Control microbiológico de Listeria monocytogenes en alimentos para consumo destinado a lactantes

1 UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Farmacia Control microbiológico de Listeria monocytogenes en alimentos para consumo destinado a lactantes María de la Paz Fernández González 2 Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Grado en Farmacia Trabajo Fin de Grado “Control microbiológico de Listeria monocytogenes en alimentos para consumo destinado a lactantes” Revisión Bibliográfica Autora: Tutora: María de la Paz Fernández González Eloísa Pajuelo Domínguez Dpto. de Microbiología y Parasitología Sevilla, 6 de julio del 2016 3 ÍNDICE INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1 OBJETIVOS ................................................................................................................... 2 METODOLOGÍA .......................................................................................................... 2 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................... 3 1. Definiciones…………………………………………………………………......3 2. Evolución de la normativa microbiológica respecto de los alimentos para lactantes………………………………………………………………………....4 3. Método horizontal para la detección y el recuento de Listeria monocytogenes. Norma ISO 11290-1. Parte 1: método de detección…………………………….9 4. Consideraciones históricas sobre Listeria monocytogenes …………………....17 5. Microbiología de Listeria monocytogenes …………………………………….18 6. Patogénesis …………………………………………………………………….20 7. Epidemiología …………………………………………………………………25 8. Manifestaciones clínicas de listeriosis…………………………………………27 CONCLUSIONES………………………………………………………………………..33 BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 34-40 1 RESUMEN La listeriosis se trata de una infección provocada por L. monocytogenes siendo su principal vía de transmisión, la ingestión de alimentos contaminados. Si bien la incidencia de esta enfermedad no es muy elevada, la morbilidad sí es un factor a tener en cuenta ya que cuando aparece de forma tardía en recién nacidos suele manifestarse gravemente con afectación al SNC, pudiendo provocar meningitis bacteriana en neonatos. Incluso puede llegar a contabilizarse entre un 30 y un 50% de mortalidad en estos casos. En la mayoría de las ocasiones (aproximadamente el 95% de los casos), la listeriosis en el neonato se presenta como consecuencia de su transmisión vertical desde la madre, bien “in utero”, ya que este microorganismo puede atravesar la barrera placentaria, o perinatal en el momento del parto. Pero aún se registran un 5% de los casos en los que la listeriosis aparece en lactantes de más de 6 meses, estando en este caso, su incidencia asociada ya al consumo de alimentos, por lo que el control microbiológico de los alimentos para lactantes y de usos médicos especiales es muy importante. Este trabajo pretende revisar la normativa vigente para el análisis de los alimentos para lactantes, así como la norma que se utiliza para llevar a cabo este análisis. Por otro lado, se ha abundado en el conocimiento de la microbiología de Listeria monocytogenes, de su taxonomía y de la clínica, particularmente en aspectos como su vía de transmisión, patogenicidad, enfermedades producidas por este microorganismo, profilaxis y tratamiento. Palabras clave: L. monocytogenes, listeriosis, lactantes, prueba CAMP, alimentos, taxonomía INTRODUCCIÓN Listeria monocytogenes se transmite principalmente por vía digestiva a través de los alimentos contaminados y afecta a colectivos especialmente susceptibles: ancianos y recién nacidos, mujeres gestantes y personas inmunocomprometidas; en estos colectivos la letalidad puede alcanzar el 30%. L. monocytogenes se diferencia de otros patógenos por su alta capacidad de resistencia a condiciones adversas: frío (<0º C), calor (>50º C), acidez (pH>4,3) y salinidad (12% de cloruro sódico), y por presentar gran ubicuidad en el medio ambiente. Todos estos factores favorecen la contaminación de los alimentos. Por ello, se hace necesario un control microbiológico de los alimentos, especialmente aquellos destinados a los lactantes y para usos médicos especiales, ya que como se ha comentado, estos colectivos son particularmente sensibles. 2 Para ello, las autoridades sanitarias han desarrollado una estricta normativa para el control microbiológico de los alimentos infantiles, que afecta tanto a toda la vida útil del producto alimenticio, como a las buenas prácticas de higiene durante el proceso de producción. Además, la inclusión de esta enfermedad entre las Enfermedades de Declaración Obligatoria en España en 2015 es otra de las estrategias encaminadas a disminuir el riesgo de esta enfermedad y sus consecuencias en lactantes. OBJETIVOS Los objetivos principales de esta revisión bibliográfica abarcan: 1. La evaluación de la normativa por la que se rige el control microbiológico de alimentos para el consumo destinado a lactantes, teniendo en cuenta su evolución mediante todas las modificaciones que ha ido presentando hasta la normativa vigente. 2. El conocimiento del método horizontal para la detección y el recuento de Listeria monocytogenes, en concreto la Norma ISO11290-1: método de detección. Se indicará el protocolo vigente seguido en los laboratorios para detección de L. monocytogenes en muestras de alimentos. 3. La revisión monográfica de Listeria monocytogenes, incluyendo sus antecedentes históricos, morfología, pruebas bioquímicas y de identificación, taxonomía y patogenicidad. 