Uhlíkové nanomateriály

Zdeněk Fiala, Drahomíra Holmannová (ed.) UHLÍKOVÉ NANOMATERIÁLY Zdeněk Fiala Drahomíra Holmannová editoři UHLÍKOVÉ NANOMATERIÁLY KAROLINUM Kniha se zabývá biomedicínským využitím uhlíkových nanomateriálů (CNM) a hodnocením jejich potenciálního zdravotního rizika. Je rozdělena na část teoretickou, ve které byly sumarizovány dostupné informace o biomedicínském využití uhlíkových nanomateriálů, jejich toxikokinetice, biologických interakcích a potenciální nebezpečnosti (toxicitě), a na část praktickou, kterou tvoří výsledky autorského kolektivu z oblasti testování nebezpečnosti nanočástic. Potenciální nebezpečnost nanočástic zahrnuje toxicitu respirační, kardiovaskulární, gastrointestinální, kožní, oční, reprodukční a vývojovou i hepatotoxicitu, neurotoxicitu, imunotoxicitu, genotoxicitu a toxicitu vůči močovému ústrojí. Jsou tu popsány výsledky výzkumů Ústavu lékařské biologie a genetiky, Ústavu histologie a embryologie, Ústavu lékařské biofyziky, Ústavu klinické alergologie a imunologie a Ústavu preventivního lékařství (pracoviště Lékařské fakulty v Hradci Králové a Fakultní nemocnice Hradec Králové). V příloze je představen soubor optimalizovaných metodik pro testování cytotoxicity, genotoxicity a imunotoxicity nanočástic. Biomedicínské aplikace a toxicita Uhlikove nanomaterialy_obalka_hrb 13 mm.indd 1Uhlikove nanomaterialy_obalka_hrb 13 mm.indd 1 15.01.2025 10:4315.01.2025 10:43 Uhlíkové nanomateriály Biomedicínské aplikace a toxicita Zdeněk Fiala Drahomíra Holmannová editoři Recenzovali: prof. MUDr. Jiří Kassa, CSc. (Katedra toxikologie a vojenské farmacie, Vojenská lékařská fakulta Univerzity obrany) prof. MUDr. Milan Tuček, CSc. (Ústav hygieny a epidemiologie, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze) Tato publikace byla připravena v roce 2023 v návaznosti na výstupy projektu NANOBIO (Posilování mezioborové spolupráce ve výzkumu nanomateriálů a při studiu jejich účinků na živé organismy, reg. č.: CZ.02.1.01/0.0/0.0/17_048/0007421, s finanční podporou EFRR). Vydání publikace bylo finančně podpořeno z programu Univerzity Karlovy „Cooperatio“, vědní oblasti HEAS (Zdravotnické vědy, Health Sciences). Vydala Univerzita Karlova Nakladatelství Karolinum Praha 2025 Redakce Jakub Fráňa Sazba DTP Nakladatelství Karolinum Vydání první This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License (CC BY 4.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. © Univerzita Karlova, 2025 © Zdeněk Fiala, Drahomíra Holmannová et al., 2025 ISBN 978-80-246-5954-1 ISBN 978-80-246-5984-8 (pdf) https://doi.org/10.14712/9788024659848 Univerzita Karlova Nakladatelství Karolinum www.karolinum.cz [email protected] Autorský kolektiv Editoři: Zdeněk Fiala a Drahomíra Holmannová (Ústav preventivního lékařství, Univerzita Karlova, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Autoři: Zdeněk Fiala (Ústav preventivního lékařství, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Drahomíra Holmannová (Ústav preventivního lékařství, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Tereza Švadláková (Ústav klinické imunologie a alergologie, Lékařská fakulta v Hradci Králové a Fakultní nemocnice Hradec Králové) Michaela Hanzlová (Ústav preventivního lékařství, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Ctirad Andrýs (Ústav klinické imunologie a alergologie, Lékařská fakulta v Hradci Králové a Fakultní nemocnice Hradec Králové) Hana Bavorová (Ústav histologie a embryologie, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Aleš Bezrouk (Ústav lékařské biofyziky, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Lenka Borská (Ústav preventivního lékařství, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Pavel Borský (Ústav preventivního lékařství, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Andrea Rybová (Ústav preventivního lékařství, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Dana Čížková (Ústav histologie a embryologie, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Martina Koláčková (Ústav klinické imunologie a alergologie, Lékařská fakulta v Hradci Králové a Fakultní nemocnice Hradec Králové) Věra Králová (Ústav lékařské biologie a genetiky, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Jan Krejsek (Ústav klinické imunologie a alergologie, Lékařská fakulta v Hradci Králové a Fakultní nemocnice Hradec Králové) Jaroslav Mokrý (Ústav histologie a embryologie, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Rishikaysh Pisal (Ústav histologie a embryologie, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Emil Rudolf (Ústav lékařské biologie a genetiky, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Ladislava Schröterová (Ústav lékařské biologie a genetiky, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Blanka Šestáková (Ústav lékařské biologie a genetiky, Lékařská fakulta v Hradci Králové) Jindra Šmejkalová (Ústav preventivního lékařství, Lékařská fakulta v Hradci Králové) OBSAH Předmluva předsedy Společnosti hygieny a komunitní medicíny ČLS JEP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Předmluva děkana Lékařské fakulty v Hradci Králové . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Předmluva editorů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Úvod (Zdeněk Fiala, Drahomíra Holmannová) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 TEORETICKÁ ČÁST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 1. Biomedicínskévyužitíuhlíkovýchnanomateriálů (Zdeněk Fiala, Drahomíra Holmannová) . . . . . . . . . 23 1 .1 Diagnostika s využitím nanočástic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 1 .2 Ochrana proti RTG záření . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1 .3 Léčba s využitím uhlíkových nanočástic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 1 .4 Stenty a biokompatibilní uhlíkové nanomateriály v ortopedii, kardiologii a stomatologii . . . . . . . . . . . . . . 33 1 .5 Scaffoldy, regenerační medicína . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 1 .6 Závěr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 1 .7 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2. Toxikokinetikaabiologickéinterakceuhlíkovýchnanomateriálů (Zdeněk Fiala, Drahomíra Holmannová) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 2 .1 Fyzikálně-chemické vlastnosti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 2 .2 Aplikační (expoziční) cesty a distribuce v organismu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 2 .3 Prostup do intracelulárního prostředí a mechanismy buněčné toxicity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 2 .4 Závěr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 2 .5 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 3. Respiračnítoxicita(Zdeněk Fiala, Drahomíra Holmannová) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 3 .1 In vitro studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 3 .2 In vivo studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 3 .3 Pracovní expozice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 3 .4 Závěr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 3 .5 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 4. Kardiovaskulárnítoxicita (Zdeněk Fiala, Drahomíra Holmannová) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 4 .1 In vitro studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 4 .2 In vivo studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 4 .3 Pracovní expozice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4 .4 Závěr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 4 .5 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 5. Gastrointestinálnítoxicitaahepatotoxicita (Zdeněk Fiala, Drahomíra Holmannová) . . . . . . . . . . . . . . 74 5 .1 In vitro studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 5 .2 In vivo studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 5 .3 Závěr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 5 .4 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 6. Kožníaočnítoxicita (Zdeněk Fiala, Drahomíra Holmannová) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 6 .1 In vitro studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 6 .2 In vivo studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 6 .3 Závěr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 6 .4 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 7. Toxicitavůčimočovémuústrojí(Zdeněk Fiala, Drahomíra Holmannová) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 7 .1 In vitro studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 7 .2 In vivo studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 7 .3 Závěr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 7 .4 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 8. Neurotoxicita (Zdeněk Fiala, Drahomíra Holmannová) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 8 .1 In vitro studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 8 .2 In vivo studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 8 .3 Závěr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 8 .4 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 9. Imunotoxicita(Tereza Švadláková, Ctirad Andrýs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 9 .1 Rozpoznání CNM složkami imunitního systému . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 9 .2 Zánět . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 9 .3 Imunomodulace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 9 .4 Eliminace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 9 .5 Závěr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 9 .6 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 10. Genotoxicita (Andrea Rybová) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 10 .1 In vitro studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 10 .2 In vivo studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 10 .3 Závěr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 10 .4 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 11. Reprodukčníavývojovátoxicita (Drahomíra Holmannová) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 11 .1 In vitro studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 11 .2 In vivo studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 11 .3 Vývojová toxicita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 11 .4 Závěr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 11 .5 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144 PRAKTICKÁ ČÁST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 12. VlivdlouhodobéhovystavenígrafenunaviabilituamotilituA549buněk (Ústav biologie a genetiky) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 12 .1 Úvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 12 .2 Cíle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 12 .3 Materiál a metodika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 12 .4 Výsledky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 12 .5 Shrnutí . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 12 .6 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 13. Cytotoxickýefektgrafenuzávislýnadávceačasuvpokusechin vitro ain vivo (PAECbuňky,C57Bl/6myši)(Ústav histologie a embryologie) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 13 .1 Úvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 13 .2 Cíle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 13 .3 Materiál a metodika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159 13 .4 Výsledky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 13 .5 Shrnutí . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 13 .6 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 14. Vlivuhlíkovýchnanomateriálůnaaktivituimunitníchbuněk(lidskéTHP-1, lidskémonocytyzperiferníkrve)(Ústav klinické alergologie a imunologie) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164 14 .1 Úvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164 14 .2 Cíle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 14 .3 Materiál a metodika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 14 .4 Výsledky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166 14 .5 Shrnutí . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 14 .6 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 15. Genotoxickýpotenciálgrafenuvpokusechin vitro (THP-1 buňky) (Ústav preventivního lékařství) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 15 .1 Úvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 15 .2 Cíle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 15 .3 Materiál a metodiky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174 15 .4 Výsledky a diskuse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 15 .5 Shrnutí . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 15 .6 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 PŘÍLOHA: SOUBOR OPTIMALIZOVANÝCH METODIK PRO TESTOVÁNÍ CYTOTOXICITY, GENOTOXICITY A IMUNOTOXICITY NANOČÁSTIC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 MetodikyÚstavulékařskébiologieagenetiky(LékařskáfakultavHradciKrálové) (Věra Králová, Emil Rudolf, Ladislava Schröterová, Blanka Šestáková) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182 Test metabolické aktivity alamarBlue (test cytotoxicity) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182 Test záchytu neutrální červeně (Neutral Red Uptake – NRU; test cytotoxicity) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184 Počítání buněk pomocí obrazového cytometru metodou barvení jader DAPI (test cytotoxicity) . . . . . . . . . . . . 186 Dlouhodobé sledování buněčné proliferace pomocí kumulovaného počtu populačních zdvojení (test cytotoxicity) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188 Stanovení PDL u linie normálních dermálních fibroblastů během chronické expozice grafenovým nanočásticím . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189 Test metabolické aktivity WST-1 (test cytotoxicity) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194 MetodikyÚstavuhistologieaembryologievespoluprácisÚstavemlékařskébiofyziky (LékařskáfakultavHradciKrálové)(Hana Bavorová, Aleš Bezrouk, Dana Čížková, Jaroslav Mokrý, Rishikaysh Pisal) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196 LDH test (test cytotoxicity) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196 MTT test (test cytotoxicity) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 Genová kvantifikace prostřednictvím RT-qPCR (Real-time qPCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 xCELLigence (buněčná proliferace, adheze, viabilita, morfologie) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201 Histologická analýza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202 Transmisní elektronová mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208 16 ÚVOD Uhlík je jedním z nejběžnějších a nejdůležitějších prvků našeho „vesmírného prostoru“ . Je základní složkou makromolekul nepostradatelných pro život, jakými jsou proteiny, lipidy, nukleové kyseliny a sacharidy . Uhlík vykazuje jedinečné chemicko-fyzikální vlastnosti, které jsou dále umocňovány u jeho nanomateriálových forem .1,2 V souvislosti s uhlíkem i s výzkumem, jehož výsledky zde prezentujeme, považujeme za vhodné hned v úvodu připomenout jeho alotropii, vlastnost některých chemických prvků, která znamená schopnost daného prvku vyskytovat se v několika různých strukturních formách, jež mohou mít výrazně odlišné chemicko-fyzikální vlastnosti .3 Nejznámějšími přírodními alotropy krystalického uhlíku jsou diamanty a grafit, amorfní uhlíkové alotropy představuje uhlí, dřevěné uhlí a lampová čerň . Uhlíkové nanomateriály (CNM) byly prvně popsány v osmdesátých letech dvacátého století a ve velmi krátké době dokázaly vytvořit široké spektrum uhlíkových individualit zahrnující amorfní uhlíkové nanočástice (ultrajemné uhlíkové částice, uhlíkové nanočástice a uhlíkové tečky), uhlíkové nanomateriály s hybridizací sp2 (fullereny, uhlíkové nanotrubice, uhlíkové „nanohorns“, grafeny a kvantové tečky grafenu) a nanodiamanty .4,5 CNM jsou tvořeny čistým uhlíkem . Mají značnou stabilitu, vysokou elektrickou a tepelnou vodivost, mimořádné mechanické vlastnosti a vysokou biokompatibilitu s nízkou toxicitou . Díky hybridizaci sp2 jsou vysoce hydrofobní . Mezi nejvýznamnější CNM patří grafen, oxid grafenu, redukovaný oxid grafenu, uhlíkové nanotrubice, fullereny, nanodiamanty a grafenové kvantové tečky .6 Grafen je dvojrozměrný materiál, monovrstva, kde jsou atomy uhlíku uspořádány ve voštinové mřížkové struktuře . Grafen má extrémně velký povrch, vysokou stabilitu a vysokou tepelnou a elektrickou vodivost . Je pružný, elastický, ale zároveň tvrdý a odolný . Je strukturní bází dalších uhlíkových alotropů (grafenoidů), včetně „nanoringů“, jednostěnných, dvoustěnných a vícestěnných nanotrubic, grafitu, uhlíkových vláken a grafynu .7,8 Mezi klíčové technologie výroby grafenu jsou řazeny chemická nebo plazmová exfoliace surového grafitu, mechanické štěpení z přírodního grafitu, chemická depozice par a epitaxní růst grafenu na křemíkové ploše karbidu křemíku . Grafen je možné připravit z derivátů grafenu cestou rozpojování uhlíkových nanotrubic nebo odpařováním fullerenu .9 Nejčastěji používané deriváty grafenu, oxidgrafenu(GO)a redukovanýGO(rGO) lze připravit oxidací grafenu, respektive redukcí GO . Jako oxidační činidla bývají používána protonovaná rozpouštědla (kyselina dusičná, sírová, fosforečná nebo jejich směsi) a manganistan draselný . Proces vede k navázání karboxylových, hydroxylových a epoxidových skupin na 17 povrch grafenu a k modifikaci jeho vlastností . Příprava rGO zahrnuje chemickou, tepelnou nebo fototepelnou redukci GO (odstranění kyslíkových funkčních skupin) .10,11 Nicméně ani intenzivní redukční reakce neodstraní všechny kyslíkové skupiny a nepřevede GO kompletně na grafen . Hlavní funkční rozdíly mezi GO a rGO jsou v elektrické vodivosti . GO vykazuje nižší elektrickou vodivost a nižší mechanickou pevnost ve srovnání s rGO či grafenem .11,12 Uhlíkovénanotrubice(CNT)jsou grafenové listy svinuté do válcového tvaru . Jsou klasifikovány na základě počtu stěn (jednostěnné, dvoustěnné nebo vícestěnné) . Stejně jako grafen vykazují CNT vysokou elektrickou a tepelnou vodivost, pevnost a elasticitu a velký povrch, který lze snadno funkcionalizovat .13 Fullereny(buckyballs) jsou třídou uhlíkových alotropů kulovitého nebo elipsoidního tvaru . Jejich velikost odpovídá počtu uhlíků (například C60, C70 nebo C80) . Nejběžnější fullerenová struktura C60 je molekula, která se skládá z 60 atomů uhlíku uspořádaných jako dvacet pravidelných šestiúhelníků a dvanáct pravidelných pětiúhelníků . Fullereny jsou rozpustné v organických rozpouštědlech (zejména C60 a C70) a jsou snadno funkcionalizovatelné .14 Fullereny jsou skvělé antioxidanty a jejich antioxidační kapacitu lze zvýšit funkcionalizací hydroxylovými skupinami .15,16 Mezi nejčastější metody syntézy CNT jsou řazeny chemická depozice z plynné fáze (CVD), obloukový výboj a pulzní laserová ablace . CVD je prováděna pomocí prekurzorových plynů obsahujících uhlík, jako je například CO2 (oxid uhličitý), C2H2 (acetylen) nebo C2H4 (ethylen) . Teplota při CVD se pohybuje kolem 350–1000 °C . Růst CNT ovlivňuje řada parametrů, mezi které patří reakční doba, teplota, velikost částic katalyzátoru nebo typ/rychlost reakčního plynu .13,17 Metoda obloukového výboje umožňuje přípravu CNT a fullerenů . Stejnosměrné napětí oblouku je aplikováno přes grafitové elektrody ponořené do inertního plynu (helia) . Na katodě vznikají vícestěnné CNT, fullereny se ukládají jako saze uvnitř komory . Pulzní laserová ablace grafitu představuje rychlou a levnou metodu přípravy, nevyžaduje použití katalyzátoru nebo vakua a poskytuje vysoce čisté produkty požadované velikosti a morfologie .17,18 Nanodiamanty se skládají z diamantového jádra (sp3 vázané atomy uhlíku) a amorfních uhlíkových vrstev (sp2 vrstvy) pokrývajících jádro . Nanodiamanty jsou chemicky inertní, mají vysokou tvrdost, optickou průhlednost a vysokou tepelnou vodivost . Povrch nanodiamantů je možné funkcionalizovat skupinami hydroxylovými, karboxylovými, etherovými a karbonylovými .19,20 Takto funkcionalizované nanodiamanty vykazují značnou afinitu k vodě a k polárním organickým rozpouštědlům . V olejích a v nepolárních organických rozpouštědlech vytváří aglomeráty .19,21 Grafenovékvantovétečky(GQD) jsou kvazisférické nanočástice s pozoruhodnými fotochemickými a fotoluminiscenčními vlastnostmi, které lze připravit destrukcí větších uhlíkových materiálů (grafenových nebo GO desek, uhlíkových vláken nebo CNT) . K destrukci lze využít hydrotermální nebo solvotermální procesy nebo silné minerální kyseliny . GQD lze bez dalších chemických úprav rozpouštět ve většině polárních rozpouštědel . V roztocích vykazují, ve srovnání s jinými fluorescenčními barvivy, velmi dobrou stabilitu .22,23 Jak již bylo zmíněno v předmluvě, CNM našly v krátké době široké uplatnění v řadě výrobních odvětví a dynamika jejich vývoje a výroby má vzestupnou tendenci .24 Této dynamice však neodpovídá úroveň našich vědomostí v oblasti hodnocení jejich zdravotních rizik pro člověka .25 Vedeni snahou o zlepšení stávajícího stavu provedli autoři knihy zhodnocení dostupných údajů o toxikokinetice, biologických interakcích, formách toxicity a biomedicínských aplikacích CNP, které doplnili nejvýznamnějšími experimentálními výsledky projektu NanoBio . 18 LITERATURA 1 . Choudhary N, Hwang S, Choi W . Carbon Nanomaterials: A Review . In: Adhikari R, Kar P, Lee S, Tiwari N, eds . Handbook of Nanomaterials Properties . Springer; 2014:709–769 . doi:10 .1007/ 978-3-642-31107-9_37 . 2 . Fojtík A, Kálal M, Prnka T et al . NANO – Fascinující Fenomén Současnosti. COMTES FHT; 2014 . ISBN: 978-80-260-7135-8 . 3 . Thomas S, Sarathchandran C, Ilangovan SA et al . Handbook of Carbon-Based Nanomaterials . Elsevier Inc .; 2021 . ISBN: 9780128219966 . 4 . Zarzycki PK . Pure and Functionalized Carbon-Based Nanomaterials. CRC Press; 2020 . ISBN: 9780367532147 . 5 . Pundir CS, Narang J . Introduction to Carbon Nanomaterials. Bentham Science Publishers; 2018 . ISBN: 978-1-68108-596-8 . 6 . Speranza G . Carbon Nanomaterials: Synthesis, Functionalization and Sensing Applications . Nanomater. 2021;11(4):967 . doi:10 .3390/nano11040967 . 7 . Kitko KE, Zhang Q . Graphene-Based Nanomaterials: From Production to Integration with Modern Tools in Neuroscience . Front Syst Neurosci. 2019;13:26 . doi:10 .3389/FNSYS .2019 .00026 . 8 . Peng Q, Dearden AK, Crean J et al . New Materials Graphyne, Graphdiyne, Graphone, and Graphane: Review of Properties, Synthesis, and Application in Nanotechnology . Nanotechnol Sci Appl. 2014;7(2):1–29 . doi:10 .2147/NSA .S40324 . 9 . Mbayachi VB, Ndayiragije E, Sammani T et al . Graphene Synthesis, Characterization and Its Applications: A Review . Results Chem. 2021;3:100163 . doi:10 .1016/j .rechem .2021 .100163 . 10 . Brisebois PP, Siaj M . Harvesting Graphene Oxide – Years 1859 to 2019: A Review of Its Structure, Synthesis, Properties and Exfoliation . J Mater Chem C. 2020;8(5):1517–1547 . doi:10 .1039/ c9tc03251g . 11 . Rhazouani A, Gamrani H, El Achaby M et al . Synthesis and Toxicity of Graphene Oxide Nanoparticles: A Literature Review of In Vitro and In Vivo Studies . Biomed Res Int. 2021;2021(1):5518999 . doi:10 .1155/2021/5518999 . 12 . Morales-Torres S, Jiříčková A, Jankovský O et al . Synthesis and Applications of Graphene Oxide . Mater. 2022;15(3):920 . doi:10 .3390/MA15030920 . 13 . Rathinavel S, Priyadharshini K, Panda D . A Review on Carbon Nanotube: An Overview of Synthesis, Properties, Functionalization, Characterization, and the Application . Mater Sci Eng B. 2021;268:115095 . doi:10 .1016/J .MSEB .2021 .115095 . 14 . Baskar AV, Benzigar MR, Talapaneni SN et al . Self-Assembled Fullerene Nanostructures: Synthesis and Applications . Adv Funct Mater. 2022;32(6):2106924 . doi:10 .1002/ADFM .202106924 . 15 . Mikheev IV, Sozarukova MM, Izmailov DY et al . Antioxidant Potential of Aqueous Dispersions of Fullerenes C60, C70, and Gd@C82 . Int J Mol Sci. 2021;22(11):5838 . doi:10 .3390/IJMS22115838 . 16 . Grebowski J, Konopko A, Krokosz A et al . Antioxidant Activity of Highly Hydroxylated Fullerene C60 and Its Interactions With the Analogue of α-Tocopherol . Free Radic Biol Med. 2020;160: 734–744 . doi:10 .1016/J .FREERADBIOMED .2020 .08 .017 . 17 . Shoukat R, Khan MI . Carbon Nanotubes: A Review on Properties, Synthesis Methods and Applications in Micro and Nanotechnology . Microsyst Technol. 2021;27(12):4183–4192 . doi:10 .1007/ s00542-021-05211-6 . 18 . Ramazani A, Moghaddasi MA, Mashhadi Malekzadeh A et al . Industrial Oriented Approach on Fullerene Preparation Methods . Inorg Chem Commun. 2021;125:108442 . doi:10 .1016/J .INOCHE .2021 .108442 . 19 . Nunn N, Torelli M, McGuire G et al . Nanodiamond: A High Impact Nanomaterial . Curr Opin Solid State Mater Sci. 2017;21(1):1–9 . doi:10 .1016/J .COSSMS .2016 .06 .008 . 19 20 . Barzegar Amiri Olia M, Donnelly PS, Hollenberg LCL, Mulvaney P, Simpson DA . Advances in the Surface Functionalization of Nanodiamonds for Biological Applications: A Review . ACS Appl Nano Mater. 2021;4(10):9985–10005 . doi:10 .1021/ACSANM .1C02698/ASSET/IMAGES/MEDIUM /AN1C02698_0021 .GIF . 21 . Qin JX, Yang XG, Lv CF et al . Nanodiamonds: Synthesis, Properties, and Applications in Nanomedicine . Mater Des. 2021;210:110091 . doi:10 .1016/J .MATDES .2021 .110091 . 22 . Zheng XT, Ananthanarayanan A, Luo KQ et al . Graphene Quantum Dots and Carbon Dots: Properties, Syntheses, and Biological Applications . Small. 2015;11(14):1620–1636 . doi:10 .1002/ SMLL .201402648 . 23 . Ghaffarkhah A, Hosseini E, Kamkar M et al . Synthesis, Applications, and Prospects of Graphene Quantum Dots: A Comprehensive Review . Small. 2022;18(2):2102683 . doi:10 .1002/ SMLL .202102683 . 24 . Pande K, Kumar VS, Sharma JA . Novel Applications of Carbon Based Nano-materials . Chopra S, ed . CRC Press; 2022 . doi:10 .1201/9781003183549 . 25 . Zielińska A, Costa B, Ferreira MV et al . Nanotoxicology and Nanosafety: Safety-by-Design and Test ing at a Glance . Int J Environ Res Public Health. 2020;17(13):1–22 . doi:10 .3390/ijerph 17134657 . TEORETICKÁ ČÁST 23 1 BIOMEDICÍNSKÉ VYUŽITÍ UHLÍKOVÝCH NANOMATERIÁLŮ Uhlíkové nanomateriály (CNM) mají jedinečné vlastnosti, které mohou být využity v klinické diagnostice a léčbě . „Horkými kandidáty“ jsou grafen, grafen oxid (GO), uhlíkové nanotrubice (CNT, MWCNT) a fullereny . Uvedené materiály mají vysokou stabilitu, pevnost, odolnost, výbornou elektrickou a tepelnou vodivost a často i dobrou biokompatibilitu (která je dále zvyšována funkcionalizací) . Většina aplikací CNM se zatím nachází ve stadiích preklinického výzkumu . Jedním z důvodů je i skutečnost, že zatím máme nedostatečné vědomosti o interakcích CNM s tělními tkáněmi a z toho plynoucí vyšší míru nejistoty odhadu toxického potenciálu . V následujícím textu se pokusíme shrnout poznatky o oblastech medicíny, ve kterých se již nanomateriály s úspěchem využívají či se o jejich využití uvažuje . 1.1 DIAGNOSTIKA S VYUŽITÍM NANOČÁSTIC 1.1.1 Zobrazovací vyšetření CNM zvyšují kvalitu výsledků a ve většině případů i snižují finanční náročnost vyšetřovacích postupů . Díky svým unikátním fyzikálně-chemickým vlastnostem se stávají součástí zobrazovacích metod, které identifikují různé patologické stavy (nádorovou tkáň nebo záněty) .1,2 Většina uhlíkových nanočástic má přirozenou schopnost emitovat fluorescenci po expozici odpovídajícímu záření (indukce fotoexcitace) .3,4 Často jsou používány uhlíkové kvantové tečky, grafen a uhlíkové nanotrubice . Poslední zmíněné látky, především vícevrstvé nanotrubice (MWCNT), mají extrémní plochu, na kterou lze navázat velké množství molekul s různými funkcemi . Ty mohou zlepšovat detekci cílových látek a zesilovat signál analytického procesu .5 Na tomto místě je však nutné zdůraznit, že pro výběr vhodného materiálu k zobrazovacímu vyšetření jsou dvě klíčová kritéria . Prvním kritériem je vhodnost (vysoká efektivita) daného CNM pro konkrétní diagnostický účel . Druhým, neméně důležitým kritériem je jejich snadná exkrece z organismu po splnění diagnostického úkolu .6 Díky přirozené rozmanitosti nanočástic a možnosti funkcionalizace je možné zacílit na zobrazení zcela určitých tkání, či dokonce buněk nebo organel . Pokusy in vivo i klinické studie přinášejí důkazy o tom, že využití uhlíkových nanočástic v zobrazovacích metodách může přinést mnoho výhod . Jednou z nich je i skutečnost, že CNM mohou pronikat prakticky do všech tělních kompartmentů . Například po intravenózní aplikaci prostupují uhlíkové kvantové tečky poměrně rychle do tkání plic, jater a ledvin . Jsou schopny překonávat 24 i hematoencefalickou bariéru . Posledně uvedený fakt naznačuje možnost využívání uhlíkových kvantových teček při zobrazovacích vyšetřeních CNS .7 Další výhody CNM pro zobrazovací technologie představují procesy funkcionalizace . Například nanotrubice pokryté virem M13 mohou být specificky zachytávány v nádorových tkáních . Pokud jsou tyto částice označeny vhodným radionuklidem (například techneciem99m), je možné nádory detekovat pomocí pozitronové emisní tomografie .8,9 Obdobně lze značením nanočástic fluorescenčními látkami usnadňovat a zpřesňovat výsledky výpočetní tomografie a magnetické rezonance . U magnetické rezonance je možné dostáhnout lepších výsledků i díky nanodiamantům, a pokud jsou na ně navázány ještě ionty manganu, dochází k dalšímu zlepšení kvality zobrazení .10 Tento efekt je možný díky tomu, že nanodiamanty fungují jako hyperpolarizační prvek .11 Vyšetření má vyšší senzitivitu, kontrast a je možné detekovat více detailů .12 Uhlíkové nanočástice našly své uplatnění také při obrazové analýze hlubších vrstev tkání pomocí blízkého infračerveného záření (NIR) . Vyšetření (Near Infrared Optical Imaging) využívá spektrum NIR-II (1000–1700 nm) a lze při něm získat údaje z nitra tkání ve velmi dobrém rozlišení bez autofluorescence . Díky tomu je možné provádět například celotělovou a mozkovou angiografii, při které je zobrazen krevní tok a mikrocirkulace . Vizualizace orgánů a tkání umožňuje využít tento typ zobrazení rovněž při nádorové terapii a chirurgických zákrocích .13,14 Další oblastí uplatnění uhlíkových nanočástic je zobrazování intracelulárních struktur a intracelulárního transportu . K tomuto účelu jsou využívány uhlíkové kvantové tečky nebo nanodiamanty (ND) s křemíkovým centrem, které jsou buňkami snadno pohlcovány, vykazují přijatelnou fotostabilitu a mají úzká emisní spektra v oblasti NIR .15,16 Uhlíkové kvantové tečky mohou interagovat také s kmenovými buňkami, kde vedle detekce dochází i k podpoře jejich diferenciace do specifických buněčných linií . Uvedený proces pak podporuje regeneraci poškozených tkání .16 V průběhu operačních zákroků lze uhlíkovými nanočásticemi detekovat lymfatické uzliny s nádorovými buňkami, které je pak možné ještě během operace odstraňovat . Identifikace metastatických uzlin je důležitá pro snížení rizika rekurence nádorů . Autoři Li s kolegy sledovali lymfatický transport a kumulaci uhlíkových nanočástic v uzlinách v průběhu gastrektomie pokročilých nádorů žaludku . U jedné skupiny pacientů byly před gastrektomií aplikovány uhlíkové nanočástice do žaludeční subserózy, druhá skupina pacientů podstoupila standardní operační protokol . Po aplikaci uhlíkových nanočástic nedošlo k žádné nežádoucí reakci a nanočástice se přednostně kumulovaly v drénujících lymfatických uzlinách, které zabarvovaly načerno . Touto metodou bylo možné detekovat i menší uzliny s metastázami, které by jinak mohly být přehlédnuty .17 Stejné výsledky přinesly i studie zaměřené na pacienty s nádory štítné žlázy, karcinomu prsu, tlustého střeva a konečníku . Podané uhlíkové nanočástice prea perioperačně významně zvyšovaly úspěšnost detekce lymfatických uzlin s nádorovými buňkami .18–20 V případě karcinomů štítné žlázy mohou uhlíkové nanočástice navíc pomáhat při rozlišení příštítných tělísek a lymfatických uzlin .21 U kolorektálního karcinomu je možné po endoskopické aplikaci nanočástic doslova „vytetovat“ oblast nádoru a prekancerózních lézí . Uvedené skutečnosti vedou k lepším operačním výsledkům i k redukci operačního traumatu .22 25 1.1.2 EEG EEG umožňuje základní vyšetření stavu mozkové aktivity . Použití uhlíkových nanomateriálů má oproti jiným materiálům výhody zejména u klíčového prvku EEG, u snímacích elektrod . Zvýšení intenzity snímaného signálu podporuje například grafen a od něj odvozené nanomateriály . Garcia-Cortadella et al . popsali 64kanálový bezdrátový snímací systém na bázi grafenové suspenze, umožňující 24hodinové snímání mozkové aktivity . Systém byl použit u potkanů . Bylo jím možné snímat epikortikální mozkovou aktivitu volně se pohybujících zvířat a zkoumat asociace mezi chováním a nervovou aktivitou .23 Autoři Ko et al . navrhli snímací elektrody obsahující grafen a GO . Jejich výhodou je, že mohou být použity bez vodivého gelu, aniž by to snížilo kvalitu výsledků (vodivý gel může být pro některé pacienty velmi nepříjemný) .24 K podobným (pozitivním) výsledkům dospěli také Faisal et al ., když pro EEG použili „suché“ grafenové elektrody . Tyto elektrody zlepšily kontakt s pokožkou a měly v porovnání s komerčními suchými elektrodami vyšší výkonnost i po opakovaném použití . Přítomnost elektrolytů na pokožce (slané prostředí, pot) vedly k dalšímu zlepšení míry detekce .25 Na závěr nutno doplnit, že grafenové elektrody nejsou využívány pouze k účelu detekce, ale lze je použít také ke stimulaci (hluboká mozková stimulace, retinální a kochleární implantáty) .26 1.1.3 EKG Vynikající elektrická vodivost uhlíkových nanočástic umožňuje jejich využití v řadě elektrotechnických komponent, například tranzistorů . Přítomnost nanočástic zesiluje získaný signál a redukuje nežádoucí šumy, což je velmi důležité pro snímání srdeční aktivity . Uhlíkové nanočástice (grafen, GO a MWCNT) byly rovněž použity pro přípravu snímacích elektrod EKG . Testování elektrod probíhalo pro krátkou a dlouhou monitoraci . Při dlouhé monitoraci byly elektrody součástí přenosného snímacího zařízení, což umožnilo snímání změn srdeční aktivity během celého dne .27–29 1.1.4 Fotoakustická diagnostika Fotoakustické zobrazování, využívané například ve fotoakustické mikroskopii nebo fotoakustické počítačové tomografii (CT), je řazeno do skupiny neinvazivních vyšetření . Jeho princip je založený na fotoakustickém efektu, při němž jsou světelné či laserové pulzy absorbovány exogenními nebo endogenními kontrastními látkami a konvertovány na termální energii s emisí ultrazvukového signálu . Fotoakustické CT má vysoké prostorově-časové rozlišení, které umožňuje zobrazení stavu hlubokých tkání, včetně diagnostiky nádorů mléčné žlázy, kůže, střeva a rekta . Jako kontrastního materiálu lze u této diagnostiky úspěšně využít uhlíkových nanočástic, například grafenu, CNT či GQD, které mohou být dále povrchově funkcionalizovány organickými polymery, peptidy, kovovými nanočásticemi nebo barvivy .30,31 Takto upravené komplexy pak mohou být zacíleny na specifické tkáně . Například jednostěnné uhlíkové nanotrubice (SWCNT), funkcionalizované cyklickými Arg-Gly-Asp peptidy, jsou preferenčně vychytávány různými typy nádorů (nikoliv však tkáněmi zdravými) .32 Do nádorových tkání snadno prostupují také GQD, které po vystavení NIR-II mnohobarevné 32 vivo jsou na CNM navazovány cisplatina, oxaliplatina, doxorubicin, metotrexát, paklitaxel, tamoxifen a rituximab .84 Například Lay et al . navázali na polyetylenglykolované MWCNT (PEG-MWCNT) paklitaxel a tento komplex inkubovali s nádorovými buněčnými liniemi HeLa (karcinom děložního čípku) a MCF-7 (karcinom prsu) . PEG-MWCNT vykazovaly nízkou cytotoxicitu a vysokou účinnost v likvidaci nádorových buněk (po uvolnění paklitaxelu) .85 Yu et al . připravili CNT s PEG, estradiolem a loboplatinou, což představuje terapeutickou kombinaci pro léčbu nádorů prsu . Účinek této kombinace byl potvrzen v in vitro i in vivo studiích . Důležitým zjištěním bylo, že na rozdíl od standardní protinádorové léčby měla léčba s účastí CNT méně systémových nežádoucích účinků a účinnost si udržela i při nižších dávkovacích schématech .86 Jako nosič lze použít také GO . Buskaran et al . navázali na GO protokatechovou, chlorogenní a listovou kyselinu, což vedlo k úspěšné likvidaci buněk karcinomu jater . Obdobně jako u předchozí práce byla pozorována dostatečná účinnost terapeutického komplexu i při relativně nízkých koncentracích léčiva .87 Léčba s využitím CNM může být zacílená také pomocí molekul, které jsou exprimovány určitými typy buněk . Například nádorové buňky obecně exprimují vyšší množství receptorů pro kyselinu listovou . CNM s povrchově adsorbovanou kyselinu listovou budou tedy atrahovány k nádoru . K zacílení je možné použít rovněž specifické antigeny nádorových buněk či patogenů, resp . monoklonální protilátky, které se na antigeny a receptory cílových buněk vážou .88–90 Li et al . použili komplex GO s navázaným doxorubicinem v kombinaci se specifickým antigenem HN-1 . Nanočástice byly intenzivně vychytávány buňkami orálního skvamózního karcinomu (CAL27), na který byly zacílené . Účinnost komplexu převyšovala účinnost samotného doxorubicinu .91 Kromě grafenu a jeho derivátů a CNT je možné jako nosiče použít také fullereny . I tento typ nanočástic je možné osadit léčivy, např . 