Caracterização preliminar da bioenergética do efluxo pelo sistema AcrAB-TolC em Escherichia coli

UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA CARACTERIZAÇÃO PRELIMINAR DA BIOENERGÉTICA DO EFLUXO PELO SISTEMA AcrAB-TolC EM Escherichia coli SUSANA CRISTINA NUNES SANTOS COSTA DISSERTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM MICROBIOLOGIA MÉDICA OUTUBRO DE 2010 UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA CARACTERIZAÇÃO PRELIMINAR DA BIOENERGÉTICA DO EFLUXO PELO SISTEMA AcrAB-TolC EM Escherichia coli SUSANA CRISTINA NUNES SANTOS COSTA DISSERTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM MICROBIOLOGIA MÉDICA Orientador: Professor Doutor Miguel Viveiros Laboratório onde o trabalho experimental foi desenvolvido: Unidade de Ensino e Investigação de Micobactérias Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa OUTUBRO DE 2010 i Comunicações em congressos Os resultados apresentados foram objecto de apresentação em co-autoria das seguintes comunicações em congressos, sobre a forma de Poster: Susana Costa, Ana Martins, Gabriella Spengler, Leonard Amaral e Miguel Viveiros. 2009. Bioenergetic Characterization of efflux in Escherichia coli strains, In Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica vol. 56 (suppl.) pp. 134. Second Central European Forum for Microbiology. Keszthely, Hungria, 7-9 Outubro 2009. Susana Costa, Ana Martins, Gabriella Spengler, Leonard Amaral e Miguel Viveiros. 2009. ATPase inhibitors as new efflux pump inhibitors of Escherichia coli, In livro de abastracts do Congresso Nacional Microbiotec09. Vilamoura, Portugal, 28-30 Novembro 2009. Ana Martins, Gabriella Spengler, Susana Costa, Miguel Viveiros e Leonard Amaral. 2009. Influence of Calcium and pH in the accumulation and efflux of ethidium bromide, In livro de abastracts do Congresso Nacional Microbiotec09. Vilamoura, Portugal, 28-30 Novembro 2009. ii Agradecimentos Este espaço é dedicado a todos aqueles que participaram directa ou indirectamente e que estiveram ao meu lado durante a realização deste trabalho. Mais uma etapa concluída… e a muitos de vocês o devo… O meu sincero agradecimento a todos. Ao meu orientador, Professor Doutor Miguel Viveiros, Director da Unidade de Micobactérias, do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, pela disponibilidade em partilhar o seu saber e pelo interesse demonstrado desde o primeiro momento. Pela paciência e empenhamento com que acompanhou a elaboração desta dissertação. Pelas suas palavras de incentivo que tornaram possíveis a sua realização, mesmo quando tudo parecia indicar o contrário. Obrigado por me ter ajudado a não desistir. À Professora Doutora Isabel Couto, pela disponibilidade, sugestões e interesse demonstrado em todas as fases que levaram à concretização deste trabalho, e por todo o apoio que me concedeu desde o primeiro dia. À Unidade de Ensino e Investigação de Micobactérias, do Instituto de Higiene e Medicina Tropical da Universidade Nova de Lisboa, pelas condições laboratoriais disponibilizadas, e a todos os colegas de laboratório pelo companheirismo e boa disposição com que fazem investigação e por estarem sempre dispostos a ensinar o que sabem. À Ana Martins e Gabriella Spengler pela cumplicidade e espírito de entreajuda que sempre existiu entre nós durante a realização deste trabalho. “Köszönök mindent Ananak és Gabinak”. À Diana Machado e Sofia Costa, pela partilha de conhecimentos, pela ajuda e compreensão nos momentos difíceis. Diana, o empréstimo do computador foi uma ajuda preciosa, sem ele a fase final teria sido ainda mais caótica. Às instituições organizadoras do Mestrado, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Faculdade de Ciências Médicas, Instituto de Tecnologia Química e Biológica, e Faculdade de Ciências e Tecnologia, pela oportunidade cedida. iii À Doutora Marta Martins, pelos conselhos sempre úteis, pelas palavras de apoio e pelo exemplo. A todos os elementos da Unidade de Virologia, pelo apoio, motivação e amizade durante a realização deste projecto, pelos alegres momentos de descontracção e camaradagem. Aos meus amigos, pela constante motivação e por todos os momentos de convívio partilhados, mas acima de tudo obrigado por me entenderem. A toda a família Nunes, um profundo e sincero obrigado pelo carinho, apoio e acima de tudo por acreditarem em mim. Ao Mário, por estar sempre ao meu lado em todos os momentos, pela paciência, dedicação, incentivo e pelo seu apoio incondicional. Aos meus pais, que tantos sacrifícios fizeram para eu chegar onde cheguei e que sempre me fizeram acreditar que só é impossível fazer o que não nos propomos seriamente fazer e a quem eu quero dedicar esta tese. Muito obrigado a todos. iv Resumo A resistência aos antibióticos em bactérias Gram-negativas pode ser aumentada pela extrusão de antibióticos através de sistemas de efluxo. Em Escherichia coli, o principal sistema de efluxo é o AcrAB-TolC o qual tem como principal fonte energética a força proto-motriz. Este trabalho pretendeu estudar alguns aspectos essenciais da bioenergética na actividade de efluxo de E. coli usando três estirpes bem caracterizadas genotipica e fenotipicamente. Foi utilizado um método fluorimétrico semi-automático no qual a fluorescência do fluorocromo brometo de etídeo, substrato de bombas de efluxo foi seguida, permitindo a medição em tempo real da actividade de efluxo e acumulação de fluorocromo (inibição do efluxo). A utilização de brometo de etídeo é particularmente vantajosa pois emite baixa fluorescência no exterior da célula bacteriana tornando-se extremamente fluorescente no seu interior. Este método é uma nova aplicação do termociclador em tempo real RotorGeneTM 3000 que permite o cálculo da cinética de transporte reflectindo o balanço entre acumulação de substrato por difusão passiva através da membrana e a sua extrusão/efluxo, proporcionando uma detecção rápida e económica de inibidores de efluxo. Os resultados obtidos mostram, para todas as estirpes, que a GLU e o pH afectam a acumulação e o efluxo do brometo de etídeo. De todos os inibidores de vias biossintéticas testados, o ortovanadato de sódio, foi o que demonstrou maior actividade inibitória, a qual é revertida na presença de GLU. Em conclusão, este estudo mostra que a actividade de efluxo de E. coli depende não só da fosforilação oxidativa por via da força proto-motriz mas também da energia proveniente da hidrólise de ATP pelas ATPases. O ortovanadato de sódio tem potencial para ser um novo inibidor de bombas de efluxo de largo espectro. A tecnologia utilizada neste trabalho demonstrou ser apropriada para a caracterização bioenergética da actividade de bombas de efluxo e permite a selecção de novos inibidores de bombas de efluxo em bactérias. v Abstract Antibiotic resistance in Gram-negative bacteria can be increased by extrusion of the antibiotic through efflux systems. In Escherichia coli, the major efflux pump system is the AcrAB-TolC which is mainly driven by energy coming from the proton motive force. In this work was studied basic aspects of the bioenergetics of the efflux activity of E. coli using three genotipically and phenotipically well characterized strains. It was used the semi-automated fluorimetric method that utilizes the fluorochrome ethidium bromide, a known fluorescent efflux pump substrate, which allows the real time measurement of efflux activity and efflux inhibition (accumulation). Ethidium bromide has been shown to be particularly suitable to be used as a probe because it emits weak fluorescence outside the bacterial cell and becomes strongly fluorescent inside the cell. This method is a new application of the RotorGeneTM 3000 real-time thermocycler and provides the sum of transport kinetics reflecting the balance between accumulation of substrate via passive diffusion through the membrane permeability barrier and extrusion via efflux, thereby offers a rapid and inexpensive screening of inhibitors. The results obtained show, for all strains, that GLU and pH affects the accumulation and efflux of ethidium bromide. From all the inhibitors of energy biosynthetic pathways tested, sodium orthovanadate was the one that revealed the highest inhibitory activity and this inhibitory effect was reversed by the presence of GLU in the medium. In conclusion, this study shows the dependence of the efflux activity of E. coli on energy from the hydrolysis of ATP by the ATPases, besides the already known dependence on the oxidative phosphorylation, to maintain the proton motive force of the cells. Sodium orthovanadate has potential to be a new broad range efflux-pump inhibitor. The technology used in this work showed to be suitable for the characterization of the bioenergetic requirements of the bacterial efflux pump activity, allowing the screening of new efflux pump inhibitors. vi Índice Geral Comunicações em congressos i Agradecimentos ii Resumo iv Abstract v Índice de Figuras ix Índice de Tabelas xi Lista de Abreviaturas xii 1. INTRODUÇÃO 1 1.1. Enterobacteriaceae 1 1.1.1. Escherichia coli 1 1.1.2. Parede celular 2 1.1.3. Importância clínica e terapêutica 5 1.1.4. Mecanismos de acção, e resistência 5 1.2. Sistemas de efluxo e sua presença em E. coli 8 1.2.1. Superfamília “ATP-binding cassette” (ABC) 10 1.2.2. Superfamília "Major Facilitator" (MFS) 11 1.2.3. Família "Multidrug and Toxic Compound Extrusion" (MATE) 11 1.2.4. Família "Small Multidrug Resistance" (SMR) 12 1.2.5. Superfamília "Resistance Nodulation Division" (RND) 12 1.3. Bioenergética bacteriana 16 1.3.1. ATPases, gradiente electroquímico de protões e força proto-motriz (FPM) 18 1.3.2. Desacopladores 24 1.3.2.1. Mecanismo de acção / Efeito bioenergético do CCCP 26 1.3.3. Inibidores das ATPases membranares 28 1.3.3.1. Ortovanadato de Sódio 28 1.3.3.1.1. Mecanismo de acção 29 1.3.3.2. Azida de Sódio 30 1.3.3.2.1. Mecanismo de acção 30 vii 1.3.4. Inibidores (das ATPases dependentes) dos canais de cálcio 30 1.3.4.1. Mecanismo de acção 31 1.3.4.2. Clorpromazina (CPZ) 32 1.3.4.3. Tioridazina (TZ) 32 1.4. Metodologias de detecção do efluxo em bactérias 33 1.4.1. Método fluorimétrico semi-automático para monitorização do transporte de brometo de etídeo através de membranas e paredes celulares 34 1.5. Objectivos do trabalho 37 2. MATERIAL E MÉTODOS 40 2.1. Material 40 2.1.1. Estirpes Bacterianas 40 2.1.2. Meios de cultura, compostos e soluções 40 2.2. Métodos 44 2.2.1. Cultivo das Estirpes Bacterianas 44 2.2.2. Determinação de CMI (Concentração Mínima Inibitória) pelo método de diluição em microplaca (microdiluição) para as três estirpes de E. coli em estudo 44 2.2.3. Determinação de CMB (Concentração Mínima Bactericida) para as três estirpes de E. coli em estudo 46 2.2.4. Fluorimetria em Termociclador de Tempo Real Rotor-Gene TM 3000 47 2.2.4.1. Protocolo de acumulação de brometo de etídeo 47 2.2.4.2. Determinação da viabilidade celular 49 3. RESULTADOS 50 3.1. Determinação das concentrações mínimas inibitórias e concentrações mínimas bactericidas dos compostos em estudo para as estirpes AG100, AG100A e AG100TET 50 3.2. Aplicação do método fluorimétrico semi-automático para monitorização do transporte de brometo de etídeo 54 3.2.1. Parâmetros base na caracterização do transporte de EtBr 54 3.2.2. Influência de desacopladores na acumulação de EtBr 57 3.2.3. Influência de Inibidores de ATPases membranares na acumulação de EtBr 63 1 1. INTRODUÇÃO 1.1. Enterobacteriaceae As bactérias entéricas pertencem a uma família numerosa e são caracterizadas fenotipicamente por serem bacilos Gram-negativos, aeróbios facultativos, não esporogénicos, imóveis ou móveis, com flagelos perítricos, fermentadores da glucose, produtores de catalase e citocromo-oxidase negativo, (23, 64) com requisitos nutricionais relativamente simples (64). Os principais géneros de microrganismos patogénicos desta família são Enterobacter, Escherichia, Salmonella, Serratia, Shigella e Yersinia (23). Estes microorganismos são responsáveis por variadas infecções no ser humano (infecção urinária, entérica, etc.) que se caracterizam por uma elevada morbilidade e mortalidade. A antibioterapia das infecções por Enterobacteriaceae constitui presentemente um sério problema de Saúde Pública, dada a elevada resistência das estirpes bacterianas aos principais grupos de antibióticos (β-lactâmicos, quinolonas e aminoglicosídeos), sobretudo em ambiente hospitalar (23, 95, 100). 1.1.1. Escherichia coli E. coli foi identificada pela primeira vez pelo pediatra Alemão Theodor Escherich em 1885, tendo sido originalmente denominada de Bacterium coli commune. Desde 1920, que E. coli tem sido um organismo útil para estudos de fisiologia bacteriana, pois era facilmente acessível, geralmente não patogénico, e crescia rapidamente em meios com requisitos nutricionais simples. Por tudo isso e devido à sua enorme plasticidade metabólica é ainda hoje um aliciante modelo para estudos em microbiologia e em bioquímica microbiana (5, 101). 