4. La consideración de las manifestaciones clínicas de listeriosis, así como su epidemiología y tratamiento. METODOLOGÍA La metodología seguida en esta investigación ha consistido en la búsqueda bibliográfica y en la revisión de artículos científicos y bases de datos. La gran heterogeneidad del tema y el importante número de estudios relacionados con L. monocytogenes ha supuesto la necesidad de centrarnos en determinados criterios que permitieran acotar la búsqueda bibliográfica, para una elaboración adecuada de este Trabajo de Fin de Grado. Puesto que el título de la revisión es “Control microbiológico de L. monocytogenes en alimentos para consumo destinado a lactantes”, el criterio de selección seguido para la búsqueda de la información consiste en la división de la información en tres partes diferenciadas: Una primera parte centrada en la normativa vigente que se aplica al control microbiológico de los alimentos, para ello se ha hecho uso de: 1. El Real Decreto 867/2008, de 23 de mayo, para la definición de términos 3 2. Reglamento (CE) no 2073/2005 de la comisión de 15 de noviembre de 2005 relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios y sus posteriores modificaciones de 2007 y 2010. Una segunda parte centrada en la redacción del método de detección de L. monocytogenes en muestras de alimentos, para lo que se ha utilizado la versión oficial, en español, de la Norma ISO 11290-con sus correspondientes actualizaciones. Finalmente, se ha abordado la microbiología de L. monocytogenes y las manifestaciones clínicas típicas de listeriosis. En esta parte, las principales palabras claves utilizadas para la búsqueda de información han sido: L. monocytogenes, listeriosis, lactantes, prueba CAMP, alimentos y taxonomía. También se han usado otras palabras claves de carácter más secundario como; neonatos, epidemiología, patogenicidad, serotipo, Listeria spp, meningitis bacteriana neonatal. Como fuentes de información se han utilizado fundamentalmente bases de datos de revistas científicas, entre los que destacan: Scopus, Pubmed, ScienceDirect, National Library of Medicine (MEDLINE plus), Scientific Electronic Library Online (Scielo), Elsevier y Medwave. A estos recursos he accedido principalmente mediante la Biblioteca de la Universidad de Sevilla (http://bib.us.es/). Además, se han consultado algunas páginas webs de organismos oficiales (NIH, CDC, Ministerio de Sanidad y Seguridad Social, Junta de Andalucía, SAS, etc.). La última fecha de consulta de algunos de ellos ha sido el 07/06/ 2016, con la intención de una recopilación adecuada, verídica y actualizada de la información requerida. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. DEFINICIONES Según el Real Decreto 867/2008, de 23 de mayo, por el que se aprueba la reglamentación técnico-sanitaria específica de los preparados para lactantes y de los preparados de continuación, se entenderá por:  Lactantes: los niños que tengan menos de doce meses.  Preparados para lactantes: los productos alimenticios destinados a la alimentación especial de los lactantes durante los primeros meses de vida, que satisfagan por sí mismos las necesidades nutritivas de estos lactantes hasta la introducción de una alimentación complementaria apropiada. 4 2. EVOLUCIÓN DE LA NORMATIVA MICROBIOLÓGICA RESPECTO DE LOS ALIMENTOS PARA LACTANTES 2.1. Normativa hasta el año 2005 El comité científico de medidas veterinarias relacionadas con la salud pública, emitió un dictamen el 23 de septiembre de 1999 sobre la evaluación de los criterios microbiológicos para los productos alimenticios de origen animal destinados al consumo humano. Éste recomienda que los criterios microbiológicos sean pertinentes y eficaces en lo que se refiere a la protección de la salud de los consumidores. Además, el comité emitió a la vez otro dictamen sobre Listeria monocytogenes. En él se recomendaba como objetivo que la concentración de Listeria monocytogenes en los alimentos se mantuviera por debajo de 100 ufc/g y posteriormente el Comité científico de alimentación humana (SCF) respaldó estas recomendaciones en su dictamen de 22 de junio de 2000. 2.2. Necesidad de la adecuación a la normativa común europea: el reglamento de 2005 La normativa microbiológica que se aplica a los alimentos listos para el consumo destinado a lactantes y a usos médicos especiales, se basa en el siguiente reglamento: REGLAMENTO (CE) nº 2073/2005 DE LA COMISIÓN de 15 de noviembre de 2005 relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios. Con las respectivas modificaciones posteriores por los Reglamentos CE 1441/2007 D.O.U.E. de 07/12/2007 y Reglamento 365/2010 D.O.U.E. de 29/04/2010. Según este reglamento, uno de los objetivos fundamentales de la legislación alimentaria es asegurar un nivel elevado de protección de la salud pública. Para ello, se establecen los principios y requisitos generales de la legislación alimentaria y se fijan procedimientos relativos a la seguridad alimentaria. Puesto que los riesgos microbiológicos de los productos alimenticios constituyen una de las principales fuentes de enfermedades de origen alimentario, dichos productos no deben contener microorganismos ni sus toxinas o metabolitos en cantidades que supongan un riesgo inaceptable para la salud humana La principal modificación que introduce este reglamento es la necesidad de adoptar buenas prácticas de higiene y la aplicación de procedimientos basados en los principios de análisis de peligros y puntos de control críticos ( HACCP), ya que se entiende como un método preventivo que garantiza la seguridad de los alimentos y también es necesario fijar criterios microbiológicos que establezcan un límite por encima del cual, un producto alimenticio deba considerarse contaminado de forma inaceptable con los microorganismos para los que se hayan fijado los criterios. Ello implica que el productor tiene que garantizar el control microbiológico de su producto antes de que éste abandone las instalaciones del productor. 5 En el artículo 3 del reglamento (CE) no 2073/2005, cabe destacar como condición general, que cuando sea necesario, los explotadores de las empresas alimentarias responsables de la fabricación de un producto determinado realizarán estudios para investigar el cumplimiento de los criterios a lo largo de toda la vida útil. Esto se debe aplicar especialmente a los alimentos listos para el consumo que puedan permitir el desarrollo de Listeria monocytogenes y puedan suponer un riesgo para la salud pública en relación con dicha bacteria. Por otra parte, la Comisión técnica de peligros biológicos (Comisión BIOHAZ) de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA), la cual emitió, el 9 de Septiembre de 2004, un dictamen sobre los riesgos microbiológicos en los preparados para lactantes y preparados de continuación en el que se concluyó que Salmonella y Enterobacter sakazakii son los microorganismos más preocupantes en los preparados para lactantes, preparados para lactantes destinados a usos médicos especiales y preparados de continuación. La presencia de dichos agentes patógenos en alimentos supone un riesgo considerable si hay condiciones que permiten su multiplicación. Las enterobacteriáceas, presentes