Recuperación y rehabilitación de suelos contaminados con elementos traza mediante la aplicación de enmiendas y el establecimiento de una cubierta vegetal natural o de una planta de crecimiento rápido (Paulownia fortunei)

Recuperación y rehabilitación de suelos contaminados con elementos traza mediante la aplicación de enmiendas y el establecimiento de una cubierta vegetal natural o de una planta de crecimiento rápido (Paulownia fortunei). Memoria que presenta Jian Xiong Para optar al título de Doctor por la Universidad de Sevilla Sevilla, septiembre de 2015 Recuperación y rehabilitación de suelos contaminados con elementos traza mediante la aplicación de enmiendas y el establecimiento de una cubierta vegetal natural o de una planta de crecimiento rápido (Paulownia fortunei). Visado en Sevilla, septiembre de 2015 LOS DIRECTORES Dr. D. Francisco de Paula Cabrera Capitán Dra. Dña. Engracia María Madejón Rodríguez Profesor de Investigación Investigador Científico IRNAS, CSIC IRNAS, CSIC EL TUTOR Dra. Dña. Rosario Vaz Pardal Profesor Titular de la Universidad de Sevilla DOCTOR D. JOSÉ ENRIQUE FERNÁNDEZ LUQUE, DIRECTOR DEL INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA (IRNAS) DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC) Certifica: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Recuperación y rehabilitación de suelos contaminados con elementos traza mediante la aplicación de enmiendas y el establecimiento de una cubierta vegetal natural o de una planta de crecimiento rápido (Paulownia fortunei)”, presentada por D. Jian Xiong para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en el Departamento de Protección del Sistema Suelo, Planta, Agua del IRNAS, bajo la dirección de los Drs. D. Francisco de Paula Cabrera Capitán y Dña. Engracia María Madejón Rodríguez, reuniendo todas las condiciones exigidas a los trabajos de Tesis Doctorales. En Sevilla, septiembre de 2015 El presente trabajo de investigación se ha realizado gracias a una beca predoctoral del China Scholarship Council, en el marco de las actividades del grupo de investigación de la Junta de Andalucía, Utilización de Fertilizantes. Impacto Ambiental (UTFERTIM), Programa Operativo FEDER de Andalucía 2007-2013 (PAIDI AGR108), del proyecto de Investigación de Excelencia de la Junta de Andalucía (RNM-6398) y del proyecto de Plan Nacional de Investigación (AGL2011-23617). AGRADECIMIENTOS A los Drs. Francisco Cabrera y Engracia Madejón, directores de este trabajo, por su interés, implicación y conocimientos transmitidos, por su ayuda en la sistematización y estructuración del trabajo, por sus correcciones y sugerencias en el contenido, por sus enseñanzas en el análisis estadístico de los datos y en la interpretación de los resultados, por su dedicación desde el inicio hasta la redacción final, y sobre todo por su paciencia y amistad, sin su ayuda no estaría aquí hoy. Muchas Gracias. A la Dra. María del Rosario Vaz, tutor de este trabajo, por haber aceptado la tutoría del mismo, así como por su amabilidad y disponibilidad para cualquier consulta. A la dirección del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla IRNAS-CSIC, por haber permitido el desarrollo de este trabajo en sus instalaciones. A todo el personal del Departamento “Protección del sistema suelo, planta, agua” y a todo el personal del IRNAS, especialmente a Paula, Patri, Rosa, Iván, Lisa y Marco por su compañía, por su ayuda en mi trabajo, por haber hecho más agradables los días pasados en el Instituto y por haberme ayudado a conocer el ambiente de Sevilla. A Piluka, Chona, Cristina, Eli, Rocío y Álvaro y todo los que trabajan en el laboratorio de análisis por el interés y la disponibilidad mostrada hacia mi trabajo y por tratarme siempre tan bien. A Ignacio Girón por ayudarme en todas mis instalaciones y por todos los favores realizados que han facilitado muchísimo el desarrollo del experimento. A mis padres y mis hermanas por darme lo mejor de ellos y por su apoyo constante incluso en la distancia. A los compañeros del curso de doctorado por haber hecho más interesante y alegre todas las clases. A todos mis amigos sevillanos o no, que aunque no hayan participado en mi trabajo me han hecho pasar buenos ratos y por todas las risas compartidas cuando más lo necesitaba. Resumen ii la cantidad y calidad de la biomasa obtenida; 5) el estudio del efecto de enmiendas en la translocación de elementos traza a la parte aérea de las plantas. El experimento de campo se llevó a cabo en una parcela (20 x 50m) de suelo ácido contaminado con As, Cd, Cu, Zn y Pb, que se dividió en 12 subparcelas de 7 × 8 metros cada una, con un pasillo de 1 m (largo) y 2 m (ancho) entre las subparcelas. Se establecieron tres tratamientos con enmienda: SL (espuma de azucarera), BC (compost de biosólidos), y LESL (mezcla de leonardita y espuma de azucarera) y un tratamiento control (NA) sin adición de enmiendas, siguiendo un diseño de bloques completos al azar con tres repeticiones por tratamiento. Las dosis de enmienda fueron: BC: 30 Mg ha-1 año-1, SL: 30 Mg ha-1 año-1, y LESL: 25 Mg ha-1 año-1 más 10 Mg ha-1 año-1 de SL. En una primera fase del experimento las enmiendas se aplicaron durante dos años consecutivos (octubre de 2002 y octubre de 2003), dosis DO2. En la segunda etapa del experimento, cada subparcela se subdividió en dos mitades iguales. Una mitad se mantuvo sin enmendar en los años siguientes (dosis, DO2) (SL2, BC2 y LESL2), mientras que la otra mitad recibió nuevas enmiendas en octubre de 2005 y octubre de 2006; dosis, DO4 (SL4, BC4 y LESL4). En 2011, a los ocho años de la primera aplicación de enmiendas, los valores medios de pH de los suelos (0-15 cm) de las parcelas enmendadas era fue más alto que el de las que no recibieron enmiendas, observándose los valores más altos en los suelos tratados con SL (hasta 3,6 unidades respecto al tratamiento NA). Los valores medios de carbono orgánico total (COT) también resultaron más altos en las parcelas enmendadas, correspondiendo el más alto al tratamiento LESL4 (2,3 veces mayor que en NA). En general, la aplicación de enmiendas aumentó las concentraciones medias de N-Kjedhal, P-Olsen y K-disponible de los suelos. Las enmiendas redujeron las “disponibilidad” de Cd, Cu y Zn estimada mediante las concentraciones en los extractos con 0,01 M CaCl2, respecto a los correspondientes en el suelo sin enmendar, obteniéndose los valores más bajos de Cd y Zn en el tratamiento con SL, y los de Cu en el tratamiento con BC. Las actividades enzimáticas estudiadas (deshidrogenasa, aril-sulfatasa, ß-glucosidasa, fosfatasa ácida y ureasa) también aumentaron notablemente en las parcelas enmendadas. El cálculo de índices de contaminación, fertilidad química y fertilidad bioquímica mediante los diagramas de Rayos de Sol, mostró que la contaminación por Cd, Cu y Zn disminuyó con las enmiendas (hasta un 83% en SL4). La fertilidad química aumentó hasta 9,2 veces en el tratamiento BC4 y 8,5 en SL2, respecto a NA. Asimismo, la fertilidad bioquímica aumento hasta 13,2 y 11,2 veces respecto a NA en los Resumen iii tratamientos SL2 y BC4. Estos aumentos de la calidad de los suelos dieron lugar a aumentos de la colonización por especies espontáneas que llegó a producir recubrimientos de hasta el 98%. La existencia de datos anteriores a 2011, permitió estudiar la evolución de algunas propiedades de los suelos durante todo el período experimental. Así por ejemplo, el valor medio pH aumentó en los suelos enmendados hasta después de la última aplicación, observándose pocas diferencias entre los tratamientos DO2 y DO4. En cambio, en los valores medios del COT que siguen una pauta similar a la del pH, sí se aprecian valores más altos con la dosis DO4 en las parcelas con enmiendas orgánicas. La “disponibilidad” de Cd, Cu y Zn sigue una pauta inversa a la del pH y COT, es decir disminuye desde el principio del experimento hasta después de la última aplicación en todos los tratamientos, incluido el suelo sin enmendar. Esto último es un signo de recuperación natural del suelo NA, debido a la reacción de los elementos traza con los componentes del suelo, que aumenta con el tiempo, así como al aumento de la materia orgánica del suelo debido a la descomposición de las partes aéreas y raíces de las plantas que colonizaron estas parcelas. La aplicación de enmiendas a un suelo ácido contaminado con elementos traza disminuye la “disponibilidad” de los mismos a la vez que aumenta la fertilidad química y bioquímica, lo que coadyuva a la colonización por especies vegetales espontáneas de las parcelas contaminadas. El experimento en contenedores al aire libre (condiciones de semicampo), se llevó a cabo en 27 contenedores de 90 l y 1 metro de altura, que se llenaron con los primeros 15 cm de dos suelos moderadamente contaminados con elementos traza (AZ pH 6,9 y V pH 3,7) y uno no contaminado, NC (pH 7,5). Por cada suelo se establecieron tres tratamientos: compost de alperujo (AC, pH 8,10; MO, 29,1%), compost de biosólidos (BC, pH 7,09; MO, 22,6%) y un control sin adición de enmienda. Los contenedores se dispusieron siguiendo un diseño de bloques al azar con tres réplicas por tratamiento. En cada contenedor se plantó una planta de Paulownia. fortunei de 10-15 cm. Las enmiendas se añadieron en noviembre 2011 a razón de 30 Mg ha-1 en todos los suelos, más 25 Mg ha-1 en marzo 2012 en el suelo V. Los contenedores se regaron por goteo diariamente (333 ml al día) entre mayo y octubre. Las enmiendas dieron lugar a aumentos del pH respecto al control en los tres suelos, aunque las diferencias sólo fueron significativas en los suelos NC y V. Los Resumen iv valores medios de COT, N-Kjeldhal y de P-Olsen también aumentaron con las enmiendas. También se observó un aumento del K-disponible medio en los tratamientos con compost de alperujo (AC), que contiene un 2,8% de K, en comparación con el BC (0,82% K). La aplicación de las enmiendas redujo los valores medios de Cd, Cu y Zn disponibles en los dos suelos contaminados, y especialmente en el suelo ácido contaminado (V). La presencia de la planta y la aplicación de enmiendas hicieron decrecer el Cd disponible al final del experimento hasta valores por debajo del límite de detección del método empleado (0,01 mg kg-1). La efectividad de ambas enmiendas para reducir la concentración de Cd, Cu y Zn disponibles fue muy similar respecto a los suelos no enmendados. Las concentraciones de As y Pb disponibles fueron siempre menores que límite de detección del método utilizado (0,01 mg l-1 en el extracto, equivalente a 0,1 mg kg-1 en el suelo). Los valores medios de las actividades enzimáticas también aumentaron en los suelos enmendados. Al final del experimento, mejoraron las propiedades químicas y bioquímicas, y disminuyó la “disponibilidad” de los elementos traza de todos los suelos de los tres tratamientos. En los suelos sin enmendar, estas mejoras deben atribuirse a la presencia de la planta. Respecto al crecimiento de las plantas de Paulownia, los valores medios de altura, diámetro y biomasa de las mismas fueron distintos en cada tipo de suelo, observándose los valores más bajos en el suelo contaminado ácido, V, en el que las enmiendas contribuyeron especialmente al aumento de los parámetros relacionados con el crecimiento. Las concentraciones de N, P y K en hojas de Paulownia fueron mayores que los valores medios normales prácticamente en todos los casos. En general dichas concentraciones fueron muy similares en los suelos NC y AZ y algo más bajas en el suelo V. Solamente se observaron aumentos de las concentraciones de dichos elementos, atribuibles a las enmiendas, en el contenido en N de las plantas que crecieron en el suelo NC y de los tres nutrientes de las plantas que crecieron en el suelo V, si bien no siempre las diferencias fueron significativas. Los valores medios de las concentraciones de As, Cd, Cu, Pb y Zn en hojas de Paulownia de los tres suelos estudiados no mostraron diferencias significativas atribuibles a las enmiendas, y estuvieron dentro de los intervalos normales, a excepción de las de Cu, que superaron el límite superior del intervalo debido a la capacidad de esta planta para acumular de este elemento. La tendencia de los coeficientes de transferencia fue la misma en los tres Resumen v suelos: Pb<As<Cd<Zn<Cu, con las únicas anomalías en Pb y Zn en el suelo V, que en este caso es Cu<Zn. En el tronco y las raíces tampoco se observaron diferencias significativas atribuibles a las enmiendas en las concentraciones medias de los elementos traza, cuyos valores siguieron distintas tendencias para cada elemento. Así, los elementos menos móviles (As y Pb) se acumulan en las raíces, y el Cd, más móvil, en las hojas. Las concentraciones medias de Zn y Cu fueron muy similares en las tres partes estudiadas de las planta. Las cantidades totales extraídas del suelo por la planta fueron muy bajas, < 2‰ del contenido en el suelo, por lo que esta planta no puede considerarse como una especie fitoextractora, al menos bajo las condiciones del presente estudio. Sin embargo, el hecho de que esta planta crezca en suelos contaminados y que su crecimiento mejore con la adición de enmiendas, la hacen viable para la fitoestabilización de dichos elementos, permitiendo a su vez la utilización de esos suelos para la obtención de su biomasa con fines energéticos. Los resultados obtenidos muestran que el uso combinado de P. fortunei y la adición enmiendas orgánicas al suelo podría ser una estrategia factible para la recuperación de áreas contaminadas con elementos traza bajo clima mediterráneo y promover su valorización económica. Summary vi Remediation and rehabilitation of soils contaminated with trace elements by applying amendments and the establishment of a natural vegetative cover or of a fast growth plant (Paulownia fortunei). Summary The remediation of soils contaminated with trace elements is a difficult task, because of the toxicity, immutability and relative immobility of these elements in the soil. For these reasons, the contamination with trace elements in soils is permanent, because the complete removal of these elements from soil, without altering its properties is in most cases practically impossible. The conventional technologies for the remediation of soils contaminated with trace elements, by removing or stabilizing (isolation and sealed), and by more innovative ones (physical-chemical acid extraction and electric-osmosis washing, or in situ immobilization by vitrification), are very drastic, expensive and pose an important deterioration for the soil and the environment. The application of these technologies affects negatively the ecological activity of the soil and its productivity, so they are no longer suitable for the cultivation or the development of plants. There are others techniques of in situ stabilization which do not disturb the environment and that at the same time ensure the maintenance of its quality, though not involve strict decontamination. Among these techniques is the so-called assisted natural remediation or attenuation, based on the enhancing, through the application of amendments, of series processes that occur naturally in the soils and contribute to the stabilization of the contaminants. The establishment of a natural or induced vegetation in the amended soils also favors their remediation (phytoremediation). In the present Thesis two experiments of assisted natural remediation of soils contaminated with trace elements were carried out, one under field conditions and another in outdoor containers (semi-field conditions). The main objectives of both experiments were: 1) to study effect of amendments on the chemical and biochemical properties of contaminated soils with trace elements; 2) to evaluate the effect of the amendments on the changes of the trace elements bioavailable concentrations in middle and long terms; 3) to study the effect of the amendments on the growth of spontaneous vegetation; 4) to evaluate the effect of the amendments on the development of a fastgrowing species (Paulownia foutunei) and on the quantity and quality of its biomass; 5) to study the effect of the amendments on the trace elements translocation to plant shoot. The field experiment was carried out in a plot (20 × 50m) of acid soil contaminated with As, Cd, Cu, Zn and Pb, which was divided in 12 subplots of 7 × 8 Summary vii meters each, with spacing of 1 m (long) and 2 m (wide) between the plots. Three treatments with amendments were established: SL (sugar beet lime), BC (biosolid compost) and LESL (mixture of leonardite and sugar beet lime) and one treatment control (NA) without amendment addition, according a complete randomized block design with four treatments and three replicates. The amendment doses were: BC: 30 Mg ha-1 year-1, SL: 30 Mg ha-1 year-1, y LESL: 25 Mg ha-1 year-1 más 10 Mg ha-1 year-1 de SL. In a first phase of the experiment the amendments were applied during two consecutive years (October 2002 and October 2003), dose DO2. In the second stage of the experiment each subplot were subdivided in two equal halves. One half did not received any more amendment in the following years (dose, DO2; SL2, BC2 and LESL2), meanwhile the other half received new dose of amendments in October 2005 and October 2006 (dose, DO4; SL4, BC4 and LESL4). In 2011, eight years after the first amendment application, the mean pH values of the soils (0-15 cm) of the amended plots were much higher than those not receiving amendments; the highest pH values were observed in soils treated with SL (up to 3.6 unites respect to treatment NA). The highest mean values of TOC also were found in amended plots, and the highest of them in treatment LESL4 (2.3 times more than in NA). In general, the application of amendments increased the mean concentrations of Kjedhal-N, Olsen-P, available-K of the soils. Amendments reduced the “availability” of Cd, Cu and Zn (estimated by the concentration of the 0.01 M CaCl2 extracts) compared to the value in non-amended soil; the lowest values of Cd and Zn were found in the treatment with SL, and those of Cu in the treatment with BC. The enzymatic activities studied (dehydrogenase, aryl-sulfatase, ß-glucosidase, acid phosphatase and urease) also increased notably in the amended plots. The calculated index of pollution and chemical and biochemical fertility by the diagram Sun Ray Plots, showed that the contamination by Cd, Cu and Zn diminished with amendments (up to a 83% in SL4). The chemical fertility increased until 9.2 times in the treatment BC4 and 8.5 in SL2, compared to NA. At the same time, the biochemical fertility increased until 13.2 and 11.2 times compared to NA in the treatments SL2 and BC4. The increases of the soils quality gave rise to increases of the colonization by spontaneous species, producing plant covering of up to 98%. The existence of data before 2011, allowed the study of the evolution of some soil properties throughout the experimental period. For example, the average pH values Summary viii went on increasing in the amended soils up to after the last application; few differences were found between DO2 and DO4 treatments. The mean total organic carbon (TOC) values had similar pattern than pH, but the highest values were found in organic amendment plots of dose DO4. Cadmium, Cu and Zn “availability” followed an inverse that those of pH and TOC, i.e.: means values diminished from the beginning of the experiment till the amendment applications ceased in all the treatments, including the no amended soils. The latter is a sign of natural remediation of soil NA, due to the reaction of the trace elements with the soil components, which increase with time, and also to the increase of the organic material in soil due to the breakdown of plant shoots and roots colonized these plots. The application of amendments to a trace element contaminated acid soil decreased their “availability” and at the same time increased the chemical and biochemical fertility of the soil, and enhances the colonization of contaminated plots by spontaneous vegetable species. The experiment in containers outdoor (semifield condition), was carried out in 27 containers of 90 l and 1 meter height, filled with the upper layer (15 cm) of two soils moderately contaminated with trace elements (AZ pH 6.9 and V pH 3.7) and of a not contaminated soil, NC (pH 7,5), as control. Three treatments were established for each soil: alperujo compost (AC, pH 8.10; MO, 29.1%), biosolid compost (BC, pH 7.09; MO, 22.6%) and one control without amendment addition. The containers were arranged following a design of random blocks with three replicates per treatments. In each container, was planted one plant of Paulownia fortunei of 10-15 cm, height. The amendments were added in November 2011 at dose of 30 Mg ha-1 in all the soils, plus 25 Mg ha-1 in March 2012 only in the soil V. The containers were irrigated by drip daily (333 ml every day) between May and October. The amendments caused increases of pH compared to control in the three soils, although the differences were only significant in the soils NC and V. Mean values of TOC, Kjeldhal-N and Olsen-P also increased with the amendments. An increase of mean available-K in the treatments with alperujo compost (AC) was observed; AC contains 2.8% of K, while BC only contains 0.82% K. The application of amendments reduced the mean values of “available” Cd, Cu and Zn in the two contaminated soils, especially in the acid contaminated soil (V). The presence of the plant and the application of amendments decreased available Cd at the end of the experiment down to values lower than the detection method limit (0.01 mg kg-1) of the analytical method. Summary ix The effectiveness of both amendments to reduce the concentration of available Cd, Cu and Zn regarding non-amended soils were very similar. The concentrations of available As and Pb were always lower than the detection method limit used (0.01 mg l-1 in the extract, equivalent to 0.1 mg kg-1 in the soil). The mean values of enzymatic activities also increased in the amended soils. At the end of the experiment, both amendments improved the chemical and biochemical properties and decreased the “availability” of the trace elements in the soils. In the non-amended soils, these increases should attribute to the presence of the plant. Regarding the growth of the Paulownia plants, their mean values of height, diameter and biomass were different in each type of soil. The lowest values were observed in contaminated acid soil (V), in which amendments enhanced the parameters related with the plant growing Practically in all the cases the concentrations of N, P and K in Paulownia leaves were higher than the mean normal values for this species. In general these concentrations were very similar in the soils NC and AZ and some lower in the soil V. It was only observed increases of the concentrations of the three nutrients, attributed to the amendments, in the concentration of N of the plants growing in soil NC, and in the concentrations of N, P, and K of the plants of soil V, although the differences were not always significant. The mean concentrations of As, Cd, Cu, Pb and Zn in leaves of Paulownia of the three soils studied showed no significant differences due to the amendments, and were within normal ranges, except for Cu, that they exceeded the upper limit of the range due to the ability of the plant to accumulate this element.The trend of the transfer coefficients was the same in the three soils: Pb<As<Cd<Zn<Cu, with the only anomaly of Pb and Zn in soil V, which in this case is Cu<Zn. In the trunk and roots no significant differences due to amendments were observed in the mean concentrations of the trace elements. These values followed different trends for each element. Thus, the less mobile elements (As and Pb) accumulated in the roots, while Cd, more mobile, accumulated in the leaves. Mean concentrations of Zn and Cu were very similar in the three parts of the plant. The total amount of trace elements extracted from soil by this plant was very low (< 2‰ of the content in the soil), and consequently this plant cannot be considered as a phytoextractor species, at least under the conditions of this study. However, this plant is able to grow in contaminated soils, improving its development with the addition of amendments. This fact makes this species viable for Summary x the phytostabilization of these elements, allowing the use of these soils for the production of biomass for energetic purpose. The results show that the combined use of P. fortunei and the aplication of organic amendments to trace elements contaminated soils could be a feasible strategy for the remediation of areas contaminated with trace elements under Mediterranean climate, thus promoting their economic valuation. 