5-aminolevulenovou kyselinou nebo doxorubicinem . Takto vzniklý komplex je schopen proniknout až do buněčného jádra .92,93 Snadný prostup tělními bariérami je obecně velkou výhodou CNM nosičů . Řada z nich proniká i přes hematoencefalickou bariéru a může léčiva dopravovat do CNS (léčba gliomů) .94 Vedle protinádorové léčby se CNM mohou uplatňovat i v dalších terapiích, například v procesu reparace poškozených tkání, kdy jsou na povrch CNM navazovány růstové faktory . Příkladem může být vaskulární endotelový růstový faktor (VEGF), který podporuje angiogenezi v ischemií poškozené srdeční tkáni . CNM mohou transportovat také látky s antimikrobiálním účinkem .38,95,96 Pokud hovoříme o antimikrobiálním efektu nanočástic, je nutné zmínit skutečnost, že ten mají i samotné nanočástice . Mohou urychlovat virovou clearance a pomáhají překonávat bakteriální antibiotickou rezistenci (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium) . Jejich přirozené antimikrobiální účinky je možné dále zvyšovat adsorpcí nanočástic stříbra .97 CNM mohou být využity také v léčbě zánětlivých onemocnění (například nespecifických střevních zánětů) . Na jejich povrch jsou v tomto případě adsorbovány protizánětlivé či imunomodulační látky, které zasahují do průběhu zánětlivé odpovědi .98 33 1.3.6 Genová terapie CNM se uplatňují také jako nosiče genetické informace v genových terapiích .99 Běžně se v genové terapii používají jako nosiče viry a touto formou je možné do buňky a jádra vnášet plazmidovou DNA, miRNA či siRNA .82,100,101 Genomové součásti pak mohou regulovat či inhibovat genovou expresi cílových genů (selektivně je blokovat) . Postup je využíván například u léčby nádorových onemocnění, kdy lze blokací vybraných genů omezit dělení a růst nádorových buněk . Andersen et al . publikovali metodu genové terapie s využitím SWCNT, na jejichž povrch navázali specifickou siRNA . V experimentu provedli inkubaci buněk karcinomu slinivky (PANC-1) ve dvou variantách, a to se samostatnou siRNA a dále s komplexem siRNA a SWCNT . Volná siRNA pronikala do buněk velmi obtížně, komplex siRNA a SWCNT však dosáhl transfekce téměř 92 % . Po internalizaci se siRNA uvolnila a interagovala s cílovým mutantním genem K-Ras, což vedlo k poklesu exprese mRNA K-Ras zhruba o 67 % .102 Studie autorů Wang et al . popsala experiment s komplexem GO s navázanou siRNA, který autoři inkubovali s buňkami karcinomu prsu . I v tomto případě pozorovali vysokou míru internalizace komplexu a inhibici dělení a růstu nádorových buněk .103 Podobným způsobem je možné využít také grafeny, fullereny, GQD a ND .101 Pomocí genové terapie je možné léčit také řadu dalších patologických stavů . Příkladem může být inhibice zánětlivých procesů u nealkoholické hepatosteatózy cestou zacílení siRNA na CCR5 gen, tento výzkum je zatím ve fázích testování in vitro .104 Využití genové terapie je stále rozšířenější a použití biokompatibilních nanočástic je pro elevaci její účinnosti jednoznačně přínosné . 1.4 STENTY A BIOKOMPATIBILNÍ UHLÍKOVÉ NANOMATERIÁLY V ORTOPEDII, KARDIOLOGII A STOMATOLOGII Biokompatibilita je nejdůležitějším předpokladem pro použití materiálů v medicíně . Běžně se pracuje se standardními netoxickými materiály, jejichž biokompatibilita je dále zvyšována speciálními povlaky . Tímto postupem lze vyrábět například stenty, kloubní náhrady nebo srdeční a zubní implantáty . Povrchová aplikace CNM na standardní materiály zlepšuje nejen jejich biokompatibiltu, ale i fyzikálně-chemické vlastnosti finálního produktu . CNM zlepšují odolnost, pevnost, hemokompatibilitu a antitrombotické vlastnosti materiálů, zvyšují míru reepitelizace a regenerace, zabraňují restenóze a chrání před infekcemi a tvorbou biofilmu .105 Nerezová ocel s označením 316L vykazuje velmi dobrou biokompatibilitu a je dobrým kandidátem pro výrobu srdečně-cévních stentů . Negativem v jejím případě je skutečnost, že může zvyšovat riziko trombóz a restenóz . Vellayappan et al . zjistili, že pokrytí stentů vyrobených z oceli 316L s několika vrstvami grafenu výrazně zlepšuje jejich fyzikálně-chemické vlastnosti a snižuje trombogenitu a riziko restenózy .105 Autoři Wawrzyńska et al . uvedli, že úprava oceli 316L pomocí grafenu nejenže nezvyšuje toxicitu takto upraveného materiálu vůči buňkám lidského primárního arteriálního endotelu (HPCAEC), ale naopak podporuje jejich adhezi, proliferaci a metabolickou aktivitu, což v konečném efektu podporuje regeneraci poškozené cévy . Navíc se díky grafenu snižuje adheze trombocytů a tím i tvorba trombů .106 Zajímavou studii provedli Ösmer Burak İstanbullu a Gulsen Akdogan, kteří navázali SWCNT metodou spin-coating na stenty vyrobené z 316L, 316LVM, CoCr-slitiny a Ti-slitiny . Takto 34 ošetřené stenty byly více inertní, nereagovaly se složkami a buňkami krve a také lépe odolávaly poškození . Autoři dále uvádějí, že polarizační odpor 1,433 kΩ cm2 a elektrochemická impedance 1,07 kΩ cm2 povlakem SWCNT zvýšily na 142,8 kΩ cm2 a 141,3 kΩ cm2, tj . zvýšila se korozní odolnost, a to až k 90 % v případě 316LVM se SWCNT .107 CNM jsou používány také pro výrobu umělých srdečních chlopní . Například Hastalex, který je tvořen funkcionalizovaným poly(carbonat-urea)urethanem (GO PCUU), má výborné mechanické vlastnosti, hemokompatibilitu a je odolný proti vzniku kalcifikací . Umělé srdeční chlopně je dále možné modifikovat polyuretanem a CNM s navázaným heparinem, což výrazně snižuje koagulaci a riziko vzniku trombů .108,109 U kardiostimulátorů je problémem nízká kapacita baterií a nutnost jejich periodické výměny . Některé studie prokázaly, že GO v kombinaci s polyvinylidendifluoridem by mohl fungovat jako nanogenerátor v samonapájecích kardiostimulátorech . Když autoři Azimi et al . implantovali takto upravené kardiostimulátory psům, zjistili, že nanogenerátor je schopen získávat energii 0 .487 μJ z každého srdečního úderu . Tato hodnota je vyšší než prahová energie nutná pro stimulaci lidského srdce .110 V kardiologii se mohou uplatnit také ND, které snižují riziko vzniku trombů, omezují adhezi a aktivaci trombocytů a inhibují tvorbu fibrinových depozit . Navíc disponují protimikrobiálními účinky .111 CNM nacházejí uplatnění i v ortopedii a ve stomatologii . Nanomateriály na povrchu náhrad a implantátů podporují regeneraci, přilnutí osteoblastů k náhradě a proliferaci . Tím se zlepšuje a urychluje vhojení náhrady a vznik kvalitní kostní tkáně . CNM rovněž zvyšují odolnost povrchu náhrad proti poškození a otěru a prodlužují jejich životnost .112 Ve stomatologii je možné přidávat ND do zubních výplňových hmot, což zvyšuje pevnost v ohybu, pružnost a drsnost povrchu a snižuje otěr . Pro prevenci stomatitidy spojené se zubními náhradami je důležitá skutečnost, že ND v zubní pryskyřici snižují adherenci Candida albicans .113–115 Obdobně lze do stomatologických výrobků přidávat i CNT, které mají antibakteriální účinky a potlačují i Streptoccoccus mutans, který je součástí zubního kazu . CNT aplikované na scaffoldech podporují významně regeneraci kostní tkáně po resekci zubů a vkládání implantátů . Implantáty pokryté CNT zvyšují pravděpodobnost jejich úspěšného vhojení do kosti .116 1.5 SCAFFOLDY, REGENERAČNÍ MEDICÍNA CNM jsou biokompatibilní a mohou pozitivně ovlivňovat životaschopnost, diferenciaci, dediferenciaci, proliferaci a adhezi mnoha typů buněk . Tyto vlastnosti předurčují použití CNM v systémech scaffoldů, umožňujících rychlou regeneraci tkání . Nejčastěji se jedná o tkáně nervového, kardiovaskulárního a pohybového systému (Obrázek 3) .117,118 Ve studiích tymů autorů Ning Liho a Rossany Rauti byl popsán pozitivní vliv grafenu na růst myších neuronů z hipokampu a na zvýšení počtu neuritů a prodloužení jejich délky . Grafen rovněž podporuje synaptogenezi a neurální aktivitu .119,120 Zhou et al . implantovali scaffold s grafenem potkanům po poranění mozku, které bylo spojené se zánikem buněk a rozvojem zánětu . Přítomnost scaffoldu ve striatu a v subventrikulárním prostoru vedla k omezení aktivace mikroglií a astrocytů (potlačení zánětu), což se v konečné fázi projevilo nižší mírou zjizvení mozkové tkáně .121 Jak ukázali Yan Zhang, Shu Qang a Ping Yang, GO a CNT jsou schopné indukovat diferenciaci myších embryonálních buněk do dopaminergních neuronů, což by mohlo být využíváno při léčbě Parkinsonovy nemoci .122 35 CNM trojrozměrné verze scaffoldů imitují mikroprostředí nervové soustavy a pozitivně ovlivňují chování neuronů a formování nervové tkáně . Severino et al . aplikovali neurony z hipokampu na trojrozměrný grafenový scaffold . Byla pozorována intenzivní proliferace neuronů a tvorba nových spojů . V porovnání s dvojrozměrnými scaffoldy docházelo i k vyšší míře synchronicity .123 Lopéz-Dolado et al . implantovali potkanům trojrozměrný GO scaffold do oblasti míšního poškození . Následkem byla zvýšená intenzita regeneračních procesů v míše a zvýšená úroveň angiogeneze . Rovněž byly zjištěny nové neurony, axony a funkční cévy .124 Vedle CNS ovlivňují CNM také regeneraci periferního nervového systému . Autoři Zhao et al . popsali pozitivní vliv scaffoldu s grafenem na růst a proliferaci Schwannových buněk .125 Ke stejným výsledkům dospěli také Pi et al ., kteří v první části své studie kultivovali Schwannovy buňky se scaffoldem s CNT a neurotropním faktorem . Bylo pozorováno zvýšení proliferace, růstu a produkce myelinu . Ve druhé části studie byl tento scaffold použit na poškozený sedací nerv, což mělo za následek obnovení jeho funkcí .126 Obrázek3.Regenerační potenciál nanočástic CNM (například grafen) mohou podporovat diferenciaci kmenových buněk a tvorbu tkání (například vytvoření myokardu či součástí nervové soustavy) . (Drahomíra Holmannová; pro přípravu obrázku byl použit: Servier Medical Art . Servier, licensed under a Creative Commons Attribution 3 .0 Unported License .) 36 Kromě tkání nervové soustavy mohou uhlíkové nanočástice zlepšovat i stav kostí, chrupavek, pokožky a svalové tkáně .127 Poškození kostí (v důsledku úrazů) se v některých případech špatně hojí a vyžaduje operační řešení s použitím kostních štěpů . Problémem je ovšem jejich dostupnost a výrazně by pomohla příprava této funkční tkáně v laboratorních podmínkách .128 Experimentální studie potvrzují, že CNM podporují diferenciaci kmenových buněk do osteoblastů a zvyšují osteogenezi a ektopickou tvorbu kostní tkáně . Například autoři Nie et al . popsali použití trojrozměrného porézního nanohydroxyapatitového scaffoldu s GO, který v in vivo experimentu na králíkovi s cirkulárním defektem kalvy (4mm průměr) umožnil jeho rychlé a plné vyhojení . Scaffold významně podpořil osteogenezi, buněčnou proliferaci a vznik kolagenových depozit .129 K obdobným výsledkům došla i studie autorů Daneshmandiho et al ., ve které byl použit trojrozměrný scaffold s funcionalizovaným grafenem a fosforečnanem vápenatým . Scaffold indukoval diferenciaci lidských mezenchymálních kmenových buněk do osteoblastů v in vitro experimentu a navodil rychlé vyhojení defektu kalvy v experimentu in vivo na myších .130 Li et al . použili k léčbě defektu femorálního epikondylu u králíků implantát z titanové slitiny pokryté grafenem . Grafenový povrch významně urychlil osteogenezi a kvalita nově vytvořené kosti, kostní mineralizace a vrůst implantátu do kosti byly lepší než u kontrolní skupiny, která dostala implantát bez grafenového krytí .131 CNM prokázaly svou účinnost také při regeneraci oční sítnice . Poškození sítnice je spojeno s ireverzibilním zhoršením zraku a slepotou a jedinou možností, jak zrak zlepšit/obnovit je regenerace sítnice . Autoři Chemla et al . popsali, že CNT a uhlíková nanovlákna (CNF) podporují diferenciaci lidských embryonálních kmenových buněk do prekurzorových buněk fotoreceptorů, které by mohly být v klinické praxi (v rámci regeneračního procesu) implantovány do oční sítnice .132 Kardiovaskulární onemocnění patří k nejčastějším příčinám populační morbidity a mortality . Ischemická choroba srdeční vede k nevratnému poškozování srdečního svalu, který má limitovanou regenerační kapacitu . Dochází tak postupně k neléčitelným ztrátám srdečních funkcí, případně až k srdečnímu selhání . Zatím jedinou formou terapie tohoto stavu je transplantace srdce (ta má ovšem své zásadní omezení v podobě omezené dostupnost orgánu) . Studie dokladují, že CNM, aplikované v podobě scaffoldu nebo injikované v podobě hydrogelů (samostatně či s kmenovými buňkami), mohou indukovat regeneraci poškozené srdeční tkáně . Scaffoldy z CNM imitují extracelulární matrix, dávají mechanickou podporu a stimulují signály pro maturaci a diferenciaci kmenových buněk . Jejich velkou výhodou je biokompatibilita, mechanické vlastnosti a elektrická vodivost, nutná pro vytvoření funkční srdeční tkáně . Smith et al . použili ve své studii scaffold z PEG a scaffold z PEG/GO osazené neonatálními myocyty z komor potkanů . Scaffold z PEG/GO významně zvýšil úroveň růstu srdečních buněk, jejich vodivost i kontraktilitu .133 Autoři Saravanan et al . připravili biodegradabilní chitosanový scaffold s GO/zlatými plátky a testovali jej v experimentech in vitro a in vivo (na izolovaném srdci a na potkaním modelu infarktu myokardu) . Scaffold byl netoxický vůči buňkám potkaního hladkého svalu a fibroblastů a lidským kardiomyocytům a neaktivoval imunitní systém (nevyvolával zánětlivou odpověď) v prostředí in vitro . V potkaním modelu byl indukován infarkt podvazem jedné z větví levé koronární arterie a aplikován připravený scaffold . Po pěti týdnech bylo pozorováno (dle EKG) zlepšení srdeční vodivosti, přenosu vzruchů a kontraktility v postižené tkáni . Ultrazvukové vyšetření potvrdilo zvýšení ejekční frakce .134 Nutno doplnit, že regenerace srdce (i ostatních tkání) významně závisí na stavu cévního systému . Scaffoldy s uhlíkovými nanočásticemi zlepšují angiogenezi a přispívají k obnovení krevního průtoku v poškozených oblastech .38 V této souvislosti potvrdila studie 37 autorů Mukherjee et al ., že GO a redukovaný GO významně zvyšují úroveň angiogeneze .135 Polykaprolaktonový scaffold s GO, připravený Quianem et al ., podpořil nejen růst Schwannových buněk, ale také angiogenezi, která je nezbytná pro regeneraci poškozeného nervu .136 Regenerační potenciál CNM je využíván i při hojení poškozených částí kůže, obzvláště v situacích obtížně se hojících ran . Například diabetická poškození kůže (rány) jsou velmi rezistentní k jakékoli léčbě a mohou skončit i amputacemi končetin . Literatura uvádí, že použití CNM snižuje riziko infikování poškození kůže a urychluje její vyhojení s proliferací fibroblastů a reepitelizací, a to i v případě zmíněných diabetických ran či závažných popálenin .137 Khalid et al . zjistili, že bakteriální celulóza, osazená MWCNT, indukuje u myší rychlejší uzávěr diabetické rány, reepitalizaci a vytvoření zdravé granulační tkáně . Nově vytvořená tkáň vykázala snížené hladiny prozánětlivých cytokinů (IL-1α a TNF-α) a zvýšené hladiny vaskulárního endotelového růstového faktoru (VEGF) .138 Antimikrobiální účinky CNM, v tomto případě grafenu, potvrdili Du et al . Nitrocelulózová membrána s grafenem, přiložená na myší ránu, zabránila infekci Escherichia coli a Staphylococcus aureus a urychlila uzavření a vyhojení rány .139 1.6 ZÁVĚR CNM mají jedinečné fyzikálně-chemické vlastnosti, které umožňují jejich využití v klinické medicíně . Mohou výrazně zefektivnit, zrychlit, zpřesnit i zlevnit mnohé diagnostické i terapeutické postupy . Mohou najít uplatnění v tak zásadních klinických oborech, jako je onkologie (diatnostika i léčba), biochemie či regenerační medicína . V současné době však stále vyvstává nedořešená otázka toxicity CNM . Zatímco využití v klinické biochemii či při EKG a EEG představuje minimální riziko, u přímého podání musíme zvažovat riziko toxicity a přínosu CNM . Ve prospěch využití CNM v klinické praxi hovoří fakt, že se často jedná o jednorázové vystavení nepříliš vysokým dávkám CNM . Vyšším rizikem je opakované podání či podání vysokých dávek . 1.7 LITERATURA 1 . Thomas DT, Baby A, Raman V et al . Carbon-Based Nanomaterials for Cancer Treatment and Diagnosis: A Review . ChemSelect. 2022;7(36):e202202455 . doi:10 .1002/SLCT .202202455 . 2 . Nadar SS, Patil SP, Kelkar RK et al . Nanobiomaterials for Bioimaging . In: Nanotechnology in Medicine and Biology. Elsevier; 2022:189-234 . doi:10 .1016/B978-0-12-819469-0 .00001-0 . 3 . Liu F, Gao Y, Li H, Sun S . Interaction of Propidium Iodide With Graphene Oxide and Its Application for Live Cell Staining . Carbon. 2014;71:190–195 . doi:10 .1016/j .carbon .2014 .01 .029 . 4 . Liu JJ, Li D, Zhang K, Yang M, Sun H, Yang B . One-Step Hydrothermal Synthesis of Nitrogen- -Doped Conjugated Carbonized Polymer Dots With 31% Efficient Red Emission for In Vivo Imaging . Small. 2018;14(15):1703919 . doi:10 .1002/smll .201703919 . 5 . Sapna K, Sonia J, Kumara BN et al . Carbon Nanotubes for Bio-Imaging Applications . In: Handbook of Carbon Nanotubes. Springer, Cham; 2022 . doi:10 .1007/978-3-030-91346-5_40 . 6 . Liu J, Li R, Yang B . Carbon Dots: A New Type of Carbon-Based Nanomaterial With Wide Applications . ACS Cent Sci. 2020;6(12):2179–2195 . doi:10 .1021/acscentsci .0c01306 . 7 . Patel KD, Singh RK, Kim HW . Carbon-Based Nanomaterials as an Emerging Platform for Theranostics . Mater Horiz. 2019;6(3):434–469 . doi:10 .1039/c8mh00966j . 38 8 . Ghosh D, Bagley AF, Na YJ et al . Deep, Noninvasive Imaging and Surgical Guidance of Submillimeter Tumors Using Targeted M13-Stabilized Single-Walled Carbon Nanotubes . Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(38):13948–13953 . doi:10 .1073/pnas .1400821111 . 9 . Bayoumi NA, Emam AN . 99mTc Radiolabeling of Polyethylenimine Capped Carbon Dots for Tumor Targeting: Synthesis, Characterization and Biodistribution . Int J Radiat Biol. 2021;97(7):977–985 . doi:10 .1080/09553002 .2021 .1919781 . 10 . Kunuku S, Lin BR, Chen CH et al . Nanodiamonds Doped With Manganese for Applications in Magnetic Resonance Imaging . ACS Omega. 2023;8(4):4398–4409 . doi:10 .1021/ACSOMEGA .2C08043 . 11 . Saul P, Schröder L, Schmidt AB, Hövener JB . Nanomaterials for Hyperpolarized Nuclear Magnetic Resonance and Magnetic Resonance Imaging . Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2023;15(4):e1879 . doi:10 .1002/wnan .1879 . 12 . Cherukula K, Lekshmi KM, Uthaman S et al . Multifunctional Inorganic Nanoparticles: Recent Progress in Thermal Therapy and Imaging . Nanomater. 2016;6(4):76 . doi:10 .3390/nano6040076 . 13 . Hu Z, Fang C, Li B et al . First-in-Human Liver-Tumour Surgery Guided by Multispectral Fluorescence Imaging in the Visible and Near-Infrared-I/II Windows . Nat Biomed Eng. 2020;4(3): 259–271 . doi:10 .1038/s41551-019-0494-0 . 14 . Wan H, Yue J, Zhu S et al . A Bright Organic NIR-II Nanofluorophore for Three-Dimensional Imaging into Biological Tissues . Nat Commun. 2018;9(1):1171 . doi:10 .1038/s41467-018-03505-4 . 15 . Liu W, Alam MNA, Liu Y et al . Silicon-Vacancy Nanodiamonds as High Performance Near-Infrared Emitters for Live-Cell Dual-Color Imaging and Thermometry . Nano Lett. 2022;22(7):2881–2888 . doi:10 .1021/acs .nanolett .2c00040 . 16 . Liu H, Guo J, Aryee AA et al . Lighting Up Individual Organelles With Fluorescent Carbon Dots . Front Chem. 2021;9:784851 . doi:10 .3389/FCHEM .2021 .784851 . 17 . Li Z, Ao S, Bu Z et al . Clinical Study of Harvesting Lymph Nodes With Carbon Nanoparticles in Advanced Gastric Cancer: A Prospective Randomized Trial . World J Surg Oncol. 2016;14(1):88 . doi:10 .1186/s12957-016-0835-3 . 18 . Ma JJ, Zhang DB, Zhang WF et al . Application of Nanocarbon in Breast Approach Endoscopic Thyroidectomy Thyroid Cancer Surgery . J Laparoendosc Adv Surg Tech A. 2020;30(5):547–552 . doi:10 .1089/lap .2019 .0794 . 19 . Liu P, Tan J, Tan Q et al . Application of Carbon Nanoparticles in Tracing Lymph Nodes and Locating Tumors in Colorectal Cancer: A Concise Review . Int J Nanomed. 2020;15:9671–9681 . doi:10 .2147/ IJN .S281914 . 20 . Du J, Zhang Y, Ming J et al . Evaluation of the Tracing Effect of Carbon Nanoparticle and Carbon Nanoparticleepirubicin Suspension in Axillary Lymph Node Dissection For Breast Cancer Treatment . World J Surg Oncol. 2016;14:164 . doi:10 .1186/s12957-016-0925-2 . 21 . Xu SW, Li ZF, Xu MB et al . The Role of Carbon Nanoparticle in Lymph Node Detection and Parathyroid Gland Protection During Thyroidectomy: A Meta-Analysis . PLoS One. 2020;15(11):e0223627 . doi:10 .1371/journal .pone .0223627 . 22 . Wang R, Zhan HL, Li DZ et al . Application of Endoscopic Tattooing With Carbon Nanoparticle in the Treatment for Advanced Colorectal Cancer . Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi. 2020;23(1): 56–64 . Chinese . doi:10 .3760/cma .j .issn .1671-0274 .2020 .01 .010 . 23 . Garcia-Cortadella R, Schwesig G, Jeschke C et al . Graphene Active Sensor Arrays for Long- -Term and Wireless Mapping of Wide Frequency Band Epicortical Brain Activity . Nat Commun. 2021;12(1):1–17 . doi:10 .1038/s41467-020-20546-w . 24 . Ko LW, Su CH, Liao PL et al . Flexible Graphene/GO Electrode for Gel-Free EEG . J Neural Eng. 2021;18(4):046060 . doi:10 .1088/1741-2552/abf609 . 25 . Faisal SN, Amjadipour M, Izzo K et al . Non-Invasive On-Skin Sensors for Brain Machine Interfaces With Epitaxial Graphene . J Neural Eng. 2021;18(6):066035 . doi:10 .1088/1741-2552/ac4085 . 26 . Bramini M, Alberini G, Colombo E et al . Interfacing Graphene-Based Materials With Neural Cells . Front Syst Neurosci. 2018;12:12 . doi:10 .3389/fnsys .2018 .00012 . 39 27 . Cui TR, Li D, Huang XR et al . Graphene-Based Flexible Electrode for Electrocardiogram Signal Monitoring . Appl Sci. 2022;12(9):4526 . doi:10 .3390/APP12094526 . 28 . Tasneem NT, Pullano SA, Critello CD, Fiorillo AS, Mahbub I . A Low-Power On-Chip ECG Monitoring System Based on MWCNT/PDMS Dry Electrodes . IEEE Sens J. 2020;20(21):12799–12806 . doi:10 .1109/JSEN .2020 .3001209 . 29 . Murastov G, Bogatova E, Brazovskiy K et al . Flexible and Water-Stable Graphene-Based Electrodes for Long-Term Use in Bioelectronics . Biosens Bioelectron. 2020;166:112426 . doi:10 .1016/ J .BIOS .2020 .112426 . 30 . Lee C, Jeon M, Kim C . Photoacoustic Imaging in Nanomedicine . In: Appl Nanoscience Photomed. Chandos Publishing . 2015:31–47 . doi:10 .1533/9781908818782 .31 . 31 . Jia Z, Dai R, Zheng Z et al . Hollow Carbon-Based Nanosystem for Photoacoustic Imaging-Guided Hydrogenothermal Therapy in the Second Near-Infrared Window . RSC Adv. 2021;11(20): 12022–12029 . doi:10 .1039/d1ra00093d . 32 . De La Zerda A, Zavaleta C, Keren S et al . Carbon Nanotubes as Photoacoustic Molecular Imaging Agents in Living Mice . Nat Nanotechnol. 2008;3(9):557–562 . doi:10 .1038/nnano .2008 .231 . 33 . Han Y, Liu H, Fan M et al . Near-Infrared-II Photothermal Ultra-Small Carbon Dots Promoting Anticancer Efficiency by Enhancing Tumor Penetration . J Colloid Interface Sci. 2022;616:595–604 . doi:10 .1016/j .jcis .2022 .02 .083 . 34 . Liu J, Li R, Yang B . Carbon Dots: A New Type of Carbon-Based Nanomaterial With Wide Applications . ACS Cent Sci. 2020;6(12):2179–2195 . doi:10 .1021/acscentsci .0c01306 . 35 . Cheraghi S, Taher MA, Karimi-Maleh H et al . Novel Enzymatic Graphene Oxide-Based Biosensor for the Detection of Glutathione in Biological Body Fluids . Chemosphere. 2022;287:132187 . doi:10 .1016/j .chemosphere .2021 .132187 . 36 . Chen Y, Zhang Y, Pan F et al . Breath Analysis Based on Surface-Enhanced Raman Scattering Sensors Distinguishes Early and Advanced Gastric Cancer Patients From Healthy Persons . ACS Nano. 2016;10(9):8169–8179 . doi:10 .1021/acsnano .6b01441 . 37 . Peng G, Track E, Haick H . Detecting Simulated Patterns of Lung Cancer Biomarkers by Random Network of Single-Walled Carbon Nanotubes Coated With Nonpolymeric Organic Materials . Nano Lett. 2008;8(11):3631–3635 . doi:10 .1021/nl801577u . 38 . Alagarsamy KN, Mathan S, Yan W et al . Carbon Nanomaterials for Cardiovascular Theranostics: Promises and Challenges . Bioact Mater. 2021;6(8):2261–2280 . doi:10 .1016/j .bioactmat .2020 .12 .030 . 39 . Demirbakan B, Sezgintürk MK . A Novel Ultrasensitive Immunosensor Based on Disposable Graphite Paper Electrodes for Troponin T Detection in Cardiovascular Disease . Talanta. 2020;213:120779 . doi:10 .1016/j .talanta .2020 .120779 . 40 . Papanikolaou E, Simos YV, Spyrou K et al . Is Graphene the Rock Upon Which New Era Continuous Glucose Monitors Could Be Built? Exp Biol Med. 2023;248(1):14–25 . doi:10 .1177/ 15353702221134105 . 41 . Lin Y, Lu F, Tu Y, Ren Z . Glucose Biosensors Based on Carbon Nanotube Nanoelectrode Ensembles . Nano Lett. 2004;4(2):191–195 . doi:10 .1021/nl0347233 . 42 . Reghunath R, Devi K, Singh KK . Recent Advances in Graphene Based Electrochemical Glucose Sensor . Nano-Struct Nano-Obj. 2021;26:100750 . doi:10 .1016/j .nanoso .2021 .100750 . 43 . Alagappan M, Immanuel S, Sivasubramanian R et al . Development of Cholesterol Biosensor Using Au Nanoparticles Decorated f-MWCNT Covered With Polypyrrole Network . Arab J Chem. 2020;13(1):2001–2010 . doi:10 .1016/j .arabjc .2018 .02 .018 . 44 . Agnihotri N, Chowdhury AD, De A . Non-Enzymatic Electrochemical Detection of Cholesterol Using β-Cyclodextrin Functionalized Graphene . Biosens Bioelectron. 2015;63:212–217 . doi:10 .1016/j .bios .2014 .07 .037 . 45 . Aminabad ED, Mobed A, Hasanzadeh M et al . Sensitive Immunosensing of α-Synuclein Protein in Human Plasma Samples Using Gold Nanoparticles Conjugated With Graphene: An Innovative 40 Immuno-Platform Towards Early Stage Identification of Parkinson’s Disease Using Point of Care (POC) Analysis . RSC Adv. 2022;12(7):4346–4357 . doi:10 .1039/d1ra06437a . 46 . Peña-Bahamonde J, Nguyen HN, Fanourakis SK et al . Recent Advances in Graphene-Based Biosensor Technology With Applications in Life Sciences . J Nanobiotechnol. 2018;16(1):75 . doi:10 .1186/ s12951-018-0400-z . 47 . Kim S, Ryu H, Tai S et al . Real-Time Ultra-Sensitive Detection of SARS-CoV-2 by Quasi-Freestanding Epitaxial Graphene-Based Biosensor . Biosens Bioelectron. 2022;197:113803 . doi:10 .1016/ j .bios .2021 .113803 . 48 . Zhu A, Luo X . Detection of Covid-19 Through a Heptanal Biomarker Using Transition Metal Doped Graphene . J Phys Chem B. 2022;126(1):151–160 . doi:10 .1021/acs .jpcb .1c09580 . 49 . Jia H, Zhang A, Yang Y et al . A Graphene Oxide Coated Tapered Microfiber Acting as a Super- -Sensor for Rapid Detection of SARS-CoV-2 . Lab Chip. 2021;21(12):2398–2406 . doi:10 .1039/ d0lc01231a . 50 . Wu G, Zhang N, Matarasso A et al . Implantable Aptamer-Graphene Microtransistors for Real-Time Monitoring of Neurochemical Release in Vivo . Nano Lett. 2022;22(9):3668–3677 . doi:10 .1021/ acs .nanolett .2c00289 . 51 . Hashemi SA, Mousavi SM, Faghihi R et al . Superior X-Ray Radiation Shielding Effectiveness of Biocompatible Polyaniline Reinforced With Hybrid Graphene Oxide-Iron Tungsten Nitride Flakes . Polymers (Basel). 2020;12(6):1407 . doi:10 .3390/polym12061407 . 52 . Silva LA, Batista AMS, Serodre T et al . Enhancement of X-Ray Shielding Properties of PVDF/ BaSO4 Nanocomposites Filled With Graphene Oxide . MRS Adv. 2019;4(3–4):169–175 . doi:10 .1557/ adv .2018 .651 . 53 . Fujimori T, Tsuruoka S, Fugetsu B et al . Enhanced X-Ray Shielding Effects of Carbon Nanotubes . Mater Express. 2011;1(4):273–278 . doi:10 .1166/mex .2011 .1043 . 54 . Viegas J, Silva LA, Batista AMS et al . Increased X-Ray Attenuation Efficiency of Graphene-Based Nanocomposite . Ind Eng Chem Res. 2017;56(41):11782–11790 . doi:10 .1021/acs .iecr .7b02711 . 55 . Zarei M, Sina S, Hashemi SA . Superior X-Ray Radiation Shielding of Biocompatible Platform Based on Reinforced Polyaniline by Decorated Graphene Oxide With Interconnected Tungsten–Bismuth– Tin Complex . Radiat Phys Chem. 2021;188:109588 . doi:10 .1016/j .radphyschem .2021 .109588 . 56 . Türkaslan SS, Ugur ŞS, Türkaslan BE et al . Evaluating the X-Ray-Shielding Performance of Graphene-Oxide-Coated Nanocomposite Fabric . Mater. 2022;15(4):1441 . doi:10 .3390/MA 15041441 . 57 . Zheng Y, Pescatore N, Gogotsi Y et al . Rapid Adsorption of Proinflammatory Cytokines by Graphene Nanoplatelets and Their Composites for Extracorporeal Detoxification . J Nanomater. 2018;2018:6274072 . doi:10 .1155/2018/6274072 . 58 . Seredych M, Haines B, Sokolova V et al . Graphene-Based Materials for the Fast Removal of Cytokines From Blood Plasma . ACS Appl Bio Mater. 2018;1(2):436–443 . doi:10 .1021/acsabm .8b00151 . 59 . Yoo W, Lee W, Kim HN et al . Nanodiamond as a Cytokine Sponge in Infectious Diseases . Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:862495 . doi:10 .3389/fbioe .2022 .862495 . 60 . Wu S, Duan B, Zeng X et al . Construction of Blood Compatible Lysine-Immobilized Chitin/Carbon Nanotube Microspheres and Potential Applications for Blood Purified Therapy . J Mater Chem B. 2017;5(16):2952–2963 . doi:10 .1039/c7tb00101k . 61 . Irfan M, Irfan M, Idris A et al . Fabrication and Performance Evaluation of Blood Compatible Hemodialysis Membrane Using Carboxylic Multiwall Carbon Nanotubes and Low Molecular Weight Polyvinylpyrrolidone Based Nanocomposites . J Biomed Mater Res A. 2019;107(3):513–525 . doi:10 .1002/jbm .a .36566 . 62 . Vakhrushev AV, Vakhrushev AA, Chuckova NN et al . Adsorption of Cholesterol by Carbon Na notubes . In: Carbon Nanotubes and Nanoparticles. Apple Academic Press; 2019:65–80 . doi:10 .1201 /9780429463877-4 . 41 63 . Hsieh HS, Wu R, Jafvert CT . Light-Independent Reactive Oxygen Species (ROS) Formation Through Electron Transfer From Carboxylated Single-Walled Carbon Nanotubes in Water . Environ Sci Technol. 2014;48(19):11330–11336 . doi:10 .1021/es503163w . 64 . Ge J, Lan M, Zhou B et al . A Graphene Quantum Dot Photodynamic Therapy Agent With High Singlet Oxygen Generation . Nat Commun. 2014;5(1):1–8 . doi:10 .1038/ncomms5596 . 65 . Chen L, Chen M, Zhou Y, Ye C, Liu R . NIR Photosensitizer for Two-Photon Fluorescent Imaging and Photodynamic Therapy of Tumor . Front Chem. 2021;9:629062 . doi:10 .3389/fchem .2021 .629062 . 66 . de Freitas LF . Nanomaterials for Enhanced Photodynamic Therapy . In: Photodynamic Therapy – From Basic Science to Clinical Research . IntechOpen; 2021 . doi:10 .5772/intechopen .94255 . 67 . Cuadrado CF, Díaz-Barrios A, Campaña KO et al . Broad-Spectrum Antimicrobial ZnMintPc Encapsulated in Magnetic-Nanocomposites With Graphene Oxide/MWCNTs Based on Bimodal Action of Photodynamic and Photothermal Effects . Pharmaceutics. 2022;14(4):705 . doi:10 .3390/ pharmaceutics14040705 . 68 . Chen Y, Huang W, Dong Y, Yu X, Mo A, Peng Q . Enhanced Antibacterial Activity of Indocyanine Green-Loaded Graphene Oxide via Synergistic Contact Killing, Photothermal and Photodynamic Therapy . J Biomed Nanotechnol. 2022;18(1):185–192 . doi:10 .1166/jbn .2022 .3236 . 69 . Lu H, Zhao Q, Wang X et al . Multi-Stimuli Responsive Mesoporous Silica-Coated Carbon Nanoparticles for Chemo-Photothermal Therapy of Tumor . Colloids Surf B Biointerfaces. 2020;190:110941 . doi:10 .1016/j .colsurfb .2020 .110941 . 70 . Yu J, Yang L, Yan J, Wang WC, Chen YC, Chen HH, Lin CH . Carbon Nanomaterials for Photothermal Therapies . In: Hui YY, Chang HC, Dong H, Zhang X, eds . Carbon Nanomaterials for Bioimaging, Bioanalysis, and Therapy . John Wiley & Sons Ltd . 2019:309–340 . doi:10 .1002/9781119373476 .ch12 . 71 . McKernan P, Virani NA, Faria GNF et al . Targeted Single-Walled Carbon Nanotubes for Photothermal Therapy Combined With Immune Checkpoint Inhibition for the Treatment of Metastatic Breast Cancer . Nanoscale Res Lett. 2021;16(1):1–9 . doi:10 .1186/s11671-020-03459-x . 72 . Wang S, Jin S, Li G et al . Transmucosal Delivery of Self-Assembling Photosensitizer-Nitazoxanide Nanocomplexes With Fluorinated Chitosan for Instillation-Based Photodynamic Therapy of Orthotopic Bladder Tumors . ACS Biomater Sci Eng. 2021;7(4):1485–1495 . doi:10 .1021/acsbiomaterials .0c01786 . 73 . Xu P, Liang F . Nanomaterial-Based Tumor Photothermal Immunotherapy . Int J Nanomed. 2020;15:9159–9180 . doi:10 .2147/IJN .S249252 . 74 . Cheng J, Liu Y, He L et al . Novel Multifunctional Nanoagent for Visual Chemo/Photothermal Therapy of Metastatic Lymph Nodes via Lymphatic Delivery . ACS Omega. 2020;5(7):3194–3206 . doi:10 .1021/acsomega .9b03258 . 75 . Li Y, Su Y, Pan H et al . Nanodiamond-Based Multifunctional Platform for Oral Chemo-Photothermal Combinational Therapy of Orthotopic Colon Cancer . Pharmacol Res. 2022;176:106080 . doi:10 .1016/j .phrs .2022 .106080 . 76 . Zhou L, Jing Y, Liu Y et al . Mesoporous Carbon Nanospheres as a Multifunctional Carrier for Cancer Theranostics . Theranostics. 2018;8(3):663–675 . doi:10 .7150/THNO .21927 . 77 . van Eden W . Vaccination Against Autoimmune Diseases Moves Closer to the Clinic . Hum Vaccin Immunother. 2020;16(2):228–232 . doi:10 .1080/21645515 .2019 .1593085 . 78 . Gottardi R, Douradinha B . Carbon Nanotubes as a Novel Tool for Vaccination Against Infectious Diseases and Cancer . J Nanobiotechnol. 2013;11(1):1–7 . doi:10 .1186/1477-3155-11-30 . 79 . Scheinberg DA, McDevitt MR, Dao T, Mulvey JJ, Feinberg E, Alidori S . Carbon Nanotubes as Vaccine Scaffolds . Adv Drug Deliv Rev. 2013;65(15):2016–2022 . doi:10 .1016/j .addr .2013 .07 .013 . 80 . Dong C, Wang Y, Gonzalez GX et al . Intranasal Vaccination With Influenza HA/GO-PEI Nanoparticles Provides Immune Protection Against Homo-and Heterologous Strains . Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(19):e2024998118 . doi:10 .1073/pnas .2024998118 . 48 K absorpci a následné translokaci do systémové cirkulace dochází rovněž po perorální expozici . Po intraperitoneálním podání se částice dostávají do kontaktu s orgány v dutině břišní a různou měrou prostupují do jejich tkání .27,28 Prostup CNM do tkání závisí na typu buněk, jejich proliferační a regenerační aktivitě a na obranných mechanismech jejich povrchových vrstev (přítomnost povrchově aktivních látek, slzného filmu či hlenu a pohyb řasinek) .29 Některé tkáně a orgány jsou schopny ve zvýšené míře CNM vylučovat (ledviny, dýchací cesty), jiné, zejména retikuloendoteliální tkáně, CNM kumulují (lymfatické uzliny, plíce, slezina, játra) .30,31 Hlavním mechanismem záchytu CNM v RES je pravděpodobně opsonizace . Snížení míry této formy záchytu je možné dosáhnout oslabením interakcí mezi CNM a opsoniny, například cestou redukce povrchového náboje nebo zvýšením hydrofility částice .32 Jednu z nejúčinnějších forem funkcionalizace CNM za účelem dosažení proteinové rezistence představuje potažení částic PEG .33,34 Výsledky studií uvádějí, že CNM pokryté PEG cirkulují déle a jsou RES zachycovány méně . Další důležitou vlastností CNP je jejich schopnost procházet hematoencefalickou bariérou .35,36 2.3 PROSTUP DO INTRACELULÁRNÍHO PROSTŘEDÍ A MECHANISMY BUNĚČNÉ TOXICITY Na buněčné úrovni závisí translokace CNM do intracelulárního prostoru především na míře a charakteru interakcí částic s buněčnou membránou, které jsou, společně s interakcemi částic s vnitrobuněčným prostředím hlavními determinujícími faktory buněčné toxicity a genotoxicity .6,37 Mezi nejznámější formy internalizace nanočástic jsou řazeny fagocytóza, makropinocytóza a mikropinocytóza, endocytóza závislá na klatrinu, endocytóza nezávislá na klatrinu, endocytóza závislá na kaveolinu, difúze atd .38–40 CNM tak mohou pronikat přímo do cytoplazmy, mohou do ní být uvolňovány z endozomů nebo mohou být internalizovány do vezikul vytvořených z buněčné membrány během endocytózy (endozomy, fagozomy a pinozomy) .41,42 V intracelulárním prostředí CNM interagují s mitochondriemi, endoplazmatickým retikulem a jádrem . Mohou ovlivňovat genom a interferovat se signálními cestami . V závislosti na charakteru CNM dochází v intracelulárním prostředí k jejich modifikaci . CNM (či jejich modifikované formy) jsou z buněk odstraňovány exocytózou .43 Mezi nejznámější mechanismy buněčné toxicity (indukované CNM) patří narušování buněčných membrán, včetně membrán organel a jádra (poškození buněčné integrity a funkcí organel), tvorba reaktivních forem kyslíku (ROS), interakce s enzymy, změny stability buněčného skeletu, změny buněčného cyklu, redukce mitózy, indukce apoptózy, interakce s DNA, indukce genové transkripce (prozánětlivé cytokiny) a epigenetických změn, změny replikace a translace, narušení opravných mechanismů DNA, spuštění zánětlivé odpovědi, sestavování multiproteinových komplexů (inflamazomů), produkce prozánětlivých cytokinů, uvolňování alarminů a prezentace intracelulárních antigenů .12,44 49 2.4 ZÁVĚR CNM představují vysoce heterogenní skupinu látek, jejíž členové se výrazně odlišují svými fyzikálně-chemickými vlastnostmi, a hlavně chováním v živých organismech . Mají různou schopnost pronikat do organismu a tkání, interagovat s buňkami a vstupovat do nich, ovlivňovat buněčnou aktivitu, a jsou také různě úspěšně eliminovány z organismu, tj . někdy může docházet ke tkáňové kumulaci . Velmi pestrá paleta interakcí s vnějším i vnitřním prostředím se tak stává základem pro jejich široké využití CNM nejen v medicíně, ale i v dalších oborech lidské činnosti . Zároveň s tím je však nutné mít na paměti, že CNM mohou vykazovat také určitou míru toxicity a vést k poškození životního prostředí, flóry a fauny včetně člověka . V následujících kapitolách bychom se oběma aspektům chtěli věnovat podrobněji . 