más a menudo, podrían usarse como indicador del riesgo, por este motivo, la EFSA recomendó que se efectuaran controles y pruebas de enterobacteriáceas, tanto en el entorno de fabricación, como en el producto acabado. Sin embargo, además de especies patógenas, la familia de las enterobacteriáceas incluye también especies medioambientales que aparecen con frecuencia en el entorno de fabricación sin plantear ningún riesgo para la salud. Por lo tanto, la familia de las enterobacteriáceas puede usarse para la vigilancia habitual y, en caso de que se manifieste su presencia, pueden iniciarse controles de agentes patógenos específicos. Dentro del Artículo 5 del reglamento, se desarrollan las normas específicas para las pruebas y la toma de muestras. Siendo importante resaltar que se deberán tomar muestras en las zonas de trabajo y del equipo utilizado en la producción de los productos alimenticios, cuando dicha toma sea necesaria para garantizar el cumplimiento de los criterios microbiológicos. Por lo que los explotadores de las empresas alimentarias que produzcan alimentos listos para el consumo susceptibles de plantear un riesgo de Listeria monocytogenes para la salud pública, deberán tomar siempre muestras de las zonas y el equipo de producción, como parte de su plan de muestro y con el fin de detectar la posible presencia de dicha bacteria. Ocurrirá lo mismo en el caso de los explotadores de las empresas alimentarias que produzcan preparados deshidratados para lactantes, o alimentos deshidratados destinados a usos médicos especiales para lactantes menores de seis meses, y que presenten un riesgo de Enterobacter sakazakii. Éstos deberán controlar las zonas y el equipo de producción para detectar la presencia de enterobacteriáceas. REGLAMENTO (CE) nº 2073/2005 DE LA COMISIÓN de 15 de noviembre de 2005 relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios (Tablas 1 y 2). 6 Tabla 1. CAPITULO 1. Criterios de seguridad alimentaria (1) n = número de unidades que componen la muestra; c = número de unidades de muestreo con valores superiores a m o comprendidos entre m y M. (2) Para estos criterios, se entenderá que m=M. (3) Se utilizará la última versión de la norma. Interpretación de los resultados Los límites indicados se refieren a cada muestra analizada. Los resultados de las pruebas demuestran la calidad microbiológica del lote analizado, aunque también podrían utilizarse para demostrar la eficacia del procedimiento HACCP o la higiene correcta del proceso. L. monocytogenes, en alimentos listos para el consumo destinados a los lactantes y para usos médicos especiales: — Se considera un resultado satisfactorio, si todos los valores observados indican ausencia de la bacteria, — Se considera un resultado insatisfactorio, si se detecta la presencia de la bacteria en cualquiera de las muestras. (L. monocytogenes en alimentos listos para el consumo que puedan permitir el desarrollo de L. monocytogenes antes de que el alimento haya dejado el control inmediato del explotador de la empresa alimentaria que los haya producido, cuando no pueda demostrar que el producto no superará el límite de 100 ufc/g durante su vida útil: — satisfactorio, si todos los valores observados indican ausencia de la bacteria, Categorías de alimentos Microorganismos/ sus toxinas, metabolitos Plan de toma de muestras(1) Límites(2) Método analítico de referencia(3) Fase en la que se aplica el criterio n c m M 1.1 Alimentos listos para el consumo destinados a los lactantes, y alimentos listos para el consumo destinados a usos médicos especiales(4) Listeria monocytogenes 10 0 Ausencia en 25 g EN/ISO 11290-1 Productos comercializados durante su vida útil 1.22 Preparados deshidratados para lactantes y alimentos dietéticos deshidratados destinados a usos médicos especiales para lactantes menores de seis meses, tal como se contempla en los criterios para las enterobacteriáceas en el capítulo 2.2 del presente anexo. Salmonella 30 0 Ausencia en 25 g EN/ISO 6579 Productos comercializados durante su vida útil 1.23 Preparados deshidratados para lactantes y alimentos dietéticos destinados a usos médicos especiales para lactantes menores de seis meses, tal como se contempla en los criterios para las enterobacteriáceas en el capítulo 2.2 del presente anexo. Enterobacter sakazakii 30 0 Ausencia en 10 g ISO/DTS 22964 Productos comercializados durante su vida útil 13 deben sembrar controles positivos (L. monocytogenes) y negativos (L. innocua). Después de la incubación a 35 º C o 37 º C durante 24 h ± 2 h, examinar las cepas control y las muestras bajo una luz brillante. L. monocytogenes: aparece como zonas aclaradas y estrechas (β-hemólisis). L. innocua: no muestra zonas claras alrededor de la siembra. L. seeligeri: muestra zonas de hemólisis débiles. L. ivanovii: generalmente muestra zonas anchas claramente delineadas de ß-hemólisis. La reacción hemolítica también puede realizarse empleando glóbulos rojos de sangre de carnero. Se dispersa la colonia en 150 µl de TSYEB, se incuba a 37 º C durante 2 h. A continuación, se añaden 150 µl de la suspensión de glóbulos rojos y luego se incuba de nuevo a 37º C de 15-60 min. Finalmente se refrigera a 3 º C ± 2 º C durante 2 h aproximadamente y se examina si hay actividad hemolítica. 3.4.2 Utilización de carbohidratos Inocular cada caldo de carbohidratos con un cultivo en TSYEB mediante un asa. Incubar a 35 o 37 º C hasta 5 días. La reacción positiva vendrá indicada por una coloración amarilla con la formación de ácido y tiene lugar en 24-48 h. 3.4.3 Prueba CAMP Sembrar en forma de líneas rectas cultivos tanto de Staphylococcus aureus como de Rhodococcus equi en placas de agar sangre de cordero. De manera que los cultivos sean paralelos y opuestos. El inóculo debe ser homogéneo y fino, (Figuras 1.D y 2) que se consigue utilizando un asa de inoculación o alambre en ángulo recto al agar. A continuación, sembrar las cepas a analizar aisladas del punto 3 de forma similar en ángulo recto a los cultivos, es decir, sembrar a la vez cultivos control de L. monocytogenes, L. innocua, y L. ivanovii en dicha placa, de tal forma que no se toque con S. aureus y R. equi. y estén separados como mínimo de 1 mm a 2 mm. (Figura 2). Figura 2. Inóculo e interpretación de las placas del ensayo de CAMP 14 Incubar las placas a 35 º C o 37 º C durante 18 h a 24 h. La reacción se