Estudo da Glicoproteína-P em Linfócitos T Humanos e em Plasma de Ratos Charles Rivers usando a TX5 como Potencial Indutor da sua Expressão e Actividade

Estudo da Glicoproteína-P em linfócitos T humanos e em plasma de ratos Charles Rivers usando a TX5 como potencial indutor da sua expressão e actividade Tese do 2º ciclo do Mestrado em Toxicologia Analítica, Clínica e Forense Trabalho realizado sob a orientação do Professor Doutor Fernando Remião e coorientação da Doutora Filipa Ponte e da Doutora Renata Silva Ana Filipa Pereira Ferreira Setembro 2014 2014|Ana Filipa Ferreira 2014|Ana Filipa Ferreira iii É autorizada a reprodução integral desta dissertação apenas para efeitos de investigação, mediante declaração escrita do interessado, que tal se compromete. 2014| Ana Filipa Ferreira iv A dissertação apresentada visa a obtenção do grau de mestre tendo sido escrita segundo o antigo acordo ortográfico. 2014|Ana Filipa Ferreira v “Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes”. Marthin Luther King 2014| Ana Filipa Ferreira vi 2014|Ana Filipa Ferreira vii AGRADECIMENTOS A parte experimental deste trabalho experimental foi realizada no laboratório de toxicologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto. A conclusão do mesmo trabalho, só foi possível, graças ao apoio e acompanhamento que tive ao longo desta etapa. Quero agradecer a todos por tudo. • À Professora Doutora Maria de Lourdes Bastos, pela magnífica orientação de todo o curso de Mestrado em Toxicologia Analítica, Clínica e Forense; • Ao Professor Doutor Fernando Remião, orientador do trabalho realizado no âmbito desta tese, pela infinita preocupação e incentivo ao longo desta fase; • Em especial à Doutora Ana Filipa Ponte pelo seu grande apoio, entusiasmo e paciência. Agradeço todo o seu esforço e dedicação em ensinar tudo o que aprendi sobre as técnicas de isolamento de linfócitos, citometria de fluxo e HPLC. Agradeço também pela ajuda na parte escrita desta tese. «Se não fossem as tuas mãos segurarem as minhas nos momentos mais difíceis, não teria chegado aqui». Desejo todo o sucesso dentro da área da investigação e desejo as maiores felicidades na sua vida pessoal; • À Doutora Renata Silva, pelo enorme apoio em todas as fases deste trabalho. Mesmo com o «pequenote» a dar pontapés, foi incrível a sua dedicação Muito obrigado pela ajuda, pela inteira disponibilidade e incentivo em todos os momentos, do fundo do coração pois sei que nem sempre foi fácil! Felicidades para a novamente futura mãe. Desejo-lhe muito sucesso; • À mestre Mariline Monteiro, mesmo estando longe, foi quem me ensinou a dar os primeiros passos no Laboratório de toxicologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto; • Ao Doutor Daniel Silva por toda a ajuda prestada no laboratório de toxicologia. Obrigado pelo grande apoio. Espero que o mundo seja justo e traga tudo de bom para a vida profissional e pessoal; • À Doutora Teresa Baltazar pela sua disponibilidade em ajudar em parte do meu trabalho experimental; • Ao Professor Doutor Joaquim Monteiro pela sua dedicação aos alunos e ex alunos. Obrigado pelos seus conselhos; • À Dr.ª Bárbara e ao laboratório de análises clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto. Sempre muito prestáveis, agradeço por toda a disponibilidade em realizar colheitas das amostras de sangue dos voluntários; • Ao laboratório de Bioquímica e de Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto pela ajuda prestada. Agradeço em especial ao Doutor. João; 2014| Ana Filipa Ferreira viii • Ao Instituto Nacional de Engenharia Biomédica (INEB) por todo o apoio e ajuda, principalmente à Doutora Andreia e Doutora Inês; • Agradeço à Técnica do Laboratório de Toxicologia, à Cátia, pela paciência, apoio em todo o meu trabalho, especialmente com o «nosso» HPLC! Obrigado pela disponibilidade durante todo o meu percurso neste laboratório; • Obrigado a todos os amigos do mestrado, pelo apoio e preocupação durante esta fase, em especial à Mariana, Sofia, Armanda, Maria João, Débora e à Margarida. Um dia ainda vamos fazer aquela viagem…; • Agradeço também aos restantes colegas de trabalho e estudantes de Doutoramento e Pós Doutoramento por me terem ajudado a ultrapassar as dificuldades em especial à Márcia, Diana e Maria João; • A todo o pessoal do departamento de Toxicologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, à Srª Engª Maria Elisa Soares, Doutora Helena Carmo, Doutora Sónia Fraga, Doutora Paula Guedes, Doutora Vera Costa e Doutor João Capela e a todos os restantes colaboradores deste mestrado; • Um sincero obrigado a todos os dadores de sangue pois sem eles o meu trabalho não seria possível; • Agradeço do fundo do meu coração ao meu irmão, avó e aos restantes familiares, pelo incentivo e carinho. Sem eles seria mais difícil chegar até aqui; • Obrigado Helena, João, Marlene, Joana, Dina, Sara Félix, Inês Ferreira, Catarina, Guilherme e Juliana, que sempre me fizeram sorrir nos melhores e piores momentos. Um dia vou compensar as minhas ausências; • Agradeço a todos os membros da Banda Marcial de Arnoso que acompanharam-me desde sempre e nesta fase não foi diferente. Obrigado pela vossa compreensão ao longo destes anos; • Por fim, agradeço todo o carinho, apoio, paciência e dedicação ao José Mário que nunca me deixa desistir. Obrigado! Um sincero obrigado a todos! 2014|Ana Filipa Ferreira ix RESUMO A glicoproteína-P (P-gp) é uma proteína de transporte transmembranar com 170 kDa pertencente à família adenosina trifosfato binding cassette (ABC). Esta proteína de transporte foi inicialmente detectada em 1976 por Ling et al. (1976) em células de ovário de hamster chinês resistentes à colchicina e foi caracterizada pela expressão do gene de resistência a multi-fármacos 1 (MDR1) humano. Inicialmente a sua sobre expressão foi associada a fenómenos de resistência em células cancerígenas, uma vez que impedia a entrada dos fármacos para as células devido ao seu mecanismo de efluxo. Actualmente, sabe-se que está presente tanto em células cancerígenas como células normais. Funciona como uma barreira fisiológica, responsável pelo efluxo de inúmeros compostos, exportando xenobióticos de células de intestino, fígado, rins, ductos pancreáticos e biliares, túbulos proximais renais, placenta, testículos, barreira hematoencefálica (BHE) bem como de linfócitos. Em conclusão pode-se afirmar que a P-gp desempenha um papel muito importante na protecção do organismo evitando a acumulação intracelular de xenobióticos. Portanto, estudos de indutores/activadores desta bomba podem ser úteis para combater fenómenos de toxicidade. Este trabalho teve como objectivo o estudo de um indutor/activador do grupo das tioxantonas (TXs) denominado por TX5. Foi possível verificar que este derivado é capaz de aumentar a actividade e induzir a expressão da proteína de transporte e, desta forma, poderá vir a ser um antídoto utilizado em situações de intoxicações por substratos da Pgp. No presente trabalho foi possível: 1. Estudar o mecanismo de indução e activação da P-gp em linfócitos T, após exposição à TX5 nas concentrações de 20 µM e 80 µM por um período de 24 horas, em estufa a 37ºC e 5% CO2: 1.1 A expressão e a actividade da P-gp foram avaliadas por citometria de fluxo, usando um anticorpo monoclonal específico anti-P-gp, o anticorpo UIC2 conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC), e a rodamina 123 (RHO 123) (5 µM) como substrato fluorescente desta bomba de efluxo, respectivamente; 2014| Ana Filipa Ferreira xvi 3.2.4 Ensaio de viabilidade com MTT ............................................................................. 47 3.2.5 Análise estatística ................................................................................................... 48 3.2.6 Estudo da expressão e actividade da glicoproteína-P ............................................ 49 3.2.7 Estudo da expressão ............................................................................................... 50 3.2.8 Estudo actividade ................................................................................................... 50 3.2.9 Estudo da activação ............................................................................................... 51 3.2.10 Determinação da fluorescência por citometria de fluxo ...................................... 52 3.2.11 Análise estatística ................................................................................................. 54 3.3 Estudo in vivo com ratos Charles River ................................................................... 54 3.3.1 Análise instrumental e estatística .......................................................................... 56 3.4 Validação do método de análise e quantificação de TX5 em HPLC ......................... 57 3.4.1 Preparação dos padrões de TX5 ............................................................................. 57 3.4.2 Condições instrumentais e cromatográficas .......................................................... 58 3.4.3 Validação do método .............................................................................................. 58 3.4.4 Análise estatística................................................................................................... 61 4 ESTUDO DA EXPRESSÃO E ACTIVIDADE DA GLICOPROTEÍNA-P ...................... 65 4.1 Ensaios in vitro com linfócitos T ............................................................................... 65 4.1.1 Estudo da viabilidade celular com o MTT .............................................................. 65 4.1.2 Adaptação das técnicas de determinação da expressão e actividade da glicoproteína-P – modificação do método ................................................................................................ 67 4.1.3 Estudo da expressão e actividade por citometria de fluxo ..................................... 68 4.1.4 Expressão da glicoproteína-P em células CD45+ e CD3+ expostas à TX5 durante 24 h 70 4.1.5 Expressão da P-gp em células em P1 expostas ao TX5 durante 24 h ...................... 71 4.1.6 Actividade da glicoproteína-P em células CD45+ e CD3 +expostas ao TX5 durante 24 h 73 4.1.7 Actividade da glicoproteína-P em células em P1 expostas ao TX5 durante 24 h ... 75 4.1.8 Activação da glicoproteína-P em células CD45+ e CD3 +expostas ao TX5 durante os 60 minutos na fase de efluxo da Rhodamina 123 ........................................................... 76 2014|Ana Filipa Ferreira xvii 4.1.9 Activação da glicoproteína-P em células em P1 expostas ao TX5 durante os 60 minutos na fase de efluxo da Rhodamina 123 ................................................................ 78 4.2 Estudo in vivo com ratos Charles River. Determinação da actividade da glicoproteínaP em após administração do indutor TX5 ...................................................................... 81 4.3 Validação do método de quantificação em HPLC .................................................... 83 4.3.1 Linearidade ............................................................................................................ 83 4.3.2 Precisão inter-dia e exactidão do método .............................................................. 86 4.3.3 Precisão intra-dia do equipamento ....................................................................... 88 4.3.4 Precisão intra-dia do método .............................................................................. 89 4.3.5 Estabilidade do TX5 após processamento da amostra .......................................... 90 4.3.6 Recuperação da TX 5 ............................................................................................. 92 4.3.7 Limite de detecção e limite de quantificação ......................................................... 94 5. CONCLUSÕES ............................................................................................................ 99 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 103 2014| Ana Filipa Ferreira xviii 2014|Ana Filipa Ferreira xix ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA 1:REPRESENTAÇÃO DE UM MODELO PROPOSTO DE TRANSPORTE ATRAVÉS DA GLICOPROTEÍNA-P. (A) O SUBSTRATO (VERMELHO) DIVIDE-SE NA BICAMADA APICAL DAS CÉLULAS ENTRANDO PARA O FOLHETO INTERNO POR LIGAÇÃO À PROTEÍNA QUE SE ENCONTRA LIVRE (TMD). OS RESÍDUOS NO LOCAL DE OS RESÍDUOS NO LOCAL DE LIGAÇÃO (ESFERAS AZUIS) INTERAGEM COM O SUBSTRATO. (B) O ATP (AMARELO) LIGA-SE AO DOMÍNIO DE LIGAÇÃO AO NUCLEÓTIDO (NBD) CAUSANDO ALTERAÇÃO DE CONFORMAÇÃO E O SUBSTRATO PASSA PARA O LOCAL EXTRACELULAR. FIGURA ADAPTADA (ALLER, YU ET AL. 2009). ............................................................................................................................. 4 FIGURA 2: REPRESENTAÇÃO DA ESTRUTURA TÍPICA DA GLICOPROTEÍNA-P PRESENTE NA BICAMADA LIPÍDICA. A PROTEÍNA CONTÉM DOIS DOMÍNIOS TRANSMEMBRANARES (TMD) E DOIS DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO A NUCLEÓTIDOS (NBD). FIGURA ADAPTADA (CHOUDHURI AND KLAASSEN 2006). ............................................................................................................ 6 FIGURA 3: O DOMÍNIO NBD DOS TRANSPORTADORES ABC CONTEM DOIS MOTIVOS: WALKER A E WALKER B. ESTES SÃO CONSERVADOS EM TODOS OS TRANSPORTADORES DESTA FAMÍLIA. CADA TRANSPORTADOR TEM A SUA PRÓPRIA ASSINATURA, MOTIVO C, ONDE ESTÁ A SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS QUE O CARACTERIZA. FIGURA ADAPTADA (CHOUDHURI AND KLAASSEN 2006). ............................................................................................................ 7 FIGURA 4: PROTEÍNA PERMEÁVEL (P-GP) EXPRESSA NA MEMBRANA APICAL NAS CÉLULAS EPITELIAIS INTESTINAIS, NA MEMBRANA DOS CANALÍCULOS DOS HEPATÓCITOS HUMANOS E NA MEMBRANA DOS TÚBULOS PROXIMAIS RENAIS A, B E C RESPECTIVAMENTE. FIGURA ADAPTADA (WESSLER, GRIP ET AL. 2013). ........................................................................ 8 FIGURA 5: LOCALIZAÇÃO DA GLICOPROTEÍNA-P NA MEMBRANA APICAL EM CÉLULAS ENDOTELIAIS DA BARREIRA HEMATOENCEFÁLICA. ESTA LOCALIZAÇÃO PERMITE O TRANSPORTE DE XENOBIÓTICOS PARA O SANGUE. FIGURA ADAPTADA (RAO, DAHLHEIMER ET AL. 1999) ..................................................................................................................... 9 FIGURA 6 REPRESENTAÇÃO DOS MODELOS PROPOSTOS DE TRANSPORTE PELA GLICOPROTEÍNAP. A MODELO CLÁSSICO OU PORO. DE ACORDO COM ESTE MODELO, A P-GP ENCONTRA O XENOBIÓTICO NO FOLHETO DA BICAMADA LIPÍDICA E EXPULSA-OS PARA FORA DO FOLHETO CONTRA O GRADIENTE DE CONCENTRAÇÃO. ESTE MODELO É BASEADO NA IDEIA DE QUE O SUBSTRATO TEM ACESSO AO LOCAL DE LIGAÇÃO DE TMD PELA BICAMADA LIPÍDICA DEPOIS DE INTERAGIR COM A MESMA MEMBRANA. B MODELO DE ASPIRAÇÃO HIDROFÓBICA (HVC) QUE PERMITE À P-GP EXPULSAR OS SEUS SUBSTRATOS. DE ACORDO COM ESTE MODELO, OS SUBSTRATOS PODEM SER EXPULSOS TANTO DO ESPAÇO INTRACELULAR COMO DE DENTRO DA BICAMADA LIPÍDICA DA MEMBRANA PLASMÁTICA, ATRAVÉS DO RECONHECIMENTO DESTES COMO XENOBIÓTICOS. C MODELO FLIPPASE COM MOVIMENTO FLIP-FLOP COM A 2014| Ana Filipa Ferreira xx BICAMADA LIPÍDICA. A MUDANÇA DE CONFORMAÇÃO FAZ COM QUE A ENTRADA DO SUBSTRATO NÃO OCORRA. FIGURA ADAPTADA (CHOUDHURI AND KLAASSEN 2006). ........ 12 FIGURA 7: REPRESENTAÇÃO DO MECANISMO DE INTERACÇÃO ENTRE A GLICOPROTEÍNA-P E O CITOCROMO P450 (CYP3A4) NOS ENTERÓCITOS. FIGURA ADAPTADA DE FROMET AL. (2003). .......................................................................................................................... 17 FIGURA 8: MECANISMO DE INIBIÇÃO DA GLICOPROTEÍNA-P POR UM INIBIDOR COMPETITIVO (ESQUERDA) E POR UM NÃO COMPETITIVO (DIREITA). FIGURA ADAPTADA (AMIN 2013) ... 23 FIGURA 9: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UM DOS MECANISMOS RESPONSÁVEIS PELO AUMENTO DE EXPRESSÃO DA GLICOPROTEÍNA-P ATRAVÉS DE FÁRMACOS ANTICANCERÍGENOS NA MEMBRANA PLASMÁTICA. ESTÍMULO DIRECTO DA TRANSCRIÇÃO DA MARN DE P-GP POR ALTERAÇÃO DA TRANSLOCAÇÃO NUCLEAR DE VÁRIOS FACTORES TRANSCRIPCIONAIS. OCORRE MODULAÇÃO DE PROCESSO EPIGENÉTICOS ONDE SE INCLUEM A METILAÇÃO DO ADN E A ACETILAÇÃO DAS HISTONAS, QUE AFECTAM A ACESSIBILIDADE DE TODOS OS FACTORES TRANSCRIPCIONAIS, PROMOVENDO A REGIÃO DETERMINANTE DE SÍNTESE DE MARN. CONSEQUENTEMENTE, ESTES FÁRMACOS TAMBÉM AFECTAM A POSTTRANSCRIÇÃO ESPECIALMENTEDE UMA PROTEÍNA CUJA FUNÇÃO É FAVORECER A LIGAÇÃO ENTRE AS MEMBRANAS PLASMÁTICAS E OS FILAMENTOS DE ACTINA,, COMO É O CASO DA PROTEÍNA EZRINA/RADIXINA/MOESINA (ERM). FIGURA ADAPTADA (KOBORI, HARADA ET AL. 2014). ..................................................................................................................... 28 FIGURA 10. : ESQUEMA REPRESENTATIVO DO MECANISMO PROPOSTO PARA O EFLUXO DO PARAQUATO (PQ) PELA GLICOPROTEÍNA-P (P-GP). GR, RECEPTOR DE GLUCOCORTICÓIDES; MDR, GENE DE RESISTÊNCIA A MULTI-FÁRMACOS; DEX, DEXAMETASONA. FIGURA ADAPTADA (DINIS-OLIVEIRA, REMIÃO ET AL. 2006). ...................................................... 29 FIGURA 12: ESTRUTURA QUÍMICA DA TIOXANTONA TX5 (A) E DO PARAQUATO (PQ) (B). FIGURA ADAPTADA (SILVA, SOUSA ET AL. 2014). .......................................................................... 32 FIGURA 12: IMAGEM REPRESENTATIVA DO MÉTODO DE SEPARAÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES A PARTIR DO SANGUE E ATRAVÉS DO HISTOPAQUE® 1077. SÃO FACILMENTE VISUALIZÁVEIS AS DIFERENTES CAMADAS DE CÉLULAS MONONUCLEARES, EM QUE OS LINFÓCITOS REPRESENTAM A MAIORIA, O PLASMA APARECE NO TOPO E OS ERITRÓCITOS ENCONTRAM-SE DEPOSITADOS NO FUNDO. IMAGEM RETIRADA (SIGMAALDRICH 2003). ............................................................................................................ 