2.5 LITERATURA 1 . Nasir S, Hussein MZ, Zainal Z, Yusof NA . Carbon-Based Nanomaterials/Allotropes: A Glimpse of Their Synthesis, Properties and Some Applications . Mater. 2018;11(2):295 . doi:10 .3390/ ma11020295 . 2 . Zarzycki PK . Pure and Functionalized Carbon-Based Nanomaterials: Analytical, Biomedical, Civil, and Environmental Engineering Applications. Routledge; 2022 . ISBN: 9780367532147 . 3 . Rahmati M, Mozafari M . Biological Response to Carbon-Family Nanomaterials: Interactions at the Nano-Bio Interface . Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:4 . doi:10 .3389/fbioe .2019 .00004 . 4 . Lee A, Beak S, Lee S et al . Hydrophilic/Hydrophobic Characteristics on the Carbon Nanotube Buckypapers With Various Mechanical and Chemical Manufacture Process . Diam Relat Mater. 2020;110:108152 . doi:10 .1016/J .DIAMOND .2020 .108152 . 5 . Camilli L, Capista D, Eramo P et al . Synthesis of Hydrophilic Carbon Nanotube Sponge via Post- -Growth Thermal Treatment . Nanotechnology. 2022;33(24):245707 . doi:10 .1088/1361-6528/ AC5BB7 . 6 . Sousa De Almeida M, Susnik E, Drasler B, Taladriz-Blanco P, Petri-Fink A, Rothen-Rutishauser B . Understanding Nanoparticle Endocytosis to Improve Targeting Strategies in Nanomedicine . Chem Soc Rev. 2021;50(9):5397–5434 . doi:10 .1039/d0cs01127d . 7 . Feng L, Liu Z . Biomedical Applications and Toxicology of Carbon Nanomaterials . In: Chen C, Wang H, eds . Biomedical Applications of Carbon Nanomaterials. Wiley-VCH; 2016:131–162 . doi:10 .1002/9783527692866 .ch5 . 8 . Weiss M, Fan J, Claudel M et al . Density of Surface Charge Is a More Predictive Factor of the Toxicity of Cationic Carbon Nanoparticles Than Zeta Potential . J Nanobiotechnology. 2021;19(1):5 . doi:10 .1186/s12951-020-00747-7 . 9 . Rauti R, Musto M, Bosi S, Prato M, Ballerini L . Properties and Behavior of Carbon Nanomaterials When Interfacing Neuronal Cells: How Far Have We Come? Carbon. 2019;143:430–446 . doi:10 .1016/J .CARBON .2018 .11 .026 . 10 . Lin Z, Zhang H, Huang J, et ak, Biodistribution of Single-walled Carbon Nanotubes in Rats, Toxicology Research . 2014; 3(6): 497–502 . doi .org/10 .1039/c3tx50059d . 11 . Cohignac V, Landry MJ, Ridoux A et al . Carbon Nanotubes, but Not Spherical Nanoparticles, Block Autophagy by a Shape-Related Targeting of Lysosomes in Murine Macrophages . Autophagy. 2018;14(8):1323–1334 . doi:10 .1080/15548627 .2018 .1474993 . 12 . Yuan X, Zhang X, Sun L, Wei Y, Wei X . Cellular Toxicity and Immunological Effects of Carbon- -Based Nanomaterials . Part Fibre Toxicol. 2019;16(1):1–27 . doi:10 .1186/S12989-019-0299-Z . 50 13 . Figarol A, Pourchez J, Boudard D et al . In Vitro Toxicity of Carbon Nanotubes, Nano-Graphite and Carbon Black, Similar Impacts of Acid Functionalization . Toxicol Vitr. 2015;30(1):476–485 . doi:10 .1016/j .tiv .2015 .09 .014 . 14 . Speranza G . Carbon Nanomaterials: Synthesis, Functionalization and Sensing Applications . Nanomater. 2021;11(4):967 . doi:10 .3390/nano11040967 . 15 . Díez-Pascual AM . Chemical Functionalization of Carbon Nanotubes With Polymers: A Brief Overview . Macromol. 2021;1(2):64–83 . doi:10 .3390/macromol1020006 . 16 . Bilardo R, Traldi F, Vdovchenko A, Resmini M . Influence of Surface Chemistry and Morphology of Nanoparticles on Protein Corona Formation . Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2022;14(4):e1788 . doi:10 .1002/WNAN .1788 . 17 . Yu Q, Zhao L, Guo C, Yan B, Su G . Regulating Protein Corona Formation and Dynamic Protein Exchange by Controlling Nanoparticle Hydrophobicity . Front Bioeng Biotechnol. 2020;8:210 . doi:10 .3389/fbioe .2020 .00210 . 18 . Pinals RL, Yang D, Rosenberg DJ et al . Protein Corona Composition and Dynamics on Carbon Nanotubes in Blood Plasma and Cerebrospinal Fluid . bioRxiv . Published January 13, 2020 . doi:10 .1101/2020 .01 .13 .905356 . 19 . Kenry . Understanding the Hemotoxicity of Graphene Nanomaterials Through Their Interactions With Blood Proteins and Cells . J Mater Res. 2018;33(1):44–57 . doi:10 .1557/jmr .2017 .388 . 20 . Palmieri V, Perini G, De Spirito M, Papi M . Graphene Oxide Touches Blood: In Vivo Interactions of Bio-Coronated 2D Materials . Nanoscale Horiz. 2019;4(2):273–290 . doi:10 .1039/C8NH00318A . 21 . Gatoo MA, Naseem S, Arfat MY, Mahmood Dar A, Qasim K, Zubair S . Physicochemical Properties of Nanomaterials: Implication in Associated Toxic Manifestations . Biomed Res Int. 2014;2014(1):498420 . doi:10 .1155/2014/498420 . 22 . Podkolodnaya OA, Ignatieva EV, Podkolodnyy NL, Kolchanov NA . Routes of Nanoparticle Uptake Into Mammalian Organisms, Their Biocompatibility and Cellular Effects . Biol Bull Rev. 2012;2(4):279–289 . doi:10 .1134/s2079086412040068 . 23 . Paramasivam G, Palem VV, Meenakshy S et al . Advances on Carbon Nanomaterials and Their Applications in Medical Diagnosis and Drug Delivery . Colloids Surf B Biointerfaces . 2024;241:114032 . doi: 10 .1016/j .colsurfb .2024 .114032 . 24 . Holmannova D, Borsky P, Svadlakova T, Borska L, Fiala Z . Carbon Nanoparticles and Their Biomedical Applications . Appl Sci. 2022;12(15):7865 . doi:10 .3390/APP12157865 . 25 . Nemmar A, Hoet PHM, Vanquickenborne B et al . Passage of Inhaled Particles Into the Blood Circulation in Humans . Circulation. 2002;105(4):411–414 . doi:10 .1161/hc0402 .104118 . 26 . Laux P, Riebeling C, Booth AM et al . Biokinetics of Nanomaterials: The Role of Biopersistence . NanoImpact. 2017;6:69–80 . doi:10 .1016/J .IMPACT .2017 .03 .003 . 27 . Jacobsen NR, Møller P, Clausen PA et al . Biodistribution of Carbon Nanotubes in Animal Models . Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2017;121:30–43 . doi:10 .1111/bcpt .12705 . 28 . Chenthamara D, Subramaniam S, Ramakrishnan SG et al . Therapeutic Efficacy of Nanoparticles and Routes of Administration . Biomater Res . 2019;23(1) . doi:10 .1186/s40824-019-0166-x . 29 . Zhang Y, Bai Y, Jia J et al . Perturbation of Physiological Systems by Nanoparticles . Chem Soc Rev. 2014;43(10):3762–3809 . doi:10 .1039/c3cs60338e . 30 . Mortensen NP, Snyder RW, Pathmasiri W, Moreno Caffaro M, Sumner SJ, Fennell TR . Intravenous Administration of Three Multiwalled Carbon Nanotubes to Female Rats and Their Effect on Urinary Biochemical Profile . J Appl Toxicol. 2022;42(3):409–422 . doi:10 .1002/jat .4226 . 31 . Zhang A, Meng K, Liu Y et al . Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion of Nanocarriers in Vivo and Their Influences . Adv Colloid Interface Sci. 2020;284:102261 . doi:10 .1016/ J .CIS .2020 .102261 . 32 . Kotagiri N, Kim JW . Stealth Nanotubes: Strategies of Shielding Carbon Nanotubes to Evade Opsonization and Improve Biodistribution . Int J Nanomedicine. 2014;9(Supplement 1):85–105 . doi:10 .2147/IJN .S51854 . 51 33 . Yang ST, Luo J, Zhou Q, Wang H . Pharmacokinetics, Metabolism and Toxicity of Carbon Nanotubes for Bio-Medical Purposes . Theranostics. 2012;2(3):271–282 . doi:10 .7150/thno .3618 . 34 . Tang Y, Wang X, Li J et al . Overcoming the Reticuloendothelial System Barrier to Drug Delivery With a “Don’t-Eat-Us” Strategy . ACS Nano. 2019; 13(11):13015–13026 . doi:10 .1021/ACSNANO .9B05679 . 35 . Hasannejad-Asl B, Pooresmaeil F, Choupani E et al . Nanoparticles as Powerful Tools for Crossing the Blood-Brain Barrier . CNS Neurol Disord Drug Targets. 2022;22(1):18–26 . doi:10 .2174/187152 7321666220222092655 . 36 . Gonzalez-Carter D, Goode AE, Kiryushko D et al . Quantification of Blood–Brain Barrier Transport and Neuronal Toxicity of Unlabelled Multiwalled Carbon Nanotubes as a Function of Surface Charge . Nanoscale. 2019;11(45):22054–22069 . doi:10 .1039/C9NR02866H . 37 . Augustine R, Hasan A, Primavera R, Wilson RJ, Thakor AS, Kevadiya BD . Cellular Uptake and Retention of Nanoparticles: Insights on Particle Properties and Interaction With Cellular Components . Mater Today Commun. 2020;25:101692 . doi:10 .1016/J .MTCOMM .2020 .101692 . 38 . Foroozandeh P, Aziz AA . Insight Into Cellular Uptake and Intracellular Trafficking of Nanoparticles . Nanoscale Res Lett. 2018;13(1):1–12 . doi:10 .1186/S11671-018-2728-6 . 39 . Mosquera J, García I, Liz-Marzán LM . Cellular Uptake of Nanoparticles Versus Small Molecules: A Matter of Size . Acc Chem Res. 2018;51(9):2305–2313 . doi:10 .1021/ACS .ACCOUNTS .8B00292 . 40 . Singh U, Teja AG, Walia S, Vaswani P, Dalvi S, Bhatia D . Water Stable, Red Emitting, Carbon Nanoparticles Stimulate 3D Cell Invasion Via Clathrin-Mediated Endocytic Uptake . Nanoscale Adv. 2022;4(5):1375–1386 . doi:10 .1039/D1NA00813G . 41 . Zhao J, Stenzel MH . Entry of Nanoparticles Into Cells: The Importance of Nanoparticle Properties . Polym Chem. 2018;9(3):259–272 . doi:10 .1039/C7PY01603D . 42 . Li Y, Shi Z, Radauer-Preiml I et al . Immunotoxicity of Carbon-Based Nanomaterials, Starring Phagocytes . Int J Mol Sci. 2022;23(16):8889 . doi:10 .3390/IJMS23168889 . 43 . Oh N, Park JH . Endocytosis and Exocytosis of Nanoparticles in Mammalian Cells . Int J Nanomedicine. 2014;9(Supplement 1):51–63 . doi:10 .2147/IJN .S26592 . 44 . Marano F, Rodrigues-Lima F, Dupret JM, Baeza-Squiban A, Boland S . Cellular Mechanisms of Nanoparticle Toxicity . In: Bhushan B, ed . Encyclopedia of Nanotechnology. Springer; 2016: 498–505 . doi:10 .1007/978-94-017-9780-1_175 . 52 3 RESPIRAČNÍ TOXICITA Dýchací systém je řazen k nejvýznamnějším cestám vstupu škodlivin do organismu . Inhalační expozice uhlíkovým nanomateriálům (CNM) může indukovat širokou škálu reakcí, včetně patologických procesů reprezentovaných rozvojem akutního nebo chronického zánětu s infiltrací tkáně imunitními buňkami a zvýšenou hladinou oxidačního stresu . Dalšími příklady patologických dějů souvisejících s expozicí CNM mohou být poškození genomu a rozvoj nádorového bujení . Důležitým fenoménem patologických procesů je změna složení mikrobioty dýchacích cest indukovaná expozicí, která zánět a související poškození dále posiluje . Na buněčné úrovni dochází v důsledku inhalační expozice CNM k narušení buněčných membrán, apoptóze, poškození DNA, epigenetickým změnám, mitochondriální a lysozomální dysfunkci, narušení cytoskeletu a mitózy, transformaci buněk a k formování kolagenních deposit (fibrotizace) či tvorbě granulomů . CNM nepoškozují pouze respirační epitel, s nímž jsou v první fázi vniknutí do dýchacích cest v přímém kontaktu, ale také podslizniční tkáň, kde se nachází svalovina dýchacích cest a další tkáně . Ovlivňují též složení surfaktantu . Intenzita a rozsah poškození respiračního systému je dán fyzikálně-chemickými vlastnostmi CNM . Velikost, průměr, tvar, plocha a komponenty navázané na povrch částic (funkcionalizace) modifikují vstup částic do různých regionů dýchacího systému . Zde mohou CNM vytvářet depozita nebo mohou být translokovány mimo dýchací cesty mechanismem transcytózy skrze epitelové buňky (a bariéru vzduch–krev) nebo mechanismem translokace pomocí fagocytujících buněk . Další možností jejich translokace je mukociliární či fagocytární clearance . Penetrační potenciál mají hlavně vláknité nanočástice, které se poměrně snadno dostávají do pleury, lymfatických uzlin, jater, ledvin, kardiovaskulárního systému a mohou vyvolávat řadu orgánových onemocnění .1–3 Některé CNM ve tkáních perzistují; příkladem může být grafen, který zůstává deponován ve tkáních delší dobu než jeho oxidované formy, které jsou snáze rozložitelné enzymy exprimovanými neutrofily (například myeloperoxidáza) či oxidačními procesy .4 Bylo uvedeno, že CNM mohou vyvolávat nežádoucí reakce akutního či chronického charakteru . Z tohoto důvodu jsou některé z nich v pracovním prostředí považovány za rizikové .5 V roce 2013 vydal National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) bulletin, v němž shrnuje výsledky padesáti čtyř in vivo studií, ve kterých byla experimentální zvířata exponována jednovrstevným (SWCNT) a vícevrstvým (MWCNT) nanotrubicím . Expozice vyvolávaly lokální i systémovou odpověď, která zahrnovala zánět, tvorbu granulomů a plicní fibrózu .6 V roce 2014 klasifikovala International Agency for Research on Cancer (IARC) MWCNT-7 jako skupinu 2B, tedy jako potenciální lidský karcinogen .7 53 3.1 IN VITRO STUDIE In vitro pokusy testující respirační toxicitu byly doposud nejčastěji prováděny na primárních bronchiálních epitelových buňkách, alveolárních epitelových buňkách, rezidentních imunitních buňkách a na vrstvách, které chrání sliznici dýchacích cest (například na surfaktantu) . Většina těchto studií prokázala toxické účinky CNM v podobě indukce zánětu a senescence, zvýšení hladiny oxidačního stresu, poškození DNA, epigenetických změn a změn v proteomu a lipidomu . Nejčastěji testovanými CNM jsou grafen, oxid grafenu (GO) a jeho deriváty, uhlíkové nanotrubice (CNT) a uhlíkové nanorohy (CNH) . Autoři Frontiñan-Rubio et al . testovali na normálních lidských bronchiálních epitelových buňkách (NHBE) a na nádorových buňkách lidského plicního karcinomu (A549) toxicitu GO, vícevrstevného grafenu (FLG) a malého vícevrstevného grafenu (sFLG) . Již po šesti až dvaceti čtyřech hodinách indukovala expozice CNM četné buněčné nekrózy a apoptózy . Cytotoxicita se zvyšovala po dobu sedmi dní, 90% úmrtnosti buněk bylo dosaženo při koncentracích 5 µg/ml . Jako rezistentnější vůči expozici se jevila buněčná kultura A549 .8 V jiných studiích hodnotily týmy vedené Nafisehem Nasirzadehem a Srikanthem Vallabanim toxicitu grafenu a GO na dvou typech buněk dýchacích cest . Jednalo se o buněčnou linii A549 a nenádorovou plicní epitelovou buněčnou linii (BEAS-2B) . V obou studiích byla potvrzena cytotoxicita obou testovaných CNM . Toxicita byla závislá na výši a délce expozice . Inhibiční koncentrace grafenu (IC50) byla 40653 µg/ml, koncentrace bez účinku 0,059 µg/ml .9,10 Hodnocení cytotoxického účinku derivátů grafenu vůči buňkám respiračního traktu se věnovala i skupina autorů Mittal et al . Ve svém experimentu porovnávala cytotoxický účinek GO, teplem redukovaného GO a chemicky redukovaného GO na BEAS-2B a A549 buněčné linie . I tato skupina autorů prokázala závislost míry respirační toxicity na fyzikálně-chemických vlastnostech CMN . Vyšší toxicitu vykazovaly částice s redukovanou laterální velikostí a vyšším počtem funkčních skupin . Zajímavým poznatkem bylo zjištění, že různé typy GO indukují rozdílné typy buněčné smrti . Smrt byla ve většině případů vyvolána zvýšenou hladinou oxidačního stresu . Jako senzitivnější se v těchto experimentech jevila buněčná linie A549 .11 Velmi důležitou kapitolu v testování respirační toxicity CNM tvoří experimenty s CNT . Například autoři Azari et al . studovali toxicitu krátkých a dlouhých MWCNT (8–26 nm a 2,11–7,20 μm) a grafitu vůči buněčné linii A549 . Oba typy MWCNT vykazovaly cytotoxicitu již od koncentrace 8 μg/ml, zatímco u grafitu byla hraniční koncentrace 16 μg/ml . Autoři nalezli významně zvýšené úrovně oxidačního stresu a peroxidace lipidů . Oba ukazatele negativně korelovaly s viabilitou buněk . Z testovaných materiálů vykazoval nejnižší toxicitu grafit .12 Ve studii Barthel et al . byla testována toxicita dvou typů MWCNT (NM-403 a Mitsui-7) vůči buněčné linii BEAS-2B . Buňky byly exponovány koncentracím 0,125-1 µg/cm2 po dobu šesti týdnů . Již po čtyřech týdnech expozice indukovaly oba typy MWCNT nevratné morfologické změny, epiteliální mezenchymální tranzici, mitotické abnormality a tvorbu mikrojader .13 Poněkud odlišné výsledky prezentovali Phuyal et al . Ani třináctitýdenní expozice nenádorových buněk lidského bronchiálního epitelu (HBEC-3KT) MWCNT (koncentrace 1,92 mg/cm2 a 0,96 mg/cm2) neovlivnila viabilitu buněk a nepoškozovala jejich DNA . Na druhou stranu autoři pozorovali sníženou míru buněčné proliferace, zvýšenou hladinu oxidačního stresu a změny proteomu a lipidomu . Posledně uvedené zahrnovalo zvýšenou expresi 54 proapoptotických molekul Bax, HIF-1α (hypoxia-inducible factor 1-alpha) a HSP70 (heat shock protein 70) . Poněkud překvapivé byly nálezy zvýšených koncentrací triglyceridů, sfingomyelinu, ceramidů, fosfatidyletanolaminů a cholesterolu .14 Některé CNM zřejmě zasahují i do epigenetických charakteristik biologických systémů formou změn genomových metylací . Autoři Li et al . exponovali buněčnou linii A549 nízkým koncentracím fullerenu, MWCNT a SWCNT . Z výsledků vyplývá, že již koncentrace 0,1 mg/l zvyšovaly míru globální metylace a redukovaly expresi DNA metyltransferázy, hlavně DNMT3b . Pozorovaný jev ovlivňuje expresi řady genů, což má za následek změny v proteomu .15 Další důkazy o schopnosti CNM zasahovat do exprese genů přinesla studie autorů Chena et al . Jejich experiment byl prováděn na buňkách BEAS-2B, které byly exponovány po dobu šesti měsíců subchronickým dávkám SWCNT (0,1 μg/ml) . Autoři pozorovali spuštění maligní transformace aktivací signálních cest Akt/p53/Bcl-2, zvýšení exprese proteinů z rodiny Ras a antiapoptotického Bcl-2, snížení exprese proapoptotické molekuly Bax a destabilizaci exprese p53 .16 Ve studii autorů Spannbruckera et al . se prokázalo, že CNM disponují potenciálem k navození buněčné senescence (charakteristický znak stárnutí) . V první z těchto studií byly potkaní plicní epitelové buňky RLE-6TN exponovány CNM s komerčním názvem Printex 90 (zbavených endotoxinů) . Expoziční dávky bez prokázané cytotoxicity měly za následek nevratnou redukci proliferace (a kumulaci) proteinů blokujících buněčný cyklus (p21 a p16), tedy navodily senescenci . Snížila se též aktivita redox senzitivní histonové deacetylázy SIRT1 a koncentrace konexinu-43 . Také výsledky druhé studie přinesly důkazy o tom, že MWCNT mohou v buňkách BEAS-2B indukovat senescenci, zvyšovat oxidační stres a omezovat jejich proliferaci . Dále byl pozorován nárůst exprese proteinů p21 a p16, β-galaktosidázy (enzymu asociovaného se senescencí), nárůst exprese TGFβ (transforming growth factor β; polypeptidový faktor s potenciálem exacerbace senescence) a poškození DNA v podobě tvorby γH2A .X .17,18 Výše uvedený CNM Printex 90 byl předmětem i další studie, tentokrát autorů Ji et al . V jejich experimentu byly Printexu 90 exponovány buňky zdravé bronchiální sliznice a buňky chronickou bronchitidou změněné sliznice . Expozice měla za následek nárůst intenzity oxidačního stresu a indukci zánětu, spojeného se zvýšenou expresí chemokinu CXCL-8 a matrixové metaloproteázy 9 . Biologická odpověď na expozici byla silnější v případě tkáně změněné chronickou bronchitidou . V souladu s obecnými toxikologickými principy lze předpokládat, že osoby se zánětlivými onemocněními respiračního traktu budou vnímavější k toxickému působení CNM .19 Další skupinu častěji testovaných CNM tvoří CNH . I u těchto nanočástic byl prokázán toxický potenciál pro respirační systém, přičemž charakter a intenzita biologické odpovědi je modifikována především velikostí částic a typem experimentální buněčné linie . Například ve studii provedené autory Schramm et al . byly buňky A549, buňky nemalobuněčného bronchoalveolárního karcinomu (NCI-H322) a buňky primárního lidského nosního epitelu (HNEpC) exponovány frakcím CNH (60–80 nm a 60–200 nm) . Expozice snižovala viabilitu všech uvedených buněčných linií, narušovala buněčný metabolismus a redukovala mitochondriální aktivitu . Míra poškození se lišila podle typu buněčné linie; jako nejsenzitivnější (vůči expozici CNH) se jevily buňky HNEpC .20 V experimentální in vitro toxikologii se stále více rozšiřuje používání tkáňových modelů . Obecně se předpokládá, že jednovrstvé buněčné kultury neposkytují takový rozsah toxikologických informací jako trojrozměrné struktury, které se charakterem více přibližují tkáním 55 a orgánům . V dosud provedených experimentech zaměřených na respirační toxicitu byly využívány vícevrstvé kultury a trojrozměrné modely složené z různých typů buněčných linií (bronchiální epitel, alveolární fibroblasty, myocyty a imunitní buňky) . Tyto experimentální struktury ve většině případů potvrdily, že CNM mohou závažně poškozovat buňky respiračního traktu . Například autoři Barosova et al . připravili experimentální model, v němž byly zastoupeny buňky A549, fibroblasty (MRC-5) a makrofágy (THP-1) . Tato buněčná směs byla jednorázově (po dobu 24 hodin) a opakovaně (po dobu 96 hodin) exponována dvěma typům aerosolizovaných MWCNT (Mitsui-7 a Nanocyl) o koncentracích 2–10 μg/cm2 . Dlouhodobá, tedy opakovaná expozice indukovala zánětlivou odpověď a redukovala hladinu glutathionu . K podobnému výsledku došli i Chortarea et al ., kteří prezentovali trojrozměrný model epitelové bariéry dýchacích cest . Opakovaná třídenní expozice MWCNT o koncentracích 25, 125 a 250 mg/ml redukovala hladinu glutathionu (kratší expozice k patologickým změnám nevedly) .21,22 Autoři Di Cristo et al . studovali vliv opakované expozice GO na trojrozměrné rekonstrukci lidské bronchiální tkáně . Expoziční koncentrace (maximálně 20 μg/cm2 po dobu 4 týdnů) byly extrapolovány z hodnot alveolární depozice CNM, které odrážejí celou pracovní dobu expozice člověka . Výsledky neprokázaly významné toxické účinky GO ve smyslu snížení viability buněk a narušení integrity plicní tkáně . Opakovaná expozice však po 14 dnech spustila prozánětlivou odpověď, narušila bariérové funkce epitelu a způsobila akumulaci autofagozomů (proces vyplývající z blokády degradace autofagozomů) . Výsledky naznačují, že opakovaná expozice GO vytváří „časové okno“ (v této studii zhruba 30 dnů opakované expozice), ve kterém inhibice autofagie zvyšuje senzitivitu exponovaných osob k plicním infekcím a plicním onemocněním . Autoři zdůrazňují význam fyziologicky relevantních modelů a expozičních koncentrací (odvozených od reálných expozic) pro získání výchozích dat využitelných v procesu hodnocení zdravotních rizik .23 Poněkud atypický cílový expoziční objekt zvolili autoři Hu et al ., kteří sledovali vliv GO na surfaktant dýchacích cest . Surfaktant se nachází na sliznici respiračního traktu a má ochranný charakter . Z výsledků vyplynulo, že expozice GO vytváří v surfaktantu póry a touto cestou snižuje jeho biofyzikální a ochranné funkce .24 Podobné výsledky prezentovali i autoři Dorota Kondej a Tomasz Sosnowski, podle kterých expozice CNT a CNH (expoziční koncentrace 0,2–0,8 mg/ml) mění v závislosti na dávce elasticitu, viskozitu a mechanické vlastnosti surfaktantu .25 In vitro studie tedy přinášejí důkazy o tom, že CNM vykazuje toxicitu vůči respiračnímu traktu, nejen k buněčným liniím samotným, ale také k trojrozměrným modelům a ochranným prvkům dýchacích cest . To může mít výrazný negativní dopad na živé organismy . 3.2 IN VIVO STUDIE Testování respirační toxicity CNM in vivo bývá prováděno nejčastěji formou inhalační nebo intratracheální aplikace (expozice) . Tyto formy umožňují sledování účinků jak lokálních (na plicní tkáně), tak i systémových (po absorpci CNM z plicní tkáně do systémové cirkulace) . Výsledky studií často uvádějí zvýšení hladiny oxidačního stresu, indukci zánětu a maligní transformace . Vedle lokálních plicních komplikací byly popsány také extrapulmonální patologie, vznikající v důsledku translokace CNM z dýchacích cest do kardiovaskulárního systému, jater a ledvin . Míra expozicí indukovaného poškození závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech CNM a na rychlosti jejich eliminace z organismu . 56 MWCNT jsou patrně nejčastěji testovanými CNM v in vivo studiích respirační toxicity . Například autoři Sager et al . exponovali potkany (formou celotělové inhalace) MWCNT-7 . Inhalovaná kumulativní dávka (koncentrace za daný čas se pohybovala mezi 22,5 až 180 mg/m3 a byla podávána po tři dny šest hodin denně . Pozornost autorů byla zaměřena jak na projevy toxicity, tak i na změny genových expresí . MWCNT-7 byly detekovány v plicní tkáni, kde indukovaly mírné až středně závažné patologické změny, například zvýšení buněčnosti (kumulace zánětlivých imunitních buněk v plicní tkáni), zesílení alveolárních sept, alveolitidu, fibrotické změny a vznik granulomů . Provedená bronchoalveolární laváž odhalila zvýšenou hladinu laktátdehydrogenázy a zvýšené počty alveolárních makrofágů a polymorfonuklárních leukocytů . Byly zjištěny změny exprese genů ovlivňujících karcinogenezi, leukocytární migraci, zánětlivou odpověď, mitózu a adhezi . Charakter změn byl dávkově závislý .26 Autoři Alswady-Hoff et al . sledovali změnu délky telomer a fibrotické procesy u myší po intrapleurální (injekční) expozici MWCNT (5 a 50 µg/myš) . Po expozici byly zjištěny závažné fibrotické změny v pleuře a indukce zánětu a hyperplazie v mezoteliálních buňkách . Došlo k nárůstu exprese genů, které jsou zapojeny do těchto procesů . Rovněž bylo pozorováno zkrácení telomer v buňkách pleury a plic exponovaných zvířat (zkracování telomer je jedním ze znaků biologického stárnutí) .27 Změny v genové expresi po expozici MWCNT popsali také týmy Khaliullin et a . a Rahman et al . V první studii byly myši faryngeálně exponovány suspenzi MWCNT (40 μg/myš) . Nanočástice penetrovaly do plicní tkáně, kde způsobovaly fibrózu a vyvolávaly vznik granulomatózních lézí a aglomerátů makrofágů . Byla detekována změna exprese mRNA v plicní tkáni i v plné krvi . Změny expresí se týkaly genů, které souvisely s výše popsanými patologiemi . Jednalo se například o geny zodpovídající za aktivaci imunitních buněk a jejich maturaci .28 Ve druhé studii byly myši intratracheálně exponovány dvěma MWCNT (Mitsui-7 nebo NM-401) v různých dávkách (36 a 109 μg/myš nebo 26 a 78 μg/myš) . Z výsledků vyplývá, že nanočástice perzistovaly v plicní tkáni ještě 90 dní po expozici . Expozice oběma typům MWCNT měla za následek poškození DNA, indukci zánětu a fibrózy a zvýšení exprese proteinu p53 .29 Zásahy do exprese genů a poškození DNA jsou úzce spjaté s rizikem karcinogeneze . Ve studii Saleh et al . byli potkani exponováni dvouvrstvým nanotrubicím (DWCNT) v dávkách 0,125, 0,25 a 0,5 mg/potkan nebo MWCNT-7 v dávce 0,5 mg/potkan, a to obden po dobu 15 dní . Potkani byli sledováni následující dva roky . Z výsledků vyplývá, že DWCNT dlouhodobě perzistovaly v plicní tkáni, indukovaly zánět a zvyšovaly počty makrofágů a expresi cytokinů . U potkanů s MWCNT došlo k tvorbě depozit kolagenu a fibrotizaci, ta byla patrná také u nejvyšší dávky DWCNT . Ta také významně zvyšovala riziko pleurálního mezoteliomu .30 K podobným výsledkům došli i jiní autoři . Například Gaté et al . porovnávali respirační účinky expozice MWCNT o různé délce, průměru, ploše a funkcionalizaci . Studie byla provedena na potkanech, kteří byli exponováni NM-401 (dlouhé, tlusté MWCNT) nebo NM-403 (krátké, tenké MWCNT) . Expozice byla prováděna intratracheálně (jednorázově) nebo inhalačně (opakovaná 28denní expozice) . Všechny expoziční scénáře indukovaly zánět v plicní tkáni, který byl spojený s influxem neutrofilů . Nejvyšší míra poškození, včetně fibrotizace, byla nalezena u potkanů, kteří byli vystaveni nejvyšším dávkám NM-401 .31 Autoři Numano et al . ve své studii porovnávali toxické účinky intratracheální expozice potkanů uhlíkovým nanovláknům VGCFTM-H (dávky 0,2, 0,4 a 0,8 mg/kg) a MWCNT-7 (dávky 0,4 a 0,8 mg/kg; doba expozice osm týdnů) . Z výsledků vyplývá, že vyšší míru poškození plic a pleury induko- 57 vala expozice MWCNT-7 . Poškození zahrnovalo intenzivní zánět, buněčnou infiltraci plicní tkáně, alveolární, pleurální a brániční fibrózu a proliferaci plicního mezotelu .32 V jiné studii exponovali autoři Numano et al . intratracheálně potkany MWCNT-7 (jedenkrát týdně po dobu dvanácti týdnů; celková podaná dávka 1,5 mg/potkan) . Autoři zjistili, že MWCNT po expozici translokovaly do pleurální dutiny, subpleurální tkáně a intrapleurálního prostoru; 35 týdnů po poslední expozici došlo k tvorbě mezoteliomů . Vznik mezoteliomů po aplikaci MWCNT potvrdili také Wang et al .33,34 Poněkud odlišné výsledky prezentovali Kasai et al . V jejich studii byli potkani 104 týdnů inhalačně exponováni MWCNT-7 o koncentracích 0,02, 0,2 a 2 mg/m3 . Histologické vyšetření tkáně pleury prokázalo přítomnost hyperplastických změn a fokální fibrózy, ale tento nález byl pozorován pouze u samců . U žádného ze zvířat nebyl zjištěn mezoteliom, na druhou stranu ale byly nalezeny nenádorové změny v dýchacích cestách (například bronchoalveolární hyperplazie) a maligní plicní nádory (bronchoalveolární karcinom, adenoskvamózní karcinom a adenokarcinom) .35 Z pohledu ochrany zdraví člověka má mimořádný význam studium dlouhodobých účinků expozice . Jednou z takových studií je práce Knudsen et al ., která byla zaměřena na histologickou analýzu plicní tkáně myší jeden rok po jednorázové intratracheální expozici 54 μg směsi jedenácti dobře charakterizovaných MWCNT . Analýza potvrdila perzistenci MWCNT v plicní tkáni . Krátké, tenké MWCNT vytvářely v plicní tkáni aglomeráty, zatímco dlouhé, tlusté byly v tkáni přítomny jednotlivě . Tenké spletené MWCNT vyvolávaly zánět s infiltrací tkáně makrofágy a tvorbu granulomů . Přirozené NRCWE-040 byly translokovány do jater a způsobovaly poškození DNA . Z výsledků je zřejmé odlišné chování různých typů MWCNT v organismu, včetně rizika jejich perzistence .36 Spletené MWCNT byly použity také ve studii autorů Kim et al . Potkani inhalovali různé dávky MWCTN (0,257, 1,439 a 4,253 mg/m3) po dobu 28 dní (6 hodin denně, 5 dní v týdnu) . V závislosti na dávce vyvolávaly MWCNT záněty plic s tvorbou granulomů, zvýšeným počtem imunitních buněk a buněčnou smrtí . Retenční poločas nejvyšší koncentrace byl 35 dní, což je kratší poločas než pro rigidní MWCNT .37 V podobně zaměřené studii exponovali Honda et al . potkany intratracheálně jedné dávce dvou typů SWCNT (krátkým SWCNT; dávka 0,2 a 1,0 mg/kg) a dlouhým SWCNT (dávka 1,0 mg/kg) . Reakce respiračního traktu byla vyhodnocena za 26, 52 a 104 týdnů po expozici . Po 52 a 104 týdnech byl v plicích zjištěn zánět, depozita SWCNT a fibróza alveolárních sept . Vyšší poškození bylo nalezeno u potkanů exponovaných dlouhým SWCNT .38 Výše uvedené studie prokazují translokaci inhalovaných MWCNT z respiračního traktu například do pleury a pleurální dutiny . Studie autorů Mercera et al . prokázala translokaci MWCNT i do dalších tkání . Myši byly v jejich experimentu inhalačně exponovány MWNT-7 (koncentrace 5 mg/m3, 5 hod/den) po dobu 12 dnů . V tracheobronchiálních lymfatických uzlinách myší byly nalezeny aglomeráty MWNT-7, jednotlivé MWNT-7 pak byly nalezeny v bránici, hrudní stěně, játrech, ledvinách, srdci a mozku . Depozita MWNT-7 byla vyšší 336 . den po ukončení expozice než během prvního expozičního dne .39 Vedle velmi často testovaných CNT (SWCNT a MWCNT) je pozornost věnována pochopitelně i dalším CNM, zastoupených fullereny, grafeny, GO, sazemi (CB) a nanodiamanty (ND) . Například Caldeira et al . exponovali myši intratracheálně fullerenu (C60; dávka 1,0 mg/kg) . Expozice indukovala plicní zánět s velmi vážným poškozením terminálních dýchacích cest, kolapsem alveol, ztluštěním sept a s plicním edémem . Na buněčné úrovni došlo k mitochondriálním dysfunkcím, redukci produkce ATP a ke zvýšení oxidačního stresu . Fulleren tedy vykazoval značnou toxicitu pro respirační trakt .40 64 4 KARDIOVASKULÁRNÍ TOXICITA Kardiovaskulární onemocnění jsou řazena mezi nejčastější příčiny morbidity a mortality v populaci . Mezi známé rizikové faktory vzniku a progrese těchto onemocnění lze v posledních desetiletích řadit i expozici uhlíkovým nanomateriálům (CNM) . CNM vstupují do kardiovaskulárního systému většinou inhalačně, perorálně nebo transdermálně (průnik skrze tkáně do cévního řečiště) . V případech terapeutického použití přichází pochopitelně v úvahu i vstup intravenózní . CNM mohou interagovat s endotelem cév a srdečních tkání . Mezi poškozující vlivy CNM patří zvýšená hladina oxidačního stresu, indukce zánětu, interakce s iontovými kanály a zvýšená úroveň apoptózy, popř . nekrózy buněk . Uvedené procesy vedou ke kardiovaskulárním dysfunkcím, arytmiím, změnám krevního tlaku, vazokonstrikci, ateroskleróze, zvýšené koagulaci, hemolýze a k nežádoucí angiogenezi . Závažnou skutečností je také kumulace CNM v kardiovaskulárním systému .1,2 Na druhou stranu ale nutno zmínit také výhody, které by pro kardiovaskulární systém mohly CNM představovat . Konkrétně se jedná o využití některých CNM jako scaffoldů, umožňujících diferenciaci buněk do podoby kardiomyocytů a podporujících jejich růst a generování elektrických impulzů . Takto vytvořené buněčné linie, či dokonce tkáně, by v budoucnu mohly být klíčovou součástí procesu regenerace srdeční tkáně .3 4.1 IN VITRO STUDIE Většina in vitro studií byla prováděna na endoteliálních buňkách lidské pupečníkové žíly (human umbilical vein endothelial cells; HUVEC), na kardiomyocytech a na buňkách hladké svaloviny, která je součástí cévních stěn . Zajímavým jevem je diverzifikace biologické odpovědi podle typu buněk . Zatímco při expozici vaskulárních buněk převažují toxické účinky CNM, v případě kardiomyocytů se jedná spíše o účinky protektivní, ve smyslu podpory jejich proliferace a jejich funkcí . V in vitro experimentech byly nejčastěji sledovány účinky grafenu, modifikací grafenu a uhlíkových nanotrubic (CNT) . Autoři Hashemi et al . exponovali buněčnou kulturu HUVEC suspenzi oxidu grafenu (GO) a grafenovým kvantovým tečkám (GQD) 4, 24 a 48 hodin (koncentrace 7,8, 15,6, 31,2, 62,5 a 125 μg/ml) . Oba typy nanočástic, zejména ve vyšších koncentracích, snižovaly viabilitu buněk v důsledku narušení membránového potenciálu mitochondrií a následné indukce dějů vedoucích ke spuštění apoptózy . Po čtyřhodinové expozici buněk koncentraci 15 μg/ml 65 (GO i GQD) byla pozorována zvýšená exprese miR-21 (nekódukující mikroRNA zapojená do karcinogeneze) a snížená exprese proapoptotického proteinu BAX, homologu fosfatázy a TENsinu (phosphatase and TENsin homolog, PTEN) . Snížená exprese antiapoptotické molekuly Bcl2 byla pozorována jen u expozice GO . Souhrnně lze říci, že expozice GO indukovala významnější změny v expresích biomolekul .4 Kultivace buněčné kultury HUVEC s GO (25 a 50 μg/ml; 24 a 48 h) v experimentu autorů Cibecchini et al . vedla ke vzniku buněčných agregátů, k nárůstu hladiny oxidačního stresu, k poškození mitochondrií a k narušení struktury cytoskeletu . V důsledku těchto změn byla narušena schopnost buněk migrovat a vytvářet kapilární struktury . Byla tedy narušena angiogeneze .5 Grafen a GO mohou poškozovat i erytrocyty . Autoři Liao et al . zjistili u obou druhů CNM hemolytickou aktivitu, přičemž významná míra hemolýzy se začala projevovat přibližně od koncentrace 50 μg/ml . Míra hemolýzy s rostoucí expoziční koncentrací souvisela s velikostí částic GO . Nejvyšší míra hemolýzy byla pozorována u nejmenších částic a dosahovala zhruba 90 % .6 Toxicita GO byla studována také na kardiomyoblastech (H9c2) . Arbo et al . exponovali kardiomyoblasty po dobu 24 hodin koncentracím GO 20, 40, 60, 80 a 100 μg/ml . V souvislosti s expozicí pozorovali u buněk narušení mitochondriálních funkcí, zvýšení produkce volných kyslíkových radikálů a poškození struktury DNA .7 V obdobné studii exponovali Zhang et al . buněčnou kulturu H9c2 GO a redukovanému GO (50 μg/ml / 24 h) . Oba CNM (silnější účinek vykazoval rGO) zvyšovaly míru apoptózy a hladinu laktátdehydrogenázy . Byla narušena funkce mitochondrií a zvýšena hladina oxidačního stresu .8 V rámci kardiovaskulárního systému je velmi zajímavá i oblast hematoencefalické bariéry, která je nezbytná jak pro ochranu, tak výživu nervové tkáně . Narušení cév může mít závažné následky . Je tedy důležité zjistit, zda CNM mohou narušit i cévy/kapiláry v této lokalitě . Autoři Rosas-Hernandez et al . zjistili, že nanočástice grafenu mohou narušovat hematoencefalickou bariéru (HEB) . Zvýšená permeabilita HEB je rizikovým faktorem pro poškození centrální nervové tkáně, což má za následek zrychlení degeneračních procesů . V experimentu uvedených autorů byly grafenu (koncentrace 50 a 100 μg/ml) exponovány mozkové mikrovaskulární endoteliální buňky (brain microvascular endothelial cells, BMEC) . Tyto buňky jsou součástí HEB a u obou byly po expozici pozorovány zvýšené hladiny laktátdehydrogenázy, zvýšený výskyt nekróz a zvýšená permeabilita endotelu . Vyšší dávky způsobovaly fragmentaci DNA, zvýšenou míru apoptózy, a naopak sníženou expresi okludinu (proteinu těsných mezibuněčných spojů) .9 Autoři Ardoña et al . analyzovali poškození HEB po expozici grafenu, redukovanému GO (rGO), částečně redukovanému GO a GO (5, 10, 25 a 50 μg/ml) . Více oxidované formy grafenu indukovaly významnější poškození a modifikovaly organizaci cystoskeletu (zvyšovaly endotelovou permeabilitu a tvorbu protruzí a filopodií buněk) .10 Toxické vlivy na HEB byly prokázány také u mnohovrstevných nanotrubic (MWCNT) . Autoři Yang et al . se zaměřili na vliv expozice MWCNT na permeabilitu HEB a za tímto účelem kultivovali kulturu BMEC s MWCNT (20 μg/ml / 24 h) . Obdobně jako ve studiích zaměřených na expozici grafenu byla i zde pozorována zvýšená permeabilita HEB a snížená exprese okludinu . Vedle toho autoři zjistili změny dalších faktorů, které obecně zvyšují buněčnou permeabilitu . Konkrétně se jednalo o narušení exprese zonula occludens-1 (periferního membránového proteinu, který patří do rodiny proteinů charakterizujících těsné buněčné spojení; ZO-1) a o zvýšenou aktivitu hemikanálů, které podporují expresi konexinu 43 a pannexinu . Karboxylované formy MWCNT uvedené změny neindukovaly .11 66 Dále budeme pokračovat toxicitou uhlíkových nanotrubic: Zhao et al . studovali vliv MWCNT na buněčnou kulturu HUVEC . V jejich experimentu byly použity