Caracterização epidemiológica da criptosporidiose em Portugal, por estudo molecular de isolados de Cryptosporidium spp. de humanos e de animais

UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA Instituto de Higiene e Medicina Tropical Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses Caracterização epidemiológica da criptosporidiose em Portugal, por estudo molecular de isolados de Cryptosporidium spp. de humanos e de animais Maria Margarida Ferreira Alves Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Ciências Biomédicas, especialidade de Parasitologia, pela Universidade Nova de Lisboa, Instituto de Higiene e Medicina Tropical. Orientador: Prof. Doutor Francisco José Nunes Antunes Lisboa 2006 i O presente trabalho foi realizado na Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, Unidade de Parasitologia e Microbiologia Médicas do Instituto de Higiene e Medicina Tropical e na “Division of Parasitic Diseases” do “Centers for Disease Control and Prevention”. A doutoranda usufruiu de uma Bolsa de Doutoramento da Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH / BD / 2898 / 2000) ii Aos meus PAIS, que tantas vezes renunciaram a si mesmos, em benefício da minha formação. A DEUS, pela inspiração e força com que me guiou nesta caminhada. iii AGRADECIMENTOS Ao Prof. Doutor Francisco Antunes, meu orientador, agradeço a confiança depositada no meu trabalho, o apoio e o incentivo à minha formação e valorização e as oportunidades que me proporcionou. À Prof.ª Doutora Maria Amélia Grácio, agradeço a amabilidade de ter acedido fazer parte da comissão tutorial deste trabalho de doutoramento. À Prof.ª Doutora Olga Matos, que co-orientou este trabalho, pelo ânimo, apoio e ensinamentos que me dispensou, o meu muito obrigada. Ao Doutor Lihua Xiao, agradeço a extraordinária oportunidade de me ter recebido no seu laboratório, os ensinamentos, a pronta disponibilidade e a preciosa ajuda que me concedeu. Ao Doutor Irshad Sulaiman, expresso o meu reconhecimento pelo modo amigo com que me acolheu, me ensinou e me ajudou durante a minha permanência no CDC. À Prof.ª Doutora Isabel Fonseca, à Dr.ª Esmeralda Delgado e à Dr.ª Ana Mafalda Lourenço, agradeço a cedência dos isolados de gado bovino e de animais silváticos que foram caracterizados neste trabalho. À Dr.ª Ana Mafalda Lourenço, ao Dr. Joaquim Henriques e à Dr.ª Maria d’Aires, deixo o meu sincero agradecimento pelo empenho e entusiasmo na recolha de material biológico dos animais de companhia. À Dr.ª Margarida Barão da Cunha, do Jardim Zoológico de Lisboa, estou grata pelo seu interesse e entusiástica cooperação neste trabalho. Agradeço, ainda, a todos os funcionários do Jardim Zoológico de Lisboa que colaboraram na recolha das amostras. À Vanessa Lemos, pela inestimável e incansável ajuda em tantos diagnósticos parasitológicos e, também, pela sua alegria, incentivo e amizade, o meu reconhecido agradecimento. Aos inúmeros colegas que passaram pela Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses e que comigo “dividiram” a bancada de trabalho, em particular, às “residentes” Luísa Lobo e Marina Costa, agradeço a amizade, o companheirismo, a ajuda, a boa disposição e o óptimo ambiente de trabalho. iv Ao Sr. Luís Filipe Marto, do Gabinete de Desenho e Audiovisuais do IHMT, que elaborou os desenhos presentes neste trabalho, o meu sincero agradecimento pelo auxílio e disponibilidade dispensados. A todos os funcionários do IHMT, em particular, a D. Arminda Barbosa, a D. Flora Silva, a D. Florbela Almeida, a D. Gracinda Santos, a D. Leónia Bernardes, a D. Manuela Moniz, a D. Maria da Luz Noras e a D. Rosa Botão o meu agradecimento, pela sã convivência, pela ajuda e pela amizade que sempre me dedicaram. Aos meus familiares e amigos, pela amizade, incentivo e paciência com que me acompanharam nesta caminhada. Muito obrigada pela vossa presença na minha vida. Aos meus pais, Armando e Maria do Carmo, sem os quais nada na minha vida teria sido possível, expresso a minha profunda gratidão pelo carinho e dedicação permanentes, pela inestimável ajuda, pela infinita paciência e pelo seu exemplo de integridade, perseverança, generosidade e humildade. A todos os que, de algum modo, contribuíram para a minha chegada ao fim desta etapa e que, por falha não intencional, não foram aqui mencionados, o meu sincero agradecimento. À Fundação para a Ciência e Tecnologia, Ministério da Ciência e Ensino Superior, agradeço a atribuição da bolsa de doutoramento. v RESUMO Cryptosporidium spp. é um protozoário ubíquo causador de patologia gastrintestinal em humanos e animais. A infecção ocorre por ingestão de oocistos, após contacto directo com pessoas – transmissão antroponótica – ou outros animais infectados – transmissão zoonótica – podendo, ainda, ocorrer, indirectamente, através da água ou de alimentos contaminados. A importância relativa dos diferentes modos de transmissão, não se encontra, ainda, esclarecida. A criptosporidiose humana está associada, sobretudo, à infecção por C. hominis e por C. parvum, embora se encontrem descritos, também, casos de infecção por C. felis, C. meleagridis, C. muris, C. canis, C. suis e Cryptosporidium genótipo cervo. Com o presente trabalho pretendeu-se determinar as espécies e genótipos de Cryptosporidium que, em Portugal, se encontram associadas, quer à infecção humana, quer à infecção em gado doméstico, animais de companhia e animais silváticos, a fim de identificar, não só os parasitas infectantes para o Homem, como, também, os seus possíveis reservatórios zoonóticos. Para além disso, foi, ainda, objectivo deste trabalho, contribuir para a compreensão do papel desempenhado pelas vias de transmissão zoonótica e antroponótica na epidemiologia da criptosporidiose humana no nosso País. Na população de infectados por VIH, com sintomatologia gastrintestinal, que estudámos, entre Junho de 2001 e Janeiro de 2005, foi encontrada a percentagem de infecção por Cryptosporidium spp. de 8,3% (18/217). Nos animais de companhia, a taxa de infecção obtida para gatos com dono e para cães com e sem dono foi de, respectivamente, 1,8% (2/109) e 0% (0/157). Nos animais silváticos de vida livre estudados, carnívoros e pequenos mamíferos, não foi encontrada infecção por Cryptosporidium spp.. Nos animais do Jardim Zoológico de Lisboa, apenas foram encontrados oocistos em duas amostras fecais de mamíferos, uma de um bisonte americano e, outra, de um gnu de cauda branca, correspondendo a uma percentagem de amostras positivas de 0,9% (2/217); também foram observados oocistos numa amostra fecal de uma tartaruga estrela indiana que havia chegado recentemente ao Jardim Zoológico. A caracterização molecular de isolados humanos de Cryptosporidium spp., detectados entre 1994 e 2005, permitiu identificar, ao nível da espécie, 51 parasitas: 52,9% (27/51) pertenciam à espécie C. parvum, 31,4% (16/51) a C. hominis, 9,8% (5/51) a C. felis e 5,9% (3/51) a C. meleagridis. No que se refere aos criptosporídeos de hospedeiros não humanos – gado doméstico e ruminantes silváticos (gamos da Tapada Nacional de Mafra e Bovídeos do vi Jardim Zoológico de Lisboa), estudados retrospectivamente, e gatos e animais do Jardim Zoológico, estudados prospectivamente –, nos casos em que a amplificação do DNA foi bem sucedida, os resultados da sua caracterização molecular mostraram que: i) 94% (80/85) dos isolados bovinos e todos os isolados de ovinos (n = 2), de gamos da Tapada de Mafra (n = 4) e de Bovídeos do Jardim Zoológico (n = 11) pertenciam à espécie C. parvum; ii) 2,4% (2/85) dos isolados bovinos pertenciam à espécie C. bovis; iii) 2,4% (2/85) dos isolados bovinos pertenciam à espécie C. andersoni; iv) 1,2% (1/85) dos isolados bovinos pertenciam ao genótipo semelhante ao do gamo; v) os isolados detectados nos dois gatos pertenciam à espécie C. felis; vi) os parasitas encontrados nas fezes do bisonte americano, do gnu de cauda branca e da tartaruga estrela indiana pertenciam, respectivamente, ao genótipo rato, a um genótipo novo e ao genótipo tartaruga. Entre as espécies e genótipos identificados nos isolados animais, duas – C. parvum e C. felis – foram, também, encontradas em infecções humanas, facto que nos leva a considerar os seus respectivos hospedeiros – gado doméstico, ruminantes silváticos e gatos – como possíveis reservatórios zoonóticos da infecção humana. A determinação da diversidade intra-específica de C. hominis e de C. parvum foi realizada por caracterização molecular de um locus de microssatélites – ML2 – e do gene GP60. A análise de fragmentos por metodologia fluorescente do STR ML2, revelou a ausência de variabilidade genética em C. hominis e permitiu caracterizar, somente, 47% (8/17) dos isolados de C. parvum humanos estudados; a presença de múltiplos picos nos electroforetogramas dos restantes parasitas de origem humana e nos de todos os outros animais impediu a identificação dos seus alelos. Os dois alelos identificados nos oito isolados de C. parvum humanos – ML2-176 e ML2-191 – não foram encontrados em nenhum dos parasitas de gado doméstico ou de ruminantes silváticos. Em virtude da impossibilidade de identificar o alelo de todos os parasitas da espécie C. parvum em estudo, a caracterização do locus ML2 mostrou ser de pouca utilidade para o nosso trabalho. A caracterização do gene GP60, permitiu identificar nove famílias de subtipos, quatro em C. parvum e cinco em C. hominis. Entre os parasitas da espécie C. parvum, os de origem humana apresentaram maior variabilidade de subtipos do que os de gado bovino e de ruminantes silváticos. A maioria dos isolados de gado bovino (61/72), um de gado ovino, um de gamos da Tapada de Mafra e todos os dos Bovídeos do Jardim Zoológico (n = 9) apresentaram o mesmo subtipo – IIaA15G2R1 –, o qual foi, também, encontrado em nove isolados humanos. O segundo subtipo de C. parvum mais frequente em isolados bovinos – IIaA16G2R1 – não foi vii encontrado em isolados humanos. Os dois subtipos menos frequentes em gado bovino e ovino – IIdA17G1 e IIdA21G1 – foram, também, identificados em isolados humanos. Em alguns parasitas humanos de C. parvum foram, ainda, encontrados quatro subtipos, pertencentes a três famílias, não identificados nos isolados de gado doméstico ou de ruminantes silváticos – IIbA14, IIcA5G3, IIdA19G1 e IIdA22G1. O facto de, em Portugal, isolados de C. parvum com o mesmo subtipo terem sido encontrados em infecções, não só humanas, como, também, de gado doméstico e de ruminantes silváticos indica que a sua transmissão ao Homem pode ocorrer pela via zoonótica e, também, pela antroponótica. Ainda, a identificação, em isolados de C. parvum humanos, de famílias/subtipos não encontrados nos animais, coloca a hipótese destes parasitas serem transmitidos ao Homem, unicamente, pela via antroponótica. Em suma, os resultados obtidos no presente trabalho sugerem que, em Portugal, a transmissão de C. parvum ao Homem envolve dois grupos de parasitas, um constituído por aqueles que são transmitidos, quer pela via zoonótica, quer pela antroponótica e, outro, composto pelos que são veiculados, exclusivamente, pela via antroponótica. viii SUMMARY Cryptosporidium species are protozoan parasites that emerged worldwide as a cause of diarrhoeal disease in humans and animals. Infection can be transmitted through person-toperson – anthroponotic transmission –, animal-to-person contact – zoonotic transmission – or by ingestion of contaminated water or food. The influence of each transmission route in the transmission dynamics of cryptosporidiosis is not yet fully understood. Although human infections are caused, mainly, by C. parvum and C. hominis, several other species have also been associated with human disease – C. felis, C. meleagridis, C. muris, C. canis, C. suis and Cryptosporidium cervine genotype. With this work we intended to identify the Cryptosporidium species and genotypes responsible for human infections in Portugal as well as those that parasitize cattle, pets and wild animals, in order to determine which ones are infectious for humans and also their possible zoonotic reservoirs. In addition, we also intended to establish the role of each transmission route in the epidemiology of cryptosporidiosis in Portugal. The rate of Cryptosporidium spp. infection in the HIV-infected patients with gastrointestinal symptoms, studied between June 2001 and January 2005, was 8,3% (18/217). In pets, 1,8% (2/109) of the privately owned cats and 0% (0/157) of the privately owned and shelter dogs were excreting Cryptosporidium spp. oocysts. In free-ranging wild animals, carnivores and small mammals, no oocysts were found in the faecal samples studied. In animals kept at the Lisbon Zoo, the rate of positive faecal samples among the mammals examined was 0,9% (2/217), corresponding to a black wildebeest and a prairie bison excreting oocysts in their faeces; Cryptosporidium spp. was also found in the faeces of an indian star tortoise newly arrived at the Zoo. Molecular characterization of human Cryptosporidium spp. isolates, detected between 1994 and 2005, was successfully accomplished for fifty-one parasites: 52,9% (27/51) were identified as C. parvum, 31,4% (16/51) as C. hominis, 9,8% (5/51) as C. felis and 5,9% (3/51) as C. meleagridis. Concerning the parasites from non-human hosts – cattle and wild ruminants (fallow deers from Tapada Nacional de Mafra and Bovids from the Lisbon Zoo), studied retrospectively, and cats and Zoo animals, studied prospectively – in those with positive DNA amplification, the results of its molecular characterization showed that: i) 94% (80/85) of the bovine isolates and all the isolates from sheep (n = 2), fallow deers from xv 10.3 Espécies e genótipos encontrados em outros hospedeiros vertebrados ............. 62 10.4 Identificação de espécies e de genótipos encontrados na água .......................... 65 10.5 Variação intra-específica em C. parvum e C. hominis ....................................... 67 SEGUNDA PARTE – CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DA CRIPTOSPORIDIOSE EM PORTUGAL ................................................................................ 70 CAPÍTULO I – OBJECTIVOS ................................................................................................ 71 CAPÍTULO II – MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 73 1. População estudada ...................................................................................................... 74 1.1 População humana ................................................................................................ 74 1.2 População animal ................................................................................................. 74 1.2.1 Gado bovino e ovino ................................................................................. 75 1.2.2 Animais de companhia .............................................................................. 75 1.2.3 Animais silváticos de vida livre ................................................................ 76 1.2.4 Animais silváticos em cativeiro ................................................................ 77 2. Diagnóstico parasitológico ........................................................................................... 80 2.1 Concentração das amostras fecais ........................................................................ 80 2.2 Coloração diferencial ........................................................................................... 80 2.3 Observação microscópica ..................................................................................... 81 3. Extracção de DNA genómico de Cryptosporidium spp. .............................................. 82 3.1 Preparação dos oocistos para extracção de DNA ................................................. 82 3.2 Método Mini-BeadBeater/Sílica ........................................................................... 82 3.3 Método KOH/Qiagen ........................................................................................... 83 4. Caracterização molecular de isolados de Cryptosporidium spp. .................................. 85 4.1 Amplificação de DNA genómico por PCR .......................................................... 85 4.2 Visualização do DNA amplificado ....................................................................... 88 4.3 Hidrólise do DNA amplificado por endonucleases de restrição – RFLP ............. 88 4.4 Purificação e sequenciação dos fragmentos amplificados por PCR ..................... 89 4.5 Análise bioinformática ......................................................................................... 90 5. Caracterização molecular intra-específica de C. parvum e C. hominis ........................ 91 5.1 Análise de microssatélites .................................................................................... 91 5.2 Caracterização molecular do gene GP60 .............................................................. 93 xvi 5.2.1 Amplificação de DNA genómico por PCR ............................................... 93 5.2.2 Purificação e sequenciação dos fragmentos amplificados por PCR .......... 95 5.2.3 Análise bioinformática .............................................................................. 97 CAPÍTULO III – INFECÇÃO POR CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM DOENTES INFECTADOS POR VIH ........................................................................................................ 98 1. Introdução ..................................................................................................................... 99 2. Resultados .................................................................................................................... 99 3. Discussão ...................................................................................................................... 101 CAPÍTULO IV – INFECÇÃO POR CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ANIMAIS DE COMPANHIA E SILVÁTICOS ............................................................................................. 104 1. Introdução ..................................................................................................................... 105 2. Resultados .................................................................................................................... 106 2.1. Animais de companhia ........................................................................................ 106 2.2. Animais silváticos de vida livre .......................................................................... 107 2.3. Animais silváticos em cativeiro .......................................................................... 107 3. Discussão ...................................................................................................................... 108 3.1. Animais de companhia ........................................................................................ 108 3.2. Animais silváticos de vida livre .......................................................................... 110 3.3. Animais silváticos em cativeiro .......................................................................... 113 CAPÍTULO V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. ....................................................................... 116 1. Introdução ..................................................................................................................... 117 2. Resultados .................................................................................................................... 119 3. Discussão ...................................................................................................................... 129 CAPÍTULO VI – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS ANIMAIS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. ..................................................................... 137 1. Introdução ..................................................................................................................... 138 2. Resultados .................................................................................................................... 139 3. Discussão ...................................................................................................................... 146 CAPÍTULO VII – CARACTERIZAÇÃO INTRA-ESPECÍFICA DE C. HOMINIS E C. PARVUM ........ 155 1. Introdução ..................................................................................................................... 156 2. Resultados .................................................................................................................... 158 xvii 2.1. Análise de microssatélites ................................................................................... 158 2.2. Caracterização do gene GP60 .............................................................................. 162 3. Discussão ...................................................................................................................... 173 CAPÍTULO VIII – CONCLUSÃO .......................................................................................... 184 CAPÍTULO IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 188 1 - Primeira Parte - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2 1. PERSPECTIVA HISTÓRICA Os microrganismos do género Cryptosporidium foram descritos, pela primeira, vez em 1907, pelo parasitologista americano Ernest Tyzzer, após observação, na mucosa gástrica de murganhos (Mus musculus), diversas formas de desenvolvimento sexuadas e assexuadas que resultavam na formação de oocistos contendo quatro esporozoítos livres. O autor identificou os parasitas como sendo coccídeos de estatuto taxonómico indefinido e deu-lhe o nome de Cryptosporidium muris [Tyzzer, 1907]. Em 1910, Tyzzer fez a descrição detalhada do ciclo de vida e das formas de desenvolvimento de C. muris e propôs a criação do género Cryptosporidium (que significa esporocisto escondido ou ausente), pertencente à classe Sporozoa e à subclasse Coccidia. O mesmo autor descreveu, ainda, em 1912, uma nova espécie, que designou de Cryptosporidium parvum, que se desenvolve no epitélio intestinal de murganhos e cujos oocistos possuem dimensões inferiores às de C. muris [Tyzzer, 1912]. Nos anos seguintes, em mamíferos, aves, répteis e peixes, foram descritas 21 novas espécies pertencentes ao género Cryptosporidium, assumindo-se que cada hospedeiro animal era parasitado por uma espécie diferente de Cryptosporidium spp.. No entanto, estudos subsequentes mostraram tratar-se, algumas delas, de esporocistos de Sarcocystis. Do mesmo modo, na sequência de estudos de transmissão cruzada, outras espécies foram invalidadas e sinonimizadas com C. parvum [Levine, 1984; O’Donoghue, 1995; Fayer et al., 1997]. A identificação, em 1971, de parasitas do género Cryptosporidium, como causa de diarreia em vitelos, marcou o início do interesse da Medicina Veterinária por estes microrganismos e, desde então, muitos autores descreveram casos de diarreia aguda provocados por estes agentes em animais domésticos e silváticos [Casemore et al., 1985b; Current e Garcia, 1991]. Os dois primeiros casos conhecidos de criptosporidiose humana foram relatados em 1976. O primeiro foi registado numa criança de três anos, residente numa zona rural de Nashville, nos Estados Unidos da América (EUA), que apresentava diarreia severa [Nime et al., 1976]. O segundo foi descrito, também nos EUA, num agricultor de 39 anos de idade que desenvolveu diarreia severa após cinco semanas de terapêutica imunossupressora, para tratamento de doença auto-imune [Meisel et al., 1976]. Nos seis anos seguintes foram documentados oito casos de criptosporidiose, cinco em imunocomprometidos e três em REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3 imunocompetentes [Centers for Disease Control and Prevention, 1982a; Reese et al., 1982; Sloper et al., 1982; Tzipori, 1983]. Em 1982, dois relatórios do “U.S. Centers for Disease Control and Prevention” (CDC) reportaram a ocorrência de um surto de criptosporidiose no Alabama, em 12 indivíduos imunocompetentes, todos tratadores de vitelos com diarreia [Centers for Disease Control and Prevention, 1982a] e de diarreia severa crónica por Cryptosporidium spp. em 21 doentes com síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA) [Centers for Disease Control and Prevention, 1982b]. Após estas duas últimas referências, as comunidades médica e científica tomaram, finalmente, consciência da importância deste parasita para a saúde humana. Mais tarde, em 1993, em Milwaukee, EUA, através da rede de abastecimento público de água à cidade, 403.000 pessoas foram infectadas por Cryptosporidium spp.. Nos dois anos que se seguiram a este surto, o número de óbitos por criptosporidiose foi 13,5 vezes superior ao registado nos dois anos anteriores, tendo 85% dos mesmos ocorrido entre a população de doentes com SIDA [Hoxie et al., 1997]. Desde então, o interesse por este protozoário passou a envolver, também, as entidades distribuidoras de água e as autoridades de saúde pública [MacKenzie et al., 1994]. O reconhecimento gradual da importância dada a este microrganismo, ao longo do último século, reflectiu-se no aumento exponencial de publicações presentes na “National Library of Medicine” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi) que, sendo de 100 até 1982, aumentou para 5.019, em Dezembro de 2005. Essas publicações documentam, não só a infecção por Cryptosporidium spp. no Homem e noutros animais e a presença deste parasita na água e nos alimentos, como dão conta de vários aspectos da sua biologia e do desenvolvimento de métodos de diagnóstico, detecção, prevenção, controlo e tratamento da criptosporidiose. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 4 2. CICLO DE VIDA Os parasitas do género Cryptosporidium apresentam um ciclo de vida monoxénico, que se inicia após a ingestão de oocistos por parte de um hospedeiro susceptível (figura 1). As condições de temperatura, de pH e a presença de sais biliares e enzimas pancreáticas, encontradas no lúmen intestinal, induzem a libertação dos quatro esporozoítos existentes em cada oocisto. Através de um processo ainda pouco compreendido, mediado por proteínas produzidas pelo esporozoíto e por receptores específicos existentes na célula hospedeira, determinados organelos do complexo apical (localizado na extremidade anterior dos esporozoítos) iniciam o processo de invasão das células do epitélio intestinal. Estas últimas começam, então, um processo de reorganização do seu citosqueleto, ao mesmo tempo que a sua membrana celular envolve o esporozoíto, formando um vacúolo parasitóforo, em que o parasita permanece numa posição intracelular, mas extracitoplasmática, passando, nesta altura, a designar-se de trofozoíto. Com excepção dos merozoítos e dos microgâmetas, que se libertam da célula hospedeira para invadirem novas células, todo o desenvolvimento endógeno se processa no interior das células epiteliais. Pensa-se que a chave da resistência aos fármacos, apresentada por estes microrganismos, possa encontrar justificação nesta localização particular, entre o lúmen intestinal e o citoplasma da célula hospedeira, que os protege do ambiente intestinal hostil e da resposta imunológica do hospedeiro. Na base de cada vacúolo parasitóforo desenvolve-se uma estrutura denominada organelo alimentador (do inglês, “feeder organelle”) que separa os citoplasmas da célula hospedeira e do parasita e que é o responsável pela entrada de energia e de nutrientes (figura 2b) [Ward e Cevallos, 1998; Tzipori e Ward, 2002; Petry, 2004]. A fase assexuada do desenvolvimento parasitário inicia-se dentro do vacúolo parasitóforo, quando o trofozoíto sofre três divisões nucleares (merogonia), originando os merontes tipo I, que contêm seis a oito merozoítos (figuras 1 e 2c), os quais são libertados para o lúmen intestinal. Cada novo merozoíto invade uma célula epitelial adjacente (figuras 1 e 2d) e, após maturação e duas ou três gerações de merogonia, origina, respectivamente, um meronte tipo I (constituindo uma fonte interna de auto-infecção) ou um meronte tipo II. Este último contém quatro merozoítos que, ao infectarem novas células, se diferenciam em microgamontes (células masculinas) e macrogamontes (células femininas) e vão iniciar a fase REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 5 sexuada do desenvolvimento (gametogonia). Os microgamontes tornam-se multinucleados, sendo cada núcleo incorporado num microgâmeta que vai fertilizar um macrogamonte (figuras 1 e 2e), formando o zigoto. Este, por sua vez, sofre duas divisões nucleares (esporogonia) dando origem ao oocisto, que contém no seu interior quatro esporozoítos. Durante a esporogonia formam-se dois tipos de oocistos, os de parede fina (cerca de 20%), que permanecem no hospedeiro, constituindo uma segunda fonte de auto-infecção e os de parede grossa (cerca de 80%), que são excretados nas fezes, já sob a forma infectante (esporulados) e que, após ingestão, vão infectar novos hospedeiros susceptíveis [O’Donoghue, 1995; Fayer et al., 1997; Kosek et al., 2001; Carey et al., 2004]. Oocisto esporulado Esporozoíto Trofozoíto Meronte tipo I Merozoítos Meronte tipo II Merozoítos Microgamonte Macrogamonte Microgâmetas Zigoto Auto-infecção Auto-infecção Oocisto de parede fina Oocisto de parede grossa Excreção Ingestão FIGURA 1 – Representação esquemática do ciclo de vida de Cryptosporidium spp. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 6 FIGURA 2 – Cryptosporidium baileyi observado em microscopia electrónica de varrimento: a) elevada carga parasitária na superfície epitelial; b) região basal do organelo alimentador; c) merontes tipo I; d) merozoíto a penetrar na célula hospedeira; e) microgâmeta a fertilizar um macrogamonte [adaptado de http://www.ksu.edu/parasitology/625tutorials/Cbaileyi.html, consultado a 10 de Novembro de 2004] a d b c e REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 7 Os oocistos apresentam forma redonda a ovalada, com dimensões que variam entre 4 a 8 µm, dependendo da espécie. No seu interior encontram-se quatro esporozoítos vermiformes e um corpo residual contendo um vacúolo lipídico e alguns grânulos de amilopectina (figura 3) [Petry, 2004]. Num estudo recente, após infecção experimental em ratinhos e vitelos, foi descrita, respectivamente, em C. parvum e C. andersoni, a existência de formas de desenvolvimento extracelulares semelhantes aos gamontes dos gregarinas, algumas das quais em sizígia. Contudo, a sua origem, o seu destino e o seu papel no ciclo de vida daqueles parasitas não é, ainda, conhecido [Hijjawi et al., 2002]. Rosales et al. (2005) também observaram, em culturas celulares de C. parvum, a presença de formas de desenvolvimento extracelulares semelhantes aos gamontes dos gregarinas e de zigotos e oocistos com oito esporozoítos; algumas das formas extracelulares foram, igualmente, observadas em sizígia. Estes resultados apontam para a necessidade de revisão do ciclo de vida de Cryptosporidium spp. o que, no entanto, só poderá ser conseguido após a realização de estudos in vitro e in vivo adicionais e da análise ultra-estrutural destas novas formas de desenvolvimento [Hijjawi et al., 2002; Rosales et al., 2005]. FIGURA 3 – Representação esquemática de um oocisto de Cryptosporidium spp.. Esp – esporozoíto, Gr – grânulo de amilopectina, VL – vacúolo lipídico Gr Esp VL REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 14 ii) Doença autolimitada, caracterizada por diarreia aquosa profusa, com duração inferior a dois meses, seguida de completa remissão dos sintomas e interrupção da excreção de oocistos. Estes casos surgem em indivíduos com contagem de linfócitos TCD4+ superior a 180 céls./mm3 [Blanshard et al., 1992; Flanigan et al., 1992]. iii) Doença crónica, caracterizada por diarreia aquosa profusa, com duração superior a dois meses. Estes indivíduos apresentam contagem de linfócitos TCD4+ inferior a 140 céls./mm3 e, concomitantemente, revelam má absorção, desidratação e perda de peso acentuada [Blanshard et al., 1992; Flanigan et al., 1992]. iv) Doença com evolução fulminante, em que a perda de líquidos nas fezes é superior a dois litros por dia. Os doentes revelam desidratação grave, alteração do equilíbrio hidroelectrolítico e caquexia, o que pode conduzir à morte. Estes casos ocorrem, unicamente, em doentes com contagem de linfócitos TCD4+ inferior a 50 céls./mm3 [Blanshard et al., 1992; Flanigan et al., 1992; Casemore, 2000]. Num estudo com duração de seis anos, realizado em Londres, em indivíduos com coinfecção por VIH e Cryptosporidium spp., a infecção crónica foi a forma de apresentação mais frequente (59,7%), seguindo-se-lhe os quadros clínicos de doença autolimitada (28,7%), doença de evolução fulminante (7,8%) e, por fim, infecção sem diarreia (3,9%) [Blanshard et al., 1992]. Nos países em vias de desenvolvimento, as formas mais frequentes da criptosporidiose nos infectados por VIH são a doença crónica e a doença com evolução fulminante [Farthing, 2000]. O tempo de sobrevida dos doentes depende da evolução clínica da infecção, apresentando um valor médio de cinco, 20 e 36 semanas, respectivamente, nos casos de doença com evolução fulminante, crónica e autolimitada [Blanshard et al., 1992]. Os doentes com função imunitária deficiente, principalmente aqueles com infecção por VIH, podem desenvolver localizações extra-intestinais, como o estômago, o tracto biliar, o pâncreas ou os pulmões [Hunter e Nichols, 2002]. A criptosporidiose biliar é a forma mais comum da doença extra-intestinal, embora o número total de casos seja desconhecido, uma vez que o seu diagnóstico depende do recurso a técnicas invasivas, que não são realizadas por rotina [Chen et al., 2002]. Na população afectada pelo grande surto de criptosporidiose de 1993, em Milwaukee, Vakil et al. (1996), verificaram que 87,5% dos doentes com manifestações clínicas sugerindo envolvimento das vias biliares, apresentavam contagem de linfócitos TCD4+ inferior a 50 céls./mm3. Apesar de existirem poucas descrições de envolvimento gástrico por Cryptosporidium spp., alguns autores consideram que este possa ser mais REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 15 frequente do que se pensa, dada, não só a dificuldade da sua identificação, que depende da realização de endoscopia gástrica com biopsia, como a frequente ausência de sintomatologia na criptosporidiose do estômago [Rossi et al., 1998; Hunter e Nichols, 2002]. A infecção do aparelho respiratório, em doentes com SIDA, tem sido descrita por diversos autores, nos casos de identificação de oocistos na expectoração, em aspirado broncoalveolar ou em biopsia pulmonar, sendo caracterizada por tosse, dispneia, febre e dor na região torácica [Farthing, 2000; Hunter e Nichols, 2002]. No entanto, o significado clínico destes achados não se encontra bem esclarecido, uma vez que a infecção respiratória por Cryptosporidium spp. se encontra, na maioria dos casos, associada a outros agentes infecciosos do aparelho respiratório, nomeadamente Mycobacterium tuberculosis, Pneumocystis jirovecii e vírus citomegálico [Farthing, 2000; Hunter e Nichols, 2002]. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 16 5. TRATAMENTO DA CRIPTOSPORIDIOSE HUMANA Não existe, actualmente, terapêutica etiotrópica eficaz para o tratamento da criptosporidiose. Nos últimos anos, foram efectuados diversos ensaios, envolvendo mais de 100 fármacos, muitos deles com acção contra outros coccídeos, sem que, no entanto, a sua actividade contra os parasitas do género Cryptosporidium tivesse sido satisfatória. Todavia, alguns fármacos mostraram alguma eficácia na diminuição do número de oocistos excretados e na melhoria do quadro clínico [Farthing, 2000; Armson et al. 2003; Benson et al., 2004]. A paramomicina foi um dos primeiros fármacos a evidenciar alguma actividade antiCryptosporidium. Quando administrada em doses elevadas, mostrou ser eficaz no tratamento da criptosporidiose no modelo animal, sendo utilizada no tratamento da doença humana. Contudo, diversos estudos efectuados em doentes com infecção VIH mostraram que a sua eficácia é variável e limitada ao período durante o qual é administrada, sendo frequentes as recidivas [Armson et al., 2003; Benson et al., 2004]. A nitazoxanida é um fármaco eficaz no tratamento de infecções por bactérias, helmintas e alguns parasitas eucariotas, nomeadamente Entamoeba hystolitica, Giardia lamblia e Isospora belli, que mostrou resultados promissores no tratamento da infecção por Cryptosporidium spp. [Armson et al., 2003; Benson et al., 2004]. Em alguns estudos efectuados em doentes com SIDA e criptosporidiose, foram observadas taxas de cura parasitológica na ordem dos 70% [Rossignol et al., 1998; Armson et al., 2003]. Em 2002, a nitazoxanida foi aprovada pela “U.S. Food and Drug Administration” para o tratamento da criptosporidiose em crianças não tendo, ainda, sido estabelecidas a sua eficácia e segurança em imunocomprometidos [U.S. Food and Drug Administration, 2002; Benson et al., 2004]. Como a evolução clínica da criptosporidiose nos doentes imunocompetentes é diferente da dos doentes com imunodeficiência, a terapêutica para estas duas populações é, igualmente, distinta. Os doentes com sistema imunitário intacto não necessitam, em regra, de terapêutica, para além da de suporte, para correcção da desidratação provocada pela diarreia aquosa [Griffiths, 1998; Chen et al., 2002; Benson et al., 2004]. Nos doentes com neoplasias ou que foram sujeitos a transplante de órgãos, a interrupção da quimioterapia ou da terapêutica imunossupressora, leva à reconstituição da função imunitária e, consequentemente, à resolução da infecção [Griffiths, 1998]. Nos doentes com SIDA, o tratamento mais adequado REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 17 consiste na administração da terapêutica anti-retroviral potente ou HAART (acrónimo anglosaxónico para “highly active antiretroviral therapy”), com o objectivo de baixar a virémia e restaurar, na medida do possível, a função imunitária, que é condição essencial para a resolução da infecção [Griffiths, 1998; Miao et al., 2000; Chen et al., 2002]. Nos casos de diarreia severa crónica ou fulminante é, ainda, necessário repor a perda de líquidos e de electrólitos, por administração oral ou intravenosa, de soluções contendo glucose, bicarbonato de sódio, potássio, magnésio e fósforo [Benson et al., 2004]. O tratamento sintomático com antidiarreicos diminui a frequência e o volume das dejecções, contribuindo para a melhoria da qualidade de vida dos doentes [Griffiths, 1998; Benson et al., 2004]. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 18 6. DIAGNÓSTICO DA CRIPTOSPORIDIOSE O diagnóstico diferencial da criptosporidiose deve ser considerado em qualquer doente que apresente diarreia aguda ou persistente, principalmente, se esta ocorre em associação com imunodeficiência. Todavia, o quadro clínico gastrenterológico causado por microrganismos do género Cryptosporidium não é patognomónico destes parasitas, sendo, de igual modo, da responsabilidade de bactérias enteropatogénicas, vírus e outros parasitas. Deste modo, para o diagnóstico definitivo da criptosporidiose é necessária, sempre, a identificação de oocistos em amostras fecais. Quando se suspeita de criptosporidiose extra-intestinal, a pesquisa de oocistos pode ser efectuada noutras amostras, nomeadamente na expectoração, em lavado broncoalveolar, em aspirado duodenal ou na bílis [Petry, 2000]. 6.1 DIAGNÓSTICO HISTOLÓGICO Os primeiros casos de infecção por Cryptosporidium spp. identificados no Homem e noutros animais, fundamentaram-se na observação das formas de desenvolvimento intracelular do parasita em biopsias da mucosa intestinal ou em material de autópsia [O’Donoghue, 1995; Petry, 2000]. Os métodos histoquímicos mais utilizados para o diagnóstico histológico da criptosporidiose baseiam-se na coloração pela hematoxilina-eosina e pelo giemsa [O’Donoghue, 1995]. O recurso à microscopia electrónica de transmissão, para observação de cortes histológicos, permite a observação morfológica detalhada das diversas formas de desenvolvimento intracelular dos criptosporídeos. No entanto, estes estudos são dispendiosos, demorados e apresentam baixa sensibilidade, dado que são observadas, apenas, pequenas secções da mucosa e que as infecções não se encontram uniformemente distribuídas naquela, particularmente nos casos em que a carga parasitária é baixa [O’Donoghue, 1995; Petry, 2000]. Apesar da sua utilidade na investigação das alterações citológicas e histopatológicas que acompanham a infecção, estes métodos não são adequados para o diagnóstico parasitológico de rotina [O’Donoghue, 1995; Petry, 2000]. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 19 6.2 DIAGNÓSTICO COPROLÓGICO A introdução, em 1981, do método de coloração de Ziehl-Neelsen modificado [Henriksen e Pohlenza, 1981] constituiu um salto qualitativo no diagnóstico da criptosporidiose, permitindo a detecção de oocistos nos esfregaços fecais, associando, assim, um método de colheita não invasivo à simplicidade de execução da técnica de coloração. Esta técnica baseia-se no facto de os oocistos, depois de corados com fucsina básica fenolada, reterem este corante aquando da descoloração pelo álcool-ácido. Esta característica permite, após coloração de contraste, com o verde-de-malaquite ou com o azul-de-metileno, diferenciar os oocistos do restante material fecal. Os oocistos podem ser observados ao microscópio óptico (com uma ampliação de 200 ou 400 vezes) e apresentam-se como pequenas estruturas cor-de-rosa, de forma esférica, com um diâmetro de 4 a 6 µm, enquanto que o restante material fecal apresenta a cor do corante de contraste. Nalguns oocistos pode observar-se, ainda, a sua estrutura interna, nomeadamente os esporozoítos e os corpos residuais, que apresentam cor mais escura [Casemore et al., 1985a; Petry, 2000]. Para além do Ziehl-Neelsen modificado existem outros métodos, vulgarmente utilizados para a coloração diferencial de oocistos de Cryptosporidium spp., nomeadamente o de auramina-fenol/fucsina ou o de Kinyoun modificado [Fayer et al., 2000; Petry, 2000]. Em qualquer dos casos, a observação deve ser feita por um técnico experiente, capaz de distinguir os oocistos de outras estruturas semelhantes, como glóbulos de gordura e algumas leveduras [Casemore, 1991]. A observação de preparações fecais a fresco, para identificação de oocistos, não deve ser efectuada, uma vez que, pela sua forma e pequena dimensão, podem ser confundidos com leveduras e esporos de fungos, conduzindo a resultados falsos positivos [Casemore, 1991]. Nos casos de infecção aguda, em que a eliminação de oocistos é elevada, estes são, facilmente, observados em esfregaços fecais. Contudo, quando a infecção é ligeira ou nos casos assintomáticos, dada não só a natureza intermitente da excreção, como, ainda, a variabilidade da quantidade de oocistos excretados durante o decorrer da infecção, a observação por microscopia convencional pode tornar-se difícil, sendo necessário recorrer a técnicas de concentração das amostras fecais [Casemore, 1991]. Vários métodos estão descritos para a concentração de oocistos presentes nas fezes, nomeadamente, a centrifugação após extracção com formol-éter, a centrifugação em gradientes de cloreto de césio, a centrifugação em gradientes de Percoll, a flutuação em solução de sacarose e a flutuação em solução saturada de cloreto de sódio, entre outros [Weber et al., 1992; Bukhari e Smith, 1995; Petry, 2000]. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 20 Estas técnicas contribuem, ainda, para a remoção de gorduras e outros detritos fecais, melhorando a qualidade da observação microscópica. No entanto, alguns autores têm referido que, durante o processamento das amostras, ocorrem perdas de oocistos, principalmente em fezes pastosas e moldadas, resultando na diminuição da sensibilidade do diagnóstico [Weber et al., 1992; Bukhari e Smith, 1995; Petry, 2000]. Para além dos métodos de coloração diferencial, já referidos, nos últimos anos têm sido comercializados diversos testes imunológicos para a detecção de oocistos de Cryptosporidium spp., com base na utilização de anticorpos monoclonais, em técnicas imunoenzimáticas e de imunofluorescência [Fayer et al.,2000; Petry, 2000]. O método de imunofluorescência permite a identificação fácil e rápida dos oocistos nos esfregaços fecais, apresentando, todavia, as desvantagens do elevado custo dos “kits” existentes no mercado e da indispensabilidade de um microscópio de fluorescência, para leitura dos esfregaços. No que diz respeito à sensibilidade deste método, relativamente à coloração diferencial, existe alguma controvérsia, na medida em que alguns autores descrevem a imunofluorescência como o método mais sensível, enquanto que outros encontram sensibilidades idênticas para as duas técnicas [Griffiths, 1998; Petry, 2000]. Os testes imunoenzimáticos permitem a análise simultânea de um grande número de amostras, sendo, no entanto, de sensibilidade inferior às técnicas de imunofluorescência. Para além disso, como não é observada a morfologia dos parasitas, é impossível distinguir os verdadeiros dos falsos resultados positivos [Petry, 2000]. Num passado recente, ocorreram problemas de especificidade em alguns testes imunoenzimáticos para detecção de antigénios de Cryptosporidium spp. nas fezes, o que deu origem a um elevado número de resultados falsos positivos [Centers for Disease Control and Prevention, 1999; Johnston et al., 2003]. Uma das limitações associadas aos métodos imunológicos é a possibilidade de ocorrerem reacções cruzadas com outros microrganismos, o que leva ao decréscimo da especificidade com resultados falsos positivos [Fayer et al., 2000]. Nos últimos anos, vários autores têm descrito técnicas de amplificação de ácido desoxirribonucleico ou DNA (sigla anglo-saxónica para “deoxyribonucleic acid”), por reacção em cadeia da polimerase ou PCR (sigla anglo-saxónica para “polymerase chain reaction”), a fim de detectar a presença de Cryptosporidium spp. em amostras clínicas e ambientais, ultrapassando as limitações de sensibilidade e especificidade apresentadas pelas técnicas acima descritas. Para além de ser uma técnica sensível e específica, a PCR apresenta REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 21 vantagens, tais como a facilidade de interpretação dos resultados e a possibilidade de processamento de um elevado número de amostras em simultâneo [Petry, 2000]. Inúmeros métodos de PCR, dirigidos a diferentes regiões alvo do genoma de Cryptosporidium spp. estão já descritos; no entanto, estes apresentam especificidades e sensibilidades distintas, originando, alguns deles, resultados falsos positivos ou falsos negativos [Sulaiman et al., 1999; Jiang e Xiao, 2003]. A baixa especificidade apresentada por alguns destes métodos encontra justificação no facto de serem utilizados oligonucleótidos iniciadores (“primers”) dirigidos a zonas do genoma muito conservadas entre os eucariotas, resultando na amplificação do DNA de outros microrganismos, nomeadamente os pertencentes ao género Eimeria [Sulaiman et al., 1999]. A sensibilidade da reacção de PCR para a detecção de Cryptosporidium spp. depende de diversos factores, tais como o número de cópias da região do genoma a amplificar ou a presença de constituintes fecais inibidores da reacção [Widmer, 1998; Carey et al., 2004]. Assim, os sais biliares, a bilirrubina, os metabolitos de fármacos, o DNA de outros microrganismos ou polissacáridos complexos de origem vegetal que sequestrem o ião magnésio, de cuja concentração depende a actividade da enzima Taq DNA polimerase, ou que mimetizem o comportamento do DNA, reduzem a eficiência e a sensibilidade da reacção de PCR [Monteiro et al., 1997; Petry, 2000]. Para ultrapassar este problema são necessários métodos de extracção de DNA genómico eficazes na remoção daqueles inibidores fecais. Por outro lado, é da máxima importância que a extracção de DNA seja precedida da eficiente destruição da parede dos oocistos, uma vez que esta é muito resistente e que a sua lise incompleta compromete todo o processo de extracção e, consequentemente, o rendimento da reacção de PCR [Alves, 1999; Carey et al., 2004]. Para além da detecção de microrganismos do género Cryptosporidium, a técnica de PCR, associada a outros métodos de biologia molecular, como o polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição ou RFLP (sigla anglo-saxónica para “restriction fragment length polymorphism”), ou a determinação da sequência nucleotídica de fragmentos de DNA amplificado, possibilita, ainda, a identificação da espécie e/ou genótipo dos parasitas [Fayer et al., 2000; Petry, 2000]. Contudo, alguns dos métodos de PCR descritos na literatura foram desenvolvidos com base em sequências de C. parvum; assim, e em virtude não só da elevada variabilidade genética apresentada pelos parasitas pertencentes ao género Cryptosporidium, como da possibilidade de outras espécies/genótipos causarem infecção humana, a sua utilidade para o diagnóstico da criptosporidiose humana é limitada, uma vez que apenas REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 22 permitem a amplificação de algumas espécies, nomeadamente C. parvum e C. hominis, não amplificando, por exemplo, C. meleagridis ou C. felis [Jiang e Xiao, 2003; Xiao e Ryan, 2004]. A reacção de PCR possui um elevado potencial como técnica de diagnóstico da criptosporidiose. Todavia, é necessário, ainda, ultrapassar alguns problemas até que seja possível adoptar métodos de referência bem definidos e adequados à sua utilização de rotina em todos os laboratórios. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 23 7. MODOS DE TRANSMISSÃO DA CRIPTOSPORIDIOSE HUMANA A transmissão da criptosporidiose humana ocorre quando um indivíduo susceptível ingere oocistos excretados por um hospedeiro infectado, seja por contacto directo ou, indirecto, através da água ou dos alimentos contaminados. Na figura 5 encontram-se representados os diferentes modos de transmissão da criptosporidiose ao Homem. Hídrica Zoonótica Alimentar Antroponótica FIGURA 5 – Representação esquemática dos diferentes modos de transmissão da criptosporidiose ao Homem REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 30 durante seis meses, quando conservados a 0ºC, 5ºC, 10ºC, 15ºC e 20ºC. Quando armazenados a 25ºC e 30ºC, o tempo durante o qual se mantêm infecciosos diminui para três meses [Fayer, 2004]. Tamburrini et al. (1999), observaram que oocistos mantidos em água salgada artificial, no escuro, sob oxigenação moderada e a uma temperatura de 6 a 8ºC mantêm a sua capacidade infectante durante 12 meses. Robertson et al. (1992), mostraram que a congelação rápida em solução aquosa a –70ºC é letal para todos os oocistos. No entanto, quando congelados a –22ºC, 10% dos oocistos permanece viável por um período de seis dias. Outros autores descreveram que oocistos armazenados a 5ºC e –10ºC mantêm a sua capacidade infectante até sete dias, diminuindo esse tempo para 24 e cinco horas, quando congelados, respectivamente, a –15ºC e a –20ºC [Fayer e Nerad, 1996]. Estes dados demonstram a resistência dos oocistos a baixas temperaturas e a possibilidade de permanecerem viáveis, por exemplo, em cubos de gelo. Os oocistos são muito sensíveis à dessecação, perdendo a sua viabilidade após quatro horas de exposição ao ar, numa lâmina, à temperatura ambiente [Robertson et al., 1992]. Experiências realizadas em diferentes tipos de solo mostraram a perda significativa de viabilidade dos oocistos, após alguns ciclos de congelação-descongelação, sendo o tempo durante o qual os oocistos estão sujeitos à congelação um factor determinante para que tal aconteça. Em solos secos, a inactivação dos oocistos ocorre mais rapidamente do que em solos húmidos. Em condições de temperatura idênticas, a perda de viabilidade dos oocistos no solo acontece mais depressa do que na água, sugerindo que outros factores, para além da temperatura, possam estar envolvidos no processo [Kato et al., 2002]. A extraordinária robustez apresentada pelos oocistos de Cryptosporidium spp. acima descrita, torna difícil a concretização eficaz do controlo da transmissão da criptosporidiose. Perante tais dificuldades, a adopção de medidas de prevenção adequadas constitui o primeiro passo no sentido de evitar o contacto do Homem com estes parasitas. Como as consequências da infecção podem ser particularmente graves em imunodeficientes, esta população deverá ter cuidados especiais para prevenir uma eventual infecção. Entre algumas das medidas recomendadas, com o objectivo de prevenir a criptosporidiose humana, destacam-se as seguintes [Carey et al., 2004; Centers for Disease Control and Prevention, 2004; Hlavsa et al., 2005]: i) Adoptar boas práticas de higiene – lavar as mãos depois de ir à casa de banho, depois de mudar fraldas a crianças, antes de preparar alimentos e antes de comer. As pessoas com REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 31 diarreia devem, ainda, proteger os outros de uma possível infecção, inibindo-se de utilizar piscinas e locais públicos com água de recreio. ii) Evitar o contacto com água que possa estar contaminada – não engolir água de recreio, não beber água de poços, de rios, de lagos e de fontes não tratada e não beber água ou gelo em países onde a qualidade da água de abastecimento seja duvidosa. Em caso de dúvida quanto à sua qualidade, a água deverá ser fervida antes de consumida. iii) Evitar ingerir alimentos contaminados – lavar bem ou tirar a casca à fruta e aos legumes e evitar comer alimentos crus, em países onde o tratamento da água é deficiente. iv) Evitar o contacto com ruminantes domésticos, especialmente vitelos e cordeiros. v) Evitar práticas sexuais que envolvam o contacto fecal-oral. Nas instituições de saúde, infantários e centros de dia, para além da adopção de rigorosos hábitos de higiene, o modo mais eficaz de prevenir a transmissão da infecção consiste na criação de áreas restritas para os doentes infectados, evitando o seu contacto com outras pessoas susceptíveis [Keusch et al., 1995; Carey et al., 2004]. A diminuição da contaminação ambiental constitui, igualmente, uma importante medida de prevenção, podendo ser conseguida através da redução da transmissão da infecção entre animais. Nas explorações pecuárias é essencial um bom maneio higio-sanitário das instalações, separar os animais jovens dos adultos, reduzir a densidade de animais num mesmo espaço, isolar os animais doentes, impedir o acesso dos animais a zonas próximas de cursos de água e tratar o estrume dos animais (secagem pelo calor, compostagem), antes da sua utilização como fertilizante do solo [Duffy e Moriarty, 2003; Ramirez et al., 2004]. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 32 9. EPIDEMIOLOGIA DA CRIPTOSPORIDIOSE Cryptosporidium spp. é causa de doença gastrintestinal no Homem e noutros animais em todo o Mundo, tendo, nos EUA, sido considerado agente infeccioso emergente pelo “Centers for Disease Control and Prevention”, a “Environmental Protection Agency”, a “American Water Works Association”, o “National Institutes of Health” e a “Food and Drug Administration” [Tzipori, 2002]. A epidemiologia destes parasitas é fortemente influenciada por uma série de características que facilitam a sua ampla transmissão: i) O pequeno tamanho dos oocistos, a sua baixa velocidade de sedimentação e a consequente elevada capacidade de flutuação facilitam o seu transporte e a sua dispersão no ambiente [Meinhardt et al., 1996; Dillingham et al., 2002]. ii) Os oocistos são muito robustos, podendo permanecer viáveis na água e no solo por vários meses, em condições de “stress” ambiental, que seriam letais para muitos outros agentes infecciosos. Para além disso, a sua resistência aos processos químicos e físicos, utilizados no tratamento da água, facilitam a sua transmissão, constituindo um enorme desafio para estruturas envolvidas na distribuição de água [Robertson et al., 1992; Rose et al., 2002; Fayer, 2004]. iii) O ciclo de vida é monoxénico, isto é, completa-se num único hospedeiro. O tempo necessário para que o ciclo de vida se complete é de cerca de três dias [Meinhardt et al., 1996]. iv) Os oocistos são eliminados já esporulados, significando que, após a excreção, a infecção de novos hospedeiros pode ser imediata, sobretudo através do contacto pessoa-apessoa. O mesmo não acontece, por exemplo, com Cyclospora cayetanensis que é excretado sob a forma não esporulada, sendo necessárias condições ambientais adequadas para que ocorra a sua maturação e se torne infeccioso, processo que pode demorar entre uma a duas semanas [Dillingham et al., 2002; Eberhard e Arrowood, 2002]. v) A dose infectante para o Homem é pequena. Estudos efectuados com voluntários saudáveis e três isolados diferentes de Cryptosporidium spp., mostraram que a dose infectante pode variar entre 9 e 1.042 oocistos, dependendo dos isolados [Okhuysen et al., 1999, 2002]. A aplicação de um modelo matemático de infecção ao surto que ocorreu em Milwaukee, em REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 33 1993, sugere que, para alguns casos, a dose infectante possa ter sido inferior a 10 oocistos/L de água [Eisenberg et al., 1998]. vi) A distribuição ubíqua e a ausência de especificidade de hospedeiro apresentadas por algumas espécies, particularmente C. parvum, contribui para o elevado número de reservatórios, aumentando o seu potencial zoonótico [Dillingham et al., 2002]. vii) O número de oocistos excretado é muito elevado, para o que contribuem os ciclos internos de auto-infecção, perpetuados pelos merontes tipo I e pelos oocistos de parede fina. Estudos em vitelos demonstraram que estes podem excretar entre 105 e 107 oocistos por grama de fezes durante um período de sete a dez dias, pensando-se que números semelhantes sejam, de igual modo, excretados por humanos com criptosporidiose. Este facto contribui para o nível elevado de disseminação e de contaminação ambiental e favorece a transmissão [Meinhardt et al., 1996; Fayer et al., 1997]. viii) A existência de múltiplos modos de transmissão (antroponótica, zoonótica e através da água ou de alimentos contaminados), que podem ocorrer em simultâneo, aumenta a sua eficiência [Casemore et al., 1997]. 9.1 A CRIPTOSPORIDIOSE NO HOMEM A criptosporidiose humana, ocorre em todas as regiões do Planeta, embora seja desconhecida a sua verdadeira prevalência. Tal prende-se com razões diversas, entre as quais se destacam o facto de muitos doentes com diarreia não procurarem assistência médica, de alguns médicos não se encontrarem familiarizados com estes parasitas e não requisitarem a sua pesquisa nas fezes, de muitos laboratórios não efectuarem as técnicas adequadas para a identificação de oocistos de Cryptosporidium spp. ou, ainda, porque muitas das infecções são assintomáticas não sendo, por isso, investigadas [Wheeler et al., 1999; Dietz et al., 2000; Hörman et al., 2004]. O contacto com Cryptosporidium spp. nem sempre resulta em infecção patente. Quando a exposição ao parasita é frequente, as infecções tornam-se assintomáticas em consequência do desenvolvimento de imunidade à infecção [Casemore et al., 1997; Frost et al., 1997]. Estas infecções são mais comuns em regiões onde a criptosporidiose é endémica, particularmente em zonas pobres, com elevada densidade populacional, condições de saneamento deficientes ou ausentes e baixa qualidade da água de abastecimento e, em zonas rurais, onde é frequente o REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 34 contacto com animais infectados [Casemore et al., 1997; Fayer et al., 2000]. Nas populações cuja água de abastecimento apresenta níveis baixos e constantes de contaminação com oocistos, observa-se, também, um menor número de casos sintomáticos da infecção [Frost et al., 1997, 2002]. Tanto as infecções assintomáticas como as sintomáticas não identificadas desempenham um papel importante na cadeia epidemiológica da infecção, principalmente em populações mais susceptíveis, como é o caso das crianças, dos idosos e dos doentes com imunodeficiências [Hörman et al., 2004]. Os números disponíveis sobre a infecção por Cryptosporidium spp., dizem respeito, unicamente, aos casos em que ocorre doença, pouco se sabendo sobre o nível endémico da infecção na população. Uma vez que a infecção por este parasita desencadeia uma resposta serológica específica, os estudos de seroprevalência podem ser úteis para estimar a respectiva prevalência na população [Frost et al., 2002]. 9.1.1 ESTUDOS SEROEPIDEMIOLÓGICOS Alguns estudos seroepidemiológicos sustentam que a infecção é frequente nos países industrializados e é quase universal nas regiões em vias de desenvolvimento [Kosek et al., 2001]. Um estudo recente, efectuado em sete zonas geográficas dos EUA, revelou que mais de 20% das crianças e jovens até aos 21 anos apresentam resposta serológica do tipo IgG a dois marcadores antigénicos específicos de Cryptosporidium spp., número que aumenta para valores superiores a 50% nos indivíduos com idade superior a 21 anos. Esta percentagem de seropositividade aumenta com a idade, sendo que cerca de 70% da população com idade superior a 70 anos apresenta evidência serológica de infecção anterior [Frost et al., 2004]. Estes valores são semelhantes aos encontrados, para os mesmos marcadores antigénicos, na população adulta em duas cidades do Canadá (>69% em Collingwood e 45% em Toronto) e na Austrália (>60% em Sidney e Melbourne) [Frost et al., 2000b, 2000c]. Na Europa, numa cidade do norte de Itália, foram descritas percentagens de seropositividade superiores a 82%, em adultos com mais de 45 anos [Frost et al., 2000a] e a 68% numa cidade da Rússia, a norte de Moscovo [Egorov et al., 2004]. Alguns autores sugerem que estas percentagens de seropositividade possam estar associadas à qualidade da água. Estes investigadores efectuaram estudos de seroprevalência em habitantes de várias cidades dos EUA, com acesso a água proveniente de diferentes REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 35 origens e de qualidade variável, tendo observado maior percentagem de indivíduos com resposta serológica detectável nas cidades abastecidas por água superficial, de menor qualidade, do que nos residentes em cidades supridas por água subterrânea, de qualidade mais elevada [Frost et al., 2001, 2002]. Nos países em vias de desenvolvimento, observam-se percentagens de seroprevalência elevadas desde a infância. Na Guatemala, Steinberg et al. (2004) encontraram, em crianças até ao primeiro, segundo e terceiro anos de idade, prevalências de IgG anti-Cryptosporidium de 27%, 70% e 73%, respectivamente. Na cidade de San António, Estado do Texas, EUA, foram observadas, para os grupos etários 0-4 anos, 5-8 anos e 9-13 anos, seroprevalências de 25%, 58% e 70%, respectivamente. No mesmo estudo, e para os mesmos grupos etários, as percentagens de seropositividade encontradas em algumas colónias junto da fronteira do Estado do Texas com o México foram de 82%, 85% e 97% [Leach et al., 2000]. Estes estudos não podem, contudo, ser vistos como indicadores de infecção activa, constituindo, somente, evidência de exposição ou de infecções prévias [O’Donoghue, 1995]. 9.1.2 ESTUDOS COPROLÓGICOS As prevalências de infecção por Cryptosporidium spp. obtidas através de estudos coprológicos são bastante inferiores aos valores encontrados nos estudos serológicos. Estimativas baseadas em dados fornecidos por diversas entidades de saúde pública dos Estados Unidos da América indicam que cerca de 2% das fezes submetidas, anualmente, a exame parasitológico são positivas para Cryptosporidium spp., o que corresponde a 300.000 pessoas infectadas [Mead et al., 1999]. Um estudo de meta análise baseado em dados epidemiológicos de 13 trabalhos efectuados em países nórdicos (Dinamarca, Finlândia, Noruega e Suécia) aponta estimativas de prevalência anual da infecção por Cryptosporidium spp. na população sintomática e assintomática de 2,91% e 0,99% respectivamente. Estes valores correspondem a 12.530 casos anuais de infecção por cada 100.000 habitantes, sendo que 3.340 são sintomáticos e 9.190 assintomáticos. Apesar da prevalência da infecção ser inferior na população assintomática, quando comparada com a sintomática, o número de casos assintomáticos representa cerca de 73% do total de casos anuais [Hörman et al., 2004]. O problema da criptosporidiose é mais dramático nos infectados por VIH, sobretudo nos países não industrializados, dada a dimensão alarmante de indivíduos com infecção VIH/SIDA, a maioria dos quais sem acesso à terapêutica anti-retrovírica [Farthing, 2000]. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 36 Nos países em vias de desenvolvimento, a criptosporidiose é uma doença endémica, sendo uma das causas mais frequentes de diarreia persistente em crianças até aos dois anos de idade [Casemore et al., 1997; Nwabuisi, 2001; Pereira M.G.C. et al., 2002; Adjei et al., 2004]. Na população adulta imunocompetente a infecção é, com frequência, assintomática [Casemore et al., 1997]. Um estudo efectuado no México, em três comunidades pobres sem água canalizada nem saneamento básico, revelou que em 70% das famílias existia, pelo menos, um membro com infecção por Cryptosporidium spp. e, em 56% dos casos, a infecção era assintomática [Redlinger et al., 2002]. Situação similar foi identificada por Chai et al. (2001), numa aldeia rural da Coreia do Sul, onde 66% da população, com mais de 50 anos, apresentava oocistos nas fezes, sendo que mais de metade estava assintomática. Nos países pobres, os episódios diarreicos ocorrem, com maior frequência e duração, em crianças malnutridas, embora não se saiba se a malnutrição resulta da infecção por Cryptosporidium spp. ou se a infecção acontece em consequência daquela [Checkley et al., 1997; Guerrant et al., 2002; Tumwine et al., 2003]. Alguns autores demonstraram que a diarreia em crianças, durante os dois primeiros anos de vida, tem efeito negativo no seu crescimento (peso e altura), desenvolvimento cognitivo e rendimento escolar [Mølbak et al., 1997; Agnew et al., 1998; Lima et al., 2000; Guerrant et al., 2002]. Num estudo efectuado numa favela em Lima, no Peru, Checkley et al. (1997), (1998) verificaram que as crianças que desenvolviam criptosporidiose durante os primeiros meses de vida apresentavam, ao fim de um ano, menos 1 cm de altura do que as que não haviam experimentado diarreia por Cryptosporidium spp.. Guerrant et al. (1999), realizaram um estudo de longa duração em crianças, numa favela em Fortaleza, no Brasil, tendo observado uma associação, estatisticamente significativa, entre o número de infecções por Cryptosporidium spp., sofridas durante a infância, e a diminuição da função cognitiva e robustez física, apresentadas por essas crianças, quatro a sete anos mais tarde. Estes défices de desenvolvimento físico e cognitivo, resultantes de diarreia persistente, em crianças malnutridas, em regiões pobres, não só apresentam elevados custos humanos e económicos para estes países, como perpetuam o ciclo da pobreza e do subdesenvolvimento [Guerrant et al., 2002]. Nos países industrializados, a infecção é mais comum em crianças entre o primeiro e o quinto ano de idade ocorrendo, também, em adultos, na sequência de contactos familiares com crianças infectadas, de exposição ocupacional, de viagens a zonas onde a doença é REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 37 endémica ou do contacto com animais infectados. A população, em geral, pode, ainda, ser afectada por surtos de criptosporidiose, após a ingestão de água ou de alimentos contaminados com oocistos [Casemore et al., 1997; Farthing, 2000]. Enquanto que, em países como a Austrália e os Estados Unidos da América, a criptosporidiose é uma das infecções humanas, transmitidas por via hídrica, mais prevalentes, a importância da infecção na Europa parece ser bastante variável. A maioria dos surtos de origem hídrica documentados no Velho Continente dizem respeito ao Reino Unido [Fricker e Crabb, 1998]. Nos Estados Unidos da América, segundo um relatório do CDC, para o período compreendido entre 1999 e 2002, o número de casos de criptosporidiose humana, declarados anualmente, foi de 2.769, 3.128, 3.787 e 3.016, respectivamente [Hlavsa et al., 2005]. Os autores crêem, contudo, que estes valores estejam muito aquém da realidade. Os estudos disponíves sobre a prevalência da criptosporidiose humana na Europa são escassos, estando limitados a um pequeno número de países, dos quais se destaca o Reino Unido, onde esta é uma doença frequente e de declaração obrigatória, encontrando-se os casos esporádicos e surtos de infecção por Cryptosporidium spp. bem documentados. Na Alemanha, embora menos frequente, a infecção é, de igual modo, de declaração obrigatória. No quadro II, são apresentados os números totais de casos declarados anualmente nestes países e, quando disponibilizada, a percentagem relativa ao grupo etário dos zero aos quatro anos, de acordo com dados das entidades oficiais de vigilância epidemiológica. QUADRO II – Número de casos de criptosporidiose declarados anualmente em três países europeus N.º DE CASOS DE CRIPTOSPORIDIOSE (% CASOS 0-4 ANOS) PAÍS 2000 2001 2002 2003 2004 REFERÊNCIA Alemanha - 1.481 (24%) 816 (29%) 885 (29%) 935 (21%) “Federal Statistical Office / Statistisches Bundesamt”, 2005 Reino Unido 5.774 3.625 2.992 5.863 (29%) 3.547 (31%) “Health Protection Agency”, 2005a, 2005b Irlanda do Norte 417 (54%) 360 (39%) 126 (59%) 140 (44%) 137 (53%) “Communicable Disease Surveillance Centre”, 2005 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 38 De entre os estudos epidemiológicos realizados na Europa é de referir um trabalho recente, efectuado em Barcelona, entre 2000 e 2004, envolvendo 1.473 doentes imunocompetentes com diarreia, onde foi encontrada uma prevalência global de criptosporidiose de 2,4% (35/1.473), sendo que 68,6% (24/35) dessas infecções foram observadas em crianças [González-Moreno et al., 2004]. Num outro estudo, realizado na Holanda, entre 1996 e 1997, foram detectados oocistos nas fezes de 2,1% (18/857) dos doentes com gastrenterite, descendo esse valor para 0,2% (1/574) na população sem queixas gastrenterológicas [de Wit et al., 2001]. Relativamente à população com infecção VIH/SIDA, um estudo multicêntrico, envolvendo 17 países europeus, com 6.548 doentes, conduzido entre 1979 e 1989, encontrou a percentagem global de infecção por Cryptosporidium spp. de 6,6% [Pedersen et al., 1996]. Em Portugal, a informação disponível sobre a criptosporidiose humana é escassa. Melo Cristino et al. (1988) descreveram um surto, o primeiro documentado em Portugal, que afectou 27% (28/103) das crianças e uma educadora do infantário do Hospital de Santa Maria, em Lisboa. Sete anos mais tarde, foi descrito um caso clínico de criptosporidiose disseminada num doente com SIDA, no Hospital de Santa Maria [Ferreira et al., 1995]. Em 1998, Matos et al. publicaram os resultados de um estudo efectuado entre 1988 e 1997 envolvendo doentes seropositivos para VIH com diarreia, também no Hospital de Santa Maria, onde a prevalência da criptosporidiose encontrada foi de 8% (36/465). A mesma autora, apresentou, quatro anos depois, um novo trabalho, envolvendo seropositivos para VIH de vários hospitais da região de Lisboa, abrangendo o período 1999-2001, tendo encontrado infecção por Cryptosporidium spp. em 9,7% (16/165) da amostra do estudo [Matos et al., 2002]. Nos quadros III e IV é apresentada uma síntese dos resultados de alguns estudos epidemiológicos realizados por diversos autores, em vários países, e publicados ao longo dos últimos anos. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 39 QUADRO III – Resultados de estudos epidemiológicos sobre a infecção por Cryptosporidium spp. em imunocompetentes, com e sem diarreia SINTOMÁTICOS (%) ASSINTOMÁTICOS (%) REFª Adultos Eslovénia 10,3% (62/602) - Logar et al., 1996 EUA 0,6% (2/315) - Ribes et al., 2004 Inglaterra e País de Gales 1,2% (463/37.763) - PHLS study group, 1990 Suécia 1,5 (12/786) 0% (0/203) Svenungsson et al., 2000 Suíça 0,2% (13/6.435) - Baumgartner et al., 2000 Crianças Arábia Saudita (idade <5 anos) 43% (27/63) 9,5% (18/190) Al Braiken et al., 2003 Bolívia (4 anos <idade <20 anos) - 31,6% (119/377) Esteban et al., 1998 Brasil (idade <11 anos) 18,7% (83/445) - Pereira M.G.C. et al., 2002 Cuba (idade <8 anos) 11,5% (13/113) 0% (0/288) Núñez et al., 2003 Dinamarca (idade <5 anos) 1,2% (4/327) 0% (0/561) Olesen et al., 2005 Eslovénia (idade <15 anos) 6,9% (39/563) - Logar et al., 1996 Espanha (idade <14 anos) 2,9% (334/11.599) - Moles et al., 1998 Gana (idade <6 anos) 27,8% (63/227) 15,6% (12/77) Adjei et al., 2004 Guatemala (2 anos ≤idade <14 anos) 32% (32/100) - Laubach et al., 2004 Índia (idade <5 anos) - 2,8% (14/508) Palit et al., 2005 Inglaterra e País de Gales (idade <15 anos) 4,1% (769/18.792) - PHLS study group, 1990 Irlanda (idade <13 anos) 4,4% (41/935) - Corbett-Feeney, 1987 México (idade <6 anos) 6,5% (26/403) - Enriquez et al., 1997 Nigéria (idade <15 anos) 15,2% (30/198) - Nwabuisi, 2001 Paquistão (idade <5 anos) 10,3% (49/475) 3,3% (5/150) Iqbal et al., 1999 Suíça (idade <14 anos) 4,8% (15/312) - Essers et al., 2000 Tanzânia (idade <5 anos) 8,8% (9/102) - Cegielski et al., 1999 Uganda (idade <6 anos) 25% (444/1.779) 8,5% (57/667) Tumwine et al., 2003 Zâmbia (idade <2 anos) 18,9% (17/90) - Amadi et al., 2001 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 46 9.2.2 ANIMAIS DE COMPANHIA A primeira descrição da infecção por Cryptosporidium spp. em gatos e cães aconteceu, respectivamente, no Japão, em 1979 e nos EUA, em 1983 [Iseki, 1979; Wilson et al., 1983]. Desde então, alguns autores têm documentado casos de criptosporidiose em canídeos e felídeos domésticos e, embora não se encontre, ainda, bem esclarecida a importância da doença nestes animais, o quadro clínico parece ser mais severo nos mais jovens, nos sujeitos a condições de “stress” e/ou com função imunitária diminuída [Robertson et al., 2000]. Nos cães, os animais com menos de seis meses de vida são mais afectados do que os adultos. Nestes últimos, a infecção é, na maior parte das vezes, assintomática, excepto quando em associação com infecções causadoras de imunossupressão, como a parvovirose ou a esgana [Turnwald et al., 1988; Denholm et al., 2001]. A importância para a saúde pública da criptosporidiose nestes animais, reside no facto de poderem constituir fontes de infecção zoonótica para o Homem. No Estado do Colorado, EUA, foi conduzida uma investigação sobre a prevalência da criptosporidiose em gatos tendo, para tal, sido estudados animais com dono e animais que viviam em associações de protecção. Os valores observados para as duas populações de animais foram de 3,9% (5/129) e 7,8% (6/77), respectivamente. Entre os gatos parasitados, 40% (2/5) dos que possuíam dono eram assintomáticos, o mesmo acontecendo em 83% (5/6) dos que viviam em associações [Hill et al., 2000]. Num estudo semelhante, efectuado na cidade de Perth, na Austrália, Sargent et al. (1998) encontraram uma prevalência global da criptosporidiose de 1,2% (2/162). Um trabalho realizado na cidade de Glasgow, na Escócia, envolvendo gatos com dono e gatos de rua, revelou prevalências de criptosporidiose de 5,1% (7/136) e 12,1% (12/99), respectivamente. De todos os animais com infecção por Cryptosporidium spp., apenas 21% (4/19) apresentavam diarreia e, destes quatro, três tinham menos de seis meses de idade [Mtambo et al., 1991]. Um outro estudo efectuado em Tóquio, no Japão, mostrou que 3,8% (23/608) dos gatos com dono excretavam oocistos de Cryptosporidium spp., sendo que 74% (17/23) dos mesmos eram jovens; no entanto, nenhum dos gatos parasitados apresentava diarreia [Arai et al., 1990]. No Hospital Veterinário da Universidade do Colorado, EUA, Hackett e Lappin (2003) estudaram os cães com dono que se apresentaram à consulta no período 1997-1998, tendo observado que 3,8% (5/130) dos animais apresentava infecção por Cryptosporidium spp.. Ainda, nos EUA, numa cidade do Estado da Califórnia, uma investigação envolvendo cães de REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 47 rua e de canis municipais revelou uma prevalência de criptosporidiose de 2% (4/200), sendo todos os animais parasitados adultos e assintomáticos [El-Ahraf et al., 1991]. Na cidade de Saragoça, em Espanha, Causapé et al. (1996) observaram em cães de rua e com dono percentagens de criptosporidiose de 6,8% (3/44) e 8,1% (3/37), respectivamente. Metade dos animais infectados apresentava diarreia, mas sofria, igualmente, de outras parasitoses concomitantes, nomeadamente de isosporose, não tendo, também, sido excluídas associações com infecções por outros agentes entéricos, como vírus ou bactérias. No Japão, num estudo efectuado em cães de rua sem diarreia, Abe et al. (2002), encontraram 9,3% (13/140) dos animais a excretarem oocistos de Cryptosporidium spp. Os autores, por sequenciação de DNA dos parasitas amplificado por PCR, identificaram a espécie responsável pela infecção em todos os cães como sendo C. canis. 