Vacunas de bacterias recombinantes vivas

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO “VACUNAS DE BACTERIAS RECOMBINANTES VIVAS” MARINA BLANCO LEÓN 1 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO GRADO EN FARMACIA “VACUNAS DE BACTERIAS RECOMBINANTES VIVAS” MARINA BLANCO LEÓN SEVILLA, 5 DE JULIO DEL 2016 DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA TUTOR: IGNACIO RODRÍGUEZ LLORENTE TRABAJO DE REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2 3 1. RESUMEN: La vacunación es uno de los logros más importantes en la historia de la medicina, que ha ido evolucionando a lo largo de los años permitiendo una reducción significativa de la mortalidad infantil, una disminución de la incidencia de enfermedades e incluso la erradicación de algunas de ellas en países enteros. Las vacunas de nueva generación surgen para reducir o eliminar las carencias de las vacunas “tradicionales”. Técnicas biotecnológicas basadas en el ADN recombinante han dado lugar, entre otras, a las vacunas de bacterias recombinantes vivas. Estas vacunas pueden ser de dos tipos: las bacterias modificadas genéticamente, que proporcionaran inmunidad contra la enfermedad que causan o, bacterias ya sean patógenas o no, que portan ADN heterólogo para la producción de un antígeno contra el que queremos inmunizar. Esta fusión entre la tecnología de ADN recombinante y el uso de vectores bacterianos ofrece múltiples ventajas tanto desde el punto de vista logístico y comercial como inmunológico. En el presente trabajo se ha realizado una recopilación de los principales vectores bacterianos usados hasta la fecha, además de una selección de los artículos de investigación sobre este tipo de vacunas, en base a las enfermedades consideradas de mayor relevancia. Palabras clave: Vector, bacteria recombinante viva, vacuna. 4 5 ÍNDICE 1. RESUMEN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2. INTRODUCCIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2.1. PRINCIPIOS DE LA VACUNACIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2.2. TIPOS DE VACUNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2.2.1. VACUNAS CLÁSICAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9 2.2.1.1. VACUNAS ATENUADAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9 2.2.1.2. VACUNAS INACTIVADAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.2.1.3. VACUNAS SUBNIDAD. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.2.2. VACUNAS DE NUEVA GENERACIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 2.2.2.1. NECESIDAD DE GENERAR NUEVAS VACUNAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 2.2.2.2. VACUNAS ATENUADAS MEDIANTE MODIFICACIÓN GENÉTICA . . . .11 2.2.2.3. VACUNAS ANTI-IDIOTIPO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11 2.2.2.4. VACUNAS SINTÉTICAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11 2.2.2.5. VACUNAS DE PROTEÍNAS Y PÉPTIDOS RECOMBINANTES. . . . . . . . . 11 2.2.2.6. VACUNAS COMESTIBLES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 2.2.2.7. VACUNAS GÉNICAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.2.2.8. VENTAJAS FRENTE A LAS VACUNAS TRADICIONALES. . . . . . . . . . . . 14 3. OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 4. METODOLOGÍA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14 5. RESULTADOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14 5.1. PRINCIPALES VECTORES BACTERIANOS USADOS EN VACUNAS RECOMBINANTES. . . 14 5.1.1. BACTERIAS PATÓGENAS ATENUADAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14 5.1.1.1. Salmonella. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 5.1.1.2. Listeria monocytogenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 5.1.1.3. Bacilo Calmette-Guerin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17 6 5.1.1.4. Shigella . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 5.1.1.5. Vibrio cholerae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 5.1.1.6. Yersinia enterocolitica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19 5.1.1.7. Bacillus anthracis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 5.1.2. BACTERIAS COMENSALES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 5.1.2.1. BACTERIAS DE ÁCIDO LÁCTICO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 5.1.2.2. Streptococcus gordonii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 5.2. ESTUDIOS DE VACUNAS CON BACTERIAS RECOMBINANTES VIVAS. . . . . . . . . . . . . . .23 5.2.1. CÁNCER. