 Intensidades integradas en función del potencial correspondientes a la vibración en la región de 1640-1650 cm -1 (▲) y la región de 1320-1380 cm -1 (●) para disoluciones de adenina 0.001 mM y timina 1 mM, ambas relativas a la intensidad integrada de las mismas señales en disoluciones que contienen únicamente adenina 0.01mM, calculadas a partir de los espectros de ATR-SEIRA en D2O a los pH indicados Para un modo de vibración en el plano molecular el ángulo θ entre el vector del dipolo de transición asociada al modo normal de vibración y la dirección normal al electrodo se puede descomponer como el ángulo de inclinación del plano molecular α entre la dirección normal al electrodo y su proyección sobre el plano molecular y el ángulo de rotación entre el momento dipolar de la transición y la proyección de la normal al electrodo en el plano molecular, φ: 5 cos()= cos (;) × cos (<) (4)
135 El estudio cuantitativo de SNIFTIRS de la adsorción de adenina sobre electrodos de Au(111) en medio neutro, realizado previamente en el Grupo, permitió deducir que el ángulo asociado a la señal de 1640 cm -1 (θ 1640 ) es de 52º. Por tanto, el mayor aumento posible causado solamente por una reorientación de la molécula, de acuerdo con la ecuación 4 sería aproximadamente 2.5 si la molécula cambia su orientación de tal manera que el ángulo cambia de 52º a 0º, es decir, totalmente normal al electrodo, que supondría un ; =>?@ = < =>?@ = 0 . Este aumento teórico es claramente inferior a lo observado experimentalmente en disoluciones neutras. Además, los momentos dipolares de las transiciones asociadas a las bandas IRRAS analizadas de adenina en medios neutros a 1640 y 1380 cm -1 están orientados dentro del plano molecular con una diferencia entre ellos de 85º. 5 Por tanto, si se supone que como consecuencia de la interacción con la timina φ 1640 disminuye hasta adoptar la dirección próxima a la normal al electrodo el ángulo de rotación asociado a la otra banda de vibración, φ 1380 , debe aumentar poniéndose más paralelo a la superficie del electrodo y contribuyendo negativamente al aumento de la intensidad integrada de la correspondiente banda IRRAS. Por tanto el aumento de las señales de adenina en presencia de timina en medios neutros sugiere un aumento del exceso superficial de adenina aunque no se puede descartar una reorientación de la molécula de adenina cuando está adsorbida en presencia de timina No obstante, no se puede descartar que exista un cambio en la orientación de la adenina adsorbida sobre oro al añadirle timina. Aunque el hecho de que las dos señales (1640 y 1380 cm -1 ) sólo es compatible con un cambio en el ángulo de inclinación del plano molecular, θ, que es común para todas las señales en el plano Por otra parte cabe observar que el aumento de las señales a 1640 y 1380 cm -1 tiene lugar no sólo a los potenciales a los que las dos bases están adsorbidas químicamente sino también a los potenciales a los que la timina está adsorbida físicamente, aunque el aumento de la intensidad es a pH ácidos y básicos es menor. 3.3.5.2. Espectros ATR-SEIRA en la Región Espectral 2800 a 3900 cm -1 . Con el fin de completar el estudio espectroelectroquímico de la co-adsorción de adenina y timina se ha estudiado el comportamiento de las señales asociadas a las vibraciones de tensiones simétricas y asimétricas de NH 2 de adenina en presencia de la base complementaria timina, así como la co-adsorción con el agua. En la figura 3.34 se
136 representa los espectros de ATR-SEIRA en disoluciones de H 2 O a pH 1 a distintos potenciales sobre películas nanoestructuradas de oro para el experimento comenzando por Adenina 0.01mM sobre la que se añade una concentración de Timina 1mM. Se incluyen también los espectros de ATR-SEIRA en disoluciones de timina 1 mM adsorbidas sobre electrodos de oro al mismo valor de pH aunque obtenidos en otro experimento. Número de onda / cm-1 30003250350037503000325035003750 0.5 V 0.4 V a) b) A A + T A A + T 3000325035003750 0.3 V Número de onda / cm-1 3000325035003750 0.1 V 3000325035003750 -0.1 V d) e) c) A A + T A A + T 3611 3201 3350 3202 3356 3215 3345 3201 3358 3216 3344 3204 3223 3360 3340 3204 3218 3359 3592 0.002 u.a. TT 3355 3342 3201 3598 3585 3340 T Fig. 3.34 Espectros de ATR-SEIRA en las regiones de 2800-3900 cm -1 para disoluciones de adenina 0.01mM (- • - • -), adenina 0.01 mM y timina 1mM (—) adsorbidas sobre películas nanoestructuradas de oro en H 2 O a pH 1 y a los potenciales indicados. Los espectros están referidos al electrolito soporte al mismo valor de potencial. A pH 1 se observa cómo se describió en apartado 3.2.5.2 de este capítulo que la timina al adsorberse química mente desplaza a las moléculas de agua de la superficie . Los espectros de ATR-SEIRAS de la adenina 0.01 mM de la figura 3.34 a pH presentan dos señales positivas en todo rango de potenciales a c.a 3345 y 3204 cm -1 que se asignan a los modos normales de vibración asimétricos y simétricos del grupo amino. 8,24 Al adicionar timina 1mM a disoluciones que contenían adenina 0.01 mM adsorbida químicamente las señales asociadas con los modos normales de vibración simétricos y
137 asimétricos del grupo amimo se desplazan hacia el azul c.a 13 y 15 cm -1 respectivamente y aparece una nueva señal como un hombro a 3590 cm -1 . Esta señal es característica de υOH libre, de moléculas de agua co-adsorbidas. 25,26 Por tanto, como consecuencia del proceso de co-adsorción parece que la interfase se reorganiza permitiendo la entrada de más moléculas de agua. Finalmente el leve desplazamiento hacia el azul descarta la posibilidad de formación de puentes de hidrógeno entre la timina y el grupo amino de la adenina, ya que, tal y como se ha descrito en la bibliografía, este tipo de interacción origina un desplazamiento hacia el rojo y en una extensión de aproximadamente 200 cm -1 . 27 La asociación de las bases complementarias en la interfase puede deberse en gran medida al apilamiento de los anillos aromáticos (π-staking) al igual que ocurre en el ADN. 28–30 Existen fundamentalmente tres tipos de interacción de tipo π-staking (Fig. 34) 31 en función de la disposición relativa de los anillos aromáticos: eclipsados desplazados (a) la geometría face-to-face o de tipo sándwich; (b) desplazamiento paralelo y (c) edge-to-face o en forma de T Fig. 3.35 Posibles interacciones de tipo π-staking entre anillos aromáticos De acuerdo con los resultados espectroelectroquímicos obtenidos cuando ambas bases están en la interfase a pH 1 la timina parece adoptar una disposición paralela a la superficie del electrodo mientras que la adenina se sitúa perpendicularmente. Estos resultados sugieren la posibilidad de interacciones de tipo T-edge to face entre bases complementarias. Se han realizado estudios similares a pH 7.5 y 11 que se muestran en las figuras 3.36 y 3.37. A ambos valores de pH se observan efectos similares en las señales de la regio 3200-3600 cm -1 cuando las dos bases están co-adsorbidas a los observados a pH 1.