43 FIGURA 13: TÉCNICA DE CONTAGEM CELULAR EM CÂMARA DE NEUBAUER. A. MÉTODO DE COLOCAÇÃO DA SUSPENSÃO CELULAR PELOS BORDOS DA CÂMARA SOB A LAMELA. B. ESQUEMAS DO INTERIOR DA CÂMARA, OS 4 QUADRADOS DOS CANTOS SÃO ONDE SE CONTAM AS CÉLULAS. C. MÉTODO DE CONTAGEM DAS CÉLULAS. D. AS CÉLULAS EM QUE É POSSÍVEL VER O NÚCLEO SÃO CONTADAS (CÉLULAS À ESQUERDA E NO CENTRO), CÉLULAS EM QUE NÃO SE VISUALIZAM OS NÚCLEOS SÃO DESCARTÁVEIS. FIGURA ORIGINAL. ...............................44 2014|Ana Filipa Ferreira xxi FIGURA 14: ESQUEMA DA EXPERIÊNCIA DE EXPOSIÇÃO DOS LINFÓCITOS À TX5 ....................... 46 FIGURA 15: IMAGEM DE EQUIPAMENTO BD ACCURITM C6 FLOW CYTOMETRY E DO SOFTWARE UTILIZADO NESTE TRABALHO. FIGURA RETIRADA DE (BIOSCIENCES 2012). ...................... 53 FIGURA 16:GRÁFICO REPRESENTATIVO DA PERCENTAGEM DE VIABILIDADE CELULAR DOS LINFÓCITOS T APÓS EXPOSIÇÃO COM TX5 NAS CONCENTRAÇÕES DE 20 µM E 80 µM. COMPARAÇÃO ESTATÍSTICA ENTRE AS DIFERENTES CONCENTRAÇÕES FOI ESTIMADA USADO O MÉTODO DE MÚLTIPLAS CONCENTRAÇÕES DE FRIEDMAN (ONE-WAY ANOVA ONRANKS), SEGUIDO PELO POST-HOC TESTE DE DUNN. ..................................................................... 66 FIGURA 17: GRÁFICOS REPRESENTATIVOS DA SELECÇÃO DA POPULAÇÃO DE LINFÓCITOS T VIÁVEIS: A-SEPARAÇÃO DA POPULAÇÃO DE LINFÓCITOS COM BASE NO SEU TAMANHO (FSC) E GRANULOSIDADE (SSH), CIRCUNSCRITA POR UM POLÍGONO DELIMITADO A AZUL; BDENTRO DO GRUPO ANTERIOR, AS CÉLULAS SÃO DETECTADAS EM FL2 PARA DETERMINAR CÉLULAS CD45+ (LEUCÓCITOS) CDENTRO DAS CÉLULAS ANTERIORES, MARCARAM-SE AQUELAS QUE SÃO POSITIVOS PARA O ANTICORPO CD3-APC (70,7%), OU SEJA, OS LINFÓCITOS T DELIMITADOS PELA LINHA A VERMELHO (R2). A EXPRESSÃO DA P-GP É DETECTADA EM FL1 ONDE SÃO SELECCIONADOS APENAS OS QUE EXPRESSAM P-GP NAS SUAS MEMBRANAS, ATRAVÉS DO ANTICORPO ANTI-P-GP UIC2-FITC. ....................................... 69 FIGURA 18: GRÁFICO REPRESENTATIVO DA ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE GLICOPROTEÍNA –P, NAS CONCENTRAÇÕES DE 20 ΜM E 80 ΜM DE TX5, COM A MARCAÇÃO DE ANTICORPO ANTI PGP, UIC2 EM CÉLULAS CD3+ E CD45+. OS RESULTADOS SÃO EXPRESSOS COMO MÉDIA ± DESVIO PADRÃO E SÃO PROVENIENTES DA ANÁLISE, EM DUPLICADO, DE CÉLULAS OBTIDAS DE 10 DADORES (6 DO SEXO FEMININO E 4 DO SEXO MASCULINO). AS COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS UTILIZANDO O MÉTODO NÃO PARAMÉTRICO DE KRUSKALWALLIS (ONE-WAY ANOVA ON RANKS), SEGUIDO PELO POST-HOC TESTE DE DUNN (* P <0,05; **** P <0,0001 VERSUS CONTROLO; ## P <0,01 VERSUS TX5 20 ΜM). ................. 70 FIGURA 19 : GRÁFICO REPRESENTATIVO DA ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE GLICOPROTEÍNA –P, NAS CONCENTRAÇÕES DE 20 ΜM E 80 ΜM DE TX5, COM A MARCAÇÃO DE ANTICORPO ANTI PGP, UIC2 EM CÉLULAS SELECCIONADAS EM P1. OS RESULTADOS SÃO EXPRESSOS COMO MÉDIA ± DESVIO PADRÃO E SÃO PROVENIENTES DA ANÁLISE, EM DUPLICADO, DE CÉLULAS OBTIDAS DE 10 DADORES (6 DO SEXO FEMININO E 4 DO SEXO MASCULINO). AS COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS UTILIZANDO O MÉTODO NÃO PARAMÉTRICO DE KRUSKAL-WALLIS (ONE-WAY ANOVA ON RANKS), SEGUIDO PELO POST-HOC TESTE DE DUNN (** P <0,01; **** P <0,0001 VERSUS CONTROLO; # P <0,05 VERSUS TX5 20 ΜM). ...................................................................................................................................... 72 FIGURA 20: GRÁFICO REPRESENTATIVO DA ANÁLISE DA ACTIVIDADE DA GLICOPROTEÍNA–P, NAS CONCENTRAÇÕES DE 20 ΜM E 80 ΜM DE TX5, COM A MARCAÇÃO DE ANTICORPOS CD3 E CD45. OS RESULTADOS SÃO EXPRESSOS COMO MÉDIA ± DESVIO PADRÃO E SÃO 2014| Ana Filipa Ferreira xxii PROVENIENTES DA ANÁLISE, EM DUPLICADO, DE CÉLULAS OBTIDAS DE 9 DADORES (5 DO SEXO FEMININO E 4 DO SEXO MASCULINO). AS COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS UTILIZANDO O MÉTODO NÃO PARAMÉTRICO DE KRUSKAL-WALLIS (ONE-WAY ANOVA ON RANKS), SEGUIDO PELO POST-HOC TESTE DE DUNN (** P <0,01; **** P <0,0001 VERSUS CONTROLO). ................................................................................................................... 74 FIGURA 21: GRÁFICO REPRESENTATIVO DA ANÁLISE DA ACTIVIDADE DA GLICOPROTEÍNA –P, NAS CONCENTRAÇÕES DE 20 ΜM E 80 ΜM DE TX5, SEM MARCAÇÃO DE ANTICORPOS. OS RESULTADOS SÃO EXPRESSOS COMO MÉDIA ± DESVIO PADRÃO E SÃO PROVENIENTES DA ANÁLISE, EM DUPLICADO, DE CÉLULAS OBTIDAS DE 20 DADORES (11 DO SEXO FEMININO E 9 DO SEXO MASCULINO). AS COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS UTILIZANDO O MÉTODO NÃO PARAMÉTRICO DE KRUSKAL-WALLIS (ONE-WAY ANOVA ON RANKS), SEGUIDO PELO POST-HOC TESTE DE DUNN (**** P <0,0001 VERSUS CONTROLO) . ........... 75 FIGURA 22: GRÁFICO REPRESENTATIVO DA ANÁLISE DA ACTIVAÇÃO DE GLICOPROTEÍNA –P, NAS CONCENTRAÇÕES DE 20 ΜM E 80 ΜM DE TX5, COM A MARCAÇÃO DE CD3 E CD45. OS RESULTADOS SÃO EXPRESSOS COMO MÉDIA ± DESVIO PADRÃO E SÃO PROVENIENTES DA ANÁLISE, EM DUPLICADO, DE CÉLULAS OBTIDAS DE 9 DADORES (5 DO SEXO FEMININO E 4 DO SEXO MASCULINO). AS COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS UTILIZANDO O MÉTODO NÃO PARAMÉTRICO DE KRUSKAL-WALLIS (ONE-WAY ANOVA ON RANKS), SEGUIDO PELO POST-HOC TESTE DE DUNN (**** P <0,0001 VERSUS CONTROLO). ............ 77 FIGURA 23: GRÁFICO REPRESENTATIVO DA ANÁLISE DA ACTIVAÇÃO DE GLICOPROTEÍNA –P, NAS CONCENTRAÇÕES DE 20 ΜM E 80 ΜM DE TX5, SEM MARCAÇÃO DE ANTICORPOS. OS RESULTADOS SÃO EXPRESSOS COMO MÉDIA ± DESVIO PADRÃO E SÃO PROVENIENTES DA ANÁLISE, EM DUPLICADO, DE CÉLULAS OBTIDAS DE 20 DADORES (11 DO SEXO FEMININO E 9 DO SEXO MASCULINO). AS COMPARAÇÕES ESTATÍSTICAS FORAM FEITAS UTILIZANDO O MÉTODO NÃO PARAMÉTRICO DE KRUSKAL-WALLIS (ONE-WAY ANOVA ON RANKS), SEGUIDO PELO POST-HOC TESTE DE DUNN (**** P <0,0001 VERSUS CONTROLO). ............ 78 FIGURA 24: GRÁFICO DO ESTUDO DA FARMACOCINÉTICA DA DIGOXINA EM ANIMAIS TRATADOS COM DIGOXINA+TX5 (REPRESENTADA A PRETO) E ANIMAIS TRATADOS APENAS COM DIGOXINA (CONTROLO) (REPRESENTADA A VERMELHO). CADA GRUPO É COMPOSTO POR CINCO ANIMAIS. ANÁLISE ESTATÍSTICA FOI FEITA PELO TESTE T STUDENT E PARA CALCULAR A ÁREA SOB A CURVA (AUC) USOU-SE O SOFTWARE WINNONLIN. .................................... 82 FIGURA 25: CROMATOGRAMA DA RESPECTIVA GAMA DE CONCENTRAÇÕES (0,5-150µM INCLUINDO O BRANCO), APÓS OPTIMIZAÇÃO DE CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS, COM TEMPO DE RETENÇÃO DO ANALÍTO DE APROXIMADAMENTE 13 MINUTOS. A FRENTE DE SOLVENTE APRESENTA TEMPO DE RETENÇÃO DE 4 MINUTOS, APROXIMADAMENTE. ......... 84 2014|Ana Filipa Ferreira xxiii FIGURA 26: REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DA RECTA DE CALIBRAÇÃO QUE RELACIONA A ÁREA DO PICO (Y) EM MV/S COM A CONCENTRAÇÃO DE TX5 (X) EM µM RESULTADO NA EQUAÇÃO Y = 5,112*X + 0,7640 COM R2≥0,99. ................................................................................... 85 FIGURA 27: CROMATOGRAMA DAS RESPECTIVAS TRÊS CONCENTRAÇÕES SELECCIONADAS: UMA BAIXA, 1 ΜM REPRESENTADA A VERMELHO, UMA MÉDIA, 10 ΜM REPRESENTADA A AZUL, E UMA ALTA, 100 ΜM REPRESENTADA A VERDE, DE TX5. ................................................... 87 FIGURA 28: CROMATOGRAMA QUE REPRESENTA A CONCENTRAÇÃO PADRÃO DE 10 ΜM INJECTADA NO MESMO DIA DA PREPARAÇÃO E APÓS 7 DIAS, ARMAZENADA A 4°C, AO ABRIGO DA LUZ. NESTE CROMATOGRAMA, OS TEMPOS DE RETENÇÃO NÃO SÃO EXACTAMENTE IGUAIS, UMA VEZ QUE FOI PREPARADA UMA NOVA FASE MÓVEL, FACTOR QUE LEVA A LIGEIRAS ALTERAÇÕES NO TEMPO DE RETENÇÃO. ............................................................ 91 FIGURA 29: CROMATOGRAMA QUE REPRESENTA A CONCENTRAÇÃO PADRÃO DE 10 ΜM INJECTADA QUANDO TX5 É ADICIONADO ANTES DA PRECIPITAÇÃO PROTEICA A1 (COR ROSA) E A CONCENTRAÇÃO PADRÃO DE 10 ΜM INJECTADA QUANDO TX5 É ADICIONADO APÓS PRECIPITAÇÃO PROTEICA COM METANOL A2 (COR VERDE). .............................................. 93 FIGURA 30: CROMATOGRAMA QUE REPRESENTA A CONCENTRAÇÃO PADRÃO DE 0 ΜM, BRANCO (VERDE)E UMA CONCENTRAÇÃO ESCOLHIDA ALEATORIAMENTE (5 ΜM) (ROSA), SENDO POSSÍVEL VER AS DIFERENÇAS DE SINAL DO ANALITO. ...................................................... 94 2014| Ana Filipa Ferreira xxiv ÍNDICE DE TABELAS TABELA 1 EXEMPLOS DE GRUPOS DE SUBSTRATOS DA BOMBA DE EFLUXO. TABELA ADAPTADA (AMBUDKAR, DEY ET AL. 1999, DANTZIG, DE ALWIS ET AL. 2003, DIETRICH, GEIER ET AL. 2003, FROMM 2004, HOFFMANN AND KROEMER 2004, MARZOLINI, PAUS ET AL. 2004, CHOUDHURI AND KLAASSEN 2006). ............................................................................... 14 TABELA 2: EXEMPLO DE ALGUNS SUBSTRATOS COM CAPACIDADE PARA INDUZIR OU INIBIR A GLICOPROTEÍNA-P (KIM 2002, PAL AND MITRA 2006). .................................................. 21 TABELA 3: GRUPO DE INIBIDORES DA GLICOPROTEÍNA-P USADOS COM FINALIDADES CLÍNICAS. TABELA ADAPTADA (KIM 2002, VARMA, ASHOKRAJ ET AL. 2003, KUPPENS, WITTEVEEN ET AL. 2007). ...................................................................................................................... 24 TABELA 4: SOLUÇÃO AI PREPARADA PARA OCORRER UMA ACUMULAÇÃO MÁXIMA DE SUBSTRATO. ...................................................................................................................................... 51 TABELA 5: SOLUÇÃO DE ACTIVAÇÃO PREPARADA COM O INDUTOR TX5 E RPMI. .................. 52 TABELA 6: COMPOSTOS COM CAPACIDADE DE EMITIREM COR, USADAS NOS VÁRIOS ENSAIOS COM RESPECTIVOS CANAIS DE DETECÇÃO DE FLUORESCÊNCIA (BIOSCIENCES 2012). ............... 68 TABELA 7: VALORES MÉDIOS E VALORES COM 95% DE NÍVEL DE CONFIANÇA RESPECTIVAMENTE À RECTA Y = 5,112*X + 0,7640 QUE APRESENTOU CORRELAÇÃO LINEAR DE R2≥0,99. ...... 85 TABELA 8: RESULTADOS OBTIDOS NA ANÁLISE DA PRECISÃO INTER-DIA E EXACTIDÃO DO MÉTODO NAS CONCENTRAÇÕES DE 1, 10 E 100 ΜM. ......................................................... 87 TABELA 9: RESULTADOS OBTIDOS NA ANÁLISE DA PRECISÃO INTRA-DIA DO EQUIPAMENTO NAS CONCENTRAÇÕES DE 1, 10 E 100 ΜM. ............................................................................. 88 TABELA 10: RESULTADOS OBTIDOS NA ANÁLISE DA PRECISÃO INTRA-DIA DO MÉTODO NAS CONCENTRAÇÕES DE 1, 10 E 100 ΜM. ............................................................................. 89 TABELA 11: RESULTADOS OBTIDOS NA ANÁLISE DA ESTABILIDADE DO COMPOSTO NAS CONCENTRAÇÕES DE 1, 10 E 100 ΜM. .............................................................................. 91 TABELA 12: RESULTADOS OBTIDOS NA ANÁLISE DA RECUPERAÇÃO DO COMPOSTO NAS CONCENTRAÇÕES DE 1, 10 E 100 ΜM. .............................................................................. 93 2014|Ana Filipa Ferreira xxv ENQUADRAMENTO DO TRABALHO A P-gp é uma proteína de 170 kDa com aproximadamente 1280 aminoácidos, pertencente à família adenosina trifosfato binding cassete (ABC). A sua principal função é exportar xenobióticos do interior das células, actuando como uma barreira fisiológica que protege o organismo da toxicidade de diferentes agentes externos (Ma, Tsunoda et al. 2010, Vilas-Boas, Silva et al. 2013). Foi detectada em 1976 por Ling et al. (1976) tendo sido a primeira bomba de efluxo da família ABC a ser descoberta, e mais tarde foi isolada a partir de células resistentes de ovário de hamsters (Ambudkar, Dey et al. 1999). Inicialmente, a expressão desta proteína estava associada a situações de resistência a multi-fármacos em células cancerígenas. No entanto, mais tarde, verificou-se que a P-gp estava presente tanto em células cancerígenas como células normais, especialmente em órgãos de eliminação ou de absorção (Choudhuri and Klaassen 2006). A P-gp é uma proteína de grande interesse clínico uma vez que se encontra expressa na maioria dos órgãos, apresenta grande afinidade para os seus substratos, sendo capaz de transportar uma vasta gama de compostos, muitos dos quais são compostos farmacologicamente activos, tais como, inibidores das proteáses do vírus da imunoinsuficiência humana (VIH), antraciclinas, alguns antibióticos, imunossupressores, bloqueadores dos canais de cálcio, bloqueadores β-adrenérgicos, glicosídeos e ainda de pesticidas como o paraquato (PQ) e do corante rodamina 123 (RHO 123) (Varma, Ashokraj et al. 2003). Um dos factores relevantes na regulação de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) dos compostos está associado à actividade dos transportadores de membrana, em especial a P-gp. A sua expressão afecta directamente a biodisponibilidade (BD) de um composto que seja seu substrato, resultando numa variável farmacocinética (Lin 2003, Zhang, Bachmeier et al. 2003). Estudar o mecanismo para induzir e aumentar a actividade desta proteína é de extrema importância para a área da toxicologia clínica e medicina, uma vez que pode evitar-se, ou fazer-se diminuir, as consequências de intoxicações agudas por compostos tóxicos ou até alterar estratégias terapêuticas no tratamento de alguns tipos de cancros. A P-gp pode ser assim considerada uma importante via de destoxificação (Amin 2013, Silva, Sousa et al. 2014). No presente trabalho estudado um conhecido indutor da P-gp, um derivado de xantona, avaliando-se a sua capacidade em induzir a expressão e aumentar a actividade desta proteína em dois modelos de estudo, in vitro recorrendo a linfócitos T humanos isolados de diferentes dadores e in vivo com ratos Charles River. Pretendeu-se ainda validar um método de análise e quantificação deste composto, por HPLC em fase reversa, com o objectivo de posteriormente quantificar TX5 em matrizes celulares. 2014| Ana Filipa Ferreira 4 isolada a partir de tecidos mamários com resistência a anticancerígenos durante tratamento do cancro da mama (Leslie, Deeley et al. 2005, Choudhuri and Klaassen 2006, Mo and Zhang 2012). 1.1 A glicoproteína-P A P-gp foi a primeira proteína de transporte (figura 1) a ser detectada em 1976, isolada primariamente a partir de células resistentes de ovário de hamsters chinesas. É considerada a principal bomba de efluxo, por estar presente na maioria dos tecidos e por reconhecer a maioria dos compostos, sejam eles compostos aromáticos, lineares, sem carga ou com carga, básicos ou ácidos (Gottesman, Hrycyna et al. 1995, van Asperen, van Tellingen et al. 1997, Ambudkar, Dey et al. 1999, Sarkadi, Homolya et al. 2006). A P-gp é uma proteína de 170 kDa, localizada na região do cromossoma 7 (7q21) com 1280 aminoácidos. Em humanos, a P-gp é codificada por dois genes, MDR1/ABCB1 e MDR3/ABCB4 (ou MDR2) devido a uma duplicação de eventos adjacentes no cromossoma 7 (Callen, Baker et al. 1987, Chin, Soffir et al. 1989). O fenótipo de resistência é associado à isoforma MDR1, enquanto a isoforma MDR3 funciona como uma fosfatidilcolina translocase, exportando fosfolípidos para a bílis (Ruetz and Gros 1994, Hennessy and Spiers 2007). Em roedores foram encontrados 3 genes para a codificação da mesma bomba de efluxo: Abcb1a/Mdr1a/mdr3 e Abcb1b/Mdr1b/mdr1 que codificam a Pgp associada ao transporte através da membrana, e o gene mdr2/Abcb4, que codifica a proteína de transporte fosfatidilcolina translocase para a passagem de fosfolípidos para a bílis (Sharom 2007). A síntese da P-gp ocorre no retículo endoplasmático tal como um núcleo glicosilado, de peso molecular de 150 kDa, sendo que a porção de hidrato de carbono é subsequentemente modificada no aparelho de Golgi, antes da exportação para a superfície celular (Loo and Clarke 1999). Figura 1:Representação de um modelo proposto de transporte através da glicoproteína-P. (A) O substrato (vermelho) dividese na bicamada apical das células entrando para o folheto interno por ligação à proteína que se encontra livre (TMD). Os resíduos no local de Os resíduos no local de ligação (esferas azuis) interagem com o substrato. (B) O ATP (amarelo) liga-se ao domínio de ligação ao nucleótido (NBD) causando alteração de conformação e o substrato passa para o local extracelular. Figura adaptada (Aller, Yu et al. 2009). 2014|Ana Filipa Ferreira 5 O nome «proteína de resistência a multi-fármacos» (MDR), está relacionado com o facto desta proteína ter sido detetada inicialmente em células cancerígenas. Consideravase que o transportador era altamente expresso nestas células para as proteger dos tratamentos com quimioterápicos. Contudo, mais tarde verificou-se que a P-gp está presente em células tanto cancerígenas como normais, especialmente em células de órgãos de eliminação ou de absorção (Choudhuri and Klaassen 2006, Vilas-Boas, Silva et al. 2013). Encontra-se expressa em várias membranas de órgãos como no intestino, fígado, rins, ductos pancreáticos e biliares, túbulos proximais, na BHE e ainda em linfócitos. Funciona como uma barreira fisiológica, actuando como um agente de destoxificação (Ma, Tsunoda et al. 2010, Vilas-Boas, Silva et al. 2013). Com a descoberta da P-gp tornou-se evidente que esta é responsável pelo aumento do efluxo de compostos de diferentes estruturas (Sarkadi, Homolya et al. 2006). Este transportador pode reconhecer uma vasta gama de substratos por ser capaz de reconhecer múltiplas estruturas químicas. Muitos dos seus substratos são compostos farmacologicamente activos. Reconhece fármacos com peso molecular de 250 g/mol (ex: cimetidina) a 1202 g/mol (ciclosporina A) (Sharom 2011). São exemplos de alguns substratos, os anticancerígenos, inibidores das protéases (VIH), antraciclinas, alguns antibióticos, imunossupressores, bloqueadores dos canais de cálcio e bloqueadores βadrenérgicos. O pesticida paraquato (PQ) e o corante rodamina 123 (RHO123) são também seus substratos (Varma, Ashokraj et al. 2003, Vilas-Boas, Silva et al. 2013). Transporta também moléculas envolvidas na resposta inflamatória. Reconhece citoquinas, prostaglandinas, esteróides e factores de activação plaquetária (PAF), sendo plausível que esta proteína esteja envolvida no efeito pró inflamatório, através do envio de activadores da inflamação para o exterior da célula (Chan, Gold et al. 2011, Kooij, Mizee et al. 2011). A P-gp apresenta um papel importante na protecção do organismo dada a sua expressão nos vários órgãos onde participa activamente na farmacocinética de qualquer composto que seja seu substrato. É responsável pelas alterações na BD em administrações orais, impedindo a absorção e reduzindo o tempo de retenção de compostos no organismo (Lin and Yamazaki 2003, Varma, Ashokraj et al. 2003). O desenvolvimento de inibidores e indutores potentes de P-gp com baixa toxicidade têm aberto novos horizontes na clínica terapêutica. A inibição das bombas de efluxo tem como principal objectivo realizar a entrada de fármaco nas células e com possibilidade de sucesso em tratamentos, sendo de bastante aplicação em tratamentos que resultam em resistência a multi-fármacos. No caso da indução ou activação da proteína, têm sido desenvolvidos compostos capazes de aumentar o efeito fisiológico da P-gp com o objectivo de limitar a toxicidade provocada por substratos da mesma (Ambudkar, Dey et al. 1999, Borst and Elferink 2002, Silva, Carmo et al. 2013). 