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23 5.2.2. VIH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24 5.2.3. LEISHMANIOSIS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 5.2.4. VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26 5.2.5. NEUMONÍA BACTERIANA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 5.2.6. DIABETES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 6. CONCLUSIONES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29 7. BIBLIOGRAFÍA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 7 2. INTRODUCCIÓN Para hablar de vacunación tenemos que remontarnos a 1796, cuando Edward Jenner inoculó a un niño de 8 años el virus de la viruela procedente de una lechera contagiada por la viruela bovina. Aunque al principio parecía que el niño empeoraba, al cabo de 9 días se recupero totalmente, e incluso Jenner, para cerciorarse de que estaba inmunizado, volvió a inocularle el virus y no se produjo ningún tipo de reacción (The college of physicians, 2016). Pero no fue hasta más de 80 años después, cuando Louis Pasteur (Figura 1) descubrió el método de atenuación de las cepas bacterianas, en concreto, de cepas del cólera aviar, produciendo así la primera vacuna de laboratorio. También se le atribuye la primera vacuna contra la rabia (The college of physicians, 2016). Figura 1. El químico y bacteriólogo francés Louis Pasteur (Morán, 2014). El médico español Jaime Ferrán creó en 1885 la primera vacuna en inmunizar a humanos frente a una enfermedad bacteriana, el cólera, producida por Vibrio cholerae; dicha vacuna fue preparada cultivando bacterias tomadas de heces de personas enfermas con cólera. Durante toda su carrera también desarrollo vacunas contra el tétanos, tuberculosis o tifus, entre otras (The college of physicians, 2016). 2.1 PRINCIPIOS DE LA VACUNACIÓN El sistema inmunitario es el encargado de proteger al organismo de la agresión de los microorganismos patógenos, mediante una diversidad de sistemas que se encuentran interrelacionados entre sí y que representan las diferentes barreras frente a la infección (Genoma España, 2004). 8 Dentro de este sistema inmune encontramos dos tipos de inmunidad: INMUNIDAD INNATA: Es aquella que no necesita contacto previo con el antígeno para ser desarrollada, se trata de una respuesta primaria. INMUNIDAD ADQUIRIDA: Se trata de una inmunidad con memoria, es decir, necesita un contacto previo con el antígeno para poder activarse. Se trata de una respuesta secundaria y es la que nos interesa en el caso de la vacunación (Genoma España, 2004). La inmunización puede realizarse de manera ACTIVA o PASIVA, dependiendo de si nuestro sistema inmune ha necesitado activarse o se trata de una transferencia directa de anticuerpos (ej.: la transferencia de inmunidad a través de la leche materna) (Genoma España, 2004). Figura 2. Esquema de la inmunidad (IES, 2016). La vacunación es el proceso que permite generar una resistencia a una enfermedad infecciosa y consiste en imitar una infección por medio del agente patógeno contra el cual se desea proteger. Para ello, se inocula al hospedador gérmenes atenuados, inactivados o fracciones de estos que simulan el proceso del primer contacto. A partir de ese momento el sujeto quedaría sensibilizado adquiriendo una memoria inmune, por lo tanto, en caso de nuevo contacto con el patógeno se produciría una respuesta de tipo secundario, evitando así todo el proceso de la puesta en marcha de la respuesta adquirida, ya que tenemos los anticuerpos creados (OMS, 2016; Genoma España, 2004). 15 5.1.1. BACTERIAS PATÓGENAS ATENUADAS 5.1.1.1. Salmonella Es un grupo amplio de microorganismos de tipo gram negativo, pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos móviles, intracelulares facultativos restringidos al compartimento endosomal de las células eucariotas, resistentes a los mecanismos de eliminación no específicos y capaces de producir gastroenteritis en humanos y animales (Medina y Guzmán, 2001). En una infección por Salmonellla, que típicamente es contraída al comer o beber alimentos contaminados, el microorganismo sobrevive a los pHs ácidos del estómago consiguiendo llegar con facilidad al intestino, que es donde se