138 3000325035003750 Número de onda / cm-1 3000325035003750 3000325035003750 Número de onda / cm-1 30003250350037503000325035003750 0.5 V 0.4 V a) b) A A + T A A + T 0 V -0.4 V d) e) A A + T A A + T 3347 3208 3360 3221 3207 3221 3355 3360 3349 3214 3365 3224 3344 3357 3211 3383 3232 3368 c) 0.2 V 3249 3211 3360 3223 3451 3451 0.002 u.a 3261 3249 3448 3245 T TT 3436 3276 Fig. 3.36 Espectros de ATR-SEIRA en las regiones de 2800-3900 cm -1 para disoluciones de adenina 0.01mM (- • - • -), adenina 0.01 mM y timina 1mM (—) adsorbidas sobre películas nanoestructuradas de oro en H 2 O a pH 7.5 y a los potenciales indicados. Los espectros están referidos al electrolito soporte al mismo valor de potencial.
139 Fig. 3.37 Espectros de ATR-SEIRA en las regiones de 2800-3900 cm -1 para disoluciones de adenina 0.01mM (- • - • -), adenina 0.01 mM y timina 1mM (—) adsorbidas sobre películas nanoestructuradas de oro en H 2 O a pH 11 y a los potenciales indicados. Los espectros están referidos al electrolito soporte al mismo valor de potencial. 3.3.6. Conclusiones Los resultados de transmisión de timina 10mM y adenina 10mM en H 2 O y D 2 O a pH 1 en comparación con los espectros de las bases individuales han permitido concluir que en disoluciones acuosas la distinción de los puentes de hidrógeno entre pares de bases complementarias y/o entre casa una de las bases con el agua parece que resulta prácticamente imposible. Sin embargo se han podido estudiar las interacciones entre la timina y la adenina adsorbidas sobre superficies de oro nanoestructuradas a pH 1, 7.5 y 11 por comparación de los espectros de ATR-SEIRAS de las bases co-adsorbidas con los espectros de las bases individuales en las mismas condiciones. El aumento de la intensidad de la señales de adenina 0.01mM en presencia de timina 1 mM parecen implicar cambios en la organización de las dos bases respecto a la superficie del electrodo. Además en medio neutro se ha encontrado que este aumento puede estar relacionado con un aumento un 3000325035003750 Número de onda / cm-1 3000325035003750 3000325035003750 Número de onda / cm-1 3000325035003750 0.1 V 0 V a) b) A A + T -0.2 V -0.4 V d) c) A A + T 3370 3378 3224 3383 3221 3356 3385 3453 3358 3225 3384 3236 3221 3391 3480 0.005 u.a 3208 T 3419 3426 A A + T T T A A + T T
140 aumento del exceso superficial de adenina aunque no se puede descartar un aumento de la inclinación del plano molecular de la adenina cuando está adsorbida en presencia de timina. Por otro lado la pérdida de las señales de timina 1 mM en presencia de adenina 0.01 mM se ha explicado como una reorientación de la molécula de timina en la que esta adopta una disposición más paralela respecto al electrodo. Esta disposición además podría favorecer la formación de puentes de hidrógeno ya que los átomos de timina implicados en esta interacción quedarían libres al no estar interaccionando con la superficie electródica. Sin embargo el análisis de las señales en la región 3600-3000 cm - 1 ha permitido confirmar que no existe interacción por puentes de hidrógeno entre el grupo amino de la adenina y la timina ya que las señales asociadas a los modos de vibración de NH 2 mantienen su posición en presencia de timina. Pero el hecho de que cantidades muy pequeñas de cada base (en el nivel de la submonocapa) induzca cambios significativos en los espectros de su base complementaria, incluso al adsorberse a partir de disoluciones a mayor concentración de la base complementaria sugiere que la co-adsorción de adenina y timina es un proceso cooperativo en el que se pueden ver implicados mecanismos de interacción de tipo dipolo-dipolo o π-staking. 3.4 Bibliografía 1. Broomhead, J. M. The structures of pyrimidines and purines. IV. The crystal structure of guanine hydrochloride and its relation to that of adenine hydrochloride. Acta Crystallogr. 4, 92–100 (1951). 2. Prado, C., Prieto, F., Rueda, M., Feliu, J. & Aldaz, A. Adenine adsorption on Au(1 1 1) and Au(1 0 0) electrodes: Characterisation, surface reconstruction effects and thermodynamic study. Electrochim. Acta 52, 3168–3180 (2007). 3. Vaz-Domínguez, C. et al. Electrochemical STM study of the adsorption of adenine on Au(111) electrodes. Electrochem. commun. 35, 61–64 (2013). 4. Rueda, M., Prieto, F., Rodes, A. & Delgado, J. M. In situ infrared study of adenine adsorption on gold electrodes in acid media. Electrochim. Acta 82, 534–542 (2012). 5. Prieto, F., Su, Z., Leitch, J. J., Rueda, M. & Lipkowski, J. Quantitative Subtractively Normalized Interfacial Fourier Transform Infrared Reflection Spectroscopy Study of the Adsorption of Adenine on Au(111) Electrodes. Langmuir 32, 3827–3835 (2016). 6. Álvarez-Malmagro, J., Prieto, F., Rueda, M. & Rodes, A. In situ Fourier transform infrared reflection absorption spectroscopy study of adenine adsorption on gold
141 electrodes in basic media. Electrochim. Acta 140, 476–481 (2014). 7. Prado, C., Navarro, I., Rueda, M. & Franc, H. Kinetics of condensation of adenine at the mercury electrolyte interface. J. Electroanal. Chem. 500, 356–364 (2001). 8. Giese, B. & McNaughton, D. Surface-enhanced Raman spectroscopic and density functional theory study of adenine adsorption to silver surfaces. J. Phys. Chem. B 106, 101–112 (2002). 9. Wierzchowski, K. L., Litońska, E. & Shugar, D. Infrared and ultraviolet studies on the tautomeric equilibria in aqueous medium between monoanionic species of uracil, thymine, 5-fluorouracil, and other 2,4-diketopyrimidines. J. Am. Chem. Soc. 87, 4621– 4629 (1965). 10. Roelfs, B. et al. Adsorption of thymine on gold single-crystal electrodes. J. Phys. Chem. B 101, 754–765 (1997). 11. Haiss, W. et al. In-situ infrared spectroscopic studies of thymine adsorption on a Au(111) electrode. J. Electroanal. Chem. 454, 107–113 (1998). 