2 E. coli é um bacilo Gram-negativo de 1.1 a 1.5 µm de largura e 2.0 a 6.0 µm de comprimento (101). Possui flagelos dispostos em torno da célula que lhe permitem a mobilidade. A existência de fímbrias ou adesinas facilitam a sua fixação o que impede o seu arrastamento pela urina ou fezes líquidas. O nucleoide contém uma única molécula de DNA circular (já sequenciado) e o citoplasma contém um ou mais plasmídeos. Possui uma grande quantidade de ribossomas, o que é uma evidência da elevada capacidade de resposta metabólica desta bactéria (52, 56). Figura 1 - Fotografia de microscopia electrónica de colónias de E. coli (x14000) (adaptado de 101). 1.1.2. Parede celular Tal como as restantes bactérias Gram-negativas, E. coli caracteriza-se por possuir uma parede celular complexa, constituída por regiões morfologicamente definidas. A camada mais interna é a membrana plasmática, uma bicamada que contém fosfolípidos e proteínas de membrana, é semipermeável e regula a passagem de metabolitos para dentro e para fora do citoplasma (73, 113), de forma a regular o pH, a pressão osmótica e a disponibilidade de substâncias essenciais. Exteriormente a esta membrana encontrase a camada de peptidoglicano, que serve como um “exoesqueleto”, que mantém a forma celular e rigidez. As bactérias Gram-negativas têm uma camada relativamente fina de peptidoglicano o que confere menos rigidez comparativamente com a camada mais espessa de peptidoglicano das bactérias Gram-positivas (113). 3 A camada de lipopolissacáridos (LPS) está localizada adjacentemente à camada de peptidoglicano, é constituída por uma bicamada fosfolipídica semelhante à que constitui a membrana plasmática e está ligada ao peptidoglicano por lipoproteínas. Os polissacáridos que se estendem para fora da bicamada contribuem para a toxicidade celular e a porção lipídica do LPS contém um lípido altamente tóxico, conhecido por lípido A, que é responsável pela maioria dos efeitos patogénicos associados às bactérias Gram-negativas. As bactérias Gram-positivas não possuem esta membrana adicional (73, 113). O LPS, as lipoproteínas e a associação dos polissacáridos formam a chamada membrana externa (26, 73, 113). Figura 2 – Representação esquemática da parede celular de bactérias Gram-negativas (adaptado de 6). O espaço entre a camada de peptidoglicano e a membrana externa é o espaço periplasmático, o qual contém proteínas hidrolíticas que destroem agentes exteriores e impede a sua penetração na célula (113). A membrana externa, é uma bicamada assimétrica tendo a sua composição lipídica e proteica um forte impacto na sensibilidade das bactérias a muitos tipos de antibióticos, é comum a resistência a esses compostos pela ocorrência de modificações dessas macromoléculas (26), esta membrana tem como principal função servir de barreira protectora, prevenindo a entrada de substâncias tóxicas, tendo por isso um impacto importante sobre a susceptibilidade dos microrganismos a uma série de compostos nocivos, tais como antibióticos, desinfectantes e detergentes (26, 41, 80) não se tratando 4 no entanto de uma barreira impermeável. Assim, existem fluxos de substâncias para o interior e para o exterior da parede celular das Enterobactereaceae mediada por proteínas específicas (81). A membrana externa é bastante mais permeável que a membrana plasmática pois permite a passagem de pequenas moléculas como glucose e outros monossacáridos para o espaço periplásmático através de porinas, que são proteínas que formam canais, os quais permitem a entrada dessas moléculas na célula (80, 113). Em oposição, as bombas de efluxo (BE) promovem o transporte de agentes químicos indesejáveis à célula através da membrana plasmática para o exterior por canais específicos da membrana externa, o que possibilita uma diminuição da sua concentração dentro da célula (87). Ancoradas na membrana externa encontram-se as porinas pertencentes à família das proteínas estruturais da membrana que formam trímeros de canais abertos (81), cheios de água (18, 41, 81) que permitem uma alta permeabilidade (81) através da membrana externa das bactérias Gram-negativas (16) permitindo a difusão não específica de iões e pequenas moléculas hidrofílicas (41, 80, 81). Em E. coli as principais porinas também designadas de proteínas de membrana externa (Outer Membrane Proteins (OMP)) são a OmpC e OmpF (81, 130) e em termos de massa são geralmente as proteínas mais abundantes de E. coli (80). Cada célula de E. coli tem cerca de 100,000 cópias destas proteínas (73, 80) o que permite a difusão passiva de pequenos solutos polares através da membrana celular (16). A expressão de porinas é maxima em condições ambientais óptimas, sendo ajustada quando necessário para minimizar a penetração de compostos nocivos ou maximizar a entrada de nutrientes (80, 81, 130) não ocorrendo a difusão de compostos de grandes dimensões o que diminui drasticamente o influxo da maioria dos antibióticos que são geralmente de dimensões maiores relativamente aos nutrientes comuns (80, 140). Para além destas porinas existem também as proteínas monoméricas, tal como a OmpA de E. coli, que permite a difusão lenta e não específica de pequenos solutos (80, 81). O canal de porinas de E. coli diminui a pH ácido, ocorrendo o estreitamento do canal a pH 5.4 (81). 5 1.1.3. Importância clínica e terapêutica Reconhecido como um organismo comensal, E. coli, é uma espécie de maior importância clínica, ocasionando frequentemente infecções intestinais, urinárias, gastroenterites, pneumonias, septicemias, abcessos, entre outras (23, 101). E. coli é a causa comum de diarreia em países em vias de desenvolvimento e em viajantes para esses países. É a bactéria aeróbia facultativa predominante na flora intestinal, sendo o ambiente natural de E. coli o tracto intestinal de humanos e animais, pertencendo ao grupo dos coliformes fecais. A sua presença é indicadora de contaminação fecal na água e nos alimentos (52, 101, 64). As infecções intestinais causam frequentemente diarreia em lactentes (52), em crianças e em imunocomprometidos, podendo causar infecções mais graves, associadas a alta morbilidade e mortalidade. Para estes grupos de pacientes, a terapia antimicrobiana é necessária, devendo ser feito com cefalosporinas de largo espectro ou fluoroquinolonas (95). 1.1.4. Mecanismos de acção, e resistência Os agentes antimicrobianos são substâncias que inibem o crescimento microbiano ou eliminam o microorganismo. Entre estes fazem parte, para além dos antibióticos (de origem natural), os compostos produzidos sinteticamente (24). A propriedade mais importante que os agentes antimicrobianos devem possuir para terem utilidade clínica, é a presença de uma toxicidade selectiva que lhes permita inibir ou eliminar o microorganismo sem ter um efeito tóxico no hospedeiro ao qual são administrados (24, 55, 136). Existe, contudo, uma má utilização dos antibióticos, nomeadamente a automedicação, o desconhecimento do mecanismo de acção dos antibióticos, utilização excessiva dos mesmos, aumento da quantidade destes compostos na alimentação animal, entre outros, que tem como principal consequência o aparecimento das bactérias multirresistentes difíceis de combater (118), ou seja, resistentes a três ou mais classes de antibióticos diferentes (96, 118). Deste modo, infecções que anteriormente eram facilmente controláveis passam a ser praticamente impossíveis de tratar. 6 Os antibióticos podem ser classificados segundo vários critérios sendo a mais comum a que usa o seu mecanismo de acção como critério de classificação (59, 118, 134): a) Inibidores da síntese da parede celular – actuam produzindo defeitos estruturais na parede interferindo no processo de replicação celular (eg. penicilinas e derivados); b) Inibidores da membrana celular – desorganizam a estrutura das membranas das bactérias (eg. polimixina); c) Inibidores da síntese de ácidos nucleicos - afectam a síntese de DNA ou RNA, ou ligam-se a estes de tal forma que a mensagem não pode ser lida pelas proteínas descodificantes (eg. quinolonas e rifampicinas); d) Inibidores competitivos – agentes quimioterapêuticos sintéticos que interferem com funções metabólicas na célula (eg. sulfamidas); e) Inibidores da síntese proteica – inibidores de etapas no processo de tradução, provocando uma paragem na síntese proteica, consequentemente no crescimento levando à eliminação da célula bacteriana (eg. cloranfenicol, tetraciclinas e macrolídos). Entre os antibióticos disponíveis para o tratamento de infecções a E. coli, os que mais são prescritos na prática clínica são, as sulfonamidas, fluoroquinolonas, ampicilina, cefalosporinas e aminoglicosídeos (15). O conjunto de antibióticos mais comum para o tratamento das infecções a E. coli (sobretudo as urinárias) é uma combinação de sulfonamida e trimetoprim, amoxacilina, ciprofloxacina e outras quinolonas. No entanto, a amoxacilina hoje em dia tem-se tornado ineficaz no combate às infecções urinárias, pelos padrões de resistência observados em infecções causadas por E. coli. Os aminoglicosídeos e as cefalosporinas são também frequentemente utilizados na prática clínica tendo sido provado que regimes terapêuticos de longa duração, são tão efectivos como os de curta duração (três dias) usando antibióticos de largo espectro (95). A resistência aos antibióticos surge quando a bactéria se altera genética e fisiológicamente tornando os antibióticos menos efectivos ou completamente inefectivos no seu combate. Assim, a resistência ao antibiótico descreve a capacidade da bactéria para sobreviver ou se multiplicar na presença de uma concentração de antibiótico que previamente lhe seria letal, ou pelo menos que seria suficiente para inibir o seu crescimento (98). 7 Os principais mecanismos para a resistência das bactérias aos antibióticos são: a) alteração da molécula alvo, como por exemplo o utilizar de outro enzima pela bactéria para desempenhar a mesma função que o enzima alvo do antibiótico; b) decomposição ou inactivação enzimática do antibiótico por enzimas hidrolíticas específicas; c) diminuição da capacidade de penetração do antibiótico na bactéria; d) Bombear do antibiótico para o exterior mais rapidamente do que este entra na bactéria; e) mutação espontânea e recombinação genética que criam variabilidade sobre a qual actua a selecção natural e f) aquisição de elementos genéticos móveis (plasmídeos, transposões, bacteriófagos), que podem transportar genes que codificam determinantes de resistência (Figura 3) (39, 55, 59, 83, 118). Figura 3 – Representação esquemática dos principais mecanismos de resistência a antibióticos. a) alteração da molécula alvo, b) inactivação enzimática do antibiótico, c) diminuição da capacidade de penetração do antibiótico, d) efluxo, e) mutações, f) aquisição de elementos genéticos móveis (adaptado de 59). Na presença desta multiplicidade de mecanismos de resistência sabe-se hoje que a multirresistência emerge sobretudo nos casos de doentes sob antibioterapia prolongada, como por exemplo, um doente com infecções urinárias ou do trato respiratório de repetição que são sujeitos a antibioterapia repetida ao longo do tempo. O abuso do 8 tratamento empírico com antibióticos, muitas vezes de largo espectro, sem antes ter sido identificado o organismo e o seu perfil de resistência aos fármacos, conduz à eliminação da flora susceptível comensal e ao aparecimento de reservatórios de estirpes multirresistentes sobretudo de bactérias comensais como E. coli. Os factores ambientais, alimentares e o abuso de desinfectantes domésticos e outros agentes antibacterianos, também são apontados como potenciadores de multirresistência, embora sejam escassos os estudos de correlação directa entre a emergência de estirpes multirresistentes em animais, na agricultura e água, e as infecções em humanos (3). Ao se proporcionar condições para uma presença constante de concentrações sub-terapêuticas e subinibitórias de antibiótico numa determinada população bacteriana, esta situação irá conduzir à selecção da resistência e um dos principias mecanismos de reacção imediata à acção antibiótica é a activação dos sistemas de efluxo. O efluxo de antibióticos só recentemente foi aceite como um possível mecanismo de resistência nas infecções bacterianas, embora já tenha sido descrito em 1978 com a descoberta de proteínas de transporte de membrana em bactérias Gram-negativas que excluem tetraciclinas de E. coli (58). Desde então chegou-se à conclusão que este mecanismo está presente na maioria das bactérias patogénicas, sendo responsável pela sua sobrevivência na presença de determinadas concentrações de antibióticos e outras toxinas (96). 1.2. Sistemas de efluxo e sua presença em E. coli As proteínas de efluxo de múltiplos agentes quiomioterapêuticos são proteínas específicas de transporte para o exterior das células que se encontram codificadas nos plasmídeos ou no cromossoma bacteriano podendo ser específicas, facilitando o efluxo de exclusivamente um substrato, ou pelo contrário, transportar uma variedade de classes de substratos, como no caso da família das tetraciclinas, ou podem ser não específicas quando apresentam uma grande especificidade para compostos químicos que não têm qualquer relação estrutural, estas designam-se de bombas de resistência a múltiplos compostos (MDR, do inglês “Multi Drug Resistance”) (21, 96). 