considera positiva con la presencia de una zona de beta-hemólisis acentuada en la intersección de la cepa ensayada con cada uno de los cultivos de S. aureus y R. equi (Tabla 5). Tabla 5. Resultados de la prueba CAMP para Listeria monocytogenes respecto de Rhodococcus equi y Staphylococcus aureus. Especie Reacción positiva Reacción negativa R. equi “Hemólisis ancha en forma de cabeza de flecha” (5-10 mm) Hemólisis débil se extiende alrededor de 1 mm de la intersección entre la cepa ensayada y la zona de difusión de R. equi. S. aureus Zona pequeña de hemólisis extendiéndose alrededor de 2 mm de la cepa ensayada y dentro de la zona de hemólisis débil debido a S. aureus. Con L. monocytogenes, no se dan zonas amplias de hemólisis. No hay hemólisis Sin embargo, la identificación de especies de Listeria por métodos bioquímicos es un proceso laborioso y costoso, que implica aislamiento primario con medios selectivos y de enriquecimiento, seguido de tinción de Gram y pruebas bioquímicas múltiples (Liu, 2006). La incorporación de diversos procedimientos bioquímicos en una única plataforma de pruebas ha simplificado el proceso de diagnóstico para las especies de Listeria. Cabe destacar la prueba API, que se trata de una técnica específicamente diseñada para el aislamiento e identificación de las especies de dicho género (Allerberger, 2003) (Figura 3). El método se emplea sobre todo en el aislamiento e identificación de las distintas especies de determinadas muestras de agua o alimentos contaminados, de una manera rápida y fiable (Farouk y cols., 2015). Figura 3. Test de la prueba Api Listeria. Distinción entre L. monocytogenes (arriba) y L. innocua (abajo). (Allerberger, 2003). 15 Los procedimientos de identificación de la técnica API, consisten en diez pruebas (Allerberger, 2003). Se trata de una tira o microtubo, que contiene 10 pocillos, en cada uno de los cuales tiene lugar una de las siguientes reacciones (Tabla 6): La diferenciación entre L. innocua y L. monocytogenes basado en la presencia o la ausencia de arilamidasa, (prueba DIM), la hidrólisis de esculina, la presencia de ox-manosidasa, y la producción de ácido a partir de D-arabinosa, D-xilosa, L-ramnosa, alfa-metil-D-glucósido, Dribosa, glucosa-1fosfato, y D-tagatosa. Se obtienen inóculos bacterianos a partir de colonias aisladas con una pipeta y se suspende en 2 ml del medio de suspensión API (McFarland). En la caja de incubación, existen unos pocillos en los que deben distribuirse 3 ml de agua destilada para crear una atmósfera húmeda. A continuación, la tira se retira de su embalaje, se coloca en la bandeja y se inocula la suspensión bacteriana en los pocillos. Finalmente ésta se incuba 18-24 horas a 37 ° C en condiciones aerobias. Los Resultados de la reacción se determinan de acuerdo a cambios de color funcionales que actúan como indicadores. La interpretación de los resultados es fácil y se realiza en función de las instrucciones del fabricante (Figura 3), (Farouk y cols., 2015). De esta manera se consigue la identificación y determinación de las especies del género Listeria, entre un gran número de microorganismos y con cantidades mínimas de material y mano de obra. Además de la obtención de unos resultados fiables 24 horas después de la incubación. Debido a esto, la técnica API, es rápida y barata. Por lo tanto, parece ser una buena herramienta para la práctica habitual de muchos laboratorios, especialmente aquellos relacionados con la microbiología presente en los alimentos y en el medio ambiente (Bille y cols., 1992). Tabla 6. Identificación de Listeria basada en el test API (Farouk y cols., 2015). 16 3.5. CONFIRMACIÓN DEFINITIVA Las cepas que se consideran L. monocytogenes, se pueden enviar a un laboratorio de referencia para Listeria para determinar el tipo serológico o incluso el tipo lisogénico. El envío debe ir acompañado con la información de las cepas disponible. 3.6. CULTIVOS CONTROL Son necesarios para determinar la capacidad de los medios de enriquecimiento e identificación de permitir el crecimiento selectivo de L. monocytogenes. Se debe proceder con los frascos control de la misma forma que con los cultivos analizados para demostrar que los cultivos de control positivos se recuperan. 3.7. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS Se debe registrar la presencia o ausencia de Listeria monocytogenes en la porción ensayada, especificando la masa en gramos o el volumen en mililitros de la muestra analizada. 3.8. PRECISIÓN DEL MÉTODO Se han seleccionado características de rendimiento, que son eficacia, conformidad y concordancia. Estas características se determinaron empleando tres tipos de alimentos contaminados a varios niveles y con materiales de referencia. 3.8.1 Eficacia: porcentaje de muestras identificadas correctamente. • Muestras positivas: la eficacia se denomina sensibilidad, es el porcentaje de muestras correctamente identificadas como positivas. Se asume que todas las muestras positivas contienen el organismo. • Muestras negativas: la eficacia se denomina especificidad, es el porcentaje de muestras correctamente identificadas como negativas. Valores globales: Para la indicación general de sensibilidad (Se) y de especificidad (Sp), pueden utilizarse los siguientes valores cuando se analizan muestras de alimentos en general; Sp= 97.4%, Se=85.2%. Según estos valores puede interpretarse que una muestra que contiene L. monocytogenes debe reconocerse como positiva en el 85.2% de los casos si es analizada con este método. 17 3.8.2 Conformidad: La conformidad es la posibilidad, expresada en porcentaje, de encontrar el mismo resultado en dos porciones de análisis idénticas, analizadas en el mismo laboratorio, en condiciones de repetibilidad (mismo técnico, mismo aparato, mismos reactivos), en el menos tiempo posible. Por ejemplo, los dos positivos o los dos negativos. Valores globales: Para la indicación general de la conformidad (Ac), se utiliza el siguiente valor; Ac: 88.7%. Según este valor si dos porciones para análisis idénticas de una muestra que contiene L. monocytogenes, son analizadas por el mismo técnico en un período corto de tiempo y con exactamente las mismas condiciones operativas, hay un 88.7 % de posibilidades de obtener el mismo resultado para ambas porciones. (Presencia de L. monocytogenes). 