12. Prieto, F., Alvarez-Malmagro, J., Rueda, M. & Orts, J. M. M. Tautomerism of adsorbed Thymine on golg electrodes: an in situ surface-enhanced infrared spectroscopy study. Electrochim. Acta 201, 300–310 (2016). 13. Irikura, K. K., Johnson, R. D. & Kacker, R. N. Uncertainties in scaling factors for ab initio vibrational frequencies. J. Phys. Chem. A 109, 8430–8437 (2005). 14. Chandra, A. K., Nguyen, M. T., Uchimaru, T. & Zeegers-Huyskens, T. Protonation and deprotonation enthalpies of guanine and adenine and implications for the structure and energy of their complexes with water: comparison with uracil, and Cytosine. J. Phys. Chem. A 103, 8853–8860 (1999). 15. Leś, A., Adamowicz, L., Nowak, M. J. & Lapinski, L. The infrared spectra of matrix isolated uracil and thymine: An assignment based on new theoretical calculations. Spectrochim. Acta Part A Mol. Spectrosc. 48, 1385–1395 (1992). 16. Chandra, A. K., Nguyen, M. T. & Zeegers-Huyskens, T. Theoretical Study of the Interaction between Thymine and Water. Protonation and Deprotonation Enthalpies and Comparison with Uracil. J. Phys. Chem. A F. Full J. TitleJournal Phys. Chem. A 102, 6010–6016 (1998). 17. Zamlynny, V. & Lipkowski, J. in Advances in Electrochemical Science and Engineering (eds. Alkire, R. C., Kolb, D. M., Lipkowski, J. & Ross, P.) 315–376 (Wiley-VCH Verlag GmbH, 2006). doi:10.1002/9783527616817.ch9 18. Rueda, M., Prieto, F., Álvarez-malmagro, J. & Rodes, A. Electrochemistry Communications Evidences of adenine – thymine Interactions at gold electrodes interfaces as provided by in-situ infrared spectroscopy. Electrochem. commun. 35, 53–56 (2013).
148 F B $ $ $ − B,- = )?<D $ $ $ $ )? (8a) F C $ $ $ − C,- = )?<E $ $ $ $ )? − : C $ $ $ (8b) Donde F=G∙I es la variable transformada, G=−1 K ? es la unidad compleja y I es la frecuencia angular. Las condiciones de contorno iniciales para las ecuaciones anteriores son: B,- = B∗ (concentración total de ∗ + A ∗ en el seno de la disolución y C,- =0. Teniendo en cuenta estas condiciones iniciales es posible obtener las soluciones generales para las ecuaciones (8a) y (8b): B $ $ $ =N @ OPQR( S T , K ? PU+N OPQR−( S T , K ? PU+ <D ∗ S (9a) C $ $ $ =V @ OPQR( SWX T , K ? PU+V OPQR−( SWX T , K ? PU(9b) Las constantes de integración N @ , N , V @ y V se obtienen de las condiciones en el seno de la disolución (suponiendo difusión semiinfinita) y en la superficie: P=∞Z B = [∗ →N @ =0 C =0→V @ =0 ] P=0 ^ _ ` _ a b8 B $ $ $ 8Pc =b8 d 8Pc =e $ $ $ $ $ →N =−e $ $ $ $ $ (F >, K ? b8 C $ $ $ 8Pc −b8 d 8Pc =−e $ $ $ $ $ →V =e $ $ $ $ $ bF+ < >c K ? f _ g _ h Por tanto, las soluciones particulares se convierten en: B $ $ $ =−e $ $ $ $ $ ( S T , K ? + B∗ (10a) C $ $ $ =e $ $ $ $ $ ( SWi T , K ? (10b) Deshaciendo el cambio de variables es posible obtener la expresión para ∆ , $ $ $ $ $ $ $ $ $ :
149 ∆ $ $ $ $ $ =−∆e $ $ $ $ $ $ R kK kK@ ( S T , K ? + @ kK@ ( SWl T , K ? U (11) con m n = on opn siendo la constante de equilibrio de la etapa química. Por otro lado, la transformación de Laplance de la ecuación (1) proporciona la relación entre ∆q r $ $ $ $ $ y ∆2 34 : ∆q r $ $ $ $ $ =s n ∆2 34 $ $ $ $ $ $ $ (12) Así la sustitución de las ecuaciones (11) y (12) en la ecuación (4) permite derivar la expresión para la impedancia de adsorción de la ecuación (2), como: =t +. uF+v F @ (13) Donde t ,. v son parámetros independientes de la frecuencia, denominados resistencia de adsorción, coeficiente de Warburg de adsorción y capacidad de adsorción, respectivamente, y cuyo significado viene expresado por las siguientes ecuaciones: t @ =( )*+ ) , # ( )w&' )# , : (14a) . =t ( )w&' )< , ,# (14b) v @ =t ( )w&' ) , :,# (14c) La función G(s) viene dada por la ecuación: uF=x kK kK@ F K ? + @ kK@ F+ < K ? y (15) Esta expresión para uF tiene la misma dependencia con la frecuencia que la denominada impedancia Gerischer, 12,13 deducida para el proceso de transferencia de un electrón acoplado con una etapa química previa homogénea. La variación de G(s) con la frecuencia depende del valor relativo de k c en comparación con los valores de la frecuencia (incluida en s). En el caso de un proceso de adsorción sin etapa química previa, G(s) es directamente proporcional a s 1/2 .
150 La impedancia interfacial incluye, además, la impedancia correspondiente al proceso de la carga de la doble capa, a exceso superficial constante, caracterizado por una corriente capacitativa, z 4{ , dada por: z 4{ =( )*+ )# , 45 4| =} 4{,45 4| (16) La densidad de corriente de la doble capa es aditiva a la densidad de corriente de adsorción, así que la impedancia de la doble capa Z dl , se puede deducir fácilmente de la ecuación (16): ~ 4{ =0} 4{,qr s1 n (17) La combinación en paralelo de las impedancias de adsorción y de doble capa proporciona la impedancia electródica o interfacial: ~ •{ =€•‚ 34 +ƒ 34 „s+} 34 s n … n +} 4{,qr s† n (18) La ecuación (18) es la expresión general para la impedancia interfacial de un proceso de adsorción acoplado a una etapa química previa. La ecuación deducida para el proceso de adsorción en ausencia de etapa química acoplada se puede obtener de la expresión general haciendo „s=s n ‡ : ~ •{ =ˆ‰‚ 34 +ƒ 34 s n/‡ +} 34 s n ‹ n +} 4{,qr sŒ n (19) Esta situación se puede obtener a partir de la más general, ecuación (18), en el caso de que la constante de equilibrio de la etapa química es muy alta m n ≫n. Naturalmente se trata de un caso trivial en el que el equilibrio químico previo estaría desplazado hacia la obtención de A en disolución. A parte de este caso trivial se pueden distinguir dos casos límites dependiendo de los valores relativos de s y de o Ž en los que la influencia de la frecuencia en la impedancia de adsorción es idéntica a la influencia de la frecuencia para la impedancia de adsorción de un proceso de adsorción sin etapa química previa.