2014| Ana Filipa Ferreira 6 Figura 2: Representação da estrutura típica da glicoproteína-P presente na bicamada lipídica. A proteína contém dois domínios transmembranares (TMD) e d ois domínios de ligação a nucleó tidos (NBD). Figura adaptada (Choudhuri and Klaassen 2006). 1.1.1 Estrutura da glicoproteína-P Na sua maioria, os transportadores ABC apresentam uma estrutura idêntica, com dois domínios distintos. O domínio hidrofóbico com NH2-terminal e COOH-terminal, designada por domínio da ligação a nucleótidos (NBD-nucleotide binding domains) e domínio hidrofílico ou domínio transmembranar (TMD-transmembrane domain). Estes constituem no total 12 segmentos em α-hélices ligados por uma sequência polipeptídica flexível (Ambudkar, Dey et al. 1999, Hoffmann and Kroemer 2004, He, Li et al. 2011) (figura 2). É no domínio NBD que ocorre a ligação e subsequente hidrólise do ATP, resultando em energia disponível utilizada no transporte transmembranar. A uma distância de 100-200 aminoácidos do domínio NBD, encontram-se duas sequências de 3 peptídeos: Walker A e Walker B, que parecem ser conservados em todos os transportadores ABC. Existe também um motivo C, onde cada proteína tem uma sequência específica que a define (fígura 3). No motivo Walker A está presente um resíduo de lisina que está envolvido na ligação do grupo fosfato do ATP, assim como o resíduo de ácido de aspartato presente no motivo Walker B parece interagir com o ião magnésio (Mg2+). O outro domínio, TMD, é o domínio responsável pelo reconhecimento do substrato pelo transportador (Leslie, Deeley et al. 2005, Sarkadi, Homolya et al. 2006). 2014|Ana Filipa Ferreira 7 Figura 3: O domínio NBD dos transportadores ABC contem dois motivos: Walker A e Walker B. Estes são conservados em todos os transportadores desta família. Cada transportador tem a sua própria assinatura, motivo C, onde está a sequência de aminoácidos que o caracte riza. Figura adaptada ( Choudhuri and Klaassen 2006). 1.1.2 Localização da glicoproteína-P A localização da P-gp nos diferentes órgãos altera significativamente a BD de qualquer composto que seja seu substrato. Consequentemente ocorrem diferentes fases de ADME, levando a efeitos diferentes entre indivíduos e, muitas vezes, efeitos inesperados (Choudhuri and Klaassen 2006) com a ocorrência, ou não, de toxicidade ou resistência a fármacos (He, Li et al. 2011). Assim sendo, é importante reconhecer o local exacto da sua expressão de modo a prever o caminho que o composto vai seguir dentro do organismo. O aparelho gastrointestinal é a primeira linha de contacto com os xenobióticos por via oral, e deste modo, deve ser também a primeira linha de defesa contra os mesmos. No intestino, a P-gp é expressa principalmente na superfície apical dos enterócitos, mas também nas restantes células intestinais (Choudhuri and Klaassen 2006, Zhou 2008). Este órgão é dividido em 4 partes: duodeno, jejuno, íleo e cólon. Ao longo do intestino a absorção processa-se de forma distinta, o que está intimamente relacionado com a distribuição da P-gp no lúmen intestinal. Esta distribuição diferencial previne e modela a passagem de certos compostos, ou seus metabolitos, do intestino para a circulação. Segundo Leslie et al. (2005), a expressão da P-gp aumenta desde o duodeno até ao cólon (Leslie, Deeley et al. 2005) (figura 4A). No fígado a P-gp encontra-se no lado apical das células das membranas caniculares dos hepatócitos (Choudhuri and Klaassen 2006, Zhou 2008). Este órgão apresenta a maior taxa de reacções metabólicas, principalmente reacções de destoxificação. Para que estas reacções ocorram são necessários transportadores como a P-gp, para eliminar os compostos e/ou tóxicos, encaminhando-os através dos canalículos ou sinusóides hepáticos para a bílis ou circulação sistémica, respectivamente (Leslie, Deeley et al. 2005) (figura 4B). A P-gp também é expressa na parte apical das células da vesícula biliar. Assim, os xenobióticos que são substratos destas proteínas, mas que escaparam à eliminação e entraram pela circulação portal são, potencialmente, excretados pela bílis (Leslie, Deeley et al. 2005) (figura 4.C). 2014| Ana Filipa Ferreira 8 Figura 4: Proteína permeável (P-gp) expressa na membrana apical nas células epiteliais intestinais, na membrana dos canalículos dos hepatócitos humanos e na membrana dos túbulos proximais renais A, B e C respectivamente. Figura adaptada (Wessler, Grip et al. 2013). Os rins têm como principal função regular a homeostasia do corpo incluindo a regulação do volume de fluido circulante e síntese de hormonas mas, além disso, também estão envolvidos na excreção de metabolitos endógenos e xenobióticos (Leslie, Deeley et al. 2005). A P-gp é também expressa na superfície apical das células epiteliais dos túbulos proximais (Lin and Yamazaki 2003), mediando o efluxo de vários xenobióticos do sangue para a urina, na sua maioria moléculas hidrofóbicas (Schaub, Kartenbeck et al. 1999, Masereeuw, Notenboom et al. 2003). Em conclusão, a localização privilegiada da P-gp no aparelho digestivo impede a passagem e, consequente acumulação de xenobióticos no organismo, sendo este o seu principal papel fisiológico (Döring and Petzinger 2014). A expressão no intestino é responsável pela limitação da entrada/absorção para os enterócitos, assim como a expressão na superfície dos canalículos dos hepatócitos e nas células túbulares renais aumentam a eliminação dos compostos para a bílis ou para a urina, respectivamente (Lin and Yamazaki 2003). 2014|Ana Filipa Ferreira 9 A P-gp encontra-se ainda expressa noutros órgãos. Desempenha um papel muito importante na BHE, impedindo a entrada de compostos endógenos ou xenobióticos para o cérebro (Schinkel, Smit et al. 1994, Schinkel, Wagenaar et al. 1995, Schinkel, Wagenaar et al. 1996, Schinkel 1999) (figura 5). A BHE é composta por células endoteliais conectadas entre si por pequenas estruturas, designadas de junções estreitas, formando um endotélio contínuo que serve de barreira entre o sistema nervoso central (SNC) – o cérebro – e a corrente sanguínea, sendo impermeável a todas as pequenas moléculas lipídicas com o objectivo de defender o sistema nervoso de agentes tóxicos (Leslie, Deeley et al. 2005). A P-gp é expressa em muitos tipos de células do cérebro incluindo do plexo coróide, astrócitos e microglia e o seu maior efeito fisiológico nesta camada é a protecção do cérebro (Fricker and Miller 2004, Ma, Tsunoda et al. 2010). A presença de transportadores na BHE protege não só o cérebro da acção de toxinas, mas também é um obstáculo para a entrada de fármacos com mecanismo de acção sobre o SNC, tal como tratamentos para a epilepsia, VIH, infecções no SNC e tumores cerebrais (Bendayan, Lee et al. 2002). . Outros órgãos também expressam a P-gp, mediando igualmente a entrada e acumulação de tóxicos. Nos pulmões, que são expostos a um grande leque de agentes tóxicos por inalação directa, a P-gp localiza-se na superfície apical do epitélio bronquial, bronquiolar e na membrana plasmática dos macrófagos alveolares, sendo a sua actividade de efluxo um mecanismo para a remoção de compostos prejudiciais ao órgão (Scheffer, Pijnenborg et al. 2002). A P-gp também é expressa nos ductos pancreáticos e nos testículos, nomeadamente em células de Leydig, macrófagos testiculares e em células de sertoli (Fojo, Ueda et al. 1987, Thiebaut, Tsuruo et al. 1987, Chin, Soffir et al. 1989, Cordon-Cardo, O'Brien et al. 1989, Cordon-Cardo, O'Brien et al. 1990, Schinkel 1999, Melaine, Lienard et al. 2002). É ainda expressa na superfície luminal de células epiteliais Figura 5: Localização da glicoproteína-P na membrana apical em células endoteliais da barreira hematoencefálica. Esta localização permite o transporte de xenobióticos para o sangue. Figura adaptada ( Rao, Dahlheimer et al. 1999) 2014| Ana Filipa Ferreira 10 secretoras do endométrio, assim como na placenta, onde parece ter um papel muito importante na protecção do feto contra a toxicidade de diferentes moléculas endógenas e exógenas (Arceci, Croop et al. 1988, Gil, Saura et al. 2005, Kalabis, Kostaki et al. 2005). 1.1.3 Expressão da glicoproteína-P em células do sistema imunitário Os transportadores de membrana são expressos em órgãos de absorção e excreção e o sistema imunológico não é excepção. A P-gp é expressa na medula óssea, encontrandose activa em células sanguíneas, em particular nas células natural killer (NK) e nos linfócitos T (Thiebaut, Tsuruo et al. 1987, Chaudhary and Roninson 1991, Kock, Grube et al. 2007, Manceau, Giraud et al. 2012). Chaudhary et al. (1991) sugeriram que a P-gp está envolvida em processos de transporte também nestas células, com a finalidade de balancear a concentração intracelular de alguns compostos como por exemplo citoquinas, hormonas, aldosterona e cortisol (Chaudhary and Roninson 1991, Eckford and Sharom 2009). O facto de a P-gp ser responsável pelo transporte de citoquinas e hormonas é um aspecto que pode explicar a sua expressão nestas células, contudo ainda não está bem definido o seu papel neste sistema (Thiebaut, Tsuruo et al. 1987, Chaudhary and Roninson 1991, Kock, Grube et al. 2007, Manceau, Giraud et al. 2012). Em estudos realizados por Klimecki et al. (1994) com células CD3+ (linfócitos T) e mais especificamente com CD4+ (linfócitos T helper), CD8+ (linfócitos T citotóxicos) assim como CD56+ (células natural killer), através da avaliação do transporte da RHO 123 (substrato da P-gp) verificou-se que os linfócitos T expressam elevados níveis desta proteína de transporte (Klimecki, Futscher et al. 1994, Robey, Bakke et al. 1999). Noutro estudo mais recente realizado por Vilas Boas et al. (2011), em linfócitos isolados a partir de sangue total de indivíduos do sexo masculino, verificou-se que a expressão da P-gp nestas células aumenta em relação à idade, mas a actividade da proteína mostrou não se relacionar com o mesmo factor. O método usado neste estudo foi também a incorporação de RHO 123, detectada por níveis de fluorescência e avaliada em citometria de fluxo. A expressão da P-gp foi avaliada usando o anticorpo monoclonal anti-Pgp UIC2 na presença e ausência de vimblastina (substrato) (Vilas-Boas, Silva et al. 2011). 2014|Ana Filipa Ferreira 11 1.1.4 Mecanismo de transporte pela glicoproteína-P O mecanismo de transporte de compostos pela P-gp não é totalmente conhecido. No entanto, existem pelo menos três modelos aceites: modelo clássico ou poro, modelo de aspiração hidrofóbica (Hydrophobic vacuum cleaner, HVC) e o modelo de flippase. O modelo clássico ou poro, descrito por Borst et al. (2002), é caracterizado por dois TMD organizados numa disposição favorável e com capacidade de formar poros. A P-gp consegue efectuar o efluxo através destes poros e é capaz de expulsar activamente os fármacos do citoplasma para o espaço extracelular (Borst and Elferink 2002) (figura 6A). De acordo com o modelo HVC proposto por Gottesman et al. (2002), a P-gp pode ter mudanças conformacionais através da hidrólise de ATP e consegue bombear substratos neutros ou carregados. Funciona como um aspirador para o meio extracelular, quer a partir do compartimento intracelular quer a partir da bicamada lipídica da membrana plasmática da célula onde estes substratos podem acumular-se (Gottesman, Fojo et al. 2002) (figura 6B). Em relação ao modelo flippase, o substrato liga-se à P-gp e é orientado para a membrana interna. A porção hidrofóbica do substrato é orientada na membrana celular para o lado hidrofóbico da proteína de transporte. Ocorre uma mudança conformacional devido à ligação que ocorre entre a NBD e o ATP. Esta mudança de conformação evita a entrada destes compostos, expulsando-os para o meio extracelular. Este parece ser o mecanismo mais bem aceite para o transporte da P-gp (Choudhuri and Klaassen 2006) (figura 6C). 2014| Ana Filipa Ferreira 12 1.1.5 Substratos da glicoproteína-P Os substratos da P-gp não apresentam uma estrutura característica que os defina como tal. Contudo sabe-se que a P-gp tem preferência por moléculas relativamente hidrofóbicas, algumas catiónicas e geralmente contendo anéis aromáticos com átomos de azoto de carga positiva (Shapiro and Shear 2002, Sharom 2011). Estudos realizados por Seelig et al. (1998) com o objectivo de entender o que define uma molécula para ser substrato desta proteína de transporte, demonstraram que um composto pode interagir com a P-gp se contiver: a) grupos dadores de dois electrões com uma separação espacial de 2,5 ± 0,3 Å; b) grupos dadores de dois electrões com uma separação espacial de 4,6 ± 0,6 Â; c) grupos dadores de três electrões com uma separação espacial de 4,6 ± 0,6 Å (Seelig 1998). Posteriormente, também afirmaram que a separação na membrana lipídica é um passo limitante na interacção de um substrato com a P-gp e que a dissociação do complexo formado entre a P-gp e o substrato é determinada pelo número e força das ligações de hidrogénio formadas entre ambas (Seelig and Figura 6 Representação dos modelos propostos de transporte pela glicoproteína-P. A Modelo clássico ou poro. De acordo com este modelo, a P -gp encontra o xenobiótico no folheto da bicamada lipídica e expulsaos para fora do folheto contra o gradiente de concentração. Este modelo é baseado na ideia de que o substrato tem acesso ao local de ligação de TMD pela bicamada lipídica depois de interagir com a mesma membrana. B Modelo de aspiração hidrofóbica (HVC) que permite à P -gp expulsar os seus substratos. De acordo co m este modelo, os substratos podem ser expulsos tanto do espaço intracelular como de dentro da bicamada lipídica da membrana plasmática, através do reconhecimento destes como xenobióticos. C Modelo flippase com movimento flip -flop com a bicamada lipídica. A mudança de conformação faz com que a entrada do substrato não ocorra. Figura adaptada (Choudhuri and Klaassen 2006). 2014|Ana Filipa Ferreira 13 Landwojtowicz 2000). Contudo, as características físico-químicas do substrato são importantes e determinantes para que ocorra interacção entre o substrato e a proteína, tais como a lipofilicidade, a capacidade de fazer ligações de hidrogénio, o peso molecular e a área de superfície (Bain, McLachlan et al. 1997, Wang, Kuo et al. 2003). Além dos substratos da P-gp poderem ser simplesmente substratos e atravessarem a membrana plasmática através dela, podem ainda actuar como seus inibidores ou indutores, através da alteração da sua actividade e/ou expressão (Wessler, Grip et al. 2013). A tabela 1 enumera alguns destes substratos. 2014| Ana Filipa Ferreira 20 significativamente a expressão de ARN mensageiro (mARN), resultando na ausência da proteína de MDR1. A depleção da expressão de MDR1 correlacionou-se bem com o aumento da retenção do fármaco e com o aumento de sensibilidade das células aos compostos (Peng, Xiao et al. 2004, Choudhuri and Klaassen 2006). Por outro lado, o uso de indutores aumenta a actividade e expressão da bomba de efluxo, a P-gp, proporcionando uma sobrevivência celular a longo prazo e tem sido uma importante estratégia terapêutica a seguir (Silva, Sousa et al. 2014). São já enumerados múltiplos mecanismos através dos quais a síntese de mARN pode ser regulada, sendo já provados alguns mecanismos de regulação positiva para o transporte de fármacos (Sharom 2007). Uma vez que este mecanismo de indução é reconhecido como uma via de destoxificação eficaz em contacto com compostos tóxicos, como o PQ, resultando numa redução significativa nos níveis intracelulares e, consequentemente, numa redução significativa da sua toxicidade, a identificação de novos indutores e activadores da P-gp irá permitir encontrar novos agentes terapêuticos que poderão funcionar como novos antídotos para intoxicações causadas por substratos da P-gp (Dinis-Oliveira, Remiao et al. 2006, Silva, Sousa et al. 2014). Alguns exemplos de indutores e inibidores são apresentados na tabela 2. 