3.8.3 Concordancia: Es la posibilidad, expresada en porcentaje, de encontrar el mismo resultado para dos muestras idénticas analizadas en dos laboratorios distintos. La concordancia. Valores globales: Para la indicación general de la concordancia (Cc), puede utilizarse el siguiente valor: Cc=84.4 %. Según este valor, si dos porciones para análisis idénticas de una muestra que contiene L. monocytogenes son analizadas por dos laboratorios hay un 84.4 % de posibilidades de obtener el mismo resultado para ambas porciones del análisis (Presencia de L. monocytogenes). 3.9. INFORME DEL ENSAYO El informe del ensayo deberá especificar el método utilizado, las temperaturas de incubación y los resultados obtenidos, además de cualquier incidente que haya podido influenciar los resultados. En definitiva, deberá incluir toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra. 4. CONSIDERACIONES HISTÓRICAS SOBRE Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes, es una bacteria que debe su nombre a Joseph Lister (1872-1912) considerado uno de los padres de la microbiología, junto a Kock y Pasteur (Ledermann, 2008). No obstante, la bacteria fue descubierta 14 años después de su muerte (1926) por Murray, Webb y Swann, microbiólogos de la Universidad de Cambridge, quienes la aislaron de conejos y conejillos de indias de laboratorio y llamaron a este nuevo agente Bacterium monocytogenes, debido a la monocitosis que causó en aquellos animales. (Murray y cols., 1926). Respecto a la relación del género con Lister, la bacteria fue bautizada en honor de Lister por James Hunter Harvey Pirie (18771965), bacteriólogo y geólogo escocés, que identificó también la bacteria un año más tarde (1927) y la denominó como Listerella hepatolytica (Pirie, 1927; 1940). Con 18 el tiempo varios investigadores fueron aislando la misma bacteria y le dieron diferentes nombres, lo que causó cierta confusión en cuanto a la nomenclatura de la misma. EL problema fue resuelto en 1957 por el alemán Heinz Seeliger, conocido taxónomo, quien en honor a Lister impuso el nombre Listeria monocytogenes. Esto fue aprobado por la Comisión Judicial de Nomenclatura bacteriológica y Taxonomía (Anon, 1954). El epíteto específico monocytogenes alude a la monocitosis que causa. 5. MICROBIOLOGÍA DE LISTERIA MONOCYTOGENES Listeria monocytogenes se trata de un bacilo pequeño, regular y corto (Figura 4), de aproximadamente 0,4 por 1 a 1,5 µm (Collins y cols., 1991; Vazquez-Boland y cols., 2001) con lados paralelos y extremos romos. Tiene un bajo contenido en G+C (37-42%) (Sallen y cols., 1996; Allerberger, 2003; Liu, 2006) Es una bacteria Gram-positiva, no esporulada y móvil, ya que posee flagelos peritricos. Puede formar pequeñas colonias de color blanco grisáceo, que están rodeadas de una delgada zona de hemólisis. Listeria monocytogenes está ampliamente distribuida en la naturaleza, es una bacteria ubicua y ha sido aislada de diversas fuentes ambientales, como suelos, polvo, en la vegetación en descomposición, en aguas, alcantarillado, incluso en alimentos para animales, desde donde se incorpora a la cadena alimentaria y pasa a formar parte de la flora fecal de muchos mamíferos, entre ellos, la de seres humanos adultos sanos (Vazquez-Boland y cols., 2001; Orsi y cols., 2011). Presenta gran resistencia a las condiciones adversas del ambiente, debido a que es un microorganismo anaerobio facultativo, puede encontrarse en un amplio rango de pH, entre 4,3 y 9,1 y a elevadas concentraciones de NaCl 12% (w / v). Además, la bacteria es capaz de crecer en un intervalo de <0º C y >50º C, el cual, incluye la temperatura de refrigeración (4-10º C). (Olivares R, 2009). Esto la ha llevado a ser reconocida como una de las principales bacterias patógenas transmitidas por los alimentos y ha generado una preocupación particular con respecto a la manipulación de los mismos (Mraheil y cols., 2013; McLauchlin y cols., 2014). Figura 4. Morfología de Listeria monocytogenes observada al microscopio electrónico de barrido. 19 5.1. PRUEBAS BIOQUÍMICAS Las especies de Listeria comparten características morfológicas y bioquímicas estrechamente relacionadas. Algunas de estas características comunes, que se han utilizado para la diferenciación de las distintas especies de Listeria de otras bacterias, son: reacción de catalasa positiva, prueba de Indol y oxidasa negativa, hidrólisis de esculina, pero no urea. Por otro lado, Listeria spp. poseen propiedades bioquímicas distintas que permiten la distinción entre especies patógenas y no patógenas de Listeria, como pueden ser: variabilidad en su capacidad para fermentar L-ramnosa, D-xilosa, y alfa-metil-D-manopiranósido y también, actividades hemolítica, lecitinasa, y la fosfolipasa C (Liu, 2006). Por ejemplo, L. monocytogenes y L. ivanovii se diferencian de otras especies de Listeria ya que muestran variaciones significativas en su capacidad de producción de una amplia, clara o doble zona de hemólisis en agar sangre de caballo u oveja, y entre ellas en la capacidad de producir ácido a partir de L-ramnosa, D-xilosa y alfa-metil-D-manósido (Ermolaeva y cols., 2003). Del mismo modo, L. innocua y L. welshimeri se distinguen de L. monocytogenes por su beta hemólisis negativa y sus características de fermentación (Robinson y cols., 2000). Además, L. ivanovii se distingue de L. monocytogenes por su fuerte reacción lecitinasa con o sin carbón vegetal en el medio, en comparación con L. monocytogenes, lo que requiere carbón para su reacción lecitinasa (Ermolaeva y cols., 2003). En cuanto a la prueba CAMP, L. monocytogenes y L. seeligeri dan positivo con Staphylococcus aureus y negativo en la prueba CAMP con Rhodococcus equi; a diferencia de L. ivanovii que da una prueba CAMP positiva con R. equi y prueba CAMP negativa con S. aureus. Todas los demás Listeria especies son prueba CAMP negativo (McLauchlin y cols., 2014). Tabla 7. Interpretación de las propiedades morfológicas y fisiológicas y de las reacciones bioquímicas para identificación de Listeria spp. 20 5.2. TAXONOMÍA DE LISTERIA MONOCYTOGENES. El Género Listeria pertenece a la familia Listeriaceae, a su vez ésta, se encuentra dentro de la clase Bacilli y del phylum Firmicutes. Actualmente el género cuenta con 17 especies distintas (Tabla 8) descritas hasta la fecha. Dos de ellas se consideran especies patógenas, Listeria monocytogenes, patógeno para el hombre y L. ivanovii, patógena para animales, principalmente bovinos y rumiantes pequeños y rara vez afecta al hombre. Además de especies no patógenas que incluyen L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi, L. marthii, L. rocourtiae, L. fleischmannii y L. weihenstephanensis (Guillet y cols., 2010) y siete nuevas especies como L. riparia, L. aquatica, L. grandensis, L. floridensis, L. cornellensis, L. booriae y L. newyorkensis. Tabla 8. Especies descritas dentro del género Listeria hasta la fecha. 