9.2.3 ANIMAIS SILVÁTICOS Infecções por Cryptosporidium spp. têm sido documentadas em inúmeros animais silváticos e, embora alguns autores tenham sugerido que estes possam constituir eventuais reservatórios e fontes de infecção para o Homem e animais domésticos, desconhece-se a dimensão de tal contribuição. Nos animais adultos, a infecção por este protozoário é, na maior parte das vezes, assintomática, o número de oocistos excretados é baixo e a sua eliminação é intermitente, podendo, no entanto, prolongar-se por longos períodos [Casemore et al., 1997; Ramirez et al., 2004]. Embora tal não tenha sido demonstrado, o gado que vive em liberdade, nos campos de pasto, pode, também, constituir fonte de infecção para os animais silváticos, com os quais partilha o habitat, na medida em que muitos deles, nomeadamente pequenos mamíferos (roedores e insectívoros) e Cervídeos são susceptíveis à espécie C. parvum que é, também, a mais vezes encontrada no gado doméstico [Olson et al., 2004]. A presença ubíqua de pequenos mamíferos (roedores e insectívoros), no meio rural, e a partilha do habitat com gado doméstico, em explorações agrícolas e pecuárias, tem levado alguns autores a conduzirem investigações, no sentido de avaliar a ocorrência de parasitas do género Cryptosporidium nestes animais. Numa exploração agrícola e pecuária, no Reino Unido, Chalmers et al. (1997) estudaram a prevalência de Cryptosporidium spp. em três espécies de roedores (Mus domesticus, Apodemus sylvaticus e Clethrionomys glareolus), tendo, por análise morfométrica dos oocistos, encontrado o valor global de 18,6% (111/595) para C. parvum e de 6,4% (38/595) para C. muris; nenhum dos animais parasitados REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 48 apresentava sinais de diarreia. Também, no Reino Unido, Quy et al. (1999) encontraram, em três populações de Rattus norvegicus, 24% (105/438) de animais infectados por C. parvum. O mesmo grupo de trabalho alargou a investigação a outros mamíferos silváticos, nomeadamente, insectívoros, lagomorfos, ungulados e carnívoros, tendo identificado, por análise morfométrica, oocistos de C. parvum em ouriços-cacheiros, musaranhos, coelhos, texugos, raposas e gamos [Sturdee et al., 1999]. Numa Reserva Natural, na Polónia, Bajer et al. (2002) estudaram, entre 1997 e 1999, a prevalência de Cryptosporidium spp., em três espécies de roedores (Apodemus flavicollis, Clethrionomys glareolus e Microtus arvalis), tendo encontrado o valor global de 61,8% (582/942). Em Espanha, Torres et al. (2000) estudaram a ocorrência de Cryptosporidium spp., em cinco espécies de roedores (Apodemus sylvaticus, Apodemus flavicollis, Clethrionomys glareolus, Mus spretus e Rattus rattus) e em duas espécies de insectívoros (Crocidura russula e Sorex araneus), em várias zonas da Província da Catalunha, tendo, por análise morfométrica dos oocistos, encontrado prevalências globais de 24,9% (110/442) para C. parvum, de 2,9% (13/442) para C. muris e de 3,6% (16/442) para infecções com ambos os parasitas. Para além de pequenos roedores e insectívoros, alguns autores têm estudado a presença destes parasitas noutros mamíferos, nomeadamente Cervídeos e Suídeos. Atwill et al. (1997) estudaram a ocorrência de Cryptosporidium spp. em populações de javalis, que habitavam zonas ribeirinhas de lagos, lagoas, nascentes e charcos, dispersas por dez locais diferentes no Estado da Califórnia, EUA, tendo encontrado uma prevalência de 5,4% (12/221) e um risco de infecção maior nos animais com idade inferior a oito meses e pertencentes a populações mais numerosas. Num outro trabalho, também realizado na Califórnia, com o objectivo de determinar a presença de parasitas do género Cryptosporidium em gamos e veados de vida livre, foi observada a percentagem de positividade de 15,9% (13/82), sendo todos os animais assintomáticos [Deng e Cliver, 1999]. Rickard et al. (1999) encontraram, em veados que ocupavam diversas zonas nos estados da Virgínia e do Mississipi, EUA, prevalências de infecção por estes parasitas de 8,8% e 5%, respectivamente. Num estudo efectuado na Tapada Nacional de Mafra, em Portugal, Lourenço et al. (2000) observaram a presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em 100% (12/12) dos gamos estudados, todos com idades entre os nove meses e os quatro anos. Os estudos epidemiológicos realizados nestes animais são escassos, sendo, muitas vezes, relativos a pequenos grupos cativos em jardins zoológicos ou reservas naturais. Num trabalho efectuado no Jardim Zoológico de Lisboa, envolvendo 34 espécies de REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 49 ruminantes artiodáctilos, foram observados oocistos de Cryptosporidium spp. em 2,1% (8/388) das amostras fecais estudadas [Delgado et al., 2003]. Num estudo realizado no Jardim Zoológico de Barcelona, Gómez et al. (1996) e (2000) encontraram oocistos de Cryptosporidium spp., em amostras fecais de diversos animais, pertencentes a várias espécies de herbívoros (Girafídeos, Bovídeos, Cervídeos, Camelídeos, Rinocerotídeos e Elefantídeos) e de primatas (Lemurídeos, Pongídeos, Cercopitecídeos e Hapalídeos). A detecção de Cryptosporidium spp. em várias espécies de herbívoros e primatas em cativeiro foi, igualmente, descrita por outros autores, em países como a Polónia e os EUA [Heuschele et al., 1986; Kalishman et al., 1996; Majewska et al., 1997]. A ocorrência de criptosporidiose, em alguns destes animais, tem sido, também, documentada em Reservas Naturais, algumas das quais vizinhas de zonas rurais, onde os animais silváticos, as populações humanas e o seu gado doméstico partilham habitats muito próximos. Na Etiópia, Legesse e Erko (2004) encontraram prevalências de Cryptosporidium spp. em babuínos e macacos de 11,9% (7/59) e 29,3% (12/41), respectivamente, enquanto que no Uganda, Nizeyi et al. (1999) encontraram em gorilas um valor de 11% (11/100). Na Tanzânia, Mtambo et al. (1997) observaram prevalências de criptosporidiose em zebras, búfalos e gnus de 28% (7/25), 22% (8/36) e 27% (7/26), respectivamente. Os estudos existentes sobre a criptosporidiose nos animais silváticos são escassos e dispersos, contribuindo para o desconhecimento quanto ao seu papel de reservatório e veículo da infecção para o Homem e para outros animais, seja por contacto directo ou através de contaminação ambiental. 9.3 CONTAMINAÇÃO DOS RECURSOS HÍDRICOS A presença de oocistos de Cryptosporidium spp. na água subterrânea, lagos, rios, estuários e oceanos tem sido descrita por inúmeros autores [Fayer et al., 2004]. Diversos estudos, conduzidos nos EUA, evidenciaram a presença de oocistos em cerca de 80% da água superficial e de 26% da água de abastecimento tratada, em concentrações que variavam entre 0,001 e 484 oocistos/L, no primeiro caso, e entre 0,005 e 0,017 oocistos/L no segundo. Estudos idênticos, realizados no Reino Unido, mostraram que 50% da água superficial e 37% da água de abastecimento se encontravam contaminadas por Cryptosporidium spp. [Smith e Rose, 1998]. Moulton-Hancock et al. (2000) descreveram, ainda, REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 50 a presença de oocistos em 10% da água subterrânea investigada em 20 Estados dos EUA, evidenciando que a filtração, pelas diferentes camadas do solo, não é suficiente para evitar o transporte destes parasitas até aos lençóis de água que alimentam poços e fontes. Apesar da maior parte da informação existente na Europa dizer respeito ao Reino Unido, nos últimos anos, a comunidade científica europeia tem despertado para este problema e desenvolvido investigação diversa, a fim de avaliar a extensão da presença de criptosporídeos nos recursos hídricos. Na Áustria, foram detectados oocistos em 10% dos reservatórios de água não tratada estudados, sobretudo naqueles mais próximos das zonas de maior densidade populacional; no entanto, não foram encontrados parasitas na água de abastecimento [Hassl et al., 2001]. Num estudo efectuado na Suíça e na Alemanha foram encontrados oocistos em 30,4% dos 56 rios, riachos, lagos e lagoas examinados, confirmando a presença frequente destes parasitas na água superficial daqueles dois países [Ward et al., 2002]. Conio et al. (1999) encontraram oocistos em 21% dos rios e lagos estudados em algumas regiões de Itália, tendo, no entanto, a água subterrânea e de abastecimento sido negativas para a presença destes parasitas. Ainda, em Itália, foram encontrados oocistos no Mar Adriático, onde existem muitos viveiros de mexilhões, que são, com frequência, consumidos crus [Tamburrini e Pozio, 1999] e em 70% das amostras colhidas, durante um ano, no rio Tibre, em concentrações entre 0,9 e 19 oocistos/L [Bonadonna et al., 2004]. Numa investigação realizada na Noruega, Robertson e Gjerde (2001a) analisaram a água de lagos e de rios, em várias regiões do País, tendo detectado parasitas do género Cryptosporidium em 24,5% dos locais estudados, embora em baixas concentrações (o valor máximo encontrado foi de 3,75 oocistos/10 L). Estes autores observaram, ainda, a associação entre a presença de oocistos na água e a existência de gado bovino e ovino nas proximidades dos locais de amostragem. Os efluentes de esgotos, de origem humana, não tratados ou tratados inadequadamente, as descargas de explorações pecuárias e a escorrência de solos estrumados com dejectos animais, são, em geral, considerados como as principais fontes de contaminação dos recursos hídricos por criptosporídeos [Meinhardt et al., 1996]. Para além disso, uma vez que a infecção por C. parvum, uma das principais espécies causadoras da criptosporidiose humana, é, também, causa de infecção em animais silváticos, como pequenos mamíferos e Cervídeos, estes podem constituir fontes de dispersão ambiental de oocistos e de contaminação dos cursos de água [Sturdee et al., 1999; Lourenço et al., 2000]. A extensão da contaminação da água superficial é, ainda, dependente de factores geográficos, como a topografia dos terrenos e climáticos, como REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 51 chuvas fortes, enxurradas, inundações e degelos [Meinhardt et al., 1996; Rose et al., 2002; Fayer, 2004; Joachim, 2004]. Também as aves aquáticas podem ter um papel importante na contaminação da água superficial, com oocistos. Para tal contribuem, por um lado, o facto destas aves serem refractárias à infecção por C. parvum, permanecendo os oocistos viáveis e infecciosos após a passagem pelo seu tracto intestinal e, por outro, os seus hábitos de, durante as migrações de Outono e Primavera, se alimentarem em pastos e campos de cultivo, áreas onde podem existir oocistos viáveis, e de defecarem no meio aquático [Graczyk et al., 1997]. Por fim, importa salientar que, apesar dos parasitas do género Cryptosporidium serem ubíquos no ambiente aquático, o risco dessa presença para a saúde pública permanece uma incógnita, na medida em que: i) na maioria dos estudos descritos, a identificação da espécie e/ou genótipo dos oocistos encontrados não é determinada, desconhecendo-se a sua capacidade de causar infecção no Homem; ii) a presença de oocistos na água só constitui risco de infecção humana, se estes se encontrarem viáveis, o que nem sempre tem sido determinado; iii) muitas vezes, o número de oocistos encontrado é baixo, ignorando-se se é ou não suficiente para causar infecção humana, o que depende, não só da virulência da espécie/genótipo em questão, como do estado imunológico do hospedeiro [Centers for Disease Control and Prevention, 1995; Joachim, 2004]. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 52 10. EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA CRIPTOSPORIDIOSE A epidemiologia molecular é, actualmente, considerada como um ramo da epidemiologia que, através de técnicas de biologia molecular, proporciona um melhor conhecimento das doenças, não só ao nível da caracterização dos agentes que estão na sua origem, mas, também, em termos da sua ecologia e dinâmica da transmissão [Thompson et al., 1998]. Antes da utilização destas novas técnicas, a caracterização dos microrganismos do género Cryptosporidium era resultante de observações microscópicas da morfologia dos oocistos e/ou formas de desenvolvimento endógeno, da constatação do hospedeiro em que eram encontrados e de estudos de infecção experimental. Estas observações permitiram a identificação de inúmeras espécies de Cryptosporidium, o que originou grande confusão e controvérsia taxonómicas [O’Donoghue, 1995]. Porém, os conhecimentos disponíveis sobre estes parasitas sofreram um progresso significativo, após a aplicação das técnicas de biologia molecular, sobretudo as baseadas na reacção de PCR, ao estudo da sua epidemiologia. Esta metodologia tem-se revelado bastante promissora, esperando-se que possa trazer algum esclarecimento a questões importantes como: i) a variabilidade entre os parasitas do género Cryptosporidium; ii) a estrutura populacional e a taxonomia deste género; iii) a definição dos parasitas capazes de causar infecção humana; iv) a identificação das fontes de contaminação e de infecção para o Homem; v) a caracterização da dinâmica da transmissão da infecção em diferentes comunidades e situações; vi) a importância, para a saúde pública, da presença de oocistos em água de consumo e de recreio; vii) a patogenicidade e virulência apresentadas pelas diferentes espécies/genótipos que provocam doença humana [Moore et al., 2003; Thompson, 2003]. 10.1 IDENTIFICAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DO GÉNERO CRYPTOSPORIDIUM Os primeiros estudos sobre a diversidade entre estes parasitas davam conta da variabilidade fenotípica encontrada entre isolados de C. parvum de humanos e de gado doméstico (bovino, ovino e caprino). Esta variabilidade foi demonstrada através da técnica de “Western blotting”, com utilização de anticorpos monoclonais e policlonais, para análise da composição antigénica dos oocistos [Nichols et al., 1991; Nina et al., 1992] e da caracterização REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 53 isoenzimática [Ogunkolade et al., 1993; Awad-el-Kariem et al., 1995]. Em todos estes trabalhos foi observado um dimorfismo entre os isolados de C. parvum de origem humana e os de origem animal. No entanto, estas técnicas apresentavam a desvantagem de necessitarem de um número considerável de oocistos, o que, por vezes, era difícil de obter. A emergência das tecnologias baseadas na reacção de PCR permitiu ultrapassar o problema da escassez de oocistos obtidos a partir de amostras biológicas, tornando, assim, possível o estudo da epidemiologia molecular destes parasitas [Fayer et al., 2000]. Em 1995, Morgan et al., através da técnica de amplificação de polimorfismos de distribuição aleatória ou RAPD (acrónimo anglo-saxónico para “random amplified polymorphic DNA”), observaram que isolados de C. parvum, de origem humana e bovina, se dividiam em dois grupos, um contendo a maioria dos isolados humanos e outro abrangendo todos os isolados bovinos e restantes isolados humanos. Muitos outros autores desenvolveram investigações semelhantes, utilizando as técnicas de PCR, RFLP e sequenciação aplicadas à caracterização genética de isolados de C. parvum de humanos e de outros animais (principalmente gado doméstico), em regiões geográficas diversas. Estes estudos incidiram, essencialmente, sobre os genes que codificam a proteína da parede do oocisto de Cryptosporidium ou COWP (acrónimo anglo-saxónico para “Cryptosporidium oocyst wall protein”), a proteína de adesão relacionada com a trombospondina de Cryptosporidium-1 ou TRAP-C1 (acrónimo anglo-saxónico para “thrombospondin-related adhesive protein of Cryptosporidium 1”), a proteína de adesão relacionada com a trombospondina de Cryptosporidium-2 ou TRAP-C2 (acrónimo anglo-saxónico para “thrombospondin-related adhesive protein of Cryptosporidium 2”), a dihidrofolato reductase ou DHFR (sigla anglosaxónica para “dihydrofolate reductase”), a β-tubulina, a proteína de choque térmico de 70kDa ou HSP70 (sigla anglo-saxónica para “heat shock protein 70-kDa”), a sintetase da acetilcoenzima A, a subunidade pequena do rRNA (SSU-rRNA), as regiões dos espaçadores internos transcritos ou ITS (sigla anglo-saxónica para “internally transcribed spacers”) do rRNA e algumas regiões genómicas não codificantes. Os resultados de todas estas investigações confirmaram a existência de dois genótipos de C. parvum, distintos e amplamente conservados, o genótipo humano, encontrado em isolados de origem humana e o genótipo bovino, presente, quer em isolados de gado doméstico, quer em isolados humanos [Bonnin et al., 1996; Peng et al., 1997; Spano et al., 1997b; Gibbons et al., 1998; Morgan et al., 1998a; Patel et al., 1998; Spano et al., 1998a, 1998b; Sulaiman et al., 1998; Cacciò et al., 1999; Morgan et al., 1999b; Xiao et al., 1999a, 1999c; Alves et al., 2001a, 2001b]. Para além das diferenças genéticas existentes, entre REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 54 estes dois genótipos de C. parvum, estudos de infecção experimental mostraram que os isolados com o genótipo bovino tinham a capacidade de produzir infecção em ratinhos e em vitelos, o mesmo não acontecendo com aqueles que exibiam o genótipo humano [Peng et al., 1997]. Estes trabalhos mostraram, assim, a existência de duas populações de C. parvum distintas, com diferentes especificidades de hospedeiro e envolvidas em diferentes ciclos de transmissão: a população constituída pelos isolados com o genótipo bovino, abundante e conservada entre o gado doméstico, que se encontrava envolvida na transmissão zoonótica e a população dos isolados com o genótipo humano, envolvida num ciclo de transmissão antroponótico ocorrendo, exclusivamente, entre humanos [Peng et al., 1997; Patel et al., 1998]. A estes estudos, seguiram-se inúmeras investigações, realizadas com o objectivo de identificar e caracterizar a diversidade genética existente entre os isolados de Cryptosporidium spp. encontrados em diversos hospedeiros animais, nomeadamente outros animais domésticos, animais de companhia e animais silváticos, de várias regiões geográficas. A sequenciação, entre outros, dos genes que codificam a SSU-rRNA e as proteínas COWP, HSP70 e actina, o alinhamento e a análise filogenética, para cada gene, das sequências nucleotídicas obtidas para os diversos isolados caracterizados, evidenciou a existência de sequências únicas, que apresentavam diferenças significativas entre si. Estes resultados mostraram que C. parvum não era uma espécie uniforme, mas sim constituída por vários genótipos distintos, aos quais foi dado o nome do hospedeiro onde os isolados haviam sido identificados. Assim, para além do genótipo bovino, encontrado em bovinos, caprinos, ovinos, suínos, roedores, Cervídeos e outros mamíferos, foram identificados inúmeros genótipos de C. parvum, adaptados ao hospedeiro, tais como os genótipos bovino B, porco I, porco II, , coelho, rato, marsupial I, marsupial II, furão, cão, esquilo, gamo, cervo, macaco, urso, raposa, pato, ganso, tentilhão, lagarto e dois genótipos de C. muris, entre outros. A análise filogenética constituiu, ainda, evidência adicional da validade das espécies C. felis, C. muris, C. baileyi, C. serpentis, C. wrairi, C. meleagridis e C. saurophilum [Morgan et al., 1998b, 1999a, 1999d, 1999e; Xiao et al., 1999a, 1999c; Morgan et al., 2000b; Sulaiman et al., 2000; Atwill et al., 2001; Graczyk et al., 2001; Morgan et al., 2001; Perz e Le Blancq, 2001; Sulaiman et al., 2002; Xiao et al., 2002b; Abe e Iseki, 2003; Ryan et al., 2003b; Silva et al., 2003; Power et al., 2004; Xiao et al., 2004b; Zhou et al., 2004]. Na figura 6, encontra-se representada uma árvore filogenética, construída para várias espécies e genótipos de Cryptosporidium, por comparação das respectivas sequências do gene que codifica a SSU-rRNA, onde podem observar-se dois grupos monofiléticos, REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 55 correspondentes aos seus braços principais, um constituído pelos parasitas intestinais e a espécie respiratória C. baileyi e outro contendo os parasitas gástricos. FIGURA 6 – Relação filogenética entre espécies e genótipos, pertencentes ao género Cryptosporidium, inferida pela análise de sequências do gene SSU-rRNA, através do método “neighbor joining”, tendo por base distâncias genéticas calculadas pelo modelo de dois parâmetros de Kimura. Os números sobre os ramos indicam os valores de confiança, determinados por análise de “bootstrap” com 1.000 réplicas [Xiao et al., 2004a] A extensão da distância genética, existente entre alguns dos novos genótipos, levou alguns autores a sugerir que pudessem tratar-se de espécies de Cryptosporidium distintas. No entanto, para que novas espécies pudessem ser descritas, foi necessário correlacionar as diferenças genéticas, com outras características biológicas, como a especificidade de hospedeiro, o local de infecção, a patogenicidade e a virulência [Morgan et al., 1999e; Xiao et al., 1999c]. Foi o que aconteceu, por exemplo, com C. andersoni. Oocistos semelhantes a C. muris, IntestinaisGástricos 0.02 substituições de nucleótido/posição Eimeria tenella AF026388 C. saurophilum C. felis C. meleagridis Genótipo tartaruga Genótipo esquilo Genótipo rato-almiscareiro I C. suis Genótipo porco II Genótipo urso Genótipo marsupial II Genótipo cavalo Genótipo rato C. canis genótipo coiote Genótipo galinhola C. bovis Genótipo coelho Genótipo cervo Genótipo pato C. parvum Genótipo toirão americano C. wrairi Genótipo furão Genótipo gambá I Genótipo marsupial I Genótipo macaco C. hominis Genótipo raposa Genótipo rato-almiscareiro II Genótipo gamo-rato Genótipo gambá II C. canis genótipo cão C. canis genótipo raposa Genótipo ganso I Genótipo ganso II Genótipo gamo Genótipo semelhante ao do gamo Genótipo cobra C. baileyi C. serpentis Genótipo lagarto C. andersoni C. muris C. galli genótipo tentilhão C. galli 100 99 98 96 93 77 60 98 92 83 89 99 70 70 92 98 81 78 95 100 IntestinaisGástricos 0.02 substituições de nucleótido/posição Eimeria tenella AF026388 C. saurophilum C. felis C. meleagridis Genótipo tartaruga Genótipo esquilo Genótipo rato-almiscareiro I C. suis Genótipo porco II Genótipo urso Genótipo marsupial II Genótipo cavalo Genótipo rato C. canis genótipo coiote Genótipo galinhola C. bovis Genótipo coelho Genótipo cervo Genótipo pato C. parvum Genótipo toirão americano C. wrairi Genótipo furão Genótipo gambá I Genótipo marsupial I Genótipo macaco C. hominis Genótipo raposa Genótipo rato-almiscareiro II Genótipo gamo-rato Genótipo gambá II C. canis genótipo cão C. canis genótipo raposa Genótipo ganso I Genótipo ganso II Genótipo gamo Genótipo semelhante ao do gamo Genótipo cobra C. baileyi C. serpentis Genótipo lagarto C. andersoni C. muris C. galli genótipo tentilhão C. galli 100 99 98 96 93 77 60 98 92 83 89 99 70 70 92 98 81 78 95 100 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 62 FIGURA 7 – Representação esquemática dos ciclos de transmissão e reservatórios de infecção das espécies e genótipos de Cryptosporidium, associados à criptosporidiose humana [adaptado de Thompson, 2003] 10.3 ESPÉCIES E GENÓTIPOS ENCONTRADOS EM OUTROS HOSPEDEIROS VERTEBRADOS A presença de microrganismos do género Cryptosporidium, em vários hospedeiros vertebrados, tem sido descrita por inúmeros autores. Na maioria dos casos, a identificação dos parasitas tem sido efectuada, unicamente, por observação microscópica da morfologia dos oocistos e, os isolados encontrados, têm sido designados como C. parvum ou Cryptosporidium spp.. Uma vez que, só recentemente, as metodologias de biologia molecular foram aplicadas ao estudo destes parasitas, desconhece-se quantos deles correspondem a espécies ou genótipos já identificados [Fayer, 2004]. C. parvum C. parvumi C. hominisi C. meleagridis . C. canis C. felis C. muris Genótipo cervo Outras espécies Outros g enóti p os ? ? + outros animais C. suisii REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 63 O número de animais distintos, pertencentes ao grupo dos mamíferos, onde, até à data, foram encontrados parasitas de Cryptosporidium spp. ascende a 155 [Fayer, 2004]. Resultados de investigações recentes evidenciaram a existência de enorme diversidade biológica e genética entre as espécies de Cryptosporidium que infectam estes animais. As espécies de Cryptosporidium que têm como hospedeiros principais animais pertencentes ao grupo dos mamíferos são: C. parvum, C. hominis, C. muris, C. andersoni, C. bovis, C. suis, C. canis, C. felis e C. wrairi. Para além destas oito espécies foram, ainda, identificados dois genótipos de C. canis (genótipos raposa e coiote) e diversos genótipos de Cryptosporidium spp. adaptados ao hospedeiro [Xiao et al., 2004a; Xiao e Ryan, 2004]. Apesar de a criptosporidiose ter sido descrita em mais de 30 espécies diferentes de aves, apenas se conhecem três espécies de Cryptosporidium responsáveis por essas infecções: C. meleagridis, C. baileyi e C. galli. Todas elas têm a capacidade de infectar um grande número de aves, divergindo, no entanto, quanto ao local de infecção (ver quadro I). Também entre os isolados de Cryptosporidium spp., encontrados em aves, foram identificados genótipos adaptados ao hospedeiro, nomeadamente quatro genótipos ganso, um genótipo pato e um genótipo galinhola [Xiao et al., 2004a; Xiao e Ryan, 2004]. Entre os vertebrados, os répteis e, sobretudo as cobras, são os animais em que a criptosporidiose se manifesta de uma forma mais severa, sendo causa de elevada mortalidade. Apesar de vários autores terem documentado prevalências elevadas desta infecção, principalmente nos répteis em cativeiro, poucos têm efectuado a caracterização desses parasitas. As duas espécies, actualmente, conhecidas, como causa de infecção em répteis são C. serpentis e C. saurophilum. Dos genótipos adaptados ao hospedeiro encontrados nos répteis fazem parte dois genótipos cobra, um genótipo lagarto e um genótipo tartaruga [Xiao et al., 2004a; Xiao e Ryan, 2004]. Nos peixes, é considerada válida a espécie C. molnari. No entanto, a definição desta espécie, por Alvarez-Pellitero e Sitjà-Bobadilla (2002), foi feita, unicamente, com base em características ultra-estruturais e histopatológicas, não tendo sido efectuada a caracterização genética dos parasitas. Recentemente, o mesmo grupo de trabalho descreveu uma nova espécie, C. scophthalmi, no epitélio intestinal de pregados (Scophthalmi maximus L.) de aquacultura [Alvarez-Pellitero et al., 2004]. Também neste caso, a caracterização da espécie foi baseada, exclusivamente, em observações ultraestruturais e histopatológicas. A ausência de uma identidade genética, para estas espécies, pode vir a constituir um problema no futuro, REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 64 quando forem identificados em peixes outro(s) parasita(s), que possa(m) vir a ser descrito(s) como nova(s) espécie(s) [Xiao et al., 2004a; Xiao e Ryan, 2004]. Até há pouco tempo considerava-se que, somente, duas espécies eram responsáveis pela criptosporidiose em gado bovino: C. parvum e C. andersoni. Enquanto que a primeira infecta o intestino e provoca diarreia aguda, em animais não desmamados, a segunda infecta o abomaso, em animais jovens e adultos, não originando sintomatologia gastrintestinal, provocando, apenas, diminuição da produção de leite [Olson et al., 2004]. Recentemente, foram identificados dois novos genótipos, em gado bovino, aos quais foi dado o nome de Cryptosporidium genótipo bovino B (posteriormente descrito como nova espécie – C. bovis) e Cryptosporidium genótipo semelhante ao do gamo (do inglês, “deer-like genotype”) [Xiao et al., 2002b; Santín et al., 2004; Fayer et al., 2005]. Santín et al. (2004), estudaram 971 vitelos, pertencentes a 15 explorações pecuárias, localizadas em sete Estados Norte Americanos, tendo observado infecção por C. parvum em 100% dos animais até às duas semanas de vida e entre 60% a 90% dos vitelos até aos dois meses. A partir das duas semanas de vida já observaram, em alguns animais, a infecção por C. bovis e por Cryptosporidium genótipo semelhante ao do gamo. Nos animais que já haviam sido desmamados (idade superior a três meses) não foi observada infecção por C. parvum, tendo, somente, sido encontrados C. andersoni, C. bovis e Cryptosporidium genótipo semelhante ao do gamo. Uma vez que, das quatro espécies/genótipos encontrados em gado bovino, apenas C. parvum é conhecida como causa de infecção humana, só através da caracterização genética dos isolados implicados na criptosporidiose bovina se poderá avaliar o seu potencial zoonótico e determinar o risco de transmissão ao Homem [Santín et al., 2004]. Em termos epidemiológicos, a característica de adaptabilidade ao hospedeiro, exibida pela maioria das espécies e genótipos de Cryptosporidium, pode significar que grande parte destes parasitas não tem elevado potencial infectante para o Homem. De facto, a maioria das espécies e genótipos, encontradas em répteis e em muitos outros animais silváticos, apresentam um grupo restrito de hospedeiros onde causam infecção, nunca tendo sido encontrados em humanos. Recentemente, com o propósito de avaliar o risco para a saúde pública da contaminação do meio aquático com oocistos de Cryptosporidium spp., foi realizado, nos EUA, um estudo envolvendo cinco espécies de mamíferos que habitam terrenos adjacentes a zonas fluviais (raposa, castor, lontra, rato almiscareiro e guaxinim). A caracterização molecular, dos oocistos encontrados nesses hospedeiros, permitiu identificar C. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 65 canis, C. canis genótipo raposa e mais três genótipos de Cryptosporidium spp. adaptados ao hospedeiro que, até à data, não foram encontrados em humanos, nem em gado doméstico. Os autores concluíram, assim, que as espécies e genótipos de Cryptosporidium adaptados ao hospedeiro excretadas por estes animais, não constituem risco elevado para a saúde pública [Zhou et al., 2004]. No entanto, a adaptabilidade ao hospedeiro não é sinónimo de estrita especificidade, sendo frequente encontrar-se uma determinada espécie ou genótipo de Cryptosporidium spp. em mais do que um hospedeiro. Exemplos disso, são os casos de criptosporidiose humana, devidos à infecção pelas espécies zoonóticas C. parvum, C. meleagridis, C. felis, C. canis, C. suis, C. muris e Cryptosporidium genótipo cervo. Exceptuando C. parvum e C. meleagridis, encontrados, com mais frequência, em infecções humanas e que infectam um largo número de hospedeiros distintos, as restantes espécies infectam um número limitado de hospedeiros e, até à data, foram associadas a um pequeno número de casos humanos, a maioria deles em crianças e em infectados por VIH. Se, por um lado, é possível especular sobre a maior susceptibilidade dessas pessoas àqueles parasitas não se pode, por outro, excluir a possibilidade dos animais domésticos, de companhia e silváticos, constituírem potenciais reservatórios de infecção para o Homem. Todavia, o papel destes animais na transmissão das diferentes espécies e genótipos de Cryptosporidium ao Homem é, ainda, desconhecido, em resultado da ausência de estudos epidemiológicos que permitam conhecer a sua prevalência naqueles animais. Deste modo, é necessário que a comunidade científica e as autoridades de saúde pública estejam atentas, na medida em que algumas das espécies e genótipos pouco prevalentes ou, ainda, não encontradas no Homem, podem emergir como novos parasitas humanos, se surgirem condições socioeconómicas e ambientais que favoreçam a sua transmissão [Xiao et al., 2002b, 2004a; Xiao e Ryan, 2004]. 10.4 IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES E DE GENÓTIPOS ENCONTRADOS NA ÁGUA Os métodos convencionais, para detecção da presença de oocistos na água, baseiam-se no método 1622, recomendado pela “United States Environmental Protection Agency”, que consiste num processo de concentração por filtração, isolamento dos oocistos por separação imunomagnética e sua detecção por uma técnica de imunofluorescência [Carey et al., 2004]. Contudo, este procedimento não permite a identificação das espécies e genótipos dos oocistos encontrados, invalidando, assim, a avaliação do risco que constitui, para a saúde pública, a sua REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 66 presença nos recursos hídricos. Embora seja frequente a contaminação de cursos e reservatórios de água, com oocistos de Cryptosporidium spp., é natural que nem todos pertençam a espécies responsáveis pela infecção humana, dado que as fontes de contaminação podem ser muito diversas [Xiao et al., 2004a]. A possibilidade de aplicar as técnicas de biologia molecular à caracterização genética e à identificação dos isolados encontrados em amostras de água veio permitir identificar o seu potencial infectante para o Homem e ultrapassar as limitações associadas à utilização dos métodos convencionais. Xiao et al. (2000a) analisaram 29 amostras de água de tempestade, recolhidas numa zona de floresta no Estado de Nova Iorque, tendo identificado a espécie C. baileyi e 11 genótipos diferentes de Cryptosporidium spp., todos eles adaptados a hospedeiros silváticos e nunca encontrados em humanos. O mesmo grupo de trabalho analisou, ainda, água superficial não tratada, recolhida em nove Estados Norte Americanos, tendo identificado a presença das espécies C. parvum, C. hominis, C. andersoni e C. baileyi, todas elas encontradas, com frequência no Homem ou em gado doméstico, sugerindo serem estas as principais fontes de contaminação [Xiao et al., 2001b]. No Japão, estudos efectuados em amostras de água, recolhidas em vários rios, identificaram a presença das espécies C. parvum e C. meleagridis, levando os autores a sugerir a eventual contaminação com origem em gado doméstico [Karasudani et al., 2001; Ono, et al., 2001]. Na Europa, mais concretamente na Suíça e na Alemanha, em amostras de água superficial e de efluentes de estações de tratamento de águas residuais, foram encontrados oocistos de C. hominis, C. parvum, C. andersoni, C. muris, C. baileyi e três genótipos silváticos não identificados, sendo as primeiras quatro espécies as mais prevalentes. Duas delas – C. parvum e C. hominis – são as responsáveis pela maioria dos casos de criptosporidiose humana devendo, a sua presença na água, constituir um alerta para as entidades de saúde pública. Entre as possíveis fontes de contaminação daqueles recursos hídricos, os autores enumeram o gado bovino, abundante naqueles países, efluentes de origem humana, pequenos roedores, aves aquáticas e outros animais silváticos [Ward et al., 2002]. Na Irlanda do Norte, Lowery et al. (2001) analisaram diversas amostras de água superficial tratada e não tratada, tendo identificado C. parvum como a única espécie de Cryptosporidium presente nas amostras estudadas. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 67 A presença de C. andersoni, C. bayleyi, C. muris e diversos genótipos silváticos na água, indica a provável contaminação por gado doméstico e por alguns animais silváticos. Porém, é importante salientar que a identificação de C. parvum na água não permite uma associação tão linear ao reservatório zoonótico, dada a possibilidade da sua contaminação ter tido origem humana [Xiao et al., 2004a]. Os casos aqui descritos confirmam a diversidade de espécies e genótipos de Cryptosporidium, presentes nos cursos e reservatórios de água. Sendo que apenas parte destes parasitas é responsável pela infecção humana, a avaliação do risco para a saúde pública, que constitui a sua presença nos recursos hídricos, só poderá ser determinada com o auxílio de técnicas de biologia molecular, para identificação do seu potencial infectante para o Homem. Todavia, é fundamental salientar que a avaliação do risco para a saúde pública só se completa após a determinação da viabilidade e infecciosidade dos oocistos encontrados [Centers for Disease Control and Prevention, 1995; Joachim, 2004]. 10.5 VARIAÇÃO INTRA-ESPECÍFICA EM C. PARVUM E C. HOMINIS Recentemente, a caracterização de vários loci genéticos, em isolados de C. hominis e C. parvum evidenciou a existência de polimorfismos intra-específicos, que permitiam a identificação de vários alelos e subtipos dentro de cada uma das espécies [Aiello et al., 1999; Feng et al., 2000; Strong et al., 2000; Cacciò et al., 2001]. O reconhecimento desta heterogeneidade intra-específica possibilitou o desenvolvimento de métodos que permitem atingir maior resolução da variabilidade genética existente em isolados de C. hominis e de C. parvum. Os microssatélites, também chamados repetições curtas aleatórias ou STR’S (sigla anglosaxónica para “short tandem repeats”), são pequenas unidades de DNA não codificante, constituídas por dois a sete nucleótidos, que se repetem sucessivamente e se encontram, amplamente, distribuídas no genoma de vários organismos eucariotas. O número de vezes que essas unidades se encontram repetidas é muito polimórfico, permitindo a distinção de vários alelos, em função do número de repetições existentes [Weber e May, 1989]. A análise de STR’S tem sido utilizada, por alguns autores, para avaliar a variabilidade intra-específica existente em C. hominis e em C. parvum. Cacciò et al. (2000), através da análise de um locus de microssatélites, em vários isolados humanos e bovinos, oriundos da Itália, da Holanda, do Japão e dos EUA, observaram a existência de dois alelos distintos em C. hominis e quatro em REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 68 C. parvum. Num outro locus, os mesmos autores observaram, ainda, a existência de sete alelos distintos entre os isolados de C. parvum de origem humana e bovina, de várias regiões de Itália. Um destes alelos foi identificado, somente, em isolados humanos, acontecendo o contrário com outros dois alelos, encontrados, exclusivamente, em isolados bovinos [Cacciò et al., 2001]. Feng et al. (2000) identificaram no genoma de C. hominis e C. parvum 14 loci de STR’S, tendo avaliado a sua utilidade na caracterização intra-específica dos parasitas daquelas espécies. Enquanto que alguns destes loci se revelaram muito polimórficos, com os isolados de ambas as espécies a exibirem vários alelos diferentes, outros apresentaram uma resolução mais limitada, não permitindo observar variação genética, em uma ou ambas as espécies. Na Dinamarca, Enemark et al. (2002a) utilizaram o STR descrito por Cacciò et al. (2000), para a caracterização de C. hominis e C. parvum de origem humana e bovina, tendo encontrado, nos isolados de C. hominis, um dos dois alelos identificados, inicialmente, por Cacciò e colaboradores e, nos parasitas de C. parvum, três dos quatro alelos descritos, também, por estes autores. Mallon et al. (2003a) analisaram, em 180 isolados humanos e bovinos de C. parvum e C. hominis, da região de Aberdeenshire, na Escócia, sete loci de microssatélites. O número de alelos observados, para as duas espécies, nos sete marcadores, variou entre o mínimo de três e o máximo de 13. A combinação do alelo exibido por cada isolado para cada um dos sete loci permitiu identificar 37 haplotipos distintos, sete correspondentes à espécie C. hominis e os restantes 30 a C. parvum. A construção de um dendograma de semelhança para os diferentes haplotipos juntou todos os isolados de C. hominis no mesmo grupo, embora sendo evidente a sua separação em dois subgrupos distintos. Os isolados de C. parvum foram distribuídos por cinco grupos diferentes, contendo, dois deles, unicamente isolados de origem humana e os restantes três, isolados de ambos os hospedeiros. O gene GP60 (também denominado gp15/45/60) codifica uma glicoproteína precursora de 60-kDa que, após clivagem, dá origem às glicoproteínas de superfície gp45 e gp15, envolvidas na ligação e na invasão dos enterócitos pelos esporozoítos. A sequenciação do gene GP60, em isolados de humanos e de bovinos de diferentes regiões geográficas, revelou que este locus apresenta elevada variabilidade genética, exibindo vários polimorfismos, principalmente entre os isolados de C. hominis [Strong et al., 2000]. Estes autores encontraram quatro subtipos diferentes, entre os isolados desta espécie, não tendo observado variação em C. parvum. Várias outras investigações se seguiram envolvendo a sequenciação do gene GP60 em isolados humanos e bovinos, de países como o Malawi, o Quénia, a Guatemala, o Kuwait, REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 69 a África do Sul, Portugal, a Irlanda do Norte, a Austrália e os EUA, tendo mostrado a existência de inúmeros polimorfismos tanto em C. parvum como em C. hominis. Actualmente, encontram-se identificadas 11 famílias de subtipos, cinco em C. hominis e seis em C. parvum compreendendo, cada uma, vários subtipos distintos. A maioria das famílias descritas apresenta ampla distribuição geográfica, sendo encontrada em isolados de regiões muito diferentes. Do mesmo modo, numa determinada região geográfica, tem sido observada a presença de várias famílias diferentes. Somente um pequeno número de famílias de subtipos apresenta distribuição geográfica limitada, sendo estas encontradas, apenas, em isolados de regiões geográficas restritas [Peng et al., 2001; Sulaiman et al., 2001; Glaberman et al., 2002; Leav et al., 2002; Alves et al., 2003b; Peng et al., 2003a, 2003b; Sulaiman et al., 2005]. A elevada resolução obtida através da caracterização do gene GP60, em isolados de C. hominis e de C. parvum, apresenta enorme potencial, não só para a identificação de fontes de infecção, em situações de surto, constituindo informação valiosa para a implementação de medidas de controlo da transmissão, mas, também, para a caracterização da dinâmica da transmissão da criptosporidiose, em zonas endémicas [Feng et al., 2000; Mallon et al., 2003a; Xiao e Ryan, 2004]. A investigação realizada, ao longo dos últimos anos, no âmbito da epidemiologia molecular da criptosporidiose, trouxe alguns progressos importantes no que diz respeito ao conhecimento da diversidade de microrganismos que constituem o género Cryptosporidium, do significado para a saúde pública de alguns desses parasitas e da existência de vários ciclos de transmissão distintos que envolvem o Homem. Contudo, muitas questões continuam, ainda, em aberto, nomeadamente no que se refere à importância das espécies zoonóticas para a saúde pública, à dinâmica da transmissão da criptosporidiose em diferentes comunidades, ao significado da variação geográfica da distribuição dos casos humanos, devidos a C. hominis e a C. parvum, na transmissão da doença e, ainda, à correlação entre as características genéticas dos parasitas com a sua virulência e patogenicidade. O conhecimento aprofundado de todas estas questões possibilitará, num futuro que esperamos próximo, desenvolver estratégias de prevenção e de controlo adequadas, capazes de quebrar os ciclos de transmissão da criptosporidiose humana [Thompson, 2003; Xiao e Ryan, 2004]. 70 - Segunda Parte - CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DA CRIPTOSPORIDIOSE EM PORTUGAL 71 Capítulo I OBJECTIVOS QUADRO VIII – Mamíferos do Jardim Zoológico de Lisboa cujas fezes foram submetidas a técnicas parasitológicas, para identificação de oocistos de Cryptosporidium spp. NOME (ESPÉCIE) Canguru de pescoço vermelho (Macropus rufogriseus) Lémure de cauda anelada (Lemur catta) Lémure de face branca (Lemur macaco albifrons) Lémure preto (Lemur macaco macaco) Lémure mangusto (Lemur mongoz) Lémure castanho (Varecia variegata rubra) Lémure de colar preto e branco (Lemur variegatus variegatus) Macaco uivador (Alouatta caraya) Macaco capuchinho (Cebus apella) Saki de face branca (Pithecia pithecia) Macaco Goeldi (Callimico goeldii) Saguim prateado (Callithrix argentata) Saguim de face branca (Callithrix geoffroyi) Mico leão de juba dourada (Leontopithecus rosalia chrysomelas) Mico leão dourado (Leontopithecus rosalia rosalia) Saguim de cabeça castanha (Saguinus fuscicollis) Saguim imperador (Saguinus imperator subgrisescens) Saguim de beiço branco (Saguinus labiatus labiatus) Saguim de mãos douradas (Saguinus midas midas) Saguim de mãos negras (Saguinus midas niger) Saguim cabeça de algodão (Saguinus oedipus oedipus) Macaco tarrafe (Cercopithecus aethiops sabeus) Macaco de cauda vermelha (Cercopithecus ascanius ascanius) Macaco de beiço branco (Cercopithecus cephus cephus) Macaco Diana (Cercopithecus diana diana) Macaco mona (Cercopithecus mona) Macaco de Brazza (Cercopithecus neglectus) Macaco de nariz branco (Cercopithecus petaurista petaurista) Colobo Guerezza (Colobus guereza kikuyuensis) Macaco do Japão (Macaca fuscata fuscata) Macaco cauda de leão (Macaca silenus) Babuíno da Guiné (Papio cynocephalus papio) Babuíno Hamadrias (Papio hamadryas hamadryas) Mandril (Papio sphinx) Langur de Douc (Pygathrix nemaeus nemaeus) Gorila (Gorilla gorilla gorilla) Gibão de mãos brancas (Hylobates lar) Siamango (Hylobates syndactylus) Chimpanzé (Pan troglodytes) Preguiça de dois dedos (Choloepus didactylus) Lobo ibérico (Canis lupus signatus) Feneca (Fennecus zerda) Raposa (Vulpes vulpes silacea) Urso do Tibete (Selenarctos thibetanus) Urso pardo (Ursus arctos) Chita (Acinonyx jubatus jubatus) Lince ibérico (Felis lynx lynx) Ocelote (Felis pardalis) Serval (Felis serval) Pantera nebulosa (Neofelis nebulosa) Leão de Angola (Panthera leo bleyenberghi) Jaguar (Panthera onca) Leopardo (Panthera pardus) Tigre da Sibéria (Panthera tigris altaica) Tigre de Sumatra (Panthera tigris sumatrae) Pantera das neves (Pantera uncia) Leão marinho da Califórnia (Zalophus californianus) Foca vitulina (Phoca vitulina) Elefante indiano (Elephas maximus indicus) Elefante africano (Loxodonta africana africana) Zebra de Grevy (Equus grevyi) Burro (Equus asinus) Pónei (Equus caballus) Rinoceronte branco (Ceratotherium simum simum) Rinoceronte indiano (Rhinoceros unicornis) Porco (Sus scrofa) Hipopótamo pigmeu (Choeropsis liberiensis liberiensis) Hipopótamo (Hippopotamus amphibius) Camelo (Camelus bactrianus bactrianus) Dromedário (Camelus dromedarius) Lama (Lama glama glama), Axis (Cervus axis axis) Veado do Canadá (Cervus elaphus canadensis) Veado da Birmânia (Cervus eldi thamin) Girafa de Angola (Giraffa camelopardalis angolensis) Cabra (Capra hircus hircus) Addax (Addax nasomaculatus) Impala de face negra (Aepyceros melampus petersi) Vaca do mato (Alcelaphus buselaphus caama) Muflão africano (Ammotragus lervia) Cervicapra (Antilope cervicapra) Bisonte americano (Bison bison bison) Iaque (Bos mutus grunniens) Gnu de cauda branca (Connochaetes gnou) Gnu azul (Connochaetes taurinus taurinus) Damalisco dorcas (Damaliscus dorcas dorcas) Palanca ruana (Hippotragus equinus) Palanca negra (Hippotragus niger niger) Cobo de crescente (Kobus ellipsiprymnus ellipsiprymnus) Cobo de leche (Kobus leche leche) Orix Cimitarra (Oryx dammah) Orix austral (Oryx gazella gazella) Orix da Arábia (Oryx leucoryx) Búfalo africano (Syncerus caffer caffer) Pacaça (Syncerus caffer nanus) Elande (Taurotragus oryx oryx) Niala (Tragelaphus angasi) Bongo (Tragelaphus eurycerus isaaci) Sitatunga (Tragelaphus spekei gratus) Cavalo de Timor (Tragelaphus strepsiceros strepsiceros) II – MATERIAL E MÉTODOS 79 QUADRO IX – Aves do Jardim Zoológico de Lisboa cujas fezes foram submetidas a técnicas parasitológicas, para identificação de oocistos de Cryptosporidium spp. NOME (ESPÉCIE) Faisão Lady Amherst (Chrysolophus amherstiae) Faisão dourado (Chrysolophus pictus) Faisão manchuriano azul (Crossoptilon aurtium) Faisão manchuriano do Tibete (Crossoptilon crossoptilon drouynii) Faisão siamês (Lophura diardi) Faisão de Edward (Lophura edwardsi) Faisão imperial (Lophura imperialis) Faisão Swinhoe (Lophura swinhoii) Faisão de Palawan (Polyplectron emphanum) Faisão de Germain (Polyplectron germaini) Faisão de Elliot (Syrmaticus ellioti) Faisão venerado (Syrmaticus reevesi) Faisão tragopan Satyr (Tragopan satyra) Faisão tragopan Temminck (Tragopan temminckii) Pombo da fruta de ventre laranja (Ptilinopus iozonus) Pombo da fruta de garganta preta (Ptilinopus leclancheri) Pombo da fruta soberbo (Ptilinopus superbus) Catatua pequena de crista amarela (Cacatua sulphurea sulphurea) Catatua de Leadbeater (Cacatua leadbeateri) Catatua galah (Elophus roseicapillus) Papagaio chuão (Amazona dufresniana rhodocorytha) Papagaio de face verde (Amazona viridigenalis) Arara maracanã (Ara maracana) Arara nanica (Ara nobilis nobilis) Jandaia ventre de fogo (Aratinga auricapilla aurifrons) Periquito dourado (Aratinga guarouba) Jandaia (Aratinga jandaya) Papagaio cabeça de falcão (Deroptyus accipitrinus accipitrinus) Papagaio eclectus (Eclectus roratus polychloros) Marianinha de cabeça branca (Pionites leucogaster) Papagaio de bico grosso (Rhynchopsitta pachyrhyncha) Turaco da costa dourada (Tauraco corythaix persa) Turaco de face branca (Tauraco leucotis leucotis) Turaco de bico preto (Tauraco schuetti) Turaco violeta (Musophaga violácea violacea) Turaco de Hartlaub (Tauraco hartlaubi) Kokaburra (Dacelo novaeguineae) As amostras fecais foram submetidas a técnicas parasitológicas, para o diagnóstico da criptosporidiose. Os isolados detectados foram, subsequentemente, sujeitos a caracterização genética, fazendo uso de técnicas de biologia molecular. A caracterização molecular foi, também, realizada em oito isolados, detectados por diagnóstico parasitológico, em igual número de animais, pertencentes a três espécies de Bovídeos (órix austral, órix da arábia e addax), cativos no Zoo de Lisboa. Estes isolados foram identificados, no âmbito de um estudo epidemiológico realizado entre Setembro de 1998 e Agosto de 1999, por Delgado (2000), na Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, do IHMT, e encontravam-se conservados a 4ºC, em dicromato de potássio a 5%. Para além destes, foram, ainda, estudados três isolados pertencentes a duas espécies de Bovídeos (addax e elande) do Zoo de Lisboa, identificados por Isabel Fonseca, em 1996, que se encontravam armazenados em condições idênticas às acima descritas. II – MATERIAL E MÉTODOS 80 2. DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO O diagnóstico parasitológico da criptosporidiose consistiu na observação de oocistos de Cryptosporidium spp. em esfregaços de fezes. Todas as amostras fecais, humanas e animais, recolhidas no âmbito do presente trabalho, foram sujeitas a um processo de concentração, a um método de coloração histoquímica dos esfregaços directo e concentrado e, subsequente, observação ao microscópio óptico. Todas as amostras de fezes em que foram encontrados oocistos de Cryptosporidium spp., foram diluídas em igual volume de dicromato de potássio a 5% e armazenadas a 4ºC. 2.1 CONCENTRAÇÃO DAS AMOSTRAS FECAIS A concentração das amostras de fecais foi efectuada segundo o método de sedimentação difásica de Ritchie modificado, adaptado de Casemore et al. (1985a). Num tubo de centrífuga cónico, com capacidade de 12 ml, foi ressuspendida uma alíquota de fezes, em 3 ml de água desionizada. Após a adição de 3 ml de éter e agitação vigorosa, a suspensão foi filtrada através de uma gaze para um novo tubo, com a finalidade de remover os detritos fecais de maior dimensão. Uma vez completado o volume final, com água desionizada, a amostra foi centrifugada a 400 g, durante cinco minutos. Depois de desprezada a fase etérea, o sobrenadante foi retirado para um tubo limpo, perfez-se o volume final com água desionizada e realizou-se nova centrifugação, desta vez a 4.100 g, durante dez minutos. O sedimento, originado na primeira centrifugação, foi guardado, para posterior pesquisa de ovos, quistos e parasitas. Após a segunda centrifugação, o sobrenadante foi rejeitado e, com o sedimento resultante, prepararam-se dois esfregaços numa lâmina onde, inicialmente, se havia feito um esfregaço directo das fezes. Ambos os sedimentos foram conservados a 4ºC, a aguardar o resultado do diagnóstico parasitológico; em caso de diagnóstico positivo, foram submetidos a uma técnica de extracção de DNA (vide pág. 82). 2.2 COLORAÇÃO DIFERENCIAL O método de coloração histoquímica, utilizado para detecção de oocistos de Cryptosporidium spp., em esfregaços fecais, foi o Ziehl-Neelsen modificado. II – MATERIAL E MÉTODOS 81 A técnica foi realizada com algumas pequenas alterações, relativamente à descrição de Casemore et al. (1985a). Assim, os esfregaços fecais, já secos, foram fixados com metanol, durante um minuto. Em seguida, foram corados com fucsina fénica (fucsina básica em pó 1% m/v, fenol cristalizado 5% m/v, álcool absoluto 10% v/v), por dez minutos e, após lavagem com água, foram descorados com álcool clorídrico a 1%, até à eliminação total do corante em excesso. Depois de nova lavagem com água, os esfregaços foram corados com verde de malaquite a 0,4%, durante 30 segundos e, de novo, lavados com água. Depois de secos, procedeu-se à sua observação ao microscópio óptico. 2.3 OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA Os esfregaços fecais corados foram observados num microscópio óptico Olympus BX51, com uma objectiva de ×20, sendo a presença de oocistos confirmada com as objectivas de ×40 e de imersão. A determinação da dimensão média dos oocistos, encontrados nalgumas amostras, foi efectuada, sempre que possível, com base na observação de 20 oocistos por cada amostra, com uma ampliação de ×1000, através do programa Olympus DP-Soft 3.2. Por cada amostra de fezes foram observados dois esfregaços concentrados e um esfregaço directo. As amostras onde, no conjunto dos três esfregaços, se observaram dois ou mais oocistos, foram consideradas positivas. Nos casos em que apenas foi observado um oocisto, a presença de parasitas, na amostra, foi confirmada por reacção de PCR, aplicada ao gene SSU-rRNA, conforme descrito mais à frente (vide 4.1, pág. 85). A carga parasitária das fezes foi estimada, mediante um estudo quantitativo, por determinação da média do número de oocistos observados nos esfregaços directos, em 20 campos microscópicos, seleccionados ao acaso (quadro X). QUADRO X – Quantificação da carga parasitária das amostras positivas para Cryptosporidium spp. CARGA PARASITÁRIA N.