produce su absorción y, por lo tanto, el daño. Una vez atravesado el epitelio intestinal, Salmonella ha desarrollado dos formas de protegerse frente a los macrófagos: la primera es que consigue sobrevivir dentro de la vacuola fagocítica y la segunda es que induce la apoptosis del macrófago; todo esto consigue una inflamación local y una aumentada respuesta inmune. La característica más importante de Salmonella es la capacidad de inducir una respuesta de células CD8+ del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) con un antígeno específico (Figueroa y Verdugo, 2005). Figura 3. El microorganismo Salmonella typhimurium (rosa) en un intestino de ratón infectado (PHYS ORG, 2013). 16 Los serotipos más estudiados de Salmonella son: Salmonella typhimurium (Figura 3) y Salmonella typhi, y algunas de las mutaciones realizadas para su atenuación son por ejemplo afectar al sistema regulatorio phoP/phoQ, que es necesario para la supervivencia de S.typhimurium ya que contiene genes de regulación de péptidos antimicrobianos, eliminación de nutrientes o de modificación del lipopolisacárido (Shahabi y cols, 2010). Otros ejemplos son la mutación de los genes implicados en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos o purinas, en la adenilato ciclasa, en el receptor proteico del AMPc o remover la adenilato metilasa del ADN (Medina y Guzman, 2001). 5.1.1.2. Listeria monocytogenes Se trata de un patógeno intracelular, cocobacilo gram positivo, anaerobio facultativo, móvil, no esporulado con una amplia distribución en la naturaleza (Torres y cols, 2005). Su vía de infección natural es la oral y la translocación se produce a través del epitelio intestinal antes de la diseminación sistémica. La bacteria entra en las células a través de las internalinas, que son unas moléculas de superficie que facilitan la entrada en las células no fagocíticas como las epiteliales y los hepatocitos (Bruhn y cols, 2007). L.monocytogenes produce una fuerte respuesta inmune tanto innata como adaptativa (Guillén y cols, 2009) y ha sido considerada como el prototipo para inducir una respuesta de clase 1 por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Estimula el sistema inmune tanto para sus proteínas como para antígenos coexpresados, hecho facilitado gracias a su capacidad para romper el citoplasma de las células infectadas (Medina y Guzmán, 2001). Esta capacidad es debida a la listeriolisina O (LLO) codificada por el gen hyl, uno de los mejor caracterizados de su virulencia. Otro de los genes que ayuda a la diseminación de Listeria en el organismo es el actA, que codifica la proteína nucleasa actina A. Existen múltiples estrategias basadas en la mutación de estos genes para construir vectores de Listeria que expresen de forma estable antígenos recombinantes (Shahabi y cols, 2010; Portnoy y cols, 1992). Ha sido ampliamente estudiado contra infecciones virales (Virus del papiloma humano) y en supresión de tumores (Guillén y cols, 2009). 17 5.1.1.3. Bacilo Calmette-Guerín Se trata de un bacilo gran positivo perteneciente a la familia Mycobacteriaceae (Figura 4), acido-alcohol resistente, aerobios estrictos, inmóviles, no formadores de esporas ni cápsulas y de crecimiento lento (Instituto nacional, 2012). Figura 4. Bacillo Calmette-Guerin en el interior de un macrófago (Max-planckgesellschaft, 2013) El principal papel de este microorganismo es como vector para la vacuna contra la tuberculosis, en la que los científicos Albert Calmette y Camille Guérin tardaron más de 13 años de investigación, llamando finalmente a la cepa atenuada bacilo CalmetteGuérin (BCG). Las principales razones por las que esta cepa es un buen vector bacteriano son: 1.- Es la vacuna más usada en el mundo, desde 1948 unos 2.500 millones de personas la han tomado con una tasa baja de incidencias graves. 2.- Se puede administrar en cualquier momento después del nacimiento y no está afectada por los anticuerpos maternos. 3.- Únicamente se requiere una toma y esta puede llegar a proteger entre 5-10 años. 4.- Es la más estable al calor de las vacunas vivas. 5.- Gran capacidad para albergar grandes fragmentos de ADN extraño. 6.- Produce una fuerte respuesta inmune celular y humoral (Shata y cols, 2000). Están siendo estudiadas vacunas con este microorganismo contra el VIH, la enfermedad de Lyme y la malaria, entre otras. Actualmente se encuentran todas en 18 fase de ensayo clínico pero la tecnología para realizarlas se encuentra recientemente disponible (Matsuo y Yasutomi, 2011). 