论文摘要 xi 被微量元素污染土壤的修复和再生通过施用添加剂和一个自然覆盖植被的建立或 者一种快速生长植物（ 白花泡桐 ） 论文摘要 修复被微量元素污染的土壤意味着一项困难的任务，由于在土壤中这些元素的毒 性，不变性和相对不移动性。因为这些原因，土壤被微量元素污染是永久的，要 完全从土壤中去除这些元素，而不改变它的性质，从大多数案例来说，基本上是 不可能的。常规的修复土壤被微量元素污染的技术，通过去除或者稳定（隔绝和 封印），同时还有其他创新者（通过酸洗和电渗透物理-化学提取，或者通过玻 璃化原位固定），是非常猛烈的，昂贵的和意味着一个重要的恶化土壤和环境的 因素。这些技术的应用对土壤生态活力和它的生产力带来负面影响，所以不适合 农作物和植物的生长。 存在其他可以原位施展的稳定技术而不会扰乱环境和确保同时维持土壤质 量，尽管不是严格的去污染。在这些技术中有被命名的辅助自然修复或减轻，它 基于潜力，通过施加添加剂，和一系列的过程，自然地发生在土壤中并有贡献于 污染物的稳定。一个自然或引入植被的建立在被添加的土壤中同时帮助其自身的 修复（植物修复）。 在本论文中开展了两个辅助自然修复被微量元素污染土壤的实验，一个是 在野外条件下和另一个在室外实验大桶（半野外条件）。这些实验的主要目的 是：1）研究添加剂对被微量元素污染土壤的化学和生物化学性质的影响；2）评 估添加剂对微量元素中期和长期的生物有效态含量变化的影响；3）研究添加剂 对自生植被生长的影响；4）评估添加剂对快速生长树种（泡桐）的生长和获得 的生物量的数量和质量的影响；5）研究添加剂对微量元素向植物地上部迁移的 影响. 野外实验建立在一个被砷，镉，铜，锌和铅污染的酸性土壤试验田 （20*50米），它被等分为12个7*8米每个的小田块，和一个过道1米（长）和2米 （宽）在小田块之间。建立了三个有添加剂的处理：SL（甜菜石灰），BC（生物 堆肥），和LESL（甜菜石灰和遏煤）和一个对照处理（NA）不施加添加剂，根据 一个区域的完全随机设计和每种处理三个重复。添加剂的剂量为：BC：30 Mg 公 顷-1 年-1, SL: 30 Mg 公顷-1 年-1, 和 LESL: 25 Mg 公顷-1 年-1 加 10 Mg 公顷-1 年-1 的SL. 在实验的第一阶段连续两年（2002年10月和2003年10月）施加添加剂，剂 I. INTRODUCCIÓN 4 biogeoquímico y que aparezcan en él cantidades anómalas de determinadas sustancias, lo que origina modificaciones importantes en sus propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo. Dichas modificaciones dan lugar a la disminución de la amortiguación o a la pérdida de la capacidad de depuración del suelo, afectando negativamente a la salud del mismo (Adriano 2001; Bolt and Bruggenwert 1976). El término “salud del suelo” está relacionado con el de calidad del suelo, para muchos autores ambos términos son sinónimos, pero que se diferencian en que el segundo hace referencia a la aptitud del suelo para un uso específico, mientras que el primero está relacionado con la sostenibilidad (Doran y Zeiss, 2000). Según Doran y Safley (1997) la salud del suelo es la capacidad continua de un suelo para funcionar como un sistema vital dentro de los límites del ecosistema y de su uso, sustentar la productividad biológica, potenciar la calidad del aire y del agua y mantener la salud de las plantas, de los animales y de los seres humanos. La salud del suelo es de vital importancia para el buen funcionamiento de nuestra sociedad, puesto que el suelo está implicado en una amplia variedad de funciones como son la producción de alimento y biomasa, y el almacenamiento de nutrientes y carbono. En nuestros días, estas funciones se encuentran amenazadas por la potencial degradación causada por la interacción de factores bio-físicos, socio-económicos y políticos (EC 2012; Jones, 2012; Warren, 2002). En la actualidad, la contaminación del suelo es uno de los principales problemas ambientales a escala global. A nivel europeo, se estima que el número de enclaves potencialmente contaminados es superior a los 2,5 millones (Panagos et al., 2013). De entre las formas de contaminación de suelo, los metales pesados y los hidrocarburos constituyen el principal grupo de contaminantes en la contaminación edáfica en la Unión Europea, contribuyendo al 60 % de los casos de contaminación. Otras de las amenazas que afectan a la salud del suelo es su degradación, que resulta de la acción de múltiples procesos que ocasionan la pérdida o disminución de la productividad y afectan sus propiedades físicas, químicas y/o biológicas. Ente los procesos que más degradan el suelo, destacan algunos sistemas de manejo agrícola de los mismos, que producen cambios físicos de la estructura, principalmente por la compactación y formación de costras. La pérdida de nutrientes, la salinización, acidificación y la contaminación son indicadores de procesos de degradación química que sufren los suelos como consecuencia de prácticas agrícolas inadecuadas. I. INTRODUCCIÓN 5 I.2. Concepto de biodisponibilidad de los contaminantes Como se ha comentado anteriormente, la contaminación del suelo tiene lugar cuando la concentración de una determinada sustancia sobrepasa su capacidad amortiguadora. Un suelo está contaminado cuando contiene una determinada sustancia, resultado de su exposición a una determinada actividad humana, que no tiene otro suelo similar no expuesto a dicha actividad. Sin embargo, la presencia de un contaminante no implica necesariamente el daño a la funcionalidad del propio suelo, o a los organismos que viven en él. Un suelo se considera dañado cuando produce cosechas insatisfactorias en cantidad y calidad y /o en sus aguas de escorrentía o de drenaje se detecta alguna sustancia indeseable. Por tanto, hay que tener en cuenta que los efectos negativos de los contaminantes no están provocados directamente por la concentración total del propio contaminante en el suelo, sino por la proporción del contaminante que es capaz de afectar negativamente a los organismo que viven en él o a sus aguas de escorrentía y drenaje, es decir, la cantidad de contaminante móvil o biodisponible. Por consiguiente, es necesario conocer en cada caso particular, de la manera más exacta y realista posible la concentración de un contaminante (dentro de la matriz total) a la que está expuesto los organismos que viven en él, o que afecte a la disolución del suelo, esto es: la concentración de contaminante que móvil o biodisponible. En principio, los contaminantes que se encuentran en el medio externo al que se encuentra un organismo no son perjudiciales para éste, sin embargo, cuando los absorbe o asimila, pueden ocasionarles efectos negativos. Para que una sustancia pueda ser asimilada por un determinado organismo es necesario que se encuentre en forma biodisponible. La biodisponibilidad es un concepto central que atañe de dos disciplinas: la química ambiental (relacionada con la exposición del medio a los contaminantes) y ecotoxicología (relacionada con los efectos que tienen estos contaminantes en los organismos vivos). El concepto de biodisponibilidad integra aspectos tales como la concentración, el destino y la evolución de los contaminantes y toda la dinámica de los mismos en el suelo dentro de la disciplina de la química ambiental. Por otra parte, incluye los efectos en el ambiente y los organismos que viven en él, y cómo estos organismos vivos son capaces de establecer mecanismos por los cuales, a pesar de verse afectados por los contaminantes, pueden acumularlos, metabolizarlos o incluso eliminarlos (Hamelink et al., 1994). La Figura I.1 ilustra esta idea. I. INTRODUCCIÓN 6 En términos de química ambiental y de ecotoxicología, la definición de biodisponibilidad de un contaminante es bastante poco específica. No existe una única definición para este término sino más bien una multitud de descripciones e interpretaciones centradas en diferentes aspectos. Algunas definiciones de biodisponibilidad o de contaminante biodisponible más relevantes, propuestas por diferentes autores son las siguientes (Frische et al., 2003): a) Cantidad/porcentaje de un compuesto que realmente es tomado por un organismo como el resultado del equilibrio dinámico de procesos de consumo del organismo, y procesos de cambio relacionados con las partículas del suelo, todos ellos relacionados con un conjunto dinámico de condiciones ambientales (Eijsackers et al., 1997). b) Es un proceso complejo que incluye todas las clases de relaciones entre la concentración ambiental del contaminante y la parte de concentración que un organismo consume (Sijm et al., 2000). c) Especie química que es biológicamente accesible y que puede ser asimilada por un organismo y reaccionar con su metabolismo (Campbell, 1995). d) Fracción de la concentración total de un elemento que interacciona con un determinado organismo (Vangrosveld y Cunningham, 1998). Figura I.1. Biodisponibilidad de contaminantes Biodisponibilidad I. INTRODUCCIÓN 7 Como resultado de la integración de estas definiciones y de las discusiones llevadas a cabo en el “Workshop” “Bioavailability of Soil Contaminants: Problems and Perspectives“,18-19 Julio, 2002, Universidad de Bremen”, Frische et al., (2003) propusieron la siguiente definición: La biodisponibilidad describe procesos complejos de transferencia de masa y la ingesta de contaminantes por los organismos del suelo, que está determinada por las propiedades del contaminante y las del suelo, por la biología de los organismos y por las influencias climáticas. La fracción de contaminante biodisponible en el suelo representa la concentración de exposición relevante para los organismos de suelo. A partir de esta última definición general, probablemente la más completa, podemos deducir los factores que influyen en la biodisponibilidad de los contaminantes y que pueden clasificarse en tres categorías, según estén relacionadas con: 1) las características del organismo; 2) las propiedades del suelo; 3) las propiedades físicoquímicas del contaminante, todas ellas influenciadas por el clima y las condiciones ambientales (Figura.I.2).  Factores relacionados con el propio organismo. En el caso del presente estudio los organismos implicados son las plantas y los microorganismos del suelo. Hay que tener en cuenta que no todas las plantas tienen los mismos mecanismos de importación de las sustancias del suelo, ya que no tienen el mismo hábitat, morfología y fisiología. En el caso de los microorganismos no todos están adaptados de la misma manera a un determinado hábitat.  Factores relacionados con la naturaleza del contaminante: estereoquímica del compuesto (cuando se trata de moléculas), solubilidad en agua (cuanto más Figura I.2. Factores que influyen en la biodisponibilidad de contaminantes. I. INTRODUCCIÓN 8 soluble sea el compuesto más fácil tendrá la entrada al organismo), presión de vapor, pK, etc.  Factores relacionados con el propio suelo. El suelo es un sistema complejo con tres fases bien definidas: sólida, líquida y gaseosa. Estas fases están en equilibrio y relacionadas por procesos de intercambio. La composición del suelo y sus propiedades (especialmente pH, contenido de materia orgánica y capacidad de intercambio catiónico) tienen una gran influencia en todos los procesos de intercambio entra dichas fases. Muchos autores coinciden en que la fase líquida (el agua de la disolución del suelo) es el factor más influyente relacionado con la biodisponibilidad de los contaminantes. Así, todos aquellos procesos fisico-químicos que afectan a esta fase afectarán a la biodisponibilidad. En este sentido hay que empezar a diferenciar entre dos grupos de contaminantes que normalmente son los más frecuentes en los suelos: los contaminantes inorgánicos (v.gr.: elementos traza) y contaminantes orgánicos. De hecho entre ambos tipos de contaminantes existe una gran diferencia en su comportamiento en el suelo. Los orgánicos son susceptibles de degradarse, descomponerse, volatizarse e incluso desaparecer por acción de la biota del suelo. En cambio, los inorgánicos, como es el caso de los elementos traza, no se descomponen, ni se volatilizan en el suelo, con excepción de algunos metales, metaloides y halógenos que mediante procesos biológicos pueden reducirse a formas elementales volátiles (e.gr.: Hg), o a la síntesis de compuestos volátiles metilados o dimetilados (Wenzel et al., 1999; Chaney et al., 2010). En el caso particular de los elementos traza, según su biodisponibilidad (movilidad) éstos se encuentran en los suelos en las siguientes formas (orden creciente): 1) fácilmente solubles (en la disolución del suelo); 2) intercambiables (en el complejo de intercambio del suelo); 3) en forma de carbonatos; 4) asociados a los óxidos de Al, Fe y Mn; 5) unidos la materia orgánica y formando y sulfuros; 6) formando parte de las redes cristalinas de los minerales de la arcilla (Adriano, 2001) (Figura I.3). La fracción biodisponible está constituida fundamentalmente por las fracciones del elemento soluble e intercambiable (existente en los sitios de intercambio catiónico o aniónico de los componentes del suelo). Para que una sustancia esté biodisponible para las plantas (fitodisponible), tiene que estar en contacto con las raíces, ser móvil y estar en una forma accesible para las mismas. En los suelos, sólo una pequeña fracción del contenido total de un elemento traza, es fitodisponible, por lo que su determinación es I. INTRODUCCIÓN 9 tanto o más importante como la de su contenido total. La fitodisponibilidad de un determinado elemento traza en un suelo depende de factores del propio suelo (pH, potencial redox, textura, materia orgánica, composición mineral, régimen hídrico), así como de la propia planta (Kabata-Pendias, 2004). Existen métodos que permiten estimar la concentración de los elementos traza en cada una de las fracciones en que estos se encuentran distribuidos entre los componentes del suelo (Figura I.3). Estos son los denominados métodos de fraccionamiento o especiación, métodos operacionales, en los que se somete al suelo a una serie de extracciones secuenciales. En cada una de las extracciones se utilizan diferentes disoluciones para extraer selectivamente los elementos traza de cada uno de los componentes del suelo, estableciéndose distintas fracciones. El número de fracciones puede variar según el método, aunque tradicionalmente se han distinguido las siguientes: a) elementos solubles y fácilmente intercambiables o disponibles, b) elementos unidos a los carbonatos, c) elementos unidos a los óxidos de Fe y Mn, d) elementos unidos a la materia orgánica y a los sulfuros y e) elementos en la fracción Figura I.3. Secuencia de movilidad y biodisponibilidad de los elementos traza en el suelo. I. INTRODUCCIÓN 10 residual (Tessier et al., 1979; Salomons y Forstner, 1980; Pickering, 1986; Lena y Gade, 1997). En la primera fracción se encuentran las formas químicas más lábiles de los elementos, mientras que en la fracción residual se encuentran aquellas más fuertemente retenidas, como son las que forman parte de la estructura cristalina de los minerales del suelo. En el resto de fracciones los elementos traza muestran un grado de retención variable que está en función de algunos factores, como el pH y el potencial redox del suelo (Ahumada y Schalscha, 1993; Gambrell, 1994). En consecuencia, la separación de las diferentes formas químicas y mineralógicas de un elemento en el suelo puede ser útil para evaluar su movilidad y disponibilidad (Allen, 1997). A pesar de su amplia utilización, las fracciones definidas en estos procedimientos son completamente operacionales, por lo que la información que proporcionan es básicamente cualitativa y los datos obtenidos deben considerarse como orientativos. También es importante tener en cuenta que la utilización de diferentes metodologías puede dar lugar a resultados muy distintos (Ramos et al., 1994). Algunos problemas que surgen en este tipo de procedimientos, independientemente del protocolo empleado se deben a: a) la selectividad limitada de los extractantes empleados, lo que origina contaminación entre las distintas fracciones, b) la redistribución de los elementos traza durante el proceso de extracción o c) una sobrecarga del sistema químico si la concentración del elemento es demasiado alta (Shuman 1985; Pickering 1986; Rauret et al., 1989). Además estos métodos requieren métodos analíticos con alto grado de sensibilidad debido a que en muchos casos la cantidad de elementos traza extraído de alguna de las fracciones es muy pequeña. Por otra parte, estos métodos son tediosos y requieren especial pericia de personal de laboratorio (Adriano et al., 2004). Uno de los método más usados en la actualidad es la extracción secuencial en tres pasos, que da lugar a 4 fracciones distintas: 1) elementos solubles, fácilmente intercambiables y asociados a los carbonatos (F1), 2) elementos asociados a la fracción reducible (F2), 3) elementos asociados a la fracción oxidable (F3) y 4) elementos en la fracción residual (F4) (Rauret et al., 1999). Existen además métodos consistentes en una simple extracción con ácidos, con agentes quelatantes o con disoluciones salinas, tamponadas o sin tamponar (AEDT, ADTP, CaCl2, NaNO3, CH3COOH, Coca-Cola, etc.), para estimar la fitodisponibilidad. Estos métodos intentan diluir la disolución del suelo, extraer los elementos intercambiables e imitar la acción de los exudados de las raíces implicados en los mecanismos de importación de la planta. El extractante ideal sería aquel que I. INTRODUCCIÓN 11 reaccionase suavemente con los componentes del suelo y que cuyos resultados estuvieran correlacionados con las cantidades de elementos traza tomados por la mayoría de las plantas. Los resultados que se obtienen por estos métodos, si bien están en concordancia con las interacciones entre los elementos traza y los componentes del suelo, frecuentemente no sirven para predecir su interacción con los organismos vivos. Las plantas por ejemplo, no siempre toman un nutriente o contaminante proporcionalmente a la cantidad estimada por esos métodos (indicadoras), ya que pueden tener mecanismos, tanto para la importación de nutrientes y contaminantes, incluso cuando están en concentraciones muy bajas en los suelos (acumuladoras), como para excluirlos (exclusoras), incluso cuando la concentración externa es muy alta (Kabata-Pendias, 2004). Según algunos autores la medida de la concentración de elementos traza en organismos vivos (bioindicadores) es una aproximación más real para la estimación de la disponibilidad de contaminantes (Madejón et al., 2004; Remón et al., 2013). I.3. Elementos traza (ET) y su origen en el medioambiente. El presente estudio se centra en los suelos contaminados por elementos traza /ET) por lo que el tema se irá focalizando precisamente en este tipo de elementos. En primer lugar hay que indicar que los ET forman parte del patrimonio geológico terrestre en el que se distinguen tres grupos de elementos en función de su abundancia (White, 2001):  Elementos mayoritarios (O, Si, Al, Na, Mg, Ca y Fe).  Elementos minoritarios (H, C, S, K, P, Ti, Cr, Mn), que pueden ser mayoritarios en determinadas ocasiones.  