º OOCISTOS/CAMPO* I 1 a 5 II 6 a 10 III 11 a 15 IV >15 * Com a ampliação de 200× (ocular ×10 e objectiva ×20) II – MATERIAL E MÉTODOS 82 3. EXTRACÇÃO DE DNA GENÓMICO DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. O DNA genómico de todos os parasitas do género Cryptosporidium, identificados por diagnóstico parasitológico, foi isolado a partir dos oocistos presentes nas fezes. Este processo constituiu o ponto de partida para a realização da reacção de PCR e restantes técnicas de biologia molecular, que permitiram a caracterização dos organismos em estudo. O método utilizado, para a extracção do DNA de todos os isolados, foi o MiniBeadBeater/Sílica. Nos casos em que a amplificação, por PCR, do DNA isolado daquele modo não foi conseguida, procedeu-se à execução de um segundo método de extracção, o KOH/Qiagen. Este último método foi, também, utilizado em todos os isolados trabalhados pela autora na “Division of Parasitic Diseases”, CDC, Atlanta, EUA. 3.1 PREPARAÇÃO DOS OOCISTOS PARA EXTRACÇÃO DE DNA Nas amostras com diagnóstico parasitológico positivo, os sedimentos, resultantes da primeira e segunda centrifugações do método de concentração de Ritchie modificado (vide 2.1, pág. 80), foram colocados num único tubo de centrífuga e submetidos a uma lavagem por ressuspensão em água desionizada e centrifugação a 4.100 g, durante dez minutos. O sedimento resultante, com os oocistos concentrados, foi armazenado a –20ºC, aguardando a subsequente extracção de DNA. Os isolados que se encontravam conservados em dicromato de potássio a 5%, foram sujeitos ao método de concentração de Ritchie modificado, já descrito em 2.1. A lavagem dos dois sedimentos, descrita no parágrafo anterior, foi repetida por duas vezes, para eliminação do dicromato de potássio, que é um composto inibidor da reacção de PCR. 3.2 MÉTODO MINI-BEADBEATER/SILICA Esta técnica, adaptada de Boom et al. (1990) e de McLauchlin et al. (2000), consiste na lise mecânica dos oocistos, por agitação vigorosa com partículas de zircónio, seguida de um processo, que envolve a adsorção do DNA a partículas de sílica activada, a lavagem com um tampão e dois solventes orgânicos e, por fim, a eluição, em água desionizada estéril. II – MATERIAL E MÉTODOS 83 Num microtubo de 2 ml, foram colocados 300 µl de suspensão de oocistos concentrados, 900 µl de tampão de lise (tiocianato de guanidina 7 M, Tris-HCl 50 mM [pH 6,4], EDTA 25 mM pH 8,0, Triton X-100 1,5% v/v), 60 µl de álcool isoamílico e 0,3 g de partículas de zircónio com 0,5 mm de diâmetro (Biospec Products). Após forte agitação, num aparelho Mini-BeadBeater (Biospec Products), e centrifugação durante 15 segundos a 23.100 g, para sedimentação dos detritos fecais insolúveis e das partículas de zircónio, o sobrenadante foi transferido para um microtubo de 1,5 ml, ao qual haviam sido, previamente, adicionados 25 µl de uma solução aquosa de sílica activada (1%, pH 2,0). O sobrenadante e a sílica activada foram incubados, à temperatura ambiente, num agitador rotativo, a velocidade moderada e constante, durante 30 minutos. Em seguida, para sedimentar a sílica com o DNA adsorvido, foi efectuada uma centrifugação de 15 segundos, a 23.100 g e desprezado o sobrenadante resultante. Posteriormente, foram realizadas cinco lavagens, duas com tampão de lavagem (tiocianato de guanidina 7 M, Tris-HCl 50 mM [pH 6,4]), duas com etanol a 80% a –20ºC e, por fim, uma com acetona. Cada lavagem consistiu na ressuspensão da sílica no tampão ou solvente apropriados, centrifugação a 23.100 g, durante 10 segundos, e rejeição do sobrenadante resultante. Após a lavagem com acetona, a sílica sedimentada foi incubada a 55ºC, até completa evaporação daquele solvente. A eluição do DNA foi feita por ressuspensão da sílica em 50 µl de água desionizada estéril e incubação a 60ºC, durante cinco minutos. Após uma centrifugação a 23.100 g, durante dois minutos, o sobrenadante, contendo o DNA genómico dos parasitas, foi transferido para um microtubo de 1,5 ml estéril e armazenado a – 20ºC. 3.3 MÉTODO KOH/QIAGEN Este método baseia-se na lise inicial dos oocistos por choque álcali/ácido, seguida de extracção orgânica e posterior utilização do “kit” comercial “QIAamp® DNA Stool Mini Kit” (Qiagen). Num microtubo de 1,5 ml foram centrifugados, a 23.100 g, durante sete minutos, 300 µl de suspensão de oocistos concentrados. Após rejeição do sobrenadante, o sedimento foi ressuspendido em 133,2 µl de hidróxido de potássio (KOH) 1M e 37,2 µl de ditiotreitol (DTT) 1M e incubado a 65ºC, durante 15 minutos. Em seguida, foram adicionados 17,2 µl de ácido clorídrico (HCl) 25% e 320 µl de Tris-HCl 2M (pH 8.3), que foram vigorosamente II – MATERIAL E MÉTODOS 84 agitados. Depois, adicionaram-se 500 µl de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) e, após suave agitação manual por inversão, a suspensão resultante foi centrifugada a 3.700 g, durante cinco minutos. O sobrenadante foi recolhido para um microtubo de 2 ml, ao qual foi adicionado 1 ml de tampão ASL (Qiagen), seguindo-se incubação a 80ºC, durante cinco minutos. Após a adição de um comprimido Inhibitex (Qiagen) e imediata agitação até à ressuspensão completa do comprimido, a mistura foi deixada em repouso durante um minuto. De seguida, foi efectuada uma centrifugação de três minutos, a 23.100 g. O sobrenadante resultante foi transferido para um microtubo de 2 ml limpo, ao qual foram adicionados 300 µl de tampão AL (Qiagen) e, após forte agitação, 800 µl de etanol absoluto. Depois de nova agitação, a solução obtida foi transferida para uma coluna QIAamp, colocada num tubo colector, em alíquotas máximas de 750 µl, e centrifugada a 23.100 g, durante um minuto. Este passo foi repetido, até toda a solução ter passado pela coluna. Seguidamente, a coluna foi colocada num tubo colector limpo, foram-lhe adicionados 500 µl de tampão AW1 (Qiagen) e foi feita nova centrifugação a 23.100 g, durante um minuto. A coluna foi, de novo, transferida para um tubo colector limpo, tendo-lhe sido adicionados 500 µl de tampão AW2 (Qiagen) e realizada nova centrifugação a 23.100 g, durante três minutos. Por fim, a coluna foi transferida para um microtubo de 1,5 ml e, após adição de 50 µl de água desionizada estéril, foi a incubar a 70ºC, durante cinco minutos. Terminada a incubação, realizou-se uma centrifugação a 23.100 g, durante um minuto, após o que a coluna foi removida e o microtubo, com o DNA, armazenado a –20ºC. II – MATERIAL E MÉTODOS 85 4. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ISOLADOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. A caracterização molecular dos isolados, de origem humana e animal, detectados pelo diagnóstico parasitológico, foi realizada com o propósito de determinar a sua espécie ou genótipo. O DNA de todos os isolados em estudo foi sujeito a amplificação, por reacção de PCR, aplicada aos loci genéticos COWP, TRAP-C1, DHFR e SSU-rRNA. Os fragmentos amplificados foram, posteriormente, submetidos a hidrólise por endonucleases de restrição (RFLP) tendo, a análise dos perfis de restrição resultantes, permitido identificar a espécie de cada isolado. Para cada gene estudado, foram seleccionados dois isolados pertencentes a cada uma das espécies de Cryptosporidium identificadas, nos quais, para confirmação do resultado da análise de RFLP, se procedeu à sequenciação dos fragmentos amplificados por PCR. Nos isolados detectados em gado bovino foi, ainda, determinada a sequência nucleotídica do fragmento do gene SSU-rRNA de todos os isolados pertencentes a animais de idade desconhecida ou superior a 15 dias, cujas PCR’S dos genes COWP, DHFR e TRAP-C1 não foram bem sucedidas. No caso dos isolados dos animais do Jardim Zoológico não foi efectuada análise de RFLP, tendo a identificação do seu genótipo sido realizada por sequenciação do fragmento do gene SSU-rRNA amplificado por PCR. 4.1 AMPLIFICAÇÃO DE DNA GENÓMICO POR PCR A amplificação do DNA dos parasitas foi realizada por reacção de PCR, aplicada aos genes COWP [Spano et al., 1997b], TRAP-C1 [Spano et al., 1998a, 1998b], DHFR [Gibbons et al., 1998] e SSU-rRNA [Xiao et al., 1999a, 2000a]. No caso dos dois primeiros genes, a amplificação foi feita através de reacções de PCR simples, enquanto que, para os dois últimos, se efectuaram reacções de PCR “nested”. No quadro XI encontram-se descritas as sequências dos oligonucleótidos iniciadores utilizados na amplificação de cada gene, bem como a dimensão dos fragmentos amplificados. As reacções de PCR, efectuadas para os genes COWP, TRAP-C1 e DHFR, sofreram alguns ajustes, em relação ao descrito pelos autores referenciados, nomeadamente, ao nível da temperatura de ligação, dos tempos de ligação e de extensão, da concentração de cloreto de II – MATERIAL E MÉTODOS 86 magnésio (MgCl2) e de oligonucleótidos iniciadores e/ou da concentração da enzima DNA polimerase. QUADRO XI – Oligonucleótidos iniciadores utilizados nas reacções de PCR GENE OLIGONUCLEÓTIDOS INICIADORES SEQUÊNCIA DIMENSÃO DO FRAGMENTO (pb) REFª COWP Cry.15 Cry.9 5’ – GTA GAT AAT GGA AGA GAT TGT G – 3’ 5’ – GGA CTG AAA TAC AGG CAT TAT CTT G – 3’ 553 Spano et al., 1997b TRAP-C1 Et.E Et.W 5’ – GGA TGG GTA TCA GGT AAT AAG AA – 3’ 5’ – CAA TTC TCT CCC TTT ACT TC – 3’ 506 Spano et al., 1998a 1ª PCR – DHFR1 DHFR2 5’ – GTG GGG ATT TAA CTT GAT TT – 3’ 5’ – GGT ATT TCT GGG AAA TAA GT – 3’ 575 DHFR 2ª PCR – DHFR3 DHFR4 5’ – ATG AGT GAA AAG AAC GTT TC – 3’ 5’ – CAC CCT TGT TAA GTA TAT TC – 3’ 408 Gibbons et al., 1998 1ª PCR – SSU1 SSU2 5’ – TTC TAG AGC TAA TAC ATG CG – 3’ 5’ – CCC ATT TCC TTC GAA ACA GGA – 3’ ≈ 1325 SSU-rRNA 2ª PCR – SSU3 SSU4 5’ – GGA AGG GTT GTA TTT ATT AGA TAA AG – 3’ 5’ – AAG GAG TAA GGA ACA ACC TCC A – 3’ 826-864 Xiao et al., 1999a, 2000a As reacções de amplificação dos genes COWP e TRAP-C1 foram efectuadas em volumes de 25 µl, contendo, em ambos os casos, 2,5 µl de 10× tampão de reacção (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM Tris-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 2 mM de MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mistura dos desoxirribonucleótidos dATP, dCTP, dGTP e dTTP (Promega), 20 pmol de cada um dos respectivos oligonucleótidos iniciadores (MWG Biotech), 0,75 U de Biotaq™ DNA Polymerase (Bioline), entre 2,5 a 7 µl de DNA genómico e água desionizada estéril, para perfazer o volume final. A amplificação do gene DHFR foi efectuada num volume de 50 µl, contendo a mistura reaccional da primeira PCR, 5 µl de 10× tampão de reacção (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM Tris-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 2,5 mM de MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mistura de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (Promega), 20 pmol de cada oligonucleótido iniciador (MWG Biotech), 1,5 U de Biotaq™ DNA Polymerase (Bioline), entre 1 a 5 µl de DNA genómico e água desionizada estéril, para completar o volume final. A segunda PCR foi realizada com 1 µl do DNA amplificado na primeira reacção, sendo a mistura reaccional igual à primeira, com excepção da concentração de MgCl2, que foi diminuída para 1,5 mM. II – MATERIAL E MÉTODOS 87 A amplificação do gene SSU-rRNA foi efectuada num volume de 50 µl, contendo, a mistura reaccional da primeira PCR, 5 µl de 10× tampão de reacção (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM Tris-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 6 mM de MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mistura de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (Promega), 10 pmol de cada oligonucleótido iniciador (MWG Biotech), 1,5 U de Biotaq™ DNA Polymerase (Bioline), entre 2,5 a 10 µl de DNA genómico e água desionizada estéril para perfazer o volume final. A segunda PCR foi realizada com 2 µl do DNA amplificado na primeira reacção, sendo a mistura reaccional igual à primeira, com excepção da concentração de MgCl2, que foi diminuída para 3 mM. Em cada reacção de PCR foi incluído um tubo com uma amostra de DNA de Cryptosporidium spp. em condições óptimas de qualidade e concentração, para funcionar como controlo positivo da mistura reaccional, e um controlo negativo, como indicador da inexistência de contaminação por DNA exógeno onde, no lugar do DNA, foi adicionada água desionizada estéril. As reacções de amplificação foram efectuadas num termociclador “T1 Thermocycler” (Biometra) tendo, em todas elas, o passo de desnaturação inicial sido de dez minutos a 95ºC e o de extensão final de dez minutos a 72ºC. No quadro XII estão descritas as restantes condições de amplificação para cada um dos loci estudados. QUADRO XII – Condições de amplificação do DNA, para os quatro genes estudados GENE CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO N.º CICLOS COWP Desnaturação Ligação Extensão 95ºC, 50 seg. 55ºC, 30 seg 72ºC, 45 seg 30 TRAP-C1 Desnaturação Ligação Extensão 95ºC, 50 seg. 50ºC, 30 seg 72ºC, 45 seg 40 DHFR – 1ª PCR Desnaturação Ligação Extensão 95ºC, 45 seg. 50ºC, 60 seg 72ºC, 3 min. 30 DHFR – 2ª PCR Desnaturação Ligação Extensão 95ºC, 45 seg. 60ºC, 60 seg 72ºC, 3 min. 30 SSU-rRNA 1ª e 2ª PCR’S Desnaturação Ligação Extensão 95ºC, 45 seg. 55ºC, 45 seg 72ºC, 60 seg 35 II – MATERIAL E MÉTODOS 94 O procedimento de amplificação GP601 foi efectuado num volume de 50 µl, contendo a mistura reaccional da primeira PCR, 5 µl de 10× tampão de reacção (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM Tris-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 3 mM de MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mistura de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (Promega), 10 pmol de cada oligonucleótido iniciador (MWG Biotech), 1,5 U de Biotaq™ DNA Polymerase (Bioline), entre 5 a 10 µl de DNA genómico e água desionizada estéril para perfazer o volume final. A segunda PCR foi realizada com 1,5 µl do DNA amplificado na primeira reacção, sendo a mistura reaccional igual à primeira. O procedimento de amplificação GP602 foi efectuado num volume de 50 µl, contendo a mistura reaccional da primeira PCR, 5 µl de 10× tampão de reacção (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM Tris-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 1,5 mM de MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mistura de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (Promega), 10 pmol de cada oligonucleótido iniciador (MWG Biotech), 0,02 mg de albumina do soro bovino ou BSA (sigla anglosaxónica para “bovine serum albumin”) (Sigma-Aldrich), 1,5 U de Biotaq™ DNA Polymerase (Bioline), entre 5 a 10 µl de DNA genómico e água desionizada estéril, para perfazer o volume final. A segunda PCR foi realizada com 3 µl do DNA amplificado na primeira reacção, sendo a mistura reaccional igual à primeira, com excepção da BSA, que foi excluída. Em cada reacção de PCR foi incluído um tubo com uma amostra de DNA, em condições óptimas de qualidade e concentração, para funcionar como controlo positivo da mistura reaccional, e um controlo negativo, como indicador da inexistência de contaminação, por DNA exógeno, onde, no lugar do DNA, foi adicionada água desionizada estéril. As reacções de amplificação foram efectuadas num termociclador “T1 Thermocycler” (Biometra), tendo, em todas, o passo de desnaturação inicial sido de dez minutos a 95ºC e o de extensão final de dez minutos a 72ºC. No quadro XIV estão descritas as restantes condições de amplificação dos fragmentos do gene GP60. Os fragmentos de DNA amplificados por PCR foram submetidos a electroforese em gel de agarose a 1,5%, conforme descrito em 4.2. II – MATERIAL E MÉTODOS 95 QUADRO XIV – Condições de amplificação do DNA, para o gene GP60 PROCEDIMENTO CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO N.º CICLOS GP601 1ª PCR/2ª PCR Desnaturação Ligação Extensão 95ºC, 45 seg. 50ºC, 45 seg 72ºC, 60 seg 35 GP602 – 1ª PCR Desnaturação Ligação Extensão 95ºC, 45 seg. 47ºC, 45 seg 72ºC, 60 seg. 35 GP602 – 2ª PCR Desnaturação Ligação Extensão 95ºC, 45 seg. 50ºC, 45 seg 72ºC, 60 seg 35 O grupo de amostras, caracterizadas no CDC, compreendeu 20 isolados de C. parvum e de C. hominis de origem humana, 32 de origem bovina e nove de ruminantes silváticos. A amplificação, por PCR, do gene GP60, foi efectuada segundo o procedimento GP601, nas condições já descritas. A reacção de amplificação foi efectuada num termociclador “GeneAmp PCR System 9700” (Perkin Elmer) [Alves et al., 2003b]. 5.2.2 PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAÇÃO DOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS POR PCR O procedimento adoptado com o propósito de sequenciar os fragmentos do gene GP60, amplificados por PCR, foi distinto para as amostras estudadas no CDC e no IHMT. O trabalho desenvolvido no CDC foi realizado conforme a descrição que se segue. Os fragmentos do gene GP60 amplificados foram purificados através do “Microcon-PCR Centrifugal Filter Devices” (Amicon, Millipore), conforme as instruções do fabricante: a um filtro (Amicon, Millipore) colocado num microtubo de 1,5 ml (Amicon, Millipore), foram adicionados 460 µl de água desionizada estéril e o produto de PCR a purificar. Depois de fechado, o tubo com o filtro foi a centrifugar a 1.000 g, durante 15 minutos. Em seguida, foram adicionados ao filtro 20 µl de água desionizada estéril, pré-aquecida a 70ºC. Após um minuto de repouso, à temperatura ambiente, o filtro foi invertido, colocado num novo microtubo e centrifugado a 1.000 g, durante dois minutos. Por fim, o filtro foi eliminado e o tubo com o produto de PCR purificado armazenado a –20ºC. Para cada fragmento do gene GP60, amplificado e purificado, foram realizadas duas reacções de sequenciação, uma no sentido directo e outra no sentido reverso. Em cada uma II – MATERIAL E MÉTODOS 96 destas reacções foi utilizado, apenas, um dos oligonucleótidos iniciadores (AL3532 ou AL3534), resultando na amplificação de apenas uma das cadeias do DNA alvo. A reacção de sequenciação foi preparada, segundo o método “ABI PRISM® BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit” (Applied Biosystems). Em cada mistura reaccional foram adicionados 4 µl de “Terminator Ready Reaction Mix”, composta por quatro didesoxirribonucleótidos terminadores marcados com quatro fluorocromos diferentes (“ADye Terminator”, “C-Dye Terminator”, “G-Dye Terminator” e “T-Dye Terminator”), quatro desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dITP e dUTP), AmpliTaq DNA Polymerase FS, MgCl2, e Tris-HCl buffer, pH 9.0 (Applied Biosystems), 4 µl de 5× tampão de sequenciação (Applied Biosystems), 1,5 µl de produto de PCR purificado, 2 µl de um dos oligonucleótidos iniciadores e água desionizada estéril para completar um volume final de 20 µl. As reacções de sequenciação foram realizadas num termociclador “GeneAmp PCR System 9700” (Perkin Elmer), durante 25 ciclos de 10 segundos a 96ºC, 5 segundos a 50ºC e quatro minutos a 60ºC. Os produtos de sequenciação foram, posteriormente, purificados de sais e dos oligonucleótidos iniciadores, didesoxirribonucleótidos terminadores e desoxirribonucleótidos não incorporados que interferem com a electroforese capilar. Para tal, foi utilizado o “kit”comercial “Centri-Sep Columns” (Princeton Separations), de acordo com a descrição que se segue: para hidratar a resina da coluna, foram-lhe adicionados 800 µl de água desionizada estéril e, após forte agitação, esta foi deixada a repousar durante uma hora, à temperatura ambiente. Depois, retiraram-se as tampas superior e inferior da coluna que foi, em seguida, colocada num tubo de recolha a eluir, durante 15 minutos. Após eliminação do eluído, foi efectuada uma centrifugação de três minutos a 750 g e a coluna foi transferida para um microtubo de 1,5 ml. O produto da sequenciação foi adicionado à coluna, tendo, em seguida, sido realizada nova centrifugação a 750 g, durante três minutos. Por fim, a coluna foi eliminada e o eluído concentrado num “Vacufuge Concentrator 5301” (Eppendorf), até completa evaporação do solvente. Os produtos de sequenciação purificados e concentrados foram ressuspendidos em 15 µl de formamida “ABI PRISM® Hi-Di™” (Applied Biosystems). Em seguida, foram colocados numa microplaca “MicroAmp® Optical 96-well Reaction Plate” (Applied Biosystems), tapados com uma tampa “96-Well Septa” (Applied Biosystems), submetidos a 94ºC, durante três minutos, num termociclador “GeneAmp PCR System 9700” (Perkin Elmer) e, de imediato, congelados a –20ºC. II – MATERIAL E MÉTODOS 97 A resolução dos produtos de sequenciação foi realizada num sequenciador automático “ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer” (Applied Biosystems), por electroforese capilar, numa matriz de polímero POP4™ (Applied Biosystems). A recolha e o processamento dos resultados da electroforese foi efectuada pelos programas “ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer Data Collection Software” e “DNA Sequencing Analysis Software” (Applied Biosystems). Os cromatogramas, com as sequências directa e reversa, de cada fragmento sequenciado, foram comparados, através do programa “AutoAssembler 2.0” (Applied Biosystems) e, após a correcção manual de alguns erros nas sequências directa e/ou reversa, foi obtida uma sequência consenso, para cada fragmento do gene GP60 amplificado. Os fragmentos do gene GP60, amplificados na Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, foram purificados, através do “JETQUICK PCR Product Purification Spin Kit” (Genomed), conforme descrito em 4.4, e enviados para o Laboratório de Sequenciação e Análise de Fragmentos, do ICAT, onde foram sequenciados, num sequenciador automático “CEQ™ 2000XL” (Beckman Coulter) e analisados pelo software “CEQ™ 8000 Genetic Analysis System” (Beckman Coulter). As sequências de DNA foram determinadas em ambos os sentidos, tendo sido obtida uma sequência consenso, por comparação das sequências directa e reversa. 5.2.3 ANÁLISE BIOINFORMÁTICA As sequências nucleotídicas consenso do fragmento do gene GP60, de todos os isolados de C. hominis e de C. parvum estudados e de outras disponíveis no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/), para o mesmo gene e os mesmos parasitas, foram alinhadas através do programa ClustalX [Thompson et al., 1997]. Ao alinhamento resultante, foram efectuados alguns acertos manuais, de forma a eliminar algumas ambiguidades. A partir deste alinhamento final, foi construída uma árvore filogenética, através do programa TreeconW [van de Peer e de Wachter, 1994] e do método “neighbour-joining”, tendo por base distâncias genéticas calculadas, pelo modelo de dois parâmetros de Kimura. Os valores de confiança, para os ramos individuais da árvore, foram determinados, por análise de “bootstrap” com 1.000 réplicas. 98 Capítulo III INFECÇÃO POR C RYPTOSPORIDIUM SPP. EM DOENTES INFECTADOS POR VIH III – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM DOENTES INFECTADOS POR VIH 99 1. INTRODUÇÃO O sintoma gastrenterológico mais comum entre os indivíduos infectados por VIH é a diarreia. Nestes doentes, a criptosporidiose destaca-se como uma das infecções oportunistas mais vezes associada a esta sintomatologia [Call et al., 2000]. No primeiro trabalho realizado em Portugal sobre a criptosporidiose em doentes infectados por VIH, da autoria de Antunes et al. (1990), a percentagem encontrada para esta parasitose foi de 13,4% (15/112). Num outro estudo, efectuado por Tomás et al. (1992), envolvendo 268 doentes infectados por VIH, no período entre 1988 e 1991, foi documentada a percentagem de infecção por Cryptosporidium spp. de 10% (27/268). Em 1998, Matos et al. publicaram um trabalho sobre a prevalência da criptosporidiose em doentes com infecção por VIH e diarreia, no Hospital de Santa Maria, em Lisboa. Este trabalho abrangeu um período de nove anos e meio, compreendido entre o início de 1988 e Maio de 1997, tendo a prevalência de criptosporidiose encontrada sido de 8% (36/465). Já no período pós-HAART, entre 1999 e 2001, o mesmo grupo de trabalho encontrou, numa população semelhante, uma percentagem de infecção por Cryptosporidium spp. de 9,7% (16/195) [Matos et al., 2002]. Este último trabalho não confirmou a regressão do número de casos de criptosporidiose nos doentes com infecção por VIH, na era pós-HAART, observada e descrita por diversos autores [Ives et al., 2001; Maggi et al., 2005; Pozio e Morales 2005]. No presente trabalho foi determinada a percentagem da criptosporidiose em doentes com infecção por VIH e sintomatologia gastrintestinal, num período de cerca de três anos e meio, com início em Junho de 2001 e fim em Janeiro de 2005. 2. RESULTADOS O diagnóstico parasitológico das amostras fecais dos 217 doentes com infecção por VIH revelou que 18 se encontravam parasitados com organismos do género Cryptosporidium spp., o que corresponde a uma percentagem da criptosporidiose nesta população de 8,3%. À excepção de um doente, todos os outros apresentavam diarreia (duas ou mais dejecções aquosas diárias), por altura do diagnóstico de criptosporidiose (vide capítulo V, quadro XIX). III – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM DOENTES INFECTADOS POR VIH 100 Entre os 18 doentes parasitados, 16 eram adultos com idades compreendidas entre os 24 e os 58 anos e, os dois restantes, eram crianças de sete e 11 anos, ambas do sexo masculino, assim como 13 (81,25%) dos adultos. Apenas três dos adultos eram do sexo feminino (18,75%) (vide capítulo V, quadro XIX). Relativamente à categoria de transmissão de VIH, nove (56,25%) dos adultos eram heterossexuais, seis (37,5%) eram toxicodependentes e um (6,25%) era homossexual. As crianças adquiriram a infecção por VIH por transmissão vertical (vide capítulo V, quadro XIX). Nos adultos, os valores de linfócitos TCD4+ variaram entre 0 e 125 céls/mm3, tendo, em 75% dos casos, sido inferiores a 50 céls/mm3 (quadro XV). A criança de sete anos apresentava imunossupressão moderada, com percentagem de linfócitos TCD4+ de 19% (213 céls/mm3), enquanto que a de 11 anos exibia imunossupressão grave, com percentagem de linfócitos TCD4+ inferior a 15% (39 céls/mm3). Onze dos 18 doentes com criptosporidiose não se encontravam a fazer terapêutica anti-retroviral, apresentando, todos eles, valores de linfócitos TCD4+ inferiores a 42 céls/mm3. QUADRO XV – Valores de linfócitos TCD4+ apresentados pelos doentes adultos com criptosporidiose LINFÓCITOS TCD4+ (céls/mm3) N.