2014|Ana Filipa Ferreira 21 Tabela 2: Exemplo de alguns substratos com capacidade para induzir ou inibir a glicoproteína-P (Kim 2002, Pal and Mitra 2006). INIBIDOR INDUTOR Nelfinavir Fármacos anti-VIH Amprenavir Ritonavir Nelfinavir Saquinavir Ritonavir Quinidina Fármacos do Sistema cardíaco Amiodarona Verapamilo Diltiazem Amiodarona Nicardipina Atorvastatina Nifedipina Diltiazem Verapamilo Fenodipina Lidocaina Nicardipina Nitrendipina Terfenadina Cisplatina Fármacos anticancerígenos Tamoxifeno Daunorubicina Vimblastina Doxorrubicina Etoposido Fluorouracilo Metotrexato Tamoxifeno Vimblatina Vincristina Claritromicina Antibióticos Eritromicina Eritromicina Rifampicina 2014| Ana Filipa Ferreira 22 1.3.1 Mecanismo de inibição da glicoproteína-P A inibição da P-gp é o principal objectivo para se obter a entrada de fármacos nas células, possibilitando o sucesso dos tratamentos. Em geral, a inibição ocorre por 4 mecanismos: 1. Bloquear o local de ligação do transportador por mecanismo competitivo, não competitivo ou no local alostérico (figura8) (Varma, Ashokraj et al. 2003); 2. Interferir com a hidrólise de ATP (Shapiro and Ling 1997); 3. Inibir da ligação ao ATP no momento da translocação (Amin 2013); 4. Alterar da integridade dos lípidos da membrana celular (Ruetz and Gros 1994, Amin 2013, Wessler, Grip et al. 2013). Cortisol Hormonas Dexametasona Hidrocortisona Estradiol Progesterona Insulina Testosterona Midazolam Sedativos Fenobarbital Nefazodone Ciclosporina A Imunossupressores Ciclosporina Tacrolimus Prednisolona Sirolimus Sirolimus Tacrolimus Metadona Opióides Morfina Cetoconazol Antifúngicos Clotrimazol Itraconazol 2014|Ana Filipa Ferreira 23 Se o bloqueio deste transportador de efluxo ocorrer, garantimos a entrada de compostos para a célula (Sharom 2011). Desta forma, têm sido feitos estudos com possíveis inibidores da bomba baseados na sua especificidade, afinidade e toxicidade e já são conhecidas quatro gerações de inibidores da P-gp: o A primeira geração é constituída por compostos farmacologicamente activos usados para tratamentos específicos, mas que têm a agilidade de inibir a bomba. Contudo, o uso da primeira geração como inibidores é limitado, uma vez que são necessárias elevadas concentrações no organismo para inibir a bomba e nestas concentrações os inibidores são potencialmente tóxicos. Outra desvantagem é que estes são também substratos de enzimas e de outros transportadores, levando a interacções farmacocinéticas (Lomovskaya and Bostian 2006, Lomovskaya, Zgurskaya et al. 2007); o A segunda geração não tem actividade farmacológica, porém são óptimos inibidores por apresentarem muita afinidade para a bomba. Neste grupo incluem-se os análogos não-imunossupressores da ciclosporina A (PSC833) e o D-isómero do verapamilo (dexaverapamilo). Contudo esta geração além de inibir a bomba, também inibe a CYP 3A4 e outros transportadores da família ABC, complicando o metabolismo normal dos compostos; Figura 8: Mecanismo de inibição da glicoproteína-P por um inibidor competitivo (esquerda) e por um não competitivo (direita). Figura adaptada (Amin 2013) 2014| Ana Filipa Ferreira 24 o A terceira geração de inibidores é recente e são poucos os estudos clínicos. No entanto, sabe-se que esta geração tem maior afinidade e menor toxicidade (ex. GF 120918, tariquidar). Foram desenvolvidos através do conhecimento da estruturada bomba de efluxo para cumprir os requisitos de menor toxicidade e maior afinidade (Malingre, Beijnen et al. 2001, Kuppens, Witteveen et al. 2007); o A quarta geração, também recente, é constituída por compostos de origem natural e sintética que têm sido mencionados nesta área. Estes podem ser os próprios excipientes do princípio activo, ou seja, já preparados de indústria e mais tarde administrados por via oral num só comprimido. São exemplos, o polietilenoglicol (PEG), TWEN-20 e SPAN-80, gomas aniónicas, alginato de sódio, poloxámeros, tiómeros e dendrímeros. O mais eficaz parece ser o PEG que tem sido introduzido em formulações farmacêuticas. O mecanismo de acção inibitório consiste na alteração da integridade dos lípidos da membrana por troca da estrutura secundária e terciária. Neste caso, a P-gp estará alterada e impedida de conduzir efluxo dos seus substratos (Werle 2008, Prakash 2010). A tabela 3 apresenta exemplos das gerações citadas. Tabela 3: Grupo de inibidores da glicoproteína-P usados com finalidades clínicas. Tabela adaptada (Kim 2002, Varma, Ashokraj et al. 2003, Kuppens, Witteveen et al. 2007). Geração Exemplos Especificidade Limitações Primeira geração Verapamilo, Ciclosporina A, Reserpina, Quinidina, Yohimbine, Toremifena e Tamoxifeno. Não selectiva e baixa afinidade. São substratos de outros transportadores e de outros sistemas enzimáticos. São farmacologicamen te activos e eles próprios são substratos da Pgp. 2014|Ana Filipa Ferreira 25 O fenómeno de inibição envolvendo a administração concomitante de fármacos poderá levar a alterações no metabolismo, aumentando os níveis plasmáticos. Por exemplo, a administração de digoxina (substrato) e que envolva a administração concomitante de inibidores conhecidos, como overapamilo ou a ciclosporina A (inibidores de primeira geração), levará a um aumento de digoxina na corrente sanguínea (Kim 2002). Segundo um estudo realizado por Sugie et. al. e Van Asperen et. al. (1997), o verapamilo influencia o transporte de digoxina por apresentar uma acção inibitória sobre Segunda geração Dexaverapamilo, Dexaniguldipina, Valspodar (PSC 833) e DofequidarFumarate (MS209). Alta especificidade que a 1ª geração de inibidores mas tem interacção com outros sistemas. São substratos da CYP 3 A4 e de outros transportadores. Terceira Geração Elacridar (GF120918/GG918), Tariquidar (XR9576), Ciclopropyldibenzosuberan e Zosuquidar (LY 335979), Laniquidar (R101933); Mitotane (NSC-38721), Bricodar (VX-710), ONT093 e HM30181. Alta especificidade e potencialidade como inibidor da P-gp. Sem inibições tais como ocorre na 1ª e 2ª geração. Quarta Geração PEG, TWEN-20, SPAM-80, Alginatos, Gomas Aniónicas Poloxámeros, Tiómeros e Dendrímeros. Alta potencialidade como inibidor da P-gp por alterar a integridade da membrana. Sem inibições 2014| Ana Filipa Ferreira 26 a P-gp mas sem interferir com a hidrólise do ATP (van Asperen, van Tellingen et al. 1997, Sugie, Asakura et al. 2004). Mais tarde, Seral et al. (2003) estudaram a influência do inibidor verapamilo, ciclosporina e GF 120918 na actividade antimicrobial com macrólidos (eritromicina, claritromicina, roxitromicina, azitromicina, telitromicina) em macrófagos de ratos. O resultado mostrou que existe alteração da extrusão de macrólidos na presença do inibidor da bomba. O uso de inibidores aumentou a acumulação dentro da célula e beneficiou a acção anti microbiana (Seral, Michot et al. 2003). Mais recente, Kwak et al. (2010) estudaram as características de um novo inibidor pertencente à terceira geração, HM30181, que apresenta bons resultados em comparação com a ciclosporina A e GF120918 quando a administração é por via oral. Este novo inibidor tem mais afinidade para a P-gp e não inibe outros transportadores pertencentes à família ABC. A ciclosporina A inibe a função transportadora da P-gp por interagir tanto com os locais de reconhecimento dos substratos, como com os NBDs sem interagir com os locais de ligação ao substrato. Num ensaio in vitro com células do cólon cancerígenas humanas, uma co-administração de HM30181 com paclitaxel aumentou a BD por via oral de paclitaxel de 3,4% para 41,3%, verificando-se a força inibitória de HM30181 (Kwak, Lee et al. 2010). Resumindo, a inibição da bomba traz um impacto para a farmacocinética. Aumenta a absorção, o tempo de semi-vida do composto e reduz a excreção ou clearence nos túbulos proximais nos rins, aumentando o reuptake. Assim, uma vez que esta bomba se encontra em vários órgãos e tecidos, a sua inibição poderá aumentar não só a sua absorção, mas também levar a diferentes fases de distribuição, metabolismo e eliminação dos seus substratos (Batrakova, Miller et al. 2001, Varma, Ashokraj et al. 2003). 1.3.2 Mecanismo de indução e activação da glicoproteína-P A P-gp é uma proteína reconhecida pelo seu papel crucial na protecção celular, devido à sua capacidade de efluxo de que resulta a diminuição da acumulação intracelular de xenobióticos (Dinis-Oliveira, Duarte et al. 2006, Silva, Carmo et al. 2011). A indução da proteína de transporte tem merecido atenção em estudos relacionados com a protecção celular, uma vez que existem vários compostos que têm demonstrado aumentar a expressão da P-gp. É o caso da dexametasona (DEX), rifampicina, hipericina e hiperforina (antidepressivos Ervas St. John´s) e agentes quimioterápicos como a doxorrubicina (DOX). Os níveis de P-gp estão também aumentados na presença do factor de necrose tumoral alfa (TNFα) sugerindo que esta 2014|Ana Filipa Ferreira 27 citoquina pro-inflamatória além de substrato também induz a expressão de P-gp nas membranas (Dinis-Oliveira, Duarte et al. 2006, Silva, Carmo et al. 2011, Vilas-Boas, Silva et al. 2011). Não só compostos químicos são descritos como indutores, mas também o stress físico como radiações UV, raios X e choque térmico induzem a P-gp (Silva et al., 2014; Zhou, 2008). Factores genéticos e ambientais demonstraram que influenciam a expressão e também a actividade da P-gp. Por exemplo, a expressão ou função da P-gp é altamente alterada por algumas condições patológicas, como o caso do cancro, diabetes e Alzheimer (Tada, Wada et al. 2000, Hartz, Miller et al. 2010, Nawa, Fujita-Hamabe et al. 2011). O mecanismo de indução da P-gp é devido a receptores de hormonas nucleares, chamados de «xenosensores» devido à sua habilidade em actuar com a vasta gama de substratos exógenos e toxinas. O receptor X-pregnane (PXR, NRAI2) e o receptor androsterona constitutivo (CAR, NR1I3) medeiam a resposta celular a tóxicos através da transcrição de factores para componentes do sistema de secreção para destoxificação, onde se incluem os transportadores de membrana, P-gp e enzimas metabólicas como CYP3A4. O substrato activa severamente os factores de transcrição, incluindo o PXR, CAR e o activador de proteínas-1 (AP1) (Handschin and Meyer 2003, Burk, Arnold et al. 2005). Uma vez que durante a quimioterapia existem resistências a fármacos em consequência da acção das proteínas de membrana, existem muitos estudos que procuraram identificar os sinais moleculares que modelam a expressão dos níveis transcripcionais durante a quimioterapia. O tratamento contínuo com anticancerígenos estimula directamente a transcrição do mARN da P-gp por alterar a translocação nuclear de vários factores transcripcionais. A transcrição do mARN da P-gp é fortemente influenciada por mecanismos epigenéticos, incluindo acetilação de histonas e metilação do ADN que afecta a acessibilidade de todos os factores transcripcionais em promover a região determinante de síntese de mARN. A expressão dos níveis da proteína revelou que a sua actividade é também controlada por estes factores post-transcripcionais que afectam a passagem através da membrana, assim como a localização e degradação da P-gp sem alteração dos níveis de mRNA ou síntese proteica. Na figura 9 está representado um possível mecanismo de indução da P-gp através de anticancerígenos. O tratamento com alguns destes fármacos estimula directamente a transcripção da mARN da P-gp por favorecer a translocação nuclear de vários factores transcripcionais. Além disso, estes fármacos também modulam um processo epigenético onde se inclui a metilação do ADN e acetilação das histonas, que afectam o acesso dos factores transcripcionais ao promotor da região determinante da síntese de mARN. Consequentemente, estes compostos também influenciam processos de modificação post-transcripcional, especialmente proteínas cuja função é favorecer a ligação entre as membranas plasmáticas e os filamentos de actina, 2014| Ana Filipa Ferreira 28 como é o caso da proteína ezrina/radixina/moesina (ERM). Estes eventos juntos contribuem para aumentar a expressão da P-gp (Kobori, Harada et al. 2014). Num estudo realizado por Silva et al. (2012), testou-se a capacidade de transporte de efluxo da P-gp em células caco-2, células que mimetizam a barreira intestinal, utilizando a DOX como indutor e o PQ como substrato. Este substrato é um herbicida envolvido em milhões de intoxicações em todo o mundo e é absorvido por via intestinal. Como resultado, observaram que indução da P-gp pela DOX pode ser usada como um potente antídoto para intoxicações com PQ uma vez que esta aumenta o efluxo do composto (Silva, Carmo et al. 2013). Portanto, o aumento da expressão ou actividade da Pgp resulta numa protecção celular contra xenobióticos (Silva, Carmo et al. 2011). Figura 9: Representação esquemática de um dos mecanismos responsáveis pelo aumento de expressão da glicoproteína - P através de fármacos anticancerígenos na membrana plasmática. Estímulo directo da transcrição da mARN de P-gp por alteração da translocação nuclear de vários factores transcripcionais. Ocorre modulação de processo epigenéticos onde se incluem a metilação do ADN e a acetilação das histonas, que afectam a acessibilidade de todos os factores transcripcionais, promovendo a região d eterminante de síntese de mARN. Consequentemente, estes fármacos também afectam a post -transcrição especialmentede uma proteína cuja função é favorecer a ligação entre as membranas plasmáticas e os filamentos de actina, , como é o caso da proteína ezrina/ra dixina/moesina (ERM). Figura adaptada (Kobori, Harada et al. 2014). 2014|Ana Filipa Ferreira 29 Adicionalmente, foram realizadas outras experiências com DEX, que pertence ao grupo de fármacos que apresentam acção anti-inflamatória com várias aplicações clínicas como em tratamentos de asma, artrite reumatóide, myasthenia gravis e também são muito utilizado como auxiliares na terapia anticancerígena. Dinis et al. (2006) evidenciaram que este composto aumenta a expressão e actividade da P-gp nos intestinos e pulmões e, portanto, resulta numa diminuição de PQ dentro das células pulmonares, com um consequente aumento da excreção fecal, demonstrando-se uma diminuição da mortalidade e morbilidade celular em culturas pulmonares. As células apresentaram uma menor peroxidação lipídica e menor conteúdo de grupos carbonilos, além de uma normalização da actividade da mieloperoxidase, resultando num aumento do tempo de vida das mesmas. O mecanismo proposto para o fenómeno da indução e consequente efluxo do PQ está representado na figura 10 (Dinis-Oliveira, Duarte et al. 2006, DinisOliveira, Remiao et al. 2006). Figura 10. : Esquema representativo do mecanismo proposto para o efluxo do paraquato (PQ) pela glicoproteínaP (P-gp). GR, receptor de glucocorticóides; MDR, gene de resistência a multifármacos; DEX, dexametasona. Figura adaptada (Dinis-Oliveira, Remião et al. 2006). 2014| Ana Filipa Ferreira 36 2014|Ana Filipa Ferreira 37 2. OBJECTIVOS DO TRABALHO A P-gp é uma proteína de transporte capaz de originar o efluxo de xenobióticos, onde se incluem compostos farmacologicamente activos e pesticidas. A expressão desta proteína de efluxo nas membranas de órgãos que participam na absorção e eliminação confere uma protecção especial às células, nomeadamente protecção na entrada e consequente acumulação de tóxicos dentro das mesmas. A indução da expressão ou aumento da actividade da P-gp poderá ser um via de tratamento eficaz em situações de intoxicações por substratos desta da proteína de transporte. Por este motivo, a presente tese de mestrado teve como objectivo determinar os níveis de expressão e actividade da P-gp na presença de um agente indutor. O trabalho laboratorial foi constituído por diferentes partes, partindo sempre do mesmo agente indutor, a tioxantona TX5, e variando-se as restantes condições (tipo de ensaio, células, concentrações de TX5 e exposição à TX5). Paralelamente foi também objectivo validar um método de análise e quantificação de TX5. Foram objectivos desta tese os seguintes:  Avaliação da expressão da P-gp em linfócitos T de sangue periférico de dadores saudáveis expostos 24 horas com TX5 em concentrações de 20 µM e 80 µM, utilizando o anticorpo UIC2 conjugado com FITC;  Avaliação da actividade da P-gp em linfócitos T de sangue periférico de dadores saudáveis, através da incorporação do substrato fluorescente RHO 123, na presença e na ausência de um inibidor da bomba de efluxo, o verapamilo, usando TX5 (em duas concentrações, 20 µM e 80 µM, por 24 horas) como agente indutor;  Avaliação da actividade da P-gp num estudo piloto in vivo com ratos Charles River, em que metade dos animais se administrou, por via oral, TX5 e digoxina e aos restantes apenas digoxina. O perfil farmacocinético da digoxina foi avaliado tendo sido recolhidas amostras de plasma durante 12 horas após a administração dos compostos. Deste modo, pretendeu-se comparar a farmacocinética da digoxina em animais tratados com e sem o indutor TX5 e relacioná-la com o aumento da actividade da P-gp;  Validação do método analítico de HPLC para análise e quantificação do composto indutor da P-gp, a TX5, em soro humano. 2014| Ana Filipa Ferreira 38 2014|Ana Filipa Ferreira 39 Parte III Material e Métodos 2014| Ana Filipa Ferreira 40 2014|Ana Filipa Ferreira 41 3. MATERIAIS E MÉTODOS NO ESTUDO DA GLICOPROTEÍNA-P NA PRESENÇA DE UM INDUTOR, TX5 Neste capítulo são apresentados todos os materiais necessários e quais as técnicas executadas para desenvolvimento deste trabalho laboratorial. 