151 En el límite de altas frecuencias que se aplica si s≫o } la función uF se simplifica a F K ? . Por tanto, la impedancia de adsorción tiene la misma dependencia con la frecuencia que presente en ausencia de la etapa química previa: •• =t +. F K ? +v F @ (20) En el límite de bajas frecuencias, cuando F≪ < , es posible simplificar la expresión de G(s), de forma que la expresión de la impedancia de adsorción queda como: ’• =t +. WlpK ? kK@ +. kK kK@ +v F @ (21) Esta ecuación proporciona la misma dependencia con la frecuencia que la ecuación 20 pero con valores aparentes para el coeficiente de Warburg y la resistencia de adsorción. El coeficiente de Warburg aparente incluye el coeficiente de Warburg verdadero y la constante de equilibrio de la etapa química: . [[ =. kK kK@ (22a) La resistencia de adsorción aparente incluye, además de la resistencia de adsorción verdadera, las constantes de equilibrio y de velocidad de la etapa química de acuerdo con: t [[ =t +. WlpK ? kK@ (22b) 4.3 Experimental 4.3.1 Reactivos células y electrodos Se prepararon disoluciones de electrolito a distintos valores de pH utilizando como reactivos HClO 4 , NaF y NaOH (ultrapura) y como disolvente agua ultrapura obtenida mediante un sistema purificador (Elgastat y MilliQ). Se han realizado medidas de impedancia en función de la frecuencia y del potencial de continua usando un electrodo de Au(111) en disoluciones de adenina (SigmaAldhrich®) de concentración 1 mM en los diferentes electrolitos soporte. La concentración de trabajo de adenina se consiguió por adición de la cantidad adecuada de
152 una disolución stock 10 mM. Las disoluciones se desoxigenaron con argón de alta pureza durante 20 minutos y después se mantuvo la presión de gas por encima de la disolución mientras se realizaban las medidas. Las demás condiciones de pureza de las disoluciones, de tratamiento del electrodo de trabajo, electrodo auxiliar y electrodo de referencia (Hg/Hg 2 SO 4 ) fueron las mismas que las descritas en el capítulo 2. 4.3.1 Procedimiento experimental Las medidas electroquímicas se realizaron con un sistema electroquímico multifuncional (IviumStat), de Ivium Technologies equipado con un analizador de respuesta de frecuencia. Como la adsorción de la adenina induce la pérdida de la reconstrucción de la superficie del electrodo de Au(111) obtenida durante el tratamiento a la llama 14 antes de cada media de impedancia se realizó un barrido anódico a 10 mV/s hasta un potencial mayor que el correspondiente a la adsorción química de la adenina a cada valor de pH (E cto ) y se mantuvo a ese valor de potencial durante un tiempo largo (5 minutos) para garantizar la pérdida de la reconstrucción de la superficie electródica. La impedancia a cada potencial se midió a frecuencias que varían desde 20 a 7500 Hz por aplicación de una sola perturbación de corriente alterna con una amplitud de 10mV. El tiempo de equilibrio a cada uno de los potenciales fue de 1s, que como ya se había estudiado en el Grupo al realizar el análisis termodinámico de la adsorción en medio neutro 14 era tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio de adsorción pero insuficiente para que a los potenciales más negativos tenga lugar la formación de dominios reconstruidos de la superficie del electrodo de oro de forma significativa. Los valores de impedancia en función de la frecuencia a cada potencial se obtuvieron por dos procedimientos diferentes en relación a la secuencia de perturbaciones de potencial aplicada sobre el electrodo, esquematizados en la figura 3. 1. Procedimiento acumulado: Este procedimiento se basa en medir la impedancia de la célula a potenciales de continua que se modifican en dos series secuenciales en direcciones opuestas. Así primero se realizó el barrido hacia potenciales inferiores y a continuación hacia potenciales más altos intercalando los potenciales. Este procedimiento permite comprobar si la reconstrucción
153 electroquímica de la superficie electródica de Au(111) que tiene lugar a bajos valores de potenciales afecta en las medidas de impedancia. (Fig. 1a), dado que el posible efecto se iría acumulando durante las medidas realizadas a potenciales bajos. 2. Procedimiento de punto a punto: la impedancia se mide igualmente en dos series intercaladas de potencial a lo largo de la onda de adsorción de la adenina a cada valor de pH, salvo que antes de aplicar cada potencial de medida (E medida ), se le aplica al electrodo un pre-tatamiento, en el que se mantiene durante 60s un potencial alto, al cual la adenina se adsorbe químicamente y en el que se garantiza la naturaleza no reconstruida de la superficie del electrodo (Potencial de contacto, E cto ). El ciclo de pasos E medida /E cto se repite para cada frecuencia hasta que se ha medido el espectro total de impedancia a cada potencial de medida. (Fig. 4.3b) Fig. 4.3Perturbaciones de potencial de continua en función del tiempo empleados en las medidas de EIS según los procedimientos: a) acumulado y b) punto a punto 4.4 Resultados 4.4.1. Curvas de pseudocapacidad frente al potencial La figura 4 representa los valores de pseudocapacidad, v S =0I ´´ 1 @ a 30Hz, frente al potencial obtenidos experimentalmente para la adosrción de adenina 1mM en medio básico utilizando el procedimiento de potenciales acumulados y el de punto a punto. 40 mV 5 min 1s E t 1 min Ecto. 40 mV 5 min 1s E t
154 Las curvas v S frente a ! en la figura 4.4 son coincidentes a potenciales mayores de - 0.4V vs SCE , sin embargo presentan diferencias marcadas a potenciales menores dependiendo del procedimiento de medida que se utilice. El procedimiento de punto a punto proporciona una excelente intercalación entre los datos obtenidos en dos barridos consecutivos en direcciones opuestas, confirmando que el pre-tratamiento al potencial de contacto, E cto , garantiza la superficie no-reconstruida del electrodo, antes de cada medida de impedancia. Sin embargo, los valores de v S obtenidos con el procedimiento acumulado claramente se desvían de las gráficas obtenidas con el procedimiento de punto a punto a los potenciales alrededor del máximo de la curva y muestra una clara histéresis entre los barridos en el sentido de los potenciales altos y en el sentido de los potenciales bajos. E vs SCE/V -0.6 -0.4 -0.2 0.0 Cs/µF cm-2 0 50 100 150 200 250 Fig. 4.4 Curvas v S vs! medidas a 30 Hz para un electrodo de Au(111) en contacto con una disolución de Adenina 1mM en NaOH/ NaF 0.3 M a pH 12 empleando diferentes procedimientos de medidas; punto a punto desde -0.1 V hasta -0.54V vs SCE con E cto = 0V vs SCE (círculos rellenos) y la vuelta desde -0.52 V vs SCE hasta -0.32 V vs SCE (círculos huecos). Procedimientos de acumulados desde 0V vs SCE hasta -0.6V (cuadros rellenos) y la vuelta desde -0.58V vs SCE hasta -0.02V vs SCE (cuadros huecos)