Elementos traza, que son el resto de elementos. El término "elemento traza" se usa ampliamente en la literatura científica y puede tener distintos significados en diferentes disciplinas científicas. Generalmente este nombre se aplica a elementos que se encuentran en pequeñas concentraciones en los distintos compartimentos ambientales, tanto alterados, como no alterados, que cuando su biodisponibilidad es alta, son tóxicos para los organismos vivos, por lo que algunos autores los denominan elementos potencialmente tóxicos. Algunos elementos trazas son esenciales para el desarrollo de los organismos vivos (Fe, Mn, Cu, Zn, B, Mo, Co, Cl, Se, F, I, Si, Cr, V, Ti, As y Ni), y a otros no se les conoce función fisiológica alguna (Cd, Hg, Pb y As). Es frecuente encontrar otras denominaciones como micronutrientes, microelementos, elementos minoritarios, metales traza o metales I. INTRODUCCIÓN 12 pesados, para referirse a estos elementos, pero que no siempre incluyen a la totalidad de ellos (Adriano, 2001; Blum et al., 1998). Los términos micronutrientes, microelementos, elementos minoritarios, son aproximadamente equivalente, e incluyen elementos que son necesarios para el desarrollo de los seres vivos en concentraciones muy pequeñas. En el caso de las plantas Fe, Mn, Cu, Zn, B, Mo, Co, Cl, se encuentran en concentraciones < 50 mg kg-1. En los animales, los microelementos son los mismos que los de la plantas, a excepción del B, además de Se, F, I, Si, Cr, V, Ti, Sn y Ni (Brady y Weil, 2002; Wild, 1988). Un término muy usado en estudios medioambientales es el de metal pesado que incluye metales y metaloides con densidades > 5 g cm-3, asociados a la contaminación y toxicidad, pero que también incluye elementos requeridos por los organismos en concentraciones muy bajas (Adriano 2001). Para algunos autores este término es un tanto arbitrario y no recomiendan su uso (Duffus, 2002; Hodson, 2004; Madrid, 2010). Aceptando el término elemento traza como uno de los más generalizados en los estudios ambientales, es interesante saber las concentraciones a las que se encuentran estos elementos en distintos compartimentos ambientales. En Ciencia del Suelo elementos traza son aquellos cuya concentración en el suelo es < 1000 mg kg-1 (0,1%). A este grupo pertenecen Mn, Cr, Ni, Pb y Zn (1 – 1500 mg kg-1), Co, Cu y As (0,1 – 250 mg kg-1) y Cd y Hg (0,01 – 2 mg kg-1) (Tabla I.1; Bowen 1979). En bioquímica y biomedicina, elementos traza son aquellos que se encuentran en los tejidos animal y vegetal en concentraciones < 100 mg kg-1 (ms). Desde el punto de vista nutricional, elementos traza son los que raramente exceden los 20 mg kg-1 en los alimentos (Adriano, 2001; Blum et al., 1998). Tabla I.1. Elementos traza más abundantes en la naturaleza (Bowen 1979) Elemento traza Intervalos de concentración(mg/kg) Cr, Zn, Ni, Pb Co, Cu, As Cd,Hg 1-1500 0.1-250 0.01-2 I. INTRODUCCIÓN 13 Los elementos traza, por tanto, se encuentran en el suelo en concentraciones relativamente bajas, aunque algunos de ellos son esenciales para el desarrollo de los organismos, si bien a partir de ciertas concentraciones y en función de su disponibilidad pueden ser tóxicos para los seres vivos. La Tabla I.2. muestra valores normales y críticos de algunos ET en suelos y plantas. Los ET del suelo tienen varios orígenes: 1) litogénicos que provienen de la litosfera (materiales precursores, roca madre); 2) pedogénicos, procedentes también de la litosfera pero después de los procesos de formación del suelo; 3) antropogénicos, que tienen como origen la actividad humana. Tabla I.2. Concentraciones de elementos traza en suelos y plantas. Elemento Intervalo normal en suelos(1) Concentración total crítica en suelos(2) Intervalo de suficiencia o nomalidad en plantas(3) Concentración crítica en plantas(3) a b mg/kg Ag 0,01-8 2 0,1-0,8 0,5 5-10 As 0,1-40 20-50 0,02-7 1-1,7 5-20 Au 0,001-0,02 - <0,0017 - - Cd 0,01-2,0 3-8 0,1-2,4 0,05-0,2 5-30 Co 0,5-65 25-50 0,02-1 0,02-1 15-50 Cr 5-1500 75-100 0,03-14 0,1-0,5 5-30 Cu 2-250 60-125 5-20 5-30 20-100 Hg 0,01-0,5 0,3-5 0,005-0,17 - 1-3 Mn 20-10000 1500-3000 20-1000 30-300 400-1000 Mo 0,1-40 2-10 0,03-5 0,2-5 10-50 Ni 2-750 100 0,02-5 0,1-5 10-100 Pb 2-300 100-400 0,2-20 5-10 30-300 Sb 0,2-10 5-10 0,0001-0,2 7-50 150 Se 0,1-5 5-10 0,001-2 0,01-2 5-30 Sn 1-200 50 0,2-6,8 - 60 Tl 0,1-0,8 1 0,03-3 - 20 U 0,7-9 - 0,005-0,06 - - V 3-500 50-100 0,001-1,5 0,2-1,5 5-10 W 0,5-83 - 0,005-0,15 - - Zn 1-900 70-400 1-400 27-150 100-400 Notas y Fuentes: 1 Datos principalmente de Bowen (1979). 2 La concentración total crítica en el suelo es el intervalo de valores por encima de los cuales la toxicidad se considera que es posible (Kabata-Pendias y Pendias, 1992). 3 La concentración crítica en las plantas es el nivel que se considera excesivo, o por encima del cual son probables efectos tóxicos: (Kabata-Pendias y Pendias, 2001). I. INTRODUCCIÓN 20 precipitación tienen gran importancia las propiedades del suelo: pH, potencial redox, presencia de agente quelantes, presencia de ligandos capaces de precipitar los ET (Waters et al., 1998; Adriano et al., 2004). Un paso más en esta filosofía de estabilizar en vez de extraer, es la recuperación natural asistida (RNA), consistente en la potenciación de esos procesos naturales mediante la aplicación de enmiendas y la utilización de plantas (Adriano et al., 2004). I.4.2. Biorrecuperación Las técnicas de biorrecuperación están basadas en la acción de los microorganismos y/o en los efectos de las plantas y sus microorganismos asociados sobre los ET del suelo (Mench et al., 2009). En concreto las “fitotecnologías” están fundamentalmente en las ventajas que ofrecen las plantas y sus microorganismos asociados. I.4.2.1. Fitorrecuperación de suelos contaminados Las plantas capaces de crecer en ambientes contaminados con ET, desarrollan complejos mecanismos para protegerse de tal contaminación. Estos mecanismos no son fáciles de identificar, debido a su gran variedad y complejidad, aunque se han descrito unas tendencias generales que permiten clasificar las plantas superiores en tres grandes grupos, en función de los mecanismos de resistencia a los elementos traza: exclusoras, indicadoras y acumuladoras (Baker, 1981). Las plantas exclusoras mantienen niveles muy bajos del ET en su parte aérea y sólo a concentraciones muy altas, las barreras que limitan la absorción y transporte de dichos elementos pueden perder su funcionalidad (niveles tóxicos), aumentando entonces la concentración de ET en los tejidos de la planta, a veces hasta niveles letales. En las plantas indicadoras la concentración interna del ET en ellas refleja la concentración del suelo, gracias a la regulación de la absorción y transporte a la parte aérea. Las plantas acumuladoras almacenan los ET preferiblemente en la parte aérea, gracias a un transporte eficaz desde la raíz, resultando una razón de concentración entre parte aérea y raíz mayor que uno. Las fitotecnologías tienen muy en cuenta estos mecanismos o estrategias que las plantas desarrollan naturalmente para protegerse de la contaminación (Figura I.4). Así, dentro de las fitotecnologías, las técnicas de fitoestabilización o fitoinmovilización tienen como estrategia la contención de la contaminación (Robinson et al., 2009). La fitoestabilización está basada en la acción mecánica de las raíces, que evita la erosión y el transporte del suelo, así como en la disminución de la lixiviación, debido al aumento I. INTRODUCCIÓN 21 de la evapotranspiración. La fitoinmovilización (o rizofiltración) implica la absorción, precipitación y acumulación de los contaminantes en la zona radicular, que se lleva a cabo en colaboración con los microorganismos existentes en dicha zona. En ambos casos, tienen como finalidad la prevención la movilidad de los contaminantes en la cadena trófica, evitar su percolación a aguas subterráneas y facilitar la retención de partículas que puedan ser directamente ingeridas o inhaladas (Méndez y Maier, 2008). Las plantas más eficaces utilizadas en estas técnicas son las exclusoras y a veces las indicadoras. Por otra parte, la fitoextracción se basa en la utilización de plantas capaces de tolerar y acumular elementos traza a altas concentraciones en la parte aérea (plantas acumuladoras o hiperacumuladoras) de manera que la biomasa se pueda cortar y guardar o tratar para recuperar si el elemento acumulado es de interés (Brown et al., 1994). Para que este tipo de técnicas sean eficaces las plantas extractoras deben ser capaces de crecer en suelos contaminados, acumular elementos traza y ser resistentes a plagas y enfermedades (Salt y et al., 1998; Bhargava et al., 2012). La mayor parte de los estudios de fitoextracción hasta la fecha se han basado en la identificación y en el uso de plantas hiperacumuladoras. Estas plantas tienen la habilidad natural de acumular elementos traza como Ni, Zn, Cu y Mn a elevadas concentraciones en su parte aérea (0,1-5 % de la masa foliar) (Chaney et al., 1997). A pesar de que algunos trabajos han demostrado la eficacia acumuladora de algunas especies, este tipo de técnicas presenta múltiples inconvenientes para constituir una verdadera alternativa a los métodos de recuperación existentes: a) generalmente las plantas hiperacumuladoras desarrollan poca biomasa, b) sólo son capaces de acumular al mismo tiempo uno o dos elementos, por lo Figura I.4. Procesos de fitorecuperación. Imagen tomada desde http://www.hemp.com/2012/06/soil-contamination-phytoremediation-with-hemp/. I. INTRODUCCIÓN 22 que no son eficaces en suelos contaminados con varios elementos, c) la eficacia de la extracción disminuye tras cada cosecha, ya que la reposición de los ET en la disolución del suelo disminuye con el tiempo, con lo que disminuye la biodisponibilidad y d) ésta técnica implica un alto riesgo de entrada de los contaminantes en la cadena trófica si no se controla la herbivoría (Clemente et al., 2005; Bhargava et al., 2012). Muchos autores han utilizado la aplicación al suelo de diversas sustancias como agentes quelantes sintéticos para aumentar la biodisponibilidad de los ET en el suelo. A esto se le ha denominado fitoextracción asistida o inducida, pero los resultados no han sido generalmente positivos, debido a diversas causas: a) los quelatos formados suelen ser muy estables, no liberando los ET a la disolución del suelo para que sean tomados por las plantas; b) los agentes quelantes pueden producir toxicidad para las plantas, extraer y movilizar ET que las plantas no tienen capacidad de absorber, producir contaminación de las aguas subterráneas, etc. (Kahn et al., 2000; Chaney et al., 2010) La fitovolatilización consiste en el uso de plantas que absorben los contaminantes del suelo y los transforman en especies volátiles (Wenzel et al., 1999). Esta técnica se puede emplear en la descontaminación de suelos contaminados con algunos elementos traza (volátiles), haluros y compuestos orgánicos. La fitodegradación se ocupa de los procesos en que los contaminantes son absorbidos y transportados a la parte aérea de la planta donde se degradan a metabolitos no tóxicos o rizodegradación si se degradan a nivel de la raíz. Esta técnica se aplica para contaminantes orgánicos ya que los ET no se pueden degradar. I.4.3. Necesidad del uso de enmiendas Los suelos contaminados tienen normalmente poca fertilidad, bajos contenidos de materia orgánica y en ocasiones pH muy ácidos. El establecimiento de una cubierta vegetal en estos de suelos resulta muy difícil a no ser que se le aplique enmiendas orgánicas o inorgánicas (Madejón et al., 2006a, 2010; Wong, 2003; García Izquierdo y Lobo Bedmar, 2007; Pérez de Mora et al., 2006bc, 2011). Por otra parte la RNA contempla la aplicación de enmiendas al suelo para potenciar los mecanismos de AN que se producen en el suelo (v. gr.: reacciones de adsorción/absorción, precipitación y complejación), que reducen la movilidad y la biodisponibilidad de los contaminantes, dando lugar a la estabilización de la contaminación (Adriano et al., 2004). Además, las enmiendas pueden facilitar el establecimiento de plantas en suelos degradados y mejorar la actividad microbiana (Pérez de Mora et al, 2005; Madejón et al, 2006a; Bolan et al., I. INTRODUCCIÓN 23 2011). Sin embargo, el potencial de los tratamientos de estabilización in situ (RNA) de los suelos contaminados por ET requiere la validación a largo plazo en experimentos de campo para evaluar su sostenibilidad o durabilidad, especialmente cuando se aplican enmiendas orgánicas (Pérez de Mora et al., 2007). La utilización de subproductos como enmiendas del suelo, tiene gran importancia desde el punto de vista del mantenimiento de la calidad ambiental, ya que es una forma de reducir la eliminación de residuos y de revalorizarlos (Lombi et al., 2002). Se han utilizado numerosos productos como enmiendas para recuperar suelos contaminados con ET (Knox et al., 2001). Algunos ejemplos son: cal, zeolitas, apatito, óxidos de Fe y Mn, biosólidos estabilizados compostados, minerales de la arcilla y subproductos industriales tales como la beringita. Además de la estabilización de los ET, el uso de estos materiales en la rehabilitación de suelos cumple dos objetivos: i) el reciclaje de subproductos, ya que en las sociedades modernas la gestión adecuada de los residuos y desechos se ha convertido en esencial y ii) la regeneración del suelo. La aplicación de alcalinizantes y composts estabilizados parece ser muy eficaz para aumentar el pH y el contenido de materia orgánica del suelo (Pérez de Mora et al., 2006b). Además, la aplicación de las enmiendas puede actuar como una fuente de nutrientes disponibles a largo plazo que mejoran la fertilidad del suelo (Alburquerque et al., 2011). Desde un punto de vista agrícola y forestal, la reutilización de residuos con una importante carga orgánica supone un efecto muy positivo para el suelo, ante el preocupante problema, cada vez más extendido, de la degradación de los suelos cultivados (Agele et al., 2007; López Piñeiro, 2007). En el caso de suelos contaminados por ET, la estabilización y fitorrecuperación, en los que se usan enmiendas y plantas que alteran las formas físicas de los ET y en definitiva su movilidad, son técnicas muy a tener en cuenta como viables desde el punto de vista ambiental y económico (Madejón et al., 2009a, 2010; Vangronsveld et al., 2009; Pardo et al., 2014). La aplicación de enmiendas y el establecimiento de plantas en suelos contaminados constituyen la llamada fitoestabilización asistida; las enmiendas contribuyen al aumento del pH del suelo y a la disminución de la concentración de ET disponibles, con lo que se mejoran las condiciones físico-químicas del suelo para un mejor establecimiento de la cubierta vegetal. Dicha cubierta vegetal también contribuye a la inmovilización física del suelo contaminado y a la estabilización de los I. INTRODUCCIÓN 24 contaminantes en la rizosfera (Adriano et al., 2004; Vangrosveld et al., 2009). La aplicación de enmiendas, sobre todo las enmiendas orgánicas, promueve la diversidad y la actividad microbiana del suelo (Bernal et al., 2006; Pérez de Mora et al., 2005; Renella et al., 2008). Los microorganismos del suelo también juegan un papel notable en la fitorrecuperación, ya que no sólo afectan a la movilidad de los ET, sino también al desarrollo de las plantas (Kidd et al., 2009). La comunidad microbiana del suelo puede aumentar o disminuir la fitodisponibildad de los ET mediante la biodegradación y la mineralización de la materia orgánica. Los cambios sobre la fitodisponibilidad pueden ser beneficiosos en uno u otro sentido, pues al aumentar la biodegradación, se favorece la fitoextracción de los ET por plantas hiperacumuladoras, mientras que al aumentar la mineralización, mejora la eficacia de la fitoestabilización/fitoinmovilización. I.4.4. Importancia de las cubiertas vegetales en la recuperación de suelos contaminados La vegetación juega un papel crucial en la restauración de las zonas degradadas y contaminadas, ya que en primer lugar es un gran anclaje físico del suelo que reduce la erosión, amortigua la dispersión de partículas contaminantes y reduce la contaminación de los suelos adyacentes y de las aguas superficiales y subterráneas (Tordoff et al., 2000). La revegetación ha sido tradicionalmente usada para recuperar la cubierta vegetal las áreas degradadas, lo que evita la pérdida del suelo por los procesos erosivos y restituye la calidad ambiental y paisajística de la zona (Moreno, 2005; Domínguez et al., 2008). Sin embargo, la posible absorción por las plantas de ET implica varios peligros como es la introducción en la cadena alimentaria de dichos elementos (McLaughin, 2001). Así, el estudio de las propiedades del suelo y de la vegetación elegida es necesario para evaluar la eficacia de las medidas de recuperación en la ecología de los ecosistemas y el riesgo que supone el contenido de ET (Madejón et al., 2006a). Entre las estrategias de revegetación de zonas contaminadas por elementos traza, se puede optar por potenciar la proliferación de la vegetación espontánea que surge del banco de semillas de la zona, o por el contrario inducir una vegetación que conlleve algún tipo de beneficio económico y paisajístico. En la presente memoria de tesis se contemplan ambas posibilidades. I.4.4.1. La vegetación espontánea La vegetación espontánea tiene lugar cuando un conjunto de especies vegetales autóctonas se instala sobre el terreno desnudo, o cuando otras sustituyen a las I. INTRODUCCIÓN 25 anteriormente existentes sin intervención directa del hombre a través de siembras, plantaciones, eliminación selectiva, etc. Es la vegetación natural correspondiente a una etapa de la sucesión natural, que las condiciones del clima, suelo y otros factores ambientales determinan en el momento actual del territorio (Seoánez, 1999). La vegetación natural puede proporcionar información acerca de las condiciones del medio (suelo-clima), pues el que consigan implantarse unas y otras plantas en un determinado lugar viene condicionado por el propio medio (Porta et al., 2003). En los suelos contaminados con ET, las plantas pueden evitar sus efectos tóxicos colonizando áreas donde la concentración sea menor, o mediante mecanismos de exclusión o absorción selectiva (Madejón et al., 2006a). Una de las condiciones básicas para la colonización de suelos contaminados con ET es la capacidad de las plantas para la resistencia de a los mismos (Ross, 1994). El papel directo de la vegetación sobre el suelo deriva de su acción pantalla frente a la radiación solar y al agua de lluvia, lo que afecta el régimen de humedad del suelo, la infiltración, la escorrentía y la erosión. La vegetación también tiene efecto sobre la fertilidad del suelo, mediante el aporte de materia orgánica, que contribuye tanto a la inmovilización de contaminantes, como a la liberación de nutrientes (Porta et al., 2003). A su vez, a través de su sistema radicular las plantas exclusoras contribuyen a la inmovilización de los elementos contaminantes. Una vez establecida la cubierta vegetal pionera, el sistema puede actuar como autosostenible. Pastor y Hemández (2002), en su estudio de suelos contaminados con elementos traza en vertederos sellados de diferentes características litológicas del substrato (arenosos, granitos, yesosos y calizo-margosos), encontraron una gran diversidad de especies espontáneas (más de 300) de la familia de las gramíneas, leguminosas, cariofiláceas, crucíferas y compuestas, que corresponde por lo general a las especies herbáceas de los ecosistemas de entorno. En las zonas semiáridas, las comunidades de plantas pioneras en suelos afectados con ET están muy bien adaptadas a la presencia de contaminantes, a la pobreza en nutrientes y a la baja disponibilidad de agua (Freitas et al., 2004; Madejón et al., 2009a). Esta vegetación juega un papel fundamental en el ciclo de los ET y los nutrientes durante las primeras etapas y condiciona la sucesión secundaria en áreas contaminadas, sobre todo en estas condiciones. La principal ventaja de adoptar esta estrategia es que los gastos de manejo de la vegetación son prácticamente nulos. En este caso, lo que se requiere es reducir al mínimo la acumulación de ET en la biomasa aérea, lo que supone es un desafío importante para cualquier programa de fitomanejo a gran I. INTRODUCCIÓN 26 escala (Domínguez et al., 2008). Por lo tanto, es necesario el estudio de estas plantas desarrolladas espontáneamente para determinar el riesgo asociado a la acumulación de elementos traza en la parte aérea, así como la su posible uso como bioindicador de la contaminación del suelo. I.4.4.2. Uso de plantas de crecimiento rápido. Caso de Estudio Paulownia sp. Otra de las técnicas con mayor potencial para el uso y recuperación de suelos contaminados y degradados, tanto desde el punto de vista sostenible y medioambiental, como económico, es el uso de plantas de crecimiento rápido (Conesa et al, 2012; Dauber et al., 2012; Shortall, 2013). La implantación de plantas arbóreas y arbustivas en zonas deterioradas y contaminadas es importante por los beneficios que se obtienen sobre la calidad del suelo, prevención de la erosión del mismo, adición de materia orgánica y enriquecimiento de la abundancia y diversidad de los microorganismos del suelo (Mertens et al., 2007; Ciadamidaro et al., 2014a, 2014b). Además de los efectos beneficiosos para el suelo, la biomasa de estas plantas podría ser usada como una posible fuente de energía. El uso de árboles de crecimiento rápido es una herramienta prometedora para reducir el CO2 atmosférico y para la producción de biomasa (Calfapietra et al., 2010). Sin embargo, a este tipo de árboles se les han atribuido efectos negativos sobre la fertilidad del suelo (Alfaia et al., 2004), ya que suelen demandar altas concentraciones de nutrientes (Szott et al., 1991). El uso de enmiendas en este tipo de plantaciones podría ser una alternativa a los fertilizantes minerales, y podría proporcionar, como se ha comentado anteriormente, una solución interesante para reciclaje de residuos. La aplicación de enmiendas orgánicas, además de la liberación de nutrientes (Larchevêque et al., 2006), pueden ofrecer beneficios adicionales a los fertilizantes minerales, ya que también pueden mejorar la estructura del suelo y, en consecuencia, crear mejores condiciones para el desarrollo de las raíces. De entre los árboles más utilizados con fines energéticos en zonas degradadas destacan el álamo y el sauce, que han sido implantados en numerosas partes del mundo, especialmente en aquellas afectadas por la contaminación de ET (Meers et al., 2005, Lavoie et. al., 2010; Zalesny et al, 2012; Ciadamidaro et al., 2013, 2014a, 2014b). Además, se han probado otras especies arbóreas como la Paulownia fortunei, tanto en suelos contaminados con ET, como en suelos muy degradados (contenido en COT I. INTRODUCCIÓN 27 menor 1%). En concreto es esta la especie elegida como vegetación inducida en los estudios llevados a cabo en la presente memoria. Paulownia es un árbol de crecimiento rápido de hoja caduca con propagación vegetativa y tolerancia a las diferentes condiciones de suelo y clima (Wang y Shogren, 1992). Este árbol es originario de China donde hay más de 15 millones de hectáreas plantadas, y su distribución natural se extiende desde climas tropicales a climas templados. Este árbol podría ser considerado como una planta de baja demanda hídrica, a pesar de no ser capaz de crecer espontáneamente en zonas áridas (Lucas-Borja et al., 2011). Esta especie tiene una elevada producción de biomasa durante su fase de crecimiento (Chirko et al., 1996), y habiéndose calculado que cada árbol, a la edad de 57 años, podría producir un metro cúbico de madera, produciendo anualmente 150 t ha-1 de biomasa en plantaciones intensivas con cerca de 2.000 árboles por hectárea (LucasBorja et al., 2011). Una de las propiedades de la Paulownia para la producción de biomasa es su facilidad de secado al aire libre (alcanza 10-12% humedad desde aprox. 