9 Verificou-se que existem BE tanto em procariontes como em eucariontes, sendo que a primeira observação do efluxo de agentes quimioterapêuticos em eucariontes se refere ao aparecimento de resistência a citostáticos em linhas celulares neoplásicas com Pglicoproteína. Algumas das BE não são apenas responsáveis pela extrusão de agentes quimioterapêuticos mas também compostos como a hemolisina em E. coli (38), ou esteroídes como a progesterona e o cortisol ou ainda exportar adesinas, toxinas e outras proteínas importantes para a colonização e infecção de células humanas e animais (30). O efluxo está envolvido na baixa susceptibilidade intrínseca, resistência cruzada a moléculas de classes quimícas não relacionadas, e selecção / aquisição de mecanismos de resistência adicionais (65). Com base no critério bioenergético e estrutural, as BE podem ser catalogadas em duas grandes classes: os transportadores activos primários pertencentes à superfamília ABC (do inglês, “Adenosine Triphosphate (ATP)-binding cassette”), que usam a energia da hidrólise do ATP; e os que utilizam o gradiente transmembranar electroquímico de protões e sódio, para transportar os antibióticos para fora da célula, constituindo os sistemas de transporte secundários (87, 95, 98). Os transportadores da classe dos transportadores activos secundários englobam quatro famílias fundamentais de BE e a sua caracterização estrutural e bioquímica depende do número de regiões transmembranares proteicas, número de componentes da bomba, da fonte de energia utilizada e do tipo de substratos que a bomba exporta (61, 106). Assim temos: - Superfamília “major facilitator” (MFS). - Família “multidrug and toxic compound extrusion” (MATE). - Família “small multidrug resistance” (SMR). - Superfamília “resistance nodulation division” (RND). As BE podem também classificar-se como sistemas multicomponentes ou sistemas constituídos apenas por um componente. Os sistemas multicomponentes, existentes em bactérias Gram-negativas, são constituídos por uma proteína membranar de fusão MFP 10 (do inglês,”Membrane Fusion Protein”), uma proteína membranar externa OMP (do inglês, “Outer Membrane Protein”) e uma proteína transportadora (53, 55). Estas bombas permitem o transporte dos compostos para o espaço extracelular através da parede celular. No caso das BE com apenas um componente, presentes em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, os compostos são transportados apenas através da membrana plasmática, sendo eliminados para o meio extracelular no caso das bactérias Gram-positivas, ou para o espaço periplasmático no caso das bactérias Gram-negativas (53). Figura 4 – Representação esquemática e simplificada das cinco famílias de bombas de efluxo bacterianas (MFS, SMR, MATE, RND, ABC) (adaptado de 53). Legenda: ATP: adenosina trifosfato; ADP: adenosina difosfato; Pi: fosfato inorgânico. 1.2.1. Superfamília “ATP-binding cassette” (ABC) Os transportadores da classe “ATP-binding cassette superfamily” (ABC), são complexos multi-proteícos (formando um canal de transporte pela membrana citoplasmática) e proteínas citoplasmáticas com actividade de ATPases, utilizando a energia da hidrólise do ATP para transportar através de membranas biológicas uma 17 Assim, os organismos heterotróficos aeróbios como E. coli retiram energia das mais diversas moléculas orgânicas (açúcares, aminoácidos, ácidos gordos, etc.) através de um processo de catabolismo que se inicia na glucose, processo que ocorre em praticamente todos os seres vivos, denominado de glicólise, também designado por via de EmbdenMeyerhof-Parnas, mesmo que complementada com outras reacções, o que parece confirmar que deverá ter sido o primeiro fenómeno eficiente de produção de energia em células (64, 75). A glicólise ocorre no citoplasma e consiste na degradação da glucose em ácido pirúvico, é designada a fase anaeróbia da respiração pois é exactamente igual ao processo que decorre na fermentação, ao que se segue a descarboxilação oxidativa pelo ciclo dos ácidos tricarboxilicos ou ciclo de Krebs. Por fim a cadeia respiratória ou cadeia transportadora de electrões consiste na transferência dos electrões, libertados durante a oxidação da glucose, para o oxigénio, aceitador final destes electrões, o qual fica carregado negativamente e combina-se com os protões em solução, originando água. Esta transferência para além de formar água, liberta energia, que é capturada ao nível dos citocromos através do processo de fosforilação oxidativa que gera ATP por acção da enzima F1FO-ATPase (31, 62, 64, 75). Deste modo, a energia disponível na célula que garante a sua sobrevivência que, para o objectivo deste trabalho, garante a energia necessária para o transporte de substratos, é gerada, armazenada e disponibilizada através desta enzima essencial à bioenergética celular. Figura 6 – Representação da membrana citoplasmática de E. coli com a maquinaria necessária à produção de ATP [cadeia de transporte electrónico (ETC), citocromos, F-ATPase] e potencial de membrana (ΔΨ). O ΔΨ fornece a energia electroquímica para as proteínas de transporte e para o movimento flagelar (adaptado de 75). 18 1.3.1. ATPases, gradiente electroquímico de protões e força proto-motriz (FPM) As conversões energéticas são comuns a todas as formas de vida. A degradação de nutrientes em animais ou bactérias ou a fotossíntese em plantas, culmina com a produção de ATP, a molécula universal de transferência de energia (27) que suporta quase todas as actividades celulares que requerem energia. O ATP é a fonte de energia primária para o transporte de solutos e macromoléculas através de membranas citoplasmáticas (97). A síntese de ATP é uma das principais reacções químicas no mundo biológico (139). ATPases ou estruturas semelhantes são encontradas em todos os organismos que sintetizam ou hidrolisam ATP acoplado com a translocação de protões (14). Existem diferentes tipos de ATPases, as quais podem diferir na estrutura, no tipo de iões que transportam e na função (síntese e/ou hidrólise de ATP). As ATPases podem ser agrupadas em quatro tipos distintos, P, F, V e ABC, com as três primeiras designadas há mais de 20 anos atrás e as do tipo ABC (vide secção 1.2.1.) descritas mais recentemente. Estes quatro tipos têm em comum o facto de existirem inseridas e transportarem pelo menos um átomo ou molécula através de membranas biológicas acoplado com a hidrólise de ATP. De facto, são nano-máquinas (tipo P e ABC) ou duplas nano-máquinas (tipo F e V) (Figura 7) (93). As F1FO-ATPases estão presentes nas membranas de bactérias, mitocôndrias e cloroplastos (17, 27, 33), e as V1VO-ATPases (ATPases vacuolares) presentes em vacuolos intracelulares de células eucariotas (25, 33, 93), em vesículas intracelulares de leveduras, plantas e animais (25). Assim, as ATPases estão presentes em todos os domínios da vida, tendo surgido de um ancestral comum, mas evoluíram em classes distintas de ATP sintetases/ATPases (33). Todas as ATPases, incluindo as de mitocôndria e cloroplastos, partilham similaridades mecânicas e estruturais (25). A distribuição tão abrangente das F1FO-ATPases em mitocôndrias e cloroplastos dos eucariotas e nas membranas celulares de eubactérias demonstra a sua grande importância. 19 Figura 7 - Estrutura das ATPases de transporte. F-ATPase e V-ATPase (adaptado de 79); P-ATPase e Transportador ABC (adaptado de Functional Membrane Proteomics, site: http://www.sfb628.uni-frankfurt.de/ acedido em Agosto de 2010). Assim, as F1FO-ATPases (Número EC 3.6.1.34) (também denominada de F1FO-ATP sintetase, ATP sintetase, F-ATPase ou simplesmente ATPase) de bactérias têm duas importantes funções fisiológicas (25): i) usam um gradiente protónico (∆µH+) e o potencial de membrana (Δψ) associado para sintetizar ATP a partir de ADP e fosfato inorgânico (Pi) na etapa final da fosforilação oxidativa (17, 46), 20 ii) podem reverter a sua acção funcionando como ATPase para catalisar a hidrólise de ATP (17) quando necessário para gerar um gradiente electroquímico transmembranar de protões requerido para a locomoção, consumo de nutrientes e outras funções (135). As F-ATPases consomem um gradiente electroquímico de protões (H+) para sintetizar ATP, ou hidrolisam ATP para construir um gradiente de H+. As V-ATPases constroem um gradiente de H+ através da membrana catalisando a hidrólise de ATP para transportar solutos e baixar o pH no interior dos organelos, não funcionando em condições fisiológicas de forma reversível (42). Figura 8 – Representação esquemática da função fisiológica da F-ATPase (adaptado de 62). Neste trabalho, dedicamos especial atenção às ATPases do tipo F. A F1FO-ATPase é a enzima chave na interconversão energética celular (17). A enzima é composta por dois domínios estrutural e funcionalmente distintos: i) o domínio FO (também denominado FO-ATPase) hidrofóbico, intrínseco na membrana, o qual está envolvido na translocação de protões através da membrana; ii) o domínio hidrofílico, extrínseco/periférico F1 (também denominado F1-ATPase) que contém os locais catalíticos para a síntese e hidrólise de ATP (25, 42, 47, 51, 115). 21 Por outro lado, F1 e FO estão ligados por um veio central e um veio periférico (27). Quando F1 e FO estão acoplados através de interacções hidrofóbicas e electroestáticas, o complexo F1FO pode funcionar como ATPase ou como ATP sintetase (25). Os domínios F1 e FO podem funcionar separadamente, no entanto, a síntese de ATP requer que as subunidades F1 e FO estejam ligadas (14, 17). Figura 9 - Estrutura da F1FO-ATPase de E. coli (adaptado de 135). A F1FO-ATPase usa a rotação física das suas próprias sub-unidades como um passo da catálise – um mecanismo diferente dos de qualquer outra enzima conhecida, pois a rotação não é um mecanismo celular preferencial (139). É possível definir a F1FO-ATPase como um sistema que funciona como um complexo de dois motores rotacionais acoplados (Figura 9) (33, 139); um no domínio F1, que executa a tarefa de síntese e hidrólise de ATP (51) com os movimentos de um rotor interno, e outro no domínio FO, que liga a translocação de protões com os movimentos deste rotor FO (17). Cada um destes domínios funciona como um motor rotacional reversível, com direcções de rotação opostas (139) e trocam energia com o motor oposto através de rotação mecânica do veio central (27). Quando F1 é separado de FO, é consequentemente dissociado da geração de FPM (51), passando F1 apenas a catalisar a hidrólise de ATP (25, 51, 139). A parte FO mantém-se intercalada na membrana e, na ausência de F1, mantém intacta a função de translocação 22 de protões através da membrana, no entanto esta translocação passa a ser passiva e bidireccional (17, 25, 46, 51, 139). O complexo F1FO-ATPase tem 8 subunidades diferentes em procariotas e 16-18 subunidades em mamíferos, com um peso molecular de 550-650 KDa. A composição mínima de subunidades de F1FO é representada pela F1FO-ATPase de E. coli (Figura 9). Consiste em oito diferentes subunidades, cinco das quais pertencem à F1-ATPase designadamente, em ordem decrescente de tamanho e número de subunidades, α3β3γδε, com uma massa molecular de ~382 kDa, e três subunidades pertencentes à FO-ATPase, com uma estequiometria de ab2c10 e com uma massa molecular de ~148 kDa (17, 25, 34, 46). A região do veio central é composta por subunidades de ambos os domínios F1 e FO. A FO-ATPase em organismos superiores é consideravelmente mais complexa (14). Em E. coli, o movimento de protões através de FO leva à rotação da subunidade oligomerica c relativamente à subunidade a, com a qual forma uma interface. Simultaneamente a rotação da subunidade elongada e assimétrica γ leva a mudanças conformacionais nos locais de ligação a nucleótidos de F1 que são necessários para a síntese de ATP. Na ausência de um gradiente de protões, a hidrólise de ATP levará à translocação de protões. As subunidades a e c, são duas proteínas hidrofóbicas membranares que estão directamente envolvidas na translocação de protões, sendo a subunidade c um anel com dez monómeros com uma cavidade central preenchida com lipidos (47). F1 e FO são então interligados por dois veios, um deles central que contém as subunidades γ e ε, e outro periférico envolvendo as subunidades δ e b (17). Um segundo grupo de ATPases a que se dedica especial atenção neste trabalho é o das P-ATPases bacterianas ou bombas iónicas que translocam protões por troca com iões sódio, potássio ou cálcio (Figura 7). As P-ATPases (anteriormente denominadas E1E2ATPases) encontram-se em bactérias, fungos e na membrana plasmática e organelos de eucariotas, estando envolvidas no transporte de formas catiónicas de cálcio, sódio, potássio, cobre, e outros metais através de membranas biológicas, seguindo um ciclo de reacção que envolve um intermediário