155 Esto sugiere que la reconstrucción electroquímica tiene lugar mientras se barre hacia la región de potenciales negativos durante la medida. El mismo efecto se ha encontrado a los otros valores de pH investigados. Por lo tanto, todos los resultados mostrados de aquí en adelante han sido realizados por el método de punto a punto. La influencia del pH en las curvas de pseudocapacidad frente al potencial obtenido a dos valores de frecuencias (30 y 938 Hz) se muestra en la figura 5 para una concentración de adenina 1mM en disolución. Se observa que el máximo de pseudocapacidad se desplaza desde -0.02 V hasta -0.38 V vs SCE cuando el pH se modifica desde 1 hasta 7.5. A pH 12 el máximo de v S se desplaza solamente 0.06 V vs SCE , con respecto al de pH 7,5 (hasta -0.44 V vs SCE ). E vs SCE / V -0.5 -0.3 -0.1 0.1 Cs / µF cm-2 0 50 100 150 200 250 pH 1 pH 7.5 pH 12 Fig. 4.5 Curvas v S vs ! medidas a 30 Hz (símbolos huecos) y 998 Hz (símbolos rellenos) con el procedimiento punto a punto en dos series intercaladas de potenciales para la adsorción de adenina 1mM sobre electrodos de Au(111) en disoluciones a pH 1 (triángulos), pH= 7.5 (cuadrados) y pH=12 (círculos) En la figura 4.5 también se puede observar una clara dependencia de v S con la frecuencia a los potenciales alrededor del máximo. Al aumentar la frecuencia los valores de capacidad del pico disminuyen y el máximo se desplaza ligeramente hacia
156 potenciales menores. Sin embargo a valores de potencial mayores que el inicio de la adsorción de la adenina la dependencia de la pseudocapacidad con la frecuencia es insignificante. Esta dispersión de la pseudocapacidad con la frecuencia, que implica una desviación del comportamiento de un circuito RC, se puede cuantificar utilizando un elemento constante de fase (CPE), que tiene un valor de impedancia de :B# =VGI ” donde V y • (que toma valores de 0 a 1) son parámetros independientes de la frecuencia. Para un comportamiento del tipo RC ideal el parámetro α del CPE toma un valor de 1. El CPE tradicionalmente se atribuye a las rugosidades superficiales, heterogeneidades o los procesos faradaicos debidos a las impurezas. En la figura 4.6 se representan los valores de α obtenidos a diferentes valores de pH frente al potencial. Se puede observar que α claramente se desvía del valor de 1 en la región de potenciales correspondientes al pico de capacidad. El valor más bajo de α se obtiene a pH 12. E vs SCE / V -0.7 -0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 α 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 pH 7.5 pH 7.5 pH 1 pH 1 pH 12
157 Fig. 4.6 Representación gráfica de los valores del parámetro •del CPE en función del potencial para la adsorción de adenina 1mM sobre electrodos monocristalinos de Au(111) a los valores de pH indicados (símbolos). Los resultados para el electrolito soporte (líneas) se incluye para la comparación. Por el contrario a potenciales menores a los del pico de capacidad o a cualquier potencial en ausencia de adenina los valores que se obtienen para α están próximos a 1, por lo que la dispersión de la capacidad con la frecuencia en estas condiciones se puede despreciar. Solamente los valores de • obtenidos en ausencia de adenina en medio ácido son algo más bajos (alrededor de 0.9) a los potenciales superiores a los del pico de adsorción de la adenina, probablemente debido a la adsorción específica de los aniones del electrolito soporte a los potenciales altos, pero las diferencias en los valores de α son aún significativas en presencia de adenina. Estos hechos y la homogeneidad de la superficie del electrodo de Au(111) permite descartar que la dispersión de la frecuencia esté causada por rugosidad o heterogeneidad. Por otra parte, el procedimiento punto a punto evita las interferencias debidas a los fenómenos de reconstrucción / pérdida de la reconstrucción inducidos por el potencial. Además, debido a las estrictas condiciones de limpieza no debe ocurrir ningún proceso faradaico en las condiciones experimentales. Por lo tanto, la dispersión de la capacidad con la frecuencia debe ser atribuida a los efectos cinéticos del proceso de adsorción de adenina, así que se han analizado los datos de impedancia para el proceso de adsorción de la adenina en concordancia con el modelo cinético de adsorción. 4.4.2 Análisis en función de la frecuencia La impedancia interfacial se puede obtener restando a la impedancia de la célula medida experimentalmente, <–— , el valor de la resistencia óhmica del electrolito, t S , que se obtiene a cada potencial del valor de la componente real de la impedancia de la célula a altas frecuencias. El comportamiento de la admitancia interfacial, Y el , con la frecuencia es más sensible que el comportamiento de la impedancia a los valores de los parámetros cinéticos y termodinámicos de la adsorción. ˜ –— = @ ™lš›œi =v —, GI+xt +. GI K ? +v GI @ y @ (23) Los diagramas de Nyquist de las componentes real e imaginaria de la admitancia normalizada frente a la frecuencia, •š› ´ ž vs •š› ´´ ž , donde ˜ –— ´ e ˜ –— ´´ son las componentes real e imaginaria de la admitancia, respectivamente, proporcionan una visión global sobre el
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262 Capítulo 7 Conclussions/ Conclusiones
