El estudio de las tolerancias térmicas para el examen de hipótesis biogeográficas y de la vulnerabilidad de los organismos ante el calentamiento global. Ejemplos en anfíbios

Miguel Tejedo1, Helder Duarte1, Luis M. Gutiérrez-Pesquera1, Juan Francisco Beltrán2, Marco Katzenberger1, Federico Marangoni3, Carlos A. Navas4, Alfredo G. Nicieza5, Rick A. Relyea6, Enrico L. Rezende7, Alex Richter-Boix8, Mauro Santos7, Monique Simon4& Mirco Solé9 El estudio de las tolerancias térmicas para el examen de El estudio de las tolerancias térmicas para el examen de hipótesis biogeográficas y de la vulnerabilidad de los orga hipótesis biogeográficas y de la vulnerabilidad de los orga- - nismos ante el calentamiento global. Ejemplos en anfíbios nismos ante el calentamiento global. Ejemplos en anfíbios 1Departmento de Ecología Evolutiva. Estación Biológica de Doñana. CSIC. Avda. Américo Vespucio s/n. 41092 Sevilla. España. C.e.: [email protected] 2Departamento de Zoología. Facultad de Biología. Universidad de Sevilla. Avda. Reina Mercedes, 6. 41012 Sevilla. España. 3Laboratorio de Genética Evolutiva, FCEQyN-UNaM y Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Cl. Félix de Azara 1552. 6to Piso. 3300 Posadas. Misiones. Argentina. 4Departamento de Fisiologia. Instituto de Biociências. Universidade de São Paulo. Rua do Matão, Travessa 14, 321. 05508-900 São Paulo. SP. Brasil. 5Departamento de Biología de Organismos y Sistemas. Universidad de Oviedo. Catedrático Rodrigo Uría s/n. 33006 Asturias. España. 6Department of Biological Sciences. University of Pittsburgh. 101 Clapp Hall. Pittsburgh. Pennsylvania 15260. Estados Unidos. 7Departament de Genètica i de Microbiologia. Grup de Biologia Evolutiva (GBE). Universitat Autònoma de Barcelona. 08193 Bellaterra. Barcelona. España. 8Department of Population Biology and Conservation Biology. Evolutionary Biology Centre (EBC). Uppsala University. Norbyvägen 18 D. SE-752 36 Uppsala. Suecia. 9Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Zoologia. Rodovia Ilhéus-Itabuna, km 16. 45662-900 lhéus. BA. Brasil. Fecha de aceptación: 15 de noviembre de 2012. Key words: amphibians, thermal tolerance limits, CTmax, CTmin, global warming, Janzen hypothesis. La temperatura afecta de manera decisiva a las reacciones químicas que condicionan todos los procesos fisiológicos (Hochachka & Somero, 2002), determinando los patrones de distribución y abundancia de los organismos, así como numerosas interacciones ecológicas (Andrewartha & Birch, 1954; Dunson & Travis, 1991). Podemos, por tanto, afirmar que la temperatura, como componente abiótico fundamental, representa un factor selectivo de primer orden al influir en la supervivencia, crecimiento y dispersión de los organismos (Angiletta, 2009). El estudio de los rangos de tolerancia fisiológicos, especialmente los rangos térmicos, resulta imprescindible para comprender numerosos aspectos de la biología de los organismos, ya que representan las conLEONATO: You will never run mad, niece. BEATRICE: No, not till a hot January. W. Shakespeare Much ado about nothing 1.1.88-89 diciones que limitan su nicho fundamental y, por tanto, su presencia y evolución en un determinado hábitat y área geográfica (Hutchinson, 1981; Kearney & Porter, 2009; Soberón & Nakamura, 2009; Townsend et al., 2011; Seebacher & Franklin, 2012). Se espera que las condiciones térmicas locales dirijan la evolución de los límites de tolerancia térmica, de su potencial plástico de aclimatación y en definitiva deriven en adaptaciones térmicas (Angiletta, 2009; Bozinovic et al., 2011). El interés por el estudio de la evolución y funcionalidad de estos límites térmicos es fuente de numerosas hipótesis biogeográficas y representa un elemento crucial en la determinación de la vulnerabilidad de las especies a los impactos del cambio climático (Figura 1). Artículo Invitado 3 Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) L LOS OS LímITES LímITES DE DE TOLERANCIA TOLERANCIA TéRmICA TéRmICA y ySu Su ImPORTANCIA ImPORTANCIA EN EN EL EL ExAmEN ExAmEN DE DE HIPóTESIS HIPóTESIS BIOgEOgRáFICAS BIOgEOgRáFICAS Tradicionalmente, la base funcional de los límites de tolerancia térmica ha sido examinada desde la perspectiva de la fisiología comparada, mediante estudios intrao inter-específicos basados en una o pocas especies (Feder, 1999; Feder & Hofmann, 1999; Rinehart et al., 2000; Hochachka & Somero, 2002; Podrabsky & Somero, 2004; Buckley & Somero, 2009). Sin embargo, más recientemente, se está produciendo un renovado interés por la fisiología térmica y sus límites de tolerancia pero, en este caso, la perspectiva de análisis ha cambiado, incorporando grandes escalas geográficas y comparaciones macroespecíficas. En particular, el examen de hipótesis macroecológicas y reglas ecogeográficas incluye, implícita o explícitamente, dentro de sus predicciones el análisis de los rangos térmicos y su plasticidad (Vernberg, 1962; Janzen, 1967; Brattstrom, 1968, 1970; Rapoport, 1975; Stevens, 1992; Lomolino et al., 2006). Todo esto está estimulando los estudios fisiológicos comparados a gran escala, en lo que se ha denominado macrofisiología o estudio de la variación en los caracteres fisiológicos a lo largo de macro escalas geográficas y temporales y las implicaciones ecológicas de esta variación (Chown et al., 2004; gaston et al., 2009). Sin embargo, todas estas predicciones no han sido analizadas en profundidad en sus fundamentos fisiológicos (Stevens, 1989; gaston et al., 1998; Chown & gaston, 1999; Clarke & gaston, 2006; ghalambor et al., 2006; millien et al., 2006; Kearney & Porter, 2009). Como ejemplo podemos tomar el patrón de variación latitudinal en la riqueza de especies. La mayor biodiversidad de los trópicos en relación a las zonas templadas se ha explicado, en parte, por la hipótesis de variabilidad climática de Janzen (1967), por la cual los organismos tropicales, expuestos a una menor variabilidad climática estacional, presentarían un menor rango de tolerancia térmica, una mayor especialización y, asociada a esta estenotermia, un menor potencial de dispersión y mayor nivel de aislamiento geográfico. De esta manera, los trópicos tendrían una mayor posibilidad de especiación que Figura 1. Curvas de eficacia biológica relativa en relación a la temperatura, para dos especies de organismos ectotérmicos hipotéticos, una tropical (línea continua) y otra templada (línea punteada), con los parámetros descriptivos esenciales: la temperatura en la cual la eficacia es máxima, Topt, los límites de temperatura críticos, CTmin y CTmax, que una vez sobrepasados, implicaría la muerte del organismo. Podemos afirmar, por tanto, que el rango de tolerancia (CTmax - CTmin) definiría su nicho térmico fundamental. Los límites de tolerancia térmica permiten examinar hipótesis biogeográficas, (H1) hipótesis de Janzen (1967), que predice que los rangos de tolerancia térmica serán más estrechos en especies tropicales, con menor variabilidad térmica, que las especies templadas. Del mismo modo, estos límites pueden permitir examinar hipótesis en fisiología de la conservación, (H2) el calentamiento global tendrá un mayor impacto en las especies tropicales que en las templadas al estar viviendo ya más cerca de sus Topt y CTmax. El incremento previsto por los modelos en las temperaturas ambientales (flechas hacia la derecha) implicaría que muchas especies tropicales pueden sobrepasar sus valores de CTmax, mientras que las especies templadas estarían bastante más alejadas de sus límites críticos, resultando incluso beneficiadas al acercarse a sus temperaturas óptimas. Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) 4 los ambientes templados. Este mayor nivel de especiación puede producirse por dos mecanismos: a) conservadurismo del nicho térmico, por el cual las especies de un mismo clado o linaje mantienen su similaridad climática con el transcurso del tiempo, y la formación de barreras climáticas da lugar a una especiación por alopatría (moritz et al., 2000; Wiens & Donoghue, 2004; Wiens & graham, 2005; graham et al., 2009); y b) evolución o divergencia del nicho térmico, por el cual las especies hermanas presentan una diferenciación fisiológica ante un gradiente climático y una especiación por divergencia parapátrica (moritz et al., 2000). Aunque esta hipótesis del gradiente latitudinal en biodiversidad se fundamenta en determinantes fisiológicos, los distintos estudios que han intentado examinar la relación (Kozak & Wiens, 2007; Hua & Wiens, 2010; Cooper et al., 2011; Cadena et al., 2012) no han medido directamente los rangos de tolerancia fisiológicos de las especies examinadas, sino que simplemente han comparado, mediante modelos de distribución de especies, gIS y bases de datos como WorldClim, los rangos climáticos y altitudinales de las mismas. Esta aproximación, inevitablemente, confunde el nicho térmico fundamental con el nicho realizado u ocupado (véase Figura 1 en Sillero et al., 2010) y, por tanto, infravalora la distribución potencial de las especies. Como afirman los autores de uno de estos estudios citados más arriba: “…This work, we hope, will inspire more detailed examination of the physiological mechanisms that might underlie the patterns we document here” [sic] (Cadena et al., 2012). Se hace necesario, por tanto, un mayor impulso de los estudios fisiológicos para examinar estas hipótesis macroecológicas. L LOS OS LímITES LímITES DE DE TOLERANCIA TOLERANCIA TéRmICA TéRmICA y ySu Su ImPORTANCIA ImPORTANCIA PARA PARA ESTImAR ESTImAR LA LA VuLNERABILI VuLNERABILI- - DAD DAD DE DE LAS LAS ESPECIES ESPECIES AL AL CAmBIO CAmBIO CLImáTICO CLImáTICO En segundo lugar, el análisis de las tolerancias térmicas tiene una especial relevancia bajo el escenario actual de crisis climática, con un calentamiento planetario de origen antropogénico que reviste unas características únicas, como la rápida tasa de calentamiento, sin precedentes en la historia del planeta (mann & Jones, 2003; Pachauri & Reissinger, 2007). Se estima que el rápido calentamiento global tendrá muy probablemente efectos drásticos sobre la biodiversidad. Recientes evidencias empíricas muestran que el calentamiento experimentado durante el siglo xx, de 0,6ºC en promedio, ha causado cambios significativos en el patrón de distribución, fenología de numerosas especies y en la estructura y funcionamiento de los ecosistemas (Root et al., 2003; Parmesan, 2006). El incremento en la tasa de calentamiento en las próximas décadas, que se espera que sea unas cinco veces superior a la experimentada durante el siglo xx (meehl et al., 2007), así como un incremento en el número de eventos climáticos extremos, como olas de calor (Schär et al., 2004; Diffenbaugh & Ashfaq, 2010), pueden ser causa de extinción de poblaciones (e.g., Sinervo et al., 2010). Tratar de predecir, remediar, y tal vez mejorar estos efectos, es un reto importante y urgente que actualmente afrontan los biólogos (Schwenk et al., 2009). La susceptibilidad de una población, especie o comunidad de recibir un impacto negativo debido al cambio climático dependerá de la combinación de dos factores: en primer lugar, la sensibilidad de los organismos, controlada por factores intrínsecos como pueden ser los límites de tolerancia térmica (CTmax y CTmin, Figura 1); y en segundo lugar, la canti- Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) 5 dad y variación en la exposición a factores ambientales extrínsecos potencialmente estresantes, como pueden ser las temperaturas extremas (Williams et al., 2008). Las inferencias más recientes en cuanto a los impactos que el calentamiento global tendrá sobre la biodiversidad se han enfocado mayormente sobre los factores extrínsecos que potencialmente determinan la distribución de las especies, ante distintos escenarios de cambio climático (e.g., modelos de distribución de especies basados en modelos de nicho ecológico). Estos modelos usan una aproximación correlativa basada en la distribución actual de las especies, que busca establecer una correspondencia entre los registros de presencia, presencia / ausencia, o abundancia, con distintas capas ambientales, principalmente temperatura y precipitación. La correspondencia estadística entre la distribución actual y el clima presente pueden potencialmente ser empleados para proyectar distribuciones futuras ante distintos escenarios (Austin, 2007; Pearman et al., 2008; Thuiller et al., 2008; Austin et al., 2009; Sillero et al., 2010). Sin embargo, estos modelos presentan deficiencias desde el momento que estas proyecciones se basan sólo en la distribución presente de la especie (que puede, por otra parte, ser incompleta) y, en el mejor de los casos, reflejaría únicamente el nicho realizado de la especie, y no la distribución que podría ser, es decir, su distribución potencial. Para modelar la distribución potencial de las especies y obtener información sobre su nicho fundamental, tendríamos que analizar las propiedades intrínsecas de las mismas, como, por ejemplo, sus rangos de tolerancia fisiológicos. Esto supone un enorme esfuerzo experimental para determinar estos parámetros fisiológicos en un elevado número de especies. Por tanto, estas aproximaciones mecanicistas, a diferencia de los modelos correlativos, son muy escasas. Sin embargo, su enorme ventaja es que incorporan la información sobre el nicho