fosforilado (93). Embora se dividam em subclasses ou sub-tipos, dependendo se translocam metais pesados ou iões sódio-potássio- 23 cálcio, têm estruturas e mecanismos de acção semelhantes. O conhecimento sobre a estrutura e função das P-ATPases assenta no modelo canónico da Ca2+-ATPase do reticulo sarcoendoplasmático do músculo dos mamíferos. É geralmente reconhecida que a estrutura desta ATPase, é representativa da família de ATPases tipo P. Esta ATPase é composta de uma secção no citoplasma e uma secção transmembranar com dois locais de ligação ao Ca2+ (Figura 10). A secção citoplasmática é constituída por três domínios citoplasmáticos, denominados domínios P, N e A, contendo mais de metade da massa da proteína e cerca de dez hélices transmembranares (M1-M10), com os dois locais de ligação de Ca2+ perto do ponto médio da bicamada lipídica. É ao longo destas secções citoplasmáticas que ocorre a fosforilação e a translocação iónica associada (43). Crê-se que parte da energia que circula ao nível da membrana plasmática bacteriana, garantindo o potencial protónico e a FPM que fica acessível às BE bacterianas, recebe importantes contributos das P-ATPases e do transporte iónico em parceria com as FATPases e o transporte protónico, as principais ATPases bacterianas (138). Figura 10 – Características gerais da estrutura da P-ATPase (adaptado de 43). As F-ATPases transportam protões ajudando a estabelecer um gradiente electroquímico transmembranar. Em determinadas condições, este processo pode funcionar em sentido oposto, com a ATPase a ser movida pela FPM e a passar a funcionar como uma ATPsintetase. O ATP é sintetizado a partir da energia obtida da translocação de protões ou iões. Esta ligação de reacções endergónicas e exergónicas nas subunidades das ATPases denomina-se de acoplamento. Quando deixa de haver interacção entre as Citoplasma 24 subunidades (F1 e FO nas F-ATPases), a transdução de energia é perdida, e o sistema diz-se estar desacoplado (17). A FPM criada pelo gradiente protónico transmenbranar (ΔμH+) é o potencial energético que pode ser obtido pela passagem de protões através da membrana citoplasmática celular, ou seja, é um gradiente electroquímico transmembranar com dois componentes: um gradiente de protões (na forma de hidrogeniões H+) que promove uma diferença de pH (ΔpH) e uma diferença na carga iónica ou potencial de membrana (Δψ) devido à distribuição desigual de cargas (15, 92). Estes dois parâmetros actuam, em geral, em sentidos opostos, permitindo que a FPM se mantenha constante (102). Em bactérias metabolicamente activas com membranas citoplasmáticas intactas, a diferença de potencial (Δψ) situa-se geralmente entre -100 mV e -200 mV, encontrando-se o interior da membrana carregado negativamente (109). O mecanismo pelo qual a ATPase cataliza o acoplamento de energia eficiente e reversível entre o transporte vectorial de iões e substratos através da membrana e as reacções químicas da síntese e hidrólise de ATP tem sido um dos maiores pontos de interesse na investigação em bioenergética bacteriana (46). Para o efeito tem-se vindo a utilizar compostos que fazem o desacoplamento entre a FPM e a actividade da ATPase de forma a ser possível estudar a sua dinâmica, estrutura e factores condicionantes da actividade geradora de energia para o transporte de substratos através da parede e membranas bacterianas. 1.3.2. Desacopladores Protonofóros ou agentes despolarizantes (94), tal como o CCCP (carbonil cianeto mclorofenilhidrazona) ou o 2,4-DNP (2,4-dinitrofenol), dissipam a FPM através da membrana plasmática de E. coli (49), sendo o CCCP 10-100 vezes mais efectivo que o 2,4-DNP (28). 25 Em células eucariotas, a principal acção dos protonóforos é colapsar o gradiente protónico através da membrana interna da mitocôndria ao permitir rearranjos e translocações transientes dos protões existentes à superfície interna e externa da bicamada lipídica das membranas mitocondriais, levando ao colapso do gradiente protónico transmenbranar (ΔμH+), o que resulta na anulação completa do potencial de membrana e na acumulação de iões cálcio. Os protonóforos, causam uma rápida perda de ATP, através da inibição da sua síntese e activação da sua hidrólise pela ATP sintetase mitocondrial (123). O resultado final é que o CCCP ao tornar a membrana permeável a iões H+, colapsa completamente o gradiente de H+ e o gradiente de potencial através das membranas mitocondriais, bloqueando desse modo a síntese de ATP, havendo uma libertação concomitante de iões cálcio e uma estimulação da ATPase mitocondrial produzindo-se assim um declínio extremamente rápido nos níveis de ATP celulares (28). Em células de E. coli em aerobiose, o ΔμH+ é completamente anulado pelo CCCP, e resulta principalmente do efluxo de protões acoplado à oxidação de substratos (54). A despolarização causada pelo CCCP é dependente da concentração, limitando com isso o seu potencial de acção (28). Assim, o CCCP e o 2,4-DNP, são desacopladores directos da FPM e indirectos da fosforilação oxidativa, sendo capazes de transportar protões através de membranas biológicas, que habitualmente têm baixa condutividade protónica (36). O 2,4-DNP é usado na produção de pesticidas, de corantes, fotoquímicos, explosivos e como indicador para a detecção de iões potássio e amónio. É também usado na produção de 2,4-diaminofenol o qual é usado no tratamento médico da obesidade (108). Figura 11 – Estrutura química do composto 2,4-dinitrofenol (C6H3N2O5-) (adaptado de 77). 26 O CCCP é um ácido orgânico fraco, lipofílico (70, 132) que inibe o gradiente protónico, ou seja inibe a FPM (19), actuado como um transportador e atractor protónico e como desacoplador (70, 132). Figura 12 – Estrutura química do composto CCCP (C9H5ClN4) (adaptado de 77). 1.3.2.1. Mecanismo de acção / Efeito bioenergético do CCCP Em estado estacionário, o nível celular de ATP em células viáveis é determinado pelas taxas de síntese e hidrólise de ATP. A maioria da síntese celular de ATP está associada ao processo de transferência de electrões na membrana. O transporte de protões na membrana serve como factor intermediário essencial para ocorrer a transferência de electrões relacionada com a síntese de ATP (72) e o transporte de solutos dependentes de energia. As células utilizam a energia proveniente da hidrólise de ATP pelas ATPases membranares para manter a concentração interna de iões, e de pequenos metabolitos através dos sistemas de transporte membranar. Sendo um protonóforo membranar, o CCCP tem a capacidade para colapsar o gradiente protónico necessário para assegurar a síntese de ATP e o transporte membranar. Consequentemente a sua presença diminui a síntese de ATP, pela diminuição do gradiente protónico transmenbranar (ΔμH+) e aumenta a utilização de ATP pois as células são forçadas a hidrolisar mais ATP para restabelecer o potencial protónico (92, 124). A acção do CCCP e os seus efeitos bioenergéticos estão ilustrados naFigura 13. 33 Figura 17 – Estrutura química do composto Tioridazina (C21H26N2S2) (adaptado de 77). 1.4. Metodologias de detecção do efluxo em bactérias Dada a crescente presença de multirresistência bacteriana devido à sobre-expressão e sobre-actividade de BE em estirpes clínicas, sobretudo em doentes sob antibioterapias prolongadas, tornou-se urgente o desenvolvimento de métodos de detecção desta actividade, embora estes ainda se encontrem numa fase de investigação e desenvolvimento (129). Não havendo ainda disponível, metodologias e tecnologias que permitam detectar rapidamente a presença destes fenómenos em estirpes isoladas de doentes sob antibioterapia, o único recurso disponível tem sido a determinação das concentrações mínimas inibitórias (CMIs) de cada estirpe para cada antibiótico na presença e ausência de compostos considerados IBEs. Sendo um método indirecto e pouco preciso, apenas permite uma qualificação indirecta da estirpe e a assumpção de que a multirresistência observada se deve à sobre-expressão e sobre-actividade de BE. Vários métodos laboratoriais detectam e quantificam a actividade dos sistemas de BE bacterianos usando a medição de substratos acumulados pelas células que possuem marcação radioactiva ou são fluorescentes. No entanto, estes métodos na sua maioria, têm dificuldade em separar a acumulação de substrato da sua extrusão bem como não permitem a variação simultânea das condições ambientais requeridas para os estudos de bioenergética (103, 129). Como tal, métodos que permitam a detecção rápida e a quantificação do efluxo são hoje uma necessidade permanente no laboratório de 34 Microbiologia Médica, e a Unidade de Micobactérias do IHMT, onde este trabalho de tese foi desenvolvido, tem vindo a contribuir para o desenvolvimento de métodos que permitam a quantificação em tempo real do efluxo activo em bactérias usando marcadores fluorescentes que sejam efluxados pelas bactérias. Em particular foram desenvolvidas metodologias de detecção do transporte parietal do composto quaternário fluorescente brometo de etídeo (EtBr), usado como marcador visual da actividade de efluxo devido às suas características de baixa fluorescência quando no exterior das células, e máxima fluorescência aquando da sua ligação no interior das mesmas (89, 127, 129). Este composto fluorescente pode-se ligar transientemente a vários níveis no interior da bactéria como seja ao RNA de cadeia dupla, RNA de cadeia simples, DNA de cadeia simples, oligonucleótidos e proteínas (50) entrando por difusão passiva a favor do gradiente de concentração e sendo o seu excesso extruido das células pelos mecanismos de efluxo pois é substrato de vários sistemas de efluxo (89, 127, 129). Assim, a acumulação de EtBr na célula e o consequente aumento de fluorescência detectada é o resultado do equilíbrio dinâmico entre a difusão passiva no sentido do meio intracelular e o transporte activo mediado pelas BE no sentido inverso. Este equilíbrio é função de uma diversidade de factores como sejam a permeabilidade da parede celular, o grau de actividade de efluxo e de energização da célula, em particular o ambiente protónico extracelular avaliado pelo pH do meio, entre outros factores. 1.4.1. Método fluorimétrico semi-automático para monitorização do transporte de brometo de etídeo através de membranas e paredes celulares Neste método, é analisada a acumulação e extrusão do fluorocromo EtBr, o qual é considerado substrato universal de BE (substrato específico do AcrAB-TolC), uma molécula biocompatível que, em condições definidas e controladas, não afecta a viabilidade celular nem as funções celulares (82, 89, 103, 129). Para estabelecer as condições experimentais que permitam detectar diferenças na acumulação de EtBr por acção dos IBEs a estudar, foi necessário determinar as condições essenciais de cada ensaio para cada estirpe e cada composto a testar. Assim, foi necessário determinar: 35 (i) Qual a concentração de EtBr à qual a estirpe por si só não apresenta acumulação significativa de EtBr, ocorrendo apenas uma acumulação de EtBr residual e basal, resultante de um equilíbrio entre a entrada por difusão passiva do EtBr e a sua saída por efluxo activo. A fluorescência detectada em equilíbrio não deverá ultrapassar 20% da fluorescência máxima detectável no intervalo máximo de 30 mínutos (i.e., aproximadamente um tempo de geração de E. coli), a pH fisiológico (pH=7) e deverá estar abaixo do 1/2 da CMI do EtBr para a estirpe em estudo. (ii) Qual a concentração dos compostos IBEs a testar (que por si só não podem ter fluorescência significativa) que não afecte a viabilidade celular. Para o efeito estabeleceu-se o 1/2 da CMI de cada composto para cada estirpe em estudo como a nível máximo a que se deveria trabalhar com um IBE, de forma a garantir a condição anterior. (iii) Quais os compostos testados nas condições anteriores que promovem um aumento significativo de acumulação de EtBr na presença e na ausência de uma fonte de energia (glucose), sem que essa concentração de EtBr e de IBEs afecte a viabilidade celular, processo inibitório este que é monitorizado pelo atingir de um novo estado de equilíbrio entre a entrada por difusão passiva do EtBr e a sua saída por efluxo activo (agora diminuído/inibido pela acção do IBE) no intervalo máximo de 30 minutos (Figura 18). Figura 18 – Representação esquemática da entrada e efluxo de EtBr na célula de E. coli. A) estado de equilíbrio da concentração de EtBr na célula (taxa de entrada ≈ taxa de saída); B) Acumulação de EtBr devido ao uso de IBE (taxa de entrada > taxa de saída). Legenda: IBE (inibidor de bomba de efluxo), BE (bomba de efluxo). 