La problemática del ajuste en la etapa de la calibración

En este trabajo se pasa revista a los factores que influyen en el proceso de calibrado en el análisis químico. Los postulados en los que se basa la aplicación del método de los mínimos cuadrados, la bondad del ajuste del modelo empleado y el análisis de residuales son objeto de consideración. Este último tópico constituye una poderosa herramienta que permite comprobar las suposiciones en las que se basa el modelo y adoptar decisiones con respecto a la independencia u homogeneidad (homocedasticidad) de los datos. En casos de varianza no uniforme (heterocedasticidad) se procede a la ponderación, o a la transformación de los datos, en su caso. Se analizan también estrategias a aplicar en situaciones más complejas tales como curvas de calibración no lineales con varianza no uniforme. Por último, se considera el uso de funciones racionales y ajuste por funciones splines. The factors, which exert an influence over the calibration process in chemical analysis, are subject of consideration. The postulates in which the least squares method are based; the goodness-of-fit of the model and the residual analysis are subject of study. This last topic is a powerful tool, which allowschecking the assumptions assumed, as well as taking decisions concerning data independence or homogeneity (homocedasticity). When the variance is non-uniform (heterocedasticity), data are either weighted or a transformation is carried out. The strategies to be applied in more complex cases such as non-linear calibration curves with non-uniform variance are also analysed. Finally, the use of rational or spline functions are considered. Palabras clave: calibración, análisis químico, varianzas uniforme y no uniforme, curvas de calibrado no lineales. Key words: calibration, chemical analysis, uniform and non-uniform variances, non-linear calibration curves. Revista Tumbaga (2006), 1, 107-128 A.G. GONZÁLEZ,ANA SAYAGO yAGUSTÍN G. ASUERO Correo electrónico: [email protected] Departamento de Química Analítica, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla El calibrado, tal como lo define Sharaf y col. (1986), es esencialmente un proceso mediante elcual, larespuestade un sistemade medida (señalanalítica) puedeexpresarseentérminos de una cualidad o cantidad de interés (concentración de analito). De manera matemática, podemos asimilarlo a una función y=f(x)donde yes la respuesta analítica correspondiente alaconcentraciónx. Elaspecto de mayorinterés analítico consiste en encontrarla forma de esa función de respuesta. En el análisis tradicional por métodos químicos como la volumetría y gravimetría, la cantidad de analito está relacionada linealmente con el volumen del agente valorante o con el peso de la forma de pesada que constituyen un modelo lineal de respuesta (1) x = F (factor gravimétrico) ×y (peso de la forma de pesada) (2) x = N (normalidad) ×Peso equivalente ×y (Volumen de valorante) Pero, es en análisis instrumental donde más se emplea la noción de función de respuesta, existiendo en algunos casos relaciones teóricas (Agtenderbos, 1979; Penninckx y col., 1996; Kleijburg y Pijpers, 1985; Wagenaar y col., 1974; Andrews y Jowett, 1982; O’Connell y col., 1990) que permiten pronosticar ésta (Tabla 1). Sin embargo, en otras muchas situaciones, la función de respuesta ha de establecerse empíricamente midiendo problemas ficticios, esto es, utilizando disoluciones patrones (diferentes concentraciones conocidas de analito presentes en la misma matriz). Bajo tales condiciones, la señal instrumental está definida por la cantidad de analito y el ruido de fondo. Tabla 1. Funciones de respuesta empleadas en análisis instrumental Función de respuesta Nombre Técnica (ejemplos) y=A+Bx y=A+Blog x y=Ax B y=A+Bx+Cx 2 y=A+B[1–exp (–C x)] yAD x C D B =- +æ è çö ø ÷ + 1 Ley de Beer Nernst