263 7.1 Conclusions The first part of this thesis has covered the study of the individual adsorption of DNA bases on gold electrodes and the co-adsorption of complementary bases by a combination of electrochemical and “in situ” spectroscopic methods with the support of DFT calculations. The main conclusions obtained are: Regarding to the adsorption of adenine on gold electrodes from basic solutions - The in-situ FT-IRRAS experiments in basic D 2 O solutions, at pH values significantly higher than the pK a2 of adenine, have revealed the adsorption of the anionic adenine form, AdD 2- , with somewhat different spectral characteristics than those of the uncharged adenine form, AdD 3 . The intense ring-stretching band in the spectral region 1600-1650 cm -1 for the anionic form is red-shifted with respect to the corresponding signal for AdD 3 and is more intense and narrower. - The high resolution and sensitivity of the ATR-SEIRAS experiments allows the deconvolution of the mixed bands due to the ring stretching signals of the two co-adsorbed adenine forms from solutions with pH values ranging from 8 to 11. From the relative normalized area of the two signals resulting from the deconvolution the pKa 2 value of adsorbed adenine was determined. The obtained value of 9.8 is the same as that reported for adenine in solution, independently of the adsorption potential. This result confirms the model previously proposed for adenine adsorption on gold electrodes, in which the atoms involved in the bonding with the metal are the nitrogen of the amino group, N 10 , and the nitrogen N 1 (or N 7 ) of the ring, but not the nitrogen N 9 of the ring, which is involved in the second acid-base equilibrium of adenine. - The comparison of the spectra obtained in H 2 O solutions at pH values ranging from 1 to 11 shows that co-adsorption of water molecules of the supporting electrolyte take place only in acid media. Regarding to the adsorption of thymine on gold electrodes - -ATR-SEIRA in situ spectroelectrochemical experiments of adsorbed thymine at pH 1, 7 and 12 in D 2 O and H 2 O media have allowed us to analyse the tautomerism of the adsorbed thymine anionic forms as a function of pH. The
264 comparison of the spectra recorded at high potentials in the chemisorption regions with the respective spectra of thymine in solution at different pHs indicates that the species adsorbed from acid and neutral media are others than the neutral thymine form existing in solution at pH bellow the pK a value. Deprotonation of thymine coupled to the adsorption process is then concluded, based also on experimental electrochemical evidences even at pH values very much bellow the pK a value. The resulting anionic thymine forms can be the N 1 and/or the N 3 tautomers. - -The assignment of the signals in the 1300-1800 cm -1 spectral region in the light of DFT calculations for the individual deuterated and non-deuterated molecules and for the same adsorbed molecules on gold surfaces indicate that the N3 tautomer is the predominant adsorbed species in acid media while the adsorbed N 1 tautomer predominates in the adsorption from basic media, but both species can be distinguished in the adsorption at pH 7. - -The influence of the electric field on the orientations and interaction sites of the adsorbed molecules with the metal have been inferred from the analysis of the relative intensities of the characteristic CH stretching signals in the 2800-3300 cm -1 spectral region. It is concluded that the N3 tautomer molecule probably rotates modifying the interaction sites from only the C 2 O group at low potentials in the chemisorption region to include also the N 3 atom and the C 4 O group as the potential is increased to finally adopt the chemically more stable configuration and the most favourable alignment of the permanent dipole moment of the molecule with the electric field. However, the N1 tautomer molecule probably interacts with the metal in all the adsorption potential region by the N 1 atom and the C 4 O group, in accordance with the most stable configuration provided by the calculations and also with the electrostatic interactions with the electric field, as the permanent dipole moment of the molecules is almost aligned with the electric field in this configuration. Only slight rotations of the molecular plane with the electric potential are proposed. Regarding the co-adsorption of adenine and thymine on gold electrodes - -The effects of the presence of the complementary base on the adsorption of adenine and thymine has been studied at three pH values, 1, 7 and 11.6, by voltammertic and in situ ATR-SEIRAS measurements.
265 - -The analysis of the voltammetric results and the “in situ” ATR-SEIRA spectra of adsorbed thymine in the absence and in the presence of adenine permits to conclude that the adsorbed thymine changes its orientation relative to the electrode , from normal to parallel, when a small concentration of adenine is present in solution. - -The ATR-SEIRAS bands of adsorbed adenine exhibit an enhancement in the presence of co-adsorbed thymine. This amplification suggests that adenine adopts a more upright orientation of the molecular plane. However, to explain quantitatively the enhancement of the signals of adsorbed adenine it is necessary to consider that the surface excess of adenine increases when thymine is coadsorbed. - -These effects on the spectra of both bases when they are co-adsorbed are similar at the three pHs investigated. However the enhancement of the ATRSEIRAS signals of adorbed adenine in the presence of thymine is clearly higher at neutral pH values. - -The comparison of the NH stretching spectral bands of adsorbed adenine, in the 2800-3900 cm -1 sepctral region in non-deuterated media , before and after the addition of thymine, permited to conclude that the amine group of adsorbed adenine does not participate in the interactions with co-adsorbed thymine. On the contrary, a π -staking (of the type edge-to-face) and/or a dipole-dipole interactions between co-adsorbed adenine and thymine are proposed to explain the long range organisation induced by the co-adsorption of both bases. Regarding the kinetics of adenine adsorption on gold Au(111) electrodes by EIS. - The Electrochemical Impedance Spectroscopy has been applied to the study of the adsorption kinetics of adenine on gold Au(111) electrodes at pH values of 1, 7 and 11.6. The analysis of the impedance behaviour with the frequency has been performed on the bases of the of the modified model of Frumkin and Melik-Gaikazyan, without any “a priori” assumption about the isotherm that applies to the adsorption process or about the potential dependence of the adsorption rate constant. The analysis with the frequency according to this model provides as a function of the dc potential the values of four frequency independent parameters, Rad, Cad, , , and , that contain the kinetic and thermodynamic information of the process.