MWCNT s různým průměrem (XFM4 /10,33 ± 3,50 nm/ < XFM22 /21,55 ± 5,66 nm/ < XFM34 /38,80 ± 13,07 nm/; koncentrace 0, 4, 8, 16, 32 a 64 μg/ml / 24 h) . Z výsledků vyplývá, že MWCNT snižovaly, v závislosti na koncentraci, viabilitu buněk . Nejsilnější účinek byl zaznamenám v případě expozice XFM4 . U této expozice byla také zjištěna nejvyšší exprese IL-6, solubilních vaskulárních buněčných adhezních molekul 1 (VCAM-1) a volných kyslíkových radikálů (ROS) . V experimentu byl zjištěn i nárůst endoplazmaticko-retikulárního stresu a snížení míry autofagie . Vlivem expozice MWCNT došlo rovněž k zvýšení adheze THP-1 monocytů na HUVEC . Studie prokázala, že toxický účinek MWCNT závisí jak na dávce, tak i na průměru částic .12 Studie autorů Longa et al . byla zaměřena na vztah mezi délkou MWCNT (0,5–2 μm a 10–30 μm) a jejich účinky na buněčnou kulturu HUVEC . Expozice zahrnovala koncentrace 2, 4, 8, 16 a 32 μg/ml (doba expozice 24 hodin) . Oba typy MWCNT byly buňkami internalizovány s lokalizacemi CNM v jádru a v mitochondriích . Kratší MWCNT vykazovaly celkově nižší míru toxicity . Poněkud překvapivé bylo zjištění, že MWCNT neindukovaly produkci ROS, nicméně snižovaly koncentraci antioxidačního glutathionu . Delší MWCNT významně zvyšovaly expresi prozánětlivých cytokinů IL-6, TNF-α, solubilních intercelulárních adhezních molekul 1 (ICAM-1) a solubilních VCAM-1 . Zvyšovaly rovněž adhezivitu THP-1 monocytů .13 Cao et al . studovali vaskulární účinky dvou typů MWCNT u myší s apolipoproteinem E(-/-), myší divokého typu a kultivovaných buněk . Myši ApoE(-/-) měly po pěti intracheálních instilacích MWCNT (25,6 μg/myš týdně po dobu 5 týdnů) zrychlenou progresi plaku v aortě . Expozice byla spojena s plicním zánětem, peroxidací lipidů, zvýšenou hladinou oxidativního stresu a se zvýšenou expresí genů reparačního mechnismu DNA a vaskulární aktivační odpovědi . Expozice MWCNT v kultivovaných lidských endoteliálních buňkách (HUVEC) zvyšovala expresi buněčných adhezních molekul (ICAM1 a VCAM1) a adhezi THP-1 na HUVEC . Expozice oběma typům MWCNT byla spojena se zvýšenou akumulací lipidů v pěnových buňkách odvozených od monocytů . Z výsledků vyplývá, že expozice MWCNT je spojena se zrychlenou progresí aterosklerózy, která by mohla souviset jak se zvýšenou adherencí monocytů na endotel, tak s transformací monocytů na pěnové buňky (zprostředkovanou oxidativním stresem) .14 Dalším typem buněk, který v in vitro experimentech může reprezentovat kardiovaskulární systém, jsou buňky hladké svaloviny aorty (HASMC) . Autoři Yang et al . exponovali tyto buňky MWCNT a karboxylovaným MWCNT (4, 8, 16, 32 a 64 μg/ml / 24 h) . Obě formy MWCNT snižovaly aktivitu mitochondrií a zvyšovaly kumulaci lipidů v buňkách . Významně zvyšovaly také hladiny mRNA markerů endoplazmaticko-retikulárního stresu; mRNA pro DDIT3 a XBP-1 a mRNA proteinů zapojených do lipogeneze (SREBF 1, SREBF2, FASN) . Autoři uvádějí, že kumulaci lipidů lze potlačit preexpozicí buněk inhibitorům endoplazmaticko-retikulárního stresu nebo antioxidantům . Z výsledků je zřejmé, že MWCNT poškozují hladkou svalovinu aorty a podporují progresi aterosklerózy .15 MWCNT mají protrombotické účinky a mohou intrinsickou cestou aktivovat koagulaci . Interagují primárně s faktorem IXa . Výzkumníci v kolektivech Andrewa Burkeho a Alana Gaffneyho popsali aktivaci trombocytů a tvorbu trombů v důsledku expozice různým modifikacím MWCNT . První tým použil 10, 50 a 100 μg/ml suspenze MWCNT, karboxylovaných MWCNT a amidovaných MWCNT, na jejichž površích byl vázán polyetylenglykol nebo 67 pluronic F-27 /(C3H6O·C2H4O)x/ . Z výsledků vyplývá, že srážecí čas nejvíce zkracovaly karboxylované MWCNT . Ve studii s obdobným designem použili Gaffney et al . MWCNT s polyvinylovým povrchem . Autoři nalezli zvýšenou agregaci trombocytů, která se v související in vivo studii projevila jako zvýšená tvorby trombů .16,17 Protrombogenní účinky byly potvrzeny také u jednovrstvých uhlíkových nanotrubic (SWCNT) . Ve studii Holzera et al . SWCNT indukovaly expresi P-selektinu (membránového glykoproteinu trombocytů), což vedlo ke zvýšené tvorbě trombocyto-granulocytárních komplexů .18 Jiná studie (Rodríguez-Yáñez et al .) byla zaměřena na fibrinolytické účinky SWCNT . Buněčná kultura HUVEC byla exponována suspenzi SWCNT o koncentracích 5, 25 a 50 μg/ml . Autoři uvádějí, že již koncentrace 5 μg/ml významně zvyšovala produkci volných radikálů; vyšší koncentrace snižovaly i viabilitu . Koncentrace 25 μg/ml zvyšovala expresi genů asociovaných s fibrinolýzou (produkce tkáňového aktivátoru tromboplastinu a urokinázy) a expresi genu inhibitoru aktivátoru plazminogenu 1 . Z výsledků je zřejmé, že SWCNT mohou poškozovat endotel a narušovat fibrinolýzu .19 Vedle buněk kardiovaskulárního systému může expozice CNM ovlivňovat i složky krve . Autoři Yuvaraj et al . zjistili, že expozice MWCNT indukuje morfologické změny erytrocytů (zvyšuje počet echinocytů) a snižuje jejich viabilitu . Morfologické změny zasahují do rheologických vlastností krve a zvyšují riziko kardiovaskulárních onemocnění . V experimentu výše uvedených autorů byly sledovány účinky MWCNT a hydroxylovaných MWCNT o koncentracích 5, 25, 50 a 100 µg/ml . Nejvyšší míra erytrocytárního poškození byla zjištěna u nejvyšších koncentrací MWCNT .20 Dalšími typy CNM se zabývalo výrazně méně studií . Jednou z nich je například práce Solarska et al ., v níž byla sledována cytotoxicita nanodiamantů (ND) vůči buněčné kultuře HUVEC (expozice 24, 48 a 72 h; koncentrace 2, 20 a 100 μg/ml) . Autoři uvádějí, že vyšší koncentrace ND byly schopné navodit apoptózu a nekrózu buněk již po 24 hodinách .21 Předmětem studie autorů Ren et al . byla analýza vlivu expozice fullerenu (C60) a jeho hydroxylovaného derivátu (C60-OH) na expresi β2-adrenergního receptoru β2AR . Tento receptor je exprimován v kardiovaskulárním systému a jeho aktivace či blokace může mít významné dopady na funkce systému . Z výsledků vyplývá, že C60 i C60-OH mohou sice měnit lokální strukturu receptoru (hlavně distorzi helixu 4), nicméně tyto změny nedosahovaly stupně statistické významnosti . Dále bylo zjištěno, že C60 blokuje vazbu ligandů receptorového kanálu . Zdá se tedy, že fulleren a jeho deriváty zřejmě disponují jistou mírou toxického potenciálu vůči buňkám exprimujícím β2AR .22 Doposud uvedené studie se zabývaly pouze negativním dopadem expozice CNM na buňky kardiovaskulárního systému . Závěrem této kapitoly je však nutno se zmínit také o jejich pozitivních vlivech . Je známo, že CNM podporují diferenciaci kardiomyocytů a přispívají k regeneraci poškozené srdeční tkáně . Například Bahrami et al . prezentovali scaffold s trojrozměrnou grafenovou pěnou, který podporoval adhezi a růst neonatálních kardiomyocytů . Přítomnost grafenu rovněž posílila expresi genů asociovaných s kontrakcí a relaxací kardiomyocytů a genů kódujících proteiny mezibuněčných spojů (troponin T, konexin 43) .23 Autoři Zhao et al . popsali scaffold připravený z rGO v kombinaci s hedvábným fibroinem . Materiál scaffoldu dokázal rekonstituovat myokardiální elektrické mikroprostředí, které je nezbytné pro regeneraci tkání po infarktu myokardu (podpora přežití kardiomyocytů) .24 Dobrou míru biokompatibility GO a buněk hladké svaloviny krysí aorty (A7r5) prokázali ve své studii autoři Ren et al . Jak plyne z jejich výsledků, expozice GO neměnila viabilitu buněk, 68 expresi buněčných markerů ani buněčnou migraci . Naopak, malé vločky GO významně zvyšovaly proliferaci hladkosvalových buněk .25 O scaffoldech a jejich využití v regenerační medicíně se můžete více dočíst v kapitole „Biomedicínské využití uhlíkových nanomateriálů“ . 4.2 IN VIVO STUDIE Díky své komplexitě přinášejí in vivo studie objektivnější pohled na účinky CNM a nutno přiznat, že ne vždy se jejich výsledky shodují s výsledky získanými ze studií in vitro . Dosud provedené studie in vivo se primárně zaměřovaly na zjišťování kardiotoxicity v podobě indukce kardiovaskulárních onemocnění či jejich progrese . Jednalo se například o aterosklerózu, kardiomyopatie nebo funkční poruchy myokardu . Ve studii Zhanga et al . vyvolala čtrnáctidenní intravenózní expozice GO a rGO (4 mg/kg) u myší významný nárůst hladin oxidačního stresu a malondialdehydu a významný pokles hladin glutathionperoxidázy, superoxiddismutázy a myokardiálních enzymů (laktátdehydrogenázy, aspartátaminotransferázy, Na+/K+-ATPázy a Ca2+/Mg2+-ATPázy) v srdeční tkáni . Oba typy CNM indukovaly apoptózu kardiomyocytů (rGO vykazovala vyšší míru toxicity) .8 Autoři Bangepparagari et al . sledovali vliv expozice GO na embryogenezi dánia pruhovaného (Brachydanio rerio) . Součástí studie byla i analýza vlivu na kardiovaskulární systém . Vyšší expoziční koncentrace GO (0,4–1 mg/ml) zvyšovaly embryonální mortalitu, způsobovaly kardiovaskulární defekty, ovlivňovaly srdeční frekvenci a poškozovaly hemoglobinizaci .26 V posledních letech se značně rozšířily biomedicínské aplikace GQD, zaměřené především na diagnostiku a léčbu rakoviny . Řada studií hodnotila GQD v biomedicínské oblasti, nicméně, pouze několik studií bylo orientováno na hodnocení možné toxicity . Jednou z těchto studií je práce Barros et al ., která se zabývala dopadem vysokých koncentrací GQD na mikrocirkulaci zdravého zvířecího modelu . Jak plyne z dat, opakovaná aplikace GQD (intraperitoneálně, dávka 1 g/kg) způsobila nevratné poškození mikrocirkulace (po sedmi dnech byla pozorována její úplná destrukce) . Kromě toho GQD vykazovaly i hemolytickou aktivitu v lidských erytrocytech .27 V kapitole zaměřené na in vitro experimenty byla zmíněna studie autorů Holzera et al . Vedle pokusů in vitro studie zahrnovala také pokus in vivo, ve kterém byly myším opakovaně aplikovány SWCNT (1 mg/kg) . Expozice SWCNT měla za následek zvýšenou tvorbu arteriolární trombů . Výsledek byl v souladu s výsledkem experimentu in vitro, který prokázal protrombotický efekt SWCNT .18 Zdá se, že MWCNT mohou alterovat i morfologii a funkce kardiovaskulárního systému (funkce autonomního nervového systému) . Například ve studii Zhenga et al . modifikovaly inhalačně podávané MWCNT (5 h / 5 mg/m3) srdeční rytmus pohybujících se potkanů . Autoři měřili EKG a krevní tlak před expozicí, v jejím průběhu a po jejím ukončení . Inhalační expozice vedla ke zvyšování systolického i diastolického tlaku a ke snižování tepové frekvence potkanů .28 Intratracheální expozice MWCNT spontánně hypertenzním a normotenzním potkanům vedla ve studii Chena et al . k poškození cév, nárůstu krevního tlaku a tepové frekvence a ke zvýšeným hladinám endotelinu 1 a angiotenzin konvertujícího enzymu (ACE) . Vyhodnocení bylo prováděno 7 a 30 dní po expozici (jednou denně / 4 po sobě jdoucí dny; celková dávka 1,2 mg/kg) .29 69 Nárůst klidové tepové frekvence vlivem expozice MWCNT pozorovali také autoři Hosseinpour et al ., kteří intraperitoneálně aplikovali karboxylované MWCNT potkanům (v dávce 1 mg/kg) . Autoři se domnívají, že elevace tepové frekvence nebyla vyvolána změnami autonomního nervového systému, ale že se jedná o následek blokování draslíkových kanálů .30 Modifikaci aktivit iontových kanálů popsali také Tan et al . Ve své práci popsali in vitro expozici izolovaných kardiomyocytů (HEK293) MWCNT, která vedla k rozpadu Kv4 v buňkách exprimujících Kv4 .2/4 .3 a KChIP2 a podporovala obnovu z inaktivace v případech, kdy byly Kv4 .2 nebo Kv4 .3 exprimovány samostatně . Při delší expozici (6 h) MWCNT snižovaly hustotu Kv4 .2, expresi Kv4 .2/Kv4 .3 (ale ne KChIP2) a omezovala přenos směrem k plazmatické membráně . Intravenózní podání MWCNT (2 mg/potkana) vyvolalo atrioventrikulární (AV) blok, a dokonce i srdeční asystolii (nebyla však pozorována tachyarytmie) . Analýza vzorku srdeční tkáně odhalila, že MWCNT indukovaly zánět myokardu (bez tvorby koronárních sraženin) .31 Výše uvedené studie se shodují v závěrech, že CNM mohou ovlivňovat srdeční funkce ve smyslu snižování/zvyšování tepové frekvence a zvyšování krevního tlaku . Zajímavou studii prezentovali Thompson et al . Intratracheální aplikace MWCNT a funkcionalizovaných MWCNT (karboxylované a nitrogenované) v jejich experimentu interferovala s adenosinergickou signalizací, což vedlo k exacerbaci ischemicko-reperfuzního poškození srdce . K tomuto jevu dochází například při infarktu myokardu po obnovení průtoku krve cévami . Důvodem je masivní nárůst oxidačního stresu jak v době ischemie, tak v době reperfuze . Myším, které prodělaly ischemicko-reperfuzní poškození, byly po 24 hodin podány suspenze MWCNT a funkcionalizovaných MWCNT (koncentrace 1 µg/ml) a po dalších 24 hodin byl zjišťován rozsah poškození srdeční tkáně . U všech testovaných MWCNT došlo k navýšení rozsahu poškození (největší poškození bylo zjištěno u nitrogenovaných MWCNT) . Ve studii byla sledována rovněž hodnota cyklického adenosinmonofosfátu (cAMP) v srdeční tkáni a v plicích . Myokardiální koncentrace cAMP byla snížena ve skupině exponované MWCNT a nitrogenovaným MWCNT; v plicích k poklesu cAMP nedošlo . Autoři uvádějí i nález změny tonu v aortě (tonus je adenosinergně modulován) .32 S ischemicko-reperfuzním poškozením pracovali také Urankar et al . V pokusu na myším modelu zjistili, že orofaryngeální aspirace MWCNT (čistých, karboxylovaných a nitrogenovaných) v dávce 0,01–100 μg vedla k rozsáhlému poškození srdeční tkáně (největší poškození bylo zjištěno opět u nitrogenovaných MWCNT) . Poškození bylo hodnotitelné ještě 28 dní po expozici funkcionalizovaným MWCNT .33 Mezi nejčastější kardiovaskulární onemocnění patří ateroskleróza, která svého nositele predisponuje k mnoha chronickým i akutním komplikacím . Údaje z odborné literatury dokládají, že expozice CNM může být jedním z rizikových faktorů vzniku a progrese aterosklerózy . Christophersen et al . popsali ztluštění stěny aortálního oblouku po 10 týdnech opakované orální nebo pulmonální MWCNT expozice myší s deficitem apolipoproteinu E (4 a 40 μg každý týden) . Nález indikuje rozsáhlejší cévní přestavbu bez zvětšení rozsahu aterosklerotických ložisek .34 Spojitost mezi expozicí MWCNT a aterosklerózou však nalezli Xu et al . Ve svém experimentu aplikovali intravenózně 50, 100 a 200 μg/kg MWCNT potkanům s aterosklerózou . Nejvyšší dávka exacerbovala aterosklerotické léze, podpořila kumulaci lipidů v intimě aorty a indukovala vznik aortálních kalcifikací a poškození endotelu se zvýšením permeability .35 Proaterosklerotická aktivita byla zjištěna také u jednovrstvých (SWNCT) a dvouvrstvých (DWCNT) nanotrubic . Suzuki et al . prezentovali experiment, ve kterém exponovali 70 (faryngeální aspirací) apolipoprotein E-deficitní myši (ApoE-/-) SWCNT a MWCNT (10 a 40 μg; jedenkrát týdně po dobu 10 týdnů) . Expozice vedla ke zvětšení aterosklerotických plaků a ke zvýšení exprese adhezní molekuly ICAM-1 . Endoteliální progenitorové buňky (EPC) jsou mobilizovány z kostní dřeně do oběhu a následně migrují do místa poškození a opravy endotelu . Vystavení myší ApoE-/- vysokým dávkám SWCNT nebo DWCNT snižovalo jednotky EPC tvořící kolonie v kostní dřeni a omezovalo jejich migrační funkci . Výsledky naznačují, že SWCNT a DWCNT zvyšují aterosklerogenezi podporou adheze monocytů k endotelovým buňkám a indukcí dysfunkce EPC .36 Na vzniku a rozvoji aterosklerotických lézí se aktivně podílí cholesterol a jeho transportní mechanismy . Autoři Davis et al . vystavili myši subakutním inhalačním expozicím MWCNT (1 mg/m3 / 6 h / den / 14 dní) . Z nálezů je zřejmé, že vlivem expozice došlo k nárůstu exprese LOX-1 (the lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor) a k poklesu exprese ABCA-1 (ATP-binding cassette transporter) . LOX-1 zprostředkovává internalizaci oxidovaného LDL a podporuje tvorbu proaterogenních faktorů (například kyslíkových radikálů nebo matrixové metaloproteázy 9) . ABCA-1 (naopak) podporuje cholesterolový eflux . Autoři dále uvádějí, že v cévách exponovaných myší byla zjištěna fibrotická kolagenová depozita a byl pozorován nárůst aktivity MMP-9 a hladin prozánětlivých cytokinů (TNF-α, IL-1β, IL-6), volných radikálů a adhezních molekul ICAM-1 a VCAM-1 .37 Zajímavou studii připravil také Mandler et al . Hodnotili změny cévní aktivity (vazodilataci a vazokonstrikci) u myší, které faryngeální expozicí vystavili dávce 50 µg MWCNT . Po 24 hodin od expozice provedli (za použití intravitální mikroskopie) vyšetření arteriální dilatace a venulární leukocytární adhezi a rolling (pohyby leukocytů po endotelu) . Jedná se o pohyb imunitních buněk po povrchu endotelu v závislosti na expresi adhezních molekul na endotelových buňkách . Po podání MWCNT došlo k narušení schopnosti relaxace cév, tj . snížila se vazodilatace . Naopak se zvýšila aktivace endotelu a s ní i exprese adhezních molekul, což bylo spojené s vyšší adhezí leukocytů k endotelu a jejich pohybu na něm . Dalším efektem, který byl zaznamenán, bylo zvýšení koncentrace prozánětlivých cytokinů a alterovala se produkce oxidu dusnatého a jeho signalizace . Výsledky nasvědčují tomu, že MWCNT indukuje mikrovaskulární dysfunkci .38 4.3 PRACOVNÍ EXPOZICE V pracovním prostředí mohou osoby být (a jsou) vystaveny expozici CNM . Bohužel dosud nebyla provedena rozsáhlejší (dlouhodobá) epidemiologická studie, která by významně přispěla k pochopení zákonitostí expozice člověka CNM a k odhadu úrovně zdravotních rizik plynoucích z této expozice . Nicméně několik dosud provedených průřezových (cross- -sectional) studií naznačuje, že expoziční nálezy u lidí mohou být podobné nálezům z in vitro a in vivo studií . Schauer-Barigan et al . provedli průřezovou studii, do které bylo zapojeno celkem 108 pracovníků z 12 podniků, v nichž se vyráběly trubicové či vláknité uhlíkové nanomateriály . Přestože koncentrace CNM v pracovních atmosférách byly nízké, u 18 % pracovníků byly tyto ultrajemné částice detekovány ve sputu . Výskyt CNM byl u exponovaných osob pozitivně asociován s hodnotami systolického tlaku . Klidová tepová frekvence měla pozitivní asociaci s respirabilním elementálním uhlíkem a negativní asociaci s dobou vystavení CNM .39 71 Průřezové studie autorů Kuijperse et al . se zúčastnilo 22 pracovníků exponovaných MWCNT a 42 kontrol . V první fázi byly vybrané ukazatele hodnoceny u všech exponovaných i kontrolních osob, ve druhé fázi byly stejné ukazatele hodnoceny po 5 měsících u 13 exponovaných osob . Hodnoty ukazatelů u exponovaných osob svědčily o aktivaci (a na dávce závislém) poškození endotelu (například zvýšená hladina adhezní molekuly ICAM-1) .40 Průřezová studie autorů Bearda et al . zahrnovala 108 pracovníků v expozici uhlíkovým nanotrubkám a nanovláknům . U všech exponovaných osob byly zjištěny zvýšené hladiny ukazatelů aktivace a poškození endotelu (endotelin 1, ICAM-1 a VCAM-1) a změněné hladiny ukazatelů oxidačního stresu (snížené hladiny glutathionperoxidázy a superoxiddismutázy a zvýšená hladina 8-hydroxy-2′-deoxyguanosinu) .41 4.4 ZÁVĚR Kardiovaskulární systém se málokdy dostává do kontaktu s CNM přímo . Musí dojít k parenterálnímu podání či přestupu CNM z jiných částí organismu, např . z dýchacího či trávicího systému . CNM se tak mohou dostat do kontaktu s cévním endotelem i srdečními tkáněmi, což může vyvolat také nežádoucí reakce, jak ukazují mnohé in vitro a in vivo studie, včetně studií pracovních expozic . Studie odhalily, že může dojít k poškození srdečního svalu i cév, to je dáno hlavně indukcí oxidačního stresu a chronického poškozujícího zánětu . Na druhou stranu nemůžeme pominout fakt, že v rámci regenerační medicíny může kultivace buněk, např . kardiomyocytů, s CNM podpořit jejich životaschopnost, množení a tvorbu organoidů . V tomto ohledu hraje výraznou roli dávka a doba expozice a typ CNM . 4.5 LITERATURA 1 . Kan H, Pan D, Castranova V . Engineered Nanoparticle Exposure and Cardiovascular Effects: The Role of a Neuronal-Regulated Pathway . Inhal Toxicol. 2018;30(9–10):335–342 . doi:10 .1080/0895 8378 .2018 .1535634 . 2 . Sharma V, Aneja B, Yata VK, Malakar D, Mohanty AK . Systemic Nanotoxicity and Its Assessment in Animal Models . In: Yata V, Ranjan S, Dasgupta N, Lichtfouse E, eds . Nanopharmaceuticals: Principles and Applications Vol. 3. Environmental Chemistry for a Sustainable World. Vol 48 . Springer; 2020 . doi:10 .1007/978-3-030-47120-0_7 . 3 . Meyers K, Lee BP, Rajachar RM . Electroactive Polymeric Composites to Mimic the Electromechanical Properties of Myocardium in Cardiac Tissue Repair . Gels. 2021;7(2):53 . doi:10 .3390/ gels7020053 . 4 . Hashemi MS, Gharbi S, Jafarinejad-Farsangi S, Ansari-Asl Z, Dezfuli AS . Secondary Toxic Effect of Graphene Oxide and Graphene Quantum Dots Alters the Expression of miR-21 and miR-29a in Human Cell Lines . Toxicol In Vitro. 2020;65:104796 . doi:10 .1016/J .TIV .2020 .104796 . 5 . Cibecchini G, Veronesi M, Catelani T, Bandiera T, Guarnieri D, Pompa PP . Antiangiogenic Effect of Graphene Oxide in Primary Human Endothelial Cells . ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(20):22507–22518 . doi:10 .1021/ACSAMI .0C03404 . 6 . Liao KH, Lin YS, MacOsko CW, Haynes CL . Cytotoxicity of Graphene Oxide and Graphene in Human Erythrocytes and Skin Fibroblasts . ACS Appl Mater Interfaces. 2011;3(7):2607–2615 . doi:10 .1021/am200428v . 7 . Arbo MD, Altknecht LF, Cattani S et al . In Vitro Cardiotoxicity Evaluation of Graphene Oxide . Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2019;841:8–13 . doi:10 .1016/j .mrgentox .2019 .03 .004 . 72 8 . Zhang J, Cao HY, Wang JQ, Wu GD, Wang L . Graphene Oxide and Reduced Graphene Oxide Exhibit Cardiotoxicity Through the Regulation of Lipid Peroxidation, Oxidative Stress, and Mitochondrial Dysfunction . Front Cell Dev Biol. 2021;9:616888 . doi:10 .3389/fcell .2021 .616888 . 9 . Rosas-Hernandez H, Escudero-Lourdes C, Ramirez-Lee MA et al . Cytotoxicity Profile of Pristine Graphene on Brain Microvascular Endothelial Cells . J Appl Toxicol. 2019;39(7):966–973 . doi:10 .1002/JAT .3786 . 10 . Ardoña HAM, Zimmerman JF, Shani K et al . Differential Modulation of Endothelial Cytoplasmic Protrusions After Exposure to Graphene-Family Nanomaterials . NanoImpact. 2022;26:100401 . doi:10 .1016/j .impact .2022 .100401 . 11 . Yang D, Shen J, Fan J, Chen Y, Guo X . Paracellular Permeability Changes Induced by Multi-Walled Carbon Nanotubes in Brain Endothelial Cells and Associated Roles of Hemichannels . Toxicology. 2020;440:152491 . doi:10 .1016/j .tox .2020 .152491 . 12 . Zhao X, Chang S, Long J, Li J, Li X, Cao Y . The Toxicity of Multi-Walled Carbon Nanotubes (MWCNTs) to Human Endothelial Cells: The Influence of Diameters of MWCNTs . Food Chem Toxicol. 2019;126:169–177 . doi:10 .1016/J .FCT .2019 .02 .026 . 13 . Long J, Xiao Y, Liu L, Cao Y . The Adverse Vascular Effects of Multi-Walled Carbon Nanotubes (MWCNTs) to Human Vein Endothelial Cells (HUVECs) In Vitro: Role of Length of MWCNTs . J Nanobiotechnol. 2017;15(1):80 . doi:10 .1186/S12951-017-0318-X . 14 . Cao Y, Jacobsen NR, Danielsen PH et al . Vascular Effects of Multiwalled Carbon Nanotubes in Dyslipidemic Apoe-/- Mice and Cultured Endothelial Cells . Toxicol Sci. 2014;138(1):104–116 . doi:10 .1093/toxsci/kft328 . 15 . Yang H, Li J, Yang C, Liu H, Cao Y . Multi-Walled Carbon Nanotubes Promoted Lipid Accumulation in Human Aortic Smooth Muscle Cells . Toxicol Appl Pharmacol. 2019;374:11–19 . doi:10 .1016/ j .taap .2019 .04 .022 . 16 . Burke AR, Singh RN, Carroll DL et al . Determinants of the Thrombogenic Potential of Multiwalled Carbon Nanotubes . Biomaterials. 2011;32(26):5970–5978 . doi:10 .1016/j .biomaterials .2011 .04 .059 . 17 . Gaffney AM, Santos-Martinez MJ, Satti A et al . Blood Biocompatibility of Surface-Bound Multi- -Walled Carbon Nanotubes . Nanomedicine. 2015;11(1):39–46 . doi:10 .1016/j .nano .2014 .07 .005 . 18 . Holzer M, Bihari P, Praetner M et al . Carbon-Based Nanomaterials Accelerate Arteriolar Thrombus Formation in the Murine Microcirculation Independently of Their Shape . J Appl Toxicol. 2014;34(11):1167–1176 . doi:10 .1002/JAT .2996 . 19 . Rodríguez-Yáñez Y, Bahena-Uribe D, Chávez-Munguía B et al . Commercial Single-Walled Carbon Nanotubes Effects in Fibrinolysis of Human Umbilical Vein Endothelial Cells . Toxicol In Vitro. 2015;29(5):1201–1214 . doi:10 .1016/J .TIV .2015 .02 .009 . 20 . Yuvaraj V, Rajiv S, Mukherjee A, Chandrasekaran N, Sastry TP . Toxicity Assessment of Carbon Nanotubes on Erythrocyte Morphology and Lymphocytes In Vitro . Asian J Pharm Clin Res. 2016;9(2):278–280 . 21 . Solarska K, Gajewska A, Bartosz G, Mitura K . Induction of Apoptosis in Human Endothelial Cells by Nanodiamond Particles . J Nanosci Nanotechnol. 2012;12(6):5117–5121 . doi:10 .1166/ jnn .2012 .4952 . 22 . Ren L, Jing Z, Xia F, Zhang JZ, Li Y . Toxic Effect of Fullerene and Its Derivatives Upon the Transmembrane β2-Adrenergic Receptors . Molecules. 2022;27(14):4562 . doi:10 .3390/molecules 27144562 . 23 . Bahrami S, Baheiraei N, Mohseni M et al . Three-Dimensional Graphene Foam as a Conductive Scaffold for Cardiac Tissue Engineering . J Biomater Appl. 2019;34(1):74–85 . doi:10 .1177/ 0885328219839037 . 24 . Zhao G, Feng Y, Xue L et al . Anisotropic Conductive Reduced Graphene Oxide/Silk Matrices Promote Post-Infarction Myocardial Function by Restoring Electrical Integrity . Acta Biomater. 2022;139:190–203 . doi:10 .1016/J .ACTBIO .2021 .03 .073 . 73 25 . Ren J, Braileanu G, Gorgojo P et al . On the Biocompatibility of Graphene Oxide Towards Vascular Smooth Muscle Cells . Nanotechnology. 2020;32(5):055101 . doi:10 .1088/1361-6528/abc1a3 . 26 . Bangeppagari M, Park SH, Kundapur RR, Lee SJ . Graphene Oxide Induces Cardiovascular Defects in Developing Zebrafish (Danio Rerio) Embryo Model: In Vivo Toxicity Assessment . Sci Total Environ. 2019;673:810-820 . doi:10 .1016/j .scitotenv .2019 .04 .082 . 27 . Barros AO da S, Ricci-Junior E, Pereira JX et al . High Doses of Graphene Quantum Dots Impact on Microcirculation System: An Observational Study . Eur J Pharm Biopharm. 2022;176:180–187 . doi:10 .1016/j .ejpb .2022 .05 .013 . 28 . Zheng W, McKinney W, Kashon ML, Pan D, Castranova V, Kan H . The Effects of Inhaled Multi-Walled Carbon Nanotubes on Blood Pressure and Cardiac Function . Nanoscale Res Lett. 2018;13:1–10 . doi:10 .1186/s11671-018-2603-5 . 29 . Chen R, Zhang L, Ge C et al . Subchronic Toxicity and Cardiovascular Responses in Spontaneously Hypertensive Rats After Exposure to Multiwalled Carbon Nanotubes by Intratracheal Instillation . Chem Res Toxicol. 2015;28(3):440–450 . doi:10 .1021/tx5004003 . 30 . Hosseinpour M, Azimirad V, Alimohammadi M, Shahabi P, Sadighi M, Nejad GG . The Cardiac Effects of Carbon Nanotubes in Rat . Bioimpacts. 2016;6(2):79–84 . doi:10 .15171/bi .2016 .11 . 31 . Tan XQ, Cheng XL, Zhang L et al . Multi-Walled Carbon Nanotubes Impair Kv4 .2/4 .3 Channel Activities, Delay Membrane Repolarization and Induce Bradyarrhythmias in the Rat . PLoS One. 2014;9(7) . doi:10 .1371/journal .pone .0101545 . 32 . Thompson LC, Sheehan NL, Walters DM, Lust RM, Brown JM, Wingard CJ . Airway Exposure to Modified Multi-Walled Carbon Nanotubes Perturbs Cardiovascular Adenosinergic Signaling in Mice . Cardiovasc Toxicol. 2019;19(2):168–177 . doi:10 .1007/s12012-018-9487-6 . 33 . Urankar RN, Lust RM, Mann E et al . Expansion of Cardiac Ischemia/Reperfusion Injury After Instillation of Three Forms of Multi-Walled Carbon Nanotubes . Part Fibre Toxicol. 2012;9(1):1–16 . doi:10 .1186/1743-8977-9-38 . 34 . Christophersen DV, Jacobsen NR, Andersen MHG et al . Cardiovascular Health Effects of Oral and Pulmonary Exposure to Multi-Walled Carbon Nanotubes in ApoE-Deficient Mice . Toxicology. 2016;371:29–40 . doi:10 .1016/j .tox .2016 .10 .003 . 35 . Xu YY, Yang J, Shen T et al . Intravenous Administration of Multi-Walled Carbon Nanotubes Affects the Formation of Atherosclerosis in Sprague-Dawley Rats . J Occup Health. 2012;54(5):361–369 . doi:10 .1539/JOH .12-0019-OA . 36 . Suzuki Y, Tada-Oikawa S, Hayashi Y et al . Singleand Double-Walled Carbon Nanotubes Enhance Atherosclerogenesis by Promoting Monocyte Adhesion to Endothelial Cells and Endothelial Progenitor Cell Dysfunction . Part Fibre Toxicol. 2016;13(1):1–12 . doi:10 .1186/S12989-016-0166-0 . 37 . Davis G, Lucero J, Fellers C, McDonald JD, Lund AK . The Effects of Subacute Inhaled Multi- -Walled Carbon Nanotube Exposure on Signaling Pathways Associated with Cholesterol Transport and Inflammatory Markers in the Vasculature of Wild-Type Mice . Toxicol Lett. 2018;296:48–56 . doi:10 .1016/J .TOXLET .2018 .08 .004 . 38 . Mandler WK, Nurkiewicz TR, Porter DW, Kelley EE, Olfert IM . Microvascular Dysfunction Following Multiwalled Carbon Nanotube Exposure Is Mediated by Thrombospondin-1 Receptor CD47 . Toxicol Sci. 2018;165(1):90–99 . doi:10 .1093/toxsci/kfy120 . 39 . Schubauer-Berigan MK, Dahm MM, Erdely A et al . Association of Pulmonary, Cardiovascular, and Hematologic Metrics With Carbon Nanotube and Nanofiber Exposure Among U .S . Workers: A Cross-Sectional Study . Part Fibre Toxicol. 2018;15(1):1–14 . doi:10 .1186/s12989-018-0258-0 . 40 . Kuijpers E, Pronk A, Kleemann R et al . Cardiovascular Effects Among Workers Exposed to Multiwalled Carbon Nanotubes . Occup Environ Med. 2018;75(5):351–358 . doi:10 .1136/oemed-2017 -104796 . 41 . Beard JD, Erdely A, Dahm MM et al . Carbon Nanotube and Nanofiber Exposure and Sputum and Blood Biomarkers of Early Effect Among U .S . Workers . Environ Int. 2018;116:214–228 . doi:10 .1016/j .envint .2018 .04 .004 . 80 buněk, což naznačuje, že SWCNT mohou být těmito buňkami fagocytovány . Zvýšená aktivita rezidentních imunitních a jaterních buněk vedla k rozvoji zánětu, infiltraci jaterní tkáně periferními imunitními buňkami a k poškození hepatocytů (důkazem poškození byly zvýšené sérové hladiny AST, ALT a bilirubinu) . V průběhu následujících tří týdnů hladiny AST a ALT postupně klesaly, ale hodnoty bilirubinu byly zvýšené minimálně čtyři měsíce po aplikaci nejvyšší dávky .36 Zdá se, že hepatotoxický potenciál mají i CNM odvozené od grafenu . Ve studii Zhanga et al ., provedené na potkanech, byly intravenózně aplikovány tři formy nanočástic GO (malé GO 50–200 nm, střední GO 200–500 nm a velké GO 500–2000 nm) v dávce 5 mg/kg . Všechny tři formy GO indukovaly expresi hepatocytárního IL-6 a zvyšovaly hladinu oxidačního stresu (nejvýraznější změny byly pozorovány u velké formy GO) . Kromě hepatocytů aktivoval GO také makrofágy, což zvýšilo produkci prozánětlivých cytokinů IL-1β a TNF-α .37 K podobným závěrům došly i další dva kolektivy . Anita Patlolla, Jonathan Randolph a Paul Tchounwou exponovali pět dní orálně potkany GO v dávkách 20 a 40 mg/kg/den . Za 24 hodin od poslední dávky odebrali vzorky krve a jater . Byla zjištěna zvýšená úroveň oxidačního stresu a na dávce závislá funkční a morfologická poškození . Druhá skupina vědců uvedla, že expozice GO (0,4, 2,0 a 10,0 mg/kg / 15 dávek v průběhu 30 dní) významně zvýšila míru oxidačního stresu a míru poškození jater, což bylo doprovázené významným nárůstem hladin jaterních enzymů AST, ALT a ALP .38,39 Funkční a morfologické změny jaterní tkáně bývají provázeny také změnami v transkriptomu . Poulsen et al . ve své studii vystavili myši intratracheální expozici GO a rGO (v dávkách 18, 54 a 162 μg/myš) . Z výsledků vyplývá, že exprese genů v jaterní tkáni byla významněji ovlivňována expozicí GO . Vyšší dávky GO i rGO aktivovaly geny, které jsou součástí signálních drah pro regulaci syntézy lipidů a homeostázy (včetně homeostázy cholesterolu) . Změny v expresi nukleárních receptorů transkripčních faktorů LXR/RXR napovídají, že vlivem expozice došlo ke zvýšení metabolismu a biosyntézy cholesterolu, zatímco míra lipogeneze a transportu cholesterolu byly omezeny .40 Vedle prokazatelné střevní a jaterní toxicity některých CNM je na druhou stranu nutno zmínit také jejich protektivní účinky, reprezentované především zástupci z řady fullerenů . Orgánová toxicita fullerenů je nejen velmi nízká až zanedbatelná, ale naopak existují důkazy o tom, že expozice fullerenům podporuje regeneraci a normální fyziologický stav tkání (včetně tkání střev a jater) . Ve studii autorů Takahashi et al . byli potkani orálně exponováni fullerenu (C60) v dávkách 1, 10, 100 a 1000 mg/kg/den po dobu 29 dní . V následujících 14 dnech nebyly u žádné z dávek pozorovány patologické orgánové změny a nebyla pozorována ani orgánová kumulace . Jedinou pozorovatelnou změnou byl nevýznamný nárůst hmotnosti jater . Zvířata exponovaná nejvyšší dávce měla černou stolici a stopy fullerenu byly nalezeny v žaludku a v tlustém střevě .41 Protektivní účinek fullerenů (C60) popsali například Elshater et al . V jejich studii byl potkanům podáván hepatotoxický cyklofosfamid, přičemž jedna ze skupin dostávala navíc také fulleren C60 (4 mg/kg/denně po dobu 10 dní) . U těchto potkanů (ve srovnání s potkany, kteří dostávali pouze cyklofosfamid) došlo k normalizaci krevního obrazu (erytrocytů, trombocytů i leukocytů), neklesla hladina hemoglobinu a byly nalezeny nižší hladiny ALT, AST, ALP a oxidačního stresu .42 Z dalších živočišných druhů, které byly využity k monitorování účinků CNM, je možné zmínit například kachnu domácí . Al-Badri et al . se pokusili o odhad hepatotoxických účinků v oblasti, jejíž prostředí bylo kontaminováno CNM . Zde žijící kachny domácí tak byly kontinuálně vystaveny expozici ultrajemných sazí (carbon black) a MWCNT . Z výsledků vyplývá, 81 že játra kachen vykazovala zřetelné známky poškození . Došlo k dilataci sinusoidů, kongesci a k zánětu . Autoři se domnívají, že k poškození jater může docházet i u ostatních zde žijících živočichů, včetně exponovaných osob .43 Vzhledem k tomu, že se CNM mohou dostávat i do vodního prostředí, jsou významné studie s vodními živočichy . V jedné studii Chernick et al . testovali toxicitu MWCNT na rybách Oryzias latipes (medaka japonská) . Ryby byly exponovány orálně v sedmi dávkách během 16 dní . Mezi nálezy patří především poškození jater a žlučových cest . Histologická analýza odhalila otoky drsného endoplazmatického retikula, zvýšenou lysozomální aktivitu hepatocytů a otoky v intrahepatických žlučových cestách .44 5.3 ZÁVĚR Gastrointestinální trakt je jednou se vstupních bran CNM do organismu, kam mohou pronikat s potravou, tekutinami, léky atd . Skrze něj pak mohou přestupovat do tkání a krevního oběhu, kde, jak jsme již popsali, mohou působit i toxicky . Toxicita byla prokázána také vůči buňkám gastrointestinálního traktu, a to jak in vitro, tak in vivo . Jak se ukazuje, toxicky působí hlavně MWCNT, SWNCT, grafen, GO a rGO . Mohou poškodit nejen střevní sliznici, ale také játra . Často se jedná o poškození zprostředkované indukcí chronického zánětu a oxidačního stresu . Alarmující je, že některé studie dokládají také mezigenerační toxicitu . 5.4 LITERATURA 1 . Sohal IS, O’Fallon KS, Gaines P, Demokritou P, Bello D . Ingested Engineered Nanomaterials: State of Science in Nanotoxicity Testing and Future Research Needs . Part Fibre Toxicol. 2018;15(1):1–31 . doi:10 .1186/S12989-018-0265-1 . 2 . Masyutin A, Erokhina M, Sychevskaya K et al . Multi-Walled Carbon Nanotubes: Biodegradation by Gastric Agents in Vitro and Effect on Murine Intestinal System . MS&E. 2015;98(1):012008 . doi:10 .1088/1757-899X/98/1/012008 . 3 . Guarnieri D, Sánchez-Moreno P, Del Rio Castillo AE et al . Biotransformation and Biological Interaction of Graphene and Graphene Oxide During Simulated Oral Ingestion . Small. 2018;14(24):1800227 . doi:10 .1002/smll .201800227 . 4 . Lu K, Dong S, Xia T, Mao L . Kupffer Cells Degrade 14C-Labeled Few-Layer Graphene to 14CO2 in Liver Through Erythrophagocytosis . ACS Nano. 2021;15(1):396–409 . doi:10 .1021/acsnano .0c07452 . 5 . Rana SVS . A Comprehensive Assessment of Hepatotoxicity Induced by Engineered Nanoparticles: A Review . J Toxicol Risk Assess. 2020;6(2):035 . doi:10 .23937/2572-4061 .1510035 . 6 . Gustafson HH, Holt-Casper D, Grainger DW, Ghandehari H . Nanoparticle Uptake: The Phagocyte Problem . Nano Today. 2015;10(4):487–510 . doi:10 .1016/j .nantod .2015 .06 .006 . 7 . Zhang YN, Poon W, Tavares AJ, McGilvray ID, Chan WCW . Nanoparticle–Liver Interactions: Cellular Uptake and Hepatobiliary Elimination . J Control Release. 2016;240:332–348 . doi:10 .1016/ J .JCONREL .2016 .01 .020 . 8 . Bartucci R, Paramanandana A, Boersma YL, Olinga P, Salvati A . Comparative Study of Nanoparticle Uptake and Impact in Murine Lung, Liver and Kidney Tissue Slices . Nanotoxicology. 2020;14(6):847–865 . doi:10 .1080/17435390 .2020 .1771785 . 9 . Bartneck M, Warzecha KT, Tacke F . Therapeutic Targeting of Liver Inflammation and Fibrosis by Nanomedicine . Hepatobiliary Surg Nutr. 2014;3(6):364–376 . doi:10 .3978/j .issn .2304 -3881 .2014 .11 .02 . 82 10 . Kodavanti T, Tennant A, Hughes M . Toxicity of Multi-walled Carbon Nanotubes in Rat and Human Intestinal Cell Models . Presented at: Society of Toxicology Annual Meeting; March 15–19, 2020; Anaheim, CA . Poster . doi:10 .23645/epacomptox .19104815 . 11 . Heshmati M, Hajibabae S, Barikrow N . Genotoxicity and Cytotoxicity Assessment of Graphene Oxide Nanosheets on HT29 Cells . J Kermanshah Univ Med Sci. 2018;22(1): e69641 . doi:10 .5812/ jkums .69641 . 12 . Domenech J, Hernández A, Demir E, Marcos R, Cortés C . Interactions of Graphene Oxide and Graphene Nanoplatelets with the In Vitro Caco-2/HT29 Model of Intestinal Barrier . Sci Rep. 2020;10(1):1–15 . doi:10 .1038/s41598-020-59755-0 . 