3.1 Síntese da TX5 A TX5 foi sintetizada pelo laboratório de química orgânica da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto. Derivado de xantona dihidroxilada, sintetizada por métodos clássicos descritos por Castanheiro et al. (2007), TX5 ou 3, 6-dihydroxy-9Hxanthen-9-one foi obtida pela ciclização de 2,2´- benzofenonas dioxigenadas através de um processo de desidratação (90% de rendimento) (Pedro, Cerqueira et al. 2002, Castanheiro, Pinto et al. 2007). Foi caracterizada por métodos espectrofotometricos e a sua purificação foi determinada por HPLC com detector diode-array onde se obteve 95% de pureza (Castanheiro, Pinto et al. 2007). 3.2 Estudo in vitro com linfócitos T humanos Este estudo incluiu amostras de sangue total, proveniente de dadores saudáveis, de ambos os sexos, entre 20-30 anos de idade. As recolhas foram feitas no laboratório de análises clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto. Todas as amostras foram recolhidas de dadores voluntários e devidamente informados. 3.2.1 Isolamento de linfócitos As técnicas de isolamento e cultura foram baseadas em protocolos anteriormente testados (Ponte, Carvalho et al. 2011, Vilas-Boas, Silva et al. 2011). Todos os parâmetros aqui aferidos foram previamente testados e optimizados. Foram colhidos aproximadamente 12 ml de sangue de cada dador para tubos com anticoagulante, heparina e lítio. O volume de sangue recolhido foi o mínimo possível para se fazer o isolamento segundo o protocolo HISTOPAQUE® 1077. 2014| Ana Filipa Ferreira 42 Todos os procedimentos realizados tiveram em conta condições de assepsia e esterilidade adequados à cultura celular e, portanto, foram realizados numa câmara de fluxo laminar vertical. Reagentes: • HISTOPAQUE® 1077 (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO USA); • PBS (Phosfate Buffered Saline solution – AccuGene, laboratórios Lanza, Bélgica); • RPMI 1640 (Sigma) suplementado com 15% de soro bovino fetal (FBS) (GIBCO Invitrogen, Laboratórios Lenexa, KS), antibiótico (10.000 unidades/ml de penicilina e 10.000 µg/ml de estreptomicina) (GIBCO) e com 29 mg/ml de LGlutamina (Sigma); • TX5 com concentração stock [TX5] 50 mM em dimetilssulfóxido (DMSO; • DMSO (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO USA). Material: • Tubos de heparina/lítio; • Tubos de centrífuga de fundo côncavo; • Pipetas de vidro; • Pompete; • Centrifuga (centrifuge 5810R); • Câmara de fluxo laminar vertical. Procedimento:  A separação dos constituintes do sangue pelo método de histopaque baseia-se no gradiente de densidades. A solução de HISTOPAQUE® 1077 é uma solução de polissacarose e diatrizoato de sódio com densidade de 1,077±0,001 g/ml e pH 8.89.0;  A solução de HISTOPAQUE® 1077 deve ser retirada do frio 1 hora antes de cada experiência, para que fique à temperatura ambiente; 2014|Ana Filipa Ferreira 43  Em tubos de fundo côncavo, e com o máximo de cuidado, adiciona-se o mesmo volume de sangue e HISTOPAQUE® 1077 (+/- 3 ml), de modo a que não se misturem (histopaque em baixo e sangue em cima);  Centrifuga-se durante 30 minutos, a 890xg, à temperatura ambiente;  Após a centrifugação é possível visualizar diferentes fases (imagem 12), em que a zona dos linfócitos (e outras células mononucleares) corresponde a um anel branco bem definido. Esse anel é recolhido com uma pipeta de vidro para outro tubo de fundo côncavo;  Lavam-se as células com 10 ml de PBS;  Centrifugam-se novamente durante 10 minutos, a 890xg, à temperatura ambiente;  Rejeita-se o sobrenadante e as células são ressuspensas em 2 ml de meio RPMI 1640. 3.2.2 Viabilidade celular pelo método da exclusão do azul de tripano Reagentes: • Azul de Tripano 0,4% (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO USA). Material: • Câmara de Neubauer; • Microscópio óptico; Figura 12: Imagem representativa do método de separação de células mononucleares a partir do sangue e através do HISTOPAQUE® 1077. São facilmente visualizáveis as diferentes camadas de células mononucleares, em que os linfócitos representam a maioria, o plasma aparece no topo e os eritrócitos encontram - se depositados no fundo. Imagem retirada (Sigma-Aldrich 2003). 2014| Ana Filipa Ferreira 44 • Pipeta de 100 μl; • Pipeta de 20 μl; • Eppendorfs. Procedimento:  Dilui-se 25 μL da suspensão de linfócitos obtida no ponto anterior em 100 μl de azul de tripano (diluição 1:5) num eppendorf, homogeneizando-se bem a suspensão resultante com a pipeta, fazendo up and down;  Com a ajuda da pipeta de 20 μL coloca-se a suspensão celular na câmara de Neubauer;  Procede-se à contagem do número de células vivas e mortas (células coradas a azul são células não viáveis, uma vez que a desintegração da membrana celular permite a entrada do corante para o interior das células) com ajuda do microscópio óptico;  Apenas são contadas as células que se encontram nos quadrados grandes dos cantos superiores e inferior e faz-se a média de células por quadrado. A figura 13 ilustra o procedimento efectuado. Figura 13: Técnica de contagem celular em câmara de Neubauer. A. Método de colocação da suspensão celular pelos bordos da câmara sob a lamela. B. Esquemas do interior da câmara, os 4 quadrados dos cantos são onde se contam as células. C. Método de contagem das células. D. As células em que é possível ver o núcleo são contadas (células à esquerda e no centro), células em que não se visualizam os núcleos são descartáveis. Figura original. 2014|Ana Filipa Ferreira 45  Para se calcular o número de células por mililitro multiplica-se a média do número de células por quadrado por 10000, tendo em conta o seguinte: - 1 ml = 1 cm3 - 1 cm3 = 1x103 mmm3 = 1000 mm3, então 1 ml = 1000 mm3 - o volume da câmara é de 0,1 mm3 Assim, o número de células por mililitro é: Nº células/ml = Média de células por quadrado x 10000 Como a suspensão celular é normalmente diluída para facilitar a contagem com azul de tripano (neste caso na proporção de 1:5) é necessário entrar com o factor de diluição para obter o número de células. Assim: Nº de células/ml = Média do nº de células por quadrado × factor de diluição ×10000 A viabilidade celular é calculada da seguinte forma: Viabilidade celular (%) = Nº de células vivas/ Nº de células totais (mortas+vivas) x 100 3.2.3 Cultura e exposição dos linfócitos ao indutor da glicoproteína-P, TX5 Reagentes • Solução stock de TX5 a 50 mM; • RPMI 1640. Material • Tubos de cultura com fundo em rampa; • Estufa a 37ºC e 5% CO2; • Pipeta de 10 μL; • Câmara de fluxo laminar vertical. 2014| Ana Filipa Ferreira 52  Adicionam-se aos linfócitos 5 μl de cada anticorpo, CD45-PE (marcação de leucócitos) e CD3-APC (marcação de linfócitos T) e completa-se o volume com PBS com 10% de FBS até aos 50 μl. As amostras são incubadas a 4°C durante 30 minutos;  Após marcação, as células são tratadas com a Solução AI - Acumulação Inibida (igual à anterior – tabela 4) e incubadas em banho-maria, a 37°C, com agitação constante durante 30 minutos;  As células são lavadas com PBS com 10% de FBS apenas uma vez;  Expõem-se as células à TX5 em RPMI para ocorrer o efluxo (AI/E) (exposição aguda);  A solução foi preparada da seguinte forma: (Preparação de uma solução intermédia de TX5 com concentração 100µM em RPMI) Tabela 5: Solução de ACTIVAÇÃO preparada com o indutor TX5 e RPMI. Solução de activação Volume [TX5] 100µM Volume RPMI Células controlo ____________________ 1 ml Células expostas a TX5 20µM 200µl 800µl Células expostas a TX5 80µM 800µl 200µl  As amostras são incubadas em banho-maria, a 37°C, com agitação por 60 minutos;  As células são lavadas duas vezes e suspensas em 500 µl de PBS com 10% de FBS e aguardam no gelo até à leitura no citómetro. 3.2.10 Determinação da fluorescência por citometria de fluxo O equipamento utilizado para determinação dos níveis de fluorescência de RHO 123 e dos restantes anticorpos foi o BD AccuriTM C6 flow cytometer (figura15). Foram adquiridas aproximadamente 20.000 células por cada amostra. O sinal de fluorescência é recolhido em modelo de logaritmo e os dados são analisados pelo software BD Accuri. 2014|Ana Filipa Ferreira 53 A avaliação da actividade da P-gp é determinada comparando níveis de intensidade de fluorescência intracelular na presença e ausência do inibidor, sendo expressa da seguinte forma: % 𝐒𝐒𝐒𝐒í𝐝𝐝𝐒𝐒 𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑 =𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌 Acumulação de RHO (𝐀𝐀𝐌𝐌) – 𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌 efluxo da RHO (𝐀𝐀𝐌𝐌/𝐄𝐄) 𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌 Acumulação de RHO (𝐀𝐀𝐌𝐌)𝑿𝑿 𝐑𝐑𝟏𝟏𝟏𝟏 A população de linfócitos foi identificada e separada das restantes células mononucleares com base no seu tamanho (FSC – Forwardscatter) e na sua granulosidade (SSC – Side scatter), através de um polígono seleccionado – P1. As células marcadas com anticorpos CD3-APC e CD45-PE foram determinadas em FL4 e FL2, respectivamente, sem que nenhuma fluorescência interferisse com outra. Inicialmente, as células foram avaliadas pela técnica de exclusão do iodeto de propídeo, que emitiu na intersecção do canal FL2 com FL3 (dados não apresentados), permitindo saber que a fluorescência detectada pertencia a células viáveis. Figura 15: Imagem de equipamento BD AccuriTM C6 flow cytometry e do software utilizado neste trabalho. Figura retirada de (Biosciences 2012). 2014| Ana Filipa Ferreira 54 3.2.11 Análise estatística Os dados foram adquiridos e analisados pelo software de BD Accuri C6 e posteriormente tratados recorrendo ao programa GraphPad Prism®, versão 6 (GraphPad Software, San Diego, CA). Procedeu-se à análise estatística dos valores da média geométrica da intensidade de fluorescência. As diferenças (na expressão e na actividade da P-gp) entre os grupos que foram avaliadas recorrendo ao método não paramétrico de Kruskal-Wallis (one-way ANOVA on ranks) seguido pelo post-hoc teste de Dunn (* p <0,05; **** p <0,0001 versus controlo e ## p <0,01 versus TX5 20 μM), considerando estatisticamente diferente um valor de p <0,05. 3.3 Estudo in vivo com ratos Charles River O estudo in vivo realizado é um estudo piloto que teve o objectivo de avaliar o efeito do indutor da P-gp (TX5) sobre a farmacocinética da digoxina. Este estudo foi feito em 10 ratos Charles River, machos e adultos, com média de peso de 288,5 g. Todos os animais fizeram jejum de 12 horas, para não interferir com o estudo da farmacocinética e foram mantidos nas condições padrão (12 /12 h de luz/escuro, 22°C, humidade de 50/60%), respeitando todos os seus direitos, segundo Institute for Laboratory Research e a legislação portuguesa. A metade dos animais foi administrado por via oral TX5 (12 mg/ml) e digoxina (0,1 mg/ml) através de uma cânula, veiculados numa solução aquosa, e aos restantes animais apenas foi administrada digoxina (0,1 mg/ml). Para facilitar a administração da solução aquosa, os animais foram colocados em exsicador com algodão embebido em isoflurano para os manter adormecidos. Foram colhidas amostras de sangue através da veia da cauda (inicialmente a cauda foi colocada no banho a 40°C para evitar a dor) para eppendorfs com heparina, durante 12 horas para avaliar as diferenças entre os dois tratamentos. No final das 12 horas de colheitas, os animais foram sacrificados por decapitação (Baltazar, Dinis-Oliveira et al. 2014). Reagentes: • HBSS++ (GIBCO, Paisley UK); • Digoxina (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO USA); 2014|Ana Filipa Ferreira 55 • Cloridrato de TX5 (fornecido pelo laboratório de química orgânica da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto); • Água destilada; • Isoflurano 100% (p/p) (Abbot house, Berkshire UK); • Heparina sódica 5000 UI/ml (Braum medical, Lda, Queluz de Baixo Portugal). Material: • Banho-maria (40°C); • Agulhas e seringas; • Algodão; • Eppendorfs com 10µl de heparina para recolha de sangue. Preparação das soluções: Tendo em conta que a administração máxima recomendável de solução é de 400 g/ml, por cada Kg de peso podemos administrar 2,5 ml de solução de compostos a testar: 𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫𝑫 = (0,25 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑘𝑘𝑚𝑚)/(2,5 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑘𝑘𝑚𝑚) = 0,1𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑻𝑻𝑿𝑿𝑻𝑻 = (30 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑘𝑘𝑚𝑚)/(2,5 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑘𝑘𝑚𝑚) = 12 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚 Para um volume de 1,5 ml de solução: • Digoxina (ratos tratados apenas com digoxina) 0,1 mg/ml x 1,5 ml = 150 µl (retirar de uma solução de concentração intermédia [Digoxina] = 1 mg/ml) e dissolver em água destilada (vf=1,5 ml). • TX5 (ratos tratados com os dois compostos) 12mg/ml x 1,5 ml = 18 mg Solução para administração: 18mg de TX5 + 150 µl de digoxina dissolvida em HBSS+/+ (vf=1,5 ml). 2014| Ana Filipa Ferreira 56 Segundo o peso dos animais e, sabendo que a quantidade máxima admissível de administração é de 400 g/ml, respeitou-se o seguinte: Tratamento Peso (g) do animal Volume da solução (µl) Digoxina 275 687 Digoxina 265 662 Digoxina 292 730 Digoxina 315 787 Digoxina 320 800 Digoxina+TX5 265 662 Digoxina+TX5 275 687 Digoxina+TX5 278 695 Digoxina+TX5 290 725 Digoxina+TX5 310 775 Tempo de recolha de amostra (minutos): 0 20 40 60 90 120 180 240 360 480 No final, o sangue é centrifugado a 3000rpm por 10 minutos, e é armazenado o sobrenadante (plasma) a -20°C. 3.3.1 Análise instrumental e estatística Todas as amostras de plasma foram analisadas em AutoAnalyzer (PRESTIGE) 24i, PZ Cormay S.A. A análise de dados foi conseguida através do Software GraphPad 6.0 e o Microsoft Excell 2010. Foi aplicado o teste t student e os valores de área sob a curva (AUC) foi determinada por uma aproximação não compartimental usando o software Winnonlin. 2014|Ana Filipa Ferreira 57 3.4 Validação do método de análise e quantificação de TX5 em HPLC A validação do método de quantificação de xantonas por HPLC tem sido reportada por alguns autores (Teixeira, Afonso et al. 2008, Pontes, Guedes de Pinho et al. 2009, Sousa, Palmeira et al. 2013, Kumar, Tandon et al. 2014). Desta forma, tentou-se optimizar todas as condições para validar um novo método de análise e quantificação de TX5 por HPLC para futuras experiências com o composto. Todos parâmetros usados para a validação do método analítico foram descritos em Guidelines (ICH 1997). Reagentes: • Metanol HPLC-grade ( Merck KGaA, Alemanha); • Soro humano; • Água ultra-pura; • TEA (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO USA); • DMSO (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO USA). Material: • HPLC Gilson Dilutor 401; • Eppendorfs; • Filtros 45µm; • Seringas; • Ultra-sons ou corrente de azoto; • Pipetas de 20, 100 e 1000 μl. 3.4.1 Preparação dos padrões de TX5 A. Fazer soluções intermédias de TX5 em DMSO a partir de uma solução stock [TX5]= 50 mM. Para preparar as concentrações entre 0,5-150 µM, são necessárias soluções intermédias 40 vezes mais concentradas devido ao factor de diluição (volume final de 200 μl/volume inicial de 5 μl=40x). Ou seja, as concentrações intermédias preparadas foram as seguintes (µM): 2014| Ana Filipa Ferreira 58 B. Preparação:  195 μl de soro + 5 μl de TX 5 nas respectivas concentrações intermédias;  Adição 600 μl de metanol;  Centrifugação a 13000rpm, 10 minutos, 4°C;  Filtrar o sobrenadante com filtro 45 µm e injecção no HPLC. 3.4.2 Condições instrumentais e cromatográficas A análise por HPLC em fase reversa foi realizada com o equipamento Gilson Dilutor 401, com sistema de bomba modelo 302 e com um detector espectrofotometro UV Gilson. A separação foi conseguida com coluna Acer 5 C18, 5 µm de diâmetro das partículas e 250 x 4,6 mm de dimensões. A análise de cromatografia líquida foi feita com eluição isocrática e as condições da fase móvel foram 90:10 (v:v) metanol/água contendo 1% de trietilamina (TEA), com fluxo de 1ml/minuto. O volume de injecção da amostra foi de 50 µl e a detecção foi feita no comprimento de onda de 255 nm. O software de análise de dados foi o software Clarity®. 