fundamental y, en consecuencia, pueden mapear la distribución potencial de la especie que se encuentre dentro de sus límites de tolerancia, y, de esta manera, proyectar la distribución futura ante distintos escenarios de cambio climático. Estos modelos mecanicistas pueden así hacer predicciones más precisas sobre las consecuencias del calentamiento global en las próximas décadas (Pörtner & Knust, 2007; Deutsch et al., 2008; Kearney et al., 2009; Kolbe et al., 2010; Diamond et al., 2012a). Podemos concluir que el análisis de las tolerancias térmicas y la magnitud de su respuesta plástica se convierte en una información crucial tanto para el examen de numerosas hipótesis biogeográficas, como para evaluar de manera más precisa el riesgo de las especies de sufrir estrés térmico y, por tanto, realizar estimas de su vulnerabilidad ante el calentamiento global en las próximas décadas. E EL LExAmEN ExAmEN DE DE LAS LAS TOLERANCIAS TOLERANCIAS TéRmICAS TéRmICAS EN EN ANFIBIOS ANFIBIOS. S . SISTEmA ISTEmA mODELO mODELO PARA PARA EVALuAR EVALuAR HIPóTESIS HIPóTESIS BIOgEOgRáFICAS BIOgEOgRáFICAS y yVuLNERABILIDAD VuLNERABILIDAD AL AL CALENTAmIENTO CALENTAmIENTO gLOBAL gLOBAL Los anfibios son considerados la clase de vertebrados más amenazados, con alrededor del 41% de sus especies clasificadas como en peligro por la IuCN (Hoffmann et al., 2010). Además de la presión directa de las actividades humanas (degradación del hábitat, contaminación), se han sugerido como causas del declive otros factores indirectos, asociados o reforzados por el calentamiento global, como las enfermedades infecciosas emergentes y los cambios en el contenido de humedad de los ambientes terrestres (Pounds et al., Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) 6 2006). Sin embargo, el efecto directo de estrés térmico asociado al aumento de las temperaturas máximas no se ha considerado como un factor causal directo del declive de los anfibios (Collins & Crump, 2009). La actividad nocturna y cavadora de la mayoría de las especies durante su etapa terrestre los hacen aparentemente menos susceptibles de sufrir golpes de calor. Sin embargo, durante su etapa larvaria, los renacuajos viven frecuentemente en charcas temporales poco profundas donde la temperatura del agua, si las charcas se encuentran en zonas abiertas y soleadas, puede alcanzar valores muy altos, oscilando entre 35ºC - 43ºC, especialmente en áreas tropicales o subtropicales donde el ángulo de inclinación del Sol alcanza su cenit (Williams, 1985; Abe & Neto, 1991; Watson et al., 1995). Estas altas temperaturas pueden representar una fuente sustancial de estrés fisiológico sobre los renacuajos y posiblemente constituyan una presión de selección importante que ha favorecido la evolución adaptativa en sus tolerancias térmicas máximas. Durante los pasados cuatro años hemos venido realizando una serie de estudios sobre la ecología térmica en distintas comunidades de larvas de anfibios situadas a lo largo de gradientes latitudinales, desde zonas templadas (Europa y NE de Estados unidos) a subtropicales (N de Argentina) y tropicales (estado de Bahía, Brasil), donde hemos examinado distintas aspectos e hipótesis que citamos a continuación: I. Variación latitudinal en el rango de tolerancias térmicas. Hipótesis de Janzen. II. La medición de los límites de tolerancia térmica. Realismo en las medidas, efecto de las tasas de calentamiento. III. Vulnerabilidad fisiológica de los anfibios ante el calentamiento global: a) Variaciones latitudinales en la respuesta plástica de aclimatación en las tolerancias térmicas máximas. b) Variación de las tolerancias térmicas máximas. Efectos en la comunidad. c) Variaciones latitudinales y microambientales en los valores de tolerancias térmicas máximas y vulnerabilidad al calentamiento global ¿Están en peligro los anfibios tropicales por el calentamiento global? I. Variación latitudinal en el rango de tolerancias térmicas en anfibios. Hipótesis de Janzen. una de las hipótesis macroecológicas más destacadas por sus connotaciones en distintas predicciones biogeográficas, es la hipótesis de variabilidad climática de Janzen (Janzen, 1967; ghalambor et al., 2006). Esta hipótesis predice que la variación estacional en la temperatura tiene unas implicaciones en la evolución adaptativa de los límites fisiológicos de tolerancia térmica, especialmente en organismos ectotérmicos que habitan distintas latitudes y altitudes. Las especies ectotérmicas de latitudes templadas, sometidas a variaciones estacionales en la temperatura y obligadas a soportar mayores extremos térmicos, presentarán rangos de tolerancia más amplios que los organismos ectotérmicos tropicales que serían especialistas térmicos, adaptados a un rango ambiental de temperaturas más estrecho. La hipótesis de un incremento en los rangos de tolerancia térmica con la latitud ha sido examinada en una síntesis global, incluyendo biomas terrestres y marinos, por Sunday et al. (2010). Igualmente, se ha examinado particularmente para distintos grupos taxonómicos: insectos (Addo-Bediako et al., 2000; Kimura, 2004; Calosi et al., 2010; Overgaard et al., 2011), lagartos (van Berkum, 1988; Huey et al., 2009; Clusella-Trullas et al., 2011; Huey et al., 2012) y anfibios adultos (Snyder & Weathers, Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) 7 1975, reanalizando los datos originales de Brattstrom, 1968). Todos estos estudios sugieren que el incremento en el rango de tolerancia de los organismos ectotérmicos no tropicales se debe básicamente a la reducción más extrema con la latitud en el CTmin que en el CTmax (Snyder & Weathers, 1975; van Berkum, 1988; Addo-Bediako et al., 2000; Huey et al., 2009; Sunday et al., 2010; Clusella-Trullas et al., 2011; Overgaard et al., 2011). Probablemente este resultado general obedece a que las temperaturas mínimas ambientales disminuyen rápidamente con la latitud, mientras que las temperaturas máximas son relativamente independientes de la misma, con excepción de las latitudes extremas donde las temperaturas máximas descienden abruptamente (gaston & Chown, 1999; Bradshaw & Holzapfel, 2006; ghalambor et al., 2006; Clusella-Trullas et al., 2011). Debido a los numerosos factores que alteran la determinación de los límites de tolerancia (véase apartado II), estos estudios comparados pueden adolecer de numerosos sesgos como señalan Sunday et al. (2010), como pueden ser diferencias sustanciales entre estudios en las tasas de calentamiento, en el punto final subletal seleccionado, y en el nivel de aclimatación. Estas disparidades metodológicas pueden incrementar la variabilidad y el error en las comparaciones (Terblanche et al., 