13 . Cebadero-Domínguez O, Ferrández-Gómez B, Sánchez-Ballester S, Moreno J, Jos A, Cameán AM . In Vitro Toxicity Evaluation of Graphene Oxide and Reduced Graphene Oxide on Caco-2 Cells . Toxicol Rep. 2022;9:1130–1138 . doi:10 .1016/J .TOXREP .2022 .05 .010 . 14 . Feng W, Wang J, Li B et al . Graphene Oxide Leads to Mitochondrial-Dependent Apoptosis by Activating ROS-p53-mPTP Pathway in Intestinal Cells . Int J Biochem Cell Biol. 2022;146:106206 . doi:10 .1016/J .BIOCEL .2022 .106206 . 15 . Garriga R, Herrero-Continente T, Palos M et al . Toxicity of Carbon Nanomaterials and Their Potential Application as Drug Delivery Systems: In Vitro Studies in Caco-2 and MCF-7 Cell Lines . Nanomaterials. 2020;10(8):1–21 . doi:10 .3390/nano10081617 . 16 . Gao Y, Xu A, Shen Q, Xie Y, Liu S, Wang X . Graphene Oxide Aggravated Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis Through Intestinal Epithelial Cells Autophagy Dysfunction . J Toxicol Sci. 2021;46(1):43–55 . doi:10 .2131/jts .46 .43 . 17 . Tilton SC, Karin NJ, Tolic A et al . Three Human Cell Types Respond to Multi-Walled Carbon Nanotubes and Titanium Dioxide Nanobelts with Cell-Specific Transcriptomic and Proteomic Expression Patterns . Nanotoxicology. 2014;8(5):533–548 . doi:10 .3109/17435390 .2013 .803624 . 18 . Lai X, Yost BLB, Clack JW et al . Protein Expression Profiles of Intestinal Epithelial Co-Cultures: Effect of Functionalised Carbon Nanotube Exposure . Int J Biomed Nanoscience Nanotechnol. 2013;3(1-2):127–162 . doi:10 .1504/ijbnn .2013 .054508 . 19 . Bantun F, Singh R, Alkhanani MF et al . Gut Microbiome Interactions with Graphene Based Nanomaterials: Challenges and Opportunities . Sci Total Environ. 2022;830:154789 . doi:10 .1016/ J .SCITOTENV .2022 .154789 . 20 . Lahiani MH, Gokulan K, Williams K, Khare S . Impact of Pristine Graphene on Intestinal Microbiota Assessed Using a Bioreactor-Rotary Cell Culture System . ACS Appl Mater Interfaces. 2019;11(29):25708–25719 . doi:10 .1021/acsami .9b07635 . 21 . Couvillion SP, Danczak RE, Cao X et al . Graphene Oxide Exposure Alters Gut Microbial Community Composition and Metabolism in an In Vitro Human Model . NanoImpact. 2023;30:100463 . doi:10 .1016/J .IMPACT .2023 .100463 . 22 . Chen H, Wang B, Gao D et al . Broad-Spectrum Antibacterial Activity of Carbon Nanotubes to Human Gut Bacteria . Small. 2013;9(16):2735–2746 . doi:10 .1002/smll .201202792 . 23 . Loutfy SA, Salaheldin TA, Ramadan MA, Farroh KY, Abdallah ZF, Youssef T . Synthesis, Characterization and Cytotoxic Evaluation of Graphene Oxide Nanosheets: In Vitro Liver Cancer Model . Asian Pac J Cancer Prev. 2017;18(4):955 . doi:10 .22034/APJCP .2017 .18 .4 .955 . 24 . Kalman J, Torrent F, Navas JM . Cytotoxicity of Three Graphene-Related Materials in Rainbow Trout Primary Hepatocytes Is Not Associated to Cellular Internalization . Ecotoxicol Environ Saf. 2022;231:113227 . doi:10 .1016/j .ecoenv .2022 .113227 . 25 . Uribe-Calderon JA, Poot-Bote CG, Cervantes-Uc JM, Pacheco-Pantoja EL, Echevarría-Machado I, Rodríguez-Fuentes N . Physicochemical and Biological Characterization of Oxidized Multi-Walled Carbon Nanotubes on HepG2 Liver Cells . J Nanopart Res. 2022;24(7):1–19 . doi:10 .1007/s11051 -022-05489-1 . 83 26 . Zhao C, Zhou Y, Liu L et al . Lipid Accumulation in Multi-Walled Carbon Nanotube-Exposed HepG2 Cells: Possible Role of Lipophagy Pathway . Food Chem Toxicol. 2018;121:65–71 . doi:10 .1016/ J .FCT .2018 .08 .033 . 27 . Piret JP, Vankoningsloo S, Noël F et al . Inflammation Response at the Transcriptional Level of HepG2 Cells Induced by Multi-Walled Carbon Nanotubes . J Phys Conf Ser . 2011;304:012040 . doi:10 .1088/1742-6596/304/1/012040 28 . Fu C, Liu T, Li L, Liu H, Liang Q, Meng X . Effects of Graphene Oxide on the Development of Offspring Mice in Lactation Period . Biomaterials . 2015;40:23–31 . doi:10 .1016/j .biomaterials .2014 .11 .014 29 . Wu Q, Yin L, Li X, Tang M, Zhang T, Wang D . Contributions of Altered Permeability of Intestinal Barrier and Defecation Behavior to Toxicity Formation From Graphene Oxide in Nematode Caenorhabditis Elegans . Nanoscale . 2013;5(20):9934–9943 . doi:10 .1039/c3nr02084c 30 . Chen H, Zhao R, Wang B et al . Acute Oral Administration of Single-Walled Carbon Nanotubes Increases Intestinal Permeability and Inflammatory Responses: Association With the Changes in Gut Microbiota in Mice . Adv Healthc Mater . 2018;7(13):1701313 . doi:10 .1002/ADHM .201701313 31 . Zheng M, Lu J, Lin G, Su H, Sun J, Luan T . Dysbiosis of Gut Microbiota by Dietary Exposure of Three Graphene-Family Materials in Zebrafish (Danio Rerio) . Environ Pollut . 2019;254:112969 . doi:10 .1016/j .envpol .2019 .112969 32 . Ji Z, Zhang D, Li L et al . The Hepatotoxicity of Multi-Walled Carbon Nanotubes in Mice . Nanotechnology . 2009;20(44):445101 . doi:10 .1088/0957-4484/20/44/445101 33 . Adedara IA, Anao OO, Forcados GE et al . Low Doses of Multi-Walled Carbon Nanotubes Elicit Hepatotoxicity in Rats With Markers of Oxidative Stress and Induction of Pro-Inflammatory Cytokines . Biochem Biophys Res Commun . 2018;503(4):3167–3173 . doi:10 .1016/j .bbrc .2018 .08 .112 34 . Xu YY, Ge J, Zhang MH et al . Intravenous Administration of Multiwalled Carbon Nanotubes Aggravates High-Fat Diet-Induced Nonalcoholic Steatohepatitis in Sprague Dawley Rats . Int J Toxicol . 2016;35(6):634–643 . doi:10 .1177/1091581816653363 35 . Zhang HY, Chen RL, Shao Y, Wang HL, Liu ZG . Effects of Exposure of Adult Mice to Multi-Walled Carbon Nanotubes on the Liver Lipid Metabolism of Their Offspring . Toxicol Res . 2018;7(5): 809–816 . doi:10 .1039/c8tx00032h 36 . Principi E, Girardello R, Bruno A et al . Systemic Distribution of Single-Walled Carbon Nanotubes in a Novel Model: Alteration of Biochemical Parameters, Metabolic Functions, Liver Accumulation, and Inflammation In Vivo . Int J Nanomedicine . 2016;11:4299–4316 . doi:10 .2147/IJN .S109950 37 . Zhang Y, Ma C, Wang Z et al . Large-Sized Graphene Oxide Synergistically Enhances Parenchymal Hepatocyte IL-6 Expression Monitored by Dynamic Imaging . Nanoscale . 2020;12(15):8147–8158 . doi:10 .1039/C9NR10713D 38 . Patlolla AK, Rondalph J, Tchounwou PB . Biochemical and Histopathological Evaluation of Graphene Oxide in Sprague-Dawley Rats . Austin J Environ Toxicol . 2017;3(1):1021 . 39 . Nirmal NK, Awasthi KK, John PJ . Hepatotoxicity of Graphene Oxide in Wistar Rats . Environ Sci Pollut Res Int . 2020;28(34):46367–46376 . doi:10 .1007/S11356-020-09953-0 40 . Poulsen SS, Bengtson S, Williams A et al . A Transcriptomic Overview of Lung and Liver Changes One Day After Pulmonary Exposure to Graphene and Graphene Oxide . Toxicol Appl Pharmacol . 2021;410:115343 . doi:10 .1016/j .taap .2020 .115343 41 . Takahashi M, Kato H, Doi Y et al . Sub-Acute Oral Toxicity Study With Fullerene C60 in Rats . J Toxicol Sci . 2012;37(2):353–361 . doi:10 .2131/jts .37 .353 42 . Elshater AEA, Haridy MAM, Salman MMA, Fayyad AS, Hammad S . Fullerene C60 Nanoparticles Ameliorated Cyclophosphamide-Induced Acute Hepatotoxicity in Rats . Biomed Pharmacother . 2018;97:53–59 . doi:10 .1016/j .biopha .2017 .10 .134 84 43 . Al-Badri AM, Bargooth AF, Al-Jebori JG, Zegyer EAK . Identification of Carbon Nanotube Particles in Liver Tissue and Its Effects on Apoptosis of Birds Exposed to Air Pollution . Vet World . 2019;12(9):1372–1377 . doi:10 .14202/vetworld .2019 .1372-1377 44 . Chernick M, Kennedy A, Thomas T et al . Impacts of Ingested MWCNT-Embedded Nanocomposites in Japanese Medaka (Oryzias Latipes) . Nanotoxicology . 2021;15(10):1403–1422 . doi:10 .1080/ 17435390 .2022 .2028919 85 6 KOŽNÍ A OČNÍ TOXICITA Kůže je největším a nejkomplexnějším orgánem lidského těla s mnoha funkcemi . Tvoří fyzikální bariéru mezi vnějším a vnitřním protředím a chrání organismus před chemickými, fyzikálními a mikrobiálními vlivy . Je zapojená do řady fyziologických procesů, které zahrnují termoregulaci, čití, imunologickou surveillance, kontrolu ztráty tekutin a depozici tuků a vody . Skládá se z několika vrstev, mezi něž patří epidermis (vrchní část kůže, již kryje stratum corneum), dermis, kožní adnexa (mazové a potní žlázky a vlasové folikuly) a podkoží, ve kterém se nacházejí keratinocyty, fibroblasty, Langerhansovy buňky, buňky imunitního systému, melanocyty a Merkelovy buňky .1 Nanočástice reagují s vrchní vrstvou pokožky (epidermis), primárně se stratem corneum . To je složeno z mrtvých, plochých, terminálně diferencovaných keratinocytů (korneocytů) a extracelulární matrix, která obsahuje lipidy . Povrch strata corneum je osídlen kožním mikrobiomem, který spolu s epidermis vytváří její „kyselý plášť“ jako ochranu před útoky patogenů a pomáhá zachovávat její přirozené prostředí . Mikrobiom také interaguje s imunitním systémem, podporuje jeho funkce a brání přemnožení oportunních patogenů na povrchu kůže .2,3 Hlubší vrstvy epidermis jsou tvořeny korneocyty a keratinocyty, které jsou propojené těsnými mezibuněčnými spoji . Pevnost spojů (a tedy i epitelu) se dynamicky mění v závislosti na působení externích faktorů, stimulů a fyziologických potřeb organismu . Díky tomu se mění permeabilita kůže, přestup iontů, proteinů, ale také penetrace xenobiotik či migrace imunitních buněk .4 Transdermální přestup nanočástic do organismu je modifikován jejich fyzikálně-chemickými vlastnostmi . Cesty vstupu lze v prvním přiblížení rozdělit na cesty paracelulární, intercelulární a transcelulární . Dalšími cestami pak může být průnik přes vlasové folikuly a potní a mazové žlázy .5–7 Nanočástice penetrují do nižších vrstev pokožky, kde vyvolávají různé typy reakcí, mezi něž řadíme iritaci, kontaktní kopřivku, kontaktní dermatitidu a fotosensitivizaci . Současně nanočástice pronikají do systémové cirkulace a následně do orgánů a tkání .8 Při hodnocení vlivu vnější expozice je nutno zmínit také oko, které je velmi citlivé k vnějším faktorům . Nanočástice mohou dráždit jak povrch oka, tak i retinální buňky, ke kterým se dostávají jinou než topickou cestou (například inhalací nebo ze systémové cirkulace po perorální expozici) . Oční toxicita tedy bude následně zmíněna společně s toxicitou kožní .9 86 6.1 IN VITRO STUDIE In vitro studie dermální toxicity jsou zaměřeny na interakce uhlíkových nanočástic s jednotlivými vrstvami pokožky a s očními kompartmenty . Výsledky naznačují, že uhlíkové nanočástice mohou zvyšovat oxidační stres, vyvolávat zánětlivou odpověď, poškozovat buňky a způsobovat jejich smrt .10 V následujícím textu se zaměříme na vliv CNM na různé typy buněk, které se nacházejí v pokožce . Jako poslední zmíníme toxicitu CNM vůči oku . Vnějším vlivům jsou nejvíce vystaveny keratinocyty, které představují hlavní buněčnou linii pro in vitro testování dermatotoxicity . Ku příkladu Frontiñán-Rubio et al . provedli dvě studie zaměřené na hodnocení dermatotoxicity vybraných uhlíkových nanomateriálů (CNM) . V první studii ověřovali vliv oxidu grafenu (GO) a vícevrstvého grafenu (FLG) na metabolismus a funkce lidských imortalizovaných keratinocytů (HaCaT) . Nízké koncentrace GO i FLG (5 μg/ml / 7 dní) měnily metabolomický profil buněk . GO zvyšovala produkci alaninu, pyruvátu, glycerofosfocholinu a uridinfosfátu, zatímco přítomnost FLG vedla ke zvýšení hladin fumarátu, glycerofosfocholinu a ke snížení hladin pyruvátu, fosfokreatinu a fosfocholinu . Oba typy nanočástic redukovaly hladinu glukózy . Při podrobnější analýze autoři zjistili, že nanočástice zasahují do metabolických cest, které jsou kritické pro buněčnou viabilitu a mobilitu . Mezi alterovanými cestami byla syntéza proteinů, Krebsův cyklus, cyklus močoviny, recyklování amonia a metabolismus methioninu . Snížení hladiny glukózy bylo spojené s nadprodukcí volných kyslíkových radikálů (ROS), zvýšením hladiny volného cytosolového Ca2+, apoptózou a nekrózou buněk .11 V druhé studii tíž autoři testovali na keratinocytech HaCaT tři typy grafenových nanomateriálů, FLG a dva typy GO (GO1, GO2) . Buňky byly kultivovány se všemi CNM (5 μg/ml) po dobu sedmi nebo třiceti dnů . Experimenty potvrdily, že přítomnost CNM mění metabolom a bioenergetiku buněk, a to zvláště v případech, kdy se buňky nacházely ve stresovém stavu . Byla rovněž zjištěna zvýšená úroveň proliferace a klonogenity buněk (zejména při kultivaci s GO2) . Nadměrná míra proliferace může být spojována s vyšším rizikem vzniku a rozvoje karcinogeneze, což potvrdily některé dále uvedené indikátory . Buňky vystavené GO2 se po třiceti dnech kultivace významně zvětšily (stejně jako jejich jádra), rychleji se pohybovaly po dvojrozměrných površích v testu hojení a byla u nich zjištěna kumulace onkometabolitů . Autoři se proto domnívají, že některé typy grafenových nanočástic mohou mít (i při subchronické úrovni expozice) karcinogenní účinky .12 Toxicitu grafenu hodnotili také Salesa et al . V experimentu byl použit FLG (2–10 vrstev), který byl aplikován do kultivačních médií HaCaT v dávkách 0–10 µg/ml po dobu 12 a 24 hodin . Proliferační aktivita buněk byla posuzována za 72 a 96 hodin od aplikace . Autoři potvrdili vztah mezi dávkou a mírou toxických účinků (snižováním viability) s prahovou koncentrací 0,5 μg/ml FLG . Zajímavé bylo zjištění, že i podprahové (netoxické) koncentrace FLG 0,005 a 0,01 μg/ml dokázaly po 72 a 96 hodinách významně zvyšovat proliferační aktivitu buněk . Analýza změn v expresi třinácti vybraných genů prokázala zvýšenou expresi u šesti z nich . Jednalo se o SOD1 (superoxiddismutáza), CAT (kataláza), TGFB1 (transforming growth factor β), FN1 (fibronektin), CDH1 (kadherin 1) a FBN (fibrilin 1) .13 Autoři Pelin et al . exponovali buňky HaCaT různým typům GO a FLG po dobu 24 a 72 hodin . Testované nanočástice redukovaly buněčnou viabilitu, alterovaly mitochondriální funkce a poškozovaly plazmatickou membránu . Nejvyšší toxicitu vykázaly nejvíce oxidované GO s největším průměrem . Tyto částice poškozovaly mitochondrie a plazmatickou membránu již při EC50 5,4 a 2,9 μg/ml (zatímco v případě FLG byly hodnoty EC50 62,8 a 45,5 μg/ml) .14 Násled- 87 ná studie stejných autorů potvrdila již získané výsledky, a navíc zjistila, že FLG a GO v dávce 100 μg/ml / 72 h zvyšují depolarizaci mitochondriální membrány a produkci ROS (minimálně o 44 %; významný nárůst produkce ROS byl detekován již při dávce 0,4 μg/ml / 24 h) .15 Buněčné linie HaCaT mohou být ovlivňovány také MWCNT, SWCNT a fullereny . Danielle McShan a Hongtao Yu vystavili buňky HaCaT nepurifikovaným, purifikovaným a karboxylovaným MWCNT (20 μg/ml) po dobu 0,5 a 24 hodin . Bylo nalezeno nevýznamné snížení viability buněk a nevýznamné poškození DNA, které zřejmě souviselo s významným nárůstem úrovně oxidačního stresu .16 Brian Palmer, Sarah Phelan-Dickenson a Lisa DeLouise testovali nekarboxylované a karboxylované MWCNT (HaCaT; expozice 0–5 μg/ml po dobu 3 a 24 hodin) . MWCT s vysokou mírou karboxylace významně snižovaly viabilitu buněk a navozovaly buněčnou smrt, zatímco nekarboxylované MWCNT významně zvyšovaly oxidační stres . Výsledky tak naznačují, že MWCNT indukují buněčnou smrt nezávisle na míře oxidačního stresu .17 Obdobně na strukturu HaCaT působí i SWCNT . Autoři Manna et al . uvádějí, že SWCNT jsou schopny redukovat viabilitu buněk i na velmi nízké expoziční hladině (0,1 μg/ml / 72 h) a dále ji snižovat se zvyšující se dávkou . Přítomnost SWCNT vede k aktivaci transkripčního faktoru NF-κB, který kontroluje expresi mnoha prozánětlivých cytokinů, jako jsou IL-8, IL-1, IL-6 a TNFα (přímá indukce zánětu) .18 Ve studii autorů Onga et al . snižovaly SWCNT (12,5, 25, 50, 100 μg/ml) buněčnou viabilitu, omezovaly růst a proliferaci buněk a inhibovaly signalizaci Hsp90 . Analýza genové exprese prokázala sníženou expresi Hsp90 vlivem SWCNT a narušení proteinové homeostázy v buňce . Porucha vede k progresi buněčného stárnutí (Hsp90 funguje jako chaperon podílející se na „refoldingu“ proteinů) .19 K dalším uhlíkovým nanočásticím, které byly testovány na buněčných liniích HaCaT, patří fullereny a jejich deriváty . Saathoff et al . vystavili buňky HaCaT třem typům fullerenolů, C60(OH)20, C60(OH)24 a C60(OH)32, v dávkách 0,0005–42,5 μg/ml / 24 a 48 h . Snížení viability autoři pozorovali pouze u buněk vystavených nejvyšší dávce C60(OH)32 . Fullerenoly C60(OH)24 a C60(OH)32, snižovaly (v nejvyšších dávkách) expresi IL-8, avšak C60(OH)32 v dávce 0,34 μg/ml / 24 h produkci IL-8 naopak zvyšoval . Autoři uvádějí, že v průběhu experimentu docházelo k paracelulární i intracelulární agregaci/aglomeraci . Fullerenol C60(OH)20 aglomeroval v cytoplazmatických vakuolách, zatímco aglomeráty fullerenolu C60(OH)24 byly detekovány uvnitř buněk fokálně přichycené k buněčné membráně . Fullerenol C60(OH)32 vytvářel menší agregáty uvnitř buněk a vykazoval menší interakce s membránami . Výsledky naznačují dávkovou závislost toxicity fullerenolů a její úzkou vazbu na míru hydroxylace molekulárních struktur .20 Fibroblasty jsou základní buňky vazivové tkáně, rozptýlené v různých částech těla . Hrají důležitou roli v epidermální proliferaci, regeneraci a tvorbě extracelulární matrix . Liao et al . exponovali lidské dermální fibroblasty (NHDF) grafenu a GO (50 μg/ml / 24 h) . Výsledkem bylo významné snížení buněčné viability, zvýšení hladiny oxidačního stresu a narušení mitochondriální aktivity .21 K podobným výsledkům došli i autoři de Godoy et al ., kteří kultivovali myší kožní fibroblasty s MWCNT funkcionalizovanými tetraetylenpentaminem (MWCNT- -TEPA; 1, 50, 250, 500 a 1000 mg/ml / 24 h) . MWCNT-TEPA významně snižovaly viabilitu buněk, na druhou stranu exprese volných radikálů a prozánětlivého cytokinu TNF-α významně vzrostly . Vyšší dávky MWCNT-TEPA způsobovaly závažnější buněčná poškození .22 K podobným závěrům došli i Anita Patlolla, Brionna Knighten a Paul Tchounwou, kteří sledovali vliv MWCNT na NHDF . Toxický účinek byl závislý na dávce, přičemž vyšší koncentrace poškozovaly DNA a aktivovaly intracelulární cesty vedoucí k apoptóze . Oba uvedené 88 jevy vedly k významnému poklesu buněčné viability .23 Autoři Tian et al . porovnávali vliv různých typů CNM na NHDF . V rozsáhlé studii exponovali tyto buňky SWCNT, MWCNT, sazím (carbon black), grafitu a aktivnímu uhlíku v široké škále koncentrací po dobu 1 až 5 dní . Nejvyšší pokles viability buněk byl zjištěn v případě expozice SWCNT . Vedle snížení viability nanočástice alterovaly rovněž buněčnou morfologii se změnou tvaru a narušením adhezitivity . Míra toxického účinku byla závislá na dávce a na čase .24 Vedle toxických účinků CNM je nutné zmínit i jejich pozitivní vlivy . Ve studii Jennifer Mytych, Macieje Wnuka a Sureshe Rattana bylo prokázáno, že fibroblasty z kůže lidského obličeje (FSF1) po expozici ND (dávky do 0,5 μg/ml) snáze proliferovaly a měly vyšší hojivou kapacitu a metabolickou aktivitu . ND rovněž vyvolávaly buněčný stres se zvýšenou expresí hemoxydogenázy, sirtuinu 1 a DNA metyltransferázy . Ve výsledku tedy došlo k prodloužení doby přežití fibroblastů a ke zlepšení jejich funkcí .25 Odborná literatura uvádí, že i aplikace dvojrozměrných grafenových struktur mohou vést ke zvýšení proliferace a zlepšení funkcí lidských fibroblastů (k vyšší efektivitě hojení) . Safina et al . připravili filmy z grafenu a GO, které osadili NHDF . Komplex potencoval růst a bioaktivitu buněk a významně posiloval jejich regenerační schopnost .26 Vedle keratinocytů a kožních fibroblastů byly v některých in vitro studiích použity i modely lidské epidermis nebo přímo vzorky lidské kůže . Například autoři Silva et al . hodnotili vliv GO na kožní permeabilitu . V jejich experimentu byly použity vzorky lidské kůže o tloušťce 0,8 mm . Nejvyšší míra penetrace byla zjištěna při koncentraci 1000 µg GO / ml disperze . Nižší koncentrace sice penetrovaly rychleji, nicméně konečný celkový objem GO v pokožce byl nižší . Dermální penetrace CNM je využívána u fototerapie . Uhlíkové nanočástice v kůži absorbují záření blízké infračervenému pásmu, což má za následek nárůst lokální teploty a zvýšení účinnosti terapie .27 Autoři Fusco et al . studovali intenzitu dráždivých účinků CNM na kůži . V experimentu použili SkinEthic™ model rekonstruované lidské epidermis (RhE), na jehož povrch aplikovali FLG, FLG funkcionalizované dodecylsíranem sodným a dodecylbenzensulfonátem sodným, GO, rGO a grafen po dobu 42 minut . Známky iritace byly zjištěny pouze u funkcionalizovaných FLG . Došlo ke ztrátě denzity ve stratu corneum a stratu granulosum a fragmentaci keratinocytových jader stratum spinosum a stratum basale . GO indukoval pouze mírné poškození strata corneum . Všechny použité nanočástice kromě grafenu formovaly malá depozita ve stratu corneum a velké agregáty na povrchu epidermis . Autoři sledovali také hladinu zástupce skupiny alarminů IL-1α . K zvýšení jeho hladiny došlo pouze u funkcionalizovaných FLG . Zdá se tedy, že z testované skupiny CNM je za kožní iritanty možné považovat pouze funkcionalizované FLG .28 Dermální expozice bývá spojena i s expozicí oka . Autoři Yan et al . použili pro hodnocení toxicity CNM pro oko retinální pigmentový epitel (RPE) . Epitelové buňky byly exponovány MWCNT, plazmou modifikovanými MWCNT, hydroxylovanými MWCNT a karboxylovanými MWCNT (5–100 mg/ml / 72 h) . Nejvyšší koncentrace všech CNM způsobovaly významné snížení viability buněk, uvolňování laktátdehydrogenázy a zesílenou produkci volných radikálů (byly nalezeny apoptotické buňky) . Nejvyšší míra oční toxicity byla zaznamenána u nemodifikovaných MWCNT . Karboxylovaná forma MWCNT se jevila jako biokompatibilní .29 Ou et al . exponovali ARPE-19 (imortalizované lidské retinální buňky) GO a rGO (10–200 µg/ml / 6–72 h) . Vedle nárůstu hladiny oxidačního stresu způsobovaly nanočástice také snížení viability a poškození DNA . Částice rGO vykazovaly vyšší míru genotoxicity než částice GO .30 89 Wu et al . zkoumali toxicitu GO vůči lidským epitelovým buňkám rohovky (hCorEC) a lidským epitelovým spojivkovým buňkám (hConEC) . Dávky GO 12,5–100 μg/ml nevykázaly během akutní dvouhodinové expozice známky toxicity vůči hCorEC ani vůči hConEC . Celodenní (24hodinová) expozice obou buněčných linií GO však významně zvýšila produkci volných kyslíkových radikálů, což mělo za následek spuštění apoptotických mechanismů .31 Ve studii An et al . byly krysí rohovkové epitelové buňky (RCEC) vystaveny působení GO a rGO (5–50 μg/ml / 24, 48 a 72 h) . Částice GO, v závislosti na čase a dávce, výrazně snižovaly viabilitu buněk . Byl nalezen zvýšený výskyt apoptóz a nekróz a docházelo i k narušování buněčného cyklu . Obecně, částice GO vykazovaly vyšší míru toxicitu než částice rGO .32 Obdobně jako u dermálních expozic, i u expozic oka je nutné zmínit některé pozitivní účinky CNM . Bylo například prokázáno, že uhlíkové nanočástice podporují regeneraci buněk oka, konkrétně jejich růst a diferenciaci . Zambrano-Andazol et al . studovali in vitro interakce membrány z rGO s vybranými buněčnými liniemi oka (buňkami pigmentového epitelu lidské sítnice, lidskými rohovkovými epitelovými buňkami CHCE-T, primárními rohovkovými keratinocyty a primárními lidskými rohovkovými limbálními buňkami . Výsledkem byla nízká úroveň genotoxicity a významná indukce dělení a migrace buněk . Experiment in vivo, který byl proveden po in vitro studii, potvrdil regenerační potenciál rGO membrány .33 6.2 IN VIVO STUDIE Také v in vivo studiích byla sledována kožní a oční iritace a senzibilace po topické aplikaci CNM . Výsledky jsou v porovnání s výsledky in vitro studií komplexnější a poskytují validnější údaje o potenciální rizikovosti CNM pro člověka . Například Ema et al . zaměřili výzkum na dermální senzibilaci a oční iritaci po aplikaci SWCNT-N (Nikkiso) a SWCNT-SG (super-growth) a MWCNT N a M (Mitsui) u králíků a morčat . Doba sledování byla 24 a 48 hodin od aplikace 0,1 % SWCNT-N, 0,5 % SWCNT-SG, 0,25 % MWCNT-N a 1 % MWNT-M do konjunktiválního vaku . Po 24 hodinách se u tří králíků po aplikaci N-MWCNT objevila mírná konjunktivální hyperémie, která však do 48 hodin vymizela . Kožní iritace byla testována pomocí náplastí s nanočásticemi a změny byly hodnoceny za 1, 24, 48 a 72 hodin od jejich odstranění . Byla pozorována mírná hyperémie u tří králíků exponovaných N-MWCNT . Iritace kůže, obdobně jako oční iritace, vymizela do 48 hodin po sejmutí náplastí . U morčat k senzibilizaci kůže nedošlo vůbec . Z tohoto pohledu lze testované nanočástice charakterizovat jako slabé iritanty a senzibilizanty .34 Experimenty autorů Kim et al . byly zaměřeny na senzibilizaci kůže myší plátky grafenu . Ani nejvyšší koncentrace suspenze grafenu neměly za následek senzibilaci pokožky .35 Podobné výsledky získali Park et al ., kteří aplikovali MWCNT (1,000 μg/ml) na zdravou a poškozenou (abrazí) pokožku králíků . Po 24 ani 48 hodinách od aplikace nebyly na pokožce zjištěny známky poškození (edém nebo hyperémie) .36 Ani Balakrishna Murthy, Sairam Kishore a Surekha Paneerselvam ne uvádí nálezy známek toxického působení MWCNT na kůži a oko potkanů, králíků a morčat .37 Vedle SWCNT a MWCNT byly studovány i dermální toxicity fullerenů . Experiment Xin Xia, Nancy Monteiro-Riviere a Jima Riviereho byl zaměřen na dermální absorpci fullerenu C60 . Pokožka odstavených selat byla exponována po dobu čtyř dnů fullerenu (200 μl nebo 500 μg/ml / 24 h) v toluenu, cyklohexanu, chloroformu a v minerálním oleji . Exponovaná pokožka byla přelepena páskou a byly odebrány vzorky pro histologickou analýzu . 96 hladiny BUN (blood urea nitrogen) a hladiny oxidačního stresu, přestože se aktivita antioxidačních enzymů zvýšila . Histologická analýza potvrdila poškození ledvinových tkání . Dávka 10 mg/kg způsobovala dilataci tubulů a renální tubulární separaci; dávka 20 mg/kg vyvolávala tubulární nekrózu, dezintegraci tubulů, degeneraci hematopoetické tkáně a eozinofilní exsudát a dávka 40 mg/kg měla za následek závažnější formy všech dříve zmíněných patologií . Všechny pozorované změny byly závislé na dávkách .9 Na rozdíl od výše popsaných výsledků však skupina jiných autorů (Karsh et al .) v in vivo experimentu přítomnost nefrotoxických účinků GO nezjistila . Tito autoři aplikovali potkanům po dobu jednoho týdne intraperitoneálně GO v denní dávce 1 mg/kg .10 Zjištěnou neshodu by bylo možné přisuzovat rozdílné formě expozice a výrazně rozdílným expozičním dávkám, neboť Patlolla et al . podávali dávky 10–40 mg/kg . Ve experimentech byla pochopitelně věnována pozornost i vlivu povrchové modifikace/ funkcionalizace CNM na jejich biologickou aktivitu . Například Jasim et al . sledovali distribuci GO funkcionalizovaného kyselinou 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctovou (GO-DOTA značený radioaktivním indiem) . Po intravenózní aplikaci (50 μg) myším byl GO-DOTA detekován v moči, v močovém měchýři, ve slinivce a v játrech .11 S ohledem na pozitivní nálezy in vitro experimentů byla potenciální nefrotoxicita uhlíkových nanotrubic (CNT) testována rovněž i v experimentech in vivo . Například Lacerda et al . aplikovali myším intravenózně nefunkcionalizované a funkcionalizované MWCNT (funkcionalizace amoniakem a karboxylovými skupinami; dávka 200 μg) . Po 24 hodinách od aplikace byly myším odebrány vzorky ledvin, jater, sleziny a plic . Z nálezů vyplývá, že čím vyšší byl stupeň funkcionalizace, tím menší byla jejich akumulace ve tkáních . Nefuncionalizované MWCNT se akumulovaly téměř výhradně v plicích a játrech (ne v ledvinách) . Vybrané indikátory analýz séra a moči neindikovaly fyziologické abnormality u žádného z odebraných orgánů . Autoři se domnívají, že kritickým faktorem, vedoucím k menší akumulaci CNT ve tkáních a k normální tkáňové fyziologii, je stupeň funkcionalizace, a nikoli povaha funkčních skupin .12 K opačným závěrům došli Maha Gazia a Mohammed El-Magd, kteří známky nefrotoxicity MWCNT popsali . V jejich experimentu byly potkanům intratracheálně podány nefuncionalizované a funkcionalizované MWCNT (amylované a obalené polyethylenglykolem – pegylované; dávka 1 mg/kg) . Nefunkcionalizované a amylované MWCNT způsobovaly prakticky stejnou formu poškození ledvinové tkáně, která měla za následek snížení ledvinových funkcí . V histologických preparátech byly patrné kolabované nebo edematózní hemoragické glomeruly, poškozené mezangiální a endotelové buňky a mnoho apoptotických buněk . V krvi byly nalezeny zvýšené hladiny močoviny a kreatininu . Příčinu poškození autoři připisují zvýšené hladině oxidačního stresu, která indukovala zánětlivou odpověď a apoptózu . Přítomnost zánětu byla potvrzena nárůstem hladiny prozánětlivého ILIL1β a zvýšenou aktivitou kaspázy 3 . V případě pegylovaných MWCNT výše uvedená poškození a změny pozorovány nebyly .13 Nefrotoxické účinky CNT popisují rovněž Zahra Matouri a Ali Noori, kteří intraperitoneálně aplikovali potkanům MWCNT, funkcionalizované karboxylovými skupinami (dávky 2,5, 5, 10 a 20 mg/kg) . Po jednom dni od aplikace byla u dávek 2,5 a 5 mg/kg nalezena snížená hladina sérové kyseliny močové . Po dvaceti dnech od aplikace byly u všech dávek zjištěny snížené hladiny sérové kyseliny močové a močoviny . Snížené hladiny kreatininu byly nalezeny pouze u dávek 5 a 10 mg/kg . Histologická analýza prokázala poškození ledvinové tkáně . Zajímavý byl nález ložisek hyalinu podobné substance, která vznikla (pravděpodobně) v důsledku zvýšené aktivity eozinofilů a dalších zánětlivých buněk (bazofilů a neutrofilů) . 97 V kůře a dřeni ledvin došlo vlivem expozice ke glomerulární degeneraci, dilataci Bowmanova pouzdra a degeneraci stěny proximálních tubulů . Poškození tkáně bylo závislé na dávce .14 Závěrem nutno zmínit i pozitivní účinky CNM na orgány vylučovací soustavy . Autoři Leporatti et al . popisují ve svém přehledovém článku antibakteriální aktivitu nanodiamantů při léčbě bakteriálních cystitid (vyvolaných například bateriemi Escherichia coli), které jsou častou komplikací nádorových onemocnění močového měchýře . U pacientů s touto diagnózou je nutné infekci řešit, nicméně bývá problém s použitím stávající farmakologické léčby . Autoři se domnívají, že antibakteriální aktivitu nanodiamantů by bylo možné využít i u rezistentních bakteriálních druhů .15 7.3 ZÁVĚR Studií, které se zabývají nefrotoxicitou není mnoho a závěry nejsou jednotné a jednoznačné, podobně jako tomu bylo v případě kožní a oční toxicity . Pokud vycházíme z principu předběžné opatrnosti a existují studie, které jistou míru toxicity prokázaly, je nutné s touto toxicitou počítat, obzvláště když právě močový systém může být jednou z eliminačních cest CNM . 7.4 LITERATURA 1 . Iavicoli I, Fontana L, Nordberg G . The Effects of Nanoparticles on the Renal System . Crit Rev Toxicol. 2016;46(6):490–560 . doi:10 .1080/10408444 .2016 .1181047 . 2 . Zhao H, Li L, Zhan H, Chu Y, Sun B . Mechanistic Understanding of the Engineered Nanomaterial- -Induced Toxicity on Kidney . J Nanomater. 2019;2019(1):2954853 . doi:10 .1155/2019/2954853 . 3 . Yu SP, Su XD, Du JL et al . The Cytotoxicity of Water-Soluble Carbon Nanotubes on Human Embryonic Kidney and Liver Cancer Cells . New Carbon Mater. 2018;33(1):36–45 . doi:10 .1016/ S1872-5805(18)60325-7 . 4 . Reddy ARN, Reddy YN, Krishna DR, Himabindu V . Multi Wall Carbon Nanotubes Induce Oxidative Stress and Cytotoxicity in Human Embryonic Kidney (HEK293) Cells . Toxicology. 2010;272(1–3): 11–16 . doi:10 .1016/J .TOX .2010 .03 .017 . 5 . Kermanizadeh A, Vranic S, Boland S et al . An In Vitro Assessment of Panel of Engineered Nanomaterials Using a Human Renal Cell Line: Cytotoxicity, Pro-Inflammatory Response, Oxidative Stress and Genotoxicity . BMC Nephrol. 2013;14(1):96 . doi:10 .1186/1471-2369-14-96 . 6 . Barillet S, Simon-Deckers A, Herlin-Boime N et al . Toxicological Consequences of TiO2, SiC Nanoparticles and Multi-Walled Carbon Nanotubes Exposure in Several Mammalian Cell Types: An In Vitro Study . J Nanopart Res. 2010;12(1):61–73 . doi:10 .1007/s11051-009-9694-y . 7 . Blazer-Yost BL, Banga A, Amos A et al . Effect of Carbon Nanoparticles on Renal Epithelial Cell Structure, Barrier Function, and Protein Expression . Nanotoxicology. 2011;5(3):354–371 . doi: 10 .3109/17435390 .2010 .514076 . 8 . Johnson-Lyles DN, Peifley K, Lockett S et al . Fullerenol Cytotoxicity in Kidney Cells Is Associated With Cytoskeleton Disruption, Autophagic Vacuole Accumulation, and Mitochondrial Dysfunction . Toxicol Appl Pharmacol. 2010;248(3):249–258 . doi:10 .1016/j .taap .2010 .08 .008 . 9 . Patlolla AK, Randolph J, Kumari SA, Tchounwou PB . Toxicity Evaluation of Graphene Oxide in Kidneys of Sprague-Dawley Rats . Int J Environ Res Public Health. 2016;13(4):380 . doi:10 .3390/ ijerph13040380 . 10 . Karsh EH, Kadhim RJ, Jabir MS . Effect of Graphene Oxide and Gold Nanoparticles on Kidney Parameters of Male Mice . AIP Conf Proc. 2020;2213:020145-1–020145-6 . doi:10 .1063/5 .0000167 . 98 11 . Jasim DA, Ménard-Moyon C, Bégin D, Bianco A, Kostarelos K . Tissue Distribution and Urinary Excretion of Intravenously Administered Chemically Functionalized Graphene Oxide Sheets . Chem Sci. 2015;6(7):3952–3964 . doi:10 .1039/C5SC00114E . 12 . Lacerda L, Ali-Boucetta H, Herrero MA et al . Tissue Histology and Physiology Following Intravenous Administration of Different Types of Functionalized Multiwalled Carbon Nanotubes . Nanomedicine. 2008;3(2):149–161 . doi:10 .2217/17435889 .3 .2 .149 . 13 . Abu Gazia M, El-Magd MA . Effect of Pristine and Functionalized Multiwalled Carbon Nanotubes on Rat Renal Cortex . Acta Histochem. 2019;121(2):207–217 . doi:10 .1016/j .acthis .2018 .12 .005 . 14 . Poormohammad Matouri Z, Noori A . Effect of Multi-Wall Carbon Nanotubes Toxicity on Kidney Function and Tissue in Rats . J Gorgan Univ Med Sci. 2018;20(1):22–28 . 15 . Leporatti S, Carbone M, Zupančič D, Veranič P . Nanodiamonds as Possible Tools for Improved Management of Bladder Cancer and Bacterial Cystitis . Int J Mol Sci. 2022;23(15):8183 . doi:10 .3390/ IJMS23158183 . 99 8 NEUROTOXICITA Uhlíkové nanomateriály (CNM) mohou pronikat i do centrální nervové soustavy (CNS) . Hlavními penetračními cestami jsou systémová cirkulace a horní cesty dýchací (primárně nosní dutina) . Translokace přes hematoencefalickou bariéru (HEB) je významně ovlivňována fyzikálně-chemickými vlastnostmi CNM a jejich funkcionalizací . Přes tuto bariéru, která má za fyziologických podmínek velmi malou permeabilitu, prostupují snadněji velmi malé hydrofobní CNM . V HEB mohou CNM indukovat zánětlivou odpověď, poškozovat endotel a zvyšovat její permeabilitu, a to zejména v těch oblastech, kde je HEB více fenestrovaná a osídlená perivaskulárními mikrogliemi (tyto buňky po stimulaci CNM produkují prozánětlivé cytokiny) . Uhlíkové nanočástice mohou také narušovat mezibuněčné spoje a prostupovat do CNS paracelulárně . Mezi další translokační cesty lze zařadit endocytózu a penetraci CNM do buněk bez narušení integrity jejich buněčné membrány (transcelulární transport) . Po průniku CNM do CNS může docházet k jejich kumulaci v různých mozkových kompartmentech . Variabilita míry kumulace (podle kompartmentů) je přitom opět významně ovlivňována fyzikálně-chemickými vlastnostmi a funkcionalizací CNM .1–3 V případech, kdy CNM vstupují do CNS cestou přes horní cesty dýchací (nosní dutinu), musí nejdříve překonat bariéru mukociliárního systému, transcelulárně nebo paracelulárně přestoupit přes vrstvu slizničních buněk a pomocí vazby na receptor penetrovat do neuronů v nosní sliznici . Podél axonů pak CNM prostupují (transcelulárně nebo extracelulárně) z čichového a/nebo trojklanného nervu až do CNS, kde vlivem CNM dochází k nežádoucím reakcím a k poškozování nervové tkáně .4–6 Dostupné literární zdroje dokládají, že CNM mohou indukovat neurozánětlivou odpověď a zvyšovat hladinu oxidačního stresu . Oba uvedené děje mají přímou vazbu na neurodegenerativní procesy, spojené s narušováním kognitivních a paměťových funkcí . Nutno však doplnit, že některé CNM naopak oxidační stres snižují, redukují produkci amyloidu a podporují neurogenezi .7 8.1 IN VITRO STUDIE Výsledky in vitro studií dokladují prozánětlivý charakter expozice CNM, nárůst hladiny volných kyslíkových radikálů (ROS), snížení viability buněk a indukci apoptózy . Některé druhy CNM sice nevykazují přímou toxicitu, nicméně mohou významně zasahovat do fyziologických pochodů v buňkách a narušit jejich funkce . 