266 - To analyse the results in acid media, were the adsorption of neutral adenine (AH 3 ) involves a previous deprotonation of the cationic adenine (AdH 4+ ), the impedance equations for an adsorption process that includes a preceding chemical step have been deduced. These equations imply in many situations a frequency dependence that differs from the case of the pure adsorption process. The differences depend on the value of the equilibrium constant of the chemical step, K c . This value should be lower than 100 in order to detect the different behaviours. For low K c values, two limiting cases provide the same frequency dependence than the pure adsorption process: the high frequency and the low frequency limits that can be obtained with low or high values for the rate constant of the chemical step, k c , respectively. The high frequency limit does not provide any information concerning the chemical step, but the low frequency limit includes K c and k c in apparent Warburg and adsorption resistance parameters. - The Nyquist plots are very useful in order to detect the presence of the chemical step as they may change from the expected semicircles, "depressed" semicircles or "distorted" semicircles for the pure adsorption process. - The Nyquist plot obtained at a representative potential for adenine adsorption on Au(111) electrodes from 0.1M HClO 4 0.1M solutions shows a frequency behaviour identical to the case of a pure adsorption process. The real interfacial capacitance component data can be fitted to the low frequency case providing apparent Warburg coefficient. The comparison of these values to the corresponding Warburg coefficient obtained for the adsorption from neutral solutions where the chemical step is absent, allows us to obtain the equilibrium constant for the chemical step in acid solutions. - The frequency independent parameters allow us to calculate the relaxation times of adsorption and diffusion, and the specific rate of the adsorption process. From the relaxation times a mixed kinetic control by diffusion and by adsorption activation is inferred for the adsorption from solutions of pH 1 and 12, but a somewhat higher kinetic control by diffusion in the case of the adsorption from solutions of pH 7.5. The potential dependence of the specific adsorption rate is explained as the result of the combined potential dependence of a Frumkin type
267 adsorption isotherm with an attractive interaction parameter and a ButlerVolmer potential dependence type for adsorption rate constant. This potential dependence justifies the higher values obtained for the specific rate of adsorption at pH 1 as compared to the values obtained at pH 7.5, as the equilibrium of the preceding chemical step shifts the adsorption process to higher potentials. The lower values obtained for the specific rate of adsorption at pH 12 suggest a lower value for the interaction parameter of the corresponding Frumkin isotherm for the adsorption of anionic adenine as compared to neutral adenine form. Regarding the adsorption of cytosine and guanine and their co-adsorption on gold electrodes. Cyclic voltrammetry and ATR-SEIRA spectroscopy have been combined to study the individual adsorption of cytosine and guanine on gold electrodes and their co-adsorption at three different pH values: 1, 6-8 and 11.6. For the analysis of the experimental results some DFT calculations have been performed. - -The ATR-SEIRAS results of the adsorption of cytosine on gold, and their comparison to the transmission spectra in the same conditions, permit to conclude that the neutral cytosine adsorbs on gold with the molecular plane inclined or normal relative to the electrode at the three pHs investigated. - -The assignation of the spectral bands of adsorbed cytosine in the 1300-1800 cm -1 spectral region has been performed in the basis of DFT calculations of the adsorbed molecule over a 19 gold atoms cluster. - -At pH 8 the ATR-SEIRAS band at c.a. 1650 cm -1 can be deconvoluted in two individual bands, that exhibit each other opposite behavior with the potential. This fact suggests that at low potentials a different form cytosine is adsorbed on the electrode thant at high potentials. This form may be a different tautomer of neutral cytosine or the cytosine with a different protonation degree. - -The “in-situ” ATR-SEIRAS in the 2800-3900 cm1 region show that the asdorption of cytosine on gold electrodes involves the desorption of water molecules previously adsorbed. - -Electrochemical ATR-SEIRAS results of adsorbed guanine on gold electrodes showed that the neutral molecule is adsorbed at acid and neutral pHs, but the
268 anionic deprotonated species is adsorbed from solutions with pHs higher than pK a2 (9.6). - -The comparison of the adsorbed ATR-SEIRA signals with the transmission spectra indicate that neutral guanine adsorbs with the C 6 O and the nitrogen N 7 towards the electrode surface (pH 1 and pH 8). However the anionic guanine adsorbs oriented with C 6 O, NH 2 and N 7 towards the electrode. Both orientations involve a stabilizing interaction between the permanent dipole of the molecule and the electric field close to the electrode. - -The ATR-SEIRAS of adsorbed guanine in the 3000-3600 cm -1 region show the presence of OH signals originated by the coadsorbed water. - -The ATR-SEIRAS of co-adsorbed cytosine and guanine on gold electrodes indicate that the coadsorption originates changes in the orientation of both bases as compared with the individual adsorption at pH values of 1, 7.5 and 11.6. The presence of guanine originates the elimination of the adsorbed cytosine bands, indicating that this molecule adopts a planar orientation relative to the electrode. On the contrary, the signals corresponding to adsorbed guanine exhibit an enhancement in the presence of co-adsorbed cytosine, that can be caused by an increase in the surface excess and/or the inclination angle of the molecular plane. - -The analysis of the ATR-SEIRAS signals of co-adsorbed cytosine and guanine in the 2800-3900 cm -1 , corresponding to the NH and NH 2 stretching vibrations of guanine, and the comparison with the same region for adsorbed guanine in the absence of cytosine permit to discard the participation of these molecular fragments in hydrogen bonding interactions between coadsorbed complementary bases. As in the case of co-adsorbed adenine and thymine another kind of interaction must be involved. According to the reorientation of the bases, an “edge to face” π -interaction is proposed. Regarding the electrochemical and PM-IRRAS study of the Au(111) electrodes modified with monolayers of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-cytidine in the presence and in the absence of guanine. - Electrochemical measurements with monolayers of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero3-cytidine confirmed that the films are stable in a wide range of potentials, although with a moderate degree of disorder.
269 - The PM-IRRA spectroscopic data in the 1400-1800 cm -1 region suggest that the nucleolipid interacts with the gold electrode surface by the cytidine fragment, as the characteristic bands of adsorbed cytosine can be observed, with different wavenumber as compared to the nucleolipid transmission spectrum. - In the presence of guanine the nucleolipid monolayer supported on gold does not show the adsorbed cytosine signals, and the signals characteristic of adsorbed guanine on gold can be observed, indicating that guanine is adsorbed on the electrode. - The analysis of the CH 2 stretching signals of the alkyl chain of the nucleolipid provided the tilt angle of the chains relative to the normal direction to the electrode. Within the stability region, the electrode potential does not affect the tilt angle, but the presence of guanine in the monolayer assembly originates an increase of 20º in the inclination of the alkyl chains. Regarding the electrochemical and PM-IRRAS study of the Au(111) electrodes modified with bilayers of hexadecanethiol / 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-cytidine in the presence and in the absence of guanine. - Tethered bilayers of hexadecanethiol / 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-cytidine were prepared on Au(111) electrodes by the self-assembly of a hexadecanothiol monolayer on clean Au(111), followed by the Langmuir-Schaeffer transfer of a 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-cytidine monolayer, in the absence and in the presence of guanine. - The electrochemical characterization of the bilayers provided the potential window at which the bilayer is stable and the minimum pseudocapacitance value, close to the expected for a compact bilayer. - The comparison of the PM-IRRA spectra of the bilayer in the absence of guanine in the 1300-1800 cm -1 region with the transmission spectrum of the nucleolipid and the ATR-SEIRA spectrum of adsorbed cytosine on gold, permitted to conclude than the cytidine fragment of the nucleolipid is not oriented towards the electrode, but it is oriented towards the electrolyte solution, with some degree of inclination relative to the electrode surface.