3.4.3 Validação do método Linearidade A linearidade do método foi determinada analisando e relacionando as áreas dos picos (Y) com as respectivas concentrações de TX5 (X) nas amostras. Foram realizadas Branco 0,5 1 2 5 10 20 40 80 100 150 Branco 20 40 80 200 400 800 1600 3200 4000 6000 X 40 2014|Ana Filipa Ferreira 59 curvas de calibração na gama de concentrações entre 0,5 e 150 μM, em duplicado (11 padrões de concentrações diferentes: 0; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0 e 150,0 μM). Os declives foram calculados tendo em conta a média de cinco curvas de calibração preparadas em 5 dias consecutivos, usando o Software GraphPad 6.0. Precisão inter-dia (método) A precisão inter-dia do método foi determinada por injecção e análise, durante 5 dias consecutivos, de soluções padrão preparadas diariamente com as 11 concentrações consideradas para a curva de calibração (0;0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0 e 150,0 μM). Exactidão A exactidão foi calculada da seguinte forma: 𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸ã𝑜𝑜 (%)=(𝐶𝐶𝑜𝑜𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸çã𝑜𝑜 𝑚𝑚é𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸 𝐶𝐶𝐸𝐸𝑚𝑚𝐶𝐶𝑐𝑐𝑚𝑚𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸)−(𝐶𝐶𝑜𝑜𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸çã𝑜𝑜 𝐶𝐶𝑜𝑜𝑚𝑚𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸𝑚𝑚) (𝐶𝐶𝑜𝑜𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸çã𝑜𝑜 𝐶𝐶𝑜𝑜𝑚𝑚𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸𝑚𝑚) 𝐸𝐸 100 Precisão intra-dia (estabilidade do equipamento) A precisão intra-dia do HPLC foi determinada injectando e analisando 5 vezes no mesmo dia os 11 padrões de uma curva de calibração (0;0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0 e 150,0 μM), ou seja, foram feitas 5 injecções consecutivas de uma mesma curva de calibração (injecção de cada padrão em duplicado). Precisão intra-dia (estabilidade do método) A precisão intra-dia do método foi determinada injectando e analisando, no mesmo dia, 5 replicados de cada um dos 11 padrões da curva de calibração (0;0,5; 1,0; 2,0; 2014| Ana Filipa Ferreira 60 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0 e 150,0 μM), ou seja, injecção consecutiva e no mesmo dia de 5 curvas de calibração diferentes. Estabilidade da amostra I. Preparar amostras de TX5 em soro (1, 10 e 100 μM) em triplicado; II. Adição de metanol numa proporção de 3:1 metanol/amostra III. Centrifugação das amostras a 13000rpm, 10 minutos, 4°C; IV. Filtrar o sobrenadante com filtro de 45 μm; V. Injecção no HPLC e armazenar no imediato as restantes amostras (sobrenadante) a 4ºC durante 7 dias; VI. Após os 7 dias, todas amostras armazenadas a 4ºC são injectar novamente no HPLC. Recuperação Adição de TX5 antes da precipitação proteica A1 Adição de TX5 após a precipitação proteica A2 Injecção no HPLC I. 195 μL de soro + 5 μL de TX5 40, 400 e 4000 μM (concentração final: 1, 10 e 100 μM) em triplicado; II. Adição 600 μL de metanol; III. Centrifugação 13000rpm, 10 minutos, 4°C; IV. Filtrar o sobrenadante. I. 195 μL de soro. Amostras em triplicado; II. Adição 600 μL de metanol; III. Centrifugação 13000rpm, 10 minutos, 4°C; IV. Recolha do sobrenadante e adição de 5 μL TX5 40, 400 e 4000 μM; 2014|Ana Filipa Ferreira 61 Limite de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) O limite de detecção ou limit of detection (LOD) é a menor concentração de analíto que pode ser detectada pelo método de análise, mas que não pode ser quantificada de forma apropriada. Frequentemente definem-se limites de detecção (LOD) em termos do desvio-padrão de medidas do branco. O limite de quantificação ou limit of quantification (LOQ) é a menor concentração de amostra, que pode ser quantitativamente detectada com precisão e exatidão aceitáveis, sob as condições experimentais adoptadas. As fórmulas de cálculo para LOD e LOQ são as seguintes: 𝑳𝑳𝑳𝑳𝑫𝑫 =3.3 𝜎𝜎 𝑆𝑆 𝑳𝑳𝑳𝑳𝑳𝑳 = 10 𝜎𝜎 𝑆𝑆 Legenda: 𝜎𝜎=desvio padrão de resposta S = declive da curva de calibração • A estimativa do desvio padrão (σ) pode ser efectuada de diversas formas, por exemplo:  Baseada no desvio padrão do branco: a medição da amplitude da resposta analítica é realizada pela análise de um número adequado de amostras em branco (20 amostras em duplicado) e do cálculo do respectivo desvio padrão dessas respostas. • O declive S é estimado da curva de calibração. 3.4.4 Análise estatística Todos os dados foram tratados usando o Software GraphPad 6.0 e o Microsoft Excell 2010. 2014| Ana Filipa Ferreira 68 os resultados foram satisfatórios, obtendo-se uma população de linfócitos densa e bem definida aquando a leitura no citómetro. 4.1.3 Estudo da expressão e actividade por citometria de fluxo A citometria de fluxo é uma técnica que avalia a dispersão da luz provocada pelas células em suspensão em meio líquido, através de um fluxo, em que esta dispersão é dependente das características físicas e químicas de cada célula (Biosciences 2000). Como descrito em 3.2.6, recorreu-se ao equipamento de citometria de fluxo para estudar a expressão e actividade da P-gp em linfócitos T, na presença e ausência de um indutor. Desta forma, para analisar as células de interesse no citómetro avaliaram-se os dados relativos ao seu tamanho (FCS) e à sua granulosidade (SSC). A detecção da fluorescência da RHO 123 e dos anticorpos acoplados a fluorocromos utilizados foi realizada de acordo com a tabela 6. Os resultados obtidos para a emissão de fluorescência foram analisados através de gráficos que relacionam a contagem de células (eixo dos Y) com a intensidade de fluorescência emitida (eixo dos X). Estes gráficos são designados por histograma (Biosciences 2012). Tabela 6: Compostos com capacidade de emitirem cor, usadas nos vários ensaios com respectivos canais de detecção de fluorescência (Biosciences 2012). O programa de aquisição e análise de dados dos histogramas obtidos em citometria de fluxo, software de BD Accuri 6C, permitiu seleccionar os linfócitos com base na sua granulosidade e no seu tamanho como se observa na figura 17 – A. A partir deste resultado (depois de confirmar que são células viáveis através de ensaio com o iodeto de propídeo), as células foram marcadas com o anticorpo CD45-PE para marcar leucócitos (onde se incluem os linfócitos T) e a fluorescência foi detectada em FL2. Como visível na Composto com fluorescência Canal de detecção RHO 123 FL1 UIC2 – FITC FL1 CD3 – APC FL4 CD45 – PE FL2 Iodeto de propídeo FL2/FL3 2014|Ana Filipa Ferreira 69 figura 17-B, da totalidade de células isoladas quase 100% são positivas para este anticorpo. A utilização do anticorpo UIC2-FITC marca a proteína de transporte P-gp permitindo excluir as células que no grupo anterior (figura 17-A) não expressam esta proteína, com detecção ocorre em FL1 (Chaudhary, Mechetner et al. 1992, Henmi, Yoshida et al. 2008, Vilas-Boas, Silva et al. 2011). Após esta selecção, o estudo da actividade da P-gp na presença do seu substrato RHO 123 e com CD3-APC (marcador de linfócitos T) para que os resultados de fluorescência sejam restritos aos linfócitos T. Em todas as amostras marcadas com estes anticorpos (CD3 e CD45), a população de linfócitos T representa pelo menos 65% da população total detectada (figura 17C). Estes resultados comprovam que os linfócitos T representam a maioria das células seleccionadas segundo as condições utilizadas, comprovando que o protocolo é adequado ao isolamento dos linfócitos T e avaliação da actividade da P-gp nesta população celular. A ausência de autofluorescência, interferente neste estudo, foi avaliada em células sem qualquer tipo de tratamento. Figura 17: Gráficos representativos da selecção da população de linfócitos T viáveis: ASeparação da população de linfócitos com base no seu tamanho (FSC) e granulosidade (SSH), circunsc rita por um polígono delimitado a azul; BDentro do grupo anterior, as células são detectadas em FL2 para determinar células CD45+ (leucócitos) CDentro das células anteriores, marcaramse aquela s que são positivos para o anticorpo CD3APC (70,7%) , ou seja, os linfócitos T delimitados pela linha a vermelho (R2). A expressão da Pgp é detectada em FL1 onde são seleccionados apenas os que expressam Pgp nas suas membranas, através d o anticorpo anti-P-gp UIC2 - FITC. 2014| Ana Filipa Ferreira 70 4.1.4 Expressão da glicoproteína-P em células CD45+ e CD3+ expostas à TX5 durante 24 h Para a expressão da P-gp usou-se o anticorpo anti-P-gp, UIC2FITC, com canal de detecção em FL1. Este protocolo, descrito em pormenor em 3.2.7, baseou-se em procedimentos anteriores (Silva, Carmo et al. 2011). Neste ensaio, as células foram marcadas com CD3 e CD45 e foram avaliadas em relação à expressão através da marcação positiva para UIC2. Os resultados expressos como média ± desvio padrão, são provenientes da análise, em duplicado, de células obtidas de 10 dadores (6 do sexo feminino e 4 do sexo masculino), figura 18. Os valores de fluorescência emitidos nas células em estudo constam da tabela seguinte: Controlo TX5 20 µM TX5 80 µM Estudo da expressão com marcação de anticorpos: CD45 + e CD3 + 100% 109,203% 120,926% Figura 18: Gráfico representativo da análise da expressão de glicoproteína –P, nas concentrações de 20 μ M e 80 μM de TX5, com a marcação de anticorpo anti P-gp, UIC2 em células CD3+ e CD45+. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão e são provenientes da análise, em duplicado, de células obtidas de 10 dadores (6 do sexo feminino e 4 do sexo masculino). As comparações estatísticas foram feitas utilizando o método não paramétrico de K ruskal-Wallis (one-way ANOVA on ranks), seguido pelo post - hoc teste de Dunn (* p <0,05; **** p <0,0001 versus controlo; ## p <0,01 versus TX5 20 μM). 2014|Ana Filipa Ferreira 71 Da análise da figura 18 conclui-se que a expressão da P-gp em linfócitos T induzida pela TX5 nas concentrações de 20µM e 80 µM diferem estatisticamente do controlo (p <0,05 e p <0,0001, respectivamente). Além disso, a indução da expressão pela TX5 na concentração de 80 µM é estatisticamente diferente da expressão induzida pela concentração mais baixa de 20 µM (p <0,01), e mais elevada. Assim, pode dizer-se que a concentração mais alta de TX5 é mais eficiente em induzir a expressão da P-gp, nas condições testadas. No entanto, não se pode concluir que a indução da expressão da P-gp em linfócitos T é dependente da concentração de TX5, apesar destes resultados o sugerirem. Futuramente, poder-se-ão realizar mais estudos relativos à expressão de P-gp testando outras concentrações de TX5 e até utilizar outros modelos celulares, no sentido de entender se o mecanismo de indução é dependente da concentração de TX5. Em estudos realizados por Silva et al. (2014) em células caco-2, com o objectivo de verificar o poder indutor da TX5 relativamente à expressão da P-gp, expôs-se as células à TX5 na concentração de 20 µM, usando-se o mesmo protocolo que neste trabalho. Os resultados mostraram que a TX5 nesta concentração induz a expressão de uma forma bastante significativa em análise estatística, 142,7% em comparação com o controlo 100%. Uma vez que neste estudo a expressão foi de apenas 9% (109,203%), sugere-se que as células caco-2,possivelmente,são mais sensíveis ao efeito indutor da TX5 em comparação com os linfócitos T (Silva, Sousa et al. 2014). De qualquer forma, mais estudos deverão ser feitos. 4.1.5 Expressão da P-gp em células em P1 expostas ao TX5 durante 24 h O estudo da expressão foi determinada com UIC2-FITC, como no ensaio anterior, à excepção da incubação prévia com anticorpos CD3-APC e CD45-PE, e neste caso, foram usados valores de fluorescência obtidos em P1, ou seja, todas as células que foram seleccionadas em primeira fase (figura 17-A) Esta determinação de fluorescência em células obtidas em P1 deveu-se ao facto das células apresentarem valores mais altos de autofluorescência que a própria fluorescência de UIC2-FITC. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão e são provenientes da análise, em duplicado, de células obtidas de 10 dadores (6 do sexo feminino e 4 do sexo masculino), como se observa na figura 19. 2014| Ana Filipa Ferreira 72 Em resumo, temos os seguintes resultados da expressão da P-gp com e sem marcação de anticorpos: Mais uma vez, verificou-se que não há diferenças entre a expressão induzida com TX5 em células marcadas com anticorpos e a expressão avaliada em células seleccionadas em P1.Verificam-se, novamente, diferenças significativas na expressão da P-gp induzida pela TX5 a 20µM e a 80 µM (p <0,01 e p <0,0001, respectivamente) em relação ao controlo, e uma diferença estatística entre a menor e a maior concentração testada (p <0,05). Controlo TX5 20 µM TX5 80 µM Estudo da expressão com marcação de anticorpos: CD45+ e CD3+ 100% 109,203% 120,926% Estudo da expressão sem marcação de anticorpos 100% 109,452% 121,16% Figura 19 : Gráfico representativo da análise da expressão de glicoproteína –P, nas concentrações de 20 μM e 80 μM de TX5, com a marcação de anti corpo anti P-gp, UIC2 em células seleccionadas em P1. Os resultados são expressos como média ± d esvio padrão e são provenientes da análise, em duplic ado, de células obtidas de 10 dadores (6 do sexo feminino e 4 do sexo masculino). As comparações estatísticas foram feitas utilizando o método não paramétrico de Kruskal -Wallis (oneway ANOVA on ranks), seguido pelo post -hoc teste de Dunn (** p <0,01; **** p <0,0001 versus controlo; # p <0,05 versus TX5 20 μM). 2014|Ana Filipa Ferreira 73 4.1.6 Actividade da glicoproteína-P em células CD45+ e CD3 +expostas ao TX5 durante 24 h Uma forma de avaliar a actividade da P-gp consiste no estudo da capacidade de efluxo da P-gp retirar um substrato fluorescente, 5 µM RHO 123, do interior celular. Este substrato apresenta características lipofílicas que lhe permitem a entrada nas células por difusão passiva, a favor do gradiente de concentração, mas o seu efluxo ocorre através da P-gp. Neste trabalho, o efluxo da RHO 123 foi avaliado na presença e ausência de um inibidor da actividade da P-gp, o verapamilo 30 µM, que sendo também um substrato, é inibidor da P-gp por um mecanismo competitivo, sem interferir com a ligação do ATP (Chaudhary, Mechetner et al. 1992). A fase de inibição do transporte também é devida à azída sódica 10 mM que impede a formação de novas moléculas de ATP, quando adicionada na solução AI. A fórmula de cálculo convencionada para o estudo da actividade da P-gp nos linfócitos T, descrita em 3.2.4.4, foi baseada em estudos anteriores realizados por Vilas Boas et al. (2011) (Vilas-Boas, Silva et al. 2011). % 𝐒𝐒𝐒𝐒í𝐝𝐝𝐒𝐒 𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑𝐑 =𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌 Acumulação de RHO (𝐀𝐀𝐌𝐌) – 𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌 efluxo da RHO (𝐀𝐀𝐌𝐌/𝐄𝐄) 𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌𝐌 Acumulação de RHO (𝐀𝐀𝐌𝐌)𝑿𝑿 𝐑𝐑𝟏𝟏𝟏𝟏 Os resultados obtidos no estudo da actividade em linfócitos T marcados com os respectivos anticorpos são expressos como média ± desvio padrão e são provenientes da análise, em duplicado, de células obtidas de 9 dadores (5 do sexo feminino e 4 do sexo masculino), como demonstra a figura 20. 2014| Ana Filipa Ferreira 74 Através da figura 20 é possível ver, em primeiro lugar, que a TX5 aumenta a actividade da P-gp de uma forma estatisticamente significativa, p <0,01 para 20 μM e p <0,0001 para 80 μM. Em segundo lugar, é possível verificar que não existe diferença na actividade da P-gp com as diferentes concentrações, o que é confirmado pelos resultados obtidos em relação às médias de fluorescência intracelular, que foram os seguintes: Controlo TX5 20 µM TX5 80 µM 100% 117,479% 126,233% Como se pode constatar a actividade da P-gp aumentou aproximadamente 17% na concentração de TX5 20 µM e aproximadamente 26% na concentração de 80 µM. Assim conclui-se que a TX5, nas concentrações testadas, induz a actividade da P-gp, embora esta não seja dependente da concentração do indutor para a variação das concentrações testadas. Figura 20: Gráfico representativo da análise da actividade da glicoproteína–P, nas concentrações de 20 μ M e 80 μM de TX5, com a marcação de anticorpos CD3 e CD45. Os resultados são expressos como m édia ± d esvio padrão e são provenientes da análise, em duplicado, de células obtidas de 9 dadores (5 do sexo feminino e 4 do sexo masculino). As comparações estatísticas foram feitas utilizando o método não paramétrico de Kruskal -Wallis (one-way ANOVA on ranks), seguido pelo post-hoc teste de Dunn (** p <0,01; **** p <0,0001 versus controlo). 2014|Ana Filipa Ferreira 75 Figura 21: Gráfico representativo da análise da actividade da glicoproteína –P, nas concentrações de 20 μ M e 80 μM de TX5, sem marcação de anticorpos. Os resultados são expressos como média ± d esvio padrão e são provenientes da análise, em duplicado, de células obtidas de 20 dadores (11 do sexo feminino e 9 do sexo masculino). As comparações estatísticas foram feitas utilizando o método não paramétrico de Kruskal -Wallis (one-way ANOVA on ranks), seguido pelo post-hoc teste de Dunn (**** p <0,0001 versus controlo) . 4.1.7 Actividade da glicoproteína-P em células em P1 expostas ao TX5 durante 24 h Numa fase de optimização do método, as células foram tratadas conforme o descrito em 3.2.8, não sendo no entanto marcadas como anticorpos específicos. As células analisadas neste caso foram as células seleccionadas em P1 (figura 17 A). Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão e são provenientes da análise, em duplicado, de células obtidas de 20 dadores (11 do sexo feminino e 9 do sexo masculino) como é possível observar na figura 21. Da análise da figura 21 verifica-se que, em termos estatísticos, os resultados são semelhantes aos anteriores: a actividade da P-gp induzida pela TX5 a 20 µM e a 80 µM não são significativamente diferentes, mas são significativamente diferentes da actividade da P-gp nas células controlo. 2014| Ana Filipa Ferreira 76 Controlo TX5 20 µM TX5 80 µM Estudo da actividade com marcação de anticorpos: CD45 + e CD3 + 100% 117,479% 126,233% Estudo da actividade sem marcação de anticorpos 100% 109,909% 122,531% Analisando os valores de fluorescência emitidos pela RHO 123 nestas células (P1) como consta na tabela acima verifica-se, mais uma vez, que não parece haver diferença significativa entre células marcadas com anticorpos e células não marcadas com anticorpos. Conclui-se, portanto, que a marcação com anticorpos específicos para linfócitos T é um passo que pode ser omisso, quando se pretende estudar a indução da Pgp segundo este protocolo (as células isoladas e seleccionadas em P1 muito provavelmente são na sua maioria linfócitos T). 