100 Wang et al . prezentovali studie, ve kterých vystavili buněčnou kulturu PC12 (buňky feochromocytomu) expozici nefunkcionalizovaným jednovrstvým uhlíkovým nanotrubicím (SWCNT) . SWCNT zvyšovaly (v závislosti na dávce a době inkubace; 0–400 μg/ml / 24–48 h) míru oxidačního stresu (produkce volných kyslíkových radikálů; ROS), což se projevilo výrazným poklesem hodnot glutathionu a aktivity glutathionperoxidázy a superoxiddismuzázy, poškozením buněčné membrány, redukcí membránového potenciálu mitochondrií a snížením buněčné viability .8,9 K podobným výsledků došli i Vaniyamparambath Vijayalaksmi, Bindu Sadanandan a Anjanapura Raghu, kteří exponovali buněčnou kulturu LN18 (lidské neurony) nefunkcionalizovaným a karboxylovaným SWCNT (5, 10, 20, 40 μg/ml / 0–48 h) . Oba typy SWCNT při expoziční koncentraci 40 μg/ml významně zvyšovaly produkci ROS (po dobu 6 hodin) a hladinu malondialdehydu (po dobu 24 a 47 hodin) .10 Neurotoxicitu prokázali rovněž autoři Visalli et al ., kteří srovnávali účinky nefunkcionalizovaných a karboxylovaných mnohovrstvých nanotrubic (MWCNT) na buněčnou kulturu SH-SY5 (lidské linie neuroblastomu) . Buňky byly exponovány koncentracím 12,5 a 25 μg/ml po dobu až 24 hodin . V závislosti na koncentraci a čase bylo zjištěno poškození DNA, snížení buněčné viability, zvýšení produkce ROS a zvýšení exprese prozánětlivých cytokinů TNFα, IL-1β a IL-6 . Vyšší míru toxicity vykazovaly nefunkcionalizované MWCNT, funkcionalizace může negativní vliv MWCNT zmírnit .11 Bussy et al . porovnali neurotoxicitu čtyř forem MWCNT (bez funkcionalizace a funkcionalizované ox-MWNT, ox-MWNTNH3+ a MWNT-NH3+; koncentrace 5–50 μg/ml) . Exponovány byly primární neurální a gliové buňky izolované z fetálního krysího frontálního kortexu a ze striata . Žádná z testovaných forem MWCNT nevykazovala účinky na neurony obou částí CNS a na gliové buňky z frontální oblasti . V případě gliových buněk ze striata byla zjištěna snížená buněčná viabilita (snížení závislé na dávce) . V komplexní gliové kultuře (v níž byly zastoupeny také mikroglie a astrocyty) došlo vlivem expozice k aktivaci mikroglií (zvýšení exprese CD11b/c), které efektivněji pohlcovaly všechny formy MWCNT a produkovaly vyšší množství oxidu dusnatého než astrocyty . Nejvyšší produkce oxidu dusnatého byla zjištěna po expozici ox-MWNTNH3+ .12 Při zmínce o mikrogliích by neměla být opomenuta studie autorů Li et al ., ve které expozice jednovrstvým nanorohům (CNH) inhibovala proliferaci a indukovala apoptózu u kultury myších mikroglií .13 Také autoři Villegas et al . popsali interferenci MWCNT s funkcemi mikroglií . Interference měla za následek omezení jejich fagocytární aktivity a migrace .14 Inhibiční vliv MWCNT na funkce mikroglií může mít ve výsledku pozitivní charakter, protože mikroglie patří k buňkám, které jsou zodpovědné za záněty a poškození CNS . Proběhlo též mnoho experimentů s dalšími CNM . Studie autorů Larner et al . byla zaměřena na testování potenciálního neurotoxického vlivu několika druhů CNM na buněčnou kulturu PC-12 . Buněčná linie PC-12 je odvozená z feochromocytomu dřeně nadledvin potkanů: po ošetření nervovým růstovým faktorem se buňky PC-12 přestanou množit a podstoupí konečnou diferenciaci a tím je vytvořen vhodný modelový systém pro studium diferenciace nervových buněk . Ve studii byly testovány SWCNT (10–100 μg/ml), fulleren (C60; 100 μg/ml) a nanosaze (nano carbon black; nano-CB; 10–100 μg/ml) . Vyšší koncentrace CNM zvyšovaly tvorbu štěpných produktů α-II-spektrinu (ukazatele narušení buněčného cytoskeletu a buněčné smrti) a indukovaly kontrakce buněčné membrány a tvorbu vakuol v cytosolu . Diferencované buňky byly v porovnání s nediferencovanými obecně vnímavější k cytotoxickému (neurotoxickému) účinku testovaných CNM .15 Pokud se jedná o nano-CB, nabízí se zmínit ještě práci Jianga et al ., v níž expozice buněčné linie PC-12 nano-CB (dávky 0,6 až 6 μg/cm2 / 24 hodin) 101 vedla ke zvýšení produkce ROS, k nárůstu endoplazmaticko-retikulárního stresu a ke snížení aktivit antioxidačních enzymů superoxiddismutázy a glutationperoxidázy .16 Velmi často zkoumaným materiálem z pohledu toxicity je grafen a od něj odvozené materiály, čemuž se věnovaly následující příspěvky . Ku příkladu autoři Bramini et al . inkubovali primární astrocyty s vícevrstvým grafenem (FLG) a oxidem grafenu (GO) o koncentracích 1 a 10 μg/ml (24–72 hodin nebo 7 dní) . Expozice uvedeným CNM nesnižovala buněčnou viabilitu či proliferaci, měla však za následek narušení metabolismu cholesterolu . To se projevilo nárůstem jeho množství v membráně . Také byly pozorovány změny koncentrací intracelulárního vápníku, vedoucí k narušování vzniku spontánních či evokovaných signálů . V reálné situaci může tento jev ovlivňovat fyziologické interakce mezi astrocyty a neurony .17 Astrocyty a GO použili ve své studii také autoři Rudnytska et al . Byly hodnoceny změny v genové expresi astrocytů (mRNA NAMPT, TSPAN13, BCAR3, BRCA1, PTGS2, P4HA1, P4HA2, miRNA96-5p a miRNA145-5p) po vystavení koncentracím 1 a 4 ng GO/ml po dobu 24 hodin . Autoři uvádějí, že expozice způsobovala deregulaci exprese vybraných genů; suprimovala expresi NAMPT, BCAR3 a TSPAN13, a naopak indukovala expresi BRCA1, PTGS2, P4HA1 a P4HA2 . Bylo rovněž pozorováno snížení exprese vybraných miRNA . Z výsledků je zřejmé, že GO zasahuje do exprese astrocytárních genů a může tak ovlivňovat funkce astrocytů .18 Chiacchiaretta et al . inkubovali primární myší astrocyty s grafenem a s GO (10 µg/ml / 24 nebo 72 hodin, po dobu 7 dní) . Expozice oběma uvedeným CNM vedla k buněčné internalizaci nanočástic s následnými morfologickými změnami a přestavbami cytoskeletu . Významnější změny indukoval GO, který hyperpolarizoval klidový membránový potenciál a zvyšoval vodivost, expresi Kir4 .1 (glial ATP-dependent inwardly rectifying potassium channel) a „uptake“ glutamátu, což mělo významný vliv na fyziologické funkce astrocytů a na jejich interakce s ostatními nervovými buňkami .19 Zajímavé jsou výsledky in vitro studií s využitím organoidů . Organoid je miniaturizovaná a zjednodušená verze orgánu (forma in vitro), která vykazuje realistickou mikroanatomii . Bývá odvozen z tkáňových buněk, embryonálních kmenových buněk nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk . Autoři Liu et al . exponovali trojrozměrný organoid mozku GO (50 μg/ml) . Expozice působila cytotoxicky, ale nezvyšovala produkci toxického superoxidového iontu . Pomocí RNA sekvenování bylo zjištěno, že expozice GO zvýšila expresi 80 genů a snížila expresi 121 genů . Vzhledem ke skutečnosti, že se ve většině případů jednalo o geny související s fyziologií metabolických cest (včetně lipidového metabolismu), vedl uvedený scénář rovněž k narušení lipidomu .20 Výše uvedené studie ve většině případů potvrzují cytotoxický účinek CNM . Ten sice může nervovou soustavu poškozovat, na druhou stranu by mohl být využit při léčbě nádorových a neurodegenerativních onemocnění CNS . V kapitole „Biomedicínské využití uhlíkových nanomateriálů“ byly uvedeny příklady transportu léčiv (pomocí CNM) do specifických tělních kompartmentů . Tímto postupem lze zvyšovat efektivitu podané dávky a omezovat nežádoucí systémové účinky . Z pohledu nádorových onemocnění CNS se jako vhodný kandidát na nosiče léčiv jeví MWCNT, které po funkcionalizaci snadno penetrují přes HEB . Navzdory mnoha pokrokům v diagnostice mozkových nádorů zatím neexistuje účinná léčba glioblastomu . Zdá se, že použití MWCNT by při řešení tohoto problému mohlo významně pomoci . Například autoři Romano-Feinholz et al . exponovali potkaní astrocyty a buňky gliomu RG2 temozolimidu v kombinaci s nefunkcionalizovaným (nedopovaným) MWCNT a dusíkem dopovanými MWCN o koncentracích 10–100 μg/ml . U nádorových buněk působily všechny MWCNT jako velmi silné adjuvans a podpořily účinnost temozolimidu . 102 Z výsledků vyplývá, že míra buněčné smrti byla při expozici kombinaci dusíkem dopovaných MWCN a temozolimidu dvojnásobně vyšší než při expozici nedopovanými MWCNT a temozolimidem .21 V jiných dvou studiích bylo zjištěno, že expozice grafenu (20–200 μg/ml a 5–100 μg/ml) zvyšuje produkci ROS, snižuje viabilitu a indukuje apoptózu u U87 a U118 glioblastomových buněk .22,23 Martínez-Herrera et al . studovali účinnost fullerenu při inhibici agregace amyloidu β, který vytváří plaky spojované s iniciací a progresí Alzheimerovy nemoci . Modifikované fullereny (multiaddukty s 4 až 6 dietylmalonyly) modulovaly produkci amyloidových fibril a agregátů (bez projevů cytotoxicity vůči nervovým buňkám) a snižovaly hladinu oxidačního stresu . Výsledky naznačují, že modifikovaný fulleren by mohl najít využití v léčbě Alzheimerovy nemoci .24 Vedle využití CNM v oblasti léčby nádorových a neurodegenerativních onemocnění CNS je nutno zmínit také možnost jejich využití v oblasti regenerace nervové tkáně . Studie v odborné literatuře dokladují, že použití scaffoldů z grafenu, GO či MWCNT podporuje diferenciaci kmenových buněk do nervových buněk, posiluje jejich proliferaci, růst axonů, formování synapsí a přenos signálů .25,26 8.2 IN VIVO STUDIE Výsledky in vivo studií (zaměřených na účinky CNM) jsou ve většině případů ve shodě s výsledky studií in vitro . Byla potvrzena vývojová neurotoxicita (více v kapitole „Reprodukční a vývojová toxicita“), narušování HEB (zvýšení její permeability), nárůst hladiny ROS a indukce a zesílení zánětové reakce . Autorské kolektivy Maria Aragon a Ekateriny Mostovenko například popsaly zvýšenou permeabilitu HEB u experimentálních zvířat exponovaných MWCNT . V obou těchto studiích byly myši vystaveny expozici MWCNT (orofaryngeální aspirace, 10 nebo 40 µg/zvíře) . V první zmíněné studii byla po čtyřech hodinách od aplikace MWCNT pozorována zánětlivá reakce, která se podílela na zvyšování permeability HEB a indukci reaktivní astrocytózy . V séru byly zjištěny zvýšené hodnoty trombospodinu 1 . Vyšší dávky MWCNT vedly ke tvorbě „astrogliálních jizev“ v CNS a aktivaci mikroglií . Autoři druhé studie zkoumali navíc i peptidom mozkomíšního moku a séra . Vlivem expozice MWCNT se významně měnily koncentrace peptidů zapojených do fibrinolýzy (fibrinopeptid A) a souvisejících s poškozením HEB (homeobox protein A4) a se zánětem v CNS (transmembránový protein 131L) . Ve všech případech se jednalo o ukazatele aktivace astrocytů a mikroglií a ukazatele neurodegenerativních procesů a nerovnováhy mezi excitací a inhibicí (došlo ke vzniku „hyperexcitovaného fenotypu“) . Uvedené změny jsou charakteristické pro raná stadia neurodegenerativních onemocnění . 27,28 Autorské kolektivy Aragona i Mostovenko například popsali zvýšenou permeabilitu HEB u experimentálních zvířat exponovaných MWCNT . V obou jejich studiích byly myši vystaveny expozici MWCNT (orofaryngeální aspirace, 10 nebo 40 µg/zvíře) . Ve studii Aragonova týmu byla po čtyřech hodinách od aplikace MWCNT pozorována zánětlivá reakce, která se podílela na zvyšování permeability HEB a indukci reaktivní astrocytózy . V séru byly zjištěny zvýšené hodnoty trombospodinu 1 . Vyšší dávky MWCNT vedly ke tvorbě „astrogliálních jizev“ v CNS a rekrutování mikroglií . Tvůrci druhé studie zkoumali navíc i peptidom mozkomíšního moku a séra . Vlivem expozice MWCNT se významně měnily koncentrace peptidů zapojených do fibrinolýzy (fibrinopeptid A) a souvisejících s poškozením HEB (homeobox 103 protein A4) a se zánětem v CNS (transmembránový protein 131L) . Ve všech případech se jednalo o ukazatele aktivace astrocytů a mikroglií a ukazatele degenerativních procesů a nerovnováhy mezi excitací a inhibicí (došlo ke vzniku „hyperexcitovaného fenotypu“) . Uvedené změny jsou charakteristické pro raná stadia neurodegenerativních onemocnění . 27,28 Kromě myší se prováděly také studie na potkanech . Autoři Gao et al . aplikovali potkanům po dobu 14 dnů intraperitoneálně MWCNT v dávce 2,5 mg/kg/den a MWCNT s chlorochinem v dávce 20 mg/kg/den . Vlivem obou expozic došlo u potkanů ke kognitivnímu deficitu a histopatologickým změnám v CNS . Zvýšení autofagické aktivity mikroglií po expozici MWCNT vedlo ke snížení synapsí, a tedy i funkčním změnám v CNS . Tento jev nebyl pozorován po expozici MWCNT s chlorochinem, který autofagie blokoval .29 Jelikož se CNM mohou kumulovat také ve vodním prostředí, provádí se studie také s vodními organismy . Autoři Deepa et al . zvolili jako modelový objekt kapra obecného . Ryby byly exponovány koncentracím SWCNT 10 a 50 μg/l po dobu 7 dní . Expozice měla za následek indukci antioxidačních enzymů (glutathion-S-transferázy, superoxiddismutázy a katalázy) a narušení mozkových funkcí .24 V průběhu prenatálního vývoje jsou tělní buňky extrémně citlivé na externí a interní faktory (včetně CNM), které touto cestou mohou narušovat vývoj tkání i celého organismu . Některé studie potvrzují, že CNM mohou v prenatálním období ohrožovat i nervovou tkáň . K testování prenatálního rizika expozice CNM bývají často používány zárodky ryby dánia pruhovaného . Například Manjunatha et al . exponovali zárodky a mladé jedince dánia pruhovaného grafenu (5–25 μg/l) a GO (0,1– 0,4 mg/ml) . Vlivem expozice došlo ke kumulaci obou CNM v mozkové tkáni . Byly popsány změny délky axonů, změny v myelinizaci a celkové narušení axonální integrity .30 V experimentu autorů Caa et al . byly zárodky dania pruhovaného vystaveny účinkům karboxylovaného GO (10, 50, 100 mg/l) . Expozice měla za následek neurologické vývojové defekty spojené se zvýšenou aktivitou acetylcholinesterázy a ATPázy . Došlo k významnému zvýšení hladiny oxidačního stresu a ke změnám exprese genů, které mají důležitou roli v neuro-vývoji (NEUROG1 a GAP43) a ovlivňují produkci neurotransmiterů . Rovněž byly narušeny neurotransmiterové cesty využívající GABA, dopamin a glutamát (došlo ke snížení exprese GLUD1 a GABRA1 a ke zvýšení exprese GAT1 a ABAT) . Zajímavou skutečností je, že došlo ke změnám expresí genů, které jsou spojovány s Parkinsonovou nemocí (snížení exprese TH, DCTN1 a DJ1 a zvýšení exprese PINK1) . Uvedené změny vedly k výraznému narušení mobility zárodků .31 Xiangang Hu, Zhong Wei a Li Mu testovali neurotoxické účinky GO u dospělých jedinců danií pruhovaných a jejich potomků, které exponovali koncentracím 0,01–1 μg GO / l vody . Částice GO translokovaly z vody do CNS všech jedinců, což vedlo k významnému poklesu hladiny proteinu Cldn5a, který je klíčovou součástí neuroepitelového bariérového systému . Zatímco u dospělých jedinců nebyly zjištěny známky neurotoxicity, u jejich potomků došlo ke snížení počtu neurodopaminergních neuronů a redukci acetylcholinesterázové aktivity . Byla též zaznamenána zvýšená hladina endoplazmaticko-retikulárního stresu, zvýšená autofagie a zvýšené hladiny ukazatelů souvisejících se stárnutím (například nárůst β-galaktosidázové aktivity) .32 Na rozdíl od výše uvedených Hua, Weie a Mua, kteří známky neurotoxicity u dospělých jedinců dania pruhovaného nenalezli, autorský kolektiv Audira et al . tyto účinky popsal . Po subchronické expozici (14 dnů) grafenu (0,1 a 0,5 ppm) a GO (0,1 a 1 ppm) došlo v CNS k nárůstu produkce ROS, k narušení lokomoční aktivity a k narušení schopnosti vyhýbat se predátorům . Expozice grafenu navíc snižovala koncentrace serotoninu, acetylcholinu, dopaminu a kortizolu .33 104 Prenatální neurotoxicita CNM byla testována také na savcích . Atsuto Onoda, Ken Takeda a Masakazu Umezawa aplikovali gravidním myším intranazálně (na nosní sliznici) CB v dávkách 2,9, 15 a 73 μg/kg a sledovali vliv této expozice na vývoj kortexu mláďat . Z výsledků vyplývá, že v kortexu a v oblastech okolo cév v CNS došlo k nárůstu exprese GFAP (glial fibril lary acidic protein) a akvaporinu 4 . Změna v expresi korespondovala s analogickou expresí u starších zvířat . Souběžně byly pozorovány změny expresí mRNA spojených s angiogenezí, buněčnou migrací, proliferací, chemotaxí a produkcí růstových faktorů . Je zřejmé, že vystavení matky CB zvyšuje riziko nástupu neurodegenerativních onemocnění u potomků .34 V novější studii stejných autorů byla popsána rovněž vývojová neurotoxicita CB a mechanismus, který je pravděpodobně zodpovědný za poškození . Vystavení mateřského organismu CB vedlo ke zvýšení endoplazmaticko-retikulárního stresu a kumulaci defektních a poškozených proteinů u potomků . Nejvyšší míra stresu byla zachycena v perivaskulárních makrofázích a astrocytech .35 Funkcionalizace CNM může výrazně měnit vlastnosti těchto materiálů, a to včetně jejich toxicity vůči tkáním, včetně nervového systému . Toxicita může mít omezena, či naopak potencována . Autoři Altwaijri et al . exponovali myši účinkům GO funkcionalizovaného polyethylenglykolem (GO-PEG) . Látka byla aplikována intravenózně do ocasní žíly v dávce 5 mg/kg . Po jedné a dvou hodinách od aplikace byla zjištěna fragmentace DNA (jednoi dvouřetězcové zlomy), nicméně, po 4 hodinách byla DNA již reparována . Histopatologické vyšetření exponovaných zvířat (po 1 a 2 hodinách od aplikace) odhalilo apoptózy a léze v CNS . Po 4 hodinách byl také patrný zánět a chromatolýza . Z výsledků je zřejmé, že GO-PEG mohou vyvolávat poškození CNS podobně, jako to vidíme u nefunkcionalizovaných GO .36 Závěrem ještě zmíníme neurotoxicitu fullerenů a (C60) a nanodiamantů (ND) . Neurotoxicitu C60 studovali například Kreamer et al . V experimentu použili C60 o dvou různých průměrech (≤ 200 a ≤ 450 nm), který injikovali potkanům přímo do hipokampu . Expozice oběma fullerenům vedla k narušení prostorové paměti, snížení BDNF (brain-derived neurotrophic factor) a k nárůstu oxidačního stresu . Vyšší míra toxických účinků byla pozorována u C60 o průměru ≤ 450 nm .37 Autoři Khosravi et al . exponovali myši inhalačně ND (3 µg/m3, 3 hodiny denně, 5 dní v týdnu po dobu 30 dní) . Podané ND se kumulovaly v plicích, srdci a mozku . Ve všech uvedených tkáních byla zjištěna zvýšená míra oxidačního stresu, narušení mitochondriálních membrán a snížená hladina glutathionu .38 Závěrem nutno zmínit i některé pozitivní účinky CNM na CNS . Například autoři Soligo et al . popsali experiment, ve kterém MWCNT, intranazálně podané potkanům, pronikaly do různých oblastí mozku (bulbus olfactorius, striatum, oblast septa, talamus, hypotalamus a hipokampus) a zvyšovaly produkci neurálního růstového faktoru, což posilovalo regenerační procesy v CNS .39 8.3 ZÁVĚR Centrální nervová soustava je pro nás lidi naprosto kruciální . Její poškození spojené s poruchou mozkových funkcí nám výrazně snižuje kvalitu života . Je proto důležité sledovat neurotoxicitu CNM . Výsledky studií, které proběhly in vitro i in vivo, naznačují, že některé typy CNM mají potenciál poškozovat CNS . Jako u ostatních orgánových systému je poškození CNS spojené hlavně s indukcí chronického poškozujícího zánětu a oxidačním stresem . Ve studiích in vivo bylo skutečně zachyceno snížení mozkových funkcí u zvířat vystavených 105 CNM . Musíme ovšem zmínit i fakt, že výsledky nejsou zcela jednoznačné a existují i studie, které prokazují opak . Některé CNM mohou dokonce působit protizánětlivě, snižovat oxidační stres a podporovat regeneraci CNS . Je tedy potřeba provést další studie, které by naše znalosti dále rozšířily . 8.4 LITERATURA 1 . Kafa H, Wang JTW, Rubio N et al . Translocation of LRP1 Targeted Carbon Nanotubes of Different Diameters Across the Blood–Brain Barrier In Vitro and In Vivo . J Control Release. 2016;225:217 . doi:10 .1016/J .JCONREL .2016 .01 .031 . 2 . Wang JTW, Rubio N, Kafa H et al . Kinetics of Functionalised Carbon Nanotube Distribution in Mouse Brain After Systemic Injection: Spatial to Ultra-Structural Analyses . J Control Release. 2016;224:22 . doi:10 .1016/J .JCONREL .2015 .12 .039 . 3 . Gonzalez-Carter D, Goode AE, Kiryushko D et al . Quantification of Blood-Brain Barrier Transport and Neuronal Toxicity of Unlabelled Multiwalled Carbon Nanotubes as a Function of Surface Charge . Nanoscale. 2019;11(45):22054–22069 . doi:10 .1039/c9nr02866h . 4 . Newman L, Rodrigues AF, Jasim DA et al . Nose-to-Brain Translocation and Cerebral Biodegradation of Thin Graphene Oxide Nanosheets . Cell Rep Phys Sci. 2020;1(9):100176 . doi:10 .1016/ j .xcrp .2020 .100176 . 5 . Crowe TP, Greenlee MHW, Kanthasamy AG, Hsu WH . Mechanism of Intranasal Drug Delivery Directly to the Brain . Life Sci. 2018;195:44–52 . doi:10 .1016/j .lfs .2017 .12 .025 . 6 . Selvaraj K, Gowthamarajan K, Karri VVSR . Nose to Brain Transport Pathways An Overview: Potential of Nanostructured Lipid Carriers in Nose to Brain Targeting . Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2018;46(8):2088–2095 . doi:10 .1080/21691401 .2017 .1420073 . 7 . Redondo-Gómez C, Leandro-Mora R, Blanch-Bermúdez D et al . Recent Advances in Carbon Nanotubes for Nervous Tissue Regeneration . Adv Polym Technol. 2020;2020:1–16 . doi:10 .1155/2020/6861205 . 8 . Wang J, Sun P, Bao Y, Liu J, An L . Cytotoxicity of Single-Walled Carbon Nanotubes on PC12 Cells . Toxicol Vitr. 2011;25(1):242–250 . doi:10 .1016/j .tiv .2010 .11 .010 . 9 . Wang J, Sun P, Bao Y et al . Vitamin E Renders Protection to PC12 Cells Against Oxidative Damage and Apoptosis Induced by Single-Walled Carbon Nanotubes . Toxicol Vitr. 2012;26(1):32–41 . doi:10 .1016/J .TIV .2011 .10 .004 . 10 . Vijayalakshmi V, Sadanandan B, Venkataramanaiah Raghu A . Single Walled Carbon Nanotubes in High Concentrations is Cytotoxic to the Human Neuronal Cell LN18 . Results Chem. 2022;4:100484 . doi:10 .1016/J .RECHEM .2022 .100484 . 11 . Visalli G, Currò M, Iannazzo D et al . In Vitro Assessment of Neurotoxicity and Neuroinflammation of Homemade MWCNTs . Environ Toxicol Pharmacol. 2017;56:121–128 . doi:10 .1016/ J .ETAP .2017 .09 .005 . 12 . Bussy C, Al-Jamal KT, Boczkowski J et al . Microglia Determine Brain Region-Specific Neurotoxic Responses to Chemically Functionalized Carbon Nanotubes . ACS Nano. 2015;9(8):7815–7830 . doi:10 .1021/ACSNANO .5B02358 . 13 . Li L, Zhang J, Yang Y et al . Single-Wall Carbon Nanohorns Inhibited Activation of Microglia Induced by Lipopolysaccharide Through Blocking of Sirt3 . Nanoscale Res Lett. 2013;8(1):1–13 . doi:10 .1186/1556-276X-8-100 . 14 . Villegas JC, Álvarez-Montes L, Rodríguez-Fernández L, González J, Valiente R, Fanarraga ML . Multiwalled Carbon Nanotubes Hinder Microglia Function Interfering With Cell Migration and Phagocytosis . Adv Healthc Mater. 2014;3(3):424–432 . doi:10 .1002/adhm .201300178 . 112 Jak bylo zmíněno, jedním z důsledků akumulace CNT a ND ve fagocytech je uvolnění katepsinu B, který je zároveň druhým signálem pro kanonickou cestu aktivace NLRP3 . Z toho vyplývá, že jejich (hlavně CNT) prozánětlivý potenciál závisí na jejich intracelulární koncentraci . Keshavan et al . ve své práci porovnávali vliv tří typů MWCNT na THP-1 a primární makrofágy a z HL-60 odvozené neutrofily . Zatímco u makrofágů, které čile fagocytovaly, došlo v případě dlouhých MWCNT k pyroptóze, neutrofily, které MWCNT nepohlcovaly, si zachovaly svoji životnost .52 Podobně tomu bylo u buněčné epiteliální linie A549 při srovnání s THP-1 a myšími NR8383 makrofágy, kdy přednostní fagocytóza trubic makrofágy u nich vedla k uvolnění chemokinů IL-8 a CXCL1 .53 Kromě aktivace inflamazomu může poškození lysozomů CNM vést také k narušení procesu autofagie .54 Autofagie je komplexní mechanismus, který obvykle zajišťuje buněčné přežití odstraňováním nesprávně složených nebo agregovaných proteinů a poškozených organel nebo eliminací intracelulárních patogenů . V případě nutriční deprivace může autofagie buňce zajistit energii a živiny metabolizací části cytoplazmy . Navíc působí modulačně a je jedním z inhibitorů inflamazomu .55 Důležitou etapou autofagického procesu je obklopení vetřelce dvojitou membránou a vytvoření autofagozomu . Následuje splynutí autofagozomu s lysozomem, které vede k usmrcení a rozkladu patogenu . Posledním krokem je prezentace antigenních peptidů získaných z vetřelce imunitním buňkám v kontextu s HLA molekulami . Případné narušení některého z těchto kroků např . destabilizací lysozomu CNT může vést k selhání tzv . autofagickéhu toku a k smrti buňky .56,57 V kontrastu s CNT, nemodifikovaný „čistý“ grafen ve formě GP, které zřejmě zůstávají uzavřené v intracelulárních váčcích, sám o sobě prozánětlivě ani cytotoxicky nepůsobí .43,58,59 To dokládá i in vivo studie zkoumající inhalační expozici a následnou distribuci GP v potkaním modelu . Autoři zde potvrdili, že inhalovaný grafen byl pohlcen alveolárními makrofágy bez dalšího efektu na plicní tkáň .5 Na druhou stranu, u modifikovaného grafenu, nejčastěji GO, bývá hodnocení prozánětlivého účinku ve svých výsledcích výrazně méně konzistentní . Starší studie uváděly možnou aktivaci TLR4 a TLR9 s následnou kumulací autofagozomů spojenou s poškozením cytoskeletu, tvorbou prozánětlivých cytokinů a buněčnou smrtí .60,61 Bohužel zde nebyl diskutován možný vliv kontaminace . Jiná studie hodnotící GO zbavený LPS cytotoxické účinky nepotvrdila . U předstimulovaných makrofágů (priming) však došlo k aktivaci NLRP3 . Autoři diskutovali možný mechanický stres .62 Jako další z mechanismů prozánětlivého působení GO byl navržen možný vliv na lipidovou dvojvrstvu, kdy dochází k jejímu narušení v důsledku „vytrhávání“ lipidových raftů přímým kontaktem s povrchem GO . Tento efekt je obzvláště důležitý při kontaktu s neutrofily, kdy se vlivem narušení jejich membrány vytváří tzv . extracelulární neutrofilové pasti (NET) a neutrofily hynou NETotickou smrtí .63,64 Bohužel, přestože je GO jedním z nejvíce studovaných CNM, jednoznačné výsledky stále chybí . Podobně jako u ostatních CNM je zkoumaný zánětlivý účinek závislý na součtu mnoha faktorů a často pomíjené hodnocení biologické kontaminace může výsledná data značně ovlivnit . 9.3 IMUNOMODULACE Jako vysoce integrovaný a dynamický nástroj musí imunitní systém reagovat na mnoho stimulů zároveň . Během toho zajišťuje správné rozeznávání, zpracování a eliminaci jak 113 vlastních poškozených či nádorových buněk, tak vnějších patogenů . Současně musí své působení regulovat a zahájit reparaci poškozených tkání . Nanočástice, které postrádají atributy infekčního agens, a tudíž přímo nevyvolávají akutní cytotoxické ani prozánětlivé reakce, mohou tyto funkce ovlivnit . Platí to zejména pro CNM, které setrvávají v organismu dlouhou dobu a nemetabolizují se . Dobrým příkladem jsou výše zmíněné nemodifikované GP, u kterých nebyl pomocí monocyto-makrofágových modelů prokázán žádný, nebo jen minimální prozánětlivý vliv . Naopak se zdá, že endocytóza GP vede u lidských izolovaných monocytů k jejich lepšímu přežívání a diferenciaci . Pozorován byl též vliv na zesílení cytokinové odpovědi na stimulaci vybranými mikroorganismy .65 K podobným výsledkům došli Lebre et al . u myších makrofágů derivovaných z kostní dřeně . Zjistili, že přítomnost grafenu zesiluje tvorbu IL-6 a TNF-α po stimulaci TLR agonisty a že grafen patrně podporuje jev, kterému se říká „trénink vrozené imunity“ nebo také „přirozená imunitní paměť“ .66 Analogicky s adaptivní imunitou zajišťuje tento jev výraznější sekundární odpověď vrozené imunity na opakovaný stimul patogenem . Předpokládaným mechanismem jsou metabolické a epigenetické změny vyvolané opakovanými kontakty s cizorodými částicemi a patogenními stimuly .67 Jak bylo řečeno, základním mechanismem reakce na poškozující nebo nebezpečný podnět je zánět . Klíčová je jeho regulace a vyváženost, tzn . maximální úroveň obranného zánětu s minimalizací jeho poškozující složky . Regulaci zánětu zajišťují humorální i buněčné mechanismy imunity . Jedním z nich je polarizace monocyto-makrofágového systému do jednotlivých subpopulací . Základní subpopulace se označují M1 a M2, přičemž M1 subpopulace je prozánětlivá a zesiluje imunitní odpověď, kdežto M2 subpopulace je regulační, účastní se tlumení imunitní odpovědi a napomáhá regeneraci a hojení tkání poškozených zánětem . Polarizace monocyto-makrofágového systému do M1 a M2 je velice efektivní a důležitá součást imunitní odpovědi a je spojena s metabolickými a genetickými změnami buněk . Bylo prokázáno, že CNM mohou do tohoto procesu vstupovat . Kupříkladu v jedné studii byl sledován vliv fragmentovaných GP na mitochondriální kapacitu lidských a myších makrofágů v závislosti na polarizačním stavu buněk . Autoři studie vyhodnotili převládající polarizaci směrem k M2, tedy protizánětlivý efekt GP .68 Schopnost ovlivnit polarizaci makrofágů do M1 nebo M2 byla studována u celé řady dalších CNM . Kinaret et al . zjistili, že zatímco grafitová nanovlákna preferenčně polarizovala THP-1 makrofágy do M1, dlouhé CNT vyvolaly polarizaci M1 i M2 a krátké MWCNT polarizovaly makrofágy do M2 . Všechny tři typy testovaných CNT vyvolaly produkci IL-1β, ale v případě MWCNT bez změny dalších polarizačních znaků .69 Zhang et al . zkoumali efekt SWCNT a MWCNT na myší alveolární makrofágy . Nanotrubice většinou v prvním kroku měnily fenotyp makrofágů do M1, ale při delší expozici došlo k přesmyku na fenotyp M2 . Navíc kondiciované médium od M2 makrofágů sekretujících TGF-β (transforming growth factor) vyvolávalo in vitro diferenciaci fibroblastů .70 Zdá se, že necytotoxické hladiny CNT obecně podněcují makrofágy k určité autoregulaci . Tato zjištění by mohla vysvětlovat negativní roli inhalovaných CNT v rozvoji plicní fibrózy . Přesný mechanismus, jakým CNM působí metabolické a epigenetické změny předcházející tvorbě přirozené imunitní paměti a změnám polarizace u monocyto-makrofágového systému, není zatím jasný . Svoji roli v něm může hrát autofagie, která je často s CNM spojována, a u cirkulujících monocytů je esenciální pro jejich přežívání a následnou diferenciaci .71 Za fyziologických podmínek autofagie brzdí sestavení inflamazomu a produkci prozánětlivých cytokinů . Avšak data některých studií, která dokládají zvýšenou produkci prozánět livých 114 cytokinů, tento mechanismus spíše vyvrací .65,72 Vedle toho situaci komplikují i změny cytoskeletu, které probíhají při endocytóze a následném pokusu o zpracování a eliminaci CNM buňkou . Nelze vyloučit, že sama endocytóza spolu s reorganizací cytoskeletu může poskytnout dostatečný signál pro přežití a diferenciaci buňky .73,74 Připomeňme též důležitý fakt, že přímé ovlivnění cytoskeletu, např . reakcí s aktinovými vlákny, bývá pro CNM pozorováno řadou autorů .38,75,76 Efekt na cytoskelet by mohl být i nepřímý především při nadměrné akumulaci CNM v cytoplazmě, kdy jsou jednotlivé organely a cytoskeletální vlákna jednoduše „utlačeny“ . V rámci hodnocení imunomodulačního potenciálu CNM je nutné zmínit dendritické buňky . Ty představují nepostradatelnou buněčnou populaci, jejíž základní funkcí je prezentace antigenních peptidů spolu s kostimulačními a prozánětlivými signály T lymfocytům . Dendritické buňky tvoří hlavní spojení mezi přirozenou a adaptivní imunitou a rozhodují o tom, do jakého subsetu se bude naivní T lymfocyt po kontaktu diferencovat: zda bude imunitní odpověď založená na produkci protilátek (Th2 subset), nebo zda budou zapojeny buněčné mechanismy jako cytotoxicita a zesílená fagocytóza (Th1 subset) . Narušení jejich funkce tedy představuje významné riziko pro fungování celého imunitního systému .77 Vliv různých variant GO na buněčnou linii dendritických buněk DC2 .4 zkoumali Yang et al . Zjistili, že jednovrstvý GO vyvolával agregaci buněk bez výrazného cytotoxického účinku . Vícevrstvý GO byl naproti tomu cytotoxický a vyvolával produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) . V obou případech došlo k produkci TNF-α bez produkce IL-6 . V následujícím experimentu však jednovrstevný GO stimuloval zvýšení produkce TNF-α i IL-6 vůči LPS, na rozdíl od vícevrstvého GO, kde pravděpodobně vlivem cytotoxicity došlo k inhibici .78 Zhou et al . pro změnu zkoumali vliv laterální velikosti GO na jeho schopnost interagovat s buněčnou membránou . Zjistili, že se malé částice GO snadněji internalizovaly, zatímco větší adherovaly k membráně a způsobily změny exprese adhezních molekul, zejména ICAM-1, která je nezbytná pro interakci dendritických buněk s T lymfocyty . Následnou kokultivací s T lymfocyty potvrdili tvorbu buněčných shluků indikující zesílení T lymfocytární aktivity .79 V obdobné studii velké částice GO zvyšovaly u dendritických buněk diferencovaných z monocytů expresi kostimulačních molekul CD80 a CD83 a napomohly tak k jejich maturaci .80 Navázání PEGu a výběr menších GO tento efekt inhiboval, což znovu potvrzuje esenciální role modifikace a velikosti .81 Pozitivní výsledky nepřímé prozánětlivé modulace pomocí CNM byly pozorovány rovněž in vivo s využitím zvířecích modelů nemocí . Řada z nich se zaměřila na hodnocení alergické reakce (konkrétně hypersenzitivitu typu 1) . Park et al . ve své práci exponovali myši různým dávkám MWCNT . Následná analýza vzorků krve a bronchoalveolární laváže odhalila spolu se zvýšeným počtem neutrofilů i vyšší hladinu prozánětlivých cytokinů . K nejvýraznějšímu nárůstu došlo u IL-4, IL-10 a IL-5, což svědčí o aktivitě proalergického Th2 subsetu pomocných induktorových T lymfocytů .82 Obdobných výsledků dosáhli Inoue et al ., kdy po souběžné intratracheální expozici ovalbuminu a MWCNT došlo oproti samostatným expozicím (placebo, ovalbumin, nebo MWCNT) k silnější aktivaci alergického zánětu s tvorbou protilátek IgE .83 Podobný pokus prezentovali Nygaard et al . Myši vystavoval působení ovalbuminu a dvou typů CNT (MWCNT a SWCNT) . V obou případech sloužily CNT jako adjuvans zvyšující produkci ovalbumin specifického IgE .84 Opačné výsledky přinesly experimenty s GO, který produkci IgE inhiboval, nicméně na myším modelu astmatu byla pozorována zvýšena hyperreaktivita a remodelace (hyperplazie gobletových buněk spolu s hypertrofií hladkého svalstva) .85 Výsledky těchto studií naznačují, 115 že CNT obecně mohou stimulovat alergický zánět v podobě Th2 imunitní odpovědi . Slouží však spíše jako adjuvans než přímý alergen . To je obzvláště důležité za situace, kdy alergeny adherují k jejich povrchu . Výsledná alergická reakce tím tedy může být značně ovlivněna . Jak bylo zmíněno, CNM mohou také přispívat k nevratné remodelaci tkání dýchacích cest a zhoršovat tak průběh chronických plicních onemocnění . K tomuto tvrzení přispívá studie provedená Beyelerem et al ., jejichž DWCNT v dávce 0,08 µg/cm2 podané intratracheálně zesílily akumulaci a aktivaci makrofágů a dendritických buněk v plicním parenchymu myšího modelu chronické obstrukční choroby plic .86 Soliman et al . pak navíc prokázali, že chronická expozice MWCNT je spojená se zvýšenou aktivací a akumulací alveolárních makrofágů, což vede k zánětu a tvorbě granulomů .87 CNM ovšem nemusí být pouze prozánětlivé . Modelovým příkladem může být práce Dellingera et al ., jež zkoumala vliv fullerenů na revmatoidní artritidu v myším modelu . Peritoneální administrace fullerenů vedla k jejich hromadění v afektovaných kloubech, kde vyvolávaly útlum zánětu spojený se snížením eroze, redukcí zánětlivé chrupavčité tkáně a poklesem hladiny TNF-α .88 Zajímavých výsledků dosáhli Babu Mija a Rajiv Saxena při výzkumu vlivu modifikovaných SWCNT na myší model akutní i chronické reakce štěpu proti hostiteli .89 Tato nežádoucí reaktivita vzniká po HLA neshodné transplantaci kmenových buněk krvetvorby u pacientů s krevními malignitami, případně jinými diagnózami . Nový, transplantovaný imunitní systém napadá a ničí buňky různých tkání příjemce . Nejčastěji jsou postiženy GIT, kůže, dýchací systém a ledviny . Je nutné podávat imunosupresivní léky, mnohdy doživotně . Ve zmíněné studii vedlo intravenózní podání SWCNT ke snížení proliferace T i B lymfocytů a omezení tvorby cytotoxických T lymfocytů a protilátek specifických proti hostitelským antigenům .89 Tlumivý efekt konkrétně grafenových kvantových teček (GQD) objevili i Tosic et al . Zjistili, že GQD utlumily zánět v nervové tkáni potkanů trpících autoimunitní encefalitidou . Výsledkem intraperitoneální expozice bylo zmírnění příznaků, snížení demyelinizace a infiltrace centrálního nervového systému imunitními buňkami, snížení poškození axonů, a ve výsledku ovlivnění vitality nervových buněk .90 Uhlíkové tečky (CD) vykazují obecně imunosupresivní efekt pravděpodobně kvůli jejich antioxidačním vlastnostem . Například CD syntetizované z kyseliny citronové a glutathionu úspěšně inhibovaly zánětlivou odpověď vyvolanou LPS na modelu myších makrofágů J774A .1 utlumením signalizace NF-κB a tvorby IL-12 a vychytáváním kyslíkových radikálů .91 V jiném experimentu CD vyrobené z melasy tlumily produkci oxidu dusnatého stimulovanou LPS na modelu makrofágů RAW 264 .7 .92 Velmi komplikovanou a obtížně uchopitelnou otázkou je interakce nanočástic s mikrobiotou střeva, kůže a sliznic . Jedná se o velmi komplexní ekosystém zahrnující desítky až stovky různých mikrobiálních a mykotických species . Jejich přínos pro člověka je bez diskuze, a kromě nutričních benefitů je mikrobiota esenciální pro nastavení optimální střevní bariéry proti patogenním mikroorganismům . Úloha mikrobioty je však daleko komplexnější . Zásadní je modulační efekt na imunitní systém, zejména v nastavení tolerance vůči různým mikrobiálním i potravním antigenům . Regulační buňky diferencované v mukózním imunitním systému byly nalezeny i ve vzdálených nikách organismu, například v centrálním nervstvu . To dalo vzniknout představě, že střevní mikrobiota může ovlivnit vznik a průběh autoimunitních onemocnění, jako je např . roztroušená skleróza .93,94 CNM mohou střevní mikrobiotu ovlivnit především svým možným selektivním antimikrobiálním účinkem na některé kmeny bakterií a tím mohou narušit osídlovací vzory na sliznicích . Jako příklad můžeme uvést čistý grafen, 116 který v koncentracích okolo 100 µg/ml podporuje butyrát produkující mikroorganismy, jako jsou Clostridium fimetarium, Clostridium hylemona a Sutterella wadsworthensis.95 Dosud prezentované výsledky jasně ukazují, že CNM mohou mít zásadní imunomodulační potenciál . Některé jsou schopny blokovat imunitní reakci a tím působit protizánětlivě, jiné a za jiných podmínek mohou naopak imunitní odpověď podporovat a zánětu napomáhat . Speciální pozornost se musí věnovat především takovým CNM, které na první pohled samy o sobě žádnou, ať už cytotoxickou, nebo prozánětlivou odpověď nevyvolávají, avšak mohou sloužit jako adjuvans či další signál . 