Scheibe-Lomakin Wagenaar y col. Andrews y col. Rodbard Espectroscopía de absorción Electroquímica Espectroscopía emisión Absorción atómica “ Radioimmunoensayo De los modelos matemáticos empleados para determinar la función de respuesta, el lineal es el más sencillo, más estudiado y fácil de tratar. Muchas funciones de respuesta presentan zonas lineales generalmente a bajas concentraciones de analito y otras donde aparece curvatura, e incluso, a veces, regiones donde la señal de respuesta es independiente (Mc Dowell, 1981) de la concentración de analito. El analista está interesado en la porción de la función de respuesta donde la variación de la señal instrumental con la A.G. González, Ana Sayago y Agustín G. Asuero Revista Tumbaga (2006), 1, 107-128 concentración de analito contiene información útil. El segmento de función de respuesta con interés analítico para establecer el calibrado y determinar el contenido de analito en unamuestra desconocidarecibe el nombre de curva de calibrado,estimándose, a partir de ella, la concentración desconocida por interpolación(método de patrones externos). Cualquier extrapolación puede conducir a resultados sometidos a grandes errores. Como ya hemos indicado, si la porción de la curva de calibrado es lineal (recta de calibrado), tanto mejor. En casos de respuestas no lineales es común efectuar transformaciones para linealizarlas (Carroll y Rupert, 1988). El ajuste de los modelos matemáticos a losdatosde lacalibración (Cuadros-Rodríguezycol., 2001) paraestablecer la curvade calibrado es una tarea que puede, hoy día, llevar a cabo el analista de manera sistemática, sin olvidar la rigurosidad. En lo que sigue trataremos el ajuste del modelo de la calibración a los datos cuando la señal responde a un solo analito y el error se asocia a la variable x. El análisis multicomponente, aunque también es tratable por el método de patrones externos, quizás sea más lógico abordarlo desde las perspectivas del método de la adición estándar generalizada (Jochum y col., 1981; Herrero y col., 1994) y no será tratado aquí, al igual que la calibración en aquellos casos en que en ambas variables xeyestán sujetas a error (Ripley and Thompson, 1987; González y Asuero, 1993). La técnica más usual para establecer una curva de calibrado por ajuste de puntos esla de los mínimos cuadrados, pero para poder aplicarla justificadamente deben de cumplirse, entre otros (Agterdenbos, 1979; Sayago y col., 2004) tres requisitos fundamentales: i) Que la variable xseencuentreexentadeerror.ii)Queelerroreiasociadoalavariabley1se encuentre normalmente distribuido con media cero y varianza ss ii N 22 0;(, ) . iii) Que la desviaciónobservada en los valores de ypara un valor fijo de x(replicaciones) permanezca constante en todo el intervalo de concentraciones. (Postulado de la uniformidad de la varianza u homocedasticidad). En calibración, la concentración de analito se conoce, dentro de unos márgenes, con gran exactitud y precisión y, por lo tanto, podemos admitir que (i) se cumple. Muchos analistas dan por supuesto que la condición (ii) de normalidad se cumple y raras veces lo comprueban. Sin embargo, Clancey (1947), ya en la década de lo 40, examinó 250 distribuciones basadas en 50.000 análisis químicos y encontró que menos de un 15% de aquellos podían considerarse normales con el propósito de aplicar las técnicas estadísticas comunes. Esto nos recuerda la sentencia socarrona de Schmitt (1969) de que “La distribución normal es la menos normal de las distribuciones”. Los analistas han prestado mucha más atención al postulado de homocedasticidad (iii). En situaciones de varianza no constante (heterocedasticidad),latécnicadelosmínimoscua - drados aún puede emplearse, pero utilizando factores de ponderación (Gort y Hoogerbrugge, 1995; Desimoni, 1999). Garden y col. (1980) y Schwartz (1979) han considerado el