Estimación del nivel de diferenciación genética de la raza merina mediante ADN Microsatélite

_ ~ feagas asociaciones Azor, P. J. I; Malina, A. l; Barajas, f.2; Arranz, J. ', 3; Valera, M,J: Rodero, A. l; Miguelez, J. J.2 /. OpIO. de Cené/ie,l. Universidad de Córdob.l. E-mail:[email protected] 2. Asociación N,lcion,l/ de Cri.ldores de e,lOado Merino. M,ldrid E-mail: florenciobv tP razilmerina.com 3 OpIO. de Producción Anima/l. Facultad de Veterinaria. Universidad de Lron. 4 Opto. de Cíenci ,lS Agro(orestales. Universidad de Sevilla. Asoc i ació n N acion al de Cri a dor es de Ganado Merino Estimación del nivel de diferenciación genética de la raza merina mediante ADN Microsatélite I NTRODUCClON El tronco Me rino es el más import an te del mundo en función del número de animal es y razas que comprende. El papel jugado por España en la difusión y desarrollo de este tronco en el mundo hacen que en nuestro país, cuna del Merino, esta raza t enga un significado especial tanto por razones históricas y económicas como por repre senta r la reserva genética más an tigua. Según Esteban y tejan (1980) la raza Me rina tiene su origen en el Ovis aries vignei pero la teoria más reciente asigna como re pr ese nt an te ancestral del tronco Meri no al Ovis afies turdetanus ( Esteban, 2004) y de ella se ha n or iginado las principales poblaciones de ovinos que existen en la actualid ad en los cinco continentes. Tuvo su origen geográfico en el tercio meridional de la pen ínsu la Ibérica en época an terior a la era cristiana, atribuyéndose a los pueblos tartesos y turdetanos (1000 a 200 a. C ) el inicio de la fase selectiva o de asentamiento de la raza en las cuencas del Guadiana y de! Guadalquivir. Originariamente se seleccionó para la producción lanera obte· niéndose las mejores lanas del mundo aunque actualmente debido a la caída de los pr ec i os de la lana de la década de los 70 se está seleccionando para la producción de carne. También existen ciert os rebaños en los que se aprovecha la leche para la elaboración de quesos art esanales de elevada calidad. Posteriormente se atribuye a 105 romanos la realización de cruzamient os con moruecos foráneos, con el objetivo de blanquear los vellones, pues, en origen, la raza Merina era pigmentada, existiendo constancia de la existencia de rebaños de Me rino Negro primitivo ( Fue n tes, 2000 ). Hemos analizado la raza Merina, precursor de Jos ovinos precoces como el Fleischachf (Merino Alemán) o el Merino Precoz que también se ha n analizado, la raza 92 FE DER AC ION ESPA N OlFI DE ASOC IAC I ONES DE GA N RDO SEl ECT O fr an cesa IIc de Francc, y tr es ra zas del sur de Es p aña que se encuentran catalogadas en peligro de ex t inció n: Churra Lebrijana, Montesina y Merino de Gr aza lem a. El objetivo de este tr aba jo es determinar el nivel de variabilidad genética que existe principalmente en la raza Merina, además de analizar su es tructura poblacional y determinar las relaciones ge néti cas existentes con ot ras ra zas utilizando marcadores de AON MATERIAL Y MÉTODOS Obtención de mu estras El número de animales que se han analizado ha sido 255 de la raza Me rino Autóctono Español ( ME ), 22 Merino Español Negro (MN ), 1 S Fl eischachf (F) 1 S Churra Leb rij ana ( CL ), 19 Merino de Grazalema( MG ), 25 Me rino Pre coz (MP ), 25 !le de France (IF) y 30 Montesina (M) (tabla 1) Las mu est r as de sang re fueron tomadas a animales de diferentes se x os en va rios re banos de España. El ONA se ha ex traído de sang re utiliz an do el método Tabla 1. Otras razas analizadas MERINO AUTÓCTONO E SPANO L 255 CHURRA LEBRIJANA 15 FLEISCHACHF 15 ILE