2011; Rezende & Santos, 2012). Examen de los rangos de tolerancia en comunidades de anfibios templadas y tropicales. Hipótesis de Janzen. En este trabajo (L.m. gutiérrez-Pesquera, m. Tejedo, H. Duarte, m. Solé, A.g. Nicieza, datos no publicados) se han determinado los rangos de tolerancia térmica en larvas de anfibios pertenecientes a dos comunidades, una tropical, situada en el estado de Bahía en Brasil, y una comunidad templada, en la Península Ibérica, que presentan temperaturas ambientales muy divergentes (Figura 2). Para ello, se colectaron larvas de distintas especies directamente en las charcas, siendo trasladadas a los laboratorios de referencia en la universidade Estadual de Santa CruzuESC, Ilhéus, Bahía, Brasil y en la EBDCSIC, Sevilla, España. Las larvas de todas las especies fueron aclimatadas durante tres días a una temperatura uniforme de 20ºC, fotoperíodo 12 L: 12 O y comida ad libitum. Los rangos de tolerancia térmica de cada especie se obtuvieron mediante las estimas, tanto de CTmax como de CTmin, mediante el método dinámico de Hutchison (Hutchison, 1961; Lutterschmidt & Hutchison, 1997). Cada individuo era colocado en un recipiente plástico (0,1 L), a su vez introducido en un baño Huber K15-cc-NR, que producía un calentamiento / enfriamiento gradual a una tasa constante (0,25ºC min-1), hasta que se alcanzaba un punto final previo a la muerte, que consistía en la total inmovilidad del renacuajo y su incapacidad de responder a 10 estímuFigura 2. Perfil térmico de una charca en un ambiente tropical, localizada dentro del bosque de la mata Atlántica, Bahía, Brasil, y una charca temporal soleada situada en Córdoba, España. Se puede apreciar la escasa variación diaria y la casi nula variación estacional en la temperatura de la charca de ambiente tropical, comparada con la charca de ambiente templado. Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) 8 los táctiles consecutivos. una vez que el individuo alcanzaba este punto final, la temperatura del agua circundante era tomada con un termómetro de lectura rápida (miller & Weber, Inc) con una precisión de ± 0,1ºC, tras lo cual el renacuajo era sumergido en agua a 20ºC, para facilitar su reanimación, midiendo su peso húmedo y estimando su estadio de desarrollo (gosner, 1960). Los renacuajos que no conseguían reanimarse eran descartados del análisis. Los resultados confirman la hipótesis de Janzen (1967): el rango de tolerancia muestra una correlación positiva con la latitud, una vez corregida la regresión por la filogenia. Las especies tropicales situadas a baja latitud tienen un menor rango de tolerancia térmica que las especies templadas (Figura 3). Esta diferenciación en los rangos térmicos se debe, principalmente, a que las especies de anfibios de latitudes altas disminuyen sus valores de CTmin con respecto a las especies tropicales, en una proporción mayor que el cambio producido en los valores de CTmax. Esto se demuestra estadísticamente por la heterogeneidad de pendientes entre la latitud y los dos límites de tolerancia (ANCOVA: CTm [min / max] x Latitud, P< 0,01). II. medición de los límites de tolerancia térmica. Realismo en las medidas. Efecto de las tasas de calentamiento El estudio de los fundamentos fisiológicos e implicaciones ecológicas de los límites de tolerancia son aspectos cruciales, tanto en biología evolutiva para conocer la evolución adaptativa de los mismos, como en biología de la conservación, o como se ha definido recientemente, fisiología de la conservación, para que estas estimas de tolerancia sean lo suficientemente realistas y permitan establecer una valoración de vulnerabilidad ecológica frente a los impactos del cambio climático (Seebacher & Franklin, 2012 y demás contribuciones en Conservation physiology: integrating physiological mechanisms with ecology and evolution to predict responses of organisms to environmental change, Philosophical Transactions of the Royal Society B, 367 (1596), 2012). La mayor parte de los organismos ectotérmicos están sujetos a fluctuaciones diarias en la temperatura que se producen de manera gradual en su ambiente natural (Sinclair, 2001). Sin embargo, muchos estudios de fisiología comparada, cuyo objetivo pasa por buscar patrones y mecanismos subyacentes en la respuesta fisiológica y su evolución, tradicionalmente han venido empleando metodologías muy estandarizadas pero que adolecen de un bajo nivel de realismo. Los métodos más empleados son dos: (1) cambios abruptos Figura 3. Examen de la hipótesis de Janzen (1967) en comunidades de larvas de anfibios tropicales (Bahía, Brasil, triángulos) y templados (España, círculos). Los rangos de tolerancia térmica en especies templadas, con mayor variabilidad en las temperaturas ambientales, son mayores que los rangos observados en especies tropicales. Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) 9 desde la temperatura de aclimatación en la que se encuentra el organismo, a la temperatura de estrés experimental, que se mantiene constante, midiéndose el tiempo hasta la muerte o manteniendo esta temperatura constante en un rango de tiempos crecientes (LT50) (método estático), o (2) incrementando / descendiendo experimentalmente esta temperatura hasta que se alcanza un punto final, como inmovilidad, pérdida de equilibrio o aparición de espasmos musculares (el método dinámico, CTmax ó CTmin, Lutterschmidt & Hutchison, 1997). Este valor de CTmax (y por analogía CTmin) fue definido operativamente por Cowles & Bogert (1944) como la temperatura en la cual el organismo presenta una actividad locomotora desorganizada perdiendo la habilidad de escapar de esta situación, que en condiciones naturales le llevaría inmediatamente a la muerte (Figura 1). Por otro lado, la tasa experimental de cambio en la temperatura en el método dinámico, se suele ajustar en valores muy rápidos (e.g., 1ºC min-1) que, en cierto sentido, se justifican para evitar introducir sesgos en las estimas con procesos compensatorios de aclimatación rápida (“hardening”) que produzcan valores de CTmax ó CTmin sobreo subestimados, respectivamente (Lutterschmidt & Hutchison, 1997). El empleo de tasas de calentamiento lentas (por motivos de brevedad, de aquí en adelante, sólo trataremos el proceso de calentamiento que resulta equivalente en argumentación al proceso de enfriamiento) tiene la ventaja de que puede simular un escenario natural de incremento diario de temperatura y, por tanto, estas estimas experimentales podrían ser generalizadas en un contexto más ecológico (Terblanche et al., 2011). Sin embargo, este método no resulta ajeno a dificultades de interpretación. un calentamiento lento lleva asociado, ineludiblemente, una