36 O sinal de fluorescência é monitorizado utilizando um termociclador de tempo real Rotor-Gene TM 3000 da Corbett Reseach (Sydney, Austrália), e os comprimentos de onda de excitação e emissão de 530nm bp e 585 nm hp, respectivamente (89). Num ensaio de acumulação, como o representado na Figura 19, é observada a capacidade de acumulação de EtBr pela célula. Esta fluorescência é maior, quanto maior a capacidade de acumulação de EtBr, e menor a capacidade de efluxo. Sabendo que a concentração de EtBr é o balanço entre a entrada de EtBr dentro da célula e a capacidade desta para o efluxar, a diferença de fluorescência (Δ) observada entre duas curvas, é uma medida da inibição do efluxo resultando na acumulação de EtBr na célula. A Figura 19 representa um exemplo teórico de duas possíveis curvas de acumulação para uma determinada estirpe em condições de acumulação diferentes (X e ●). Na presença de IBE (X), a estirpe acumula mais EtBr, ao invés na sua ausência (●) a capacidade de efluxo da estirpe não é inibida. Esta constitui, por isso, uma forma expedita e rigorosa de se avaliar o efeito de IBEs em estirpes bacterianas, tal como pretendido neste trabalho. Figura 19 – Gráfico ilustrativo de um ensaio de acumulação de EtBr. (Δ) a diferença de fluorescência entre duas curvas, é uma medida do grau de inibição do efluxo provocado pelo IBE, resultando na acumulação de EtBr na célula. Legenda: (●) ausência de IBE e (X) presença de IBE. 37 1.5. Objectivos do trabalho Como anteriormente referido, a resistência a antibióticos em bactérias Gram-negativas pode devida à extrusão activa do antibiótico através de sistemas de efluxo. Para se compreender de onde vem a energia para as BE funcionarem e como ao interferir com o fornecimento desta energia pode afectar a actividade de efluxo, foi efectuada uma extensa pesquisa bibliográfica, no sentido de encontrar compostos que consigam inibir directamente a actividade de efluxo, tais como desacopladores, inibidores das ATPases e inibidores das ATPases dependentes dos canais de cálcio, com actividade potencial sobre a nossa bactéria modelo, Escherichia coli. Os inibidores da cadeia transportadora de electrões como os clássicos cianeto de potássio, rotenona ou antimicina A, dado que actuam a montante do processo energético que garante a actividade das BE tendo um efeito letal sobre todos os processos energéticos das células procariotas e eucariotas, não foram testados pois o objectivo é o de identificar potenciais inibidores de BE que actuem no fornecimento energético às bombas sem afectar o restante metabolismo celular ou a viabilidade celular de modo a que futuramente possam vir a ser usados como adjuvantes da antibioterápia (89, 127, 129). Em E. coli, o principal sistema de efluxo é a bomba AcrAB-TolC da família RND, a qual funciona essencialmente abastecida pela energia que vem da FPM garantido pela eficiente actividade das ATPases bacterianas membranares, pelo que é um modelo académico excelente para o teste de compostos inibidores. Para tal, foram usadas três estirpes de E. coli bem caracterizadas: (i) E. coli AG100, estirpe selvagem que contém o sistema de efluxo AcrAB-TolC intacto e funcional; (ii) E. coli AG100A, que provém da estirpe AG100, nesta estirpe foram inactivados os genes que codificam para a principal bomba de efluxo AcrAB-TolC; (iii) E. coli AG100TET que foi anteriormente induzida a um alto nível de resistência à tetraciclina (TET) e tem sobreexpressão do sistema de efluxo AcrAB-TolC. 38 Da extensa pesquisa bibliográfica feita sobre possíveis compostos inibidores do fornecimento directo de energia às BE em E. coli, escolheu-se 6 compostos para este trabalho: Como desacopladores o carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona (CCCP) e o 2,4 – dinitrofenol (2,4-DNP), Como inibidores de ATPases membranares o ortovanadato de sódio e a azida de sódio, Como inibidores das ATPases dependentes dos canais de cálcio a tioridazina (TZ) e a clorpromazina (CPZ). Os critérios de escolha destes compostos, tiveram como base a existência de registos na literatura, de possível acção directa ou indirecta na inibição de BE bacterianas por interferência no fornecimento de energia. Figura 20 – Representação esquemática dos alvos celulares dos compostos CCCP, 2,4-DNP, ortovanadato de sódio, azida de sódio, TZ e CPZ (adaptado de 62, 99 e 124). 39 Assim, para avaliar a actividade inibitória destes compostos sobre o principal sistema de efluxo em E. coli testou-se, nas condições e com os critérios anteriormente descritos, as três estirpes de E. coli modelo com recurso ao método fluorimétrico semi automático que detecta em tempo real, a acumulação e efluxo do EtBr (89, 127, 129). Para este efeito foi necessário determinar o perfil de susceptibilidade para as três estirpes, por determinação dos valores de CMI (Concentração Mínima Inibitória) e CMB (Concentração Mínima Bactericida) para todos os compostos em estudo de forma a garantir que os efeitos observados se devem apenas à inibição da actividade de efluxo do EtBr, o substrato de eleição do sistema AcrAB-TolC (82, 89, 127, 129). 40 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Material 2.1.1. Estirpes Bacterianas Estirpe selvagem Escherichia coli K-12 AG100 (argE3 thi-1 rpsL xyl mtl Δ(gal-uvrB) supE44), que contém o sistema de efluxo AcrAB-TolC intacto e funcional (86). Estirpe E. coli K-12 AG100A (ΔacrAB::Tn903 Kanr), que provém da estirpe AG100. Nesta estirpe o sistema de efluxo AcrAB-TolC foi inactivado devido a inserção do transposão Tn903 no operão acrAB (86). As estirpes AG100 e AG100A foram caracterizadas e gentilmente cedidas pelo Dr. Hiroshi Nikaido (Departamentos de Química e Biologia Celular e Molecular, da Universidade da Califórnia, Berkeley, CA, E.U.A.). A estirpe E. coli AG100, susceptível ao antibiótico tetraciclina (TET), foi induzida através de passos graduais de exposição a concentrações crescentes de tetraciclina até um nível elevado de resistência a este antibiótico (CMI de 12 mg/L de tetraciclina). A estirpe adaptada, capaz de sobreviver a uma concentração entre 8 e 10 mg/L de tetraciclina por expressão de bombas de efluxo (BE), em particular sobre-expressão do sistema AcrAB-TolC, designa-se por AG100TET (126). 2.1.2. Meios de cultura, compostos e soluções A composição e modo de preparação dos meios de cultura, compostos e soluções utilizados ao longo do trabalho encontram-se descritos nas Tabelas 1 a 5. Todos os meios de culturas foram preparados com água bidestilada e esterilizados por autoclavagem a 121ºC durante 20 minutos a 1 bar. 41 Tabela 1 - Composição de meios de cultura utilizados. Meio de cultura Composição (por litro) Luria Bertani (LB) 10 g de peptona caseína ( 2 ) ; 5 g de extracto de levedura(2); 10 g de cloreto de sódio(3) Luria Bertani agar (LA) LB; 20 g de agar ( 1 ) Mueller-Hinton broth (MHB) (1) 300 g de infusão desidratada de carne; 17,5 g de caseína hidrolisada; 1,5 g de amido; 4,347 mg Ca2+; 6,206 mg Mg2+; pH 7,3 ± 0,1 a 25ºC Mueller-Hinton agar (MHA) ( 1 ) MHB; 17 g de agar ( 1 ) ; pH 7,3 ± 0,1 a 25ºC (1) Oxoid Ltd., Basingstoke, Inglaterra; (2) Merck, Darmstadt, Germany; (3) Panreac Química SA, Barcelona, Espanha. Tabela 2 - Composição e modo de preparação de soluções utilizadas. Solução Composição PBS (Phosphate Buffered Saline) 1X, pH 7 (1) PBS 1X, pH 5 (1) PBS 1X, pH 8 (1) 1 pastilha dissolvida em 200mL de água bidestilada corresponde a 10 mM tampão fosfato; 2,7 mM KCl; 137 mM NaCl. Para a solução de PBS 1X a pH 5, acertouse o pH da solução PBS 1X a pH 7 através da adição de uma solução de cloreto de hidrogénio (HCl) (3)(◊). Para a solução de PBS 1X a pH 8, acertouse o pH da solução PBS 1X a pH 7 através da adição de uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) (2) (◊). Glucose ( 2,ө ) 0,2 g/mL em água bidestilada estéril. (1) Sigma Aldrich Chemie, Steinheim, Germany; (2) Merck, Darmstadt, Germany; (3) Panreac Química SA, Barcelona, Espanha; (◊) Utilizou-se um medidor de pH Metrohm Herisau 632, Switzarland; (ө) a solução depois de preparada foi filtrada com filtros de seringa estéreis de PVDF com 0,22 μm de diâmetro de poro da Rotilabo ® Spritzenfilter Steril, Karlshure, Alemanha. 42 Tabela 3 - Composição e modo de preparação das soluções de desacopladores, soluções de inibidores de cadeia transportadora de electrões, soluções de inibidores de ATPases e soluções de inibidores das ATPases dependentes dos canais de cálcio utilizadas. Solução Composição / Preparação da solução “stock” Carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona (CCCP) (1) (pm = 204,6158 g/mol) 1 mg/mL em água bidestilada estéril e metanol (3) 1:1 (∆). Diluições preparadas em água bidestilada estéril. Armazenado ao abrigo da luz. 2,4,-dinitrofenol (DNP) ( 1 ) (pm = 184,10636 g/mol) 30 mg/mL em água bidestilada estéril e etanol absoluto (4) 1:1 (∆). Diluições preparadas em água bidestilada estéril. Mantida ao abrigo da luz. Tioridazina (TZ) ( 1,ө ) (pm = 370,57454 g/mol) 10 mg/mL em água bidestilada estéril Clorpromazina (CPZ) ( 1,ө ) (pm = 318,86416 g/mol) 10 mg/mL em água bidestilada estéril Azida de sódio (NaN3) ( 2 ) (pm = 65,00987 g/mol) 12 mg/mL em água bidestilada estéril Ortovanadato de sódio (Na3VO4) ( 1 ) (pm = 183,908410 g/mol) 8 mg/mL em água bidestilada estéril (∆) (1) Sigma Aldrich Chemie, Steinheim, Germany; (2) Sigma Chemical Co., St. Louis, USA (3) Merck, Darmstadt, Alemanha; (4) Panreac Química Sau, Barcelona, Espanha; (∆) Necessário aquecimento a 50ºC numa placa de aquecimento até dissolução total do composto; (ө) as soluções depois de preparadas foram filtradas com filtros de seringa estéreis de PVDF com 0,22 μm de diâmetro de poro. As soluções stock foram armazenadas a -20ºC. A diluição de todas as soluções stock foi feita em água bidestilada estéril. 49 Juntamente com os tubos controlo, em cada ensaio foram testados os inibidores a diferentes pH e na presença / ausência de GLU conforme se segue: i) 50 µL de suspensão celular e 50 µL de EtBr; ii) 50 µL da suspensão celular, 5 µL de solução “stock” de inibidores e 45 µL de PBS; iii) 50 µL da suspensão celular, 5 µL de solução “stock” de inibidores e 45 µL de EtBr; iv) 50 µL da suspensão celular, 5 µL de solução “stock” de inibidores, 43 µL de EtBr e 2 µL de 0,4% GLU (Cf); Para os pontos i), ii), e iii) os ensaios foram realizados a pH 5, pH 7 e a pH 8, (Tabela 2 e Tabela 4). Para os pontos ii), iii) e iv) a Cf de inibidores utilizada foi igual a 1/2 da CMI. Os tubos foram depois colocados num rotor de 36 tubos no aparelho Rotor-Gene TM 3000. As medições fluorimétricas, em tempo real, foram efectuadas a 37ºC, utilizando o filtro para comprimentos de onda de excitação de 530 nm “band-pass” (bp) e como filtro de detecção o filtro de 585 nm “high-pass” (hp), canal A.530/585hp (67). A medição fluorimétrica decorreu por um período de 30 minutos (cerca de 30 ciclos de 60 segundos cada) e as leituras foram efectuadas após cada ciclo. Cada ensaio foi realizado em triplicado. 2.2.4.2. Determinação da viabilidade celular Com o intuito de obter uma estimativa do número de células viáveis após cada ensaio no Rotor-Gene TM 3000, para garantir que as concentrações de inibidores utilizadas não estão a afectar a viabilidade celular, efectuaram-se diluições sucessivas (100 – 10-5) de cada amostra e dos controlos em PBS e plaqueou-se um volume de 100 µL em placas com meio MHA. Após 18 horas de incubação a 37ºC, contou-se o número de unidades formadoras de colónias (CFU). 50 3. RESULTADOS Com o intuito de responder às questões colocadas neste trabalho (qual o principal fornecedor de energia para a principal bomba de efluxo (BE) de E. coli, o sistema AcrAB-TolC e quais os compostos que podem actuar como inibidores deste processo), foi feita uma extensa pesquisa bibliográfica, no sentido de encontrar desacopladores, inibidores de ATPases membranares e inibidores das ATPases dependentes dos canais de cálcio. De acordo com os critérios anteriormente referidos (vide capítulo Introdução, secção 1.4.1.), foram escolhidos seis compostos, que incluem dois inibidores de ATPase (azida de sódio e ortovanadato de sódio), dois desacopladores (carbonil cianeto mclorofenilhidrazona e 2,4-dinitrofenol) e dois inibidores das ATPases dependentes dos canais de cálcio consequentemente inibidores das ATPases dependentes deste catião (clorpromazina e tioridazina). 