50% humedad en menos de 40 días.). Esto significa que no es necesario emplear costosos sistemas de secado artificial, permitiendo entregar la biomasa en centrales termoeléctricas a precios inferiores que otros tipos de biomasa. El cultivo de Paulownia a gran escala, para la producción de biomasa con fines energéticos, tiene su fundamento en su buena adaptación de la misma a los suelos y la climatología existente en algunas zonas de España, donde desde hace más de 8 años se han realizado ensayos con buenos resultados. Paulownia presenta ventajas como son la ausencia de enfermedades, la menor necesidad de agua que otros cultivos con la misma producción, la gran ventaja del rebrote de cepa después de la corta, la escasa necesidad de cuidados especializados, la posibilidad de asociar cultivos herbáceos entre sus calles de plantación, etc. I.5. Papel de las enmiendas y de las cubiertas vegetales sobre la fertilidad bioquímica del suelo, el aprovechamiento energético de biomasa vegetal y en el secuestro de C en suelos degradados y contaminados. Como se ha comentado anteriormente, las enmiendas pueden aumentar la fertilidad y estabilizar la contaminación de los suelos, siendo ambas estrategias fundamentales en los programas de recuperación de suelos contaminados. Por ello, reciclar residuos para poder suplir la escasez de materia orgánica y aumentar la fertilidad, contribuye a paliar I. INTRODUCCIÓN 28 la degradación de los suelos, coadyuvando al secuestro de C, a la mejora de su calidad y al aumento de la biodiversidad. Por otra parte el establecimiento de una cubierta vegetal natural o inducida también contribuye a la regeneración de los suelos contaminados debido a que la rizosfera es una fuente de alimento y un refugio para los microorganismos, por lo que aumenta la actividad microbiológica (Kozdroj y van Elsas, 2000; Macek et al., 2000; Pérez de Mora et al., 2005; Tordoff et al., 2000). Tanto las formas de materia orgánica exógena, p. ej. la que se añade con las enmiendas, como los compuestos orgánicos exudados por las raíces de las plantas, activan los procesos químicos y biológicos del suelo, recuperando y promoviendo la actividad microbiana del suelo. (Vangronsveld y Cunningham, 1998; Rajkumar et al., 2012; Ciadamidaro et al., 2013). En el suelo tienen lugar una serie de procesos de intercambio de moléculas e iones entre las fases sólidas, líquidas y gaseosas, que tienen gran importancia para mantener su salud. En estos procesos que tienen lugar entre los componentes físicos, químicos y biológicos, están dominados por estos últimos. El componente biológico, a pesar de representar menos del 5% del volumen de suelo de la capa arable y menos del 10% de la materia orgánica total, juega un papel fundamental en los ciclos del N, S y P, en la descomposición de los residuos orgánicos y por tanto el ciclo global del C. Además, los microorganismos tienen efectos positivos sobre las propiedades físicas del suelo, mediante la producción de sustancias que facilitan la agregación de las partículas de suelo, coadyuvando al mantenimiento de la estructura del mismo (Nielsen y Widing, 2002). Los microorganismos responden rápidamente a los cambios, por lo tanto, se adaptan rápidamente a las condiciones ambientales. Esta adaptación permite que el análisis microbiano sirva para la evaluación de la calidad/salud del suelo, de los cambios en las poblaciones y las actividades microbianas, y por tanto, funcionar como un excelente indicador de cambio en la salud del suelo. Por tanto, debido a su importancia en la funcionalidad del suelo, la actividad y la población microbiana, se han considerado como indicadores útiles para evaluar tanto la mejora, como la degradación del mismo (Dick et al., 1996) y pueden servir como indicadores de los cambios que tienen lugar en el suelo (Fabiani et al., 2009). Sin embargo, no existe un único indicador, o un indicador universal, de la calidad/salud, debido a la multitud de componentes microbiológicos y a las numerosas rutas bioquímicas existentes. Existen muchos parámetros biológicos que se tienen en cuenta para evaluar la calidad del suelo I. INTRODUCCIÓN 29 (Carter et al., 1999; Nielsen y Widing, 2002), aunque no existe un consenso acerca de cuáles son los mejores (Gil-Sostres et al., 2004; Hartley et al., 2008). El “bioindicador” ideal debería ser fácil de medir, servir para todo tipo de ecosistema, y ser capaz de revelar cuál es el posible problema que ocurre en un determinado suelo. Quizás los bioindicadores más usados por su fácil medida son la biomasa microbiana, la respiración microbiana y las actividades enzimáticas. Los microorganismos son vitales para la calidad del suelo, ya que tienen un papel destacado en la fertilidad y producción primaria del suelo, por sus funciones relacionadas con la descomposición de la materia orgánica y el ciclo de nutrientes (Alexander, 1977). Asimismo, los microorganismos pueden verse afectados por cambios en las propiedades físico-químicas (pH, potencial redox, materia orgánica, textura, estructura etc.), biológicas (poblaciones, interacciones entre organismos) y/o por la presencia de contaminantes (metales pesados, xenobióticos), por lo que han sido frecuentemente empleados como “bioindicadores” de la calidad del suelo en programas de monitorización medioambiental (Nielsen y Winding, 2002). Así por ejemplo, los ET a determinadas concentraciones, pueden constituir un riesgo para el funcionamiento de los ecosistemas (Majer et al., 2002), alterando negativamente los procesos biológicos de los mismos (Lee et al., 2002). La acumulación de ET en el suelo puede reducir la biomasa microbiana (Chander et al., 1995) y varias actividades enzimáticas, dando lugar a una disminución de la diversidad funcional en el suelo (Kandeler et al., 1996), y a cambios en la estructura de la comunidad microbiana (Pennanen et al., 1998). No obstante, la presencia de ET en el suelo, también puede propiciar el desarrollo de poblaciones tolerantes a los mismos (Ellis et al., 2003). Las actividades enzimáticas por tanto, pueden servir como estimadores rápidos de las alteraciones tanto naturales, como antropogénicas que tienen lugar en los suelos (Giller et al., 1998). Dichas actividades son muy útiles para evaluar los resultados de las técnicas de RNA, ya que no sólo favorecen la estabilización de los elementos traza en el suelo, sino que también mejoran su fertilidad, estimulando los procesos microbiológicos y mejorando la funcionalidad del mismo (García-Gil et al., 2000; Moreno et al., 2003). Por último, es interesante indicar que el establecimiento de cultivos energéticos, sin fines alimentarios, en zonas contaminadas y degradadas podría ser una alternativa que propiciaría un aumento de la revegetación de estas zonas marginales. A pesar de que la contribución de los cultivos energéticos en la producción de combustibles es aun relativamente pequeño, se va incrementado anualmente (REN21, 2013), y se estima que II.OBJETIVOS 36  analizará la evolución de las principales propiedades químicas del suelo y de la disponibilidad de los elementos traza durante los ocho años de experimentación. En el segundo experimento se estudiarán los efectos de dos enmiendas orgánicas sobre la recuperación de un suelo contaminado y sobre el desarrollo de una especie vegetal de crecimiento rápido (Paulownia fortunei). En ambos experimentos los objetivos específicos son los siguientes 1. Estudiar el efecto de enmiendas en las propiedades químicas y bioquímicas de suelos contaminados con elementos traza. 2. Evaluar el efecto de las enmiendas en las variaciones de las concentraciones de elementos traza biodisponibles a medio y largo plazo. 3. Estudiar el efecto de las enmiendas en el crecimiento de la vegetación espontánea. 4. Estudiar el efecto de las enmiendas en el desarrollo de la especie de crecimiento rápido (Paulownia fortunei) y en la cantidad y calidad de la biomasa obtenida. 5. Estudiar el efecto de enmiendas en la translocación de elementos traza a la parte aérea de las plantas.  III. MATERIALES Y MÉTODOS III. 1. Área de estudio El complejo minero de Aznalcóllar está situado en el extremo suroriental del Cinturón Pirítico Ibérico, que constituye la más vasta e importante provincia vulcanogénica de sulfuros masivos (depósitos polimetálicos) del oeste de Europa, e incluye a Río Tinto, Aljustrel, Neves Corvo, Tharsis, Sotiel y Aznalcóllar. Se extiende a través de 200 km (unos 8000 km2 de superficie) desde el suroeste de Portugal hasta Sevilla (Alastuey et al., 1999; López-Pamo et al., 1999). El 25 de abril de 1998, el dique de contención de la balsa minera de decantación de la mina de los Frailes se desplazó produciéndose una rotura del muro, ocasionando un vertido al río Agrio, afluente del Guadiamar. A través de la brecha de la balsa se vertieron unos 2 hm3 de lodos y 3-4 hm3 de aguas ácidas, que inundaron las cuencas de los ríos Agrio y Guadiamar, llegando, hasta la zona de Entremuros, límite del Parque Nacional de Doñana. Los lodos se depositaron en el cauce (985.497 m3) y sobre los suelos de las márgenes (996.347 m3). La ola de la riada alcanzó hasta 3 m de altura, dejando una franja de unos 300 m a cada margen de los ríos Agrio y Guadiamar, cubierta por una capa de lodo cuyo espesor dependió de la distancia a la balsa y de la elevación con respecto al nivel del río. En las inmediaciones de la balsa el espesor llegó a tener 1,7 m; en 79% de la superficie afectada el espesor de la capa de lodo tenía 2-30 cm (López Pamo et al., 1999). La riada afectó a un total de 4.286 ha, dedicadas en su mayoría a la agricultura y pastos, de las cuales 2.710 ha correspondían a superficie cubierta por lodo y las restantes a zonas afectadas por las aguas (Cabrera, 2000) (Figura III.1) El yacimiento de los Frailes estaba formado fundamentalmente por sulfuros polimetálicos de Fe, Cu, Pb, Zn y As: pirita (S2Fe) con arsenopirita (FeAsS), calcopirita (CuFeS2), galena (PbS), esfalerita o blenda (ZnS), minerales con concentraciones apreciables de Ag, Cd, Hg, Sb y Tl, que se encuentran en sustituciones isomorfas. La composición de los lodos era muy parecida a la del yacimiento, y estaban fundamentalmente compuestos por pirita (con arsenopirita) (75-80%), esfalerita y galena (5%), silicatos (cloritas, nontronitas, montmorillonitas), cuarzo y yeso (15-20%) (ITGE, 1998). Los suelos afectados por el vertido mostraron concentraciones totales de As, Cd, Cu, Pb, Sb, Tl y Zn en la capa superficial (0-50 cm) mayores que las concentraciones de III. MATERIALES Y MÉTODOS 40 fondo de los suelos del valle del Guiadiamar (Cabrera et al., 1999, 2008a y b; López Pamo et al., 1999; Simón et al., 1999). En la mayoría de los suelos la contaminación con elementos traza era severa en los primeros centímetros de suelo, decreciendo en profundidad, hasta alcanzar valores normales por debajo de los 20 cm en los suelos con más de un 25% de fracción arcilla, mientras que en los suelos más arenosos la contaminacoión penetró hasta al menos 50-80 cm (Cabrea et al., 1999). Los suelos contaminados se sometieron a un programa de recuperación consistente en: a) remoción de los lodos depositados sobre ellos y de una capa superficial de suelo de 5 a 20 cm de espesor. Con la retirada de esta capa superficial, los suelos perdieron gran parte de su contenido en materia orgánica, lo que repercutió negativamente sobre sus propiedades físicas, químicas y biológicas. La remoción de los lodos y suelos contaminados constituyó una tarea de gran envergadura en la que se retiraron 7 hm3 de material contaminado en una primera fase de limpieza, hasta Figura III.1. Área afectada por el vertido y localización de la parcela experimental “El Vicario” y de la zona de muestreo de Aznalcázar. III. MATERIALES Y MÉTODOS 41 diciembre de 1998, y 0,82 hm3 en la fase de relimpieza, hasta febrero de 2000 (Arenas el al., 2001); b) adición de materiales ricos en carbonato cálcico (espuma de azucarera y cenizas de pasta de celulosa, a razón de 20-40 Mg ha-1), con objeto de aumentar el pH y disminuir la movilidad de los elementos traza catiónicos; c) adición de materiales ricos en óxidos de hierro para disminuir la movilidad de los elementos traza aniónicos y d) aplicación de materiales orgánicos (estiércol y compost, a razón de 20-25 Mg ha-1), cuyo primer objetivo fue el de reponer la materia orgánica de los suelos. En todos los casos se homogeneizó la capa superficial (0-25 cm) de los suelos, mediante una labor de grada. (Cabrera et al., 2008b). Finalizado el plan de medidas puesto en marcha por la administración para controlar el impacto ambiental del accidente minero, se dio paso al denominado Proyecto del Corredor Verde del Guadiamar, cuyos objetivos fundamentales fueron:  Controlar y recuperar la contaminación generada por el vertido de las minas de Aznalcóllar;  Recuperar una de las funciones que ejercía el río Guadiamar y su cuenca en el territorio que se había perdido con anterioridad al accidente: su papel como corredor de especies y procesos naturales entre Doñana y Sierra Morena Occidental;  Mejorar la calidad de vida de los habitantes de la cuenca (CMA, 2001). Una de las medidas tomadas dentro de este proyecto fue la reforestación de la zona afectada con distintas especies autóctonas (más de 3 millones de plantas), bien adaptadas a las condiciones locales y relativamente tolerantes a la contaminación (Arenas et al., 2008) Durante todo el proceso de configuración del Corredor Verde, desde el accidente minero hasta la actualidad, se ha desarrollado una intensa actividad científica en torno a la dinámica de la contaminación del suelo y sus efectos sobre los ecosistemas de la zona. Durante los primeros años, esta actividad se centró en la monitorización de los elementos traza en los suelos, aguas superficiales y subterráneas, y en distintos grupos de seres vivos (programas PICOVER I y II; CMA, 2003). Posteriormente en el marco de otros proyectos regionales, nacionales y europeos se ha continuado con el seguimiento de la zona, incluyendo la recuperación de los procesos biogeoquímicos del suelo, el estudio de la diversidad de distintos grupos funcionales de seres vivos y la funcionalidad como corredor ecológico para distintas especies animales (programa SECOVER; CMA, 2008). Asimismo, el Corredor Verde ha servido como zona de III. MATERIALES Y MÉTODOS 42 experimentación en multitud de trabajos sobre técnicas de recuperación de suelos contaminados por elementos traza (Walker et al., 2004; Clemente et al., 2006; Madejón et. al 2006; Vázquez et al., 2006; Pérez-de-Mora et al., 2011). III. 2. Materiales III.2.1 Suelos Los dos suelos contaminados elegidos para los experimentos de presenta estudio se localizan en la zona afectada por el vertido de Aznalcóllar. A ambos suelos se les había retirado la capa de lodo y la capa de suelo superficial, de 10-15 cm, en las labores de remoción efectuadas justo después del accidente minero (Cabrera et al., 1999). Los suelos en esta región de España se caracterizan generalmente por un bajo contenido de agua que puede alterar la disponibilidad de elementos traza. La Tabla III.1 muestra las características más relevantes de estos suelos contaminados. El suelo V procede de la parcela experimental “El Vicario” (N 37º26’21’’; O 6º12’59’’), situada a unos 100 m del río Guadiamar en su margen derecha, a medio camino entre el puente de las Doblas y el pueblo de Aznalcóllar. Esta parcela se vio afectada por el accidente minero, y la única medida de recuperación que se llevó a cabo en ella fue la retirada de la capa de lodo y una capa de suelo de 10-20 cm. Es un suelo Typic Xerofluvent (Soil Survey Staff, 1996) franco-arcilloso, ácido, con bajos de Tabla III.1. Valores medios (Media) y desviación estándar (DE) de algunas características de los suelos empleados en los experimentos. Variable Suelo V Suelo AZ Suelo NC Media DS Media DS Media DS pH 3,86 1,32 6,93 0,09 7,50 0,07 TOC (g kg - 1 ) 6,15 0.16 14,7 3,99 5,10 0,15 N-Kjeldhal (g kg-1) 0,16 0,14 0,54 0,17 0,31 0,12 P-Olsen (mg kg-1) 3,47 0,57 13,9 0,16 11,9 0,78 K-disponible (mg kg-1) 55,0 7,55 154 9,56 121 12,2 Total (mg kg - 1 ) As 211 103 112 53 8,40 1,90 Cd 2,44 1,16 3,82 1,23 0,59 0,05 Cu 169 26,6 166 42,9 19,4 2,01 Pb 571 206 236 13,5 15,7 0,04 Zn 380 36,5 507 34,9 52,0 3,30 Soluble (CaCl 2 ) (mg kg - 1 ) Cd 0,37 0,26 0,02 0,00 0,01 0,00 Cu 15,0 12,2 0,25 0,07 0,05 0,002 Zn 98,6 64,6 0,03 0,001 0,01 0,00 III. MATERIALES Y MÉTODOS 43 fertilidad química y bioquímica, y concentraciones de elementos traza superiores a los valores normales de los suelos no contaminados de la zona. Este suelo se ha utilizado tanto en el experimento de campo, como en el experimento en condiciones de semicampo para el cultivo de la Paulownia. El suelo AZ procede de la zona de Aznalcázar (N 37º 18' 4,7'' O 6º 15' 39,1'). Es un suelo de bosque, situado en la margen izquierda en rivera del Guadiamar, también afectado por el vertido de Aznalcóllar, que fue sometido a labores de limpieza y aplicación de enmiendas, aunque no se tienen datos concretos a este respecto. El suelo es Typic Xerofluvent (Soil Survey Staff, 1996) franco, con pH cercano a la neutralidad y bastante fértil, tanto desde el punto de vista químico como biológico, a pesar de los niveles de elementos traza. Este suelo se ha utilizado para el experimento en condiciones de semi-campo del cultivo de Paulownia. En el experimento en condiciones de semi-campo se utilizó además el suelo no contaminado NC, procedente de la finca experimental “La Hampa” perteneciente al Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), situada en el término municipal de Coria del Río (Sevilla), (N 37º 17' 08'' 6º 04' 1,5''). Se trata de un suelo Xerochrept (Soil Survey Staff, 1996) arenoso-franco, con pH cercano a la neutralidad, niveles muy bajos de fertilidad. III.2.2 Enmiendas III.2.2.1. Espuma de azucarera La espuma azucarera (SL) es un producto residual del proceso de obtención del azúcar con un contenido en peso seco de CaCO3 de 70-80%. Es un material muy empleado para neutralizar el pH en suelos ácidos (Adriano et al., 2004), así como para inmovilizar y disminuir la biodisponibilidad de elementos traza como Cd, Ni o Zn (Geebelen et al., 2003). La espuma de azucarera empleada en este trabajo fue cedida por la empresa Azucarera Ebro SA (San José de la Rinconada, Sevilla) (Tabla III.2.). III.2.2.2. Compost de biosólidos El compost de biosólidos (BC) utilizado fue suministrado por EMASESA y está compuesto por lodos de depuradora de aguas residuales y de restos de poda de parques y jardines de la ciudad de Sevilla (Tabla III.2.). Los biosólidos han sido empleados durante más de 25 años en la recuperación de zonas degradadas por diferentes tipos de actividades (Sopper, 1993). Recientemente, su utilización se ha extendido también a la recuperación de zonas contaminadas por metales pesados (Compton et al., 2001). III. MATERIALES Y MÉTODOS 44 III.2.2.3. Leonardita La leonardita (LE) es una forma oxidada del carbón de origen lignítico formada, principalmente, por sales de ácidos húmicos y fúlvicos. La leonardita empleada en este estudio proviene de una cantera en las minas de Ariño (Teruel), explotada por DAYMSA S.A. (Zaragoza) (Tabla III.2.). Aunque su uso más común es como fertilizante y acondicionador del suelo en agricultura y horticultura, diversos autores han comprobado la eficacia de este material en la absorción/adsorción de metales pesados (Allen et al., 1997; Solé et al., 2003). III.2.2.4. Compost de alperujo El compost de alperujo (AC) fue suministrado por la cooperativa de Cotobajo (Guadalcázar, Córdoba). El alperujo es un subproducto de las almazaras de sistemas de dos fases. Es una la mezcla de aguas de vegetación, partes sólidas de la aceituna (hueso, mesocarpio y piel) y restos grasos. El co-compostaje se ha realizado mediante la mezcla de alperujo con restos de leguminosas y estiércoles procedente de agricultura ecológica (Tabla III.2.). Tabla III.2. Valores medios (±DS) de algunas características de las enmiendas empleadas en ambos experimento. Enmiendas SL AC BC1 BC2 LE pH 9,04±0,08 8,10±0,05 