9.4 ELIMINACE Pro využití CNM v medicíně je zásadní biodegradabilita – schopnost organismu odstranit z těla nežádoucí materiály . CNM jsou ze své podstaty velmi odolné a špatně degradovatelné . Nicméně je možné je za určitých podmínek eliminovat . Důležitou úlohu v tom má právě imunitní systém . Jedním z faktorů určujících biodegradabilitu CNM je poměr uhlíku a kyslíku (C/O) ve struktuře částice a její hydrofilní charakter . Kotchey et al . ve své studii ověřili, že GO lze narušit křenovou peroxidázou .96 Podobně myeloperoxidáza (MPO), která se nachází v granulech neutrofilů, byla schopna degradovat GO v přítomnosti stop peroxidu vodíku, přičemž efektivita byla úměrná množství karboxylových skupin a míře stability ve vodném prostředí .7 V jiné studii neutrofily produkovaly myeloperoxidázu v přítomnosti SWCNT navzdory jejich pokrytí PEG .97 V in vivo studii provedené na MPO knockoutovaných myších byl oproti divokým kmenům sledován pokles degradace, což je v souladu s předešlými in vitro studiemi .98 In vitro byl také proveden pokus degradovat GO pomocí eozinofilní peroxidázy (EPO) v přítomnosti peroxidu vodíku a bromidu sodného . Přestože byla degradace nekompletní, objevila se již po 90 hodinách od expozice .6 Pozorování potvrzuje i starší studie Ardóna et al ., kteří použili EPO z lidských a myších eosinofilů pro degradaci oxidovaných SWCNT .99 Na degradaci CNM by se mohla podílet také NADPH oxidáza a s ní souvisící enzymatické systémy účastnící se tzv . oxidativního vzplanutí při aktivaci fagocytů . Jejich role byla potvrzena opět Kaganem et al ., již zkoumali degradaci oxidovaných SWCNT peroxinitritem z aktivovaných THP-1 makrofágů . Schopnost štěpit SWCNT byla také výrazně snížena u NADPH deficitních myší .100 Podobné výsledky vyšly ve studii Houa et al ., v níž porovnávali degradaci čistých, oxidovaných a OH-substituovaných SWCNT na modelu RAW264 .7 buněk . Respirační vzplanutí u modelových buněk bylo dle předpokladu účinné při degradaci oxidované a OH varianty, naproti tomu čisté SWCNT, které reaktivní místa postrádají, degradaci odolaly .101 9.5 ZÁVĚR Závěrem lze říct, že jakožto rodina exogenních částic nabízí CNM širokou škálu možných interakcí s imunitním systémem . V závislosti na jejich formě, velikosti, tvaru, funkcionalizaci a čistotě mohou buď přímo vyvolat zánět, nebo působit nepřímo modulací základních funkcí imunitních buněk, kdy tyto změny nemusí nutně korelovat se zvýšenou cytotoxicitou . Prezentované výsledky naznačují, že tvar a velikost jsou rozhodující vlastnosti ovlivňující přímé prozánětlivé účinky CNM a následné chování imunitních buněk . Imunitní systém 117 funguje jako vysoce organizovaná síť a v důsledku toho může narušení jedné části ovlivnit celý systém . Musíme vzít v úvahu, že kumulace CNM v lidském těle, zejména v plicích, může mít negativní vliv na imunitní obranu proti běžným patogenům . Na druhou stranu, při pečlivém návrhu a charakterizaci CNM jsou jejich imunomodulační vlastnosti atraktivní pro biomedicínské aplikace . Tyto aplikace jsou založeny buď na přímém účinku CNM, nebo na účinku, který mají CNM ve spojení s jinými materiály nebo reagenciemi . Bohužel je evidentní, že v našich znalostech jsou stále mezery . Celkově vzato je hodnocení imunotoxického potenciálu CNM zásadním úkolem, i když ne snadným, a pozornost by měla být věnována nejen správné charakterizaci a vyloučení kontaminace, ale také složení média . Nezbytným krokem je také doplnění modelů lidských primárních buněk, neboť bychom mohli snadno přehlédnout často opomíjené, ale velmi důležité vzájemné ovlivňování probíhající během buněčné komunikace . 9.6 LITERATURA 1 . Mukherjee SP, Bottini M, Fadeel B . Graphene and the Immune System: A Romance of Many Dimensions . Front Immunol. 2017;8:673 . doi:10 .3389/fimmu .2017 .00673 . 2 . Yuan X, Zhang X, Sun L, Wei Y, Wei X . Cellular Toxicity and Immunological Effects of Carbon- -Based Nanomaterials . Part Fibre Toxicol. 2019;16(1):18 . doi:10 .1186/s12989-019-0299-z . 3 . Fadeel B, Bussy C, Merino S et al . Safety Assessment of Graphene-Based Materials: Focus on Human Health and the Environment . ACS Nano. 2018;12(11):10582–10620 . doi:10 .1021/acsnano .8b04758 . 4 . Park EJ, Lee SJ, Lee K et al . Pulmonary Persistence of Graphene Nanoplatelets May Disturb Physiological and Immunological Homeostasis . J Appl Toxicol. 2017;37(3):296–309 . doi:10 .1002/ jat .3365 . 5 . Kim JK, Shin JH, Lee JS et al . 28-Day Inhalation Toxicity of Graphene Nanoplatelets in Sprague- -Dawley Rats . Nanotoxicology. 2016;10(7):891–901 . doi:10 .3109/17435390 .2016 .1172678 . 6 . Kurapati R, Martìn C, Palermo V, Nishina Y, Bianco A . Biodegradation of Graphene Materials Catalyzed by Human Eosinophil Peroxidase . Faraday Discuss. 2021;227:189–203 . doi:10 .1039/ C9FD00094A . 7 . Kurapati R, Russier J, Squillaci MA et al . Dispersibility-Dependent Biodegradation of Graphene Oxide by Myeloperoxidase . Small. 2015;11(32):3985–3994 . doi:10 .1002/smll .201500340 . 8 . Hussain S, Vanoirbeek JA, Hoet PH . Interactions of Nanomaterials with the Immune System . Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2012;4(2):169–183 . doi:10 .1002/wnan .175 . 9 . Fitzgerald KA, Kagan JC . Toll-like Receptors and the Control of Immunity . Cell. 2020;180(6): 1044–1066 . doi:10 .1016/j .cell .2020 .02 .041 . 10 . Bertani B, Ruiz N . Function and Biogenesis of Lipopolysaccharides . EcoSal Plus. 2018;8(1):10 .1128/ ecosalplus .ESP-0001-2018 . doi:10 .1128/ecosalplus .ESP-0001-2018 . 11 . Gorbet MB, Sefton MV . Endotoxin: The Uninvited Guest . Biomaterials. 2005;26(34):6811–6817 . doi:10 .1016/j .biomaterials .2005 .04 .063 . 12 . Vallhov H, Qin J, Johansson SM et al . The Importance of an Endotoxin-Free Environment During the Production of Nanoparticles Used in Medical Applications . Nano Lett. 2006;6(8):1682–1686 . doi:10 .1021/nl060860z . 13 . Lahiani MH, Gokulan K, Williams K, Khodakovskaya MV, Khare S . Graphene and Carbon Nanotubes Activate Different Cell Surface Receptors on Macrophages Before and After Deactivation of Endotoxins . J Appl Toxicol. 2017;37(11):1305–1316 . doi:10 .1002/jat .3483 . 118 14 . Liu Z, Li W, Wang F et al . Enhancement of Lipopolysaccharide-Induced Nitric Oxide and Interleukin-6 Production by PEGylated Gold Nanoparticles in RAW264 .7 Cells . Nanoscale. 2012;4(22):7135–7142 . doi:10 .1039/c2nr32629a . 15 . Bianchi MG, Allegri M, Costa AL et al . Titanium Dioxide Nanoparticles Enhance Macrophage Activation by LPS Through a TLR4-Dependent Intracellular Pathway . Toxicol Res. 2015;4(2):385–398 . doi:10 .1039/c4tx00193a 16 . Li Y, Shi Z, Radauer-Preiml I et al . Bacterial Endotoxin (Lipopolysaccharide) Binds to the Surface of Gold Nanoparticles, Interferes with Biocorona Formation and Induces Human Monocyte Inflammatory Activation . Nanotoxicology. 2017;11(9–10):1157–1175 . doi:10 .1080/17435390 .2017 .1370112 . 17 . Duan G, Kang S-g, Tian X et al . Protein Corona Mitigates the Cytotoxicity of Graphene Oxide by Reducing Its Physical Interaction with Cell Membrane . Nanoscale. 2015;7(37):15214–15224 . doi:10 .1039/C5NR03338G . 18 . Yan H, Cacioppo M, Megahed S et al . Influence of the Chirality of Carbon Nanodots on Their Interaction with Proteins and Cells . Nat Commun. 2021;12(1):7208 . doi:10 .1038/s41467-021-27353-9 . 19 . Chong Y, Ge C, Yang Z et al . Reduced Cytotoxicity of Graphene Nanosheets Mediated by Blood- -Protein Coating . ACS Nano. 2015;9(6):5713–5724 . doi:10 .1021/acsnano .5b01711 . 20 . Ge C, Du J, Zhao L et al . Binding of Blood Proteins to Carbon Nanotubes Reduces Cytotoxicity . Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(41):16968–16973 . doi:10 .1073/pnas .1105270108 . 21 . Mukherjee SP, Bondarenko O, Kohonen P et al . Macrophage Sensing of Single-Walled Carbon Nanotubes Via Toll-Like Receptors . Sci Rep. 2018;8(1):1115 . doi:10 .1038/s41598-018-19393-z . 22 . Turabekova M, Rasulev B, Theodore M et al . Immunotoxicity of Nanoparticles: A Computational Study Suggests that CNTs and C60 Fullerenes Might Be Recognized as Pathogens by Toll-Like Receptors . Nanoscale. 2014;6(7):3488–3495 . doi:10 .1039/C3NR06465A . 23 . Park SJ . Protein-Nanoparticle Interaction: Corona Formation and Conformational Changes in Proteins on Nanoparticles . Int J Nanomedicine. 2020;15:5783–5802 . doi:10 .2147/IJN .S254808 . 24 . Huynh MT, Mikoryak C, Pantano P, Draper R . Scavenger Receptor A1 Mediates the Uptake of Carboxylated and Pristine Multi-Walled Carbon Nanotubes Coated with Bovine Serum Albumin . Nanomaterials (Basel). 2021;11(2):539 . doi:10 .3390/nano11020539 . 25 . Wang R, Lohray R, Chow E et al . Selective Uptake of Carboxylated Multi-Walled Carbon Nanotubes by Class A Type 1 Scavenger Receptors and Impaired Phagocytosis in Alveolar Macrophages . Nanomaterials. 2020;10(12):2417 . doi:10 .3390/nano10122417 . 26 . Salvador-Morales C, Flahaut E, Sim E et al . Complement Activation and Protein Adsorption by Carbon Nanotubes . Mol Immunol. 2006;43(3):193–201 . doi:10 .1016/j .molimm .2005 .01 .019 . 27 . Belime A, Thielens NM, Gravel E et al . Recognition Protein C1q of Innate Immunity Agglutinates Nanodiamonds Without Activating Complement . Nanomedicine. 2019;18:292–302 . doi:10 .1016/ j .nano .2019 .02 .002 . 28 . Wibroe PP, Petersen SV, Bovet N et al . Soluble and Immobilized Graphene Oxide Activates Complement System Differently Dependent on Surface Oxidation State . Biomaterials. 2016;78:20–26 . doi:10 .1016/j .biomaterials .2015 .11 .034 . 29 . Tan X, Feng L, Zhang J et al . Functionalization of Graphene Oxide Generates a Unique Interface for Selective Serum Protein Interactions . ACS Appl Mater Interfaces. 2013;5(4):1370–1377 . doi:10 .1021/am3029933 . 30 . Belling JN, Jackman JA, Yorulmaz Avsar S et al . Stealth Immune Properties of Graphene Oxide En - abled by Surface-Bound Complement Factor H . ACS Nano. 2016;10(11):10161–10172 . doi:10 .1021/ acsnano .6b04760 . 31 . Ghosh S, Chatterjee K . Poly(Ethylene Glycol) Functionalized Graphene Oxide in Tissue Engineering: A Review on Recent Advances . Int J Nanomedicine. 2020;15:5991–6006 . doi:10 .2147/IJN .S249717 . 119 32 . Ravelli D, Merli D, Quartarone E, Profumo A, Mustarelli P, Fagnoni M . PEGylated Carbon Nanotubes: Preparation, Properties and Applications . RSC Adv. 2013;3(33):13569–13582 . doi:10 .1039/ c3ra40444d . 33 . Luo N, Weber JK, Wang S et al . PEGylated Graphene Oxide Elicits Strong Immunological Responses Despite Surface Passivation . Nat Commun. 2017;8(1):14537 . doi:10 .1038/ncomms14537 . 34 . Gustafson HH, Holt-Casper D, Grainger DW, Ghandehari H . Nanoparticle Uptake: The Phagocyte Problem . Nano Today. 2015;10(4):487–510 . doi:10 .1016/j .nantod .2015 .06 .006 . 35 . Cui X, Wan B, Yang Y, Ren X, Guo L-H . Length Effects on the Dynamic Process of Cellular Uptake and Exocytosis of Single-Walled Carbon Nanotubes in Murine Macrophage Cells . Sci Rep. 2017;7(1):1518 . doi:10 .1038/s41598-017-01746-9 . 36 . Yaron PN, Holt BD, Short PA, Lösche M, Islam MF, Dahl KN . Single Wall Carbon Nanotubes Enter Cells by Endocytosis and Not Membrane Penetration . J Nanobiotechnology. 2011;9:45–45 . doi:10 .1186/1477-3155-9-45 . 37 . Thoo L, Fahmi MZ, Zulkipli IN, Keasberry N, Idris A . Interaction and Cellular Uptake of Surface- -Modified Carbon Dot Nanoparticles by J774 .1 Macrophages . Cent Eur J Immunol. 2017;42(3): 324–330 . doi:10 .5114/ceji .2017 .70978 . 38 . Li Y, Yuan H, von dem Bussche A et al . Graphene Microsheets Enter Cells Through Spontaneous Membrane Penetration at Edge Asperities and Corner Sites . Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(30):12295–12300 . doi:10 .1073/pnas .1222276110 . 39 . Knotigova PT, Mašek J, Hubatka F et al . Application of Advanced Microscopic Methods to Study the Interaction of Carboxylated Fluorescent Nanodiamonds With Membrane Structures in THP-1 Cells: Activation of Inflammasome NLRP3 as the Result of Lysosome Destabilization . Mol Pharm. 2019;16(8):3441–3451 . doi:10 .1021/acs .molpharmaceut .9b00441 . 40 . Li L, Chen L, Lu Y et al . Aggregated Carbon Dots-Loaded Macrophages Treat Sepsis by Eliminating Multidrug-Resistant Bacteria and Attenuating Inflammation . Aggregate . 2022;4(1):e200 . doi:10 .1002/agt2 .200 . 41 . Brown DM, Kinloch IA, Bangert U et al . An In Vitro Study of the Potential of Carbon Nanotubes and Nanofibres to Induce Inflammatory Mediators and Frustrated Phagocytosis . Carbon N Y. 2007;45(9):1743–1756 . doi:10 .1016/j .carbon .2007 .03 .023 . 42 . Boyles MS, Young L, Brown DM et al . Multi-Walled Carbon Nanotube Induced Frustrated Phagocytosis, Cytotoxicity and Pro-Inflammatory Conditions in Macrophages Are Length Dependent and Greater Than That of Asbestos . Toxicol In Vitro. 2015;29(7):1513–1528 . doi:10 .1016/ j .tiv .2015 .05 .018 . 43 . Svadlakova T, Hubatka F, Turanek Knotigova P et al . Proinflammatory Effect of Carbon-Based Nanomaterials: In Vitro Study on Stimulation of Inflammasome NLRP3 Via Destabilisation of Lysosomes . Nanomaterials. 2020;10(3):418 . doi:10 .3390/nano10030418 . 44 . Fusco L, Avitabile E, Armuzza V et al . Impact of the Surface Functionalization on Nanodiamond Biocompatibility: A Comprehensive View on Human Blood Immune Cells . Carbon N Y. 2020;160:390–404 . doi:10 .1016/j .carbon .2020 .09 .064 . 45 . Meunier E, Coste A, Olagnier D et al . Double-Walled Carbon Nanotubes Trigger IL-1beta Release in Human Monocytes Through NLRP3 Inflammasome Activation . Nanomedicine. 2012;8(6): 987–995 . doi:10 .2217/nnm .12 .75 . 46 . Sun B, Wang X, Ji Z et al . NADPH Oxidase-Dependent NLRP3 Inflammasome Activation and Its Important Role in Lung Fibrosis by Multiwalled Carbon Nanotubes . Small. 2015;11(17): 2087–2097 . doi:10 .1002/smll .201402210 . 47 . Palomäki J, Välimäki E, Sund J et al . Long, Needle-Like Carbon Nanotubes and Asbestos Activate the NLRP3 Inflammasome Through a Similar Mechanism . ACS Nano. 2011;5(9):6861–6870 . doi:10 .1021/nn200595c . 48 . Guo H, Callaway JB, Ting JP . Inflammasomes: Mechanism of Action, Role in Disease, and Therapeutics . Nat Med. 2015;21(7):677–687 . doi:10 .1038/nm .3893 . 120 49 . Sun B, Wang X, Ji Z, Li R, Xia T . NLRP3 Inflammasome Activation Induced by Engineered Nanomaterials . Small. 2013;9(9–10):1595-1607 . doi:10 .1002/smll .201202083 . 50 . He Y, Hara H, Nunez G . Mechanism and Regulation of NLRP3 Inflammasome Activation . Trends Biochem Sci. 2016;41(12):1012–1021 . doi:10 .1016/j .tibs .2016 .09 .002 . 51 . Gritsenko A, Yu S, Martin-Sanchez F et al . Priming Is Dispensable for NLRP3 Inflammasome Activation in Human Monocytes In Vitro . Front Immunol. 2020;11:565924 . doi:10 .3389/fimmu .2020 .565924 . 52 . Keshavan S, Gupta G, Martin S, Fadeel B . Multi-Walled Carbon Nanotubes Trigger Lysosome- -Dependent Cell Death (Pyroptosis) in Macrophages but Not in Neutrophils . Nanotoxicology . 2021;15(9):1125–1150 . doi:10 .1080/17435390 .2021 .1964629 . 53 . Horie M, Tabei Y, Sugino S et al . Comparison of the Effects of Multiwall Carbon Nanotubes on the Epithelial Cells and Macrophages . Nanotoxicology. 2019;13(7):861–878 . doi:10 .1080/17435390 .2 019 .1592258 . 54 . Wan B, Wang ZX, Lv QY et al . Single-Walled Carbon Nanotubes and Graphene Oxides Induce Autophagosome Accumulation and Lysosome Impairment in Primarily Cultured Murine Peritoneal Macrophages . Toxicol Lett. 2013;221(2):118–127 . doi:10 .1016/j .toxlet .2013 .06 .208 . 55 . Perrotta C, Cattaneo MG, Molteni R, De Palma C . Autophagy in the Regulation of Tissue Differentiation and Homeostasis . Front Cell Dev Biol. 2020;8:1563 . doi:10 .3389/fcell .2020 .602901 . 56 . Zhang X-j, Chen S, Huang K-x, Le W-d . Why Should Autophagic Flux Be Assessed? . Acta Pharmacol Sin. 2013;34(5):595–599 . doi:10 .1038/aps .2012 .184 . 57 . Cohignac V, Landry MJ, Ridoux A et al . Carbon Nanotubes, but Not Spherical Nanoparticles, Block Autophagy by a Shape-Related Targeting of Lysosomes in Murine Macrophages . Autophagy. 2018;14(8):1323–1334 . doi:10 .1080/15548627 .2018 .1474993 . 58 . Malanagahalli S, Murera D, Martín C et al . Few Layer Graphene Does Not Affect Cellular Homeostasis of Mouse Macrophages . Nanomaterials. 2020;10(2):228 . doi:10 .3390/nano10020228 . 59 . Murera D, Malaganahalli S, Martín C et al . Few Layer Graphene Does Not Affect the Function and the Autophagic Activity of Primary Lymphocytes . Nanoscale. 2019;11(21):10493–10503 . doi:10 .1039/C9NR00846B . 60 . Chen GY, Yang HJ, Lu CH et al . Simultaneous Induction of Autophagy and Toll-Like Receptor Signaling Pathways by Graphene Oxide . Biomaterials. 2012;33(27):6559–6569 . doi:10 .1016/j .biomaterials .2012 .05 .064 . 61 . Qu G, Liu S, Zhang S et al . Graphene Oxide Induces Toll-Like Receptor 4 (TLR4)-Dependent Necrosis in Macrophages . ACS Nano. 2013;7(7):5732–5745 . doi:10 .1021/nn402330b . 62 . Mukherjee SP, Kostarelos K, Fadeel B . Cytokine Profiling of Primary Human Macrophages Exposed to Endotoxin-Free Graphene Oxide: Size-Independent NLRP3 Inflammasome Activation . Adv Healthc Mater. 2018;7(4):1700815 . doi:10 .1002/adhm .201700815 . 63 . Zhang X, Cao F, Wu L, Jiang X . Understanding the Synergic Mechanism of Weak Interactions Between Graphene Oxide and Lipid Membrane Leading to the Extraction of Lipids . Langmuir. 2019;35(43):14098–14107 . doi:10 .1021/acs .langmuir .9b02536 . 64 . Mukherjee SP, Lazzaretto B, Hultenby K et al . Graphene Oxide Elicits Membrane Lipid Changes and Neutrophil Extracellular Trap Formation . Chem. 2018;4(2):334–358 . doi:10 .1016/j .chempr .2017 .12 .017 . 65 . Svadlakova T, Kolackova M, Vankova R et al . Carbon-Based Nanomaterials Increase Reactivity of Primary Monocytes Towards Various Bacteria and Modulate Their Differentiation Into Macrophages . Nanomaterials. 2021;11(10):2510 . doi:10 .3390/nano11102510 . 66 . Lebre F, Boland JB, Gouveia P et al . Pristine Graphene Induces Innate Immune Training . Nanoscale. 2020;12(20):11192–11200 . doi:10 .1039/C9NR09661B . 67 . Cheng SC, Quintin J, Cramer RA et al . mTORand HIF-1α-Mediated Aerobic Glycolysis as Metabolic Basis for Trained Immunity . Science. 2014;345(6204):1250684 . doi:10 .1126/science .1250684 . 121 68 . Povo-Retana A, Mojena M, Boscá A et al . Graphene Particles Interfere with Pro-Inflammatory Polarization of Human Macrophages: Functional and Electrophysiological Evidence . Small. 2021;5(11):2100882 . doi:10 .1002/adbi .202100882 . 69 . Kinaret PAS, Scala G, Federico A, Sund J, Greco D . Carbon Nanomaterials Promote M1/M2 Macrophage Activation . Small. 2020;16(21):1907609 . doi:10 .1002/smll .201907609 . 70 . Zhang X, Luo M, Zhang J et al . Carbon Nanotubes Promote Alveolar Macrophages Toward M2 Polarization Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Fibroblast-to-Myofibroblast Transdifferentiation . Nanotoxicology. 2021;15(5):588–604 . doi:10 .1080/17435390 .2021 .1905098 . 71 . Zhang Y, Morgan MJ, Chen K, Choksi S, Liu ZG . Induction of Autophagy Is Essential for Monocyte-Macrophage Differentiation . Blood. 2012;119(12):2895–2905 . doi:10 .1182/blood-2011-08-372383 . 72 . Clarke AJ, Simon AK . Autophagy in the Renewal, Differentiation and Homeostasis of Immune Cells . Nat Rev Immunol. 2019;19(3):170–183 . doi: 10 .1038/s41577-018-0095-2 . 73 . Moujaber O, Stochaj U . The Cytoskeleton as Regulator of Cell Signaling Pathways . Trends Biochem Sci. 2020;45(2):96–107 . doi:10 .1016/j .tibs .2019 .11 .003 . 74 . Hohmann T, Dehghani F . The Cytoskeleton-A Complex Interacting Meshwork . Cells. 2019;8(4):362 . doi:10 .3390/cells8040362 . 75 . Tian X, Yang Z, Duan G et al . Graphene Oxide Nanosheets Retard Cellular Migration Via Disruption of Actin Cytoskeleton . Small. 2017;13(3):1602133 . doi:10 .1002/smll .201602133 . 76 . Wang J, Wang P, He Y et al . Graphene Oxide Inhibits Cell Migration and Invasion by Destroying Actin Cytoskeleton in Cervical Cancer Cells . Aging. 2020;12(17):17625–17633 . doi:10 .18632/ aging .103821 . 77 . Krejsek J, Andrýs C, Krčmová I . Imunologie člověka. Garamon s . r . o .; 2016 . ISBN-13: 978-8086472-74-4 . 78 . Yang Z, Pan Y, Chen T et al . Cytotoxicity and Immune Dysfunction of Dendritic Cells Caused by Graphene Oxide . Front Pharmacol. 2020;11:1206 . doi:10 .3389/fphar .2020 .01206 . 79 . Zhou Q, Gu H, Sun S et al . Large-Sized Graphene Oxide Nanosheets Increase DC–T-Cell Synaptic Contact and the Efficacy of DC Vaccines Against SARS-CoV-2 . Adv Mater. 2021;33(40):2102528 . doi:10 .1002/adma .202102528 . 80 . Lin H, Peng S, Guo S et al . 2D Materials and Primary Human Dendritic Cells: A Comparative Cytotoxicity Study . Small. 2022;18(20):2107652 . doi:10 .1002/smll .202107652 . 81 . Uzhviyuk SV, Bochkova MS, Timganova VP et al . Interaction of Human Dendritic Cells with Graphene Oxide Nanoparticles In Vitro . Bull Exp Biol Med. 2022;172(5):664–670 . doi:10 .1007/s10517022-05451-0 . 82 . Park EJ, Cho WS, Jeong J et al . Pro-Inflammatory and Potential Allergic Responses Resulting from B Cell Activation in Mice Treated with Multi-Walled Carbon Nanotubes by Intratracheal Instillation . Toxicology. 2009;259(3):113-121 . doi:10 .1016/j .tox .2009 .02 .009 . 83 . Inoue K, Koike E, Yanagisawa R et al . Effects of Multi-Walled Carbon Nanotubes on a Murine Allergic Airway Inflammation Model . Toxicol Appl Pharmacol. 2009;237(3):306–316 . doi:10 .1016/j . taap .2009 .04 .003 . 84 . Nygaard UC, Hansen JS, Samuelsen M et al . Single-Walled and Multi-Walled Carbon Nanotubes Promote Allergic Immune Responses in Mice . Toxicol Sci. 2009;109(1):113–123 . doi:10 .1093/toxsci/kfp057 . 85 . Shurin MR, Yanamala N, Kisin ER et al . Graphene Oxide Attenuates Th2-Type Immune Responses but Augments Airway Remodeling and Hyperresponsiveness in a Murine Model of Asthma . ACS Nano. 2014;8(6):5585-5599 . doi:10 .1021/nn406454u . 86 . Beyeler S, Steiner S, Wotzkow C et al . Multi-Walled Carbon Nanotubes Activate and Shift Polarization of Pulmonary Macrophages and Dendritic Cells in an In Vivo Model of Chronic Obstructive Lung Disease . Nanotoxicology. 2020;14(1):77–96 . doi:10 .1080/17435390 .2019 .1663954 . 128 MWCNT (po 3 dnech od aplikace) . Byl nalezen dávkově závislý nárůst poškození DNA; vyšší aplikovaná dávka vedla k dvojnásobnému nárůstu počtu pneumocytů typu II s mikrojádrem .48 I další in vivo studie (autorská skupina Snegin et al .) potvrdila genotoxické účinky MWCNT . Po subchronické perorální expozici 0,5 mg MWCNT (opakovaná aplikace po dobu 21 dnů) byla analyzována tkáň jater, semenných tubulů, tlustého střeva, mozku, ledvin, plic, buněk kostní dřeně a leukocyty periferní krve . Ve všech typech tkání autoři nalezli zvýšenou míru poškození jaderné DNA (kometový test) . V této studii byla hodnocena rovněž akutní genotoxicita po jednorázovém perorálním podání 2,5 a 5,0 mg MWCNT . I nižší dávka (2,5 mg) vyvolala po 24 hodinách od aplikace poškození DNA ve tkáních tlustého střeva, ledvin, plic a v leukocytech .49 Ani značné množství dat potvrzujících přítomnost genotoxického potenciálu MWCNT však neumožňuje vytvořit k této problematice konzistentnější závěry . Příčinou je existence studií, jejichž výsledky jsou v rozporu s výsledky studií předcházejících . Například Hadrup et al . exponovali intratracheálně myši MWCNT (54 μg/myš) a následně analyzovali vzorky BAL (po 24 hodinách) pomocí testu detekce zlomů řetězců DNA (kometový test) . Tato studie negativní vliv MWCNT na integritu DNA nepotvrdila .50 Podobné (negativní) nálezy prezentovali i autoři Pothmann et al . Expozice potkanů MWCNT Graphistrength© C100 (inhalace pouze nosem) po dobu 90 dní (6 h / den / 5 dnů v týdnu) neměla v jejich experimentu vliv na počty zlomů řetězců DNA v buňkách získaných z tkání plic, jater a ledvin . Rovněž tak nebyl ovlivněn počet mikrojader v polychromatických erytrocytech exponovaných potkanů .51 Vedle MWCNT byla pozornost výzkumných týmů pochopitelně věnována i dalším formám CNM . Například El-Yamany et al . zkoumali genotoxický potenciál opakované intraperitoneální aplikace GO myším (aplikace jednou týdně) . Po 7, 28 a 56 dnech byl proveden test chromozomálních aberací a test detekce zlomů řetězců DNA (kometový test) v buňkách kostní dřeně a buňkách tkání respiračního traktu . Autoři prezentovali nálezy zvýšeného počtu strukturních chromozomálních aberací v kostní dřeni a nárůst úrovně oxidačního stresu v plicní tkáni (změny vykazovaly závislost na dávce) .52 V další studii (Mohamed et al .) byly myši exponovány perorálně GO . Expozice vedla k masivnímu nárůstu počtu mikrojader a poškození DNA v buňkách kostní dřeně . GO také indukoval histologické léze s nekrózou, apoptózou a zánětem ve tkáních jater a mozku .53 Genotoxické účinky GO prezentovali rovněž Liu et al . V jejich studii byla myším opakovaně intravenózně aplikována dávka 1,0, 2,0 a 4,0 mg GO/kg po dobu pěti po sobě jdoucích dnů . Dávka 4,0 mg/kg vyvolala tvorbu mikrojader v polychromních erytrocytech . Autoři se domnívají, že genotoxický a mutagenní potenciál GO je srovnatelný s potenciálem cyklofosfamidu .54 Ve výše uvedeném textu, který se týká výsledků studií in vitro, jsme ukázali, že fullereny mohou působit jak genotoxicky, tak i genoprotektivně . Podobně nekonzistentní výsledky jsou zatím bohužel i u studií in vivo . Například Nechat Sumi a Kumari Chitra exponovali sladkovodní ryby Anabas testudineus fullerenu C60 (5,0 a 10,0 mg/l) a následně provedli test detekce mikrojader a test detekce zlomů řetězců DNA (kometový test) . Expozice fullerenu indukovala tvorbu mikrojader a zlomů řetězců DNA v erytrocytech, žábrách a jaterních buňkách .55 Oproti tomu ve studii autorů Ema et al . intratracheální podávání fullerenu C60 (jednorázově 0,5 a 2,5 mg/kg; opakovaně 0,1 a 0,5 mg/kg jednou týdně po dobu pěti týdnů) nevedlo u potkaních samců k nárůstu míry poškození DNA v plicní tkáni .56 Je ale nutné poznamenat, že celková dávka podaná v této studii byla nižší než dávka ve studii předchozí (Sumi a Chitra) . Totsuka et al . hodnotili genotoxické účinky intratracheální aplikace fullerenu (C60), sazí (carbon black) a kaolinu na organismus C57BL/6J myší a gpt delta transgenních myší . Myši 129 byly exponovány jednou nebo opakovaně (0,2 mg/myš) . Intenzita poškození DNA v plicních buňkách klesala v řadě C60 > saze > kaolin a byla celkově 2–3krát vyšší než ve skupině kontrolních myší . U gtp delta transgenních myší expozice C60 významně zvýšila frekvenci mutací DNA .57 10.3 ZÁVĚR Genotoxické látky poškozují genetickou informaci buňky, což může mít závažný dopad nejen na buňku samotnou, ale na celý organismus . Poškození genetické informace je mimo jiné spojené s mutacemi a také s vyšším rizikem rozvoje nádorových onemocnění a v případě, že k poškození dochází v zárodečných buňkách, je možné přenést poškození i na další generace . In vitro i in vivo studie zaměřené na genotoxicitu ukazují, že některé CNM pravděpodobně mají genotoxický potenciál, tj . indukují genomové změny . Jedná se o závažná zjištění, která nelze brát na lehkou váhu a je nezbytné se této problematice dále věnovat . 10.4 LITERATURA 1 . Kohl Y, Rundén-Pran E, Mariussen E et al . Genotoxicity of Nanomaterials: Advanced In Vitro Models and High Throughput Methods for Human Hazard Assessment—A Review . Nanomaterials. 2020;10(10):1–25 . doi:10 .3390/NANO10101911 . 2 . Samadian H, Salami MS, Jaymand M et al . Genotoxicity Assessment of Carbon-Based Nanomaterials; Have Their Unique Physicochemical Properties Made Them Double-Edged Swords? Mutat Res Mutat Res. 2020;783:108296 . doi:10 .1016/J .MRREV .2020 .108296 . 3 . Burgum MJ, Clift MJD, Evans SJ et al . Few-Layer Graphene Induces Both Primary and Secondary Genotoxicity in Epithelial Barrier Models In Vitro . J Nanobiotechnology. 2021;19(1):24 . doi:10 .1186/S12951-021-00769-9 . 4 . Malkova A, Svadlakova T, Singh A et al . In Vitro Assessment of the Genotoxic Potential of Pristine Graphene Platelets . Nanomater. 2021;11(9):2210 . doi:10 .3390/NANO11092210 . 5 . Svadlakova T, Hubatka F, Knotigova PT et al . Proinflammatory Effect of Carbon-Based Nanomaterials: In Vitro Study on Stimulation of Inflammasome NLRP3 via Destabilisation of Lysosomes . Nanomaterials. 2020;10(3):418 . doi:10 .3390/nano10030418 . 6 . Fraser K, Kodali V, Yanamala N et al . Physicochemical Characterization and Genotoxicity of the Broad Class of Carbon Nanotubes and Nanofibers Used or Produced in U .S . Facilities . Part Fibre Toxicol. 2020;17(1):1–26 . doi:10 .1186/S12989-020-00392-W . 7 . Kidane D, Chae WJ, Czochor J et al . Interplay Between DNA Repair and Inflammation, and the Link to Cancer . Crit Rev Biochem Mol Biol. 2014;49(2):116 . doi:10 .3109/10409238 .2013 .875514 . 8 . Barroso SI, Aguilera A . Detection of DNA Double-Strand Breaks by γ-H2AX Immunodetection . Methods Mol Biol. 2021;2153:1–8 . doi:10 .1007/978-1-0716-0644-5_1 . 9 . Turkez H, Arslan ME, Ozdemir O . Genotoxicity Testing: Progress and Prospects for the Next Decade . Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2017;13(10):1089–1098 . doi:10 .1080/17425255 .2017 .1375097 . 10 . Rodriguez-Fernandez L, Valiente R, Gonzalez J, Villegas JC, Fanarraga ML . Multiwalled Carbon Nanotubes Display Microtubule Biomimetic Properties In Vivo, Enhancing Microtubule Assembly and Stabilization . ACS Nano. 2012;6(8):6614–6625 . doi:10 .1021/nn302222m . 11 . Nagai H, Okazaki Y, Chew SH et al . Diameter and Rigidity of Multiwalled Carbon Nanotubes Are Critical Factors in Mesothelial Injury and Carcinogenesis . Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(49):E1330–E1338 . doi:10 .1073/pnas .1110013108 . 130 12 . Grosse Y, Loomis D, Guyton KZ et al . Carcinogenicity of Fluoro-Edenite, Silicon Carbide Fibres and Whiskers, and Carbon Nanotubes . Lancet Oncol. 2014;15(13):1427–1428 . doi:10 .1016/ S1470-2045(14)71109-X . 13 . World Health Organization (WHO) . IARC Publications Website - IARC Monographs on the Identification of Carcinogenic Hazards to Humans . Published 2019 . Accessed February 19, 2022 . https:// publications .iarc .fr/Book-And-Report-Series/Iarc-Monographs-On-The-Identification-Of-Carcinogenic-Hazards-To-Humans?sort_by=year_desc&limit=20&page=7 . 14 . Catalan J, Siivola KM, Nymark P et al . In Vitro and In Vivo Genotoxic Effects of Straight Versus Tangled Multi-Walled Carbon Nanotubes . Nanotoxicology. 2016;10(6):794–806 . doi:10 .3109/1743 5390 .2015 .1132345 . 15 . Siegrist KJ, Reynolds SH, Porter DW et al . Mitsui-7, Heat-Treated, and Nitrogen-Doped Multi- -Walled Carbon Nanotubes Elicit Genotoxicity in Human Lung Epithelial Cells . Part Fibre Toxicol. 2019;16(1):1–19 . doi:10 .1186/S12989-019-0318-0 . 16 . Lucas JH, Wang Q, Muthumalage T, Rahman I . Multi-Walled Carbon Nanotubes (MWCNTs) Cause Cellular Senescence in TGF-β Stimulated Lung Epithelial Cells . Toxics. 2021;9(6):144 . doi:10 .3390/ TOXICS9060144 . 17 . Ventura C, Pereira JFS, Matos P et al . Cytotoxicity and Genotoxicity of MWCNT-7 and Crocidolite: Assessment in Alveolar Epithelial Cells Versus Their Coculture with Monocyte-Derived Macrophages . Nanotoxicology. 2020;14(4):479–503 . doi:10 .1080/17435390 .2019 .1695975 . 18 . Di Ianni E, Erdem JS, Møller P et al . In Vitro-In Vivo Correlations of Pulmonary Inflammogenicity and Genotoxicity of MWCNT . Part Fibre Toxicol. 2021;18(1):1–16 . doi:10 .1186/s12989-021 -00413-2 . 19 . Kato T, Totsuka Y, Ishino K et al . Genotoxicity of Multi-Walled Carbon Nanotubes in Both In Vitro and In Vivo Assay Systems . Nanotoxicology. 2013;7(4):452–461 . doi:10 .3109/17435390 .2012 .674571 . 20 . Borghini A, Roursgaard M, Andreassi MG, Kermanizadeh A, Møller P . Repair Activity of Oxidatively Damaged DNA and Telomere Length in Human Lung Epithelial Cells After Exposure to Multi-Walled Carbon Nanotubes . Mutagenesis. 2017;32(1):173–180 . doi:10 .1093/mutage/gew036 . 21 . Öner D, Ghosh M, Putzeys E, Godderis L, Hoet P . The Assessment of Asbestos and Carbon Nanotubes Induced Genotoxic Effects . Front Genet. Conference Abstract: ICAW 2015 – 11th International Comet Assay Workshop . 2015 . doi:10 .3389/conf .fgene .2015 .01 .00075 . 22 . Kermanizadeh A, Gaiser BK, Hutchison GR, Stone V . An In Vitro Liver Model - Assessing Oxidative Stress and Genotoxicity Following Exposure of Hepatocytes to a Panel of Engineered Nanomaterials . Part Fibre Toxicol. 2012;9(1):1–13 . doi:10 .1186/1743-8977-9-28 . 23 . Guo YY, Zhang J, Zheng YF, Yang J, Zhu XQ . Cytotoxic and Genotoxic Effects of Multi-Wall Carbon Nanotubes on Human Umbilical Vein Endothelial Cells In Vitro . Mutat Res Toxicol Environ Mutagen. 2011;721(2):184–191 . doi:10 .1016/J .MRGENTOX .2011 .01 .014 . 24 . Long J, Xiao Y, Liu L, Cao Y . The Adverse Vascular Effects of Multi-Walled Carbon Nanotubes (MWCNTs) to Human Vein Endothelial Cells (HUVECs) In Vitro: Role of Length of MWCNTs . J Nanobiotechnology. 2017;15(1):80 . doi:10 .1186/s12951-017-0318-x . 25 . Ema M, Imamura T, Suzuki H, Kobayashi N, Naya M, Nakanishi J . Evaluation of Genotoxicity of Multi-Walled Carbon Nanotubes in a Battery of In Vitro and In Vivo Assays . Regul Toxicol Pharmacol. 2012;63(2):188–195 . doi:10 .1016/j .yrtph .2012 .03 .014 . 26 . Jiang T, Amadei CA, Gou N et al . Toxicity of Single-Walled Carbon Nanotubes (SWCNTs): Effect of Lengths, Functional Groups and Electronic Structures Revealed by a Quantitative Toxicogenomics Assay . Environ Sci Nano. 2020;7(5):1348–1364 . doi:10 .1039/D0EN00230E . 27 . Cveticanin J, Joksic G, Leskovac A, Petrovic S, Sobot AV, Neskovic O . Using Carbon Nanotubes to Induce Micronuclei and Double Strand Breaks of the DNA in Human Cells . Nanotechnology. 2009;21(1):015102 . doi:10 .1088/0957-4484/21/1/015102 . 131 28 . Yao C, Carlisi C, Li Y, Chen D, Ding J, Feng YL . Interaction Potency of Single-Walled Carbon Nanotubes with DNAs: A Novel Assay for Assessment of Hazard Risk . PLoS One. 2016;11(12):e0167796 . doi:10 .1371/journal .pone .0167796 . 29 . Sargent LM, Shvedova AA, Hubbs AF et al . Induction of Aneuploidy by Single-Walled Carbon Nanotubes . Environ Mol Mutagen. 2009;50(8):708–717 . doi:10 .1002/EM .20529 . 30 . Sargent LM, Hubbs AF, Young SH et al . Single-Walled Carbon Nanotube-Induced Mitotic Disruption . Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2012;745(1–2):28–37 . doi:10 .1016/j .mrgentox .2011 .11 .017 . 31 . Pacurari M, Yin XJ, Zhao J et al . Raw Single-Wall Carbon Nanotubes Induce Oxidative Stress and Activate MAPKs, AP-1, NF-κB, and Akt in Normal and Malignant Human Mesothelial Cells . Environ Health Perspect. 2008;116(9):1211–1217 . doi:10 .1289/ehp .10924 . 32 . Samadian H, Salami MS, Jaymand M et al . Genotoxicity Assessment of Carbon-Based Nanomaterials; Have Their Unique Physicochemical Properties Made Them Double-Edged Swords? Mutat Res Rev Mutat Res. 2020;783:108296 . doi:10 .1016/j .mrrev .2020 .108296 . 33 . Akca S, Foroughi A, Frochtzwajg D, Postma HWC . Competing Interactions in DNA Assembly on Graphene . PLoS One. 2011;6(4):e18442 . doi:10 .1371/journal .pone .0018442 . 34 . Burgum MJ, Clift MJD, Evans SJ et al . In Vitro Primary-Indirect Genotoxicity in Bronchial Epithelial Cells Promoted by Industrially Relevant Few-Layer Graphene . Small. 2021;17(15):2002551 . doi:10 .1002/SMLL .202002551 . 35 . Chatterjee N, Yang JS, Choi J . Differential Genotoxic and Epigenotoxic Effects of Graphene Family Nanomaterials (GFNs) in Human Bronchial Epithelial Cells . Mutat Res Toxicol Environ Mutagen. 2016;798–799:1–10 . doi:10 .1016/J .MRGENTOX .2016 .01 .006 . 36 . Wang A, Pu K, Dong B et al . Role of Surface Charge and Oxidative Stress in Cytotoxicity and Genotoxicity of Graphene Oxide Towards Human Lung Fibroblast Cells . J Appl Toxicol. 2013;33(10): 1156–1164 . doi:10 .1002/JAT .2877 . 37 . De Marzi L, Ottaviano L, Perrozzi F et al . Flake Size-Dependent Cyto and Genotoxic Evaluation of Graphene Oxide on In Vitro A549, CaCo2 and Vero Cell Lines . J Biol Regul Homeost Agents. 2014;28(2):281–289 . 38 . Di Ianni E, Møller P, Vogel UB, Jacobsen NR . Pro-Inflammatory Response and Genotoxicity Caused by Clay and Graphene Nanomaterials in A549 and THP-1 Cells . Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2021;872:503405 . doi:10 .1016/j .mrgentox .2021 .503405 . 39 . Zhao X, Striolo A, Cummings PT . C60 Binds to and Deforms Nucleotides . Biophys J. 2005;89(6): 3856–3862 . doi:10 .1529/biophysj .105 .064410 . 40 . Firdaus S, Lohani M, Dhasmana A, Haneef M . Interaction Pattern of Fullerene Family with Different Forms of DNA . Int J Sci Eng Res. 2015;6(3):1536–1541 . 41 . Ershova ES, Sergeeva VA, Chausheva AI et al . Toxic and DNA Damaging Effects of a Functionalized Fullerene in Human Embryonic Lung Fibroblasts . Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2016;805:46–57 . doi:10 .1016/j .mrgentox .2016 .05 .004 . 42 . Gudkov SV, Guryev EL, Gapeyev AB et al . Unmodified Hydrated С60 Fullerene Molecules Exhibit Antioxidant Properties, Prevent Damage to DNA and Proteins Induced by Reactive Oxygen Species and Protect Mice Against Injuries Caused by Radiation-Induced Oxidative Stress . Nanomedicine Nanotechnology, Biol Med. 2019;15(1):37–46 . doi:10 .1016/J .NANO .2018 .09 .001 . 43 . Aly FM, Othman A, Haridy MAM . Protective Effects of Fullerene C60 Nanoparticles and Virgin Olive Oil Against Genotoxicity Induced by Cyclophosphamide in Rats . Oxid Med Cell Longev. 2018; 2018(1):1261356 . doi:10 .1155/2018/1261356 . 44 . Xing Y, Xiong W, Zhu L, O’Sawa E, Hussin S, Dai L . DNA Damage in Embryonic Stem Cells Caused by Nanodiamonds . ACS Nano. 2011;5(3):2376–2384 . doi:10 .1021/nn200279k . 45 . Dworak N, Wnuk M, Zebrowski J, Bartosz G, Lewinska A . Genotoxic and Mutagenic Activity of Diamond Nanoparticles in Human Peripheral Lymphocytes In Vitro . Carbon N Y. 2014;68:763–776 . doi:10 .1016/j .carbon .2013 .11 .067 . 