DE FRANC E 25 MERINO DE GRAZALEMA 19 MERINO PRECOZ 25 MONTESINA 30 NSalting Out " (Millcr et aL , 1988) o utilizando CHElEX 1 00 resin según dt-scribió Walsh et al (1991) añadiéndole proteinasa K. Mar ca dor es de ADN Hemos utilizado 33 marcadores microsatélites de ADN: BM2S04, 60\1\6526 , 8M8125, 8MS1948, 60\1\S2626 , BMS356, 8MS522, 8MS975, CSRD2111 , CSRD263, CSSMOO8 , CSSMOI5, CSSMJ1 , CSSM4 1, CSSM43, FAS , HMHIR, IlSTS005, ILSTSOII , INRA026, LSCV29, MCM1, MCM26, MCM527, MCM53, OARCP49, OARKP6, RBP3 , RMOO6, SP S1 15, TGLA429, TGLA53, que hemos se leccion ado en base a las recomendaciones de la fAO (Grupo de Trabajo de la FAO , 1993 ). Esta ha realizado una selección de microsatélites (Crawford, 2000 ) recomendados para la caracterización del ovino en base a estudios anteriores en los que han demostrado su fiabilidad, un número de alelos elevados, su adecuación para ser analizados en un secuenciador automático o para la amplificación en múltiplex, una distancia entre marcado res elevada (estar en diferentes cromosomas o en todo caso presentar una distancia entre marcadores superior a los 50 cM para evitar ineficiencia por ligamient o) y su distribución a lo largo de todo el gcnoma. A esto hemos añadido otros marcadores que aparecen con frecuencia publicados para la caracterización de razas ovinas. La amplificación del ADN la hemos llevado a cabo en PCR en un Gcneamp 9600 (Pelkin Elmer, Foster City, CA ). Los productos de la PCR se analizaroo en el secuenciador automático ABI PR1SM 377 (Applied Biosystems ). Análisis estadístico Los estadisticos-F (Wright, 1 965 , 1978 ), F I\I FSf Y F rs (basados en un infinito modelo de mutación ( IAM)) fu eron estimados en la forma de F, e y f, es timadores respectivos de esos parámetros propuestos por Weir and Cockerham (1984 ). De la misma forma hemos c alculado el Coeficiente de Diferenóaóón Genélica (Gst ) (Nei, 1973, 1977 ). Este parámetro fue propuesto por Nei para analizar la subdivisión de poblaciones. rara su cálculo no es necesario conocer las frecuencias genotípicas ya que se utilizan solamente la s frecuencias alélicas en términos de Hctcrocigosidades esperadas dentro y entre poblaciones, es d ec ir, no se tiene en cuen ta la distribución de frecuencias genotípicas dentro de una población sino la va ria ción genómica intra e intra poblacional (Nei, 1987). Tiene la ventaja de que no está influen ci ado por el número de alelos por locus, ni por el modelo de evolución (diseñado tCfliendo en cuenta la mutación, selección y migración ). rara el estudio de asociación entre las diferentes sub· poblaciones analizadas y la distribución de frecuencias de los diferentes marcadores utilizados se ha realizado un análisis fa ctorial de correspondencias (Benzécri, 1973; lebart el al. , 1977; Grecnacre, 1984; Excofier y rages, 1990). En lo refere nt e a la estimación de las distancias genéticas, en la actualidad existe un gran ab.lnico de ellas y no existe un convenio general sobre cual de las distancias es la más apropiada para el análisis de poblaciones. No obs - tante, las correlaciones entre varias medidas son, generalmente, bastante altas (Nei el al ., 1983 ), particularmente cuando se apl ic an a poblaciones l oc ales como es el caso de poblaciones ganaderas. En nuestro caso, la estimación de las distancias genéticas entre las posibles subpoblaciones de esta raza, mediante el anális is de las fre<:uencias alélicas de los microsatélites se ha realizado mediante la distancia de Reynolds, basada en el modelo de deriv.l pura, por su utilidad en estudios de divergencia a muy corto plazo y en diferenciación de subpoblaciones. En