3.1. Determinação das concentrações mínimas inibitórias e concentrações mínimas bactericidas dos compostos em estudo para as estirpes AG100, AG100A e AG100TET O perfil de susceptibilidade das estirpes AG100, AG100A e AG100TET, foi determinado por cálculo dos valores de CMI (concentração mínima inibitória) e CMB (concentração mínima bactericida) para o brometo de etídeo (EtBr), desacopladores, inibidores de ATPases membranares e inibidores das ATPases dependentes dos canais de cálcio. Os valores de CMI e CMB para cada composto encontram-se nas Tabelas 7 e 8, respectivamente. A eficiência de um antibiótico é caracterizada pela sua CMI, sendo esta definida como a menor concentração de um composto antimicrobiano suficiente para impedir o crescimento visível de um microrganismo. Este valor reflecte o sucesso de um antibiótico em atravessar todas as barreiras na célula bacteriana e atingir o seu alvo. No 51 entanto, diferentes mecanismos de resistência podem interagir para aumentar o nível de resistência. A inibição de um mecanismo de resistência por um antibiótico pode aumentar a susceptibilidade da bactéria a esse agente específico, podendo no entanto também restaurar ou melhorar a actividade de uma segunda classe de antibióticos (137). Tabela 7 - Valores de CMI obtidos para substratos de bombas de efluxo, desacopladores, inibidores de ATPase e inibidores das ATPases dependentes dos canais de cálcio nas três estirpes de E. coli em estudo. Agente CMI AG100 AG100A AG100TET mg/L M mg/L M mg/L M EtBr (*) 150 380x10-9 5 12,6x10-9 300 760x10-9 CCCP (◊) 10 48,8x10-9 10 48,8x10-9 20 97,7x10-9 2,4-DNP (◊) 290 1,57x10-6 290 1,57x10-6 145 788x10-9 CPZ (□) 60 188x10-9 20 62,7x10-9 140 439x10-9 TZ (□) 100 269x10-9 25 67,4x10-9 200 539x10-9 NaN3 (∆) 230 3,5x10-6 230 3,5x10-6 230 3,5x10-6 Na3VO4 (∆) 5000 27,2 5000 27,2 2500 13,6 Legenda: (*) Substrato de bombas de efluxo; (◊) desacoplador; (□) Inibidor das ATPases dependentes dos canais de cálcio; (∆) inibidor de ATPases membranares; CMI: concentração mínima inibitória; M= molar; EtBr - Brometo de Etídeo; CCCP - Carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona; 2,4-DNP - 2,4-Dinitrofenol, CPZ - Clorpromazina; TZ - Tioridazina; NaN3 - Azida de Sódio; Na3VO4 - Ortovanadato de Sódio. Os valores são a média de pelo menos três ensaios independentes, com resultados consistentes. 52 Tabela 8 - Valores de CMB obtidos para substratos de bombas de efluxo, desacopladores, inibidores de ATPase e inibidores das ATPases dependentes dos canais de cálcio nas três estirpes de E. coli em estudo. Agente CMB AG100 AG100A AG100TET mg/L M mg/L M mg/L M EtBr (*) 150 480x10-9 10 25,3x10-9 500 1,26x10-6 CCCP (◊) 10 48,8x10-9 10 48,8x10-9 20 97,7x10-9 2,4-DNP (◊) 580 3,15x10-6 >580 >3,15x10-6 580 3,15x10-6 CPZ (□) 60 188x10-9 40 125,3x10-9 280 878x10-9 TZ (□) 200 538x10-9 50 134,5x10-9 800 215,6x10-8 NaN3 (∆) >920 >14x10-6 >920 >14x10-6 >920 >14x10-6 Na3VO4 (∆) 6000 32,6x10-6 >6000 >32,6x10-6 6000 32,6x10-6 Legenda: (*) Substrato de bombas de efluxo; (◊) desacoplador; (□) Inibidor das ATPases dependentes dos canais de cálcio; (∆) inibidor de ATPases membranares; CMB: concentração mínima bactericida;M= molar; EtBr - Brometo de Etídeo; CCCP - Carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona; 2,4-DNP - 2,4Dinitrofenol, CPZ - Clorpromazina; TZ - Tioridazina; NaN3 - Azida de Sódio; Na3VO4 - Ortovanadato de Sódio. Os valores são a média de pelo menos três ensaios independentes, com resultados consistentes. Como se observa na Tabela 7, a estirpe AG100A (ΔacrAB::Tn903 Kanr) apresenta uma susceptibilidade ao EtBr 30 vezes superior à da estirpe AG100. No respeitante à estirpe AG100TET, onde ocorre sobre expressão do sistema AcrAB-TolC, a CMI para o EtBr é duas vezes superior à da estirpe selvagem. Estes resultados demonstram que, a bomba AcrAB-TolC tem um papel importante na extrusão do EtBr. A confirmação experimental destes resultados, já reportado em trabalhos anteriores (89, 126), é fundamental para a validação dos modelos experimentais escolhidos para o teste às hipóteses colocadas nesta tese. 53 Igualmente, verificam-se significativas diferenças nas CMIs da estirpe AG100A para o composto TZ, apresentando um valor de CMI 4 vezes inferior à estirpe AG100 e para o composto CPZ, que apresenta um valor de CMI 3 vezes inferior. A CMI do composto CPZ para a estirpe AG100TET é 2,3 vezes superior à da estirpe AG100. Estes resultados indiciam que, como no caso de outros inibidores de bombas de efluxo (IBE), as fenotiazinas podem ser elas próprias substrato das bombas, pelo que estes compostos poderão ter um efeito inibitório múltiplo: quer competitivo, quer depletor de energia para o efluxo (63, 67). No caso dos restantes compostos a estudar: CCCP, 2,4-DNP, NaN3 e Na3VO4 o valor de CMI para as estirpes AG100 e AG100A é o mesmo, verificando-se apenas algumas diferenças, na ordem de uma diluição, entre AG100TET e AG100. Nenhum destes compostos apresenta assim sinais de ser transportado pelo sistema AcrAB-TolC. Os valores de CMI e CMB apresentados nas Tabelas 7 e 8 são a média de três ensaios independentes e todos apresentaram resultados concordantes. As experiências realizadas tendo como controlo os solventes (DMSO, 50% etanol ou 50% metanol) mostraram que nenhum dos solventes tem efeito significativo no crescimento celular e na viabilidade (resultados não apresentados), não havendo portanto inibição do crescimento das estirpes pelos solventes usados. 54 3.2. Aplicação do método fluorimétrico semi-automático para monitorização do transporte de brometo de etídeo Neste estudo, o método fluorimétrico semi-automático de monitorização do transporte de EtBr, desenvolvido na Unidade de Micobactérias do Instituto de Higiene e Medicina Tropical (127, 129), foi seleccionado com o intuito de identificar e avaliar os compostos anteriormente seleccionados como potenciais inibidores específicos de BE, bem como para permitir efectuar estudos preliminares de bioenergética do sistema AcrAB-TolC de E. coli. Esta técnica permite detectar de forma rápida, precisa e reprodutível o transporte de EtBr através da parede celular bacteriana em concentrações de trabalho que não interfiram com a viabilidade celular nem perturbam as funções celulares, usando uma metodologia que permite a distinção entre acumulação e efluxo, ou seja, a direcção de transporte do EtBr através da membrana celular. 3.2.1. Parâmetros base na caracterização do transporte de EtBr De forma a auxiliar a leitura e interpretação dos resultados que se apresentam de seguida, convém relembrar que a acumulação de EtBr na célula bacteriana é o resultado do equilíbrio dinâmico entre a difusão passiva no sentido do meio intracelular e a extrusão activa, mediada por BE, no caso particular de E. coli, pelo sistema AcrABTolC, que o efectua utilizando a força proto-motriz (FPM). Este equilíbrio é função de uma diversidade de factores como sejam a permeabilidade da parede celular, o grau de actividade de efluxo e de energização da célula, em particular o pH do meio extracelular, entre outros factores. Quando se ultrapassa a concentração de equilíbrio entre a difusão passiva e o efluxo activo de EtBr, este irá ligar-se irreversivelmente aos componentes intracelulares, em particular aos ácidos nucleicos, e como tal não poderá ser extrusado por efluxo. Uma vez no interior da célula ocorre um incremento do sinal de fluorescência do EtBr face a soluções de EtBr livre, como resultado da sua ligação transiente a diversos alvos intracelulares (89, 131). 55 Critérios utilizados para todos os ensaios de acumulação e compostos testados neste trabalho, com recurso ao método fluorimétrico semi-automático de monitorização do transporte de EtBr através de membranas e paredes celulares: • A concentração de EtBr livre no ambiente extracelular em cada ensaio deverá permitir o estabelecimento do equilíbrio entre a entrada por difusão passiva do EtBr e a sua saída por efluxo activo, não afectando de alguma forma a viabilidade celular. A fluorescência detectada em equilíbrio não deverá ultrapassar 20% da fluorescência máxima detectável no intervalo máximo de 30 mínutos a pH fisiológico (pH=7) e deverá estar abaixo de 1/2 da CMI do EtBr para a estirpe em teste; • A concentração de composto a testar como possível inibidor do efluxo não deverá exceder 1/2 da CMI para a estirpe a ser testada, de modo a não afectar a viabilidade celular. A garantia de viabilidade é um requisito fundamental para a correcta análise do efeito de um determinado composto sobre a actividade de efluxo uma vez que não se pretende que ocorram variações na fluorescência detectada por variação dos efectivos celulares. Assim, os ensaios são efectuados em tampão fostato e durante não mais de 30 minutos (para evitar o eventual aumento de efectivos por multiplicação celular), utilizando concentrações dos compostos a testar que não ultrapassem 1/2 das respectivas CMIs (diminuição de efectivos por interferência na viabilidade); Após a determinação da viabilidade celular, observou-se que as concentrações dos compostos utilizadas não causaram diminuição significativa no crescimento (dados não apresentados). • O composto não deve interferir com o sinal de fluorescência no termociclador de tempo real; • Deverá ser garantida às celulas condições ideais de fornecimento de energia (glucose a 0,4%) em pelo menos um tubo com o composto em teste para garantir que, mesmo nas condições óptimas de fornecimento de energia, o efeito inibitório do composto sobre o efluxo é visível. Sem esta condição poder-se-ia verificar inibição do transporte por depleção natural da energia celular durante o ensaio. 56 Todos estes critérios foram respeitados através da inclusão, em cada ensaio realizado, e para todos os compostos e estirpes testados neste trabalho, de tubos controlo de acordo com o descrito no capítulo Material e Métodos, secção 2.2.4.1. Nenhum dos controlos apresentou fluorescência significativa nos ensaios efectuados. Como exemplo estão apresentados na Figura 21 os resultados obtidos para os controlos (i) a (iv) que, para facilitar a leitura e interpretação dos resultados dos restantes gráficos foram aqui analisados separadamente. As três estirpes em estudo foram expostas a concentrações crescentes de EtBr de 0.05 mg/L a 2,5 mg/L, com o objectivo de determinar a concentração de EtBr a partir da qual se começa a detectar acumulação nas células (dados não apresentados). A concentração imediatamente abaixo dessa será a concentração para a qual as células são capazes de manter um equilíbrio entre a entrada do EtBr por difusão passiva e a sua extrusão pelos sistemas de efluxo intrínsecos. Os resultados da detecção fluorimétrica da acumulação de concentrações crescentes de EtBr mostrou que para a estirpe AG100A, uma concentração de EtBr de 0.5 mg/L e para as estirpes AG100 e AG100TET uma concentração de EtBr de 1 mg/L, apresentam a mesma fluorescência residual/basal e são as concentrações que podem ser usadas como limite inferior de acumulação para as três estripes em estudo. Deste modo, as concentrações de EtBr utilizadas nos ensaios de acumulação não são iguais para as três estirpes, pois a estirpe AG100A tem o principal sistema de efluxo AcrAB-TolC inactivado, não tendo por isso capacidade para extrusar tão facilmente o EtBr (substrato do sistema AcrAB-TolC), o que se comprova pelo facto de a CMI do EtBr para a estirpe AG100A ser 30 vezes inferior relativamente à estirpe selvagem AG100, vide Tabela 7, o que faz com que a AG100A tenha maior susceptibilidade a este composto. Anteriormente já tinha sido estudado e concluído que em E. coli a concentração óptima de EtBr para estudar a acumulação é de 1 mg/L (67), podendo esta concentração variar conforme a estirpe com que se está a trabalhar, e que numa concentração inferior a 0.5 mg/L o sinal está abaixo da sensibilidade do instrumento (111). 57 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 EtBr (1µg/mL) + Glucose 0.4% 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Glucose 0.4% 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 EtBr (1µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 AG100TET 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 AG100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 AG100A Tempo (minutos) Fluorescência (unidades arbitrárias) Figura 21 - Monitorização da intensidade de fluorescência dos controlos a 37ºC, ao comprimento de onda de excitação de 530 nm bp e de emissão de 585 nm hp. 3.2.2. Influência de desacopladores na acumulação de EtBr Desacopladores são compostos que permitem rearranjos e translocações transientes dos protões existentes na superfície interna e externa da bicamada lipídica das membranas celulares, levando ao colapso do gradiente protónico transmenbranar (ΔμH+) necessário para assegurar a síntese de ATP e o transporte membranar. Consequentemente a sua presença activa as ATPases da membrana plasmática diminuindo a síntese de ATP e aumentando a sua utilização/hidrólise, pois as células são forçadas a hidrolisar ATP para rapidamente poderem restabelecer o potencial protónico e sobreviver. Utilizou-se os compostos 2,4-DNP e CCCP com o objectivo de estudar a sua influência na inibição do efluxo e consequente, acumulação de EtBr nas células de E. coli utilizadas neste estudo. Os resultados obtidos através de ensaios de acumulação, pelo método fluorimetrico semi-automático de monitorização do transporte de EtBr, para este compostos encontram-se nas Figuras 22 a 25. 58 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) EtB r Estirpe Estirpe + EtB r 2,4-DNP 2,4-DNP + EtBr Estirpe + 2,4-DNP Estirpe + 2,4-DNP + EtBr Estirpe + 2,4-DNP + EtBr + GLU 0.4% (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figura 22 - Influência do 2,4-dinitrofenol na acumulação de EtBr. Ensaio de acumulação de EtBr, durante um período de 30 minutos, a 37ºC e pH 7, para as estirpes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na presença e ausência de GLU, e na presença de 2,4-DNP a ½ da CMI (145mg/L para E. coli AG100 e AG100A, e 72,5mg/L para E.coli AG100TET). Concentração de EtBr para E. coli AG100 e AG100TET de 1 mg/L e concentração de EtBr de 0.5 mg/L para E. coli AG100A. Os vários controlos estão representados no gráfico. Como se constata na Figura 22B, ensaio de acumulação para a estirpe AG100, na presença de glucose (GLU) linha a vermelho, em comparação com o ensaio sem GLU linha laranja, a diferença de fluorescência entre as duas curvas reflecte a capacidade de efluxo de EtBr que as células têm na presença de GLU. O atingir de valores de fluorescência diferentes, reflecte o efluxo de EtBr na curva de acumulação. 