5.1.1.4. Shigella Shigella es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, integrado por bacterias de forma bacilar, no esporuladas, inmóviles, pero con movimiento pendular (oscilación) in situ. Son gram negativos, aerobios-anaerobios facultativos, citocromo-oxidasa negativos y no crecen en el medio cianuro potásico (USAL, 2016). Aunque ha recibido poca atención como vector en vacunas, el reciente desarrollo de la genética recombinante ha hecho que se vuelva a considerar. Las principales características que lo hacen posible son: su facilidad para escapar del endosoma, entrando directamente en las células hospedadoras y que se tejido diana es la mucosa del colon, lo que produce una fuerte respuesta inmune tanto sistémica como de la propia mucosa (Shata y cols, 2000). La cepa estudiada y disponible actualmente para vacunas en roedores, primates y humanos es Shigella flexneri, en la que múltiples estudios afirman que es capaz de portar ADN eucariotico (Shata y cols, 2000). Algunas de las atenuaciones realizadas en esta cepa son, por ejemplo, mutaciones que alteran la producción citosólica (Hantman y cols, 1999), la capacidad de propagarse de una celula a otra o la capacidad de producir enterotoxinas (Kotton y Hohmann, 2004). 5.1.1.5. Vibrio cholerae Vibrio cholerae (Figura 5) es el agente causal del cólera, forma parte de la familia Vibrionaceae, es un bacilo gran negativo aerobio facultativo. Su estructura antigénica consiste en antígeno flagelar H y un antígeno somático O. Este último, permite la diferenciación entre cepas patógenas y no patógenas (Ulloa, 2016). A diferencia de muchos patógenos entéricos, V.cholerae no invade la mucosa sino que coloniza la superficie del intestino delgado donde secreta la toxina del cólera, que es la causante de la diarrea acuosa, este hecho puede considerarse como una debilidad porque disminuye la interacción con los compartimentos inmunes más profundos, o como una ventaja puesto que así se disminuye su patogenicidad. Por ello 19 V.cholerae puede ser el más adecuado para la presentación de antígenos relevantes para los organismos luminales, en lugar de infecciones que invaden vía sistémica y / o requieren una fuerte respuesta inmune para la presentación del antígeno (Kotton y Hohmann, 2004). Figura 5. Bacteria Vibrio cholerae en una superficie de quinina (École, 2015). Se han producido numerosas cepas de V.cholerae con técnicas de ADN recombinante, un ejemplo es la cepa CVD 103-hgR que no expresa la subunidad que activa enzimáticamente la toxina del cólera y contiene un gen de resistencia al mercurio (lo que permite una fácil identificación de la cepa), esta es utilizada como vacuna oral contra la propia enfermedad del cólera, pero en forma de vacuna inactivada (Ryan y Calderwood, 2000). Otro ejemplo del uso de V.cholerae es en el desarrollo de una vacuna contra la sigelosis, en el que se usó la cepa anteriormente mencionada como vector del fragmento antígeno-O de Shigella sonnei. La vacunación con esta cepa recombinante resulto en la obtención de altas concentraciones de anticuerpos antígenos-O específicos en los animales vacunados (Medina y Guzmán, 2001). 5.1.1.6. Yersinia enterocolitica Es un patógeno entérico que invade el tejido intestinal, capaz de resistir a los mecanismos de eliminación del hospedador. Esta invasión depende en gran medida de la presencia de un plásmido de virulencia (Paerregaard y cols, 1991), que es el que 20 codifica la síntesis de los determinantes de la virulencia, proteínas sintetizadas durante la fase de invasión que son capaces de estimular una fuerte respuesta inmune. Los genes de dichas proteínas son la diana para la atenuación de la bacteria (Medina y Guzmán, 2001). Algunas de las características que hacen que Y.enterocolitica sea un buen vector en vacunas es que es capaz de persistir en el tejido durante varios días después de la inmunización y que se replica el ADN desnudo de la vacuna durante su división lo que aumenta la cantidad de ADN plasmídico (Al-Marini y cols, 2004). 