cuanto al cladograma que representa g rá ficamente estas distancias hemos utilizado el método Neighbor-joining (Saitou y Nei, 1987 ), valorándose la robustez del dendograma mediante un Bootstrapping basado en el remuestreo de las frecuencias en los loci (Weir, 1990 ), utilizando para ello 1000 permutaciones con sustitución de los individuos (Felsenstein, 1985 ). Hemos abordado desde diferentes perspectivas la asignadón de determinados individuos a las posibles poblaciones a la que pueden pertenec er (Rannala y Montain 1997; Waser y Strobeck, 1998, Oavies et al. 1999). El método utilizado consiste en determinar la probabilidad (máxima verosimilitud) de ca da genotipo individual multilocus en cada población, asumiendo que el individuo viene de esa población. rara calcular la probabilidad de máxima verosimilitud, hemos usado las frecuencias aléli· cas estimadas en cada población de la coostitución glo· bal. Hemos asumido que todos los loci son independientes dado que la verosimilitud global individual es obtenida como el producto de la verosimilitud en cada lacus. El método que hemos empleado fue descrito por raetkau el al. (1995, 1997) Y Waser Y 51robeck (1998 ). RESULTADOS Variabilidad genéti ca Se han encon tr ado 390 alelos (figura 1 ), de los cuales 356 se han detectado en la raza Merino Español, el resto de alelos son exclusivos de las otras razas. En esta raza el número de alelas por marcador ha oscilado entre 6 que han presentado los marcadores BM5356, CSSM015 y MCMI y 18 que ha manifestado el marcador CSSM031. Se han dado varios casos en los que todos los alelas que ha p re sentado un marcador se han encontrado en la raza Merino autóctono. 5e ha calculado el número de alelas encontrados en cada una de las razas estudiadas y los valores para c ada una de ellas de heterocigosidad observada ( Ha ) y esperada (He) (tabla 2 ). La raza Merino Autóctono ha sido la que ha presentado un mayor número medio de alelos (I0 , 6J ) seguido de las razas Montesina (7,46) y Merino de Grazalema (6,62 ). Las razas Churra Lebrijana y Fleishchaf han sido las que han presentado un menor número de alelas, 4,75 y 5,03 respectivamente. Este menor número FEDERACION ESF'fW.A DE RSOOOCIONES DE GANADO SELECTO 93 _ ~ feagas c::::=::::: nformación asociaciones Figura T. Número de alelos encontrados en cada mar cador amplifi cado 20 18 - '" 16 - :::J ,. u - .2 - 12 '" .2 10 --- ~ '" 8 -- ., 't:J 6 e Z • - - 2 - - Microsatélites medio de alelos encontrado en estas razas es debido posi. bleme nl e al tipo de cría cerrada de los rebaños de donde se han tomado las muestras de estas razas. No obstante el número medio de alelos en las razas presenta un rango de oscilación muy bajo, ent re 4,75 y 7,46, es decir un rango de 2,71 aleJos, excluyendo al Merino español debido al alto número de ejemplares que se han genotipado. 9. Tabla 2. Número de animales ana li zados (N), número medio de alelos por l oc us (NMA) , heterocigosidad observada (Ha) y esperada (H e) p ara c ada una de la s razas estudiadas NMA I Hu Cl 15 4.75 0,5862 0, 580 4 F 15 5,03 0,5661 0, 5829 1F 25 5.63 0, 5599 0,6120 ME 255 10.63 0,6967 0,7462 MG 19 6.62 0,6725 0,6873 MN 22 5.64 0,6378 0,61 47 M 30 7.46 0,6527 0,6945 MP 25 5.75 0,5802 0,6432 fEDERACION ESPfWolA DE ASOCIACIONES DE GANADO SELECTO Variabilidad ge néti ca entre y dentro de las razas; Estadísticos-F de Wright El estado de la población se puede expresar en términos de tam año efectivo que a su vez determina la tasa de consanguinidad y la intensidad de fijación que ha tenido lugar. Para e ll o se han definido lo s parámetros F de W rig ht (1965) (F ,v F ~ Y F IS ). Pos