problemadelavarianzanouniformeenlaconstruccióndecurvasdecalibrado. LA PROBLEMÁTICA DEL AJUSTE EN LA ETAPA DE LA CALIBRACIÓN Revista Tumbaga (2006), 1, 107-128 Comenzaremos por estudiar el modelo de ajuste más sencillo –y aplicado– que el analista puede ensayar: El lineal. Supongamos que entre dos variables existe (Hunter, 1981) la relación lineal (3) hb bx=+ 01 donde b0yb1sonlosvaloresdela ordenadaen el origen y la pendientede larecta,yhyx,los valores verdaderos desconocidos de la respuesta analítica y la concentración de analito calibrado, relacionados con los valores experimentales según (4) hexl=+ =+yx siendo eyluna medida del error aleatorio asociado a nuestro intento de medir hyx. Una vez establecido el control de calidad en el proceso de medida, los errores tipo “blunder”, pérdidas no aleatorias de control y errores sistemáticos (Blanco y Cerdá, 1988) no se contemplan. Afortunadamente, como ya hemos indicado, la medida de la concentración del analito puede considerarse exenta de error (i) y, por tanto, l»0omejor le,con lo cual el modelo por ajustar sería (5) yx ii 101 =+ +bb e Por otra parte, si aceptamos la distribución normal del error en la yi(ii), la función de distribución de un valor cualquiera yialrededor del valor verdadero vendrá dada por la campana de Gauss (6) fsp h s (y y i ii i )exp () =-- æ è ç ç ö ø ÷ ÷ 1 22 1 2 2 La distribución conjunta independientemente de todos los valores de yserá (7) ffsp h s (y y y ii n ii i )() () exp () == -- æ è ç ç ö ø ÷ ÷ PP 1 22 1 2 2 puesto que (8) eh iii y 22 =-() y si existe homocedasticidad (iii) (9) ss s 1 22 22 ===K con lo cual (10) fsp e s (y nn i )() exp=- æ è çö ø ÷ æ è ç ç ö ø ÷ ÷ å 1 2 1 2 2 2 Nos interesa ajustar el modelo a los datos, de manera que la distribución conjunta tome un valor máximo, es decir, se desvíe lo mínimo de los valores verdaderos. Para ello basta A.G. González, Ana Sayago y Agustín G. Asuero Revista Tumbaga (2006), 1, 107-128 con que ei 2 åsea mínimo. Desgraciadamente, trabajamos con una muestra de tamaño finito y desconocemos los valores de b0,b1,hi, por lo que debemos contentarnos con sus estimacionesb0,b1,yi. De este modo, en lugar de hacer mínima la suma ei 2 å, debe hacerse mínima la cantidad ($)yy r ii i -= åå 22.Alnúmerori, diferencia entre el dato experimentalyiyel valor estimado $ yi,selellamaresidualy,paranuestros propósitos, deberá distribuirse tal como ei.Asípues,como (11) Qybbx ii =-- å() 01 2 de la condición necesaria de mínimo (12) ¶ ¶ ¶ ¶ Q b Q b 01 00== obtenemos las ecuaciones normales de la regresión lineal, de las que se calcula fácilmente los estimadores (13) bxxyy xx ii i 12 =-- - åå ()() () (14) bybx 01 =- Sin embargo, las cosas no siempre son tan sencillas. A veces, los datos se acomodan aparentementea unalínea rectacuandoenla realidad adolecende curvatura. El ojo humano reconoce con mucha más facilidad que cualquier técnica de procesado matemático la presencia de conductas diferentes entre grupos de puntos en una gran cantidad de casos. Por ello, la representación gráfica de la función de respuesta es un paso esencial para detectar curvaturas. De todos modos, la bondad del ajuste debe confrontarse con algún procedimiento matemático. Los analistas, para estimar la bondad del ajuste han utilizado demasiado a menudo el coeficiente de correlación rdefinido por (15) rxxyy xx yy ii ii =-- -- å åå ()() ()() 22 estando los valores de rcomprendidos (Koch, 1984) entre –1 y +1. Sin embargo, el empleo tan difundidodel coeficiente decorrelación ha sido nefasto, debido al poco valor real de este parámetro para detectar curvatura (AMC, 1988; Thompson, 1990; Asuero y col., 2006). Como indica Hunter (1981), en la teoría estadística, la correlación es la medida de la asociación entre dos variables aleatorias pero, en nuestro caso, xyhestán funcionalmente relacionados. Correlación, en su sentido