6,93±0,03 7,09±0,28 6,08±0,07 Humedad (%) 25,0 14,9 45,0 15,6 27,5 COT (%) 6,70±1,55 16,4±1,12 19,5±1,22 16,6±0,23 28,9±0,39 N (%) 0,98±0,04 1,56±0,25 2,31±0,06 2,27±0,29 1,17±0,02 P (%) 0,51±0,06 2,54±0,10 1,24±0,02 1,49±0,05 0,04±0,001 K (%) 0,53±0,05 2,30±0,05 0,93±0,02 0,68±0,03 3,97±0,08 As (mg kg - 1 ) 1,63±0,34 2,45±0,22 5,63±1,48 13,5±0,60 34,9±3,46 Cd (mg kg - 1 ) 0,43±0,15 0,25±0,01 0,73±0,40 1,94±0,09 0,83±0,11 Cu (mg kg - 1 ) 51,0±8,20 94,2±1,12 121±5,66 188±10,9 28,2±2,40 Mn (mg kg - 1 ) 297±10,3 360±5,34 257±24,8 570±36 66,2±1,41 Pb (mg kg - 1 ) 39,2±6,70 9,77±0,06 137±26,2 61,4±4 22,0±2,33 Zn (mg kg - 1 ) 138±31,0 187±11,1 258±18,4 600±32 64,5±1,06 COT: Carbon orgánico total SL: espuma de azucarera; AC: compost de alperujo, BC: compost de biosolidos; LE: leonardita; (n=3) BC1: compost de biosólidos utilizados en el experimento de campo; BC2: compost de biosólidos utilizados en el experimento en contenedores. III. MATERIALES Y MÉTODOS 45 III.3. Diseño de los experimentos III.3.1. Diseño del experimento de campo El experimento se estableció en una parcela localizada en la finca “El Vicario” (20 x 50m) (Figura III.1), dividida en 12 subparcelas de 7 × 8 metros cada una, con un pasillo de 1 m (largo) y 2 m (ancho) entre las subparcelas (Figura III.2). El experimento se comenzó en octubre de 2002, estableciéndose tres tratamientos con enmienda: SL (espuma de azucarera), BC (compost de biosólidos), y LESL (mezcla de leonardita y espuma de azucarera). Asimismo, se estableció un tratamiento control (NA) sin adición de enmiendas. Las dosis de enmienda fueron las siguientes (peso fresco): BC: 30 Mg ha-1 Figura III.2. Distribución de los tratamientos y localización de los puntos de muestreo en la parcela experimental. NA, control sin enmienda; SL, espuma de azcarera; BC, compost de biosólidos; LESL, leonardita + espuma de azucarera. DO2, parcelas que recibieron dos dosis (en 2002 y 2003); DO4, parcelas que recibieron cuatro dosis (en 2002, 2003, 2005 y 2006). Ver texto, párrafo III.3.1. III. MATERIALES Y MÉTODOS 52 de HF para la disolución total de los silicatos componentes del suelo, lo que entraña serios peligros y dificultades de manipulación de las muestras. Sin embargo, la fracción de elementos traza existente en la red cristalina de los silicatos es poco relevante desde el punto de vista medioambiental por lo que también lo es para la estimación de la movilidad y biodisponibilidad de los elementos traza. Por esta razón, en estudios medioambientales se suelen usar métodos, que si bien no disuelven totalmente las muestras, dan una estimación razonable de las concentraciones de elementos traza susceptibles de movilizarse y hacerse disponible para los microrganismos y plantas (Díaz-Barrientos et al. 1991). Uno de estos métodos es el del aqua regia recomendado por la USEPA (1998) e ISO (1995). A este respecto, las Tablas III.4 y III.5 muestran que los porcentajes de elementos traza extraídos con aqua regia son mayores del 94,5% en un suelo enmendado con lodo de depuradora y del 63,9% en otro ligero arenoso. El ataque de las muestras de suelo se llevó a cabo en vasos de teflón, herméticamente cerrados, en horno microondas (MILESTONE ETHOS 900, Milestone Tabla III.4. Valores certificados totales (Total) y solubles en aqua regia (Aqua regia), y solubles en aqua regia obtenidos en el laboratorio del IRNAS (Aqua regia IRNAS) y recuperación respecto a los certificados con aqua regia. Resultados expresados sobre muestra seca. Muestra de referencia BCR-143R, suelo enmendado con lodo de depuradora. Elemento Total Aqua regia Aqua regia IRNAS1 mg kg - 1 mg kg - 1 Recup. 2 % mg kg - 1 Recup. 3 % Recup. 4 As - 11,51 - Cd 71,8 72,0 100,3 70,3 97,6 97,9 Co 12,3 (11,8) 95,9 11,2 94,9 91,1 Cr - 426 - 428 100,5 Cu 130,6 (128) 98,0 130 101,6 99,5 Mn 904 858 94,5 873 101,7 96,6 Ni 299 296 99,0 283 95,6 94,6 Pb 179,7 174 96,8 169 97,1 94,0 Zn 1055 1063 100,8 1022 96,1 96,9 Los valores entre paréntesis no están certificados 1Valor medio de 6 repeticiones 2 Recuperación respecto al total 3 Recuperación respecto a valores de aqua regia certificados 4 Recuperación respecto al total III. MATERIALES Y MÉTODOS 53 s.r.l., Sorisole, Italia). Para ello se pesaron 0,5 g de muestra (<60 μm) a la que se añadieron 3 ml de HCl concentrado y 1 ml de HNO3 concentrado (agua regia). Tras la digestión y enfriamiento de los extractos, estos se diluyeron con agua deionizada hasta 50 ml. Finalmente, los extractos diluidos se filtraron a través de filtro de Nylon (0,45 µm) y se conservaron en botes de PVC hasta su análisis. Las concentraciones de los distintos elementos en los extractos se midieron por espectrofotometría de emisión de plasma, ICP-OES (Inductively Coupled Plasma-Optic Emission Spectrometry) en un equipo Varian ICP (Inductively Coupled Plasma-Optic Emission Spectrometry) 720-ES. Las concentraciones de elementos traza se expresaron en mg kg-1. La exactitud y la precisión del método empleado se determinó analizando muestras de materiales de referencia BCR 142 R y 143R. Las Tabla III.4. y III.5. muestran que los resultados obtenidos en los laboratorios del IRNAS son muy similares a los valores certificados con aqua regia. Tabla III.5. Valores certificados totales (Total) y solubles en aqua regia (Aqua regia), y solubles en aqua regia obtenidos en el laboratorio del IRNAS (Aqua regia IRNAS) y recuperación respecto a los certificados con aqua regia. Resultados expresados sobre muestra seca. Muestra de referencia BCR-142R, suelo ligero arenoso. Elemento Total Aqua regia Aqua regia IRNAS1 mg kg - 1 mg kg - 1 Recup. 2 % mg kg - 1 Recup. 3 % Recup. 4 % As - - 14,6 - Cd 0,34 0,25 73,5 0,27 108 79,4 Co 12,1 (10,2) 84,3 9,65 94,6 79,8 Cu 69,7 (69,8) 100,1 66,1 94,7 94,8 Mn 970 (800) 82,5 803 100,4 82,8 Ni 64,5 61,1 94,7 52,7 86,3 81,7 Pb 40,2 25,7 63,9 23,7 92,2 60,0 Zn (101) 93,3 92,4 79 84,7 78,2 Los valores entre paréntesis no están certificados 1Valor medio de 6 repeticiones 2 Recuperación respecto al total 3 Recuperación respecto a valores de aqua regia certificados 4 Recuperación respecto al total Colinet et al. (1983a y b). III. MATERIALES Y MÉTODOS 54 III.3.4.8. Extracción secuencial de los elementos traza La extracción secuencial de los elementos traza de los suelos se llevó a cabo por el método BCR descrito por (Rauret et al., 1999). El método consiste en la extracción de los elementos traza de una muestra de suelo (<60µm) en tres etapas sucesivas que da lugar a tres fracciones: 1) primera etapa (fracción F1): extracción con ácido acético 0,11M (pH 2,85); 2) segunda etapa (fracción F2): extracción con cloruro de hidroxilamina 0,5M; 3) tercera etapa (fracción F3): digestión con peróxido de hidrógeno 8,8M y posterior extracción con acetato amónico 1M (pH 2,00). Finalmente la muestra se trata con aqua regia para obtener la fracción residual. Tradicionalmente a este tipo de metodología se le denomina “especiación” porque a cada fracción del elemento extraído se le suele relacionar con una espacie química o con su asociación con algún componente específico del suelo. Aunque (Rauret et al., 1999) no relacionan esas fracciones con especies químicas específicas de los elementos traza o con su asociación con los componentes del suelo, se admite que en: F1 incluye fundamentalmente elementos traza solubles, cambiables y asociados a los carbonatos; F2 incluye elementos traza asociados a compuestos reducibles, especialmente óxidos e hidróxidos de Fe; F3 incluye elementos traza asociados a compuestos oxidables, especialmente orgánicos y sulfuro. La fracción residual comprende los elementos trazas existentes en compuestos más recalcitrantes como los minerales de la arcilla, cuya movilidad es mínima (Pérez de Mora et al., 2007). III.3.4.9. Determinación de los elementos traza extraíbles con CaCl2 0,01 M Se pesaron 3 g de muestra de suelo (<60µm) en tubos de centrífuga y se añadieron 30 ml de una disolución de CaCl2 0,01 M (Houba et al., 1996). Las muestras se agitaron durante tres horas (140 agitaciones min-1) en un agitador automático de vaivén (Selecta Rotabit) a temperatura constante (22 ± 1ºC). A continuación, las muestras se centrifugaron a 10000 rpm (12000 g) durante 10 min, filtrándose el sobrenadante con papel de filtro Whatman 1 (diámetro de poro <11 m). El filtrado se recogió y se guardó en botes de PVC hasta su análisis. La determinación de los elementos traza en la disolución se realizó por ICP-OES. III.3.4.10. Determinaciones de actividades enzimáticas en suelos Determinación de la actividad deshidrogenasa La actividad deshidrogenasa se determinó según el método de Trevors (1984), basado en la incubación de la muestra de suelo (1 g en húmedo) durante 20 h en oscuridad en presencia de 1 ml de tampón Tris-HCl (pH 7,5) y de una disolución de cloruro 2-p- III. MATERIALES Y MÉTODOS 55 iodofenil-3-p-nitrofenol 5 fenil tetrazolio (INT) al 0,4 %. Al final de la incubación, el producto formado (iodonitrofenil formazano (INTF)) se extrajo del suelo con metanol, agitando vigorosamente durante 1 min. Paralelamente, se prepararon controles sin INT. La absorbancia del extracto se leyó espectrofotométricamente a 490 nm frente a disoluciones patrón preparadas con distintas concentraciones de INTF. Los resultados se expresaron en mg INTF kg-1 h-1. Determinación de la actividad aryl-sulfatasa La actividad aryl-sulfatasa se determinó según la metodología propuesta por Tabatabai y Bremmer (1970). Para ello, se incubó 1 g de muestra (peso húmedo) durante 1 h a 37 ºC en tampón acetato 0,5 M (pH 6,5) en presencia de p-nitrofenil sulfato (PNS), en un baño con agitación (Selecta Unitronic Or). Al final de la incubación, se añadió 1 ml de CaCl2 0,5 M y 4 ml de NaOH 0,5 M, y la suspensión resultante se filtró. Al mismo tiempo, se prepararon controles a los que se añadió el PNS después de la incubación. En el extracto filtrado, se determinó espectrofotométricamente a 400 nm la concentración del producto formado p-nitrofenol (PNP). La recta patrón se realizó preparando disoluciones de PNP de concentración conocida. El resultado se expresó en mg PNP kg1 h-1. Determinación de la actividad ß-glucosidasa La determinación de la actividad ß-glucosidasa se realizó por el método de Tabatabai (1982), incubando 1 g de suelo (peso húmedo) durante 1 h en tampón MUB (modified universal buffer) (pH = 6) y en presencia de p-nitrofenil-ß-D-glucopiranósido (PNG) (0,025 M), en un baño con agitación (Selecta Unitronic Or). Al término de la incubación, se añadieron 1 ml de CaCl2 (0,5 M) y 4 ml de tampón Tris (0,1 M pH = 12), y la suspensión se filtró. Los controles se prepararon añadiendo el PNG después de la incubación. En el extracto filtrado, se determinó espectrofotométricamente a 400 nm la concentración del producto formado p-nitrofenol (PNP). La recta patrón se realizó preparando disoluciones de concentración conocida de PNP. El resultado se expresó en mg PNP kg-1 h-1. Determinación de la actividad fosfatasa ácida La determinación de la actividad fosfatasa ácida se llevó a cabo por el método de Nannipieri et al. (1980). Se incubaron 0,5 g de muestra húmeda a 37ºC durante 1,5 h en tampón maleato 0,1 M (pH = 6,5) en presencia de p-nitrofenilfosfato hexahidratado (PNPP) en una baño con agitación (Selecta Unitronic Or). Después de la incubación se III. MATERIALES Y MÉTODOS 56 añadieron 0,5 ml de CaCl2 0,5 M, 2 ml de NaOH 0,5 M y 25 ml de agua destilada. La suspensión resultante se filtró. Los blancos se prepararon añadiendo el PNPP después de la incubación. En el extracto filtrado, se determinó espectrofotométricamente a 400 nm la concentración del producto formado p-nitrofenol (PNP). La recta patrón se realizó preparando disoluciones de PNP de concentración conocida. El resultado se expresó en mg PNP kg-1 h-1. Determinación de la actividad ureasa La determinación de la actividad Ureasa se realizó por el método de Kandeler y Gerber (1988) modificado por Kandeler et al. (1999). Se pesaron 2 g de suelo húmedo en tubos de centrífuga, se añadió 1,5 ml de la disolución de urea de 79,9 mM, y se dejó incubar durante 2 h a 37 ºC. Los controles se preparan sustituyendo la disolución de urea por 1,5 ml de agua destilada. El amonio liberado en la incubación se extrajo añadiendo al final de la misma 13,5 ml de una disolución de KCl 2M y agitando durante 30 min. A 1 ml del extracto filtrado se le añadió 9 ml de agua destilada, 5 ml de una disolución de salicilato sódico en hidróxido de sodio y 2 ml de la solución de dicloroisocianurato de sodio; la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 min., y finalmente se midió la densidad óptica a 690 nm. III.3.5. Análisis de aguas1 Tras cada episodio de precipitación, cuando esto fue posible se recogieron muestras de agua de poro (SPW, Soil pore water) con los rizhon samplers. III.3.5.1. Determinación del pH El pH se determinó en el mismo bote de PVC en el que se recogieron las muestras, mediante un pH-metro CRISON micro pH 2002 con compensación automática de la temperatura. III.3.5.2. Determinación de la concentración de nutrientes y elementos traza Para la determinación de la concentración de sales y de elementos traza, las muestras de agua se filtraron a través de papel de filtro Whatman 1 (diámetro de poro <11 µm) y añadiéndole a los filtrados, recogidos en frascos de vidrio, 0,5 ml de ácido nítrico (30 %) por cada 25 ml. Las concentraciones de los distintos elementos se determinaron por espectrofotometría de emisión de plasma, ICP-OES en un equipo Varian ICP 720-ES). III. MATERIALES Y MÉTODOS 57 III.3.6. Análisis de plantas III.3.6.1. Preparación del material vegetal El material vegetal se pesó y se llevó inmediatamente al laboratorio, donde se lavó primero con una disolución de ácido clorhídrico al 1 % durante 15 s, y después con agua desionizada durante 10 s, se dejó escurrir, se guardó en sobres de papel cerrados y se dejó secar en estufa a 70 ºC durante 48 h. El material seco, se molió en un molino Ika Labortechnik, se tamizó a 500 µm y se guardó en sobres de papel antihumedad. III.3.6.2. Determinación del N-Kjeldahl Para la determinación del N-Kjeldahl, las muestras molidas y secas de material vegetal se trataron con H2SO4 concentrado en presencia de catalizador (mezcla de Se y K2SO4) a 380ºC durante 2 h. El nitrógeno amoniacal se determinó por el método del indofenol en un autoanalizador Bran + Luebbe AIII. Los resultados se expresaron como g 100 g-1 (%) de N-NH4+ sobre muestra seca. III.3.6.3. Extracción y determinación de nutrientes y elementos traza El análisis del material vegetal se realizó mediante extracción total por vía húmeda, bajo presión en horno microondas. Se pesaron 0,5 g de muestra molida y seca en vasos de teflón, se añadieron 4 ml de HNO3 Suprapur, se agitó suavemente para mojar la muestra por completo, se dejó reposar durante toda la noche, tras lo cual se procedió a la digestión en horno microondas. El extracto obtenido se con agua desionizada hasta 50 ml y se filtró a través de papel de filtro Whatman 2 (diámetro de poro < 8 µm), Tabla III.6. Valores certificados y obtenidos en el laboratorio del IRNAS (mg kg - 1 ± DE) de la muestra de referencia INCT-TL-1 (hojas de té).Resultados expresados sobre muestra seca. Elemento Valor certificado IRNAS mg kg-1 mg kg-1 Recuperación % As 0,106±0,021 0,131±0,011 124 Cd 0,030±0,004 0,021±0,004 70 Cu 20,4±1,5 20,0±0,45 98 Pb 1,78±0,24 0,87±0,015 48,9 Zn 34,7±2,7 34,7±0,03 100 III. MATERIALES Y MÉTODOS 58 recogiéndose la disolución en un bote de PVC. La determinación de los macronutrientes y elementos traza en la disolución se realizó mediante ICP-OES en un equipo Varian ICP 720-ES). Las concentraciones de elementos traza se expresaron en mg kg-1 en base a materia seca. La exactitud y la precisión del método empleado se determinó analizando muestras de materiales de referencia INCT-TL-1(muestra de té, Polish Certified Reference Material For Multielement Trace Analysis) y NCS-DC73348 (Elementos traza en ramas y hojas de arbustos) (Tabla III.6). Las Tabla III.6. y III.7. muestran que los resultados obtenidos en los laboratorios del IRNAS son muy similares a los valores certificados. III.3.7. Tratamiento estadístico de los datos El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo con el paquete estadístico SPSS 23.0 para Windows. Los datos se sometieron al test de normalidad de Shapiro-Wilk. Cuando algunos grupos de datos no pasaron el test de normalidad, se transformaron logarítmicamente y se les volvió a pasar el test de normalidad. La comparación de Tabla. III.7. Valores certificados y obtenidos en el laboratorio del IRNAS de la muestra de referencia NCS-DC73348 (elementos traza en ramas y hojas de arbustos), Resultados expresados sobre muestra seca. Elemento Valor certificado IRNAS1 mg kg-1 mg kg-1 Recuperación % As 0,95±0,12 0,88±0,11 92,6 Cd 0,14±0,06 0,19± 0,01 135 Cu 5,2±0,5 4,80±0,19 92,3 Mn 58±6 56,6±0,75 97,4 Fe 1020±67 870±43,5 85,3 Pb 7,1±1,1 7,07±0,25 99,6 Zn 20,6±2,2 22,0±1,32 106 Ca (%) 2,22±0,13 2,17 ±0,02 97,7 K (%) 0,85±0,05 0,78±0,02 91,8 Mg (%) 0,29±0,018 0,28±0,002 96,6 P (%) 0,083±0,004 0,083±0,002 100 1 Valor medio de 5 repeticiones III. MATERIALES Y MÉTODOS 59 medias entre tratamientos se llevó a cabo mediante análisis ANOVA de un factor, realizándose el test de Tukey cuando existió homogeneidad de las varianzas, o el test de Games-Howell en caso contrario. Cuando algún grupo de datos no cumplía los requisitos para la aplicación del ANOVA, se aplicó la estadística no-paramétrica usando los tests de Wilcoxon o de Mann-Whitney, según se compararan datos apareados o no pareados. Las matrices de correlación entre los diferentes parámetros se basaron en los coeficientes de Pearson con un nivel de significación de p<0,01 o p<0,05, según el caso. El análisis multivariante de los resultados de los experimentos, se llevó a cabo mediante el análisis de componentes principales (PCA, Principle component analysis), usando el paquete estadístico SPSS 15.0 para Windows, así como mediante las representaciones de rayos de sol (SRP, Sun ray plots) usando Microsoft Excel. El PCA transforma en conjunto de variables originales del sistema en otro, las componentes principales, cada una de las cuales explican una proporción de la varianza del sistema. Generalmente, un número de componentes (2 o 3), menor que el de variables originales suelen explicar un alto porcentaje de la varianza, lo que facilita establecer las diferencias entre los tratamientos. Las SRP permiten comparar gráficamente los valores medios de las variables en los distintos tratamientos (Dilly and Blume, 1998; Moreno et al., 2009; 2011). La forma de la figura y el área integrada de la misma permiten la comparación visual y estadística de los distintos tratamientos. El área integrada de cada figura de cada tratamiento se determinó mediante las herramientas de medida de Adobe® Acrobat® 9 (Adobe Systems Incorporated, CA, USA). IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 68 Pendias, 2001). Por otra parte, la aplicación de enmiendas orgánicas disminuye el pH de los suelos calcáreos, lo que se atribuye a la acidez generada en la mineralización de la materia orgánica, que aumenta los nivelas de CO2 en el suelo (Mohammad y Athamneh, 2004), o/y a los ácidos orgánicos que pueden liberar las enmiendas orgánicas como los composts de RSU los de biosólidos (Zinati et al., 2001). El aumento de la acidez del suelo provoca el aumento de la disponibilidad de micronutrientes de los suelos calcáreos no contaminados (Mohammad y Athamneh, 2004). IV.1.3. Carbono orgánico total (COT) y Carbono orgánico hidrosoluble (COS) de los suelos La aplicación de enmiendas aumentó los valores medios de COT en la capa de 0-15 cm de todos los suelos enmendados respecto al tratamiento sin enmiendas, pero no tuvo efecto en la capa más profunda de 15-30 cm (Figura IV.1b). Los aumentos fueron mayores con las enmiendas orgánicas BC y LESL, siendo la tendencia LESL>BC>SL. Con la dosis DO2 los aumentos respecto a NA en BC2 y LESL2 fueron significativos (p<0,05) y supusieron valores de COT 1,6 y 1,7 veces mayores que en NA. Posteriores aplicaciones de enmiendas (DO4) supusieron nuevos aumentos, alcanzándose valores de COT 1,8 y 2,3 veces mayores que en NA en los tratamientos BC4 y LESL4 respectivamente. La disminución observada en el tratamiento con espuma de azucarera SL4 no fue significativa (p<0,05). Las Figuras IV.2c y d muestran la evolución de las concentraciones medias de COT desde el comienzo del experimento. En ambas capas de todos los suelos enmendados se observa que COT aumenta respecto al suelos original (2002). Las diferencias entre el COT del suelo original y el tratamiento sin enmienda (NA) en 2003 no fueron significativas. Entre 2003 y 2007 en la capa de 0-15 cm (Figura IV.2c), se observa un aumento de los valores medios de COT: 1,8 g kg-1 en NA, 0,8 g kg-1 en SL2, 4,6 g kg-1 en BC2 y 4,5 g kg-1 en LESL2, respecto a los valores de 2003 (Madejón et al., 2009a, 2010). Al final del experimento (2011) se observa una disminución de los valores medios de COT en BC2 y LESL2 respecto a 2007, que no son significativos estadísticamente (BC2, F=468 p=0,58; LESL2, F=4,17 p=0,93). Es interesante resaltar que los aumentos de COT observados en los tratamientos sin enmiendas orgánicas (NA y SL2) pueden deberse a un efecto indirecto del pH que hace aumentar el desarrollo del recubrimiento vegetal; la posterior descomposición del material vegetal contribuye al aumento de la concentración de COT del suelo. IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 69 La aplicación de dos nuevas dosis de enmienda en 2005 y 2006 (DO4) (Figura IV.2c), produjo aumentos de COT en los dos tratamientos con enmiendas orgánicas (BC4 y LESL4). También en estos dos casos