teriormente estos indicadores han sido modificados por diversos autores. la más utilizada es la modificación de Weir y Cockerham (1984). los va lores F IS indican el defecto o exceso de heterocigotos en cada una de las subpoblaciooes. En el caso del análisis para todas las razas en conjunto este valor ha si do de 0,066. Cu ando esta cifra se aproxima a cero o incluso infer ior , es in di cativo de una población no consanguínea y cuando se aproxima a I estaríamos ante una población co n· sangulnea. los valores de F IS superiores a 0,10 están indicando una baja resolución en estudios de diferenciación genética. En nuestro caso solamente se ha superado esta cifra cuando se ha realizad el análisis por razas independientemente en el l le de France y el Merino precoz (tabla 4). El parámetro FI T indica al igual que el F I$' el exceso o defecto de hetcrocigotos pe ro en este caso en la población global. Es el mejor indicador del grado de consanguinidad existente en las poblaciones. Al se r calculado este parámetro en el conjunto de razas estudiadas (tabla 3) el valor que se ob tuvo fue del 14,3%. Este val or se corresponde con el del parámetro Relat (14, 4% ) que es la estimación del parentesco de la población según Queller y Goodn igh l (1989). Tabla 3. Estadísticos F de Wright en toda la población de animales estudiados (todas las razas) Interva lo de confianza (95 %) o,, 43:0 , 021 0,102-0, 183 El coeficie nt e de diferenciación gené ti ca o FST que se ha obtenido es este análisis de todas las razas ha sido de 0.082 lo que indica que el 8,2% de la variabilidad genética existente es debida a diferencias entre las razas, el resto es debido a diferencias individuales. El valor del parámetro GST para to das las razas ha sido de 0. 1 224. En la tabla 4 se han estimado los valores del parámetro F rs usando todos los individuos genotipados para todos los loci mediante el procedimiento Bootslraps en cada una de las razas que se han genotipado para este estudio. Los valores han oscilado entre -0,01489 del Meri no Negro y O, 13214 de la raza Me rino Precoz. Esta última raza junto co n el lle de France son las ra zas con unos mayores valore s de este parámetro lo que demuestra su elevada endogamia en los rebaños en los que se procedió a la toma de muestras. Tabla 4. Va lores FIS de todas las razas ovinas ana li zadas CHU RRA LEBR IJANA 0,03156 (-0,06442 - 0, 04088 ) FLE ISCHSCHAF 0, 08005 (-0, 03284 - 0, 08005 ) ILE DE FRANCE 0,11629 ( 0, 02818 · 0,16094) ME R INO AUTÓCTONO 0, 06879 , 0, 05806 - 0,07021 ) ME R INO DE GRAZALEMA 0, 05099 '-0,03534 - 0, 06400 ) ME RINO NEGRO -0,01489 (-0 ,0 7535 - 0, 00 5 08 ) MONTESINA 0,08204 ( O, 0198 5 - 0,10152) MERINO PRECOZ 0,13214 ( 0, 0007 5 - 0,15191 ) Al realizar el análisis de todas las razas exceptuando el Me ri no autóctono y el Me rin o Negro los valores que se han oblenido se muestran en la tabla 5. El valor del parámetro F ,S ha sido de 0,082, superior al obtenido en la tabla anterior, lo que demuestra que al excluir del análisis la raza Merino Español y Merino Negro la variabilidad genética dentro de las poblaciones que quedan, se ha visto reducida. Esto muestra el a lt o grado de va ri abilidad ex is - f " I F" 0,082:0,0 10 0,065-0, 102 O,066±0,018 O, OJO · O, 1 01 0,144 :0 ,015 0,117-0,175 tente en la raza Merina. El coeficiente de consanguinidad (f jf) en esta población de razas, asciende de la misma forma que lo hace el F ¡y desde el 14,3 hasta el 19 ,5 '110 lo que indica el alto grado de homocigosis de estas razas destacando el l1e de France y el Merino Precoz_ En este caso existe un mayor grado de diferenciación racial