matemático-estadísticonoexiste,ylosvaloresderpróximos a+1 o–1 proporcionan un ambiente de respetabilidad, pero no mucho más. Las curvas de calibrado analíticas dan a menudo un valor muy próximo a r = 1,000 aunque haya diferencia significativa entre los puntos de la linealidad. Generalmente, se considera que 100 r2proporciona una estimación del %de variación LA PROBLEMÁTICA DEL AJUSTE EN LA ETAPA DE LA CALIBRACIÓN Revista Tumbaga (2006), 1, 107-128 de los puntos experimentales a la linealidad (Kvälseth, 1985). Así, un valor de r = 0.980 indica que el 96% de la variación está explicado por el modelo, pero debemos recordar, sin embargo, que ese 4% restante de la variación no explicada podría concentrarse en una pequeña porción de la curva. En consecuencia, el coeficiente de correlación es un medio poco sensible para estimar la calidad del ajuste de una recta de calibrado, y su uso discriminado puede conducir a conclusiones erróneas. Algunos analistas utilizan ensayos estadísticos para saber si el coeficiente de correlación es significativo, como el tde Student (Miller and Miller, 2000) (16) trn r =- - 2 12 o la transformación de Fischer (Akhnazarova y Kafarov, 1982) (17) zr r =- 1 21 In 1+ pero no por ello se conjura el peligro, pues puedenindicar correlación cuando no la hay. Más interesante es el análisis de la varianza del ajuste (Sharaf y col., 1986; Aknazarova y Kafarov, 1982; AMC, 1994), calculando la varianza debida al modelo y la varianza residual. Se puede aplicar el criterio Fpara ensayar la bondad del ajuste. En el caso de una recta sin error F = ¥y en el caso de independencia entre yyx,F=0. Sin embargo, este ensayo por sí mismo no es evidencia (Sharaf, 1986) de que el modelo sea el adecuado. Elanalista necesita, pues, algunosmedios, para comprobar si las suposicionesii y iiise cumplen, así como para asegurarse de que el modelo escogido es el que mejor se ajusta a los datos experimentales. Para ello cuenta con una herramienta muy válida, el análisis de residuales (Draper y Smith, 1998; Meloun y col., 2002). Si estudiamos el comportamiento de los residuales después de haber obtenido la recta de regresión lineal y representamos tales residuales frente a los valores de x, pueden observarse cuatro situaciones (Belloto y Sokoloski, 1985) (figura 1). El comportamiento I indica que el modelo utilizado era el adecuado y los residuales se han distribuido a lo largo del intervalo de medida con media cero y desviación constante. El comportamiento II aparece cuando la ecuación utilizada para el ajuste no es la adecuada y podría necesitar probablemente, términos de orden superior para el ajuste completo. La situación III es típica cuando no existe uniformidad en la varianza de y.El sistema es heterocedástico, y la dispersión disminuye con x, como indica la figura, aunque también podría aumentar o tomar la forma de una pajarita. El comportamiento IV se refiere a una situación en la que los erroresdependen de alguna variable que aún no ha sido descubierta, vulnerando la suposición de independencia del error. Para corregir esta tendencia deben considerarse otras variables que tácitamente pudieran intervenir en el proceso. De todos modos, a veces, las situaciones reales no son tan claras como las que idealmente se A.G. González, Ana Sayago y Agustín G. Asuero Revista Tumbaga (2006), 1, 107-128 muestran en la figura. El comportamiento I ya hemos dicho que corresponde al caso de un ajuste perfecto en que los residuales se distribuyen según Ni (, )02 s. Para examinar matemáticamente si los residuales se distribuyen como hemos supuesto existen numerosos ensayos. Los más sencillos consisten en representar la curva de frecuencia acumulativa (%) frente al valor del residual, que da la familiar curva en forma de So una recta si se traza sobre papel de probabilidadnormal (Miller y Miller, 2000; Shapiro, 1990). Métodos más