276 - A pH 8 la banda de ATR-SEIRAS a c.a 1650 cm -1 se puede deconvolucionar en dos bandas individuales, que exhiben mutuamente un comportamiento opuesto con el potencial. Este hecho sugiere que a bajos potenciales puede adsorberse una forma diferente de citosina - -A pH 8, la banda ATR-SEIRAS a c.a. 1650 cm -1 puede ser deconvoluted en dos bandas individuales, que exhiben mutuamente comportamiento opuesto con el potencial. Este hecho sugiere que a bajos potenciales una forma diferente de citosina es adsorbida en el electrodo a altos potenciales. Esta forma puede ser un tautómero diferente de citosina neutra o la citosina con un grado de protonación diferentente de citosina que no lo hace a potenciales altos. Esta forma podría ser un tautómero neutro diferente de citosina o la citosina con otro estado de protonación. - -Los espectros de ATR-SEIRA in-situ en la región de 2800-3900 cm -1 muestran que la adsoción de citosina sobre electrodos de oro implica la desorción de moléculas de agua previamente adsorbidas. - Los resultados electroquímicos de ATR-SEIRAS de guanina adsorbida sobre electrodos de oro mostraron que la molécula neutra se adsorbe pH ácido y neutro mientras que la especie aniónica de adsorbe a valores de pH superiores a pK a2 (9.6). - -Electrochemical ATR-SEIRAS results of adsorbed guanine on gold electrodes showed that the neutral molecule is adsorbed at acid and neutral pHs, but the anionic deprotonated species is adsorbed from solutions with pHs higher than pK a2 (9.6). - La comparación de las señales de ATR-SEIRA de las moléculas adsorbidas en comparación con los espectros de transmisión indica que la guanina neutra se adsorbe con el C 6 O y el N 7 hacia la superficie del electrodo a pH 1 y 8. Sin embargo la guanina aniónica se adsorbe con los grupos C 6 O, NH 2 y N 7 orientados hacia el electrodo. Ambas orientaciones implican una interacción estabilizadora entre el dipolo permanente de la molécula y el campo eléctrico cerca del electrodo. - Los espectros de ATR-SEIRAS de la guanina adsorbida en la región 2800-3900 cm -1 muestran la presencia de señales de OH originadas por el aguna coadsorbida.
277 - Los espectros de ATR-SEIRAS de citosina y guanina co-adsorbidas sobre electrodos de oro indican que la co-adsorción origina cambios en la orientación de ambas bases en comparación con la adsorción individual a valores de pH de 1, 7.5 y 11.6. La presencia de guanina provoca la pérdida de las señales de citosina adsorbida, lo que indica que esta molécula adopta una orientación plana con relación al electrodo. Por el contrario, las señales correspondienes la guanina adsorbidas aumenten su intensidad en presencia de citosina coadsorbida, que puede ser causada por un aumento del exceso superficial y/o del ángulo de inclinación del plano molecular. - El análisis de las señales de ATR-SEIRAS de citorina y guanina co-adsorbidas en la región 2800-3900 cm -1 , correspondiente a las vibraciones de tensión de NH y NH 2 de guanina y la comparación con la misma región de guanina adsorbida en ausencia de citosina permite descartar la participación de citosina y guanina en puentes de hidrógeno entre bases complementarias cuando están coadsorbidas. Como en el caso de la co-adsorción de timina y adenina debe estar implicado otro tipo de interaccion. De acuerdo con la interacción de las bases de propone una interacción de tipo edge-to-face. Respectro el estudio electroquímico y por PM-IRRAS de electrodos de Au(111) modificados con monocapas de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-citidina en presencia y en ausencia de guanina - -Las medidas electroquímicas con monocapas de 1,2-dipal,itoil-sn-glicero-3citidina confirmaron la formación de monocapas estables en una amplia gama de potenciales, aunque con un grado moderado de desorden - -Los resultados de PM-IRRAS en la región 1300-1800 cm -1 sugieren que el nucleolípido interacciona con la superficie del oro por el fragmento de citidina, ya que pueden observarse las bandas características de la citosina adsorbida con diferentes números de onda en comparación con el espectro de transmisión del nucleolípido. - En presencia de guanina, la monocapa de nucleolípido soportada sobre oro no muestra las señales adsorbidas de citosona, y se pueden observar las señales características de la guanina adsorbida sobre el oro, lo que indica que la guanina está adsorbida sobre el electrodo de oro.
278 - El análisis de las señales correspondientes a las vibraciones de tensiín de CH2 de la cadena alquílica del nucleolípido proporciono el valor del ángulo de inclinación de las cadenas con respecto a la dirección normal al electrodo. Atendiendo a la estabilidad se ha encontrado que el potencial no afecta al ángulo de inclinación sin embargo la presencia de guanina en el conjunto de la monocapa provoca un aumente de 20º en la inclinación de las cadenas alquílicas. Respectro el estudio electroquímico y por PM-IRRAS de electrodos de Au(111) modificados con bicapas de hexadecanotiol/1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-citidina en presencia y en ausencia de guanina - -Se prepararon bicapas de hexadecanotiol/1,2-dipalmitoil-sn-glicero-citidina sobre electrodos de Au(111) por autoensamblaje de una monocapa de hexadenaotiol sobre electrodos de Au(111) limpios deguido de la una transferencia de Langmuir-Schaeffer de una monocapa de 1,2-dipalmitoil-snglicero-citidina, en ausencia y en presencia de guanina. - La comparación de los espectros de PM-IRRA de la bicapa en ausencia de guanina en la región 1300-1800 cm-1 con el espectro de transmisión del nucleolípido y el espectro de ATR-SEIRA de citosina adsorbido sobre el oro permitión concluir que la citidina del nucleolípidono está orientada hacia el electrodo, si no que se orienta hacia la disolución de electrolito, con un cierto grado de inclinación con respecto la superficie del electrodo. - -Los espectros de PM-IRRAS de la bicapa en presencia y ausencia de guanina en la región de 1300-1800 cm-1 muestran la presencia de guanina en la bicapa , pero sin interaccionar con el electrodo. La desaparición de las señales de los fragmentos de citosina del nucleolípido indican que la interacción con guanian provoca una orientación paralela del fragmento de citosina. No se observa la banda característica asociada a las vibracioens de tensión de CO de guanina, lo que sugiere que este grupo esta involugrado en las interacciones de los fragmentos guanina-citosina. - El análisis de las señales asociadas a las vibraciones de tensión de CH 2 proporcionó los ángulos de inclinación de las cadenas alquílicas obteniéndose un aumento de 10º en presencia de guanina en el valor del ángulo al compararlo con los resultados obtenidos en ausencia de ésta.
279 - La capacidad potencial para el reconocimiento molecular de las bicapas es mayor que la de las monocapas debido al efecto de protección superficial de la capa de tiol - La capacidad potencial de las bicapas para el reconocimiento molecular es mayor que las monocapas, debido al efecto de protección superficial de la capa de tiol