ya que el 12,3% de la variabilidad ge nética to t al existe es devida a diferencias entre estas razas. El valor de Rel at muestra al igual que el fu el parentesco po bl acional y sus valores son muy similares (0, 206 ). Análisis fac torial de Co rr espondencias Es un ti po de análi sis canónico particularmente adaptado para describir las asociaciones entre dos var iables cualitativas (análisis de una tabla de contingencia). Los individuos analizados se ven como una nube de puntos dentro de un hiperespacio. Las d ir ecciones que son definidas por los vectores propios de la matriz determinan una serie de ejes factoriales. En este análisis hemos representado gráficamente la agrupación en el espacio de los individuos de las ra zas en los dos primer os ejes principales. Se han representado grá ficamente la posición de cada indivi· duo en el espacio bidimensional canónico. Este análisis complemen ta a los anteriores como los Estadfsticos F de Wright de los cuales se han sacado las mismas conclusiones ya que amb os junto con el estudio de las di stancias genélicas que se verán posteriormente muestran los mismas conclusiones. En la figura 2 se muest ra la distribución de l os animales pertenecientes a todas la s razas que hemos estudiado. En ella se observan la posición que adoptan los individuos pertenecientes a la s diferentes razas. La s razas !le de France, Merino Precoz o Ch urra Le brijana se muestran bastante alejadas de la raza Meri na. Sin embargo la raza Merino de Grazalema o Merino Negro se encuentran próximas a ella. Debido a la proximidad genética de estas razas con la raza Merina, hemos realizado el análisis excluyéndola pa ra determinar el nivel de diferenciación del resto ( figura 3)_ Como se puede apreciar en la figura 3 todas las razas están bien diferenciadas, con mayor o menor proximidad entre ellas dependiendo de las razas de l as que se trate. Tabla 5. Estadísticos F de Wright e ll a población de razas de ovino excluyendo el Merino Español Resto de razas Ov in o Carne Intervalo de co nfi an za (95%) F" I F" I F" I Rclat 0, 195:0 ,028 0,143-0,251 0, 123:0 ,014 0,097-0,153 0,082±0,024 0,036-0, 131 0,206:0,021 0,167·0,248 FEDEAACtON ESPAÑOLA DE ASOC I ACIONES DE GANADO SELECTO 95 _ ~ f eagas n asociaciones Figura 2. Repre se ntación espacial de los individuos de toda s la s razas estudiadas según el aná li sis factorial de cor respondencias v ~."". p t"O pru C o n uib utio n o d .. all" .. 1 C on l ributi on du indivi duo In dóvi du o ro' A e W' o ... ' ''pp . t"" A a tif'. ('" "' "" un An .l .. ¡- h e l"','" ou pp ("' ... ~ W" . ~ A" " un Imp ñiM . , • • o>¿. .- .. " • ••• . ... • • • • :;¡.. e .. . 0 o - <Po o .. [] [] [] o o • MONTESINA 0 0 0 o -, o o. o o • • • FLElSCHACHF MERINO NEGRO MERINO ESP~OL MERINO GRAZALEMA • MERINO PRECOZ CHURRA LEBRDANA ILE DE FRANCE -, 1. e l: am arillo; I F: bl~ nc o : MN : verd e; MG: r OSi!. Fl : ¡¡;wl; MO: Jñil; MP: rojo: ME: gri s. o Figura 3. Representaci ón espacial de los individuos de todas las razas estudiadas según el aná li sis factorial de correspondencias, excluyendo al Merino Autóctono - -'-" '" -'" -'" -'" .!L = , .Inicoo l .. :;a o • • ••• .. ~ . .. • • • • •• o c o o .0 coeC o o o c c • • c c. • ,1. .... c • 0\ • eL: amarillo; I F: blanco; M P: verde; MG : Gris, Fl : azul; MO: ros a. 96 FE DEAACION ESPAAou'I DE ASOC IACKlNES DE GANADO SElECTO • • •• • • FLElSCHACHF ILE DE FRANCE - MERJNO ORAZALI!MA CHURRA LEBRIJANA MONTESINA • MERlNO PRECOZ o o o o o • 'rP'b 'b 0 8 o o .