de se observó un decaimiento no significativo de COT entre 2007 y 2011 (BC4, F=1,76 p=0,14; LESL4, F=6,69 p=0,35). En la capa de 15-30 cm la aplicación de enmiendas no produjo efectos apreciables en COT (Figura IV.2d). La aplicación de enmiendas parece que aumentó las concentraciones medias de COS en ambas capas de los suelos enmendados, si bien en ningún caso se observaron diferencias estadísticamente significativas (Figura IV.1c). Debido a los bajos contenidos de materia orgánica de los suelos de los valles de los ríos Agrio y Guadiamar y a la pérdida de la capa superficial de los mismos, la más año 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 pH 2 3 4 5 6 7 8(0-15 cm) 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 (15-30 cm) a b año 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 COT (g kg -1 ) 0 5 10 15 20 25 30 (0-15 cm) 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 (15-30 cm) cd Figura IV.2. Evolución de los valores medios de pH y de COT. La flechas indican las fechas de las aplicaciones de las enmiendas (2002 y 2003, DO2; 2005 y 2006 DO4). Los asteriscos corresponden a los valores medios (48 puntos de muestreos) en 2002, antes del comienzo del experimento. IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 70 rica en materia orgánica, durante las labores de limpieza y de recuperación se incluyó la aplicación de enmiendas orgánicas. Generalmente, la materia orgánica de las enmiendas presenta una alta estabilidad frente a la degradación microbiana, lo que constituye una clara ventaja para los suelos enmendados y que contribuye a largo plazo a la mejora de la fertilidad de los mismos (Bernal et al., 1998). La concentración de materia orgánica del suelo del presente estudio, al que sólo se le había removido la capa superficial, era en 2002 1,59% (COT 0,92%), cuando empezó el experimento. Por esta razón y por el consabido efecto de las enmiendas orgánicas en la reducción de la disponibilidad de los elementos traza de los suelos (Cabrera y Madejón, 2014), se optó por la aplicación de enmiendas orgánicas. Los resultados obtenidos, como se acaba de describir, mostraron 1) el aumento de la concentración de COT de los suelos enmendados con enmiendas orgánicas, que es función de la naturaleza de las mismas, así como de las dosis aportadas, y 2) la perdurabilidad del efecto de dichas enmiendas. IV.1.4. Nitrógeno Kjeldhal (N-Kj), Fósforo Olsen (P-Olsen) y Potasio disponible (K-disp) de los suelos En general, la aplicación de enmiendas aumentó las concentraciones medias de N-Kj, POlsen y K-disp de los suelos (Figure IV.3). En la capa superficial, con la dosis DO2, las concentraciones medias de N-Kj aumentaron en todos los suelos enmendados respecto a NA, 27, 49 y 18 % en SL2, BC2 y LESL2 respectivamente, aunque sólo en el caso de BC2 las diferencias fueron significativas (p<0,05). Posteriores enmiendas (DO4) sólo supusieron nuevos aumentos en BC4 y LESL4, en cuyas parcelas las concentraciones de N-Kj llegaron a aumentar un 72 y 34% respecto a NA, respectivamente (Figura IV.3a). Las concentraciones de P-Olsen en la capa superficial aumentaron con la dosis DO2 en los tratamientos SL2 y BC2 (2,9 y 2,2 veces respectivamente). Posteriores enmiendas (DO4), sólo tuvieron efectos positivos significativos en el tratamiento BC4 en el que se alcanzó una concentración 3,7 superior a la de NA (Figura IV.3b). En general la primera aplicación de enmiendas (DO2) hizo aumentar la concentración de K-disp en la capa superficial de los suelos, aunque las diferencias con el tratamiento NA no fueron significativas en ningún caso, a pesar de que en LELS2 dicha concentración se duplicó. Las subsiguientes aplicaciones de enmiendas (DO4) siguieron aumentando la disponibilidad del K en SL4 y BC4, pero como en los casos anteriores dichos aumentos no tuvieron significación estadística (Figura IV.3c). Los IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 71 aumentos de observados de N-Kj, P-Olsen y K-disp en la capa subsuperficial no fueron estadísticamente significativos (p<0,05). Nitrógeno, P y K son nutrientes esenciales para el crecimiento de las plantas, cuyo déficit en muchos suelos de los ecosistemas mediterráneos constituye un factor limitante de su fertilidad (Mayor y Roda, 1994; Hanley y Fenne, 2001; Sardans et al., 2004). Las enmiendas actúan como una fuente de liberación lenta de nutrientes debido a sus bajas tasas de mineralización, que favorecen el aumento de la fertilidad de los suelos (Alburquerque et al., 2011). Las aplicaciones de enmiendas a los suelos implican por tanto la adición a los mismos de cantidades de N, P y K dependientes sus concentraciones en las enmiendas y de las cantidades aportadas. El aumento de la concentración total de dichos nutrientes en el suelo depende de la extracción por parte de las plantas y de pérdidas por lixiviación, escorrentía, desnitrificación, etc. El aumento de la disponibilidad de los nutrientes aportados por las enmiendas depende de la forma en que se encuentren en ellas y de las Figura IV.3. Valores medios ±ES (n=3) de K-Kj, P-Olsen y K-disp de los suelo a 015 y 15-30 cm. En cada profundidad, los valores con distinta letra difieren significativamente (Test de Tukey, p<0,05). Profundidad (cm) 0-15 15-30 N-Kj ( % ) 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 a abc ab cd d ab bc a ES Profundidad (cm) 0-15 15-30 P-Olsen ( mg kg -1 ) 0 20 40 60 80 NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 a bc abc abc c a ab b ES Profundidad (cm) 0-15 15-30 K-disp ( mg kg -1 ) 0 50 100 150 200 250 NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 ES c IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 72 propiedades del suelo (p. ej.: pH, contenido en materia orgánica, mineralogía, etc.). Por todas estas razones no es fácil hacer un balance de materia en estos experimentos. En el presente estudio es difícil relacionar los aumentos de N, P y K observados experimentalmente (Figura IV.3) con los teóricos calculados a partir de las cantidades de nutrientes aportadas (Tabla IV.1), entre otras razones porque los datos experimentales de P y K son concentraciones de disponibles, pero la comparación de darían una idea de la eficacia fertilizante de las enmiendas empleadas En el caso del N se observa que con los tratamientos orgánicos (BC y LESL) se aporta prácticamente la misma cantidad de este nutriente, que es casi dos veces más que con el inorgánico (SL). Sin embargo, los resultados experimentales reflejan sólo que con los tratamientos BC y LESL los suelos muestran mayor concentración de N que en NA, pero que no se comportan de la misma manera. Las diferencias observadas están relacionadas con la naturaleza del N aportado en cada caso, que tendría un distinto comportamiento en el suelo. En el caso del P y K la comparación es aún más difícil porque como se ha dicho anteriormente, en la Tabla IV.1 se muestran valores totales aportados, mientras que las Figuras IV.3b y 3c muestran valores de P y K disponibles. Dicha tabla muestra que el tratamiento LESL es el que menos P aporta y con el que se obtienen los valores más bajos de P-Olsen. Sin embargo, a pesar de que el tratamiento SL aporta tres veces menos P que el BC, las dos primeras adiciones de SL (DO2) produjeron mayores valores de P-Olsen, lo que muy probablemente se deba al aumento del pH producido Tabla IV.1. Cantidades de N, P y K aportadas por las enmiendas (Aport.) 1 y aumentos teóricos esperables (∆)2 en el suelo. Enmienda Tratamiento N P K Aport. ∆ Aport. ∆ Aport. ∆ kg ha - 1 mg kg - 1 kg ha - 1 mg kg - 1 kg ha - 1 mg kg - 1 SL DO2 323 162 168 84 175 87,5 BC DO2 569 285 540 270 404 202 LESL DO2 586 293 91 45,5 1566 783 SL DO4 643 324 336 168 350 175 BC DO4 1138 570 1080 540 808 404 LESL DO4 1172 586 182 91 3132 1566 1Las cantidades aportadas se calcularon con los datos de humedad y concentraciones de la Tabla III.2. 2Los aumentos teóricos esperables se estimaron considerando que la capa de suelo de 15cm de 1 hectárea de un suelos franco (densidad aparente ≈1,4 g cm-3) pesa aproximadamente 2×106 kg. IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 73 por SL, un material con un alto poder “encalante” (liming potential) por su alta proporción de CaCO3 (Figura IV.1a). No es hasta después de las siguientes aplicaciones (DO4) cuando el P disponible tiene valores más altos en el tratamiento BC. A este último respecto, algunos autores han encontrado que los niveles de P disponible dependen más de las aplicaciones acumulativas que de la naturaleza del P aportado (Eghball & Power, 1999; Cooperband et al., 2002; Madejón et al., 2003a; Paredes et al., 2005; López-Piñeiro et al., 2008). Al igual que para el P-Olsen, el K disponible aumenta con las enmiendas, aunque no está directamente relacionado con las cantidades totales aportadas. Por ejemplo, con la aplicación de las dos primeras dosis (DO2) los valores más altos se observaron en el tratamiento LESL que es el que más K aporta, en cambio con los tratamientos SL y BC se obtuvieron resultados similares a pesar de que con BC se aportó más de dos veces más K que con SL. Este hecho también podría explicarse, como en el caso del P, por el aumento de pH que produjo la aplicación de SL. IV.1.5. Concentraciones de elementos traza de los suelos IV.1.5.1. Elementos traza pseudototales No se encontraron diferenciadas significativas entre tratamiento, ni entre dosis en las concentraciones pseudototales de As, Cd, Cu, Pb y Zn (Tabla IV.2). En cada profundidad, las concentraciones fueron similares en todos los tratamientos, independientemente del tipo de enmienda y de las dosis empleadas. Esto concuerda con lo esperado ya que los elementos trazas no se degradan y que las concentraciones de elementos traza que podrían ser movilizadas por las enmiendas son muy pequeñas respecto al total en el suelo. Por otra parte, en un estudio previo Madejón et al. (2010) demostraron que considerando las concentraciones de elementos traza en las enmiendas (Tabla III.2), las dosis de las mismas no fueron suficientemente altas para aumentar la concentración de elementos traza del suelo. El grado de contaminación por elementos traza se evaluó usando el Índice de Carga Contaminante (Pollution Load Index, PLI) de Tomlinson et al. (1980). Este índice está basado en los valores de los factores de concentración (FC), que es cociente entre la concentración de un elemento traza en el suelo (Celemento traza) y el valor de fondo del mismo elemento (Cvalor de fondo). Como valores de fondo se han utilizado las concentraciones medias de los suelos de la zona no afectada por el vertido (Cabrera et IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 74 al., 1999). Para cada muestra de suelo, el PLI se determina calculando la raíz enésima (n, depende del número de elementos considerados) del producto de los n FC de los elementos considerados: nn FCFCFCPLI )( 21  . Este índice proporciona un medio sencillo, para evaluar y comparar el nivel de contaminación por elementos traza de los suelos. Valores PLI = 1, indican que el suelos tiene concentraciones de elementos traza iguales a los valores de fondo. Cuando los valores de PLI se alejan de la unidad indican que hay contaminación, que es mayor cuanto más alto es el valor de PLI. Los valores de PLI obtenidos para este suelo indican una severa contaminación por As, Cd, Cu, Pb y Zn, mayor en la capa superficial que en la subsuperficial (Tabla IV.2). Tabla IV.2. Resultado del ANOVA de las concentraciones de elementos traza pseudototales en los suelos de los distintos tratamientos (n=3). Valores medios y error standard (mg kg-1±ES). Tratamiento Capa superficial (0-15cm) As Cd Cu Pb Zn PLI N 250±50 1,2±0,20 180±10 600±140 360±48 SL2 180±49 2,1±0,36 165±7,7 350±91 550±73 SL4 170±61 2.3±0,72 180±22 400±110 600±124 BC2 200±42 1,7±0,33 180±22 430±52 460±72 BC4 200±17 2,3±0,59 190±21 410±46 600±150 LESL2 180±54 1,5±0,29 180±22 500±160 380±68 LESL4 230±28 1,4±0,23 169±8,6 600±93 400±58 Media total 201±72 1.78±0,75 177±27 451±178 478±167 7,06 p 0,810 0,427 0,968 0,587 0,282 gl=20 dns dns dns dns dns Valor de fondo * 18,3 0,33 30,9 38,2 109 1 Tratamiento Capa subsuperficial (15-30cm) As Cd Cu Pb Zn N 110±39 1,1±0,23 120±28 260±85 330±36 SL2 50±14 0,6±0,16 100±24 130±29 260±19 SL4 50±14 0,5±0,17 100±17 120±23 220±24 BC2 73±3,4 1,2±0,28 130±29 165±7,5 380±75 BC4 42±6,8 1,1±0,09 100±13 120±11 330±34 LESL2 49±9,3 1,0±0,07 140±28 130±14 310±26 LESL4 120±52 0,6±0,13 120±28 290±99 250±27 Media total 71±49 0.87±0,36 116±39 173±101 297±78 3,43 p 0,230 0,079 0,836 0,147 0,111 gl=20 dns dns dns dns dns p, probabilidad; gl, grados de libertad; dns, diferencias no significativas *El valor de fondo de cada elemento fue prácticamente constante a través del perfil del suelo (Cabrera et al. 1999). IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 75 IV.1.5.2. Especiación de los elementos traza A pesar de que los resultados de los métodos de extracción secuencial o fraccionamiento, están afectados por una serie de problemas inherentes a los mismos (vr. g.: inespecificidad de los extractantes (falta de selectividad), reabsorción por otras fases y precipitación de los elementos liberados), estos métodos se usan frecuentemente para estimar la distribución de los elementos traza entre los distintos componentes del suelo, aunque de una manera imprecisa, como manifiesta Adriano (2001). Asimismo, el mismo autor considera que son una herramienta útil para comprender la dinámica de los elementos traza (sus cambios de una fase a otra) durante y después de la recuperación de los suelos contaminados. Teniendo en cuenta todo lo anterior, los resultados de la extracción secuencial mostraron que en el suelo en estudio cada elemento traza tiene una distribución específica (Figura IV.4). Examinado la distribución de los elementos estudiados en los suelos no tratados se observa que el Cd se encuentra fundamentalmente en las formas más solubles (F1 72%) y asociada a óxidos e hidróxidos de Fe (F2 27%). El Pb, en cambio, se encuentra en un 92,6% en la fracción residual. El Cu y Zn se encuentran distribuidos entre todas las fracciones, siendo la principal en ambos casos la residual (Cu 38,5%, 36,8%), aunque no la más importante desde el punto de vista medioambiental, que en el Cu es F2 (29,7%) y en el Zn es la F1 (24,6%), que son las fracciones en las que estos elementos se encuentran en formas más disponibles. El efecto de la aplicación de las enmiendas en la distribución de estos elementos en las distintas fracciones consideradas es difícil de explicar por este método, debido a los problemas comentados anteriormente. Por otra parte, las pequeñas variaciones que entrañan el efecto de las enmiendas sobre la concentración pseudototal de los elementos en cada fracción, hacen que las determinaciones estén afectadas por altos errores analíticos. El ejemplo más problemático es Cd que en el suelo en estudio tiene una concentración pseudototal de 1,24 mg kg-1 en NA, valor cercano al límite de detección del método analítico empleado. De cualquier forma, los resultados obtenidos parecen indicar que en general la aplicación de enmiendas hace disminuir la concentración de los elementos estudiados en la fracción F1, constituida por las formas más lábiles, más IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 76 NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 Cd, % 0 20 40 60 80 100 0-15 cm NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 0 20 40 60 80 100 15-30 cm NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 Pb, % 0 20 40 60 80 100 0-15 cm NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 0 20 40 60 80 100 15-30 cm NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 Cu, % 0 20 40 60 80 100 0-15 cm NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 0 20 40 60 80 100 15-30 cm 0-15 cm 15-30 cm NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 Zn, % 0 20 40 60 80 100 NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 0 20 40 60 80 100 Figura IV.4. Resultado del fraccionamiento de Cd, Cu, Pb y Zn en los suelos de los distintos tratamientos. F1 F2 F3 Residual IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 77 móviles y disponibles, de dichos elementos. Sin embargo, el ANOVA indicó que las diferencias encontradas sólo eran significativas en el caso del Cu en la capa superficial. En la fracción F2 las concentraciones de Cd y Zn en ambas capas de suelo aumentaron en general con la aplicación de enmiendas, si bien el ANOVA no mostró diferencias significativas. Los valores de Pb en esta fracción estuvieron por debajo del límite de detección del método, y los de Cu mostraron pequeñas disminuciones en superficie y leves aumentos en profundidad. Es interesante tener en cuenta que el aumento de las concentraciones en esta fracción trae consigo la disminución de la movilidad y de la disponibilidad de los elemento traza. Las concentraciones de Cd y Pb en la F3 estuvieron en ambos casos por debajo de los límites de detección del método analítico. Sin embargo, las de Cu y Zn en la capa superficial experimentaron aumentos que para el Zn fueron significativos. En la capa subsuperfical no se observaron variaciones dignas de mención. También en este caso los aumentos de las concentraciones en esta fracción suponen una disminución de la movilidad y de la disponibilidad. Respecto a las concentraciones en la fracción residual, lo esperable de la aplicación de enmienda sería la disminución de dicha fracción, que es lo que se ha encontrado en el Pb, en el que la disminución de esta fracción va en beneficio del aumento de la F2 encontrado fundamentalmente en la capa subsuperficial del suelo. Las concentraciones de Cd en fracción residual fueron muy pequeñas, en muchos casos por debajo del límite de detección del método. En el Cu la proporción en la fracción residual osciló entre el 60-70% en la capa superficial y el 40-50% en la subsuperficial de los suelos. En el Zn las proporciones fueron algo menores, 28-30% y 30-47% a 0-15 y 1530 cm respectivamente. Solamente en la capa subsuperficial el ANOVA detectó que los valores medios de este elemento eran significativamente más bajos en los suelos enmendados que en el control sin tratar, pero su origen no se ha podido relacionar con aumentos de en las otras fracciones. IV.1.5.3. Elementos traza extraíbles en CaCl2 0,01 M. La extracción con CaCl2 0,01M es un método que se utiliza para estimar la concentración de elementos traza disponibles en los suelos (Kabata-Pendias, 2004). La disolución de CaCl2, por una parte disuelve todo el material soluble existente en el suelo, y por otra los iones Ca+2 en el extracto reemplazan, por un proceso de intercambio iónico, a los cationes existentes en el complejo de cambio, los cuales pasan IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 84 En los últimos años, las actividades enzimáticas han demostrado ser mejores indicadores de la calidad del suelo de las propiedades físico-químicas (Dick, 1997). Sin embargo, su variabilidad ante distintos factores que no sean exactamente aquellos que se pretende comparar hace necesario un esquema de muestreo claro. En cualquier caso es difícil proporcionar normas universales o umbrales para la interpretación de los resultados obtenidos en ensayos de determinación de actividades enzimáticas en el suelo. Por ello, se ha sugerido que las actividades enzimáticas pueden ser más útiles para el seguimiento de las tendencias en el tiempo que para la caracterización de un suelo en un momento dado (Speir y Ross, 2002; Hinojosa et al., 2004). En cualquier caso en el presente estudio se han incluido dos muestreos: uno en primavera, en el mes de marzo de 2012, y el otro en invierno, en el mes de diciembre de 2012 con temperaturas más bajas. En el muestreo de marzo, las determinaciones se realizaron a las dos profundidades (0-15cm y 15-30cm), mientras que en el muestreo de diciembre, dada la poca respuesta observada en el muestre anterior en la capa más profunda, las determinaciones se hicieron solamente en la capa superficial. En general, en los dos muestreos llevados a cabo en el presente estudio, los valores medios de todas las actividades enzimáticas en la capa más superficial de los suelos tratados con las enmiendas fueron superiores que las de los suelos sin tratar (Figura IV.8). Asimismo, en el muestreo de marzo, en los suelos de las parcelas enmendadas, los valores medios en la capa superior (Figura IV.8) fueron mucho mayores que en la capa inferior (Tabla IV.3). El aumento de los valores medios de las actividades enzimáticas del suelo tratado con las distintas enmiendas siguió la tendencia: SL> BC> LESL. La Figura IV.8 muestra además que las actividades DHA y UA fueron en general más altas en el muestreo de marzo que en el de diciembre, lo que puede atribuirse a las menores temperaturas en este mes. La misma figura muestra que todos valores medios de BGA y algunos de ASA fueron más altos en diciembre que en marzo, sin embargo la comparación de los valores de cada tratamiento en ambos meses por el test t de Student, mostró que las diferencias no eran significativas. La respuesta de la actividad enzimática a la temperatura depende de la enzima estudiada, aunque en general los numerosos trabajos realizados en este tema (Trasar-Cepeda et al., 2007; Allison y Treseder, 2008; Wallenstein et al., 2012; Steinweg et al., 2012, 2013) coinciden en que las actividades potenciales se ven favorecidas con temperaturas suaves del suelo, IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 85 Figura IV.8. Valores medios ± ES (n=3·) de las distintas actividades enzimáticas (DHA, deshidrogenasa, BGA, β-glucosidasa; ASA, arilsulfatasa; APA, fosfatasa ácida, y UA, ureasa) en los