º DOENTES ≤ 10 5 11 – 50 7 51 – 125 3 Desconhecido 1 A carga parasitária, presente nas fezes dos doentes com criptosporidiose, foi de nível I, nível II e nível IV (vide Material e Métodos, quadro X) em 27,8% (5/18) dos casos e de nível III nos restantes 16,6% (3/18) (vide capítulo V, quadro XIX). Dois dos cinco doentes com carga parasitária de nível I apresentavam fezes de consistência pastosa. Não foi observada qualquer correlação entre a quantidade de oocistos excretados e os valores de linfócitos TCD4+. Dos 18 casos de infecção por parasitas do género Cryptosporidium, um foi encontrado em associação com Giardia lamblia, seis com Microsporídia e um com Giardia lamblia e Microsporídia (vide capítulo V, quadro XIX). III – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM DOENTES INFECTADOS POR VIH 101 Os oocistos identificados, no diagnóstico parasitológico, apresentavam forma esférica a ovalada e dimensão média de 4,68 × 4,28 µm. Na figura 8 podem observar-se oocistos de Cryptosporidium spp., num esfregaço fecal, corado pelo método de Ziehl-Neelsen modificado. FIGURA 8 – Fotografia de oocistos de Cryptosporidium spp., em esfregaço fecal, corado pelo ZiehlNeelsen modificado (×1000). Original da autora 3. DISCUSSÃO No presente trabalho foi encontrada uma percentagem de criptosporidiose, em doentes com infecção por VIH e sintomatologia gastrintestinal, de 8,3%. Este valor revela diminuição em relação aos 9,7% (16/165) encontrados por Matos et al. (2002), na era pós-HAART, entre 1999 e 2001. Contudo, apesar desta diminuição, a percentagem encontrada é semelhante aos 8% (36/465) descritos no Hospital de Santa Maria, durante o período pré-HAART de 1988 a 1997 [Matos et al., 1998]. Em trabalhos publicados recentemente, em doentes com infecção por VIH e diarreia, durante a era pós-HAART, foram documentadas prevalências de 20,6% (35/170), em Cuba, durante o ano de 1999 [Paz et al., 2003], de 19,7% (29/147), em Lima, no Peru, entre 1998 e 2000 [Cárcamo et al., 2005] e de 12,8% (20/156), em Nonthaburi, na Tailândia, em 2001 [Saksirisampant et al., 2002]. Na cidade de Bogotá, na Colômbia, a prevalência de criptosporidiose, em doentes com infecção por VIH e sintomatologia III – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM DOENTES INFECTADOS POR VIH 102 gastrintestinal, foi de 10,4% (12/115) [Flórez et al., 2003]. No Brasil, nas cidades do Rio de Janeiro e de Uberlândia, os valores encontrados, de co-infecção Cryptosporidium spp./VIH, foram, respectivamente, de 9,3% (7/75), no período 1998-1999 [Ribeiro et al. 2004] e de 4% (4/100), entre 2001 e 2002 [Silva et al., 2005]. Para além do facto de as populações estudadas nem sempre serem comparáveis, esta diversidade de valores pode ser explicada, entre outros factores, pelas diferentes condições económicas, culturais e higio-sanitárias existentes nas diversas cidades, pelas diferentes taxas de implementação da HAART e/ou pela utilização de diferentes métodos de diagnóstico. A comparação dos resultados obtidos, no presente trabalho, com os descritos por Matos et al. (2002) mostram que, a partir de 2001, se verificou diminuição do número de casos de criptosporidiose, observados na população com infecção por VIH e sintomatologia gastrenterológica. Esta diminuição pode encontrar justificação no decréscimo do número de casos de SIDA, diagnosticados em Portugal desde 2000, em consequência do efeito da HAART no atraso da progressão da infecção por VIH para SIDA [Antunes e Doroana, 2003; Centro de Vigilância Epidemiológica das Doenças Transmissíveis, 2005]. Desde a introdução da terapêutica HAART, em 1996, que diversos autores têm descrito, nos países industrializados, diminuição acentuada da ocorrência da criptosporidiose, em doentes infectados por VIH. Num estudo que envolveu seropositivos para VIH, da Austrália e de dez países europeus (Dinamarca, França, Alemanha, Grécia, Itália, Noruega, Espanha, Suíça, Holanda e Reino Unido), Babiker et al. (2005) compararam a taxa de ocorrência da criptosporidiose enquanto doença definidora de SIDA nos períodos 1994-1996 e 1997-2001, tendo os valores encontrados sido de 3.1% e 0,2%, respectivamente. Numa investigação efectuada num hospital em Londres foi observado, após introdução da HAART, decréscimo da incidência da criptosporidiose, em indivíduos com infecção por VIH, que, tendo sido de 1,1% no período de 1988 a 1995, passou para 0,3%, entre 1996 e 1998 [Miao et al., 2000]. Num hospital associado à Universidade do Alabama, nos EUA, Call et al. (2000) observaram diminuição da incidência da criptosporidiose, como causa de diarreia em doentes com SIDA, de 2%, na era préHAART, para 0,3%, na era pós-HAART, em consequência da melhoria da função imunológica dos doentes, por acção da terapêutica anti-retroviral potente. O facto de 61% (11/18) dos doentes com criptosporidiose não estarem sob a acção da terapêutica anti-retroviral, pode justificar os valores baixos de linfócitos TCD4+. Com excepção da criança de sete anos, que apresentava imunossupressão moderada, os restantes III – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM DOENTES INFECTADOS POR VIH 103 doentes, com valores de linfócitos TCD4+ conhecidos, apresentavam valores inferiores a 125 céls/mm3 e 86,7% (13/15), destes, exibiam valores iguais ou inferiores a 50 céls/mm3. A relação entre a diarreia por Cryptosporidium spp. e os valores de linfócitos TCD4+ tem sido documentada por diversos autores [Blanshard et al., 1992; Flanigan et al., 1992]. Num estudo efectuado num hospital de Londres, entre 2000 e 2001, a criptosporidiose foi considerada a principal causa de diarreia em doentes com SIDA, com contagens de linfócitos TCD4+ inferiores a 200 céls/mm3, tendo sido diagnosticada em 12% destes doentes. Naqueles com contagens entre 200-350 céls/mm3 e superiores a 350 céls/mm3, a percentagem de infectados por Cryptosporidium spp. foi de 2,6% e 1,4%, respectivamente [Datta et al., 2003]. Noutro estudo, na cidade de Uberlândia, no Brasil, todos os doentes com infecção por VIH e criptosporidiose apresentavam valores de linfócitos TCD4+ entre 8 e 49 céls/mm3. Nenhum destes doentes estava sob terapêutica anti-retroviral [Silva et al., 2005]. No trabalho realizado por Matos et al. (1998), a categoria de transmissão de VIH mais representada, entre os doentes com infecção por Cryptosporidium spp., foi a dos heterossexuais (36%), seguida da dos homossexuais (33%) e da dos toxicodependentes (6%). No presente trabalho, observou-se um aumento do número dos casos de criptosporidiose nas categorias dos heterossexuais (56,25%) e dos toxicodependentes (37,5%) e um decréscimo na categoria dos homossexuais (6,25%). Estes valores acompanham o padrão epidemiológico verificado, anualmente, desde 2000, em que se tem registado um aumento do número de casos de SIDA, resultantes da transmissão heterossexual de VIH e diminuição naqueles de transmissão homossexual. Para os períodos 1983-1999 e 2000-2004, a categoria da transmissão heterossexual, totalizou, respectivamente, 26,9% e 40,9% dos casos de SIDA em Portugal, enquanto que na categoria da transmissão homossexual, os casos de SIDA constituíam, respectivamente, 17,3% e 7,3% dos casos totais de SIDA [Centro de Vigilância Epidemiológica das Doenças Transmissíveis, 2005]. IV – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ANIMAIS DE COMPANHIA E SILVÁTICOS 110 pessoal]. Devido à falta de colaboração por parte dos donos dos gatos infectados, não nos foi possível investigar se os membros da família e/ou outros animais de companhia, que partilhavam o ambiente doméstico com esses animais, estariam, também, infectados por Cryptosporidium spp.. A relação causa-efeito, entre a partilha do ambiente doméstico com um animal de companhia infectado por Cryptosporidium spp. e a infecção humana, é difícil de conseguir. Tal prende-se com o facto de a presença de oocistos, nas fezes de um animal, não comprovar a origem de uma eventual infecção do seu dono, devido à possibilidade de ambos terem sido expostos à mesma fonte de infecção ou de o animal ter sido infectado pelo seu dono [Casemore et al., 1997; Glaser et al., 1998]. Contudo, o facto de se encontrarem descritos diversos casos de criptosporidiose humana, devido a C. felis e a C. canis, nomeadamente em crianças e em doentes com infecção VIH/SIDA, leva-nos a crer que a prevenção é a melhor defesa. Assim, os donos de animais de companhia, principalmente aqueles com função imunitária diminuída, deverão dar aos seus animais alimentação e água de qualidade, conferir-lhes cuidados médicoveterinários regulares (desparasitação, imunização activa e exame parasitológico das fezes) e adoptar medidas de higiene, como lavar bem as mãos, após afagar o animal, evitar o contacto com as suas fezes e evitar o contacto com o animal, caso ele apresente diarreia [Angulo et al., 1994]. Neste aspecto é, ainda, fundamental que o médico veterinário proporcione aos donos dos animais informação clara e objectiva sobre a existência destes parasitas, o seu potencial zoonótico e as medidas a tomar, no sentido de evitar uma eventual transmissão. O papel dos animais de companhia, como fonte da infecção, por Cryptosporidium spp., para o Homem, encontra-se, ainda, pouco esclarecido, sendo necessárias investigações epidemiológicas mais abrangentes e aprofundadas que possam clarificar este assunto. 3.2 ANIMAIS SILVÁTICOS DE VIDA LIVRE A investigação realizada, com o objectivo de contribuir para o conhecimento sobre a ocorrência da criptosporidiose, em animais silváticos de vida livre, mostrou que, na altura em que os animais estudados foram capturados, nenhum deles se encontrava a excretar oocistos de Cryptosporidium spp.. No que diz respeito aos carnívoros, não só o número de animais estudados foi muito reduzido (13 raposas), como a sua captura se confinou a uma única ocasião, factores que limitam o alcance dos resultados obtidos. O único trabalho encontrado na literatura, sobre a IV – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ANIMAIS DE COMPANHIA E SILVÁTICOS 111 presença de Cryptosporidium spp. em raposas, foi realizado na região de Warwickshire, no centro da Inglaterra, e descreve uma percentagem de infecção de 9% (2/23) [Sturdee et al., 1999]. Relativamente aos pequenos mamíferos, apesar do número de animais estudados ter sido superior ao dos carnívoros, a sua captura foi realizada, apenas, em três ocasiões (Maio, Agosto e Novembro de 2003), facto que não nos permite obter um quadro representativo da globalidade da situação anual. Para além disso, não foram capturados animais durante os meses de Inverno, altura em que se regista maior precipitação. A excreção de C. parvum e C. muris, por pequenos mamíferos, tem sido documentada por diversos autores, que utilizaram as características morfométricas dos oocistos, como critério de identificação de espécie. Alguns desses autores observaram variações temporais, nos valores de prevalência encontrados, tanto entre diferentes alturas de um mesmo ano, como entre anos diferentes. Numa investigação, conduzida na região de Warwickshire, em Inglaterra, entre 1992 e 1997, Sturdee et al. (2003) observaram, não só uma variação sazonal da prevalência da criptosporidiose em pequenos roedores e insectívoros (Apodemus sylvaticus, Clethrionomys glareolus, Mus domesticus, Sorex araneus e Sorex minutus), com valores mínimos de 17,8% (33/185), na Primavera, e máximos, de 45,6% (139/305), no Outono, mas, também, uma variação ao longo dos anos, com um máximo de 46,2% (54/117) registado em 1996, e um mínimo de 9,3% (8/86), encontrado em 1997. No Reino Unido, Webster e MacDonald (1995) descreveram, também, a variação sazonal da prevalência da criptosporidiose em Rattus norvegicus, tendo registado valores de 95% na Primavera, 14% no Verão, 53% no Outono e 70% no Inverno. Esta variação sazonal foi, também, encontrada na província da Catalunha, em Espanha, por Torres et al. (2000), que, entre 1995 e 1997, observaram, em sete espécies de roedores e insectívoros (Apodemus flavicollis, Apodemus sylvaticus, Clethrionomys glareolus, Crocidura russula, Mus spretus, Rattus rattus e Sorex araneus), prevalências de criptosporidiose de 32,9% (30/91), no Outono e de 21,9% (34/155), na Primavera. Na Polónia, Sisnki et al. (1993), descreveram, em pequenos mamíferos, pertencentes às espécies Apodemus flavicollis, Apodemus agrarius, Clethrionomys glareolus, Sorex araneus e Sorex minutus, variação da prevalência de infecção por C. parvum, durante a estação do Outono, em dois anos consecutivos, tendo registado um valor de 29,2% (24/82), no ano de 1989 e de 12,9% (17/131), no ano seguinte. Estes resultados demonstram que as observações efectuadas, em períodos de tempo curtos, não são representativas da situação global, sendo esta uma limitação associada à investigação que realizámos. IV – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ANIMAIS DE COMPANHIA E SILVÁTICOS 112 O facto de todos os animais capturados, no presente trabalho, serem adultos poderá, também, justificar a ausência de infecções por Cryptosporidium spp., na medida em que os animais jovens são, regra geral, mais susceptíveis a esta infecção. No Reino Unido, Quy et al. (1999) observaram, em Rattus norvegicus, jovens e adultos, percentagens de infecção por C. parvum, de 40% e 12%, respectivamente. Também, na Polónia, Bajer et al., 2002 observaram, em três espécies de roedores (Apodemus flavicollis, Clethrionomys glareolus e Microtus arvalis), maior prevalência de infecção por C. parvum nos animais jovens, do que nos adultos. Por fim, não podemos excluir a influência que as características climáticas e orográficas, da região onde os animais foram capturados, possam ter tido nos resultados negativos que obtivemos. O Baixo Alentejo tem um clima sub-húmido a seco, caracterizado pela pouca precipitação anual, que se concentra, principalmente, nos meses de Outono e Inverno. Segundo dados recolhidos na estação meteorológica de Beja, fornecidos pelo Instituto de Meteorologia, a temperatura média do ar, registada entre Maio e Agosto de 2003, variou, aproximadamente, entre 20ºC e 26ºC. Durante os mesmos meses, a temperatura mínima oscilou entre 11,5ºC e 18,5ºC, enquanto que a temperatura máxima se situou entre 27,3ºC e 35,7ºC. De salientar, ainda, que, para o mesmo período, e de acordo com a mesma fonte, apenas se verificou alguma precipitação, durante o mês de Maio, tendo o valor registado sido cerca de 10 mm. [Pires et al., 2004; http://www.meteo.pt/InformacaoClimatica/Anos/Anos.htm, consultado a 24 de Abril de 2005]. No mês de Novembro de 2003, foram registados, para a temperatura média do ar e a precipitação mensal total, valores compreendidos nos intervalos de 12 a 14ºC e de 100 a 150 mm, respectivamente [http://web.meteo.pt/resources/im/produtos/clima/mapas/mrrto200311.jpg e http://web.meteo.pt/resources/im/produtos/clima/mapas/mttme200311.jpg, consultados a 18 de Agosto de 2005]. As elevadas temperaturas, que se fizeram sentir nesta região, sobretudo nos meses de Verão, associadas à secura do solo, em resultado da ausência de precipitação, constituem factores desfavoráveis à sobrevivência dos oocistos, contribuindo para a diminuição do número de oocistos viáveis existentes no ambiente. Por outro lado, não só a orografia pouco acentuada, dos locais estudados, como o tipo de biótopo, caracterizado por vegetação herbácea (juncos e gramíneas), silvados e loendros, criam condições que limitam a ocorrência de escorrimentos superficiais de água, nas alturas em que se verifica precipitação. Perante o exposto, pode colocar-se a hipótese de, nesta região, em consequência dos factores acima referidos, o nível de transmissão de Cryptosporidium spp. ser reduzido. IV – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ANIMAIS DE COMPANHIA E SILVÁTICOS 113 No presente estudo, realizado em pequenos mamíferos, na região do Baixo Alentejo, não foi observado nenhum animal com infecção por Cryptosporidium spp.. Todavia, os resultados obtidos foram limitados pelo facto de a captura dos animais ter sido realizada num período de tempo curto e de forma descontínua, sendo necessário proceder a investigações mais aprofundadas, de forma a obter resultados representativos da situação epidemiológica existente naquela região. 3.3 ANIMAIS SILVÁTICOS EM CATIVEIRO Os resultados da investigação realizada em mamíferos, répteis e aves cativos no Jardim Zoológico de Lisboa, mostraram que, durante o período em que decorreu o trabalho, o número de animais a excretar oocistos de Cryptosporidium spp. foi muito baixo. Entre os mamíferos estudados, foram encontrados oocistos, apenas, em duas amostras fecais, pertencentes a dois Bovídeos – um bisonte americano e um gnu de cauda branca. Estes eram, ambos, adultos e não apresentavam diarreia, observação concordante com as descrições, efectuadas por diversos autores, que dão conta do facto de a infecção por Cryptosporidium spp., em animais adultos, ser, com frequência, assintomática, [Majewska et al., 1997; Deng e Cliver, 1999; Gómez et al., 2000; Lourenço et al., 2000]. No Jardim Zoológico de Barcelona, Gómez et al. (2000) e Gracenea et al. (2002) já haviam identificado oocistos de Cryptosporidium spp., nas fezes de bisontes americanos. A infecção por Cryptosporidium spp., em gnus de cauda branca, foi, também, descrita por Mtambo et al. (1997), em 27% (7/26) dos animais estudados no parque Nacional de Mikumi, na Tanzânia. A percentagem de amostras fecais positivas, obtida no presente trabalho, para os ruminantes artiodáctilos (2,3% – 2/87), foi idêntica à encontrada por Delgado (2000), também no Jardim Zoológico de Lisboa, entre Setembro de 1998 e Agosto de 1999, para o mesmo grupo de animais (2,1% – 8/388). Todavia, ao contrário do sucedido no nosso trabalho, aquela autora estudou, não só animais adultos, mas, também, recém-nascidos. Cinco dos oito animais que Delgado (2000) encontrou parasitados tinham menos de dois meses de vida. O facto da criptosporidiose atingir, com mais frequência, animais jovens encontra-se descrito por diversos autores, quer em gado doméstico [Olson et al., 1997a; Pereira da Fonseca et al., 2001; Izumiyama et al., 2001], quer em animais de companhia [Arai et al., 1990; Mtambo et al., 1991] e, ainda, em animais silváticos [Kalishman et al., 1996; Atwill et al., 1997; Quy et al., 1999; Rickard et al., 1999]. O nascimento das crias que Delgado (2000) identificou com criptosporidiose, aconteceu IV – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ANIMAIS DE COMPANHIA E SILVÁTICOS 114 no Inverno, altura em que a precipitação é mais intensa, levando à presença de águas de escorrência e poças de água, eventualmente contaminadas com oocistos, o que facilita a transmissão do parasita. Para além disso, as condições de humidade e temperatura, características desta estação do ano, são favoráveis à sobrevivência dos oocistos no solo. Segundo informação disponibilizada pelo Instituto de Meteorologia, no período compreendido entre Setembro de 2002 e Março de 2003, a precipitação mensal total, registada em Lisboa, variou entre o valor máximo de 193 mm (em Novembro de 2002) e o mínimo de 76 mm (em Março de 2003) [http://web.meteo.pt/pt/clima/clima.jsp, consultado a 12 de Agosto de 2005]. À excepção do mês de Fevereiro de 2003, os valores de precipitação, que se verificaram naqueles sete meses, excederam, em média, 40,8 mm (valores mínimo e máximo de 7 mm e 79 mm, respectivamente), os valores médios mensais, registados entre 1961 e 1990. Apesar da elevada pluviosidade verificada, principalmente entre Setembro de 2002 e Março de 2003, o número de infecções por Cryptosporidium spp., identificado nos mamíferos estudados, foi muito baixo. Estes resultados sugerem que, no Jardim Zoológico de Lisboa, a contaminação ambiental é, provavelmente, pequena e que a limpeza dos recintos e o maneio higio-sanitário dos animais são eficazes no controlo da transmissão deste parasita. Com excepção da tartaruga estrela indiana, que havia chegado de Singapura e que se encontrava em quarentena, não foi observada a excreção de oocistos, por parte de nenhum dos répteis do Jardim Zoológico de Lisboa, que foram alvo do nosso estudo. Estes animais vivem, em condições de temperatura e humidade constantes, em recintos isolados, não só do exterior como, também, de outros animais. Esta situação de isolamento não é propícia à introdução de parasitas nos habitats individuais, constituindo, provavelmente, uma das razões pela qual não foram encontrados oocistos de Cryptosporidium spp. neste grupo de animais. A infecção em tartarugas estrela já havia sido descrita nos EUA, no “San Diego Wild Animal Park” [Heuschele et al., 1986], na “Wildlife Conservation Society”, em Nova Iorque [Raphael et al., 1997] e no Zoo de Louisville [Xiao et al. 2004b]. Em relação às aves, apenas foi possível realizar uma única recolha de fezes, o que aconteceu no mês de Agosto, altura em que as condições de elevada temperatura e a ausência de precipitação, não favorecem a sobrevivência dos oocistos. Por esta razão, os resultados obtidos, para este grupo de animais, têm um alcance muito limitado. As características de acomodação dos animais em cativeiro, em especial dos mamíferos, como a vida em grupo, ao ar livre, em recintos de terra batida e expostos aos elementos IV – CRYPTOSPORIDIUM SPP. EM ANIMAIS DE COMPANHIA E SILVÁTICOS 115 climáticos, particularmente, à chuva, são factores que podem favorecer a transmissão da criptosporidiose. Contudo, a presente investigação parece indicar que esta é uma parasitose pouco frequente nos animais do Jardim Zoológico de Lisboa estudados. No entanto, sendo a transmissão zoonótica uma das vias de infecção do Homem, é importante, para a saúde pública, estudar a infecção por Cryptosporidium spp. nos animais presentes em locais públicos, como o Jardim Zoológico de Lisboa, que recebe, anualmente, milhares de visitantes e, entre estes, particularmente, crianças. 116 Capítulo V CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE C RYPTOSPORIDIUM SPP. V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 117 1. INTRODUÇÃO A maioria das infecções por Cryptosporidium spp. são confirmadas pela observação microscópica de oocistos do parasita, em amostras fecais. Todavia, a semelhança morfométrica existente entre as diferentes espécies pertencentes a este género, não permite que a sua identificação seja efectuada por microscopia óptica [Petry, 2000; Fall et al., 2003]. Ao longo da última década, assistiu-se à ampla utilização das técnicas de biologia molecular, aplicadas ao estudo da epidemiologia de Cryptosporidium spp.. Com recurso a técnicas de PCR, RFLP e sequenciação de DNA, entre outras, tendo como alvo diversos loci genéticos, foi possível desenvolver métodos que permitiram detectar e diferenciar as várias espécies pertencentes a este género [Peng et al., 1997; Spano et al., 1997b; Gibbons et al, 1998; Morgan et al., 1998a; Spano et al., 1998b; Sulaiman et al., 1998; Cacciò et al., 1999; Xiao et al., 1999a, 1999c]. A aplicação destes métodos a inúmeros isolados, responsáveis por infecções humanas, em várias regiões do Mundo, permitiu, assim, conhecer a diversidade de espécies de Cryptosporidium, infectantes para o Homem. Apesar das espécies C. parvum e C. hominis serem as que mais se encontram associadas à criptosporidiose humana, sabe-se, hoje, que outras, como C. felis, C. meleagridis, C. canis, C. muris, C. suis e Cryptosporidium genótipo cervo podem, também, ser responsáveis pela infecção no Homem [Peng et al., 1997; Spano et al., 1997b; Gibbons et al, 1998; Morgan et al., 1998a; Spano et al., 1998a, 1998b; Sulaiman et al., 1998; Cacciò et al., 1999; McLauchlin et al., 1999; Pieniazek et al., 1999; Alves et al., 2000, 2001a; Guyot et al., 2001; Xiao et al., 2001a; Ong et al., 2002; Cama et al., 2003; Matos et al., 2004]. Com o objectivo de identificar as espécies de Cryptosporidium, responsáveis pela criptosporidiose numa população de infectados por VIH, em Portugal, os isolados detectados, por diagnóstico parasitológico, no decurso do presente trabalho, foram caracterizados por PCR, RFLP e/ou sequenciação de quatro loci genéticos – COWP, DHFR, TRAP-C1 e SSUrRNA. No genoma de Cryptosporidium spp., existem cinco cópias deste último gene e uma cópia dos restantes três [Vásquez et al., 1996; Le Blancq et al., 1997; Spano et al., 1997a, 1998c]. Le Blancq et al. (1997) estudaram, num isolado bovino, pertencente à espécie C. parvum, a organização e a estrutura dos genes que codificam o rRNA, tendo observado, nas cinco cópias do ácido desoxirribonucleico ribossómico ou rDNA (sigla anglo-saxónica para “ribosomal deoxyribonucleic acid”), a existência de duas sequências nucleotídicas distintas, que denominaram de A e B. Estes autores verificaram que, das cinco cópias do rDNA, quatro V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 118 apresentavam a sequência nucleotídica A e uma a sequência B. A diferença nucleotídica entre as sequências A e B do rDNA localiza-se, essencialmente, nas regiões ITS, embora tenham, também, sido identificadas pequenas dissemelhanças nos genes que codificam as subunidades grande (28S), pequena (18S) e 5.8S do rRNA [Le Blancq et al., 1997]. Em C. parvum, as sequências das cópias A e B do gene que codifica a subunidade pequena (SSU) do rRNA, diferem, entre si, por uma delecção de três nucleótidos e por duas substituições de um nucleótido [Xiao et al., 1999b]. Estas diferenças não alteram os perfis de restrição dos produtos de PCR, obtidos por hidrólise com as endonucleases SspI e VspI, que utilizámos na análise de RFLP. Em C. felis e em C. hominis, foram, também, identificadas sequências nucleotídicas distintas nas diferentes cópias do gene que codifica a SSU-rRNA. Em C. felis, na sequência da cópia B, foi observada, relativamente à da cópia A, uma inserção, uma delecção e uma substituição, todas elas, de um único nucleótido. A substituição nucleotídica que se verifica em C. felis, na cópia B do gene SSU-rRNA, resulta na criação de um local de restrição adicional para a endonuclease VspI, originando, assim, perfis de restrição distintos para os dois tipos de cópias deste gene [Xiao et al., 1999b]. Ao invés do descrito em C. parvum, nos isolados de C. felis, não foi observada a proporção de quatro cópias da sequência A para, apenas, uma da sequência B [Xiao, L., 2005, comunicação pessoal]. Em C. hominis, a diferença entre a sequência das cópias do gene que codifica a SSU-rRNA, consiste em duas substituições de um nucleótido e na variação do número de resíduos de timina (6T, 8T, 10T, 11T ou 12T), presentes numa região poli-T do gene. Ao contrário do que sucede em C. felis, estas diferenças não alteram os perfis de restrição dos fragmentos amplificados, que se obtêm com as endonucleases utilizadas na análise de RFLP, sendo detectadas, somente, por sequenciação dos produtos de PCR [Xiao et al., 1999b; Dalle et al., 2003]. Xiao et al. (1999b) alinharam as sequências das diferentes cópias do gene SSU-rRNA de C. parvum, C. hominis e C. felis, com as de outras espécies e genótipos de Cryptosporidium e verificaram, por análise filogenética do alinhamento de sequências resultante, que a relação existente, entre as várias espécies e genótipos do género Cryptosporidium, não é alterada pelas dissemelhanças na sequência nucleotídica das diversas cópias do gene que codifica a SSU-rRNA. V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 119 2. RESULTADOS No conjunto dos quatro loci genéticos estudados (SSU-rRNA, COWP, DHFR e TRAPC1), foi possível amplificar, por PCR, o DNA genómico de 50 isolados de Cryptosporidium spp.. Deste grupo fazem parte seis dos 15 isolados, identificados entre Dezembro de 1994 e Agosto de 1997, que se encontravam conservados em MIF, todos os 26 isolados, identificados entre Setembro de 1997 e Maio de 2001, que se encontravam conservados em dicromato de potássio a 5% e todos os 18 isolados, identificados entre Junho de 2001 e Janeiro de 2005, que foram caracterizados, logo após a sua detecção. No quadro XVI, encontram-se resumidos, para cada locus estudado, os resultados da amplificação, por PCR, do DNA destes isolados de Cryptosporidium spp.. QUADRO XVI – Resultados da amplificação, por PCR, do DNA dos isolados de Cryptosporidium spp. identificados numa população portuguesa com infecção por VIH N.