mayor duración de estos ensayos, lo que puede provocar efectos colaterales que inducirían respuestas muy heterogéneas en las estimas de tolerancia. En primer lugar, exposiciones más prolongadas al calor pueden acumular estrés térmico directo y otros elementos de estrés indirectos, como un aumento en la deshidratación y una disminución en el nivel de recursos, que simultáneamente pueden reducir el CTmax y, por tanto, la respuesta de tolerancia sería una subestima del CTmax verdadero. En segundo lugar, un experimento de calentamiento largo puede, al mismo tiempo, inducir en el organismo respuestas compensatorias de aclimatación rápida que, contrariamente al proceso anterior, implicarían un aumento en la tolerancia (Rezende et al., 2011; Santos et al., 2011; Overgaard et al., 2012). Estos dos procesos concurrentes y de efectos contrapuestos podrían explicar el rango de plasticidades en las estimas de termo-tolerancia que se ha observado en diferentes estudios. Calentamientos lentos, y ecológicamente más realistas, determinan una depresión en los valores de tolerancia en algunas especies de peces (Becker & genoway, 1979), insectos, (Terblanche et al., 2007; Chown et al., 2009; mitchell & Hoffmann, 2010; Allen et al., 2012; Ribeiro et al., 2012), e invertebrados marinos, tanto tropicales (Nguyen et al., 2011) como antárticos (Peck et al., 2009); mientras que una respuesta contraria, de aclimatación beneficiosa, incrementa el valor de CTmax en algunas especies de peces tropicales (Chung, 1997; mora & maya, 2006) e insectos (Nyamukondiwa & Terblanche, 2010; Chidawanyika & Terblanche, 2011; Allen et al., 2012). Si esta heterogeneidad en la respuesta de tolerancia responde a variaciones adaptativas, los estudios interespecíficos de las tolerancias deben de considerar este aspecto y, según la cuestión que nos interese, se debe decidir por Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) 10 un protocolo de tasas de calentamiento rápido, que evite estos efectos distorsionadores, más idóneo en análisis comparativos (Lutterschmidt & Hutchison, 1997; mora & maya, 2006) o, por el contrario, nos puede interesar emplear una tasa realista que incorpore estos efectos con el fin de realizar inferencias sobre el efecto real del calentamiento global sobre los organismos. Por otro lado, la posibilidad de cruzar métodos y aproximaciones entre distintos estudios y poder, de este modo, comparar especies o tratamientos sometidos a protocolos independientes, requiere cuantificar la precisión de las medidas de tolerancia térmica, tanto en sus componentes de validez, es decir, que protocolos independientes midan el mismo carácter (Hoffmann et al., 1997; Loeschcke & Hoffmann, 2007; Sgrò et al., 2010; Santos et al., 2011; Terblanche et al., 2011; Rezende & Santos, 2012), y como de fiabilidad, o error de medida asociado a una repetibilidad o correlación intra-clase < 1 (Rezende & Santos, 2012; Castañeda et al., 2012). Estos argumentos representan un importante motivo de preocupación que hasta la fecha ha sido prácticamente obviado (Terblanche et al., 2011; Rezende & Santos, 2012). Parece necesario que las estimas de tolerancia térmica se hagan, por tanto, lo más estandarizadas posibles, empleando el mismo protocolo de aclimatación previa (Brattstrom, 1968), idénticas temperaturas iniciales y de tasas de calentamiento (Terblanche et al., 2007; Rezende et al., 2011), idéntico punto final en la estima (Lutterschmidt & Hutchison, 1997), similares estadios de desarrollo (Sherman, 1980), e incluso fotoperíodo y hora del día (mahoney & Hutchison, 1969), factores que se ha demostrado que pueden producir alteraciones en las estimas de tolerancias térmicas máximas y por extensión a las estimas de temperaturas de tolerancias mínimas (Terblanche et al., 2007). Experimentos de tolerancia térmica en anfibios a distintas tasas de calentamiento. En el primer experimento (m. Tejedo, H. Duarte, m. Simon, m. Katzenberger, C.A. Navas, datos no publicados) examinamos el potencial de plasticidad en los valores de CTmax en renacuajos de Hyla meridionalis. Elegimos la fase larvaria acuática por varias razones: el medio acuático es más fácil de controlar de manera experimental, por el alto calor específico y mayor conductividad del agua, lo que determina una mayor homogeneidad en su variación térmica. Esta variabilidad puede ser fácilmente medida, tanto en laboratorio como en campo, mediante el uso de registradores continuos (“dataloggers”). Por otro lado, los anfibios durante su fase larvaria se reproducen principalmente en charcas temporales que pueden alcanzar temperaturas elevadas o incluso, a veces, sufrir congelación parcial o total, lo cual supone que las larvas han de enfrentarse a condiciones extremas que la fase terrestre adulta puede, en cierto modo, evitar, mediante la selección activa de micro-hábitats, hábitos nocturnos o incluso permanecer inactivos durante estos periodos de estrés térmico. Las larvas fueron colectadas directamente en el campo, siendo trasladadas al laboratorio de cámaras climáticas de la EBD-CSIC y mantenidas en condiciones controladas de temperatura, fotoperiodo 12 L: 12 O y comida ad libitum. Los valores de CTmax fueron estimados mediante el método dinámico de Hutchison (véase apartado I). El diseño del experimento fue de doble vía con dos factores: a) Tasa de calentamiento, con tres niveles: 1,0ºC min-1, 0,05ºC min-1, y 0,03ºC min-1; y temperatura inicial del experimento a 20ºC. La primera tasa corresponde a un calentamiento rápido, donde el CTmax se alcanzaría en menos de 20 Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) 17 Figura 9. Relación entre la tolerancia térmica (CTmax) y la temperatura máxima (Tmax) de las charcas de reproducción para 47 especies de larvas de anfibios, pertenecientes a comunidades subtropicales de ambiente cálido de gran Chaco (rótulos azules) y frescos de bosque Atlántico (morados), y comunidades templadas de la Península Ibérica (rojos) y Suecia (verdes). La regresión filogenética (PgLS) muestra una relación significativa, con una pendiente de 0,18. La línea de igualdad (Tmax = CTmax) representa un umbral letal, la proximidad de cada especie a esta línea permite estimar su riesgo de muerte por causa de estrés térmico agudo, bajo las condiciones contemporáneas de su hábitat (modificado de Duarte et al., 2012). 