132 46 . Poulsen SS, Saber AT, Williams A et al . MWCNTs of Different Physicochemical Properties Cause Similar Inflammatory Responses, but Differences in Transcriptional and Histological Markers of Fibrosis in Mouse Lungs . Toxicol Appl Pharmacol. 2015;284(1):16–32 . doi:10 .1016/ J .TAAP .2014 .12 .011 . 47 . Knudsen KB, Berthing T, Jackson P et al . Physicochemical Predictors of Multi-Walled Carbon Nanotube–Induced Pulmonary Histopathology and Toxicity One Year After Pulmonary Deposition of 11 Different Multi-Walled Carbon Nanotubes in Mice . Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2019;124(2):211–227 . doi:10 .1111/bcpt .13119 . 48 . Muller J, Decordier I, Hoet PH et al . Clastogenic and Aneugenic Effects of Multi-Wall Carbon Nanotubes in Epithelial Cells . Carcinogenesis. 2008;29(2):427–433 . doi:10 .1093/CARCIN/ BGM243 . 49 . Snegin E, Gusev A, Snegina E, Barkhatov A, Vasyukova I, Artemchuk O . Genotoxicity Evaluation of Multiwalled Carbon Nanotubes: In Vivo Studies in Mice . IOP Conf Ser Earth Environ Sci. 2020; 433:012010 . doi:10 .1088/1755-1315/433/1/012010 . 50 . Hadrup N, Bengtson S, Jacobsen NR et al . Influence of Dispersion Medium on Nanomaterial- -Induced Pulmonary Inflammation and DNA Strand Breaks: Investigation of Carbon Black, Carbon Nanotubes and Three Titanium Dioxide Nanoparticles . Mutagenesis. 2017;32(6):581–597 . doi:10 .1093/mutage/gex042 . 51 . Pothmann D, Simar S, Schuler D et al . Lung Inflammation and Lack of Genotoxicity in the Comet and Micronucleus Assays of Industrial Multiwalled Carbon Nanotubes Graphistrength C100 After a 90-Day Nose-Only Inhalation Exposure of Rats . Part Fibre Toxicol. 2015;12:21 . doi:10 .1186/ S12989-015-0096-2 . 52 . El-Yamany NA, Mohamed FF, Salaheldin TA, Tohamy AA, Abd El-Mohsen WN, Amin AS . Graphene Oxide Nanosheets Induced Genotoxicity and Pulmonary Injury in Mice . Exp Toxicol Pathol. 2017;69(6):383–392 . doi:10 .1016/J .ETP .2017 .03 .002 . 53 . Mohamed HRH, Welson M, Yaseen AE, El-Ghor A . Induction of Chromosomal and DNA Damage and Histological Alterations by Graphene Oxide Nanoparticles in Swiss Mice . Drug Chem Toxicol. 2021;44(6):631–641 . doi:10 .1080/01480545 .2019 .1643876 . 54 . Liu Y, Luo Y, Wu J et al . Graphene Oxide Can Induce In Vitro and In Vivo Mutagenesis . Sci Rep. 2013;3:3469 . doi:10 .1038/srep03469 . 55 . Sumi N, Chitra KC . Cytogenotoxic Effects of Fullerene C60 in the Freshwater Teleostean Fish, Anabas testudineus (Bloch, 1792) . Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2019;847:503104 . doi:10 .1016/j .mrgentox .2019 .503104 . 56 . Ema M, Tanaka J, Kobayashi N et al . Genotoxicity Evaluation of Fullerene C60 Nanoparticles in a Comet Assay Using Lung Cells of Intratracheally Instilled Rats . Regul Toxicol Pharmacol. 2012; 62(3):419–424 . doi:10 .1016/j .yrtph .2012 .01 .003 . 57 . Totsuka Y, Higuchi T, Imai T et al . Genotoxicity of Nano/Microparticles in In Vitro Micronuclei, In Vivo Comet and Mutation Assay Systems . Part Fibre Toxicol. 2009;6(1):23 . doi:10 .1186/1743 -8977-6-23 . 133 11 REPRODUKČNÍ A VÝVOJOVÁ TOXICITA Reprodukční systém samců a samic je složen z více druhů orgánů a tkání, které jsou rozdílně vnímavé k potenciálně poškozujícím stimulům, včetně expozice uhlíkovým nanomateriálům (CNM) . Reprodukční a vývojová toxicita je dle OSHA (Occupational Safety and Health Administration) a HSC 2012 (Hazard Communication Standard) definována jako substancemi indukovaný nežádoucí efekt, který postihuje sexuální funkce, fertilitu a prenatální i postnatální vývoj .1,2 Do narušení sexuálních funkcí a fertility u obou pohlaví jsou řazeny změny sexuálního chování, strukturní a funkční změny reprodukčního systému a změny, které narušují některou z fázi fertilizace až do procesu implantace embrya v děloze . Příkladem mohou být změny libida, poruchy sexuálních funkcí, endokrinní poruchy, narušení gametogeneze, oplodnění a transportu oplodněného vajíčka do dělohy a implantace embrya do endometria .3 Obecně platí, že embryo a plod (s vysokou úrovní tkáňové proliferace) jsou k působení škodlivých látek vnímavější než již vyvinuté organismy . Z uvedeného důvodu je nutné věnovat velkou pozornost látkám, které jsou schopny penetrovat přes placentární bariéru a kumulovat se ve vyvíjejícím se plodu . Díky svém velikosti patří mezi „potenciálně podezřelé“ i nanomateriály, které mohou ovlivňovat jak reprodukční systém mateřského organismu, tak tkáně embrya a plodu .4,5 11.1 IN VITRO STUDIE Cílem testů reprodukční toxicity je hodnocení účinku látek na tkáně reprodukčních orgánů a na strukturu a funkce pohlavních buněk (spermií a vajíček) . V reprodukci hrají důležitou roli steroidní hormony, které se podílejí na gametogenezi, ovulaci a sexuálním chování . Studie v odborné literatuře přinášejí důkazy o tom, že do procesu steroidogeneze mohou zasahovat i CNM . Například autoři Qu et al . zjistili, že mnohovrstvé uhlíkové nanotrubice (MWCNT) inhibují u potkanů produkci progesteronu v preovulačních buňkách granulózy (produkce progesteronu významně klesala při dávkách 10 a 50 μg/ml / 48 h) . Bylo zjištěno, že expozice MWCNT alteruje expresi steroidogenního proteinu StAR, který transportuje cholesterol z vnější na vnitřní mitochondriální membránu . Zde je za přítomnosti P450scc (klíčového enzymu steroidogeneze) cholesterol metabolizován na pregnenolon (P450scc je enzym ze skupiny cytochromů P450, který odštěpuje postranní řetězec cholesterolu za vzniku pregnenolonu) . Důležitou skutečností bylo, že přerušení expozice 134 MWCNT obnovilo produkci progesteronu (inhibiční účinek je pravděpodobně reverzibilní) . Vedle uvedeného byla popsána také zvýšená produkce volných kyslíkových radikálů (ROS) a narušený mitochondriální membránový potenciál . Zdá se, že MWCNT by mohly mít potenciál endokrinních disruptorů .6 Reprodukční toxicita se samozřejmě in vitro ověřuje na samčích a samičích buňkách pohlavního systému a pohlavních buňkách . Gurunathan et al . testovali vliv oxidu grafenu (GO) na Leydigovy (TM3) a Sertoliho (TM4) samčí zárodečné buňky . Pro expozici použili dva typy GO s průměrem částic 20 nm (GO-20) a 100 nm (GO-100) . Oba typy GO snižovaly viabilitu buněk (silnější vliv byl pozorován u GO-20) . Vlivem expozice docházelo k uvolňování laktátdehydrogenázy a k narušování mitochondriálního membránového potenciálu . Byl pozorován nárůst produkce ROS a poškození DNA (oxidace nukleotidů a tvorba 8-oxo-d-guanosinu) . Expozice snižovala expresi proapoptotických genů (Bax, Bak, p53, p21, kaspáza-3) a zvyšovala expresi antiapoptotických genů (Bcl2), což může být problematické, neboť mohou přežít i poškozené buňky . K účinkům GO (obou typů) byly citlivější Leydigovy buňky .7 V jiné studii (Ji et al .) byly použity Sertoliho buňky a GC-2 spd buňky (myší testikulární zárodečné buněčné linie), které byly exponovány kvantovým tečkám oxidu grafenu (GO-QD) . Uvedená expozice sice neovlivňovala viabilitu buněk, nicméně indukovala proces apoptózy . Pomocí transmisní elektronové mikroskopie bylo zjištěno, že expozice GO-QD zvyšovala počty autofagazómů . Autofagozóm je sférická struktura s dvojitou membránou, která je klíčovou strukturou v procesu makroautofagie (vnitrobuněčný degradační systém cytoplazmatických komponent a mikroorganismů) . Zformovaný autofagozom fúzuje s lysozomem, což umožňuje degradaci sekvestrovaného materiálu . Přestože nebylo zjištěno narušení procesu fúze autofagozomů s lyzozomy, docházelo ke kumulaci nedegradovaného materiálu . Autoři tento jev připisují snížené funkci lyzozomů (snížení funkce lyzozomů je spojeno také se stárnutím a senescencí buněk) .8 GC-2-spd buňky použili také autoři Xu et al . v experimentu s expozicí MWCNT (0,05, 0,25, 0,5 a 1, 5 μg/ml / 24 h) . Od dávky 0,5 μg/ml / 24 h pozorovali kumulaci MWCNT v mitochondriích, což vedlo k narušení jejich funkcí, včetně snížení produkce ATP .9 Reprodukční toxicita MWCNT byla testována také na spermiích bizonů a prasat divokých . Sanand et al . exponovali spermie bizonů MWCNT o koncentracích 1, 10, 25, 50, 75 a 100 µg/ml po dobu 30, 60 a 120 minut . V závislosti na čase a dávce byla pozorována snížená viabilita buněk, závažné narušení integrity buněčné membrány, zvýšené hladiny malondialdehydu (ukazatel oxidačního stresu) a snížená aktivita antioxidačních enzymů (gluthationperoxidázy a superoxiddismutázy) .10 Autoři Bernabò et al . exponovali spermie divočáka suspenzi GO o koncentracích 0,5, 1, 5, 10 a 50 μg/ml . Koncentrace 5–50 μg/ml interagovaly s membránou spermií a narušovaly její fluiditu . Redukovaly viabilitu buněk a narušovaly jejich fertilizační a adhezní kapacitu a integritu akrozomu . Koncentrace 0,5 a 1 μg/ml však fertilizační kapacitu buněk naopak podporovaly . Je zřejmé, že charakter vlivu expozice GO na komponenty reprodukčního systému významně závisí na hladině expozičních koncentracích (dávkách) .11 Zajímavé výsledky přinesly práce zaměřené na vlivy expozice fullerenu (C60) . Například autoři Li et al . exponovali spermie divočáka karboxylovanému fullerenu (C60-COOH; 2 μg/ml; 10 dní) . Expozice zvýšila motilitu spermií, zlepšila integritu akrozomu a zvýšila mitochondriální aktivitu . Došlo rovněž ke snížení hladiny oxidačního stresu .12 Autoři další studie (Türk et al .) přidali do vzorků spermatu beranů hydratovaný fulleren (200 nM, 400 nM, 135 800 nM, 1 µM a 5 µM C60) a následně byly vzorky standardním způsobem zamrazeny . Po rozmrazení vykazovaly vzorky spermií exponované vyšším dávkám C60 lepší motilitu, kvalitnější membrány a vyšší aktivity antioxidačních enzymů (glutathionperoxidáza, kataláza) .13 Ke stejným výsledkům v obdobně strukturovaném experimentu dospěli i autoři Güngör et al . Vzorky spermatu, exponované vyšším dávkám C60, obsahovaly více živých spermií s vyšší mírou motility . Vlivem expozice došlo k poklesu hladin malondialdehydu a nárůstu aktivity glutathionperoxidázy a katalázy .14 Zdá se tedy, že fulleren chrání spermie, a to patrně i díky tomu, že snižuje poškozující oxidační stres . Významné informace přinášejí studie, ve kterých jsou CNM exponovány lidské spermie . Asghar et al . zjistili, že expozice lidských spermií karboxylovaným jednovrstvým uhlíkovým nanotrubicím (SWCNT) vedla ke zvýšení produkce ROS . Stejná expozice spermií redukovanému GO (rGO) však tento účinek nevykázala . Žádná z použitých expozičních koncentrací (1–25 μg/ml) obou použitých typů CNM nesnižovala viabilitu spermií .15 S lidskými spermiemi pracovali také Aminzadeh et al ., kteří studovali důsledek jejich expozice karboxylovaným SWCNT a MWCNT (0,1–100 μg/ml / 5 hod) . Žádný z expozičních CNM nesnižoval viabilitu buněk, nicméně v závislosti na dávce bylo pozorováno snížení jejich motility a zvýšení produkce ROS .16 Vedle samčích pohlavních buněk byla ve studiích pochopitelně věnována pozornost i samičím pohlavním buňkám (oocytům) . Například autoři Lin et al . studovali poškození myších oocytů po expozici kvantovým tečkám grafenu (GQD; 0,5, 1,0 a 1,5 mg/ml; doba 2, 8,5 a 12 hodin) . Expozice GQD narušovala maturaci oocytů; při koncentracích 1 a 1,5 mg/ml docházelo ke snížení extruze prvního polárního tělíska . Rovněž bylo pozorováno zvýšení produkce ROS a poškození DNA . Pomocí elektronové transmisní mikroskopie byla registrována kumulace GQD v blízkosti jádra a mitochondrií, což mělo za následek narušení jejich morfologie a funkcí .17 Tvůrci jiné studie (Lei et al .) exponovali potkaní oocyt-granulózní buňky fullerenolu o koncentracích 1, 10, a 100 μg/ml . Dvouhodinová expozice významně redukovala tvorbu transzonálních protruzí . Transzonální protruze vycházejí z vnitřních vrstev granulózních buněk a vytvářejí „výběžky“, které překračují zóna pelucida a dosahují až k oocytům . Vrstva granulózních buněk obaluje oocyty a transzonální protruze zajišťuje spojení mezi granulózou a oocytem . Takto vzniká funkční komplex, který je nezbytný pro normální vývoj oocytů . Redukce tvorby transzonálních protruzí, popisovaná v daném experimentu, byla závislá na dávce . Expozice fullerenolům snižovala rovněž expresi granulózového konexinu 43, který je důležitou součástí mezibuněčných spojů . Dvouhodinová expozice fullerenolu měla za následek snížení jeho exprese o 56 %, což vedlo ke snížení tvorby cyklického adenosinmonofosfátu v oocytu a k urychlení obnovy meiózy . Uvedený děj má za následek pokles kvality oocytů .18 Důkazy o reprodukční toxicitě fullerenolů však nejsou zcela jednoznačné . Například autoři Mrdanović et al . nenalezli známky genotoxicity (nárůst počtu mikrojader a chromozomálních aberací) u CHO-K1 buněk (ovariálních buněk křečků) ani po relativně vysokých expozicích fullerenolu (11–221 μM / 24 h) . Nižší expoziční hladiny fullerenolů hladiny genotoxických markerů dokonce snižovaly .19 Kultura CHO-K1 buněk byla použita i v dalších experimentech s CNM . Například Yadav et al . tyto buňky exponovali MWCNT . Expozice měla za následek remodelaci cytoskeletu, konkrétně zvýšení počtu cytoplazmatických vakuol a tvorbu lamelopodií (v důsledku polymerizace aktinu) . Remodelace cytoskeletu byla doprovázena zvýšenou expresí genů spojených s cytoskeletem a buněčnou motilitou (Dic-1, kofilin a Rac1) .20 Danute Batiuskaite, Nora 136 Grinceviciute a Valentinas Snitka exponovali CHO-K1 buňky GO (12,5–50,0 μg/ml) . GO snižoval viabilitu buněk v závislosti na dávce (ze 44 % na 11 %), pronikal do buněk a ovlivňoval jejich morfologii, strukturu a schopnost vytvářet kolonie .21 Výsledky in vitro studií tedy naznačují potenciální reprodukční toxicitu CNM, a to již ve fázi produkce pohlavních hormonů, poškození buněk pohlavních orgánů i pohlavních buněk samotných . 11.2 IN VIVO STUDIE S ohledem na závažnost dané problematiky byla reprodukční toxicita testována na široké škále organismů od červů přes hmyz a ryby až po savce, především myši a potkany . Často používanými nižšími experimentálními organismy jsou hlístice, hlavně Caenorhabditis elegans (háďátko obecné) . Na tomto organismu testovali například autoři Kim et al . reprodukční toxicitu GO . Po dvouhodinové expozici koncentraci 10 mg GO / l byl GO distribuován po celém organismu, včetně reprodukčního systému, a po 48 hodinách od podání byla zjištěna kumulace GO okolo zárodečných buněk a embryí . GO narušoval spermatogenezi, snižoval počty spermií, indukoval nárůst oxidačního stresu a narušoval metabolismus tuků .22 Reprodukční toxicitu GO a rGO (5 až 50 mg/l) testovali na Caenorhabditis elegans také autoři Chatterjee et al . Expozice měla za následek kumulaci GO v reprodukčních orgánech . Známky reprodukční toxicity byly patrné již při koncentracích 5 mg/l a koncentrace 50 mg/l reprodukci zcela zablokovaly . Významně nižší míra reprodukční toxicity byla zjištěna u rGO .23 Tvůrci další studie (Zhao et al .) zjistili, že expozice Caenorhabditis elegans GO redukuje reprodukční kapacitu, narušuje vývoj gonád a indukuje apoptózu zárodečných buněk v důsledku poškození DNA a alterace epigenetické signalizace .24 Vedle evidentních projevů reprodukční toxicity GO (vůči Caenorhabditis elegans) nebyla tato forma toxicity pozorována při expozicích Caenorhabditis elegans grafenu a PLA-Gu (poly-lactic acid-graphene) o koncentracích 50 µg/ml až 1000 µg/ml .25 Hojně jsou využívány ke zjišťování reprodukční toxicity také hmyzí modely . Například autoři Kapeta-Kaczmarek et al . dlouhodobě exponovali Acheta domesticus (cvrček domácí) nanodiamantům (ND) v dávkách 20 µg/g a 200 µg/g . Kolonie byly exponovány denně od dvou týdnů po narození do úmrtí posledního cvrčka . Zatímco kontrolní kolonie přežila 28 dní, exponovaná kolonie pouze 21 dní . Expozice ND (zejména vyšší dávka) negativně ovlivnila také produkci vajíček a proces líhnutí . Zatímco samice s nejvyšší expozicí kladly v průběhu 24 hodin průměrně 15 vajíček, samice s nižší expozicí 25 vajíček a kontrolní kolonie dokonce 35 vajíček . Z výsledků je zřejmé, že expozice ND může negativně ovlivňovat plodnost .26 Martins et al . testovali reprodukční toxicitu oxidovaných MWCNT a GO (expozice 10, 100 a 1000 μg/g) na Spodoptera frugiperda (blýskavka kukuřičná) . V závislosti na dávce vyvolaly obě formy expozice snížení fertility a plodnosti . Došlo také ke snížení počtů nakladených a vylíhnutých vajíček .27 Poněkud kontroverzní výsledky přinesly studie reprodukční toxicity prováděné na Drosophila melanogaster (octomilka obecná) . Autoři Philbrook et al . exponovali Drosophila melanogaster hydroxylovaným SWCNT v dávce 10mg/kg . Uvedená dávka nijak neovlivnila porodnost ani plodnost exponovaných organismů .28 Jiné výsledky však uvádějí tvůrci dalšího experimentu (Priyadarsiny et al .), kteří Drosophila melanogaster exponovali GO v dávkách 50 a 300 mg/l a v závislosti na dávce pozorovali nárůst oxidačního stresu (ROS), poškození orgánů a snížený počet vylíhlých much z nakladených vajíček . Rozdíly ve výsledcích autoři 137 přisuzují odlišným expozičním hladinám .29 Nárůst oxidačního stresu vlivem expozice GO pozorovali také Fang et al . Koncentrace 25 mg GO/l indukovala u Bombyx mori (bourec morušový) produkci ROS, což mělo za následek poškození DNA ovariálních buněk, snížení počtu oogonií a oocytů v ovariích a nárůst tvorby vakuol ve folikulárních buňkách . U larev byla zjištěna redukce gonosomatického indexu o 41 % . Rovněž došlo ke snížení exprese genů důležitých pro vývoj ovarií .30 CNM se ve značné míře kumulují ve vodních organismech a mohou významně ovlivňovat jejich reprodukční systémy . Mesarič et al . exponovali Paracentrotus lividus (ježovka dlouhoostrná) GO a sazím (CB, carbon black) koncentracím 0,0001–1,0 mg CNM / l po dobu jedné hodiny . Z výsledků vyplývá, že i nejnižší koncentrace CB (0,0001 mg/l) snižovala (přibližně o 50 %) schopnost spermií oplodnit vajíčka . GO neovlivňoval fertilizaci ani při nejvyšší koncentraci 1,0 mg/l . Zajímavým nálezem byly vývojové anomálie v gastrulách i v larvách po oplodnění spermiemi, které byly vystaveny GO nebo CB .31 Reprodukční toxicitu fullerenu testovali také autoři další studie (Sumi et al .) . Sladkovodní ryby Anabas testudineus (lezoun indický) byly exponováni koncentracím 5 a 10 mg/l krátkodobě (24, 48, 72 a 96 hodin) a dlouhodobě (7, 15, 30 a 60 dní) . Expozice fullerenu obecně snižovala váhu ovarií i varlat a redukovala aktivitu antioxidačního enzymu superoxiddismutázy . Dlouhodobá expozice indukovala závažné histologické změny v ovariích i varlatech . V ovariích byly nalezeny atrezie, ztluštění oocytu během vitelogenní fáze a zcela degenerované oocyty . Ve varlatech byly zjištěny vakuoly, snížený počet spermií a spermatocytů a deformace semenotvorného epitelu . Výsledky experimentu ukazují na výraznou reprodukční toxicitu fullerenu .32 V další studii (Carrillo et al .) byly rybky Danio rerio (dánio pruhované) exponovány po dobu 48 hodin karboxylovaným MWCNT o koncentracích 0,5 a 1,0 ppm . Expozice vedla ke zvýšení oxidačního stresu a k peroxidaci lipidů v ovariální a testikulární tkáni .33 Danio rerio použili ve své studii také Chen et al . Jejich experimenty měly komplexnější charakter a byly zaměřeny na hodnocení míry „endokrinní disrupce“ (změny endokrinních signálů) vlivem společné expozice GO a bisfenolu A . Z výsledků vyplývá, že kombinovaná expozice bisfenolu A a GO (50 a 500 ng/l) indukovala významně vyšší míru toxicity než samostatné expozice těmto látkám . Sedmidenní kombinovaná expozice dospělých samců významně zvyšovala hladiny vitelogeninu a estradiolu a snižovala hladiny testoteronu a folikuly stimulujícího hormonu (FSH) . Samotná expozice GO (koncentrace 250 ng GO/l) nevyvolávala změny v koncentracích hormonů .34 Reprodukční toxicita GO byla zjištěna také u Oryzias latipes (medaka japonská) . Autoři Dasmahapatra et al . podali těmto rybám intraperitoneálně dávky 25 a 200 μg/g a sledovali jejich účinek následujících 21 dní . V závislosti na dávce došlo ke snížení plodnosti již během prvních dní po aplikaci . Dávka 200 μg/g významně snižovala počty vylíhnutých mláďat, ke zvyšování mortality embryí nicméně nedocházelo . Histologická analýza prokázala aglomeráty GO v gonádách . Významnější změny ve folikulogenezi a v Leydigových buňkách zjištěny nebyly .35 Sedmidenní expozice SWCNT (10 a 50 μg/l), v experimentu s Cyprinus carpio (kapr obecný) (Deepa et al .), měla za následek pokles exprese steroidogenních genů a genů souvisejících s varlaty . V séru byly nalezeny snížené hodnoty testosteronu a 11-ketosteronu . Rovněž byla zjištěna změněná morfologie varlat .36 Reprodukční toxicita CNM byla testována i na obojživelnících . Autoři Zhao et al . zjistili, že MWCNT o koncentracích 0,5 a 2,5 mg/l, aplikované 56 dní, inhibovaly růst/vývoj orgánů 144 11.5 LITERATURA 1 . Meyer JD, McDiarmid M, Diaz JH, Baker BA, Hieb M . Reproductive and Developmental Hazard Management . J Occup Environ Med. 2016; 58(3):e94–e102 . doi:10 .1097/JOM .0000000000000669 . 2 . SCHC-OSHA Alliance . Hazard Communication Information Sheet Reflecting the US OSHA Implementation of the Globally Harmonized System (GHS) of Classification and Labelling of Chemicals . Produced by the SCHC-OSHA Alliance on Acute Dermal Toxicity; 2018 . 3 . Tyl RW . Toxicity Testing, Reproductive . In: Encyclopedia of Toxicology . 3 . vyd . Academic Press; 2014 . doi:10 .1016/B978-0-12-386454-3 .00439-5 . 4 . Buerki-Thurnherr T, Schaepper K, Aengenheister L, Wick P . Developmental Toxicity of Nanomaterials: Need for a Better Understanding of Indirect Effects . Chem Res Toxicol. 2018;31(8):641–642 . doi:10 .1021/ACS .CHEMRESTOX .8B00177 . 5 . Dugershaw BB, Aengenheister L, Hansen SSK, Hougaard KS, Buerki-Thurnherr T . Recent Insights on Indirect Mechanisms in Developmental Toxicity of Nanomaterials . Part Fibre Toxicol. 2020;17(1):1–22 . doi:10 .1186/S12989-020-00359-X . 6 . Qu Y, Yang B, Jiang X, Ma X, Lu C, Chen C . Multiwalled Carbon Nanotubes Inhibit Steroidogenesis by Disrupting Steroidogenic Acute Regulatory Protein Expression and Redox Status . J Nanosci Nanotechnol. 2017;17(2):914–925 . doi:10 .1166/jnn .2017 .12647 . 7 . Gurunathan S, Kang MH, Jeyaraj M, Kim JH . Differential Cytotoxicity of Different Sizes of Graphene Oxide Nanoparticles in Leydig (TM3) and Sertoli (TM4) Cells . Nanomaterials. 2019;9(2):139 . doi:10 .3390/nano9020139 . 8 . Ji X, Xu B, Yao M et al . Graphene Oxide Quantum Dots Disrupt Autophagic Flux by Inhibiting Lysosome Activity in GC-2 and TM4 Cell Lines . Toxicology. 2016;374:10–17 . doi:10 .1016/ j .tox .2016 .11 .009 . 9 . Xu C, Liu Q, Liu H, Zhang C, Shao W, Gu A . Toxicological Assessment of Multi-Walled Carbon Nanotubes In Vitro: Potential Mitochondria Effects on Male Reproductive Cells . Oncotarget. 2016;7(26):39270–39278 . doi:10 .18632/oncotarget .9689 . 10 . Sanand S, Kumar S, Bara N, Kaul G . Comparative Evaluation of Half-Maximum Inhibitory Concentration and Cytotoxicity of Silver Nanoparticles and Multiwalled Carbon Nanotubes Using Buffalo Bull Spermatozoa as a Cell Model . Toxicol Ind Health. 2018;34(9):640–652 . doi:10 .1177/0748233718783389 . 11 . Bernabò N, Fontana A, Sanchez MR et al . Graphene Oxide Affects In Vitro Fertilization Outcome by Interacting with Sperm Membrane in an Animal Model . Carbon. 2018;129:428–437 . doi:10 .1016/ j .carbon .2017 .12 .042 . 12 . Li X, Wang L, Liu H et al . C60 Fullerenes Suppress Reactive Oxygen Species Toxicity Damage in Boar Sperm . Nano-Micro Lett. 2019;11(1):1–17 . doi:10 .1007/s40820-019-0334-5 . 13 . Türk G, Koca RH, Güngör İH et al . Effect of Hydrated C60 Fullerene on Lipid, Vitamin and Amino Acid Composition in Frozen-Thawed Ram Semen . Anim Reprod Sci. 2022;238:106939 . doi:10 .1016/J .ANIREPROSCI .2022 .106939 . 14 . Güngör İH, Dayan Cinkara S, Acısu TC et al . Effect of Hydrated Carbon 60 Fullerene on Frozen Ram Semen Quality . Biopreserv Biobank. 2022;20(4):340–347 . doi:10 .1089/bio .2021 .0001 . 15 . Asghar W, Shafiee H, Velasco V et al . Toxicology Study of Single-Walled Carbon Nanotubes and Reduced Graphene Oxide in Human Sperm . Sci Rep. 2016;6(1):1–11 . doi:10 .1038/srep30270 . 16 . Aminzadeh Z, Jamalan M, Chupani L et al . In Vitro Reprotoxicity of Carboxyl-Functionalised Singleand Multi-Walled Carbon Nanotubes on Human Spermatozoa . Andrologia. 2017;49(9):e12741 . doi:10 .1111/and .12741 . 17 . Lin YH, Zhuang SX, Wang YL et al . The Effects of Graphene Quantum Dots on the Matura tion of Mouse Oocytes and Development of Offspring . J Cell Physiol. 2019;234(8):13820–13831 . doi:10 .1002/jcp .28062 . 145 18 . Lei R, Bai X, Chang Y et al . Effects of Fullerenol Nanoparticles on Rat Oocyte Meiosis Resumption . Int J Mol Sci. 2018;19(3):699 . doi:10 .3390/ijms19030699 . 19 . Mrdanović J, Šolajić S, Bogdanović V, Stankov K, Bogdanović G, Djordjevic A . Effects of Fullerenol C60(OH)24 on the Frequency of Micronuclei and Chromosome Aberrations in CHO-K1 Cells . Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2009;680(1–2):25–30 . doi:10 .1016/j .mrgentox .2009 .08 .008 . 20 . Yadav K, Ali SA, Mohanty AK, Muthusamy E, Subaharan K, Kaul G . MSN, MWCNT and ZnO Nanoparticle-Induced CHO-K1 Cell Polarisation is Linked to Cytoskeleton Ablation . J Nanobiotechnol. 2021;19(1):1–24 . doi:10 .1186/s12951-021-00779-7 . 21 . Batiuskaite D, Grinceviciute N, Snitka V . Impact of Graphene Oxide on Viability of Chinese Hamster Ovary and Mouse Hepatoma MH-22A Cells . Toxicol In Vitro. 2015;29(5):1195–1200 . doi:10 .1016/j .tiv .2015 .05 .004 . 22 . Kim Y, Jeong J, Yang J, Joo SW, Hong J, Choi J . Graphene Oxide Nano-Bio Interaction Induces Inhibition of Spermatogenesis and Disturbance of Fatty Acid Metabolism in the Nematode Caenorhabditis elegans . Toxicology. 2018;410:83–95 . doi:10 .1016/j .tox .2018 .09 .006 . 23 . Chatterjee N, Yang JS, Park K, Oh SM, Park J, Choi J . Screening of Toxic Potential of Graphene Family Nanomaterials Using In Vitro and Alternative In Vivo Toxicity Testing Systems . Environ Health Toxicol. 2015;30:e2015007 . doi:10 .5620/eht .e2015007 . 24 . Zhao Y, Wu Q, Wang D . An Epigenetic Signal Encoded Protection Mechanism is Activated by Graphene Oxide to Inhibit Its Induced Reproductive Toxicity in Caenorhabditis elegans . Biomaterials. 2016;79:15–24 . doi:10 .1016/j .biomaterials .2015 .11 .052 . 25 . Kong C, Aziz AI, Kakarla AB, Kong I, Kong W . Toxicity Evaluation of Graphene and Poly(Lactic- -Acid) Using a Nematode Model . Solid State Phenom. 2019;290:101–106 . doi:10 .4028/www .scientific .net/SSP .290 .101 . 26 . Karpeta-Kaczmarek J, Kędziorski A, Augustyniak-Jabłokow MA, Dziewięcka M, Augustyniak M . Chronic Toxicity of Nanodiamonds Can Disturb Development and Reproduction of Acheta domesticus L . Environ Res. 2018;166:602–609 . doi:10 .1016/j .envres .2018 .05 .027 . 27 . Martins CHZ, de Sousa M, Fonseca LC, Martinez DST, Alves OL . Biological Effects of Oxidized Carbon Nanomaterials (1D Versus 2D) on Spodoptera frugiperda: Material Dimensionality Influences on the Insect Development, Performance and Nutritional Physiology . Chemosphere. 2019;215:766–774 . doi:10 .1016/j .chemosphere .2018 .09 .178 . 28 . Philbrook NA, Walker VK, Afrooz ARMN, Saleh NB, Winn LM . Investigating the Effects of Functionalized Carbon Nanotubes on Reproduction and Development in Drosophila melanogaster and CD-1 Mice . Reprod Toxicol. 2011;32(4):442–448 . doi:10 .1016/j .reprotox .2011 .09 .002 . 29 . Priyadarsini S, Sahoo SK, Sahu S, Mukherjee S, Hota G, Mishra M . Oral Administration of Graphene Oxide Nano-Sheets Induces Oxidative Stress, Genotoxicity, and Behavioral Teratogenicity in Drosophila melanogaster . Environ Sci Pollut Res. 2019;26(19):19560–19574 . doi:10 .1007/s11356 -019-05357-x . 30 . Fang Y, Lu Z, Li M et al . An Assessment of the Reproductive Toxicity of GONPs Exposure to Bombyx mori . Ecotoxicol Environ Saf. 2021;210:111888 . doi:10 .1016/j .ecoenv .2020 .111888 . 31 . Mesarič T, Sepčić K, Drobne D et al . Sperm Exposure to Carbon-Based Nanomaterials Causes Abnormalities in Early Development of Purple Sea Urchin (Paracentrotus lividus) . Aquat Toxicol. 2015;163:158–166 . doi:10 .1016/j .aquatox .2015 .04 .012 . 32 . Sumi N, Chitra KC . Fullerene C60 Nanomaterial Induced Oxidative Imbalance in Gonads of the Freshwater Fish, Anabas testudineus (Bloch, 1792) . Aquat Toxicol. 2019;210:196–206 . doi:10 .1016/ j .aquatox .2019 .03 .003 . 33 . Carrillo Y, Torres-Duarte C, Oviedo MJ, Hirata GA, Huerta-Saquero A, Vazquez-Duhalt R . Lipid Peroxidation and Protein Oxidation Induced by Different Nanoparticles in Zebrafish Organs . Appl Ecol Environ Res. 2015;13(3):709–723 . doi:10 .15666/aeer/1303_709723 . 146 34 . Chen P, Yang J, Wang R et al . Graphene Oxide Enhanced the Endocrine Disrupting Effects of Bisphenol A in Adult Male Zebrafish: Integrated Deep Learning and Metabolomics Studies . Sci Total Environ. 2022;809:151103 . doi:10 .1016/j .scitotenv .2021 .151103 . 35 . Dasmahapatra AK, Powe DK, Dasari TPS, Tchounwou PB . Assessment of Reproductive and Developmental Effects of Graphene Oxide on Japanese Medaka (Oryzias latipes) . Chemosphere. 2020;259:127221 . doi:10 .1016/j .chemosphere .2020 .127221 . 36 . Deepa S, Mamta SK, Anitha A, Senthilkumaran B . Exposure of Carbon Nanotubes Affects Testis and Brain of Common Carp . Environ Toxicol Pharmacol. 2022;95:103957 . doi:10 .1016/ J .ETAP .2022 .103957 . 37 . Zhao J, Luo W, Xu Y, Ling J, Deng L . Potential Reproductive Toxicity of Multi-Walled Carbon Nanotubes and Their Chronic Exposure Effects on the Growth and Development of Xenopus tropicalis . Sci Total Environ. 2021;766:142652 . doi:10 .1016/j .scitotenv .2020 .142652 . 38 . Zhang D, Zhang Z, Wu Y et al . Systematic Evaluation of Graphene Quantum Dot Toxicity to Male Mouse Sexual Behaviors, Reproductive and Offspring Health . Biomaterials. 2019;194:215–232 . doi:10 .1016/j .biomaterials .2018 .12 .001 . 39 . Skovmand A, Jacobsen Lauvås A, Christensen P, Vogel U, Sørig Hougaard K, Goericke-Pesch S . Pulmonary Exposure to Carbonaceous Nanomaterials and Sperm Quality . Part Fibre Toxicol. 2018;15(1):1–12 . doi:10 .1186/s12989-018-0242-8 . 40 . Liang S, Xu S, Zhang D, He J, Chu M . Reproductive Toxicity of Nanoscale Graphene Oxide in Male Mice . Nanotoxicology. 2015;9(1):92–105 . doi:10 .3109/17435390 .2014 .893380 . 41 . Farshad O, Heidari R, Zamiri MJ et al . Spermatotoxic Effects of Single-Walled and Multi-Walled Carbon Nanotubes on Male Mice . Front Vet Sci. 2020;7:591558 . doi:10 .3389/fvets .2020 .591558 . 42 . Akhavan O, Ghaderi E, Hashemi E, Akbari E . Dose-Dependent Effects of Nanoscale Graphene Oxide on Reproduction Capability of Mammals . Carbon. 2015;95:309–317 . doi:10 .1016/j .carbon .2015 .08 .017 . 43 . Hougaard KS, Jackson P, Kyjovska ZO et al . Effects of Lung Exposure to Carbon Nanotubes on Female Fertility and Pregnancy . A Study in Mice . Reprod Toxicol. 2013;41:86–97 . doi:10 .1016/ j .reprotox .2013 .05 .006 . 44 . Johansson HKL, Hansen JS, Elfving B et al . Airway Exposure to Multi-Walled Carbon Nanotubes Disrupts the Female Reproductive Cycle without Affecting Pregnancy Outcomes in Mice . Part Fibre Toxicol. 2017;14:17 . doi:10 .1186/s12989-017-0197-1 . 45 . National Toxicology Program . Toxicity Studies of Fullerene C60 (1 μm and 50 nm) Administered by Nose-Only Inhalation to Wistar Han [Crl(Han)] Rats and B6C3F1/N Mice . Toxic Rep Ser. 2020;(87) . doi:10 .22427/NTP-TOX-87 . 46 . Nirmal NK, Awasthi KK, John PJ . Effects of Nano-Graphene Oxide on Testis, Epididymis and Fertility of Wistar Rats . Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2017;121(3):202–210 . doi:10 .1111/bcpt .12782 . 47 . Nirmal NK, Awasthi KK, John PJ . Effects of Hydroxyl-Functionalized Multiwalled Carbon Nanotubes on Sperm Health and Testes of Wistar Rats . Toxicol Ind Health. 2017;33(6):519–529 . doi:10 .1177/0748233716685661 . 48 . Farombi EO, Adedara IA, Forcados GE, Anao OO, Agbowo A, Patlolla AK . Responses of Testis, Epididymis, and Sperm of Pubertal Rats Exposed to Functionalized Multiwalled Carbon Nanotubes . Environ Toxicol. 2016;31(5):543–551 . doi:10 .1002/tox .22067 . 49 . Liu B, Campo EM, Bossing T . Drosophila Embryos as Model to Assess Cellular and Developmental Toxicity of Multi-Walled Carbon Nanotubes (MWCNT) in Living Organisms . PLoS One. 2014;9(2):e88681 . doi:10 .1371/journal .pone .0088681 . 50 . Dziewięcka M, Flasz B, Rost-Roszkowska M, Kędziorski A, Kochanowicz A, Augustyniak M . Graphene Oxide as a New Anthropogenic Stress Factor – Multigenerational Study at the Molecular, Cellular, Individual and Population Level of Acheta domesticus . J Hazard Mater. 2020;396:122775 . doi:10 .1016/j .jhazmat .2020 .122775 . 147 51 . Martínez-Paz P, Negri V, Esteban-Arranz A, Martínez-Guitarte JL, Ballesteros P, Morales M . Effects at Molecular Level of Multi-Walled Carbon Nanotubes (MWCNT) in Chironomus riparius (Diptera) Aquatic Larvae . Aquat Toxicol. 2019;209:42–48 . doi:10 .1016/j .aquatox .2019 .01 .017 . 52 . Zhu B, Zhu S, Li J, Hui X, Wang GX . The Developmental Toxicity, Bioaccumulation and Distribution of Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes in Artemia salina . Toxicol Res. 2018;7(5): 897–906 . doi:10 .1039/c8tx00084k . 53 . D’Amora M, Camisasca A, Lettieri S, Giordani S . Toxicity Assessment of Carbon Nanomaterials in Zebrafish During Development . Nanomaterials. 2017;7(12):414 . doi:10 .3390/nano7120414 . 54 . Yang X, Yang Q, Zheng G et al . Developmental Neurotoxicity and Immunotoxicity Induced by Graph ene Oxide in Zebrafish Embryos . Environ Toxicol. 2019;34(4):415–423 . doi:10 .1002/ tox .22695 . 55 . Bangeppagari M, Park SH, Kundapur RR, Lee SJ . Graphene Oxide Induces Cardiovascular Defects in Developing Zebrafish (Danio rerio) Embryo Model: In-Vivo Toxicity Assessment . Sci Total Environ. 2019;673:810–820 . doi:10 .1016/j .scitotenv .2019 .04 .082 . 56 . Jaworski S, Strojny-Cieślak B, Wierzbicki M et al . Comparison of the Toxicity of Pristine Graphene and Graphene Oxide, Using Four Biological Models . Materials. 2021;14(15):4250 . doi:10 .3390/ ma14154250 . 57 . Chen Y, Hu X, Sun J, Zhou Q . Specific Nanotoxicity of Graphene Oxide During Zebrafish Embryogenesis . Nanotoxicology. 2016;10(1):42–52 . doi:10 .3109/17435390 .2015 .1005032 . 58 . Lopez RM, White JR, Truong L, Tanguay RL . Sizeand Oxidation-Dependent Toxicity of Graphene Oxide Nanomaterials in Embryonic Zebrafish . Nanomaterials. 2022;12(7):1050 . doi:10 .3390/ nano12071050 . 59 . Falinski MM, Garland MA, Hashmi SM, Tanguay RL, Zimmerman JB . Establishing Structure- -Property-Hazard Relationships for Multi-Walled Carbon Nanotubes: The Role of Aggregation, Surface Charge, and Oxidative Stress on Embryonic Zebrafish Mortality . Carbon. 2019;155:587–600 . doi:10 .1016/j .carbon .2019 .08 .063 . 60 . Martinez CS, Igartúa DE, Czarnowski I, Feas DA, Alonso S del V, Prieto MJ . Biological Response and Developmental Toxicity of Zebrafish Embryo and Larvae Exposed to Multi-Walled Carbon Nanotubes with Different Dimension . Heliyon. 2019;5(8):e02308 . doi:10 .1016/j .heliyon .2019 .e02308 . 61 . Zhu X, Zhu L, Li Y, Duan Z, Chen W, Alvarez PJJ . Developmental Toxicity in Zebrafish (Danio rerio) Embryos After Exposure to Manufactured Nanomaterials: Buckminsterfullerene Aggregates (nC60) and Fullerol . Environ Toxicol Chem. 2007;26(5):976–979 . doi:10 .1897/06-583 .1 . 62 . Wang W, Zhao X, Ren X, Duan X . Antagonistic Effects of Multi-Walled Carbon Nanotubes and BDE-47 in Zebrafish (Danio rerio): Oxidative Stress, Apoptosis and DNA Damage . Aquat Toxicol. 2020;225:105546 . doi:10 .1016/j .aquatox .2020 .105546 . 63 . Jurgelėnė Ž, Montvydienė D, Šemčuk S et al . The Impact of Co-Treatment with Graphene Oxide and Metal Mixture on Salmo trutta at Early Development Stages: The Sorption Capacity and Potential Toxicity . Sci Total Environ. 2022;838:156525 . doi:10 .1016/j .scitotenv .2022 .156525 . 64 . Sawosz E, Jaworski S, Kutwin M et al . Toxicity of Pristine Graphene in Experiments in a Chicken Embryo Model . Int J Nanomedicine. 2014;9(1):3913–3922 . doi:10 .2147/IJN .S65633 . 65 . Szmidt M, Sawosz E, Urbańska K et al . Toxicity of Different Forms of Graphene in a Chicken Embryo Model . Environ Sci Pollut Res. 2016;23(19):19940–19948 . doi:10 .1007/s11356-016 -7178-z . 66 . Kurantowicz N, Sawosz E, Halik G et al . Toxicity Studies of Six Types of Carbon Nanoparticles in a Chicken-Embryo Model . Int J Nanomedicine. 2017;12:2887–2898 . doi:10 .2147/IJN .S131960 . 67 . Jaworski S, Hinzmann M, Sawosz E et al . Interaction of Different Forms of Graphene with Chicken Embryo Red Blood Cells . Environ Sci Pollut Res. 2017;24(27):21671–21679 . doi:10 .1007/s11356 -017-9788-5 . 148 68 . Liu X, Zhang F, Wang Z, Zhang T, Teng C, Wang Z . Altered Gut Microbiome Accompanying with Placenta Barrier Dysfunction Programs Pregnant Complications in Mice Caused by Graphene Oxide . Ecotoxicol Environ Saf. 2021;207:111143 . doi:10 .1016/j .ecoenv .2020 .111143 . 69 . Fujitani T, Ohyama KI, Hirose A, Nishimura T, Nakae D, Ogata A . Teratogenicity of Multi-Wall Carbon Nanotube (MWCNT) in ICR Mice . J Toxicol Sci. 2012;37(1):81–89 . doi:10 .2131/jts .37 .81 . 70 . Fu C, Liu T, Li L, Liu H, Liang Q, Meng X . Effects of Graphene Oxide on the Development of Offspring Mice in Lactation Period . Biomaterials. 2015;40:23–31 . doi:10 .1016/j .biomaterials .2014 .11 .014 . 71 . Cao Z, Su M, Wang H et al . Carboxyl Graphene Oxide Nanoparticles Induce Neurodevelopmental Defects and Locomotor Disorders in Zebrafish Larvae . Chemosphere. 2021;270:128611 . doi:10 .1016/j .chemosphere .2020 .128611 . PRAKTICKÁ ČÁST [Document text truncated for crawler view.]