º DE ISOLADOS COM AMPLIFICAÇÃO POSITIVA ISOLADOS (n.º estudado) SSU-rRNA COWP DHFR TRAP-C1 Dez.94-Ago.97 (MIF) (n = 15) 6 (40,0%) 4 (26,7%) 2 (13,3%) 2 (13,3%) Set.97-Mai.01 (K2Cr2O7) (n = 26) 26 (100%) 22 (84,6%) 20 (76,9%) 16 (61,5%) Jun.01-Jan.05 (n = 18) 18 (100%) 13 (72,2%) 13 (72,2%) 11 (61,1%) Total (n = 59) 50 (84,7%) 39 (66,1%) 35 (59,3%) 29 (49,2%) No quadro XVI é possível observar que, independentemente do gene alvo, a percentagem de amplificação do DNA dos isolados que se encontravam conservados em MIF, foi muito inferior à daqueles que se encontravam preservados em dicromato de potássio ou que foram caracterizados logo após a sua identificação. O método de PCR para o gene SSUrRNA, foi o que permitiu a amplificação do DNA de um maior número de parasitas, seguindo-se-lhe, por ordem decrescente, os genes COWP, DHFR e TRAP-C1. Se excluirmos os isolados que se encontravam preservados em MIF, a percentagem de amplificação para o QUADRO XIX – Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e epidemiológicos dos doentes com criptosporidiose, cujos isolados foram caracterizados no presente trabalho (continuação) ISOLADO DATA IDADE SEXO RAÇA TRANSMISSÃO VIH LINFÓCITOS CD4+ (céls/µl) CARGA PARASITÁRIA DIARREIA OUTROS PARASITAS INTESTINAIS EVOLUÇÃO CLÍNICA OUTROS ESPÉCIE CH.84 Out-00 36 M – Homo 20 II S Giardia spp. (oito meses de evolução), Microsporidia Faleceu de criptosporidiose (2001) – C. meleagridis CH.86 Nov-00 34 M – Tóxico 19 II S N Melhorou – C. parvum CH.87 Dez-00 27 M Caucasiana Tóxico 3 II S Microsporidia Faleceu de criptosporidiose – C. parvum CH.88 Jan-01 40 F Negra Hetero 22 I S N Melhorou – C. felis CH.96 Mai-01 55 M Caucasiana Hetero 16 IV S N Melhorou – C. parvum CH.104 Jan-02 24 F Cigana Tóxico 17 II S N – – C. hominis CH.105 Jan-02 11 M Negra Vertical <15% (39) I N Giardia spp. (um mês antes), Microsporidia Melhorou – C. hominis CH.108 Mar-02 58 F Negra Hetero 13 IV S N Faleceu – C. hominis CH.113 Mai-02 40 F Negra Hetero 6 III S N Melhorou Residente em Angola C. hominis CH.128 Out-02 30 M Caucasiana Tóxico 7 IV S Microsporidia Melhorou – C. parvum CH.129 Out-02 29 M Caucasiana Hetero 23 II S Microsporidia Melhorou – C. parvum CH.130 Out-02 7 M Caucasiana Vertical 19% (213) I S (crónica) Microsporidia Melhorou Contacto com gatos no ambiente doméstico C. felis CH.151 Mai-03 40 M Caucasiana Tóxico – III S N Melhorou – C. hominis CH.170 Nov-03 30 M Caucasiana Tóxico 0 IV S N Faleceu – C. hominis CH.176 Jan-04 42 M Caucasiana Hetero 37 II S (crónica) Microsporidia – – C. parvum CH.182 Mai-04 38 M Caucasiana Homo 42 IV S N – – C. parvum CH.183 Mai-04 42 M Caucasiana Hetero 57 III S (crónica) Microsporidia (quatro meses antes) – – C. parvum CH.187 Mai-04 52 M Caucasiana Hetero 7 I S Microsporidia – Residente em Angola C. felis CH.190 Mai-04 40 M Negra Hetero 24 I S N – – C. hominis CH.191 Jun-04 41 M Negra Hetero 7 II S N – – C. hominis CH.198 Jul-04 38 M Caucasiana Tóxico 20 I S N – – C..hominis CH.201 Nov-04 50 M Caucasiana Hetero 125 IV S Giardia spp. – – C. parvum CH.203 Jan-05 >18 M Negra Tóxico 50-100 II S N Melhorou – C. parvum M: masculino, F: feminino; “–“: informação desconhecida; Homo: homossexual; Hetero: heterossexual; Tóxico: toxicodependente; S: sim; N: não V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 127 Tendo por base todos os casos de criptosporidiose humana identificados por diagnóstico parasitológico, na Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, no período compreendido entre Janeiro de 1995 e Janeiro de 2005, foi elaborado o gráfico da figura 12, onde se pode observar a distribuição do número de casos de criptosporidiose em função dos meses do ano. Os resultados representados neste gráfico mostram que, para a totalidade dos anos considerados, os meses de Janeiro e Maio foram aqueles em que se verificou maior número casos de criptosporidiose, seguindo-se-lhe os meses de Junho, Outubro e Novembro; o menor número de infecções foi registado nos meses de Abril e de Setembro. No gráfico da figura 13, é apresentada, para o mesmo período, a distribuição do total mensal de casos de criptosporidiose, em função da espécie causadora da infecção, nos casos em que a sua identificação foi possível. Esta representação gráfica mostra que, para o período considerado, as infecções por C. hominis ocorreram ao longo de todo o ano, à excepção dos meses de Fevereiro, Abril e Agosto, tendo apresentado picos em Janeiro e Maio. Por seu lado, os casos de criptosporidiose devidos a C. parvum concentraram-se entre os meses de Outubro e Junho, exceptuando o mês de Fevereiro, tendo sido verificados picos nos meses de Janeiro, Maio, Junho, Outubro e Novembro. Nos meses de Fevereiro e de Agosto, apesar de não terem sido observados casos de criptosporidiose devido a C. hominis ou a C. parvum, foram registadas infecções por C. meleagridis. FIGURA 12 – Representação gráfica do número de casos de criptosporidiose, diagnosticados entre Janeiro de 1995 e Janeiro de 2005, em função dos meses do ano 0 1 2 3 4 N.º de casos de criptosporidiose Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 128 FIGURA 13 – Representação gráfica do total de casos de criptosporidiose, por mês, diagnosticados entre Janeiro de 1995 e Janeiro de 2005, em função da espécie de Cryptosporidium spp. Em virtude do reduzido número de casos anuais de criptosporidiose estudados, não se verificaram as condições necessárias para a realização de qualquer inferência estatística, que permitisse avaliar a eventual variação sazonal da infecção humana pelas diversas espécies de Cryptosporidium. Por fim, encontra-se descrita no quadro XX a dimensão média dos oocistos de cada espécie de Cryptosporidium spp., de acordo com os dados obtidos por microscopia óptica. QUADRO XX – Dimensão dos oocistos pertencentes às espécies de Cryptosporidium, identificadas na população humana estudada ESPÉCIE DIMENSÃO MÉDIA DOS OOCISTOS (µm) C. parvum 4,97 × 4,42 C. hominis 4,91 × 4,36 C. felis 4,13 × 3,81 C. meleagridis 4,72 × 4,52 0 1 2 3 4 5 6 7 N.º de casos de criptosporidiose Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez C. parvum C. hominis C. felis C. meleagridis V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 129 3. DISCUSSÃO No conjunto dos quatro loci estudados (SSU-rRNA, COWP, DHFR e TRAP-C1), foi possível caracterizar, geneticamente, 84,7% dos isolados de Cryptosporidium spp. de origem humana (quadro XVI). Esta percentagem é, no entanto, um valor global, que não reflecte as assimetrias observadas, quer entre diferentes grupos de isolados, quer entre os diversos loci. Conforme se observa no quadro XVI, a percentagem de sucesso da PCR, no grupo de parasitas que se encontrava conservado em MIF, foi, no mínimo, duas vezes e meia inferior à observada no grupo dos que foram preservados em dicromato de potássio ou daqueles cuja caracterização molecular foi realizada logo após a sua identificação parasitológica. Esta situação está, com certeza, relacionada com o facto de os oocistos pertencentes ao primeiro grupo terem sido conservados, durante longo tempo, num meio contendo formaldeído (MIF). O formaldeído é um composto orgânico, amplamente utilizado na conservação de tecidos e seus componentes. No entanto, estudos realizados sobre as reacções químicas que ocorrem entre este composto e os ácidos nucleicos, revelaram que o formaldeído não só provoca a degradação das cadeias de DNA, através da formação de ligações cruzadas por pontes de metileno, da formação de nucleótidos apurínicos e apirimidínicos e da cisão da ligação fosfodiester da cadeia nucleotídica, como inibe a sua reparação [Grafstrom et al., 1983; Douglas e Rogers, 1998; Srinivasan et al., 2002]. Como consequência destas reacções, o DNA extraído de tecidos preservados em formaldeído, encontra-se muito fragmentado e apresenta um peso molecular muito baixo, o que compromete, seriamente, a sua amplificação por PCR [Douglas e Rogers, 1998; Srinivasan et al., 2002]. Gillespie et al. (2002), compararam, por PCR, a qualidade do DNA extraído de amostras de tecido humano preservadas em formaldeído e noutro tipo de conservantes, tendo, no último caso, observado maior facilidade de amplificação do DNA do que no primeiro. Resultados idênticos foram obtidos por Douglas e Rogers (1998), que descreveram o insucesso da PCR em amostras de tecidos vegetais tratadas com formaldeído, ao contrário do que aconteceu na amplificação do DNA de amostras idênticas não tratadas. No que respeita à amplificação dos quatro loci, a PCR do locus SSU-rRNA foi a que permitiu amplificar o DNA de um maior número de isolados, seguindo-se-lhe, por ordem decrescente, as dos genes COWP, DHFR e TRAP-C1 (quadro XVI). Para os isolados que não se encontravam conservados em MIF, as taxas de amplificação dos genes SSU-rRNA, COWP, DHFR e TRAP-C1, foram de 100% (44/44), 79,5% (35/44), 75% (33/44) e 61,4% V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 130 (27/44), respectivamente. Sulaiman et al. (1999) compararam os mesmos quatro métodos de PCR, tendo identificado como mais sensíveis os que amplificaram os genes SSU-rRNA e DHFR, seguidos, por ordem decrescente, pelos dos loci COWP e TRAP-C1. McLauchlin et al. (1999) observaram, para as mesmas PCR’S dos genes TRAP-C1 e COWP e para outra, dirigida para o locus SSU-rRNA, mas com oligonucleótidos iniciadores diferentes dos utilizados no presente trabalho, sensibilidades de 66% (139/211), 91% (191/211) e 97% (204/211), respectivamente, valores não muito díspares dos obtidos no presente trabalho. Resultados idênticos foram obtidos, ainda, por Pedraza-Díaz et al. (2001b), para estes mesmos métodos. A maior sensibilidade, exibida pela amplificação do gene SSU-rRNA, não será alheia à existência, no genoma de Cryptosporidium spp., de cinco cópias deste gene contra, apenas, uma dos genes COWP, DHFR e TRAP-C1 [Vásquez et al., 1996; Le Blancq et al., 1997; Spano et al., 1997a, 1998c]. Deste modo, no início da PCR, para um mesmo número de oocistos, o número de cadeias alvo do gene SSU-rRNA disponível é cinco vezes superior ao do presente para os restantes genes, o que se traduz no aumento da sensibilidade da sua amplificação. A sensibilidade da PCR é, também, determinada pelo tipo de reacção de amplificação realizada, na medida em que as PCR’S “nested” apresentam, regra geral, maior sensibilidade do que as simples. O método de PCR “nested”, para amplificação do gene SSUrRNA, apresentou sensibilidade superior à dos métodos de PCR simples, responsáveis pela amplificação dos genes COWP e TRAP-C1. Contrariamente ao esperado e aos resultados obtidos nos isolados de bovinos e de ruminantes do Jardim Zoológico de Lisboa (vide capítulo VI, quadro XXI), e, ainda, aos descritos por Sulaiman et al. (1999), nos isolados humanos, a percentagem de sucesso de amplificação do gene DHFR, por um método de PCR “nested”, foi inferior à observada para a PCR simples do gene COWP. Contudo, esta situação pode, em parte, ser explicada, pelo facto da PCR do gene COWP ter amplificado o DNA de alguns parasitas da espécie C. felis, o que não sucedeu com a PCR do gene DHFR. O número de criptosporídeos presentes nas amostras fecais constituiu outro dos factores com influência no sucesso dos métodos de PCR, em particular, nos dos genes DHFR e TRAP-C1. Nestes dois loci, a percentagem de insucesso da PCR, observada nas amostras fecais com carga parasitária baixa (nível I e II), foi cerca de duas vezes superior (20% e 40%, respectivamente) à da obtida nas fezes com carga parasitária de nível III e IV (10,5% e 21,1%, respectivamente), facto que, contudo, não se verificou na amplificação do locus COWP. A influência da carga parasitária fecal, no sucesso da PCR, foi, igualmente, descrita por McLauchlin et al. (1999), que V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 131 observaram, na amplificação dos genes COWP e TRAP-C1, o aumento da sensibilidade da reacção, proporcional ao número de oocistos presentes nas amostras fecais. O sucesso de cada método de PCR é, também, medido em função da sua capacidade de amplificação do DNA das diferentes espécies de Cryptosporidium, o que depende, fundamentalmente, da escolha dos oligonucleótidos iniciadores. Para que o DNA de todas as espécies e genótipos de Cryptosporidium seja amplificado, é essencial a ausência de polimorfismos do DNA alvo, na região de ligação dos oligonucleótidos iniciadores. No presente trabalho, apenas os métodos de amplificação dos genes SSU-rRNA e COWP permitiram amplificar o DNA das quatro espécies identificadas na população estudada (quadros XVII e XVIII). Porém, no caso do gene COWP, não só a amplificação do DNA de C. felis ocorreu em, apenas, 40% (2/5) dos isolados, como o rendimento da reacção foi muito baixo. Jiang e Xiao (2003) compararam diferentes métodos de PCR-RFLP (SSU-rRNA, COWP, DHFR, TRAP-C1, TRAP-C2, HSP70), no sentido de avaliar a sua capacidade de identificar as sete espécies de Cryptosporidium infectantes para o Homem, tendo verificado que, apenas, dois métodos, ambos baseados na amplificação de um fragmento do gene SSU-rRNA, permitiam a sua detecção e/ou diferenciação. Xiao et al., (2000b) conseguiram amplificar, com o método de PCR do locus COWP, desenvolvido por Spano et al. (1997b), o DNA de C. felis o que, no entanto, aconteceu com baixo rendimento e, apenas, em oocistos purificados. Estes autores determinaram a sequência nucleotídica do gene COWP em várias espécies de Cryptosporidium, tendo observado grande variabilidade entre sequências de diferentes espécies, em particular, na região de ligação dos oligonucleótidos iniciadores, sendo esta a razão da grande dificuldade da amplificação do gene COWP, em espécies como C. felis, C. canis, C. muris ou C. andersoni. Xiao et al. (2000b) conseguiram amplificar o gene COWP destas espécies, somente, com DNA isolado a partir de um número superior a 100 oocistos purificados. Tanto o método de amplificação do gene COWP, como o dos genes TRAP-C1 e DHFR, foram desenvolvidos com base na sequência nucleotídica das espécies C. hominis e C. parvum. Assim, a amplificação do DNA de espécies cuja sequência nucleotídica, na zona de ligação dos oligonucleótidos iniciadores, seja distinta da daquelas espécies, fica comprometida [Morgan et al., 2000a; Xiao et al., 2000b]. Por fim, há, ainda, a referir o caso do gene TRAP-C1, no qual, apesar de se ter verificado a amplificação do DNA dos isolados pertencentes à espécie C. meleagridis, a reduzida variabilidade da região amplificada, não possibilitou a distinção entre estes parasitas e os pertencentes à espécie C. hominis. Perante o V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 132 exposto, a utilidade dos métodos de amplificação dos genes COWP, DHFR e TRAP-C1, na identificação das espécies de Cryptosporidium que causam infecção humana e daquelas presentes em amostras ambientais, encontra-se limitada, não só pela baixa sensibilidade da reacção, como, também, pelo facto de não permitirem a amplificação ou a diferenciação do DNA das várias espécies e genótipos deste parasita. Em todos os isolados pertencentes à espécie C. felis, identificados no presente trabalho, a visualização, em gel de agarose, dos fragmentos de restrição do gene SSU-rRNA, obtidos por hidrólise com a endonuclease VspI, permitiu identificar a presença dos dois tipos de cópias deste gene. Em três isolados, foi observado o predomínio do perfil de restrição correspondente à cópia A do gene que codifica a SSU-rRNA, enquanto que, noutros dois, o perfil dominante dizia respeito à cópia B daquele gene. Nestes cinco isolados, a diferença de intensidade, observada nos fragmentos de restrição, correspondentes aos dois tipos de cópia do gene SSUrRNA, sugere a existência de variabilidade na proporção do número de cópias A e B, presentes em cada um (figura 10). Considerando os doentes com criptosporidiose nos quais foi identificada a espécie responsável pela infecção, 52% (26/50) encontravam-se parasitados por C. parvum, 32% (16/50) por C. hominis, 10% (5/50) por C. felis e 6% (3/50) por C. meleagridis (quadro XVII). Estes números põem em evidência o facto de mais de metade dos doentes se encontrarem infectados por C. parvum. O predomínio da infecção humana por esta espécie tem, também, sido observado em diversos países do Continente Europeu. Estudos realizados em França, no Reino Unido, na Irlanda do Norte e na Suíça, dão conta de percentagens de infecção humana, devidas a C. parvum, de 47,8% (22/46), 61,5% (1.049/1.075), 89,7% (35/39) e 53,8% (7/133), respectivamente, contra valores de 30,4% (14/46), 37,8% (645/1.075), 10,3% (4/39) e 15,4% (2/13), para a infecção por C. hominis [McLauchlin et al., 2000; Morgan et al., 2000a; Guyot et al., 2001; Lowery et al., 2002]. Pelo contrário, noutros Continentes, observa-se maior número de infecções devidas a C. hominis. Em dois estudos epidemiológicos, realizados no Peru, um em crianças e outro em adultos infectados por VIH, as percentagens de infecção por C. hominis foram de 78,8% (67/85) e 66,9% (204/302), respectivamente, contra valores de 9,4% (8/85) e 11,2% (34/302) para a infecção por C. parvum [Xiao et al., 2001a; Cama et al., 2003]. Nos Estados Unidos da América, a caracterização molecular de isolados de Cryptosporidium spp., identificados em casos esporádicos e em surtos, revelou percentagens de infecção por C. hominis e C. parvum de 79,5% (35/44) e V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 133 20,5% (9/44), respectivamente [Sulaiman et al., 1998]. No Malawi, no Uganda e na Tailândia, a percentagem de casos de criptosporidiose humana, atribuída à espécie C. hominis, foi de 95,3% (41/43), 73,4% (326/444) e 50% (17/34), respectivamente, enquanto que, para a infecção por C. parvum, foi de 4,6% (2/43), 19,1% (85/444) e 14,7% (5/34) [Gatei et al., 2002b; Peng et al., 2003a; Tumwine et al., 2003]. No que respeita à infecção pelas espécies C. felis e C. meleagridis, as percentagens de infecção, encontradas na população portuguesa estudada, de 10% (5/50) e de 6% (3/50), respectivamente, são idênticas às de 13% (6/46) e de 6,5% (3/46) encontradas, em França, por Guyot et al. (2001), para as mesmas espécies. No Reino Unido, McLauchlin et al. (2000) encontraram uma percentagem de casos de criptosporidiose humana devidos a C. meleagridis de 0,46% (5/1705). Num estudo realizado, em crianças, no Uganda, a percentagem de infecção por C. meleagridis, registada por Tumwine et al. (2003), foi de 1,1% (5/444). Nas investigações realizadas nestes dois últimos países, não foram identificadas infecções devidas a C. felis. No entanto, a caracterização genética dos isolados foi efectuada pela técnica de PCR-RFLP, aplicada ao gene COWP, que, como já foi referido, não permite a detecção do DNA de todos os parasitas pertencentes a esta espécie. Contrariamente ao observado nos estudos acima descritos, noutros países, o número de casos de infecção por C. meleagridis foi mais elevado. No Peru, em doentes infectados por VIH, as percentagens de criptosporidiose, devidas a C. meleagridis e a C. felis, foram de 12,6% (38/302) e 3,3% (10/302), respectivamente [Cama et al., 2003]. Na Tailândia, numa população semelhante, os valores encontrados, para estas duas espécies, foram de 20,6% (7/34) e 8,8% (3/34), respectivamente [Gatei et al., 2002b]. Para além das quatro espécies já referidas, diversos autores descreveram, ainda, infecções humanas causadas pelas espécies C. muris, C. canis e C. suis e por Cryptosporidium genótipo cervo [Pieniazek et al., 1999; Guyot et al., 2001; Xiao et al., 2001a; Gatei et al., 2002a; Ong et al., 2002; Cama et al., 2003; Gatei et al., 2003]. Estas espécies e genótipo não foram, porém, encontradas na população portuguesa estudada. O significado epidemiológico da diferente distribuição das várias espécies de Cryptosporidium responsáveis pela infecção humana, em diversas zonas geográficas, é, ainda, desconhecido, embora se pense que possa estar relacionado com a existência de variadas fontes de infecção e/ou ser o reflexo de diferenças na contribuição de cada modo de transmissão, para a epidemiologia da criptosporidiose, numa dada região. A ocorrência, nos países europeus, de um maior número de infecções por C. parvum, leva a supor a existência, não só de um elevado reservatório zoonótico desta espécie, como de um predomínio da transmissão zoonótica, sobre a V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 134 antroponótica [Xiao et al., 2000c; Thompson, 2003]. Estudos epidemiológicos, conduzidos no Reino Unido, mostraram que os casos esporádicos, devidos a C. parvum, se encontram associados, sobretudo, ao contacto com gado doméstico e ao consumo de água da rede de abastecimento não fervida, enquanto que os devidos a C. hominis são mais frequentes em indivíduos que viajaram para fora do País ou que estiveram em contacto directo com pessoas parasitadas [McLauchlin et al., 2000; Pedraza-Díaz et al., 2001b; Goh et al., 2004]. Num estudo casocontrolo, sobre a criptosporidiose esporádica em Inglaterra e no País de Gales, Hunter et al. (2004) encontraram uma associação, estatisticamente significativa, entre a infecção por C. hominis e a deslocação recente ao estrangeiro ou o proceder à muda de fraldas em crianças com idade inferior a cinco anos. Os mesmos autores encontraram, ainda, o mesmo tipo de associação, entre a infecção por C. parvum e o contacto com gado doméstico. O facto de as medidas adoptadas, no Reino Unido, para o controlo da epidemia de febre aftosa, em 2001, terem tido como consequência um decréscimo do número de casos de criptosporidiose humana por C. parvum, sustenta a hipótese da importância da transmissão zoonótica naquele País [Smerdon et al., 2003; Xiao e Ryan, 2004]. Num estudo realizado na Suíça, em crianças com diarreia, Glaeser et al. (2004) observaram que a infecção por C. hominis era responsável por 90% (9/10) dos casos de criptosporidiose associados a viagens para fora do País. Os dados epidemiológicos recolhidos, ao longo do presente trabalho, não foram suficientes para permitir a associação entre a infecção por determinada espécie de Cryptosporidium spp. e os factores de risco que se sabe poderem favorecer a sua transmissão. A informação sobre a permanência no estrangeiro, nos meses que antecederam o diagnóstico, apenas foi disponibilizada para cinco doentes. Destes, três infectados por C. hominis, um por C. parvum e outro por C. felis, quatro haviam regressado de Angola (dois deles eram residentes neste País) e um da Guiné-Bissau (quadro XIX). Nos dois doentes, que se sabia residirem em Angola, a criptosporidiose não pode, contudo, ser considerada como infecção do viajante. Quanto aos restantes três doentes, todos eles africanos, desconhece-se se teriam residência em Angola e na Guiné-Bissau ou se a chegada a Portugal se terá verificado na sequência da deslocação àqueles países. No que se refere ao contacto com gado doméstico ou com animais de companhia, apenas foi conseguida a informação de que um dos doentes, com infecção por C. felis, tinha contacto com gatos, no seu ambiente doméstico. Contudo, não foi possível realizar um exame parasitológico às fezes desses animais, para averiguar se estariam a excretar oocistos. V – CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS HUMANOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP. 135 A variação sazonal, do número de casos de criptosporidiose humana encontra-se bem descrita em países, como os EUA ou o Reino Unido. Nos EUA, verifica-se que o número de casos de criptosporidiose notificados regista um aumento entre os meses de Junho e Outubro, o que os epidemiologistas associam à prática de actividades ao ar livre, particularmente à utilização de água de recreio (rios, lagos, piscinas) [Dietz et al., 2000; Hlavsa et al., 2005]. No Reino Unido, McLauchlin et al. (2000) e Pedraza-Díaz et al. (2001b), observaram a existência de dois picos de ocorrência da criptosporidiose, um durante a Primavera, que se encontra associado à infecção por C. parvum, devido ao aumento dos casos de criptosporidiose no gado doméstico na época do parto e, outro, no fim do Verão e início do Outono, associado à infecção por C. hominis e a deslocações para fora do País. No que respeita ao presente trabalho, a observação das figuras 12 e 13 revela a existência de picos do número de casos de criptosporidiose, sobretudo, nos meses de Janeiro e Maio, mas, também, nos de Junho, Outubro e Novembro. Enquanto que as infecções devidas a C. hominis foram registadas em todas as estações do ano, o mesmo não se verificou com as causadas por C. parvum, que não foram observadas durante os meses de Verão (entre Julho e Setembro). Ainda, enquanto que a criptosporidiose por C. hominis evidencia uma transmissão mais ou menos constante, destacando-se, somente, dois picos de infecção, um em Janeiro e outro em Maio, os casos devidos a C. parvum parecem registar maior número anual de picos de infecção (Janeiro, Maio, Junho, Outubro e Novembro). Dado que o número de casos anuais de criptosporidiose estudado foi muito reduzido, desconhece-se se estas observações constituem, ou não, o reflexo da realidade epidemiológica do nosso País. Para além disso, também não dispomos de dados epidemiológicos suficientes que nos permitam interpretar e fundamentar as variações na distribuição temporal dos casos de criptosporidiose, acima descritas. A análise dos resultados da identificação das espécies de Cryptosporidium, em função da carga parasitária excretada pelos doentes, mostrou que todos aqueles com infecção por C. felis ou C. meleagridis exibiam cargas parasitárias de nível I ou II, enquanto que os doentes que excretavam maior número de oocistos (nível III ou IV) se encontravam parasitados por C. hominis ou por C. parvum (quadro XIX). A comparação dos casos de infecção devidos a estas duas últimas espécies revelou, ainda, que a percentagem de infectados por C. hominis e com elevada carga parasitária (nível III ou IV) – 50% (8/16) – foi ligeiramente superior à dos parasitados por C. parvum – 46,2% (12/26). No Reino Unido, McLauchlin et al. (1999) verificaram que 52,7% (39/74) dos infectados por C. hominis exibiam carga parasitária