6. PATOGÉNESIS Como mencionamos anteriormente, Listeria monocytogenes se encuentra de forma natural en la capa superficial del suelo rico en materia vegetal en descomposición. A partir de este hábitat, ganan acceso al huésped vertebrado a través de la vía oral, utilizando alimentos contaminados ESPECIES REFERENCIAS L. monocytogenes (Murray y cols., 1926; Pirie, 1940) L. ivanovii (Seeliger y cols., 1984) L. seeligeri (Rocourt, Grimont., 1983) L. innocua (Bubert y cols., 1992) L. welshimeri (Rocourt, Grimont, 1983) L. grayi Rocourt y cols., 1992 L. marthi (Graves y cols., 2010) L. rocourtiae (Leclercq y cols., 2010) L. fleischmannii (Bertsch y cols., 2012) L. weihenstephanensis (Lang y cols., 2012) L. riparia (Den Bakker y cols., 2014) L. aquatica (Den Bakker y cols., 2014) L. grandensis (Den Bakker y cols., 2014) L. floridensis (Den Bakker y cols., 2014) L. cornellensis (Den Bakker y cols., 2014) L. booriae (Weller y cols., 2015) L. newyorkensis (Weller y cols., 2015) 21 como vehículo (Vazquez-Boland y cols., 2001), por tanto, el tracto gastrointestinal es el primer sitio de entrada de este microorganismo al hospedador. La bacteria es capaz de atravesar las tres barreras fisiológicas presentes en los seres humanos: intestinal, hemato-encefálica y placentaria (Figura 5). Al cruzar la barrera intestinal, la bacteria se absorbe desde el lumen intestinal, atravesando las células epiteliales y si el sistema inmune no es capaz de controlar eficientemente la infección, la bacteria seguirá multiplicándose y la infección puede diseminarse al torrente sanguíneo y a los ganglios linfáticos. Tras el ingreso al torrente sanguíneo, la mayoría de las bacterias alcanza el hígado y el bazo, donde puede replicarse en el interior de macrófagos o células epiteliales. Si la replicación de L. monocytogenes no es controlada por una efectiva respuesta inmune innata, la bacteria escapa y continúa replicándose. La supervivencia del hospedador depende del desarrollo de una efectiva respuesta inmune adaptativa; de otro modo, la bacteria puede ingresar nuevamente al torrente sanguíneo y alcanzar el cerebro o la placenta, causando infecciones sistémicas potencialmente letales (Camejo y cols., 2011). Figura 5. Mecanismo de infección de Listeria monocytogenes. A través de los alimentos contaminados, L. monocytogenes llega al tracto gastrointestinal y pasa al torrente sanguíneo, desde dónde las bacterias alcanzan el hígado y el bazo. Pueden verse afectados tanto el cerebro como la placenta, causando listeriosis. 6. 1 CICLO INTRACELULAR DE L. MONOCYTOGENES El proceso de infección comprende varias etapas, en las que están involucrados múltiples factores de virulencia (Chen y cols., 2009; Témoin y cols., 2008). 1. Adhesión e invasión de la célula hospedadora. Para ingresar al medio intracelular Listeria utiliza dos proteínas de invasión que son InlA y InlB, codificadas por los genes inlA e inlB, respectivamente. Se tratan de proteínas de superficie conocidas como Invasinas o Internalinas A y B, que interactúan con dos receptores celulares de transmembrana: 22 ·) E-Caderina, en el caso de Internalina A, la proteína E-Caderina tiene un papel muy importante en las uniones intercelulares. Se sabe que cuando se producen fenómenos de remodelación en la vellosidad intestinal esta proteína queda expuesta en la superficie del lumen, donde se encuentra Listeria; en ese momento se produce la interacción entre Internalina A y ECaderina, que culmina en la fagocitosis de la bacteria (Pizarro-Cerdá, Cossart, 2006; Bonazzi y cols., 2009). ·) Tirosin-kinasa Met-c, en el de Internalina B; esta proteína tendría un rol en el paso de Listeria a través de la barrera hematoencefálica. Ambas interacciones favorecen la entrada de la bacteria mediante fagocitosis por las células hospedadoras del epitelio intestinal y se traslada de célula en célula sin exponerse al ambiente extracelular (Shen y cols., 2000). 2. Escape de la vacuola. Una vez en el interior de la célula Listeria expresa la proteína Listeriolisina O, responsable de su capacidad de invasión y virulencia, ya que es una toxina dependiente de colesterol y capaz de formar poros en la membrana de los fagosomas, permitiendo que L. monocytoges escape de las vacuolas hacia el citoplasma. (Gedde y cols., 2000). 3. Multiplicación intracelular. Después de la replicación, se induce la polimerización de filamentos de actina en un polo de la bacteria, denominados filopodios; este proceso es dirigido por la proteína ActA. Se produce la formación de una estructura semejante a una cola de cometa que facilita el movimiento intracelular, permitiendo la invasión de nuevas células. (Liu y cols., 2007). 4. Proliferación extracelular. Cuando alcanza las fronteras celulares es capaz de inducir una fagocitosis por parte de otra célula vecina, lo que permite que el ciclo se repita mientras la bacteria se mantiene oculta para el sistema inmunológico (Figura 6). Figura 6. Esquema del ciclo intracelular de Listeria monocytogenes. Con entrada en la célula hospedera, supervivencia dentro de la vacuola fagocítica, disrupción de las membranas del fagosoma y escape al citosol; replicación en el citosol, movimiento a través de la polimerización de actina, propagación célula-célula, supervivencia en fagosomas secundarios, escape del fagosoma secundario y reinicio del ciclo. (Pizarro-Cerdá y cols., 2004). 