2,4-Dinitrofenol 65 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) Estirpe + EtB r Estirpe + NaN 3 + EtB r Estirpe + NaN 3 + EtBr + GLU 0.4% Azida de Sódio Dos gráficos apresentados na Figura 26, podem-se destacar como resultados mais importantes os que se apresentam na Figura 27. (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figura 27 - Influência da azida de sódio na acumulação de EtBr. Ensaio de acumulação de EtBr, durante um período de 30 minutos, a 37ºC e pH 7, para as estirpes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na presença e ausência de GLU, e na presença de NaN3 a ½ da CMI. As concentrações de NaN3 e de EtBr são as mesmas da figura anterior. Para as três estirpes em estudo, na presença de azida de sódio, e comparando com o controlo da estirpe na presença apenas de EtBr, não se observa aumento significativo da acumulação de EtBr na presença de composto, sendo as curvas de acumulação praticamente sobrepostas ao longo do tempo. Para a estirpe AG100TET não se observa acumulação de EtBr, o que indica uma total incapacidade da actividade inibitória da azida de sódio sobre o sistema AcrAB-TolC sobreexpresso nesta estirpe. A azida de sódio foi descrita como sendo um inibidor preferencial das V-ATPases (H+- ATPases vacuolares típicas dos eucariotas), que uma vez inibidas não conseguem manter o potencial de membrana, dada a diminuição do transporte de protões para o meio extracelular, o que conduz à redução da FPM (48, 132, 141). Contudo, foi 66 igualmente reportado que a actividade enzimática da F1FO-ATPase é também inibida, em menor escala pela azida, bem como outras ATPases são parcialmente inibidas pela azida, tais como os transportadores ABC, a translocase SecA e a DNA topoisomerase IIα (13, 133). Não existindo um grande número de V-ATPases ao nível das membranas citoplasmáticas procariotas, estes resultados enquadram-se na hipótese de que, a FPM que garante o funcionamento das BE da família RND como a AcrAB-TolC, provém sobretudo do acoplamento com as F-ATPases membranares e as P-ATPases, compreendendo-se por isso que a azida de sódio não tenha uma acção inibitória significativa sobre a actividade do sistema AcrAB-TolC no efluxo de EtBr em E. coli. 67 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) EtB r Estirpe Estirpe + EtBr Na 3 VO 4 Na 3 VO 4 + EtB r Estirpe + Na 3 VO 4 Estirpe + Na 3 VO 4 + EtBr Estirpe + Na 3 VO 4 + EtBr + GLU 0.4% Ortovanadato de Sódio Nas Figuras 28 e 29 encontram-se os resultados obtidos para o composto ortovanadato de sódio. (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figura 28 - Influência do ortovanadato de sódio na acumulação de EtBr. Ensaio de acumulação de EtBr, durante um período de 30 minutos, a 37ºC e pH 7, para as estirpes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na presença e ausência de GLU, e na presença de Na3VO4 a ½ da CMI (2500mg/L para E. coli AG100 e AG100A, e 1250mg/L para E.coli AG100TET). Concentração de EtBr para E. coli AG100 e AG100TET de 1 mg/L e concentração de EtBr de 0.5 mg/L para E. coli AG100A. Os vários controlos estão representados no gráfico. 68 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) Estirpe + EtB r Estirpe + Na 3 VO 4 + EtB r Estirpe + Na 3 VO 4 + EtBr + GLU 0.4% Ortovanadato de Sódio Dos gráficos apresentados na Figura 28, podem-se destacar como resultados mais importantes os que se apresentam na Figura 29. (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figura 29 - Influência do ortovanadato de sódio na acumulação de EtBr. Ensaio de acumulação de EtBr, durante um período de 30 minutos, a 37ºC e pH 7, para as estirpes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na presença e ausência de GLU, e na presença de Na3VO4 a ½ da CMI. As concentrações de Na3VO4 e de EtBr são as mesmas da figura anterior. Para as três estirpes em estudo, comparativamente ao controlo da estirpe somente com EtBr, observa-se que na presença do composto ortovanadato de sódio, há uma forte acção inibitória do efluxo que promove uma grande acumulação de EtBr nas células. Para a concentração utilizada, verifica-se que a presença de GLU não altera significativamente a acumulação de EtBr pelas células, o que evidência o potencial inibitório deste composto. Devido ao facto de ser um composto com um resultado tão evidente a 1/2 da CMI, e sendo a CMI para este composto bastante elevada (5000 mg/L), tal significa que mesmo na presença de uma grande concentração de composto, a célula continua a multiplicarse normalmente, não sendo por isso um efeito inibitório letal. Tal evidencia que este composto é específico das ATPases não essenciais envolvidas no transporte de iões a 69 nível membranar. Por outro lado, e uma vez que relativamente à acumulação de EtBr na presença de Na3VO4, se observam os mesmos resultados para todas as estirpes, inclusive para a AG100A, que tem o sistema de efluxo AcrAB-TolC inactivado, logo a inibição não é específica do sistema AcrAB-TolC, mas sim de todas as BE que usam a energia proveniente da FPM acoplada às ATPases inibidas por este composto. Na mesma linha de raciocínio e para a estirpe AG100TET, que tem o principal sistema de efluxo AcrAB-TolC sobre-expresso, observa-se uma acumulação significativa de EtBr na presença de ortovanadato de sódio, comparando com o controlo sem composto, atingindo um máximo de acumulação ao fim de 15 minutos. Igualmente a GLU, como fonte de energia alternativa, tem pouca capacidade para alterar/superar o efeito do ortovanadato de sódio, pois a inibição com este composto é tão forte, que mesmo com GLU não se consegue superar esta inibição, uma vez que a ligação entre a produção de ATP ao nível das vias metabólicas e a sua utilização para gerar FPM para as BE encontra-se bloqueada. Sendo o ortovanadato de sódio um inibidor preferencial de Fe P-ATPases (13, 78, 133), verifica-se que, na presença deste composto, há inibição das BE dependentes da FPM sem ser afectado directamente o metabolismo celular o que o coloca como um excelente candidato a adjuvante de quimioterapia por inibição do efluxo de agentes quimioterapeuticos ao mesmo nível que outros compostos, também tidos como inibidores de ATPases de translocação iónica (P-ATPases), como as fenotiazinas (2, 68, 128). 70 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) EtB r Estirp e Estirpe + EtB r CPZ CPZ + EtB r Estirpe + CPZ Estirpe + CPZ + EtB r Estirpe + CPZ + EtBr + GLU 0.4% CPZ 3.2.4. Influência de compostos que inibem os canais de cálcio na acumulação de EtBr Como compostos inibidores dos canais de cálcio, e consequentemente inibidores das ATPases dependentes dos canais de cálcio, utilizaram-se os compostos clorpromazina (CPZ) e tioridazina (TZ), ambos do grupo das fenotiazinas. (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figura 30 - Influência da Clorpromazina na acumulação de EtBr. Ensaio de acumulação de EtBr, durante um período de 30 minutos, a 37ºC e pH 7, para as estirpes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na presença e ausência de GLU, e na presença de CPZ a ½ da CMI (30mg/L para E. coli AG100, 10mg/L para E. coli AG100A, e 70mg/L para E.coli AG100TET). Concentração de EtBr para E. coli AG100 e AG100TET de 1 mg/L e concentração de EtBr de 0.5 mg/L para E. coli AG100A. Os vários controlos estão representados no gráfico. 71 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) Estirpe + EtBr Estirpe + CPZ + EtB r Estirpe + CPZ + EtBr + GLU 0.4% CPZ Dos gráficos apresentados na Figura 30, podem-se destacar como resultados mais importantes os que se apresentam na Figura 31. (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figura 31 - Influência da Clorpromazina na acumulação de EtBr. Ensaio de acumulação de EtBr, durante um período de 30 minutos, a 37ºC, e pH 7 para as estirpes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na presença e ausência de GLU, e na presença de CPZ a ½ da CMI. As concentrações de CPZ e de EtBr são as mesmas da figura anterior. Para as três estirpes em estudo, e comparativamente ao controlo da estirpe somente com EtBr, observa-se acumulação significativa de EtBr na presença de CPZ, atingindo-se um valor máximo aos 30 minutos de acumulação para a estirpe selvagem. 72 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) EtB r Estirpe Estirpe + EtB r TZ TZ + EtB r Estirpe + TZ Estirpe + TZ + EtB r Estirpe + TZ + EtBr + GLU 0.4% TZ Nas Figuras 32 e 33 encontram-se os resultados obtidos com a tioridazina (TZ). (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figura 32 - Influência da Tioridazina na acumulação de EtBr. Ensaio de acumulação de EtBr, durante um período de 30 minutos, a 37ºC e pH 7, para as estirpes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na presença e ausência de GLU, e na presença de TZ a ½ da CMI (50mg/L para E. coli AG100, 12,5mg/L para E. coli AG100A, e 100mg/L para E.coli AG100TET). Concentração de EtBr para E. coli AG100 e AG100TET de 1 mg/L e concentração de EtBr de 0.5 mg/L para E. coli AG100A. Os vários controlos estão representados no gráfico. 73 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 102030 Fluorescência (unidades arbitrárias) Tempo (minutos) Estirpe + EtB r Estirpe + TZ + EtB r Estirpe + TZ + EtBr + GLU 0.4% TZ Dos gráficos apresentados na Figura 32, podem-se destacar como resultados mais importantes os que se apresentam na Figura 33. (A) AG100A (B) AG100 (C) AG100TET Figura 33 - Influência da Tioridazina na acumulação de EtBr. Ensaio de acumulação de EtBr, durante um período de 30 minutos, a 37ºC e pH 7, para as estirpes E. coli (A) AG100A, (B) AG100 e (C) AG100TET, na presença e ausência de GLU, e na presença de TZ a ½ da CMI. As concentrações de TZ e de EtBr são as mesmas da figura anterior. Na presença do composto TZ, as estirpes AG100 e AG100TET na presença e na ausência de GLU, acumulam EtBr até um valor máximo de fluorescência ao fim de 10 minutos, de 70 e 80 unidades relativas de fluorescência, respectivamente, e a partir desse momento as células começam a efluxar EtBr, superando o efeito inibitório da TZ. Com base nestes resultados, há que considerar a hipótese de o sistema AcrAB-TolC ter vias alternativas, para superar a inibição provocada pela TZ pois, para a estirpe AG100A, não se observa esse fenómeno, observando-se apenas acumulação de EtBr nas mesmas condições experimentais. Para ambas as fenotiazinas testadas, a presença de GLU não alterou a acumulação de EtBr em qualquer uma das estirpes. Os inibidores dos canais de cálcio não vêm o seu efeito afectado pela GLU, tal como os restantes inibidores de ATPases testados. 74 3.3. Influência de diversos inibidores na acumulação de EtBr a pH 5, pH 7 e pH 8 Do conjunto dos resultados anteriores, tornou-se evidente a dependência do efluxo de EtBr em E.coli da existência e manutenção da FPM, sendo que, os compostos que melhores efeitos evidenciaram, foram aqueles que promovem a dissipação do potencial protónico (desacopladores) e os inibidores das F e P-ATPases bacterianas (ortovanadato de sódio e fenotiazinas), que garantem a manutenção da FPM. Os efeitos anteriormente postos em evidência foram observados a pH fisiológico (pH 7). Se as hipóteses anteriormente avançadas forem válidas, então a avaliação do efeito destes mesmos compostos na acumulação de EtBr também a pH 5 e a pH 8, na presença e ausência de GLU, irá colocar em evidência, a dependência do transporte de EtBr em E. coli do gradiente electroquímico transmembranar, com os seus dois componentes: um gradiente de protões que promove uma diferença de pH (ΔpH) e uma diferença na carga iónica ou potencial de membrana (Δψ) devido à distribuição desigual de cargas, os dois componentes da FPM (15). Ao testarmos a acumulação de EtBr a diferentes pH, podemos observar diferentes resultados conforme a quantidade de protões que estão disponíveis no meio extracelular, pois a célula bacteriana utiliza os protões como antiporte para as BE, as ATPases e a própria FPM, esperando-se que a pH baixo (elevada concentração de hidrogeniões no meio extracelular) o efeito dos inibidores anteriormente identificados seja diminuído quando em comparação com os resultados a pH 7. Ao invés, espera-se uma exacerbação dos efeitos inibitórios a pH alto (baixa concentração de hidrogeniões no meio extracelular). Para este efeito seleccionou-se o desacoplador, o inibidor das ATPases membranares e o inibidor dos canais de cálcio que melhores resultados inibitórios apresentaram nas secções anteriores, nomeadamente o CCCP, o Na3VO4 e o CPZ. 81 4. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES Tal como anteriormente referido, neste trabalho procurou-se compreender a origem da energia utilizada pelas BE (bombas de efluxo) de E. coli, em particular, o seu principal sistema de efluxo, AcrAB-TolC, interferindo no fornecimento desta energia e observando como isso pode afectar a actividade de efluxo. Depois de seleccionados os compostos que, na literatura, são apontados como possíveis inibidores da actividade de efluxo em E. coli, tais como desacopladores (CCCP e 2,4-DNP), inibidores das ATPases membranares (NaN3 e Na3VO4) e inibidores dos canais de cálcio (TZ e CPZ), foi utilizado um método fluorimétrico semi-automático que detecta em tempo real, a acumulação e efluxo do brometo de etídeo (EtBr), com o objectivo de avaliar a sua actividade inibitória e inferir da sua acção sobre a bioenergética do processo de transporte de EtBr em E. coli. Iniciou-se o estudo pela determinação da CMI e CMB. Tal como observado na Tabela 7, a estirpe AG100A, apresenta susceptibilidade ao EtBr 30 vezes superior à estirpe AG100. O mesmo acontece para o composto TZ, apresentando um valor de CMI 4 vezes inferior à estirpe AG100. No que respeita ao composto CPZ, este apresenta um valor de CMI 3 vezes inferior. Podendo-se inferir que quando o sistema AcrAB-TolC está inactivado, outros sistemas de efluxo substituem esta actividade, embora menos eficientemente, como se demonstra pelas CMIs menores dos compostos para a estirpe AG100A. No caso dos compostos CCCP, 2,4-DNP, NaN3 e Na3VO4, o valor de CMI para a estirpe AG100 e AG100A é o mesmo. Sabe-se que o genoma de E. coli tem várias BE que são homólogas ao AcrB (86), ou seja, mesmo tendo o sistema AcrAB-TolC inactivado, alguns compostos podem também ser extrusados por outras bombas homólogas ao AcrAB-TolC ou por outro sistema de efluxo que use directamente a energia da hidrólise de ATP, constituindo os sistemas de transporte primários como os sistemas ABC. 82 Do estudo efectuado neste trabalho, sobre o transporte de EtBr por fluorimetria em tempo real em E. coli, podemos concluir que: • O protocolo de fluorimetria no Rotor-Gene 3000TM, que constitui um método semi-automático, detecta acumulação e efluxo de EtBr em tempo-real, e no qual podem ser alteradas condições como a temperatura e o pH, se mostrou adequado aos objectivos e hipóteses colocadas desde que se cumpram os requisitos e condições seguintes: i) a concentração de EtBr livre no ambiente extracelular em cada ensaio, deverá permitir o estabelecimento do equilíbrio entre a entrada por difusão passiva do EtBr e a sua saída por efluxo activo, não afectando de alguma forma a viabilidade celular, ii) a concentração de composto a testar, como possível inibidor do efluxo, não deverá exceder 1/2 da CMI para a estirpe a ser testada, de modo a não afectar a viabilidade celular; iii) o composto ou mesmo o solvente utilizado, não devem de interferir com o sinal de fluorescência no termociclador de tempo real, iv) deverão ser dadas às células condições ideais de fornecimento de energia (glucose a 0,4%) em pelo menos um tubo com o composto em teste para garantir que, mesmo nas condições óptimas de fornecimento de energia, o efeito inibitório do composto sobre o efluxo é visível; • A acumulação de EtBr aumenta na presença dos compostos inibidores de bombas de efluxo (IBEs) seleccionados para este trabalho; • O sistema AcrAB-TolC é altamente susceptível à dissipação da FPM promovida pelos desacopladores 2,4-DNP e CCCP, ressaltando a importância que a manutenção da FPM tem para a eficiente actividade do sistema AcrAB-TolC e consequentemente para o efluxo de EtBr em E. coli; • Quando se inibe directamente a acção das ATPases, que garantem a FPM, por recurso a inibidores de V, F e P-ATPases membranares, como o NaN3 (VATPases) e o Na3VO4 (F e P-ATPases), verifica-se um substancial aumento da acumulação de EtBr nas células, pois estas não conseguem manter o potencial de membrana dada a diminuição do transporte de protões para o meio extracelular; • Na presença de inibidores específicos das P-ATPases, como as fenotiazinas CPZ e TZ, ocorre significativa inibição do efluxo de EtBr nas estirpes AG100 e AG100TET na presença e na ausência de glucose (GLU). Os inibidores dos canais 83 de cálcio não vêm o seu efeito afectado pela GLU tal como os restantes inibidores de ATPases testados; • De todos os compostos testados, o Na3VO4, foi o que revelou um maior efeito inibitório, não sendo um efeito inibitório letal. Tal observação evidência que este composto é específico das ATPases não essenciais envolvidas no transporte de iões a nível membranar, não sendo a inibição específica do sistema AcrABTolC, mas sim de todas as BE que usam a energia proveniente da FPM acoplada às ATPases inibidas por este composto (F e P-ATPases) (13, 78, 133). A GLU, como fonte de energia alternativa, tem pouca capacidade para alterar/superar o efeito do Na3VO4, pois a ligação entre a produção de ATP ao nível das vias metabólicas e a sua utilização para gerar FPM para as BE se encontra bloqueada. O Na3VO4 será então um excelente candidato, para futuros estudos, como adjuvante de quimioterapia por inibição do efluxo de agentes quimioterapeuticos; • A acumulação e efluxo de EtBr em E. coli são dependentes da energia disponível na célula, sendo o seu efluxo afectado pelo pH e pela disponibilidade em GLU no meio extracelular; • A GLU, como fonte de energia e a pH fisiológico (pH 7) ou a pH 8, estimula a produção/manutenção da FPM pelo acoplamento com a produção protónica pelas ATPases, o que contraria a acção inibitória do 2,4-DNP e do CCCP por dissipação e desacoplamento do potencial protónico, sobretudo na estirpe AG100TET onde este efeito é mais notório dado o elevado número de cópias do sistema AcrAB-TolC que estão a operar na dependência da FPM; • Num ambiente rico em protões (pH 5) o efeito de dissipação do potencial protónico causado pelo CCCP, sobre a acumulação de EtBr é rapidamente suprimido, ou seja, a pH 5 a actividade do desacoplamento do potencial protónico provocada pelo CCCP, é rapidamente suprimida e a presença ou ausência de GLU não tem influência sobre a manutenção da actividade de efluxo de EtBr em E. coli. Num ambiente com escassez em protões (pH 8) o efeito de dissipação do potencial protónico causado pelo CCCP, sobre a acumulação de EtBr é lentamente suprimido na ausência de GLU, o que claramente promove a acumulação de EtBr. Uma vez fornecida GLU ao meio, a glicólise é activada 84 bem como as ATPases, as quais vão gerar uma maior disponibilidade de protões, para o restabelecimento do potencial protónico, que garante o retomar do efluxo de EtBr pelo sistema AcrAB-TolC; • As outras BE que substituem o sistema AcrAB-TolC no efluxo de EtBr, na estirpe AG100A não recorrem à FPM para actuar, não sendo afectadas pela dissipação causada pela presença do desacoplador CCCP, pela escassez em protões (pH 8), ou pela presença ou ausência de GLU, a qualquer um dos três pH testados, na ausência de IBEs. São provavelmente BE dependentes da energia gerada directamente pela hidrólise do ATP, pertencentes ao sistema ABC, pois apenas quando estão presentes no meio IBEs específicos para estas bombas é possível inibir o efluxo de EtBr pela estirpe AG100A; • Num ambiente rico em protões (pH 5), o efeito de inibição das ATPases membranares causado pelo Na3VO4, que conduz a um aumento da acumulação de EtBr, é grandemente diminuído e a presença de GLU tem grande influência no retomar do efluxo de EtBr pelo sistema AcrAB-TolC e pelos sistemas que o substituem na estirpe AG100A. De notar que na presença de sobreexpressão do sistema AcrAB-TolC e num ambiente rico em protões, o efeito do inibidor Na3VO4 é completamente anulado, realçando a dependência do sistema AcrABTolC da FPM. Num ambiente com escassez em protões (pH 8), o efeito de inibição das ATPases membranares causado pelo Na3VO4 é aumentado, não sendo suprimido ou diminuído mesmo na presença de GLU, mesmo na estirpe com sobreexpressão de AcrAB-TolC (AG100TET). No caso da estirpe AG100A, a inactivação das BE do tipo ABC pelo Na3VO4 é directa e significativa, uma vez que estas bombas dependem directamente da energia provida por estas ATPases membranares para poderem operar; • Num ambiente rico em protões (pH 5), o efeito de inibição das P-ATPases dependentes dos canais de cálcio, potássio e sódio, causado pelo CPZ, é muito reduzido uma vez que a inibição das P-ATPases não afecta a FPM para as bombas RND (tal como o AcrAB-TolC) operarem, ou as F-ATPases que garantem o funcionamento dos sistemas ABC da estirpe AG100A. A presença ou ausência de GLU não tem pois qualquer influência na manutenção do efluxo de EtBr. Num ambiente com escassez em protões (pH 8), o efeito de inibição 85 das P-ATPases causado pelo CPZ conduz a um aumento da acumulação de EtBr, não sendo suprimido ou diminuído mesmo na presença de GLU. Em resumo, foi possível optimizar a aplicação do método fluorimétrico semiautomático, para monitorização do transporte de EtBr através da parede de E. coli, utilizando a fluorimetria em tempo real no Rotor-Gene TM 3000, através da definição dos parâmetros e condições experimentais essenciais para a obtenção de resultados significativos em termos da bioenergética deste efluxo bacteriano. Os resultados mostraram que, o sistema de efluxo intrínseco de EtBr em E. coli é maioritariamente efectuado pelo sistema AcrAB-TolC, o qual é controlado directamente pela energia proveniente da FPM transmembranar, a qual é maioritariamente mantida pelas FATPases apoiadas secundariamente pelas P-ATPases bacterianas. Todo este sistema está dependente do catabolismo da GLU e da concentração de protões no meio (pH extracelular). Quando o sistema AcrAB-TolC está inactivo, outras BE encarregam-se de efluxar o EtBr, tendo os resultados apontado que estas deverão ser BE dependentes de ATPases, ou seja, do tipo ABC. De todos os compostos testados, o mais eficiente na inibição do transporte de EtBr em E. coli foi o Na3VO4, ao inibir directamente a fonte primordial de protões para a FPM bacteriana, as F-ATPases. O segundo mais eficiente foi a fenotiazina CPZ que inibe preferencialmente as P-ATPases bacterianas, as quais actuam como suporte secundário para a manutenção da FPM, ao translocarem catiões por protões. Contribuiu-se assim para um melhor conhecimento da bioenergética do efluxo em E. coli. Uma vez que a resistência intrínseca das estirpes de E. coli é afectada pelos IBEs testados tais como o Na3VO4, CPZ e TZ, estes efeitos podem vir a ser importantes na pesquisa e desenvolvimento de novas e mais eficazes terapias antimicrobianas. 86 4.1. Perspectivas Futuras Sendo a resistência bacteriana aos antibióticos um aspecto do conhecimento actualmente em grande expansão, a acção das bombas de efluxo (BE), e a sua interligação com outros mecanismos de regulação do transporte celular, como o da síntese de porinas, é hoje uma realidade que se terá de ter em conta quando se procura explicar o fenómeno conhecido de médicos e microbiologistas de que à medida que se acentua o uso de um antibiótico, maior a rapidez no aparecimento de estirpes resistentes. Os investigadores são unânimes em afirmar que o antibiótico é um factor de selecção que privilegia as bactérias que possuem determinantes genéticos para a resistência, seja as que adquiriram genes de resistência ou uma mutação de resistência, seja por aumento dos fenómenos associados de resistência dita fisiológica ou aumento da expressão e da actividade das BE. Certamente que o desenvolvimento de inibidores específicos de BE, nomeadamente aqueles que interfiram nos requisitos energéticos específicos deste efluxo, facilitará grandemente a quimioterapeutica antibacteriana, podendo tornar bactérias resistentes, em susceptíveis a doses terapêuticas normais, e como tal permitir um reaproveitamento do actual arsenal quimioterapeutico e assim contribuir para o combate ao flagelo da resistência aos antibióticos. A tecnologia e metodologia aqui aplicada e optimizada, tendo em conta os resultados obtidos, poderá ser uma enorme mais valia na determinação em tempo real de novos inibidores e das melhores condições ambientais, para que se possa prevenir e combater a multirresistência por BE. 87 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Amaral, L., M. Viveiros e Molnar, J. 2004. Antimicrobial activity of phenothiazines. In Vivo. 18(6): 725-732. 2. Amaral, L., M. Martins, e M. Viveiros. 2007. Enhanced killing of intracellular multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis by compounds that affect the activity of efflux pumps. J. Antimicrob. Chemother. 59(6): 1237–1246. 3. Barbosa, T. M., S. B. Levy. 2000. The impact of antibiotic use on resistance development and persistence. Drug Resist. Updat. 3(5): 303–311. 4. Benabe, J. E., L. A. Echegoyen, B. Pastrana, e M. Martinez-Maldonado. 1987. Mechanism of inhibition of glycolysis by vanadate. J. Biol. Chem. 262(20): 95559560. 5. Berg, H. C. 2004. 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