suelos a 0-15 cm, en los muestreos realizados en marzo y diciembre 2012. En cada muestreo, los valores con distinta letra difieren significativamente (Test de Tukey, p<0,05) Muestreo Marzo Diciembre DHA ( mg INTF kg-1 ps h-1 ) 0 1 2 3 4 NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 a bb abababab a cc abc bc ab abc Muestreo Marzo Diciembre BGA ( mg PNP kg-1 ps h-1 ) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 a cbc abc c ababc a aaa a a a Muestreo Marzo Diciembre ASA ( mg PNP kg-1 ps h-1 ) 0 5 10 15 20 25 NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 a bb ab ab ab ab a a a a a a a Muestreo Marzo Diciembre APA ( mg PNP kg-1 ps h-1 ) 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 a a a aa a a a a a aaaa Muestreo Marzo Diciembre UA ( mg N-NH4 + kg-1 ps h-1 ) 0 5 10 15 20 25 30 NA SL2 SL4 BC2 BC4 LESL2 LESL4 a b b ab b ab ab a aa a a a a IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 86 como ocurre en los suelos del área mediterránea en los meses de primavera (muestreo de marzo). En cualquier caso hay que tener en cuenta que las temperaturas registradas en diciembre en la zona donde se llevó a cabo el estudio, no son tan bajas como las que se registran en zonas mucho más frías, en las que en los meses de invierno la actividad microbiológica del suelo es extremadamente baja (Allison y Treseder, 2008). Por consiguiente, para evaluar el efecto de las distintas enmiendas en la regeneración del suelo, los resultados obtenidos en primavera son mucho más decisivos. Particularizando, en los resultados obtenidos para las distintas actividades analizadas, la deshidrogenasa (DHA) es una actividad intracelular implicada en la actividad oxidativa microbiana del suelo (Trevors, 1984) y está considerada como un indicador general de la actividad microbiológica. Esta enzima ha sido empleada como indicador de estrés por metales pesados (Rossel et al., 1997) y otras alteraciones del suelo debidas a laboreo intensivo (Melero et al., 2008, 2011) o a la contaminación por sustancias orgánicas (Wolinska and Stepniewska, 2012). Algunos autores han cuestionado la validez de esta enzima en suelos contaminados con Cu debido a alteraciones en el desarrollo del color del producto final (INTF) por este elemento (Chander y Brookes, 1991). Sin embargo, esto no pareció ser un problema en los suelos de este estudio, ya que la concentración máxima de Cu en disolución estuvo por debajo de 1 mg l-1, cantidad que tan sólo inhibe en un 5% el desarrollo del color en el ensayo Tabla IV.3. Valores medios (n=3) de las distintas actividades enzimáticas (DHA; deshidrogenasa, BGA,  -glucosidasa, ASA, arilsulfatasa; APA, fosfatasa ácida, UA, ureasa) en los suelos a 15-30 cm en el muestreo realizado en marzo de 2011. En cada muestreo, los valores con distinta letra difieren significativamente (Test de Tukey, p<0,05). DHA BGA ASA APA UA Tratamiento mg INTF kg-1 ps h-1 mg PNP kg - 1 ps h-1 mg PNP kg-1 ps h-1 mg PNP kg-1 ps h-1 mg N-NH4 kg-1 ps h-1 NA 0,01 1,84 0,69 708 3,58 ab SL2 0,36 7,04 3,33 875 7,84 b SL4 0,30 4,67 4,30 1149 7,52 b BC2 0,17 6,40 2,30 1154 6,75 b BC4 0,08 5,87 1,75 1074 5,47 ab LESL2 0,09 2,74 1,33 1045 3,63 ab LESL4 0,01 3,87 0,69 995 2,33 a p 0,247 0,226 0,120 0,211 0,004 gl=20 dns dns dns dns p, probabilidad; gl, grados de libertad; dns, diferencias no significativas IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 87 (Obbard, 2001). En general, como se ha indicado anteriormente para todas las actividades estudiadas, en 2011, 8 años después de la primera aplicación de las enmiendas, los valores medios en el muestreo de marzo fueron superiores que en el de diciembre (Figura IV.8). En la capa superior del suelo (0-15 cm) de todas las parcelas enmendadas, los valores medios de DHA fueron mucho más altos que en las no enmendadas (NA), aunque las diferencias no siempre fueron significativas. Los valores medios de DHA siguieron en general la tendencia: SL> BC> LESL >> NA. Es muy importante resaltar la gran influencia que tiene el pH sobre esta actividad. Como se ha indicado anteriormente (apartado IV.1.2) la espuma de azucarera (SL) fue la enmienda más eficaz para aumentar el pH del suelo hasta valores próximos a la neutralidad o incluso ligeramente alcalinos (Figura IV.2a), lo que se tradujo en mayores valores de esta actividad. Las otras enmiendas (LESL y BC) también dieron lugar aumentos de la DHA con respecto al suelo sin enmienda, lo que está relacionado con su efecto alcalinizante (Figura IV.2a), así como a los aportes de materia orgánica (Figura IV.2c). En ningún caso se encontraron diferencias significativas entre los valores medios de DHA entre las dosis DO2 y DO4 (Figura IV.8). Se han analizado también enzimas extracelulares, como la β-glucosidasa (BGA), arylsulfatasa, ureasa y fosfatasa, que son hidrolasas que asimismo han demostrado ser indicadores sensibles a los cambios inducidos por las enmiendas, debido a su fuerte relación con el contenido de materia orgánica del suelo (Tejada et al., 2006). La BGA limita la velocidad de la degradación microbiana de celulosa a glucosa y desempeña un papel crucial en el ciclo C en los suelos. En el presente estudio, los valores medios de la actividad (BGA) fueron superiores en los tratamientos con enmiendas, especialmente SL y BC (Figura IV.8), y siguieron la tendencia: SL> BC> LESL> NA. La aplicación de dos dosis (DO2) o cuatro (DO4), sólo dio lugar a cambios importantes con las enmiendas orgánicas: los valores medios obtenidos con las dosis altas (BC4 y LESL4) fueron superiores a dosis bajas (BC2 y LESL2), pero en ningún caso significativo estadísticamente. En la capa subsuperficial no se encontraron diferencias significativas entre tratamientos (Tabla IV.3). La arilsulfatasa (ASA) es una enzima extracelular que cataliza la hidrólisis de los ésteres de sulfatos orgánicos y la liberación sulfatos disponible para la planta. En los dos muestreos realizados, los valores medios de esta actividad fueron más altos en los suelos enmendados que en los suelos sin enmendar (NA) (Figura IV.8). La tendencia es IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 88 prácticamente la misma que la encontrada para las otras actividades: SL> BC> LESL> NA. La aplicación de cuatro dosis de enmienda (DO4), en casi todos los casos dio lugar a valores más altos que con dos dosis (DO2), pero en ningún caso las diferencias fueron significativas. La actividad fosfatasa ácida (APA) ha sido también frecuentemente utilizada como indicador de cambios en la calidad del suelo debidos al manejo o a la presencia de contaminantes (Gil-Sostrés et al, 2005). Esta actividad, conocida también como fosfomonoesterasa ácida, es una enzima inespecífica que cataliza la hidrólisis de los glicerofosfatos. En el presente estudio los valores medios de APA, tanto en el muestreo de marzo como en el de diciembre, fueron ligeramente mayores en todas las parcelas enmendadas, aunque en ningún caso las diferencias fueron significativas (Figura IV.8). Tampoco se encontraron diferencias significativas debidas a la aplicación de dos o cuatro dosis (DO2 o DO4). En este caso, el uso de esta actividad como indicador de la recuperación del suelo puede ser poco apropiado cuando se aplican enmiendas ricas en fosforo. Madejón et al. (2003b) atribuyeron un efecto de retroinhibición negativa al aumentar la concentración del producto de la reacción. En consecuencia, el aporte de P y de compuestos orgánicos lábiles pudo tener más peso en la inhibición de la actividad que otros factores que pudieran incrementarla como el aumento del pH o la disminución de las concentraciones de los elementos traza disponibles. La enzima ureasa (UA) cataliza la hidrólisis de la urea a amonio y dióxido de carbono, y es una de las enzimas más valoradas en estudios de calidad del suelo, así como en la evaluación del impacto de los contaminantes. En este ensayo, en el muestreo de marzo, los valores medios de UA fueron en general más altos en todas las parcelas enmendadas, aunque las diferencias no siempre fueron significativas (Figura IV.8). De nuevo, los valores en el muestreo de marzo fueron superiores a los de diciembre y siguen la misma tendencia que el resto de las actividades analizadas: SL> BC> LESL> NA. La aplicación dos o cuatro dosis (DO2 o DO4) no tuvo efectos significativos en ninguno de los tratamientos. En el muestreo de diciembre no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos. IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 89 IV.1.7. Estimación del recubrimiento vegetal de las parcelas y determinación de la concentración de elementos traza en Cynodon dactylon. En el muestreo llevado a cabo en junio de 2011 se observó que todas las parcelas estaban colonizadas por especies espontáneas, pero que el recubrimiento vegetal era mayor en las parcelas enmendadas (78-98%) que en las que no recibieron enmiendas (NA, 58%). Sin embargo, el ANOVA no mostró diferencias significativas entre los tratamientos, ni por la aplicación de dos o cuatro dosis (DO2 y DO4) de enmienda (Tabla IV.4). El aumento de la vegetación tiene gran importancia ya que reduce la diseminación de las partículas de suelo contaminadas por el viento y las aguas hacia otras áreas no contaminadas, con lo que se reduce posibilidad de la absorción de los contaminantes por la biota (Bargagli, 1998). La Tabla IV.4 muestra que las parcelas del tratamiento NA son las que en 2011 tienen el recubrimiento más bajo (58%), sin embargo este valor representa un aumento respecto al encontrado previamente por Pérez de Mora et al (2011): <5% en 2006 y 40% en 2008. En 2011 las parcelas que habían recibido enmiendas tenían un recubrimiento del 78-98%, lo que en todos los casos representa un aumento respecto a los valores encontrado entre 2006 y 2011 por esos Tabla IV.4. Resultados del ANOVA llevado a cabo con los datos de recubrimiento vegetal y concentraciones de elemento traza en plantas de Cynodon dactylon in 2011. Valores medios y error standard (ES). Tratamiento Recub. vegetal As Cd Cu Pb Zn %±ES mg kg - 1 ±ES NA(n=7) a 58±20 0,8±0,2 0,10±0,02ab 5,4±0,2 0,8±0,3 80±14ab SL2(n=6) 97±3 0,6±0,1 0,05±0,03a 4,9±0,1 0,5±0,2 49±4a SL4(n=6) 88±6 0,7±0,1 0,07±0,02ab 5,8±0,1 0,8±0,2 58±7ab BC2(n=4) 92±6 0,7±0,1 0,14±0,03ab 5,4±0,1 0,3±0,1 102±6b BC4(n=4) 98±2 0,5±0,2 0,10±0,03ab 6,3±0,2 0,3±0,1 90±17ab LESL2(n=7) 78±17 1,1±0,3 0,16±0,02b 5,8±0,3 1,7±0,6 78±5ab LESL4(n=3) 85± 8 0,7±0,4 0,10±0,02ab 4,6±0,4 1,0±0,6 64±6ab gl 20 36 36 36 36 36 p 0,159 0,477 0,011 0,313 0,162 0,012 dns dns dns dns Intervalos normalesb 0,01-1,5 0,05-0,9 4-20 0.2-20 1,4-160 p, probabilidad; gl, grados de libertad; dns, diferencias no significativas anúmero de plantas analizadas; bIntervalos normales en herbáceas (Bowen 1979). En cada columna los valores con distintas letras difieren significativamente (p<0,05) según el test de Tukey. IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 90 Fotografía IV.1. Aspecto de cuatro subparcelas perteneciente a los distintos tratamientos. mismos autores en 2006: 45% en SL2 y SL4, 37% y 32% en BC2 y BC4, y 21 y 23% en LESL2 y LESL4. En el caso de las parcelas enmendadas estos aumentos indican una mejora de la calidad del suelo producido por las enmiendas. En el caso de las parcelas no enmendadas (NA) el aumento refleja la recuperación natural de este suelo (Fotografía IV.1). Las concentraciones de As, Cd, Cu, Pb y Zn en Cynodon dactylon estuvieron dentro de los intervalos normales para herbáceas (Bowen, 1979), incluso en las parcelas que no recibieron enmiendas (NA) (Tabla IV.4). No se detectaron diferencias significativas entre los valores medios de As, Cu y Pb de los distintos tratamientos o por la aplicación de dos o cuatro dosis (DO2 y DO4). En los casos del Cd y Zn se encontraron diferencias significativas (p<0,05), que mostraron que los valores más bajos aparecían en el tratamiento SL2. Estudios previos en estas mismas parcelas mostraron que después de recibir dos dosis de enmiendas (DO2) se reducía la acumulación de elementos traza en la parte aérea de la vegetación (Burgos et al., 2008; Madejón et al., 2006b), poniendo de IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 91 manifiesto la necesidad de la recuperación natural asistida de este suelo. Las subsiguientes aplicaciones (DO4) siguieren generalmente la misma tendencia (Pérez de Mora et al., 2011). Los resultados del presente estudio ponen de manifiesto la durabilidad y sostenibilidad del método de recuperación empleado a medio plazo, así como de atenuación natural del suelo. La importación de elementos traza por las plantas de un mismo suelo en años sucesivos es cada vez menos eficiente, ya que la concentración disponible de dichos elementos decrece a medida que son importados y la lenta reposición de la fracción disponible a partir de otras fracciones menos disponibles (McGrath et al., 2002). Este hecho explica que las concentraciones de elementos traza disponibles decrece con el tiempo si el suelo no recibe ningún tipo de tratamiento o aporte de esos elementos. En el presente estudio, al cabo de 8 años, las concentraciones de elementos traza en la parte aérea de Cynodon dactylon son mucho más bajas que las encontradas en la misma parcela experimental por Pérez de Mora et al. (2011), o en otras áreas de suelos similares sometidos a recuperación (Madejón et al., 2002, 2006b). También se podría explicar de esta forma por qué al cabo de 8 años en las parcelas NA las concentraciones en la parte aérea de las plantas son similares a las de la parcelas enmendadas, cuando a los 6 años la vegetación en las parcelas NA aun presentaban concentraciones potencialmente tóxicas (Madejón et al., 2006a; Pérez de Mora et al., 2011). IV.1.8. Discusión general del experimento de campo IV.1.8.1. Correlaciones de Pearson entre las variable estudiadas Los resultados de la Tabla IV.5 muestran que las concentraciones medias de Cd, Cu y Zn extraídos con CaCl2 0,01M de los suelos a 0-15 cm, están correlacionadas negativamente con los valores medios de pH. Estos resultados están de acuerdo con lo expuesto en el apartado IV.1.2 (la aplicación de enmiendas aumentaba el pH de los suelos). Consecuentemente es de esperar que se produjera una disminución de la movilidad y disponibilidad de los elementos traza, que en efecto se observó según se describió en el apartado IV.1.5.3. IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 92 Tabla IV.5. Coeficientes de correlación de Pearson entre las distintas variable estudiadas en las capas de 0-15 cm de los suelos. **p<0,01; * p<0,05 (n=21) a) 0-15 cm pH COT COS CdCaCl 2 CuCaCl 2 ZnCaCl 2 N-Kjeld P-Olsen K-disp DHA BGA ASA APA UA Recub. vegetal pH 1 - - -0,917** -0,556** -0,897** - 0,555** - 0,909** 0,853** 0,844** - 0,858** 0,677** COT 1 - -0,439* - 0,556** 0,480* - - - - - COS 1 - - - - - - - - 0,423* - - - Cd-CaCl 2 1 0,592** 0,970** - - -0,492* -0,781** -0,766** -0,732** - -0,784** -0,700** Cu-CaCl 2 1 0,747** - - -0,634** - -0,479* - -0,577** -0,599** -0,875** Zn-CaCl 2 1 - -0,443* -0,545* -0,736** -0,758** -0,697** - -0,797** -0,813** N-Kjeld 1 0,640** - 0,469* - 0,554** 0,468* 0,452* P-Olsen 1 - - 0,600** - - 0,571** - K-disp 1 - - - 0,531* 0,620** DHA 1 0,828** 0,860** - 0,788** 0,567** BGA 1 0,847** - 0,884** 0,673** ASA 1 - 0,744** 0,580** APA 1 0,446* 0,623** UA 1 0,764** Recub. Vegetal 1 IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 93 La aplicación de enmiendas aumenta la concentración de COT de los suelos (apartado IV.1.3). La materia orgánica juega un papel crítico en el comportamiento de los elementos traza en el suelo, pudiendo disminuir o aumentar su movilidad y disponibilidad, dependiendo de la naturaleza de la misma y de la del elemento traza (Cabrera y Madejón, 2014). En el presente estudio, sólo el Cu extraíble en CaCl2 se correlaciona negativamente con el COT (Tabla IV.5) Respecto a los nutrientes, se observa que tanto el N-Kjeldhal, como el K disponible, se correlacionan positivamente con el COT, o sea, con los aportes orgánicos (Tabla IV.5). No así el P-Olsen que se correlaciona positivamente con el pH (Tabla IV.5), ya que el P disponible aumenta al hacerlo el pH. Lo que concuerda con lo puesto de manifiesto en el apartado IV.1.4: la enmienda que más aumentaba el P-Olsen era la SL, que era la que producía mayor aumento del pH del suelo. La actividad DHA se correlaciona positivamente con el pH del suelo, con las otras actividades estudiadas (excepto con la APA) y con el recubrimiento vegetal, y negativamente con las concentraciones de elementos traza extraíbles con CaCl2 0,01 M (Tabla IV.5). Otros autores corroboraron el aumento de DHA provocado por el aumento del pH y el descenso en la solubilidad de elementos traza (Jiang et al., 2003; Pérez de Mora et al., 2006a). La actividad BGA también se correlaciona positivamente con el pH del suelo, con las demás actividades estudiadas a excepción de la APA y con el recubrimiento vegetal, y negativamente con las concentraciones de elementos traza disponibles (Tabla IV.5). La bibliografía muestra diferentes resultados al respecto, mientras Kuperman y Carreiro (1997) encontraron que esta actividad se redujo notablemente a altas concentraciones de metales pesados, Aoyama et al. (1993) observaron que esta actividad se veía poco afectada por altas concentraciones de Cu y Zn. En el presente estudio, parece que el aumento del pH en el suelo, debido a la aplicación de las enmiendas, con la consecuente reducción de la disponibilidad de metales, es la causa principal del aumento de los niveles de la BGA en el suelo. La ASA se correlaciona positivamente con el pH, con el COS, con las demás actividades enzimáticas (excepto con la APA) y con el recubrimiento vegetal, y negativamente con las concentraciones de Cd y Zn solubles (Tabla IV.5). Según Dick (1997), esta actividad es la más sensible a la contaminación con elementos traza. También Pérez de Mora et al. (2005) encontraron correlaciones similares entre esta actividad y la disponibilidad de metales. IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 100 que tiene pH ácido y altas concentraciones de elementos traza disponibles y consecuentemente baja fertilidad bioquímica. En contraste, los suelos enmendados con SL que al final del experimento tenían los pH más altos, las concentraciones más bajas de elementos disponibles y los más altos valores de las actividades enzimáticas, son los que tienen valores más altos de PC1. El resto de los tratamientos ocupan posiciones intermedias. Por consiguiente, los valores de PC1 indican el grado de recuperación de los suelos debido a la aplicación de las distintas enmiendas, que es el siguiente: NA<LESL2<LESL4≤BC2<BC4<SL4<SL2 (Figura IV.12). El segundo componente CP2, que explica el 16,1% de la varianza, está correlacionado negativamente con la concentración de la actividad enzimática APA y con las concentraciones de COT y N-Kj, y positivamente con las de COS. La distribución de los suelos respecto a este componente pone de manifiesto que los tratamientos en los que los suelos recibieron enmiendas orgánicas (BC2, BC4, LESL2 y Figura IV. 12. Distribución de los suelos (0-15 cm) de los distintos tratamientos respecto a los componentes principales CP1 y CP2. Los símbolos más grandes son los centroides de cada tratamiento (Valores medios de las coordenadas CP1 y CP2 de cada tratamiento). IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 101 LESL4) tienen los valores más altos, mientras que los que recibieron enmienda mineral (SL) o no recibieron enmienda (NA), tiene los valores más bajos (Figura IV.12). En la Figura IV.12 puede observarse que los suelos de los distintos tratamientos se encuentran agrupados en diferentes zonas. Generalmente, los suelos que recibieron dos o cuatro dosis (DO2 y DO4) de cada enmienda se encuentran en zonas solapadas. El solapamiento en cierto modo indica de una manera global que la aplicación de dos o cuatro dosis de enmienda conduce a resultados similares en cuanto a las propiedades del suelo. Los tratamientos dan lugar a una separación muy notable entre los suelos no enmendados y enmendados, debido fundamentalmente a los valores de CP1. Las dos zonas extremas corresponden a los suelos sin enmendar (NA) y a los enmendados con espuma de azucarera (SL2 y SL4), en los que, que como se ha puesto de manifiesto anteriormente, las principales diferencias entre ellos radican en los valores de pH y de las concentraciones de elementos trazas disponibles (Figuras IV.1 y IV.3). También se observa en esa figura que los tratamientos con enmiendas orgánicas (BC2, BC4, LESL2 y LESL4) ocupan zonas en que los valores de CP2 son generalmente positivos. IV.1.9. Conclusiones del experimento de campo Al cabo de ocho o seis años, la aplicación de dos dosis o cuatro dosis de enmiendas (espuma de azucarera, compost de biosólido y leonardita) para la recuperación de un suelo ácido contaminado con elementos traza dio lugar a aumentos del pH y disminución de la concentración de elementos traza móviles/disponibles, principal objetivo de dicha aplicación. A su vez, la enmienda de los suelos mejoró la fertilidad del suelo, observándose aumentos de la calidad química y bioquímica del mismo. El efecto de las enmiendas fue mucho mayor en la capa superficial (0-15 cm) que en la subsuperficial (15-30 cm) del suelo. Todo ello potenció la colonización de los suelos enmendados por especies espontáneas. Globalmente, la enmienda más efectiva fue la espuma de azucarera con la que se consiguió mayores aumento de pH, que es la variable mejor correlacionada prácticamente con todas las demás estudiadas (disminución de la movilidad/disponibilidad de los elementos traza y aumentos del P-Olsen y de la actividades deshidrogenasa, β-glucosidasa, arilsulfatasa