específicos son el de Kolmogorof-Smirnov (Miller y Miller, 2000; Kateman y Pijpers, 1993), el de Bowman yShenton de losparámetros de simetría y kurtosis (Bowman y Shenton, 1975) y el de Anderson-Darling (Pettit, 1977) de los percentiles. Un testnoparamétrico muyútil para comprobarsilosresiduales se ajustanbiena lassuposiciones de una distribución al azar, y que se usa mucho para detectar curvaturas en rectas de calibrados, es el de Wald-Wolfowitz (Miller y Miller, 2000). Se define “ristra” (run en la literatura anglosajona) como cada secuencia de signos distintos que aparecen separados cuando seobservaelsignodelosresidualesavalorescrecientesdex(Thompson,1982). Así, enla siguiente serie de residuales: ++++------++ hay tres ristras. Evidentemente, si existe una secuencia no aleatoria de signos + y - aparecerá un número menor de ristras que en el caso de distribución aleatoria (o en algún caso, mucho mayor, como sucede en las variaciones sistemáticas periódicas). El ensayo anterior nos indica si los residuales se distribuyen al azar. No obstante, puede serque aunquesudistribución seaaleatoria, no seanormal. Yahemosindicado quemuchos experimentos conducen a distribuciones no normales del error. Los estudios Monte-Carlo indican que el estimador decentralización en mínimos cuadrados,la media, es uno de los más pobres estimadores frente a la variedad de distribuciones de error diferentes a la normal (Staudte y Sheather, 1990; Rousseeuw, 1991). La puesta a punto de los estimadores de mínimos cuadrados cuando se viola la imposición de normalidad basados en estadísticas robustas es de una gran importancia (Rousseeuw, 1991; Walczak y Massart, 1998; Massart y col., 1986; Danzar, 1989; Thompson, 1989). Un estimador se llama robusto (Rousseeuw, 1991) cuando es insensible a desviaciones suaves de las suposiciones establecidas, y solo es ligeramente ineficiente relativo a los mínimos LA PROBLEMÁTICA DEL AJUSTE EN LA ETAPA DE LA CALIBRACIÓN Revista Tumbaga (2006), 1, 107-128 Figura 1. Representación de los residuales frente a valores de la variable cuadrados cuando las suposiciones se cumplen. Así, los métodos robustos proporcionan protección frente a las distribuciones no normales y son además resistentes a la presencia de resultados sospechosos (outliers en la literatura anglosajona) en los datos (Walczak y Massart, 1998). Si después de haber ajustado nuestro modelo a los datos observamos una distribución de los residuales como en el caso III nos encontramos ante una violación del postulado de homocedasticidad. En tales casos, la aplicación directa de la técnica convencional de los mínimos cuadrados puede conducir a conclusiones erráticas (Draper and Smith, 1998). Es por ello que se reconoce en la literatura química que usualmente la varianza no es constante en análisisquímico (Garden y col., 1980). Como indica Schwarz(1979), aunque la suposición de homocedasticidad es válida para muchos procesos analíticos, hay algunas típicamente heterocedásticas, que incluyen todos los métodos basados en las medidas de cuentas, así como los métodos fotométricos y cromatográficos en ciertos casos. Efectivamente, en determinadas ocasiones, la heterocedasticidad puede aparecer en cualquier método analítico, como en espectrofotometría de absorción y voltametría de redisolución anódica, cromatografía, electroforesis capilar (Baumann y Wätzig, 1995), espectroscopía deplasmaacoplado porinducción(Ketkar yBzik, 2000), yotros. Una vez hemos observado dicha tendencia en los residuales, se comprueba la heterocedasticidad (a la vez que se soslaya) mediante replicado de los valores de para un valor dado de x. Los ensayos de Barlett o Cochran (Akhnazarova y Kaarov, 1982; Sayago and Asuero, 2004; UNE 82009-2, 1999), son suficientemente rigurosos. Analicemos ahora la situación correspondiente al caso IV en la que se observa una tendencia de los