- 'O • o "ª' • " o • - •• • - 01' • • '" Distancias genéticas entre las razas Hemos realizado la estimación de la Distancia Genética de Reynolds, y su poster io r re presen ta ción mediante un Cladograma entre las 7 ra zas analizadas (figura 4) El da dograma que representa la distancia entre las razas estudiadas se observa que las razas I le de Fran ce y Churra Lebrijana son las razas más distantes. Desde el mismo nodo d el árbol nacen todos los ovinos del tronco merino y la Montesina, estando la raza Fleischchaf un poco alejada de e ll as. Todos estas razas aunque na ce n de l mi smo nodo se muest ra un ac ercamiento un poco mayor entre la raza Merino Español y la raza Merino de Grazale ma . figura 4. Distancia genética de Reynolds y d adograma para las 7 razas ana li zadas r·, o: Churra Lebrijana: FI: Fleishchachf; ME : Merino Español; MG:;Merino de Grazalema; MO: Montesina; MN: Merino Negro; MP: Merino Prec;:oz; I F: lIe de France Asignación de genotipos individuales a l as distintas poblaciones est ud iadas Cuando an al izamos el poder de asignar co rr ectamente los individuos a las distintas raza s, es decir la probabilidad de asignar correctamente un individuo a la raza a la que pertenece mediante el a nál isis de su ADN, ( ta bla 6) se obtienen unos resu lt ados muy satis fa cto ri os. En el 50% de las razas el poder de asignación es del 1 00% Y en el resto de razas está por encima del 83,33%. La probabilidad media de asignación de los an im ales a las distintas razas ha si do del 92%. CONClUS IONES La raza Merina presenta en la actualidad un alto nivel de variabilidad genética puesto de manifiesto por el alto n úm ero de alelos que se ha n encontrado y por el elevado v al or de la heterocigosida d. De todas las razas analizadas en este trabajo se muestran tota lm ente diferenciadas las razas tle de France, la Ch urr a lebrijana yen menor medida la s raza fleischachf y Merino Precoz. El resto de razas, Merino Español, Merino Tabla 6. Probabilidad de asignación de los individuos a la s distintas razas N" ,101m,lIl" '" dl' i\: ,1OHll.1ll" R,lIa, lol,lll"" lOrr( , (t"ml·n ,1"gn,UI<Jn Il' , l,,!:n,ulns I ~Urr("{l,l CL fL IF ME MG MN MO MP TO T AL 14 13 23 230 18 25 29 23 375 14 12 23 208 15 25 25 23 345 0,92 0,90 0,83 0,86 0,92 de Grazalema y Montesina presentan una menor diferenciación debido a la existencia de interca mbi o genético en la hi storia más o menos reciente de es ta s razas. AGRADECIMIENTOS Este Trabajo ha sido fi nanciado por la Dirección General de Ganadería del Min iste rio de Ag ri cultura Pesca y Alimentación. REFERENCIA S BIBLIOGRÁFICAS Benzéc ri , J.P. 1973. l 'Analyse des Données: T. 2, l' Analyse des correspondance s. París: Dunod. Crawfo rd , A., 2000. Medida de la Diver si dad de los Animales Domésticos (MoDAD): Marcadores Microsatélites Ovinos R ecomendados. 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Asociación Nacional de Criadores de Ganado Merino ACTIVIDADES • Desarrollo del Libro Genealógico de la Raza Merina • Organización de Concursos, Exposiciones y Subastas de Reproductores • Ejecución del Programa de Selección y Testeje de Sementales • Divulgación y Promoción de la Roza y sus Productos • Comercialización de Corderos de Calidad • Comercialización y Promoción de Lona • Prestación de Servicios Técnicos, Sanitarios y Asesoramiento a sus socios • Organización de Conferencias Mundiales y Españolas sobre el Merino ASOCIACiÓN NACIONAL DE CRIADORES DE GANADO MERINO Logasce, 70 . 6° Dcha .• 28001 Madrid Tel. y Fax : 91 431 S990 E-moil: [email protected] SocIEDAD COOf>ERAnVA GANADEROS DE MERINO AUTÓCTONO ESPAÑOL Pabellón Central Recinto Ferial. 06300 ZAFRA {Bodajoz} Tel. : 924 55 38 53 • Fax 924 55 36 13 98 FEDERACION ESPAÑOUl DE ASOCIACIONES DE GANADO SElECTO