29 trimestre, puede dar lugar también a la muerte intrauterina o bien, la entrega de un neonato gravemente enfermo. Este tipo de listeriosis neonatal, se conoce como infección de aparición temprana, con síntomas que ocurren en la primera semana de vida. En este caso hay un inicio temprano de sepsis en el recién nacido que se caracteriza por signos inespecíficos de la infección y por ser prematuro. Las lesiones cutáneas pueden estar presentes (Figura 8), a veces con granulomas y el recién nacido puede tener convulsiones, insuficiencia respiratoria y aquellos que sobreviven suelen presentar secuelas a largo plazo, especialmente aquellos de partos prematuros o con afectación del sistema nervioso central (VazquezBoland, 2001; Allerberger, Huhulescu, 2015) -Si los síntomas se producen a partir del octavo día y hasta 4 semanas después del nacimiento, se trata de una listeriosis neonatal de aparición tardía. Los bebés con inicio tardío de la infección generalmente nacen a término y es probable que el momento de infección ocurra durante el paso por el canal del parto o desde el entorno post-natal. Este tipo de listeriosis se caracteriza por compromiso del SNC, de hecho, listeria monocytogenes es una de las tres principales causas de meningitis bacteriana en neonatos. Esto da lugar al desarrollo de meningitis, y en ocasiones de neumonía. Sin embargo, con un tratamiento adecuado, el cuadro presenta un mejor pronóstico que la listeriosis neonatal de aparición temprana (Jackson y cols., 2010). • Sepsis sin foco evidente La bacteriemia sin foco evidente es la manifestación más frecuente en inmunocomprometidos y ancianos. Los síntomas son similares a los de cualquier otra causa de bacteriemia: fiebre, mialgias, pródromo con diarrea y náuseas (Olivares, 2009). El choque séptico puede desarrollarse y afectar al cerebro y meninges, conduciendo a la meningoencefalitis o encefalitis. Esto último es más frecuente en personas asociadas a condiciones debilitantes subyacentes graves (McLauchlin y cols., 2014). Figura 8. Granulomatosis Infantiséptica. Se aprecian granulomas multiorgánicos manifestándose en la piel, del tamaño de la cabeza de un alfiler. Se tratan de nódulos de color blanco-amarillento y con un halo rojo (Allerberger, Huhulescu, 2015). 30 Figura 9. Infección del SNC por Listeria. (Olivares, 2009). • Infección del sistema nervioso central La infección del SNC por Listeria que se manifiesta con mayor frecuencia es la meningoencefalitis. Existen además otras como cerebritis, abscesos cerebrales y romboencefalitis, pero son menos comunes. Meningoencefalitis - ocurre con mayor frecuencia en los recién nacidos después de tres días de edad y en adultos inmunocomprometidos y ancianos. El inicio de la meningoencefalitis, puede ser repentino o agudo, con fiebre, intenso dolor de cabeza, náuseas, vómitos y signos de irritación meningea, o puede ser subaguda, particularmente en una inmunocomprometido o ancianos, con signos neurológicos focales. Estos incluyen anormalidades craneales, ataxia, temblores, hemiplejía, sordera, convulsiones e incluso fluctuaciones en el nivel de la conciencia (Mylonakis y cols., 1998; Brouwer y cols., 2006). Cerebritis - resulta de la invasión hematógena directa del parénquima cerebral, por lo general con poca o ninguna participación de las meninges (Figura 9). Sin embargo, los síndromes de meningitis y encefalitis pueden ocurrir también. La presentación clínica de la encefalitis va de fiebre y dolor de cabeza hasta hemiplejia y se asemeja a un accidente cerebrovascular (Watson y cols., 1978). Rombencefalitis - se trata de una encefalitis que compromete el tronco cerebral y /o el cerebelo. Es una rara manifestación de la infección por Listeria que ocurre típicamente en individuos sanos a través del consumo de alimentos contaminados (Kleemann y cols., 2009). La rombencefalitis a menudo sigue un curso bifásico, comenzando con dolor de cabeza, fiebre, náuseas y vómitos, seguidos de varios días por parálisis de los nervios craneales, ataxia, temblores y otros signos cerebelosos. Además produce disminución de la conciencia, y posiblemente convulsiones y hemiparesia. Casi la mitad desarrollan insuficiencia respiratoria (Moragas y cols., 2011). 31 • Otras infecciones más raras denominadas infecciones focales Las infecciones focales por Listeria son muy poco frecuentes, la mayoría de estas infecciones focales no tienen características distintivas (Mylonakis y cols., 1998), pero tienden a ocurrir en mayor medida en personas inmunodeprimidas, entre ellas destacan: • Infecciones de la piel o de los ojos, como resultado de una exposición ocupacional directa en veterinarios, agricultores y trabajadores de laboratorio, pero no suelen ser muy frecuentes. • Otras complicaciones pueden ser el sindrome oculoglandular, linfadenitis, neumonía, empiema, dermatitis, miocarditis, endocarditis en pacientes con lesiones cardíacas subyacentes o bien, con válvulas cardíacas protésicas, artritis séptica, osteomielitis, infección de la articulación protésica, fascitis necrotizante (Kowalski, Agger, 2009) artritis e infección del injerto protésico, incluyendo fístulas de diálisis (Zeitlin y cols., 1982). • Abcesos cerebrales y espinales (Eckburg, Montoya, 2001). • La peritonitis puede ocurrir en pacientes tratados con diálisis peritoneal continua ambulatoria y aquellos con cirrosis (Dylewski, 1996). 8.1 PERÍODO DE INCUBACIÓN El período de incubación de la gastroenteritis por Listeria es más corto que el período de incubación de la enfermedad invasiva (Ooi, Lorber, 2005). Para la gastroenteritis, el período de incubación promedio es de 24 horas, con un intervalo de horas a 6-10 días aproximadamente, después de haber ingerido una dosis alta del patógeno a través de alimentos. Para la listeriosis invasiva el período de incubación promedio es de 21 días (Allerberger, Wagner, 2010). Los datos de investigaciones de brotes e informes de casos recientes, han mostrado algunas diferencias en los períodos de incubación de distintas formas de listeriosis invasiva. Según esos estudios, el período de incubación de listeriosis asociada a embarazo puede variar entre 17-67 días aproximadamente. En el caso de bacteremia suele encontrarse entre 1-12 días y en caso de meningitis, puede variar entre 1 y 14 días (King y cols., 2013). 8. 