residuales cuya causa es la dependencia de una variable aún no analizada. Se trata de una situación que por su curiosidad e importancia vamos a aclarar con un ejemplo. Cuando se estudia la solubilidad del Diazepan en propilenglicol (Belloto y Sokoloski, 1985), la relación obtenida entre la concentración y la absorbancia (ley de Beer) fue: C = –0,034084 + 0,117424 A (r = 0,999).Sinembargo,alrepresentarlosresidualesrespecto al orden numérico en que cada muestra fue medida, se observa una situación típica del casoIV. Si al representar los residualesfrente a una variable considerada o no, se observa una tendencia como ésta, debe sospecharse la dependencia de una variable oculta o no, relacionadacon lasanteriores.Enel caso delDiazepam, esta representación sugiere que los errores no son independientes, pudiendo estar relacionados con el tiempo de alguna manera desconocida, ya que los residuales parecen ser función del orden de las medidas. Si el tiempo se incluyeenelmodelo,seobtienelaecuaciónC = –0,071217 + 0,118201 A + 0,0003625566 t (r = 1,00). Los residuales así obtenidos representadosfrentealavariabletiemposiguen una representación típica de adecuación al modelo como el caso I. Gracias al análisis de residuales se detecta la influencia de la variable tiempo que de otro modo hubiese pasado inadvertida. Un modelo residual dependiente del tiempo, como el que hemos visto, puede indicar que se está produciendo una seria A.G. González, Ana Sayago y Agustín G. Asuero Revista Tumbaga (2006), 1, 107-128 contaminación, o que la fuente de luz decae con el tiempo. El modelo residual indica que existe una variable dependiente del tiempo, pero no indica por qué existe esa dependencia. Cuando los residuales obtenidos al ajustar el modelo lineal a nuestros datos muestra un comportamiento como II, esto nos indica, desafortunadamente, que el modelo sugerido no se adecua a la realidad y que son necesarios términos adicionales en xpara asegurar el ajuste a los datos analíticos. En este caso, los residuales no se distribuyen al azar, sino que muestran una disposición cóncava o convexa. El ensayo de Wald-Wolfowitz (Miller and Miller, 2000) nos sugeriría que existe una curvatura, y que nuestra función de respuesta no es lineal en x. Si aplicamos la condición de mínimo a la distribución conjunta en el caso en que las varianzas no son constantes, la expresión a minimizar sería (/)es ii 2 å. En situaciones reales, tratando con residuales, es conveniente definir (Asuero and González, 1989) una cantidad denominada peso o factor de ponderación, que denotaremos por wi, asociado con una observación yi, y definido por (18) wi i =s s 0 2 2 El peso de una observación es inversamente proporcional a la varianza. El término s0 2es simplemente un factor de proporcionalidad que coincide con la varianza de peso unidad, y que muchos analistas (Cuadro-Rodríguez y col., 2001) toman arbitrariamente como unidad. El objeto de introducir los pesos es estabilizar la varianza de los residuales. En el caso del modelo ponderado tendríamos (19) wy w w w ii i i ii =++bbe 01 y por tanto (20) () var var( )ww w cte ii i i ii i i ees s sss===== 20 2 2 20 2 Ahora, la condición de minimización es (21) Qwyy ii i =-= å($)min 2 que conduce a expresiones similares a las deducidas para la regresión lineal simple (22) bxxyy xx ii i 12 =-- - åå ()() () (23) bybx 01 =- donde LA PROBLEMÁTICA DEL AJUSTE EN LA ETAPA DE LA CALIBRACIÓN Revista Tumbaga (2006), 1, 107-128 (59) VxP x P x Px k ikiki ki - -- - =åå 1 12 1 2 () () () Los valores de ajse calculan fácilmente (60) ayP x Px j ij i ji =å å () () 2 Para encontrar la ecuación de regresión por el método de aproximaciones sucesivas, se calculan las varianzas residuales para la regresión de orden kdonde Qkes la suma de los cuadrados de los residuales, que se calcula por la recurrencia: (61) QQ a Px kk k k i =- -å 122 () El prerrequisito (Akhnazarova y Kafarov, 1982) es queQyy i 02 =- å() . Cuando al aumentar el grado del polinomial,ss kk+> 1 22 ,medianteelensayoF,sedaporterminadoelproceso. Alserortogonaleslospolinomiales,lamatrizde covarianza esdiagonalysustérminosson (62) Vs sC jj aj kjj == -221 Haciendoun resumende lo visto hasta ahora, elmétodo delossegmentos rectilíneospuede ser útil en los casos de datos altamente precisos y curvas de calibrado de poca curvatura. El método de los tres parámetros es siempre intrínsecamente inexacto para curvas no lineales de elevada curvatura, a menos que se sepa la forma correcta de las funciones. En general, el método de ajuste polinomial proporciona lamayorconfianzaporqueutilizaeltestFpara ajustar apropiadamente los puntos, aunque se trata, sin lugar a dudas, del modelo más complicado. A pesar de las grandes ventajas y numerosísimas aplicaciones de los polinomiales ortogonales, no son enabsoluto el arma definitiva. Rice (1964) ha propuesto funciones polinomiales del tipo (63) Fx ax bx ii ii ()=å å que tienen un grado de flexibilidad mucho mayor que los polinomiales, pues una función racional de grado relativamente bajo puede ajustarse a una forma que nunca podría aproximarse de manera efectiva mediante el uso de polinomiales de grado bajo o medio. Este tipo de función es más difícil de evaluar que un polinomial, siendo necesario el uso de la regresión no lineal. Otro método de ajuste poco usado pero muy recomendable (Jost y Rock, 1954) es el de los polinomiales ortogonales discontinuos de Vettin, análogos a los de Legendre, que se expresan siempre en función de un parámetro que es la longitud entre puntos A.G. González, Ana Sayago y Agustín G. Asuero Revista Tumbaga (2006), 1, 107-128 equidistantes. Se trata de un procedimiento muy similar al de la Serie de Fourier solo que utiliza un número finito de puntos. El inconveniente es la necesidad de conocer los puntos equidistantes, pero esto puede soslayarse mediante lectura a ojo de la curva diseñada. Estos dos últimos tipos de ajuste sirven para curvas de calibrado, donde se superponen dos o más fenómenos. A título de ejemplo, en fluorimetría, las representaciones de la intensidad de emisión frente a la concentración son prácticamente lineales en disolución diluida, pero muestran curvatura negativa a altas concentraciones debido a la presencia de artefactos ópticos o a la no adecuación del modelo que predecía linealidad. Comoambos efectossonindependientes, en lapráctica pueden aparecer curvasdemuy diferenteaspecto, ya que sesuperponendos omás procesos. Eslógico pensarque nohabrá ninguna función algebraica que, por sí sola, sea capaz de ajustar completamente los datos. La mejor solución sería tal vez ajustar los puntos a una curva que consistiera en varias secciones unidas de diferente forma matemática. Éste es exactamente el fundamento del ajuste por funciones Spline (Price y Simonnen, 1962; Ahlberg y col., 1967; Hwang y Wineforner, 1988). En la práctica, los Splines cúbicos (Frigieri y Rossi, 1979) son los más empleados, y aproximan los datos a una serie de ecuaciones cúbicas. Estos “eslabones” cúbicos se superponen en ppuntos de interpolación (Knots en la literatura anglosajona) y es esencial que los Splines muestren una transición continua en tales puntos. Esta continuidad debe seguirla tanto la función como sus m–1 primeras derivadas. Un Spline Cúbico completo tiene p–1 eslabones, cada uno de ellos con coeficientes (S=a+bx+cx 2 +dx 3). Así, es necesario calcular 4x (p – 1) coeficientes. Este procedimiento ha sido utilizado exitosamente en radioinmunoensayo, cromatografía gas-líquido y espectrometría de absorción atómica (Miller and Miller, 2000). Agterdenbos,J.(1979).Calibrationin quantitative-analysis.1.General-considerations. Analytica Chimica Acta, 108, 315-323. 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