5.1.1.7. Bacillus anthracis Este microorganismo es una bacteria formadora de esporas gram positiva y responsable del ántrax. Se trata de un patógeno extracelular, en el que su virulencia depende de la secreción de dos endotoxinas y la producción de una capsula antifagocitaria, codificados en los plásmidos pOX1 y pOX2, respectivamente (Sirard y cols, 1997b). Se han estudiado dos modelos en los que B.anthracis actua como vector: El primero fue desarrollado por Sirard y cols (1997b), y en él introducen genes que codifican componentes de Clostridium perfringes, lo que conlleva a una protección frente a las toxinas iota de dicha bacteria. En el segundo también realizado por Sirard y cols (1997a), se introducen genes de L.monocytogenes para la protección frente a esta bacteria (Brossier y cols, 1999). Las cepas atenuadas de B.anthracis expresando antígenos heterólogos muestra un potencial significativo en el desarrollo de vacunas veterinarias (Medina y Guzmán, 2001). 5.1.2. BACTERIAS COMENSALES: 5.1.2.1. Bacterias de ácido láctico Las bacterias lácticas son un grupo heterogéneo de microorganismos ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo general son bacilos o cocos gram positivos, anaerobios, no esporulados, no móviles y que producen como único y 21 principal producto de la degradación de los carbohidratos el ácido láctico (Carr y cols, 2002; Vázquez y cols, 2009). En la década de los 80, cuando comenzó la investigación de los vectores bacterianos, se usaron los microorganismos patógenos atenuados (Curtiss, 2002); pero estos, aunque ya no tienen tanta virulencia, siguen siendo inmunogénicos y para pacientes no inmunocompetentes, tales como bebés, ancianos o inmunodeprimidos, constituye una vía menos segura y por ello comenzaron a investigar con las bacterias de acido láctico. Ya que estas son ampliamente utilizadas en la industria y presentan una baja inmunogenicidad (Konings, y cols, 2000; Ross y cols, 2002; Schnuren y Magnusson, 2005) En los últimos 20 años numerosos estudios han demostrado las diferentes aplicaciones de estas bacterias en su utilización como vectores, principalmente como vacunas orales, ya que presentan muy buenas características: no son patógenos y son fácilmente modificables genéticamente (LeBlanc, 2013). Las dos especies por las que se ha mostrado un mayor interés son: Lactococcus lactis: Es un microorganismo ampliamente usado en la industria alimentaria y es considerado como el modelo de las bacterias de ácido láctico, ya que se han desarrollado numerosas herramientas genéticas para que pueda expresar proteínas heterólogas (Bermúdez-Humaran y Langella, 2004). Las cepas de laboratorio más comúnmente usadas son: MG1363 y IL1403, están libres de plásmidos (Gasson, 1983; Chopin y cols, 1984) y sus genomas han sido completamente secuenciados (Bolotin y cols, 2001; Wegmann y cols, 2007). La primera investigación del uso de una cepa recombinante de L. lactis como una vacuna mucosa fue realizado en 1990 con una bacteria no viable a la que se le introduce los genes del antígeno de superficie de Streptococcus mutans (Iwaki y cols, 1990), a partir de ese momento se han escrito una media de 20 artículos por año sobre el tema, lo que revela el gran éxito de este microorganismo como vector (LeBlanc y cols, 2013). 22 Lactobacillus spp.: Existen más de 80 especies diferentes de este género, que difieren en muchas propiedades, lo que produce muchas diferencias de ADN entre sí, esta es una de las razones por las que este género ha sido menos estudiado (LeBlanc y cols, 2013). Pero a lo largo de los últimos años se ha comenzado a investigar y algunas de las ventajas que encontramos es que pueden permanecer mayor tiempo en el intestino y algunas de las cepas presentan propiedades probióticas (Gareau y cols, 2010; Kechaou y cols, 2013). Streptococcus gordonii Se trata de un microorganismo comensal de la cavidad bucal y placa dental humana, además también puede encontrarse en la zona de la faringe y nasofaringe, es uno de las primeras bacterias de la flora dental ya que suele aparecer alrededor de los 6 meses de edad. Esto hace que durante su colonización no tenga prácticamente competencia, y es una característica que puede utilizarse para su uso como vectores y, en concreto, en las vacunas orales (Carlsson y cols, 1970; Smith y Taubman, 1992). Otra de las ventajas que tiene el uso de S.gordonii como vector es su fácil administración oral, ya que se eliminan las manifestaciones