0,70, bivalvos [Compton et al., 2007]; 0,51, lagartos Phrynosomatidae [Sinervo et al., 2010]; 0,18, larvas de anfibios [Duarte et al., 2012]; véase Figura 9). La interpretación de estos resultados puede resumirse de este modo: una subida en la temperatura ambiental de 1,0ºC supondría un incremento en el CTmax de sólo 0,5ºC en promedio entre taxones. Esto implica una limitación en la evolución fisiológica de las tolerancias que presenta una tasa de evolución media de sólo un 50% con respecto al incremento en la Tmax ambiental. En el caso de los anfibios durante su etapa acuática, este desfase evolutivo es aún mucho más drástico (sólo un 20% del incremento en Tmax ). Como consecuencia, podríamos generalizar que dentro de las especies y comunidades de organismos ectotérmicos que, a priori, podrían sufrir mayores impactos por el calentamiento, estarían, entre otras, las especies que habitan en este momento micro-hábitats cálidos, ya que muy probablemente sus valores de tolerancia máxima fisiológica no estarán muy por encima de las temperaturas máximas de sus hábitats. Sin embargo, dada la enorme diversidad de micro-hábitats térmicos y las capacidades compensatorias de los organismos, como la aclimatación y la inercia comportamental (Bogert, 1949; Huey et al., 2003), el poder de esta generalización puede quedar reducido. Es por ello, que creemos necesario hacer una estimación exhaustiva tanto de los valores de CTmax como de las Tmax , en grupos taxonómicos sensibles como en sus microambientes térmicos. Hasta la fecha existe muy poca información que aúne las informaciones fisiológicas de los organismos con las temperaturas reales a las que estos se ven expuestos. En la mayoría de ocasiones, la información ambiental se infiere de modo indirecto a partir de bases de datos climáticas como WorldClim (Hijmans et al., 2005) que no recogen la información micro-climática. A pesar de estas deficiencias, los resultados están confirmando que las comunidades más vulnerables se sitúan en ambientes tropicales. Es el caso para varios grupos de ectotermos terrestres: insectos pertenecientes a diversos órdenes (Deutsch et al., 2008), hormigas (Diamond et al., 2012b) y lagartos de bosques tropicales (Huey et al., 2009). Sin embargo, otros análisis en reptiles parecen mostrar mayor vulnerabilidad en comunidades situadas en latitudes medias (Clusella-Trullas et al., 2011). En organismos ectotérmicos marinos, las comunidades con mayor riesgo de sufrir choques térmicos son, igualmente, las comunidades tropicales, tanto en cangrejos mareales del género Petrolisthes (Stillman & Somero, 2000) como en moluscos bivalvos (Compton et al., 2007). Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) 18 Vulnerabilidad al estrés térmico en comunidades de larvas de anfibios subtropicales y templados. Efecto del microambiente (Duarte et al., 2012). La predicción fundamental de este estudio es que las especies subtropicales serían más susceptibles a sufrir estrés térmico agudo y, por tanto, a la extinción inducida por el calentamiento global, que las especies templadas, ya que sus valores de CTmax serían sólo ligeramente superiores a los valores de Tmax de las charcas que habitan. Por otro lado, las variaciones térmicas micro-ambientales podrían ser decisivas en la determinación del nivel de vulnerabilidad. El examen de estas predicciones se realizó en 47 especies de anfibios, durante su etapa larvaria, pertenecientes a tres comunidades: dos comunidades subtropicales del norte de Argentina, con ambientes térmicos muy contrastados (Figura 10): la comunidad del gran Chaco, donde los ambientes larvarios son charcas temporales de bosque abierto y muy soleadas, con temperaturas diarias muy variables y Tmax muy altas que oscilan entre 34,2ºC y 41,4ºC, y la comunidad del bosque Atlántico de la provincia de misiones, que se reproducen en charcas y arroyos dentro del bosque, con pocas oscilaciones diarias y temperaturas máximas que oscilan entre 21,3ºC y 30,4ºC. Igualmente, se examinó una comunidad templada en Europa (Península Ibérica y Suecia) que incluía especies con reproducción invernal, (sur de la Península Ibérica), y especies con reproducción a principios de verano, (Suecia y montañas ibéricas). Los rangos de temperatura máxima oscilan entre 18,8ºC y 35,5ºC. Los valores de CTmax se Foto m. Tejedo Foto m. Tejedo Figura 10. Perfiles térmicos de dos micro-ambientes acuáticos del norte de Argentina. Paneles a la izquierda, bosque abierto del gran Chaco (Teniente Fraga, provincia de Formosa, 23°45'36.33"S / 62°08'6.62"W, 28 Nov 2009 ‐ 10 Feb 2010), y del bosque Atlántico (paneles a la derecha), charcas del bosque Atlántico (Cuña Pirú, provincia de misiones: 27°03'37.94"S / 54° 49' 39.82" W; 6 Dic 2009 ‐ 15 Ene 2010). obtuvieron, para todas las especies de las distintas comunidades, siguiendo el método dinámico de Hutchison, a una tasa de calentamiento de 1ºC min-1 y cuatro días de aclimatación a 20ºC, en los distintos laboratorios de referencia (Argentina, CECOAL - CONICET, Corrientes 2009, FCEQyN - uNam, Posadas, 2010; España, EBD-CSIC, Sevilla 2009; Suecia, EBC, universidad de uppsala, 2009). Al mismo tiempo, se consiguieron los perfiles térmicos y las Tmax de un total de 34 charcas y arroyos. Los resultados revelaron que los valores de CTmax de las especies de la comunidad de charcas de elevada temperatura del gran Chaco fueron claramente superiores, tanto a los de la comunidad templada, como a los de la comunidad subtropical de bosque atlántico (Figura 9). Paradójicamente, esta comunidad mostró la menor tolerancia al calentamiento (TC) (TC = CTmax - Tmax, sensu Deutsch et al. [2008]; Figura 11). Este resultado sugiere que la subida esperada en las Tmax de las charcas del gran Chaco pronto superarán los valores de CTmax de las especies de esta comunidad y, por tanto, estas especies serán más susceptibles de sufrir futuras extinciones locales debido al incremento en el nivel de exposición a episodios de estrés térmico agudo. Las especies del bosque atlántico presentan mayores TCs, al estar protegidas por el dosel forestal, y, por tanto, estarían relativamente protegidas ante el calentamiento global. Finalmente, las especies templadas estarían relativamente seguras de los impactos térmicos, excepto aquellas especies poco tolerantes Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) 19 Figura 11. Valores de tolerancia al calentamiento (“Warning Tolerance” = CTmax - Tmax, sensu Deutsch et al. [2008]) para 47 especies de larvas de anfibios pertenecientes a dos comunidades subtropicales de ambiente cálido de gran Chaco (“Subtropical Warm”) y frescos de bosque Atlántico (“Subtropical Cool”), y una comunidad templada de Europa (“Temperate”). La línea roja muestra los valores de tolerancia al calentamiento, si suponemos un incremento de 3,0ºC por el calentamiento global. Aquellas especies que queden por debajo de la línea sufrirían extinciones por estrés térmico intenso. Las flechas verdes y las dobles líneas moradas, indican el nivel de riesgo corregido una vez que se incluyen mecanismos fisiológicos de mitigación como aclimatación a corto y medio plazo (ver apartados II y IIIa) (modificado de Duarte et al., 2012). Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) 20 y de reproducción tardía (e.g., P. ibericus, P. waltl, P. cultripes) que pueden sufrir estrés térmico en las décadas venideras. Los resultados obtenidos confirman la hipótesis de que las comunidades de organismos ectotérmicos que están sometidas a altas temperaturas ambientales son más susceptibles de recibir impactos por el calentamiento global. Por extensión, podríamos considerar que otras comunidades de anfibios tropicales y subtropicales, que se reproducen en verano, en charcas soleadas y en biomas no forestales (e.g., formaciones de Cerrado, Caatinga y Llanos en Sudamérica, sabanas tropicales y subtropicales de Australia, sabanas tropicales del centro, sur y oeste de áfrica e India), podrían sufrir niveles similares de estrés térmico. Por otro lado, se confirma la predicción de que la variación en el micro-hábitat térmico resulta determinante en la vulnerabilidad a sufrir estrés por el calentamiento en comunidades geográficamente próximas. Este último resultado es destacable desde el momento en el que el 72% de todas las especies de anfibios conocidas viven en bosques tropicales, tanto montanos como de llanura (Chanson et al., 2008). El dosel forestal protege térmicamente los ambientes acuáticos donde se desarrollan las larvas y posiblemente también los huevos y embriones terrestres de especies con desarrollo directo. La deforestación intensa de los bosques tropicales puede determinar la pérdida de esta protección con la consiguiente disminución de humedad relativa y subida de temperaturas en charcas, arroyos y suelo del bosque (Ernst & Rödel, 2005; meegaskumbura et al., 2012), lo que puede promover extinciones locales de aquellas especies con menor tolerancia térmica. Nuestros análisis en el bosque atlántico de misiones muestran que las temperaturas de charcas y arroyos deforestados sufren un incremento notable, tanto en la variabilidad diaria, como en los valores máximos de sus temperaturas, que llegan a sobrepasar los límites de tolerancia de dos especies ligadas al bosque (C. schmidti e H. curupi, Figura 12). Estos cambios en las temperaturas, por causa directa de la deforestación de origen antrópico, podrían ser una de las causas de la disminución observada en la riqueza de especies con reproducción acuática en fragmentos de mata Atlántica del SE de Brasil (Becker et al., 2007, 2009). El valor promedio de TC para la comunidad del gran Chaco (3,5ºC), es claramente insuficiente para evitar el riesgo de extinción de muchas de las poblaciones de esta comunidad de anfibios, ya que no supera el incremento en las temperaturas medias y la intensificación de olas de calor esperado en esta área geográfica (Burgos & Fuenzalida-Ponce, 1991; IPCC, 2007; Battisti & Naylor, 2009). Sin embargo, existen mecanismos biológicos de remediación que pueden minimizar la vulnerabilidad extrema de esta comunidad. Si tenemos en cuenta que los anfibios presentan un escaso nivel de movilidad y dispersión (véase no obstante, Funk et al., 2004; Phillips et al., 2006), los mecanismos que probablemente pueden compensar los efectos del calentamiento global variarán según la intensidad y la temporalidad de este calentamiento (véase Figura 7 en Huey et al., 2012). En las etapas iniciales del proceso, cuando el nivel de calentamiento es bajo, la compensación a través de mecanismos de termorregulación, (el efecto Bogert de inercia comportamental; Bogert, 1949; Huey et al., 2003; marais & Chown, 2008) y la aclimatación fisiológica serían la respuestas más rápidas. Los renacuajos, aunque pueden termorregular de manera efectiva (Hutchison & Dupré, 1992), difícilmente pueden hacerlo cuando las temperaturas de las charcas alcanzan temperaturas elevadas, al no existir apenas estratificación, sobre todo en charcas temporales de poca profundidad y expuestas al sol. Si la temperatura Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) 21 ambiental sigue aumentando y se superan los límites que permiten estos mecanismos plásticos, la compensación se tiene que sustentar en una respuesta evolutiva mediante cambios genéticos compensatorios. Las pruebas empíricas parecen mostrar dificultades en las poblaciones naturales para adaptarse rápidamente al cambio climático, debido a una baja heredabilidad en las tolerancias (Kellerman et al., 2009), interacciones genéticas entre caracteres y, finalmente, a variaciones en la dirección de la selección (Hoffmann & Sgrò, 2011). Además, los anfibios son organismos con un tiempo de generación relativamente largo, con lo cual las respuestas evolutivas rápidas, como mecanismo compensatorio al cambio climático, pueden ser poco eficaces. un mecanismo compensatorio alternativo sería un cambio fenológico en la reproducción que eludiera los episodios de calentamiento intenso. Los cambios en las fechas de reproducción son factibles en anfibios (Beebee, 1995) y serían una posibilidad de evitar estrés térmico en aquellas especies templadas que sufren temperaturas altas sólo al final de la estación, pero no así en las especies tropicales y subtropicales como las del gran Chaco donde los picos de altas temperaturas pueden ocurrir de manera errática y no predecible (apartado II, Figura 6). En resumen, pensamos que el mecanismo de mitigación real más efectivo para esta comunidad sería el de aclimatación fisiológica descrito previamente (apartados II y IIIa). En este caso, las especies vulnerables de la comunidad del gran Chaco pueden tener una ligera respuesta compensatoria, tanto por aclimatación a medio plazo (días) como a corto plazo (horas), que puede incrementar su CTmax como máximo Figura 12. Comparación de los perfiles térmicos de charcas y arroyos del bosque Atlántico de la provincia de misiones, NE de Argentina. En el panel superior aparece un arroyo con la cubierta forestal intacta, mientras que en los paneles central e inferior aparecen los perfiles de temperatura para un arroyo y charca deforestados, respectivamente. Las líneas discontinuas son los valores de CTmax para dos especies de la comunidad, C. schmidti e H. curupi. Se puede apreciar que las temperaturas de los dos micro-ambientes deforestados sufren un incremento notable, tanto en la variabilidad diaria como en los valores máximos, con respecto al arroyo intacto, llegando incluso a superar los valores de tolerancia de estas especies. Hypsiboas curupi Crossodactylus schmidthii Foto D. Baldo Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) 22 unos 2 - 