y ureasa). En general la aplicación de dos o cuatro dosis se enmiendas produjo al cabo de los 8 o 6 años resultados muy similares, aunque ligeramente superiores en el segundo caso, para todas las variables estudiadas, lo que hace pensar que no hubiera sido necesaria la tercera y IV.1. Resultados y discusión del experimento de campo 102 cuarta aplicación de enmiendas. Estos resultados demuestran la posibilidad de la recuperación natural asistida (RNA) de este suelo. Aprovechado los resultados obtenidos anteriormente a los del presente trabajo, se ha estudiado la evolución de todas las variables durante un período de ocho años. En ese estudio se ha podido constatar que en general los valores de todas las variables se mantienen o disminuyen ligeramente después de la última aplicación de enmienda, lo que da una idea de la perdurabilidad de la recuperación mediante la aplicación de enmiendas, y en definitiva de la recuperación natural asistida el suelo. La evolución de los resultados obtenidos también ha mostrado que en ese período en el suelo sin tratar aumentó el pH y disminuyó la concentración de elementos traza móviles/disponibles, lo que es un signo de la recuperación natural (RN) de ese suelo. VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores al aire libre (condiciones de semicampo) VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 105 IV.2.1. Evolución del pH de los suelos Los valores medios de pH de los suelos neutros (NC y AZ) no mostraron apenas cambios ocasionados por la aplicación de enmiendas; sólo en el suelo NC en el tercer muestreo (mayo 2013) se observó un incremento significativo de pH debido al BC. En el suelo AZ se observaron aumentos de los valores de pH con el tiempo en todos los tratamientos, aunque no siempre significativos (Figura IV.13a). Estos resultados pueden explicarse por la naturaleza de ambos suelos y enmiendas (pH cercano a la neutralidad, Tabla III.1 y Tabla II.2). Sin embargo, los efectos debidos a las enmiendas fueron evidentes en el suelo ácido V, aunque sólo mostraron diferencias significativas en los dos últimos muestreos (mayo 2012 y 2013), debido a la adición extra de enmienda en marzo de 2012 (ver II.3.2). La evolución en el tiempo de este suelo ácido también mostró incrementos importantes en los tres tratamientos (V, V+AC, V+BC). Como ya se ha indicado, el pH es una de las propiedades del suelo que más influye para mantener su fertilidad (Brady y Weil, 2002). De hecho la adición de enmiendas orgánicas con pH neutros o alcalinos normalmente aumenta la alcalinidad del suelo, especialmente en suelos ácidos como se ha comprobado también en el experimento de campo con el mismo suelo en IV.2.2 (Madejón et al., 2010; Xiong et al, 2015) y en otros estudios (Pérez de Mora et al., 2006b). En los suelos sin enmienda las raíces de Paulownia fueron capaces de mantener el pH entorno a la neutralidad en los suelos NC y AZ y en caso del suelo ácido V incluso aumentaron dicho valor (Figura IV.13a). Este hecho puede estar relacionado con la acción de los exudados y metabolitos liberados por las raíces y por los metabolitos liberados por los microrganismos del suelo de la rizosfera (Marschner y Romheld, 1983; Leyval y Berthelin, 1993). Las raíces son capaces de alterar el pH del suelo por asimilación/producción de aniones/cationes, liberación de ácidos orgánicos y CO2, consumo de O2 y a través de reacciones redox (Nye, 1981; Jones et al., 2004). Pérez de Mora et al. (2006) observaron aumentos de pH similares en el mismo suelo ácido V usando Agrostis como cubierta vegetal tras 36 meses de experimentación. IV.2.2. Evolución de la conductividad eléctrica (CE) de los suelos Los valores de la conductividad eléctrica solo se presentan en el muestreo inicial y final (2011 y 2013) (Figura IV.13b). En los suelos neutros, NC y AZ, en primer año de estudio (2011), la aplicación de enmiendas causó un aumento de la salinidad del suelo, que en caso del compost de biosólidos (BC) fue significativo estadísticamente. En el VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 106 Tratamiento NC NC+AC NC+BC AZ AZ+AC AZ+CB V V+AC V+CB pH 1 2 3 4 5 6 7 Nov 11 Mayo 12 Mayo 13 aab bbb a a b b a b b ES Tratamiento NC NC+AC NC+BC AZ AZ+AC AZ+BC V V+AC V+BC CE (dS m -1 ) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Nov 11 May 13 aab baa b ES Tratamiento NC NC+AC NC+BC AZ AZ+AC AZ+BC V V+AC V+BC COT (%) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Nov 11 May 13 aab b a a ab b ab b ES Figura IV.13. Evolución del a) pH, b) conductividad eléctrica (CE) y c) carbono orgánico total (COT) de los suelos (Valores medios ± ES, n=3). En cada suelo y muestreo, las diferencias significativas debidas a las enmiendas están marcadas con distintas letras (Test de Tukey p<0,05). a b c VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 107 suelo ácido V no se observaron diferencias debidas a las enmiendas, pero sí un descenso importante de la CE en el tiempo, relacionado con el aumento de pH que experimentaron estos suelos. Según algunos autores cuando se añaden enmiendas orgánicas de forma sucesiva a los suelos, se corre el riesgo de aumentar la salinidad de los suelos (Climent et al., 1994). Sin embargo, otros autores (Bevacqua y Mellano, 1994; Madejón et al., 2001) no encontraron aumentos en la salinidad del suelo cuando la dosis de aplicación de residuos orgánicos o compost no superaban las dosis de 50-100 Mg ha-1 debido al efecto de dilución y a los procesos de lavado de sales. IV.2.3. Evolución del carbono orgánico total (COT) de los suelos Al igual que para la CE, las concentraciones de COT sólo se muestran al principio y final del experimento (Figura IV.13c). La adición de ambas enmiendas supuso un aumento de COT en todos los suelos estudiados. El aumento de COT (excepto en el suelo neutro contaminado AZ) se potenció con el tiempo. Estos aumentos en el contenido de C son debidos tanto a la adición de la enmienda, como al aporte realizado por la planta. En el caso del suelo V hay que tener en cuenta que el fuerte aumento de COT se debe en parte a la adición extra de enmienda realizada en marzo de 2012. Las diferencias de C entre el primer y último muestreo en los suelos sin enmienda permiten calcular el aporte realizado por la planta. Así, en estos suelos sin enmienda los contenidos de COT aumentaron entre noviembre 2011 y mayo 2013, en NC de 0,49 a 0,85 % (Δ 0,45%) y en V de 0,63 a 1,06 % (Δ 0,43%). Estos resultados muestran que el crecimiento de Paulownia contribuyó al incremento de materia orgánica en los suelos NC y V sin enmendar. En el suelo AZ, que es el que mayor COT inicial presentaba, no se observó aumento atribuible a la planta. Como ya se ha indicado, la materia orgánica es fundamental para mantener la calidad de un suelo y para regular sus diversas funciones. Además, la aplicación de enmiendas puede mejorar y acelerar la recuperación de un suelo contaminado (Terry, 1998; Brown, 1997; Kumpiene, 2010). Por tanto, aumentar el contenido de materia orgánica del suelo es uno de los principales objetivos cuando se aplican enmiendas orgánicas a suelos contaminados o degradados, como los del presente estudio, cuyos valores medios de COT en los suelos antes de las enmiendas fueron muy bajos para NC y bajos para V (Figura IV.13c) (Hazelton and Murphy, 2007). Por tanto los incrementos de COT fueron fundamentales en el suelo NC y V, pobres en materia orgánica. VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 108 IV.2.4. Evolución del Nitrógeno Kjeldhal (N-Kj), Fósforo Olsen (P-Olsen) y Potasio disponible K-disp) de los suelos Las concentraciones de N-Kj en los suelos sin enmendar fueron muy bajas en el suelo NC, bajas en V y normales en AZ (Figura IV.14a) (Hazelton and Murphy, 2007). Como las plantaciones de Paulownia tienen altos requerimientos nutricionales (Zhu, 1991), la adición de enmiendas es fundamental para un adecuado desarrollo de este cultivo, y más teniendo en cuenta la baja fertilidad de estos suelos. La aplicación de ambas enmiendas supuso un aumento en las concentraciones de N-Kj en los tres suelos aunque estos incrementos no siempre fueron significativos (Figura IV.14a). En los suelos NC y V con o sin enmienda las concentraciones de N-Kj tendieron a aumentar durante el periodo experimental, mientras que en el suelo AZ las concentraciones permanecieron prácticamente constantes durante el periodo estudiado. En los suelos sin enmendar se observó que las concentraciones de N-Kj tendían a aumentar durante el período experimental, lo que pone de manifiesto el efecto del crecimiento de la Paulownia que causa un aumento del N del suelo a pesar de los altos requerimientos de este elemento que tiene esta planta (Zhu, 1991). Las concentraciones de N-Kj aumentaron durante el período experimental en los suelos NC y V enmendados tanto con AC, como con BC; en el caso del suelo V los aumentos están relacionados con los aportes extra de enmiendas realizados en marzo de 2012. El efecto de ambas enmiendas sobre la disponibilidad de P fue evidente, especialmente con el BC, debido al alto contenido de P-disponible en esta enmienda (Tabla III.2), mostrando diferencias significativas con el suelo no enmendado en la mayoría de los casos (Figura IV.14b). En los suelos sin enmendar y en los suelos NC y AZ enmendados con AC, las concentraciones de P-disponible disminuyeron a lo largo del experimento, probablemente debido a los requerimientos nutricionales de la planta. Sin embargo la aplicación de BC mantuvo constante los contenidos de P-disponible hasta el segundo muestreo, e incluso dio lugar a un incremento importante en el último muestreo, en las que las concentraciones de P-disponible superaron los 50 mg kg-1 (Figura IV.14b). De nuevo, hay que poner de manifiesto que el comportamiento del suelo V es distinto al de los otros dos, especialmente con la enmienda AC, debido al aporte extra comentado anteriormente. En general, los resultados parecen indicar que los valores más altos de disponibilidad del P al final del experimento están relacionados con la menor demanda de P de la planta en ese momento. VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 109 Tratamiento NC NC+AC NC+BC AZ AZ+AC AZ+BC V V+AC V+BC N-Kj (%) 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 Nov 11 Mayo 12 Mayo 13 a b b a bab a ab b a ab b a b ab ES a Tratamiento NC NC+AC NC+BC AZ AZ+AC AZ+BC V V+AC V+BC P-Olsen (m kg -1 ) 10 20 30 40 50 60 70 Nov 11 Mayo 12 Mayo 13 a b b a ab b a a b a bb a b c a b c a bab a b ab a b b ES b Tratamiento NC NC+AC NC+BC AZ AZ+AC AZ+BC V V+AC V+BC K-disp. (m kg -1 ) 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 Nov 11 Mayo 12 Mayo 13 a b a a b a a b a a b a a a aaaa bb b SE c Figura IV.14. Evolución de los valores de a) N-Kjeldahl (N-Kj), b) P-Olsen y c) Kdisponible (K-disp.) de los suelos (Valores medios ± ES, n=3). En cada suelo y muestreo, las diferencias significativas debidas a las enmiendas están marcadas con distintas letras (Test de Tukey p<0,05). VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 116 Tabla IV.8. Valores medios (±ES, n=3) de las actividades de las enzimáticas de los suelos. Tratamiento Muestreo Deshidrigenasa, DHA (µg INTF g-1dwh -1) Β-glucosidasa, BGA (µg PNF g-1dw h-1) Aryl-sulfatasa, ASA (µg PNF g-1dw h-1) Fosfatasa Ácida, APA (µg PNF g-1dw h-1) Ureasa, UA (µg N-NH 4 + g-1dw h-1) NC Nov 2011 0,39 ± 0,09* 71,4 ± 23,6 13,2 ± 1,11 311 ± 40,9 8,90 ± 2,28 NC+AC 0,68 ± 0,19 105 ± 13,3 11,1 ± 2,36* 403 ± 28,9 6,48 ± 1,71 NC+BC 0,98 ± 0,32 99,8 ± 18,4 13,01 ± 2,79 499 ± 76,7 27,9 ± 18,7 NC Mayo 2012 2,14 ± 0,06 72,5 ± 25,7 10,2 ± 4,18 149 ± 20,2 21,6 ± 1,08 NC+AC 3,37 ± 0,81 80,0 ± 12,8 12,7 ± 3,18 213 ± 107 21,07 ± 1,06 NC+BC 2,89 ± 0,43 79,6 ± 3,65 9,09 ± 1,59 347 ± 162 22,1 ± 2,70 NC Mayo 2013 1,68 ± 0,35* 102 ± 12,4 19,8 ± 7,37 627 ± 48,5 13,96 ± 2,66 NC+AC 1,14 ± 0,26 132 ± 10,7 22,4 ± 1,87* 608 ± 112 26,6 ± 9,43 NC+BC 1,63 ± 0,14 126 ± 23,3 21,2 ± 5,53 657 ± 61,7 20,4 ± 1,71 AZ Nov 2011 1,19 ± 0,13 337 ± 10,5 52,9 ± 3,03 1979 ± 130 21,0 ± 4,77 AZ+AC 1,20 ± 0,14 339 ± 27,8 39,3 ± 5,50 1652 ± 122 21,0 ± 1,28 AZ+BC 1,39 ± 0,12* 300 ± 33,4 55,5 ± 6,71 1933 ± 98,7* 28,5 ± 10,7 AZ Mayo 2012 3,83 ± 0,33 a 283 ± 34,5 31,1 ± 2,55 691 ± 18,9 a 31,1 ± 1,90 AZ+AC 4,73 ± 0,30 ab 185 ± 5,28 34,5 ± 4,83 900 ± 48,7 b 24,61 ± 2,54 AZ+BC 5,31 ± 0,30 b 273 ± 38,0 41,9 ± 1,50 859 ± 22,2 b 33,5 ± 1,85 AZ Mayo 2013 2,29 ± 0,48 297 ± 39,6 55,0 ± 19,1 1194 ± 102 44,2 ± 21,0 AZ+AC 2,36 ± 0,58 255 ± 44,7 44,0 ± 4,64 1044 ± 103 33 ± 2,91 AZ+BC 2,49 ± 0,25* 389 ± 19,2 78,9 ± 9,06 1313 ± 20,9* 41,4 ± 3,55 V Nov 2011 0,37 ± 0,17 34,5 ± 10,1 8,77 ± 0,85 502 ± 156 2,91 ± 2,91 V+AC 0,14 ± 0,09 15,6 ± 15,6 8,86 ± 2,02 465 ± 132 0 V+BC 0,10 ± 0,04* 8,60 ± 4,38 14,2 ± 2,61 723 ± 140 8,71 ± 5,07 V Mayo 2012 0,15 ± 011 a 14,9 ± 8,35 0,92 ± 0,80 a 1037 ± 260 6,52 ± 6,52 V+AC 2,62 ± 0,33 b 14,4 ± 3,44 6,02 ± 0,65 b 1098 ± 83,3 9,26 ± 0,74 V+BC 2,42 ± 0,85 b 12,6 ± 3,32 3,30 ± 0,42 ab 1169 ± 83,3 8,82 ± 2,70 V Mayo 2013 1,57 ± 0,63 43,9 ± 19,1 5,33 ± 2,28 641 ± 69,4 6,45 ± 0,96 V+AC 2,49 ± 0,61 66,1 ± 11,9 12,1 ± 2,33 946 ± 184 24,9 ± 4,44 V+BC 1,90 ± 0,39* 49,5 ± 21,6 22,3 ± 3,67 722 ± 34,1 13,5 ± 1,91 En cada suelo y muestreo, las diferencias significativas debidas a las enmiendas están marcadas con distintas letras (test de Tukey p<0,05). En cada suelo * indica diferencias significativas (p<0,05) entre resultados en cada tratamiento del primer y último muestreo. VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 117 En el suelo contaminado ácido (V), la aplicación de enmienda no tiene una influencia clara sobre los valores medios de las actividades enzimáticas estudiadas: unas veces aumentan y otras disminuyen, aunque en ningún caso las diferencias fueron significativas. En el primer muestreo se obtuvieron resultados un tanto anómalos y la presencia de las enmiendas no causó ningún efecto positivo destacable en el estatus bioquímico del suelo. En cada tratamiento los valores finales fueron generalmente más altos que en el primer muestreo, pero sólo significativamente en el tratamiento V+BC. Si se comparan los valores de las actividades enzimáticas de los tres suelos, se observa que en general los valores más altos siguen la tendencia: AZ>NC>V, relacionada con la fertilidad original de estos suelos. Como en el caso del experimento de campo (apartado IV.1.8.2) se han construido las figuras poligonales resultantes de los diagramas de Rayos de Sol y calculado sus áreas superficiales, obtenidas con los valores medios estandarizados de las actividades enzimáticas analizadas, que son características de cada suelo y de cada tratamiento. El área superficial de cada polígono es una medida relacionada con la fertilidad bioquímica del suelo. En cada suelo la variación de los valores de dichas actividades debidas al tiempo y a la aplicación de enmiendas puede evaluarse mediante el área superficial relativa (RSA) respecto a los tratamientos sin enmiendas. En la Figura IV.18, IV.19 y IV.20 se observa que los valores de RSA en los tres suelos aumentan generalmente con la aplicación de enmiendas. Asimismo, en cada suelo se observan aumentos con el tiempo de los valores de RSA de cada tratamiento, obteniéndose los valores más altos en el último muestreo (mayo 2013). Es interesante observar que en los tres suelos los valores de RSA en todos los tratamientos aumentan desde el primer muestreo al último. En el caso de los tratamientos sin aplicación de enmienda (NC, AZ y V) este aumento está relacionado con la influencia positiva de la planta sobre la fertilidad bioquímica de los suelos, debido a la excreción por las raíces de una serie de sustancias (v.gr.: ácidos acético, oxálico, fumárico, cítrico, tartárico, polisacáridos, etc.) que aumentan la actividad microbiológica en la rizosfera. Las raíces constituyen no sólo un refugio para los microorganismos, sino también una fuente de C lábil, mediante la liberación de compuestos orgánicos en los exudados radiculares (Martin y Merckx, 1992). VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 118 Figura IV. 18. Diagramas de Rayos de Sol construidos con los valores medios estandarizados de las actividades enzimáticas: DHA, BGA, APA, ASA y UA del suelo NC. RSA, son los valores de las áreas superficiales relativas. VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 119 Figura IV. 19. Diagramas de Rayos de Sol construidos con los valores medios estandarizados de las actividades enzimáticas: DHA, BGA, APA, ASA y UA del suelo AZ. RSA, son los valoras de las áreas superficiales relativas. VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 120 Figura IV. 20. Diagramas de Rayos de Sol construidos con los valores medios estandarizados de las actividades enzimáticas: DHA, BGA, APA, ASA y UA del suelo V. RSA, son los valoras de las áreas superficiales relativas. VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 121 En esas mismas figuras puede observarse que la fertilidad en los suelos de partida sin enmiendas es mayor en el suelo contaminado neutro AZ: 7 veces mayor que el neutro no contaminado NC y 8 veces superior que el suelo ácido contaminado V. Al final del experimento la situación es ligeramente distinta con valores de AZ 3 y 6 veces superiores que los correspondientes a NC y V respectivamente. Los valores más altos de fertilidad bioquímica del suelo AZ se deben probablemente a sus mejores características físico-químicas (pH neutro, baja salinidad, relativamente altos niveles de fertilidad y baja disponibilidad de contaminantes). Ciadamidaro et al. (2014b) encontraron resultados similares en suelos bajo cultivo de álamo, poniéndose de manifiesto el mejor estado bioquímico en suelos contaminados y neutros que presentaban baja biodisponibilidad de elementos traza. Probablemente en este suelo las poblaciones microbianas se ven poco afectadas por las cantidades de metales pseudo-totales. IV.2.7. Efectos de las enmiendas sobre la planta de Paulownia IV.2.7.1. Efectos sobre el crecimiento vegetal El crecimiento de Paulownia se ha medido mensualmente teniendo en cuenta altura y diámetro en cada uno de los dos ciclos de crecimiento estudiados (el segundo después del corte de marzo 2013). Las Figuras IV.21 y IV.22 muestran la evolución de las alturas de la plantas de Paulownia en cada suelo y tratamiento durante los dos ciclos. En todos los casos se observa que las alturas de las plantas aumentan paulatinamente de mayo a agosto y durante los tres siguientes meses el crecimiento se estanca. Cuando se estudia la evolución de las alturas en conjunto durante el primer ciclo (2012, Figura IV.23) se observan valores medios más altos en el suelo no contaminado enmendado con AC. Durante el mes de mayo (2 meses después de ser plantada) no se apreciaron diferencias significativas de altura en ninguno de los tratamientos, no superando la altura los 26 cm. En junio se observaron diferencias significativas de altura en función del suelo y del tratamiento; el valor máximo fue de unos 50 cm en suelo NC+AC. En general los valores del suelo AZ fueron algo más bajos que en el NC aunque las diferencias no fueron significativas. Los valores en el suelo V (suelo contaminado y ácido) fueron mucho más bajos que en los otros dos a pesar de los aumentos observados con las enmiendas (Fotografía IV.2). Esta misma pauta es la que se observa durante los meses siguientes. En septiembre todas las plantas de todos los suelos experimentaron un notable aumento de altura que se mantuvo hasta noviembre (Figura IV.21) VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 122 Figura IV.21. Evolución de los valores medios (±DS) de las alturas de las plantas de Paulownia en cada suelo en 2012. En cada suelo y tratamiento, las diferencias significativas debidas a la evolución con el tiempo están marcadas con distintas letras (Test de Tukey p<0,05). NC NC+AC NC+BC altura (cm) 0 50 100 150 200 250 a ab ab b bc c bc a b c d d d d a ab b bc c c c AZ AZ+AC AZ+BC altura (cm) 0 50 100 150 200 250 a b c d eee a b b c dd d a b b bc c c c V V+AC V+BC altura (cm) 0 50 100 150 200 250 a a ab b b b b a a ab b c c c a ab ab b c c c Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre DS VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 123 Figura IV.22. Evolución de los valores medios (±DS) de las alturas de las plantas de Paulownia en cada suelo en 2013. En cada suelo y tratamiento, las diferencias significativas debidas a la evolución con el tiempo están marcadas con distintas letras (Test de Tukey p<0,05). NC NC+AC NC+BC altura (cm) 0 50 100 150 200 250 a b b b b b b a b b b bbb a b bc bc bc bc bc AZ AZ+AC AZ+BC altura (cm) 0 50 100 150 200 250 300 a bb b bc cbc a bbc c ccc a b b b bbb V V+AC V+BC altura (cm) 0 50 100 150 200 250 a b bc c c c c a b b c ccc a b bc c c c c Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre DS VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 124 Fotografía IV.2. Plantas de Paulownia seis meses después de la plantación. Figura IV.23. Evolución de los valores medios (±DS) y comparación de las alturas y diámetro de tronco de las plantas de Paulownia en los tres suelos en los tres tratamientos en 2012. En los valores de cada mes, las diferencias significativas debidas a los suelos y tratamientos están marcadas con distintas letras (Test de Tukey p<0,05). VI. 2. Resultados y discusión del experimento en contenedores 125 Figura IV.24. Evolución de los valores medios (±DS) y comparación de las alturas y diámetro de tronco de las plantas de Paulownia en los tres suelos en los tres tratamientos en 2013. En los valores de cada mes, las diferencias significativas debidas a los suelos y tratamientos están marcadas con distintas letras (Test de Tukey p<0,05).