locales (tales como rojeces, hinchazón…) y que no produce manifestaciones sistémicas (fiebre, malestar general, dolor de cabeza…) (Lee, 2003). Existen dos formas de expresar antígenos heterologos en S.gordonii, el primero se basa en localizar en la superficie el antígeno bien usando la proteína M6 de Streptococcus pyogenes (Sharma y cols, 2001) o el antígeno P1 de Streptococcus mutans (Lee y cols, 1999), la segunda opción es la de expresar el antígeno en forma de proteína soluble excretada en el medio (Lee, 2003). Algunos ejemplos del uso de S.gordonii como vector puede ser el estudio realizado por Sharma y colaboradores en 2001 en el que usaron una cepa de S.gordonii para expresar el antígeno FimA de Porphyromonas gingivalis (microorganismo gram negativo causante de la periodontitis) e inducir una respuesta inmune en ratas. Otro estudio fue el de Medaglini y colaboradores (2001) que usaron una S.gordonii para expresar el fragmento C de la toxina tetánica (Lee, 2003). 23 5.3. ESTUDIOS DE VACUNAS CON BACTERIAS RECOMBINANTES VIVAS: Para que una vacuna pueda ser comercializada es necesario que presente una serie de características (que son llevadas a cabo en los estudios preclínicos y en los ensayos clínicos) que son: Deben ser eficaces y proporcionar una inmunización duradera y completa. Deben ser seguras y no provocar reacciones adversas en el paciente. Tener una producción relativamente fácil y no muy costosa (ArgenBio, 2007). A continuación se muestran una selección de diferentes enfermedades actuales frente a las cuales se están diseñando vacunas de bacterias recombinantes vivas. Las enfermedades escogidas han sido: cáncer, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), Leishmaniosis, virus del papiloma humano (VPH), neumonía bacteriana y diabetes. 5.3.1. CÁNCER El cáncer es el nombre que se le da a un conjunto de enfermedades relacionadas con una división incontrolada de las células que pueden llegar a diseminarse por otros tejidos del organismo (INC, 2015). En 2007, Zhang y colaboradores comprobaron la eficacia relativa de una vacuna con únicamente S.typhimurium atenuada o de esta bacteria expresando además el ARNip-STAT3, para el tratamiento del cáncer de próstata. El resultado fue una disminución significativa del crecimiento tumoral además de una reducción de los órganos metastásicos en los ratones a los que se les inoculó. Kim y colaboradores (2009) realizaron un estudio con una cepa de L.monocytogenes expresando los genes de la listeriolisina O modificada y de un fragmento de aminoácido (Mage-b). Fue realizado in vitro e in vivo (en ratones con cáncer de mama), en ambos casos se llego a la conclusión de que ambas cepas son capaces de infectar células tumorales. Le y colaboradores (2011) realizaron dos estudios de fase I en el que utilizaban la cepa ANZ-100 de L.monocytogenes y esa misma cepa expresando la mesotelina 24 humana (CRS-207), que es un antígeno que se expresa en numerosos tumores. El estudio fue realizado en pacientes con metástasis de hígado y en otro tipo de cáncer que expresan la mesotelina. Las conclusiones del estudio fueron positivas, ya que ambas vacunas son seguras y tolerables en sujetos con cánceres avanzados refractarios al tratamiento de activación inmune. También se observa un aumento de las citoquinas y quimiocinas, lo que puede servir como un biomarcador para la actividad de la vacuna. Además, L.monocytogenes expresando un antígeno antitumoral puede inducir una respuesta de las células T específicas en pacientes con cánceres avanzados. Por último, Jin y colaboradores (2015), utilizaron una cepa de S.typhi para expresar los siguientes genes: CEACAM6 y 4-1BBL. Fue suministrado en ratones con cáncer de colon, y tras el estudio quedo demostrado que las cepas que contenían dichos genes producían un aumento de las células natural killers, CD8+ y CD3+, además de una inhibición en el desarrollo del cáncer de colon. 5.3.2. VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH) Es el virus de la inmunodeficiencia humana (Figura 2), que puede causar el síndrome de inmunodeficiencia humana (SIDA). El VIH ataca al sistema inmune y en concreto a las células T, que al agotarse sus reservas no son capaces de proteger al organismo ante infecciones (CCPE, 2015b). Figura 2. 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