2 DIAGNÓSTICO El diagnóstico de la infección por Listeria puede sospecharse a partir de los hallazgos clínicos. No hay forma clínica para distinguir la infección provocada por Listeria de muchas otras enfermedades infecciosas que pueden conducir a la fiebre y síntomas constitucionales Shetty y cols., 2009). Como resultado, el diagnóstico sólo puede establecerse mediante el cultivo del organismo a partir del líquido cefalorraquídeo o la sangre. Para llegar al diagnóstico es importante tener un alto grado de sospecha clínica y buscar el antecedente epidemiológico de consumo de alimentos sospechosos, sobre todo lácteos, especialmente en el contexto de pacientes inmunodeprimidos o embarazadas. Por este motivo la obtención de hemocultivos 32 deben ser considerados en cualquier mujer embarazada con síntomas febriles, cuando no hay una explicación alternativa y evidente. Además el cultivo vaginal o cultivos de heces no son útiles en el diagnóstico, debido a que algunas de las mujeres son portadoras asintomáticas (Jankiraman, 2008). L. monocytogenes se pueden cultivar fácilmente a partir de especímenes clínicos tales como sangre, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido amniótico, placenta, meconio, loquios, lavados gástricos o hisopos para los oídos de los recién nacidos, mediante siembra directa del material en placas de agar sangre y e incubándose durante una noche a 35 grados en atmósfera ambiente (Armstrong, Brainstem, 1993; Olivares, 2009). -En la mayoría de los estudios de meningitis por Listeria, el análisis del LCR revela una pleocitosis que se relaciona típicamente con una elevación moderada en la concentración de proteínas y puede estar asociada con una baja concentración de glucosa. La infección por Listeria es la principal causa de meningitis bacteriana (no tuberculosa) en la que se puede encontrar un número de linfocitos en el LCR (> 25 por ciento) (Mylonakis y col., 1998). - En cuanto a la romboencefalitis, la mayoría de los casos ocurren en adultos previamente sanos; no hay casos registrados en lactantes. El diagnóstico diferencial de rombencefalitis incluye una serie de enfermedades infecciosas y no infecciosas (Kayaaslan y cols., 2009). Aunque Listeria monocytogenes es la causa infecciosa más común de rombencefalitis, el análisis del líquido cefalorraquídeo (LCR) a menudo revela sólo alteraciones leves, lo que puede retrasar el diagnóstico (Armstrong, Fung, 1993). Los cultivos de líquido cefalorraquídeo son positivos en 40% de los casos y los hemocultivos, en 60 a 70% de ellos. -En el caso de cerebritis, los hemocultivos a menudo son positivos y los niveles de glucosa en LCR son normales en dos tercios de los casos. -La PCR es la única prueba utilizada para la detección rápida de L. monocytogenes en muestras clínicas. El ensayo de PCR es particularmente útil cuando la administración previa de los agentes antimicrobianos es susceptible de comprometer los cultivos (Shetty y cols., 2009). -El cultivo de heces para la Listeria no está indicado en pacientes con listeriosis sistémica. Sin embargo, es un buen método en pacientes con sospecha de gastroenteritis por Listeria, o cuando se investiga un brote de listeriosis. Se deben utilizar medios selectivos especiales ya que, los cultivos de rutina para los patógenos entéricos, no soportan el crecimiento de Listeria. 33 8. 3 TRATAMIENTO Existen dos factores que dificultan el tratamiento de la listeriosis: primero, los pacientes afectados generalmente son inmunocomprometidos, por lo tanto, presentan cuadros atípicos. Segundo, el ciclo de vida intracelular y la formación de granulomas en los tejidos dificultan una rápida respuesta al antibiótico, ya que se requieren altas concentraciones intracelulares. El tratamiento más recomendado es la combinación sinérgica de dos antibióticos; ampicilina o penicilina, más gentamicina, por vía intravenosa (Hof, 2003). La eficacia clínica de penicilina y ampicilina es solamente bacteriostática contra L. monocytogenes, dándole importancia a los propios mecanismos de defensa celular del cuerpo. El uso de gentamicina como coadyuvante no debe ser prescrito para mujeres embarazadas, debido a que puede provocar efectos tertogénicos (Jacobson, 2008). No obstante, Listeria monocytogenes es sensible a muchos más antibióticos, de ahí que sea posible el uso de alternativas. Sin embargo, presenta resistencia frente a las cefalosporinas de tercera generación, que son medicamentos de primera línea frente a la meningitis (Lungu y cols., 2011). En caso de alergia se recomiendan cotrimoxazol y trimetroprim (Tunkel y cols., 2004). Sin embargo, el clotrimoxazol no debe ser utilizado en el primer trimestre de embarazo, ya que puede limitar la interrupción del metabolismo del ácido fólico y provocar defectos en el tubo neural, ni en el tercer trimestre por riesgo de kernicterus (Lamont y cols., 2011) en embarazadas se podría utilizar vancomicina o meropenem por vía intravenosa (Temple, Nahata, 2000; Lin y cols., 2013). Algunos de las alternativas que podrían hacer frente a L. monocytogenes, serían Linezolid, macrólidos, meropenem, vancomicina y rifampicina, sin embargo su utilización y eficacia son inciertas y han dado lugar a polémica (Allerberger, Dierich, 1992). En cuanto a la duración de la terapia, en pacientes inmunocompetentes se recomienda dos semanas en bacteriemias y entre dos semanas y cuatro semanas en caso de infección del SNC. En pacientes inmunocomprometidos el tratamiento se prolonga entre tres y seis semanas en cuadros de bacteriemia y entre cuatro y ocho semanas en infecciones del sistema nervioso central. (Olivares, 2009). CONCLUSIONES 1. Listeria monocytogenes es un patógeno intracelular facultativo que provoca infección intestinal, y enfermedades invasivas como meningitis y bacteriemia. Los principales grupos de riesgo son embarazadas, neonatos e inmunodeprimidos. 2. Si bien la incidencia no es muy alta, se debe conceder mayor importancia a Listeria monocytogenes por su alta tasa de mortalidad, así como a la morbilidad de algunas de la enfermedades que produce. 34 3. En los últimos años se está registrando un incremento de los casos, motivado por el consumo de alimentos precocinados y listos para el consumo y a su declaración como EDO en países europeos. 4. Dada la vulnerabilidad de neonatos y niños menores de tres años, el control microbiológico de los alimentos para lactantes es de los más exhaustivos, equiparándose al de los alimentos para usos médicos especiales. El control de Listeria se debe efectuar durante todo el proceso del alimento, desde su producción por las empresas alimentarias y durante toda la vida útil del producto comercializado. 5. La declaración de la listeriosis como EDO en España, al igual que ya se había hecho en la mayoría de los países europeos y en Andalucía, contribuirá a tener un mayor control epidemiológico. 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