4.1.8 Activação da glicoproteína-P em células CD45+ e CD3 +expostas ao TX5 durante os 60 minutos na fase de efluxo da Rhodamina 123 No estudo da activação as células, linfócitos T, são incubadas 24 horas na estufa, não sendo expostas ao indutor. Após a fase de acumulação inibida, ocorre a incubação (60 minutos) com TX5 nas concentrações de 20 µM e 80 µM em meio RPMI, sendo as células marcadas com os mesmos anticorpos que nos ensaios anteriores. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão e são provenientes da análise, em duplicado, de células obtidas de 9 dadores (5 do sexo feminino e 4 do sexo masculino), como demonstra a figura 22. 2014|Ana Filipa Ferreira 77 Os valores de fluorescência emitidos pela RHO 123 nas células em estudo foram os seguintes: A análise da figura 22 demonstra que existe diferença significativa entre a activação com o indutor TX5 e a activação nas células controlo (p <0,0001 para ambas as concentrações) e que não existem diferenças na activação da P-gp pelas diferentes concentrações de TX5 (p>0,05). A análise dos dados de fluorescência indica que a TX5 na concentração de 20 µM resulta num aumento da actividade neste estudo de cerca de 70% e de 54% para a concentração de 80 µM. Controlo TX5 20 µM TX5 80 µM Estudo da activação com marcação de anticorpos: CD45+ e CD3+ 100% 169,928% 154,235% Figura 22: Gráfico representativo da análise da activação de glicoproteína –P, nas concentrações de 20 μ M e 80 μM de TX5, com a marcação de CD3 e CD45. Os resultados são expressos como média ± d esvio padrão e são provenientes da análise, em duplicado, de células obtidas de 9 dadores (5 do sexo feminino e 4 do sexo masculino). As comparações estatísticas foram feitas utilizando o método não paramétrico de Kruskal -Wallis (one-way ANOVA on ranks), seguido pelo post-hoc teste de Dunn (**** p <0,0001 versus controlo). 2014| Ana Filipa Ferreira 84 concentração de TX5 (X) corresponde à gama de concentrações de 0,5 a 150 μM (11 padrões de concentrações diferentes): 0; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0 e 150μM A figura 25 representa o cromatograma obtido nas gamas de concentração utilizadas, 0,5-150 µM de TX5 incluindo o branco. O tempo de retenção foi de aproximadamente 13 minutos. A frente de solvente aparece com tempo de retenção diferente, aproximadamente 4 minutos. A linearidade foi calculada através das médias de 5 rectas de calibração preparadas em 5 dias consecutivos. Estes valores foram considerados adequados para verificar a linearidade da regressão que resultou na curva de calibração seguinte (figura 26): Y = 5,112*X + 0,7640 Figura 25: Cromatograma da respectiva gama de concentrações (0,5150µM incluindo o branco), após optimização de condições cromatogr áficas, com tempo de retenção do analíto de aproximadamente 13 minutos. A frente de solvente apresenta tempo de retenção de 4 minutos, aproximadamente. 2014|Ana Filipa Ferreira 85 Nesta análise, utilizaram-se as médias das áreas dos picos obtidas nos duplicados. A linearidade foi alcançada com um coeficiente de correlação (R2) mínimo de 0,99 em todo o intervalo de concentrações, indicando uma relação linear nesta gama, e o valor de desvio padrão residual como factor de resposta foi de 17,02%. O valor obtido de p <0,0001 nesta análise corresponde a uma curva de calibração com declive significativamente diferente de zero. Os números obtidos em X foram 13 e os obtidos em Y foram 20. A tabela 7 apresenta os valores estatísticos da recta obtida e são apresentados com 95% de intervalo de confiança. Tabela 7: Valores médios e valores com 95% de nível de confiança respectivamente à recta Y = 5,112*X + 0,7640 que apresentou correlação linear de R2≥0,99. Valores de ajuste Declive 5,112 ± 0,03143 Intercepção em Y quando X=0 0,7640 ± 1,695 Intercepção em X quando Y=0 -0,1495 1/Declive 0,1956 Com 95% de intervalo de confiança Declive 5,050 - 5,174 Intercepção em Y quando X=0 -2,558 - 4,086 Intercepção em X quando Y=0 -0,8045 - 0,4972 Figura 26: Representação gráfica da recta de calibração que relaciona a área do pico (Y) em mV/s com a concentração de TX5 (X ) em µM resultado na equação Y = 5,112*X + 0,7640 com R 2≥0,99. 2014| Ana Filipa Ferreira 86 Qualidade de ajuste R 2 0,9948 Desvio padrão residual (Sy.x) 17,02% É o declive diferente de Zero? F 26458 DFn, DFd 1,000, 139,0 Valor de P <0,0001 Desvio de zero? Significativo Valores Número de valores 13 Número máximo de réplicas em Y 20 Número total de valores 141 Números totais perdidos 119 Equação Y = 5,112*X + 0,7640 4.3.2 Precisão inter-dia e exactidão do método A precisão inter-dia e a exactidão do método foram calculadas através da injecção e análise de cinco rectas diferentes em cinco dias consecutivos de soluções padrão preparadas diariamente com as 11 concentrações consideradas para a curva de calibração (0; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0 e 150,0 μM). Para avaliar, foram escolhidas três concentrações: uma baixa (1 μM), uma média (10 μM) e outra alta (100 μM). Na figura 27 observa-se o cromatograma obtido nestas três concentrações. O tempo de retenção é de aproximadamente de 13 minutos e a área dos picos aumenta na mesma proporção que aumenta a concentração de TX5. 2014|Ana Filipa Ferreira 87 As amostras foram preparadas em triplicado e injectadas em duplicado, sendo usadas as médias destes valores. Na tabela 8 são apresentados os resultados. Tabela 8: Resultados obtidos na análise da precisão inter-dia e exactidão do método nas concentrações de 1, 10 e 100 μM. Concentração (μM) Área do Pico (média ±SD) CV (%) Exactidão (%) 1 6,288 ± 0,495 7,87 8,07 10 49,554 ± 4,680 9,44 -4,56 100 536,905 ± 13,109 2,44 4,88 Após análise dos resultados, verifica-se que o coeficiente de variação (CV) é sempre abaixo dos 10% (2,44%-9,44%), concluindo-se que nas diferentes injecções e em diferentes curvas preparadas nos cinco dias consecutivos, os padrões não se alteram. Ou seja, o método é preciso na análise do composto quando preparado e injectado em diferentes momentos. Figura 27: Cromatograma das respectivas três concentrações seleccionadas: uma baixa, 1 μM representada a vermelho, uma média, 10 μM representada a azul, e uma alta, 100 μM representada a verde, de TX5. 2014| Ana Filipa Ferreira 88 A exactidão avalia a percentagem da amostra que se distingue da média dos padrões. Neste caso, foi calculada pela fórmula seguinte: 𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸ã𝑜𝑜 (%)=(𝐶𝐶𝑜𝑜𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸çã𝑜𝑜 𝑚𝑚é𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸 𝐶𝐶𝐸𝐸𝑚𝑚𝐶𝐶𝑐𝑐𝑚𝑚𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸)−(𝐶𝐶𝑜𝑜𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸çã𝑜𝑜 𝐶𝐶𝑜𝑜𝑚𝑚𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸𝑚𝑚) (𝐶𝐶𝑜𝑜𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸çã𝑜𝑜 𝐶𝐶𝑜𝑜𝑚𝑚𝐸𝐸𝐶𝐶𝐸𝐸𝑚𝑚) 𝐸𝐸 100 Como resultado, obtivemos uma boa exactidão uma vez que o maior valor obtido é inferior a 10%. Sabendo que, quanto mais próximo de zero, mais exacto é o método, os resultados obtidos confirmam que o método é exacto. 4.3.3 Precisão intra-dia do equipamento Não só o método deve ser testado quanto à sua precisão, mas também o equipamento o deve ser. A precisão intra-dia do equipamento de HPLC foi determinada injectando e analisando 5 vezes no mesmo dia os 11 padrões de uma curva de calibração (0; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0 e 150,0 μM), ou seja, injecções 5 vezes consecutivas de uma mesma curva de calibração (injecção de cada padrão em duplicado) (tabela 9).  Foram escolhidas três concentrações representativas: 1, 10 e 100µM Tabela 9: Resultados obtidos na análise da precisão intra-dia do equipamento nas concentrações de 1, 10 e 100 μM. Concentração (μM) Área do Pico (média ±SD) CV (%) 1 6,688 ± 0,3709 5,55 10 51,196 ± 1,277 2,49 100 573,971 ± 3,810 0,66 2014|Ana Filipa Ferreira 89 Neste parâmetro, verifica-se que o equipamento é preciso, uma vez que após análise de resultados, o coeficiente de variação é inferior a 10%. A concentração com maior coeficiente de variação é a concentração de 1 μM que obteve um coeficiente igual a 5,55%, e a concentração de menor coeficiente de variação foi de 100 μM, com 0,66%. O facto de o coeficiente de variação diminuir com o aumento da concentração dos padrões injectados explica-se porque, quanto maior a concentração, menor são as variações na determinação pelo equipamento. Na figura 27, é possível ver o cromatograma que envolveu as três concentrações requeridas para esta análise estatística. Em conclusão, pode-se afirmar que este equipamento é capaz de validar este método nestas condições. 4.3.4 Precisão intra-dia do método A precisão intra-dia do método foi determinada injectando e analisando, no mesmo dia, 5 replicados de cada um dos 11 padrões da curva de calibração (0; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0 e 150,0 μM), ou seja, injecções consecutivas e no mesmo dia de 5 curvas de calibração diferentes, injectadas em duplicado. Foram escolhidas três concentrações representativas: 1, 10 e 100µM (tabela 10). Tabela 10: Resultados obtidos na análise da precisão intra-dia do método nas concentrações de 1, 10 e 100 μM. No estudo da precisão intra-dia do método, verifica-se após análise dos resultados, que o coeficiente de variação é sempre inferior a 10% (4,16%-7,97%), concluindo-se que este método é eficiente para a análise e determinação da TX5. Na figura 27, é possível ver o cromatograma que envolveu as três concentrações requeridas para esta análise estatística. Concentração (μM) Área do Pico (média ±SD) CV (%) 1 6,560 ± 0,485 7,39 10 50,794 ± 4,050 7,97 100 538,756 ± 22,424 4,16 2014| Ana Filipa Ferreira 90 4.3.5 Estabilidade do TX5 após processamento da amostra A estabilidade de um composto é determinada pela capacidade deste se manter intacto após preparação. Podem ser estudados factores como: exposição à luz; armazenamento a temperaturas como, 4°C, -20°C ou temperatura ambiente; ou armazenamento das amostras por um determinado período de tempo. Na validação deste método, a estabilidade foi determinada pela análise das amostras que foram injectas no equipamento após preparação e posterior armazenamento a 4°C por um período de sete dias, sendo novamente injectadas no HPLC após esse período, como representa o esquema seguinte. Em experiências feitas durante a optimização deste método (dados não apresentados), o composto mostrou não se degradar após o armazenamento à temperatura ambiente ou à temperatura de -20°C após extracção com metanol e posterior armazenamento. O tempo de intervalo estipulado foi de 7 dias e a escolha desta temperatura foi uma opção própria. O composto esteve sempre protegido da luz, por recomendações do laboratório de química orgânica, uma vez que a TX5 é fotossensível. O estudo da estabilidade foi realizado com as concentrações 1, 10 e 100 µM, preparadas em triplicado e injectadas em duplicado. Seguiu-se o esquema seguinte: Como resultado da injecção das amostras para o estudo da estabilidade, obtiveramse os cromatogramas que sugerem que o composto nesta matriz é estável. No cromatograma seguinte (figura 28), é possível ver um exemplo da análise de estabilidade na concentração de 10 μM: quando injectada no mesmo dia da preparação (cor verde); após 7 dias armazenada a 4°C e ao abrigo da luz (cor rosa). Neste cromatograma, os tempos de retenção não são exactamente iguais, uma vez que foi preparada uma nova fase móvel, factor que leva a ligeiras alterações no tempo de retenção. 2014|Ana Filipa Ferreira 91 Após análise estatística, os resultados obtidos foram positivos para o parâmetro da estabilidade (tabela 11). Tabela 11: Resultados obtidos na análise da estabilidade do composto nas concentrações de 1, 10 e 100 μM. Não foi observado nenhum tipo de degradação neste estudo. A variação obtida nestas três concentrações durante os sete dias foi muito próxima de 100% (98,80%- 101,71%) revelando que o composto permaneceu intacto. O estudo da estabilidade nas concentrações de 1, 10 e 100 μM provou que TX5, numa matriz de soro com precipitação Concentração (μM) Área do Pico ‒ injecção imediata (média ±SD) Área do Pico ‒ injecção 7 dias após processamento (média ±SD) Variação (%) 1 6,396 ± 0,855 6,423± 0,805 100,98 ± 9,12 10 50,990 ± 2,203 51,834 ± 2,565 101,71 ± 4,37 100 500,134 ± 44,524 493,706 ± 44,140 98,80 ± 4,54 Figura 28: Cromatograma que representa a concentração padrão de 10 μM injectada no mesmo dia da preparação e após 7 dias, armazenada a 4°C, ao abrigo da luz. Neste cromatograma, os tempos de retenção não são exactamente iguais, uma vez que foi pr eparada uma nova fase móvel, factor que leva a ligeiras alterações no tempo de retenção. 2014| Ana Filipa Ferreira 92 Adição de TX 5 antes da precipitação proteica – A1 de proteínas por metanol, ao final de 7 dias e armazenados a 4°C, é estável. Em futuras experiências de determinação e análise de TX5, podem-se cumprir as mesmas condições de preparação e armazenamento de amostras. 4.3.6 Recuperação da TX 5 A análise de recuperação consiste na avaliação da percentagem que se perde no manuseamento das amostras. Neste caso, a precipitação de proteínas presentes no soro com metanol poderá levar a alterações na quantidade de TX5. Desta forma, a recuperação foi determinada através do cálculo, em percentagem, das concentrações de cada nível a que corresponde à concentração teórica. Portanto, a preparação das amostras dos padrões de 1, 10 e 100 µM foram preparados como mostra o seguinte esquema: Após injecção das amostras com concentração de 1, 10 e 100 µM preparadas em triplicado e injectadas em duplicado (usadas as médias destes valores). No seguinte cromatograma (figura 29) é apresentada a concentração de 10 µM injectada sobre o protocolo A1 (adição de TX 5 antes da precipitação proteica) (cor rosa) e A2 (adição de TX 5 após a precipitação proteica) (cor verde). Adição de TX 5 após a precipitação proteica – A2 2014|Ana Filipa Ferreira 93 A tabela 12 apresenta os valores de recuperação obtidos em amostras tratadas de forma diferente: A1 e A2. Tabela 12: Resultados obtidos na análise da recuperação do composto nas concentrações de 1, 10 e 100 μM. Concentração (μM) Área do Pico ‒ adição TX 5 antes da precipitação proteica (média ±SD) Área do Pico ‒ adição TX 5 após precipitação proteica (média ±SD) Recuperação (%) A1 x 100/ A2 1 6,396 ± 0,855 7,467 ± 0,411 85,96 ± 13,40 10 50,990 ± 2,203 73,228 ± 3,470 69,82 ± 5,36 100 500,134 ± 44,524 715,288 ± 13,384 69,91 ± 5,88 Figura 29: Cromatograma que representa a concentração padrão de 10 μM injectada quando TX5 é adicionado antes da precipitação proteica A1 (cor rosa) e a concentração padrão de 10 μM injectada quando TX5 é adicionado após precipitação proteica com metanol A2 (cor ver de). 2014| Ana Filipa Ferreira 100 quando é induzida de forma aguda pelo TX5 é de grande importância, mostrando ser uma vantagem para contrariar de forma rápida intoxicações por substratos da P-gp. Por outro lado, não é possível concluir que a expressão da P-gp induzida pela TX5 é dependente da concentração, embora se tenham obtido resultados significativamente diferentes com as duas concentrações. Pode-se apenas sugerir que existe uma tendência. Por fim, os dados não nos permitem relacionar aumento de actividade com aumento de expressão, ou vice-versa. No estudo in vivo realizado com ratos Charles River, verificou-se que a farmacocinética da digoxina durante 0s 420 minutos em estudo foi alterada quando administrada concomitantemente com TX5. Pode-se assim concluir que as diferenças na BD da digoxina se devem ao efeito da TX5 no aparelho gastrointestinal dos animais, possivelmente por aumento da actividade desta proteína à superfície dos enterócitos. Induzir a expressão e a actividade da P-gp em linfócitos T pela TX5, bem como aumentar o mecanismo de efluxo, como demonstrado no estudo in vivo, pode ser extremamente importante para a toxicologia clínica, por exemplo como antídoto em intoxicações por substratos da P-gp. No entanto, é de salientar que, apesar dos resultados mostrarem que a P-gp pode ser uma via de tratamento eficiente em casos de intoxicações mediada por substratos da P-gp, como a PQ, resultando numa redução significativa nos níveis intracelulares e, consequentemente, numa redução significativa da sua toxicidade, ainda muitos estudos podem e devem ser feitos relacionando a P-gp, a sua indução e activação como uma estratégia terapêutica eficaz. Por fim, mas não menos importante, a validação de um método simples de quantificação de TX5 por HPLC em fase reversa com eluição isocrática foi desenvolvido com sucesso. Este método foi validado de acordo com as directrizes do ICH, através do estudo da linearidade, recuperação e precisão do método e do equipamento. Os resultados obtidos mostraram, sem margem para dúvidas, que este método é específico, linear, reprodutível e preciso no intervalo de concentrações escolhido (0,5-150 µM de TX5). Desta forma, o método desenvolvido poderá ser no futuro utilizado como método de quantificação e análise de TX5. É um método simples e de custos baixos podendo ser adoptado para a análise de rotina deste composto num laboratório de análise química. 