3ºC (ver apartados II y IIIa, Fig. 5 y 7). Por tanto, estas especies podrían tener cierto nivel de seguridad aumentando su tolerancia al calentamiento (Figura 11), aunque no podemos descartar un riesgo significativo de sufrir estrés térmico agudo, especialmente ante episodios extremos de olas de calor. En el caso de las especies templadas esta subida global en CTmax sería inferior ya que los valores de CTmax estimados a tasa rápida están sobrevalorados entre 0ºC y 1,4ºC (Fig. 4 y 5) lo cual determina una compensación inferior a las especies tropicales, lo cual puede determinar que algunas especies templadas poco tolerantes puedan sufrir igualmente estrés térmico en las próximas décadas. C CONCLuSIONES ONCLuSIONES El análisis de parámetros fisiológicos como las tolerancias térmicas resulta fundamental tanto para el examen de numerosas hipótesis biogeográficas como para conseguir estimas realistas de la vulnerabilidad de los organismos ectotérmicos al calentamiento global. En este estudio hemos examinado, en primer lugar, la hipótesis de Janzen aplicada a larvas de anfibios, demostrando que en una comunidad tropical los rangos de tolerancia son más estrechos que en una comunidad templada, gravitando estas diferencias en una mayor tolerancia a temperaturas bajas de las especies de climas templados, cuyas temperaturas mínimas ambientales varían de manera estacional. En segundo lugar, hemos examinado la hipótesis de una mayor vulnerabilidad de los anfibios tropicales a sufrir los efectos del calentamiento global. Nuestros resultados sugieren que las comunidades de larvas de anfibios subtropicales que se reproducen en ambientes de altas temperaturas, presentan, como predice la hipótesis, una mayor vulnerabilidad a sufrir estrés térmico agudo, a pesar de presentar mayores valores de tolerancia térmica, y un mayor nivel de compensación por aclimatación rápida. Igualmente, descubrimos que la variación en los micro-ambientes térmicos son fundamentales en estas estimas de vulnerabilidad, que, asimismo, pueden alterarse por acción directa del hombre (e.g., deforestación de los bosques tropicales). Proponemos un mayor estímulo en los estudios de fisiología térmica en dos áreas principales. Primero, en el ámbito de la biología de la conservación para promover tanto modelos bioclimáticos mecanicistas, que proporcionen estimas de vulnerabilidad más realistas, como un conocimiento más profundo de los impactos globales sobre la comunidad e implicaciones asociadas a sinergias con contaminantes como, por ejemplo, la disminución observada en la tolerancia térmica (CTmax ) en renacuajos de Bufo calamita tratados con el pesticida glifosato, (C. Cabido, I. garin, x. Rubio, m. Tejedo, datos no publicados). un segundo ámbito de impulso sería en los estudios biogeográficos, en particular en el análisis de los fundamentos fisiológicos del origen y mantenimiento de la extraordinaria biodiversidad existente en las montañas tropicales. A AgRADECImIENTOS gRADECImIENTOS: :Numerosas personas han ayudado de manera decisiva en este proyecto, tanto en el trabajo de campo como en el soporte logístico. mostramos un especial reconocimiento a: J.L. Acosta, D. Baldo, R. Cajade, m. Duré, m. garcía, A.I. Kehr, D. martí, Lety monzón, J.J. Neiff, N. Oromí, R. Reques y E. Shaefer en CECOALCONICET, uNNE y FCEQyN-uNam//CONICET (Argentina); D. álvarez, m. Benítez, J. Bosch, C. Cabido, m. Chirosa, J. Díaz, D. Donaire, A. Egea, I. garin, I. gómez-mestre, D. Kulkarni, C. maldonado, R. Reques, x. Rubio, S. Tripodi y E. Valdés (España); A. Laurila, g. Orizaola y B. Rogell (EBC, uppsala university, Suecia); W. Brogan, J. Hammond, J. Hua y A. Stoler (PLE, university Pittsburgh); I. Ribeiro, A. Santiago y E. Valdés (uESC, Ilhéus, Brasil). gracias en especial a Z.P. Sousa do Amaral Bol. Asoc. Herpetol. Esp. (2012) 23(2) 23 R REFERENCIAS EFERENCIAS Abe, A.S. & Neto, J.R. 1991. Tolerance to high temperatures in tadpoles of Leptodactylus fuscus and Hyla fuscovaria in temporary ponds (Amphibia, Leptodactylidae, Hylidae). Zoologischer Anzeiger, 226: 280-284. Addo-Bediako, A., Chown, S.L. & gaston, K.J. 2000. Thermal tolerance, climatic variability and latitude. Proceedings of the Royal Society, London B, 267: 739–745. Allen, J.L., Clusella-Trullas, S. & Chown, S.L. 2012. The effects of acclimation and rates of temperature change on critical thermal limits in Tenebrio molitor (Tenebrionidae) and Cyrtobagous salviniae (Curculionidae). Journal of Insect Physiology, 58: 669-678. Andrewartha, H.g. & Birch, L.C. 1954. The distribution and abundance of animals. university of Chicago Press. Chicago. Angilletta, m.J., Jr. 2009. 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Todas las especies fueron muestreadas y analizadas experimentalmente con los permisos del ministerio de Ecología de la provincia de misiones (Argentina); Consejería de medio Ambiente de la Junta de Andalucía y Consejería de medio Ambiente del Principado de Asturias (España); Länsstyrelsen uppsala Län (Suecia); “use of Laboratory Animals in Research and Education, university of Pittsburgh (Estados unidos). Este proyecto ha sido financiado por la Agencia Española de Cooperación y Desarrollo (AECID), ayudas A/016892/08, A/023032/09, AP/038788/11 y por el proyecto CgL2009-12767-C02-02 del ministerio de Ciencia e Innovación a mT y CgL200804814C02-02 a JFB. ARB fue financiado por una beca postdoctoral del ministerio de Educación y Cultura de España (mEC2007-0944), LmgP fue financiado por una beca FPI BES-2010-032912 del ministerio de Economía y Competitividad y mK por una beca de la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), SFRH/BD/60271/2009. Agradecemos finalmente las sugerencias y comentarios sobre el ms del editor, un revisor y m. Piñero. Cavicchi, S., guerra, D., La Torre, V. & Huey, R.B. 1995. Chromosomal analysis of heatshock tolerance in Drosophila melanogaster evolving at different temperatures in the laboratory. Evolution, 49: 676–684. Chanson, J.S., Hoffmannn, m., Cox, N.A. & Stuart, S.N. 2008. The state of the world’s amphibians. 33-44. In: Stuart, S.N., Hoffmannn, m., Chanson, J.S., Cox, N.A., Berridge, R.J., Ramani, P & young, B.E. (eds.), Threatened amphibians of the world. Lynx editions. Barcelona. Chidawanyika, F. & Terblanche, J.S. 2011. Rapid thermal responses and thermal tolerance in adult codling moth Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae). Journal of Insect Physiology, 57: 108-117. Chown, S.L. & gaston, K.J. 1999. Exploring links between physiology and ecology at macro‐scales: the role of respiratory metabolism in insects. Biological Reviews, 74: 7–120. 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