2014|Ana Filipa Ferreira 101 Parte VI Referências Bibliográficas 2014| Ana Filipa Ferreira 102 2014|Ana Filipa Ferreira 103 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Akamine, Y., N. Yasui-Furukori, I. Ieiri and T. Uno (2012). "Psychotropic drug-drug interactions involving P-glycoprotein." CNS Drugs 26(11): 959-973. Al-Khazaali, A. and R. Arora (2014). "P-glycoprotein: a focus on characterizing variability in cardiovascular pharmacotherapeutics." Am J Ther 21(1): 2-9. Allabi, A. C., J. L. Gala and Y. Horsmans (2005). "CYP2C9, CYP2C19, ABCB1 (MDR1) genetic polymorphisms and phenytoin metabolism in a Black Beninese population." Pharmacogenet Genomics 15(11): 779-786. Aller, S. G., J. Yu, A. Ward, Y. Weng, S. Chittaboina, R. Zhuo, P. M. Harrell, Y. T. Trinh, Q. Zhang, I. L. Urbatsch and G. Chang (2009). "Structure of P-glycoprotein reveals a molecular basis for poly-specific drug binding." Science 323(5922): 1718-1722. Ambudkar, S. V., S. Dey, C. A. Hrycyna, M. Ramachandra, I. Pastan and M. M. Gottesman (1999). "Biochemical, cellular, and pharmacological aspects of the multidrug transporter." Annu Rev Pharmacol Toxicol 39: 361-398. Amin, M. L. (2013). "P-glycoprotein Inhibition for Optimal Drug Delivery." Drug Target Insights 7: 27-34. Arceci, R. J., J. M. Croop, S. B. Horwitz and D. Housman (1988). "The gene encoding multidrug resistance is induced and expressed at high levels during pregnancy in the secretory epithelium of the uterus." Proc Natl Acad Sci U S A 85(12): 4350-4354. Ayrton, A. and P. Morgan (2008). "Role of transport proteins in drug discovery and development: a pharmaceutical perspective." Xenobiotica 38(7-8): 676-708. Bain, L. J., J. B. McLachlan and G. A. LeBlanc (1997). "Structure-activity relationships for xenobiotic transport substrates and inhibitory ligands of P-glycoprotein." Environ Health Perspect 105(8): 812-818. Baltazar, M. T., R. J. Dinis-Oliveira, A. Martins, L. Bastos Mde, J. A. Duarte, L. Guilhermino and F. Carvalho (2014). "Lysine acetylsalicylate increases the safety of a paraquat formulation to freshwater primary producers: a case study with the microalga Chlorella vulgaris." Aquat Toxicol 146: 137-143. Batrakova, E. V., D. W. Miller, S. Li, V. Y. Alakhov, A. V. Kabanov and W. F. Elmquist (2001). "Pluronic P85 enhances the delivery of digoxin to the brain: in vitro and in vivo studies." J Pharmacol Exp Ther 296(2): 551-557. Bendayan, R., G. Lee and M. Bendayan (2002). "Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier." Microsc Res Tech 57(5): 365-380. 2014| Ana Filipa Ferreira 104 Biosciences, B. (2000). "Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide." Retrieved 05 de Setembro de 2014, from http://www.d.umn.edu/~biomed/flowcytometry/introflowcytometry.pdf. Biosciences, B. (2012). "BD Accuri C6 Flow cytometer instrumental guide." Retrieved 18 August 2014, from https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_Accuri_C6Flow_Cyto_Instrument_Ma nual.pdf. Borst, P. and R. O. Elferink (2002). "Mammalian ABC transporters in health and disease." Annu Rev Biochem 71: 537-592. Burk, O., K. A. Arnold, A. Geick, H. Tegude and M. Eichelbaum (2005). "A role for constitutive androstane receptor in the regulation of human intestinal MDR1 expression." Biol Chem 386(6): 503-513. Callen, D. F., E. Baker, R. N. Simmers, R. Seshadri and I. B. Roninson (1987). "Localization of the human multiple drug resistance gene, MDR1, to 7q21.1." Hum Genet 77(2): 142-144. Castanheiro, R. A., M. M. Pinto, A. M. Silva, S. M. Cravo, L. Gales, A. M. Damas, N. Nazareth, M. S. Nascimento and G. Eaton (2007). "Dihydroxyxanthones prenylated derivatives: synthesis, structure elucidation, and growth inhibitory activity on human tumor cell lines with improvement of selectivity for MCF-7." Bioorg Med Chem 15(18): 6080-6088. Chan, A., R. Gold and N. von Ahsen (2011). "ATP-binding cassette transporters in inflammatory brain disease." Curr Pharm Des 17(26): 2803-2807. Chaudhary, P. M., E. B. Mechetner and I. B. Roninson (1992). "Expression and activity of the multidrug resistance P-glycoprotein in human peripheral blood lymphocytes." Blood 80(11): 2735-2739. Chaudhary, P. M. and I. B. Roninson (1991). "Expression and activity of P-glycoprotein, a multidrug efflux pump, in human hematopoietic stem cells." Cell 66(1): 85-94. Chen, C. J., D. Clark, K. Ueda, I. Pastan, M. M. Gottesman and I. B. Roninson (1990). "Genomic organization of the human multidrug resistance (MDR1) gene and origin of Pglycoproteins." J Biol Chem 265(1): 506-514. Chin, J. E., R. Soffir, K. E. Noonan, K. Choi and I. B. Roninson (1989). "Structure and expression of the human MDR (P-glycoprotein) gene family." Mol Cell Biol 9(9): 38083820. Choudhuri, S. and C. D. Klaassen (2006). "Structure, function, expression, genomic organization, and single nucleotide polymorphisms of human ABCB1 (MDR1), ABCC (MRP), and ABCG2 (BCRP) efflux transporters." Int J Toxicol 25(4): 231-259. 2014|Ana Filipa Ferreira 105 Christians, U. (2004). "Transport proteins and intestinal metabolism: P-glycoprotein and cytochrome P4503A." Ther Drug Monit 26(2): 104-106. Colabufo, N. A., F. Berardi, M. Contino, M. Niso and R. Perrone (2009). "ABC pumps and their role in active drug transport." Curr Top Med Chem 9(2): 119-129. Cordon-Cardo, C., J. P. O'Brien, J. Boccia, D. Casals, J. R. Bertino and M. R. Melamed (1990). "Expression of the multidrug resistance gene product (P-glycoprotein) in human normal and tumor tissues." J Histochem Cytochem 38(9): 1277-1287. Cordon-Cardo, C., J. P. O'Brien, D. Casals, L. Rittman-Grauer, J. L. Biedler, M. R. Melamed and J. R. Bertino (1989). "Multidrug-resistance gene (P-glycoprotein) is expressed by endothelial cells at blood-brain barrier sites." Proc Natl Acad Sci U S A 86(2): 695-698. Dantzig, A. H., D. P. de Alwis and M. Burgess (2003). "Considerations in the design and development of transport inhibitors as adjuncts to drug therapy." Adv Drug Deliv Rev 55(1): 133-150. DeGorter, M. K., C. Q. Xia, J. J. Yang and R. B. Kim (2012). "Drug transporters in drug efficacy and toxicity." Annu Rev Pharmacol Toxicol 52: 249-273. Dietrich, C. G., A. Geier and R. P. Oude Elferink (2003). "ABC of oral bioavailability: transporters as gatekeepers in the gut." Gut 52(12): 1788-1795. Dinis-Oliveira, R. J., J. A. Duarte, F. Remiao, A. Sanchez-Navarro, M. L. Bastos and F. Carvalho (2006). "Single high dose dexamethasone treatment decreases the pathological score and increases the survival rate of paraquat-intoxicated rats." Toxicology 227(1-2): 73-85. Dinis-Oliveira, R. J., F. Remiao, J. A. Duarte, R. Ferreira, A. Sanchez Navarro, M. L. Bastos and F. Carvalho (2006). "P-glycoprotein induction: an antidotal pathway for paraquat-induced lung toxicity." Free Radic Biol Med 41(8): 1213-1224. Döring, B. and E. Petzinger (2014). "Phase 0 and phase III transport in various organs: Combined concept of phases in xenobiotic transport and metabolism." Drug Metabolism Reviews 0(0): 1-22. Dresser, G. K., U. I. Schwarz, G. R. Wilkinson and R. B. Kim (2003). "Coordinate induction of both cytochrome P4503A and MDR1 by St John's wort in healthy subjects." Clin Pharmacol Ther 73(1): 41-50. Eckford, P. D. and F. J. Sharom (2009). "ABC efflux pump-based resistance to chemotherapy drugs." Chem Rev 109(7): 2989-3011. Fojo, A. T., K. Ueda, D. J. Slamon, D. G. Poplack, M. M. Gottesman and I. Pastan (1987). "Expression of a multidrug-resistance gene in human tumors and tissues." Proc Natl Acad Sci U S A 84(1): 265–269. 2014| Ana Filipa Ferreira 106 Franke, R. M., E. R. Gardner and A. Sparreboom (2010). "Pharmacogenetics of drug transporters." Curr Pharm Des 16(2): 220-230. Fricker, G. and D. S. Miller (2004). "Modulation of drug transporters at the blood-brain barrier." Pharmacology 70(4): 169-176. Fromm, M. F. (2003). "Importance of P-glycoprotein for drug disposition in humans." Eur J Clin Invest 33 Suppl 2: 6-9. Fromm, M. F. (2004). "Importance of P-glycoprotein at blood-tissue barriers." Trends Pharmacol Sci 25(8): 423-429. Gil, S., R. Saura, F. Forestier and R. Farinotti (2005). "P-glycoprotein expression of the human placenta during pregnancy." Placenta 26(2-3): 268-270. Gottesman, M. M. and S. V. Ambudkar (2001). "Overview: ABC transporters and human disease." J Bioenerg Biomembr 33(6): 453-458. Gottesman, M. M., T. Fojo and S. E. Bates (2002). "Multidrug resistance in cancer: role of ATP-dependent transporters." Nat Rev Cancer 2(1): 48-58. Gottesman, M. M., C. A. Hrycyna, P. V. Schoenlein, U. A. Germann and I. Pastan (1995). "Genetic analysis of the multidrug transporter." Annu Rev Genet 29: 607-649. Greiner, B., M. Eichelbaum, P. Fritz, H. P. Kreichgauer, O. von Richter, J. Zundler and H. K. Kroemer (1999). "The role of intestinal P-glycoprotein in the interaction of digoxin and rifampin." J Clin Invest 104(2): 147-153. Handschin, C. and U. A. Meyer (2003). "Induction of drug metabolism: the role of nuclear receptors." Pharmacol Rev 55(4): 649-673. Hartz, A. M., D. S. Miller and B. Bauer (2010). "Restoring blood-brain barrier Pglycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer's disease." Mol Pharmacol 77(5): 715-723. He, S. M., R. Li, J. R. Kanwar and S. F. Zhou (2011). "Structural and functional properties of human multidrug resistance protein 1 (MRP1/ABCC1)." Curr Med Chem 18(3): 439481. Henmi, K., M. Yoshida, N. Yoshikawa and T. Hirano (2008). "P-glycoprotein functions in peripheral-blood CD4+ cells of patients with systemic lupus erythematosus." Biol Pharm Bull 31(5): 873-878. Hennessy, M. and J. P. Spiers (2007). "A primer on the mechanics of P-glycoprotein the multidrug transporter." Pharmacological Research 55(1): 1-15. Hirano, T., K. Onda, T. Toma, M. Miyaoka, F. Moriyasu and K. Oka (2004). "MDR1 mRNA expressions in peripheral blood mononuclear cells of patients with ulcerative colitis in relation to glucocorticoid administration." J Clin Pharmacol 44(5): 481-486. 2014|Ana Filipa Ferreira 107 Hoffmann, U. and H. K. Kroemer (2004). "The ABC transporters MDR1 and MRP2: multiple functions in disposition of xenobiotics and drug resistance." Drug Metab Rev 36(3-4): 669-701. Hoffmeyer, S., O. Burk, O. von Richter, H. P. Arnold, J. Brockmoller, A. Johne, I. Cascorbi, T. Gerloff, I. Roots, M. Eichelbaum and U. Brinkmann (2000). "Functional polymorphisms of the human multidrug-resistance gene: multiple sequence variations and correlation of one allele with P-glycoprotein expression and activity in vivo." Proc Natl Acad Sci U S A 97(7): 3473-3478. ICH, E. g. (1997). "Q2B Validation of analytical procedures: Methodology." Jones, P. M. and A. M. George (2004). "The ABC transporter structure and mechanism: perspectives on recent research." Cell Mol Life Sci 61(6): 682-699. Kalabis, G. M., A. Kostaki, M. H. Andrews, S. Petropoulos, W. Gibb and S. G. Matthews (2005). "Multidrug resistance phosphoglycoprotein (ABCB1) in the mouse placenta: fetal protection." Biol Reprod 73(4): 591-597. Kim, R. B. (2002). "Drugs as P-glycoprotein substrates, inhibitors, and inducers." Drug Metab Rev 34(1-2): 47-54. Kim, R. B., B. F. Leake, E. F. Choo, G. K. Dresser, S. V. Kubba, U. I. Schwarz, A. Taylor, H. G. Xie, J. McKinsey, S. Zhou, L. B. Lan, J. D. Schuetz, E. G. Schuetz and G. R. Wilkinson (2001). "Identification of functionally variant MDR1 alleles among European Americans and African Americans." Clin Pharmacol Ther 70(2): 189-199. Kimchi-Sarfaty, C., J. M. Oh, I. W. Kim, Z. E. Sauna, A. M. Calcagno, S. V. Ambudkar and M. M. Gottesman (2007). "A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity." Science 315(5811): 525-528. Klein, I., B. Sarkadi and A. Varadi (1999). "An inventory of the human ABC proteins." Biochim Biophys Acta 1461(2): 237-262. Klimecki, W. T., B. W. Futscher, T. M. Grogan and W. S. Dalton (1994). "P-glycoprotein expression and function in circulating blood cells from normal volunteers." Blood 83(9): 2451-2458. Kobori, T., S. Harada, K. Nakamoto and S. Tokuyama (2014). "Mechanisms of pglycoprotein alteration during anticancer treatment: role in the pharmacokinetic and pharmacological effects of various substrate drugs." J Pharmacol Sci 125(3): 242-254. Kock, K., M. Grube, G. Jedlitschky, L. Oevermann, W. Siegmund, C. A. Ritter and H. K. Kroemer (2007). "Expression of adenosine triphosphate-binding cassette (ABC) drug transporters in peripheral blood cells: relevance for physiology and pharmacotherapy." Clin Pharmacokinet 46(6): 449-470. Kooij, G., M. R. Mizee, J. van Horssen, A. Reijerkerk, M. E. Witte, J. A. Drexhage, S. M. van der Pol, B. van Het Hof, G. Scheffer, R. Scheper, C. D. Dijkstra, P. van der Valk and H. 2014| Ana Filipa Ferreira 108 E. de Vries (2011). "Adenosine triphosphate-binding cassette transporters mediate chemokine (C-C motif) ligand 2 secretion from reactive astrocytes: relevance to multiple sclerosis pathogenesis." Brain 134(Pt 2): 555-570. Kumar, S., S. Tandon and N. K. Sand (2014). "Determination and method validation of metamitron in soil by RP-HPLC." Bull Environ Contam Toxicol 92(2): 165-168. Kuppens, I. E., E. O. Witteveen, R. C. Jewell, S. A. Radema, E. M. Paul, S. G. Mangum, J. H. Beijnen, E. E. Voest and J. H. Schellens (2007). "A phase I, randomized, open-label, parallel-cohort, dose-finding study of elacridar (GF120918) and oral topotecan in cancer patients." Clin Cancer Res 13(11): 3276-3285. Kwak, J. O., S. H. Lee, G. S. Lee, M. S. Kim, Y. G. Ahn, J. H. Lee, S. W. Kim, K. H. Kim and M. G. Lee (2010). "Selective inhibition of MDR1 (ABCB1) by HM30181 increases oral bioavailability and therapeutic efficacy of paclitaxel." Eur J Pharmacol 627(1-3): 92-98. Leslie, E. M., R. G. Deeley and S. P. Cole (2005). "Multidrug resistance proteins: role of Pglycoprotein, MRP1, MRP2, and BCRP (ABCG2) in tissue defense." Toxicol Appl Pharmacol 204(3): 216-237. Lin, J. H. (2003). "Drug-drug interaction mediated by inhibition and induction of Pglycoprotein." Adv Drug Deliv Rev 55(1): 53-81. Lin, J. H. and M. Yamazaki (2003). "Clinical relevance of P-glycoprotein in drug therapy." Drug Metab Rev 35(4): 417-454. Lin, J. H. and M. Yamazaki (2003). "Role of P-glycoprotein in pharmacokinetics: clinical implications." Clin Pharmacokinet 42(1): 59-98. Lomovskaya, O. and K. A. Bostian (2006). "Practical applications and feasibility of efflux pump inhibitors in the clinic--a vision for applied use." Biochem Pharmacol 71(7): 910918. Lomovskaya, O., H. I. Zgurskaya, M. Totrov and W. J. Watkins (2007). "Waltzing transporters and 'the dance macabre' between humans and bacteria." Nat Rev Drug Discov 6(1): 56-65. Loo, T. W. and D. M. Clarke (1999). "Merck Frosst Award Lecture 1998. Molecular dissection of the human multidrug resistance P-glycoprotein." Biochem Cell Biol 77(1): 1123. Ma, J. D., S. M. Tsunoda, J. S. Bertino, Jr., M. Trivedi, K. K. Beale and A. N. Nafziger (2010). "Evaluation of in vivo P-glycoprotein phenotyping probes: a need for validation." Clin Pharmacokinet 49(4): 223-237. Magnarin, M., M. Morelli, A. Rosati, F. Bartoli, L. Candussio, T. Giraldi and G. Decorti (2004). "Induction of proteins involved in multidrug resistance (P-glycoprotein, MRP1, MRP2, LRP) and of CYP 3A4 by rifampicin in LLC-PK1 cells." Eur J Pharmacol 483(1): 19-28. 2014|Ana Filipa Ferreira 109 Maillefert, J. F., M. Maynadie, J. G. Tebib, S. Aho, P. Walker, C. Chatard, V. Dulieu, M. Bouvier, P. M. Carli and C. Tavernier (1996). "Expression of the multidrug resistance glycoprotein 170 in the peripheral blood lymphocytes of rheumatoid arthritis patients. The percentage of lymphocytes expressing glycoprotein 170 is increased in patients treated with prednisolone." Br J Rheumatol 35(5): 430-435. Malingre, M. M., J. H. Beijnen, H. Rosing, F. J. Koopman, R. C. Jewell, E. M. Paul, W. W. Ten Bokkel Huinink and J. H. Schellens (2001). "Co-administration of GF120918 significantly increases the systemic exposure to oral paclitaxel in cancer patients." Br J Cancer 84(1): 42-47. Manceau, S., C. Giraud, X. Decleves, F. Batteux, C. Chereau, S. Chouzenoux, J. M. Scherrmann, B. Weill, J. Y. Perrot and J. M. Treluyer (2012). "Expression and induction by dexamethasone of ABC transporters and nuclear receptors in a human T-lymphocyte cell line." J Chemother 24(1): 48-55. Martin, C., G. Berridge, C. F. Higgins, P. Mistry, P. Charlton and R. Callaghan (2000). "Communication between multiple drug binding sites on P-glycoprotein." Mol Pharmacol 58(3): 624-632. Martin, P., R. Riley, P. Thompson, D. Williams, D. Back and A. Owen (2010). "Effect of prototypical inducers on ligand activated nuclear receptor regulated drug disposition genes in rodent hepatic and intestinal cells." Acta Pharmacol Sin 31(1): 51-65. Marzolini, C., E. Paus, T. Buclin and R. B. Kim (2004). "Polymorphisms in human MDR1 (P-glycoprotein): recent advances and clinical relevance." Clin Pharmacol Ther 75(1): 1333. Masereeuw, R., S. Notenboom, P. H. Smeets, A. C. Wouterse and F. G. Russel (2003). "Impaired renal secretion of substrates for the multidrug resistance protein 2 in mutant transport-deficient (TR-) rats." J Am Soc Nephrol 14(11): 2741-2749. Masters, K. S. and S. Brase (2012). "Xanthones from fungi, lichens, and bacteria: the natural products and their synthesis." Chem Rev 112(7): 3717-3776. McIlleron, H., G. Meintjes, W. J. Burman and G. Maartens (2007). "Complications of antiretroviral therapy in patients with tuberculosis: drug interactions, toxicity, and immune reconstitution inflammatory syndrome." J Infect Dis 196 Suppl 1: S63-75. Melaine, N., M. O. Lienard, I. Dorval, C. Le Goascogne, H. Lejeune and B. Jegou (2002). "Multidrug resistance genes and p-glycoprotein in the testis of the rat, mouse, Guinea pig, and human." Biol Reprod 67(6): 1699-1707. Mo, W. and J. T. Zhang (2012). "Human ABCG2: structure, function, and its role in multidrug resistance." Int J Biochem Mol Biol 3(1): 1-27.